ES2879599T3 - Plantas tolerantes a la sequía - Google Patents

Abstract

Una planta no transgénica de la especie Solanum lycopersicum que comprende un alelo SlPP2C1 (proteína serina/treonina fosfatasa 2C de Solanum lycopersicum ) en su genoma, donde un alelo SlPP2C1 es un alelo que codifica una proteína que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2, caracterizada porque dicho alelo SlPP2C1 comprende una o más mutaciones en su secuencia de nucleótidos y por lo que, como resultado de dichas una o más mutaciones, la planta que comprende dicho alelo mutante en su genoma tiene una tolerancia a la sequía significativamente mayor en comparación con la planta que comprende un alelo SlPP2C1 de tipo salvaje en su genoma.

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas tolerantes a la sequía

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología vegetal y la reproducción de plantas. Se proporcionan plantas tolerantes a la sequía, especialmente especies vegetales tolerantes a la sequía tal como el tomate (Solanum lycopersicum), y procedimientos para elaborar plantas genéticamente modificadas o mutantes tolerantes a la sequía. La invención proporciona un nuevo gen, denominado SIPP2C1, que codifica la proteína S1PP2C que es un regulador negativo de la respuesta al ácido absísico (ABA). La regulación a la baja, el knock-out o el silenciamiento del gen SlPP2C1 hace que las plantas tengan una tolerancia a la sequía significativamente mayor. También se proporcionan plantas, semillas, frutos y partes de plantas, que comprenden un alelo mutante SlPP2C1 en su genoma y que tienen una tolerancia a la sequía significativamente mayor. En otra realización se proporcionan procedimientos para elaborar plantas tolerantes a la sequía que comprenden uno o más alelos mutantes de SlPP2C1 en su genoma.

Antecedentes de la invención

La fitohormona ácido abscísico (ABA) es importante para la regulación de las respuestas al estrés abiótico (tal como sequía, salinidad, choque de frío, heridas, ataque de patógenos) y el desarrollo y la latencia de las semillas. La búsqueda de mutantes con respuestas alteradas al estrés abiótico o a la latencia de las semillas se ha utilizado con frecuencia y ha dado lugar a la identificación de genes importantes para la biosíntesis del ABA y la transducción de señales del ABA. A través de esta búsqueda se han identificado los mutantes de Arabidopsis insensibles al ABA abi1-1 y abi2-1 (Koornneef et al. 1984, Physiol Plantarum 61: 377-383).

La clonación y caracterización del gen AtABI1 reveló que codifica una proteína serina/treonina fosfatasa tipo 2C (PP2C, Leung et al. 1994, Science 264: 1448-1452 Meyer et al. 1994, Science 264: 1452-1455). AtABI2 también codifica una proteína fosfatasa tipo 2C. Los mutantes abi1-1 y abi2-1 presentan mutaciones en los genes AtABI1 y AtABI2 , que dan lugar a sustituciones idénticas de Gly a Asp en posiciones equivalentes (Leung et al. 1997, Plant Cell 9: 759-771). Se ha demostrado que ambos mutantes tienen una actividad fosfatasa reducida (Bertauche et al. 1996, Eur J Biochem 241: 193-200; Leung et al. 1997, supra), lo que sugeriría que AtABI1 y AtABI2 son reguladores positivos de la sensibilidad al ABA. Sin embargo, la sobreexpresión constitutiva de AtABI1 inhibió la acción de ABA en los protoplastos de maíz, y los mutantes de reducción de función de AtABI1 y AtABI2 demostraron tener respuestas hipersensibles al ABA (Scheen 1998, PNAS 95:975-980 Gosti et al. 1999, Plant Cell 11: 1897­ 1909 ; Merlot et al. 2001, Plant J 25:295-303). En conjunto, se concluyó que AtABI1 y AtABI2 son reguladores negativos de la respuesta a ABA. El mecanismo exacto por el que las mutaciones en abi1-1 y abi2-1 inducen la insensibilidad al ABA es aún desconocido, aunque podría estar relacionado con la localización nuclear preferente de las proteínas mutadas (Moes et al. 2008, Plant J 54: 806-819). AtABI1 y AtABI2 son importantes para la latencia de las semillas, pero también para el crecimiento de las plántulas y la regulación de la apertura estomática, lo que sugiere que estas proteínas actúan antes de los principales puntos de ramificación que controlan las cascadas de señalización de ABA específicas de cada tejido (Leung et al. 1997, supra).

Se han identificado 76 PP2Cs en Arabidopsis, de los cuales un subgrupo PP2C-A), que consta de nueve genes, se ha asociado con la transducción de señales de ABA (Schweighofer et al. 2004, Trends in Plant Science Vol 9: 236­ 243). También se encontró que varios de los genes de Arabidopsis pertenecientes a este grupo codifican reguladores negativos de la respuesta al ABA. Por ejemplo, AtP2C-HA (Rodríguez et al. 1998, Plant Mol Biol 38: 879-883) (también llamado AtHAB1, Saez et al. 2004, Plant J 37: 354-369) es un represor de la vía de señalización del ABA que regula numerosas respuestas al ABA, tal como el cierre estomático, la germinación de semillas y la inhibición del crecimiento vegetativo. También HAB2 parece tener un papel regulador similar. AtPP2CA (Kuhn et al.

2006, Plant Physiol 140:127-139) también se ha descrito como un regulador negativo del ABA, y el mutante muestra hipersensibilidad al ABA. Curiosamente, el mutante de la disrupción del gen mostró una respuesta de cierre estomático hipersensible al ABA, mientras que la transpiración (pérdida de agua) del mutante no fue diferente a la de las plantas de tipo salvaje. También Yoshida et al. (2006, Plant Physiology 140: 115-126) estudió una mutación de pérdida de función en AtPP2CA, que tenía una centésima parte de la actividad de la proteína fosfatasa del tipo salvaje, y por la cual las plantas mutantes de Arabidopsis mostraban hipersensibilidad al A^ba durante la germinación de las semillas, pero las plantas mutantes no mostraban ningún cambio en la tolerancia a la sequía en comparación con el tipo salvaje (página 124, columna LH, último párrafo).

ABI1 y ABI2 son represores de las vías de señalización de ABA que regulan muchas respuestas de ABA, tal como el cierre estomático, la permeabilidad osmótica al agua de las membranas plasmáticas, la resistencia inducida por la sequía y la rizogénesis, la respuesta a la glucosa, el estrés lumínico elevado, la germinación de semillas y la inhibición del crecimiento vegetativo. AHG1 (At5g51760) es un regulador negativo del ABA durante la germinación de las semillas (Nishimura et al. 2007, Plant J 50: 935-949) y AHG3 (At3g11410) es un regulador negativo del ABA durante la germinación de semillas y la aclimatación al frío. Otros tres, At5g9220, At2g29380 y Atlg07430, podrían no estar implicados en la señalización del ABA, ya que las mutaciones nulas no revelaron ningún cambio en la sensibilidad al ABA (Yoshida et al, 2006: Fisiología vegetal 140:115-126).

La biosíntesis y la señalización de ABA son, por tanto, extremadamente complejas, y aunque se han identificado varios genes en Arabidopsis que parecen estar implicados (grupo PP2C-A), su papel en las respuestas dependientes de ABA, tal como estrés abiótico, latencia de las semillas y crecimiento de las plántulas no está en gran medida claro. Además, las secuencias de proteínas muestran poca conservación y las secuencias de aminoácidos comparten poca identidad de secuencia. Los genes se agrupan filogenéticamente, en base a los dominios (o motivos) de las proteínas, tal como el dominio catalítico (dominio similar a la serina/treonina fosfatasa de las proteínas), que suele estar situado en el extremo C-terminal de las proteínas. El extremo N-terminal varía considerablemente y puede desempeñar un papel en la unión del sustrato o proporcionar sitios de unión específicos a los complejos de señalización. Además de que la función in vivo no está clara, también se sabe poco sobre la localización subcelular, los sustratos y la especificidad de las enzimas o cómo se regulan estas enzimas monoméricas in vivo.

El documento WO2007/088234 describe que la inactivación combinada de ABI1 y HAB1 refuerza la respuesta a ABA y conduce a plantas de Arabidopsis resistentes a la salinidad y al estrés hídrico. Los ortólogos de tomate de ABI1 (SGN- U231558) y HAB1 (SGN-U217609) se presentan en las Fig. 6 y 7. Véase también Saez et al. 2006, Plant Physiol 141:1389-1399.

Aunque los mutantes dobles abil habí conducen a la tolerancia a la sequía en Arabidopsis thaliana, sigue siendo necesario proporcionar genes que sean adecuados para generar tolerancia a la sequía en plantas de cultivo, especialmente en cultivos de campo (por ejemplo arroz, maíz, soja, trigo, cebada, centeno, sorgo, Brassica, etc.) y cultivos hortícolas (por ejemplo, tomate, pepino, cebolla, zanahoria, col, coliflor, brócoli, sandía, melón, lechuga, puerro, espinaca, rábano, patata, alcachofa, ensalada de maíz, calabaza, calabacín, judía, guisantes, pimiento, etc.). Especialmente en los cultivos hortícolas, la escasez de agua puede ser un gran problema, ya que las raíces de muchos cultivos son poco profundas y los productos suelen venderse frescos, por lo que la escasez de agua puede reducir la calidad de las hortalizas y el rendimiento. Las hortalizas de fruto y semilla, tal como el tomate, son sensibles a la escasez de agua durante la floración y el desarrollo del fruto y la semilla. El cuajado de los frutos puede verse seriamente reducido por la falta de agua durante su desarrollo. La práctica habitual para hacer frente a posibles situaciones de estrés hídrico es regar los cultivos y/o plantar cultivares o variedades con tolerancia a la sequía, en la medida en que estén disponibles. También se pueden utilizar mantillos y cubiertas para hileras.

A pesar de los esfuerzos de reproducción, las plantas de tomate siguen siendo sensibles a la sequía y no existe ningún cultivar comercial con tolerancia a la sequía.

La presente invención proporciona nuevos genes, denominados SIPP2C1, adecuados para generar plantas de cultivo tolerantes a la sequía, especialmente plantas de tomate y otras plantas hortícolas. La presente invención también proporciona procedimientos para generar plantas tolerantes a la sequía. También se proporcionan las plantas tolerantes a la sequía, las semillas y las partes de las plantas (frutos cosechados, etc.) mismas.

Definiciones generales

El término "secuencia de ácidos nucleicos" (o molécula de ácido nucleico) se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma de cadena simple o doble, particularmente un ADN que codifica una proteína o un fragmento de proteína según la invención. Una "secuencia de ácidos nucleicos aislada" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que ya no se encuentra en el entorno natural del que fue aislada, por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos en una célula huésped bacteriana o en el genoma nuclear o plastidial de una planta.

Los términos "proteína" o "polipéptido" se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas formadas por una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción específico, tamaño, estructura tridimensional u origen. Por lo tanto, un "fragmento" o "porción" de una proteína S1PP2C1 puede seguir denominándose "proteína". Una "proteína aislada" se utiliza para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo, in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante.

El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, unida de forma operativa a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Así, un gen puede comprender varias secuencias vinculadas de forma operativa, tal como un promotor, una secuencia líder 5' que comprende, por ejemplo, secuencias implicadas en la iniciación de la traducción, una región codificante (de proteínas) (ADNc o ADN genómico) y una secuencia no traducida 3' que comprende, por ejemplo, sitios de terminación de la transcripción.

Un "gen quimérico" (o gen recombinante) se refiere a cualquier gen, que no se encuentra normalmente en la naturaleza en una especie, en particular un gen en el que están presentes una o más partes de la secuencia de ácidos nucleicos que no están asociadas entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o toda la región transcrita o con otra región reguladora. Se entiende que el término "gen quimérico" incluye construcciones de expresión en las que un promotor o una secuencia reguladora de la transcripción está vinculada de forma operativa a una o más secuencias codificantes o a una secuencia de repetición antisentido (complemento inverso de la cadena sentido) o invertida (sentido y antisentido, por lo que el transcrito de ARN forma un ARN de doble cadena al transcribirse). Un "gen cis" es un gen quimérico en el que, preferentemente, todas las secuencias del gen, pero al menos la secuencia transcrita, son/son de una especie vegetal que es sexualmente compatible con la especie en la que se introduce el gen.

"Expresión de un gen" se refiere al proceso en el que una región de ADN, que está unida de forma operativa a regiones reguladoras apropiadas, en particular un promotor, se transcribe en un ARN, que es biológicamente activo, es decir, que es capaz de traducirse en una proteína o péptido biológicamente activo (o fragmento de péptido activo) o que es activo en sí mismo (por ejemplo, en el silenciamiento génico postranscripcional o ARNi). La secuencia codificadora puede estar orientada al sentido y codificar una proteína o un péptido deseado y biológicamente activo, o un fragmento de péptido activo. En los enfoques de silenciamiento de genes, la secuencia de ADN está presente preferentemente en forma de ADN antisentido o de ADN de repetición invertida, que comprende una secuencia corta del gen diana en antisentido o en orientación de sentido y antisentido (repetición invertida). La "expresión ectópica" se refiere a la expresión en un tejido en el que el gen no se expresa normalmente.

Una "proteína activa" o "proteína funcional" es una proteína que tiene una actividad proteica medible in vitro, por ejemplo, mediante un ensayo de actividad in vitro , y/o in vivo, por ejemplo, por el fenotipo conferido por la proteína. Una proteína "de tipo salvaje" es una proteína totalmente funcional, como está presente en la planta de tipo salvaje. Una "proteína mutante" es aquí una proteína que comprende una o más mutaciones en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína, por lo que la mutación resulta en (la molécula de ácido nucleico mutante que codifica) una proteína de "función reducida" o "pérdida de función", como por ejemplo, medible por la actividad de la proteína in vitro en comparación con la actividad de la proteína de tipo salvaje, por ejemplo, por un ensayo de actividad, y/o in vivo, por ejemplo, por el fenotipo conferido por el alelo mutante. Una "mutación" en una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína es un cambio de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo salvaje, por ejemplo, mediante la sustitución, eliminación o inserción de uno o más nucleótidos. Una "mutación puntual" es la sustitución de un solo nucleótido, o la inserción o supresión de un solo nucleótido.

Una mutación "sin sentido" es una mutación (puntual) en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína, por la que un codón se convierte en un codón de parada. Esto da lugar a la presencia de un codón de parada prematuro en el ARNm y a una proteína truncada. Una proteína truncada puede tener una función reducida o una pérdida de función.

Una mutación de "sentido erróneo" es una mutación (puntual) en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína, por la que se cambia un codón para codificar un aminoácido diferente. La proteína resultante puede tener una función reducida o una pérdida de función.

Una mutación de "sitio de empalme" es una mutación en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína, mediante la cual se modifica el empalme del ARN previo, lo que da lugar a un ARNm con una secuencia de nucleótidos diferente y a una proteína con una secuencia de aminoácidos distinta a la del tipo salvaje. La proteína resultante puede tener una función reducida o una pérdida de función.

Una mutación de "cambio de marco" es una mutación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína por la que se cambia el marco de lectura del ARNm, dando lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. La proteína resultante puede tener una función reducida o una pérdida de función.

Una mutación en una secuencia reguladora, por ejemplo, en un promotor de un gen, es un cambio de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo salvaje, por ejemplo, mediante la sustitución, la supresión o la inserción de uno o más nucleótidos, lo que conduce, por ejemplo, a la reducción o a la ausencia de transcripción del ARNm del gen.

"Silenciamiento" se refiere a una regulación a la baja o a la inhibición completa de la expresión del gen o familia de genes diana.

Un "gen diana" en los enfoques de silenciamiento génico es el gen o familia de genes (o uno o más alelos específicos del gen) cuya expresión génica endógena se regula a la baja o se inhibe completamente (se silencia) cuando se expresa un gen silenciador quimérico (o "gen quimérico de ARNi") y, por ejemplo, produce un transcrito de ARN silenciador (por ejemplo, un ARNd o ARNp capaz de silenciar la expresión del gen diana endógeno). En los enfoques de mutagénesis, un gen diana es el gen endógeno que debe ser mutado, lo que conduce a un cambio en (la reducción o la pérdida de) la expresión del gen o un cambio en (la reducción o la pérdida de) la función de la proteína codificada.

