ES2364932A1 - Alteración en la expresión de la proteína della u ortóloga para alterar el patrón de crecimiento de las plantas y el contenido de metabolitos del fruto. - Google Patents
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Abstract
Alteración en la expresión de la proteína DELLA u ortóloga para alterar el patrón de crecimiento de las plantas y el contenido de metabolitos del fruto. La presente invención describe nuevas funciones del gen SIDELLA de Solanum lycopersicum así como sus usos y versiones mutantes del gen asociadas a nuevos fenotipos que suponen la modificación del hábito de crecimiento y del metabolismo de las plantas portadoras de esas alteraciones así como cierta influencia en el contenido de metabolitos del fruto del tomate.
Description
Alteración en la expresión de la proteína DELLA
u ortóloga para alterar el patrón de crecimiento de las plantas y el
contenido de metabolitos del fruto.
La presente invención describe nuevas funciones
del gen SlDELLA de Solanum lycopersicum así como sus usos y
versiones mutantes del gen asociadas a nuevos fenotipos que suponen
la modificación del hábito de crecimiento y del metabolismo de las
plantas portadoras de esas alteraciones que resulta en una
alteración en el contenido de metabolitos del fruto del tomate.
\vskip1.000000\baselineskip
En general la arquitectura final de una planta
depende del número, tamaño y porte de los elementos constituyentes
(hojas, entrenudos, flores y frutos) y de la forma en la que se
insertan en el cuerpo general de la planta. Incluso más importante
que lo anterior es el hábito de crecimiento.
La productividad de una planta resulta afectada
por factores genéticos, fisiológicos y medioambientales, pero la
propia arquitectura y hábito de crecimiento son determinantes
clave.
La planta del tomate (Solanum
lycopersicum) es de la familia de las solanáceas (Solanaceae)
originaria de América y cultivada en todo el mundo por su fruto
comestible, el cual es una baya coloreada de tonos que van del
amarillento al rojo, debido a la presencia de los pigmentos licopeno
y caroteno. Posee un sabor ligeramente ácido y se produce y consume
en todo el mundo tanto fresco como procesado de diferentes
modos.
Por el hábito de crecimiento, que va a estar
dado por el tipo de ramificaciones de las plantas, se reconocen dos
grandes grupos de variedades, las de crecimiento indeterminado y las
de crecimiento determinado. El primer grupo se caracteriza por tener
un ápice vegetativo con dominancia, que le confiere crecimiento
continuo al tallo o eje principal. Se reconocen fácilmente ya que
presentan un racimo floral cada tres hojas y un crecimiento radial
amplio. En las variedades de crecimiento determinado los brotes
siempre terminan en una inflorescencia, por lo tanto siempre se debe
dejar el brote axilar superior para conducirla como indeterminada.
Este grupo de variedades, las cuales también se denominan
"arbustivas", no requieren soporte durante su crecimiento. Las
variedades arbustivas enanas son un subgrupo dentro de las
variedades determinadas caracterizadas por su menor tamaño y por
producir frutos del tipo "cereza" o "cherry".
El cuidar el sabor del tomate no es tarea fácil.
La intensidad de las propiedades del sabor del fruto de tomate está
determinado por la cantidad de azúcar (fructosa y glucosa
principalmente), por el contenido de ácidos orgánicos (cítrico y
málico principalmente) y la composición de los compuestos volátiles.
La diferencia de sabores entre variedades se explican por la
diferencia de las proporciones cuantitativas de las sustancias
volátiles, muchas de las cuales se desarrollan durante la
maduración.
La solicitud de patente ES 2235335 T3 describe
un procedimiento de manipulación del aroma de productos del tomate,
que consiste en incubar trozos de tomate con una enzima con
actividad alcohol deshidrogenasa y un cofactor de alcohol
deshidrogenasa; así como los productos obtenidos por este
procedimiento.
Las plantas de crecimiento simpodial tienen un
tipo de crecimiento lateral peculiar en el que el meristemo apical
termina (aborta o se diferencia en una flor/meristemo inflorescente)
pero la planta continua creciendo a partir del meristemo axilar
normalmente localizado por debajo de la hoja superior, lo que se
repite después de unos cuantos nodos foliares, provocando un
crecimiento apical continuado.
Las plantas de tomate exhiben un patrón de
crecimiento simpodial caracterizado por la alternancia en los brotes
de órganos vegetativos y reproductivos. Este patrón se establece
después de un periodo inicial en el que solo se producen órganos
vegetativos (tallos/entrenudos y hojas en la parte aérea) que en el
caso del tomate supone la producción de unos 5 a 20 nodos foliares
que acaba con la formación, en el meristemo apical del brote
principal, de un meristemo inflorescente que supone la terminación
de dicho simpodio principal. El crecimiento de la planta no se
detiene ahí, sino que continúa a partir de la yema axilar situada en
la axila de la hoja más próxima a esa nueva inflorescencia. En todas
las especies de tomate silvestres y la mayor parte de las de consumo
en fresco el habito de crecimiento que continua a partir de aquí es
la producción de simpodios cada uno consistente en unas 2 o 3 hojas
y una inflorescencia en el que el nuevo simpodio se vuelve a
producir a partir de la axila de la ultima hoja por debajo de la
nueva inflorescencia. Ello produce una planta de gran crecimiento
que produce continuamente frutos a lo largo del eje principal, con
frutos de diferente estadio de maduración en cualquier momento del
crecimiento post floración. Este habito de crecimiento se denomina
en este caso "indeterminado".
Por el contrario las plantas de tomate que
llevan en homozigosis la mutación recesiva
self-pruning sp (sp/sp) solo producen
dos o tres brotes simpodiales después de la primera inflorescencia
consistentes cada uno en 2 ó 3 hojas y una inflorescencia, tras lo
cual producen 2 inflorescencias seguidas y cesa así el crecimiento.
Esta mutación confiere un hábito de crecimiento "determinado"
que además de afectar el porte de la planta resulta en un cuajado y
maduración de frutos más concentrada en el tiempo de lo que ocurre
en las plantas de crecimiento indeterminado (Stevens y Rick, 1986;
Yeager, 1927).
El locus self-pruning
(SP) ha sido clonado (Pnueli et al., 1998) y
demostrado ser un ortólogo de los genes Centroradialis
(CEN) de Antirrhinum y Terminal Flower (TFL1) de
Arabidopsis. La familia de genes denominada a partir de estos
tres "CETS" (de CEN, TFL1 y
SP), están conservados entre diferentes especies
vegetales donde afectan la floración y la
determinación/indeterminación (Pnueli et al., 2001, Foucher
et al., 2003).
En el caso del tomate, SP pertenece a una
pequeña familia génica de seis miembros (SP, SP2I, SP3D, SP5G,
SP6A, and SP9D) distribuidos en cinco cromosomas
(Carmel-Goren et al., 2003), si bien el
causante de la mutación sp que esta en el cromosoma seis es
el único demostrado que puede controlar el paso entre habito de
crecimiento determinado e indeterminado. Los otros parálogos de
SP en tomate no están muy caracterizados pero parecen afectar
la expresión del fenotipo determinado modificando el momento en el
que se determina la planta (caso de introgresiones de SP9D y
de SP5G de pennelli en M82
(Carmel-Goren et al., 2003; Eshed and Zamir,
1995; Jones et al.,
2007).
2007).
La mutación self-pruning
ha sido introducida en la mayor parte de las variedades de tomate de
industria, ya que favorece la recolección mecánica (Hanna et
al., 1966; Friedland y Barton, 1975; Stevens y Rick, 1986;
Yeager, 1927) y no se dispone de métodos alternativos o que modulen
la expresión de SP.
Por otra parte, las proteínas DELLA se han
descrito como elementos clave que integrarían tanto señales externas
como las mediadas por fitohormonas, adaptando el crecimiento de las
plantas a las necesidades y condiciones medioambientales.
Las proteínas DELLA son miembros de una
subfamilia GRAS de reguladores que parecen actuar a nivel nuclear
como represores de procesos de desarrollo y crecimiento. Según el
modelo actual, elaborado fundamentalmente a partir del trabajo
realizado en Arabidopsis y arroz, el bloqueo en el
crecimiento ejercido por las proteínas DELLA (una familia de cinco
miembros en Arabidopsis, pero uno solo en el arroz) y en la
mayor parte de los cultivos, incluido el tomate, sería eliminado por
degradación dirigida de la proteína DELLA (Dill et al., 2001;
Dill y Sun, 2001; Lee et al., 2002; Peng et al., 1997;
Richards et al., 2001; Wen y Chang, 2002). El mecanismo de
acción subyacente al efecto de inducción del crecimiento de las
fitohormonas giberelinas (GA) estaría basado en que tras la unión de
la GA al receptor GID se produciría un cambio conformacional de la
proteína que favorecería su interacción con DELLA y aumentaría su
afinidad a ser degradada por el proteosoma 26S. (Murase et
al, 2007; Ueguchi-Tanaka et al, 2007;
2008).
Por lo que respecta al crecimiento y programas
de desarrollo, parece ser que la ruta DELLA integra la transición
floral en respuesta a la luz, al etileno y a las auxinas entre otras
y actuarían afectando la estabilidad de la proteínas DELLA, su
transcripción o de forma indirecta afectando los niveles de GAs
(Achard et al., 2006; Achard et al., 2003; Fu y
Harberd, 2003; Oh et al., 2007).
Existen mutantes en dos genes DELLA de
Arabidopsis (gai y rga) que están alterados en la
estatura de la planta, fundamentalmente debido a la longitud de los
entrenudos y al tiempo de floración (Koornneer et al., 1985;
Peng y Harberd, 1999, 1993; Peng et al., 1997; Silverstone
et al., 1998; Wilson y Somerville, 1995). La modulación de
los niveles del único gen DELLA en tomate, SlDELLA,
provoca alteraciones en las estructuras reproductivas y en el porte
de la planta (Marti et al. 2007). Todas las alteraciones
descritas en el porte de la planta tienen que ver con la longitud de
los entrenudos y con el tiempo de floración en plantas monopodiales
(crecen produciendo tejido vegetativo hasta producir la flor
terminal y detienen ahí su crecimiento).
Sería necesario y deseable disponer de otros
mecanismos de control del hábito de crecimiento de las plantas de
cultivo, por ejemplo en tomate, alternativos a
self-pruning o que modularan la actividad de
self-pruning produciendo plantas con
diferente grado de determinación, y en consecuencia con diferente
porte y número de flores y frutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona plantas
genéticamente modificadas con la expresión de las proteínas DELLA u
ortóloga alterada produciendo así una inhibición en la represión del
desarrollo y crecimiento de las plantas en comparación a plantas
correspondientes no modificadas genéticamente. Debido a la
alteración en la expresión de DELLA, mediante silenciamiento o
mutación, las plantas genéticamente modificadas verán alterado su
patrón de crecimiento simpodial y/o el contenido de metabolitos y/o
sustancias volátiles en el fruto. La presente invención también se
refiere a los frutos y semillas de las plantas modificadas
genéticamente así como al procedimiento empleado para obtener dichas
plantas.
La expresión de DELLA se regula mediante el gen
SlDELLA descrito y ha sido. utilizado por los autores de la presente
solicitud (Marti et al. 2007), sin embargo la regulación de
su expresión para alterar el patrón de crecimiento y/o para alterar
el contenido de los metabolitos de los frutos son funciones nuevas,
así como sus aplicaciones.
