CN114181949B

CN114181949B - 番茄SlERF063基因在促进果实成熟和降低果实毒性中的应用

Info

Publication number: CN114181949B
Application number: CN202111584406.5A
Authority: CN
Inventors: 王守创; 杨君; 郭昊; 毛梦迪; 曹鹏; 邓渊; 陈日东; 赖军; 张越冉
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114181949A

Abstract

本发明公开了番茄SlERF063基因在促进果实成熟和降低果实毒性中的应用，属于植物基因工程技术领域。通过正向遗传学手段，采用全基因组关联分析(mGWAS)的方法，定位到番茄SlERF063基因，并通过在番茄植株中进行果实注射特异超量表达，发现超量表达SlERF063基因促进果实成熟，并且通过代谢物含量检测发现具有毒性的番茄甾体糖生物碱代谢物含量降低，转化为无毒性的生物碱代谢物，证实了该基因的功能及应用途径。

Description

番茄SlERF063基因在促进果实成熟和降低果实毒性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及番茄SlERF063基因在促进果实成熟和降低果实毒性中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum L.)为茄科一年生草本植物，原产于南美洲，在中国南北方广泛栽培。其果实营养丰富且具特殊风味，有多种食用方法，如生食、煮食、加工番茄酱、或整果罐藏。番茄除了食用还具有药用价值，通常有生津止渴、健胃消食、清热消暑、补肾利尿等功能，可治热病伤津口渴、食欲不振、暑热内盛等病症，有显著止血、降压、降低胆固醇作用，对治疗血友病和癞皮病有特殊功效(杨胜清等，番茄的药用价值和食用价值.北方园艺,2016(05):55)。

番茄作为世界上最有价值的水果和蔬菜作物，对人类饮食所需营养的提供具有很大的贡献，并且可作为研究肉质水果的典范(Seymour,G.B.等，Fruit development andripening.Annu Rev Plant Biol.2013；64:219-41)。果实成熟是指果实生长末期经过一系列生理生化变化而达到食用品质的最佳状态的过程，主要表现为果实变软、变甜、变艳，酸涩味消失，散发香味等，是一个复杂的生理过程，这些变化通常会因激素水平和复杂的基因调节因子的变化而改变，例如乙烯和脱落酸，生产上大多通过控制乙烯发生来调节果实的成熟。研究果实成熟的调控机制对提高果实品质具有重要意义，而关于肉质果实成熟的遗传调控大多来自于番茄(Gapper,N.E.等，Molecular and genetic regulation of fruitripening.Plant Mol Biol.2013Aug；82(6):575-91)。

在茄科植物(例如番茄、马铃薯)中存在一类特有的抗营养代谢产物，即甾体糖生物碱SGAs，为一种含氮有毒化合物，对于植物本身来说，有助于抵抗广泛的病原体和捕食者，包括细菌、真菌、昆虫等；但对于人类来说则是抗营养化合物，SGAs会通过抑制胆碱酯酶的活性引起中毒反应，其中龙葵碱还能与生物膜上的甾醇类物质结合，导致生物膜穿孔，引起膜结构破裂，在马铃薯和番茄中主要的SGAs通常被认为是对人体的抗营养因子，其在商品马铃薯品种块茎中的含量甚至会受到法律的限制(Eich,E.Solanaceae andConvolvulaceae:Secondary Metabolites(Springer,2008)；Roddick,J.G.等，Steroidalglycoalkaloids:nature and consequences of bioactivity.Adv.Exp.Med.Biol.1996；404,277–295)。

全基因组关联分析(GWAS)是一项在实验人群中对一组常见基因变异进行的研究，目的是识别与某一性状相关的变异，为有力的正向遗传学手段。在过去的十年里，GWAS已经被证明在解剖复杂表型变异的遗传基础上是很强大的，包括人类和动物的疾病，以及植物的生理和农业特征，而基于代谢物的全基因组关联研究(mGWAS)现已成为全球识别植物代谢多样性遗传决定因素的最有力工具之一，能获得多个控制代谢物自然变异的显著位点，为新陈代谢多样性的遗传基础提供了更深入的见解(Fang C等,Metabolic GWAS-baseddissection of genetic bases underlying the diversity of plantmetabolism.Plant J.2019Jan；97(1):91-100)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一个调控番茄果实发育以及毒性的乙烯响应转录因子SlERF063，提高番茄的果实品质。