Un transcrito de ARN "sentido" se realiza generalmente vinculando de forma operativa un promotor a una molécula de ADN de doble cadena en la que la cadena sentido (cadena codificante) de la molécula de ADN está en la orientación 5' a 3', de forma que al transcribirse se transcribe un ARN sentido, que tiene la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena de ADN sentido (excepto que la T se sustituye por la U en el ARN). Un transcrito de ARN "antisentido" se realiza generalmente vinculando de forma operativa un promotor a la cadena complementaria (cadena antisentido) del ADN sentido, de forma que al transcribirse se transcribe un ARN antisentido.

Una "secuencia reguladora de la transcripción" se define en el presente documento como una secuencia de ácidos nucleicos capaz de regular la tasa de transcripción de una secuencia (codificante) vinculada operativamente a la secuencia reguladora de la transcripción. Una secuencia reguladora de la transcripción, tal y como se define en el presente documento, comprenderá todos los elementos de secuencia necesarios para el inicio de la transcripción (elementos promotores), para el mantenimiento y para la regulación de la transcripción, incluyendo, por ejemplo, atenuadores o potenciadores. Aunque se hace referencia principalmente a las secuencias reguladoras de la transcripción aguas arriba (5') de una secuencia codificante, las secuencias reguladoras que se encuentran aguas abajo (3') de una secuencia codificante también se incluyen en esta definición.

Como se utiliza en el presente documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, situado aguas arriba con respecto a la dirección de la transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen, y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente del ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a sitios de unión de factores de transcripción, sitios de unión de proteínas represoras y activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la materia que actúe directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de los tejidos en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor regulado fisiológicamente (por ejemplo, por la aplicación externa de determinados compuestos) o por el desarrollo. Un promotor "específico de tejido" sólo es activo en determinados tipos de tejidos o células.

Como se utiliza en este documento, el término "operablemente enlazado" se refiere a una unión de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor, o más bien una secuencia reguladora de la transcripción, está vinculada de forma operativa a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Vinculado operativamente significa que las secuencias de ADN que se vinculan son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas, contiguas y en marco de lectura para producir una "proteína quimérica". Una "proteína quimérica" o "proteína híbrida" es una proteína compuesta por varios "dominios" (o motivos) proteicos que no se encuentran como tales en la naturaleza pero que se unen para formar una proteína funcional, que muestra la funcionalidad de los dominios unidos. Una proteína quimérica también puede ser una proteína de fusión de dos o más proteínas presentes en la naturaleza.

El término "dominio", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier parte o dominio de la proteína con una estructura o función específica que puede transferirse a otra proteína para proporcionar una nueva proteína híbrida con al menos la característica funcional del dominio. Los dominios específicos también pueden utilizarse para identificar a los miembros de las proteínas pertenecientes al grupo S1PP2C1, como los ortólogos de S1PP2C 1 de otras especies vegetales. Ejemplos de dominios encontrados en las proteínas S1PP2C1 son el dominio catalítico de la serina/treonina fosfatasa 2C (PP2C o similar a PP2C) que comprende aproximadamente los aminoácidos 84-391 de SEQ ID NO: 2 o la región N-terminal de la proteína ^s 1^p P2C (aminoácidos 1-83 de SEQ ID No: 2).

Los términos "péptido diana" se refieren a secuencias de aminoácidos que dirigen una proteína a orgánulos intracelulares como los plastos, preferentemente cloroplastos, mitocondrias, o al espacio extracelular (péptido señal de secreción). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido diana puede fusionarse (en marco) con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el extremo amino terminal (extremo N-terminal) de la proteína. Por "construcción de ácido nucleico" o "vector" se entiende aquí una molécula de ácido nucleico fabricada por el hombre que resulta del uso de la tecnología del ADN recombinante y que se utiliza para introducir ADN exógeno en una célula huésped. La columna vertebral del vector puede ser, por ejemplo, un vector binario o superbinario (véase, por ejemplo, los documentos US5591616, US2002138879 y WO9506722), un vector de cointegración o un vector de ADN-T, como se conoce en la técnica y como se describe en el presente documento, en el que se integra un gen quimérico o, si ya está presente una secuencia reguladora de la transcripción adecuada, sólo se integra una secuencia de ácidos nucleicos deseada (por ejemplo, una secuencia codificadora, una secuencia antisentido o una secuencia de repetición invertida) aguas abajo de la secuencia reguladora de la transcripción. Los vectores suelen incluir otros elementos genéticos para facilitar su uso en la clonación molecular, como, por ejemplo, marcadores seleccionables, sitios de clonación múltiples y similares (véase más adelante).

Una "célula huésped" o una "célula huésped recombinante" o "célula transformada" son términos que se refieren a una nueva célula individual (u organismo) que surge como resultado de la introducción en dicha célula de al menos una molécula de ácido nucleico, que comprende especialmente un gen quimérico que codifica una proteína deseada o una secuencia de ácidos nucleicos que, al transcribirse, produce un ARN antisentido o un ARN de repetición invertida (o ARN de horquilla) para el silenciamiento de una familia de genes diana. La célula huésped es preferentemente una célula vegetal o una célula bacteriana. La célula huésped puede contener la construcción de ácido nucleico como una molécula de replicación extracromosómica (episomal), o más preferentemente, comprende el gen quimérico integrado en el genoma nuclear o plastidial de la célula huésped.

El término "marcador seleccionable" es un término familiar para un experto en la materia y se utiliza aquí para describir cualquier entidad genética que, cuando se expresa, puede utilizarse para seleccionar una célula o células que contienen el marcador seleccionable. Los productos genéticos marcadores seleccionables confieren, por ejemplo, resistencia a los antibióticos o, más preferentemente, resistencia a los herbicidas u otro rasgo seleccionable, como un rasgo fenotípico (por ejemplo, un cambio en la pigmentación) o un requisito nutricional. El término "reportero" se utiliza principalmente para referirse a marcadores visibles, tal como la proteína verde fluorescente (GFP), eGFP, luciferasa, GUS y similares.

El término "ortólogo" de un gen o una proteína se refiere en el presente documento al gen o la proteína homólogos encontrados en otra especie, que tienen la misma función que el gen o la proteína, pero (normalmente) divergieron en la secuencia desde el momento en que las especies que albergan los genes divergieron (es decir, los genes evolucionaron desde un ancestro común por especiación). Los ortólogos del gen SIPP2C1 del tomate pueden, por tanto, identificarse en otras especies de plantas en base a comparaciones de secuencias (por ejemplo, en base a los porcentajes de identidad de secuencias en toda la secuencia y/o en dominios específicos) y/o análisis funcionales.

Los términos "homólogo" y "heterólogo" se refieren a la relación entre un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos y su célula u organismo huésped, especialmente en el contexto de los organismos transgénicos. Así, una secuencia homóloga se encuentra de forma natural en la especie huésped (por ejemplo, una planta de tomate transformada con un gen de tomate), mientras que una secuencia heteróloga no se encuentra de forma natural en la célula huésped (por ejemplo, una planta de tomate transformada con una secuencia de plantas de patata). Dependiendo del contexto, el término "homólogo" u "homólogo" puede referirse alternativamente a secuencias que descienden de una secuencia ancestral común (por ejemplo, pueden ser ortólogas).

Las "condiciones estrictas de hibridación" pueden utilizarse para identificar secuencias de nucleótidos que sean sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos determinada. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Por lo general, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. Típicamente, se elegirán condiciones estrictas en las que la concentración de sal es de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es de al menos 60°C. La disminución de la concentración de sal y/o el aumento de la temperatura aumentan la rigurosidad. Las condiciones estrictas para las hibridaciones ARN-ADn (Northern blots que utilizan una sonda de, por ejemplo, 100 nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado en 0,2 X SSC a 63°C durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Las condiciones estrictas para la hibridación de ADN-ADN (Southern blots utilizando una sonda de, por ejemplo, 100nt) son, por ejemplo, las que incluyen al menos un lavado (normalmente 2) en 0,2 X SSC a una temperatura de al menos 50°C, normalmente aproximadamente 55°C, durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. Véase también Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).

La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" pueden determinarse mediante la alineación de dos secuencias peptídicas o de dos nucleótidos utilizando algoritmos de alineación global o local. Las secuencias pueden considerarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando (cuando se alinean de forma óptima mediante, por ejemplo, los programas GAP o BESTFIT o el programa "Needle" de Emboss (utilizando los parámetros por defecto, véase más adelante) comparten al menos un determinado porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define más adelante). Estos programas utilizan el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. En general, se utilizan los parámetros por defecto, con una penalización de creación de huecos = 10 y una penalización de extensión de huecos = 0,5 (tanto para los alineamientos de nucleótidos como de proteínas). Para los nucleótidos la matriz de puntuación por defecto utilizada es nwsgapdna y para las proteínas la matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Los alineamientos de secuencias y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencias pueden determinarse, por ejemplo, utilizando programas informáticos, como el GCG Wisconsin Package, Versión 10.3, disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA o EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/ emboss). Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad puede determinarse mediante la búsqueda en bases de datos como FASTA, BLAST, etc., pero las coincidencias deben recuperarse y alinearse por pares para comparar la identidad de la secuencia.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utilizan en su sentido no limitativo para significar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos no mencionados específicamente. Además, la referencia a un elemento mediante el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que haya más de un elemento, a menos que el contexto exija claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. Así, el artículo indefinido "un" o "una" suele significar "al menos uno". Se entiende además que, al referirse a las "secuencias" en este documento, generalmente se hace referencia a las moléculas físicas reales con una determinada secuencia de subunidades (por ejemplo, aminoácidos).

Como se utiliza en el presente documento, el término "planta" incluye la planta entera o cualquier parte o derivado de la misma, tal como los órganos de la planta (por ejemplo, órganos de almacenamiento cosechados o no, bulbos, tubérculos, frutos, hojas, etc.), las células de la planta, los protoplastos de la planta, los cultivos de tejidos de células de la planta a partir de los cuales se pueden regenerar plantas enteras, los callos de la planta, los grupos de células de la planta y las células de la planta que están intactas en las plantas, o partes de las plantas, como los embriones, el polen, los óvulos, los frutos (por ejemplo, tejidos u órganos cosechados, como los tomates cosechados, etc.), tubérculos (por ejemplo, patatas) flores, hojas, semillas, tubérculos, bulbos, plantas propagadas clonalmente, raíces, portainjertos, tallos, puntas de raíces y similares. También se incluye cualquier fase de desarrollo, tal como plántulas, inmaduras y maduras, etc.

La "variedad vegetal" es un grupo de plantas dentro del mismo taxón botánico del grado más bajo conocido, que (independientemente de que se cumplan o no las condiciones para el reconocimiento de los derechos de obtentor) puede definirse sobre la base de la expresión de los caracteres que resultan de un determinado genotipo o de una combinación de genotipos, puede distinguirse de cualquier otro grupo de plantas por la expresión de al menos uno de esos caracteres, y puede considerarse como una entidad, porque puede multiplicarse sin ningún cambio. Por lo tanto, el término "variedad vegetal" no puede utilizarse para designar un grupo de plantas, aunque sean del mismo tipo, si todas se caracterizan por la presencia de 1 locus o gen (o una serie de características fenotípicas debidas a este único locus o gen), pero que por lo demás pueden diferir enormemente entre sí en lo que respecta a los demás loci o genes.

"F1, F2, etc." se refiere a las generaciones consecutivas relacionadas que siguen a un cruce entre dos plantas o líneas parentales. Las plantas cultivadas a partir de las semillas producidas por el cruce de dos plantas o líneas se denominan generación F1. La autofertilización de las plantas F1 da lugar a la generación F2, etc. La planta "híbrida F1" (o semilla F1) es la generación obtenida del cruce de dos líneas parentales endogámicas. Una "población M1" es una pluralidad de semillas / plantas mutagénicas de una determinada línea vegetal o cultivar. "M1, M2, M3, M4, etc." se refiere a las generaciones consecutivas obtenidas tras la autofertilización de una primera semilla/planta mutagénica (M1).

El término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular, todos los cuales alelos se relacionan con un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un determinado gen se encuentran en un lugar específico, o locus (loci en plural) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie vegetal diploide puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus concreto. Pueden ser alelos idénticos del gen (homocigotos) o dos alelos diferentes (heterocigotos).

El término "locus" (loci en plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen o un marcador genético. El locus SIPP2C1 es, por tanto, el lugar del genoma donde se encuentra el gen SIPP2C1.

"Alelo de tipo salvaje" (WT) se refiere en el presente documento a una versión de un gen que codifica una proteína funcional (proteína de tipo salvaje). El alelo SlPP2C1 de tipo salvaje se representa, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 1. "Alelo mutante" se refiere en el presente documento a un alelo que comprende una o más mutaciones en la secuencia codificante (ARNm o ADNc) o en la secuencia genómica en comparación con el alelo de tipo salvaje. Dicha(s) mutación(es) (por ejemplo, inserción, inversión, supresión y/o sustitución de uno o más nucleótidos) puede dar lugar a que la proteína codificada tenga una funcionalidad reducida in vitro y/o in vivo (función reducida) o ninguna funcionalidad in vitro y/o in vivo (pérdida de función), por ejemplo, debido a que la proteína, por ejemplo, está truncada o tiene una secuencia de aminoácidos en la que se suprimen, insertan o sustituyen uno o más aminoácidos. Dichos cambios pueden dar lugar a que la proteína tenga una conformación tridimensional diferente, se dirija a un compartimento subcelular diferente, tenga un dominio catalítico modificado, tenga una afinidad y/o especificidad de sustrato modificada, etc.

"Tolerancia a la sequía" o "tolerancia a la sequía significativamente mejorada" o "planta tolerante a la sequía" se refiere en el presente documento a una capacidad (en promedio) significativamente mejorada de una línea, cultivar o variedad de plantas para soportar la escasez de agua/estrés hídrico/sequía en comparación con las plantas de control adecuadas (por ejemplo, plantas de tipo salvaje), es decir, los síntomas asociados con el estrés hídrico (por ejemplo el marchitamiento de las hojas) se reducen (estadísticamente) de forma significativa en las plantas tolerantes a la sequía en comparación con los controles expuestos a las mismas condiciones de estrés hídrico y/o la tasa (media) de recuperación y/o supervivencia y/o el rendimiento cosechable de las plantas tras la exposición a condiciones de escasez de agua/estrés hídrico/sequía se incrementa de forma significativa en comparación con las plantas de control, como las plantas de tipo salvaje. Existen varios procedimientos para determinar si una planta es tolerante a la sequía, como se explicará en otra parte del presente documento. Preferentemente, una planta tolerante a la sequía tiene una tolerancia a la sequía significativamente mayor durante todas las etapas de desarrollo, pero al menos durante una de las siguientes etapas de desarrollo: como planta madura, durante la floración o antesis, durante el cuajado y el desarrollo del fruto, durante el desarrollo de la semilla, durante la maduración del fruto. Preferentemente, la planta tiene además tolerancia a la sequía al menos en la fase de semilla y/o durante la fase de plántula y/o desde la fase de plántula hasta (e incluyendo) la planta madura.

"Planta de tipo salvaje" se refiere en el presente documento a una planta que comprende un alelo SIPP2C1 de tipo salvaje (WT) que codifica una proteína funcional (por ejemplo, en contraste con las "plantas mutantes", que comprenden un alelo SIPP2C1 mutante). Estas plantas son controles adecuados en los ensayos fenotípicos. Preferentemente, las plantas de tipo salvaje y/o mutantes son "plantas cultivadas", es decir, variedades, líneas de reproducción o cultivares de una especie, cultivadas por el ser humano y que tienen buenas características agronómicas; preferentemente, dichas plantas no son "plantas salvajes", es decir, plantas que generalmente tienen rendimiento y características agronómicas mucho más pobres que las plantas cultivadas y que, por ejemplo, crecen de forma natural en poblaciones salvajes. Las "plantas salvajes" incluyen, por ejemplo, los ecotipos, las líneas de introducción de plantas, las razas autóctonas o las accesiones salvajes o los parientes salvajes de una especie, o las denominadas variedades o cultivares heredados, es decir, las variedades o cultivares que se cultivaban comúnmente durante períodos anteriores de la historia de la humanidad, pero que no se utilizan en la agricultura moderna.