Se conoce un gen ortólogo (semejante por
pertenecer a dos especies que tienen un antepasado común) del gen
SlDELLA, más concretamente es el gen GAI de
Arabidopsis en tomate (Solanum lycopersicum). En US
6,307,126 y su continuación US 6,830,930, se describe que el gen GAI
se ha clonado y mutado y la expresión de tales genes en plantas
afecta al crecimiento de las mismas, concretamente logrando unas
plantas enanas que son útiles para la reducción de las pérdidas que
tienen lugar durante el almacenamiento de la cosecha.
Los autores de la presente solicitud han
observado que el gen SlDELLA en tomate es importante para
determinar el número de repeticiones simpodiales, y por lo tanto el
porte y número de flores/frutos en el eje principal. Esto debería
afectar a la productividad total (número y tamaño de frutos
producidos). Por otro lado, modificaciones en este gen afectan al
contenido metabólico de los frutos como se ejemplifica para el
contenido de compuestos volátiles asociados al aroma del fruto.
De acuerdo con lo descrito en el estado de la
técnica, sería simplemente esperable que las modificaciones en
SlDELLA o genes ortólogos afectaran la altura de la planta y la
distancia de los entrenudos, sin afectar al número de estos a
excepción del que se produce por una modificación en el tiempo de
floración. Las funciones descritas para el gen GAI tienen que ver
con el crecimiento y el tiempo de floración y esta apoyado por los
fenotipos observados en Arabidopsis y en cereales. Muchas
plantas como tomate son de "día neutro" y florecen con
independencia de la duración del día.
Una nueva función descrita aquí tiene relevancia
en las plantas cuyo crecimiento del eje principal se detiene con la
primera flor para seguir creciendo a partir del brote axilar
(denominado simpodial) por debajo de la nueva flor. La nueva función
se ha puesto de manifiesto por los autores de la presente solicitud
en estudios con el gen SlDELLA. En plantas de tomate
afectadas en los niveles de expresión del gen SlDELLA se
observa el fenotipo esperable de crecimiento que se ve reflejado en
la longitud de los entrenudos. Lo importante de la presente
invención es que plantas de tomate que llevan la mutación sp
y por tanto tienen un crecimiento determinado, es decir el
crecimiento del eje principal se detiene después de un número
pequeño de 2 ó 3 repeticiones simpodiales (metámero consistente por
ejemplo en 2 hojas y una inflorescencia) tras la primera flor,
incrementan el número de simpodios o incluso se vuelven
indeterminados cuando se bloquea con diferente eficiencia la
expresión de SlDELLA en plantas transgénicas. Esto ocurre sin
modificar significativamente el tiempo de floración y sugiere una
forma alternativa a sp de alterar el hábito de crecimiento
del tomate y por extensión de otras plantas de crecimiento similar
(i.e.
simpodial).
simpodial).
Hasta el momento la única forma de alterar el
hábito de crecimiento en tomate ha sido mediante el gen
self-pruning. La introducción de ese gen para
alterar el patrón de. crecimiento del tomate de indeterminado a
determinado significó una revolución en el cultivo de tomate de
industria y permitió la mecanización de la recolección. Actualmente
esta mutación recesiva del gen self-pruning
ha sido introducida en la mayor parte de las variedades de tomate de
industria que son por tanto sp/sp. Aparte de unas pocas
formas alélicas de genes de la familia
self-pruning no se ha propuesto ni se dispone
de ningún método para alterar el patrón de crecimiento.
En la presente invención se modifica la
arquitectura de la planta y el hábito de crecimiento actuando al
nivel de DELLA (o a nivel de proteínas ortólogas) i.e.
mediante transgénesis alterando el nivel de SlDELLA (o gen
ortólogo) o mediante introducción de mutaciones en el gen
SlDELLA (o gen ortólogo) que alteran el patrón de
crecimien-
to.
to.
También es objeto de la presente invención la
producción e identificación de versiones mutantes en ese gen (o gen
ortólogo) que proporcionan diversas intensidades del fenotipo de
interés.
Los resultados de la presente solicitud han sido
obtenidos utilizando el tomate (Solanum lycopersicum) como
ejemplo, pero pueden ser de utilidad para otras plantas de
crecimiento simpodial determinado o no.
También se describe un método para asociar el
carácter con las mutaciones abriendo así la posibilidad de
identificar nuevos mutantes en el gen que den versiones diferentes
del fenotipo que puedan adaptarse a lo que el productor
necesite.
El carácter conferido por el silenciamiento y
las mutaciones es de interés comercial y/o agronómico. Puede ser de
muy importante para aquellos interesados en alterar el número de
brotes simpodiales en plantas con ese tipo de crecimiento,
incluyendo pero no limitando a solaneaceas, cucurbitáceas como el
melón, leñosas, árboles, y obviamente ornamentales como orquidáceas,
entre otras plantas de interés.
Es de interés disponer de mecanismos para
conferir el habito de crecimiento que convenga a un determinado tipo
de planta, de cultivo u ornamental. Así, puede interesar conferir el
carácter determinado a una especie de crecimiento indeterminado, con
el propósito de limitar su crecimiento (razones estéticas,
disponibilidad de espacio, etc.), o de concentrar como consecuencia
de ello la producción y maduración de los frutos en el tiempo.
Por otra parte, interesa incrementar el número
de brotes simpodiales de una planta de crecimiento determinado, con
objeto de aumentar la producción y la exposición solar de los
frutos, incluso de volverla indeterminada.
\newpage
El disponer de formas de modificar el contenido
metabólico de los frutos es importante también desde el punto de
vista organoléptico y nutricional. Así, en otro aspecto de la
presente invención, se describe como segunda nueva función del gen
SlDELLA u ortólogo la regulación del contenido de los metabolitos
y/o sustancias volátiles asociadas al aroma de los frutos que puede
ser empleada en todo tipo de plantas, de crecimiento simpodial
o
no.
no.
El primer objeto de invención se refiere a
plantas genéticamente modificadas con la expresión alterada de la
proteína DELLA u ortóloga caracterizadas porque la alteración en la
expresión de la proteína DELLA u ortóloga produce una inhibición en
la represión del desarrollo y crecimiento de las plantas en
comparación a plantas correspondientes no modificadas genéticamente.
La alteración en la expresión de DELLA del objeto de invención se
obtiene mediante silenciamiento del gen SlDELLA u ortólogo o
mediante mutación del gen SlDELLA u ortólo-
go.
go.
En una realización particular, el silenciamiento
del gen SlDELLA u ortólogo se obtiene mediante el empleo una
construcción génica que se basa en una copia antisentido del gen
SlDELLA u ortólogo controlada por el promotor 2XCaMV35S.
En otra realización particular, la mutación en
la secuencia genética de SlDELLA se debe a adición y/o inserción y/o
supresión y/o sustitución de uno o más nucleótidos de gen SlDELLA u
ortólogo, concretamente, la mutación consiste en la sustitución del
nucleótido guanina por adenina en el nucleótido 458, denominada
mutación TILLING 1 (SEQ ID No.3) o la sustitución del nucleótido
guanina por adenina en el nucleótido 1498, denominada mutación
TILLING 2 (SEQ ID No.5) o la sustitución del nucleótido citosina por
timina en el nucleótido 994, denominada mutación TILLING 3 (SEQ ID
No.7) o la sustitución del nucleótido citosina por timina en el
nucleótido 661, denominada mutación TILLING 4 (SEQ ID No.9).
En otra realización particular las plantas
genéticamente modificadas del presente objeto de invención, exhiben
un patrón de crecimiento simpodial, concretamente un patrón de
crecimiento simpodial determinado que se modifica a indeterminado o
a semideterminado.
En otra realización particular, las plantas
genéticamente modificadas con la expresión alterada de la proteína
DELLA u ortóloga del presente objeto de invención están
caracterizadas porque el contenido de metabolitos y/o sustancias
volátiles asociadas al aroma de los frutos se ve aumentado y/o
disminuido respecto a plantas correspondientes no modificadas
geneticamente. Concretamente el aumento en el contenido de los
metabolitos se refiere en una realización particular al aumento de
sacarosa, tirosina, asparagina, isoleucina, treonina, prolina, ácido
piroglutámico y mio-inositol de un orden del
100-400%, y/o el de fructosa y glucosa en un orden
del 10-30%, y/o el de las sustancias volátiles
asociadas al aroma de los frutos
E-2-hexenal,
1-penten-3-ona y
\beta.damascenona de un orden del 100-200%, y/o el
de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos
ácido 3-metilbutanoico,
E,E-2,4-decadienal y
E-2-octenal en un orden del
100-200% respecto de plantas correspondientes no
modificadas genéticamente. En otra realización particular la
disminución en el contenido de las sustancias volátiles asociadas al
aroma de los frutos se refiere a una disminución en
3-metilbutanol,
1-nitro-2-feniletano,
2-feniletanol, fenilacetaldehído y
2-isobutiltiazol en un orden del
80-90%, y/o la de las sustancias volátiles no
asociadas al aroma de los frutos geranilacetona, terpineol,
linalool, bencil alcohol, eugenol, benzilnitrilo,
2-metil-1-butanol y
2-metil-1 -propanol en un orden del
50-100% respecto de plantas correspondientes no
modificadas genética-
mente.
mente.
Las plantas genéticamente modificadas del
presente objeto de invención son plantas con un interés comercial
y/o agrícola y se seleccionan del grupo de las solanaceas,
cucurbitáceas, orquidáceas, leñosas, entre otras plantas de interés.
En una realización particular las plantas de la invención pertencen
a la familia de las Solanaceas, siendo concretamente una
planta de tomate Solanum lycopersicum.
Un segundo objeto de invención se refiere a los
frutos obtenidos de las plantas genéticamente modificadas según el
anterior objeto de invención con un contenido de ciertos metabolitos
y/o sustancias volátiles asociadas al aroma aumentado y/o el
contenido de otros metabolitos y/o sustancias volátiles asociadas al
aroma disminuido respecto a los frutos de plantas correspondientes
no modificadas genéticamente. El aumento en el contenido de los
metabolitos se refiere en una realización particular al aumento de
sacarosa, tirosina, asparagina, isoleucina, treonina, prolina, ácido
piroglutámico y mio-inositol de un orden del
100-400%, y/o el de fructosa y glucosa en un orden
del 10-30%, y/o el de las sustancias volátiles
asociadas al aroma de los frutos
E-2-hexenal,
1-penten-3-ona y
\beta.damascenona de un orden del 100-200%, y/o el
de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos
ácido 3-metilbutanoico,
E,E-2,4-decadienal y
E-2-octenal en un orden del
100-200% respecto de plantas correspondientes no
modificadas genéticamente. En otra realización particular la
disminución en el contenido de las sustancias volátiles asociadas al
aroma de los frutos se refiere a una disminución en
3-metilbutanol,
1-nitro-2-feniletano,
2-feniletanol, fenilacetaldehído y
2-isobutiltiazol en un orden del
80-90%, y/o la de las sustancias volátiles no
asociadas al aroma de los frutos geranilacetona, terpineol,
linalool, bencil alcohol, eugenol, benzilnitrilo,
2-metil-1-butanol y
2-metil-1 -propanol en un orden del
50-100% respecto de plantas correspondientes no
modificadas genéticamente.
Otro objeto de invención se refiere a las
semillas de las plantas genéticamente modificadas según el primer
objeto de invención, en las que la expresión de las proteínas DELLA
u ortóloga se encuentra alterada.
Otro objeto de invención se refiere al
procedimiento de obtención de plantas genéticamente modificadas con
la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga que comprende
las siguientes etapas:
- a)
- transformar el genoma de una célula de la planta,
- b)
- regenerar la planta a partir de la célula de la etapa a),
- c)
- obtener semillas de las planta transformada que contengan el genoma modificado y,
- d)
- crecer al menos una de las semillas de la etapa c) para obtener una planta que contenga la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga.