本发明的技术方案为：

本发明应用一种基于代谢物的mGWAS分析方法，在SGAs生物合成方面存在显著差异的品种进行研究，通过物质番茄皂苷A定位到SlERF063基因，其全长核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。SlERF063基因表达量的高低直接影响番茄果实成熟过程以及SGAs的含量。

SlERF063基因编码区(CDS)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，序列长度为1359bp，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID No.3所示，编码452个氨基酸残基。

可以采用PCR技术，从番茄基因组DNA和由mRNA反转录而得的cDNA中扩增得到本发明的SlERF063基因，可将这一序列构建到果实特异性超量表达载体上，通过番茄果实瞬时注射表达，提高该基因在果实中的表达量，从而获得对果实提前发育成熟的番茄材料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现调控番茄果实发育以及毒性的乙烯响应转录因子SlERF063，该转录因子可以加快番茄的成熟，降低甾体糖生物碱SGAs的含量并转化为无毒性的生物碱代谢物。

附图说明

图1：通过mGWAS筛选定位到SlERF063基因，图1中的A图为番茄皂苷A含量的全基因组关联分析结果，虚线表示显著性阈值(P＝4.19E^-7)；图1中的B图和C图为定位到的基因所在的4号染色体区域的连锁不平衡(LD)分析。

图2：SlERF063基因在番茄不同发育时期的表达量，20DPA表示开花后第20天，IMG表示未成熟青果，MG表示成熟绿果，BR表示破色期；BR3、7、10、15表示破色后天数，结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。

图3：图3为SlERF063基因在果实中瞬时超量表达以及对照植株果实在破色第五天(Br5)时期时的相对表达量，结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)，****表示Pvalue值小于0.0001，表示差异极显著。

图4为SlERF063基因在果实中瞬时超量表达以及对照植株果实破色期表型，三个时期分别为青果时期(MG)、破色第二天(Br2)以及破色第五天(Br5)。

图5为番茄SGAs生物合成与调控通路示意图(部分)以及相关基因在瞬时超量表达以及对照植株在Br5时期果实中的相对表达量，虚线表示其中有步骤省略，实线表示只有一步；相对表达量结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)，**表示P value值小于0.01，***表示P value值小于0.001，****表示P value值小于0.0001，三者均表示差异极显著。

图6为番茄部分SGAs在瞬时超量表达以及对照植株在Br5时期果实中的相对含量。结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)；**表示P value值小于0.01，***表示Pvalue值小于0.001，****表示P value值小于0.0001，三者均表示差异极显著。

图7：入门载体pDonr207质粒图谱。

图8：果实特异性表达载体pBin18-E8-GW质粒图谱。

图9：超量表达载体PBI121质粒图谱。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1：SlERF063基因的发现和定位

申请人对来自世界各地的349份番茄材料进行代谢图谱的测定，对测量数据进行统计分析，选择在甾体糖生物碱SGAs生物合成方面存在显著差异的品种进行全基因组关联分析，结果发现位于SGAs合成通路下游的番茄皂苷A和4号染色体上的一个loci存在着显著的关联，且lead SNP位点区域附近的SNP为高连锁不平衡区域(LD)Block，表明在该Block区域内存在着调控番茄皂苷A的候选基因，在这些基因中我们发现了SlERF063，推测SlERF063基因可能对甾体糖生物碱的生物合成造成影响。

