KR101820401B1

KR101820401B1 - 경도가 증가된 토마토 과실

Info

Publication number: KR101820401B1
Application number: KR1020127013295A
Authority: KR
Inventors: 찰스 제임스 백스터; 나탈리 헬렌 채프먼; 이안 퍼드팻; 그레이엄 배런 시모어
Original assignee: 신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2018-02-28
Also published as: AU2010311726B2; IL218345A0; JP2013507977A; MA33733B1; US8987549B2; AU2010311726A1; MX2012004558A; WO2011051120A1; US20150237817A1; CA2773471A1; MX339382B; IL218345A; US10888056B2; EP2494055A1; US20190313594A1; CA2773471C; US10362741B2; US20120204284A1; EP2314704A1; KR20120104555A

Abstract

본 발명은 토마토 과실을 생성하는 재배된 식물에 적어도 하나의 유전 요소 (또는 양적 형질 유전자좌, QTL)를 포함함으로써 적어도 하나의 유전 요소와 연관되는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실에 관한 것이다. 과실 경도가 상당히 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물과 과실 경도의 상당한 증가와 연관되는 QTL의 검출 방법이 제공된다.

Description

경도가 증가된 토마토 과실{TOMATO FRUIT HAVING INCREASED FIRMNESS}

본 발명은 경도가 증가된 토마토 과실에 관한 것이다.

모든 과실 상품에 있어, 소비자의 기대를 만족시키거나 능가할 수 있는 용도에 적합한 과실 경도 (단단함, firmness)가 필요하다. 소비자는 맛과 색상 등 다른 품질 특성이 좋거나 우수하더라도 과실 경도가 허용될 수 없는 상품은 거부할 것이다. 또한, 공급망(supply chain)은 소매판매점에 고품질의 과실을 효과적으로 운반하기에 적합한 과실 경도가 필요하다. 원료의 품질을 개선하여 건강 식품(healthier diets)의 개발을 촉진할 수도 있을 것이다.

토마토는 광범위한 유전 자원과 게놈 자원에 의해 과실 성숙 연구에 이용되는 모델 시스템이다. 토마토 과실 경도는 세포벽 구조, 팽압 및 각피(큐티클) 특성 등 많은 요인에 의해 결정된다. 과실 경도는 복잡한 형질이며, 많은 유전자의 작용에 의존한다. 이 때문에 세포벽 분해 효소의 변화에 중점을 두어 과실 경도의 변화를 규명하는 연구를 분석하는 것은 어렵다.

성숙기에 접어 든 토마토 과실을 수확하는 것은 눈에 보이는 껍질 색상을 통해 이루어지고 완벽한 품질 개발을 보장하므로 성숙도를 보다 쉽게 결정할 수 있다. 수확 후, 성숙은 계속되고 연화가 진행되어, 과실 취급상 손상 가능성이 높아지고 판매 기간이 제한된다. 성숙과 연화 단계의 속도를 늦추면 완전히 익지는 않지만 단단한 과실의 수확, 운송 및 저장이 가능할 것이다 (T. Chanthasombath et al, 2008).

무색의 미성숙 및 성숙 저해제 등 토마토 성숙 변종은 성숙을 조절하고 과실 경도를 조정하는 새로운 유전 구조에 중요한 정보를 제공하였다 (Thompson et al, 1999; Vrebalov et al, 2002; Eriksson et al, 2004; Manning et al, 2006). 성숙과 연화의 지연은 토마토 등 다양한 과일과 채소의 유통기간을 연장할 수 있는 간단하고 저렴한 방법으로서 널리 연구된 변형 공기 포장법(MAP)을 이용하여 달성될 수 있지만 (Batu & Thompson, 1998, Exama et al, 1993, Geeson et al, 1985), 이 때, 과실의 포장과 취급 비용이 증가된다. 종래의 식물 교배 프로그램에서 기존의 과실 경도 향상 방법은 성숙한 식물로부터 수확된 과실간 과실 경도 차이 검사를 통해 이루어진다. 이러한 시나리오에서 과실 경도의 향상의 확인 가능성은 매우 낮을 것이다. 현재, 수많은 식물의 재배와 표현형 분석 비용과 복잡성 때문에, 과실 경도 증가를 위해 교배하는 것은 재정적으로 불가능하거나 효율적이지 않다.

새로운 과실 성숙 조절 모델과 과실 경도의 조절에 관련되는 요소의 완전한 지식간의 격차를 상쇄하기 위해서는 알려진 세포벽 관련 단백질 유전자를 대상으로 하거나 다면발현성 성숙 변종의 조사를 통한 이에 대한 전략이 더 필요할 것이다. 과실 경도는 많은 유전자를 수반하는 양적 형질이고 이들 유전자 대부분의 본질(identity)은 아직 확인되지 않았다.

야생 토마토종은 브리더(breeder)에게 새로운 유전 변이의 풍부하고 거대한 미개발 소스를 제공한다. Tanksley 및 Zamir (Frary et al, 2000; Fridman et al, 2004)은 유전적 다형성 소스는 중요한 과실 품질 형질의 분자 기원을 이해하고 새로운 품질 개량 물질을 제공하는 데 이용될 수 있음을 증명하였다.

이에 따라, 특히, 과실이 장기간 덩굴에 머무르도록 토마토 과실 경도를 변형하고 토마토 과실의 연화를 지연할 필요가 있는 것은 본 기술 분야에 자명하다. 그 후, 과실은 더 많은 풍미와 맛 성분을 축적하면서 더 단단해져, 조기 수확되거나 가스 등에 의해 인공적으로 성숙된 과실에 비해 최종적인 맛은 더 좋다. 이러한 과실 경도의 증가는 취급 단계, 포장 단계 및 슈퍼마켓 선반으로 운반 단계에 유해와 관련되는 연화 과정 없이 과실이 덩굴에 남아 있으므로 장기간의 수확이 가능하다.

'자미르(Zamir)' 주의 토마토 과실 물리적 특성에 대한 양적 형질 유전자좌 (QTL)의 분포를 조사하였다(Eshed 및 Zamir, 1994). 이들은 Solanum lycopersicum 배경(cv. M82)에서 생성된 76개의 Solanum pennellii 유전자이입 주 (IL) 세트이다. 이들 IL은 하나의 또는 중첩되는 S. pennellii 부분에 의해 정의되는 107개의 용기로 유전자 지도를 분획한다. QTL의 멘델화(Mendelisation)이 가능한 표적 집단은 환경 효과를 감안해서 처리가능한 실험 장치를 이용하여 형질의 매핑과 분석을 가능하게 한다.

발명자는 예기치않게 토마토의 과실 경도의 상당한 증가와 연관되는 유전 요소 (또는 QTL)을 정의하였다. 따라서, 본 발명의 제 1 특징은 수확 단계, 바람직하게는, 녹숙 단계, 또는 브레이커+7일 단계에서 과실 경도가 상당히 증가된 토마토 과실에 관한 것으로서, 상기 과실 경도 증가는 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물내 유전 요소와 연관되고, 상기 경도는 이들 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실의 1.2 내지 2배 이상 또는 1.2배 내지 1.5배 이상 높은 토마토 과실에 관한 것이다. 이들 유전 요소를 갖는 유전자이입 주 IL2-3 및 IL2-4 (각각 LA4038 및 LA4039의 기탁 번호로 기탁됨)는 M82 부모 대조군에 비해 과실 경도가 매우 증가하였으며, IL2-3에서 가장 현저한 효과가 나타났다. F1 세대에는 이들 유전 요소의 우성 효과가 있고, 형질은 익은 토마토 과실에서 가장 현저하다.

또한, a) 적어도 하나의 유전 요소는 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커와 연관되고/연관되거나, b) 적어도 하나의 유전 요소는 기탁번호 LA4038 및 LA4039로 각각 기탁된 Solanum pennellii 주 IL2-3 및 IL2-4내 대응 유전 요소에 상보적이고, LA4038 및 LA4039내 상기 적어도 하나의 유전 요소는 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커와 연관되는 것을 특징으로 하는 본원에 개시된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 적어도 하나의 유전 요소는 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 또는 d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 및 이들 QTL의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 QTL인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고 내부 과피에만 존재하는 상술된 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 근친 교배체, 이성반수체 또는 잡종인 상술된 재배된 토마토 식물이 제공된다. 일 양태에 있어, 상기 식물은 웅성 불임성이다.

또한, 본 발명에 따른 재배된 토마토 식물을 생성하는 토마토 종자가 제공된다.

또한, 본 발명에 따른 따른 재배된 토마토 식물의 식물 부분이 제공된다. 일 양태에 있어, 본원에 개시된 재배된 토마토 식물의 식물 부분으로부터 얻을 수 있는 식물 물질이 제공된다.

상기 동정된 DNA 마커는 정의된 유전 영역을 포함하는 재배된 토마토 식물을 선택하기 위한 급속 분석과 및 검색 수단을 나타낸다. 이들 DNA 마커는 과실 경도 증가와 연관되는 매우 작고 정의가 잘된 유전자 영역을 조작할 수 있다. 이는 DNA 마커의 바람직한 조합물에 대한 매우 이른 성장 단계에서 다수의 (1000) 식물을 스크리닝할 수 있어 토마토 상품종에서 과실 경도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다.

또한, a) 공여체 토마토 식물과 수여체 토마토 식물을 교배하여 자손 식물을 얻는 단계와, b) 자손 식물의 과실에서 과실 경도를 양적으로 분석하는 단계와, c) 상기 자손 식물에서 상기 공여체 식물로부터 적어도 하나의 DNA 마커의 존재에 관찰된 과실 경도 증가를 연계하는 유전 연관 지도를 확립하는 단계와, d) 과실 경도의 상당한 증가와 연관되는 상기 지도상 DNA 마커를 QTL에 지정하는 단계를 포함하는, 대조군 토마토 식물보다 과실 경도가 상당히 증가된 재배된 토마토 식물과 연관되는 QTL의 검출 방법이 제공된다.

바람직하게는, 상기 공여체 식물은 수여체 식물에 비해 과실 경도가 상당히 증가된 과실을 갖는다.

바람직하게는, 상기 공여체 식물은 S. pennellii이고, 상기 수여체 식물은 S. lycopersicum이다. 자손 식물의 과실 경도 범위는 수확 단계에서 대조군 토마토 식물로부터 생성되는 과실보다 1.2배 내지 2.0배 이상 또는 1.2배 내지 1.5배 높다. 바람직하게는, 수확 단계는 녹숙 단계이다. 바람직하게는, 적어도 하나의 DNA 마커는 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 QTL은 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상이다.

일 양태에 있어, 상기 QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재한다.

본원에 기술된 방법에 의해 검출된 재배된 토마토 식물에 의해 제공되는 과실에서 과실 경도 증가의 원인이 되는 QTL이 제공된다.

일 양태에서, 상기 QTL은 염색체 2상 긴 암(arm)에 위치한다.

일 양태에서, NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커와 연관되는 본원에 기술된 QTL이 제공된다.

일 양태에서, a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상인 본원에 기술된 QTL이 제공된다.

일 양태에서, DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재하는 본원에 따른 QTL이 제공된다.

또한, 본원에 기술된 QTL을 포함하는 토마토 식물로부터 수득한 분리된 DNA 시료가 제공된다.

또한, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법이 제공된다.

본원에 따른 공여체 토마토 식물에서 과실 경도 증가와 연관되는 QTL의 존재 여부를 검출하는 단계와, 검출된 적어도 하나의 QTL을 포함하는 핵산 서열 또는 과실 경도 증가 제공부 또는 이의 부분을 공여체 식물에서 수여체 토마토 식물로 전달하는 단계를 포함하고, 과실 경도 증가는 재배된 토마토 식물의 자손의 과실과 대조군 토마토 식물의 과실을 비교하여 측정되는 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 재배된 자손 토마토 식물의 제조 방법이 제공된다. 핵산의 전달은 형질전환, 원형질 융합, 복반수체 방법 또는 미숙배 배양 등 본 기술 분야에 알려져 있는 방법 중 하나에 의해 수행된다.

바람직하게는, 자손 토마토 식물의 과실 경도 범위는 녹숙 단계 또는 브레이커 후 7일에 대조군 토마토 식물 과실보다 높다. 과실 경도 범위는 1.2배 내지 2배 높거나, 1.2배 내지 1.5배 높을 수 있다. 바람직하게는, 공여체 식물은 S. pennellii이고, 수여체 식물은 S. lycopersicum이다. 바람직하게는, 상기 QTL은 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 또는 d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상이다.

일 양태에서, 상기 QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재한다.

또한, 본원에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는 재배된 토마토 식물, 또는 이의 부분이 제공된다.

또한, 본원에 기술된 과실 경도 증가의 원인이 되는 재배된 QTL을 포함하는 토마토 식물이 제공된다.

또한, 본원에 기술된 토마토 식물과 상업상 바람직한 특성을 갖는 토마토 식물을 교배하여 얻을 수 있는 잡종 토마토 식물, 또는 이의 부분이 제공된다.

또한, 본원에 기술된 토마토 식물을 성장시켜 생성된 토마토 종자가 제공된다.

또한, 대조군 식물보다 과실 경도가 상당히 증가한 식물을 얻을 수 있도록 본원에 기술된 토마토 식물과 바람직한 표현형 형질을 갖는 식물을 교배하여 얻은 토마토 종자가 제공된다.

또한, 대조군 식물보다 과실 경도가 증가된 토마토 식물을 생성하기 위한 본원에 기술된 QTL의 용도가 제공된다.

또한, 토마토 과실의 수확 슬롯을 연장하고/연장하거나 신선 편이 상품 또는 식품 가공을 위한 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 용도가 제공된다.

또한, 본원에 기술된 적어도 하나의 QTL을 포함하는 토마토 식물로 제조된 가공 식품이 제공된다.

도 1은 (A) IL2-3 (B) IL2-4 및 (C) QTL-NIL 301 유전자이입을 나타낸다. 내부 및 외부 마커는 M82 영역으로부터 유전자도입 영역(흑색 표시)의 범위를 정하는 데 이용된다.
도 2는 M82 대조군에 비해, 브레이커+7일 이하의 단계까지 과실 경도 향상됨을 보여주는 IL2-3F1 주의 (A) 외부 과피 및 (B) 내부 과피상 기계적 측정을 도시한다. 각 그래프에서 Y축은 최대 하중(N)을, X축은 성장 단계를 나타낸다. M82주는 실선으로 표시한다. IL2-3 F1주는 점선으로 표시한다. 과실 성장 단계: MG, 녹숙 단계; B, 브레이커 단계; B+3, 브레이커 단계후 3일; B+5, 브레이커 단계 후 5일; B+7, 브레이커 단계 후 7일; B+10, 브레이커 단계 후 10일.
도 3은 신젠타 SSR 및 공지된 RFLP 및 PCR계 마커에 대한 재조합 과정의 분포를 나타내는 (A) IL 2-3 F2 및 (B) IL 2-4 F3의 무작위로 선택된 주의 유전자형 분석을 도시한다. 기호 설명: A = M82; B = S. pennellii; H = 이형접합체; * = 손실 데이타. SSR 마커는 좌측 칼럼에 나타낸다. 선택된 주는 상단 열에 나타낸다.
도 4는 (A) 외부 과피 및 (B) 내부 과피에서 과실 경도를 측정함으로써 결정되는 토마토 염색체 2상의 과실 경도를 증가시키는 QTL의 위치를 나타낸다. QTL은 흑색 실선으로 나타낸다. 외부 과피에 있어서, 좌측에서 우측 방향으로 QTL은 QTL2, QTL4, QTL5 및 QTL3에 대응된다. 내부 과피에 있어서, 좌측에서 우측 방향으로 QTL은 QTL1, QTL2, QTL4, QTL5 및 QTL3에 대응된다. 마커 위치 및 이들간 거리(센티모건)는 X축상의 QTL 위치 하부에 나타낸다. LOD값은 Y축에 나타낸다.
도 5는 2007년 및 2008년에 선택된 이종 재조합 개체 및 부모주의 외부 및 내부 과피에 있어 평균 과실 경도의 분석을 나타낸다. Y축은 최대 부하(N)를 나타내고, X축은 주의 수를 나타낸다. (A) 외부 과피 2007; (B) 내부 과피 2007; (C) 외부 과피 2008; (D) 내부 과피 2008.
도 6은 M82 부모에 비해 IL2-3에서 고농도의 발현을 나타내는 펙틴 메틸에스테라제/펙틴 메틸에스테라제 저해제 (PME)를 도시한다. PME의 정규화된 mRNA 발현 농도는 Y축에 나타낸다. 개화기 후 일수는 X축에 나타낸다. 기호 설명: 백색 막대 = IL2-3; 흑색 막대 = M82.
도 7은 (A) 외부 과피 및 (B) 내부 과피에서 측정된 녹숙 단계 (M 표시) 또는 브레이커 단계(B 표시)에서 M82, IL2-4, IL2-3, 1088, 301, 769 및 910주에 대한 에틸렌 반응성 인자 12의 표준화 상대적 mRNA 농도를 나타낸다. 같은 주에서 얻은 조직감 데이터는 (C) 외부 과피 및 (D) 내부 과피에 대해 나타낸다. H 문자는 주가 이종 유전자이입됨을 나타낸다.
도 8은 (A) 외부 과피 및 (B) 내부 과피에서 측정된 녹숙 단계 (M 표시) 또는 브레이커 단계(B 표시)에서 M82, IL2-3, 124, 142, 301 및 331주의 펙틴 메틸에스테라제의 정규화 상대적 mRNA 농도를 나타낸다. 같은 주에서 얻은 조직감 데이터는 (C) 외부 과피 및 (D) 내부 과피에 대해 나타낸다. H 문자는 주가 이종 유전자이입됨을 나타낸다.
도 9는 (A) 외부 과피 및 (B) 내부 과피에서 측정된 녹숙 단계 (M 표시) 또는 브레이커 단계 (B 표시)에서 M82, IL2-4 및 IL2-3주에 대한 도프 징크 휭거 단백질 6에 대한 정규화된 상대적 mRNA 농도를 나타낸다.
도 10(A)는 마커 위치를 나타내는 외부 과피의 QTL 지도의 상세도를 나타내고, 도 10(B)는 마커 위치를 나타내는 내부 과피의 QTL 지도의 상세도를 나타낸다.

정의

본원의 범위내에서 사용된 기술 용어 및 표현은 하기 본원에 달리 지시되지 않는 경우 일반적으로 식물 기르기 및 재배의 관련 기술에서 이들에게 통상적으로 적용되는 의미로 제공된다.

본 명세서와 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥에서 명확하게 달리 언급하지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 식물에 대한 언급은 하나 이상의 식물을 포함하고, 세포에 대한 언급은 세포 및 조직 등의 혼합물을 포함한다.

본원에 사용된 용어 “약”은 질량, 중량, 부피, 농도 또는 퍼센트의 값이나 양을 언급하는 경우, 특정량으로부터 일부 양태에서는 ±20% 오차, 일부 양태에서는 ±10% 오차, 일부 양태에서 ±5% 오차, 일부 양태에서는 ±1% 오차, 일부 양태에서는 ±0.5% 오차, 일부 양태에서는 ±0.1% 오차를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 오차는 개시된 방법을 수행하는 데 적절하다.

“대립유전자”는 상동 염색체에서 동일한 유전자좌에 배치되므로 상이한 형태의 유전자 또는 유전적으로 대체물인 임의의 동정가능한 유전 요소와 동일하거나 이에 연관되는 다양한 유전 단위의 대안 형태나 변형 형태를 말하는 것으로 본 발명의 범주에서 이해된다. 이러한 대체 형태나 변형 형태는 단일 뉴클레오티드 다형성, 삽입, 역위, 전좌 또는 결실의 결과이거나, 화학적 또는 구조적 변이, 전사 조절 또는 번역후 변이/조절 등에 의해 야기되는 유전자 조절의 결과이다. 이배체 세포 또는 유기체에서 임의의 유전자나 유전 요소의 두 개의 대립유전자는 전형적으로 한 쌍의 상동염색체상의 대응 유전자좌를 차지한다.

양적 형질과 연관되는 대립유전자는 단일 유전자 또는 복수개의 유전자 또는 이들의 생성물 또는 QTL로 나타내는 표현형에 기여하는 유전 요소에 의해 교란되거나 제어되는 유전자와 유사하거나 결합되는 것을 포함하는 다양한 유전 단위의 대체 형태나 변형 형태를 포함한다.

