KR100742219B1 - 멜론 유래의 익스펜신 유전자를 이용한 과실의 성숙조절방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 멜론 유래의 익스펜신(expansin) 유전자를 이용한 과실의 성숙을 조절방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물체에서 멜론 유래의 익스펜신 유전자의 발현을 억제하거나 과다발현시킴으로써 과실의 성숙을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 과실의 성숙을 조절할 수 있는 효과가 있다.

익스펜신, 멜론, 과실, 성숙

Description

멜론 유래의 익스펜신 유전자를 이용한 과실의 성숙 조절방법{Controlling method of ripening in fruit using expansin gene from melone}

도 1은 멜론의 과실의 발달단계 및 부위에 따른 멜론 익스펜신 유전자의 발현양상을 RT-PCR로 분석한 결과이다.

레인 1: 분자량 마커(1kb ladder marker) 레인 2: 수분 직후

레인 3: 수분 후 9일 레인 4: 수분 후 18일

레인 5: 수분 후 27일 레인 6: 수분 후 36일

레인 7: 잎 레인 8: 웅화

레인 9: 자화 레인 10: 줄기

레인 11: 덩굴손

도 2는 멜론 익스펜신 유전자의 RNAi 단편을 삽입하여 제조한 재조합 벡터의 개략적인 모식도이다.

도 3은 멜론 익스펜신 유전자의 RNAi 단편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체의 사진이다.

도 4는 형질전환 멜론에서 익스펜신 유전자의 RNAi 단편의 도입 여부를 nptII 증폭여부로 확인한 결과이다.

M: 분자량 마커 레인 1: 형질전환 식물체 #1

레인 2: 형질전환 식물체 #2 레인 3: 형질전환 식물체 #3

(+): 형질전환용 벡터

도 5는 형질전환된 멜론의 과실 성숙을 수분 후 15일부터 5일 간격으로 촬영한 사진이다.

도 6은 멜론 익스펜신 유전자의 RNAi 단편이 도입된 멜론 형질전환체와 형질전환되지 않은 멜론을 비교한 사진이다.

수분 후 36일: 형질전환되지 않은 멜론, 수분 후50일: 멜론 형질전환체

도 7은 가나마이신이 포함된 배지에서 멜론 형질전환체를 배양한 결과이다

Control(no Km): 가나마이신이 함유되지 않은 배지에서 배양한 야생형 멜론

Control(Km 20mg/L): 가나마이신 20mg/L가 함유된 배지에서 배양한 야생형 멜론

TS MERNAi #2(Km 20mg/L): 가나마이신 20mg/L가 함유된 배지에서 배양한 멜론 형질전환체

도 8은 가나마이신에 저항성을 나타내는 멜론 형질전환체 33주의 잎으로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 선택마커로 사용한 nptII 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 결과이다.

본 발명은 멜론 유래의 익스펜신(expansin) 유전자를 이용한 과실의 성숙 조절방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물체에서 멜론 유래의 익스펜신 유전자의 발현을 억제하거나 과다발현시킴으로써 과실의 성숙을 조절하는 방법에 관한 것이다.

과실은 성숙기간 동안에 클로로필은 감소하는 반면 카로티노이드는 증가하고 세포벽 구성 성분의 변화, 유리당과 유기산의 축적, 향기 성분의 생성, 호흡량의 증가 등의 변화와 동시에 연화효소의 활성이 증가하고 세포벽 구성 성분이 분해되어 과실의 물성변화가 유발되고 연화 현상이 일어난다.

상기 과실의 연화 및 성숙을 조절하는 것은 과실의 품질과 저장수명을 결정하는 중요한 요인이 되고 있다. 과실의 연화에 대한 연구는 토마토, 아보가도 및 인과류(pome fruit) 등을 대상으로 많이 연구되어 왔으며, 주로 세포벽의 구조, 세포벽 구성성분과 조성, 성숙과 저장 중에 일어나는 세포벽 구성 성분의 변화와 세포벽분해효소들의 조성과 활성의 변화 및 이들 효소의 작용기전을 규명하는데 초점을 두고 있다.

한편, 익스펜신은 세포벽의 신장을 위한 가장 중요한 인자로 여겨지고 있다(Vissenberg K. et al., Plant Cell, 12:1229-1237, 2000). 익스펜신은 셀룰로오스 미세섬유(microfibril)와 매트릭스 폴리머 사이의 수소결합을 느슨하게 함으로 써 세포벽의 변형(wall creep)을 야기하는 것으로 알려져 있다(McQueen-mason S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6574-6578, 1994; Cosgrove D.J., Plant Cell, 9:1031-1041, 1997). 익스펜신 유전자는 최초로 클로닝된 이후(Shcherban T. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9245-9249, 1995) 다양한 식물 종으로부터 많은 종류의 유전자들이 동정되었으며 이들은 다중유전자 족(multigene family)을 형성하는 것으로 알려져 있다(Cosgrove D. J., Plant Physiol., 118:333-339, 1998).

익스펜신 유전자의 발현 패턴은 특히, 벼와 토마토를 대상으로 심도 있게 연구되었다. 문헌에는 벼에서 세포벽 신장과 빠른 성장이 시작되기 전에 엑스판신 유전자 OsEXP4의 전사체 양이 증가한다고 보고 된 바 있다(Cho H-T et al., Plant J. 15:805-812, 1998). 또한, 토마토에서 초기의 잎 원기가 발생되는 정단 분열조직 세포에서 익스펜신 유전자인 LeEXP18이 발현된다고 보고 된 바 있다(Reinhardt D. et al., Plant Cell, 10:1427-1437, 1998). 국제특허공개 제02086066호에는 식물에서 세포벽 구조를 변형시키는 신규한 익스펜신 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 개시된 바 있다.

