KR101171347B1 - 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식미가 향상된 벼 식물체 및 이의 종자 및 상기 유전자를 포함하는, 벼의 식미 향상용 조성물에 관한 것이다.

Description

벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법{Method for producing rice plant with enhanced eating quality transformed with gene encoding starch branching enzyme from rice}
본 발명은 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식미가 향상된 벼 식물체 및 이의 종자 및 상기 유전자를 포함하는, 벼의 식미 향상용 조성물에 관한 것이다.
벼는 세계 인구의 반 이상이 이용하는 가장 중요한 식량작물의 하나이다. 매년 전 세계적으로 4억톤 이상을 생산하지만 대부분은 품질이 낮다. 특히, 영양성분, 기능성분 및 미질 등의 품질이 낮다. 쌀밥을 먹을 때에 여러 가지 품질 관련 요소들 중에서 식미도는 소비자들이 특정 품종을 선택하는 가장 중요한 선결조건의 하나이다. 쌀의 식미는 배유 내의 전분, 단백질, 지질 및 미량원소들, 그들 간의 조화에 의하여 결정된다. 이제까지 연구된 바로 양식미 품종이 갖추어야 할 조건은 낮은 호화온도, 저단백, 저아밀로스, 저 응집 및 치반 점도, 아밀로펙틴 단쇄비율 향상, 구수한 냄새, 투명한 외관, 얇은 겨층 등으로 요약되며, 이러한 이화학적 선발지표에 의해 지금까지 양식미 육종이 이루어져 왔고 생활수준의 끊임없는 향상과 더불어 벼 품종의 식미도가 증진된 새로운 품종을 개발하는 것은 전 세계 벼 육종가들의 연구목표가 되어 왔다.
최근 연구보고에 의하면 벼 배유의 저 단백질 함량과 양질의 전분특성은 고품질미를 나타내는 가장 중요한 요소들이라고 하였다 (Shu et al. 1998. Scientia Agricultura Sinica 31(3): 25-29). 쌀알에서 전분은 현미 중의 약 90%를 차지하고 (Yoshida 1972. Annual Review of Plant Physiology 23: 437-464), 백미에서는 76.7-78.4% 를 차지하고 있다 (Huang et al. 1998. Chinese J Rice Sci 12(3): 172-176). 일반적으로 쌀은 아밀로스 함량에 따라 1~2%는 찰벼, 7~20%는 저 아밀로스, 20~25%는 중간 아밀로스와 25% 이상의 고 아밀로스로 분류된다. 보통 멥쌀의 배유에서 전분은 주로 아밀로스와 아밀로펙틴으로 구성되어 있는데, 아밀로스는 주로 α-1,4 연결된 글루코스 분자와 소수의 α-1,6 연결된 branches의 긴 선형체인으로 되어 있고, 아밀로펙틴은 짧은 α-1,4 연결된 글루코스 분자와 더 빈번한 α-1,6 branches로 구성되어 있는데, 이들 두 종류의 분자들이 결합하여 반결정성 전분 과립(semi-crystalline starch granule)을 형성하고 여기에 지질과 포스페이트가 결합하게 되는데 이들의 비율은 종에 따라 다양하며 그 비율이 양식미를 좌우할 수 있다.
아밀로펙틴의 미세구조, 특히 중합(DP) 정도와 긴 선형체인 정도는 쌀알의 수분흡수와 팽창 및 쌀밥의 점착성, 유연성, 경도 등을 결정하는 중요한 요소이다 (Asaoka et al. 1985. Agric Biol Chem 49: 373-379). 아밀로펙틴은 ADP-Glc pyrophosphorylase (AGPase), soluble starch synthase (SS), starch-branching enzyme (SBE), starch-debranching enzyme 및 granule-bound starch synthase I (GBSSI) 등의 공조작용에 의하여 합성되어진다(Smith et al., 1997. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 67-87). Starch branching enzyme (SBE)은 α-polyglucans에 단지 α-1,6 glucan branches를 도입하며 아밀로펙틴의 미세구조에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 또한, SBE는 α-1,6 glucan branches가 위치하는 아밀로펙틴 tandem-cluster 구조의 결정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Ball et al. 1998. Trends Plant Sci 3: 462-467). 이러한 전분 합성에 관여하는 유전자들의 적절한 조합에 의해 아밀로펙틴의 구조를 변형시키고 함량을 높임으로써 고도 양식미 쌀을 개발할 수 있다.
식물에서 전분가지화 효소 (starch brancing enzyme, sbe)는 α-1.6-glucosidic linkages를 α-polyglucans으로 만드는 유일한 효소이다. 벼에서는 SBE1, SBE3(QE Ⅱa, 또는 SBEⅡb), 및 SBE4(QE Ⅱb, 또는 SBEⅡa)의 3가지 이성질형이 존재하는데 (Yamanouchi and Nakamura 1992. Plant Cell Physiol 33(7): 985-991), SBE1은 벼 배유에서 SBE3와 SBE4 보다 높게 발현된다. Hanashiro 등 (1996)은 배 배유에서 아밀로펙틴의 A, B1, B2, B3 체인의 크기는 각각 A는 6≤DP≤12，B1은 13≤DP≤24, B2는 25≤DP≤36, 및 B3는 DP≥37이라고 하였다. SBE1의 발현이 낮을 때 아밀로펙틴은 중간 크기(16≤DP≤23)와 긴 체인(DP≥37)이 적고 짧은 체인(DP≤12)이 많아진다고 하였다 (Nakamura 2002. Plant Cell Physiol 43(7): 718-725). SBE3가 적을 때에는 특히 8≤DP≤11 범위의 짧은 체인의 많은 감소와 함께 DP≤13 체인이 많이 감소한다고 하였다 (Nishi et al. 2001. Plant Physiology 127: 459-472). SBE4의 활성은 벼 배유에서 전체 SBE 효소 활성의 약 15-20%를 차지하는데, 이는 SBE3의 기여 정도와 비슷한 것으로 알려져 있다(Yamanouchi and Nakamura 1992. Plant Cell Physiol 33(7): 985-991). SBE4의 활성이 저하될 때 아밀로펙틴 체인은 유의하게 변화하지 않지만, SBE3가 발현되지 않는 벼 엽초의 아밀로펙틴에서 DP≤10의 짧은 체인은 유의하게 감소한다(Nakamura 2002. Plant Cell Physiol 43(7): 718-725).
전분합성효소(starch synthase)에는 soluble starch synthase(SSS)와 granule-bound starch synthase(GBSS)가 있다. 전분합성효소는 α-1.4-glucosidic linkage의 체인 신장을 촉매하는데, SSS1, SSS2A(SSSⅡ-3), SSS2B(SSSⅡ-2), SSS2C(SSSⅡ-1), SSS3A (SSSⅢ-2)，SSS3B(SSSⅢ-1), SSS4A(SSSⅣ-1)，SSS4B(SSSⅢ-2), 및 GBSS1, GBSS2 등 10개의 이성질형이 존재한다(Hirose et al. 2004. Planta 220: 9-16). 전분 생합성에 관여하는 효소 중에서 전분합성 효소는 불안정하고 다양한 이성질형들이 존재하기 때문에 동정하기가 매우 어려운 것으로 알려져 있다. SSS1 효소는 6≤DP≤7의 체인의 신장을 촉매하여 8≤DP≤12 정도의 짧은 체인을 합성하며 SSS1 효소 활성이 저하되면 호화온도가 높아지게 된다(Fujita et al. 2006. Plant Physiology 140: 1070-1084). SSS2A 효소는 짧은 체인(6≤DP≤11)을 긴 체인(13≤DP≤25)으로 직접 신장시키는 작용을 하며 이 효소는 ALK(alkali spreading score) 유전자에 의하여 합성되어 호화온도를 조절하는 작용을 한다(Mckenzie and Rutger 1983. Crop Science 23: 306-313). SSS1 효소는 벼의 잎과 배유에 발현하지만, SSS2A 효소는 배유의 soluble phase와 granule-bound phase에 모두 발현한다. SSS3A 효소는 DP≥30의 긴 체인과 6≤DP≤8의 짧은 체인, 그리고, 16≤DP≤20의 체인 등을 배유 발달과정에 합성하는 작용을 한다(Fujita et al. 2007. Plant Physiology144: 2009-2023).