본원에 사용된 “역교배(backcross)” 및 이들의 문법적 변형은 브리더(breeder)가 부모 중 하나와 그 후의 잡종 자손을 교배하는 과정을 말하는 것으로서, 예를 들면, 잡종 제 1대 F1와 F1 잡종의 부모 유전자형 중 하나를 교배한다. 일부 양태에서는 동일한 부모 유전자형과 역교배되는 하나의 역교배의 자손 개체와 반복적으로 역교배가 수행된다.

본원에 사용된 “교배하는” 및 이들의 문법적 변형은 자손 개체를 만드는 과정을 말한다. 교배는 유성 또는 무성이거나 이들의 조합일 수 있다. 교배의 비제한예로는 교잡, 자가수분, 이중 반수체 유도체 생성 및 이의 조합이 포함된다.

본 발명의 목적을 위한 용어 “공분리(co-segregation)”는 형질에 대한 대립유전자와 마커에 대한 대립유전자(들)은 동일한 염색체에서 물리적으로 서로 인접하므로 함께 운반되는 경향이 있어(이들의 물리적 인접성 때문에 이들간 재조합은 감소됨), 이들의 대립유전자의 비무작위 연관을 초래하는 것을 말한다. “공분리”는 적어도 하나가 유전인 것으로 알려져 있고 우연으로 쉽게 설명될 수 없는, 하나의 식물체에서 둘 이상의 형질이 존재함을 말한다.

“재배된 토마토 식물”은 자연 상태가 아닌 사람의 보살핌에 의해 사람의 용도 및/또는 소비를 목적으로 성장한 식물을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다. “재배된 토마토 식물”은 자연 유전학의 자연 형질 및/또는 그 일부로 서 본 발명의 대상이 되는 형질을 포함하는 야생형 토마토류는 제외하는 것으로 이해된다. 재배된 토마토 식물은 전형적으로 토마토 모자이크 바이러스에 대한 내성도 나타내지만, 야생종은 그렇지 않다.

두 종류의 토마토 성장으로서 유한(determinate) 성장과 무한(indeterminate) 성장이 있다. 유한 성장은 촘촘하게 재배되는 관목(bush) 토마토를 생성한다. 전체 식물은 정과가 성숙하면 성장을 멈추고 남은 과실 모두 동시에 성숙한 후, 식물은 죽는다. 무한 성장은 10 피트의 높이까지 자랄 수 있는 토마토 (소위, “비닝(vining)” 토마토)를 생성하고 동사하는 경우에만 성장을 멈춘다. 이들의 과실은 차례로 성숙한다. 일반적인 식물에서 모든 성장은 세 장의 잎과 복꽃 화서를 형성하는 모듈형 가축 단위(modular sympodial units)의 반복에 의해 일어난다. M82를 포함하는 모든 경작 성장 토마토 품종은 새가지(shoots)가 성장의 조기 종결 전에 잎의 수가 점차 감소하는 범위에서 각각 하나의 화서를 갖는 평균 여섯 개의 가축 단위를 생성하는 유한 식물이다. 일반적으로, 유한 토마토는 노지 재배에 적합하다.

반유한 및 무한 “재배된” 품종은 노지나 보호망에서의 말뚝 재배와 온실 재배에 적합하다. 본 발명의 목적을 위해서는 IL2-3 및 IL2-4 등 S. pennellii 유전자이입주는 재배주로 간주되지 않으나, 부모주 M82와 QTL-NIL 301 등 재조합 주는 재배주로 간주된다.

본원에 사용된 용어 “이성반수체 주”는 또다른 배양물로부터 유래된 안정한 근교계주를 말한다. 특정 배지 및 환경에서 재배된 몇몇 화분립(단수체)은 n 염색체를 함유하는 묘목을 성장시킬 수 있다. 이어서, 이들 묘목은 “2배”가 되고 2n 염색체를 포함한다. 이들 묘목의 자손을 “이성반수체”라고 하고, 본질적으로 더 이상 분리되지 않는다 (안정하다).

본원에 사용된 용어 “유전자”는 염색체상에 특이적 위치를 차지하고 유기체에 특정한 특성 또는 형질에 대한 유전적 지시를 포함하는 DNA 서열로 이루어진 유전적 단위를 말한다.

본원에 사용된 용어 “QTL의 유전 구조” 는 목적하는 표현형 형질과 통계적으로 관계가 있고 목적하는 표현형 형질의 근본적인 유전 기반을 나타내는 유전자 영역을 말한다.

본원에서 “유전자 조작”, “형질전환” 및 “유전적 변이”의 모두는 DNA (대부분 또다른 유기체의 염색체 DNA 또는 게놈)으로 분리되고 클로닝된 유전자의 전이의 동의어로 사용된다.

본원에 사용된 구 “유전자 마커”,”DNA 마커” 또는 “분자 마커”는 상호교환가능하고, 하나 이상의 목적 유전자좌와 연관되는 각 게놈 (예컨대, 각 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열)의 특성을 나타낸다. 일부 양태에서, 유전자 마커는 목적 집단에서 다형성이거나, 문맥에 따라서 다형성에 의해 차지하게 된 유전자좌이다. 유전자 마커는 많은 다른 예 중에서, 예를 들어 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), indel(즉, 삽입/결실), 단순 서열 반복(SSR), 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 무작위 증폭 다형성 DNA(RAPD), 절단 증폭 다형성 서열(CAPS) 마커, 다양성 분석 기술(DArT) 마커 및 증폭 단편 길이 다형성(AFLP)을 포함한다. 예를 들면, 유전자 마커는 표현형 형질의 다양성에 기여하는 염색체 상에 대립유전자를 포함하는 유전적 유전자좌를 배치하는데 사용될 수 있다. 구 “유전자 마커”는 프로브로 사용된 핵산 서열 등과 같은 게놈 서열과 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낼 수도 있다. 유전적 또는 분자 마커는 연관되는 유전적 유전자좌의 안쪽 또는 바깥쪽(즉, 각각 유전자내 또는 유전자외)에 있는 염색체상의 하나의 위치에 물리적으로 위치될 수 있다. 다른 방식으로 말하면, 예를 들어, 목적하는 유전자좌에 상응하는 유전자의 바깥쪽 조절 요소에 있는 유전자 또는 기능적 변이의 염색체 상의 위치가 동정되지 않았던 경우와 유전자 마커와 목적하는 유전자좌 사이에 상당히 낮은 재조합률이 존재하는 경우에 유전자 마커가 전형적으로 사용되지만, 본 기재된 주제는 유전적 유전자좌의 경계에 (예를 들어, 유전자의 인트론 또는 엑손내 다형성과 같지만 이에 제한되는 것은 아닌 유전자에 상응하는 게놈 서열내) 물리적으로 존재하는 유전자 마커도 사용할 수 있다. 본 기재된 주제의 일부 양태에서는 하나 이상의 유전자 마커는 1개 내지 10개의 마커를 포함하고, 일부 양태에서는 하나 이상의 유전자 마커는 10개 이상의 유전자 마커를 포함한다.

본원에 사용된 용어 “유전자형”은 세포 또는 유기체의 유전적 구조를 말한다. 개체의 “유전자 마커 세트에 대한 유전자형”은 개체의 일체배형에 포함되는 하나 이상의 유전자 마커 유전자좌에 대한 특정 대립유전자를 포함한다. 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 유전자좌가 관련되거나 관련되지 않고/않거나 연관되거나 연관되지 않느냐에 따라 유전자형은 하나의 유전자좌나 복수 개의 유전자좌와 관련된다. 일부 양태에서는, 개체의 유전자형은 유전자의 하나 이상이 목적하는 표현형의 발현과 관련되는 점과 관련되는 하나 이상의 유전자와 관련된다 (본원에 정의된 양적 형질). 따라서, 일부 양태에서, 유전자형은 양적 형질의 하나 이상의 유전적 유전자좌에 있는 개체에 존재하는 하나 이상의 대립유전자의 개요를 포함한다. 일부 양태에서, 유전자형은 일체배형으로 나타낸다 (본원에서 후에 정의함).

“이형”은 동종 염색체상에 하나 이상의 대응 유전자좌에 존재하는 상이한 대립유전자를 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“동형”은 동종 염색체상에 하나 이상의 대응 유전자좌에 존재하는 동일한 대립유전자를 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

본원에 사용된 용어 “잡종”은 다른 주, 품종 또는 종의 식물을 교배하여 생성된 유전적으로 유사하지 않은 부모의 자손인 식물을 나타내며, 두 근교계 주 간의 교배를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 “하이브리드화하다”는 종래의 하이브리드화 조건에서, 바람직하게는 용액으로서 5xSSPE, 1% SDS, IxDenhardts 용액을 이용하고/이용하거나 하이브리드화 온도는 35°C 내지 70°C, 바람직하게는 65°C인 하이브리드화 조건을 말한다. 하이브리드화 후, 세척은 35°C 내지 75°C, 특히, 45°C 내지 65°C, 보다 상세하게는 59°C (Sambrook et al. (2001), SSPE, SSC 및 Denhardts 용액의 정의에 관한 내용을 참조할 것)의 온도에서 먼저 2xSSC, 1% SDS로 수행한 후에 0.2xSSC로 수행하는 것이 바람직하다. Sambrook et al. (2001)에 예시된 보다 가혹한 하이브리드화 조건이 특히 바람직하다. 예컨대, 상술한 바와 같이 하이브리드화와 세척이 65°C에서 이루어지는 경우에 특히 바람직한 가혹한 하이브리드화 조건이 존재한다. 예를 들어, 45°C에서 수행되는 하이브리드화와 세척을 포함하는 엄격하지 않은 하이브리드화 조건은 바람직하지 않으며, 35°C인 경우 더욱 바람직하지 않다.

본원에 사용된 구 “근교계 주”는 유전적으로 동종이거나 동종에 가까운 집단을 나타낸다. 근교계 주는 예를 들어 형/매 교배 또는 자가수분 또는 이성반수체 생성에서의 몇 사이클을 통해 유도될 수 있다. 일부 양태에서, 근교계 주는 목적하는 하나 이상의 표현형 형질을 위한 순종을 만들어낸다. “근교계”, “근교계 개체” 또는 “근교계 자손”은 근교계 주로부터 채취된 개체이다.

본원에 사용된 용어 “유전자이입”, “유전자이입된” 및 “유전자이입하는”은 하나의 종, 변종 또는 품종의 유전자, QTL 또는 일체배형을 이들 종을 교배함으로써 또다른 종, 변종 또는 품종의 게놈으로 이동시키는 과정을 나타낸다. 교배는 자연적이거나 인위적일 수 있다. 그 과정은 계속되는 부모와 역교배함으로써 선택적으로 완성될 수 있고, 이러한 경우, 유전자이입은 이의 부모 중 하나와 이종 잡종의 반복된 역교배를 통해 하나의 종의 유전자가 또다른 유전자 풀로 침입하는 것을 말한다. 유전자이입은 수여자 식물의 게놈에 안정하게 통합된 이종 유전적 물질로서 기재될 수도 있다.

본원에 사용된 용어 “연관” 및 이의 문접적 변형은 동일한 염색체상에 상이한 유전자좌에서 대립유전자가 이들의 이동이 독립적인 경우 우연히 예상되는 것보다 자주 분리되는 성향을 말하며, 일부 양태에서는 이들의 물리적 근접성의 결과이다. 연관은 유전자좌간 재조합율로 측정된다 (센티모건, cM).

본원에 사용된 구 “연관 그룹(linkage group)”은 동일한 염색체상에 위치하는 유전자 또는 유전적 형질 모두를 말한다. 연관 그룹에서 서로 충분히 인접하는 유전자좌들은 유전 교배에서 연관을 나타낼 수 있다. 염색체상 유전자좌간 물리적 거리에 따라 교배 가능성이 증가하므로, 연관 그룹에서 서로 멀리 제거되는 위치에 있는 유전자좌는 직접 유전 시험에서 검출가능한 연관을 나타내지 않는다. 용어 “연관 그룹”은 염색체 배치가 아직 일어나지 않은 유전계에서 연관 양상을 나타내는 유전적 유전자좌를 말한다. 그러므로, 본 기술 분야의 당업자는 연관 그룹이 소정의 염색체의 영역 (예를 들면, 전체보다 작은 부분)에 대응되는 것으로 정의될 수도 있음을 이해할 수 있으나, 본 문맥에서 용어 “연관 그룹”은 염색체의 물리적 개체와 같은 의미를 지닌다.

“유전자좌”는 형질에 기여하는 유전자나 다른 유전 요소 또는 인자를 포함하는 염색체상의 영역을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

본원에 사용된 용어 “마커 대립유전자”는 표현형 형질의 다양성에 기여하는 염색체상의 대립유전자를 포함하는 유전적 유전자좌를 배치하는 마커로 이용되는 경우 앞서 정의한 바와 같은 유전 단위의 대안 또는 변형 형태를 말한다.

“마커 의존 선택”은 예를 들어 식물로부터 하나 이상의 핵산을 검출하는 유전자 마커의 용도를 나타내는 것으로 본 발명의 범위에서 이해되고, 이때 핵산은 바람직한(또는 바람직하지 않은) 형질에 대한 유전자, QTL 또는 일체배형을 포함하는 식물을 동정하는 바람직한 형질과 연관되어, 이들 식물이 선택적 교배 프로그램에 사용될 수 있게 (또는 피할 수 있게) 된다.

“마커 의존 선택”은 재배된 식물로부터 하나 이상의 핵산을 검출하여 재배된 식물(들)에서 원하는 형질(들)을 선택하는 과정을 말하며, 이 때 핵산은 원하는 형질과 연관된다.

본원에 사용된 “마커 유전자좌”는 개체의 게놈에 존재하고 목적하는 하나 이상의 유전자좌와 연관되는 뉴클레오티드나 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 염색체상의 영역을 말하며, 이는 형질에 기여하는 유전자나 다른 유전 요소 또는 인자를 포함할 수도 있다. “마커 유전자좌”는 프로브로서 이용되는 핵산 서열 등 게놈 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 염색체상의 영역을 말한다.

“미세부수체 또는 SSR (단순 서열 반복체) 마커”는 식물의 게놈을 통해 유전자좌에서 발견되고 다형성이 높을 가능성이 있는 DNA 염기의 짧은 서열의 복수 개의 반복체로 구성되는 유전자 마커의 일종을 나타내는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

본원에 사용된 “핵산” 또는 “올리고뉴클레오티드” 또는 “폴리뉴클레오티드” 또는 이들의 문법적 균등물은 서로 공유 결합된 적어도 두 개의 뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 약 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 40, 50 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 핵산과 폴리뉴클레오티드는 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10000 등의 길이를 갖는 긴 고분자이다. 어떤 경우에는 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연관과 펩티드 핵산 골격 및 연관 등을 포함하는 대체 골격을 갖는 핵산 유사체가 포함되기도 하지만(Eckstein, 1991 참조), 본 발명의 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 포함할 것이다. 자연발생된 핵산과 유사체의 혼합물이 이용될 수 있다. 특히 바람직한 올리고뉴클레오티드 유사체는 펩티드 핵산 (PNA)이다.

본원에 사용된 용어 “자손” 식물은 하나 이상의 부모 식물이나 이들의 후손으로부터 영양 생식이나 유성 생식에 의해 자손으로 얻은 식물을 말한다. 예를 들면, 자손 식물은 부모 식물의 클로닝 또는 자가수분에 의하거나, 두 부모 식물의 교배에 의해 얻을 수 있고, F1, F2 또는 그 다음 세대의 자가 수분을 포함한다. F1은 이들 중 적어도 하나가 형질의 수여자로서 최초로 이용된 부모로부터 얻은 제 1대 자손으로부터 생성되며, 제 2대 자손(F2)이나 그 이후 세대 (F3 및 F4 등)는 F1 및 F2 등을 자가수분하여 생성된 샘플이다. F1은 두 순종 부모 (순종 교배는 동형 형질이다)를 교배하여 얻은 잡종일 수 있으나 (일부 양태에서는 잡종임), F2는 F1 잡종의 자가 수분에 의해 얻은 자손일 수 있다(일부 양태에서는 자손임).

“PCR(폴리머라제 연쇄 반응)”은 DNA의 특이적 영역 또는 게놈의 하부세트(들)을 상대적으로 대량 생산하는 방법을 나타내는 것으로 본 발명의 범위에서 이해되고, 이들 영역을 기반으로 다양한 분석이 가능하다.

“PCR 프라이머”는 DNA 특이 영역의 PCR 증폭에 이용된 단쇄 DNA의 상대적으로 짧은 단편을 나타내는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

본원에 사용된 표현 “표현형” 또는 “표현형 형질”은 개체의 게놈, 프로테놈 및/또는 대사체의 환경과의 상호작용에 의해 얻어지는 개체의 외모나 검출가능한 특징을 말한다.

“식물”은 성장 단계에 있는 식물로서, 특히 종자 식물이다.

“식물 세포”는 원형질체와 세포벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태이거나, 또는 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물 등 고등 유기체 단위의 일부로서 존재할 수 있다.

“식물 세포 배양물”은 원형질체, 세포 배양 세포, 식물 조직 세포, 꽃가루, 꽃가루관, 난세포, 싹 낭, 접합자 및 다양한 성장 단계의 싹 등과 같은 식물 단위 배양물을 의미한다.

“식물 물질”은 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 과실, 꽃가루, 난세포, 접합자, 종자, 꺽꽃이 순, 세포 또는 조직 배양물, 또는 다른 부분 또는 산물을 말한다.

본원에 사용된 구 “식물 부분”은 식물, 세포 덩어리 및 식물을 재생할 수 있는 조직 배양물에 손상되지 않는 식물 세포 등 단일 세포와 세포 조직을 포함하는 식물의 부분을 말한다. 식물 부분의 예는 꽃가루, 난세포, 잎, 배아, 뿌리, 뿌리 종단, 꽃밥, 꽃, 과실, 줄기, 순 및 종자에서 얻은 단일 세포와 조직뿐만이 아니라, 어린 가지, 근경, 원형질체, 캘리(calii) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에 사용된 “식물 조직”은 구조적 및 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹을 의미한다. 모종 또는 배양물 중 식물 조직이 포함된다. 이 용어는 식물 전체, 식물 기관, 식물 종자, 조직 배양액 및 구조적 및/또는 기능적 단위에 유기화된 식물 세포의 그룹을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 용어를 앞서 나열되거나 이 정의에 포함되는 특정 형태의 식물 조직과 함께 또는 단독으로 이용하는 데 있어 다른 종류의 식물 조직이 제외되는 것은 아니다.

“다형성”은 예컨대 선택적 스플라이싱, DNA 메틸화 등을 통해 유전자, 유전자 마커 또는 유전된 형질 또는 수득가능한 유전자 산물의 둘 이상의 상이한 형태의 집단에 존재함을 나타내는 것으로 본 발명의 범위내에서 이해된다.

본원에 사용된 용어 “집단”은 공통 유전 기원을 공유하는 식물의 유전적 이종 집합을 의미한다.

본원에 사용된 “프로브”는, 특이적 표적 분자 또는 세포 구조를 인지하고 이와 결합할 수 있어서, 표적 분자 또는 구조의 검출이 가능한 원자 또는 분자의 그룹을 나타낸다. 특히, “프로브”는 분자 하이브리드화에 의한 상보적 서열의 존재를 검출하고 정량하는데 사용될 수 있는 표지된 DNA 또는 RNA 서열을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 “자손”은 특정 교배의 후손(들)을 말한다. 어떤 품종 (특히, 일부 식물과 양성동물)은 자가 생식될 수 있으나 (즉, 같은 식물이 웅성 생식세포와 자성 생식세포의 공여체 역할을 함), 자손은 두 개체의 교배로부터 얻어지는 것이 전형적이다. 후손(들)은 예를 들면, F1, F2, 또는 그 후 세대일 수도 있다.