En una realización particular la etapa a) del
presente objeto de invención consiste en una mutagénesis dirigida
cuya realización se obtiene mediante el silenciamiento del gen
SlDELLA empleando la construcción génica asDELLA que se basa en una
copia antisentido del gen SlDELLA controlada por el promotor
2XCaMV35S. En otra realización particular la etapa a) del presente
objeto de invención consiste en una mutagénesis dirigida cuya
realización consiste en modificar la secuencia nativa del gen
SlDELLA a la secuencia del gen SlDELLA mutado seleccionado del grupo
de las mutaciones denominadas TILLING 1 (SEQ ID No 3), TILLING 2
(SEQ ID No 5), TILLING 3 (SEQ ID No 7) y/o TILLING 4 (SEQ ID No
9).
En otra realización particular, del presente
objeto de invención, la etapa b) es opcional y en otra realización
dicha transformación es mediada por Agrobacterium.
En otra realización particular la etapa a)
consiste en una mutagénesis no dirigida que comprende las siguientes
etapas:
- i.
- exponer la planta a un agente mutagénico, preferentemente el tilmetanosulfonato
- ii.
- extraer el DNA de cada una de las familias y combinar siguiendo una estrategia 3D,
- iii.
- rastrear el gen SlDELLA en cada familia mediante PCR anidada y cebadores universales,
- iv.
- detectar los alelos mutantes de SlDELLA por secuenciación y deconvulución.
A partir de la etapa (iv) de la presente
realización se seleccionaron 4 formas alélicas de SlDELLA,
concretamente las denominadas: TILLING 1 (SEQ ID No 3), TILLING 2
(SEQ ID No 5), TILLING 3 (SEQ ID No 7), TILLING 4 (SEQ ID No 9).
Figura 1: Estructura de la construcción génica
introducida en tomate para disminuir los niveles de SlDELLA
en plantas transgénicas. Esquema de la estructura del
T-DNA: 2x35S: promotor 35SCaMV (virus del
mosaico del tabaco) duplicado. CaMV poli (A)^{+}:
secuencia de poliadenilación del CaMV. NptII: gen que
confiere resistencia a la kanamicina, con el promotor y el
terminador de la nopalin sintetasa (pnos y tnos).
Figura 2: Efecto de la estrategia sobre los
niveles de SlDELLA en las plantas transgénicas
asDELLA. Análisis de los niveles de expresión de
asSlDELLA y SlDELLA en entrenudos de plantas
transgénicas y silvestres mediante RT-PCR
semicuantitativa. En la figura se confirma la expresión de
asSlDELLA en las líneas transgénicas (líneas 5A, 24B y 7C).
Al mismo tiempo se comprueba la disminución de los niveles endógenos
de SlDELLA en estas misma líneas en comparación con una
planta silvestre (wt). Como control de carga se utilizó la reacción
de RT-PCR para la actina.
Figura 3: Efecto de la estrategia sobre el
crecimiento y la producción de brotes simpodiales en las plantas
transgénicas asDELLA. (A) Efecto sobre la altura total de las
plantas medida después de 90 días. (B) Efecto sobre el crecimiento,
número de entrenudos y tamaño de los mismos a lo largo de 120 días.
En estas gráficas se observa la mayor altura alcanzada por las
plantas transgénicas en comparación con las silvestres, así como que
esta mayor altura se debe tanto a un aumento en el número de
entrenudos como en su longitud. En las plantas transgénicas el
crecimiento del brote simpodial se detiene más tarde o incluso
adquiere crecimiento indeterminado. Los valores corresponden a la
media de 4 plantas. La barra indica el error estándar, wt:
planta silvestre. 5A, 24B, 7C: líneas transgénicas asDELLA
independientes. EN: entrenudo
Figuras 4-7: (A) Secuencias
nucleotídica y (B) estructura primaria de las proteínas
correspondientes a las formas mutadas de SlDELLA
identificadas por TILLING: Mutante TILLING 1 (figura 4), Mutante
TILLING 2 (figura 5), Mutante TILLING 3 (figura 6) y Mutante
TUILLING 4 (figura 7), donde se marcan en negrita y subrayadas los
nucleótidos y aminoácidos mutados respecto a la secuencia de
SlDELLA cultivar determinado M82.
Figura 4 En el mutante TILLING 1 (A) a nivel
nucleotídico existe una sustitución de guanina por adenina (en el
nucleótido 458) y (B) a nivel aminoacidico existe una sustitución de
alanina por treonina (en el aminoácido 153). Figura 5 En el mutante
TILLING 2 (A) a nivel nucleotídico existe una sustitución de guanina
por adenina (en el nucleótido 1498) y (B) a nivel aminoacidico
existe una sustitución de glutamina por lisina (en el aminoácido
500). Figura 6 En el mutante TILLING 3 (A) a nivel nucleotídico
existe una sustitución de citosina por timina (en el nucleótido 994)
y (B) a nivel aminoacidico existe una sustitución de leucina por
fenilalanina (en el aminoácido 332). Figura 7 En el mutante TILLING
4 (A) a nivel nucleotídico existe una sustitución de citosina por
timina (en el nucleótido 661) y (B) a nivel aminoacidico existe una
sustitución de leucina por fenilalanina (en el aminoácido 221).
Figuras 8-11: Apilamiento de los
diferentes mutantes de TILLING caracterizados y localización de la
mutación en la estructura primaria de la proteína comparada con
otras proteínas DELLA de otras plantas para ver el grado de
conservación del aminoácido afectado. Salvo en el mutante TILLING 1,
todas las mutaciones se producen en regiones muy conservadas de la
proteína. (SlDELLA de Solanum licopersicum del
cultivar determinado M82; StGAI de Solanum tuberosum;
GhGAI de Gosipium hirsutum; AtGAI, AtRGA,
AtRGL1; AtRGL2 y AtRGL de Arabidopsis thaliana;
VvGAI de Vitis vinifera; ZmGAI de Zea
mais; OsGAI de Oryza sativa y TaGAI de
Triticum aestivum) El alineamiento se realizó con el
algoritmo "ClustalW" del EBI (www2.ebi.ac.uk/clustalw/). Las
secuencias de las proteínas DELLA empleadas para la realización de
estos apilamientos pueden ser consultada en bases de datos públicas
como GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).
Figura 12: Fenotipo de planta silvestre M82
frente al de las plantas de TILLING con mutación puntual en
homozigosis o heterozigosis en SlDELLA. Se observa un aumento
en la altura de las plantas mutantes, que presentan mayor biomasa y
mayor número de frutos.
En la presente invención el término "índice
simpodial" (sympodial index) es el número de nodos (hojas)
sobre el brote principal hasta la inflorescencia.
El "hábito de crecimiento" (plant
habit), también denominado patrón de crecimiento, según la presente
invención es aquél presentado por las plantas debido a la
composición, el patrón de ramificación, el desarrollo y la textura
así como la disposición en el espacio temporal de las unidades
modulares consistentes en hojas, entrenudos y flores (frutos).
El "crecimiento simpodial" es el que
presentan plantas como el tomate, melón, muchas cucurbitáceas,
legumbres y orquídeas, etc, y que está caracterizado porque el
crecimiento del eje principal de la planta se detiene con la
formación de la primera inflorescencia, para seguir creciendo por
diferenciación y elongación a partir de la diferenciación del brote
correspondiente a la yema situada en la hoja justo por debajo de esa
inflorescencia. Ese brote axilar produce un número de hojas y una
nueva flor terminal, para reanudar el crecimiento a partir de la
yema axilar situada por debajo de esa nueva inflorescencia y así
consecutivamente.
Entre las plantas de crecimiento simpodial se
encuentran las solanaceas, cucurbitáceas, orquidáceas, leñosas,
entre otros grupos de interés.
El "crecimiento determinado", a
efectos de esta patente, es el hábito de crecimiento caracterizado
por la producción de un número limitado de brotes simpodiales sobre
el eje principal, después de la primera flor, resultando en una
planta de altura más reducida. En el caso del tomate se consigue
mediante mutación en el gen self-pruning en
homozigosis.
Igualmente, el "crecimiento
semi-determinado" es el hábito que presentan
las plantas de crecimiento determinado, en el que producen un número
mayor de brotes simpodiales que el genotipo de referencia en
determinadas condiciones.
Y el "crecimiento indeterminado" es
el presentado por muchas especies (todas las silvestres relacionadas
con el tomate y muchas cultivadas) de tomate y típico de todas las
"viñas", se caracteriza por un crecimiento simpodial, que se
repite indefinidamente sobre el eje principal produciendo nuevos
brotes con cada nueva inflorescencia terminal.
Asimismo, se considera que
"transgénesis", en la presente invención, es el proceso
mediante el cual se introduce una secuencia de DNA que contiene al
menos una región no presente en el genoma del organismo inicial.
"Planta modificada genéticamente"
(planta transgénica) se refiere, en la presente invención, a plantas
cuyo material genético ha sido modificado deliberadamente con el fin
de modificar la expresión de la proteína DELLA u ortóloga. La
modificación genética puede realizarse tanto mediante una
mutagénesis dirigida como a través de mutaciones no dirigidas. En la
presente invención, "mutagénesis dirigida" se refiere
una modificación genética concreta, en la que se modifica
específicamente una cadena nucleotídica en el genoma de una célula
de planta. "Mutagénesis no dirigida" se refiere a la
mutagénesis del genoma celular sin dirigir la mutación, es decir no
se conoce de antemano qué mutación se va a generar, dónde o el
efecto que dicha mutación ejercerá sobre la célula y/o planta.
El término "planta correspondiente no
modificada genéticamente" (planta silvestre) se refiere en la
presente invención a plantas cuyo material genético no ha sido
modificado.
"Gen ortólogo" en la presente
invención se refiere a genes homólogos en diferentes especies que
codifican "proteínas ortólogas" que catalizan la misma
reacción (es decir, con una misma función) en plantas.
En la presente invención se describen nuevas
funciones y usos del gen SlDELLA de Solanum
lycopersicum junto con versiones mutantes del gen asociadas a
los nuevos fenotipos. Estos nuevos caracteres genotípicos incluyen
la modificación del hábito de crecimiento y del metabolismo.
Plantas genéticamente modificadas en SlDELLA o formas
mutantes alélicas de esta proteína pueden utilizarse para
incrementar el número de repeticiones simpodiales en un fondo
genético determinado con el correspondiente incremento en el número
de inflorescencias y de frutos, y por otra parte producir frutos con
un contenido metabólico modificado, incluido el de los volátiles
asociados al aroma.
La presente invención está relacionada con el
control genético del crecimiento y más concretamente con el hábito
de crecimiento que determina el crecimiento simpodial determinado o
no de una planta. Más concretamente esta invención está relacionada
con la utilización del gen SlDELLA para modificar ese aspecto
del desarrollo mediante estrategias de ingeniería genética y de
TILLING seguidas de mejora asistida por marcadores utilizando las
formas mutantes de este gen.
Un primer aspecto de esta invención se basa en
la identificación de una nueva función de la proteína DELLA no
previamente descrita y que proporciona una forma de alterar el
hábito de crecimiento determinado de plantas (en nuestro caso de
plantas de tomate portadoras de la mutación sp/sp). Esta
forma de alterar el hábito de crecimiento en tomate consiste en
utilizar una construcción asDELLA para disminuir los niveles
endógenos del regulador SlDELLA en plantas transgénicas. Las
plantas transgénicas así producidas presentan un fenotipo de planta
semideterminada a indeterminada con una mayor producción de flores y
frutos en el eje principal, sin alterar significativamente el tiempo
de floración.
