KR20170114912A - 신규한 기능성을 갖는 전분 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

신규한 기능성을 갖는 전분 생산을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명 개시내용은 신규한 메이즈 전분에 관한 것이다. 전분은 과립 결합 전분 합성효소 I (GBSSI)의 낮은 활성을 갖고 따라서 낮은 아밀로스 수준을 유도하는 새로 개발된 왁시 슈가리-2 이중-돌연변이체 메이즈로부터 생산될 수 있다. 새로 개발된 왁시 슈가리-2 이중-돌연변이체로부터의 전분은 동결-해동에 안정성을 보이고, 높은 점도를 갖는다. 기존의 왁시 슈가리-2 이중-돌연변이체 메이즈의 전분에 비해, 새로운 왁시 슈가리-2 이중-돌연변이체 메이즈 전분은 특히, 개선된 페이스트화 프로파일, 전분 과립 완전성, 보다 큰 전분 과립 크기, 및 보다 높은 점도를 보였다.

Description

신규한 기능성을 갖는 전분 생산을 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING STARCH WITH NOVEL FUNCTIONALITY}
관련 출원에 대한 상호-참조
본원은 2016년 4월 5일 출원된 미국 출원 번호 15/090,926의 연속 출원이며, 그의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 식물 및 곡물로부터 유래된 메이즈 전분, 이러한 전분 생산을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
기존의 왁시 슈가리(waxy sugary)-2 이중-돌연변이체 메이즈 전분은 매우 우수한 동결/해동 안정성을 보인다. 그러나, 기존의 왁시 슈가리-2 메이즈 전분의 점도는 상업적인 찰메이즈 전분, 예컨대 아미오카(AMIOCA)™ 전분보다 실질적으로 더 낮다. 또한, 기존의 왁시 슈가리-2 이중-돌연변이체 메이즈 전분의 페이스트화 온도는 아미오카™ 전분보다 실질적으로 더 낮다. 따라서, 우수한 동결/해동 안정성, 증가된 점도, 및/또는 보다 높은 페이스트화 온도를 갖는 메이즈 전분의 생산에 대한 관련 기술분야의 필요성이 존재한다.
본 발명에서, 본 발명자들은 기존의 왁시 슈가리-2 이중-돌연변이체 메이즈에 낮은 활성의 GBSSI를 도입함으로써 상업적인 찰메이즈 전분, 예컨대 아미오카™ 전분보다 더 높은 점도 및/또는 더 높은 페이스트화 온도를 갖는 새로운 메이즈 전분을 개발하였다.
본 발명은 자연에서 발견되지 않는 신규한 기능성을 갖는 전분을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전분은 아밀로스/아밀로펙틴 검정 키트, 예를 들어, 메가자임(Megazyme)®을 사용할 때 약 2 wt% 내지 약 20 wt%의 아밀로스 함량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분은 래피드 비스코 애널라이저 (Rapid Visco Analyzer: RVA, 뉴포트 사이언티픽(Newport Scientific), 호주 시드니)를 사용하여 측정 시 대조군 전분의 전분 페이스트화 온도보다 적어도 약 5% 더 높은 수성 전분 페이스트화 온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 전분은 내배유에 적어도 1종의 wx-스토너(wx-Stonor) (wxS) 대립유전자를 포함하는 왁시-슈가리 2 이중 돌연변이체 옥수수 식물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 이중 돌연변이체 옥수수 식물은 열성 su2 돌연변이체 대립유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 전분은 개시되고 특허청구된 전분을 생산하는 유전자형에 대해 트랜스제닉이 아닌 (즉, 비-GMO) 식물로부터 생산된다.
일부 실시양태에서, 전분의 아밀로스 함량은 약 8 wt% 내지 약 15 wt%이다.
일부 실시양태에서, 수성 페이스트화 온도는 대조군 전분의 것보다 약 5% 내지 약 15% 더 높다.
일부 실시양태에서, 전분은 결정화도의 엔탈피 변화를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 결정화도의 엔탈피 변화는 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정 시 대조군 전분의 결정화도의 엔탈피 변화보다 적어도 약 30% 더 크다. 일부 실시양태에서, 결정화도의 엔탈피 변화는 DSC를 사용하여 측정 시 대조군 전분의 결정화도의 엔탈피 변화보다 약 30% 내지 약 200% 더 크다.
일부 실시양태에서, 전분은 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 전분으로부터의 5 마이크로미터 미만의 과립 비율에 비해 적어도 약 40% 더 적은 5 마이크로미터 미만의 과립을 포함하는 전분 과립 크기의 분포를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 전분은 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 옥수수 식물로부터 유래된 전분에 비해 증가된 완전성을 나타내는 과립을 갖는다.
일부 실시양태에서, 전분은 적어도 3회의 동결-해동 사이클을 견딜 수 있다. 일부 실시양태에서, 전분은 적어도 3회 내지 적어도 5회의 동결-해동 사이클을 견딜 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 전분을 생산하는 식물은 wxwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제1 옥수수 식물, 및 wxSwxSsu2su2의 유전자형 또는 wxSwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제2 옥수수 식물의 타가 수분에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물의 내배유는 1 도스(dose), 2 도스, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 갖고, 내배유는 wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2의 유전자형을 갖는다.
본 발명은 또한 개선된 페이스트화 프로파일을 갖는 전분의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1종의 wxS 대립유전자를 찰옥수수 식물의 내배유 내로 도입하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 신규한 이중-돌연변이체 식물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 식물은 옥수수 식물이다. 일부 실시양태에서, 식물은 전분 합성효소 IIa (su2) 유전자에 대해 동형접합성 열성이다. 일부 실시양태에서, 식물은 돌연변이된 과립-결합 전분 합성효소 I (GBSSI) 유전자에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 GBSSI 유전자는 야생형 GBSSI 유전자 (Wx)보다 작은 GBSSI 활성을 갖지만, 열성, 기능 상실 GBSSI 유전자 (wx)보다는 더 높은 GBSSI 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 돌연변이된 GBSSI 유전자는 야생형 GBSSI 유전자의 약 8% 내지 약 10%의 GBSSI 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 GBSSI 유전자는 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 GBSSI 유전자는 wx -G 대립유전자, wx -B5 대립유전자, 또는 wx -M 대립유전자이다.
일부 실시양태에서, 이중-돌연변이체 식물은 2개의 모체 식물의 타가 수분에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 식물은 wxwxsu2su2의 유전자형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 식물은 wxSwxSsu2su2의 유전자형, 또는 wxSwxsu2su2의 유전자형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 식물의 내배유는 1 도스, 2 도스, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 식물의 내배유는 wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2의 유전자형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 식물의 내배유에서 생산된 전분은 wxwxwxsu2su2su2의 유전자형을 갖는 이중, 왁시 슈가리-2 열성 돌연변이체 식물의 내배유에서 생산된 전분에 비해 더 높은 점도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 식물의 내배유에서 생산된 전분은 wxwxwxsu2su2su2의 유전자형을 갖는 이중, 왁시 슈가리-2 열성 돌연변이체 식물의 내배유에서 생산된 전분에 비해 더 높은 전분 페이스트화 온도를 갖는다.
본 발명은 또한 식물 부분, 식물 세포, 및 식물의 조직 배양물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 식물 부분은 내배유, 잎, 꽃, 배주, 화분, 근경, 또는 접가지이다. 일부 실시양태에서, 식물 부분은 식물의 종자이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 식물로부터 추출된 전분을 제공한다.
본 발명은 또한 전분의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본 발명의 식물의 내배유로부터 전분을 얻는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전분의 생산 방법은 본 발명의 식물을 성장시키고 식물로부터 종자를 수확하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 종자의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 모 식물을 제2 모 식물과 교배하고, 생성되는 종자를 수확하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 모 식물 및/또는 제2 모 식물은 본 발명의 식물이다. 일부 실시양태에서, 방법은 본 발명의 식물을 자가 수분시키고, 생성되는 종자를 수확하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 식물의 영양 번식 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 식물의 부분을 수거하고 상기 부분으로부터 식물을 재생하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 식물로부터 유래된 식물의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 식물로부터 유래된 자손체 식물을 생산하기 위해 본 발명의 식물을 적어도 1회 자가 수분시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 식물 자손체를 생산하기 위해 본 발명의 식물을 제2 식물과 교배하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 트랜스제닉 식물의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 관심 트랜스진을 본 발명의 식물 내로 도입하는 것을 포함한다. 관심 트랜스진은 하나 이상의 요구되는 표현형을 식물에 부여한다.
본 발명은 또한 본 발명의 식물에서 유전자 서열을 생산하기 위해 유전자-편집을 포함하는, 요구되는 표현형을 갖는 식물의 생산 방법을 제공한다. 유전자 서열은 식물에서 하나 이상의 요구되는 표현형을 부여한다.
본 발명은 또한 유전자 서열을 생산하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 본 발명의 식물 내로 도입하는 것을 포함하는, 요구되는 표현형을 갖는 식물의 생산 방법을 제공한다. 유전자 서열은 식물에서 하나 이상의 요구되는 표현형을 부여한다.
도 1은 가열-냉각 사이클 동안 시간에 걸쳐 래피드 비스코 애널라이저 (RVA)에 의해 측정 시 아미오카™ 전분, wxwxwxSU2su2su2 전분, 및 0, 1, 2, 또는 3 도스의 wxS 유전자를 갖는 왁시-슈가리 2 이중-돌연변이체 식물의 전분의 페이스트화 프로파일을 보여준다.
도 2는 아미오카™ 전분, wxwxwxSU2su2su2 전분, 및 0, 1, 2, 또는 3 도스의 wxS 유전자를 갖는 왁시-슈가리 2 이중-돌연변이체 식물의 전분의, 페이스트화 온도, 최고 RVU, 최저 RVU, 최종 RVU, 강하 RVU, 및 치반 RVU를 포함하는 페이스트화 특성을 보여준다.
도 3은 1, 2, 3, 또는 0 도스의 wxS 유전자를 갖는 왁시-슈가리 2 이중-돌연변이체 식물의 전분, 왁시 스토너(Waxy Stonor) 종자로부터의 전분, wxwxwxSU2su2su2 전분, 및 아미오카™ 전분에 대한 동결-해동 안정성 시험을 보여준다. 상기 언급된 전분은 일렬로 제시되고, 전분 겔의 예시적인 영상은 제1 동결-해동 (사이클 1) 후, 제3 동결-해동 (사이클 3) 후, 및 제5 동결-해동 (사이클 5) 후에 제시된다.
도 4는 아미오카™ 전분, wxwxwxSU2su2su2 전분, 및 0, 1, 2, 또는 3 도스의 wxS 유전자를 갖는 왁시-슈가리 2 이중-돌연변이체 식물의 전분의 열적 특성을 보여준다.
도 5는 아미오카™ 전분, wxwxwxSU2su2su2 전분, 및 0, 1, 2, 또는 3 도스의 wxS 유전자를 갖는 왁시-슈가리 2 이중-돌연변이체 식물의 전분의 과립 크기 분포를 보여준다.
도 6은 1, 2, 3, 또는 0 도스의 wxS 유전자를 갖는 왁시-슈가리 2 이중-돌연변이체 식물의 전분, wxwxwxSU2su2su2 전분, 아미오카™ 전분, 및 왁시 스토너 종자로부터의 전분의 과립 형태를 보여준다. 주사 전자 현미경을 사용하여 포획된 상기 언급된 각각의 전분에 대한 예시적인 영상이 제시된다.
정의
본원에 사용되는 바와 같이, 본 설명 및 청구범위에서 사용되는 동사 "포함한다" 및 그의 동사 활용형은 그 다음에 오는 대상이 포함되지만, 구체적으로 언급되지 않은 대상이 배제되지 않음을 의미하기 위해 비-제한적인 의미로 사용된다.
본 발명은 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물"은 임의의 살아있는 유기체 식물계 (즉, 식물계 내의 임의의 속/종)을 의미한다. 일부 실시양태에서, 식물은 메이즈, 감자, 밀, 타피오카, 쌀, 감자 및 수수를 포함하나 이에 제한되지는 않는 전분을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물은 옥수수 식물이다.
본 발명은 식물 부분을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 부분"은 배, 내배유, 싹, 뿌리, 줄기, 종자, 턱잎, 잎, 꽃잎, 꽃, 배주, 포엽, 가지, 잎자루, 마디사이, 목피, 연모, 분얼경, 근경, 엽상체, 풀잎, 배주, 화분, 수술 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 식물의 임의의 부분을 의미한다.