Starch branching enzyme(DBE)에는 isoamylase(ISA)와 pullulanase(PUL)가 있다. 벼에서 ISA는 ISA1, ISA2 및 ISA3의 3개 이상의 이성질형들이 존재하고, PUL은 하나의 형태가 보고 되었다(Fujita et al. 2009. Journal of Experimental Botany 60(3): 1009-1023). ISA1와 ISA2는 배유에서 전분을 주로 6≤DP≤15의 체인으로 debranch 하는 작용을 하고, 가끔 DP≥25의 체인에 작용하는 경우도 있다 (Fujita et al. 2003. Plant Cell Physio 44(6): 607-618). ISA3은 DP7과 10≤DP≤19의 체인으로 debranches 하며 주로 벼 잎에서 발현하고 가끔 배유에서도 작용한다 (Ohdan et al. 2005. Journal of Experimental Botany 56 (422): 3229-3244). PUL은 2≤DP≤4 크기의 짧은 체인으로 전분을 debranches 하며 주로 배유에서 발현한다 (Ohdan et al. 2005. Journal of Experimental Botany 56 (422): 3229-3244).
한국특허공개 제2005-0113217호에는 식물에서의 아밀로스 생산 증강 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2007-0001057호에는 아밀로스 비율이 증가된 전분을 갖는 쌀 및 이의 생성물이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2008-0028950호에는 식물 중 전분 합성효소의 과발현이 개시되어 있으나, 본 발명의 방법과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 분자육종을 통하여 현재 고품질 벼로 재배되고 있는 벼의 수준보다 향상된 식미를 가진 중간모본들을 육성하기 위해, 전분가지화효소 (starch branching enzyme 1, OsSbe1) 유전자를 식물 형질전환 운반체에 삽입하여 재조합 운반체를 제작하여 아그로박테리움을 이용하여 벼에 형질전환하였다. 그 형질전환 벼 계통의 후대를 육성하여 OsSbe1 유전자의 발현을 RNA 및 효소 분석을 통해 알아보았으며, 또한 식미 관련 성분 등을 분석하였으며 식미 형질이 우수하고 농업적 특성이 우수한 양식미 계통을 선발하여 그 후대계통을 육성함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식미가 향상된 벼 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는, 벼의 식미 향상용 조성물을 제공한다.
본 발명은 유전자 형질전환에 의한 분자육종을 통하여 현재 고품질 벼로 재배되고 있는 벼의 수준보다 향상된 식미를 가진 중간모본들을 육성하였다. Sbe1 유전자의 형질전환에 의하여 선발한 고식미, 다수성 벼 계통은 앞으로 고양식미, 다수성 품종 개발에 이용되어 쌀 산업의 경쟁력을 제고할 수 있고, 수입개방 시대에 최고식미를 통해 우리 쌀의 경쟁력을 높임으로써 쌀 산업을 활성화하고 장차 최고품질 쌀 및 종자의 수출가능성도 확보할 수 있다.
도 1은 아밀로스 및 아밀로펙틴의 합성 관련하여 효소들의 활성 기능성 위치를 보여주는 전분 대사 과정의 모식도이다.
도 2는 벼의 전분 대사에서 전분가지화효소의 발현을 증가시킬 것으로 기대되는 p35S : OsSbe1의 벡터 구축물을 보여준다.
도 3은 Sbe1 유전자의 형질전환 후 벼 배아 캘러스의 유도 및 재분화를 보여준다.
도 4는 아그로박테리움 매개 방법에 의해 35S::Sbe1 재조합 벡터가 도입된 형질전환 벼 식물체에서 HPT(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제) 유전자 및 전분가지화효소 1(Sbe1) 유전자의 분석을 보여준다. T1 세대에서 1,065개 형질전환 벼 식물체를 HPT-Fw/HPT-Rv(A) 및 35S-F1/Sbe1-Rv1(B) 프라이머 쌍을 이용하여 분석하였다. 라인 11903에서 12012까지의 1,005개 형질전환 벼 식물체는 2개의 식물체인 19 및 21을 제외하고 HPT 유전자의 삽입을 보여주었으며(A), 2개의 식물체인 5 및 13을 제외하고 Sbe1 ORF의 삽입을 보여주었다 (B). M: 100 bp ladder DNA, V: 양성 대조군 벡터, W: 모품종, N: 음성 대조군.
도 5는 35S::Sbe1 벡터 구축물로 형질전환된 형질전환 벼 식물체 중에서 호모 식물체를 선발하기 위한 온실에서 형질전환 벼 식물체의 육성 및 50 ppm 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 T1 종자의 선발을 보여준다.
도 6은 모품종 및 형질전환 벼 식물체에 대한 Sbe1 유전자의 반정량적 RT-PCR을 보여준다. 80 ng의 합성된 cDNA 및 대조군으로서 액틴 유전자를 반정량적 RT-PCR에 이용하였다. W, 모품종; 1-5, 바람직한 표현형을 갖는 형질전환 식물체, 6-11, 비정상적인 표현형을 갖는 형질전환 식물체.
도 7은 Sbe1 ORF를 갖는 형질전환 벼의 돌연변이체를 보여준다. 모품종 고품벼(Gopumbeyo)와 비교하여 1, 자색 줄기 돌연변이; 2, 긴 까끄라기 작은이삭(long awn spikelet); 3, 직립 이삭 돌연변이(erect panicle mutation); 4, 키가 작고 분얼수가 거의 없는 돌연변이.
도 8은 903개 T2 형질전환 라인에 대한 현미에서 AAC(apparent amylose content)의 분포를 보여준다.
도 9는 T2 세대에서 상이한 AAC(apparent amylose content)를 보여준 T3 세대에서 개화 후 15일에 샘플링된 미숙 종자를 이용한 반정량적 RT-PCR 분석 결과이다. 50 ng의 제1가닥 cDNA를 주형으로 이용하였으며, Sbe1 프라이머를 Sbe1의 보존된 도메인으로부터 디자인하였고, 28 사이클을 Sbe1 및 Actin에 대해 채택하였다. Code W, 및 1-6은 표 3에서의 라인을 나타낸다.
도 10은 벼 종자 발달 동안 Sbe1 및 Sbe3 의 발현 프로필을 보여준다. 벼 이삭(panicle)를 개화 후 0, 5, 10, 15, 20, 및 25일에 수확하였다. 100 ng의 제1가닥 cDNA를 주형으로서 이용하였다.
도 11은 개화 후 15일에 샘플링된 T2 라인에서 low, medium, 및 high AAC(apparent amylose content)를 갖는 모품종 고품벼 및 T3 라인 유래의 벼 미숙 종자에서 Sbe1, Sbe3, 및 Sbe4 를 포함하는 벼 전분가지화효소의 효소 활성을 보여준다. Code W, 및 1-6은 표 4에서의 라인을 나타낸다. 낮은 Sbe 효소 활성은 높은 아밀로스 함량을 야기한다.
도 12는 Sbe1에 의해 형질전환된 고품벼 유래의 193개 T2 라인에서 초장(plant height), 간장(culm length), 수장(panicle length), 수수(panicles per plant)의 분포를 보여준다.
도 13은 Sbe1에 의해 형질전환된 고품벼 유래의 52개 T3 라인의 벼 알곡에서 Toyo taste meter 값의 분포를 보여준다.
도 14는 52개 T3 라인의 백미에서 AAC(apparent amylose content), P(Toyo meter value), protein content, ADV(alkali digestion value), PV(peaking value), HPV(hot paste viscosity), CPV(cool paste viscosity), BDV(breakdown value), SBV(setback viscosity), CTV(consistency viscosity), PT(pasting temperatue)의 분포를 보여준다.
도 15는 T2 세대에서 바람직한 표현형을 갖는 형질전환 라인의 선발을 보여준다. a: 13347 라인, b: 13341-13352 라인, c: 이삭 비교, 첫번째 3개의 이삭은 고품벼 유래이며, 나머지 3개의 이삭은 13347 라인 유래이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자 OsSbe1(Oryza sativa starch branching enzyme 1)를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 쌀의 식미는 배유 내의 전분, 단백질, 지질 및 미량원소들, 그들 간의 조화에 의하여 결정되며, 본 발명의 OsSbe1를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 벼 식물체는 식미가 향상되었다.
상기 OsSbe1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, OsSbe1 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자 OsSbe1(Oryza sativa starch branching enzyme 1)를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터는 바람직하게는 도 2에 기재된 35S::Sbe1 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 HvNHX1 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(하이그로마이신), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 벼이다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 식미가 향상된 벼 식물체를 제공한다. 상기 벼는 바람직하게는 고품벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 식미가 향상된 식물체는 벼에 한정되지 않으며, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수 등의 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 벼의 종자이다.