"Sequía" se refiere preferentemente tanto a la escasez o el estrés hídrico a corto plazo (artificial, por ejemplo, sin riego del suelo y/o natural, por ejemplo, sin lluvia), por ejemplo, igual o inferior a 30 días, 20 días, 15, días, 14 días, 10 días, 9, 8, 7, 6, 5 días, o menos, y/o a la escasez o el estrés hídrico a largo plazo (artificial, por ejemplo, sin riego del suelo y/o natural, por ejemplo, sin lluvia), por ejemplo, igual o superior a 31 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días, 70 días, 80 días por ejemplo, ausencia de riego del suelo y/o natural, por ejemplo, ausencia de lluvia), por ejemplo, igual o superior a 31 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días, 70 días, 80 días, 90 días o más. Las "variantes" del gen o de la proteína SIPP2C1 incluyen tanto las variantes alélicas naturales encontradas dentro de la especie S. lycopersicum, como los ortólogos encontrados en otras especies de plantas, como otras especies de plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores se propusieron estudiar los genes que se expresan diferencialmente durante el cuajado del fruto del tomate, realizando un análisis del transcriptoma (cDNA-AFLP) de ovarios polinizados y de ovarios tratados con GA3 (ácido giberélico) (Vriezen et al. 2008, New Phytologist 177:60-76). Un gen, que se expresaba de forma relativamente alta en los ovarios no polinizados y menos en los polinizados, en correlación con los niveles de ABA (ácido abscísico) (altos en los ovarios no polinizados y bajos después de la polinización) se caracterizó aún más mediante la generación de plantas transgénicas, con el fin de estudiar el papel de este gen en la señalización del ABA. El gen del tomate se denominó SIPP2C1 (Solanum lycopersicum PP2C1), ya que codifica una proteína de 397 aminoácidos que comprende un dominio catalítico de la serina/treonina fosfatasa 2C en la región C-terminal entre los aminoácidos 84 y 391 aproximadamente (según lo determinado por InterProScan).

Se descubrió que SlPP2C1 está implicado en la señalización del ABA y que la sobreexpresión de este gen bajo el control del promotor CaMV 35S da lugar a plantas que son menos sensibles a la fitohormona ABA que las plantas de tipo salvaje, mientras que las plantas en las que el gen estaba co-suprimido (con niveles de transcripción de SlPP2C1 significativamente más bajos en al menos el tejido foliar que las plantas de tipo salvaje) tenían una mayor sensibilidad al ABA (ver Ejemplos). Los niveles reducidos de la proteína S1PP2C1 (tipo salvaje), por lo tanto, aumentaron la sensibilidad al ABA, lo que significa que la proteína S1PP2C1 es un regulador negativo de la señalización del ABA.

Sorprendentemente, se descubrió además que las plantas de tomate en las que los niveles de transcripción de SlPP2C1 estaban significativamente reducidos en comparación con las plantas de tipo salvaje no mostraban ningún tipo de marchitamiento después de 9 días de privación de agua, mientras que las plantas de tipo salvaje tenían hojas marchitas y las plantas que sobreexpresaban SlPP2C1 mostraban graves signos de marchitamiento. Esto fue aún más sorprendente, ya que el gen SlPP2C1 y la proteína S1PP2C1 no tenían ninguna identidad de secuencia significativa con ninguno de los reguladores negativos conocidos de ABA que han demostrado desempeñar un papel en la tolerancia a la sequía en Arabidopsis, como ABI1 y HAB1, o con cualquiera de las proteínas del grupo A, véase la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1 - Identidad de secuencia entre las proteínas de Arabidopsis (putativamente) implicadas en la señalización del ABA (Schweigerhofer et al. 2004, supra, véase la Figura 1, grupo A de la misma) y la proteína S1PP2C1

La identidad de secuencia de S1PP2C1 con las proteínas PP2C, subgrupo A, de Arabidopsis es, por tanto, baja. En particular, las mutaciones nulas (inserciones de ADN-T, por las que no se detectó ARNm por RT-PCR) en la proteína con la que se encuentra la mayor similitud, At2g29380, no mostraron ningún cambio en la sensibilidad al ABA en Arabidopsis (Yoshida et al, 2006, Plant Physiology 140:115-126). Además, este gen se expresa en las raíces y silicuas de Arabidopsis, pero no en las hojas ni en las inflorescencias (véase la Fig.5 de Xue et al. 2008. BMC Genomics 9:550).

El hallazgo de que SIPP2C1 está implicado en la tolerancia a la sequía en el tomate puede utilizarse para generar plantas transgénicas y/o no transgénicas con mayor tolerancia a la sequía y, preferentemente, con las características agronómicas deseadas. Las diferentes realizaciones de la invención se describen a continuación y en los Ejemplos no limitativos. Las partes descritas en este documento como aplicables a los enfoques transgénicos son generalmente también aplicables a los enfoques no transgénicos y viceversa, a menos que se indique lo contrario.

En una realización se proporcionan plantas transgénicas de la especie Solanum lycopersicum en las que la expresión endógena de SlPP2C1 está regulada a la baja o silenciada, al menos en el tejido foliar, y que son tolerantes a la sequía. En otra realización, las plantas no transgénicas de la especie Solanum lycopersicum que comprenden uno o más alelos mutantes de SlPP2C1 (ya sea en forma homocigota o heterocigota) y en las que dicho(s) alelo(s) mutante(s) codifica(n) una proteína S1PP2C1 que tiene una funcionalidad reducida in vitro y/o in vivo en comparación con la proteína de tipo salvaje, o incluso ninguna funcionalidad, y en la que la mutación da lugar a que las plantas (línea mutante o progenie de la misma) tengan una tolerancia a la sequía significativamente mayor en comparación con las plantas que carecen del alelo o alelos mutantes (plantas de tipo salvaje), se proporcionan en el presente documento. Dichas plantas no transgénicas y tolerantes a la sequía se generan, en una realización de la invención, utilizando TILLING o Eco-TILLING, pero también pueden generarse utilizando otros procedimientos de mutagénesis conocidos combinados con procedimientos de reproducción. Así, en una realización el alelo mutante SlPP2C1 es inducido e identificado por los humanos, utilizando técnicas de mutagénesis ("mutante inducido"), mientras que en otra realización de la invención el alelo mutante SlPP2C1 es un "mutante natural", lo que significa que se encuentra en las poblaciones naturales de plantas. Los "mutantes inducidos" se generan preferentemente en el germoplasma cultivado y, por tanto, están presentes directamente en las líneas de valor agronómico. Por otro lado, los "mutantes naturales" o "mutantes espontáneos" o "variantes naturales" o "variantes alélicas naturales / variación" se basan en la variación natural (polimorfismos / mutaciones) que se encuentran en una especie y, por lo tanto, es probable que estén presentes en material vegetal de calidad agronómica inferior, no cultivado en la agricultura moderna, por ejemplo, plantas salvajes. Los alelos posteriores deben entonces ser transferidos a una planta cultivada que tenga buenas características agronómicas, lo que constituye una realización de la invención.

El estrés por sequía o deshidratación es uno de los estreses abióticos más graves a los que tienen que hacer frente las plantas en todo el mundo. Cuatro décimas partes de las tierras agrícolas del mundo se encuentran en regiones áridas o semiáridas. Aparte de eso, también las plantas cultivadas en regiones con precipitaciones relativamente altas pueden sufrir rachas de sequía a lo largo de la temporada de crecimiento. Muchas regiones agrícolas tienen poca lluvia y dependen del riego para mantener el rendimiento y la calidad de los productos. Es claramente importante conferir o mejorar la tolerancia de las plantas de cultivo a los periodos cortos y largos de sequía y reducir las necesidades de agua de los cultivos de la agricultura de regadío. Las plantas proporcionadas en el presente documento tienen una menor necesidad de riego y/o un mayor rendimiento y/o un mayor porcentaje de supervivencia cuando se cultivan en regiones que experimentan periodos cortos de sequía o periodos más largos de sequía.

Secuencias de ácido nucleico y proteínas según la invención

En una divulgación se proporcionan secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de S1PP2C1, así como procedimientos para aislar o identificar "variantes" de las mismas, por ejemplo, variantes alélicas dentro de la especie(Solanum lycopersicum) o dentro del género Solanum, u ortólogos de S1PP2C1 de otras especies de plantas, como otras especies vegetales o especies de cultivos de campo.

La proteína S1PP2C1 de tipo salvaje (derivada del cultivar de tomate Moneymaker) se representa en la SEQ ID NO: 2. Se trata de una proteína de 397 aminoácidos que comprende un dominio catalítico (putativo) de serina/treonina fosfatasa 2C en la región C-terminal entre los aminoácidos 84 a 391 aproximadamente. En particular, el dominio comprende los aminoácidos Asp-Xaa-Phe-Leu-Ile-Leu-Ala-Ser-Asp-Gly-Leu-Trp-Asp-Val (siendo Xaa cualquier aminoácido, pero preferentemente Glu, véase el aminoácido 307-320 de SEQ ID nO: 2). También hay un sitio de unión de aspartato de manganeso/magnesio (putativo) del aminoácido 147 al 149 (DGH o Asp-Gly-His, donde Asp se une al magnesio o al manganeso). Alternativamente, el dominio que comprende o consiste en los aminoácidos 144 a 150, es decir, GVXDGHG (donde X es cualquier aminoácido, preferentemente Y) puede participar en la interacción con las proteínas quinasas. Una "proteína S1PP2C1" (incluidas sus "variantes", como las proteínas codificadas por variantes alélicas del gen o por ortólogos del mismo) puede definirse por su identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2 en toda su longitud, es decir, proteínas que tienen una identidad de secuencia de al menos alrededor del 90%, 95%, 98%, 99% o más con la SEQ ID NO: 2 (según lo determinado por la alineación por pares utilizando Emboss "Needle", matriz Blossum 62, penalización por apertura de huecos = 10, penalización de extensión de huecos = 0,5) y que tiene una función in vivo que es esencialmente similar a la de SlPP2C1. También se incluyen en el presente documento mutantes de pérdida de función de las proteínas S1PP2C1 de tipo salvaje (o de variantes de las mismas, como se ha definido anteriormente) o mutantes de función reducida de las proteínas S1PP2C1 de tipo salvaje (o de variantes de las mismas), como se ha descrito en otro lugar, y plantas o partes de plantas que comprenden uno o más nucleótidos que codifican dichos mutantes y que tienen una mayor tolerancia a la sequía en comparación con las plantas que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de tipo salvaje.

Preferentemente, una proteína S1PP2C1 según la invención también comprende al menos un dominio catalítico de serina/treonina fosfatasa en la región C-terminal, es decir, un dominio que comprende al menos el 60%, 70%, 80%, 90% o preferentemente al menos el 95%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con el aminoácido 84 a 391 de SEQ ID NO: 2 (según lo determinado por la alineación por pares utilizando la matriz Emboss "Needle", Blossum 62, penalización por apertura de huecos = 10, penalización por extensión de huecos = 0,5). En una realización, una proteína S1PP2C1 según la invención comprende la secuencia Asp-Xaa-Phe-Leu-Ile-Leu-Ala-Ser-Asp-Gly-Leu-Trp-Asp-Val (siendo Xaa cualquier aminoácido, pero preferentemente Glu) o una secuencia que tiene un 90% o 95% o 98% o más de identidad de secuencia con esta secuencia (según se determina por alineación por pares utilizando Emboss "Needle", matriz Blossum 62, penalización por apertura de huecos = 10, penalización de extensión de huecos = 0,5). Preferentemente, una proteína S1PP2C1 comprende además al menos un motivo DGH, es decir, al menos una secuencia DGH o GVXDGHG (donde X es cualquier aminoácido, preferentemente Y).

Una "función que es esencialmente similar a la función de S1PP2C1" se refiere en el presente documento a la proteína que tiene una función probada en la sensibilidad/tolerancia al estrés por sequía y/o en la determinación de la sensibilidad al ABA del tejido vegetal. Las plantas que sobreexpresan SIPP2C1, o una variante de la misma, al menos en el tejido foliar, son significativamente más susceptibles al estrés por sequía que las plantas de tipo salvaje y/o tienen una sensibilidad al ABA significativamente reducida en comparación con los controles (por ejemplo, plantas de tipo salvaje o plantas transformadas con un vector vacío). A la inversa, las plantas con niveles reducidos de la proteína SlPP2C1 totalmente funcional (tipo salvaje), o una variante de la misma, al menos en el tejido foliar, son significativamente menos susceptibles al estrés por sequía que las plantas de tipo salvaje y/o tienen una sensibilidad al ABA significativamente mayor en comparación con los controles.

Así, la función de una proteína (putativa) S1PP2C1 puede probarse utilizando una variedad de procedimientos conocidos, preferentemente comparando el fenotipo de los transformantes que expresan constitutivamente la proteína que se está probando con el fenotipo de los transformantes que sobreexpresan SlPP2C1 de la misma especie (y variedad) de huésped (preferentemente que comprenden un gen quimérico que codifica S1PP2C1 integrado de forma estable en el genoma del huésped), lo que permite una comparación directa del efecto funcional en el fenotipo de los transformantes.

Del mismo modo, se pueden utilizar transformantes en los que el gen SIPP2C1 (o la variante) está silenciado o regulado a la baja (por ejemplo, el ARNm de SIPP2C1 se reduce significativamente al menos en el tejido foliar en comparación con los transformantes de tipo salvaje o de control) para determinar la función. Una "reducción significativa" del ARNm del transcrito de SIPP2C1 se refiere a que el ARNm diana está presente a un nivel inferior o igual al 90%, 80%, 70%, 60%, 50% 40%, 30%, 20% o menos (10%, 5% o 0%) del nivel de transcrito encontrado en los transformantes de tipo salvaje o de control (por ejemplo, transformante de vector vacío). Se entiende que en cualquier experimento de transformación se observa un cierto grado de variación en el fenotipo de los transformantes, normalmente debido a efectos de posición en el genoma y/o debido al número de copias. Una persona experta sabrá cómo comparar los transformantes entre sí, por ejemplo, seleccionando eventos con un único número de copias y analizando sus fenotipos. Otros procedimientos para determinar o confirmar la función in vivo de un gen/proteína incluyen la generación de mutantes knock-out o de función reducida o estudios de expresión transitoria. Los estudios de expresión génica de los promotores también pueden proporcionar información sobre el patrón de expresión espacio-temporal y la función de la proteína.

La (sobre)expresión constitutiva de un gen SIPP2C1, o de un gen que codifique una variante del mismo, debe dar lugar a uno o más de los siguientes cambios fenotípicos en comparación con las plantas de tipo salvaje o los transformantes de control:

• Aumento significativo de la sensibilidad al estrés hídrico (es decir, reducción significativa de la tolerancia a la sequía) y/o

• Sensibilidad al ABA significativamente reducida.

Un "aumento significativo de la sensibilidad al estrés híd rico" o "reducción significativa de la tolerancia a la sequía" se refiere a un aumento medio y estadísticamente significativo de los síntomas de marchitamiento de las hojas de una pluralidad de plantas que comprenden el alelo SIPP2C1 en al menos un 10% en comparación con los niveles de control y puede, por ejemplo, probarse como se describe en los Ejemplos o en experimentos equivalentes. En resumen, una pluralidad (por ejemplo, al menos 10, 15, 20 o más de una línea transgénica) de plantas transformadas y plantas de control de la misma edad (por ejemplo, plantas maduras) se saturan de agua al comienzo del experimento y luego no se riegan durante un período prolongado, por ejemplo, al menos aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días o más, por ejemplo, 3 semanas o 4 semanas o más (dependiendo de la especie de planta). Cuando las plantas de control empiezan a mostrar un marchitamiento de las hojas ("marchitamiento leve" o "marchitamiento moderado"), se evalúan todas las plantas en busca de signos de marchitamiento de las hojas utilizando, por ejemplo, la evaluación visual. Los síntomas de marchitamiento de las hojas pueden, por ejemplo, puntuarse en una escala de 4 a 1, como "muy/gravemente marchitas" (4), "moderadamente marchitas" (3), "ligeramente marchitas" (2) o "no marchitas" (1). Se dice que las plantas tienen una tolerancia a la sequía significativamente reducida si el marchitamiento (medio) se incrementa en al menos un 10%, preferentemente en al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con el control de tipo salvaje (o transformado en vector vacío). De forma alternativa o adicional, se pueden llevar a cabo ensayos de campo para probar y/o confirmar si se observa o no una reducción significativa de la tolerancia a la sequía en el campo bajo periodos de estrés hídrico.

Por supuesto, se pueden utilizar otros ensayos. Por ejemplo, un período de privación de agua puede ir seguido de un período de recuperación (riego) y se puede evaluar el porcentaje de supervivencia de las plantas, véase, por ejemplo Zheng et al. (2009, Biochemical and Biophysical Research Communications 379: 986, Columna LH). Se dice que las plantas tienen una tolerancia a la sequía significativamente reducida si el porcentaje de supervivencia se reduce al menos en un 10%, preferentemente al menos en un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con el control de tipo salvaje (o transformado en vector vacío). Véase también Xiong et al. 2006 (Fisiología vegetal 142: 1065-1074) y Yu et al. 2008 (The Plant Cell 20: 1134-1151).