본 발명자들은 과실의 연화 및 성숙을 조절하는 방법에 대해 연구하던 중 멜론 유래 익스펜신 유전자의 발현을 억제하거나 과다발현시키면 과실의 성숙을 조절할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 멜론의 익스펜신 유전자를 이용하여 과실의 성숙을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 멜론의 익스펜신 유전자를 이용하여 과실의 성숙을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 멜론 유래 익스펜신 유전자의 RNAi 단편 또는 안티센스 핵산을 포함하는 발현벡터를 식물 내로 도입하는 것을 포함하는 과실의 성숙이 지연된 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 멜론 유래 익스펜신 유전자를 포함하는 발현벡터를 식물 내로 도입하는 것을 포함하는 과실의 성숙이 촉진된 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 방법을 보다 구체적으로 살펴보면, 본 발명은 멜론의 익스펜신 유전자를 이용하여 과실의 성숙을 조절하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로 본 발명은 식물에서 멜론의 익스펜신 유전자의 발현을 억제시킴으로써 과실의 성숙을 지연시키거나 또는 식물체에서 익스펜신 유전자를 과다 발현시킴으로써 과실의 성숙을 촉진시키는 방법을 제공한다.

멜론의 익스펜신 유전자는 당업계에 공지되어 있다. 상기 핵산은 멜론 유래의 익스펜신 단백질을 암호화하는 게놈 DNA, RNA, cDNA, PCR 산물, 클로닝된 DNA, 합성 DNA 또는 RNA를 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 멜론의 익스펜신 유전자는 서열번호 9에 나타낸 바와 같다.

본 발명은 식물에서 멜론 유래 익스펜신 유전자의 발현을 억제함으로써 과실의 성숙을 지연시키는 방법을 제공한다. "과실의 성숙"이란 과실의 크기가 커지고 과육이 연화되면서 과육의 당도가 급증하여 섭취하기에 적합한 상태가 되는 것을 말한다. 구체적으로 과실의 성숙되면 과실의 호흡이 일시적으로 증가되고 에틸렌의 생성이 급증하며 전분이 분해되어 수크로오스로 전환되면서 과육의 당도가 급증한다. 이 시기에 과육의 경도 또한 급격히 감소하며 세포벽의 구조상의 변화가 활발히 진행된다.

상기 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 상기 “유전자의 발현 억제”에는 유전자 전사의 억제 및 단백질로의 번역 억제가 포함된다. 또한, 유전자 발현이 완전히 정지된 것 뿐 만 아니라 발현이 감소된 것도 포함된다. 바람직하게는 상기 유전자의 발현 억제는 상기 유전자의 전사 생성물인 mRNA를 파괴하거나 해독을 억제할 수 있는 것을 말한 다.

식물에서 특정의 내재성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 안티센스 분자를 이용하는 것이 가장 보편적이다. 안티센스 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 폴리머라제에 의해 국부적인 개상 루프 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA에서 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, 인트론과 엑손과의 접합접에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소좀 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 번역 개시인자 결합 부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제 등이 있다. 이들은 전사, 스플라이싱 또는 번역 과정을 저해하여 표적 유전자의 발현을 억제한다.

본 발명에 사용되는 안티센스 분자는 상기의 어느 작용으로든지 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 대표적인 안티센스 분자로는 RNAi 또는 안티센스 핵산 등이 포함된다. RNAi는 염기서열 특이적으로 작용하는 헤어핀형태의 소분자의 RNA를 사용하여 전사 수준 혹은 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제시키는 방법이다(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000). 안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자를 말한다(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). 세포 내에서, 안티센스 핵산은 이에 상응하는 mRNA와 하이브리드화하여 2 본쇄 분자를 형성한다. 이로 인해 mRNA의 해독이 저해된다(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).

바람직하게는, 본 발명은 멜론 유래 익스펜신 유전자의 RNAi 단편 또는 안티센스 핵산을 포함하는 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 생성되는 과실의 성숙을 지연시키는 방법을 제공한다.

상기 익스펜신 유전자의 RNAi 단편은 멜론 유래 익스펜신 유전자의 mRNA에 특이적이며 상기 mRNA의 절단을 통하여 유전자의 발현 억제를 유도할 수 있는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 말한다. 상기 이중 가닥 RNA를 식물체 등에 주입하는 경우 식물체 내에 존재하는 그에 대응하는 mRNA가 특이적으로 분해되어 유전자의 기능이 상실된다.

상기 dsRNA는 약 200∼300개의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 말단 구조는 표적유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 본 발명에 따른 dsRNA의 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

dsRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 dsRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 dsRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 RNAi 발현 벡터 또는 RNAi 발현 카세트를 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다.