본 발명은 또한, 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자 OsSbe1(Oryza sativa starch branching enzyme 1)를 포함하는, 벼의 식미 향상용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 OsSbe1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 벼의 식미 향상용 조성물은 유효 성분으로서 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자 OsSbe1(Oryza sativa starch branching enzyme 1)를 포함하며, 상기 OsSbe1 유전자를 벼 식물체에 형질전환시킴으로써 벼의 식미를 향상시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
재조합 유전자 운반체 제작
벼 종자의 전분합성 대사의 마지막 부분에서 전분가지화효소 (starch synthase 1, Sbe1) 유전자의 발현량을 늘려서 아밀로펙틴 생합성량을 증대시키기 위하여 35S 프로모터에 Sbe1 유전자를 연결한 재조합 유전자를 도 2와 같이 제작하였다. 식물 유전자 운반체인 pCAMBIA1300은 형질전환된 식물체의 선발을 위하여 하이그로마이신 phosphotransferase (HPT)를 가지고 있는데, 그 부근에 있는 35S 프로모터에 연결된 multiple cloning site(MCS)에 Sbe1 유전자를 삽입하여 재조합 유전자를 제작하였다. 우선 Sbe1 (GenBank Accession No. AK068920) 유전자의 ORF를 얻기 위하여 유전자 특이적인 프라이머인 Sbe1-Fw(XbaI) 5'-TCTAGAATGGTGACTGTTGTGGAGGAG-3'(서열번호 2)와 Sbe1-Rv(XbaI), 5'-TCTAGATCATTTGCAGTCTTCGTCAGA-3'(서열번호 3)를 제작하였고 이를 이용하여 Nipponbare (Oryza sativa L. ssp. janopica) 유래의 cDNA에서 RT-PCR 증폭에 의하여 Sbe1 유전자 ORF를 획득하였다. RT-PCR로 증폭된 Sbe1 ORF는 35S 프로모터에 연결된 multiple cloning site(MCS)인 XbaI site에 삽입하여 p35S : OsSbe1 재조합유전자를 제작하였다.
형질전환 및 재배 육성
재조합유전자 p35S : OsSbe1를 MicroPulser electroporation system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA4404에 도입한 다음 아그로박테리움 매개 형질전환 방법을 이용하여 다음과 같이 유전자를 형질전환 하였다. 벼 종자를 이용하여 재조합 유전자 p35S : OsSbe1를 형질전환하는 방법은 Melgar et al. (2009)에 기술하였듯이 Toki 등(2006. The Plant Journal 47: 969-976)의 방법을 수정하여 실험을 수행하였다. 유전자 형질전환에 사용한 배지의 조성은 표 1과 같다.
Figure 112010011136366-pat00001
우선 p35S : OsSbe1를 가진 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 LBA4404를 50 mg/L 카나마이신 설페이트와 100 mg/L 스트렙토마이신이 포함되고 1.5% agar를 함유한 AB 고체 배지에서 3일 동안 30℃ 암 조건에서 배양하였다. 벼 종자의 배양은 일본형 고품질벼인 고품벼 종자의 건전한 종자만을 선발하여 종피를 제거한 다음 70% 에탄올로 2분 동안 멸균한 후 증류수로 1회 세척하였다. 그 다음 5% sodium hypochlorite 용액에서 15 분 동안 2회 소독한 후 증류수로 10회 이상 세척하였다. 소독한 종자는 1시간 동안 무균 상태에서 충분히 건조한 뒤 2.5 mg/L 2,4-D와 0.4% gelrite가 포함된 N6D 배지에 치상하여 32℃에서 5일 동안 배양하였다. 앞서 AB 배지에 배양한 p35S : OsSbe1를 지닌 LBA4404를 30 mg/L 아세토시링곤이 포함된 20 ml AAM 액체 배지에 현탁하여 OD650 값이 0.2가 되도록 농도를 조절하였다.
치상 후 약간의 캘러스가 유기된 종자를 LBA4404 현탁액 30 ml에 넣고 27℃에서 30분 동안 가볍게 거꾸로 흔들어 준 후 LBA4404 현탁액을 제거하고 멸균된 필터페이퍼(직경 9cm) 위에서 여분의 현탁액을 제거하였다. 균을 접종한 종자들을 0.4% gelrite를 함유한 ½2N6-AS 고체 배지 위에 멸균된 필터페이퍼를 깔고 0.5 ml AAM-AS 액체 배지로 적신 다음 그 위에 옮겨 28.5℃에서 1일, 23.5℃에서 4-5일 동안 암 조건에서 공동 배양하였다. 공동 배양한 후 종자를 500 mg/L 카베니실린이 포함된 증류수에서 10회, 2% plant preservative mixture(PPM, Plant Cell Technology, USA)가 포함된 증류수로 5회를 세척하여 잔여 아그로박테리움을 제거하였다. 세척이 끝난 종자를 신속히 멸균된 마른 필터 페이퍼로 물기를 가볍게 제거하고 50 mg/L 하이그로마이신과 400 mg/L 카베니실린이 포함된 N6D 고체 배지에 치상하여 32℃에서 2주 동안 캘러스의 유기와 동시에 하이그로마이신에 의한 형질전환 캘러스의 선발과정을 수행하였다.
그 후 유기된 캘러스를 조심스럽게 종자로부터 분리하여 200 mg/L 카베니실린이 포함된 SF 배지로 옮겨 식물체의 재분화를 유도하였고 캘러스로부터 분화되어 성장한 식물체를 50 mg/L 하이그로마이신이 포함된 RF 배지에 옮겨 뿌리를 유도하였다. 재분화 배지에서 줄기와 뿌리가 정상적으로 분화한 개체만을 선발하여, 2주 동안 배양실에서 순화시킨 후 개체별로 포트에 이식하여 인공환경조절 온실에서 재배한 뒤 종자를 수확하였다.
Sbe1 형질전환 벼 계통의 재배는 벼 유묘를 온실에서 육성하여 2008년, 2009년 6월 1일에 실험농장 벼 격리포장에 이앙하여 재배하였고 물 관리와 비료의 시용 및 병, 해충의 방제는 벼 표준재배법에 준하여 수행하였다.
DNA 추출 및 도입 유전자 확인
벼 재배 포장에 재배 중인 벼 식물체로부터 분얼기에 소량의 잎을 채취하여 DNA를 추출하였다(Cho et al. 2009. Korean J. Plant Biotechnology 36(1): 87-95). 벼 잎 1g을 14 ml 튜브에 넣고, 액화질소를 이용하여 곱게 마쇄한 후 DNA 추출 용액 (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 25 mM EDTA, Sodium bisulfate 0.38g/100 ml) 1 ml를 첨가하여 유봉으로 잘 혼합한 후, 클로로포름:이소아밀 알콜 (24:1) 1 ml를 첨가하여 10분간 흔들어 잘 혼합한 다음 3,500 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상등액을 분리한 후 동일 양의 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (25:24:1)를 첨가하여 10회 정도 흔들어 준 후, 12,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 1.5 ml 튜브에 옮긴 다음 2 ㎕의 RNase(10mg/l)를 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 2/3~1 부피의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 응축시킨 다음 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 DNA를 침전시킨 후, 70% 에탄올로 세척하고, 12,000 rpm으로 5분간 다시 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 DNA를 풍건시킨 다음 70 ㎕의 TE에 DNA를 녹여서 PCR 분석에 사용하였다. 추출한 DNA를 10~50배로 희석한 다음 시료당 20 ng을 취하여 PCR 분석에 이용하였다.
PCR에 사용한 프라이머는 Sbe1 앞에 위치한 35S 프로모터 단편의 특이적인 DNA 증폭을 위하여 정방향 프라이머 (5'-TTCAACAAAGGGTAATATCCGG-3'; 서열번호 4)와 역방향 프라이머 (5'-CGAAGGATAGTGGGATTGTGC-3'; 서열번호 5)를 합성하여 사용하였다. HPT 유전자(GenBank Accession No. V01499.1)는 HPT 정방향 (5'-GGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGA-3'; 서열번호 6)와 HPT 역방향 (5'-CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3'; 서열번호 7) 프라이머를 사용하여 유전자의 도입 여부를 분석하였고, Sbe1 유전자는 35S 프로모터부터 Sbe1 유전자 부위를 35S-Fw:CGCACAATCCCACTATCCTT(서열번호 8)와 Glb-Rv.Sbe1:GAAATTGGTCTTGACCTTTCCA(서열번호 9) 2개의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 hot step, 94℃에서 1분간 변성, 60℃에서 40초간 어닐링, 72℃에서 1분간 연장 과정을 35 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 5분간 마지막 연장의 프로그램으로 PTC-100 Thermal Cycler (MJ Research Inc., CA, USA)를 사용하여 증폭하였으며 1％ 아가로스 겔 상에서 유전자의 도입 여부를 확인하였다.