용어 “QTL”은 공지된 기술의 의미로 본원에서 이용된다. 용어 “토마토 과실의 경도 증가와 연관된 QTL”과 간단한 용어 “과실 경도를 증가하는 QTL”은 과실 경도 증가에 원인이 되는 적어도 하나의 유전자 또는 적어도 하나의 조절 영역(즉, 과실 경도 증가와 관련되는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 염색체상 영역)과 연관되는 토마토의 특정 염색체상에 위치하는 영역을 말한다. QTL은 예를 들면 과실 경도 증가를 부여하는 산물인 하나 이상의 유전자를 포함한다. 또는, QTL은 예를 들면 식물 게놈에 있는 다른 유전자좌상에 있는 유전자의 발현에 영향을 주는 산물인, 조절 유전자 또는 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명의 QTL은 하나 이상의 분자 게놈 마커를 이용한 각 야생형 토마토 접근의 게놈에서 이들의 유전적 위치를 나타냄으로써 정의될 수 있다. 하나 이상의 마커는 차례로 특정 유전자좌를 나타낸다. 유전자좌간 거리는 대개 동일한 염색체상 유전자좌간 교배의 횟수로 측정된다. 두 유전자간 거리가 멀수록, 이들간 교배가 일어날 가능성이 더 높다. 반대로, 두 유전자좌가 인접하면, 이들간 교배는 일어나기 어렵다. 일반적으로, 일 센티모건 (cM)은 유전자좌(마커) 간 1% 재조합과 같다. QTL이 다중 마커에 의해 표시될 때, 종점 마커간 유전적 거리는 QTL의 크기를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 “QTL1”, “QTL2”, “QTL3”, “QTL4” 및 “QTL5”은 마커 NT3853, NT3907 및 TG14; HOX7A 및 CT277; HB2600, 및 TG353; Lm0127 및 Lm1650; 및 LE5100 및 LE5200 각각에 의해 정의되는 토마토 경도 증가와 연관되는 게놈 영역을 말한다. 구체적으로 설명하면, 이들 마커는 S. pennellii 염색체 2상에 존재한다고 한다.

용어 “양적 결정”은 측정, 특히 양과 숫자 단위로 측정될 수 있는 특성의 측정을 수반하는 방식으로 확립하거나 접근하는 것으로 본원에서 정의된다. 심각도의 결정과, 높은, 많은, 적은 또는 동등한 정도, 또는 증가 또는 감소 정도의 표시는 본 용어 “양적 결정”에 포함되지 않고, 본 용어는 궁극적으로 절대값을 결정하는 목적 카운팅 메커니즘의 존재를 암시한다.

용어 “수여체 토마토 식물”은 본원에서 과실 경도를 증가하는 QTL를 포함하는 공여체 토마토 식물로부터 얻은 DNA를 공급받는 토마토 식물을 나타내는 데 이용된다.

“수여체 토마토 식물”은 하나 이상의 과실 경도를 증가시키는 QTL을 이미 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, 이러한 경우 본 용어는 추가적인 QTL을 공급받는 식물을 의미한다.

용어 “자연적인 유전적 배경”은 본원에서 QTL의 최초 유전 배경을 나타내는 데 이용된다. 이러한 배경은 예를 들어 토마토의 야생 접근 게놈일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 QTL은 S. pennellii의 염색체 2상의 특정 위치에서 발견된다. 일 예로, S. pennellii는 S. pennellii의 염색체 2상의 QTL 1, 2, 3, 4 및 5의 자연 유전적 배경을 나타낸다.

반대로, S. pennellii의 염색체 2로부터 이들 QTL을 포함하는 DNA나 이들의 과실 경도 제공 부분의 또다른 토마토 종(바람직하게는 배양된 S. lycopersicum)의 염색체 2상의 동일한 위치로 전이를 수반하는 방법은 이의 자연 유전적 배경이 아니라, 이들 QTL이나 이의 과실 경도 부여 부분을 초래할 것이다.

본원에서 “재조합 조작”은 감수분열 교차를 의미한다.

“서열 상동” 또는 “서열 동일”은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 둘 이상의 핵산이나 단백질 서열의 문맥에서 용어 “동일한” 또는 “퍼센트 동일성”은 길이가 서로 다른 두 개의 서열을 비교하는 경우, 하기 서열 비교 알고리즘 또는 시각 관찰 중 하나를 이용하여 측정되는 최대 유사성을 비교하고 조정할 때, 동일하거나 동일한 아미노산 잔사나 뉴클레오티드를 특정 퍼센트 갖는 둘 이상의 서열이나 하부서열을 말하며, 서열 동일은 바람직하게는 긴 서열의 뉴클레오티드 잔사와 유사한 짧은 서열의 뉴클레오티드 잔사의 퍼센트에 관련된다. 서열 동일은 종래의 Bestfit 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wl 53711) 등 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. Bestfit는 두 서열간 가장 높은 서열 동일성을 갖는 부분을 찾기 위해 Smith 및 Waterman (1981)의 국부적인 동종 알고리즘을 이용한다. 예를 들면 특정 서열이 본 발명의 대조군 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 Bestfit이나 또다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 동일성 퍼센트가 대조군 서열의 전체 길이를 넘도록 계산되고 대조군 서열내 뉴클레오티드의 총 개수의 5% 이하의 동일성 차이가 허용되도록 변수를 조정하는 것이 바람직하다. Bestfit를 이용하는 경우, 이러한 소위 선택적 변수는 이들의 소정(기정(default)값으로 두는 것이 바람직하다. 소정의 서열과 본 발명의 상술한 서열 간 비교에서 나타나는 차이는 예를 들면 부가, 결실, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 야기된다. 이러한 서열 비교는 “프로그램 fasta20u66” (2.0u65 버젼, 1998년 9월, 버지니아 대학, William R. Pearson; W. R. Pearson (1990), 첨부한 실시예와 http://workbench.sdsc.edu/를 참조할 것)으로 수행하는 것이 바람직하다. 이를 위해, “기정” 변수 셋팅이 이용될 수 있다.

두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 것은 가혹한 조건에서 두 분자가 하이브리드화된다는 것도 의미한다. “특이적으로 하이브리드화되는”은 서열이 복합 혼합물 (전체가 세포임) DNA 또는 RNA에 존재하는 경우, 분자가 가혹한 조건에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합, 중복, 또는 하이브리드화하는 것을 의미한다. “실질적으로 결합한다”는 것은 프로브 핵산과 표적 핵산간 상보적 하이브리드화를 말하며, 표적 핵산 서열의 원하는 검출을 달성하기 위한 하이브리드화 매체의 가혹성을 감소시킴으로써 수용될 수 있는 작은 부조화를 포함한다.

본원에 사용된 구 “유성 교배” 및 “유성 생식”는 기술된 주제의 문맥에서 자손을 생성하는 생식 세포 (배우자)의 융합을 말한다 (예를 들면, 식물에서 수분에 의해 종자를 생성하기 위한 수정에 의해). 일부 양태에서 “유성 교배” 또는 “타가 수정”은 하나의 개체와 또다른 개체간의 수정(예를 들어, 식물의 타가 수분)을 말한다. 용어 “자가생식”은 일부 양태에서는 자가 수정이나 자가 수분에 의해 종자를 생성하는 것을 말하며, 즉, 꽃가루와 배주는 동일한 식물에서 얻는다.

“단일 뉴클레오타이드 다형성”(SNP)은, 게놈 (또는 미토콘드리아 DNA로서 다른 공유된 서열)내 단일 뉴클레오티드인 A,C,G,T가 각각의 세트(쌍을 이룸)의 염색체 사이에서 상이하거나 다수의 종 사이에서 상이한 경우 발생하는 DNA 서열 변이이다.

용어 “표준 온실 조건” 및 “표준 조건”은 예를 들면, 질병 과실 경도의 표현형을 규명하기 위해 식물이 자라거나 배양되는 빛, 습도, 온도 등 조건이 표준인 것을 말한다.

성장 조건은 광 기간은 16 시간일 수 있고 (광합성 광량 자속 (PPF)은 50 내지 1000 μmol nv2 s1), 바람직하게는 암 기간은 8 시간이고, 공기 온도는 낮에는 약 20°C, 밤에는 18°C이고, 약 60%-85%의 상대 온도 (RH)에 대응되는 물 증기압차는 약 4.4 gm3이고, 대기압 산소 농도와 대기압 (일반적으로 1008 hPa)으로 설계하는 것이 바람직하다. 물과 영양분은 스프레이나 미스트 형태로 줄기 주변에 적가될 수 있다.

써던 및 노던 하이브리드화 등 핵산 하이브리드화 실험의 문맥에서”가혹한 하이브리드화 조건” 및 “가혹한 하이브리드화 세척 조건”은 서열 의존적이며 상이한 환경 변수에 따라 다르다. 긴 서열은 고온에서 특이적으로 하이브리드화된다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 가이드는 핵산 프로브 1권, 2장, 엘비세르(Elsevier), 뉴욕, “하이브리드화 원리와 핵산 프로브 분석의 전략의 검토”를 이용한 생화학 및 분자 생물학-하이브리드화의 Tijssen (1993) 실험 기법에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 매우 가혹한 하이브리드화 및 세척 조건은 소정의 이온화도와 pH에서 특정 서열에 대한 융점 (Tm)보다 약 5°C 낮도록 선택된다. 전형적으로, “가혹산 조건”에서 프로브는 이의 표적 하부서열과 하이드리드화되지만, 다른 서열은 그렇지 않다.

Tm은 (소정의 이온화도와 pH에서) 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브와 하이브리드화되는 온도이다. 매우 가혹한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하게 선택된다. 써던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개의 이상의 상보적인 잔사를 갖는 상보적인 핵산의 하이브리드화에 있어 가혹한 하이브리드화 조건의 일 예로는 헤파린 1 mg을 포함한 50% 포름아미드와 42°C를 들 수 있고 하이브리드화는 밤새 수행된다. 매우 가혹한 세척 조건의 일 예로는 0.15M NaCI, 72°C, 약 15분을 들 수 있다. 가혹한 세척 조건의 일 예로는 0.2배 SSC 세척, 65°C, 15 분을 들 수 있다(Sambrook, infra, SSC 버퍼에 대한 설명). 가끔, 매우 가혹한 세척은 주변 프로브 신호를 제거하는 덜 가혹한 세척에 의해 진행된다. 100개 이상의 뉴클레오티드의 듀플렉스(duplex)에 대한 보통의 가혹한 세척의 예로는 1배 SSC, 45°C, 15분을 들 수 있다. 100개 이상의 뉴클레오티드에 대한 덜 가혹한 세척의 예로는 4-6 배 SSC, 40°C, 15분을 들 수 있다. 짧은 프로브 (약 10 내지 50 뉴클레오티드), 가혹한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M의 Na 이온 농도 미만의 염 농도를, 전형적으로, 약 0.01 내지 1.0 M의 Na 이온 농도 (또는 다른 염)를 포함하며, 온도는 적어도 약 30°C인 것이 전형적이다. 가혹한 조건은 포름아미드 등 탈안정화제를 첨가하여 달성될 수도 있다. 일반적으로, 특정 하이브리드화 분석에서 관련되지 않는 프로브에 있어 관측된 것의 2배인 신호대잡음비(또는 그 이상)는 특정 하이브리드화의 검출을 나타낸다. 가혹한 조건에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은 이들이 코딩한 단백질이 실질적으로 동일하다면 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들면 핵산 사본이 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 저하를 이용하여 형성될 때 발생된다.

본원에 사용된 용어 “토마토”는 Solanum lycopersicum 종 (Lycopersicon lycopersicum 또는 Lycopersicon esculentum과 동의어) 또는 Lycopersicon (L. cerasiforrne, L. cheesmanii, L. chilense, L. chmielewskii, L. esculentum (현재, S. pennellii), L. hirsutum, L. parviborum, L. pennellii, L. peruvianum, L. pimpinellifolium, 또는 S. lycopersicoides를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님)의 속명으로 이미 알려진 종에 속하는 식물, 주 또는 집단을 의미한다. L. esculentum의 새로 제안된 학명은 S. pennellii이다. 마찬가지로, 야생종 이름은 달라질 수 있다. L. pennellii은 S. pennellii가 되었다. L. Hirsutum는 S. habrochaites가 되었고, L. peruvianum은 S. 'N peruvianum' 및 S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, 및 S. corneliomuelleri으로 구분될 수 있고, L. parviflorum은 S.neorickii가 될 수 있고, L. chmielewskii는 S. chmielewskii가 될 수 있고, L. chilense는 S. chilense가 될 수 있고, L. cheesmaniae는 S. cheesmaniae 또는 S. galapagense가 될 수 있고, L. pimpinellifolium는 S. pimpinellifolium가 될 수 있다 (Knapp (2005)).

“형질”은 예를 들면 과실 경도 증강의 특징 또는 표현형을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다. 형질은 우성 또는 열성 방식으로 유전되거나 단원자성이거나 다원자성일 수 있다.

“단원자성”은 하나의 유전자좌에 의해 결정되는 것을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“다원자성”은 하나 이상의 유전자좌에 의해 결정되는 것을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“우성”은 이종 또는 동종 상태로 존재할 때 표현형을 결정하는 대립형질을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“열성”대립형질은 동종 상태로 존재할 때만 나타난다.

“동종 유전자성”은 이종 DNA 서열의 존재의 여부에 따라 달라질 수 있는 점을 제외하고는 유전적으로 동일한 재배된 식물을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“수확 단계”는 식물에서 토마토 과실을 제거하는 수확 시기를 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“미녹숙 단계”는 과실이 덜 익어서 계속 크기가 성장하는 시기로 정의된다. 이 단계는 성숙 과정의 첫 단계인 것으로 이해된다.

“녹숙 단계”는 과실이 완전히 성숙하지는 않았으나 덜 익고 성숙 과정에서 미녹숙 단계의 후속 단계이다. 녹숙 토마토는 과정부 (blossom end)상에 백색 내지 황색의 “별(star)”형태를 갖는다. 황녹 단계에서 수확된 전통적인 토마토는 더 성숙한 단계보다 거친 취급을 견딜 수 있고 저장 및 운반중이나 슈퍼마켓 선반에 진열되었을 때, 다소 향이나 맛이 부족할 수 있으나 오랫동안 이들의 형태를 유지할 수 있으므로 상업상 신선한 상품에 가장 적합하다.

“브레이커 단계”는 과실의 적색이 처음 나타나는 시기로 정의되며, 녹숙 단계 후 24 시간내에 발생하는 것이 전형적이다. “브레이커 단계”에서 수확되는 토마토는 대개 향미와 맛이 더 좋지만 단단함이 감소되어 녹숙 단계의 토마토보다 취급, 포장 및 운송에 약간 부적합하다.

“적숙 단계”는 과실이 녹색을 나타내지 않고 완전한 적색이 되는 시기로 정의된다. 이들 과실은 맛과 향은 최적 상태에 이르지만, 경도가 부족하여 심한 취급을 견디지 못하므로 운반될 수 없다.

“유전 요소” 및 “유전 요소 또는 이의 부분”은 DNA 자체 수준과 최종 폴리펩티드 산물의 번역, 전사 및/또는 활성화 수준에서 유전자형의 표현형 발현을 야기하는 토마토 과실 과육의 대사를 조절하도록 경도 형질의 발현에 영향을 주어 식물 과실의 경도에 기여할 수 있는 QTL 또는 이의 부분 (특히, QTL 하부 염색체상에 존재하는 유전자)를 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 정의된다.

“내부 과피” 및 “외부 과피”는 외부 과피가 외부 표피 바로 아래 관다발 조직층 위에 위치하는 층 (약 2 mm)인 과실 조직을 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다. 내부 과피는 관다발층 아래 내부 표피 앞에 3 mm 내지 10 mm의 크기를 갖는다.

“상업상 바람직한 특성”은 우수한 과실 품질, 질병 내성, 방충성 균일한 형태와 크기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“수확 슬롯(slot)”은 수확 단계 후 과실이 상업적인 판매를 목적으로 수확하기에 너무 익을 때까지 일정 기간을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다. 전형적으로, 수확 슬롯은 녹숙 단계에서 시작되어 품종 및 환경 조건에 따라 브레이커 단계 후 2일 내지 5일 후까지 지속된다 .

“공여체 토마토 식물”은 과실 경도의 상당한 증가와 연관되는 적어도 하나의 유전 요소를 제공하는 토마토 식물을 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

본 발명의 DNA 마커의 적어도 하나와 “연관되는” 및 “특성을 갖는” 또는 “관련되는”은 과실 경도 형질 증진하는 유전 요소와 유전적으로 연관되는 DNA 서열을 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해되며, 이 때 특정 마커 서열은 유전자의 특정 대립유전자이다. 두 마커/서열이 유전적으로 관련된다고 말할 때는, 두 마커/서열간 재조합 빈도가 낮고 이들 두 마커/서열이 유전적으로 함께 유전되는 것이 기대될 수 있다. 본원에 개시된 식물의 집단에 있어, QTL과 관련되는 것으로 불리우는 마커는 1 cM 이하의 거리를 갖는다. 서로 1 cM 거리 분리되어 있는 마커는 일 세대에서 한번 재조합되므로 서로 격리될 확률이 1%이다.

“QTL의 과실 경도 제공 부분”는 실시예에 기술된 기계적 측정에 의해 결정되는 토마토 과실 경도의 증가의 원인이 되는 유전 요소(들) 또는 이들의 부분(들)을 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“과실 경도의 증가” 및 “증가된 과실 경도”는 최대 하중 증가량을 갖는 토마토 과실을 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해되며 (예를 들면, 실시예 1에 기술됨), 대조군 식물 과실과 비교했을 때 P < 0.05 또는 P < 0.01의 통계적 유의성을 갖는다.

최대 하중은 조직 유지의 실패의 실패를 야기하는 데 요구되는 가장 큰 하중 (뉴턴 (N))을 나타내는 값으로 정의된다.

“대조군 토마토 식물”은 본 발명의 재배된 토마토 식물과 동일한 유전적 배경을 갖는 토마토 식물을 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해되며, 대조군 식물은 과실 경도 증가와 관련되는 본 발명의 적어도 하나의 유전 요소(들) 또는 이의 부분을 갖지 않는다. 특히, 대조군 토마토 식물은 같은 식물 품종에 속하고 적어도 하나의 유전 요소 또는 이의 부분을 포함하지 않는 토마토 식물이다. 대조군 토마토 식물은 본 발명의 재배된 토마토 식물과 동일한 기간내 동일한 조건에서 자란다. 식물 품종은 본원에서 UPOV의 정의에 따라 이해된다. 따라서, 대조군 토마토 식물은 대조군 식물이 같은 식물 품종에 속하고 적어도 하나의 유전 요소 또는 이의 부분을 포함하지 않는 점만을 제외하고 본 발명의 토마토 식물과 동일한 유전 배경을 갖는다면 근교계 주 또는 잡종일 수 있다.

“개화기”는 꽃이 만발하고 꽃가루가 방출되는 시기를 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“가공 식품”은 자연 상태로부터 변화된 식품을 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다. 가공 식품에 이용되는 방법은 통조림화, 냉동, 냉장, 탈수 및 탈균 처리를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

“신선 편이 상품(fresh cut market)”은 가공이 최소화되어 판매되는 채소를 의미하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

“제일본잎”은 종자 잎이나 떡잎이 발생한 후 최초로 나타난 잎을 말하는 것으로 본 발명의 범위에서 이해된다.

식물 교배

농업과 원예업에서 교배 프로그햄의 목적은 이들의 유전 조성을 개선함으로써 식물의 기능을 증진하는 것이다. 본질적으로, 이 개선은 목적하는 기능 특성에 가장 큰 영향을 미치는 유전자의 대립형질의 빈도를 높임으로써 이루어진다.

야생형 식물 주는 유전형 및 표현형 변이의 풍부한 자원을 제공한다. 전통적으로, 농업이나 원예업 조작은 원하는 유전형 또는 잠재적인 표현형 특성을 갖는 야생형 식물 주 또는 이의 자손을 선택하고, 추가적으로 원하는 유전자형 또는 잠재적인 표현형 특성을 갖는 주와 이를 교배하고, 자손 식물 중에서 원하는 유전자형 또는 잠재적인 표현형 특성(또는 이의 빈도가 증가됨)을 나타내는 것을 선택함으로써 이러한 변이를 이용한다.