Otro aspecto de la presente invención, y dado
que las proteínas DELLA se degradan tras el tratamiento con la
hormona giberelína GAs (Dill et al. 2001; 2004; Gubler et
al. 2002; Itoh et al. 2002; Silverstone et al.,
2001), se basa en otro método de variar el nivel de determinación
(número y composición de las repeticiones simpodiales después de la
primera flor) consistente en el tratamiento de la planta con
concentraciones de GAs.
Otro aspecto de esta invención, y dado que
existen formas de DELLA insensibles a GAs, es alterar el número y
composición de las repeticiones simpodiales después de la primera
flor de forma independiente de GAs y conferir un fenotipo de
ganancia de función mediante utilización de una versión mutada de
DELLA.
La nueva función de SlDELLA se puede conferir
mediante transgénesis de forma análoga a la resultante de la
utilización de una estrategia de asDELLA como se describe en el
ejemplo 1 o mediante sobre expresión de versiones mutadas, incluidas
las de ganancia de función (supresión tipo gai en asDELLA o
relacionadas).
En otro aspecto de la presente invención se
propone un método para identificar mutantes, derivados, variantes y
alelos de esa proteína de plantas mutagenizadas y que resulten en
características funcionales nuevas que modifiquen en diferente grado
el número y composición de las repeticiones simpodiales, produciendo
así plantas con un número de flores y porte adaptado a las
necesidades. Los cambios en la proteína pueden ser uno o más de los
siguientes: adición, inserción, supresión o sustitución de uno o más
nucleótidos que resulte en cambios en la secuencia de aminoácidos o
no.
La presente invención también suministra la
construcción nucleoacídica o vector que comprende un promotor desde
el cual se exprese la secuencia de SlDELLA en orientación
antisentido. La construcción o vector esta diseñada para su
expresión en una célula, especialmente de tipo vegetal. Dicha célula
vegetal que expresa esa construcción en antisentido está también
comprendida en esta invención. Esta construcción cuando se inserta
en el genoma de la planta dirige la expresión de la cadena
complementaria de mRNA de SlDELLA ocasionando la disminución
de los niveles de la cadena codificante expresada endógenamente.
Dicha disminución también puede obtenerse por otros métodos como
RNAi, microRNA, etc.
Dicha construcción o vector que contenga el
SlDELLA en antisentido, RNAi, etc., contendrá generalmente un
promotor u otra secuencia reguladora.
La persona experta en la materia conoce métodos
para realizar dichas construcciones que contengan las señales y
elementos necesarios para su expresión en plantas y obtener plantas
transgénicas portadoras de dichas construcciones y que expresen el
gen de forma constitutiva o inducida. Para más detalles se pueden
ver, por ejemplo: "Molecular Cloning: a Laboratory
Manual", 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold
Spring Harbor Laboratory Press. "Protocols in Molecular
Biology", Second Edition, Ausubel et al. ed., John
Wiley & Sons, 1992. "Specific procedures and vectors
previously used with wide success upon plants" are described by
Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721), and
Guerineau and Mullineaux, (1993); "Plant transformation and
expression vectors", In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD
ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp
121-148.
La presente invención se puede llevar a cabo en
cualquier planta, especialmente de crecimiento simpodial, aparte de
tomate (ie cucurbitáceas o orquídeas, etc) en las que se puede
aislar e identificar el ortólogo de SlDELLA mediante PCR con
oligos conservados y llevar a cabo una aproximación similar.
Alternativamente se pueden rastrear librerías de ácidos nucléicos
con sondas heterólogas. Las personas conocedoras del arte pueden
llevar a cabo estos procedimientos sin problemas y llevar a cabo
construcciones y transformación genética de forma similar para
obtener una alteración del fenotipo descrito en esa plantas.
En otro aspecto de la presente invención se
presentan secuencias mutantes de SlDELLA que confieren
alteraciones en la nueva función descrita y que resultan en plantas
de tomate con un número mayor de simpodios que la variedad que
aporta el fondo genético y con un número mayor de inflorescencias y
alteración de la composición simpodial.
En otro aspecto de la invención se proporciona
la forma de producir e identificar nuevas versiones de DELLA (o
proteína ortóloga)que estén afectadas en esta nueva función y
que resulten de interés. Actuando sobre DELLA (o proteína ortóloga)
podemos alterar no sólo la longitud de los entrenudos sino el número
de brotes simpodíales sobre el eje principal y, en consecuencia, el
número de inflorescencias y frutos asociados. Concretamente, permite
en el caso de plantas de tomate de crecimiento determinado
(sp/sp) convertirla en indeterminado.
En otro aspecto de la presente invención la
alteración de SlDELLA (o gen ortólogo) ocasiona en el fruto
cambios en el contenido sustancial del mismo que afectaran sus
características nutricionales y organolépticas. Las características
organolépticas, nutricionales y de salud de los frutos son
consecuencia directa del contenido en una serie de moléculas
presentes en el mismo. Concretamente el sabor y aroma del tomate
está relacionado con la concentración y cantidades relativas de
azúcares (fundamentalmente glucosa y fructosa) y de ácidos orgánicos
(málico, cítrico) y de los compuestos volátiles que contribuyen al
aroma (al menos 14 compuestos volátiles). El sabor y el aroma son
unos caracteres a menudo olvidados en los programas de mejora más
recientes, donde el énfasis ha sido en la productividad, larga vida
de los frutos, etc, con la consecuente demanda social por frutos con
mejores o diferentes sabores. En la presente patente se muestra que
es posible modificar el contenido relativo de compuestos volátiles,
de azúcares y de aminoácidos en el fruto del tomate actuando a nivel
de SlDELLA.
El método consiste en utilizar variabilidad
natural o generada mediante mutágenos e identificar las variantes
mutadas mediante TILLING o similar. El TILLING (Targeting Induced
Local Lesions In Genomes) es una tecnología dirigida a la
identificación de mutantes en un gen de interés de secuencia
conocida y se aplica a todo tipo de organismos, desde plantas hasta
animales o bacterias (McCallum et al., 2000; Till et
al., 2004; Slade et al., 2005). Esta tecnología
proporciona una forma de obtener mutantes en un gen y en nuestro
caso se utilizó para encontrar mutantes en SlDELLA, ya que
sabíamos que el TILLING combina protocolos de mutagénesis con la PCR
y un método para detección de polimorfismos en el DNA.
Ello resulta en la identificación de formas
mutadas como las que se presentan en las Figuras de la 4 a la 11.
Algunas de las mutaciones son silenciosas, pero otras resultan en
cambios notables en el número de simpodios y en la composición de
estos incluyendo un mayor número de flores por simpodio. Aunque no
sabemos exactamente cuáles son los residuos más importantes para la
nueva función de interés, se entiende en general que aquellas
mutaciones que ocasionen cambios conservativos, es decir provocan un
cambio aminoacídico de por ejemplo un aminoácido hidrofóbico por
otro hidrofóbico, o uno ácido por otro ácido no resultan a menudo en
cambios sustanciales en la actividad de la proteína. Por otro lado,
cambios no conservativos como pueden ser un aminoácido ácido por un
básico o uno polar por uno hidrofóbico alteran de forma importante
la función. De especial importancia es que afecte la nueva función
alterando en menor medida otras funciones ya descritas como la
longitud del entrenudo o la fertilidad. La descripción de nuevas
mutaciones puede permitir definir mejor lo aminoácidos más
relevantes para cada caso.
En otro aspecto de la presente invención se
proporcionan mutaciones concretas (ver Figuras tabla 3, 4 y figura
12) que proporcionan cambios en el número y composición de los
simpodios alterando sólo levemente la longitud de los entrenudos u
otros aspectos del fenotipo.
Es posible, mediante la utilización de una
técnica de TILLING similar a la utilizada aquí, identificar nuevos
alelos que proporcionen intensidades de alteración del número de
simpodios y de composición de los mismos (incluido el número de
flores) que mejor se adapte a las necesidades o deseos del obtentor,
rastreando un número suficiente de mutantes y caracterizando dicha
colección.
Otros mutantes en DELLA afectados en esta nueva
función son también objeto de la presente invención.
También representan un aspecto de la presente
intención, cualquier célula, especialmente vegetal, que contenga la
construcción dirigida a modificar los niveles de expresión de DELLA
o que contenga mutantes puntuales en DELLA afectados en esta nueva
función.
La presente invención también comprende la
planta que comprenda dicha célula portadora de la construcción o de
la mutación en SlDELLA.
Además de la planta, la presente invención
proporciona cualquier clon de dicha planta, semilla de
autofecundación o híbrida y sus descendiente y cualquier parte de
ellos como esquejes, semillas, etc. que pueda ser utilizado para
propagar dicho material.
La presente invención también proporciona un
método para influenciar dicho nuevo fenotipo, como es el tratamiento
con GAs o activadores o inhibidores de su síntesis o mecanismo de
acción.
La presente invención también proporciona un
método para utilizar mutaciones de ganancia de función en DELLA
(supresiones en la proteína tipo mutante gai) para alterar el
fenotipo en el sentido contrario (disminuir el número de simpodios o
de flores por repetición simpodial).
De especial relevancia es que se proporciona un
método para aumentar el número de simpodios manteniendo (mutantes
puntuales o mayor nivel de represión) o no (alto nivel de represión
o mutantes nulos) el carácter determinado y el número de flores por
simpodio, lo que repercute en el número de frutos.
Debería de ser posible para cualquier persona
experimentada en el arte de introducir variaciones en esta
estrategia en la que la disminución en los niveles de DELLA o la
expresión de formas mutadas de DELLA se hiciera de forma inducible o
mediante promotores específicos. Por ejemplo las construcciones como
las indicadas arriba o versiones mutadas como las descritas
controladas por un promotor específico o inducible. Ello permitiría
afectar al número de simpodios y la composición de los frutos de
forma más dirigida.
Existen promotores específicos, así como
inducibles, que pueden ser muy útiles para realizar esas nuevas
aplicaciones y procedimientos de transformación para la mayor parte
de las plantas de cultivo y muchas ornamentales.
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Ejemplo
1
La secuencia codificante del gen SlDELLA
(SEQ ID No. 1 y 2) se colocó en orientación antisentido bajo el
control del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV) (ver esquema Figura 1) (La secuencia del cDNA de
SlDELLA ya se ha publicado y se ha utilizado en esta
construcción), y se introdujo en plantas de tomate (Solanum
lycopersicum UC82 sp/sp) mediante transformación mediada por
Agrobacterium siguiendo procedimientos establecidos (Ellul
et al. 2003). Se seleccionaron plantas homozigotas para el
transgen y se evaluó el tamaño de la planta a lo largo del tiempo,
el número de entrenudos y la longitud de estos, el número de hojas
hasta la primera inflorescencia, y la composición del metámero
simpodial, y los resultados se muestran en las Figuras 3, tablas
1
y 2.
y 2.
Las plantas UC82 (sp/sp) portadoras de la
mutación self-pruning en homozigosis
presentan el característico habito determinado, formando la primera
inflorescencia después de unas 10 hojas y terminando su crecimiento
tras producir 3 metámeros simpodiales. Las líneas transgénicas de
tomate UC82 (sp/sp) portadoras de la construcción asDELLA muestran
niveles disminuidos en SlDELLA (Figura 2) y un porte (hábito
de crecimiento) alterado (Figura 3, tablas 1 y 2). No sólo las
plantas son más altas por una mayor longitud de los entrenudos, sino
porque el crecimiento del brote principal no se detiene como en UC82
(sp/sp) tras tres metámeros simpodiales sino que continua
creciendo mediante la adición de nuevos unidades que depende de la
línea transgénica, desde 8 simpodios (línea asDELLA 24B) hasta
incluso adquirir crecimiento indeterminado (líneas asDELLA 5A y
7C).