아밀로스 함량 조사
현미에서의 아밀로스 함량의 분석은 Juliano (1971. Cereal Science. Today 16. 10 : 334)의 방법을 약간 변형한 방법을 사용하여 조사하였다. 10 mg의 미세하게 분쇄한 현미가루를 20 ml 튜브에 넣고 100 μl의 100% 에탄올을 첨가하고 잘 혼합한 다음 900 μl의 1N NaOH를 첨가하고 잘 혼합하여 현미가루가 잘 풀어지며 섞이게 하였다. 그 다음에 100℃의 수조에서 30분 동안 가온을 하여 전분이 완전히 호화되도록 하였고 튜브를 식히고 볼텍스 믹서로 혼합하여 10 ml까지 증류수로 채웠다. 500 ul의 시료을 취하여 5 ml의 증류수를 넣은 새로운 20 ml 튜브에 넣고 100 μl의 1N 아세트산으로 중화하였다. 여기에 200 μl의 새롭게 만든 iodine-potassium iodide solution (2g KI+100 ml 증류수 + 0.2g I2)와 4.2 ml의 증류수를 첨가하고 볼텍스 믹서로 잘 혼합하여 30℃에서 30분 동안 암 조건에서 반응을 시킨 후 분광흡광광도계(HP 845x UV-visible system)의 620 nm에서 흡광도를 조사하였다.
아밀로스 함량의 표준곡선은 감자 유래의 1 mg/ml 표준 아밀로스 용액(Cat. No: A0512-5G, Sigma-Aldrich)과 1 mg/ml 표준 아밀로펙틴 용액(Cat.No: 10118, Sigma-Aldrich)을 사용하여 설정하였다. 아밀로스 함량 시리즈를 (0%) 18 ml 표준 아밀로펙틴 용액 + 2 ml 0.09 mol/L NaOH, (5%) 1ml 표준 아밀로스 용액 + 17 ml 표준 아밀로펙틴 용액 + 2 ml 0.09 mol/L NaOH, (10%) 2ml 표준 아밀로스 용액 + 16 ml 표준 아밀로펙틴 용액 + 2 ml 0.09 mol/L NaOH, (15%) 3ml 표준 아밀로스 용액 + 15 ml 표준 아밀로펙틴 용액 + 2 ml 0.09 mol/L NaOH, (20%) 4ml 표준 아밀로스 용액 + 14 ml 표준 아밀로펙틴 용액 + 2 ml 0.09 mol/L NaOH, (25%) 5ml 표준 아밀로스 용액 + 13 ml 표준 아밀로펙틴 용액 + 2 ml 0.09 mol/L NaOH 로 제조하였다. 무 전분 용액은 500 μl의 호화된 전분시료 대신에 500 μl 0.09 mol/L NaOH만으로 만들었고 이 무 전분 용액과 앞의 아밀로스 함량 시리즈 전분 표준용액은 다른 분석 대상 시료와 동일하게 분석과정을 처리하였다. 아밀로스 함량의 대조 품종으로서는 아밀로스 함량 18%의 고품벼(형질전환 모품종)를 사용하였고 각 시료는 3 반복을 취하여 분석을 수행하였다.
반정량적( Semi - quantitative ) RT - PCR 및 정량적 실시간( quantitative real-time) RT - PCR 분석
실험농장의 벼 포장에 재배 중인 T2 형질전환 벼의 등숙기에 RT-PCR 분석을 위한 벼 미숙 종자의 시료를 초형이 균질화된 형질전환 벼 계통 중에서 채취하였다. 우선 T1 종자의 아밀로스 함량에 따라 저 아밀로스함량 계통(10-14%), 중 아밀로스함량 계통(18-19%), 고 아밀로스함량 계통(>25%)으로 벼의 초형이 우수한 계통들 중에서 샘플링할 대상 계통을 선정하고 T2 형질전환 벼의 출수기에 각 계통의 출수일을 정하고 출수일로부터 각각 10일과 15일된 이삭을 채취하여 즉시 액화질소로 냉동하여 -80℃에 사용 전까지 보관하였다.
벼 미숙 종자로부터 총 RNA의 분리는 RNeasy mini kit(Qiagen)의 회사에서 제공하는 실험방법을 약간 수정하여 수행하였다. 90 mg의 곱게 분쇄한 동결분말을 1.5 ml 튜브에 넣고 600 μl RLC 버퍼를 가하여 즉시 볼텍스로 강하게 섞어준 다음 지체 없이 13,000 rpm에서 2 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 lilac spin column으로 용액이 굳지 않도록 신속히 옮기고 12,000 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리하였다. 원심분리 후에 컬럼을 통하여 분리한 추출물을 정제하기 위하여 100% 에탄올 280 μl를 가하고 4-5회 피펫으로 혼합한 다음 pink RNeasy spin column으로 옮겨 10,000 rpm에서 1 분 동안 원심분리하였다. 다시 pink RNeasy spin column에 700 μl의 RW1 버퍼를 가하고 10,000 rpm에서 1 분 동안 원심분리하였다. 그 다음 RNA의 세척을 위하여 500 μl의 RPE 버퍼를 가하고 10,000 rpm에서 1 분 동안 원심분리하는 과정을 2회 반복하고 여분의 RPE 버퍼를 완전히 제거하기 위하여 10,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. RNA의 회수를 위하여 50 μl의 RNase-free water를 pink spin column에 가한 다음 10,000 rpm에서 1 분 동안 원심분리하였다. RNA의 농도는 Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc. USA)를 사용하여 정확한 농도를 측정하였으며, 즉시 -80℃에 보관하였다.
RT-PCR을 수행하기 위하여 cDNA의 합성은 다음과 같이 수행하였다. 총 RNA는 DNase 1 kit (Cat. No: 18068-015, invitrogen)를 사용하여 정제를 하였고, first-strand cDNA의 합성은 Oligo(dT)20 프라이머와 SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase (Cat. No:18080-051, Invitrogen)를 사용하여 mRNA를 cDNA로 합성하였다.
RT-PCR에 사용한 프라이머를 conserved region으로부터 제작하기 위하여 Sbe1 유전자의 단백질 서열을 NCBI/BlAST website에서 블라스트 분석을 수행하여 14 종의 단백질 서열을 획득하였고 이들을 가지고 clustalw(DDBJ/CLUSTALW website) 분석을 수행하여 Sbe1 유전자의 conserved domain을 찾을 수 있었고 그로부터 RT-PCR을 위한 프라이머들을 프라이머3 온라인 소프트웨어(http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi)를 이용하여 고안하였고 Oligo 6 소프트웨어에서 검토하였다. 제작한 RT-PCR 프라이머는 Sbe1-Fw (5'-CTACCATCAACCGTGGCATT-3'; 서열번호 10)와 Sbe1-Rv(5'-GTCGACAAGGCTCCACTGAC-3'; 서열번호 11)이었고, 사용한 cDNA의 균일 함량을 체크하기 위한 내부 마커로서 Actin-1 유전자(GenBank Accession No. AK071586.1)를 사용하였는데, 그 프라이머들은 ACT1-Fw (5'-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3'; 서열번호 12)와 ACT1-Rv (5'-ATCCAACCGGAGGATAGCATG-3'; 서열번호 13)였다.
반정량적 RT-PCR first-strand cDNA 50ng, 5 pmol Sbe1-Fw/Rv 프라이머와 0.5 unit Takara Ex-Taq(Takara Bio Inc.)을 20 μl PCR 반응액에 혼합하여 94℃에서 4 분 동안 반응 후에 94℃에서 30 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 30 초의 과정을 28회 반복하고 마지막 72℃에서 5분 동안 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 분리하여 분석하였다.
Sbe1 효소 활성 분석
벼 종자에서 Sbe1, Sbe3 및 Sbe4 동위효소들의 효소활성 분석은 여러 보고에서 사용한 방법(Nakamura et al. 1989. Plant and Cell Physiology 30(6): 833-839)을 종합하고 변형하여 수행하였다.