분자 유전 수단과 함께 멘델의 유전 법칙의 보다 깊은 이해와 이용은 지난 100년간 선택 과정을 촉진하였다. 예를 들면, 원하는 유전형 또는 잠재적인 표현형 특성을 갖도록 식물을 선택하는 방법은 양적 형질 유전자좌 (QTL) 존재하에, 즉, 연속적으로 분포되는 (양적) 표현형 형질의 발현과 연관되는 대립유전자를 포함하는 유전 요소의 존재 하에, 식물의 실험을 통해 이용될 수 있었다. 대개, QTL은 표현형 형질의 양적 변화와 통계적으로 관련되고 유전자와 본질적으로 동일한 하나 이상의 마커에 의해 규명된다. QTL 지도 작성은 목적하는 형질의 발현에 영향을 주는 유전 유소(들)의 동정을 가능하게 한다. 식물 교배에서, 이로써 식물에서 QTL 관련 마커를 검출함으로써 유리한 대립유전자를 갖는 식물을 선택하는 마커 의존 선택 (MAS)이 가능하게 된다.

다양한 형질의 유전 정보로 과실 경도 증가와 연관되는 QTL과 동종인 주를 선택할 수 있을 것이다. 교배 프로그램에서 원하는 형질의 유전적 기원과 위치 정보를 이용하면 종래의 교배 프로그램과 비교했을 때 예상 교배 산물의 정확도를 높이고 선택률을 증진할 수 있다. 예를 들면, 원하는 형질의 유전적 기원이 또다른 형질과 유전적으로 연관되는 것은 모두 자손이 아니면 원하는 대립유전자와 동종인 부모가 형질을 최대한 무시하므로 자손 중 두 형질에 대한 동일성 증가에 기여하여, 자손에서 분리의 감소를 초래한다.

본 개시된 요지는 보다 우수한 마커 의존 선택 (MAS) 모델을 제공한다. 본 개시된 요지는 식물 교배 방법과 토마토 식물 선택 방법을 제공하며, 특히 교배 프로그램 또는 재배된 토마토 식물에 이용되는 브리더 식물 또는 원하는 유전형 또는 잠재적인 표현형 특성을 갖는 재배된 토마토 식물, 특히 수확 단계에서 과실 경도가 증가된 토마토를 생성하는 식물의 제조 방법과 선택 방법에 관한 것이다.

따라서, 토마토를 생성하는 재배된 토마토 식물에서 적어도 하나의 유전 요소와 연관되는 수확 단계의 과실 경도가 증가된 토마토 과실로서, 상기 경도는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실보다 1.2배 내지 2.0배 높은 토마토 과실이 제공된다.

수확 단계는 녹숙 단계가 바람직하다. 또는, 수확 단계는 토마토 과실의 성장 중 선택된 시기일 수 있으며, 미녹숙 단계, 급속 확대 단계, 녹숙 단계, 브레이커 단계 또는 적숙 단계 또는 이들 단계 중 하나 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일 양태에 있어서, 수확기는 브레이터 단계 후 7일이다.

일 양태에 있어, 토마토를 생성하는 재배된 토마토 식물내 적어도 하나의 유전 요소와 연관되는 녹숙 단계의 과실 경도가 증가된 토마토 과실로서, 상기 경도는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실보다 1.2배 내지 2.0배 높은 토마토 과실이 제공된다. 다른 양태에 있어, 상기 경도는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실의 1.2배 내지 1.5배 높다.

일 양태에 있어, 토마토를 생성하는 재배된 토마토 식물내 적어도 하나의 유전 요소와 연관되는 브레이커 단계후 7일에 과실 경도가 증가된 토마토 과실로서, 상기 경도는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실보다 1.2배 내지 2.0배 높은 토마토 과실이 제공된다. 다른 양태에 있어, 상기 경도는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실의 1.2배 내지 1.5배 높다.

과실 경도는 재배된 토마토 식물의 외부 과피와 내부 과피에서 측정되는 것이 바람직하다. 또는, 과실 경도는 내부 과피에서만 측정된다. 바람직하게는, 과실 경도는 물리적 수단으로 측정된다. 전형적으로, Lloyd LRX 장치는 실시예 부분에서 기술된 바와 같이 이용된다. 이러한 측정은 종래의 경도계 분석과 매우 상관성이 있는 과실 경도의 섬세한 기계 측정값을 나타내지만, 실질적으로 보다 섬세하고 재생가능한 분석을 제공한다. 또한, 이들 측정은 과실 경도의 감각수용/감각 설명과 크게 관련된다(King et al, 2001). 그러나, 당업자에게 알려져 있는 다른 과실 경도 측정 방법은 Causse et al (2002)에 기술된 바와 같이 이용될 수도 있고, 이의 전문은 그 자체가 참조문헌으로서 본원에 병합된다.

바람직하게는, 대조군 토마토 식물은 기탁 번호가 NCIMB 41661인 M82이다.

또는, 대조군 식물은 재배된 토마토 식물에서 과실 경도 증가의 원인이 되는 적어도 하나의 유전 요소 또는 이의 부분이 없기 때문에 본질적으로 그의 자손과 다른 토마토 식물일 수 있다. 대조군 토마토 식물은 Solanum lycopersicum 종 (Lycopersicon lycopersicum 또는 Lycopersicon esculentum과 동의어) 또는 Lycopersicon (L. cerasiforrne, L. cheesmanii, L. chilense, L. chmielewskii, L. esculentum (현재, S. pennellii), L. hirsutum, L. parviborum, L. pennellii, L. peruvianum, L. pimpinellifolium, 또는 S. lycopersicoides를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님)의 속명으로 이미 알려진 종에 속하는 식물, 주 또는 집단을 의미한다. L. esculentum의 새로 제안된 학명은 S. pennellii이다. 마찬가지로, 야생종 이름은 달라질 수 있다. L. pennellii은 S. pennellii가 되었다. L. Hirsutum는 S. habrochaites가 되었고, L. peruvianum은 S. 'N peruvianum' 및 S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, 및 S. corneliomuelleri으로 구분될 수 있고, L. parviflorum은 S.neorickii가 될 수 있고, L. chmielewskii는 S. chmielewskii가 될 수 있고, L. chilense는 S. chilense가 될 수 있고, L. cheesmaniae는 S. cheesmaniae 또는 S. galapagense가 될 수 있고, L. pimpinellifolium는 S. pimpinellifolium가 될 수 있다 (Knapp (2005)).

바람직하게는, 본 발명의 과실 경도의 상당한 증가의 원인이 되는 유전 요소(들)은 토마토의 염색체 2에 존재한다. 바람직하게는, 적어도 하나의 유전 요소는 S. pennellii의 염색체 2에 존재한다. 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 유전 요소는 S. pennellii의 염색체 2의 긴 암(arm)에 존재한다. 가장 바람직하게는, 적어도 하나의 유전 요소는 S. pennellii의 염색체 2의 긴 암에 존재하고 QTL 1 내지 5 중 하나, 둘, 셋, 넷 또는 모두이다.

다른 특성에 있어, 본원에 기술된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커인 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 유전 요소를 포함하는 식물이 제공된다.

다른 특성에 있어, 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 식물은 LA4038 및 LA4039의 기탁 번호로 각각 기탁된 S. pennellii 주 IL2-3 및/또는 IL2-4에서 상응되는 유전 요소에 상보적인 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, S. pennellii IL2-3 및/또는 IL2-4 내의 상기 유전 요소는 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커인 것을 특징으로 하는 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 하나의 유전 요소를 갖고, 상기 유전 요소는 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 또는 d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5로부터 선택되는 QTL인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 HB2600, 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커 H0X7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 DNA 마커인 HB2600, 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 HB2600 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 및 DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 HB2600 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 및 DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 및 DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 및 DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 및 DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 재배된 토마토 식물이 제공된다.

또한, 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물로서, 상기 재배된 토마토 식물은 적어도 하나의 유전 요소를 포함하고, 상기 유전 요소는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고 내부 과피에만 존재하는 재배된 토마토 식물이 제공된다.

본 발명의 다른 특성에 있어, 근친 교배체, 이성반수체 또는 잡종인 본원에 기술된 재배된 토마토 식물이 제공된다. 일 양태에 있어, 재배된 토마토 식물은 웅성 불임이다.

본 발명의 다른 특성에 있어, 본원에 기술된 재배된 토마토 식물을 생성하는 토마토 종자가 제공된다.

본 발명의 다른 특성에 있어, 본원에 기술된 재배된 토마토 식물의 식물 부분이 제공된다.

다른 특성에 있어, 본원에 기술된 재배된 토마토 식물의 식물 부분으로부터 얻을 수 있는 식물 물질이 제공된다.

토마토의 과실 경도 증가와 연관되는 QTL 의 동정

또한, 본 개시된 요지는 대조군 토마토 식물의 과실보다 과실 경도가 증가된 과실을 갖는 재배된 토마토 식물을 선택하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 재배된 토마토 식물내 본원에서 정의된 QTL 1 내지 5 중 하나 이상의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 본 방법은 토마토 식물로부터 게놈 DNA 시료를 얻는 단계; 및 (b) 게놈 DNA 시료에서 적어도 하나의 분자 마커 QTL 1 내지 5로 구성되는 군으로부터 선택되는 QTL과 연관되는 적어도 하나의 분자 마커를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 검출 단계는 상기 군으로부터 QTL 1 내지 5 중 적어도 하나를 검출하는 적어도 하나의 분자 마커를 검출하는 단계를 포함한다. 토마토 식물로부터 게놈 DNA 시료를 얻는 단계는 본 기술분야에 공지되어 있는 표준 DNA 분리 방법에 의해 수행될 수 있다.

일부 양태에서는, 분자 마커 검출 단계((b) 단계)는 분자 마커를 정의하는 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산 프로브를 이용하고, 핵산 프로브는 분자 마커를 정의하는 핵산 서열과 가혹한 조건에서 특이적으로 하이브리드화한다. 적합한 핵산 프로브는 예를 들면 마커에 상응하는 증폭 산물의 단쇄일 수 있다. 분자 마커의 검출은 게놈 DNA상에서 핵산 증폭 반응을 수행하여 하나 이상의 QTL을 검출하는 단계도 포함한다. 이는 마커-특정 프라이머 세트를 이용하는 PCR 반응을 수행하여 달성될 수 있다. 일부 양태에서, 본 검출은 QTL 1 내지 5 중 하나 이상과 연관되는 하나 이상의 마커를 정의하는 적어도 하나의 프라이머 세트, 또는 QTL 1 내지 5 중 하나 이상과 연관되는 하나 이상의 마커의 핵산 서열과 가혹한 조건에서 특이적으로 하이브리드화하는 프라이머 세트를 이용한다.

본 방법은 QTL의 존재 여부와 연관되는 증폭된 DNA 단편을 검출하는 단계도 포함한다. 일부 양태에서는, GTL의 존재 여부와 연관되는 증폭 단편은 예상 길이 또는 핵산 서열을 갖고, 예상 길이나 예상 핵산 서열을 갖는 증폭된 DNA 단편의 검출은 증폭된 DNA 단편이 동일한 프라이머와 마커가 처음 검출되는 식물로부터 얻은 DNA를 이용하는 유사 반응을 통해 예상되는 길이에 상응하는 길이(수 개 안팎의 염기; 예컨대, 하나, 둘, 셋 이상 또는 이하의 염기), 또는 마커가 처음 검출되는 식물의 QTL과 연관되는 마커의 서열을 통해 예상되는 서열에 대응되는 (상동성이 일부 양태에서는 80%를 초과하고, 일부 양태에서는 90%를 초과하고, 일부 양태에서는 95%를 초과하고, 일부 양태에서는 97%를 초과하고, 및 일부 양태에서는 99%를 초과함) 핵산 서열을 갖도록 수행된다. 본 기술 분야의 당업자는 대조군 부모(들)에는 존재하지만, 과실 경도가 증가된 과실을 제공하는 식물에 결여된 마커 (소위, 트랜스-마커)는 특정 형질의 존재 여부를 검출하는 마커의 결여를 시험하는 것이 최적하지 않더라도 자손 식물에서의 과실 경도의 증가를 검출하는 분석에 유용할 수도 있다. 예상 길이 또는 예상 핵산 서열을 갖는 증폭된 DNA 단편의 검출은 다양한 방법(표준 겔 전기영동법을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님) 또는 자동 DNA 서열분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 이들 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

분자 마커 및 QTL

분자 마커는 핵산 서열간 차이를 가시화하는 데 이용된다. 가시화는 제한효소(RFLP)를 이용한 소화 후 DNA-DNA 하이브리드화 방법 및/또는 중합효소 연쇄반응을 이용한 방법(예컨대, STS, SSR/미소부수체, AFLP 등)에 의할 수 있다. 일부 양태에서는, 두 부모의 유전자형간 모든 차이는 이들 부모의 유전자형의 교배를 통한 맵핑 군집에서 분리된다. 상이한 마커의 분리를 비교할 수 있고 재조합 빈도를 계산할 수 있다. 식물내 마커의 지도작성 방법은 Glick & Thompson, 1993; Zietkiewicz et al., 1994 등에 기술되어 있다.

상이한 염색체상 분자 마커의 재조합 빈도는 일반적으로 50%이다. 동일한 염색체에 위치하는 분자 마커간 재조합 빈도는 일반적으로 마커간 거리에 의존한다. 낮은 재조합 빈도는 염색체상 마커간 가까운 유전적 거리에 상응된다. 모든 재조합 빈도를 비교하면, 염색체상 분자 마커의 가장 논리적인 순서를 얻을 수 있다. 가장 논리적인 순서는 연관 지도에 나타낼 수 있다 (Paterson, 1996). 과실 경도 증가량과 연관되는, 연관 지도에서 인접하거나 근접하는 마커의 그룹은 과실 경도 증가와 연관되는 QTL의 위치를 제공한다.

본원에서 동정된 마커는 본 개시된 요지의 다양한 특징에 이용될 수 있다. 본 개시된 요지의 특징은 본원에서 확인된 마커의 이용에 제한되지 않지만, 상기 특징은 본원에 명백하게 개시되지 않거나 아직 동정되지 않은 마커를 이용할 수도 있음을 강조한다. 표현형 발현이 예상될 수 없는 수많은 인자에 따라 달라지는 유전 단위 “유전자” 외에, 유전 단위 “QTL”은 표현형의 정량화될 수 있는 형질과 직접 관련되는 게놈상 영역을 나타낸다.

본원에서 동정된 다섯 개의 QTL은 토마토의 염색체 2상에 위치하고, 이들의 위치는 다른 임의적인 마커에 의해 규명될 수 있다. 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 마커, 증폭 단편 길이 다형성 (AFLP) 마커, 삽입 변이 마커, 서열-규명 증폭 영역 (SCAR) 마커, 절단 증폭 다형성 서열 (CAPS) 마커 또는 동질효소 마커 또는 이들 마커의 조합이 이용될 수도 있지만, 본 연구에서는, 미소부수체 마커 (예컨대, SSR) 및 단일염기 다형성 (SNP)이 이용되었다.

일반적으로, QTL은 수백만 염기 영역에 이른다. 따라서, QTL에 대한 완벽한 서열 정보를 제공하는 것은 인접하는 복수 개의 게놈 마커의 존재와 특정 표현형 형질의 존재간 상관 관계를 관찰하여 QTL가 최초로 검출된 방법으로 자손 식물의 군집에서 특정 표현형 형질을 나타내는 유전적 가능성을 갖는 식물을 추적할 수 있으므로 현실적으로 실현불가능할 뿐만 아니라 불필요하다. 마커의 비제한적인 리스트를 제공함에 따라, 본 개시된 요지는 교배 프로그램에서 여기에 바로 개시된 QTL의 효과적인 이용을 제공한다.

일반적으로, 마커는 특정 후손 주에 특이적이다. 따라서, 특정 형질은 특정 마커와 연관될 수 있다. 본원에 개시된 마커는 QTL의 위치를 나타낼 뿐만 아니라, 식물내 특정 표현형 형질의 존재 여부와 관련될 수도 있다. 게놈상에서 QTL의 위치를 나타내는 인접하는 게놈 마커는 대부분 임의적이거나 비제한적임을 주목해야 한다. 일반적으로, QTL의 위치는 표현형 형질과 통계적 상관관계가 있는 마커의 인접하는 스트링 의해 나타날 수 있음을 주목해야 한다. 마커가 그 스트링 외부에 나타나면 (즉, 소정의 역치보다 낮은 LOD값을 갖는 것으로서, 이는 마커가 너무 멀어서, 마커와 QTL 사이의 영역에서 재조합이 너무 빈번하여, 통계적 유의성 방법으로 마커의 존재 여부가 표현형의 존재와 상관관계가 없음을 나타냄), QTL 경계가 고정되었다고 생각될 수 있다. 따라서, 특정 영역에 위치하는 다른 마커에 의해 QTL의 위치를 나타낼 수도 있다. 인접하는 게놈 마커가 각 식물에서 QTL (또한 이에 따른 표현형)의 존재를 나타내는 데 이용될 수도 있음을 주목해야 하며, 때로는 이들이 마커 의존 선택 (MAS) 과정에도 이용될 수 있음을 의미한다. 원칙적으로, 이용가능한 마커의 수는 제한되지만 매우 크고, 본 기술 분야의 당업자는 본원에 구체적으로 기술된 것 뿐만 아니라 용이하게 마커를 동정할 수 있다. QTL과 연관된 마커 (예컨대, 소정의 역치를 초과하는 LOD값을 확립한 마커에 의해 차지하게 된 게놈 영역의 물리적 경계에 포함되어, 교배 중 마커와 QTL간 재조합이 없거나 매우 적게 발생됨을 나타내는 마커, QTL과 연관 불균형인 마커, 및 QTL내 실제 원인이 되는 변이를 나타내는 마커)는 MAS 과정에 이용될 수도 있다. 이는 QTL과 연관되는 것으로 본원에서 확인된 마커인 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200 등의 마커가 MAS 과정에 이용하기에 적합한 마커의 유일한 예임을 나타낸다. 게다가, QTL 또는 이의 특정 형질 부여 부분이 또다른 유전 배경 (즉, 또다른 토마토 또는 또다른 식물 종의 게놈)에 유전자 이입된 후, 일부 마커는 형질이 그 안에 존재하더라도, 자손에서 더 이상 발견될 수 없으며, 이는 이러한 마커가 최초 부모 주에만 존재하는 QTL의 특정 형질 제공부를 나타내는 게놈 영역 외부에 있고, 새로운 유전 배경이 다른 게놈 조직을 가짐을 의미한다. 마커의 결여는 자손에 유전 요소가 성공적으로 도입됨을 나타내는 마커는“트랜스 마커”(상술된 것을 참조할 것)라 부른다.

QTL의 동정 중에, QTL 효과 (즉, 과실 경도 증가)는 예를 들면 연구되는 QTL에서 자손 분리에 과실 경도를 접근하여 확인할 수 있다. 이러한 과실 경도의 접근은 본 기술 분야에 알려진 과실 경도를 측정함으로써 적절하게 수행될 수 있다.