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En la tabla 1 se observa la mayor altura de las
plantas transgénicas en relación a las silvestres, así como un
aumento en el número y longitud de sus entrenudos. Por otro lado se
comprueba que el tiempo de floración, medido como número de hojas
hasta la aparición de la primera inflorescencia, sólo se retrasa
algo en las plantas 5A. En cuanto a la composición de los metámeros,
se observa que en las plantas silvestres las inflorescencias
aparecen en hojas consecutivas y el crecimiento de la plantas se
detiene tras tres inflorescencias, mientras que en las asDELLA la
inflorescencia aparece cada 2 ó 3 hojas y continua formando
metámeros adicionales de forma indefinida cuando las silvestres ya
han dejado de crecer.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El cDNA correspondiente a SlDELLA (SEQ.
ID. No. 1 y 2) se aisló a partir de una genoteca de expresión en
Lambda ZAP de ovarios de tomate (Solanum lycopersicum L. vc
Rutger) emasculados un día antes de la antesis. El gen
SlDELLA se rastreo a partir de las colonias obtenidas (40000)
de la genoteca de expresión utilizando como sonda la región
codificante completa (cDNA) (1750 pb) del gen mutado gaidel de
Arabidopsis thaliana (Atgaidel). La hibridación de los
filtros de nitrocelulosa obtenidos de las placas de lisis se realizó
a 46ºC durante 6 h. Los filtros de nitrocelulosa se lavaron dos
veces con 2 x SSC, 0.1% SDS a temperatura ambiente durante 5 min y
una vez con 0.1 x SSC, 0.1% SDS a 46ºC durante 22 minutos. Se
obtuvieron 15 clones positivos correspondientes todos al mismo gen,
aislándose y secuenciándose el más largo de ellos (2389 pb). Este
clon contenía una ORF de 1764 pb capaz de sintetizar una proteína de
588 aminoácidos con un peso molecular de 64,45 KDa y un punto
isoeléctrico teórico de 5.07. La comparación de la secuencia
proteica deducida con las existentes en los bancos de datos, mostró
que el clon aislado era un ortólogo en tomate de los genes
DELLA.
Posteriormente, el gen se clonó en dirección
antisentido en el plásmido pBINJIT60 bajo el control del promotor
35S del virus del mosaico del tabaco (35S::SlDELLAas). El plásmido
binario, pBINJIT60, se utilizó para la obtención de plantas
transgénicas de Lycorpersicon esculentum mediante
transformación con Agrobacterium tumefaciens. Este plásmido
está construido a partir del "casette" del plásmido pJIT60, que
aporta el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV)
con el "enhancer" duplicado (2x35S), el sitio de clonación
múltiple del pUC9 y la secuencia de poliadenilación del CaMV, [CaMV
poli (A)+] (Guerineau et al., 1992), extraído como fragmento
KpnI y XhoI, y subclonado en los sitios KpnI y SalI del plásmido
binario pBIN19. El pBIN19 contiene el gen NPTII, que confiere
resistencia a la kanamicina, fusionado al promotor y al terminador
de la nopalina sintetasa (pnos y tnos), incluido en el
T-DNA (Bevan, 1984). El vector resultante pBINJIT
posee un tamaño de 13,2 kb aproximadamente y presenta como sitios
únicos de clonaje SalI, BamHI y SmaI. Para clonar asDELLA en
antisentido en este vector, se amplifico mediante PCR su secuencia
genómica completa utilizando los oligonucleótidos TGxC7
(5'-CCAG
CACTTGTCATTCTTACC-3' SEQ. ID. No. 13) y TGxC8 (5'-CATCTCTCTCATTGTCTCTTCC-3' SEQ. ID. No. 14). El producto de 1800 pb se digirió con EcoRV y subclonó en el vector pBSK, eligiéndose aquellos clones en los que SlDELLA se había clonado en antisentido para subclonarlo en el vector binario pBINJIT?O utilizando los sitios SmaI/
SalI.
CACTTGTCATTCTTACC-3' SEQ. ID. No. 13) y TGxC8 (5'-CATCTCTCTCATTGTCTCTTCC-3' SEQ. ID. No. 14). El producto de 1800 pb se digirió con EcoRV y subclonó en el vector pBSK, eligiéndose aquellos clones en los que SlDELLA se había clonado en antisentido para subclonarlo en el vector binario pBINJIT?O utilizando los sitios SmaI/
SalI.
Con el fin de reducir los niveles endógenos de
SlDELLA, esta construcción fue introducida en la cepa LBA4404
de Agrobacterium tumefaciens mediante electroporación para su
utilización posterior en la transformación de tomate a partir de
explantes de cotiledón (Ellul et al., 2003). Se
seleccionaron plantas homozigotas para el transgen y se comprobó,
mediante RT-PCR semicuantitativa, que efectivamente
mostraban disminución del nivel de expresión de SlDELLA
endógeno (Figura 2). En estas misma plantas se evaluó, a lo largo
del tiempo, su altura, el número de entrenudos y la longitud de
estos, el número de hojas hasta la primera inflorescencia, y la
composición del metámero simpodial. Los resultados se muestran en
las Figuras 3 y tablas 1 y 2.
\newpage
Ejemplo
2
Con objeto de identificar alelos mutados en el
gen SlDELLA que pudieran proporcionar diferentes intensidades
del nuevo fenotipo se utilizó una estrategia de TILLING.
El TILLING (Targeting Induced Local Lesions In
Genomes) es una tecnología dirigida a la identificación de mutantes
en un gen de interés de secuencia conocida y se aplica a todo tipo
de organismos desde plantas hasta animales o bacterias (McCallum
et al., 2000; Till et al., 2004; Slade et al.,
2005). Esta tecnología proporciona una forma de obtener mutantes en
un gen y en nuestro caso se utilizó para encontrar mutantes en
SlDELLA ya que sabíamos que el TILLING combina protocolos de
mutagénesis con la PCR y un método para detección de polimorfismos
en el DNA. Existen muchas formas de mutagenizar poblaciones y
diferentes formas de identificar mutantes puntuales en un conjunto
de materiales (Mccollum et al., 2004; Gady et al.,
2009) En nuestro caso el método TILLING combina la inducción de un
gran número de mutaciones puntuales al azar ocasionadas por el Ethyl
Methane Sulfonate (EMS) que produjo una población de 12,000 M2
familias en la variedad de tomate determinado M82 (Menda et
al., 2004). Se extrajo el DNA de cada una de las familias y se
combinó siguiendo una estrategia de 3D para disminuir el número de
reacciones de PCRs a realizar. Para el rastreo TILLING, el locus de
interés SlDELLA se amplificó de cada uno de los pools
mediante una PCR anidada y cebadores universales. La primera
amplificación PCR es una reacción estandar de PCR que utiliza
cebadores específicos del gen diana SlDELLA según se indica
en (Qiu et al., 2004). Para la reacción específica se
utilizaron los siguientes oligonucleótidos:
SlDELLA-ext-F1
5'cattctctaatggtgctgttttcttc3' (SEQ. ID. No. 15);
SlDELLA-ext-R1:
5'aggtagctataagtggccgtgtatg3' (SEQ. ID. No. 16);
SlDELLA-F1: 5'gaaaagtaagatttgggaagaaga3' (SEQ. ID.
No. 17); SlDELLA-R1 5'ctaaaagcatggaagcttgtttgaa3'
(SEQ. ID. No. 18). Las condiciones de amplificación fueron de 1 min
a 94ºC y 30 ciclos de (10 s a 94ºC, 20 s a 63ºC, 1 min a 72ºC) y 5
min a 72ºC cuando se utilizan los oligonucleótidos
SlDELLA-ext-R1 y
SlDELLA-ext-F1.
Se utilizó un microlitro de la primera PCR como
molde para una segunda reacción de amplificación PCR anidada,
utilizando una mezcla de oligonucleótidos específicos internos que
llevaban una cola de M13 universal, combinando con los cebadores de
M13 universales. M13F700 (CACGACGTTGTAAAACGAC; SEQ. ID. No. 19) y
M13R800 (GGATAACAATTTCACACAGG; SEQ. ID. No. 20), marcados en el
extremo 5' con marcas fluorescentes IRD700 e IRD800
(LI-COR®, Lincoln, Nebraska, USA), respectivamente.
Esta reacción de PCR se llevó a cabo utilizando cada cebador a la
concentración de 0.1 \muM, y el siguiente programa de ciclos en
dos pasos: 94ºC durante 2 min, 10 ciclos a 94ºC durante 15 s, una
temperatura de anillamiento de cebadores específicos durante 30 s y
72ºC durante 1 min, seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 15 s, 50ºC
durante 30 s y 72ºC durante 1 min, y al final una extensión de 5 min
a 72ºC.
La detección de mutaciones en productos de PCR
no purificados se llevó a cabo según se indica en Triques et
al., 2007, excepto que el extracto enzimático se utilizó a una
dilución de 1 a 10 000 y se cargaron 0.6 \mul de productos de la
digestión con ENDO1 en el gel de secuenciación. Los mutantes se
evidenciaron por ocupar una posición diferente en el gel de
secuenciación, y por deconvolución de las diferentes líneas
mezcladas en el pool. El mutante presente en el pool se confirmó
individualmente y la mutación se secuenció siguiendo procedimientos
estándar.
Sólo se presentan aquellas mutaciones
identificadas que suponen un cambio en la secuencia aminoacídica de
la proteína, destacando aquellas que dan cambio no conservado en el
aminoácido correspondiente (i.e. ácido por básico o prolina por
otro, etc.) y que es de esperar por tanto que resulten en una
alteración en el nuevo fenotipo descrito mediado por
SlDELLA.
Se identificaron de esa forma una serie de
alelos mutantes que tras su secuenciación resultaron presentar
alteraciones respecto a la secuencia de SlDELLA del cultivar
determinado M82 (SEQ. ID. No 11 y 12) denominados mutantes TILLING 1
(SEQ. ID. No 3 y 4), TILLING 2 (SEQ. ID. No 5 y 6), TILLING 3 (SEQ.
ID. No 7 y 8), y TILLING 4 (SEQ. ID. No 9 y 10) que se muestran en
las Figuras 4 a 7.
En el mutante TILLING 1 a nivel nucleotídico
(SEQ. ID. No. 3) existe una sustitución de guanina por adenina (en
el nucleótido 458) y a nivel aminoacidico (SEQ. ID. No. 4) existe
una sustitución de alanina portreonina (en el aminoácido 153).
En el mutante TILLING 2 a nivel nucleotídico
(SEQ. ID. No. 5) existe una sustitución de guanina por adenina (en
el nucleótido 1498) y a nivel aminoacidico (SEQ. ID. No. 6) existe
una sustitución de glutamina por lisina (en el aminoácido 500).
En el mutante TILLING 3 a nivel nucleotídico
(SEQ. ID. No. 7) existe una sustitución de citosina por timina (en
el nucleótido 994) y a nivel aminoacidico (SEQ. ID. No. 8) existe
una sustitución de leucina por fenilalanina (en el aminoácido
332).
En el mutante TILLING 4 a nivel nucleotídico
(SEQ. ID. No. 9) existe una sustitución de citosina por timina (en
el nucleótido 661) y a nivel aminoacidico (SEQ. ID. No. 10) existe
una sustitución de leucina por fenilalanina (en el aminoácido
221).
También se realizó un apilamiento de la
estructura primaria de la proteína SlDELLA para cada una de
las mutaciones junto con otras proteínas DELLA de otras especies
vegetales con el fin de ver el grado de conservación del aminoácido
mutado y en que región de la proteína se producía este (Figuras 8 a
11). Salvo en el mutante TILLING 1, todas las mutaciones se producen
en regiones muy conservadas de la proteína.