实施例2：分离克隆SlERF063基因

为了获得SlERF063基因的编码序列，申请人将已经测序的番茄品种MicroTom种植一个月后，利用TRIZOL试剂(Invitrogen公司)抽提番茄叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录试剂盒Supermix(购自北京全式金公司)将RNA进行反转录合成cDNA，反应条件：42℃30min，80℃5sec。以该cDNA为模板，用引物SlERF063-F：5’-AAAAAGCAGGCTTAATGTGCATATTAAAGGTGGCGAATC-3’和SlERF063-R：5’-AGAAAGCTGGGTATTAGCTAGAAGAAGGTGGATAGTGGC-3’进行PCR扩增，得到SlERF063基因的全长编码序列(Full length ofcoding sequence，CDS序列)(1359bp，见SEQ ID No.2)。PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃ 10sec，60℃ 30sec，68℃ 2min，35个循环；68℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物通过GATEWAY克隆技术的BP反应连入pDonr207入门载体，筛选阳性克隆并测序确认，获得SlERF063基因全长cDNA，再通过GATEWAY克隆技术的LR反应连入果实特异性瞬时表达载体pBin18-E8-GW(Ying S等，Trichome regulator SlMIXTA-like directly manipulatesprimary metabolism in tomato fruit.Plant Biotechnol.J.2020Feb；18(2):354-363)以及超量表达载体PBI121，申请人将这两个克隆命名为E8-SlERF063和PBI-SlERF063。

实施例3：SlERF063基因超量表达载体的构建和转化

超量表达载体构建方法如下：首先将实施例2中得到的阳性克隆PBI-SlERF063质粒测序正确后用于转化。即通过农杆菌介导的番茄遗传转化体系将其导入到番茄品种MicroTom中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有卡那霉素抗性的愈伤、分化、生根、移栽、鉴定后得到转基因植株。转化载体中共获得了3株独立的转基因番茄植株。

具体步骤：(1)点种：将番茄品种MicroTom种子数粒提前泡水中3-4h，再倒掉水加入75％酒精消毒45sec，无菌水冲洗五次，加入20％NaClO消毒18min(避光)，消毒结束用无菌水洗种子五次，每次约浸泡两分钟后倒掉无菌水，稍微吸干水分后转移至萌发培养基1/2MS上进行暗培养；(2)切苗进行预培养：当种子发芽并长到有两片成熟子叶时，用剪刀剪去叶尖和叶基部，将子叶倒扣叶背面朝上铺到预培养基上，避光预培养1-2天左右；(3)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的YEB固体培养基上预培养农杆菌LBA4404(来源于上海唯地生物，商用菌株)两天，培养温度为28℃；将所述的农杆菌转移至YEB液体培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养12小时；(4)农杆菌侵染及共培养：使用液体MS培养基调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.2-0.3，将子叶在农杆菌悬浮液中轻柔振荡培养12-15min，再转移至灭菌好的滤纸上吸干，放置在共培养培养基上培养2天；(5)筛选培养：将共培养基上的子叶转移到筛选培养基上，每两个周更换一次培养基，直至愈伤组织长出不定芽；(6)生根：将长出的不定芽切下，去掉周围所有的愈伤组织，尽量保持完整，转移至生根培养基上(插入培养基)进行生根培养；(9)移栽：选取长出根的健壮植株，移栽到营养土中，移栽后5天避免水分大量丧失，待植株生长正常后进行鉴定。

鉴定具体步骤如下：(1)DNA提取：剪下1cm大小左右的叶片，通过CTAB法(配方见后)进行DNA的提取，首先使用1.5×CTAB提取液加热提取后，加入氯仿和异戊醇分离有机相，再使用无水乙醇沉淀DNA后用75％乙醇进行洗涤后即可获得DNA溶液；(2)载体转入鉴定：为了验证PBI121超量表达载体是否转化进植株，使用载体特异性引物OJX487：5’-CGCAAGACCCTTCCTCTATATAAG-3’和OJX488：5’-TAAAACGACGGCCAGTGAATTCCC-3’进行PCR扩增鉴定，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸5min。然后进行琼脂糖凝胶电泳，有条带的表示载体转入；(3)RNA提取和反转录：使用实施例2中的RNA提取以及反转录方法从载体转入的植株叶片以及野生型叶片中提取总RNA并获得cDNA；(4)qPCR测定表达量变化：利用SYBR qPCR定量PCR检测试剂盒(购自Vazyme公司)进行qPCR检测(使用方法根据上述试剂盒说明书)，使用实时荧光定量PCR软件QuantstudioTM，以番茄Ubiquitin 3基因SlUBI为内参，检测引物序列为SlUBI-qRT-F：5’-GCCAAAGAAGATCAAGCACA-3’，SlUBI-qRT-R：5’-TCAGCATTAGGGCACTCCTT-3’，采用ΔΔCt法计算转基因植株中SlERF063的相对表达量。表达量上升表示获得超量表达植株，鉴定完成。