본 개시된 요지에 의해 제공된 마커는 과실 경도가 증가된 토마토 식물내 본 개시된 요지의 QTL에서 하나 이상의 과실 경도가 증가된 대립유전자의 존재를 검출하는 데 이용되어, 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 마커 의존 교배 및 선택을 수반하는 방법에 이용될 수 있다. 일부 양태에서는, 본 개시된 요지의 QTL의 존재의 검출은 본원에서 정의된 QTL에 대한 마커의 적어도 하나를 이용하여 수행된다. 따라서, 본 개시된 요지는, 또다른 특징에 있어, 본원에 개시된 마커를 이용하여 존재 여부를 검출될 수 있는, 토마토 식물에서 QTL의 핵산 서열의 존재를 검출하는 것을 포함하는 과실 경도를 증가시키는 QTL의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 개시된 요지의 QTL의 뉴클레오티드 서열은 예를 들면 QTL과 연관되는 하나 이상의 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 마커 서열 외부에 존재하는 QTL 서열을 결정하는 데 이용될 수 있는 마커 서열에 대한 내부 프라이머를 지정함으로써 분석될 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 SSR 마커의 뉴클레오티드 서열은 대상 식물의 게놈내 마커의 존재를 결정하는 데 이용되는 전기영동 겔로부터 마커를 분리하고, 예를 들면, 본 기술 분야에 공지되어 있는 디데옥시 사슬 종결 시퀀싱 방법을 이용하여 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 얻을 수 있다. 이러한 토마토 식물내 QTL의 존재를 검출하는 방법의 양태에서, 본 방법은 가혹한 하이브리드화 조건에서 QTL과 연관되는 마커(일부 양태에서는 본원에 개시된 마커로부터 선택됨)의 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드도 제공하는 단계와, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 토마토 식물의 소화된 게놈 핵산에 접촉시키는 단계와, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 소화된 게놈 핵산의 특정 하이브리드화의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서는, 본 방법은 인 시투 하이브리드화 방법을 이용할 수도 있으나 토마토 식물에서 얻은 핵산 시료에서 수행된다. 또는, 본 기술 분야의 당업자는 QTL의 뉴클레오티드 서열이 결정되면 가혹한 하이브리드화 조건에서 QTL의 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 특정 하이브리드화 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 설계하고 이러한 하이브리드화 프로브를 토마토 식물에서 본원에 개시된 QTL의 존재를 검출하는 방법에 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 특성에 있어, a) 공여체 토마토 식물과 수여체 토마토 식물을 교배하여 자손 식물을 얻는 단계와, b) 자손 식물의 과실에서 과실 경도를 양적으로 분석하는 단계와, c) 상기 자손 식물에서 상기 공여체 식물로부터 적어도 하나의 DNA 마커의 존재에 관찰된 과실 경도 증가를 연계하는 유전 연관 지도를 확립하는 단계와, d) 과실 경도의 상당한 증가와 연관되는 상기 지도상 DNA 마커를 QTL에 지정하는 단계를 포함하는, 대조군 토마토 식물보다 과실 경도가 상당히 증가된 재배된 토마토 식물과 연관되는 QTL의 검출 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 공여체 식물은 수여체 식물에 비해 과실 경도가 상당히 증가된 과실을 갖는다.

공여체 식물은 바람직하게는 S. pennellii이고, 수여체 식물은 바람직하게는 S. lycopersicum이다. 모든 경우에서, 수여체 식물은 대조군 식물이다.

공여체 식물 또는 수여체 식물은 Solanum lycopersicum 종 (Lycopersicon lycopersicum 또는 Lycopersicon esculentum과 동의어) 또는 Lycopersicon (L. cerasiforrne, L. cheesmanii, L. chilense, L. chmielewskii, L. esculentum (현재, S. pennellii), L. hirsutum, L. parviborum, L. pennellii, L. peruvianum, L. pimpinellifolium, 또는 S. lycopersicoides를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님)의 속명으로 이미 알려진 종에 속하는 식물, 주 또는 집단을 의미한다. L. esculentum의 새로 제안된 학명은 S. pennellii이다. 마찬가지로, 야생종 이름은 달라질 수 있다. L. pennellii은 S. pennellii가 되었다. L. Hirsutum는 S. habrochaites가 되었고, L. peruvianum은 S. 'N peruvianum' 및 S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, 및 S. corneliomuelleri으로 구분될 수 있고, L. parviflorum은 S.neorickii가 될 수 있고, L. chmielewskii는 S. chmielewskii가 될 수 있고, L. chilense는 S. chilense가 될 수 있고, L. cheesmaniae는 S. cheesmaniae 또는 S. galapagense가 될 수 있고, L. pimpinellifolium는 S. pimpinellifolium가 될 수 있다 (Knapp (2005)).

일 양태에 있어, 자손 식물의 과실 경도 범위는 수확 단계에서 대조군 토마토 식물로부터 생성되는 과실보다 1.2배 내지 2.0배 이상 높다.

일 양태에 있어, 자손 식물의 과실 경도 범위는 대조군 토마토 식물 수확 단계에서 대조군 토마토 식물로부터 생성되는 과실보다 1.2배 내지 1.5배 이상 높다.

수확 단계는 바람직하게는 녹숙 단계이다. 또는, 수확 단계는 토마토 과실의 성장 중 임의의 선택된 시기일 수 있으며, 미녹숙 단계, 급속 확대 단계, 녹숙 단계, 브레이커 단계 또는 적숙 단계 또는 이들 단계 중 하나 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

일 양태에 있어, 적어도 하나의 DNA 마커는 S. pennellii에서 발견된다. 또는, 적어도 하나의 DNA 마커는 Solanum lycopersicum 종 (Lycopersicon lycopersicum 또는 Lycopersicon esculentum과 동의어) 또는 Lycopersicon (L. cerasiforrne, L. cheesmanii, L. chilense, L. chmielewskii, L. esculentum (현재, S. pennellii), L. hirsutum, L. parviborum, L. pennellii, L. peruvianum, L. pimpinellifolium, 또는 S. lycopersicoides를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님)의 속명으로 이미 알려진 종에 속하는 식물, 주 또는 집단을 의미한다. L. esculentum의 새로 제안된 학명은 S. pennellii이다. 마찬가지로, 야생종 이름은 달라질 수 있다. L. pennellii은 S. pennellii가 되었다. L. Hirsutum는 S. habrochaites가 되었고, L. peruvianum은 S. 'N peruvianum' 및 S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, 및 S. corneliomuelleri으로 구분될 수 있고, L. parviflorum은 S.neorickii가 될 수 있고, L. chmielewskii는 S. chmielewskii가 될 수 있고, L. chilense는 S. chilense가 될 수 있고, L. cheesmaniae는 S. cheesmaniae 또는 S. galapagense가 될 수 있고, L. pimpinellifolium는 S. pimpinellifolium가 될 수 있다 (Knapp (2005)).

또한, NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커가 제공된다.

본 발명의 QTL는 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 또는 d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상이다.

일 양태에 있어, QTL는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재한다.

다른 특성에 있어, 재배된 토마토 식물에 의해 제공되는 과실에서 과실 경도 증가와 연관되는 QTL이 제공된다. 바람직하게는, QTL은 본원에 개시된 방법에 의해 검출된다. QTL은 본 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 검출될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 적어도 하나의 QTL는 토마토의 염색체 2상에 존재한다. 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 QTL은 S. pennellii의 염색체 2상에 존재한다. 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 QTL은 S. pennellii의 염색체 2상 긴 암(arm)에 존재한다. 가장 바람직하게는, 적어도 하나의 유전 요소는 S. pennellii의 염색체 2의 긴 암에 존재하고 QTL 1 내지 5 중 하나, 둘, 셋, 넷 또는 모두이다.

일 양태에 있어, 본 발명의 QTL은 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커와 연관된다.

본 발명의 QTL은 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5; 및 이들의 조합물 중 하나 이상이다.

일 특정 양태에서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재한다.

또한, QTL 1 내지 5 중 하나, 둘, 셋, 넷 또는 모두를 포함하는 토마토 식물로부터 수득한 분리된 DNA 시료가 제공된다. DNA 시료는 실시예에 기술된 바와 같은 방법이나 당업자에게 익숙한 방법으로 분리된다.

유전자도입법에 의한 경도가 증가된 토마토 과실의 제조

본 개시된 요지의 또다른 특성에 있어, QTL 1 내지 5 중 하나 이상 또는 이의 과실 경도 제공부를 포함하는 핵산 (일부 양태에서는, DNA) 서열은 대조군 토마토 식물에 비해 경도가 증가된 과실을 제공하는 토마토 식물의 제조에 이용될 수 있다. 이 특성에 있어, 본 개시된 요지는 본원에서 정의된 QTL 또는 이의 과실 경도 증가 제공부의 대조군 토마토 식물에 비해 경도가 증가된 과실을 제공하는 토마토 식물을 제조하는 용도를 제공하고, 본 용도는 적합한 수여체 식물에 QTL을 포함하는 핵산 서열의 도입을 수반한다. 언급한 바와 같이, 핵산 서열은 대조군 토마토 식물에 비해 과실 경도가 증가된 적합한 공여체 식물로부터 유래된다. QTL 1 내지 5 중 어느 하나로서 본원에서 동정된 과실 경도가 증가된 유전자좌의 적합한 소스는 S. pennellii이다. 과실 경도 증가도가 다른 다수의 토마토 품종이 상품으로 판매되고 있다.

본원에 기술된 과실 경도가 증가된 유전자좌의 소스는 다니 자미르(Dani Zamir)와 동료들에 의해 처음으로 개발된 유전자이입 주, IL-2 및 IL-3이다 (Eshed & Zamir, 1994). 이들 주는 캘리포니아 데이비스에 소재하는 토마토 유전학 자원 센터 (http://tgrc.ucdavis.edu/) 또는 이스라엘 예루살렘, 히브리 대학의 다니 자미르로부터 얻었다. 적합한 공여체 식물에서 동정되면, 과실 경도를 증가시키는 QTL 또는 이의 과실 경도 증가 제공부를 포함하는 핵산 서열은 이용가능한 임의의 방법에 의해 적합한 수여체 식물로 이식될 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열은 유전자이입, 형질전환, 원형질 융합, 복반수체 방법, 미숙배 배양, 또는 다른 핵산전달계에 의해 공여체 토마토 식물을 수여체 식물과 교배한 후 전달될 수 있다. 전달을 통한 유전자도입법에 있어, 과실 경도를 증가하는 QTL, 또는 이의 과실 경도 증가 제공부를 포함하는 핵산 서열은 본 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 공여체 식물로부터 분리될 수 있고, 분리된 핵산 서열은 예를 들면, 벡터를 이용하여, 생식 세포에서 또는 핵산 서열이 코팅된 탄도 입자 등 다른 적합한 전달 요소에서, 유전자도입법에 의해 수여체 식물로 전달될 수 있다.

식물 형질전환은 일반적으로 식물 세포에서 작용하는 발현 벡터의 구성을 수반한다. 본 개시된 요지에서 이러한 벡터는 과실 경도를 증가하는 QTL, 또는 이의 과실 경도 증가 제공부를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 벡터는 프로모터 등 조절 요소의 조절하에 또는 이와 효과적으로 연관되는 과실 경도 증가 제공부를 포함한다. 발현 벡터는 조합물에 포함된 유전자 중 적어도 하나가 과실 경도 증가를 암호화한다면 하나 이상의 사용가능하도록 연관된 유전자/조절 요소 조합물을 포함한다. 벡터(들)은 플라스미드 형태일 수 있고, 단독이나 다른 플라스미드와 혼합하여 이용되어 아그로박테리움 형질전환계 등 본 기술분야에 공지된 형질전환 방법을 이용하여 과실 경도가 증가된 형질도입 식물을 제공한다.

발명자는 분자 수준에서 QTL 1 내지 5를 규명하고, 발현 벡터 용도로 수 개의 예상 후보 유전자를 동정하였다. 예상 유전자 리스트는 다음과 같다: 본원에 기술된 QTL1은 피튜니아 유전자 pMADS3 (Tsuchimoto et al. 1993. Plant Cell 5, 843-853)와 서열로 관계되는 MADS-박스 전사 인자, TG451에 관한 것이고, 본원에 개시된 QTL2는 에틸렌 반응성 전사 인자 (SL1.00sc00226_365.1) 위치 3895565 내지 3896029 (-쇄)에 상응되는 개방형 해독틀에 관한 것이고, 본원에 개시된 QTL3은 펙틴에스테라아제/펙틴에스테라아제 저해제 (신젠타 유전자칩 프로브 ID, Le0023899)에 상응되는 개방형 해독틀에 관한 것이다. 본원에 개시된 QTL4는 도프 징크 휭거 단백질 (dof zinc finger protein) 6 (SL1.00sc00226_436.1.1) 위치 4475868 내지 4476845 (+쇄)에 상응하는 개방형 해독틀에 관한 것이다. 본원에 개시되는 QTL5은 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질 (SL1.00sc00226_51 1.1) 위치 5133572 내지 5135660 (-쇄)에 상응되는 개방형 해독틀에 관한 것이다. 에틸렌 반응성 전사 인자, 도프 징크 휭거 6 및 평형화 뉴클레오시드 수송체 단백질의 보다 상세한 설명은 http://soigenomics.net/에서 얻을 수 있다.

발현 벡터는 (선택가능한 마커 유전자를 포함하지 않는 세포의 성장을 저해함으로써) 음의 선택에 의하거나, (마커 유전자에 의해 암호화된 산물을 선별함으로써) 양의 선택에 의해 마커를 포함하는 형질도입 세포가 발견될 수 있게 하는 조절 요소(프로모터 등)와 연관될 수 있는 적어도 하나의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 식물 형질전환에 일반적으로 이용되는 선택가능한 마커 유전자는 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들면, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택적 화학물질을 대사작용으로 해독하는 효소를 암호화하는 유전자, 또는 저해제에 무감각한 변화된 표적을 암호화하는 유전자일 수 있다. 만노오스 선택 등 다양한 양의 선택 방법이 본 기술 분야에 알려져 있다. 또는, 마커없는 형질전환은 상술한 마커 유전자 없이 식물을 얻는 데 이용될 수 있고, 이러한 방법도 본 기술 분야에 알려져 있다.

식물에 발현 벡터를 도입하는 방법은 아그로박테리움의 자연 형질전환계를 기반으로 한다 (Horsch et al., 1985 참조). A. tumefacien 및 A. rhizogene는 식물 세포를 유전적으로 형질변환하는 식물 병원성 토양 박테리아. A. tumefaciens 및 A. rhizogenes의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질변환의 원인이 되는 유전자를 운반한다 (예컨대, Kado, 1991 참조). 식물 조직에 발현 벡터를 도입하는 방법은 직접 감염 또는 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 식물 세포의 공동 배양을 포함한다 (Horsch et al., 1985). 아그로박테리움 벡터계 및 아그로박테리움-매개 유전자 전이 방법의 설명은 Gruber & Crosby, 1993, Moloney et al., 1989, 및 미국 특허 제 5,591,616호에 제공된다. 식물 발현 벡터 및 리포터 유전자 및 형질전환 프로토콜의 개략적인 설명과 아그로박테리움 벡터계 및 아그로박테리움-매개 유전자 전이 방법의 설명은 Gruber & Crosby, 1993에서 찾을 수 있다. 일반적인 식물 조직 배양 방법은 예를 들면 Miki et al., 1993, 및 Phillips et al., 1988에 제공된다. 분자 클로닝 방법과 적합한 발현 벡터의 참조 문헌은 Sambrook & Russell, (2001)에 나타난다.

식물에 발현 벡터를 도입하는 다른 방법은 미세발사체-매개 형질전환을 기반으로 하고, DNA는 미세발사체 표면에서 운반된다. 발현 벡터는 식물 세포벽 및 세포막 (Sanford et al., 1987; Klein et al., 1988; Sanford, 1988; Sanford, 1990; Klein et al., 1992; Sanford et al., 1993 참조)을 침투하기에 충분한 300 내지 600 m/s으로 미세발사체의 속도를 촉진하는 발리스틱 디바이스를 이용하여 식물 조직으로 도입한다. 식물에 DNA를 도입하는 다른 방법은 표적 세포의 초음파처리에 의한 것이다(Zhang et al., 1991 참조). 또는, 리포좀 또는 스페로플라스트 융합은 식물에 발현 벡터를 도입하는 데 이용될 수 있다 (Deshayes et al., 1985 및 Christou et al., 1987 참조). CaCI2 침전, 폴리비닐 알콜, 또는 폴리-L-오르니틴를 이용한 원형질내 직접 DNA 도입은 보고되었다 (예컨대, Hain et al. 1985 및 Draper et al., 1982 참조). 원형질체 및 전체 세포 및 조직의 전기청공법도 기술되었다 (D'Halluin et al., 1992 및 Laursen et al., 1994).

토마토 게놈의 일부가, 대장균에서 발견된 자연발생한 F-인자 플라스미드를 기반으로 하는 대장균 세포에서 DNA 단편의 클로닝에 이용되는 벡터 (100- 내지 300-kb 삽입 크기; 평균 150 kb)인, 박테리아 인공 염색체 (BAC)로 도입되는 BAC의 이용 등 공지된 방법(Zhao & Stodoisky, 2004)가 예를 들면 Bi BAC계와 함께 이용되어 (Hamilton, 1997) 형질도입 식물을 생성할 수 있다. 과발현 벡터의 일 예는 pGWB405이다 (Nakagawa T, Suzuki T, Murata S at el.. Improved Gateway Binary Vectors: High-performance Vectors for CREATION of Fusion Constructs in Transgenic Analysis of Plants. Bioscience biotechnology Biochemistry, 71 (8)2095-2010, 2007). 과발현 구조 생성을 위해, 토마토 과실 경도의 조절에 관련되는 후보 유전자의 완벽한 개방형 해독틀에 대응되는 서열은 제한 영역이 필요 없는 게이트웨이 클론계를 이용한 CaMV 35S 프로모터 앞에서 클로닝될 수 있다. 이러한 구조는 반대쪽 말단에 CaMV 종결체를 포함한다. RNAi 구조 생성을 위해, 토마토 과실 경도 조절에 관련되는 후보 유전자에 독특한 코딩 서열의 단편은 예를 들면 게이트웨이 시스템 RNAi 벡터 pK7GWIWG2(l)에서 클로닝될 수 있다.

토마토 표적 조직의 형질전환 후, 상술한 선택가능한 마커 유전자의 발현은 표준 재생 및 선택 방법을 이용하여 형질변환 세포, 조직 및/또는 식물의 우선적인 선택을 허용한다.

발현도가 더 높은 과실 경도를 갖는 재조합에서 달라지는 다섯 개의 유전자가 제공된다. 다섯 개의 유전자는 TG451 (MADS 박스 전사 인자), 에틸렌 반응성 전사 인자 12, 펙틴 메틸에스테라제, 도프 징크 휭거 단백질 6 및 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질을 암호화하고, QTL 1 내지 5의 위치에 각각 대응되는 것으로 밝혀졌다. mRNA 발현 분석에서 에틸렌 반응성 전사 인자 12는 브레이커 단계에서 경도 증가와 반비례 관계가 있으나, 펙틴 메틸에스테라제는 정비례 관계가 있는 것으로 나타났다 (도 8). 야생형 M82에 비해 유전자이입 주 IL2-4 및 IL2-3에서 도프 징크 휭거 단백질 mRNA 양이 낮았다 (도 9). 이러한 데이터를 고려하면, 토마토 식물 등 식물은 에틸렌 반응성 전사 인자 12 및/또는 도프 징크 휭거 단백질 6을 하강조절된 양으로 포함하거나 포함하지 않고, 펙틴 메틸에스테라제를 상승조절된(또는 과발현된) 양으로 포함하는 식물은 과실 경도가 증가된다. MADS 박스 전사 인자인 TG451과 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질도 과실 경도 개선에 관련되었다 (실시예 9 참조).

본 발명은 a) 에틸렌 반응성 전사 인자 12 또는 펙틴 메틸에스테라제 또는 도프 징크 휭거 단백질 6 또는 TG451 또는 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질에 대응되는 개방형 해독틀 또는 이의 부분에 대응되는 뉴클레오티드 서열; b) a)의 뉴클레오티드 서열과 80%이상 동일한 뉴클레오티드 서열; c) a)의 뉴클레오티드 서열의 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열; d) 뉴클레오티드 서열 a) 내지 c) 중 하나의 보체와 가혹한 조건에서 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열; 및 e) 뉴클레오티드 서열 a) 내지 d) 중 하나의 보체와 가혹한 조건에서 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 일 양태에서, b) 단계의 뉴클레오티드 서열은 a) 단계의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일하다.

일 양태에서, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열은 MADS 박스 전사 인자인 TG451이다. 다른 양태에 있어, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열은 에틸렌 반응성 전사 인자 12이다. 다른 양태에 있어, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열은 펙틴 메틸에스테라제이다. 다른 양태에 있어, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열은 도프 징크 휭거 단백질 6이다. 다른 양태에 있어, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열은 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질이다.

또한, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터도 제공된다. 일 양태에서, 분리된 뉴클레오티드 서열은 센스 방향이다. 다른 양태에 있어, 분리된 뉴클레오티드 서열은 안티센스 방향이다.

또한, 본 발명의 벡터를 발현하는 숙주 세포도 제공된다.

본 발명의 숙주 세포를 포함하는 형질도입 식물 또는 이의 부분도 제공된다. 일 양태에서, 형질도입 식물 또는 이의 부분은 단자엽이다. 식물 또는 이의 부분은 토마토 등 이자엽이다.