상기 안티센스 핵산은 멜론 익스펜신 유전자의 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA, RNA 또는 이들의 유도체를 말하며 멜론 익스펜신 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 상기 안티센스 핵산은 멜론 익스펜신 유전자의 mRNA 단편에 상보적으로 설계된 뉴클레오티드를 포함하도록 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 약 6개 내지 100개, 더욱 바람직하게는 8개 내지 60개, 가장 바람직하게는 10개 내지 40개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

안티센스 핵산의 경우에는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 핵산이 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 핵산을 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 핵산이 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 핵산이 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 핵산은 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

상기 RNAi 또는 안티센스 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 적절한 벡터 내에 삽입될 수 있다. 여기서, '벡터'라 함은 본 발명의 RNAi 단편이 삽입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 식물 세포 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 적합한 벡터 로는 Ti 플라스미드, 뿌리 유도성(Ri) 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

상기에서 "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 멜론 유래 익스펜신 유전자의 RNAi 단편을 pCAMBIA2300 벡터에 삽입하여 도 2에 기재된 바와 같은 모식도를 가지는 식물형질 전환용 재조합 벡터 MERNAi를 제조하였다.

상기 본 발명에 따른 발현 벡터를 식물체로 도입하는 방법은 당 업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 식물에서 멜론 유래 익스펜신 유전자를 과다발현함으로써 과실의 연화 또는 성숙을 촉진하는 방법을 제공한다.

식물체에서 멜론의 익스펜신 유전자를 과다발현시키는 방법으로는 익스펜신 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 익스펜신 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 익스펜신 유전자 또는 그 단편을 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기에서 “유전자의 과다발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다.

식물체내로 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 표적 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환 하는 방법이 있다. 상기 에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과다발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전길이 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명은 멜론 유래 익스펜신 유전자 및 그 단편을 포함하는 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 생성되는 과실의 연화 또는 성숙을 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 멜론 유래 익스펜신 유전자의 RNAi 단편 또는 안티센스 핵산을 포함하는 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 과실의 연화 또는 성숙이 지연된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 멜론 유래 익스펜신 유전자 및 그 단편을 포함하는 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 과실의 성숙이 촉진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기에서 발현 벡터를 제조하고 식물체 내로 도입하는 방법은 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 형질전환 식물체는 멜론 유래 익스펜신 유전자의 RNAi 단편, 안티센스 핵산 및 익스펜신 유전자 중에서 선택된 어느 하나를 발현 벡터에 삽입한 후 상기 발현 벡터를 식물체 내로 도입하고 이를 조직배양을 통해 재분화시킴으로써 제조할 수 있다.

상기에서 조직 배양의 예는 다음과 같다: 본 발명에 따른 형질전환 식물체의 조직을 캘러스 유도 배지에서 배양하여 캘러스를 유도한 후, 이를 뿌리 유도 배지에서 배양하여 발근을 유도한다. 이후, 뿌리 유도 배지에서 배양된 유식물체(plantlet)로부터 세근(부정근)이 나면, 배지를 깨끗이 제거하여 멸균 배합토에 이식한다. 이 때 비닐로 화분을 덮어 약 2일간 밀봉하는 것이 바람직하다. 그리고 나서, 큰 화분으로 옮겨 완전한 식물체로 재분화시킨다

본 발명의 일 실시예에서는 멜론 종자를 발아시킨 후 자엽으로부터 외식편을 제조하고 상기 외식편을 멜론 익스펜신의 RNAi 단편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스와 공동배양하였다. 그 다음 상기 외식편으로부터 신초 및 뿌리를 유도한 다음 기내에서 순화시키고 온실에서 재배하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 멜론의 형질전환체와 야생형을 각각 교배한 후 발생된 과실의 연화 및 성숙정도를 비교조사하였다. 그 결과, 익스펜신 유전자 발현이 억제된 형질전환체의 경우 과실의 성숙이 지연됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 식물체내에 익스펜신 유전자의 발현이 억제되어 과실의 연화 또는 성숙이 지연되었거나 익스펜신 유전자가 과다발현되어 과실의 성숙이 촉진되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방법들이 적용될 수 있는 식물은 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 단자엽 식물(monocotyledonous plant)일 수 있다. 상기에서 쌍자엽 식물은 멜론, 대두, 애기장대, 담배, 가지, 고추, 페튜니아, 감자, 토마토, 배추, 유채, 양배추, 목화, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리를 포함한다. 또한 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 및 바나나를 포함한다. 특히, 바람직하게는 멜론, 감, 무화과, 토마토, 사과, 배, 바나나, 복숭아 및 오이와 같은 과수류 식물이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 식물체의 과실 성숙 시기를 조절 방법은 본 발명의 핵산을 과발현시킴으로써 과실의 성숙을 촉진하여 과실의 생산을 단시간 내에 생산하거나 또는 본 발명의 핵산의 발현을 억제함으로써 과실의 성숙을 지연시켜 낙과를 방지하여 적합한 성숙시기까지 과실이 식물에 남아있도록 하며 효과적인 수확을 위해 과실의 성숙 시기를 일치시킴으로써 수확량을 증대시킬 수 있다. 나아가 본 발명의 방법에 따라 과실의 성숙을 지연시킴으로써 과육 연화를 지연시켜 과실의 저장 및 수송을 보다 효율적으로 수행할 수 있는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