转化中所用试剂和培养基的配制：

(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下，KN(Kanamycin，卡那霉素)；KT(Kinetin，激动素)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；Tim(Timentin，特美汀)；ZR(trans-Zeatin-riboside，玉米素核苷)；IBA(3-Indolebutyric acid，吲哚丁酸)；KH₂PO₄(磷酸二氢钾)；MS(Murashige&Skoog)。

(2)主要溶液配方：

1)MS液体培养基的配制

MS Base salt 4.33g；

MS Vitamin 0.1031g；

蔗糖 30g；

室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

2)ZR贮存液，IBA贮存液为2g/L；IAA贮存液，KH₂PO₄，2,4-D贮存液，KT贮存液为1g/L；Tim贮存液为320g/L；KN贮存液为50g/L；AS贮存液为200mM/L。均需要过滤灭菌。

(3)用于番茄遗传转化的培养基配方

1)预/共培养基

调节pH值到5.8，定容至1000ml，封口灭菌。

2)筛选培养基

调节pH值到5.8，定容至1000ml，封口灭菌。

3)生根培养基

调节pH值到5.8，定容至1000ml，封口灭菌。

4)YEB培养基

调节pH值到7.4，定容至1000ml，封口灭菌。

5)1.5×CTAB提取液

加入ddH2O定容至1000ml。

实施例4：SlERF063基因果实中瞬时超量表达载体的构建和转化

果实瞬时超量表达载体构建方法如下：首先将实施例2中得到的阳性克隆E8-SlERF063质粒测序正确后用于转化。即通过农杆菌介导的瞬时表达体系将其注射到番茄品种MicroTom的果实中，经过正常培养5d后得到瞬时表达的果实。

具体步骤：(1)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的YEB固体培养基上预培养农杆菌GV3101(来源于上海唯地生物，商用菌株)两天，培养温度为28℃；将所述的农杆菌转移至YEB液体培养基里，28℃摇床上培养12h；(2)注射菌液的准备：将培养后的农杆菌收集，使用缓冲液(配方见后)重悬并调节OD600为1，振荡2h以上；(3)果实注射：选取大小一致的成熟绿果(不同株的果实要分别注射对照)，使用1ml注射器，将针头从果柄处插入，将菌液缓慢的注射进去，注射后培养5d左右即可进行采样；(4)表型观察并拍照：从注射前到取样期间，每天对转化果实进行表型观察并进行拍照，表型变化情况如例图4所示，结果表明，与对照相比，超量表达SlERF063的番茄果实在注射后第二天就出现了提前破色的情况，并且在注射后，果实均比野生型的要更红，甚至提前到达完全成熟，表明超量表达SlERF063能够使得果实提前成熟。

转化中所用试剂和缓冲液的配制：

(1)主要溶液配方：

1)MES贮存液为0.5M，工作浓度为10mM，PH为5.7；MgCl₂贮存液为1M，工作浓度为10mM；AS贮存液为100mM，工作浓度为200uM。均需要过滤灭菌。

2)缓冲液的配制：

MES 20ml；

MgCl₂ 10ml；

AS 2ml；

用蒸馏水定容至1000ml。

实施例5：SlERF063基因果实中瞬时超量表达后相关基因表达量以及代谢物的测定

基因表达量测定和代谢物测定方法如下：首先将实施例4中得到的瞬时转化的果实进行取样，其中一部分进行RNA提取后反转录成cDNA，再进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)完成基因表达量测定；剩下的样品通过冻干、研磨、提取后进行代谢物含量的测定。