본 발명은 단리된 (예를 들어, 야생형, 유기체에 대해 내인성), 키메라, 재조합 또는 합성 핵산 서열을 포함하는 유전자를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 DNA의 임의의 절편을 의미한다. 따라서, 유전자는 그 발현에 필요한 코딩 서열 및/또는 조절 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유전자는 또한 예를 들어 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는, 비발현되는 DNA 절편을 포함할 수 있다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 알려진 또는 예측된 서열 정보로부터의 합성을 비롯하여 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 요구되는 파라미터를 갖도록 설계된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 야생형 참조 서열에 비해 뉴클레오티드 변화를 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드 변화"는 관련 기술분야에서 잘 이해되고 있는 바와 같이, 예를 들어, 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입, 또는 트랜스포손을 의미한다. 예를 들어, 돌연변이는 코딩되는 단백질의 특성 또는 활성 또는 단백질이 제조되는 방법을 변경하거나 변경하지 않는 침묵 치환, 부가, 결실, 또는 선택적 스플라이싱을 생성하는 변경을 포함한다. 뉴클레오티드 변화는 또한 유전자 내에 레트로트랜스포손 요소의 삽입 및/또는 배제일 수 있다.
본 발명은 야생형 참조 서열과 비교 시 단백질 변형을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질 변형"은 관련 기술분야에서 잘 이해되고 있는 바와 같이, 예를 들어, 아미노산 치환, 아미노산 변형, 결실, 삽입, 또는 단백질 활성의 변화를 의미한다.
본 발명은 야생형 참조 서열로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "로부터 유래된"은 기원 또는 공급원을 나타내고, 천연 생성, 재조합, 비정제된, 또는 정제된 분자를 포함할 수 있다. 특정 기원 또는 공급원으로부터 유래된 핵산 또는 아미노산은 본원의 다른 곳에서 규정되는 모든 종류의 뉴클레오티드 변화 또는 단백질 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열의 생물학상 활성 변이체 또는 기능적 변이체를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 단백질에 대한 문구 "생물학상 활성 변이체" 또는 "기능적 변이체"는 참조 서열의 실질적인 생물학적 활성을 계속 유지하면서 참조 서열에 대해 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산 서열을 의미한다. 변이체는 치환되는 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 "보존적" 변화, 예를 들어, 류신의 이소류신으로의 교체를 가질 수 있다. 다음 표는 예시적인 보존적 아미노산 치환을 보여준다. 일부 실시양태에서, 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 하나 이상의 또는 모든 치환은 산성 아미노산, 예컨대 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 또는 글루타민이다.
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별법으로, 변이체는 "비보존적" 변화, 예를 들어, 글리신의 트립토판으로의 교체를 가질 수 있다. 유사한 미소한 변화는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 제거하지 않으면서 어떠한 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지 결정할 때의 지침은 관련 기술분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNASTAR 소프트웨어를 사용하여 발견될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대해, 변이체는 5' 및/또는 3' 말단부의 결실 (즉, 말단절단); 참조 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 내부 부위의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 부가; 및/또는 참조 폴리펩티드에서 하나 이상의 부위의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "참조" 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 변이체 폴리뉴클레오티드는 또한 합성에 의해 유도된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 부위지정 돌연변이 유발을 사용하여 생성되지만 유전자 조절 요소 활성을 계속 포함하는 것을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 특정한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자, 또는 폴리펩티드의 변이체는 본원의 다른 곳에서 기재된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 결정 시 특정한 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 초과의 서열 동일성을 가질 것이다.
변이체 폴리뉴클레오티드는 또한 돌연변이 유발 및 재조합 절차, 예컨대 DNA 셔플링으로부터 유래된 서열을 포함한다. 상기 DNA 셔플링을 위한 전략은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Stemmer (1994) PNAS 91:10747-10751]; [Stemmer (1994) Nature 370:389-391]; [Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438]; [Moore et al. (1997) J. Mol . Biol . 272:336-347]; [Zhang et al. (1997) PNAS 94:4504-4509]; [Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291]; 및 미국 특허 번호 5,605,793 및 5,837,458을 참조한다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭을 위해, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 임의의 관심 식물로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터의 대응하는 DNA 서열을 증폭하기 위한 PCR 반응에 사용하기 위해 설계될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 설계하는 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]에 개시되어 있다. 또한, 문헌 [Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)]; [Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)]; 및 [Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)]을 참조한다. 알려진 PCR 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 중첩 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축중성 프라이머, 유전자-특이적 프라이머, 벡터-특이적 프라이머, 부분적으로 미스매치된 프라이머 등을 사용한 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 트랜스제닉 식물을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스제닉"은 다양한 형질전환 방법 중의 하나에 의해 외래 또는 변형된 유전자를 수용한 세포, 세포 배양물, 유기체 (예를 들어, 식물), 및 자손체를 나타내며, 여기서 외래 또는 변형된 유전자는 외래 또는 변형된 유전자를 수용하는 유기체의 종과 동일하거나 또는 상이한 종으로부터 유래된다.
왁시 유전자: 왁시 유전자는 과립-결합 전분 합성효소 I (GBSSI) 유전자이다. 이 유전자는 발달하는 커넬의 삼배체 내배유에서 및 반수체 화분 및 배낭에서 아밀로스 생합성을 책임지는 전분 과립-결합 ADP-글루코스-글루코실 트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.242)를 코딩한다. "Wx"는 야생형 대립유전자를 의미하고, "wx"는 널(null), 참조 돌연변이체-대립유전자를 의미한다. 용어 wxS (일명 wx - 스토너), wx-G, wx -B5, 및 wx -M은 각각 그 전부가 본원에 참조로 포함된 문헌 [Wessler and Varagona (PNAS, 82:4177-4181, 1985)] 및 [Varagona et al. (The Plant Cell, 4:811-820, 1992)]에 기재된 바와 같이, 왁시 유전자 내에 레트로트랜스포손 삽입을 갖는 중간체 대립유전자를 의미한다. 이들 중간체 대립유전자는 야생형 식물에서의 왁시 단백질 활성보다 더 작은 단백질 활성을 그 대립유전자를 갖는 식물에서 유도한다. 메이즈 왁시 유전자는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1의 서열을 갖는 단백질을 코딩한다.
wx - 스토너: 메이즈 식물 내의 wx - 스토너 대립유전자는 왁시 유전자의 인트론 5의 스플라이스 공여자 부위에서의 레트로트랜스포손 삽입에 의해 유도된다. 삽입은 스플라이싱 기구에 영향을 주지 않지만, 야생형 대립유전자에 비해 더 낮은 수준의 효소 활성 (예를 들어, 야생형의 단지 약 9.5%의 GBSSI 활성)을 유도한다. 그 결과, wx - 스토너 대립유전자를 갖는 식물은 wx - 스토너 대립유전자를 갖지 않는 동일한 식물보다 더 높은 아밀로스 수준을 갖는다.
슈가리-2 유전자: 슈가리-2 유전자는 전분 합성효소 이소형 IIa (SSIIa, EC 2.4.1.21)를 코딩한다. "SU2"는 야생형 대립유전자를 의미하고, "su2"는 열성 돌연변이체 대립유전자를 의미한다. 메이즈에서 슈가리-2 단백질의 기능은 그 전부가 본원에 참조로 포함된 문헌 [Zhang et al. (Plant Molecular Biology, 54(6):865-879, 2004)]에 기재되어 있다. 메이즈 야생형 SU2 유전자는 서열식별번호: 2의 서열을 갖는 야생형 단백질을 코딩한다.
메이즈 내의 왁시 유전자 및 슈가리-2 유전자에 대한 보다 상세한 내용은 각각 그 전부가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 4428972, 5954883, 6828474, 6960703, 및 7678898에 기재되어 있다.
아미오카™ 전분: 이 용어는 내셔널 스타치 앤드 케미칼 캄파니(National Starch and Chemical Company) (현재 인그레디온 인코포레이티드(Ingredion Incorporated))에 의해 생산된 아미오카™ 옥수수 전분을 의미한다.
wxwxwxSU2su2su2 전분: 이 용어는 wxwxwxSU2su2su2의 유전자형을 갖는 메이즈 내배유로부터 단리된 전분을 의미한다.
wxwxwxsu2su2su2 전분: 이 용어는 왁시 슈가리-2 이중 열성 돌연변이체의 내배유인, wxwxwxsu2su2su2의 유전자형을 갖는 메이즈 내배유로부터 단리된 전분을 의미한다. 돌연변이된 왁시 유전자는 그의 우수한 동결-해동 안정성에 기여하고, 돌연변이된 슈가리-2 유전자는 짧은 분지쇄 길이를 생성한다. 그러나, 전분은 전분 과립의 낮은 완전성을 갖는다. 과립은 쉽게 분해되고, 전분은 낮은 점도를 갖는다.
멜로젤(MELOJEL)® 전분: 이 용어는 내셔널 스타치 앤드 케미칼 캄파니 (현재 인그레디온 인코포레이티드)에 의해 생산된 멜로젤® 옥수수 전분을 의미한다.
대조군 옥수수 식물: 이 용어는 비교를 위한 적절한 조사 식물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 조사 식물은 야생형 식물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조사 식물은 본원에 기재된 중간체 왁시 유전자를 갖지 않는 식물이다. 일부 실시양태에서, 조사 식물은 wxwxwxSU2su2su2 전분 또는 wxwxwxsu2su2su2 전분을 생산하는 옥수수 식물이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 대조군 옥수수 식물은 내배유에 wx -S 대립유전자를 갖지 않는 옥수수 식물이다.
대조군 전분: 이 용어는 대조군 전분을 의미한다.
wxSwxwxsu2su2su2: 이 용어는 1 도스의 wxS를 갖는 메이즈 내배유를 의미한다.
wxSwxwxsu2su2su2 전분: 이 용어는 1 도스의 wxS를 갖는 메이즈 내배유로부터 단리된 전분을 의미하고, 상기 내배유는 유전자형 wxSwxwxsu2su2su2를 갖는다.
wxSwxSwxsu2su2su2: 이 용어는 2 도스의 wxS를 갖는 메이즈 내배유를 의미한다.
wxSwxSwxsu2su2su2 전분: 이 용어는 2 도스의 wxS를 갖는 메이즈 내배유로부터 단리된 전분을 의미하고, 상기 내배유는 유전자형 wxSwxSwxsu2su2su2를 갖는다.
wxSwxSwxSsu2su2su2: 이 용어는 3 도스의 wxS를 갖는 메이즈 내배유를 의미한다.
wxSwxSwxSsu2su2su2 전분: 이 용어는 3 도스의 wxS를 갖는 메이즈 내배유로부터 단리된 전분을 의미하고, 상기 내배유는 유전자형 wxSwxSwxSsu2su2su2를 갖는다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 예시한다. 실시예는 물론 본 발명의 범위에 대한 어떠한 제한을 구성하는 것이 아니라, 단지 본 발명의 특정 실시양태를 예시하는 것으로 이해되어야 한다.
신규한 기능성을 갖는 전분
한 측면에서, 본 개시내용은 야생형 GBSSI 유전자 (Wx)보다 더 작은 GBSSI 활성을 갖지만 열성, 기능 상실 GBSSI 유전자 (wx)보다 더 높은 GBSSI 활성을 갖는 중간체 GBSSI 대립유전자를 포함하는 이중-돌연변이체 옥수수 식물로부터 유래된 전분을 제공한다. 일부 실시양태에서, 중간체 GBSSI 대립유전자를 갖는 이중-돌연변이체 옥수수 식물은 내배유 내에 적어도 1종의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하는 왁시-슈가리 2 옥수수 식물이다. 일부 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물은 wxwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제1 옥수수 식물, 및 wxSwxSsu2su2의 유전자형 또는 wxSwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제2 옥수수 식물의 타가 수분에 의해 생성된다. 추가의 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물의 내배유는 1 도스, 2 도스, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 갖고, 내배유는 wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2의 유전자형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 전분은 메가자임® 아밀로스/아밀로펙틴 검정 키트를 사용하여 측정 시 약 2 wt% 내지 약 20 wt%의 아밀로스 함량, 및 RVA 분석을 사용하여 측정 시 대조군 전분의 페이스트화 온도보다 적어도 약 5% 더 높은 수성 전분 페이스트화 온도를 포함한다.
아밀로스 함량. 전분은 아밀로스 및 아밀로펙틴으로 구성된다. 아밀로스는 α(1→4) 글리코시드 결합을 통해 연결된, α-D-글루코스 단위로 이루어진 나선형 중합체이다. 아밀로펙틴은 α(1→4) 및 α(1→6) 글리코시드 결합을 포함하는 글루코스의 고도 분지형 중합체이다. 분지는 α(1→6) 결합에서 발생하고, 이것은 대략 24 내지 30 글루코스 단위마다 일어난다. 일부 실시양태에서, 전분 내의 아밀로스 함량은 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 아밀로스/아밀로펙틴 검정 키트, 예컨대 메가자임®에서 제조된 아밀로스/아밀로펙틴 검정 키트를 사용하여 측정할 수 있다.