멜론에서 익스펜신 유전자의 과실발달 단계 및 조직별 발현양상 분석

멜론 익스펜신(Melone Expansin; 이하 ME 유전자라 함) 유전자의 과실발달 단계 및 조직별 발현양상을 RT-PCR법으로 조사하였다. 이를 위해 과실발달 단계에 따라(수분직후, 수분후 9일, 수분후 18일, 수분후 27일 및 수분후 36일)의 과실과 조직별로는 수분 직후(0 DAP)의 잎(leaf, L), 웅화(male flower, MF), 자화(female flower, FF), 줄기(stem, S) 및 덩굴손(tendril, T)에서 RNA 분리 키트(QIAGEN RNAeasy Kit, #74904)를 이용하여 각각의 총 RNA를 추출하였다. 전기영동을 수행하여 분리된 RNA를 확인하였으며, 상기 RNA를 주형으로 하고 인비트로겐(Invitrogen)사의 수퍼스크립트 역전사 효소(superscript, catalog No.:12371-019)를 이용하여 1차-스트랜드 cDNA(firtst-strand cDNA)를 합성하였다. 합성된 1차-스트랜드 cDNA를 주형으로 MESF 프라이머(서열번호 1)와 MESR 프라이머(서열번호 2)를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 1).

PCR은 94℃에서 3분 동안 전변성(predenaturation)을 시킨 후, 94℃에서 1분; 50℃에서 1분; 72℃에서 1분 30초를 한 사이클로 하여 총 30 사이클을 반복 수행하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이때 대조군으로는 멜론의 액틴(actin) 유전자를 증폭할 수 있는 CmActinF 프라이머(서열번호 5)와 CmActinR 프라이머(서열번호 6)를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 1).

PCR 증폭에 사용한 프라이머

서열번호	프라이머명	서열(5'to 3')
1	MESF	GAG AGG TAC CAG ACT CAT T
2	MESR	AGT GAG CTC TCA TGC TCA
3	MEASF	GAG AGG ATC CAG ACT CAT T
4	MEASR	AGT TCT AGA TCA TGC TCA
5	CmActinF	GCT GTG TTC CCC AGT ATT GTT G
6	CmActinR	ACT GGC ATA GAG AGA TAG AAC G
7	nptIIF	GGA GAG GCT ATT CGG CTA TGA C
8	nptIIR	AGG AAG CGG TCA GCC CAT TCG

실험 결과, ME 유전자는 과실 발달 단계 중 수분 후 27일 및 36일에서 상대적으로 높게 발현이 되는 것으로 나타났다(도 1).

<실시예 2>

멜론 익스펜신 유전자의 RNAi 단편을 포함하는 재조합 벡터의 제조

ME 유전자 RNAi 단편을 함유하는 재조합 벡터는 35S 프로모터, GUS 유전자 및 Nos를 포함하는 pCAMBIA2300 벡터를 이용하여 다음과 같이 제조하였다. 먼저 각 단편을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 멜론 유래 익스펜신 유전자(이하 ME 유전자라 함)의 전체 cDNA 서열(서열번호 9)을 참고로 하여 제작하였다. ME 유전자의 안티센스 단편은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, ME 유전자의 센스 단편은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 반응은 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 수행하였다. 증폭된 각 PCR 산물은 키트(Qia quick PCR purification kit, QIAGEN, #28104)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물 안티센스인 경우, XbaI과 BamHI으로 센스인 경우는 KpnI과 SacI으로 절단하여 상기 벡터 내 GUS 유전자의 앞부분과 뒷부분에 각각 삽입함으로써 멜론의 익스펜신 유전자의 RNAi를 포함하는 식물형질전환용 재조합 벡터 MERNAi를 제조하였다(도 2).

상기 MERNAi 식물형질전환용 재조합 벡터는 전기천공법(electrophoration)으로 DH10B 세포에 도입하였다. 세포를 가나마이신(50 ㎎/L)을 함유하고 있는 LB 고체배지에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하여 형질전환체를 선발하였다. 선발된 콜로니들을 대상으로 PCR 분석과 DNA 제한효소 절단분석을 수행하여 유전자 삽입을 확인하였다(결과 미도시). 이후, 각 재조합 벡터를 분리하고, 이를 다시 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404에 도입시켰다. 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404는 PCR 분석을 통해 형질전환여부를 확인하였다.

<실시예 3>

식물형질전환용 재조합 벡터 MERNAi를 이용한 멜론의 형질전환

멜론의 형질전환은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 멜론의 종자를 발아용 배지(GM; MS 4.4 g/L, Sucorse 20 g/L, Agar 8g/L)에 2일간 발아시킨 후, 자엽에서(cotyledone)에서 외식편(explant)을 제작하였다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4401을 멜론의 외식편과 공동배양하였다. 이후, 상기 외식편을 전배양 배지(MPM; LS 4.4g/L, 수크로오스 20g/L, BA 5uM, 아가 8g/L)에 2일간 배양한 후, 선별배지(MSM; LS 4.4g/L, 수크로오스 20g/L, BA 5uM, Km 50mg/L, Cf 250mg/L, 아가 8g/L)에서 신초(shoot)를 유도하였다. 3-6주 후, 유도된 신초를 뿌리 유도용배지(MRM; MS 2.2g/L, 수크로오스 20g/L, 아가 6g/L)에 옮겨 배양하였다. 그 결과, ME RNAi 단편이 삽입된 신초에서 뿌리가 유도되었고, 유식물체를 기내에서 순화시킨 후, 온실에서 재배하였다(도 3).