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Ejemplo
3
Para llevar a cabo un estudio del efecto que
sobre el fenotipo ocasionan las nuevas mutaciones obtenidas en
SlDELLA, se hizo un pequeño "mini breeding". Para ello, las
líneas portadoras de las diferentes mutaciones TILLING 1 (SEQ. ID.
No 3 y 4), TILLING 2 (SEQ. ID. No 5 y 6), TILLING 3 (SEQ. ID. No 7 y
8) y TILLING 4 (SEQ. ID. No 9 y 10) se autofecundaron y se
seleccionaron plantas descendientes que eran portadoras de la
mutación en homozigosis, heterozigosis o azigoticas. Dichos
materiales se caracterizaron a continuación.
Se hizo un seguimiento del hábito de crecimiento
de estas plantas y que se resume en las tablas 3 y 4. En dichas
tablas se muestra que las mutaciones en DELLA señaladas en la tabla
producen un fenotipo de planta de mayor altura y de crecimiento
semideterminado en comparación con su fondo silvestre que es
determinado.
En la Figura 12 se puede ver el aspecto general
de las plantas que llevan mutaciones puntuales en SlDELLA
identificadas por TILLING. Lo más destacable es que líneas presentan
un fenotipo que es básicamente el del fondo silvestre no modificado
UC82 excepto en el mayor número de repeticiones simpodiales que se
obtienen a partir de la primera inflorescencia, lo que resulta en un
mayor número de hojas e inflorescencias antes de detenerse el
crecimiento, lo que implica, según puede observarse, plantas de
mayor porte y, en consecuencia, mayor biomasa y número de
frutos.
frutos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez conocido tanto las secuencias genéticas
y aminoacídicas de los mutantes TILLING (SEQ. ID No
3-9), resultaría fácil para un experto en la materia
generar plantas transgénicas que contengan dichas mutaciones
empleando técnicas conocidas del estado de la técnica.
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Ejemplo
4
Una observación preliminar de los frutos de las
plantas asDELLA indicaba que el contenido en sólidos solubles
totales había aumentado en relación con los frutos de plantas no
modificadas. Con objeto de averiguar si los frutos asSlDELLA
tenían alterada la composición metabólica se analizaron el contenido
de compuestos volátiles y metabolitos primarios de frutos maduros de
las líneas asDELLA, tanto partenocárpicos como con semillas, y se
compararon con dos grupos de silvestres, un grupo de silvestres sin
tratar y el otro grupo de silvestres que habían sido tratados por
spray con una solución 10 uM de GA1+3.
Los metabolitos analizados tienen un efecto
determinante sobre las cualidades organolépticas y nutritivas del
tomate, ya que los compuestos volátiles son los responsables del
aroma, mientras que algunos de los metabolitos primarios analizados,
entre los que se incluyen los azúcares glucosa y fructosa, los
ácidos orgánicos cítrico, málico y succínico, y varios aminoácidos,
tienen una contribución decisiva sobre el sabor y el contenido
nutricional de los
frutos.
frutos.
\newpage
Los resultados indican un cambio en el contenido
tanto de metabolitos primarios como de aromas en las muestras
asDELLA, que puede imitarse mediante tratamiento de los frutos
silvestres con GAs, como se muestra más adelante. Esta nueva función
de SlDELLA y de las GAs en cambiar el perfil metabólico del fruto es
de interés para alterar las propiedades organolépticas del fruto.
Además, se analizó si el contener o no semillas alteraba el
contenido de metabolitos de los frutos asDELLA.
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El análisis de compuestos volátiles se realizó
básicamente utilizando el protocolo descrito en Zanor et al.,
2009, que se detalla a continuación. Para ello se recolectaron
frutos de tomate en el estadio rojo maduro. Se tomaron trozos del
pericarpo y se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido. Las
muestras congeladas se trituraron con un molinillo de café (Moulinex
de Luxe) y se guardaron a -80ºC hasta el momento del análisis. Este
mismo material se utilizó tanto para el análisis de compuestos
volátiles como de metabolitos primarios.
Previamente a su análisis se pesaron 0,5 g de
material en un vial de 7 ml y se incubó en baño de agua a 37ºC
durante 5 minutos, con el vial cerrado. Posteriormente se añadieron
0,5 ml de una solución EDTA 100 mM a pH 7,5 y 1,1 g de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O. Inmediatamente se cerró el vial de
nuevo, se agitó vigorosamente y se sonicó durante 5 minutos.
Finalmente, 1 ml de este extracto se llevó a un vial de espacio de
cabeza de 10 ml, sobre el cual se realizó el análisis. Los volátiles
se capturaron en el espacio de cabeza por microextracción en fase
sólida (SPME). La fibra utilizada tiene un recubrimiento de 65
\mum de polidimetilsiloxano-divinilbenceno
(PDMS/DVB) (SUPELCO). Los viales se atemperaron a 50ºC durante 10
minutos y, posteriormente, la fibra estuvo expuesta al, espacio de
cabeza, durante 20 minutos, a la misma temperatura. La adquisición
de volátiles en la fibra y posterior desorción se realizó de manera
automatizada con un CombiPAL (CTC Analytics).
Para la separación cromatográfica y la detección
de los volátiles adsorbidos a la fibra PDMS/DVB, estos se
desorbieron en el puerto de inyección a 250ºC de un cromatógrafo de
gases Agilent 6890N durante 1 minuto. Las condiciones
cromatográficas se describen a continuación. Gas portador: helio,
1,2 ml/min. Columna: DB-5 ms (60 m, 0,25 mm, 1
\mum) (J&W Scientific). Temperatura: 40ºC durante 2 min, rampa
de 5ºC/min hasta 260ºC y luego 260ºC durante 5 min. La detección se
realizó mediante un espectrómetro de masas Agilent 5975B en el modo
sean, en el rango de m/z 35-220, a 7 scans/s,
temperatura de la fuente de ionización 230ºC y energía de ionización
70 eV. Los cromatogramas se procesaron con el software MSD
ChemStation Enhanced Data Análisis (Agilent Technologies).
Los resultados (según se puede ver en la tabla
5) indican un cambio en el contenido de volátiles en las muestras
asDELLA que además puede imitarse mediante tratamiento de los frutos
silvestres con GAs. Los cambios observados en la asDELLA se
detectan tanto en los frutos con semillas (tamaño igual que el
Silvestre) como sin semillas (menor tamaño). Concretamente se
observa un aumento significativo de los volátiles que contribuyen
al aroma siguientes: beta-damascenona,
1-penten-3-ona y
(E)-2-hexenal, que poseen valores de
al menos el doble en las asDELLA o en las tratadas. Otros compuestos
como el 3-metilbutanol,
1-nitro-2-feniletano,
2-feniletanol, fenilacetaldehído y
2-isobutiltiazol disminuyeron de forma importante en los frutos modificados. Los descriptores olfativos asociados a cada uno de estos compuestos de forma individual se pueden ver en la tabla 6.
2-isobutiltiazol disminuyeron de forma importante en los frutos modificados. Los descriptores olfativos asociados a cada uno de estos compuestos de forma individual se pueden ver en la tabla 6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Otros compuestos volátiles que no parecen
contribuir al aroma del fruto pero que pueden tener otras funciones,
incluida la comunicación con otros organismos, se encuentran en
niveles diferentes y de forma estadísticamente significativa,tanto
en los frutos modificados asDELLA (con o sin semillas) como los
tratados con GAs (tabla 7). Los más afectados en este caso son el
2-metil-1-butanol y
2-metil-1-propanol,
que presentan niveles mucho menores. La importancia de dichos
cambios en la adaptación a las condiciones ambientales, etc. está
por esclarecer, pero muy probablemente afecte a la atracción o
repulsión de diferentes organismos hacia el fruto.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El análisis de metabolitos primarios se realizó
básicamente utilizando el protocolo descrito en
Roessner-Tunali et al., 2003, que se detalla
a continuación, utilizándose el mismo material vegetal descrito
anteriormente para el análisis de los elementos volátiles.
Para llevar a cabo el análisis, primero se
realizó la extracción de los metabolitos. Se pesaron aproximadamente
250 mg de material vegetal, se le añadieron 3 ml de metanol y 120
\mul de una solución del patrón interno ribitol (0,2 mg/ml en
agua), y se agitó vigorosamente en vórtex durante 20 s. Se
transfirió a un vial de vidrio de 5 ml, se cerró y se incubó en baño
de agua a 70ºC durante 15 min. Posteriormente se le añadieron 1,5 ml
de agua, se agitó en vórtex, y se centrifugó a 4000 rpm durante 15
min. Se tomaron 50 \mul del sobrenadante, se llevaron a un tubo de
polipropileno de 1,5 ml y se llevó a sequedad en un
speed-vac durante 12 horas, a temperatura
ambiente.
A continuación, los metabolitos extraídos se
derivatizaron del siguiente modo. Se adicionaron 60 \mul de una
solución de clorhidrato de O-metilhidroxilamina (30
mg/ml en piridina), y se mantuvo a 37ºC en agitación durante 2
horas. Tras un pulso de centrifugación, se añadieron 120 \mul de
N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida
(MSTFA) y 12 \mul de una mezcla de varios metilésteres de ácidos
grasos (800 ng/ml de cada uno en cloroformo), y se mantuvo a 37ºC,
en agitación, durante 30 min. Finalmente, se transfirió a un vial GC
de 2 ml con inserto de 200 \mul, desde el cual se realizó la
inyección.
Para realizar la separación cromatográfica y la
detección, se inyectó 1 \mul del extracto en el puerto de
inyección a 230ºC de un cromatógrafo de gases Agilent 6890N. Se
realizaron dos inyecciones de cada extracto: una con split 1:20 para
la determinación de los metabolitos más abundantes (fructosa y
glucosa), y otra splitless para el resto de los metabolitos. Las
condiciones cromatográficas se describen a continuación. Gas
portador: helio, 2 ml/min. Columna BPX35 (30 m, 0,32 mm, 0,25
\mum) (SGE). Temperatura: 85ºC durante 2 min, rampa de 15ºC/min
hasta 360ºC.
La detección se llevó a cabo mediante un
espectrómetro de masas PEGASUS 4D (LECO), en el rango de m/z
40-600, a 6,25 scans/s, temperatura de la fuente de
ionización 200ºC y energía de ionización 70 eV. Se aplicó un solvent
delay de 150 s.
Para analizar los datos, los cromatogramas se
procesaron con el software ChromaTOF-GC v3.32
(LECO). Las áreas obtenidas para cada compuesto se corrigieron
respecto al patrón interno y al peso fresco exacto de cada
muestra.
Los resultados (según se puede ver en la tabla
8) indican que los frutos asDELLA, tanto los partenocárpicos como
los que tienen semillas, contienen niveles incrementados de
sacarosa, así como de los aminoácidos tirosina, asparagina,
isoleucina, treonina y prolina, entre otros metabolitos. El efecto
sobre la acumulación de estos compuestos en los frutos asDELLA puede
obtenerse en parte mediante el tratamiento con 10 uM GA1+3.
Esta nueva función de SlDELLA y de las
GAs consistente en alterar el perfil metabólico del fruto es de
interés, ya que permite modificar las propiedades organolépticas y
nutricionales del fruto.
\bulletAchard P. Vriezen W. H.
Van Der Straeten D. and Harberd N. P. (2003)
Ethylene regulates Arabidopsis development via the modulation of
DELLA protein growth repressor function. Plant Cell 15:
2816-2825.
\bulletAchard P. Cheng, H. De
Grauwe L. Decat J. Schoutteten H. Moritz
T. Van der Straeten D. Peng J. R. and Harberd
N. P. (2006) Integration of plant responses to
environmentally activated phytohormonal signals. Science 311:
91-94.