동결 보존되어 있던 벼 종자 1g을 취하여 종피와 배를 제거하고 배유만을 분리하여 미리 차갑게 한 유발에 넣고 4 ml의 차가운 추출 버퍼 (50mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4mM MgCl2, 50mM 2-mercaptoethanol, 12.5%(v/v) glycerol)를 가하여 유봉을 사용하여 얼음 위에서 곱게 마쇄하였다. 마쇄한 배유를 미리 차갑게 한 40 ml 튜브에 넣고 6 ml의 추출 버퍼를 사용하여 2회 유발을 세척하여 40 ml 튜브에 넣고 15,000 rpm, 2℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층액을 Whatman filter(0.45μm, Whatman, LTD)를 통하여 수집한 다음 그 용액을 효소활성의 측정에 사용하였다. Sbe 효소의 활성은 토끼 근육 phosphorylase에 의하여 glucose-1-P를 α-glucan 합성을 촉매하는 반응과정을 분석 측정하였다 (Hawker et al. 1974. Archives of Biochemistry and Biophysics 160: 530-551). 앞에서 준비한 400 μl의 효소 추출액을 400 μl의 차가운 반응 버퍼 (50 mM HEPES-NaOH pH7.0, 50 mM glucose-1-P, 2.5 mM AMP, 4.8 units phosphorylase)에 넣고 혼합한 다음 30℃에서 30분 동안 반응시켰다. 효소의 반응은 50 μl 1M HCl과 1 ml 디메틸설폭시드, 1.5 ml fresh iodine-potassium iodide 용액(2g KI+ 200 ml 증류수 + 0.2g I2)을 넣고 혼합하여 30℃에서 60 분 동안 암 조건에서 반응시켜 반응을 중지하였다. Sbe 효소의 활성은 분광흡광광도계(HP 845x UV-visible system)의 540 nm에서 흡광도를 조사하여 분석하였다. 분석에 사용한 표준용액은 다음과 같이 준비하였다. 400 μl의 효소 추출액을 50 μl 1M HCl과 잘 혼합하고 400 μl의 차가운 반응 버퍼를 가하여 혼합하였으며 다른 과정은 앞의 시료와 동일하게 처리하였고, 무처리 용액은 400 μl의 효소 추출액 대신에 400 μl의 차가운 반응액 만을 첨가하였고 다른 과정은 시료와 동일하게 처리하였다. Sbe1 효소활성의 계산은 다음과 같이 하였다. Sbe1 효소활성(%)=((시료 OD540－표준액 OD540)/표준액 OD540)×100로 하여 계산하였는데, OD540에서 흡광도 1% 수준에서의 증가를 Sbe1 효소활성(Units/g/min)의 1 unit으로 정의하였다. 또한, 모든 시료는 3 반복으로 하여 분석을 수행하였다.
농업형질과 수량 및 수량구성요소
Sbe1 형질전환 벼 513 개 T2 계통을 온실에서 육묘하여 2009년 6월 1일에 실험농장 벼 포장에 이앙하여 재배하였고 물 관리와 비료의 시용 및 병, 해충의 방제는 벼 표준재배법에 준하여 수행하였다.
형질전환 벼 513 개 T2 계통 중에서 초형이 우수하고 균일한 193 개 계통에 대하여 출수기, 초장, 간장, 수장, 수수와 수량 및 수량구성요소 등을 8월부터 10월에 걸쳐 조사하였다. 조사방법은 농촌진흥청 표준조사방법에 준하여 조사하였다.
식미도 및 관련 형질 조사
벼 종실을 91% 백미로 도정을 하여 식미도 및 관련 성분의 분석에 이용하였다 (Peng et al. 2006. Rice Science 13(1): 43-50). 식미도의 검정은 TOYO 식미계 (Toyo taste meter, model MA-90)를 사용하여 제조회사의 분석방법(Toyo Rice Polishing Machine Factory, Japan)에 따라 분석하였다. 단백질 함량은 micro-Kjeldahl 방법(AOAC 1995)을 사용하였고 측정된 값을 질소계수 5.95를 곱하여 환산하였다. 백미의 아밀로스 함량은 100-mesh 쌀가루 호화용액의 starch-idodine 색도의 비교흡광도를 측정하여 구하였다 (Perez and Juliano, 1978. Starch/Staerke 30:424-426). 알칼리붕괴도(ADV)는 Little 등(1958. Cereal chemisity 35: 111-126)의 알칼리붕괴도 실험법과 spreading score 방법에 따라 수행하였다. RVA pasting properties은 Rapid Visco Analyzer(RVA)를 사용하여 제조회사의 분석방법(NewPort Sci. Co., Australia)에 따라 분석하였다. 벼의 전분 paste profile은 다음과 같은 6가지 요소들에 대하여 조사하였다; Peak viscosity (PV), hot paste viscosity (HPV), cool paste viscosity (CPV), breakdown viscosity (BDV=PV-HPV), setback viscosity (SBV= CPV-PV), consistency viscosity (CTV=CPV-HPV) (Bao and Xia, 1999. Theoretical and Applied Genetics 98:1120-1124); Shen et al., 2006. Rice Science 13(1): 43-50) 및 호화온도. 모든 viscosity parameters는 Rapid Visco Units(RVU)으로 나타내었다.
통계적 분석
실험에서 얻어진 자료들은 Microsoft Excel 2007과 Statistix software version 8.0을 활용하여 분석하였다. 주요 농업형질들과 식미도 및 식미 관련 요소들에 대한 빈도 분포도의 작성은 Microsoft Excel 2007을 사용하여 수행하였고, 식미 관련 요소들간의 상관관계 분석은 Statistix software version 8.0을 사용하여 수행하였다.
실시예 1. 재조합 유전자 운반체 제작
전분대사 과정 중에서 도 1에 나타낸 바와 같이 아밀로스와 아밀로펙틴 합성에 관련된 주요 효소인 Sbe1, SSS, GBSS, SUS, AGPase 등 유전자를 클로닝하여 이들 유전자를 과발현 및 RNAi 방법을 이용하여 유전자의 발현을 조절함으로써 다양한 아밀로스와 아밀로펙틴 함량이 발현되는 벼 계통을 육성하며 이들 중에서 양식미의 특성을 나타내는 고품질미 계통을 선발하고자 하는 실험의 일환으로 연구를 수행하였다.
벼 종자의 전분합성 대사의 마지막 부분에서 전분가지화효소 (starch synthase 1, Sbe1) 유전자의 발현량을 늘려서 아밀로펙틴 생합성량을 증대시키기 위하여 35S 프로모터에 Sbe1 유전자를 연결한 재조합 유전자를 제작하였다. 식물 유전자 운반체인 pCAMBIA1300은 형질전환된 식물체의 선발을 위하여 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 가지고 있는데, 그 부근에 있는 35S 프로모터에 연결된 multiple cloning site(MCS)에 Sbe1 유전자를 삽입하여 재조합 유전자를 제작하였다. 우선 Sbe1 (GenBank Accession No. AK068920) 유전자의 ORF를 얻기 위하여 유전자 특이적인 프라이머인 Sbe1-Fw (XbaI) 5'-TCTAGAATGGTGACTGTTGTGGAGGAG-3'(서열번호 2)와 Sbe1-Rv (XbaI) 5'-TCTAGATCATT TGCAGTCTTCGTCAGA-3'(서열번호 3)를 제작하였고 이를 이용하여 Nipponbare(Oryza sativa L. ssp. janopica) 유래의 cDNA에서 RT-PCR 증폭에 의하여 Sbe1 유전자 ORF를 획득하였는데, ORF 염기서열은 2,268 bp(서열번호 1)이었고 아미노산 서열은 755 개의 아미노산으로 구성되어 있었다. RT-PCR로 증폭된 Sbe1 ORF는 35S 프로모터에 연결된 multiple cloning site(MCS) XbaI 좌에 삽입하여 p35S : OsSbe1 재조합유전자를 제작하였다(도 2).