<실시예 4>

멜론 형질전환체의 검증

상기 실시예 3에서 제조된 각 형질전환 멜론의 유식물체의 잎으로부터 키트(DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, #69104)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 분리된 DNA를 주형으로 선별마커로 사용된 가나마이신 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머(서열번호 7과 서열번호 8)를 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 형질전환여부를 조사하였다. 그 결과, 모든 형질전환 멜론에서 ME 유전자가 삽입된 형질전환체를 검증하였다(도 4).

또한, 형질전환된 식물체의 낙과 후 과실에서 RNA를 추출하여 ME 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 조합(서열번호 1과 2 또는 서열번호 3과 4)을 이용하여 실제로 멜론 과실에서 익스펜신이 발현되지 않는지를 조사하였다.

<실시예 5>

멜론 형질전환체의 과일 성숙의 지연확인

멜론 익스펜신 유전자의 RNAi 단편을 포함하는 MERNAi 재조합 벡터로 형질전환된 식물체와 형질전환하지 않은 과실의 생육 차이를 교배 후 15일 이후부터 5일 간격으로 조사하였다.

일반적으로 샤렌테이즈 멜론(Chrantais melone)의 경우에는 교배 후 35일이 경과하면 후숙이 빠르게 진행되어 37일 이후에는 과실의 자연 낙과가 이루어진다. 그러나 MERNAi로 형질전환된 식물체의 과실은 50일이 경과하여도 과색의 변화가 일어나지 않고 있으며 과실의 연화가 지연되는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6).

<실시예 6>

멜론 형질전환체의 후대 검증

실시예 3에서 멜론의 익스펜신 유전자의 RNAi 단편으로 형질전환한 식물체에서 종자를 확보하여, 가나마이신(20ug/ml)이 포함된 배지에서 발아성 검증을 실시하고, 발아된 유식물체를 토양에서 재배한 후, 실시예 4와 5의 실험을 진행하여 후대에서도 과일 성숙이 지연되는지를 검증하였다.

실험 결과, 가나마이신이 포함되지 않은 배지에서는 형질전환체와 형질전환하지 않은 멜론이 모두 발아하였으나, 가나마이신이 포함된 배지의 경우에는 형질전환체의 발아율이 68%로 3:1의 분리비를 나타냈다(도 7).

발아된 식물체를 정식한 다음 과일 성숙이 지연되는지를 검증하였다. 또한, 정식된 멜론 식물체의 잎으로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 선택마커로 사용한 nptII 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 그 결과 발아된 식물체 모두에서 증폭된 산물을 확인하였다(도 8).

<실시예 7>

멜론 형질전환체 과실의 성숙 및 생리적 특성 조사

멜론 유래 익스펜신 유전자의 RNAi 단편으로 형질전환된 멜론 형질전환체로부터 수득된 과실의 성숙 특성 및 생리적 특성을 조사하였다.

실시예 3에서 제조한 멜론 형질전환체(T1)를 실시예 6과 같은 방법으로 가나마이신 저항성 검정을 실시한 뒤 가나마이신에 저항성이 있는 33주의 식물을 수득하였다. 이를 플라스틱 트레이에 파종 및 육묘된 상태로 분양 받아 중앙대학교 내 플라스틱 필름하우스에서 재배하여 실험에 이용하였다. 대조군으로는 형질전환에 이용된 야생형의 샤렌테이즈(Charentais) 멜론 품종을 33주 재배하여 이용하였다. 과실의 착과는 착과절위가 높게 형성되는 형질전환체의 특성을 고려하여 형질전환체와 야생형 모두 25-30 절위에 과실을 착과 시켰으며 야생형의 멜론 품종은 성숙(ripening) 중 과피의 착색 정도와 에틸렌 발생량을 기준으로 성숙 단계를 나누어 수분 후 34일 부터 수확하여 실험에 이용하였으며 에틸렌 피크를 보이는 수분 후 39일을 기준으로, 형질 전환체는 에틸렌 피크를 보이는 수분 후 42일을 기준으로 하여 에틸렌 피크 전, 후 두 단계씩 샘플링을 하여 실험에 이용하였다.

<7-1> 과실의 품질 특성 분석 및 에틸렌 분석

과실을 수확 한 뒤 0.3% 소디움 하이포클로라이트(sodium hypochlorite)에 1분, 0.5% 베노밀(benomyl) 수용액에 1분간 침지하여 살균, 세척 한 후 ddH₂O에 1분간 세척한 후 페이퍼 타월을 이용하여 수분을 제거 한 다음 1시간 동안 자연 건조시켜 과피의 수분을 제거한 후 품질 조사에 이용하였다. 과실을 종으로 2등분 하여 상단부와 하단부를 컬럴 리더(Color Reader, CR-10, Minolta, Japan)를 이용하여 녹색에서 적색값으로의 변화를 나타내는 헌터(Hunter) 'a'와 보라색에서 노란색으로의 값을 나타내는 헌터(Hunter) 'b' 값을 각각 2회 측정하였다. 과실을 종으로 4등분 하여 과실의 적도 부위 과육에서 착즙한 후 간이굴절당도계(Atago, Japan)를 이용하여 가용성 고형물의 함량을 측정하였으며 당도 측정 부위에서 코르크 보러(cork borer)를 이용하여 1cm X 1cm X 1cm의 원통형 시료를 채취한 후 텍스쳐 분석기(Texture analyser TA-HDi, Stable Micro system, England)를 이용하여 Volodkevich bite jaws probe로 경도를 측정하였다.