이중-돌연변이체 옥수수 식물에서 GBSSI 유전자의 중간체 돌연변이는 널-대립유전자 GBSSI 유전자를 갖는 대조군 옥수수 식물에 비해 그로부터 유래된 전분 내의 아밀로스 함량을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 내배유 내에 적어도 1종의 wx -스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하는 왁시-슈가리 2 옥수수 식물로부터 유래된 전분의 아밀로스 함량은 대조군 옥수수 식물에 비해 증가하는 것으로 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 내배유 내에 적어도 1종의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자를 갖는 옥수수 식물로부터 유래된 전분은 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 약 2 wt% 내지 약 20 wt%, 약 4 wt% 내지 약 18 wt%, 약 5 wt% 내지 약 15 wt%, 또는 약 8 wt% 내지 약 15 wt%의 아밀로스 함량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 아밀로스 함량은 그 사이의 모든 값을 포함하여 약 5 wt%, 약 6 wt%, 약 7 wt%, 약 8 wt%, 약 9 wt%, 약 10 wt%, 약 11 wt%, 약 12 wt%, 약 13 wt%, 약 14 wt%, 약 15 wt%, 약 16 wt%, 약 17 wt%, 또는 약 18 wt%이다.
이론에 의해 제한되지는 않지만, 아밀로스 함량의 증가는 전분 내의 아밀로펙틴 함량을 감소시키는 것으로 예상되고, 그에 의해 수성 매질과 상호작용에 이용가능한 글루코스 단위 및 수소-결합기의 총 수를 감소시킨다. 수소 결합의 그러한 감소는 상기 전분과 수성 매질과의 상호작용의 강도의 총 감소에 상응하고, 전분의 페이스트화 특성을 감소시킬 것이다. 그러나, 본원에 개시된 전분 내에서 아밀로스 함량이 증가될 때 페이스트화 프로파일의 예기치 않은 개선이 관찰되었다. 이론에 의해 제한되지는 않지만, 상기 예기치 않은 결과는 내배유 내에 적어도 1종의 wx-스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하는 왁시-슈가리 2 옥수수 식물에서 관찰된 분지쇄 길이의 증가에 기인할 수 있다. 전분 상의 보다 긴 분지쇄는 보다 많은 글루코스 단위를 제공하고, 이것은 보다 짧은 분지쇄 길이에 비해 수성 매질과의 수소 결합 상호작용의 수를 증가시킨다.
전분의 페이스트화 프로파일은 공지의 방법에 의해, 예컨대 래피드 비스코 애널라이저 (RVA) (뉴포트 사이언티픽, 호주 시드니)를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, RVA는 페이스트화 온도 (℃), 최고 점도 (RVU), 최저 점도 (RVU), 최종 점도 (RVU), 강하 점도 (RVU), 및 치반 점도 (RVU)를 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개선된 페이스트화 프로파일은 대조군 전분에 비해 젤라틴화가 특히 보다 적은 유효량의 전분에서 및/또는 보다 높은 페이스트화 온도에서 일어나도록 허용한다. 전분 젤라틴화는 물 및 열의 존재 하에 전분 분자의 분자간 결합을 파괴하여, 수소 결합 부위 (예를 들어, 히드록실 기)가 보다 많은 물에 결합하도록 허용하는 과정을 나타낸다. 전분 페이스트화 프로파일을 측정하기 위해, 유효량의 전분을 중성 pH에서 수용액에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 전분을 수용액에 8 w/w% 고형분 수준으로 첨가할 수 있다.
페이스트화 온도. 페이스트화 온도는 본원에 사용될 때 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 측정되도록 의도된다. 전분의 페이스트화 온도는 물 내에 현탁될 때 전분 과립의 초기 팽윤이 일어나는 온도이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 전분은 RVA 분석을 사용하여 측정 시 대조군 전분의 페이스트화 온도보다 적어도 약 5% 더 높은 수성 페이스트화 온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 수성 페이스트화 온도는 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 약 1% 내지 약 100%, 약 1% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 14% 증가한다. 특정한 실시양태에서, 수성 페이스트화 온도는 대조군 옥수수 식물, 예컨대 이중 돌연변이체 왁시-슈가리 2 옥수수 식물보다 약 5% 내지 약 14% 더 높다.
다른 실시양태에서, 수성 페이스트화 온도는 대조군 전분의 페이스트화 온도에 비해, 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 또는 적어도 약 20% 더 높게 증가한다.
또 다른 실시양태에서, 수성 페이스트화 온도는 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 1℃ 내지 약 20℃, 또는 약 5℃ 내지 약 10℃ 증가한다. 다른 실시양태에서, 수성 페이스트화 온도는 대조군 전분의 페이스트화 온도에 비해 적어도 약 4℃, 적어도 약 5℃, 적어도 약 6℃, 적어도 약 7℃, 적어도 약 8℃, 적어도 약 9℃, 적어도 약 10℃, 적어도 약 11℃, 적어도 약 12℃, 적어도 약 13℃, 적어도 약 14℃ 또는 적어도 약 15℃ 증가한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 전분은 적어도 약 50℃, 적어도 약 55℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 65℃, 적어도 약 70℃, 적어도 약 75℃, 적어도 약 80℃, 적어도 약 85℃, 적어도 약 90℃, 적어도 약 95℃, 또는 적어도 약 100℃의 수성 페이스트화 온도를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 내배유 내에 적어도 1종의 wx-스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하는 왁시-슈가리 2 옥수수 식물로부터 유래된 전분은 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 약 55℃ 내지 약 68℃, 또는 약 59℃ 내지 약 65℃의 수성 페이스트화 온도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 수성 페이스트화 온도는 그 사이의 모든 값을 포함하여 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 또는 약 68℃이다.
결정화도의 엔탈피 변화. 결정화도의 엔탈피 변화는 본원에 사용될 때 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 측정되도록 의도된다. 결정화는 침전에 의해 용액으로부터 고체 결정을 형성하는 과정을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 이중-돌연변이체 옥수수 식물의 내배유 내에 적어도 1종의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자의 도입은 대조군 옥수수 식물로부터의 전분에 비해 결정화도의 엔탈피 변화를 증가시키는 것으로 관찰되었다. 엔탈피 변화는 예를 들어, 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결정화도의 엔탈피 변화는 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 약 10% 내지 약 300%, 약 10% 내지 약 200%, 약 10% 내지 약 150%, 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 10% 내지 약 50% 증가한다. 하나의 상기 실시양태에서, 결정화도의 엔탈피 변화는 DSC를 사용하여 측정 시 대조군 전분의 결정화도의 엔탈피 변화보다 약 70% 내지 약 200% 더 크다.
일부 실시양태에서, 결정화도의 엔탈피 변화는 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 또는 적어도 약 200% 증가한다.
일부 실시양태에서, 결정화도의 엔탈피 변화는 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 약 1 J/g 내지 약 20 J/g, 약 5 J/g 내지 약 15 J/g, 약 6 J/g 내지 약 13 J/g이다. 다른 실시양태에서, 8 w/w%에서 결정화도의 엔탈피 변화는 그 사이의 모든 값을 포함하여 약 4 J/g, 약 5 J/g, 약 6 J/g, 약 7 J/g, 약 8 J/g, 약 9 J/g, 약 10 J/g, 약 11 J/g, 약 12 J/g, 약 13 J/g이다. 특정한 실시양태에서, 옥수수 식물은 내배유 내에 1개의 wxS 대립유전자를 포함하고, 결정화도의 엔탈피 변화는 wxwxwxsu2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물로부터 유래된 전분보다 적어도 약 150% 더 크다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 옥수수 식물은 내배유 내에 2개의 wxS 대립유전자를 포함하고, 결정화도의 엔탈피 변화는 wxwxwxsu2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물로부터 유래된 전분보다 적어도 약 30% 더 크다. 추가의 또 다른 특정한 실시양태에서, 옥수수 식물은 내배유 내에 3개의 wxS 대립유전자를 포함하고, 결정화도의 엔탈피 변화는 wxwxwxsu2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물로부터 유래된 전분보다 적어도 약 75% 더 크다.
동결 해동 안정성. 동결 해동 안정성은 본원에 사용될 때 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 측정되도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 전분은 바람직한 동결-해동 특징, 예를 들어, 개선된 동결-해동 안정성을 보인다. 동결-해동 안정성은 유효량의 전분을 물에 첨가하여 슬러리를 형성하고, 이어서 조리하고, 동결/냉각의 사이클 후에 시네레시스를 측정함으로써 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 옥수수 식물의 내배유 내로 적어도 1종의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자의 도입은 대조군 전분에 비해 그로부터 유래된 전분의 동결-해동 안정성을 감소시키지 않았다. 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 내배유 내로 적어도 1종의 wx -스토너 (wxS) 대립유전자의 도입은 전분의 동결-해동 안정성을 개선하였다. 하나의 상기 실시양태에서, 전분은 총 적어도 3회 내지 적어도 5회의 동결-해동 사이클을 견딜 수 있다.
과립 분포 및 완전성. 과립 분포 및 완전성은 본원에 사용될 때, 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 측정되도록 의도된다.
일부 실시양태에서, 옥수수 식물의 내배유 내에 적어도 1종의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자의 도입은 대조군 전분에 비해 전분 과립의 크기의 분포를 변경시키는 것으로 관찰되었다. 일부의 그러한 실시양태에서, 본원에 기재된 전분의 전분 과립 크기의 분포는 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 전분으로부터의 5 마이크로미터 미만의 과립 비율에 비해 적어도 약 40% 더 적은 5 마이크로미터 미만의 과립을 포함한다.
과립 완전성은 본원에 사용될 때, 수성 매질 내에 용해시킨 후 무손상 과립으로서 유지되는 전분의 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 전분은 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 옥수수 식물로부터 유래된 전분에 비해 증가된 완전성을 나타내는 과립이다.
점도. 점도는 본원에 사용될 때 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 측정되도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 전분은 RVA 분석을 사용하여 측정 시 대조군 전분의 수성 최고 점도보다 적어도 약 10% 더 큰 수성 최고 점도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 수성 최고 점도는 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 약 10% 내지 약 300%, 약 10% 내지 약 250%, 약 10% 내지 약 200%, 약 10% 내지 약 150%, 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 10% 내지 약 50% 증가하였다. 일부 실시양태에서, 수성 최고 점도는 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 또는 적어도 약 200% 증가하였다.
일부 실시양태에서, 8 w/w% 고형분에서 전분의 수성 최고 점도는 모든 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함하여 약 100 RVU 내지 약 500 RVU, 약 100 RVU 내지 약 400 RVU, 약 100 RVU 내지 약 300 RVU, 약 100 RVU 내지 약 200 RVU, 또는 약 100 RVU 내지 약 150 RVU이다. 일부 실시양태에서, 수성 최고 점도는 그 사이의 모든 값을 포함하여 약 150 RVU, 약 155 RVU, 약 160 RVU, 약 165 RVU, 약 170 RVU, 약 175 RVU, 약 180 RVU, 약 185 RVU, 약 190 RVU, 약 195 RVU, 약 200 RVU, 약 205 RVU, 약 210 RVU, 약 215 RVU, 약 220 RVU, 약 225 RVU, 약 230 RVU, 약 235 RVU, 약 240 RVU, 약 245 RVU, 약 250 RVU, 약 255 RVU, 약 260 RVU, 약 265 RVU, 약 270 RVU, 약 275 RVU, 약 280 RVU, 약 285 RVU, 약 290 RVU, 약 295 RVU, 약 300 RVU, 약 305 RVU, 약 310 RVU, 약 315 RVU, 약 320 RVU, 약 325 RVU, 약 330 RVU, 약 335 RVU, 약 340 RVU, 약 345 RVU, 약 350 RVU, 약 355 RVU, 약 360 RVU, 약 365 RVU, 약 370 RVU, 약 375 RVU, 약 380 RVU, 약 385 RVU, 약 390 RVU, 약 395 RVU, 또는 약 400 RVU이다.
특정한 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물은 내배유 내에 1개의 wx -스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하고, 전분은 wxwxwxsu2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물보다 약 110% 더 큰 최고 점도를 갖는다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물은 내배유 내에 2개의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하고, 전분은 wxwxwxsu2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물보다 약 30% 더 큰 최고 점도를 갖는다. 추가의 또 다른 특정한 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물은 내배유 내에 3개의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하고, 전분은 wxwxwxsu2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물보다 약 40% 더 큰 최고 점도를 갖는다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물은 내배유 내에 2개의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하고, 전분은 wxwxwxSU2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물보다 약 20% 더 큰 최고 점도를 갖는다. 추가의 또 다른 특정한 실시양태에서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물은 내배유 내에 2개의 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자를 포함하고, 전분은 wxwxwxSU2su2su2의 내배유 유전자형을 갖는 대조군 식물보다 적어도 약 30% 더 큰 최고 점도를 갖는다.
추출. 본 발명의 식물의 커넬로부터 전분의 추출은 관련 기술분야에 공지된 습식-밀링 또는 건식-밀링 공정에 의해 표준 방식으로 수행할 수 있지만 이 방법에 제한되는 것은 아니다. 하나의 대표적인 습식-밀링 공정에서, 식물을 원치않는 물질을 제거하기 위해 강한 기류, 체 및 전자석에 의해 세정한다. 그 후, 이를 소량의 이산화황을 함유하는 온수 내에 침지시킨다. 침지수를 빼내고, 연화된 커넬을 마멸 밀로 통과시켜 파괴한다. 배아를 제거하고, 남아있는 혼합물을 연마하고 세척하고 슬러리로서 체질한다. 원심분리에 의해 글루텐으로부터 전분을 분리시킨 후, 남아있는 슬러리형 전분을 여과하고, 세척하고, 재현탁하고, 재여과한다.