실시예 2. Sbe1 재조합 유전자의 형질전환 벼 분석 및 후대육성
벼 전분가지화효소 (Sbe1)를 35S 프로모터에 Sbe1 유전자를 연결하고 선발마커로 HPT 유전자를 결합하여 제작한 p35S : OsSbe1 재조합 유전자는 아그로박테리움 방법을 이용한 벼 종자단기 형질전환방법을 사용하여 도 3과 같이 형질전환 하였다. 식물체 분화 배지에서 재분화된 어린 벼는 조직배양실에서 2주 동안의 순화과정을 거친 다음 온실의 포트에 이식하여 재배하여 종자를 수확하였다. 벼 식물체에 유전자 도입 여부 HPT 유전자와 35S 프로모터 3'-말단과 Sbe1 유전자의 5'-말단에서 제작한 프라이머를 이용하여 PCR로 분석한 결과 도 4와 같이 1,065개 벼 재분화 개체 중에서 1,005개 개체에서 Sbe1 유전자의 도입이 확인되었다. 또한, p35S:OsSbe1 재조합체에 의한 벼 형질전환 재분화체의 호모화 개체를 선발하여 후대육성을 위하여 수확한 종자를 도 5와 같이 하이그로마이신 50 mg/L가 첨가된 배지에서 발아검정을 하여 발아된 종자를 온실에서 육묘하여 포장에 이앙하여 후대를 육성하였다.
실시예 3. RT - PCR 에 의한 Sbe1 유전자의 발현 분석
재조합 Sbe1 유전자의 형질전환을 통하여 벼에 도입한 Sbe1 유전자의 발현을 RNA 전사체의 발현수준에서 검토하기 위하여 반정량적 RT-PCR로 분석한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 모품종인 고품벼는 아주 약한 발현을 보인데 비하여 Sbe1 유전자가 도입된 계통들은 모두 고품벼 보다 높은 RNA의 발현을 보였는데 계통에 따라서 발현에 큰 차이를 나타내었다. 한편. 이들 벼 형질전환 계통을 포장에 이앙하여 재배하였을 때의 변이계통들의 표현형도 도 7에 나타낸 바와 같이 형질전환 과정에서 다양한 변이의 발생으로 큰 변이를 나타내었다.
실시예 4. Sbe1 유전자 도입 T2 세대 형질전환체의 아밀로스 함량 분석
벼의 starch branching enzyme 1 효소 유전자를 35S 프로모터를 이용하여 과발현시켜 육성한 벼 형질전환체 903개 T2 계통에서 종실의 아밀로스 함량(AAC)을 조사한 결과는 도 8에 나타낸 바와 같다. Sbe1 유전자가 도입된 형질전환 벼 종실의 아밀로스 함량은 커다란 변이를 보였는데 12~29% 범위의 다양한 변이를 나타내었다. 특히, 고품질미 벼의 육성에 적합하리라 예상하는 15~17% 범위에 가장 많은 빈도를 나타내어 예상했던 다양한 아밀로스 함량 변이체의 육성이 가능할 것으로 생각되었다. 그러나, 22~25% 범위의 높은 아밀로스 함량을 나타낸 계통들에서는 gene silencing이 일어난 결과로 아밀로스 함량이 높아졌을 가능성이 있을 것으로 생각되었다.
Sbe1 유전자가 도입된 903개 T2 형질전환 벼 계통에서 아밀로스 함량별 계통수를 보면 표 2에 나타낸 바와 같이 17~17.5% 범위에 가장 많은 90개 계통들이 속하였고 식미도가 우수한 아밀로스 함량 범위인 15.5~19.0% 범위에 속하는 계통들이 513개 계통이 되어 Sbe1 유전자의 도입에 의하여 전분가지화 효소의 과발현으로 전분 중에 아밀로스의 함량이 감소된 것으로 생각된다.
903개 T2 형질전환 벼 라인으로부터 현미 전분에서 AAC(apparent amylose content)의 변이.
아밀로스
함량(%）		 전형적인 라인 라인 수 아밀로스
함량(%）		 전형적인 라인 라인 수
10.5-11 12006-15 1 18-18.5 11919-13 69
11.5-12 11962-13 1 18.5-19 11918-9 63
12-12.5 11954-8 2 19-19.5 11921-13 66
12.5-13 11905-12 3 19.5-20 11925-18 42
13-13.5 11916-14 6 20-20.5 11911-18 43
13.5-14 11916-1 9 20.5-21 11917-8 39
14-14.5 11915-17 17 21-21.5 11912-14 22
14.5-15 11905-3 33 21.5-22 11920-3 30
15-15.5 11905-15 35 22-22.5 11916-10 14
15.5-16 11917-2 55 22.5-23 11909-11 11
16-16.5 11925-13 60 23-23.5 11917-4 13
16.5-17 11919-12 74 23.5-24 11917-14 6
17-17.5 11921-4 90 24-24.5 11917-17 10
17.5-18 11912-12 67 24.5-25 11985-7 9
실시예 5. Sbe1 유전자 형질전환체의 아밀로스 함량의 세대별 변이
형질전환 벼의 T2 세대에서 아밀로스 함량을 분석하였을 때 도 8 및 표 2에 나타낸 바와 같이 벼 종실의 아밀로스 함량은 커다란 변이를 보여 12~25% 범위의 다양한 변이를 나타내었는데, 그 계통들 중에서 T2 세대에서 아밀로스 함량이 low(12%), medium (18%), high(28%)를 보였던 계통들을 선택하여 T3 세대에서 RT-PCR에 의하여 RNA 발현을 분석한 결과, 도 9와 같이 모품종 고품벼에 비하여 6개 계통에서 RNA 함량이 높게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 이들 계통에 대하여 종실의 아밀로스 함량을 분석한 결과 표 3에 나타낸 바와 같이 12% 정도로 낮았던 계통들은 15% 정도로 높아졌고 28% 정도로 높았던 계통들은 17% 정도로 낮아졌으나 18% 정도였던 계통들은 거의 비슷한 수준을 유지하여 형질전환 벼의 세대가 진전되면서 벼에 도입된 Sbe1 유전자의 세포 내 안정화와 더불어 전분가지화 효소의 발현이 전사 후 단계에서 조절이 되어 아밀로스 함량의 조절이 이루어진 것으로 생각된다.
상이한 AAC(apparent amylose content)의 T2 세대로부터 발달된 몇가지 T3 라인
Lines Gopum 13017 13282 13218 13145 11985-11 12010-8
T3 18% 14.96% 15.76% 17.75% 16.16% 16.92% no data
T2 18% 12.57% 12.32% 18.35% 18.04% 28.48% 29.62%
Code* W 1 2 3 4 5 6
* Code in RT-PCR
실시예 6. 벼 계통의 전분가지화 효소 활성
벼에서 전분가지화 효소 Sbe1과 Sbe3의 활성을 고품질벼들과 저품질벼들에서의 발현양상을 RNA 수준에서 개화기부터 5일 간격으로 개화 후 25일까지 미숙종자를 채취하여 분석한 결과 도 10에 제시한 바와 같이 전분가지화 효소의 발현은 개화 후 10~15일에 가장 높은 발현을 보였는데, 고품질벼들과 저품질벼들 간에 발현시기가 상이한 것으로 나타났다. Sbe1과 Sbe3 모두에서 고품질벼인 고품벼와 일품벼는 개화 후 10~20일에 가장 높은 발현을 보였으나 저품질벼인 팔공벼에서는 고품질벼들에 비하여 전분가지화 효소의 발현이 훨씬 낮았고 발현시기도 후기까지 이어지는 양상을 보였고 삼남벼에서는 발현량은 고품벼들과 비슷하였으나 발현시기가 5일 정도 빠른 개화 후 5~15일 사이에 많은 발현을 나타내었다.
이러한 현상은 고품벼들의 경우에는 배유에 전분의 축적이 가장 왕성한 개화 후 10~20일에 가장 높은 발현이 집중됨으로써 전분의 가지화에 Sbe1과 Sbe3 효소들이 효율적으로 이용되어 아밀로펙틴의 함량을 증가시키고 아밀로스의 함량을 저하시키는 한편 전분이 축적될 때에 물리성을 향상시켜 식미도를 증가시키는 것으로 추정된다.
따라서, 형질전환 벼에서도 Sbe1과 Sbe3 발현이 가장 높은 시기인 개화 후 15일에 미숙 종자 시료를 채취하여 전분가지화 효소의 활성을 측정하였다. 형질전환 벼의 T2 세대에서 아밀로스 함량을 분석하였을 때 아밀로스 함량이 low(12%), medium (18%), high(28%)를 보였던 계통들을 각각 2 계통씩 선택하여 T3 세대에서 출수 후 15일에 미숙 종자를 채취하여 모품종인 고품벼와 함께 전분가지화 효소의 활성을 분석한 결과는 도 11 및 표 4에 나타낸 바와 같다.