한편, 각 과실을 5.56L의 밀폐용기에 각각 넣은 뒤 25℃, 상대 습도 80% 상태에서 에틸렌을 측정하였다. 에틸렌의 발생은 각각의 용기에 과실을 담고 1시간 동안 밀폐한 후 3ml 주사기로 밀폐용기 안의 공기를 채취하고 이를 기체 크로마토그래피(Gas chromatography, Younglin corp, M600D)를 이용하여 측정하였다. 에틸렌 분석은 Al₂O₃/Na 컬럼(Chrompack)을 이용하여, 오븐 온도 70℃, 주입구 온도 220℃ 조건에서 FID(Flame ionization detector)로 분석하였다.

형질전환에 사용된 샤렌테이즈(Charentais) 품종은 성숙이 매우 빠른 전형적인 클라이맥테릭(climacteric) 타입으로 교배 후 35일 이후 성숙이 빠르게 진행되어 3∼4일 만에 성숙이 완성되는 것으로 알려져 있다. 형질전환체 과실의 연화 지연결과를 생리적으로 분석하기 위해 야생형 품종과 형질전환체의 성숙과정 중 과실 변화와 에틸렌 발생을 비교 분석 하였다.

실험 결과, 야생형 멜론 과실은 수분 후 34일부터 에틸렌의 발생이 증가하여 39일 째에 피크(climacteric peak)를 보인 후 이후 감소하였으며 형질전환체는 수분 후 34일부터 에틸렌의 발생이 증가하였으나 야생형 멜론 과실보다 완만하게 증가하여 수분 후 42일 때에 피크(climacteric peak)를 보인 후 이후 감소하였다. 에틸렌 발생량은 형질전환체가 야생형 멜론 과실에 비하여 정량적으로 감소하였으며 에틸렌 피크도 야생형 멜론 과실에 비하여 3-4일 정도 지연됨을 확인할 수 있었다.

야생형 멜론 과실은 수분 후 34일부터 에틸렌 피크를 보이는 수분 후 39일까지 당도가 증가한 후 이후 감소하였으며 형질전환체는 수분 후 34일 부터 꾸준히 증가하는 모습을 보였다. 과실의 경도는 수분 후 34일 이후로 급격이 감소하였으며 야생형 멜론 과실은 수분 후 43일 이후로는 더 이상 실험할 수 없는 상태로 물러져 낙과하였으나 형질전환체의 경우는 수분 후 48일까지 과실의 연화가 지연되는 것을 확인하였다. 과실의 색도는 야생형 멜론 과실과 형질전환체 모두 수분 후 34일부터 착색이 진행되었으며 피크(climacteric peak)시까지 급격하게 착색되다가 이후 완만하게 증가하는 패턴을 보였다.

형질전환체는 야생형 멜론 과실에 비하여 성숙이 3∼4일 지연되고 있음이 확인되었으며 일단 성숙이 시작되어도 에틸렌 발생량이 감소하며 과실의 연화도 지연되었다.

<7-2> 유리당 분석

수확 후 당도 및 경도 측정을 완료한 멜론의 과육을 즉시 LN₂를 이용하여 동결하여 -80??에 보관하여 분석에 이용하였다. 동결 중인 멜론 시료 20g을 80% 차가운 에탄올(Ice cold ethanol) 150ml에 밤새도록 담군 후 1분간 균질화(homogenize) 하고 미라클로쓰(Miracloth)로 여과한 후 12,000rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 상등액을 5ml 취하여 Sep-Pak C₁₈ 카트리지(Waters)로 분획한 용액을 N₂를 이용하여 건조 시킨 후 증류수 1ml로 녹인 다음 멤브레인 필터(Milipore 0.45㎛)로 여과하여 HPLC(Gilson: France)로 분석하였다. HPLC 컬럼은 슈가 팩(Sugar Pak I, Waters)을 이용하였고 용매는 ddH₂O, 유속은 0.5㎖·min^-1, 검출기는 RI 검출기(refractive-index detedctor, Gilson; France)를 사용하여 90℃에서 분석하였다. 표준물질로서는 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 수크로오스, 솔비톨, 라피노오즈, 스타키오스를 ddH₂O에 각각 100mg/㎖로 녹여 이용하였다.

분석 결과, 야생형과 형질전환체의 과실의 총 유리당 함량은 숙성이 진행되면서 모두 지속적으로 증가하고 있었으나 형질전환체의 증가 속도가 야생형 과실에 비하여 상대적으로 느린 것으로 나타났다. 야생형 멜론 과실과 형질전환체의 당함량의 대부분을 차지하고 있는 것은 수크로오스, 글루코오스와 프럭토오스였으며 스타키오스, 라피노오스, 갈락토오스 등은 검출되지 않거나 소량이었다. 유리당 함량 중 수크로오스는 숙성이 진행되면서 급격하게 증가하였으며 야생형 멜론 과실과 형질전환체 모두 피크(climacteric peak)를 보이는 수분 후 39일과 수분 후 42일에 수분 후 34일 보다 4배 이상 증가하는 것이 확인 되었다. 이후 노화 단계인 수분 후 42일과 수분 후 48일에는 함량이 감소하였다. 글루코오스와 프럭토오스는 야생형 멜론 과실의 경우 숙성이 진행되면서 완만하게 감소되는 모습을 보였으나 형질전환체 과실의 경우에는 지속적으로 증가하는 것이 확인되었다. 멜론에서는 과실의 발달과 노화 중에 잎로부터 전류되어 온 수크로오스가 과실에 축적되는 것으로 보고 되어 있으며 이렇게 전류된 수크로오스는 분해되어 프럭토오스와 글루코오스가 생성되며 호흡작용에 의해 에너지로 전환되어 소비된다고 한다. 형질전환체에서의 프럭토오스와 글루코오스의 축적은 숙성의 지연으로 인한 대사작용의 지연에 기인하는 것으로 사료된다.