식물로부터 가루 또는 그의 변이체의 추출은 건식-밀링 공정에 의해 달성할 수 있다. 본원에 적합하지만 다른 절차를 배제하지 않는 대표적인 절차에서, 본 발명의 식물로부터 얻은 곡물을 먼저 완전히 세정하고, 연마기를 통해 통과시킨 후, 수분첨가 또는 조건화하고, 배아분리기를 통해 통과시킨다. 배아분리기로부터 원액을 건조시킨 후 냉각시키고, 호미니 분리기 및 흡인기를 통해 통과시키고, 연마하고, 마지막으로 전체 또는 별개의 분획이 요구되는지에 따라 체질한다.
변형. 예를 들어, 흔히 사용되는 온도 미만의 침지수 온도를 이용하는 것과 같이 상기 추출 공정에서의 일부 변형이 바람직할 수 있음이 이해될 수 있고 전분 전문가는 쉽게 알 것이다.
본원의 전분은 요구되는 경우에, 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해, 예컨대 에테르 또는 에스테르, 예컨대 히드록시프로필 에테르, 아세테이트, 포스페이트, 숙시네이트, 예를 들어, 옥테닐 숙시네이트, 3급 및 4급 아민 에테르 등을 형성하기 위해 유도체화에 의해, 또는 본원에 규정된 특징을 갖는 전분을 생산하는 임의의 다른 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 본원에서 바람직한 치환기는 히드록시프로필, 포스페이트 또는 아세테이트 기이다.
상업적 목적을 위해, 본원의 전분의 하나의 변형은 제조 작업에서 빈번하게 마주치는 취급 및 가공 조건에 대해 과립을 강화하기 위해, 및 식품 시스템에 바람직한 레올로지 특성을 부여할 수 있는 전분을 제공하기 위해 가교결합이다. 식품 시스템을 위한 에피클로로히드린, 선형 디카르복실산 무수물, 시트르산 아크롤레인, 옥시염화인, 아디프산/아세트산 혼합산 무수물, 및 트리메타포스페이트 염, 및 비-식품 시스템에서 에피클로로히드린, 선형 디카르복실산 무수물, 시트르산 아크롤레인, 옥시염화인, 아디프산/아세트산 혼합산 무수물, 트리메타포스페이트 염, 포름알데히드, 시아누르산 염화물, 디이소시아네이트, 및 디비닐 술폰을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 가교결합제가 상기 목적을 위해 사용될 수 있다. 가교결합 반응은 관련 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어 미국 특허 번호 2,328,537 및 2,801,242에 기재된 기술을 사용하여 수행한다. 전분을 변형하기 위한 절차는 문헌 [M. W. Rutenberg, pages 22-26 to 22-47, Handbook of Water Soluble Gums and Resins, R. L. Davidson, Editor (McGraw-Hill, Inc., New York, N.Y. 1980)]의 챕터 "전분 및 그의 변형(Starch and Its Modification)"에 기재되어 있다.
적합한 제품을 제공하기 위해 필요한 가교결합제의 양은 예를 들어, 사용된 가교결합제의 종류, 가교결합제의 농도, 반응 조건, 및 가교결합된 전분이 요구되는 점도 범위 내에 있도록 하는 필요성에 따라 다를 것이다. 전문가는 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이 어떤 양이 사용될 수 있는지 알 것이다. 대개, 상기 양은 전분 중량의 약 0.001%만큼 적은 양부터 식품 용도로 허용되는 것으로 여겨지는 다량까지 다양할 것이다.
본 발명의 전분은 또한 예컨대 WO 95/04082 (1995년 2월 9일 공개)에 기재된 열적 억제에 의해 물리적으로 변형될 수 있다.
가공. 전분을 또한 프리젤라틴화할 수 있다. 프리젤라틴화 전분을 제조하기 위한 예시적인 공정은 미국 특허 번호 4,280,851 (Pitchon, et al.), 미국 특허 번호 4,465,702 (Eastman, et al.), 미국 특허 번호 5,037,929 (Rajagopalan), 미국 특허 번호 5,131,953 (Kasica, et al.) 및 미국 특허 번호 5,149,799 (Rubens)에 개시되어 있다. 전분을 프리젤라틴화하기 위한 통상적인 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예컨대 문헌 [Chapter XXII--"Production and Use of Pregelatinized Starch", Starch: Chemistry and Technology, Vol. III--Industrial Aspects, R. L. Whistler and E. F. Paschall, Editors, Academic Press, New York 1967]에 기재되어 있다.
본 발명의 전분은 전분에 고유하거나 전분 변형 공정 동안 생성된 이취 및 색상을 제거하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 전분을 처리하기 위해 바람직한 정제 공정은 미국 특허 번호 07/832,838 (1992년 2월 7일자 출원, Kasica, et al.)에 개시되어 있다. 과립 또는 프리젤라틴화 형태로 사용하기 위해 의도된 전분에 대한 알칼리 세척 기술이 또한 유용하고, 미국 특허 번호 5,187,272 (Bertalan, et al.)에 제시된 특허 패밀리에 기재되어 있다.
산화, 특히 α-아밀라제에 의한 효소 전환, 산 가수분해, 열 및 또는 산 덱스트린화에 의해 생성된 유동성 또는 저점도-비등성 전분, 열적 및/또는 전단 생성물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 발명의 전분으로부터 유래된 전환 생성물이 또한 본원에서 유용하다.
전분을 생산하는 식물
본 발명은 상기 기재된 전분을 생산하는 식물을 제공한다. 전분 생산 식물은 메이즈, 감자, 밀, 타피오카, 쌀, 카사바, 및 수수를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 전분은 옥수수 식물로부터, 예컨대 옥수수 식물의 내배유로부터 추출될 수 있다. 본 발명의 전분을 생산하는 옥수수 식물은 왁시/슈가리-2 유전자형의 이중 돌연변이체 식물이다. 왁시 유전자는 옥수수의 염색체 9에 위치하는 한편, 슈가리-2 유전자는 염색체 6에 위치한다. (M. G. Nueffer, L. Jones, and M. Zuber, "The Mutants of Maize" (Crop Science Society of America, Madison, WI, 1968), pp. 72 and 73.] 참조).
본 발명의 식물은 전분 합성효소 IIa (su2) 유전자에 대해 동형접합성 열성이고, 돌연변이된 과립-결합 전분 합성효소 I (GBSSI) 유전자에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다. 돌연변이된 GBSSI 유전자는 야생형 GBSSI 유전자 (Wx)보다 더 작은 GBSSI 활성을 갖지만, 열성, 기능 상실 GBSSI 유전자 (wx)보다 더 높은 GBSSI 활성을 갖는다. 본원에 사용될 때, 상기 왁시 돌연변이체 유전자는 중간체 왁시 돌연변이체로 불린다. 일부 실시양태에서, 중간체 왁시 돌연변이체는 야생형 GBSSI 유전자 발현의 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중간체 왁시 돌연변이체는 야생형 GBSSI 유전자 발현의 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 또는 약 15%를 갖는다.
야생형 GBSSI 유전자보다 더 작은 GBSSI 활성을 갖지만 열성, 기능 상실 GBSSI 유전자보다 더 높은 GBSSI 활성을 갖는 중간체 GBSSI 유전자는 관련 기술분야에 이전에 공지된 것이거나, 임의의 적합한 돌연변이 유발 방법에 의해 생성될 수 있다.
돌연변이체 대립유전자, 예컨대 wxS (일명 wx - 스토너), wx -G, wx -B5, 및 wx -M은 중간체 GBSSI 활성을 갖는다. 이들 돌연변이체 대립유전자는 문헌 [Wessler and Varagona (PNAS, 82:4177-4181, 1985)] 및 [Varagona et al. (The Plant Cell, 4:811-820, 1992)]에 기재된 바와 같이 GBSSI 유전자 내에 레트로트랜스포손 삽입으로 인한 것이다. 이들 중간체 대립유전자는 야생형 왁시 단백질보다 더 적은 활성을 갖는 왁시 단백질을 생성한다.
중간체 GBSSI 활성을 갖는 추가의 돌연변이체 대립유전자는 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 레트로트랜스포손 돌연변이 유발을 사용하여 중간체 GBSSI 활성을 갖는 돌연변이된 GBSSI 유전자를 갖는 옥수수 식물을 스크리닝하기 위한 집단을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, wxS (일명 wx - 스토너), wx-G, wx -B5, 및 wx -M은 추가의 돌연변이체 대립유전자를 생산하기 위해 출발 물질로서 사용할 수 있다.
중간체 GBSSI 활성을 갖는 돌연변이체 대립유전자를 생산하기 위해 사용될 수 있는 다른 돌연변이 유발 방법은 화학적 돌연변이 유발, 방사선 돌연변이 유발, 트랜스포손 돌연변이 유발, 삽입 돌연변이 유발, 서명 태그부착된 돌연변이 유발, 부위-지정 돌연변이 유발, 및 자연 돌연변이 유발을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 일부 실시양태에서, 중간체 GBSSI 활성을 갖는 돌연변이체 대립유전자를 생산하기 위해 안티센스 RNA, 리보자임, dsRNAi, RNA 간섭 (RNAi)을 사용할 수 있다. 안티센스 RNA 기술은 세포 내에서 특정한 mRNA에서 발견되는 서열에 상보성 또는 안티센스인 RNA 분자 (또는 RNA 유도체)를 세포 내에서 발현시키거나 세포 내로 도입하는 것을 수반한다. mRNA와 회합함으로써, 안티센스 RNA는 코딩된 유전자 생성물의 번역을 억제할 수 있다. 특이적 식물 유전자의 발현을 감소 또는 억제하기 위한 안티센스 기술의 사용은 예를 들어 유럽 특허 공개 번호 271988, 문헌 [Smith et al., Nature, 334:724-726 (1988)]; [Smith et al., Plant Mol. Biol., 14:369-379 (1990)]에 기재된 바 있다. 리보자임은 촉매 도메인, 및 특정한 mRNA에 상보성인 서열 둘 다를 갖는 RNA이다. 리보자임은 mRNA (리보자임의 상보성 도메인을 통해)과 회합하고, 이어서 촉매 도메인을 사용하여 메시지를 절단 (분해)함으로써 기능을 한다. RNA 간섭 (RNAi)은 침묵된 유전자에 서열이 상동성인 이중 가닥 RNA (dsRNA)에 의해 개시된, 동물 및 식물에서 서열-특이적, 전사후 유전자 침묵 또는 전사 유전자 침묵의 과정이다. RNAi 기술은 예를 들어, 문헌 [Elibashir, et al., Methods Enzymol. 26:199 (2002)]; [McManus & Sharp, Nature Rev. Genetics 3:737 (2002)]; PCT 출원 WO 01/75164; [Martinez et al., Cell 110:563 (2002)]; [Elbashir et al., supra]; [Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735 (2002)]; [Tuschl et al., Nature Biotechnol. 20:446 (2002)]; [Tuschl, Chembiochem. 2:239 (2001)]; [Harborth et al., J. Cell Sci. 114:4557 (2001)]; [et al., EMBO J. 20:6877 (2001)]; [Lagos-Quintana et al., Science 294:8538 (2001)]; [Hutvagner et al., loc cit, 834]; [Elbashir et al., Nature 411:494 (2001)]에 논의되어 있다.
돌연변이체 wx 및/또는 su2 대립유전자가 전좌, 역전, 또는 임의의 다른 염색체 조작 방법에 의해 식물 게놈의 또 다른 부분으로 이동된 돌연변이체로부터 생성되는 전분이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 돌연변이 육종의 공지의 표준 방법에 의해 생산될 수 있는 상기 유전자 조성의 인공 돌연변이 및 변이로부터 성장시킨 식물로부터 추출된 전분이 또한 본원에 적용가능하다.
전분 생산 식물이 중간체 GBSSI 활성을 갖는 메이즈 GBSSI 유전자의 돌연변이체 오르토로그, 및 메이즈 SSIIa 유전자의 열성 돌연변이체 오르토로그를 갖는 한, 옥수수 식물 이외의 식물로부터 생산된 전분이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 식물은 밀, 타피오카, 쌀, 카사바, 사고, 감자, 또는 수수일 수 있다.