전분가지화 효소의 활성 측정에는 Sbe1, Sbe3 및 Sbe4 3종의 전분가지화에 관련된 효소의 활성이 모두 포함된 효소 활성으로 측정하였는데, T2 세대에서 전분함량이 낮은 12.57%였던(표 3) 13017 계통에서 가장 높은 전분가지화 효소의 활성으로 모품종인 고품벼 보다 5.6배의 높은 효소 활성을 보였고 그 다음으로 12.32%였던 13282 계통에서 높아 고품벼 보다 1.9배의 높은 효소 활성을 나타내었고, 고품벼와 유사한 아밀로스 함량을 보였던 13218 (18.35%)과 13145(18.04%)에서는 모품종인 고품벼와 유사한 효소 활성을 나타내었으나, T2 세대에서 아밀로스 함량이 높았던 11985-11 (28.48%)과 12101-8 (29.62%) 계통은 모품종인 고품벼 보다 효소 활성이 각각 0.52배와 0.32배로 현저히 낮았다. Sbe1 유전자의 형질전환 벼 중에서 이와 같이 전분가지화 효소의 활성이 현저히 낮았던 것은 도입된 Sbe1 유전자의 발현에서 RNA 간섭에 의하여 gene silencing이 일어난 것으로부터 기인한 것으로 생각되었다.
낮은, 중간 및 높은 아밀로스 함량을 갖는 T2 라인에서 발달된 6개의 T3 형질전환 라인에서 AAC, 효소 활성 및 식미(eating quality).
라인 Gopum 13017 13282 13218 13145 11985-11 12010-8
T3 apparent
amylose content		 18% 14.96% 15.76% 17.75% 16.16% 16.92% -
T2 apparent
amylose content		 18% 12.57% 12.32% 18.35% 18.04% 28.48% 29.62%
Sbe 효소 활성
(Units g-1min-1)		 121.65 684.53 230.37 105.91 135.76 63.51 38.82
Toyo taste
meter value		 70.4 65.9 71.2 65.3 69.5 - -
형질전환 벼의 T2 세대에서 아밀로스 함량을 분석하였을 때 아밀로스 함량이 low(12%), medium (18%), high(28%)를 보였던 계통들을 각각 2 계통씩 선택하여 T3 세대에서 출수 후 15일에 미숙 종자를 채취하여 모품종인 고품벼와 함께 전분가지화 효소의 활성을 분석하고 수확 종자를 가지고 아밀로스 함량과 Toyo 식미치를 분석하여 비교한 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다.
T2 세대에서 아밀로스 함량이 low(12%)와 medium (18%)이었던 계통들에서는 T3 세대에서도 T2 세대와 유사한 아밀로스 함량의 경향을 나타내었으나 high(28%)이었던 계통들에서는 오히려 감소하였다. 아밀로스 함량이 Low(12%)이었던 계통들에서 약 2.5% 정도의 아밀로스 함량의 증가를 보였고 medium (18%)이었던 계통들에서는 비슷하거나 약간의 감소를 보였는데, 전체적으로 전분가지화 효소의 활성과 비교하여 검토해 보면 전분가지화 효소의 활성이 높은 계통들에서 아밀로스 함량이 저하되는 경향을 보였는데, T2 세대에서 아밀로스 함량이 많이 낮아서 RNA 간섭에 의한 post-transcriptional gene silencing이 일어났을 것으로 예상되는 11985-11(28.48%)과 12101-8(29.62%) 계통은 전분가지화 효소의 활성이 저하되었는데도 T3 세대에서 아밀로스 함량이 16.96%의 낮은 값을 나타내어 좀 더 자세한 검토가 필요한 것으로 생각되었다.
한편, 6개 형질전환 벼 계통의 식미 정도를 검토하기 위하여 Toyo Taste Meter를 이용하여 측정한 식미치를 비교해 보면 전분가지화 효소 활성이 고품벼 보다 1.9배가 높고 아밀로스 함량이 낮은 13282 계통은 식미치가 71.2로서 모품종 고품벼의 70.4 보다 높은 값을 나타내었으며, medium인 13145 계통이 69.5로서 고품벼와 유사한 값을 보였으나 13017과 130218은 각각 65.1과 65.3으로서 고품벼 보다 다소 낮았는데 특히, 전분가지화 효소 활성이 가장 높았던 13017 계통이 식미치가 낮은 경향을 보여 자세한 검토가 필요한 것으로 생각된다.
실시예 7. 형질전환 벼 계통의 주요 작물학적 특성
형질전환 벼의 T3 세대에서 1차 선발한 193개 계통에 대하여 초장, 간장, 수장, 수수 등을 조사하여 모품종인 고품벼와 비교한 결과는 표 5 및 도 12와 같다.
초장은 형질전환 벼 계통들은 83.7~113.5 cm의 분포를 보였는데 도 12에 나타낸 바와 같이 100 cm를 중심으로 정규분포를 이루었는데 전체적으로 모품종인 고품벼의 평균 112.2 cm에 비하여 작은 분포를 보였다. 간장은 형질전환 벼 계통들은 56.5~81.3 cm의 분포를 보였는데 고품벼의 간장과 같은 71 cm를 중심으로 정규분포를 이루었다. 수장도 형질전환 벼 계통들은 18.6~26.6 cm의 분포를 보였는데 고품벼의 수장과 같은 22 cm를 중심으로 정규분포를 이루었다. 수수도 형질전환 벼 계통들은 8~16 개의 분포를 보였는데 고품벼의 수수와 같은 11 개를 중심으로 정규분포를 이루었다. 52개의 T3 계통만을 선발하여 분석한 Toyo Taste meter 식미치는 고품벼가 70.4의 값을 나타내었는데 도 13에서 볼 수 있듯이 형질전환 벼에서는 61.1~72.6의 값을 보여 평균이 67.6으로서 고품벼 보다 낮았으나 70.4의 고품벼의 식미치 보다 높은 계통이 8개, 비슷한 계통이 5개 계통이 선발되었다.
모품종 및 193개 T2 라인의 농업적 형질 및 Toyo taste meter 값 (Toyo taste test는 52개 T3 라인에 대해 수행되었다).
형질 모품종 T2 라인
평균 SD 변이 범위 CV(%) Max/Min
Plant height(cm) 112.2 100.1 4.15 83.7-113.5 4.15 1.36
Culm length(cm) 71.4 71.0 4.70 56.5-81.3 6.62 1.44
Panicle length(cm) 22.7 22.0 1.26 18.6-26.6 5.73 1.43
Panicles per plant 11 11 1.47 8-16 13.29 8
Toyo taste meter
value		 70.4 67.6 2.93 61.1-72.6 4.33 1.19
실시예 8. 형질전환 벼 계통의 주요 품질 특성
고품벼에 Sbe1 유전자를 도입한 형질전환 벼의 T2 세대에서 식미도(palatability)와 관련된 여러 가지 요소들을 백미를 가지고 분석한 결과 표 6과 도 14에서 보인 바와 같이 쌀의 물리화학적 특성에 많은 변화가 발생한 것으로 나타났다. 특히 호화점성(peaking viscosity), 치반점도(setback), 강하점도(breakdown)과 같은 호화특성(pasting property)의 변화가 컸으며, 아밀로스 함량과 단백질 함량에서도 큰 차이를 나타내었다. 밥맛을 평가하는 기준으로 많이 고려하는 식미도 (palatability)의 경우에도 많은 변이를 보였는데, Toyo Taste meter 식미치는 고품벼가 70.4의 값을 나타내었는데 형질전환 벼에서는 61.1~72.6의 값을 보여 평균이 67.6으로서 고품벼 보다 낮았으나 70.4의 고품벼의 식미치 보다 높은 계통이 8개, 비슷한 계통이 5개 계통이 선발되었다.
모품종 및 52개 T3 라인의 백미에서 식미도(palatability quality) 변수.
Parameters 모품종
 T3 라인
Mean SD Range CV(%) Skew Kurtosis
P* 70.4 67.6 2.93 61.1-72.6 4.33 -0.17 -0.58
AAC(%) 18.00 18.21 0.69 16.87-19.81 3.77 0.09 -0.74
PC(%) 6.13 6.47 0.33 5.91-7.80 5.12 1.17 3.43
ADV 6.3 6.5 0.09 6.3-6.6 1.42 0.17 -0.81
PV(RVU) 276.07 251.66 42.90 142.01-325.37 17.05 -0.88 -0.17
HPV(RVU) 163.45 125.83 36.87 29.85-163.74 29.30 -1.26 -0.02
CPV(RVU) 269.90 234.90 40.28 124.43-281.80 17.15 -1.23 0.11
BDV(RVU) 112.62 125.84 15.64 94.24-170.35 12.43 0.34 0.02
SBV(RVU) -6.17 -16.76 15.12 -59.96- 22.46 90.21 -0.30 0.44
CTV(RVU) 106.44 109.08 8.36 94.58-127.09 7.67 0.53 -0.65
PT(℃) 68.08 68.11 0.04 68.05-68.2 0.05 0.36 -0.57
* P(Toyo meter value), AAC(apparent 아밀로스 content), PC(protein content), ADV(alkali digestion value), PV(peaking value), HPV(hot paste viscosity), CPV(cool paste viscosity), BDV(breakdown value), SBV(setback viscosity), CTV(consistency viscosity), PT(pasting temperatue).