<7-3> 세포벽 조성 분석

멜론 시료 20g을 150ml 80% 에탄올과 혼합하여 균질화한 후 부흐너(buchner) 깔때기를 이용 미라클로쓰(miracloth)로 여과하고 색소 및 지질을 제거하기 위해 잔사를 클로로포름과 메틸 알코올 혼합액(1:1v/v)에 20분간 진탕한 후 재차 여과 하였다. 잔사는 아세톤으로 핫 플레이트에서 10분간 교반 시킨 후 글라스 필터(sintered glassfilter)상에서 여과하였으며 클로로포름과 메틸알코올 혼합액(1:1v/v)과 아세톤을 이용한 여과를 2회 반복하였다. 잔사는 실온에서 24시간 건조 한 후 드라이 오븐에 48시간 건조 시켜 세포벽(crude cell wall)을 추출하였고 진공 데시케이터에 보관하면서 실험에 사용하였다.

폴리우로나이드(Polyuronide)의 추출 및 정량은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기에서 제조한 세포벽 시료 10㎎을 시험관에 넣고 2ml의 진한 H₂SO₄₍ice cold)를 첨가하였다. 시험관을 얼음물에서 진탕하면서 찬 ddH₂O 0.5㎖을 조금씩 가하고 5분이 지난 후 다시 ddH₂O 0.5㎖을 가하여 완전히 분해가 될 때까지 진탕하였다. 분해 된 시료를 여과한 후 ddH₂O로 10㎖ 정용하였다. 용액중의 폴리우로나이드(polyuronide) 함량을 측정하기 위하여 여과한 시료 중 0.4㎖을 유리섬유로 여과하여 취하고 40㎕ 설파메이트-KOH(sulfamate-KOH)를 넣은 후 2.4㎖ 소디움 테트라보레이트(sodium tetraborate, disolved in conc H₂SO₄₎를 넣어 20분간 끓인 후 상온에서 냉각하였다. 시료액에 80㎕ 0.15% m-페닐페놀을 첨가하여 볼텍싱(vortexing) 하여 발색시켜 20분 후에 525nm에서 O.D 값을 측정하였다. 표준물질(Standard)로는 갈락투론산(galacturonic acid, 0-400㎕/㎖)을 사용하였다.

셀룰로오스(Cellulose) 분리 및 정량은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 세포벽 10㎎을 1㎖ 2N 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)에 넣고 1시간 동안 121℃에서 분해한 후 상등액은 논-셀루로직 뉴트랄 슈가(non-cellulosic neutral sugar) 분석을 위해 보관하고 그 잔사를 셀룰로오스(cellulose)의 정량에 사용하였다. 잔사를 1㎖ 78% H₂SO₄ 에 넣고 30℃에서 1시간 동안 진탕하면서 가수분해 시킨 후 ddH₂O로 20㎖로 정용하였다. 분해 시료 0.5㎖을 취하여 3㎖의 차가운 안트론(ice cold Anthrone)을 넣고 15분간 끓인 후 20분간 식힌다음 620nm에서 O.D. 값을 측정하였으며 표준물질로는 글루코오스(400㎍/㎖)를 사용하였다.

논-셀루로직 뉴트랄 슈가(Non-cellulosic neutral sugar) 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기에서 제조한 세포벽 시료 10㎎을 2N TFA로 가수분해시켜 얻은 용액을 40℃ 수조 상에서 N₂를 불어 주면서 완전히 건조시켰다. 건조된 시료에 100㎕ 1N NH₄OH(내부 표준 물질로서 200㎕/㎎ allose를 첨가시킴), 500㎕ DMSO(dimethyl sulfide: containing 20㎎/㎖ NaBH₄)를 넣어 진탕 시킨 후 40~45℃에서 90분간 반응시켜 퍼메틸레이티드 슈가(permethylated sugar)를 제조하였다. 이 반응액을 100㎕ 글라시알 아세트산(glacial acetic acid)으로 중화시킨 후 100㎕ 1-메틸이미다졸, 500㎕ 무수 아세틱 안하이드라이드(anhydrous acetic anhydride)를 가하여 알디톨 아세테이트(alditol acetates) 유도체를 형성하였다. 이 반응 10분 후에 1.5㎖ ddH₂O, 1㎖ 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, MeCl₂)를 넣어 잘 섞은 다음 3,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 분리된 유기용매층(MeCl₂)만 취하여 다시 증류수와 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)로 분획한 다음 유기용매층을 취해 N₂하에 40℃에서 건조시켰다. 건조 시킨 알디톨 아세테이트(alditol acetates) 유도체에 100㎕의 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)를 넣어 GC-FID(Young-In Scientific Co., LTD, M680D)로 분석하였다. 표준물질로는 각 당들을 50㎍씩 사용하였으며 알로오스(allose)는 내부 표준물질로 사용하였다. 당분석에 사용된 컬럼은 5% 페닐메틸 실리콘(phenylmethyl silicone 30m, 0.25 mm i.d.) 모세관 컬럼(capillary column)을 사용하였다.