具体步骤：表达量测定：(1)取样：在果实破色期第五天的时候进行取样。将果实摘下后分为两部分，快速分装后放入液氮，保存于-80℃冰箱；(2)RNA提取：在液氮中将果实研磨成粉末后采用多糖多酚总RNA提取试剂盒(购自北京天根生化公司)进行番茄果实RNA提取(提取方法根据上述试剂盒说明书)；(3)反转录及鉴定：利用反转录试剂盒Supermix(购自北京全式金公司)将其反转录合成cDNA，反应条件：42℃ 30min，80℃ 5sec，将产物稀释10倍；(4)qRT-PCR测定表达量：利用SYBR qPCR定量PCR检测试剂盒(购自Vazyme公司)进行qPCR检测(使用方法根据上述试剂盒说明书)，使用实时荧光定量PCR软件QuantstudioTM，以番茄Ubiquitin 3基因SlUBI为内参，检测引物序列为SlUBI-qRT-F：5’-GCCAAAGAAGATCAAGCACA-3’，SlUBI-qRT-R：5’-TCAGCATTAGGGCACTCCTT-3’，采用ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

测定结果：qRT-PCR结果表示，在三株超量表达植株果实中，SlERF063的表达量均上升，如附图3所示；附图5为番茄SGAs生物合成与调控通路部分示意图以及相关基因的相对表达量，其中GAME12参与了从呋喃甾醇-26-醛(furosutanol-26-aldehyde)至具有毒性的番茄碱(Tomatidine)的合成，而GAME18、GAME2以及GAME5则参与了番茄碱分解的过程，通过表达量的测定，发现GAME12在三个超量表达的株系中表达量均下降，表明番茄碱的合成受到抑制，而GAME18、GAME2以及GAME5的表达量均上升，表明番茄碱的分解过程被促进。

代谢物含量测定：(1)冻干及研磨：将液氮中或者-80℃冰箱中取出的样品放入冻干机中进行干燥(约1周左右)，然后使用研磨机研磨成粉末；(2)提取：每个样品称量0.1g左右，加入万倍体积的70％甲醇(如0.1g加入1ml)，涡旋振荡混匀，放置于冰上，每隔10min涡旋一次，共三次，而后保存于4度5小时以上，再涡旋后进行离心，吸取上清液进行过滤灭菌后即可使用液相色谱-质谱联用仪LC-MS进行代谢样的检测。

测定结果：结果如例图6所示，通过测定番茄碱以及下游代谢物质的相对含量，发现有毒物质番茄碱的含量显著下降，而下游分解过程所产生的代谢物含量均上升，最后得到的无毒的七叶皂苷A含量上升与GWAS结果相对应，表明SlERF063基因的超量表达加快了番茄果实中有毒物质番茄碱的分解，使得番茄果实毒性降低。

序列表

<110> 海南大学

<120> 番茄SlERF063基因在促进果实成熟和降低果实毒性中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1655