\bulletBevan M. (1984).
Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.
Nucleic Acids Res. 12:8711-21.
\bulletCarmel-Goren L.
Liu Y. S. Lifschitz E. Zamir D (2003)
The SELF-PRUNING gene family in tomato.
Plant Molecular Biology 52: 1215-1222.
\bulletGubler F. Chandler P. M.
White R. G. Llewellyn D. J. Jacobsen J. V.
(2002) Gibberellin signaling in barley aleurone cells.
Control of SLN1 and GAMYB expression. Plant Physiol. 129:
191-200.
\bulletDill A. Jung H. S. y
Sun T. P. (2001) The DELLA motif is essential for
gibberellin-induced degradation of RGA. Proc.
Natl Acad. Sci. USA 98: 14162-14167.
\bulletDill, A., Thomas, S. G.,
Hu, J., Steber, C. M., and Sun, T.-P.
(2004). The Arabidopsis F-box protein
SLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for
gibberellin-induced degradation. Plant Cell
16: 1392-1405.
\bulletDoebley J. (2006).
Unfallen grains: how ancient farmers turned weeds into crops.
Science 312: 1318-1319.
\bulletEllul P.
Garcia-Sogo B. Pineda B. Rios
G. Roig L. and Moreno V. (2003) The ploidy
level of transgenic plants in Agrobacterium mediated transformation
of tomato cotyledons (Lycopersicon esculentum Mili.) is
genotype and procedure dependent. Theor. Appl. Genet. 106,
231-238
\bulletEshed Y. Zamir D.
(1995). An introgression line population of Lycopersicon
pennellii in the cultivated tomato enables the identification
and fine mapping of yield-associated QTL. Genetics
141: 1147-1162.
\bulletFoucher F. Morin J.
Courtiade J. Cadioux S. Ellis N.
Banfield M. J. Rameau C. (2003). DETERMINATE
and LATE FLOWERING are two TERMINAL FLOWER1/CENTRORADIALIS homologs
that control two distinct phases of flowering initiation and
development in pea. Plant Cell 15:
2742-2754.
\bulletFriedland W. H. Barton
A. (1975). Destalking the wily tomato: a case study in social
consequences in California agricultural research. Research
Monograph No. 15. Dept. of Applied Behavioral Sciences,
University of California, Davis, California, USA.
\bulletFu X. D. y Harberd N. P.
(2003) Auxin promotes Arabidopsis root growth by modulating
gibberellin response. Nature 421:
740-743.
\bulletAntoine L F Gady,
Freddy W K Hermans, Marion H B J Van de
Wal, Eibertus N van Loo, Richard G F
Visser and Christian W B Bachem (2009).
Implementation of two high through-put techniques in
a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated
plant populations. Plant Methods 5:13 doi:
10.1186/1746-4811-5-13.
\bulletGuerineau F, Lucy A,
Mullineaux P. (1992). Effect of two consensus
sequences preceding the translation initiator codon on gene
expression in plant protoplasts. Plant Mol Biol.
18:815-8.
\bulletHanna G. C. Gentle A.
Smith P. G. Lippe L. F. Davis G. N.
McCoy D. N.(1964). Recently developed vegetables aid
mechanical cultivation. California Agriculture 18:
8-10.
\bulletItoh, H.,
Ueguchi-Tanaka, M., Sato, Y.,
Ashikari, M. and Matsuoka, M. (2002). The
gibberellin signaling pathway is regulated by the appearance and
disappearance of SLENDER RICE1 in nuclei. Plant Cell, 14,
57-70.
\bulletCari M. Jones, Charles
M. Rick, Dawn Adams, Judy Jernstedt and Roger T.
Chetelat (2007). Genealogy and fine mapping of
obscuravenosa, a gene affecting the distribution of
chloroplasts in leaf veins, and evidence of selection during
breeding of tomatoes (Lycopersicon esculentum, Solanaceae).
Am. J. Botany 94: 935-947.
\bulletKoornneef M. Elgersma A.
Hanhart C. J. van Loenen-Martinez E.
P. van Ring L. and Zeevaart J. A. D. (1985). A
gibberellin insensitive mutant of Arabidopsis thaliana.
Physiol. Plant 65: 33-39.
\bulletKrebs A. V. (2005).
La Causa: the word was made flesh. Website
http://www.farmworkermovement.orQ/essavs/
essavs/KREBS%20MANUSCRIPT%20LA%20CAUSA.pdf
essavs/KREBS%20MANUSCRIPT%20LA%20CAUSA.pdf
\bulletLee S. C. Cheng H.
King K. E. Wang W. F. He Y. W. Hussain
A. Lo J. Harberd N. P. y Peng, J. R.
(2002) Gibberellin regulates Arabidopsis seed germination via
RGL2, a GAI/RGA-like gene whose expression is
up-regulated following imbibition. Genes Dev.
16: 646-658.
\bullet Cristina Marti, Diego
Orzáez, Philippe Ellul, Vicente Moreno, Juan
Carbonell y Antonio Granell, (2007). Silencing
of DELLA induces facultative parthenocarpy in tomato fruits. The
Plant Journal 52: 865-876.
\bulletMcCallum C M, Comai L,
Greene E A, Henikoff S: Targeting induced local
lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics
(2000). Plant Physiol.
123(2):439-442.
\bulletMenda N, Semel Y,
Peled D, Eshed Y, Zamir D.(2004) In
silico screening of a saturated mutation library of tomato.
Plant J. Jun; 38(5):861-72.
\bulletMurase K. Hirano Y.
Sun t-P. y Hakoshima T. (2008).
Gibberellin-induced DELLA recognition by the
gibberellin receptor GID1. Nature 456:
459-464.
\bulletOh E, Yamaguchi S,
Hu J, Yusuke J, Jung B, Paik I,
Lee H S, Sun T P, Kamiya Y, Choi G.
(2007) PIL5, a phytochrome-interacting bHLH
protein, regulates gibberellin responsiveness by binding directly
to the GAI and RGA promoters in Arabidopsis seeds. Plant
Cell 19: 1192-1208.
\bulletPeng J. and Harberd P.
(1993). Derivative alleles of the Arabidopsis
gibberellin-insensitive (gai) mutación confer
a wild-type phenotipe. Plant Cell. 5:
351-360.
\bulletPeng J. Richard D. E.
Hartley N. M. Murphy G. P. Devos K. M.
Flitntham J. E. et al. (1999). "Green
Revolution" genes encode mutant gibberellin response modulators.
Nature 400: 256-261.
\bulletPeng J. R. Carol P.
Richards D. E. King K. E. Cowling R. J.
Murphy G. P. y Harberd N. P. (1997). The
Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively
regulates gibberellin responses. Genes Dev. 11:
3194-3205.
\bulletPnueli L.
Carmel-Goren L. Hareven D.
Gutfinger T. Alvarez J. Ganal M. Zamir
D. Lifschitz E. (1998). The
SELF-PRUNING gene of tomato regulates
vegetative to reproductive switching of sympodial meristems and is
the ortholog of CEN and TFL1. Development 125:
1979-1989.
\bulletPnueli L. Gutfinger T.
Hareven D. Ben-Naim O. Ron N.
Adir N. Lifschitz E. (2001). Tomato
SP-interacting proteins define a conserved signaling
system that regulates shoot architecture and flowering. Plant
Cell 13: 2687-2702.
\bulletQiu P. Shandilya H.
D'Alessio J M. O'Connor K. Durocher J.
Gerard G F. (2004) Mutation detection using Surveyor
nuclease. Biotechniques
36(4):702-707.
\bulletRichards D. E., King K.
E., Ait-ali T., y Nicholas P
Harberd. (2001). How gibberellin regulates plant
growth and development: A Molecular Genetic Analysis of Gibberellin
Signaling. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
52:67-88.
\bulletRoessner-Tunali
U, Hegemann B, Lytovchenko A, Carrari F,
Bruedigam C, Granot D and Fernie A R.
(2003). Metabolic Profiling of Transgenic Tomato Plants
Overexpressing Hexokinase Reveals That the Influence of Hexose
Phosphorylation Diminishes during Fruit Development. Plant
Physiology 133:84-99.
\bulletSilverstone A. L.
Ciampaglio Ch. N. Sun T.-p. (1998). The
Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing
the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell, 10:
155-169.
\bulletSilverstone, A. L.,
Jung, H-S., Dill, A., Kawaide,
H., Kamiya, Y., and Sun, T-p.
(2001). Repressing a repressor:
Gibberellin-induced rapid reduction of the RGA
protein in Arabidopsis. Plant Cell. 13:
1555-1565.
\bulletSlade A J, Knauf V C:
TILLING moves beyond functional genomics into crop improvement.
(2005). Transgenic Res.
14(2):109-115.
\bulletSmith B. (1998)
Foreword, Livingston and the tomato. Ohio State University
Press, Columbus, Ohio, USA.
\bulletStevens M. A. Rick C. M.
(1986). Genetics and breeding. In J. G. Atherton, J.
Rudich [eds.] The tomato crop: a scientific basis for
improvement, 35-105. Chapman and Hall, New
York, New York, USA.
\bulletSzymkowiak E. J. Irish
E. E. (2006). JOINTLESS suppresses sympodial identity
in inflorescence meristems of tomato. Planta 223:
646-658.
\bulletTill B J, Reynolds S H,
Weil C, Springer N, Burtner C, Young K,
Bowers E, Codorno C A, Enns L C, Odden A
R. (2004). Discovery of induced point mutations in maize
genes by TILLING. BMC Plant Biol 4(1):12.
\bulletTriques K, Sturbois B,
Gallais S, Dalmais M, Chauvin S, Clepet
C, Aubourg S, Rameau C, Caboche M,
Bendahmane A. (2007). Characterization of
Arabidopsis thaliana mismatch specific endonucleases:
application to mutation discovery by TILLING in pea. Plant
J., 51 (6): 1116-1125.
\bulletUeguchi-Tanaka,
M., Nakajima, M., Motoyuki, A., and Matsuoka,
M. (2007). Gibberellin receptor and its role in gibberellin
signaling in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 58:
183-198.
\bulletUeguchi-Tanaka
M. Hirano K. Hasegawa Y. Kitano H. y
Matsuoka M. (2008). Release of the repressive activity
of rice DELLA proteína SLR1 by gibberellin does not require SLR1
degradationn in the gid2 mutant. Plant Cell 20:
2437-2446.
\bulletWen C. K. y Chang C.
(2002) Arabidopsis RGL1 encodes a negative regulator of
gibberellin responses. Plant Cell 14:
87-100.
\bulletWilson R. N. and Chris
R. Somerville (1995) Phenotypic Suppression of the
Gibberellin-Insensitive Mutant (gai) of
Arabidopsis. Plant Physiol. (1995) 108:
495-502.
\bulletYeager A. F. (1927).
Determinate growth in the tomato. Journal of Heredity 28:
263-265.
\bulletZanor M I, Rambla J L,
Chaib J, Steppa A, Medina A, Granell A,
Fernie AR, Causse M., (2009). Metabolic
characterization of loci affecting sensory attributes in tomato
allows an assessment of the influence of the levels of primary
metabolites and volatile organic contents. Journal of
Experimental Botany 60: 2139-2154.