La "sensibilidad al ABA significativamente reducida" también puede comprobarse como se describe en los Ejemplos, probando los porcentajes de germinación de semillas en una o más concentraciones diferentes de ABA y/o la elongación de raíces en una o más concentraciones diferentes de ABA. En resumen, la germinación de las semillas en un medio que contiene ABA es al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más, mayor para el transformante que sobreexpresa SIPP2C1 que para las semillas de control en la misma concentración de ABA. Por ejemplo, con 1 o 3 |jM de ABA, el 50% de las semillas de tipo salvaje germinan, mientras que el 55%, 60% o más de las semillas transformadas (que sobreexpresan SIPP2C1) germinan. Así, la germinación de las semillas de los transformantes sobreexpresados se ve menos inhibida por el ABA. El crecimiento / elongación de la raíz de los transformantes de sobreexpresión también se inhibe menos por ABA.

La regulación a la baja o el silenciamiento de un gen SIPP2C1, o de un gen que codifique una variante del mismo, debe dar lugar a uno o más de los siguientes cambios fenotípicos en comparación con las plantas de tipo salvaje o los transformantes de control:

• Reducción significativa de la sensibilidad al estrés hídrico (es decir, aumento significativo de la tolerancia a la sequía) y/o

• aumentó significativamente la sensibilidad al ABA.

Una "sensibilidad significativamente reducida al estrés hídrico" o una "tolerancia a la sequía significativamente mejorada" se refiere a una disminución media y estadísticamente significativa de los síntomas de marchitamiento de las hojas de una pluralidad de plantas, en las que el gen SIPP2C1 está regulado a la baja o silenciado, en al menos un 10% en comparación con los niveles de control (por ejemplo, plantas de tipo salvaje o transformantes de vector vacío) y puede, por ejemplo, ensayarse como se describe en los Ejemplos o utilizando procedimientos equivalentes. En resumen, una pluralidad de plantas transformadas (por ejemplo, al menos 10, 15, 20 o más de una línea transgénica) y los controles de la misma edad se saturan con agua al comienzo del experimento y luego no se riegan durante un período prolongado, por ejemplo, al menos aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días o más, por ejemplo, 3 semanas o 4 semanas o más (dependiendo de la especie de planta). Cuando las plantas de control empiezan a mostrar un marchitamiento de las hojas ("marchitamiento leve" o "marchitamiento moderado"), se evalúan todas las plantas en busca de signos de marchitamiento de las hojas utilizando, por ejemplo, la evaluación visual. Los síntomas de marchitamiento de las hojas pueden, por ejemplo, puntuarse en una escala de 1 a 4, como "muy/severamente marchitas" (4), "moderadamente marchitas" (3), "ligeramente marchitas" (2) o "no marchitas" (1). Se dice que las plantas tienen una tolerancia a la sequía significativamente mejorada si el marchitamiento (medio) se reduce al menos en un 10%, preferentemente al menos en un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con las plantas de control. Alternativa o adicionalmente se pueden utilizar ensayos de campo para determinar si la tolerancia a la sequía significativamente mejorada es conferida por la regulación a la baja o el silenciamiento de el/los gen(es) endógeno(s) SIPP2C1.

Por supuesto, se pueden utilizar otros ensayos. Por ejemplo, un período de privación de agua puede ir seguido de un período de recuperación (riego) y se puede evaluar el porcentaje de supervivencia de las plantas, véase, por ejemplo Zheng et al. (2009, Biochemical and Biophysical Research Communications 379: 986, Columna LH). Se dice que las plantas tienen una tolerancia a la sequía significativamente mejorada si el porcentaje de supervivencia aumenta al menos un 10%, preferentemente al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con el control de tipo salvaje (o transformado en vector vacío). Véase también Xiong et al. 2006 (Fisiología vegetal 142: 1065-1074) y Yu et al. 2008 (The Plant Cell 20: 1134-1151).

Los ensayos anteriores, o ensayos equivalentes, también pueden utilizarse para determinar si la planta que comprende un alelo mutante de SIPP2C1 (por ejemplo, un mutante de pérdida de función o de función reducida) ha mejorado significativamente la tolerancia a la sequía, como se describirá más adelante.

La "sensibilidad al ABA significativamente mejorada" también puede probarse como se describe en los Ejemplos. En resumen, la germinación media de las semillas en un medio que contiene ABA es al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más, más baja para los transformantes silenciados o regulados a la baja por SIPP2C1 que para las plantas de control (por ejemplo, las de tipo salvaje) en la misma concentración de ABA. Por ejemplo, con 1 o 3 pM de ABA, el 50% de las semillas de tipo salvaje germinan, mientras que menos del 40%, 35%, 30% o menos, de las semillas transformadas (silenciadas con SIPP2C1 ) germinan. Por lo tanto, la germinación de las semillas de los transformantes regulados a la baja o silenciados se ve más inhibida por el ABA. El crecimiento de las raíces de los transformantes con regulación a la baja o silenciados también se ve más inhibido por el ABA.

Los procedimientos exactos utilizados pueden variar, dependiendo, por ejemplo, de la especie vegetal. Los ensayos para determinar la tolerancia a la sequía y/o la sensibilidad al ABA en especies vegetales o en cultivos de campo son conocidos en la técnica. También se entiende que existen procedimientos alternativos para evaluar los fenotipos. Tales procedimientos están al alcance del experto.

Los procedimientos anteriores pueden utilizarse para comprobar si cualquier gen putativo de SIPP2C1, tal como un alelo de una planta de tomate de tipo salvaje o cultivada o de una línea de reproducción de tomate o de una línea de introducción de plantas o de una especie diferente (por ejemplo, tabaco, u otras especies vegetales o de especies de cultivos de campo) es realmente una variante de SIPP2C1, que puede utilizarse entonces para generar plantas transgénicas y/o no transgénicas que tengan una tolerancia a la sequía (significativamente) mejorada en comparación con controles adecuados, como la planta de tipo salvaje. Se entiende que, en lo que respecta a las plantas transgénicas, se transforman y regeneran preferentemente plantas con buenas características agronómicas, es decir, plantas cultivadas (por ejemplo, cultivares o líneas de reproducción de alto rendimiento) y que los controles más adecuados son los transformantes de vector vacío de la misma línea o una pluralidad de plantas de la línea no transformada como tal.

Además, se pueden llevar a cabo ensayos de actividad de fosfatasas in vitro para comprobar la actividad/funcionalidad de las proteínas, véase, por ejemplo Gosti et al. 1999, Plant Cell 11: 1897-1910, Material y procedimientos - Actividades de PP2C, página 1907, donde la proteína se expresa en E. coIi y la actividad enzimática se ensaya utilizando caseína marcada con 32P como sustrato. Dichos ensayos de actividad también son adecuados para determinar si tipos específicos de proteínas S1PP2C1 mutantes (por ejemplo, generadas por TILLING u otros procedimientos, véase otra parte del presente documento) o proteínas quiméricas conservan toda o parte de la funcionalidad. Véase también Bertauche et al., 1996, Eur. J. Biochem 241: página 195 para un ensayo de fosfatos y página 194 para la expresión en E. coIi.

Una proteína S1PP2C1 tiene una "función reducida in vitro" si el porcentaje de desfosforilación de 32P-caseína por la proteína mutante es igual o inferior al 70% de la proteína de tipo salvaje (en las mismas condiciones de ensayo, por ejemplo 1 o 2 pg de proteína incubada con 32P-caseína durante 2 horas a 30 grados Celsius en presencia de 20mM de acetato de magnesio, y en presencia de ácido okadaico), preferentemente igual o inferior a alrededor del 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ("reducción de la función") o alrededor del 0% de la proteína de tipo salvaje (es decir, "pérdida de la función" completa). Una proteína que tiene una función reducida in vitro puede utilizarse para inferir que la proteína también tiene una "función reducida o ninguna función in vivo", es decir, en Ia pIanta, por ejemplo, al menos en el tejido de la hoja y/o el tejido del fruto. Por ejemplo, una planta que comprende uno (heterocigoto) o dos (homocigoto) alelos que codifican una proteína mutante que tiene una función reducida o nula in vitro da lugar a que la planta tenga una tolerancia a la sequía significativamente mayor (en comparación con las plantas que carecen del alelo mutante / que tienen alelos de tipo salvaje) y, por tanto, también una función reducida o nula in vivo. La función reducida o la pérdida de función de la proteína in vivo se confirma mediante ensayos de tolerancia a la sequía (por ejemplo, en el campo o como se describe en los Ejemplos) de plantas homocigóticas o heterocigóticas para el alelo mutante.

Otros genes/proteínas putativos de S1PP2C1 pueden identificarse in silico, por ejemplo, identificando secuencias de ácidos nucleicos o proteínas en bases de datos de ácidos nucleicos o proteínas existentes (por ejemplo, GENBANK, SWISSPROT, TrEMBL) y utilizando software estándar de análisis de secuencias, como herramientas de búsqueda de similitud de secuencias (BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLAST, FASTA, etc.). Se seleccionan, clonan o sintetizan de novo secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico putativas que comprenden o codifican una proteína S1PP2C1 (como se ha definido anteriormente) y se comprueba su funcionalidad in vivo mediante, por ejemplo, la sobreexpresión o el silenciamiento en una planta huésped. Cabe señalar que la designación SlPP2C1 también se utiliza en el presente documento para las proteínas que se derivan de especies distintas de Solanum lycopersicum, es decir, el prefijo Sl no limita en el presente documento que la proteína sea de una especie particular.

Un ortólogo putativo del gen y la proteína SlPP2C1 del tomate es la proteína de la patata de SEQ ID NO: 15 (StPP2C1), codificado por el ADNc de SEQ ID NO: 14(StPP2C1). La proteína StPP2C1 tiene un 89,1% de identidad de secuencia de aminoácidos con S1PP2C1 y un 91,5% de identidad de secuencia de nucleótidos con SlPP2C1 (utilizando Emboss-Needle, apertura de huecos = 10,0, extensión de huecos = 0,5, y Blosum62 para proteínas o dnafull para ácidos nucleicos).

Las proteínas S1PP2C1 según la invención pueden ser aisladas de fuentes naturales, sintetizadas de novo por síntesis química (utilizando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos como el suministrado por Applied Biosystems) o producidas por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli). Las proteínas SlPP2C1 pueden utilizarse para generar anticuerpos monoclonales o policlonales, que pueden utilizarse, por ejemplo, para la detección de las proteínas S1PP2C1 en muestras de tejido, como las hojas (procedimientos y kits de análisis inmunoquímico).

En una divulgación se proporcionan proteínas S1PP2C1 mutantes de función reducida o de pérdida de función y plantas y partes de plantas que comprenden uno o más alelos SlPP2C1, que codifican mutantes de función reducida o de pérdida de función. Cualquier tipo de mutación puede conducir a una reducción de la función o a la pérdida de la función de la proteína codificada, por ejemplo, la inserción, la supresión o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ADNc (SEQ ID NO: 1, o variantes) o en la correspondiente secuencia genómica de SlPP2C1 (SEQ ID NO: 11, o variantes). La "secuencia genómica correspondiente" es la secuencia de ADN endógena (representada en la SEQ ID NO: 11, o sus variantes) de los cuales ^s E^q ID NO: 1 ARNm (ADNc), o se transcribe una variante de ARNm. La región genómica de tipo salvaje que se transcribe en ARNm comprende los nucleótidos 2591 a 5050, que incluyen el UTR 5' (nucleótidos 2591-2675 de SEQ ID NO: 11), dos intrones y el 3'UTR (nucleótidos 4976-5050 de SEQ ID NO: 11). La función in vitro y/o in vivo de dichas proteínas puede probarse como se ha descrito anteriormente. Las plantas que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dichas proteínas mutantes de función reducida o de pérdida de función y que tienen una mayor tolerancia a la sequía, pueden, por ejemplo, generarse mediante TILLING o identificarse mediante EcoTILLING, como se describe más adelante.

En una realización de la invención, las secuencias de ácido nucleico (ADNc o genómicas) que codifican dichas proteínas mutantes comprenden una o más mutaciones sin sentido y/o con sentido erróneo, por ejemplo, transiciones (sustitución de purina por otra purina (A ^ G) o de pirimidina por otra pirimidina (C ^ T)) o transversiones (sustitución de purina por pirimidina, o viceversa (C/T ^ A/G). En una realización, la(s) mutación(es) sin sentido y/o con sentido erróneo está(n) en la secuencia de nucleótidos que codifica la región C-terminal, preferentemente en el dominio catalítico (putativo) del aminoácido 84 a 391 de SEQ ID NO: 2 (o de un dominio esencialmente similar en una variante de la proteína S1PP2C1, es decir, en un dominio que comprenda al menos el 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad de aminoácidos con este dominio). En otra realización, la(s) mutación(es) sin sentido y/o con sentido erróneo está(n) en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el aminoácido 307-320 de SEQ ID NO: 2 (o una variante del mismo). En otra realización, la(s) mutación(es) sin sentido y/o con sentido erróneo está(n) en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el sitio putativo de unión al magnesio, es decir, Asp-Gly-His (aminoácido 147-149 de SEQ ID NO:2 o variante del mismo) y/o en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio putativo de interacción con la proteína quinasa (aminoácidos 144-150 de SEQ ID NO: 2 o de un dominio esencialmente similar en una variante de la proteína S1PP2C1).

En una realización específica, las secuencias de ácido nucleico que codifican dichas proteínas mutantes comprenden una o más mutaciones sin sentido en los aminoácidos Gly148, Ser171, Ala155, Gly132 de SEQ ID NO: 2 (o el aminoácido equivalente en una variante de la proteína S1PP2C1). También se incluyen en el presente documento las plantas mutantes, las semillas y las partes de plantas que comprenden una o más de las mutaciones de sentido erróneo mencionadas anteriormente y que tienen una tolerancia al estrés significativamente mayor, especialmente a la sequía.

En una realización específica de la invención, se proporcionan plantas tolerantes a la sequía que comprenden un alelo mutante de pérdida de función o de función reducida de SlPP2C1, por ejemplo, donde el alelo mutante comprende una mutación con sentido erróneo en la secuencia de nucleótidos que codifica GVXDGHG (siendo X cualquier aminoácido, preferentemente Y), o una secuencia esencialmente similar (que comprende al menos el 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad de aminoácidos con este dominio), dando como resultado la sustitución de al menos un aminoácido, por ejemplo dando como resultado, por ejemplo, DVXDGHG o GVXDGHD o DVXDGHD o GVXDDHG.

La función de dominios específicos, tal como el dominio N-terminal o el dominio catalítico o el dominio de unión al magnesio y/o de interacción con la proteína quinasa, puede analizarse mediante la supresión de todo o parte del dominio o dominios en una proteína S1PP2C1 o la introducción de una o más mutaciones en el dominio, y el análisis del efecto resultante en la función de la proteína SlPP2C1. Asimismo, las plantas que comprenden mutaciones espontáneas o inducidas (por ejemplo, generadas por TILLING o identificadas por EcoTILLING) pueden ser analizadas para la mutación y el fenotipo de la planta que comprende la mutación, en particular la tolerancia a la sequía.

En una realización, la proteína S1PP2C1 de pérdida de función o de función reducida es una proteína truncada, es decir, un fragmento de proteína de cualquiera de las proteínas S1PP2C1 definidas más arriba (incluidas sus variantes). En general, el EMS (metanosulfonato de etilo) induce sustituciones de guanina/citosina a adenina/timina. En el caso de un codón de glutamina (Gln o Q, codificado por los nucleótidos CAA o CAG) o de arginina (Arg o R, codificado por los nucleótidos CGA), una sustitución de la citosina por timina puede conducir a la introducción de un codón de parada en el marco de lectura (por ejemplo, de CAA/CAG/CGA a TAA/TAG/TGA), lo que da lugar a una proteína truncada. La proteína truncada puede, por ejemplo, comprender los aminoácidos 1 a cualquiera de los aminoácidos Gln (codificados por CAA o CAG) o Arg (codificados por CGA) aguas abajo del codón de inicio de SEQ ID NO: 2, o de una variante de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, la proteína truncada puede, por ejemplo, comprender o consistir en los aminoácidos 1-5, 1-1-20, 1-28, 1-33. 1-35, 1-36, 1-40, 1-43, 1-44, 1-46, 1-48, 1-49, 1­ 5-. 1-51, 1-54, 1-57, 1-66, 1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-83 de SEQ ID NO: 2, o 1-85, 1-88, 1-91, 1-93, 1-94, 1-97, 1-104, 1-106, 1-110, 1-120 1-130, 1-141, 1-149, 1-151, 1-160, 1-170, 1-200, 1-301, 1-302, 1-305, 1-307, u otras proteínas truncadas de S1PP2C1 (SEQ ID NO: 2), o de una variante del mismo.