<212> DNA

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 1

atgtgcatat taaaggtggc gaatcaagga gattccggca agtatgacag aattccgtcg 60

acagcaggtg attctgaaac tacaacgaat gaaggaattc ctcaaccgta tgaacagtcg 120

caatcttttg aagaaatgtt acagcaacaa atacagcaag aaacagagta tttgatgtcg 180

gaatcggcta atccgatgta tacagggtat agtcagtcga gggatatgtc ggcaatggtg 240

acggcgttaa cacacgtggt ttcgggtcgg agagaggcag agtggggtta caggccggat 300

attagcggtg ttacgacttc gtttggtggt ggtggttcag ggagtattta ttcggcaaat 360

tcaccgtctt cttcgagttc aggatcatgg gctggacaga aaagaagacg tgatcaagaa 420

gaaagtgtta ctggagaaca agctcaaagg ggttatggag gtatcggaga atttaaaaat 480

ggagaatcat cttcctctgt taagctcggt tcgtatcgat actttccact tattaaactc 540

tcttccgttc tttttagttg gaaatattag gaaatcaccg taactcacgc tattatttca 600

cccgatataa gtctatcgga cgagctaaat attttgggtt catttcaaga ttctatcctt 660

ttattttatt tttcttctca attttcaaat tgttctctgt tttggaccgg atatatgctc 720

tgttttcttt atcttgtatt gattgatttt gactctttaa aacttgattt tgattccata 780

tcatcttcta atggttggtt ccagaagaag atacaagcct ggcaacacca caaacgagca 840

gcatatcgac aactactgcg tcgcagacac caccgcaagc atcggaagta acaggtgaag 900

aaacagggga gaggaagagg agatacagag gagtaagaca gagaccatgg ggtaaatggg 960

cagcagagat aagagatcca cataaagcag caagagtttg gttaggcaca ttcgatacag 1020

cagaagcagc cgctaaagct tatgatgacg ccgctcttag attcagagga aacagagcta 1080

aactcaattt ccctgaaaat gttcggttat taccacaaca acaacaacaa cccacaacaa 1140

gattagccat atcaacctca tcatcaaccg cagctccgcg attccaatta atgtctgcag 1200

catcaacgcg atcaccatca ccatcaccat ttttttttca atcatataat caacctccgc 1260

gtcaatctga tcagcagcat cagaatcagc aacaacagtt atttcagagc tcagatatgg 1320

ctagagatta ttgggaatac tcgcaattac ttcaaaatcc aatagatttc catggaggac 1380

aacaatcatc atctttgtta gaacaaatgt tactagcttc atcattggga gtgttacatt 1440

cacatacatt tccttcttcg tcatcttctt cattagcaac ttctgcagct tcttccacta 1500

cttcccctgc atatcccctg ttttactctg ctcaacaatc acgcttcttt cagccacaaa 1560

ctcatcaaaa tcaaagcaat agcagtagca acagctcaaa ttttcctcca cctttttgga 1620

ctagttccgg ccactatcca ccttcttcta gctaa 1655

<210> 2

<211> 1359

<212> DNA

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 2

atgtgcatat taaaggtggc gaatcaagga gattccggca agtatgacag aattccgtcg 60

acagcaggtg attctgaaac tacaacgaat gaaggaattc ctcaaccgta tgaacagtcg 120

caatcttttg aagaaatgtt acagcaacaa atacagcaag aaacagagta tttgatgtcg 180

gaatcggcta atccgatgta tacagggtat agtcagtcga gggatatgtc ggcaatggtg 240

acggcgttaa cacacgtggt ttcgggtcgg agagaggcag agtggggtta caggccggat 300

attagcggtg ttacgacttc gtttggtggt ggtggttcag ggagtattta ttcggcaaat 360

tcaccgtctt cttcgagttc aggatcatgg gctggacaga aaagaagacg tgatcaagaa 420

gaaagtgtta ctggagaaca agctcaaagg ggttatggag gtatcggaga atttaaaaat 480

ggagaatcat cttcctctgt taagctcgaa gaagatacaa gcctggcaac accacaaacg 540

agcagcatat cgacaactac tgcgtcgcag acaccaccgc aagcatcgga agtaacaggt 600

gaagaaacag gggagaggaa gaggagatac agaggagtaa gacagagacc atggggtaaa 660

tgggcagcag agataagaga tccacataaa gcagcaagag tttggttagg cacattcgat 720

acagcagaag cagccgctaa agcttatgat gacgccgctc ttagattcag aggaaacaga 780

gctaaactca atttccctga aaatgttcgg ttattaccac aacaacaaca acaacccaca 840

acaagattag ccatatcaac ctcatcatca accgcagctc cgcgattcca attaatgtct 900