일부 실시양태에서, 메이즈 이외의 식물 내에서 오르토로그 GBSSI 유전자는 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하고, GBSSI 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 오르토로그는 각각 그 전부가 본원에 참조로 포함된 UniProt 엔트리 번호 O82627 (안티리늄 마주스(Antirrhinum majus) (금어초)), P12615 (아베나 사티바(Avena sativa) (귀리)), Q42968 (오리자 글라베리마(Oryza glaberrima) (아프리카벼)), Q43784 (마니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta) (카사바)), P0C585 (오리자 사티바(Oryza sativa) (벼)), Q00775 (솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) (감자)), P27736 (트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum) (밀)), Q43134 (소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor) (수수)), Q43092 (피숨 사티붐(Pisum sativum) (완두)), P84766 (애기롭스 타우시이(Aegilops tauschii) 아종 스트랑굴라타(strangulata) (염소풀)), Q0DEV5 (오리자 사티바 아종 자포니카(japonica) (벼)), Q42857 (이포모에아 바타타스(Ipomoea batatas) (고구마), P84633 (파고피륨 에스쿨렌툼(Fagopyrum esculentum) (메밀)), P84765 (세칼레 세레알레(Secale cereale) (호밀)), Q9MAQ0 (아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)), P09842 (호르데움 불가레(Hordeum vulgare) (보리), 또는 A2Y8X2 (오리자 사티바 아종 인디카(indica) (벼)의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 메이즈 이외의 식물 내에서 오르토로그 SSIIa 유전자는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하고, SSIIa 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 오르토로그는 각각 그 전부가 본원에 참조로 포함된 UniProt 엔트리 번호 V6BPG5 (트리티쿰 우라르투(Triticum urartu) (적색 야생밀)), V6BPN2 (트리티쿰 모노코쿰(Triticum monococcum) 아종 모노코쿰(Monococcum)), C3W8L4 (호르데움 불가레 변종 디스티쿰(distichum) (맥주보리)), E2GHR4 (오리자 사티바 아종 인디카 (벼)), 또는 E2GHR6 (오리자 사티바 아종 자포니카 (벼))의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중간체 wx 돌연변이체 및 열성 su2 돌연변이체를 갖는 이중 돌연변이체 식물을 생산하기 위해, 중간체 wx 돌연변이체를 갖는 식물, 및 열성 su2 돌연변이체를 갖는 식물 사이의 타가 수분을 이룰 수 있다.
예를 들어, 타가 수분은 동형접합성 wxS 돌연변이체 (wxSwxSSU2SU2) 또는 이형접합성 wxS 돌연변이체 (wxSWxSU2SU2)와 동형접합성 왁시 su2 돌연변이체 (wxwxsu2su2) 또는 이형접합성 왁시 su2 돌연변이체 (wxWxsu2su2 또는 wxwxSU2su2) 사이에서 이루어질 수 있다. 타가 수분 후에, wxSwxSU2su2의 유전자형을 갖는 F1 세대의 자가 수분을 사용하여 F2 식물을 생성할 수 있다. 내배유 내에 0, 1, 2, 또는 3 도스의 wxS 유전자, 및 3 도스의 열성 su2 유전자를 갖는 식물이 따라서 단리될 수 있다 (예를 들어, wxwxwxsu2su2su2, wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwSsu2su2su2의 유전자형을 갖는 내배유). 이것은 단지 육종 방법의 하나의 예이고, 다른 육종 계획이 사용될 수 있고 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1 도스의 중간체 왁시 대립유전자 및 열성 슈가리-2 대립유전자를 갖는 내배유를 갖는 식물의 재배지 생산은 자성 메이즈 식물을 웅성 메이즈 식물과 교배함으로써 수행한다. 대표적인 식재 배열은 1개의 웅성열 대 수개의 자성열이다. 자성열은 관련 기술분야에 공지된 다양한 다른 수단, 예컨대 세포질 또는 유전적 수단을 통해 웅수제거되거나 웅성 불임으로 된다.
본 발명에서 이용되는 전분은 근교계로부터 얻을 수 있거나, 전분은 중간체 왁시/열성 su2 이중 돌연변이체를 함유하는 근교배체로부터 유래된 잡종으로부터 얻을 수 있다. 메이즈가 본원에서 찰전분의 공급원에 대한 예시적인 식물이지만, 본 발명은 중간체 왁시 유전자 및 열성 su2 유전자를 갖는 한 예를 들어 찹쌀, 찰보리 및 찰수수와 같은 다른 식물 종에 또한 적용가능하다.
육종 방법
본 발명의 식물을 제조하기 위해, 적합한 육종 또는 선택 방법을 사용할 수 있다. 인기있는 선택 방법은 일반적으로 계통 선택, 변형된 계통 선택, 집단 선택, 순환 선택, 및 역교배 육종을 포함한다.
방임 수분 집단. 호밀, 많은 메이즈 및 사탕무, 목초, 콩과식물, 예컨대 알팔파 및 클로버, 및 열대 나무 작물, 예컨대 카카오, 코코넛, 기름 야자 및 일부 고무와 같은 작물의 방임 수분 집단의 개선은 본질적으로, 높은 (그러나 최대에서는 먼) 정도의 이형접합성을 유지하면서 유전자-빈도를 우호한 대립유전자의 고정을 향해 변화시키는 것에 의존한다. 그러한 집단 내에서 균일성은 불가능하고, 방임 수분 품종에서 전형성은 전체로서의 집단의 통계적 특징이고, 개별 식물의 특징은 아니다. 따라서, 방임 수분된 집단의 이질성은 근교계, 클론 및 잡종의 동질성 (또는 따라서 사실상 그러한)과 대조된다.
집단 개선 방법은 자연적으로, 순수하게 표현형 선택에 기초한 군 (보통 집단 선택으로 불림), 및 자손체 시험을 사용하는 선택에 기초한 군의 2개의 군으로 나누어진다. 집단간 개선은 유전자가 한 집단에서 또 다른 집단으로 흐르는 것을 허용하는 방임 육종된 집단의 개념을 이용한다. 하나의 집단 (재배종, 계통, 생태형, 또는 임의의 생식질 공급원) 내의 식물은 다른 집단의 식물과 자연적으로 (예를 들어, 바람에 의해) 또는 손에 의해 또는 벌 (흔히 아피스 멜리페라 엘.(Apis mellifera L.) 또는 메가칠레 로툰다타 에프.(Megachile rotundata F.))에 의해 교배된다. 선택은 양쪽 공급원으로부터 바람직한 형질을 갖는 식물을 단리함으로써 한 (또는 때때로 둘 다의) 집단(들)을 개선하기 위해 적용된다.
기본적으로 방임 수분된 집단 개선의 2가지 주요 방법이 존재한다. 먼저, 집단이 선택된 선택 절차에 의해 집단으로서 변화되는 상황이 존재한다. 결과는 단리 상태에서 그 자체 내에서 무작위-교배에 의해 무한하게 번식가능한 개선된 집단이다. 두 번째로, 합성 품종은 집단 개선과 동일한 최종 결과를 보유하지만, 그 자체는 번식가능하지 않고; 모 식물계 또는 클론으로부터 재구성되어야 한다. 방임 수분된 집단을 개선하기 위한 이들 식물 육종 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 타가 수분된 식물을 개선하기 위한 일상적으로 사용되는 육종 절차의 포괄적 검토는 다음을 포함한 무수한 문헌 및 논문에 제공되어 있다: [Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, Inc. (1960)]; [Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman Group Limited (1979)]; [Hallauer and Miranda, Quantitative Genetics in Maize Breeding, Iowa State University Press (1981)]; 및 [Jensen, Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc. (1988)].
집단 선택. 집단 선택에서, 바람직한 개별 식물을 선택하고, 수확하고, 다음 세대를 생산하기 위해 자손체 시험 없이 종자를 생산하였다. 선택은 단지 모계 식물에만 기초로 하고 수분에 대한 제어가 없으므로, 집단 선택은 선택을 갖는 무작위 교배의 형태에 이른다. 본원에 기술된 바와 같이, 집단 선택의 목적은 집단 내에서 우수한 유전자형의 비율을 증가시키기 위한 것이다.
합성. 합성 품종은 모든 가능한 잡종 조합 내에서 우수한 조합 능력에 대해 선택된 많은 유전자형을 동일 육종간에 교배하고, 방임 수분에 의해 품종을 후속적으로 유지함으로써 생산된다. 모 식물이 (다소간의 근교배된) 종자-번식 식물계인지 여부는 일부 사탕무 및 콩 (비시아(Vicia)) 또는 클론에서와 같이, 목초, 클로버 및 알팔파에서와 같이, 원칙적으로 차이가 없다. 모 식물은 때때로 시험 교배 또는 톱교배에 의해, 보다 일반적으로 다교배에 의해 일반적인 조합 능력을 기초로 하여 선택된다. 모 종자 계열은 의도적으로 근계교배될 수 있다 (예를 들어, 자가교배 또는 형매 교배에 의해). 그러나, 모 식물이 의도적으로 근계교배되지 않더라도, 계통 유지 동안 계통 내의 선택은 일부의 근계교배가 발생하는 것을 보장할 것이다. 클론 모 식물은 물론 변하지 않고 높은 이형접합성 상태로 유지될 것이다.
합성 품종이 모 종자 생산지로부터 농부까지 직접 전달될 수 있는지 또는 먼저 1 또는 2회 사이클의 번식을 거쳐야 하는지의 여부는 종자 생산 및 종자에 대한 수요의 규모에 따라 결정된다. 실제로는, 목초 및 클로버는 일반적으로 1회 또는 2회 번식되고, 따라서 본래의 합성 품종으로부터 상당해 제거된다.
집단 선택이 때때로 사용되지만, 그의 처리 단순성 및 목적, 즉 합성 품종에서 일반적인 조합 능력의 이용에 대한 분명한 관련성 때문에 자손체 시험이 다교배에 대해 일반적으로 바람직하다.
합성 품종에 도입되는 모 식물계 또는 클론의 수는 크게 상이하다. 실제로, 모 식물계의 수는 10 내지 수백개이고, 100-200개가 평균이다. 100개 이상의 클론으로부터 형성된 광범위한 합성 품종은 편중된 합성 품종보다 종자 번식 동안 더 안정할 것으로 예상된다.
계통 품종. 계통 품종은 분리 집단으로부터 개별 식물의 선택, 이어서 자가 수분된 자손의 번식 및 종자 증가 및 수 세대에 걸친 유전자형의 유의한 시험으로부터 개발된 우수한 유전자형이다. 이것은 자연적으로 자가 수분하는 종에서 잘 적용되는 방임 수분 방법이다. 상기 방법은 품종 개발에서 집단 선택과 조합하여 사용될 수 있다. 조합 사용되는 계통 및 집단 선택에서의 변이가 자가 수분된 작물에서 품종을 생성하기 위한 가장 보편적인 방법이다.
잡종. 잡종은 상이한 유전자형의 모 식물 사이의 교배에 의해 생성된 개별 식물이다. 상업적인 잡종은 이제 옥수수 (메이즈), 수수, 사탕무, 해바라기 및 브로콜리를 비롯한 많은 작물에서 광범하게 사용된다. 잡종은 2개의 모 식물을 직접 교배함으로써 (단교배 잡종), 단교배 잡종을 또 다른 모 식물과 교배함으로써 (3원 또는 삼중 교배 잡종), 또는 2개의 상이한 잡종을 교배함으로써 (4원 또는 복교배 잡종)를 비롯한 많은 상이한 방식으로 형성할 수 있다.
계통 선택. 계통 육종은 자가 수분하는 작물 또는 타가 수분하는 작물의 근교계를 개선하기 위해 통상적으로 사용된다. 우래한 상보성 형질을 갖는 2개의 모 식물을 교배하여 F1을 생산한다. F2 집단은 하나 또는 수개의 F1을 자가수정시키거나 또는 2개의 F1을 이계교배 (형매 교배)시킴으로써 생산된다. 이성반수체 육종 방법 또는 다른 배수성 감소 기술이 또한 사용될 수 있다. 최고 개체의 선택은 대체로 F2 집단에서 시작되고; 이어서, F3에서, 최고 패밀리 내에서 최고의 개체가 선택된다. 패밀리, 또는 상기 패밀리의 개체를 수반하는 잡종 조합물에 대한 반복 시험은 종종 낮은 유전성을 갖는 형질에 대한 선택의 유효성을 개선하기 위해 F4 세대에서 시행된다. 근계교배의 진행된 시기 (즉, F6 및 F7)에서, 최고의 식물 계통 또는 표현형이 유사한 계통의 혼합물이 새로운 재배종의 잠재적인 배출에 대해 시험된다. 유사하게, 이성반수체 시스템을 통한 새로운 재배종의 개발은 재배종의 선택, 이어서 반복 시험지에서 2 내지 5년의 시험을 필요로 한다.
역교배 육종. 역교배 육종은 간단하게 유전되는, 고도로 유전가능한 형질에 대한 유전자를 바람직한 동형접합성 재배종 또는 반복친인 근교계 내로 전달하기 위해 사용되어 왔다. 전달되는 형질의 공급원은 공여친으로 불린다. 생성되는 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 특질 및 공여친으로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 초기 교배 후에, 공여친의 표현형을 갖는 개체를 선택하고 반복친에 반복적으로 교배 (역교배)시킨다. 생성되는 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 특질 및 공여친으로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다.
집단 분리 분석 ( BSA). BSA, 일명 집단화 분리 분석, 또는 집단 분리개체 분석은 마이클모어(Michelmore) 등에 의해 기재되어 있다 (Michelmore et al., 1991, Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 99:9828-9832) 및 [Quarrie et al., 1999, Journal of Experimental Botany, 50(337):1299-1306).