También se proporcionan secuencias de ácido nucleico (ADN genómico, ADNc, ARN) que codifican proteínas S1PP2C1, como, por ejemplo, la S1PP2C1 representada en la SEQ ID NO:2 o variantes de la misma como se ha definido anteriormente (incluyendo cualquier proteína quimérica o híbrida o proteínas mutadas o truncadas descritas), o cualquier proteína SlPP2C1 de otra especie. Debido a la degeneración del código genético, varias secuencias de ácido nucleico pueden codificar la misma secuencia de aminoácidos. Cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifique una proteína S1PP2C1 (como se ha definido anteriormente, incluyendo sus variantes) se denomina en el presente documento SIPP2C1. Las secuencias de ácido nucleico proporcionadas incluyen secuencias de ácido nucleico naturales, artificiales o sintéticas. En la SEQ ID NO. se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica S1PP2C1: 1 (secuencia de ADNc del tomate) y SEQ ID NO: 11 (ADN genómico de tomate que codifica la proteína S1PP2C1 de tipo salvaje). La secuencia genómica correspondiente puede aislarse mediante procedimientos rutinarios, como la PCR utilizando cebadores específicos o degenerados basados en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11.

Se entiende que cuando las secuencias se representan como secuencias de ADN mientras se hace referencia al ARN, la secuencia de bases real de la molécula de ARN es idéntica con la diferencia de que la timina (T) se sustituye por uracilo (U).

También se proporcionan secuencias de ácido nucleico (ADN genómico, ADNc, ARN) que codifican proteínas S1PP2C1 mutantes, es decir, proteínas S1PP2C1 de función reducida o de pérdida de función, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de SIPP2C1 que comprenden una o más mutaciones sin sentido y/o con sentido erróneo en la secuencia codificante de SlPP2C1 de tipo salvaje, haciendo que la proteína codificada no sea funcional o tenga una función reducida in vivo y/o in vitro. También se proporcionan secuencias con otras mutaciones, tales como mutantes de sitio de empalme, es decir, mutaciones en la secuencia genómica S1PP2C1 que conducen a un empalme aberrante del pre-ARNm, y/o mutaciones de cambio de marco, y/o inserciones y/o deleciones de uno o más ácidos nucleicos.

También se incluyen variantes y fragmentos de secuencias de ácido nucleico de SIPP2C1, tales como secuencias de ácido nucleico que hibridan con secuencias de ácido nucleico de SIPP2C1, por ejemplo, con SEQ ID NO: 1, en condiciones estrictas de hibridación, como se ha definido. Las variantes de las secuencias de ácido nucleico SIPP2C1 también incluyen secuencias de ácido nucleico que tienen una identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 (nucleótidos 2676 - 4975) de al menos el 50% o más, preferentemente al menos el 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más (según lo determinado por Emboss "needle" utilizando los parámetros por defecto, es decir, penalización por creación de huecos = 10, penalización por extensión de huecos = 0,5, matriz de puntuación nwsgapdna). Está claro que se pueden utilizar muchos procedimientos para identificar, sintetizar o aislar variantes o fragmentos de secuencias de ácido nucleico de SlPP2C1, como la hibridación de ácidos nucleicos, la tecnología PCR, el análisis in silico y la síntesis de ácidos nucleicos, y similares. Variantes de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 (nucleótidos 2676 - 4975) pueden codificar proteínas S1PP2C1 funcionales de tipo salvaje (por ejemplo, alelos de otras variedades de tomate o líneas de reproducción o accesiones salvajes, u ortólogos de otras especies distintas del tomate), o pueden codificar alelos mutantes de función reducida o de pérdida de función de cualquiera de ellas, como por ejemplo generados o identificados por procedimientos como TILLING o EcoTILLING, u otros procedimientos.

Los fragmentos incluyen partes de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de SIPP2C1 mencionadas anteriormente (o variantes), que pueden utilizarse, por ejemplo, como cebadores o sondas o en construcciones de silenciamiento de genes. Las partes pueden ser tramos contiguos de al menos aproximadamente 10, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 50, 60, 100, 200, 300, 450, 500, 600, 700, 800, 900, o más, nucleótidos de longitud, tanto de la cadena codificante (cadena sentido) como de la cadena complementaria (cadena antisentido,). También se incluyen, por tanto, fragmentos de secuencias de ácido nucleico de SIPP2C1, en los que un fragmento de al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 100, 150, 200 300, 450, 500, 600, 700, 800, 900 nucleótidos de longitud comprende al menos el 50, 60, 70, 75%, más preferentemente al menos 80, 90, 95, 98, 99% o más (100%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con otro fragmento de una secuencia de ácidos nucleicos de SIPP2C1 de aproximadamente la misma longitud (según lo determinado por la alineación por pares utilizando Emboss "needle" con los parámetros por defecto, es decires decir, penalización por creación de huecos = 10, penalización por extensión de huecos = 0,5, matriz de puntuación nwsgapdna).

Los pares de cebadores que pueden utilizarse para la amplificación por PCR de los transcritos de SIPP2C1 (ARNm o ADNc correspondiente) a partir de una muestra de ADN de tejido vegetal se describen, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 3 y 4 y en el par de cebadores de SEQ ID NO: 9 y 10. Estos pares de cebadores pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión de SIPP2C1 en el tejido vegetal, por ejemplo, en el tejido foliar del tomate. Asimismo, pueden diseñarse otros cebadores específicos o degenerados basados en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 (nucleótidos 2676 - 4975) y se utilizó para amplificar variantes de alelos de SIPP2C1 de otras líneas de tomate o de otras especies.

Una vez que se ha generado y/o identificado un alelo mutante específico de SIPP2C1 (por ejemplo, mediante TILLING o EcoTILLING), también pueden diseñarse cebadores o sondas específicas para el alelo mutante y puede desarrollarse un ensayo que detecte la presencia y/o ausencia del alelo mutante en una planta o parte de la planta (utilizando ensayos de detección específicos del alelo). Pueden desarrollarse ensayos de marcadores moleculares para la detección y/o transferencia (por ejemplo, mediante MAS, selección asistida por marcadores) del alelo mutante. Por ejemplo, se puede desarrollar un ensayo de detección de SNP o un marcador CAPS que detecte la presencia de la secuencia de ácidos nucleicos de SIPP2C1 mutante en el ADN de las plantas y/o que pueda utilizarse para la transferencia del alelo a otras plantas.

En una divulgación se proporcionan secuencias de ácido nucleico mutantes, en las que la secuencia de ácidos nucleicos SIPP2C1 comprende una o más mutaciones que conducen a un mutante de pérdida de función de la proteína S1PP2C1 o a un mutante de función reducida de la proteína S1PP2C1. Este aspecto se describirá con más detalle en otra parte del presente documento.

También pueden identificarse o generarse plantas (por ejemplo, por recombinación homóloga, o por inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos, etc.) que tengan una o más mutaciones en la(s) región(es) reguladora(s) de SIPP2C1, por ejemplo, el promotor, por lo que la expresión del gen SIPP2C1, es decir, los niveles de ARNm (de SEQ ID NO: 1 o variantes) es/son significativamente reducidos en la planta en comparación con el tipo salvaje y por lo que la planta ha mejorado significativamente la tolerancia a la sequía.

La secuencia de ácidos nucleicos descrita anteriormente, o fragmentos de la misma, en particular la secuencia de ADN, que codifica las proteínas S1PP2C1 de esta invención (o variantes de las mismas) puede insertarse en vectores de expresión (en enfoques de co-supresión) o en vectores de silenciamiento de genes para generar plantas tolerantes a la sequía.

En una realización de la invención, la expresión del gen SIPP2C1 se regula a la baja en una célula huésped, planta o tejido(s) específico(s), por ejemplo, mediante enfoques de ARNi, como se describe en otra parte.

En otra realización se proporcionan plantas que comprenden uno o más alelos mutantes de SIPP2C1, por lo que la(s) mutación(es) confiere(n) una mayor tolerancia a la sequía en la planta en comparación con las plantas que carecen del alelo(s) mutante(s). Los alelos mutantes se generan preferentemente por mutagénesis de la planta o semilla e identificando aquellas plantas o semillas que comprenden una o más mutaciones en el alelo o alelos de PP2C1 diana y por las que la mutación resulta en la abolición de la transcripción o traducción (de modo que no se produce la proteína S1PP2C1), o en la traducción de una proteína S1PP2C1 de función reducida o de pérdida de función. La reducción de la proteína S1PP2C1 funcional, de tipo salvaje, al menos en el tejido foliar, confiere una mayor tolerancia a la sequía a la planta, a la parte de la planta o a la semilla.

En otra divulgación se proporcionan cebadores y/o sondas de PCR y kits para detectar las secuencias de ADN SIPP2C1 . Pueden sintetizarse pares de cebadores de PCR degenerados o específicos para amplificar el ADN de SIPP2CI de las muestras en base a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 (por ejemplo, en base a los nucleótidos 2676 - 4975 o 2591- 5050) como se conoce en la técnica (véase Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressy McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, primera edición, Springer Verlag, Alemania). Asimismo, los fragmentos de ADN de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 (o sus variantes) pueden utilizarse como sondas de hibridación. Un kit de detección de SIPP2C1 puede comprender cebadores específicos de SIPP2C1 y/o sondas específicas de SIPP2C1, y un protocolo asociado para utilizar los cebadores o la sonda para detectar ADN de SIPP2C1 en una muestra. Dicho kit de detección puede utilizarse, por ejemplo, para determinar si una planta ha sido transformada con un gen SIPP2C1 (o parte del mismo) de la invención o si una planta comprende uno o más alelos mutantes de SIPP2C1 . Debido a la degeneración del código genético, algunos codones de aminoácidos pueden ser sustituidos por otros sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína.

En otra divulgación se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a una proteína S1PP2C1, o proteína S1PP2C1 mutante, según la invención. En particular, los anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen a la S1PP2C1, o a fragmentos o variantes de la misma (por ejemplo, proteínas mutantes), están comprendidos en el presente documento. Se puede preparar un anticuerpo utilizando una proteína S1PP2C1 según la invención como antígeno en un animal utilizando procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos en Harlow y Lane "Using Antibodies: A laboratory manual"(Nueva York: Cold Spring Harbor Press 1998) y en Liddell y Cryer "A Practical Guide to Monoclonal Antibodies" (Wiley and Sons, 1991). Los anticuerpos pueden utilizarse posteriormente para aislar, identificar, caracterizar o purificar la proteína SlPP2C1 a la que se une, por ejemplo para detectar la proteína S1PP2C1 en una muestra, permitiendo la formación de un inmunocomplejo y detectando la presencia del inmunocomplejo mediante, por ejemplo, ELISA (inmunoensayo ligado a enzimas) o análisis de inmunoblot. También se proporcionan kits inmunológicos, útiles para detectar las proteínas S1PP2C1, fragmentos de proteínas o epítopos en una muestra proporcionada. Las muestras pueden ser células, sobrenadantes celulares, suspensiones celulares, tejidos, etc. Dicho kit comprende al menos un anticuerpo que se une a una proteína S1PP2C1 y uno o más reactivos de inmunodetección. Los anticuerpos también pueden utilizarse para aislar/identificar otras proteínas S1PP2C1, por ejemplo mediante ELISA o Western blotting.

Está claro que se pueden utilizar muchos procedimientos para identificar, sintetizar o aislar variantes o fragmentos de secuencias de ácido nucleico de SIPP2C1, tal como la hibridación de ácidos nucleicos, la tecnología PCR, el análisis in silico y la síntesis de ácidos nucleicos, y similares. Así, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína S1PP2C1 puede ser una secuencia sintetizada químicamente o clonada a partir de cualquier especie vegetal.

Plantas transgénicas tolerantes a la sequía

Se proporcionan plantas, semillas y partes de plantas transgénicas en las que se silencia SIPP2C1, preferentemente al menos en el tejido foliar o aéreo, y que tienen una mayor tolerancia a la sequía en comparación con las plantas de control de tipo salvaje (no transgénicas) u otras plantas de control (por ejemplo, transformantes de vector vacío).

En una realización de la invención se utiliza una secuencia de ácidos nucleicos homóloga o heteróloga para silenciar el/los gen(es) SIPP2C1 endógeno(s) de la especie huésped Solanum lycopersicum que se va a transformar. Por ejemplo, un gen SIPP2C1 de patata, como el StPP2C1 de SEQ ID NO: 14 (o una variante o fragmento del mismo) puede utilizarse para silenciar la expresión del gen SIPP2C1 en plantas de tomate transgénicas. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias de ácido nucleico SIPP2C1 homólogas. Por ejemplo, una secuencia procedente de una especie de planta de tomate se reintroduce en dicha especie (tomate). Así, en una realización, el ADN SIPP2C1 corresponde a, o es una modificación/variante del ADN SIPP2C1 endógeno de la especie que se utiliza como especie huésped en la transformación. Así, se utiliza preferentemente un ADNc o ADN genómico de SIPP2C1 de tomate (o una variante o fragmento del mismo) para transformar plantas de tomate. Además (por razones de aprobación reglamentaria y aceptación pública), la secuencia de ácidos nucleicos homóloga o heteróloga puede estar vinculada de forma operativa a una secuencia reguladora de la transcripción, especialmente a un promotor, que también procede de una especie vegetal o incluso de la misma planta que se va a transformar.

Para generar plantas que comprenden un gen quimérico, que al expresarse resulta en el silenciamiento de la expresión de un gen o familia de genes SIPP2C1 endógenos, se pueden utilizar procedimientos conocidos en la técnica.

El "silenciamiento génico" se refiere a la regulación a la baja o a la inhibición completa de la expresión génica de uno o más genes diana, por ejemplo, los genes SIPP2C1, en una célula o tejido huésped. Se entiende que en cualquier experimento de transformación se observa un cierto grado de variación en el fenotipo de los transformantes, normalmente debido a efectos de posición en el genoma y/o debido al número de copias. En general, en el presente documento se distinguen las plantas con silenciamiento génico "débil" y "fuerte" (todas ellas son realizaciones de la invención), en las que los eventos de silenciamiento génico (ARNi) "débil" se refieren a plantas o partes de plantas en las que la expresión del gen diana endógeno se reduce en aproximadamente un 15, 20 o 30% en comparación con el tejido de control y los eventos de silenciamiento génico (ARNi) "fuerte" se refieren a plantas o partes de plantas en las que la expresión del gen diana endógeno se reduce en al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90% o más en comparación con el tejido de control (por ejemplo, de tipo salvaje).por ejemplo, el tipo salvaje). El silenciamiento puede cuantificarse, por ejemplo, mediante la cuantificación del nivel de transcripción del gen diana (por ejemplo, utilizando RT-PCR cuantitativa) y/o mediante la determinación y opcionalmente la cuantificación de la actividad enzimática de la proteína S1PP2C1 diana y/o la evaluación y opcionalmente la cuantificación del fenotipo resultante (mayor tolerancia a la sequía y/o mayor sensibilidad al ABA).

Sin limitar el alcance de la invención, pueden seleccionarse plantas que tengan un nivel óptimo de silenciamiento, de modo que las plantas resultantes tengan una tolerancia a la sequía significativamente mejorada en las condiciones climáticas a las que están expuestas en el campo, al tiempo que tienen efectos secundarios negativos mínimos, como un rendimiento reducido, un número reducido de frutos, etc. en comparación con los controles. Preferentemente, la supervivencia y/o el rendimiento aumentan en las plantas tolerantes a la sequía.

El uso de ARN inhibidor para reducir o suprimir la expresión génica está bien establecido en la técnica y es objeto de varias revisiones (por ejemplo Baulcombe 1996, Plant Cell 8(2): 179-188 Depicker y Van Montagu, 1997, Curr Opin Cell Biol. 9(3): 373-82). Existe una serie de tecnologías disponibles para lograr el silenciamiento de genes en las plantas, como los genes quiméricos que producen ARN antisentido de todo o parte del gen diana (véase, por ejemplo EP 0140308 B1, Ep 0240208 B1 y EP 0223399 B1), o que producen ARN en sentido del gen diana (también denominado "co-supresión"), véase EP 0465572 B1.