본 발명에 따른 숙주 세포로부터 식물을 재생하는 단계를 포함하는 형질도입 식물의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 방법으로 제조된 재배된 식물 또는 이의 부분이 제공된다.

본 발명의 벡터로 식물을 형질도입하는 단계를 포함하는 토마토 식물 등 형질도입 식물의 과실의 조직감을 조절하는 방법이 제공된다. 양태에서, 형질도입되지 않은 식물의 과실보다 과실 성숙 속도가 증가된다. 다른 양태에 있어, 형질도입되지 않은 식물의 과실보다 과실 성숙 속도는 감소된다. 일 양태에서, 토마토 성숙 속도는 브레이커 단계에서 측정된다.

본 발명의 벡터를 이용하여 식물의 형질도입하는 단계를 포함하는 토마토 식물 등 형질도입 식물의 과실내 토마토 과실 색소의 함량을 조절하는 방법이 제공된다. 일 양태에서, 형질도입되지 않은 식물의 과실보다 과실 색소 함량이 증가된다. 일 양태에서, 형질도입되지 않은 식물의 과실보다 과실 색소 함량은 감소된다. 일 양태에서, 과실 색소 함량은 브레이커 단계에서 측정된다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 얻은 토마토 식물 등 식물 또는 이의 부분이 제공된다.

또한, 식물 또는 식물의 하나 이상의 부모로부터 DNA를 분리하는 단계와, 본 발명의 분리된 서열에 대응하는 서열이나 이에 근접하는 DNA의 영역에서 유전 마커를 선별하는 단계와, 하나 또는 둘의 부모로부터 각 개체로 마커의 공동 유전을 결정하는 단계를 포함하는 가지과(Solanaceae) 식물의 토마토 조직감을 나타내는 유전자 마커의 검출 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 유전자 마커의 검출 방법에 의해 검출될 수 있는 유전자 마커가 제공된다.

또한, 토마토 과실을 맺을 수 있는 재배된 토마토 식물을 제조하기 위한 유전자 마커의 용도가 제공된다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 생성된 재배된 토마토 식물 또는 이의 부분이 제공된다.

또한, 신선 편이 상품 또는 식품 가공을 위한 본 발명에 따른 재배된 토마토 식물 또는 이의 부분의 용도가 제공된다.

토마토 식물 등 식물 과실의 성숙 속도 또는 색소 함량을 조절하기 위한 본 발명의 분리된 뉴클레오티드 서열의 용도가 제공되고, 이 때 조절은 식물의 유전적 변이의 영향을 받는다.

또한, 본 발명의 방법의 용도가 제공된다.

유전적 변이는 트랜스포존 삽입 돌연변이생성, T-DNA 삽입 돌연변이생성, 틸팅(TILLING), 특정 위치 돌연변이생성, 인위적 진화, 및 동종 재조합으로 구성되는 리스트로부터 선택된 방법에 의해 도입된다. 일 양태에서, 유전적 변이는 틸팅에 의해 도입된다.

비유전자도입법에 의한 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 제조

과실 경도가 증가된 토마토 식물을 제조하는 일부 양태에서, 원형질 융합은 공여체 식물에서 수여체 식물로 핵산의 이식에 이용된다. 원형질 융합은 단일, 이중 또는 다중 세포핵 세포를 생성하는 체세포 하이브리드화 등 둘 이상의 원형질체간 유도되거나 자발적인 조합(세포벽은 효소 처리에 의해 제거됨)이다. 자연적으로는 이종 교배될 수 없는 식물 품종으로부터 얻을 수 없는 융합 세포는 형질의 바람직한 조잡을 나타내는 잡종 식물로 배양된 조직이다. 보다 상세하게는, 제 1 원형질은 과실 경도가 증가된 토마토 식물 또는 다른 식물주로부터 얻을 수 있다. 제 2 원형질은 제 2 토마토 식물 또는 다른 식물 품종, 바람직하게는 상업상 유리한 특성을 갖는 토마토 식물주로부터 얻을 수 있다. 이어서, 원형질은 본 기술 분야에 알려져 있는 종래의 원형질 융합과정을 통해 융합된다.

또는, 미숙배 배양은 본원에 기술된 하나 이상의 QTL를 포함하는 핵산의 공여체 토마토 식물로부터 수여체 토마토 식물로의 전달에 이용될 수 있다. 미숙배 배양은 교배체로부터 배아를 분리하는 과정으로서 이용되며, 식물은 생존가능한 종자를 생성하지 못한다. 이 과정에서, 식물의 수정된 씨방이나 미성숙 종자는 새로운 식물을 생성하도록 배양된 조직이다 (Pierik, 1999). 본 개시된 요지는 본원에 기술된 공여체 토마토 식물에서 과실 경도 증가와 연관되는 QTL의 존재 여부를 검출하는 단계와 검출된 적어도 하나의 QTL을 포함하는 핵산 서열 또는 과실 경도 증가 제공부 또는 이의 부분을 공여체 식물에서 수여체 토마토 식물로 전달하는 단계를 포함하는 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 제조 방법에 관한 것이다. 핵산 서열의 전달은 앞서 기술된 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다

이러한 방법의 일 양태는 식물을 교배함으로써 공여체 토마토 식물에서 수여체 토마토 식물로 유전자이입에 의해 핵산 서열을 전달하는 단계를 포함한다. 이러한 전이는 종래의 교배 방법을 이용하여 적절하게 수행될 수 있다. QTL은 일부 양태에서 마커 의존 선택 (MAS) 또는 마커 의존 교배 (MAB)에 의해 상업용 토마토 품종에 유전자도입된다. MAS 및 MAB는 원하는 형질을 위해 암호화하는 유전자의 하나 이상을 포함하는 자손 식물의 동정화 및 선택을 위한 분자 마커를 하나 이상 사용한다. 본 개시된 요지의 맥락에서, 이러한 동정과 선택은 본 개시된 요지의 QTL 또는 이와 관련된 마커의 선택을 토대로 이루어진다. MAS는 목적하는 QTL을 포함하는 근동질계 주 (NIL)의 성장에 이용되어, QTL 효과의 상세한 연구를 가능하게 하며 역교배 근교계 주 (BIL) 군집의 효과적인 육종 방법이다 (Nesbitt & Tanksley, 2001 ; van Berloo et al., 2001 등 참조). 이들 양태에 따라 성장된 토마토 식물은 수여체 식물로부터 많은 형질을 얻을 수 있고 공여체 식물로부터 과실 경도 증가를 얻을 수 있어 유리하다. 본원에서 논의된 바와 같이, 종래의 교배 방법은 수여체 토마토 식물 과실 경도 증가 암호화 핵산 서열을 유전자도입하는 데 이용된다. 일부 양태에서는, 과실 경도가 증가되고 과실 경도 증가를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 공여체 토마토 식물은, 일부 양태에서, 상업상 바람직한 특성을 나타내는 수여체 토마토 식물과 교배된다.

결과로 얻은 식물 군집 (F1 잡종을 나타냄)은 그 후에 자가 수분되어 종자를 정한다 (F2 종자). F2 종자로부터 성장된 F2 식물에 있어, 본 당업자에게 알려진 방법에 의해 과실 경도 증가를 분석한다.

과실 경도가 증가된 토마토 식물주는 순환 선택 및 역교배, 자가생식, 및/또는 이성반수체 방법, 또는 부모주 생성에 이용되는 다른 방법을 이용하여 성장될 수 있다. 순환 선택 및 역교배 방법에서, 과실 경도 증가는 순환 부모와 순환 부모와 다른 제 1 공여체 식물을 교배하여 표적 수여체 식물 (순환 부모)에 도입될 수 있고, 본원에서 이는 “비순환 부모”라 일컫는다. 순환 부모는 과실 경도가 증가되지 않았지만 상업상 바람직한 특성을 갖지 않는 식물이다.

일부 양태에서는, 비순환 부모는 과실 경도가 증가되고 과실 경도 증가를 암호화하는 과실 경도 증가를 암호화하는 핵산 서열이다. 비순환 부모는 순환부모와 교배가능한 식물 품종 또는 근교계 주일 수 있다.

순환 부모 및 비순환 부모간 교배로부터 얻은 자손은 순환 부모와 역교배된다. 그 후, 이로써 얻은 식물 군집의 과실 경도 증가를 검사한다. 마커 의존 선택 (MAS)은 본원에 기술된 분자 마커 중 하나 이상을 이용하거나, 과실 경도 증가를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 자손을 동정하는 하이브리드화 프로브, 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, MAS는 양적 과실 경도 측정으로부터 얻은 결과를 확인하는 데 이용될 수 있다.

분석 후, 과실 경도 증가 표현형(또는, 일부 양태에서는, 유전자형)을 나타내어, 과실 경도 증가를 암호화하는 데 필요한 핵산 서열을 포함하는 F1 잡종 식물이 선택되고 토마토 식물이 점차 근친 교배될 수 있도록 다수의 순환 부모와 역교배된다 이 과정은 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟 또는 이 이상의 세대에서 수행될 수 있다. 원칙적으로, 과실 경도가 증가된 순환 부모와 비순환 부모를 교배하는 과정에서 얻은 자손은 과실 경도 증가를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 이종이다.

일반적으로, 잡종 토마토종에 원하는 형질을 도입하는 방법은,

(a) 근친교배된 토마토 부모와 하나 이상의 원하는 형질로서 과실 경도 증가를 포함하는 또다른 토마토 식물을 교배하여 F1 자손 식물을 생성하는 단계로서 원하는 형질은 과실 경도 증가인 단계와;

(b) (일부 양태에서는 본원에 개시된 분자 마커를 이용하여) 원하는 형질을 갖는 F1 자손 식물을 선택하여 선택된 F1 자손 식물을 생성하는 단계와;

(c) 선택된 자손 식물을 근친교배된 토마토 부모 식물과 역교배하여 역교배 자손 식물을 생성하는 단계와;

(d) 근친교배된 토마토 부모 식물의 원하는 형질과 형태적 및 생리적 특성을 갖는 역교배 자손 식물을 선택하는 단계로서, 선택은 본원에 개시된 일부 양태에서는 게놈 DNA를 분리하고 DNA내 본원에 기술된 QTL1, QTL2, QTL3, QTL4 및/또는 QTL5의 적어도 하나의 분자 마커의 존재를 시험하는 단계를 포함하는 단계와;

(e) (c) 및 (d) 단계를 차례로 2회 이상 반복하여 제 3 또는 그 이상의 역교배 자손 식물을 생성하는 단계와;

(f) 동종 식물을 동정하기 위해 선택된 역교배 자손을 선택적으로 자가생식하는 단계와;

(g) 역교배 자손 또는 자가생식 식물 중 적어도 하나를 또다른 근친교배된 토마토 부모 식물과 교배하여 동일한 조건에서 자랐을 때 잡종 토마토의 원하는 형질과 형태적 및 생리적 특성을 갖는 잡종 토마토 종을 생성하는 단계를 포함한다.

언급한 바와 같이, 마지막 역교배 새대는 과실 경도가 증가된 동종 순종 교배 (근친교배) 자손을 부여하도록 자가생식된다. 따라서, 순환 선택, 역교배, 및 자가생식의 결과로서, 과실 경도 증가와 연관되는 유전자 (일부 양태에서는 상업적으로 유리한 형질과 연관되는 다른 유전자)와 유전적으로 동종인 주가 생성된다.

따라서, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도 증가와 연관되는 QTL을 검출하는 단계와, 적어도 하나의 QTL를 포함하는 핵산을 공여체 토마토 식물에서 수여체 토마토 식물로 전달하는 단계를 포함하는 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, 과실 경도 증가는 대조군 토마토 식물의 과실과 재배된 토마토 식물의 과실을 비교되는 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 개시된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물의 제조 방법으로서, 핵산의 전달은 형질전환, 원형질 융합, 복반수체 방법 또는 미숙배 배양에 의해 수행된다.

일 양태에 있어, 본원에 개시된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물의 제조 방법으로서, 자손 토마토 식물의 과실 경도 범위는 수확 단계의 대조군 토마토 식물 과실의 1.2배 내지 2.0배 높은 방법이 제공된다. 또는, 자손 토마토 식물의 과실 경도 범위는 수확 단계의 대조군 토마토 식물 과실의 1.2배 내지 1.5배이다. 바람직하게는, 수확 단계는 녹숙 단계이다. 또는, 수확 단계는 미녹숙 단계, 급속 확대 단계, 브레이커 단계 또는 적숙 단계 또는 이들 단계 중 하나 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 일 수 있다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, 과실 경도 범위는 브레이커 단계 후 7일까지 지속된다.

다른 특성에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, 공여체 식물은 S. pennellii이고 수여체 식물은 S. lycopersicum인 방법이 제공된다. 또는, 공여체 식물 또는 수여체 식물은 Solanum lycopersicum 종 (Lycopersicon lycopersicum 또는 Lycopersicon esculentum과 동의어) 또는 Lycopersicon (L. cerasiforrne, L. cheesmanii, L. chilense, L. chmielewskii, L. esculentum (현재, S. pennellii), L. hirsutum, L. parviborum, L. pennellii, L. peruvianum, L. pimpinellifolium, 또는 S. lycopersicoides를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님)의 속명으로 이미 알려진 종에 속하는 식물, 주 또는 집단을 의미한다. L. esculentum의 새로 제안된 학명은 S. pennellii이다. 마찬가지로, 야생종 이름은 달라질 수 있다. L. pennellii은 S. pennellii가 되었다. L. Hirsutum는 S. habrochaites가 되었고, L. peruvianum은 S. 'N peruvianum' 및 S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, 및 S. corneliomuelleri으로 구분될 수 있고, L. parviflorum은 S.neorickii가 될 수 있고, L. chmielewskii는 S. chmielewskii가 될 수 있고, L. chilense는 S. chilense가 될 수 있고, L. cheesmaniae는 S. cheesmaniae 또는 S. galapagense가 될 수 있고, L. pimpinellifolium는 S. pimpinellifolium가 될 수 있다 (Knapp (2005)).

본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상인 방법이 제공된다.

또한, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재하는 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 HB2600 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 및 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4인 방법이 제공된다.

특정 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 HB2600 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 및 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 및 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 및 DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 및 DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 및 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 및 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5인 방법이 제공된다.

일 양태에 있어, 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 과실을 생성하는 토마토 식물의 제조 방법으로서, QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재하는 방법이 제공된다.

다른 특성에 있어, 본원에 개시된 방법에 의해 수득가능한 토마토 식물, 또는 이의 부분이 제공된다.

다른 특성에 있어, 본원에 개시된 과실 경도의 원인이 되는 QTL을 포함하는 재배된 토마토 식물이 제공된다.

다른 특성에 있어, 본원에 개시된 토마토 식물과 상업상 바람직한 특성을 갖는 토마토 식물을 교배하여 얻을 수 있는 잡종 토마토 식물, 또는 이의 부분이 제공된다.

다른 특성에 있어, 본원에 개시된 토마토 식물을 재배하여 생성된 토마토 종자가 개시된다.

다른 특성에 있어, 대조군 식물보다 과실 경도가 상당히 증가한 식물을 얻을 수 있도록 본원에 기술된 재배된 토마토 식물과 바람직한 표현형 형질을 갖는 식물을 교배하여 얻은 토마토 종자가 제공된다.

다른 특성에 있어, 대조군 식물보다 과실 경도가 증가된 토마토 식물을 생성하기 위한 본원에 기술된 QTL의 용도가 제공된다.

다른 특성에 있어, 토마토 과실의 수확 슬롯을 연장하기 위한 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 용도가 제공된다. 수확 슬롯은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 연장될 수 있다.

다른 특성에 있어, 신선 편이 상품 또는 식품 가공을 위한 본원에 기술된 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 용도가 제공된다.

다른 특성에 있어, 본원에 개시된 적어도 하나의 QTL을 포함하는 토마토 식물로 구성되는 가공 식물이 제공된다.

본 발명의 양태

양태 1: 토마토를 생성하는 재배된 토마토 식물에서 적어도 하나의 유전 요소와 연관되는 수확 단계의 과실 경도가 증가된 토마토 과실로서, 상기 경도는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실보다 1.2배 내지 2.0배 높은 토마토 과실.

양태 2: 상기 수확 단계는 녹숙 단계인 양태 1에 따른 토마토 과실.

양태 3: 상기 과실 경도는 적어도 하나의 유전 요소를 갖지 않는 대조군 토마토 식물 과실보다 1.2배 내지 1.5배 높은 양태 1 또는 2에 따른 토마토 과실.

양태 4: 상기 경도 범위는 브레이커 후 7일에 측정되는 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 토마토 과실.

양태 5: 상기 유전 요소는 염색체 2의 긴 암에 위치하는 선행하는 양태 중 어느 하나에 따른 토마토 과실.

양태 6: a) 상기 적어도 하나의 유전 요소는 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커와 연관되고/연관되거나, b) 적어도 하나의 유전 요소는 기탁번호 LA4038 및 LA4039로 각각 기탁된 Solanum pennellii 주 IL2-3 및 IL2-4내 대응 유전 요소에 상보적이고, LA4038 및 LA4039내 상기 적어도 하나의 유전 요소는 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커와 연관되는 것을 특징으로 하는 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 토마토 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물.

양태 7: 상기 적어도 하나의 유전 요소는 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 또는 d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5로부터 선택되는 하나 이상의 QTL인 양태 6에 따른 재배된 토마토 식물.

양태 8: 상기 QTL은 DNA 마커커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고 내부 과피에만 존재하는 양태 7에 따른 재배된 토마토 식물.

양태 9: 근친 교배체, 이성반수체 또는 잡종인 양태 6 내지 8 중 어느 하나에 따른 재배된 토마토 식물.

양태 10: 웅성 불임성인 양태 9에 따른 재배된 토마토 식물.

양태 11: 양태 6 내지 10 중 어느 하나에 따른 재배된 토마토 식물을 생성하는 토마토 종자.

양태 12: 양태 11에 따른 재배된 토마토 식물의 식물 부분.

양태 13: 양태 12에 따른 재배된 토마토 식물의 식물 부분으로부터 얻을 수 있는 식물 물질.

양태 14: a) 공여체 토마토 식물과 수여체 토마토 식물을 교배하여 자손 식물을 얻는 단계와, b) 자손 식물의 과실에서 과실 경도를 양적으로 분석하는 단계와, c) 상기 자손 식물에서 상기 공여체 식물로부터 적어도 하나의 DNA 마커의 존재에 관찰된 과실 경도 증가를 연계하는 유전 연관 지도를 확립하는 단계와, d) 과실 경도의 상당한 증가와 연관되는 상기 지도상 DNA 마커를 QTL에 지정하는 단계를 포함하는, 대조군 토마토 식물보다 과실 경도가 상당히 증가된 재배된 토마토 식물과 연관되는 QTL의 검출 방법.

양태 15: 상기 공여체 식물은 수여체 식물에 비해 과실 경도가 상당히 증가된 과실을 갖는 양태 14에 따른 방법.

양태 16: 상기 공여체 식물은 S. pennellii이고, 상기 수여체 식물은 S. lycopersicum인 양태 14 또는 15에 따른 방법.

양태 17: 자손 식물의 과실 경도 범위는 수확 단계에서 대조군 토마토 식물로부터 생성되는 과실보다 1.2배 내지 2.0배 이상 높은 양태 14 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법.

양태 18: 자손 식물의 과실 경도 범위는 수확 단계에서 대조군 토마토 식물로부터 생성되는 과실보다 1.2배 내지 1.5배 이상 높은 양태 17에 따른 방법.

양태 19: 상기 수확 단계는 녹숙 단계인 양태 17 내지 18 중 하나에 따른 방법.

양태 20: 상기 적어도 하나의 DNA 마커는 Solanum pennellii에서 발견되는 양태 14 내지 19 중 하나에 따른 방법.

양태 21: 상기 적어도 하나의 DNA 마커는 NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로부터 선택되는 양태 14 내지 20 중 하나에 따른 방법.

양태 22: 상기 QTL은 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 또는 d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상인 양태 14 내지 21 중 하나에 따른 방법.

양태 23: 상기 QTL은 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재하는 양태 22의 방법.

양태 24: 양태 14 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 검출된 재배된 토마토 식물에 의해 제공되는 과실에서 과실 경도 증가의 원인이 되는 QTL.