gcagcatcaa cgcgatcacc atcaccatca ccattttttt ttcaatcata taatcaacct 960

ccgcgtcaat ctgatcagca gcatcagaat cagcaacaac agttatttca gagctcagat 1020

atggctagag attattggga atactcgcaa ttacttcaaa atccaataga tttccatgga 1080

ggacaacaat catcatcttt gttagaacaa atgttactag cttcatcatt gggagtgtta 1140

cattcacata catttccttc ttcgtcatct tcttcattag caacttctgc agcttcttcc 1200

actacttccc ctgcatatcc cctgttttac tctgctcaac aatcacgctt ctttcagcca 1260

caaactcatc aaaatcaaag caatagcagt agcaacagct caaattttcc tccacctttt 1320

tggactagtt ccggccacta tccaccttct tctagctaa 1359

<210> 3

<211> 452

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 3

Met Cys Ile Leu Lys Val Ala Asn Gln Gly Asp Ser Gly Lys Tyr Asp

1 5 10 15

Arg Ile Pro Ser Thr Ala Gly Asp Ser Glu Thr Thr Thr Asn Glu Gly

20 25 30

Ile Pro Gln Pro Tyr Glu Gln Ser Gln Ser Phe Glu Glu Met Leu Gln

35 40 45

Gln Gln Ile Gln Gln Glu Thr Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ser Ala Asn

50 55 60

Pro Met Tyr Thr Gly Tyr Ser Gln Ser Arg Asp Met Ser Ala Met Val

65 70 75 80

Thr Ala Leu Thr His Val Val Ser Gly Arg Arg Glu Ala Glu Trp Gly

85 90 95

Tyr Arg Pro Asp Ile Ser Gly Val Thr Thr Ser Phe Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Ser Ile Tyr Ser Ala Asn Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Trp Ala Gly Gln Lys Arg Arg Arg Asp Gln Glu Glu Ser Val Thr

130 135 140

Gly Glu Gln Ala Gln Arg Gly Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asn

145 150 155 160

Gly Glu Ser Ser Ser Ser Val Lys Leu Glu Glu Asp Thr Ser Leu Ala

165 170 175

Thr Pro Gln Thr Ser Ser Ile Ser Thr Thr Thr Ala Ser Gln Thr Pro

180 185 190

Pro Gln Ala Ser Glu Val Thr Gly Glu Glu Thr Gly Glu Arg Lys Arg

195 200 205

Arg Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu

210 215 220

Ile Arg Asp Pro His Lys Ala Ala Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp

225 230 235 240

Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala Tyr Asp Asp Ala Ala Leu Arg Phe

245 250 255

Arg Gly Asn Arg Ala Lys Leu Asn Phe Pro Glu Asn Val Arg Leu Leu

260 265 270

Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Thr Thr Arg Leu Ala Ile Ser Thr Ser

275 280 285

Ser Ser Thr Ala Ala Pro Arg Phe Gln Leu Met Ser Ala Ala Ser Thr

290 295 300

Arg Ser Pro Ser Pro Ser Pro Phe Phe Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Pro

305 310 315 320

Pro Arg Gln Ser Asp Gln Gln His Gln Asn Gln Gln Gln Gln Leu Phe

325 330 335

Gln Ser Ser Asp Met Ala Arg Asp Tyr Trp Glu Tyr Ser Gln Leu Leu

340 345 350

Gln Asn Pro Ile Asp Phe His Gly Gly Gln Gln Ser Ser Ser Leu Leu

355 360 365

Glu Gln Met Leu Leu Ala Ser Ser Leu Gly Val Leu His Ser His Thr

370 375 380

Phe Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ala Thr Ser Ala Ala Ser Ser

385 390 395 400

Thr Thr Ser Pro Ala Tyr Pro Leu Phe Tyr Ser Ala Gln Gln Ser Arg

405 410 415

Phe Phe Gln Pro Gln Thr His Gln Asn Gln Ser Asn Ser Ser Ser Asn

420 425 430

Ser Ser Asn Phe Pro Pro Pro Phe Trp Thr Ser Ser Gly His Tyr Pro

435 440 445

Pro Ser Ser Ser

450

Claims

1.SlERF063基因在促进番茄果实成熟或/和降低番茄果实甾体糖生物碱SGAs含量上的应用，所述SlERF063基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在番茄果实中超量表达SlERF063基因，可以促进果实成熟并降低果实甾体糖生物碱SGAs含量。