Sin embargo, el enfoque más exitoso hasta ahora ha sido la producción de ARN tanto en sentido como en antisentido del gen diana ("repeticiones invertidas"), que forma aRn de doble cadena (ARNd) o una estructura de bucle de tallo (ARN de horquilla, ARNhp) en la célula y silencia el/los gen(es) diana al transcribirse desde un promotor aguas arriba. Los procedimientos y vectores para la producción de ARNds y ARNhp y el silenciamiento de genes se han descrito en los documentos EP 1068311, EP 983370 A1, EP 1042462 A1, Ep 1071762 A1 y EP 1080208A1.

Un gen quimérico para la transformación de plantas puede, por lo tanto, comprender una región reguladora de la transcripción que sea activa en las células vegetales unida de forma operativa a un fragmento de ADN en sentido y/o antisentido (o una secuencia completa de ácido nucleico) de, o complementaria o sustancialmente similar a, un gen o familia de genes diana de SLPP2C1 .

Generalmente son suficientes tramos cortos (sentido y antisentido) de la secuencia del gen diana, tal como 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos de la secuencia codificante y/o no codificante del gen diana. También pueden utilizarse secuencias más largas, como por ejemplo de al menos aproximadamente 50, 100, 200, 250, 500, 1000 o más nucleótidos. Incluso el ADN correspondiente o complementario al ARN transcrito completo o al ARNm puede utilizarse para hacer una construcción en sentido y/o antisentido. Preferentemente, los fragmentos/secuencias en sentido y antisentido están separados por una secuencia espaciadora, como un intrón, que forma un bucle (u horquilla) al formarse el ARNds.

En principio, se puede apuntar a cualquier gen o familia de genes SIPP2C1. Por ejemplo, uno o varios alelos específicos de SlPP2C1 pueden ser silenciados eligiendo una región de ácido nucleico de sus transcritos primarios o de ARNm específicos para estos alelos (véase Byzova et al. Planta 2004 218: 379-387 para el silenciamiento específico del alelo en un órgano específico). Del mismo modo, se puede silenciar toda una familia de genes eligiendo una o más regiones conservadas de los transcritos para hacer la construcción de silenciamiento. Como se ha mencionado anteriormente, la región de ADN utilizada en sentido y/o antisentido no tiene por qué formar parte de la región codificante, sino que también puede corresponder a, o ser complementaria a, partes del transcrito primario (que comprende una secuencia no traducida 5' y 3' e intrones, como se representa en los nucleótidos 2591-5050 de SEQ ID NO: 11) o a partes del transcrito del ARNm (donde se han eliminado los intrones y se ha añadido una cola de poli A). Se entiende que en una secuencia de ADN que corresponde a una secuencia de ARN la U se sustituye por una T. También se observa que en un gen quimérico que transcribe un ARNd o un ARNh capaz de silenciar la expresión del gen SIPP2C1 al transcribirse en una célula huésped, las regiones en sentido y en antisentido no tienen por qué tener la misma longitud y una región puede ser más larga que la otra.

Así, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o sus variantes, como se ha descrito anteriormente, o fragmentos de cualquiera de ellos, o la secuencia genómica o la secuencia de transcripción primaria de SEQ ID NO: 1 (como se representa en la SEQ ID NO: 11 del nucleótido 2591 al 5050), puede utilizarse para hacer un gen silenciador del gen SIPP2C1 y un vector y una planta transgénica en la que uno o más genes SIPP2C1 se silencian en todos o algunos tejidos u órganos, o al inducirse (véase, por ejemplo Wielopolska et al. Plant Biotechnol J. 2005 6:583-90). Una forma conveniente de generar construcciones de horquilla es utilizar vectores genéricos como los vectores pHANNIBAL, pHELLSGATE, pSTARGATE en base a la tecnología Gateway® (véase Wesley et al. 2004, Methods Mol Biol.

265:117-30 Wesley et al. 2003, Methods Mol Biol. 236:273-86 y Helliwell & Waterhouse 2003, Methods 30(4):289-P95). Véase también http://www.pi.csiro.au/rnai/ para otros vectores de silenciamiento de genes, como los vectores de silenciamiento inducible y los vectores para el silenciamiento de múltiples genes diana, y para el programa MatchPoint, que puede utilizarse para encontrar la mejor secuencia para silenciar el gen diana. Mediante la elección de secuencias de ácido nucleico conservadas se pueden silenciar todos los miembros de la familia de genes SIPP2C1 en una planta huésped. El silenciamiento de todos los miembros de la familia de una planta huésped es una realización específica.

En una realización, el promotor, que está vinculado de forma operable a la secuencia de ácidos nucleicos en sentido y/o antisentido (para hacer un gen quimérico de silenciamiento/ARNi) se selecciona entre un promotor constitutivo, un promotor inducible (por ejemplo, inducible por estrés, inducible por luz, inducible químicamente, etc.), un promotor inducible por hormonas (por ejemplo, inducible por etileno o aBa, etc.) un promotor específico de la hoja o un promotor activo en el tejido aéreo. También se incluyen aquí los promotores tempranos que responden a la deshidratación, como el RD2, así como otros promotores inducibles por estrés, como el RD29 (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki 1993, Mol Genet 236: 331-340).

En ciertas realizaciones puede ser adecuado un promotor específico de la fruta. Además, el propio promotor de un gen SIPP2C puede utilizarse para enfoques de silenciamiento. El promotor del tomate está comprendido en la SEQ ID NO: 11 desde el nucleótido 1-2675, especialmente el promotor comprende o consiste en unos 2000 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio de traducción ATG en la posición 2676-2679 de la SEQ ID NO: 11) o fragmentos funcionales de los mismos (por ejemplo, 1500 pb, 1000 pb o menos aguas arriba de la ATG). Opcionalmente, una UTR 3' puede estar vinculada de forma operable al extremo 3' del gen quimérico, de modo que los elementos de ADN vinculados de forma operable incluyen promotor - gen SIPP2C1 RNAi - 3'UTR.

Los promotores constitutivos preferentes incluyen: los promotores constitutivos fuertes 35S o los promotores 35S mejorados (los "promotores 35s") del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) de los aislados CM 1841 (Gardner et al., 1981, Nucleic Acids Research 9, 2871-2887), CabbB-S (Franck et al., 1980, Cell 21, 285-294) y CabbB-JI (Hull y Howell, 1987, Virology 86,482-493); el promotor 35S descrito por Odell et al. (1985, Nature 313, 810-812) o en US5164316Promotores de la familia de la ubiquitina (por ejemplo, el promotor de la ubiquitina del maíz de Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18,675-689, PE 0342 926, véase también Cornejo et al. 1993, Plant Mol.Biol. 23, 567-581), el promotor gos2 (de Pater et al., 1992 Plant J. 2, 834-844), el promotor emu (Last et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 81,581-588), los promotores de actina de Arabidopsis, como el promotor descrito por An et al. (1996, Plant J. 10, 107.), promotores de actina de arroz como el promotor descrito por Zhang et al.(1991, The Plant Cell 3, 1155-1165) y el promotor descrito en el documento US 5,641,876 o el promotor de actina 2 de arroz descrito en el documento WO070067; promotores del virus del mosaico venoso de la yuca (WO 97/48819, Verdaguer et al. 1998, Plant Mol. Biol. 37,1055-1067), la serie de promotores pPLEX del virus del trébol subterráneo (WO 96/06932particularmente el promotor S7), un promotor de la alcohol deshidrogenasa, por ejemplo, pAdhlS (números de acceso del GenBank X04049, X00581), y el promotor TR1' y el promotor TR2' (el "promotor TR1" y el "promotor TR2", respectivamente) que impulsan la expresión de los genes 1' y 2', respectivamente, del ADN-T (Velten et al., 1984, eMbO J 3, 2723-2730), el promotor del virus del mosaico de la higuera descrito en el documento US6051753 y en el documento EP426641, promotores de genes de histonas, tal como el promotor Ph4a748 de Arabidopsis (PMB 8: 179-191), u otros.

Alternativamente, se puede utilizar un promotor que no sea constitutivo sino que sea específico para uno o más tejidos u órganos de la planta (tejido preferente / tejido específico, incluyendo promotores regulados por el desarrollo). Por ejemplo, puede utilizarse un promotor activo en el tejido foliar o en las partes aéreas de la planta, o promotores específicos de la epidermis o de las células de guarda.

Promotores específicos epidérmicos, tal como por ejemplo el promotor LTP1 de Arabidopsis (Thoma et al, 1994, Plant Physiol. 105(1):35-45.), el promotor CER1 (Aarts et al 1995. Célula vegetal. 7:2115-27), y el promotor C^e R6 (Hooker et al 2002, Plant Physiol 129:1568-80) y el ortólogo del tomate LeCER6 (Vogg et al, 2004, J. Exp Bot. 55: 1401-10), proporcionan una expresión específica en las superficies epidérmicas de la superficie.

También son adecuados los promotores específicos de la hoja o del tejido fotosintético, tal como el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa inducible por la luz (Pssu) de Arabidopsis, como se describe en en documento US5034322 o de girasol, de guisante (US 5254799) o de Zea mays; el promotor ST-LS1 de la patata, que es específico del tallo y de la hoja (Stockhaus et al. 1987, Nucleic Acids Res.15(8):3479-91); el promotor de la proteína de unión a la clorofila a/b (CAB).

Promotores específicos de células de guarda, tal como el promotor DGP1 (Li et al., Sci China C Life Sci. 2005 48(2):181-6) o promotores inducibles por estrés de sequía como RD29 (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki 1993, supra), que es activo en casi todos los órganos y tejidos de las plantas vegetativas durante la deficiencia de agua.

El experto puede probar fácilmente diversos promotores para comprobar su especificidad e idoneidad en los procedimientos según la invención. Además, la especificidad de los promotores puede modificarse suprimiendo, añadiendo o sustituyendo partes de la secuencia promotora. Dichos promotores modificados pueden vincularse de forma operativa a genes reporteros para comprobar su actividad espacio-temporal en plantas transgénicas.

Otra alternativa es utilizar un promotor cuya expresión sea inducible. Ejemplos de promotores inducibles son los promotores químicos inducibles, tal como la dexametasona descrita por Aoyama y Chua (1997, Plant Journal 11: 605-612) y en el documento US6063985 o por tetraciclina (promotor TOPFREE o ToP 10, véase Gatz, 1997, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 48: 89-108 y Love et al. 2000, Plant J. 21: 579-88). Otros promotores inducibles son, por ejemplo, inducibles por un cambio de temperatura, como el promotor de choque térmico descrito en el documento US 5.447.858 por condiciones anaeróbicas (por ejemplo, el promotor ADH1S del maíz), por la luz (US6455760), por patógenos (por ejemplo EP759085 o EP309862) o por la senescencia (SAG12 y SAG13, véase US5689042) o por la sequía (véase más arriba). Evidentemente, existe una serie de otros promotores disponibles. Ejemplos de otros promotores inducibles son el promotor Adh1 que es inducible por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70 que es inducible por estrés por calor, y el promotor PPDK que es inducible por luz. Un promotor preferente es el sistema promotor inducible por etanol, como se describe en Ait-ali et al. (2001, Plant Biotechnology Journal 1, 337-343), donde el tratamiento con etanol activa alcR, que a su vez induce la expresión del promotor alc:35S. Véase también Deveaux et al. (2003, The ethanol switch: a tool for tissue-specific gene induction during plant development. Plant J. 36, 918-930).

Opcionalmente, el gen de ARNi del promotor-SlPP2C1 puede comprender además señales de regulación de la transcripción en el extremo 3' ("3'end" o "3' UTR") (es decir, señales de formación de la transcripción y de poliadenilación). Las señales de poliadenilación y de formación de la transcripción incluyen las del gen de la nopalina sintasa ("3' nos") (Depicker et al., 1982 J. Molec. Appl. Genética 1, 561-573.), el gen de la octopina sintasa ("3'ocs") (Gielen et al., 1984, EMBO J 3, 835-845) y el gen del ADN-T 7 ("3' gen 7") (Velten y Schell, 1985, Nucleic Acids Research 13, 6981-6998), que actúan como secuencias de ADN no traducidas en células vegetales transformadas, y otros.

El gen quimérico de silenciamiento de SIPP2C1 (es decir, el promotor operativamente unido a una secuencia de ácidos nucleicos que al transcribirse en una célula vegetal es capaz de silenciar la expresión del gen endógeno SIPP2C1 ) puede insertarse de manera estable y convencional en el genoma nuclear de una única célula vegetal, y la célula vegetal así transformada puede utilizarse de manera convencional para producir una planta transformada que tenga un fenotipo alterado debido al silenciamiento de SIPP2C1 en determinadas células en un momento determinado. A este respecto, puede introducirse en Agrobacterium tumefaciens un vector de ADN-T, que comprenda un promotor operablemente unido a una secuencia de SlPP2C1 en sentido y/o antisentido (y opcionalmente una 3'UTR), y utilizarse para transformar la célula vegetal, y a partir de ahí, puede regenerarse una planta transformada a partir de la célula vegetal transformada utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en EP 0116718, EP 0270822, La publicación PCT WO84/02913 y la solicitud de patente europea publicada EP 0 242 246 y en Gould et al. (1991, Plant Physiol. 95,426-434). La construcción de un vector de AdN-T para la transformación de plantas mediada por Agrobacterium es bien conocida en la técnica. El vector de ADN-T puede ser un vector binario como el descrito en PE 0120561 y PE 0120515 o un vector co-integrado que puede integrarse en el plásmido Ti de Agrobacterium por recombinación homóloga, como se describe en el documento PE 0116718.

Los vectores de ADN-T preferentes contienen cada uno un promotor operativamente vinculado al gen silenciador SlPP2C1 entre las secuencias de borde del ADN-T, o al menos situado a la izquierda de la secuencia de borde derecha. Las secuencias fronterizas se describen en Gielen et al. (1984, EMBO J 3,835-845). Por supuesto, pueden utilizarse otros tipos de vectores para transformar la célula vegetal, utilizando procedimientos como la transferencia directa de genes (como se describe, por ejemplo, en EP 0223247), la transformación mediada por el polen (como se describe, por ejemplo, en el documento PE 0 270 356 y WO85/01856), la transformación de protoplastos como, por ejemplo, la descrita en el documento US 4.684.611 la transformación mediada por un virus de ARN vegetal (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0067553 y US 4.407.956), la transformación mediada por liposomas (descrita, por ejemplo, en el documento US 4.536.475), y otros procedimientos como los descritos para transformar ciertas líneas de maíz (por ejemplo US 6.140.553; Fromm et al., 1990, Bio/Technology 8, 833-839 Gordon-Kamm et al., 1990, The Plant Cell 2, 603-618) y el arroz (Shimamoto et al., 1989, Nature 338, 274­ 276; Datta et al. 1990, Bio/Technology 8, 736-740) y el procedimiento de transformación de monocotiledóneas en general (Publicación PCT WO92/09696). Para la transformación del algodón, véase también WO 00/71733y para la transformación del arroz véanse también los procedimientos descritos en los documentos WO92/09696, WO94/00977 y WO95/06722. Para la transformación del sorgo, véase, por ejemplo Jeoung JM et al. 2002, Hereditas 137: 20-8 o Zhao ZY et al. 2000, Plant Mol Biol.44:789-98). Para la transformación del tomate o del tabaco, véase también An G. Biology Manual A5, Dordrecht, Países Bajos, Kluwer Academic Publishers, pp 1-9 Koornneef M. et al., 1986, In: Nevins D.J. y R.A. Jones, eds. Tomato Biotechnology, New York, NY, USA, Alan R. Liss, Inc. pp 169-178). Para la transformación de la patata, véase, por ejemplo Sherman y Bevan (1988, Plant Cell Rep. 7: 13-16). La transformación y la regeneración del tomate también pueden llevarse a cabo según De Jong et al. (2008) Plant Journal 57:160-170 y Sun et al. (2006) Plant Cell Physiol.

47: 426-431.

Asimismo, la selección y regeneración de plantas transformadas a partir de células transformadas es bien conocida en la técnica. Obviamente, para diferentes especies e incluso para diferentes variedades o cultivares de una misma especie, los protocolos están específicamente adaptados para regenerar transformantes con alta frecuencia.

Además de la transformación del genoma nuclear, también se incluye en la invención la transformación del genoma de los plástidos, preferentemente del cloroplasto. Una de las ventajas de la transformación del genoma de los plástidos es que se puede reducir el riesgo de propagación de los transgenes. La transformación del genoma plasmídico puede llevarse a cabo como se conoce en la técnica, véase, por ejemplo Sidorov VA et al. 1999, Plant J.19: 209-216 o Lutz KA et al. 2004, Plant J. 37(6):906-13.