양태 25: 염색체 2상 긴 암(arm)에 위치하는 양태 24에 따른 QTL.

양태 26: NT3853, NT3907, TG14, HOX7A, CT277, HB2600, TG353, Lm0127, Lm1650, LE5100 및 LE5200으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 마커와 연관되는 양태 24 내지 25 중 어느 하나에 따른 QTL.

양태 27: a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; c) DNA 마커인 HB2600, TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상인 양태 24 내지 26 중 어느 하나에 따른 QTL.

양태 28: DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재하는 양태 27에 따른 QTL.

양태 29: 양태 24 내지 28 중 어느 하나에 따른 QTL을 포함하는 토마토 식물로부터 수득한 분리된 DNA 시료.

양태 30: 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 과실 경도가 상당히 증가한 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 31: 양태 14 내지 23 중 어느 하나에 따른 공여체 토마토 식물에서 과실 경도 증가와 연관되는 QTL의 존재 여부를 검출하는 단계와, 검출된 적어도 하나의 QTL을 포함하는 핵산 서열 또는 과실 경도 증가 제공부 또는 이의 부분을 공여체 식물에서 수여체 토마토 식물로 전달하는 단계를 포함하고, 과실 경도 증가는 재배된 토마토 식물의 자손의 과실과 대조군 토마토 식물의 과실을 비교하여 측정되는 양태 30에 따른 과실 경도가 상당히 증가한 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 32: 핵산의 전달은 형질전환, 원형질 융합, 복반수체 방법 또는 미숙배 배양에 의해 수행되는 양태 30 내지 31 중 어느 하나에 따른 과실 경도가 상당히 증가한 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 33: 자손 토마토 식물의 과실 경도 범위는 수확 단계의 대조군 토마토 식물 과실의 1.2배 내지 2.0배 높은 양태 30 내지 32 중 어느 하나에 따른 과실 경도가 상당히 증가한 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 34: 상기 경도 범위는 브레이커 후 7일에 측정되는 양태 30 내지 33 중 어느 하나에 따른 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 35: 상기 공여체 식물은 S. pennellii이고, 상기 수여체 식물은 S. lycopersicum인 양태 31 내지 34 중 어느 하나에 따른 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 36: 상기 QTL은 a) DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1; 또는 b) DNA 마커인 HOX7A 및 CT277 중 적어도 하나와 연관되는 QTL2; 또는 c) DNA 마커인 HB2600 및 TG353 중 적어도 하나와 연관되는 QTL3; 또는 d) DNA 마커인 Lm0127 및 Lm1650 중 적어도 하나와 연관되는 QTL4; 또는 e) DNA 마커인 LE5100 및 LE5200 중 적어도 하나와 연관되는 QTL5 중 하나 이상인 양태 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 37: QTL는 DNA 마커인 NT3853, NT3907 및 TG14 중 적어도 하나와 연관되는 QTL1이고, 내부 과피에만 존재하는 양태 36에 따른 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 제조 방법.

양태 38: 양태 30 내지 37 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 재배된 토마토 식물, 또는 이의 부분.

양태 39: 양태 24 내지 28 중 어느 하나에 따른 과실 경도 증가의 원인이 되는 QTL을 포함하는 재배된 토마토 식물.

양태 40: 양태 6 내지 10 및 38 내지 39에 따른 재배된 토마토 식물과 상업상 바람직한 특성을 갖는 토마토 식물을 교배하여 얻을 수 있는 잡종 토마토 식물, 또는 이의 부분.

양태 41: 양태 6 내지 10 및 38 내지 40 중 어느 하나에 따른 토마토 식물을 성장시켜 생성된 토마토 종자.

양태 42: 대조군 식물보다 과실 경도가 상당히 증가한 식물을 얻을 수 있도록 양태 6 내지 10 및 38 내지 40 중 어느 하나의 재배된 토마토 식물과 바람직한 표현형 형질을 갖는 식물을 교배하여 얻은 토마토 종자.

양태 43: 대조군 식물보다 과실 경도가 증가된 토마토 식물을 생성하기 위한 양태 24 내지 28 중 어느 하나에 따른 QTL의 용도.

양태 44: 토마토 과실의 수확 슬롯을 연장하기 위한 양태 6 내지 10 및 38 내지 40에 따른 토마토 식물의 용도.

양태 45: 신선 편이 상품 또는 식품 가공을 위한 양태 6 내지 10 및 38 내지 40에 따른 토마토 식물의 용도.

양태 46: 신선 편이 상품 또는 식품 가공을 위한 양태 1 내지 5에 따른 과실 경도가 증가된 토마토 식물의 용도.

양태 47: 양태 6 내지 10에 따른 적어도 하나의 유전 요소를 포함하는 토마토 식물로 제조된 가공 식품.

기탁된 주

후술된 종자 시료는 2009년 10월 22일, 영국 스코트랜드 아베르딘 AB21 9YA 벅스붐 크레이브스톤 에스테이트 페르구손 빌딩 소재의 NCIMB에 신젠타 파티서페이션즈 아게의 이름으로 부다페스트 조약의 규정에 의거하여 기탁되었다: Solanum lycopersicum CV M82, 기탁 번호 (NCIMB 41661)

Solanum lycopersicum QTL NIL 301, 기탁 번호 (NCIMB 41662)

주의 상세한 설명: IL2-3 주의 F2 재조합 및 IL2-4의 F3에 대한 과실 경도 증가를 시험하였다. 매우 단단한 주는 QTL 재조합 주 301을 포함하는 것으로 확인되었다. 이종 재조합 301의 F3 종자를 뿌리고, 마커를 이용하여 동종 개체를 동정하였다. F4 종자를 회수하고, 다섯 주를 재성장시키고, 잎 DNA를 마커로 표지하였다. F5 종자를 회수하고, 301 주로부터 QTL-NIL 종자로서 기탁하였다. 배양된 부모로서 CV M82의 종자도 기탁되었다.

참조문헌

Batu, A. and Thompson, A.K. 1998 Effects of modified atmospheric packaging on post harvest qualities of pink tomatoes, Tr. J. Agr. & Forestry, 22, 365-372

Causse M, Saliba-Colombani V, Lecomte L, Duffe P, Rousselle P, Buret M. (2002) QTL analysis of fruit quality in fresh market tomato: a few chromosome regions control the variation of sensory and instrumental traits. J Exp Bot. Oct;53(377):2089-98

Chanthasombath T, Sanatem K, Phomachan C, Acedo Jr. A and Weinberger K, (2008) Postharvest Life of Breaker and Turning Tomatoes Subjected to Transient Modified Atmosphere Proc. EURASIA Sym. on Quality Management in Postharvest Systems. Acta Hort. 804, ISHS 2008

Chi W, Ma J, Zhang D, Guo J, Chen F, Lu C, and Zhang L (2008)The Pentratricopeptide Repeat Protein DELAYED GREENING1 Is Involved in the Regulation of Early Chloroplast Development and Chloroplast Gene Expression in Arabidopsis Plant Physiol. 147: 573-584.

Christou P, Murphy JE, and Swain WF (1987) Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3962-3966.

Deshayes A, Herrera-Estrella L, Caboche M (1985) Liposome-mediated transformation of tobacco mesophyll protoplasts by an Escherichia coli plasmid. EMBO J. 4:2731-2737.

D'Halluin K, Bonne E, Bossut M, De Beuckeleer M, Leemans J (1992) Plant.Cell 4:1495-1505. Dik AJ, Koning G, Kohl J (1999) Evaluation of microbial antagonists for biological control of tomato cinerea stem infection in cucumber and tomato. Eur. J. Plant Pathol. 105:115-122.

Draper J, Davey MK, Freeman JP, Cocking EC and Cox BJ (1982) Ti plasmid homologous sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed Petunia protoplasts. Plant and Cell Physiol. 23:451-458.

Eckstein F (ed) (1991) Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach. Oxford Univ. Press, NY 1991.

Eriksson EE, Bovy A, Manning K, Harrison L, Andrews J, De Silva J, Tucker GA and Seymour GB (2004) Effect of the Colorless non-ripening Mutation on Cell Wall Biochemistry and Gene Expression during Tomato Fruit Development and Ripening. Plant Physiology 136:4184-4197

Eshed Y, Zamir D (1994) A genomic library of Lycopersicon pennellii in S. pennellii: a tool for fine mapping of genes. Euphytica. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1994 79: 175-179

Exama, A., Arul, J., Lencki, R.W., Lee, L.Z. and Toupin, C. 1993. Suitability of plastic films for modified atmosphere packaging of fruits and vegetables. J. Food Sci. 58: 1365-1370.

Frary A, Nesbitt TC, Grandillo S, Knaap Evd, Cong B, Liu J, Meller J, Elber R, Alpert KB, Tanksley SD (2000) fw2.2: a quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size. Science Washington. 2000; 289: 85-88.

Fridman E, Carrari F, Liu YS, Fernie AR, Zamir D (2004) Zooming in on a quantitative trait for tomato yield using interspecific introgressions. Science 305: 1786-1789.

Geeson, J.D., Browne, K.M., Maddison, K.I., Shepherd, J. and Guaraldi, F. 1985. Modified atmosphere packaging to extend the shelf life of tomatoes. J. Food Technol. 20:339-349.

Glick BR and Thompson JE (eds) (1993) Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, CRC Press, pp. 67-88.

Gruber MY, Crosby WL (1993) Vectors for Plant Transformation. In: Glick BR and Thompson JE (Eds.) Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, CRC PresSj pp. 89-119.

Hain R, Stabel P, Czernilofsky AP, Steinbliss HH, Herrera-Estrella L, Schell J (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimaeric gene to plant protoplasts. MoI. Gen. Genet. 199:161-168.

Hamilton CM (1997) A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene 200:107?116

Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL, Eichholts D, Rogers SG, Fraley RT (1985)A simple method for transferring genes into plants. Science 227:1229-1231.

Kado CI (1991) Molecular mechanisms of crown gall tumorigenesis. Crit. Rev. Plant Sd. 10:1-32.

King, G.J., Lynn, J.R., Dover, C.J., Evans, K.M. and Seymour, G.B. (2001). Resolution of quantitative trait loci for mechanical measures accounting for gentic variation in fruit texture of apple (Malus pumila Mill). Theoretical and Applied Genetics 102:1227-1235.

Klein TM, Gradziel T, Fromm ME, Sanford JC (1988). Factors influencing gene delivery into zea mays cells by high velocity microprojectiles. Biotechnology 6:559-563-

Klein TM, Arentzen R, Lewis PA, and Fitzpatrick- McEUigott S (1992) Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment. Bio/Technology 10:286-291.

Knapp S (2005) New nomenclature for Lycopersicon http://sgn.cornell.edu/about/solanum_nomenclature.pl

Laursen CM, Krzyzek RA, Flick CE, Anderson PC, Spencer TM (1994) Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture cells. Plant MoI Biol. 24(1):51-61.

Manning, K., Tor, M., Poole, M., Hong, Y., Thompson, A.J., King, G.J., Giovannoni, J.J. and Seymour, G.B. (2006). A naturally occurring epigenetic mutation in a gene encoding an SBP-box transcription factor inhibits tomato fruit ripening. Nature Genetics 38:948-952.

Miki BL, Fobert PF, Charest PJ, Iyer VN (1993) Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants. In: Glick BR and Thompson JE (Eds.) Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, CRC Press, pp. 67-88.

Moloney MM, Walker JM, Sharma KK (1989) High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Reports 8:238-242.

Nesbitt TC, Tanksley SD (2001) fw2.2 directly affects the size of developing tomato fruit, with secondary effects on fruit number and photosynthate distribution. Plant Physiol. 127: 575-583.

Paterson AH (1996) Making genetic maps. In: Paterson AH (ed) Genome mapping in plants. RG Landes, San Diego, pp 23?39

Pearson WR (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods in Enzymology 183: 63?98.

Phillips RL, Somers DA, Hibberd KA. 1988. Cell/tissue culture and in vitro manipulation. In: G.F. Sprague & J. W. Dudley, eds. Corn and corn improvement, 3rd ed., p. 345-387. Madison, WI, USA, American Society of Agronomy.

Pierik RLM (1999) In vitro Culture of Higher Plants, 4th edition, 360 pages, ISBN:0-7923-5267-X.

Sambrook J, and Russell DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, NY, USA., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987). Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. J. Particulate Sd. Technol. 5:27-37.

Sanford JC (1988) The biolistic process. Trends in Biotechnology 6:299-302.

Sanford JC (1990) Biolistic plant transformation. Physiologica Plantarum 79: 206-209.

Sanford JC, Smith FD, and Russell JA (1993) Optimizing the biolistic process for different biological applications. Methods in Enzymology 217:483-509.

Smith T, Waterman M (1981) Identification of common Molecular Sequences J. Mol. Biol: 147, 195-197.

Thompson, A.J., Tor, M., Barry, C.S., Vrebalov, J., Orfila, C., Jarvis, M.C., Giovannoni, J.J., Grierson, D. and Seymour, G.B. (1999). Molecular and genetic characterisation of a novel pleiotropic tomato ripening mutant. Plant Physiology 120:383-389.

Tijssen P (1993) Hybridization With Nucleic Acid Probes. Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation. In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology.Elsevier.

Tsuchimoto S, van der Krol AR and Chua NH. Ectopic Expression of pMADS3 in Transgenic Petunia Phenocopies the Petunia blind Mutant (1993) Plant Cell 5, 843-853.

Van Berloo R, Aalbers H, Werkman A, Niks RE (2001) Fruit firmness QTL confirmed through development of QTL-NILs for barley leaf rust fruit firmness. MoI. Breeding 8: 187-195

van Ooijen JW, Maliepaard C (1996) MapQTL® version 4.0: Software for the calculation of QTL positions on genetic maps. CPRO-DLO, Wageningen

van Oijen JW, Voorips RE (2001) JoinMap® 3.0: Software for the calculation of genetic linkage maps. Plant Research International, Wageningen, Netherlands

Vrebalov J, Ruezinsky D, Padmanabhan V, White R, Medrano D, Drake R, Schuch W, Giovannoni J (2002) A MADS-Box Gene Necessary for Fruit Ripening at the Tomato Ripening-Inhibitor (Rin) Locus. Science 296: 5566, 343 - 346

Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2007). Windows QTL Cartographer 2.5 Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC. (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)

Zhang L, Cheng L, Xu N, Zhao M, Li C, Yuan J, and Jia S (1991) Efficient transformation of tobacco by ultrasonication. Biotechnology 9:996?997.

Zhao S, and Stodolsky M (2004) “Bacterial Artificial Chromosomes,” Methods in Molecular Biology , Vol. 255, Humana Press Inc., Totowa, N.J., USA

Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D (1994) Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 94: 176?183

실시예

실시예 1

유전자이입 주의 과실 경도 측정

2006년 여름 표준 온실 조건에서 76개의 S. pennellii IL을 재배하였다 (“정의”부분에서 기술된 바와 같음). 과실 경도를 측정하기 위해, 과실의 중심부에서 주문제작한 장치에 장착된 이중 칼날을 이용하여 횡단부를 절단하여 6 mm 분획을 얻었다. 이는 분획을 평판에 놓았다. 10N 로드 셀을 구비한 Lloyd LRX 장치를 이용하여, 외부 및 내부 과피 조직을 침투하는 데 필요한 힘을 10 mm/분(최대 부하)로 작동하는 6 mm 프로브에 의해 측정하였다. 성숙한 과실의 과실 경도를 측정하여 IL2-3 및 IL2-4주가 M82 대조군에 비해 성숙 중 과실 경도가 상당히 증가됨을 알 수 있었다. 가장 현저한 효과는 IL2-3에서 나타났고 주의 외부 및 내부 과피로부터 IL2-3 및 과실 경도 데이터는 이하 표 1 및 표 2 에 나타냈었다.

각 표에서, 경도는 최대 부하 (N)의 측정량으로 나타낸다. 이들 값은 잔차최대우도추정 (REML) 통계를 이용하여 생성된 2년간 (2007 및 2008) 주들의 예측 방법이고, 온실내 과실 중량, 트러스(truss) 개수, 수확일 및 위치의 변화를 고려하였다.

* 이들 주는 다른 주와 함께 QTL 지도 형성에 이용된다. 이들은 F2주이고 일부 유전자좌에서도 이종이다.

실시예 2

IL2 -3 및 IL2 -4 유전자이입주에서 재조합 과정을 식별하는 마커의 개발과 실험에 이용된 유전자형의 확인

토마토 유전자 지도 (Tanksley et al, 1992; www.sgn.cornell.edu)를 통해, 마커를 선택하여 (도 1) 2-3 및 2-4 유전자이입 염색체 2상에 2-3 및 2-4 유전자이입을 구별하고 한계를 정하였다. S. lycopersicum 및 S. pennellii 간의 단일염기 다형성 (SNP)을 동정하였다. 이들은 실험에 이용된 모든 7200주의 유전자형을 확인하는 데 이용되었다. CT255, TG353, TG451 및 TG583용 Taqman계 마커(도 1)가 생성되어 유리한 재조합의 고속 대량 분석이 가능하였다. 도 1은 (A) IL2-3 (B) IL2-4 및 (C) QTL-NIL 301를 식별하는 마커를 나타내는 도면이다.

실시예 3

과실 경도 증가 형질의 우성 또는 열성 여부 확립과 재조합 과정 분석에 충분한 IL2 -3 x M82F2 및 IL2 -4 x M82F2 종자의 수집

IL2-3 및 M82간 역교배를 위한 F1주의 과실이 M82 부모보다 단단하므로 S. pennellii 과실 경도 대립유전자는 M82 대립유전자보다 우성인 것으로 나타났다. IL2-3 x M82 및 IL2-4 x M82간 역교배로 얻은 종자는 다니 자미르로부터 얻었다 (예루살렘 히브리 대학). 대부분의 경우, F1 종자는 자라지만, 어떤 경우에는 이는 이용불가능하고, F2 종자는 이종 F2 개체의 자가생식 및 선택에 의해 얻을 수 있다. 이들 개체의 종자를 수집하여 재조합 분석하였다.

이들 F1 및 F2 이종 주의 성숙 과실은 표준 조건에서 성장된 후 기계적 특성을 시험하였다. 과실은 적색이 처음 나타난 후 7일 후에 수거하였다 (브레이커 후 기간). 과실의 중심부에서 주문제작한 장치에 장착된 이중 칼날을 이용하여 횡단부를 절단하여 6 mm 분획을 얻었다. 이 분획을 평판에 놓았다. 10N 로드 셀을 구비한 Lloyd LRX 장치를 이용하여, 외부 및 내부 과피 조직을 침투하는 데 필요한 힘을 10 mm/분로 작동하는 6 mm 프로브에 의해 (최대 부하) 측정하였다. 이러한 측정은 각 과실의 과피층에서 3회 반복하였다. 최대 부하량은 프로브가 조직을 통과할 때 최대 저항이다. 달리 언급하지 않는 한, 각 성장 단계에서 각 주에서 5개 이상의 과실을 얻었다. IL2-3 부모 주와 IL2-3 F1 주의 과실은 M82 대조군에 비해 성숙 후 단계에서 높은 경도를 유지하였다. 예를 들면, M82에 비해서, IL2-3 F1(도 2A +B)에서, B+5 및 B+7(과실이 소비될 수 있는 단계)에서, 성숙 유사 단계에서 외부 과피는 매우 단단하였다 (P<0.01). IL2-4 주의 과실 경도차도 M82보다 현저하였으나, 배꼽썩음병 때문에 본 주의 과실의 수는 적으므로, 적절한 통계적 분석을 저해하였다. 다니 자미르로부터 염색체 2 1L(IL2-3-1)를 더 얻었다. 이는 2-3 유전자이입의 상단부(측면에 위치하는 마커 CT176 및 TG554에 대응됨)와 IL2-3 및 2-4간 중첩부 상부를 덮었다. 이러한 주로부터 얻은 과실은 유사한 과실 경도 특성을 갖거나(즉, 최대 부하), 모든 성숙 단계에서 M82 보다 유연하였다 (데이터는 나타내지 않음).

모든 주의 과실은 선명한 적색으로 익었다 (즉, 모든 과피 표면은 적색이고 이는 내부 과피 조직의 경우도 마찬가지임).