식미도와 관련이 있는 요소들간의 상관관계를 살펴보면 표 7과 도 14에 나타낸 바와 같이 쌀알의 아밀로스 함량은 식미도에 관여하는 많은 요소들과 상관 관계를 보였는데 응집점도(CTV, consistency viscosity), 최종점도(CPV, cool paste viscosity), HPV(hot paste viscosity), SBV(setback viscosity) 등과는 높은 정의 상관을 나타냈고 ADV(alkali digestion value), PV(peaking value)와도 정의상관을 보였으나 단백질과는 부의 상관을 나타내었다. 그러나, 백미에서 특정 범위의 아밀로스 함량이나 단백질 함량과 식미도(palatability) 간에는 정의 상관이 없는 것으로 나타나서 아밀로스 함량이나 단백질 함량을 적절히 조절을 하여 식미도에 관여하는 여러 가지 요소들의 적정한 조합을 찾는다면 현재보다 식미도가 우수한 고품질의 벼를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
52개 T3 라인의 백미에서 식미도 변수 중 상관 계수.
Parameter AAC ADV BDV CPV CTV HPV P PC PT PV
ADV 0.29*
BDV -0.19 -0.15
CPV 0.49** 0.09 0.26
CTV 0.42** 0.39** 0.33* 0.49**
HPV 0.44** 0.01 0.21 0.98** 0.31*
P -0.10 0.13 -0.15 -0.25 0.19 -0.32*
PC -0.28* 0.07 -0.16 -0.18 0.05 -0.21 -0.19
PT 0.05 -0.02 0.12 0.17 -0.10 0.21 -0.13 -0.26
PV 0.31* -0.05 0.54** 0.94** 0.39** 0.93** -0.33* -0.24 0.22
SBV 0.43** 0.37** -0.85** 0.01 0.21 -0.04 0.26 0.20 -0.18 -0.34*
실시예 9. 우수 형질전환 벼 계통의 선발 및 주요 특성
T2 세대의 형질전환 벼를 포장에 재배하였을 때에 초형과 수량성이 우수한 농업적 특성을 나타내는 계통을 도 15와 같이 선발하여 그들에 대하여 각종 형질을 조사한 결과는 표 8과 같다.
도 15에서 볼 수 있듯이 Sbe1 유전자의 형질전환 벼 계통 중에서 모품종인 고품벼와 비교하여 초형, 병충해에 대한 건전성, 이삭 특성 등을 고려하여 선발한 계통들 중의 일부에 대한 형질 조사 결과를 보면 표 8에 나타낸 바와 같이 초장, 간장, 수장, 수수, 등숙률, 천립중 등에서 모품종의 변이폭 내에 분포할 정도의 작물학적 특성을 나타냈으며, 특히 수량에서 보면 모품종인 고품벼의 602.7 kg/10a에 비하여 높은 607.9~722.7 kg/10a의 현미 수량성을 나타내었다.
모품종인 고품벼 및 엘리트 라인으로서 선발된 바람직한 표현형을 갖는 8개의 T2 라인의 수량 성분.
Lines Plant
height (cm)		 Culm
length
(cm)		 Panicle length
(cm)		 Plants
/10a		 Panicles
/plant		 Spikelets
/panicle		 Ripened
grain
ratio
(%)		 1000
brown
rice grain
weight (g)		 Yield/10a (kg)
Gopum 101.6 70.2 22.8 22684 11 119 91.8 22.11 602.7
13341 109.1 76.6 23.6 22684 12 128 92.8 22.35 722.7
13343 103.0 72.8 22.1 22684 12 127 94.5 21.80 712.2
13344 104.3 75.1 22.2 22684 12 136 88.6 21.45 703.6
13345 107.4 76.1 22.3 22684 12 121 93.1 22.69 695.8
13347 105.8 77.5 21.5 22684 11 124 91.3 21.52 607.9
13348 106.0 75.7 22.4 22684 11 141 87.6 22.92 706.4
13349 104.4 71.8 21.7 22684 11 146 92.2 20.85 700.3
13352 102.5 81.3 21.4 22684 12 134 92.9 21.09 714.7
실시예 10. 고식미 형질전환 벼 계통의 선발 및 주요 특성
T2 세대의 형질전환 벼를 포장에 재배하였을 때에 초형과 수량성이 우수한 농업적 특성을 나타내면서 T2 종자에서 아밀로스 함량이 낮았던 계통을 중심으로 선발하여 T3 종자를 수확하여 아밀로스 함량, 작물학적 특성, 수량성, 식미도 등을 조사한 결과는 표 9와 같다.
초형이 우수하면서 아밀로스 함량이 12.32~17.45%로 고품벼 보다 낮았던 9개 계통을 선발하여 작물학적 특성을 살펴보면 출수기는 고품벼의 8월 16일과 비슷한 8월 14일~16일 정도였고 초장은 고품벼의 112.2 cm 보다 작은 97.6~105.3 cm 로 도복을 고려하면 유리한 조건으로 작아졌고 간장은 고품벼는 71.4 cm 인데 선발 계통들은 66.5~77.5 cm 범위에 분포하였으며 수장은 고품벼는 22.7 cm 이고 선발 계통들은 19.3~23.7 cm 범위에 분포하였고 수수는 고품벼는 11개인데 선발 계통들은 10~13개 범위에 분포하였다. 수량성을 살펴보면 고품벼가 현미 수량에 있어서 602.7 kg/10a 인데 비하여 선발한 엘리트 계통들은 607.9~719.0 kg/10a의 높은 수량성을 나타내어 모품종인 고품벼 보다 높은 수량성을 나타내었으며, 식미도에 있어서도 고품벼가 Toyo taste value가 70.4인데 비하여 모든 선발 계통에서 70.5~72.6으로서 고품벼와 같거나 높은 우수한 식미성을 나타내어 앞으로 새로운 품종으로 개발할 수 있는 높은 가능성을 나타내었다.
높은 식미도 및 양호한 표현형을 갖는 9개의 엘리트 형질전환 라인의 선발.
2009
T2 lines		 AAC in
T2 seed
(%)		 Phenotype
evaluation		 Flowering
date		 Plant
height
(cm)		 Culm
length
(cm)		 Panicle
length (cm)		 Panicles
/plant		 Yield
/10a
(Kg)		 Toyo
taste of T3 seeds
Gopum 18% good 8.16. 112.2 71.4 22.7 11 602.7 70.4
13144 16.78 A 8.16. 100.4 68.4 19.3 12 719.0 72.5
13182 14.93 E 8.15. 102.4 72.1 22.9 11 678.6 71.9
13211 17.45 A 8.16. 98.9 66.8 21.1 11 689.5 72.6
13234 16.45 A 8.16. 103.1 71.2 23.7 10 697.9 70.7
13255 17.02 E 8.16. 100.1 70.0 23.1 10 654.1 70.5
13262 16.66 A 8.17. 98.9 66.5 22.6 10 701.1 71.5
13282 12.32 A 8.14. 97.6 69.5 21.6 13 735.9 71.2
13297 15.30 E 8.15. 103.4 75.8 21.2 12 716.4 71.7
13347 16.49 E 8.14. 105.3 77.5 21.5 12 607.9 70.5
Note: E, excellent; A, grade A.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자 OsSbe1 (Oryza sativa starch branching enzyme 1)을 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식미가 향상된 벼 식물체의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 식물 발현 벡터는 도 2에 기재된 35S::Sbe1 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제3항의 방법에 의해 제조된 식미가 향상된 벼 식물체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벼는 고품벼 품종인 것을 특징으로 하는 벼 식물체.
  6. 제4항에 따른 벼 식물체의 종자.
  7. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 벼 유래의 전분가지화효소를 코딩하는 유전자 OsSbe1 (Oryza sativa starch branching enzyme 1)을 포함하는, 벼의 식미 향상용 조성물.
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