Los huésped divulgados son de la familia Solanaceae, tal como las especies del género Solanum, por ejemplo, el tomatej'S. lycopersicum).

En una divulgación preferente, el huésped es de la familia Solanaceae. En una divulgación más preferente, el huésped es del género Solanum. El huésped según la presente invención es de la especie S. lycopersicum. Preferentemente, el huésped es un tomate cultivado de la especie S. lycopersicum, es decir, una línea o variedad que produce altos rendimientos, como frutos de al menos 50 g de peso fresco medio o más, por ejemplo, al menos aproximadamente 80 g, 90 g, 100 g, 200 g, 300 g, o incluso hasta 600 g (tipos de tomate bola). También se incluyen los tipos pequeños, como el tomate cherry o de cóctel, así como los tomates de pulpa completa, como la variedad Intense de Nunhems, por ejemplo, que carecen de gel en las cavidades de las semillas. La planta de tomate huésped puede ser determinada o indeterminada, de diversos tamaños y formas de fruto, tal como tipo Roma, tipo racimo, redondo. Puede ser un tomate de tipo de procesamiento o de tipo de mercado fresco. También se incluyen aquí tanto los de polinización abierta como los híbridos. En una realización, la planta de tomate tolerante a la sequía es una planta híbrida F1, cultivada a partir de una semilla híbrida F1. Para hacer semillas híbridas F1 de una planta transgénica según la invención, se pueden hacer dos líneas parentales endogámicas, cada una de las cuales comprende una copia del transgén en sus genomas. Cuando estas plantas se fecundan de forma cruzada, se recogen las semillas F1, que producen plantas híbridas transgénicas F1 con alto rendimiento y tolerancia a la sequía gracias al transgén.

Las realizaciones aquí descritas para las plantas "huésped" también se aplican a las plantas mutantes no transgénicas descritas en otras partes del presente documento, en las que en lugar de un transgén está presente endógenamente un alelo mutante SIPP2C1 .

Por lo tanto, en una realización de la invención, las plantas transgénicas comprenden un elemento regulador de la transcripción (especialmente un promotor como el descrito anteriormente) unido de forma operable a una molécula de ácido nucleico que al transcribirse es capaz de silenciar la expresión del gen SIPP2C1 endógeno en las células huésped.

La construcción de genes quiméricos y vectores para la introducción, preferentemente estable, del gen silenciador SIPP2C1 en el genoma de las células huésped es generalmente conocida en la técnica. Para generar un gen quimérico, la secuencia SIPP2C sentido y/o antisentido se une de forma operativa a una secuencia promotora, adecuada para la expresión en las células huésped, utilizando técnicas estándar de biología molecular. La secuencia promotora puede estar ya presente en un vector, de modo que la secuencia nucleica se inserta simplemente en el vector a continuación de la secuencia promotora. A continuación, el vector se utiliza para transformar las células huésped y el gen quimérico se inserta en el genoma nuclear o en el genoma de los plástidos, las mitocondrias o los cloroplastos y se expresa allí utilizando un promotor adecuado (por ejemplo, Mc Bride et al., 1995 Bio/Technology 13, 362 US 5,693, 507).

La planta transformada resultante puede utilizarse en un esquema convencional de reproducción de plantas para producir más plantas transformadas con las mismas características o para introducir la parte del gen en otras variedades de la misma especie vegetal o de especies relacionadas. Se puede seleccionar un "evento élite", que es un evento de transformación que tiene el transgén insertado en una ubicación particular en el genoma, que resulta en una buena expresión del fenotipo deseado (por ejemplo, silenciamiento óptimo y tolerancia a la sequía).

En una realización de la invención se desea aumentar la pérdida de agua, es decir, disminuir la tolerancia a la sequía de tejidos específicos y/o disminuir la sensibilidad al ABA de tejidos específicos, por ejemplo frutas, sobreexpresando SIPP2C1 en al menos dichos tejidos. Por ejemplo, para conseguir frutos (por ejemplo, tomates) con una mayor pérdida de agua y, por tanto, una pulpa más sólida y/o un mayor sabor, es adecuado un promotor específico de la fruta o preferente por la fruta, unido de forma operable a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína S1PP2C funcional (SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo). Para conferir la expresión a los frutos, se utilizó un promotor específico para frutos y cáscaras de tomate, por ejemplo, la beta-galactosidasa II (Smith et al., 1998, Plant Physiol 117: 417-23) o el promotor de la cera epicuticular del tomate LeCER6 (Vogg et al, 2004, supra). O un promotor de la piel de la fruta o epidérmico puede ser identificado y aislado por un experto en la materia, utilizando microarrays y la confirmación mediante la transformación de fusiones de genes promotores. Estos promotores también pueden utilizarse para el silenciamiento de SIPP2C1 en tejidos específicos, como las frutas.

Las plantas transgénicas, o partes de ellas, en las que se silencia SIPP2C1, tienen una tolerancia a la sequía significativamente mayor. La tolerancia a la sequía significativamente mejorada (como se ha descrito anteriormente) se utiliza aquí para referirse a una mayor capacidad de los transformantes (en comparación con los transformantes de tipo salvaje o de control) para tolerar uno o más períodos de sequía (privación/agotamiento de agua que conduce, por ejemplo, a síntomas visibles de marchitamiento de las hojas en las plantas de control), como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, las plantas son capaces de recuperarse posteriormente, con lo que se reduce la pérdida de rendimiento global, ya que sobreviven más plantas por m2 y/o el rendimiento de las plantas supervivientes no se reduce significativamente.

La tolerancia a la sequía significativamente mejorada puede evaluarse en entornos controlados (invernadero o cámaras de crecimiento) como se ha descrito anteriormente o utilizando procedimientos equivalentes. Por ejemplo, un procedimiento alternativo es el siguiente: al menos unos 10 transformantes por evento de transformación y al menos 10 plantas de control se colocan durante varios períodos de tiempo (que van desde unas pocas horas hasta 1-4 semanas o más) en el medio ambiente sin regarlas, hasta que se produzca el marchitamiento de las hojas o la pérdida de turgencia en las plantas de control, y posteriormente se vuelven a regar las plantas durante, por ejemplo, al menos 1 semana, 2 semanas o más, mientras se analiza su fenotipo de recuperación. Los transformantes con mayor tolerancia a la sequía sobreviven al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, preferentemente al menos 2-5 días más sin agua que los transformantes de control (por ejemplo, transformados con un vector vacío) o las plantas de tipo salvaje en las mismas condiciones, y que muestran daños irreversibles en los tejidos. Alternativamente, el % de supervivencia puede calcularse en un punto de tiempo determinado, en el que las plantas tolerantes a la sequía tienen un % de supervivencia que es al menos 10%, 20%, 30% o más, superior al del control. Este procedimiento alternativo también puede utilizarse para determinar si las plantas mutantes (es decir, las plantas no transgénicas que comprenden uno o más alelos mutantes de SIPP2C1) tienen una tolerancia a la sequía significativamente mayor. Se entiende que cuando se analizan las plantas mutantes por su fenotipo, las plantas de control son preferentemente cerca de líneas isogénicas del mutante, que comprenden el alelo o alelos de tipo salvaje. El periodo de privación de agua/estrés y el periodo de recuperación pueden variar en función de la especie vegetal. Por ejemplo, en el arroz, 9,5 horas de estrés hídrico seguidas de 10 días de recuperación (riego) son adecuadas para determinar si una línea de plantas o un evento de transformación ha mejorado la tolerancia a la sequía en comparación con el control, ya que el porcentaje de supervivencia aumenta significativamente en la línea tolerante a la sequía (véase, por ejemplo Zheng et al. Comunicaciones de Investigación Bioquímica y Biofísica 2009, 985-989).

En última instancia, los ensayos de campo se utilizan para demostrar que los transformantes (o las plantas mutantes descritas más adelante) han mejorado significativamente la tolerancia a la sequía en comparación con las plantas de tipo salvaje.

Como ya se ha mencionado, las transformantes que tienen un nivel óptimo de silenciamiento pueden seleccionarse, por ejemplo, analizando el número de copias (análisis de Southern blot), los niveles de transcripción de ARNm (por ejemplo, RT-PCR utilizando pares de cebadores SIPP2C1) o analizando la presencia y/o el nivel de la proteína S1PP2C1 en varios tejidos (por ejemplo, SDS-PAGE; ensayos ELISA, etc.). Los eventos transgénicos óptimos se utilizan entonces para nuevos cruces/retrocruzamientos/autocruces hasta obtener un evento élite de alto rendimiento con un transgén estable. En una realización se proporcionan especialmente las semillas transgénicas derivadas de tales plantas, que pueden venderse como "tolerantes a la sequía".

Los transformantes que expresan uno o más genes SIPP2C1 según la invención también pueden comprender otros genes trans, como otros genes que confieren tolerancia a la sequía o que confieren tolerancia a otros estreses bióticos o abióticos. Para obtener tales plantas con transgenes "apilados", se pueden introgresar otros transgenes en los transformantes SIPP2C1, o los transformantes pueden ser transformados posteriormente con uno o más genes, o alternativamente se pueden utilizar varios genes quiméricos para transformar una línea o variedad de plantas. Por ejemplo, varios genes quiméricos pueden estar presentes en un solo vector, o pueden estar presentes en diferentes vectores que son co-transformados.

En una realización, los siguientes genes se combinan con el silenciamiento de SIPP2C1 según la invención: Los genes que codifican otros factores de transcripción del tipo AP2/EREBP, preferentemente los que tienen un papel en la respuesta de la planta a las tensiones ambientales, tal como por ejemplo los genes que codifican CBF1, CBF2, CBF3 y/o CBF4 de Arabidopsis (Jaglo-Ottosen et al 1998, Science 280, 104-106, 1998 Kasuga et al 1999 Nat. Biotechnol. 17, 287-291) o sus ortólogos de otras especies (Dubouzet et al 2003, Plant J. 33: 751), con genes de resistencia a los insectos, tal como los genes de la toxina del Bacillus thuringiensis (que codifican proteínas insecticidas, tal como los genes cry, los genes vip, etc. véase http://www.biols.susx.ac.uk/home/ para una lista de genes disponibles), genes de resistencia a los hongos, genes de resistencia a los herbicidas u otros genes.

Los transformantes apilados pueden así tener una tolerancia al estrés ambiental aún más amplia, por ejemplo a la salinidad, el estrés por frío, la resistencia a los insectos, la resistencia a los patógenos, el estrés por calor, el estrés por agua, etc.

Las plantas enteras, las semillas, las células, los tejidos y la progenie (tal como las semillas/plantas F1, F2, etc.) de cualquiera de las plantas transformadas descritas anteriormente están incluidas en el presente documento y pueden identificarse por la presencia del transgén en el ADN, por ejemplo, mediante un análisis de PCR. También pueden desarrollarse procedimientos de diagnóstico por PCR "específicos para el evento", en los que los cebadores de PCR se basan en el ADN de la planta que flanquea el gen quimérico insertado, véase US6563026. Del mismo modo, se pueden desarrollar huellas dactilares AFLP o RFLP específicas para cada evento que identifiquen la planta transgénica o cualquier planta, semilla, tejido o células derivadas de ella. Se entiende que las plantas transgénicas según la invención preferentemente no muestran fenotipos no deseados, como la reducción del rendimiento, menos frutos por planta, mayor susceptibilidad a las enfermedades o cambios arquitectónicos no deseados (enanismo, deformaciones), etc. y que, si se observan tales fenotipos en los transformantes primarios, éstos pueden eliminarse mediante procedimientos normales de reproducción y selección (cruce / retrocruzamiento / autoselección, etc.). Cualquiera de las plantas transgénicas descritas en el presente documento puede ser homocigota o hemicigota para el transgén.

Plantas no transgénicas tolerantes a la sequía y procedimientos para fabricarlas

También es una realización de la invención utilizar procedimientos no transgénicos, por ejemplo, sistemas de generación e identificación de mutantes diana como TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomics McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455y McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442, Henikoff et al. 2004, Plant Physiol. 135: 630. 636) y la selección para generar líneas de plantas que comprendan al menos una mutación en un alelo SlPP2C1 endógeno y en las que las plantas que comprendan el alelo SlPP2C1 mutante en forma heterocigótica u homocigótica tengan una tolerancia a la sequía significativamente mayor y/o una sensibilidad al ABA significativamente mayor en comparación con las plantas que carezcan del alelo mutante (que tengan alelo(s) de tipo salvaje en el locus SlPP2C1). Por lo tanto, en una realización de la invención se proporcionan plantas que comprenden uno o más alelos mutantes de SIPP2C1 en el genoma y que tienen una tolerancia a la sequía significativamente mejorada en comparación con las plantas que carecen de dicho(s) alelo(s) mutante(s), pero que comprenden alelos de tipo salvaje en su lugar, así como partes de plantas (por ejemplo, frutos cosechados, hojas cosechadas, etc.), semillas, propagaciones clonales de dichas plantas, progenie de dichas plantas que comprenden el alelo mutante.

Una "sensibilidad significativamente reducida al estrés hídrico" o una "tolerancia a la sequía significativamente mejorada" se refiere a una reducción (estadísticamente significativa) de los síntomas de marchitamiento de las hojas de una pluralidad de plantas que comprenden el alelo o alelos mutantes en al menos un 10% en comparación con los niveles de control (por ejemplo, las mismas plantas que carecen del alelo mutante, como las plantas no mutadas) y puede, por ejemplo, ensayarse como se describe en el presente documento para las plantas transgénicas o utilizando procedimientos alternativos equivalentes. En resumen, una pluralidad de plantas mutantes (preferentemente al menos 10, 15, 20 o más plantas de una línea que comprende una mutación particular en el alelo SIPP2C1 ) y controles de la misma edad se saturan con agua al comienzo del experimento y luego no se riegan durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días o más. Cuando los controles comienzan a mostrar el marchitamiento de las hojas ("marchitamiento leve" o "marchitamiento moderado"), se evalúan todas las plantas en busca de signos de marchitamiento de las hojas utilizando, por ejemplo, la evaluación visual. Los síntomas de marchitamiento de las hojas pueden calificarse en una escala de 1 a 4, como "muy marchitado" (4), "moderadamente marchitado" (3), "ligeramente marchitado"(2) o "sin marchitar" (1), por ejemplo. Se dice que las plantas mutantes tienen una tolerancia a la sequía significativamente mejorada si el marchitamiento medio se reduce al menos en un 10%, preferentemente al menos en un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con las plantas de control de tipo salvaje. Por ejemplo, si se puntúan 10 plantas para los síntomas de marchitamiento (w) por línea, el control puede tener una puntuación media de w = 40/10 = 4,0, mientras que la línea tolerante a la sequía puede tener una puntuación media de w = 36/10 = 3,6 o menos, por ejemplo, w = 3,4, 3,2, 2,0, 1,4 o 1,0.

Alternativa o adicionalmente se pueden utilizar ensayos de campo para determinar si el alelo mutante SIPP2C1 confiere a la línea una tolerancia a la sequía significativamente mayor. Por ejemplo, una pluralidad de plantas que comprenden un alelo mutante SIPP2C1 particular (preferentemente al menos 10, 20, 30 o más plantas de una línea) se plantan en el campo junto con plantas de control y no se riegan durante un período de tiempo prolongado, como 1, 2, 3, 4 semanas o más. Cuando las plantas de control muestren marchitamiento, los síntomas de marchitamiento pueden evaluarse como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, se puede evaluar el % de recuperación y/o el % de supervivencia tras el suministro de agua (recuperación). Cuando se produce el marchitamiento de las hojas o la pérdida de turgencia en las plantas de control, se vuelven a regar las plantas (por ejemplo, durante 1 semana, 2 semanas o más) mientras se analiza su fenotipo de recuperación. Los mutantes con mayor tolerancia a la sequía sobreviven al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, preferentemente al menos 2-5 días más sin agua que las plantas de control (por ejemplo, las de tipo salvaje o líneas casi isogénicas) en las mismas condiciones, y que muestran daños irreversibles en los tejidos. Del mismo modo, puede calcularse el % de supervivencia, teniendo la línea de plantas mutantes tolerantes a la sequía un % (medio) de supervivencia que se incrementa al menos en un 10%, 20%, 30% o más, en comparación con la del control.

Como se mencionó anteriormente, se pueden utilizar otros ensayos de tolerancia a la sequía. El ensayo más adecuado puede ser diferente para las distintas especies de cultivos, es decir, para las plantas de tomate puede ser adecuado un ensayo diferente que para la lechuga o el arroz. Por ejemplo, puede medirse un aumento estadísticamente significativo de las plantas (que comprenden el alelo mutante) que se recuperan de un periodo de sequía y/o puede medirse una reducción significativa de la mortalidad de las plantas tras un periodo de sequía en las plantas que comprenden el alelo mutante en comparación con las plantas que carecen de él. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en Zheng et al. (2009, supra), Yu et al. (2008, supra) o Xiong et al. 2006 (supra).