실시예 4

재조합 과정용 묘목의 관찰( Screening ), 재조합물의 선택, 및 10개의 과실/주의 과실 경도 시험

1200개의 IL2-3 x M82F2 및 IL2-4 x M82F3 묘목의 과실 경도 시험은 표준 성장 조건에서 수행하였고, 제일본잎으로부터 표준 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다.

재조합은 이 영역내 거대한 중첩부가 QTL을 포함할 수도 있기 때문에 재조합 과정은 두 유전자이입을 이용하여 관찰하였다. Taqman계 마커는 재조합 개체의 동정에 이용되었다. 최초 1200주에서, 89 재조합물이 동정되었다. 이들 식물 중 하나는 분열 조직을 생성하지 못하고 죽었다. 남은 식물은 SNP의 시퀀싱을 통해 재관찰되어 78 개체의 유전자형이 확인되었다. Taqman에 의해 이종인 것으로 평가된 10주는 SNP 분석으로 확인되었다.

실시예 5

재조합주의 유전자형분석

78개의 재조합 개체에 대하여 신젠타(Syngenta) SSR 대지상에서 38개 마커를 이용하여 유전자형을 분석하였다. 마커는 조인맵(Joinmap)을 이용하여 정렬된 후 각 주의 유전자형 데이터를 이용하여 마이크로 엑셀로 나타내었다. 나타난 주는 다양한 수득한 재조합물을 나타내도록 선택되었다(도 3). 이들 마커는 IL2-3 및 2-4 유전자이입을 포괄한다. 이들 마커는 SFLP 자원에서 유래하는 복수의 추가 SNP 마커로 재조합물의 유전자형을 분석하여 토마토 유전자 지도의 맥락에서 보다 정밀하게 셋팅하였다(도 7A+B의 QTL 지도 참조). SSR 대지는 재조합 과정의 무작위적인 분포를 나타내었다. 따라서, 50 cm 간격의 78 재조합물을 이용하여, 과실 경도 QTL의 실질적인 해결책을 얻었다.

실시예 6

과실 경도 QTL 에 대한 5 미만의 센티모건의 지도작성 간격의 확립

브레이커 7일 후, 78 재조합주로부터 각각 얻은 10개의 과실의 과실 경도를 상술한 바와 같이 측정하였다. 위치추정 클로닝 시험을 대상으로 하는 센티모건 미만의 (< 5 cM) 영역을 도시하였다 (도 4A+B).

이 영역의 측면을 나타내는 마커는 토마토 유전자 지도, 게놈 서열 데이터로부터 전개되고 필요한 경우 신젠타 초고밀도 지도로부터 전개되었다. 이 후에, 이들은 지도제작 간격에 유리한 재조합물의 6000 F2 묘목을 관찰(screening)하는 데 이용된다 (실시예 8 참조).

QTL1은 외부 과피가 아니라, 내부 과피에서 브레이커 후 7일 후에만 나타난다(도 4). QTL 분석은 필요한 동일 결과와 함께 MapQTL 및 QTL 지도제작 장치를 포함한 확립이 잘된 통계 패키지를 이용하여 착수되었다 (van Ooijen JW, Maliepaard C (1996) MapQTL® version 4.0: 유전자 지도상 QTL 위치의 측정을 위한 소프트웨어. CPRO-DLO, Wageningen; van Oijen JW, Voorips RE (2001) JoinMap® 3.0: 유전 연관 지도 계산을 위한 소프트 웨어. Plant Research International, Wageningen, Netherlands; Wang S., C. J. Basten, anc Z.-B. Zeng (2007). Windows QTL Cartographer 2.5 Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC. (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm).

높은 과실 경도를 갖는 특정 하부 주에서, QTL 1 내지 5가 과실 경도에 실질적으로 미치는 효과는 IL 부모에서 현저하게 나타내었다 (도 5).

이들 과실 경도차는 크고 유의성이 높다 (P<0.001).

실시예 7

신젠타 토마토 유전자칩(GeneChip)을 이용한 M82 및 관련 염색체 2 유전자이 입간 염색체 2내 유전자 발현의 비교

M82 대조군과 다른 IL2-3내 유전자 발현 프로파일을 조사하기 위한 실험을 신젠타 토마토 유전자칩을 이용하여 수행하였다. RNA 추출 및 토마토 유전자칩 분석을 위해, 매일 점심 12시 전에 개화된 꽃에 표지하였다. 개화기 후 5일 (dpa) (미녹숙), 25 dpa (급속 확대 단계), 40 dpa (녹숙), 및 54 dpa (적숙)에 식물의 과실을 채취하였다. 액체 질소중에 과실을 급속 냉동하였다. 세 개의 과실을 모아 하나의 생물 복사본을 나타내었다. RNA 추출 프로토콜은 RNA 추출 버퍼 RNAwiz™ (영국 암비온사(유럽). Cat #9736) (제조자의 프로토콜에 따름)를 이용한 방법을 기반으로 이루어진다. 그 후, 토마토 유전자칩 분석을 수행하였다.

분석 데이터는 유전자형 차이에 대한 이중 ANOVA에 의해 분석하였다 (영국 애질런트사의 GeneSpring가 데이터의 정규화와 통계적 분석에 이용되었다). 많은 유전자는 개화기후 15일, 25일, 40일 및 54일에 M82 및 IL2-3 주간 상이한 발현을 나타내었다. 가장 명백한 변화는 개화기 후 40일에 구체적으로 녹숙이 될 때까지 IL2-3주내 펙틴 메틸에스테라제 프로브 ID Le002389의 농도 증가이다 (도 6).

총 29개의 유전자 모델을 QTL2에서 부모 주에서 RT-PCR 분석하였고, 17개의 유전자 모델은 QTL 4 및 5에서 시험하였다.

에틸렌 반응성 전사 인자 12(QTL2), 펙틴 메틸에스테라제(QTL3), 도프 징크 휭거 단백질 6(QTL4) 및 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질(QTL5)의 mRNA 농도를 녹숙 및 브레이커 단계에서 M82, IL2-4, IL2-3 및 다양한 재조합주에서 측정하였다. 조직감 데이터도 대응 과실의 외부 및 내부 과피로부터 얻었다.

브레이커 단계에서는 에틸렌 반응성 전사 인자 12는 M82에서는 높은 농도로 발현되었지만, 유전자이입 주 및 일부 재조합주에서는 낮은 농도로 발현되었다 (도 7). 도 3에 나타난 바와 같이, 910 재조합주보다 S. pennellii의 유전자도입이 더 높은 301 및 769 재조합주에서 특히 발현 농도가 낮았다. 대응 조직감 데이터는 301 및 769 재조합주가 910 주보다 더 단단한 과실을 가짐을 나타낸다.

펙틴 메틸에스테라제는 M82 과실에서는 낮은 농도로 발현되었지만, 유전자이입 주 및 일부 재조합주에서는 높은 농도로 발현되었다(도 8). 도 3에 나타난 바와 같이, 124 및 142 재조합주보다 S. pennellii의 유전자도입이 더 높은 301 재조합주에서 특히 발현 농도가 높았다. 대응 조직감 데이터는 301 재조합주가 124 및 142 재조합주보다 더 단단한 과실을 가짐을 나타낸다.

도프 징크 휭거 단백질 6은 M82 과실에서 높은 농도로 발현되었지만, 유전자이입주에서 낮은 농도로 발현되었다(도 9). RT-PCR을 통해 또다른 후보 유전자인 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질이 M82 및 유전자이입 주 IL2-3 사이에서 상이하게 발현됨이 확인되었다 (데이타는 나타내지 않음).

이들 결과는 상술한 후보 유전자의 과발현 또는 침묵을 수반하는 GM법을 이용한 토마토 과실 조직감 표현형에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 토마토 과실 조직감의 증가는 고농도의 펙틴 메틸에스테라제와 상응되지만, 저농도의 에틸렌 반응성 전사 인자 12 및 도프 징크 휭거 단백질 6과 상응된다.

실시예 8

약 4000 개체의 추가 F2 NIL 군집의 관찰에 의한 0.5 이하의 센티모건에 매 핑 간격의 추가 해결책과, 물리적 지도 및 게놈 서열상 QTL 의 고정

IL2-3 x M82F2 6000개의 개체는 표준 온실 조건에서 성장되고 많고 적은 QTL 및 마커 TG451 내지 TG353를 포함하는 간격을 둔 재조합을 관찰하였다 (도 1 참조). 유전자형 분석된 6000개의 F2 주인, 총 222개 재조합물은 다섯 개의 QTL에서 지도제작 사이에 42개의 재조합물로만 발견되었다. 이로써 QTL 지도 생성에 이용된 120개의 유용한 재조합 개체를 얻었다 (도 10A+10B).

실시예 9

후보 과실 경도 관련 유전자의 명명

DNA 분자 마커 정보뿐만 아니라, 본 발명은 기술된 형질을 조절하는 예상 후보 유전자의 동정화와 관련된다. 이들 QTL은 분자 수준에서 규명되고, 후보 유전자는 이들 유전자좌에서 동정되었다. 통상적인 후보 유전자의 리스트는 다음과 같다: 애기장대(Arabidopsis)내 초기 원형질 성장의 조절과 관련되는 유사 유전자인 피튜니아 유전자 pMADS3와 서열 관계인 MADS 박스 전사 인자인 QTL1, TG451(Chi et al (2008)), 에틸렌 반응성 전사 인자 12인 QTL2, (SL1.00sc00226_365.1), 펙틴에스테라아제/펙틴에스테라아제 저해제인 QTL3 (신젠타 유전자칩 프로브 ID, Le0023899).

가능한 경우, QTL은 토마토 물리적 지도에 고정되었다. QTL3에 대한 후보 서열은 세 개의 예상 펙틴에스테라아제 (pme)/펙틴에스테라아제 저해제 유전자 중 하나이다. 신젠타 분석에서 프로브는 이들 pme 유전자 세 개 모두와 동일함을 나타낸다. 이들 유전자는 서열이 동일해서 3’말단 서열을 이용하더라도 이들 개별적인 발현 패턴을 구별하는 것이 어렵다. 이들 세 유니진(unigene)은 SGN-U585819, SGN-U585820 및 SGN-U58523이다.

QTL4 후보 유전자는 도프 징크 휭거 단백질 6 (SL1.00sc00226_436.1.1) 위치 4475868 내지 4476845 (+쇄)에 대응하는 개방형 해독틀이다. QTL5 후보 유전자는 평형화 뉴클레오시드 수송체류 단백질(SL1.00sc00226_511.1) 위치 5133572 내지 5135660 (-쇄)에 대응하는 개방형 해독틀이다.

실시예 10

본원에 이용된 마커 서열

NCIMB 리미티드

NCIMB41661

20091022

NCIMB 리미티드

NCIMB41662

20091022

SEQUENCE LISTING <110> SYNGENTA PARTICIPATIONS AG <120> TOMATO FRUIT HAVING INCREASED FIRMNESS <130> 72952 <150> EP 09174072.0 <151> 2009-10-26 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer NT3853F used to screen for the presence or absence of SSR marker NT3853 <400> 1 ggattgtgtt atctccgatg 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer NT3853R used to screen for the presence or absence of SSR marker NT3853 <400> 2 gaaaaaggga agagatggg 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer NT3907F used to screen for the presence or absence of SSR marker NT3907 <400> 3 gaacagtttc cggtggag 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer NT3907R used to screen for the presence or absence of SSR marker NT3907 <400> 4 ttgggccagg aagaaaac 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer TG14F used to screen for the presence or absence of SNP marker TG14 <400> 5 gccaactgat tgcctatcct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer TG14R used to screen for the presence or absence of SNP marker TG14 <400> 6 ctcactccac ccatcacaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer HOX7AF used to screen for the presence or absence of SNP marker HOX7A <400> 7 tgactccggc aaatttctct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer HOX7AR used to screen for the presence or absence of SNP marker HOX7A <400> 8 tcccccatgt atggactgat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer CT277F used to screen for the presence or absence of SNP marker CT277 <400> 9 tggtaacctg ctgtggtcaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer CT277R used to screen for the presence or absence of SNP marker CT277 <400> 10 aggtaaaccg ccagctcatt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer Lm0127F used to screen for the presence or absence of SNP marker Lm0127 <400> 11 gaaaggatgc agccaaaaat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer Lm0127R used to screen for the presence or absence of SNP marker Lm0127 <400> 12 tactctaagg gcgcacaatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer Lm1650F used to screen for the presence or absence of SNP marker Lm1650 <400> 13 aggttggcag aagacgaaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer Lm1650R used to screen for the presence or absence of SNP marker Lm1650 <400> 14 acatcccaaa gagctccaga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer LE5100F used to screen for the presence or absence of SNP marker LE5100 <400> 15 tgttccaaac gcctaaaacc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer LE5100R used to screen for the presence or absence of SNP marker LE5100 <400> 16 ttccccaagt gattcctcag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer LE5200F used to screen for the presence or absence of SNP marker LE5200 <400> 17 tttgtacaag cggcacaaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer LE5200R used to screen for the presence or absence of SNP marker LE5200 <400> 18 cagctcgcgt catctcatta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer HB2600F used to screen for the presence or absence of SNP marker HB2600 <400> 19 agggaggctg tgggtaagat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer HB2600R used to screen for the presence or absence of SNP marker HB2600 <400> 20 ggcacctaga ccaaatccaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer TG353F used to screen for the presence or absence of SNP marker TG353 <400> 21 cagagcctga tctttcacca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesised oligonucleotide primer TG353R used to screen for the presence or absence of SNP marker TG353 <400> 22 ttcgtgttgg agatggaaag 20

Claims

a) 공여체 토마토 식물과 수여체 토마토 식물을 교배하여 자손 재배된 토마토 식물을 얻는 단계, b) 상기 자손 식물의 과실에서 경도를 양적으로 분석하는 단계, c) 상기 자손 식물에서 상기 공여체 식물로부터 DNA 마커 TG353의 존재에 관찰된 증가된 과실 경도를 연계하는 유전 연관 지도를 확립하는 단계, 및 d) 증가된 과실 경도와 연관되는 상기 지도상 DNA 마커를 QTL3에 지정하는 단계를 포함하는, 대조군 토마토 식물과 비교하여 재배된 토마토 식물로부터의 과실에서 증가된 과실 경도와 연관되는 QTL3의 검출 방법.
제 1항에 따른 방법에 의해 검출된 재배된 토마토 식물에 의해 제공되는 과실에서 증가된 과실 경도의 원인이 되는 QTL3.
제 2항에 따른 QTL3을 포함하는 토마토 식물로부터 수득한 분리된 DNA 시료.
제 1항에 따른 증가된 과실 경도와 연관되는 QTL3의 검출 방법을 수행하는 단계와, 검출된 QTL3을 포함하는 핵산 서열을 공여체 토마토 식물에서 수여체 토마토 식물로 전달하는 단계를 포함하고, 상기 증가된 과실 경도는 자손 재배된 토마토 식물로부터의 과실과 대조군 토마토 식물로부터의 과실을 비교하여 측정되는 증가된 과실 경도를 지니는 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물의 제조 방법.
제 4항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 재배된 토마토 식물.
제 2항에 따른 증가된 과실 경도의 원인이 되는 QTL3을 포함하는 재배된 토마토 식물.
제 5항 또는 제 6항에 따른 재배된 토마토 식물과 상업상 바람직한 특성을 갖는 토마토 식물을 교배하여 얻을 수 있는 잡종 토마토 식물.
제 5항 또는 제 6항의 재배된 토마토 식물을 성장시켜 생성된 토마토 종자.
대조군 식물보다 증가된 과실 경도를 갖는 식물을 얻을 수 있도록 제 5항 또는 제 6항의 재배된 토마토 식물과 바람직한 표현형 형질을 갖는 식물을 교배시켜 생성된 토마토 종자.
대조군 식물보다 증가된 과실 경도를 갖는 식물을 얻을 수 있도록 제 7항의 잡종 토마토 식물과 바람직한 표현형 형질을 갖는 식물을 교배시켜 생성된 토마토 종자.
제 2항에 있어서, 대조군 토마토 식물과 비교하여 증가된 과실 경도를 갖는 토마토 식물을 생성하기 위한 QTL3.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 토마토 과실의 수확 슬롯을 연장하기 위한 재배된 토마토 식물.
제 7항에 있어서, 토마토 과실의 수확 슬롯을 연장하기 위한 잡종 토마토 식물.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 신선 편이 상품 또는 식품 가공을 위한 재배된 토마토 식물.
a) 재배된 토마토 식물에서 QTL3의 존재를 검출하는 단계, 및
b) 상기 QTL3의 존재를 포함하는 재배된 토마토 식물을 선택하여 대조군 토마토 식물로부터의 과실과 비교하여 증가된 경도를 갖는 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물을 선택하는 단계를 포함하고,
재배된 토마토 식물에서 상기 QTL3의 존재를 검출하는 단계는
i) 재배된 토마토 식물로부터 게놈 DNA의 시료를 얻는 단계, 및
ii) 게놈 DNA의 시료에서 TG353을 포함하는 적어도 하나의 DNA 마커를 검출하는 단계를 포함하고,
증가된 과실 경도는 수확 단계에서 대조군 토마토 식물로부터의 과실의 경도보다 1.2 내지 2배인, 대조군 토마토 식물로부터의 과실과 비교하여 증가된 경도를 갖는 과실을 생성하는 재배된 토마토 식물을 선택하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 수확 단계는 녹숙 단계인, 방법.
a) 공여체 토마토 식물을 수여체 토마토 식물과 교배하여 자손 토마토 식물을 생성하는 단계,
b) 자손 토마토 식물에서 QTL3의 존재를 검출하는 단계, 및
c) 상기 QTL3의 존재를 포함하는 자손 토마토 식물을 선택하여 공여체 토마토 식물로부터 수여체 토마토 식물에 증가된 과실 경도를 위한 형질을 유전자이입하는 단계를 포함하고,
자손 토마토 식물에서 상기 QTL3의 존재를 검출하는 단계는 자손 토마토 식물로부터 게놈 DNA의 시료를 분리하는 단계 및 게놈 DNA 시료에서 TG353을 포함하는 적어도 하나의 DNA 마커를 검출하는 단계를 포함하는, 대조군 토마토 식물로부터의 과실과 비교하여 증가된 경도를 갖는 과실을 생성하는 공여체 토마토 식물로부터 수여체 토마토 식물로 증가된 과실 경도를 위한 형질을 유전자이입하는 방법.
a) 대조군 토마토 식물로부터의 과실과 비교하여 증가된 경도를 갖는 과실을 생성하는 공여체 토마토 식물과 수여체 근친교배된 토마토 식물을 교배하여 F1 자손 식물을 생성하는 단계,
b) 증가된 과실 경도를 갖는 F1 자손 식물을 선택하는 단계,
c) b) 단계의 선택된 자손 식물(들)과 수여체 근친교배된 토마토 식물을 역교배하여 역교배 자손 식물을 생성하는 단계,
d) 수여체 근친교배된 토마토 식물의 증가된 과실 경도와 형태적 및 생리적 특성을 갖는 c) 단계의 역교배 자손 식물을 선택하는 단계로서, 증가된 과실 경도를 위한 선택은
(i) 역교배 자손의 게놈 DNA를 분리하는 단계, 및
(ii) 상기 분리된 게놈 DNA의 시료에서 적어도 하나의 DNA 마커 TG353을 검출하는 것을 포함하는, QTL3에 대한 적어도 하나의 분자 마커의 존재를 위해 분리된 게놈 DNA를 시험하는 단계를 포함하는, 단계, 및
e) c) 및 d) 단계를 차례로 2회 이상 반복하여 선택된 제 3 또는 그 이상의 역교배 자손을 생성하는 단계를 포함하는, 잡종 토마토종에 증가된 과실 경도를 위한 형질을 도입하는 방법.
제 18항에 있어서,
f) 동종 식물을 동정하기 위해 선택된 역교배 자손을 자가생식하는 단계, 및
g) 역교배 자손 또는 자가생식 식물 중 적어도 하나를 또다른 근친교배된 토마토 식물과 교배하여 동일한 환경 조건에서 자랐을 때 증가된 과실 경도를 위한 형질이 결여된 동일한 두 부모로부터의 대조군 잡종 토마토종의 증가된 과실 경도와 모든 형태적 및 생리적 특성을 갖는 잡종 토마토종을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.