관심 형질의 BSA를 위해, 특정의 상이한 표현형을 갖는 모 식물계가 선택되고, QTL 분석으로 F2, 배가 반수체 또는 재조합 근교배체 집단을 생성하기 위해 교배된다. 이어서, 집단은 형질의 높은 또는 낮은 발현을 갖는 개별 식물 또는 계통을 확인하기 위해 표현형이 결정된다. 2개의 DNA 집단을 제조하며, 여기서 한 집단은 한 표현형 (예를 들어, 바이러스에 대한 내성)을 갖는 개체의 집단이고, 다른 집단은 반대되는 표현형 (예를 들어, 바이러스에 대한 감수성)을 갖는 개쳉 집단이고, 분자 마커를 사용하여 대립유전자 빈도에 대해 분석된다. 마커가 우성이면 (예를 들어, RAPD), 단지 몇몇 개체만이 각각의 집단 (예를 들어, 각각 10개의 식물)에 필요하다. 마커가 공동-우성이면 (예를 들어, RFLP), 보다 많은 개체가 필요하다. 표현형과 연관된 마커가 확인되고, 육종 또는 QTL 매핑을 위해 사용될 수 있다.
게놈 내의 표적화 유도된 국소 병변 ( 틸링(TILLING)®). 본원의 육종 계획은 틸링® 식물 재배종과의 교배를 포함할 수 있다. 틸링®은 특정 유전자 내의 돌연변이의 유도된 확인을 허용하는 분자생물의 방법이다. 틸링®은 모델 식물 아라비돕시스 탈리아나를 사용하여 2000년도에 도입되었다. 틸링®은 그 이후에 다른 유기체, 예컨대 제브라피쉬, 옥수수, 밀, 쌀, 대두, 토마토 및 브라시카 라파(Brassica rapa) 변종 니포시니카(nipposinica)에서 역 유전학 방법으로 사용되고 있다.
이 방법은 화학적 돌연변이 유발원 (예를 들어, 에틸 메탄술포네이트 (EMS))를 사용하는 돌연변이 유발의 효율적인 표준 기술을, 표적 유전자 내의 단일 염기 돌연변이 (점 돌연변이로도 언급됨)를 확인하는 감수성 DNA 스크리닝-기술과 조합한다. 에코틸링(EcoTILLING)은 대체로 집단 유전자 분석을 위해 개체 내의 자연 돌연변이를 찾기 위해 틸링® 기술을 사용하는 방법이다 (각각 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Comai, et al., 2003 The Plant Journal 37, 778-786]; [Gilchrist et al. 2006 Mol. Ecol. 15, 1367-1378]; [Mejlhede et al. 2006 Plant Breeding 125, 461-467]; [Nieto et al. 2007 BMC Plant Biology 7, 34-42] 참조). 데코틸링 (DEcoTILLING)은 단편을 확인하기 위해 저비용 방법을 사용하는 틸링® 및 에코틸링의 변형이다 (Garvin et al., 2007, DEco-TILLING: An inexpensive method for SNP discovery that reduces ascertainment bias. Molecular Ecology Notes 7, 735-746).
틸링® 방법은 다양한 대립유전자 (이형접합체 또는 다양한 동형접합체 및 이형접합체의 풀에서 유래될 수 있음)가 PCR에서 증폭되고, 가열된 후, 서서히 냉각될 때 형성되는 이종이중체의 형성에 의존한다. "버블"이 2개의 DNA 가닥의 미스매치 (틸링®에서의 유도된 돌연변이 또는 에코틸링에서의 자연 돌연변이 또는 SNP)에서 형성된 후, 단일 가닥 뉴클레아제에 의해 절단된다. 생성물은 이어서 여러 상이한 플랫폼에서 크기에 의해 분리된다.
틸링®의 방법 및 조성물에 대한 보다 상세한 설명은 각각 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 US 5994075, US 2004/0053236 A1, WO 2005/055704, 및 WO 2005/048692에서 볼 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 육종 방법은 하나 이상의 확인된 돌연변이를 갖는 하나 이상의 틸링® 식물 계통을 사용한 육종을 포함한다.
돌연변이 육종. 돌연변이 육종은 새로운 형질을 식물 내로 도입하기 위한 또 다른 방법이다. 자발적으로 발생하거나 인공적으로 유도되는 돌연변이는 식물 육종가들에게 유용한 변이 공급원일 수 있다. 인공 돌연변이 유발의 목표는 요구되는 특징을 위한 돌연변이의 비율을 증가시키는 것이다. 돌연변이 비율은 온도, 장기간 종자 보관, 조직 배양 조건, 방사선 (예컨대 X선, 감마선, 중성자, 베타선, 또는 자외선), 화학적 돌연변이 유발원 (예컨대 5-브로모-우라실과 같은 염기 유사체), 항생제, 알킬화제 (예컨대 황 머스타드, 질소 머스타드, 에폭시드, 에틸렌아민, 술페이트, 술포네이트, 술폰, 또는 락톤), 아지드, 히드록실아민, 아질산 또는 아크리딘을 포함하는 많은 상이한 수단 또는 돌연변이제에 의해 증가될 수 있다. 요구되는 형질이 돌연변이 유발을 통해 관찰되면, 형질은 전통적인 육종 기술에 의해 기존의 생식질 내로 통합될 수 있다. 돌연변이 육종에 대한 상세한 내용은 문헌 [W. R. Fehr, 1993, Principles of Cultivar Development, Macmillan Publishing Co.]에서 볼 수 있다. 새로운 육종 기술, 예컨대 징크 핑거(Zinc Finger) 뉴클레아제 또는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발의 사용을 수반하는 기술이 또한 유전적 가변성을 생성하고 새로운 형질을 품종 내로 도입하기 위해 사용될 것이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이 육종은 단일 유전자좌 전환을 포함한다. 단일 유전자좌는 동일한 발현 벡터 내에 제초제 내성에 대한 트랜스진을 또한 함유하는, 여러 개의 유전자 및/또는 트랜스진, 예컨대 질병 내성을 위한 트랜스진을 함유한다. 제초제 내성에 대한 유전자는 선택가능 마커로서 및/또는 표현형 형질로서 사용될 수 있다. 부위 특이적 통합 시스템의 단일 유전자좌 전환은 전환된 유전자좌에서 다중 유전자의 통합을 허용한다. 단일 유전자좌 전환은 또한 하나 이상의 부위 특이적 변화를 식물 게놈에서 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 유전자좌 전환은 게놈 편집, 일명 조작된 뉴클레아제를 사용한 게놈 편집 (GEEN)에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집은 하나 이상의 조작된 뉴클레아제의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 및 조작된 메가뉴클레아제 재-조작된 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 단일 유전자좌 전환은 식물 게놈의 1개 또는 수개의 핵산을 변경한다.
배가 반수체 및 염색체 배가. 2개의 모 식물계를 교배한 후, 분리 자손체의 오랜 선택, 및/또는 다중 역-교배를 필요로 하지 않으면서 동형접합성 식물을 얻기 위한 하나의 방식은 반수체를 생산한 후, 염색체를 배가시켜 배가 반수체를 형성하는 것이다. 반수체 식물은 자발적으로 발생할 수 있거나, 화학적 처리를 통해 또는 식물을 유도제 계통과 교배함으로써 인공적으로 유도될 수 있다 ([Seymour et al. 2012, PNAS vol 109, pg 4227-4232]; [Zhang et al., 2008 Plant Cell Rep. Dec 27(12) 1851-60]). 반수체 자손체의 생산은 배우자 형성 동안 염색체의 분포에 영향을 미칠 수 있는 다양한 기전을 통해 일어날 수 있다. 반수체의 염색체 상보체는 때때로 자발적으로 배가하여 동형접합성 배가 반수체 (DH)를 생산한다. 상이한 배수성을 갖는 세포를 함유하는 식물인 혼수체가 때때로 발생할 수 있고, 배가 반수체 조직, 기관, 싹, 꽃 부분 또는 식물을 자발적으로 생산하도록 염색체 배가를 겪는 식물을 나타낼 수 있다. 또 다른 일반적인 기술은 염색체 배가 처리, 예컨대 콜키신을 사용하여 배가 반수체 식물의 형성을 유도하는 것이다 (El-Hennawy et al., 2011 Vol 56, issue 2 pg 63-72]; [Doubled Haploid Production in Crop Plants 2003 edited by Maluszynski ISBN 1-4020-1544-5). 배가 반수체 식물의 생산은 고도로 균일한 재배종을 생산하고, 세대가 보다 긴 작물의 유성 근계교배의 대안으로서 특히 바람직하다. 배가 반수체 자손체를 생산함으로써, 유전되는 형질에 대한 가능한 유전자 조합의 수는 보다 잘 처리될 수 있다. 따라서, 효율적인 배가 반수체 기술은 근교배체 및 재배종 개발의 시간 및 비용을 유의하게 감소시킬 수 있다.
원형질체 융합. 식물을 육종하기 위한 또 다른 방법으로, 형질-부여 게놈 물질을 공여자 식물로부터 수용자 식물로 전달하기 위해 원형질체 융합을 또한 사용할 수 있다. 원형질체 융합은 유도된 또는 자발적 결합, 예컨대 단일 이핵성- 또는 다핵성 세포를 생산하는, 2개 이상의 원형질체 (효소 처리에 의해 세포벽이 제거된 세포) 사이의 체세포 혼성화이다. 심지어 자연에서 이종교배될 수 없는 식물 종을 사용하여 얻을 수 있는 융합된 세포는 바람직한 형질의 조합을 나타내는 잡종 식물로 조직 배양된다.
조직 배양물. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조직 배양물"은 식물의 부분으로 조직화되는 동일한 또는 상이한 종류의 단리된 세포 또는 상기 세포의 집합체를 포함하는 조성물을 나타낸다. 조직 배양물의 예시적인 종류는 식물 또는 식물의 부분, 예컨대 배, 화분, 꽃, 종자, 잎, 줄기, 뿌리, 근단, 꽃밥, 암술, 분열조직 세포, 곁눈, 씨방, 종피, 내배유, 배축, 떡잎 등에서 무손상 상태인, 조직 배양물을 생성할 수 있는 원형질체, 캘루스, 식물 무리, 및 식물 세포이다. 식물 조직 배양물을 제조하고 유지하는 수단은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예로서, 기관을 포함하는 조직 배양물이 재생된 식물을 생산하기 위해 사용되었다. 미국 특허 번호 5,959,185, 5,973,234, 및 5,977,445는 특정 기술을 기재하고 있고, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 하기 실시예 및 실시양태에 의해 추가로 예시된다. 본원 전체에 걸쳐서 언급되는 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원, 및 도면 및 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다.
실시양태
1. 아밀로스/아밀로펙틴 검정 키트를 사용하여 측정 시 약 2 wt% 내지 약 20 wt%의 아밀로스 함량; 및
RVA 분석을 사용하여 측정 시 대조군 전분의 전분 페이스트화 온도보다 적어도 약 5% 더 높은 수성 전분 페이스트화 온도
를 포함하는 전분이며, 내배유 내에 적어도 1종의 wxS 대립유전자를 포함하는 왁시-슈가리 2 옥수수 식물로부터 유래되는 전분.
2. 실시양태 1에 있어서, 아밀로스 함량이 약 8 wt% 내지 약 15 wt%인 전분.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 수성 페이스트화 온도가 대조군 전분보다 약 5% 내지 약 14% 더 높은 것인 전분.
4. 실시양태 1-3 중 어느 한 실시양태에 있어서, RVA 분석을 사용하여 측정 시 대조군 전분의 결정화도의 엔탈피 변화보다 적어도 약 30% 더 높은 결정화도의 엔탈피 변화를 추가로 포함하는 전분.
5. 실시양태 4에 있어서, 결정화도의 엔탈피 변화가 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정 시 대조군 전분의 결정화도의 엔탈피 변화보다 약 70% 내지 약 200% 더 큰 것인 전분.
6. 실시양태 1-4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 전분의 5 마이크로미터 미만의 과립 비율에 비해 적어도 약 40% 더 적은 5 마이크로미터 미만의 과립을 포함하는 전분 과립 크기의 분포를 추가로 포함하는 전분.
7. 실시양태 1-6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 전분에 비해 증가된 완전성을 나타내는 과립인 전분.
8. 실시양태 1-7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 3회의 동결-해동 사이클을 견딜 수 있는 전분.
9. 실시양태 8에 있어서, 적어도 3회 내지 적어도 5회의 동결-해동 사이클을 견딜 수 있는 전분.
10. 실시양태 1-9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물이 wxwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제1 옥수수 식물, 및 wxSwxSsu2su2의 유전자형 또는 wxSwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제2 옥수수 식물의 타가 수분에 의해 생성되는 것인 전분.
11. 실시양태 1-10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물의 내배유가 1 도스, 2 도스, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 갖고, 내배유가 wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2의 유전자형을 갖는 것인 전분.