과실의 세포벽 조성을 분석한 결과 셀룰로오스 함량은 야생형 과실의 경우 수분 후 36일에 363.2㎍/㎎ C.W.로 일시적으로 증가한 뒤 336.3㎍/㎎ C.W.감소하여 유지되었으며 형질전환체는 수분 후 42일까지 312.4㎍/㎎ C.W.로 지속적으로 감소하다가 이후 329.7㎍/㎎ C.W.로 증가한 뒤 유지되었다.

폴리우로나이드(Polyuronides) 함량은 숙성 전 기간동안 증감을 반복하였으며 피크(climacteric peak) 직전까지 야생형 멜론 과실은 252.7㎍/㎎ C.W에서 289.9㎍/㎎ C.W로 형질전환체는 223.0㎍/㎎ C.W에서 300.7㎍/㎎ C.W으로 모두 급격히 증가하다가 피크(climacteric peak)인 수분 후 39일과 수분 후 42일에 야생형 멜론 과실은 210.6㎍/㎎C.W로 형질전환체는 226.9㎍/㎎ C.W으로 감소한 뒤 이후 증가하는 모습을 보였다.

총 논-셀룰로직 뉴트랄 슈가(Total non-cellulosic neutral sugars)의 함량은 야생형 멜론 과실에서 수분 후 36일에 177.6㎍/㎎ CW에서 120.0㎍/㎎ CW로 급격히 감소하였으며 형질전환체 과실은 수분 후 42일에 103.7㎍/㎎로 서서히 감소하였다. 이는 과실의 경도의 감소가 야생형 멜론 과실보다 느린 형질전환체 과실의 특성은 과실의 경도 감소와 밀접하게 연관이 있는 논-셀루로직 뉴트랄 슈가(Non-cellulosic neutral sugars)의 함량이 야생형 멜론 과실에 비해 형질전환체 과실에서 더 서서히 감소하고 있기 때문인 것으로 사료된다. 논-셀루로직 뉴트랄 슈가(Non-cellulosic neutral sugars)의 각 중성당인 람노스(rhamnose), 아라비노스(arabinose), 자일로오스(xylose), 만노스(mannose), 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose)의 함량을 조사한 결과 야생형 멜론 과실과 형질전환체 과실에서 climacteric peak 직전에 급격히 증가한 뒤 감소하였으며 그 양은 형질전환체가 1.4배정도 더 많았다. 또한 갈락토오스의 함량은 야생형 멜론 과실에서 수분 후 36일에 67.4㎍/㎎ CW에서 26.0㎍/㎎ CW로 급감하였으나 형질전환체 과실에서는 수분 후 38일에 58.4㎍/㎎ CW에서 31.5㎍/㎎ CW로 감소하였다. 갈락토오스의 함량감소의 경우 형질전환체가 보다 완만하게 감소하는 경향이 확인되었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 식물체에서 익스펜신 유전자를 이용하여 과실의 성숙을 조절할 수 있는 효과가 있다. 즉, 본 발명에 따른 방법은 멜론의 익스펜신 유전자를 과발현시킴으로써 과실의 성숙을 촉진하여 과실의 생산을 단시간 내에 생산하거나 또는 멜론의 익스펜신 유전자의 발현을 억제함으로써 과실의 성숙을 지연시켜 낙과를 방지하여 적합한 성숙시기까지 과실이 식물에 남아있도록 하며 효과적인 수확을 위해 과실의 성숙 시기를 일치시킴으로써 수확량을 증대시킬 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

1. 서열번호 9로 표시되는 멜론 유래 익스펜신 유전자를 이용하여 멜론의 성숙을 조절하는 방법
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 멜론의 성숙을 조절하는 방법이 멜론 식물체에서 멜론 유래 익스펜신 유전자의 발현을 억제함으로써 멜론의 성숙을 지연시키는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제는 3중제, 리보자임(ribozyme), RNAi 및 안티센스 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 이용함으로써 수행되는 것인 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제가 RNAi 단편 또는 안티센스 핵산을 포함하는 발현벡터를 멜론 식물체에 도입함으로써 수행되는 것인 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 멜론의 성숙을 조절하는 방법이 멜론 식물체에서 서열번호 9로 표시되는 멜론 유래 익스펜신 유전자를 과다발현함으로써 멜론의 성숙을 촉진하는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 과다발현은 서열번호 9로 표시되는 멜론 유래 익스펜신 유전자를 포함하는 발현 벡터를 멜론 식물체에 도입함으로써 수행되는 방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 서열번호 9로 표시되는 멜론 유래 익스펜신 유전자의 RNAi 단편 또는 안티센스 핵산을 포함하는 발현 벡터를 멜론 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 멜론의 성숙이 지연된 형질전환 멜론 식물체의 제조방법.
13. 서열번호 9로 표시되는 멜론 유래 익스펜신 유전자를 포함하는 발현 벡터를 멜론 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 멜론의 성숙이 촉진된 형질전환 멜론 식물체의 제조방법.
14. 제12항의 방법에 따라 제조되고, 조직배양에 의해 무성번식된 형질전환 멜론 식물체.
15. 제13항의 방법에 따라 제조되고, 조직배양에 의해 무성번식된 형질전환 멜론 식물체.

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