<110> Universidad Politécnica de Valencia
y Consejo Superior de Investigaciones Científicas
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> ALTERACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LA
PROTEÍNA DELLA U ORTÓLOGA PARA PARA ALTERAR EL PATRÓN DE CRECIMIENTO
DE LAS PLANTAS Y EL CONTENIDO DE METABOLITOS DEL FRUTO
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<130> Gen SlDELLA
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1767
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SlDELLA Rutgers
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> SlDELLA Rutgers
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1767
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Mutante TILLING 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante TILLING 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 1773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante TILLING 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante TILLING 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante TILLING 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante TILLING 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante TILLING 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante TILLING 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1767
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SlDELLA M82 Det
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SlDELLA M82 Det
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótidos TGxC7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagcacttg tcattcttac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótidos TGxC8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatctctctc attgtctctt cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
SlDELLA-ext-F1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattctctaa tggtgctgtt ttcttc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
SlDELLA-ext-R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtagctat aagtggccgt gtatg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
SlDELLA-F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaaagtaa gatttgggaa gaaga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
SlDELLA-R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaaaagcat ggaagcttgt ttgaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebadores M13F700
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgacgttg taaaacgac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador M13R800
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggataacaat ttcacacagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (45)
1. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga
caracterizada porque la alteración en la expresión de la
proteína DELLA produce una inhibición en la represión del desarrollo
y crecimiento de las plantas en comparación a plantas
correspondientes no modificadas genéticamente.
2. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 1, caracterizada porque dicha alteración se
obtiene mediante silenciamiento del gen SlDELLA u ortólogo.
3. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 2, caracterizada porque el silenciamiento se
obtiene empleando una construcción génica que se basa en una copia
antisentido del gen - SlDELLA controlada por el promotor
2XCaMV35S.
4. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 1, caracterizada porque dicha alteración se
obtiene mediante mutación del gen SlDELLA u ortólogo.
5. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 4, caracterizada porque la mutación en la
secuencia genética de SlDELLA se debe a adición y/o inserción y/o
supresión y/o sustitución de uno o más nucleótidos de gen SlDELLA u
ortólogo.
6. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste
en la sustitución del nucleótido guanina por el nucleótido adenina
en el nucleótido 458.
7. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 6, caracterizada porque la mutación en la
secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 1 (SEQ ID No
3).
8. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste
en la sustitución del nucleótido guanina por el nucleótido adenina
en el nucleótido 1498.
9. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 8, caracterizada porque la mutación en la
secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 2 (SEQ ID
No.5).
10. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste
en la sustitución del nucleótido citosina por timina en el
nucleótido 994.
11. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 10, caracterizada porque la mutación en la
secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 3 (SEQ ID
No.7).
12. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste
en la sustitución del nucleótido citosina por timina en el
nucleótido 661.
13. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 12, caracterizada porque la mutación en la
secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 4 (SEQ ID
No.9).
14. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicaciones 1 a 13 caracterizada porque la planta exhibe
un patrón de crecimiento simpodial.
15. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque el patrón de
crecimiento simpodial determinado se modifica a indetermi-
nado.
nado.
16. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque el patrón de
crecimiento simpodial determinado se modifica a semidetermi-
nado.
nado.
17. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicaciones 1 a 13 caracterizada porque el contenido de
metabolitos y/o algunas sustancias volátiles y/o no asociadas al
aroma de los frutos se ve aumentado respecto a plantas
correspondientes no modificadas genéticamente.
18. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicaciones 1 a 13 caracterizada porque el contenido de
algunas sustancias volátiles asociadas y/o no asociadas al aroma de
los frutos se ve reducido respecto a plantas correspondientes no
modificadas genéticamente.
19. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 17 caracterizada porque el aumento en el
contenido dejos metabolitos sacarosa, tirosina, asparagina,
isoleucina, treonina, prolina, ácido piroglutámico y
mio-inositol es del orden del
100-400%, y/o el de fructosa y glucosa es del orden
del 10-30%, y/o el de las sustancias volátiles
asociadas al aroma de los frutos
E-2-hexenal,
1-penten-3-ona y
\beta.damascenona es del orden del 100-200%, y/o
el de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos
ácido 3-metilbutanoico,
E,E-2,4-decadienal y
E-2-octenal es del orden del
100-200% respecto de plantas correspondientes no
modificadas genéticamente.
20. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 18 caracterizada porque la disminución en el
contenido de las sustancias volátiles asociadas al aroma de los
frutos 3-metilbutanol,
1-nitro-2-feniletano,
2-feniletanol, fenilacetaldehído y
2-isobutiltiazol es del orden del
80-90%, y/o la de las sustancias volátiles no
asociadas al aroma de los frutos geranilacetona, terpineol,
linalool, bencil alcohol, eugenol, benzilnitrilo,
2-metil-1-butanol y
2-metil-1-propanol
es del orden del 50-100% respecto de plantas
correspondientes no modificadas genéticamente.
21. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicaciones 1 a 20 caracterizada porque la planta tiene
un interés comercial y/o agrícola.
22. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 21 caracterizada porque dicha planta se
selecciona del grupo de las solanaceas, cucurbitáceas, orquidáceas
y/o leñosas.
23. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 22 caracterizada porque la planta pertenece a
la familia de las Solanáceas.
24. Planta genéticamente modificada con la
expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según
reivindicación 23 caracterizada porque la planta
genéticamente modificada es una planta de tomate, Solanum
lycopersicum.
25. Fruto de la planta genéticamente modificada
según reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque el
contenido de metabolitos y/o sustancias volátiles asociadas y/o no
asociadas al aroma de los frutos está aumentado respecto a los
frutos de plantas correspondientes no modificadas genéticamente.
26. Fruto de la planta genéticamente modificada
según reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque el
contenido de algunas sustancias volátiles asociadas y/o no asociadas
al aroma de los frutos está reducido respecto a los frutos de
plantas correspondientes no modificadas genéticamente.
27. Fruto de la planta genéticamente modificada
según reivindicación 25 caracterizado porque aumento del
contenido de metabolitos sacarosa, tirosina, asparagina, isoleucina,
treonina, prolina, ácido piroglutámico y
mio-inositol es del orden del
100-400%, y/o el de fructosa y glucosa es del orden
del 10-30%, y/o el de las sustancias volátiles
asociadas al aroma de los frutos
E-2-hexenal,
1-penten-3-ona y
\beta.damascenona es del orden del 100-200%, y/o
el de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos
ácido 3-metilbutanoico,
E,E-2,4-decadienal y
E-2-octenal es del orden del
100-200% respecto a los frutos de plantas
correspondientes no modificadas genéticamente.
28. Fruto de la planta genéticamente modificada
según reivindicación 26 caracterizado porque la disminución
de las sustancias volátiles asociadas al aroma de los frutos
3-metilbutanol,
1-nitro-2-feniletano,
2-feniletanol, fenilacetaldehído y
2-isobutiltiazol es del orden del
80-90%, y/o la de las sustancias volátiles no
asociadas al aroma de los frutos geranilacetona, terpineol,
linalool, bencil alcohol, eugenol, benzilnitrilo,
2-metil-1-butanol y
2-metil-1-propanol
es del orden del 50-100% respecto a los frutos de
plantas correspondientes no modificadas genéticamente.
29. Fruto según reivindicaciones
25-28 caracterizado porque el fruto es el
tomate.
30. Semilla de la planta genéticamente
modificada según reivindicaciones 1 a 29 caracterizada porque
la expresión de la proteína DELLA se encuentra alterado.
31. Procedimiento de obtención de plantas
genéticamente modificadas con la expresión alterada de la proteína
DELLA u ortóloga caracterizado porque comprende las etapas
siguientes:
- a)
- transformar el genoma de una célula de la planta,
- b)
- regenerar la planta a partir de la célula de la etapa a),
- c)
- obtener semillas de las planta transformada que contengan el genoma modificado y,
- d)
- crecer al menos una de las semillas de la etapa c) para obtener una planta que contenga la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga.
\vskip1.000000\baselineskip
32. Procedimiento según reivindicación 31
caracterizado porque la etapa a) consiste en una mutagénesis
dirigida.
33. Procedimiento según reivindicación 32
caracterizado porque la mutagénesis dirigida consiste en
silenciar el gen SlDELLA.
34. Procedimiento según reivindicación 33
caracterizado porque para el silenciamiento de la etapa a) se
emplea la construcción génica asDELLA.
35. Procedimiento según reivindicación 34
caracterizado porque la construcción génica se basa en una
copia antisentido del gen SlDELLA controlada por el promotor
2XCaMV35S.
36. Procedimiento según reivindicación 32
caracterizado porque la mutagénesis dirigida de la etapa a)
consiste en modificar la secuencia nativa del gen SlDELLA a la
secuencia del gen SlDELLA mutado seleccionado del grupo de las
mutaciones denominadas TILLING 1 (SEQ ID No 3), TILLING 2 (SEQ ID No
5), TILLING 3 (SEQ ID No 7), o TILLING 4 (SEQ ID No 9).
37. Procedimiento según reivindicación 31
caracterizado porque la etapa b) es opcional.
38. Procedimiento según reivindicación 37
caracterizado porque la etapa b) se realiza mediante
transformación mediada por Agrobacterium.
39. Procedimiento según reivindicación 31
caracterizado porque la etapa a) consiste en una mutagénesis
no dirigida que comprende las siguientes etapas:
- i.
- exponer la planta a un agente mutagénico,
- ii.
- extraer el DNA de cada una de las familias y combinar siguiendo una estrategia 3D,
- iii.
- rastrear el gen SlDELLA en cada familia mediante PCR anidada y cebadores específicos y universales,
- iv.
- detectar los alelos mutantes de SlDELLA por secuenciación y deconvolución.
\vskip1.000000\baselineskip
40. Procedimiento según reivindicación 39
caracterizado porque el agente mutagénico de la etapa i) es
etilmetanosulfonato.
41. Procedimiento según la reivindicación 39
caracterizado porque en la etapa (iv) se seleccionaron 4
formas alélicas de SlDELLA.
42. Procedimiento según las reivindicaciones 39
a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4
formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 1 (SEQ ID
No.3).
43. Procedimiento según las reivindicaciones 39
a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4
formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 2 (SEQ ID
No.5).
44. Procedimiento según las reivindicaciones 39
a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4
formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 3 (SEQ ID
No.7).
45. Procedimiento según las reivindicaciones 39
a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4
formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 4 (SEQ ID
No.9).
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200902130A ES2364932B1 (es) | 2009-11-07 | 2009-11-07 | Alteración en la expresión de la proteína della u ortóloga para alterar el patrón de crecimiento de las plantas y el contenido de metabolitos del fruto. |
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN104558132B (zh) * | 2015-01-14 | 2018-06-19 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 花生della基因家族及其编码基因与应用 |
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-
2010
- 2010-11-05 WO PCT/ES2010/070719 patent/WO2011054998A2/es active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BASSEL GW., ET AL. Procera is a putative DELLA mutant in tomato (Solanum lycopersicum): effects on the seed and vegetative plant. 2008. Journal of Experimental Botany. Vol.59, No.3, páginas 585-593. Páginas 585-588. * |
| DAVIERE J-M., ET AL. Transcriptional factor interaction: a central step in DELLA function.2008. Current Opinion in Genetics & Development. Vol.18, páginas 295-303. Página 295. * |
| IZQUIERDO RM. Ingeniería genética y transferencia génica. Ediciones Pirámide 2001. Páginas 164-166, 298. * |
| MARTÍ C., ET AL. Silencing of DELLA induces facultative parthenocarpy in tomato fruits.2007. The Plant Journal. Vol.52, páginas 865-876. Página 867. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11555195B2 (en) | 2017-09-18 | 2023-01-17 | Futuragene Israel Ltd. | Tissue-specific expression control of DELLA polypeptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| WO2011054998A3 (es) | 2011-07-07 |
| ES2364932B1 (es) | 2012-08-08 |
| WO2011054998A2 (es) | 2011-05-12 |
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