12. 적어도 1종의 wxS 대립유전자를 찰옥수수 식물의 내배유 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 내배유 내에 적어도 1종의 wxS 대립유전자를 포함하는 찰옥수수 식물로부터 유래된 생성되는 전분이 RVA 분석을 사용하여 측정 시 대조군 전분의 전분 페이스트화 온도보다 적어도 약 5% 더 높은 수성 전분 페이스트화 온도를 포함하여, 대조군 전분에 비해 전분의 페이스트화 프로파일의 적어도 1종의 특징을 개선하는 것인, 전분의 페이스트화 프로파일의 적어도 1종의 특징을 개선하는 방법.
13. 이중-돌연변이체 옥수수 식물이 전분 합성효소 IIa (su2) 유전자에 대해 동형접합성 열성이고, 돌연변이된 과립 결합 전분 합성효소 I (GBSSI) 유전자에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이며, 여기서 돌연변이된 GBSSI 유전자는 야생형 GBSSI 유전자 (Wx)보다 작은 GBSSI 활성을 갖지만, 열성, 기능 상실 GBSSI 유전자 (wx)보다는 더 높은 GBSSI 활성을 갖는 것인 이중-돌연변이체 옥수수 식물.
14. 실시양태 13에 있어서, 돌연변이된 GBSSI 유전자가 wx - 스토너 (wxS) 대립유전자인 이중-돌연변이체 옥수수 식물.
15. 실시양태 14에 있어서, wxwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제1 옥수수 식물, 및 wxSwxSsu2su2의 유전자형 또는 wxSwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제2 옥수수 식물의 타가 수분에 의해 생성되는 이중-돌연변이체 옥수수 식물.
16. 실시양태 15에 있어서, 옥수수 식물의 내배유가 1 도스, 2 도스, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 가지며, 여기서 내배유가 wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2의 유전자형을 갖는 것인 이중-돌연변이체 옥수수 식물.
17. 실시양태 13-16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 옥수수 식물의 내배유에서 생산된 전분이 wxwxwxsu2su2su2의 유전자형을 갖는 이중, 왁시 슈가리-2 열성 돌연변이체 옥수수 식물의 내배유에서 생산된 전분에 비해 더 높은 페이스트화 온도를 갖는 것인 이중-돌연변이체 옥수수 식물.
18. 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물의 종자.
19. 실시양태 13-18 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물의 식물 부분, 식물 세포, 또는 조직 배양물.
20. 실시양태 19에 있어서, 내배유, 잎, 꽃, 배주, 화분, 근경, 및 접가지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식물 부분.
21. 실시양태 13-20 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물의 내배유로부터 전분을 얻는 것을 포함하는, 전분의 생산 방법.
22. 실시양태 13-21 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물을 성장시키고, 이중-돌연변이체 옥수수 식물로부터 종자를 수확하는 것을 포함하는, 전분의 생산 방법.
23. 제1 모 옥수수 식물을 제2 모 옥수수 식물과 교배하고, 생성되는 옥수수 종자를 수확하는 것을 포함하며, 여기서 상기 제1 모 옥수수 식물 및/또는 제2 모 옥수수 식물은 실시양태 13-22 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물인 옥수수 종자의 생산 방법.
24. 실시양태 13-23 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물을 자가 수분시키고, 생성되는 옥수수 종자를 수확하는 것을 포함하는, 옥수수 종자의 생산 방법.
25. 실시양태 1-11 중 어느 한 실시양태의 식물의 부분을 수거하고, 상기 부분으로부터 식물을 재생시키는 것을 포함하는, 실시양태 13-24 중 어느 한 실시양태의 옥수수 식물을 영양 번식시키는 방법.
26. 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물로부터 유래된 자손체 식물을 생산하기 위해 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물을 적어도 1회 자가 수분시키는 것을 포함하는, 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물로부터 유래된 옥수수 식물의 생산 방법.
27. 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물로부터 유래된 자손체 식물을 생산하기 위해 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물을 제2 옥수수 식물과 교배하는 것을 포함하는, 실시양태 1-11 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물로부터 유래된 옥수수 식물의 생산 방법.
28. 트랜스진을 옥수수 식물 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 트랜스진은 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물의 요구되는 표현형을 부여하는 것인, 옥수수 식물의 생산 방법.
29. 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물의 요구되는 표현형을 부여하는 유전자 서열을 생산하기 위한 유전자-편집을 포함하는, 옥수수 식물의 생산 방법.
30. 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 식물의 요구되는 표현형을 부여하는 유전자 서열을 생산하기 위한 돌연변이를 도입하는 것을 포함하는, 옥수수 식물의 생산 방법.
31. 실시양태 13-17 중 어느 한 실시양태의 이중-돌연변이체 옥수수 식물로부터 추출된 전분.
32. 실시양태 15의 이중-돌연변이체 옥수수 식물로부터 추출된 전분.
33. 실시양태 16의 이중-돌연변이체 옥수수 식물의 내배유로부터 추출된 전분.
실시예 1
1, 2, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 갖는 곡물의 생성
모계 식물로부터의 2개의 극성 핵이 부계 식물로부터의 1개의 정자 세포에 의해 수정되는 옥수수 내배유의 삼배체 특성 때문에, 3개의 유전자형 조합이 가능하다. wxSwxSsu2su2 식물을 자성 식물로 사용할 때, 이것이 wxwxsu2su2 웅성 식물에 의해 수분되면 '도스-2' 또는 wxSwxSwxsu2su2su2 곡물이 생성된다. wxSwxSsu2su2를 웅성 식물로 사용할 때, wxwxsu2su2 자성 식물의 수분은 '도스-1' 또는 wxSwxwxsu2su2su2 곡물을 생성한다. wxSwxSsu2su2의 자가 수분은 '도스-3' 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2 곡물을 생성한다.
Figure pat00002
실시예 2
래피드 비스코 애널라이저 (RVA)를 사용한 전분의 점도
열성 슈가리-2 돌연변이체 식물 내에 0, 1, 2, 및 3 도스의 wxS 대립유전자를 포함하는 식물로부터 유래된 메이즈 전분의 점도는 래피드 비스코 아밀로그래프 (Rapid Visco Amylograph) (뉴포트 사이언티픽, 미네소타주 에덴 프레리)를 사용하여 결정하였다. 아미오카™ 전분 및 wxwxwxSU2su2su2 전분이 대조용으로 포함되었다. 전분이 그로부터 단리된 내배유의 유전자형을 아래 표에 요약한다. 아밀로스 함량은 메가자임® 아밀로스 키트를 사용하여 측정하였다. 전분의 아밀로스 함량은 GBSSI 활성 증가와 함께 증가한다. wxwxwxsu2su2su2 전분 (7.4%), 아미오카™ 전분 (7.1%), 및 wxwxwxSU2su2su2 전분 (6.1%)의 아밀로스 함량은 왁시 스토너 (12.8%) 및 내배유 내에 1 내지 3 도스의 wxS 유전자를 갖는 wxwxwxsu2su2su2 전분 (8.2-14.6%)보다 더 낮았다. wxwxwxsu2su2su2 전분의 아밀로스 함량 (7.4%, 8.2%, 13.8%, 및 14.6%)은 wxS 용량의 증가 (각각 0, 1, 2, 및 3 도스의 wxS)와 함께 증가하였다. 이 결과는 wxwxwxsu2su2su2에 대한 wxS 유전자의 도입이 전분의 아밀로스 함량을 경미하게 증가시킴을 시사하였다.
Figure pat00003
찰옥수수 전분의 페이스트화 특성은 "스탠다드(Standard) 2" 프로파일 방법을 사용하여 래피드 비스코-애널라이저 (RVA, 뉴포트 사이언티픽, 호주 시드니)를 사용하여 분석하였다. 8% 전분 (w/w, 무수 전분 기준, dsb)을 함유하는 현탁액 (28.0 g)을 50℃에서 1 min 동안 평형화하고, 6℃/min의 속도로 95℃로 가열하고, 95℃에서 5 min 동안 유지한 후, 6℃/min의 속도로 50℃로 냉각하였다. 패들 회전 속도는 960 rpm이 처음 10 s 동안 사용된 것을 제외하고, 160 rpm이었다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 제시한다. 기존의 wxwxwxsu2su2su2 전분은 최저 페이스트화 온도, 최고 점도, 및 최종 점도를 가졌다. wxwxwxsu2su2su2 전분 내로 wxS 유전자를 도입한 후, 전분 샘플 (Q3017a [1 wxS], Q8412a [2 wxS], 및 Q7738a [3 wxS])은 기존의 wxwxwxsu2su2su2 전분 (0 wxS)에 비해 증가된 최고 점도를 보였다. 그러나, 1 도스의 wxS 유전자를 갖는 wxSwxwxsu2su2su2 전분만이 왁시 스토너, 아미오카™ 전분, 및 wxwxwxSU2su2su2 전분보다 훨씬 더 높은 최고 점도를 보였다.
결과는 페이스트화 온도의 개선이 습식-밀링 공정을 통한 전분 추출을 가능하게 함을 나타낸다.
실시예 3
전분의 동결-해동 안정성
열성 슈가리-2 돌연변이체 식물 내에 0, 1, 2, 및 3 도스의 wxS 대립유전자를 포함하는 식물로부터 유래된 메이즈 전분을 동결-해동 안정성에 대해 시험하였다. 아미오카™ 전분 및 wxwxwxSU2su2su2 전분은 대조용으로 포함된다. 전분 샘플 8% 고형분을 수조 내에서 95℃에서 20분 동안 조리하였다. 전분 슬러리를 유리 막대로 3분 동안 혼합한 후, 조리 동안 17분 동안 정지 상태에서 가열하였다. 중성 pH에서 전분 겔 (8%, w/w)의 동결-해동 안정성을 5회의 동결-해동 사이클에 대해 카론(Caron) 사이클링 냉동기를 사용하여 분석하였다. 각각의 사이클에서, 샘플을 2회 사이클/일로 6시간 동안 동결시키고 6시간 동안 해동시켰다. 샘플을 표면 상에서 및 압축 시에 둘 다에서 시네레시스에 대해, 및 불투명도 및 겔화 변화시각적으로 검사하였다. 상기 동결-해동 사이클을 반복하였다. 결과를 도 3에 제시한다. 제1 동결/해동 사이클 후에, 단지 왁시 스토너 전분 겔만이 높은 불투명도를 보였고, 이것은 고도의 전분 퇴화를 나타낸다. 전분 겔의 불투명도는 동결/해동 사이클의 증가와 함께 증가하였다. 제3 동결/해동 사이클에서, 아미오카™ 전분, wxwxwxSU2su2su2 전분, 및 왁시 스토너의 전분 겔은 매우 불투명해진 반면, Q3017a (1 wxS), Q8412a (2 wxS), Q7738a (3 wxS), 및 기존의 wxwxwxsu2su2su2 전분의 전분 겔은 계속 불투명도하지 않았다. 5회의 동결/해동 사이클 후에, Q3017a (1 wxS), Q8412a (2 wxS), Q7738a (3 wxS), 및 기존의 wxwxwxsu2su2su2 전분은 약간 불투명해졌다.
결과는 전분 샘플 내의 아밀로스의 증가가 동결/해동 안정성에 거의 영향을 주지 않음을 시사하였다. Q3017a (1 wxS), Q8412a (2 wxS), Q7738a (3 wxS) 전분은 wxwxwxSU2su2su2 전분 및 아미오카™ 전분보다 양호한 동결/해동 안정성을 가졌다.
실시예 4
시차 주사 열량계 (DSC) 시험
열성 슈가리-2 돌연변이체 식물 내에 0, 1, 2, 및 3 도스의 wxS 대립유전자를 함유하는 식물로부터 유래된 메이즈 전분의 열적 특성을 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 결정하였다. 아미오카™ 전분 및 wxwxwxSU2su2su2 전분이 대조용으로 포함되었다. 시차 주사 열량계 (DSC)는 특정된 온도에서 제어된 분위기 내의 샘플에 의해 흡수되거나 방출되는 열을 측정한다. DSC는 무정형 및 결정질 구조의 변화를 나타내는, 온도가 상승하면서 샘플의 비열 및 잠열에 대한 정보를 제공한다. 데이타는 열 유동의 측면에서 기록되고, 주울/그램 (J/g)으로 표시된다 (Cassel, 2002). 전분의 분석에서, 전분 젤라틴화 파라미터, 예컨대 피크 개시, 피크 온도, 피크 종료, 및 젤라틴화 엔탈피 변화 정보가 수집되었다. 결과를 도 4에 제시한다. wxSwxwxsu2su2su2 전분 (Q3017a), wxSwxSwxsu2su2su2 전분 (Q8412a), wxSwxSwxSsu2su2su2 전분 (Q7738a), 및 wxwxwxsu2su2su2 전분 (0 wxS)은 아미오카™ 전분, 왁시 스토너, 및 wxwxwxSU2su2su2 전분보다 더 낮은 젤라틴화 온도를 보였고, 이것은 1, 2, 및 3 도스의 wxS를 갖는 메이즈의 내배유로부터 단리된 전분의 보다 양호한 동결/해동 안정성과 일치한다. 1 도스의 wxS를 갖는 wxSwxwxsu2su2su2 전분 (Q3017a)은 다른 잡종 (Q8412a [2 wxS], Q7738a [3 wxS], 및 wxwxwxsu2su2su2 전분)보다 경미하게 더 높은 젤라틴화 개시 온도를 가졌고, 이것은 Q3017a가 다른 잡종보다 우수한 습식 밀링 특징을 가짐을 나타낸다.
실시예 5
전분 과립
열성 슈가리-2 돌연변이체 식물 내에 1, 2, 및 3 도스의 wxS 대립유전자를 포함하는 식물로부터 유래된 찰메이즈 전분의 평균 입자 크기는 레이저 광 산란에 의해 측정하였다. 아미오카™ 전분 및 wxwxwxSU2su2su2 전분이 대조용으로 포함되었다. 결과를 도 5에 제시한다. 또한, 각각의 샘플의 주사 전자 현미경 사진은 과립 형태를 보여주기 위해 도 6에 제시되었다. Q3017a (11.4 μm), Q8412a (11.4 μm), 및 Q7738a (10.9 μm)의 평균 전분 과립 크기는 기존의 wxwxwxsu2su2su2 전분 (10.4 μm)보다 더 컸고, 이것은 왁시 VO에 wxS 유전자를 도입하면 전분 과립 크기가 증가함을 시사하였다. 결과는 wxwxwxsu2su2su2 전분 내에 wxS 유전자의 도입이 전분 과립 완전성을 증가시킴을 보여주는 SEM 영상 (도 5)과 일치하였다.
달리 규정하지 않으면, 본원에서 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험 시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재된다. 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 논의되는 간행물은 단지 본원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제시된다. 본원에서 그 어느 것도 본 개시내용이 선행 발명에 의해 상기 간행물보다 먼저 이루어졌다고 말할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명은 그의 구체적인 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 추가의 변형이 가능하고, 본원은 본 발명이 속하는 기술에서 알려진 또는 통상적인 관례 내에서 이루어지고 상기 본원에서 제시되고 첨부되는 청구항의 범위를 따른 본질적인 특징에 적용될 수 있는 상기 본 개시내용의 변경을 비롯하여, 일반적으로 본 발명의 원칙을 따른 임의의 변경, 사용, 또는 변용을 포괄하는 것으로 의도됨이 이해될 것이다.
Figure pat00004
Figure pat00005
SEQUENCE LISTING <110> Ingredion Incorporated JIANG, Hongxin OSTRANDER , Brad LANE, Chris <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING STARCH WITH NOVEL FUNCTIONALITY <130> INGR-036/00US 317596-2045 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 605 <212> PRT <213> Zea mays <400> 1 Met Ala Ala Leu Ala Thr Ser Gln Leu Val Ala Thr Arg Ala Gly Leu 1 5 10 15 Gly Val Pro Asp Ala Ser Thr Phe Arg Arg Gly Ala Ala Gln Gly Leu 20 25 30 Arg Gly Ala Arg Ala Ser Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ser Met Arg Thr 35 40 45 Ser Ala Arg Ala Ala Pro Arg His Gln Gln Gln Ala Arg Arg Gly Gly 50 55 60 Arg Phe Pro Ser Leu Val Val Cys Ala Ser Ala Gly Met Asn Val Val 65 70 75 80 Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly 85 90 95 Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala Ala Asn Gly His Arg 100 105 110 Val Met Val Val Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp Asp 115 120 125 Thr Ser Val Val Ser Glu Ile Lys Met Gly Asp Gly Tyr Glu Thr Val 130 135 140 Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val Asp 145 150 155 160 His Pro Leu Phe Leu Glu Arg Val Trp Gly Lys Thr Glu Glu Lys Ile 165 170 175 Tyr Gly Pro Val Ala Gly Thr Asp Tyr Arg Asp Asn Gln Leu Arg Phe 180 185 190 Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ile Leu Ser Leu 195 200 205 Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val Phe 210 215 220 Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu Ser Cys Tyr Leu Lys Ser 225 230 235 240 Asn Tyr Gln Ser His Gly Ile Tyr Arg Asp Ala Lys Thr Ala Phe Cys 245 250 255 Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Asp Tyr Pro 260 265 270 Glu Leu Asn Leu Pro Glu Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile Asp 275 280 285 Gly Tyr Glu Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys Ala 290 295 300 Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly Cys Glu Leu Asp Asn Ile 325 330 335 Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val Ser 340 345 350 Glu Trp Asp Pro Ser Arg Asp Lys Tyr Ile Ala Val Lys Tyr Asp Val 355 360 365 Ser Thr Ala Val Glu Ala Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln Ala 370 375 380 Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Asn Ile Pro Leu Val Ala Phe Ile 385 390 395 400 Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ala Ala Ala Ile 405 410 415 Pro Gln Leu Met Glu Met Val Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly 420 425 430 Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Arg Met Leu Met Ser Ala Glu Glu Lys 435 440 445 Phe Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn Ala Ala Leu Ala 450 455 460 His His Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val Thr Ser Arg Phe 465 470 475 480 Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg Tyr Gly Thr Pro 485 490 495 Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr Ile Ile Glu Gly 500 505 510 Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp Cys Asn Val Val 515 520 525 Glu Pro Ala Asp Val Lys Lys Val Ala Thr Thr Leu Gln Arg Ala Ile 530 535 540 Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val Arg Asn Cys Met 545 550 555 560 Ile Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn Trp Glu Asn Val 565 570 575 Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Gly Gly Glu Pro Gly Val Glu Gly Glu 580 585 590 Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala Pro 595 600 605 <210> 2 <211> 729 <212> PRT <213> Zea mays <400> 2 Met Ser Ser Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Ser Thr Phe Phe Leu Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ser Ala Ser Pro Gly Gly Arg Arg Arg Ala Arg Val Gly Ser 20 25 30 Ser Pro Phe His Thr Gly Ala Ser Leu Ser Phe Ala Phe Trp Ala Pro 35 40 45 Pro Ser Pro Pro Arg Ala Pro Arg Asp Ala Ala Leu Val Arg Ala Glu 50 55 60 Ala Glu Ala Gly Gly Lys Asp Ala Pro Pro Glu Arg Ser Gly Asp Ala 65 70 75 80 Ala Arg Leu Pro Arg Ala Arg Arg Asn Ala Val Ser Lys Arg Arg Asp 85 90 95 Pro Leu Gln Pro Val Gly Arg Tyr Gly Ser Ala Thr Gly Asn Thr Ala 100 105 110 Arg Thr Gly Ala Ala Ser Cys Gln Asn Ala Ala Leu Ala Asp Val Glu 115 120 125 Ile Lys Ser Ile Val Ala Ala Pro Pro Thr Ser Ile Val Lys Phe Pro 130 135 140 Ala Pro Gly Tyr Arg Met Ile Leu Pro Ser Gly Asp Ile Ala Pro Glu 145 150 155 160 Thr Val Leu Pro Ala Pro Lys Pro Leu His Glu Ser Pro Ala Val Asp 165 170 175 Gly Asp Ser Asn Gly Ile Ala Pro Pro Thr Val Glu Pro Leu Val Gln 180 185 190 Glu Ala Thr Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Asp Glu Pro Asp 195 200 205 Glu Ala Lys Asp Asp Ser Arg Val Gly Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe 210 215 220 Glu His Tyr Gly Asp Asn Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val 225 230 235 240 Met Asn Val Ile Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr 245 250 255 Gly Gly Leu Gly Asp Val Val Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Arg 260 265 270 Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Val 275 280 285 Glu Ala Phe Asp Met Gly Ile Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Pro 290 295 300 Val Asn Tyr Phe His Ala Phe Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe Ile 305 310 315 320 Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Asp Asp Ile Tyr Gly Gly Ser 325 330 335 Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys Val Ala Val 340 345 350 Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Cys Tyr Gly Asp Gly 355 360 365 Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro Val 370 375 380 Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly Leu Met Gln Tyr Thr Arg 385 390 395 400 Ser Val Leu Val Ile His Asn Ile Ala His Gln Gly Arg Gly Pro Val 405 410 415 Asp Glu Phe Pro Tyr Met Asp Leu Pro Glu His Tyr Leu Gln His Phe 420 425 430 Glu Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His Ala Asn Ile Phe Ala Ala 435 440 445 Gly Leu Lys Met Ala Asp Arg Val Val Thr Val Ser Arg Gly Tyr Leu 450 455 460 Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile 465 470 475 480 Arg Ser Asn Asp Trp Lys Ile Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp His 485 490 495 Gln Glu Trp Asn Pro Lys Val Asp Val His Leu Arg Ser Asp Gly Tyr 500 505 510 Thr Asn Tyr Ser Leu Glu Thr Leu Asp Ala Gly Lys Arg Gln Cys Lys 515 520 525 Ala Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Glu Val Arg Asp Asp Val Pro 530 535 540 Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Asp Ile 545 550 555 560 Ile Gly Asp Ala Met Pro Trp Ile Ala Gly Gln Asp Val Gln Leu Val 565 570 575 Met Leu Gly Thr Gly Arg Ala Asp Leu Glu Arg Met Leu Gln His Leu 580 585 590 Glu Arg Glu His Pro Asn Lys Val Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser Val 595 600 605 Pro Met Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Val Leu Val Met Pro 610 615 620 Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val 645 650 655 Ala Pro Phe Asp Pro Phe Ser Asp Ala Gly Leu Gly Trp Thr Phe Asp 660 665 670 Arg Ala Glu Ala Asn Lys Leu Ile Glu Ala Leu Arg His Cys Leu Asp 675 680 685 Thr Tyr Arg Asn Tyr Glu Glu Ser Trp Lys Ser Leu Gln Ala Arg Gly 690 695 700 Met Ser Gln Asp Leu Ser Trp Asp His Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Asp 705 710 715 720 Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp 725

Claims (12)

  1. 아밀로스/아밀로펙틴 검정 키트를 사용하여 측정 시 약 2 wt% 내지 약 20 wt%의 아밀로스 함량; 및
    RVA 분석을 사용하여 측정 시 대조군 전분의 전분 페이스트화 온도보다 적어도 약 5% 더 높은 수성 전분 페이스트화 온도
    를 포함하는 전분이며, 내배유 내에 적어도 1종의 wxS 대립유전자를 포함하는 왁시-슈가리 2 옥수수 식물로부터 유래되는 전분.
  2. 제1항에 있어서, 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정 시 대조군 전분의 결정화도의 엔탈피 변화보다 적어도 약 30% 더 큰 결정화도의 엔탈피 변화를 추가로 포함하는 전분.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 전분의 5 마이크로미터 미만의 과립 비율에 비해 적어도 약 40% 더 적은 5 마이크로미터 미만의 과립을 포함하는 전분 과립 크기의 분포를 추가로 포함하는 전분.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰 시 대조군 전분에 비해 증가된 완전성을 나타내는 과립인 전분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 3회의 동결-해동 사이클을 견딜 수 있는 전분.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 왁시-슈가리(waxy-sugary) 2 옥수수 식물이 wxwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제1 옥수수 식물, 및 wxSwxSsu2su2의 유전자형 또는 wxSwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제2 옥수수 식물의 타가 수분에 의해 생성되는 것인 전분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 왁시-슈가리 2 옥수수 식물의 내배유가 1 도스(dose), 2 도스, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 갖고, 내배유가 wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2의 유전자형을 갖는 것인 전분.
  8. 이중-돌연변이체 옥수수 식물이 전분 합성효소 IIa (su2) 유전자에 대해 동형접합성 열성이고, 돌연변이된 과립-결합 전분 합성효소 I (GBSSI) 유전자에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이며, 여기서 돌연변이된 GBSSI 유전자는 야생형 GBSSI 유전자 (Wx)보다 작은 GBSSI 활성을 갖지만, 열성, 기능 상실 GBSSI 유전자 (wx)보다는 더 높은 GBSSI 활성을 갖는 것인 이중-돌연변이체 옥수수 식물로부터 추출된 전분.
  9. 제8항에 있어서, 돌연변이된 GBSSI 유전자가 wx - 스토너(wx - Stonor) (wxS) 대립유전자인 전분.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 식물이 wxwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제1 옥수수 식물, 및 wxSwxSsu2su2의 유전자형 또는 wxSwxsu2su2의 유전자형을 갖는 제2 옥수수 식물의 타가 수분에 의해 생성되는 것인 전분.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 옥수수 식물의 내배유가 1 도스, 2 도스, 또는 3 도스의 wxS 대립유전자를 가지며, 여기서 내배유가 wxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2, 또는 wxSwxSwxSsu2su2su2의 유전자형을 갖는 것인 전분.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 옥수수 식물의 내배유에서 생산된 전분이 wxwxwxsu2su2su2의 유전자형을 갖는 이중, 왁시 슈가리-2 열성 돌연변이체 옥수수 식물의 내배유에서 생산된 전분에 비해 더 높은 페이스트화 온도를 갖는 것인 전분.
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