La "sensibilidad al ABA significativamente mejorada" también puede probarse como se describe en los Ejemplos para plantas transgénicas. En resumen, la germinación media de las semillas en un medio que comprende ABA es al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más inferior para la planta que comprende el alelo mutante SIPP2C1 que para el control en la misma concentración de ABA. Por ejemplo, con 1 o 3 pM de ABA, el 50% de las semillas de tipo salvaje germina, mientras que menos del 40%, 35%, 30% o menos, de las semillas mutantes germina. Así, la germinación de las semillas de las plantas que comprenden el alelo mutante se ve más inhibida por el ABA. El crecimiento de las raíces de las plantas que comprenden el alelo mutante también se ve más inhibido por el ABA.

Preferentemente, las plantas fenotipadas para la tolerancia a la sequía y/o la sensibilidad al ABA, como se ha descrito anteriormente, son homocigóticas para el alelo mutante SIPP2C1, aunque las plantas heterocigóticas también pueden ser fenotipadas y también pueden mostrar una mayor tolerancia a la sequía y/o una mayor sensibilidad al ABA. Para generar plantas que comprendan el alelo mutante en forma homocigota, puede utilizarse la autofertilización, opcionalmente combinada con el genotipado (detectando la presencia del alelo mutante, por ejemplo, mediante PCR utilizando cebadores específicos del alelo y/o secuenciación). Si se utilizan poblaciones TILLING, las plantas mutantes (M1) se autofertilizan preferentemente una o más veces para generar, por ejemplo, poblaciones M2 o, preferentemente, poblaciones M3 o M4 para el fenotipado. En las poblaciones M2 el alelo mutante está presente en una proporción de 1 (homocigoto para el alelo mutante) : 2 (heterocigoto para el alelo muíante) : 1 (homocigoto para el alelo de tipo salvaje). La segregación de la tolerancia a la sequía debería correlacionarse con la segregación del alelo mutante.

La planta que comprende el alelo mutante SIPP2C1, o una variante del mismo, y que tiene una mayor tolerancia a la sequía puede ser de cualquier especie, ya que las secuencias de tomate proporcionadas en el presente documento pueden utilizarse para generar e identificar plantas que comprenden mutaciones en homólogos y ortólogos del gen, como se describe más adelante. Se puede identificar la secuencia de ácidos nucleicos de la variante SIPP2C1 endógena en la planta, que puede utilizarse como gen diana en la generación y/o identificación de plantas que comprenden un alelo mutante de la variante SIPP2C1. Así, la planta mutante tolerante a la sequía puede ser una especie dicotiledónea o monocotiledónea. Preferentemente, la planta es una planta cultivada, aunque también es una realización del presente documento identificar alelos mutantes en plantas salvajes o plantas no cultivadas y transferirlos mediante técnicas de reproducción a las plantas cultivadas.

En una divulgación, la planta que comprende al menos un alelo mutante SIPP2C1 (en forma homocigota o heterocigota) y que tiene una tolerancia a la sequía significativamente mejorada (y/o una sensibilidad al ABA significativamente aumentada), es de la familia Solanaceae, es decir, que abarca los géneros Solanum, Capsicum, Nicotiana y otros. En otra divulgación, la planta es del género Solanum, por ejemplo, abarca el tomate cultivado, la patata, la berenjena y otros.

En una divulgación, una planta de patata tolerante a la sequía comprende un alelo mutante SIPP2C1 (por ejemplo, StPP2C1 de SEQ ID NO: 14 o una variante de la misma), que codifica una proteína de función reducida o de pérdida de función (por ejemplo, una proteína StPP2C1 de función reducida o de pérdida de función de SEQ ID NO: 15 o una variante del mismo).

En la presente invención la planta es de la especie S. lycopersicum. Se puede generar y/o identificar cualquier S. lycopersicum que tenga al menos un alelo mutante SlPP2C1 en su genoma y que sea tolerante a la sequía. La planta de tomate puede, por tanto, ser cualquier tomate cultivado, cualquier variedad comercial, cualquier línea de reproducción u otra, puede ser determinada o indeterminada, de polinización abierta o híbrida, y producir frutos de cualquier forma y tamaño. El alelo mutante generado y/o identificado en una planta de tomate en particular, o en un pariente sexualmente compatible, puede ser fácilmente transferido a cualquier otra planta de tomate mediante la reproducción (cruce con una planta que comprende el alelo mutante y luego la selección de la progenie que comprende el alelo mutante).

La planta de la presente invención es de la especie Solanum lycopersicum, cuya especie se muta por sí misma para generar el alelo mutante (por ejemplo, mediante TILLING) o en la que se identifican una o más mutaciones naturales o espontáneas en el gen SlPP2C1 (o variante), por ejemplo, mediante Ecotilling.

El alelo mutante se genera o se identifica en una planta cultivada, pero también puede generarse y/o identificarse en una planta salvaje o en una planta no cultivada y luego transferirse a una planta cultivada utilizando, por ejemplo, cruces y selección (opcionalmente utilizando cruces interespecíficos con, por ejemplo, rescate de embriones para transferir el alelo mutante). Así, puede generarse un alelo mutante SlPP2C1 (mutación inducida por el ser humano mediante técnicas de mutagénesis para mutagenizar el gen diana SlPP2C1 o una variante del mismo) y/o identificarse (variación alélica espontánea o natural) en otras especies de Solanum , incluyendo por ejemplo S. cheesmanii, S. chilense, S. habrochaites, S. chmielewskii, S. lycopersicum x S. peruvianum, S. glandulosum, S. hirsutum, S. minutum, S. parviflorum, S. pennellii, S. peruvianum, S. peruvianum var. humifusum y S. pimpinellifolium, y luego transferidos a una planta cultivada de Solanum , por ejemplo, Solanum lycopersicum , mediante técnicas tradicionales de reproducción. El término "técnicas tradicionales de reproducción" abarca aquí el cruce, la autofertilización, la selección, la producción de dobles haploides, el rescate de embriones, la fusión de protoplastos, etc., tal y como los conoce el obtentor, es decir, procedimientos distintos de la modificación genética por los que se pueden transferir alelos.

La(s) mutación(es) en el alelo SlPP2C1 hace(n) que la planta tenga una tolerancia a la sequía significativamente mejorada y/o una sensibilidad al ABA significativamente mejorada en comparación con las plantas que carecen del(los) alelo(s) mutante(s) (es decir, que comprenden alelos SlPP2C1 de tipo salvaje), como se ha descrito anteriormente.

Sin limitar la invención, la mutación en SlPP2C1 (SEQ ID NO: 1, o sus variantes, o en la secuencia genómica correspondiente, por ejemplo, SEQ ID NO: 11 de los nucleótidos 2676 a 4975, o sus variantes), dan lugar a la reducción de la funcionalidad o a la pérdida de la función de la proteína S1PP2C1, por ejemplo, a través de una o varias transiciones de una sola base, mutaciones con o sin sentido, o la inserción o supresión de uno o más aminoácidos o un cambio de marco en la secuencia de codificación, lo que a su vez da lugar al cambio de fenotipo. La presencia y el tipo de mutación(es) pueden analizarse mediante la secuenciación del gen, utilizando cebadores específicos de SIPP2C1 . Una "reducción significativa" de la funcionalidad de la proteína S1PP2C1 se determina preferentemente de forma indirecta in vivo por el fenotipo (es decir, una tolerancia a la sequía significativamente mayor) en plantas heterocigotas o, preferentemente, homocigotas para el alelo mutante. El fenotipo tolerante a la sequía coincide con el alelo mutante. Sin embargo, una "reducción significativa" de la funcionalidad de la proteína también puede determinarse in vitro mediante ensayos de fosfatasa proteica, en los que la actividad de la fosfatasa proteica S1PP2C1 muíante se reduce al menos en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 (función reducida) o en un 100% (mutación de pérdida de función). Para ello, se clona el alelo mutante y se expresa, por ejemplo, en E. coli, seguido de un ensayo de fosfatasa in vitro como el descrito, por ejemplo, por Gosti et al. 1999, Plant Cell 11: 1897-1910, Material y procedimientos - Actividades PP2C, página 1907.

En una realización de la invención se proporciona una planta de la especie Solanum lycopersicum , que comprende una o más mutaciones en la SEQ ID NO:1 o SeQ ID NO: 11 (de los nucleótidos 2676 a 4975), o en la correspondiente secuencia genómica de cualquiera de ellos, por lo que la mutación da lugar a que la proteína S1PP2C1 codificada (o la variante) tenga una actividad reducida (en comparación con la proteína funcional de tipo salvaje) o ninguna actividad in vivo y/o in vitro y en la que dicha planta comprende una tolerancia a la sequía significativamente mejorada en comparación con una planta (preferentemente tomate) que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína S1PP2C 1 de tipo salvaje (o la variante).

En una realización se proporciona una planta de la especie Solanum lycopersicum , que comprende una o más mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de SEQ ID NO: 2, o una proteína que comprenda al menos un 90%, 95%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 (como se define), y en el que la planta (de tomate) comprende una tolerancia a la sequía significativamente mejorada en comparación con una planta (de tomate) que carece de dicha una o más mutaciones.

En una realización, se proporciona una planta tolerante a la sequía de la especie Solanum lycopersicum que comprende un alelo mutante SlPP2C1, caracterizado porque la mutación es una mutación de pérdida de función o de función reducida de la proteína S1PP2C1 codificada, siendo dicha proteína una proteína que comprende al menos un 90%, 95%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

La planta (por ejemplo, la planta de tomate) es preferentemente homocigota para el alelo mutante SlPP2C1 .

Las plantas mutantes pueden distinguirse de las no mutantes por procedimientos moleculares, como la(s) mutación(es) presente(s) en el ADN genómico o el ARNm (ADNc) de SlPP2C1, los niveles de proteína y/o la actividad proteica de S1PP2C1, etc., y por las características fenotípicas modificadas en comparación con el tipo salvaje. El alelo mutante puede transferirse a otras plantas que sean sexualmente compatibles con la planta mutante mediante el cruce y la selección tradicionales. Así, el alelo mutante puede utilizarse para generar variedades de tomate tolerantes a la sequía de cualquier tipo, por ejemplo, variedades de polinización abierta, variedades híbridas, híbridos F1, tipo Roma, tipo cereza, tipos determinados o indeterminados, etc. En una realización, la plantafS. lycopersicum) que comprende el alelo mutante SlPP2C1 y que tiene una mayor tolerancia a la sequía es una planta híbrida F1 o una semilla F1, a partir de la cual se cultiva una planta híbrida F1. Es preferente que los progenitores endogámicos utilizados para hacer el híbrido F incluyan en su genoma el mismo alelo mutante SlPP2C1 en forma homocigótica.

En otra realización, la planta de tomate que comprende el alelo mutante SlPP2C1 se cruza con otra planta de la misma especie o de una especie estrechamente relacionada, para generar una planta híbrida (semilla híbrida) que comprende el alelo mutante SlPP2C1 . Esta planta híbrida es también una realización de la invención. También se proporciona un procedimiento para transferir un alelo mutante SlPP2C1 a otra planta, que comprende proporcionar una planta que comprende un alelo mutante SlPP2C1 en su genoma, cruzar dicha planta con otra planta y obtener las semillas de dicho cruce. Opcionalmente, las plantas obtenidas a partir de estas semillas se pueden autofertilizar y/o cruzar y seleccionar la progenie que comprenda el alelo mutante y que tenga una mayor tolerancia a la sequía.

En una realización, los progenitores utilizados para hacer el híbrido F1 comprenden diferentes alelos mutantes SlPP2Cl en forma homocigota, de modo que el híbrido comprende dos alelos mutantes SlPP2C1 diferentes. Por ejemplo, el progenitor 1 puede comprender un mutante de pérdida de función mientras que el progenitor 2 comprende un mutante de función reducida. El híbrido F1 comprende entonces un alelo de cada progenitor. Así, también se proporcionan plantas de tomate que comprenden dos alelos mutantes diferentes de SlPP2Cl en el locus S1PP2C1 y que tienen una mayor tolerancia a la sequía.

Las plantas que comprenden un alelo mutante de SlPP2C1, que codifica una proteína de pérdida de función o de función reducida (por ejemplo, una proteína truncada como resultado de una mutación sin sentido, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos modificada, que resulta, por ejemplo, en un sitio catalítico modificado, un plegamiento modificado, etc., por ejemplo, debido a una mutación sin sentido, una mutación de cambio de marco y/o una mutación de sitio de empalme), puede generarse y/o identificarse utilizando procedimientos de mutagénesis o examinando poblaciones naturales en busca de variantes naturales en el alelo SlPP2C1 . En una realización de la invención, el TILLING se utiliza para generar tales plantas y/o para identificar tales mutaciones inducidas por mutagénesis y/o el EcoTILLING se utiliza para identificar plantas, tales como plantas salvajes o plantas no cultivadas, que comprenden mutaciones naturales (espontáneas) en el gen SlPP2C1, que luego pueden transferirse a las plantas cultivadas mediante técnicas tradicionales de reproducción. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro procedimiento de mutagénesis y se entiende que aquí se incluyen tanto los mutantes inducidos por el hombre, la mutagénesis por rayos UV o X, los mutantes químicos, etc., como los mutantes espontáneos del gen SlPP2C1 generados en plantas cultivadas o transferidos a ellas por medio de la reproducción tradicional.

En una divulgación específica, la planta muíante tolerante a la sequía es una planta de una especie diferente a la del tomate, por ejemplo, una planta cultivada monocotiledónea, preferentemente una planta de arroz, maíz, trigo o cebada que comprende un alelo mutante SIPP2C1 en su genoma. Cuando se utilizan procedimientos como el TILLING, la amplificación del fragmento del gen diana puede basarse en la SEQ ID NO: 1, o fragmentos del mismo (por ejemplo, utilizando cebadores específicos o degenerados, por ejemplo, diseñados en base a uno o más de los dominios conservados de S1PP2C1), o se puede aislar primero el ortólogo de SIPP2C1 y basar el diseño del cebador en la secuencia ortóloga.

TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) es una técnica general de genética inversa que utiliza procedimientos tradicionales de mutagénesis química para crear bibliotecas de individuos mutagenizados que posteriormente se someten a cribas de alto rendimiento para el descubrimiento de mutaciones. TILLING combina la mutagénesis química con el cribado de mutaciones de productos de PCR agrupados, lo que da lugar al aislamiento de alelos mutantes sin y con sentido de los genes diana. Así, TILLING utiliza la mutagénesis química tradicional (por ejemplo, la mutagénesis EMS o MNU) u otros procedimientos de mutagénesis (por ejemplo, la radiación, como la UV) seguidos de un cribado de alto rendimiento para buscar mutaciones en genes diana específicos, como el SIPP2C1 según la invención. Las nucleasas S1, como CEL1 o ENDO1, se utilizan para escindir heterodúplex de ADN diana mutante y de tipo salvaje y la detección de los productos de escisión utilizando, por ejemplo, electroforesis como un sistema analizador de gel LI-COR, véase, por ejemplo Henikoff et al. Fisiología vegetal 2004, 135: 630-636. El laboreo se ha aplicado en muchas especies vegetales, como el tomate (véase http://tilling.ucdavis.edu/index.php/Tomato_Tilling), el arroz (Till et al. 2007, BMC Plant Biol 7: 19), Arabidopsis (Till et al. 2006, Methods Mol Biol 323: 127-35), Brassica, maíz (Till et al. 2004, BMC Plant Biol 4: 12), etc. También se ha utilizado ampliamente el EcoTILLING, mediante el cual se detectan mutantes en poblaciones naturales, véase Till et al. 2006 (Nat Protoc 1: 2465-77) y Comai et al. 2004 (Plant J 37: 778-86). En una de las realizaciones del presente documento, se modifica el TILLING clásico y, en lugar de utilizar la detección de mutantes basada en enzimas (digestión enzimática con una nucleasa específica de una sola hebra y electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución), se pueden utilizar dos sistemas diferentes de detección de alto rendimiento que se han utilizado anteriormente en humanos. Estos protocolos de detección son adaptaciones de la CSCE (Conformation Sensitive Capillary Electrophoresis, véase Rozycka et al. 2000, Genomics 70, 34-40) o de HRM (High Resolution Melting, véase Clin Chem 49, 853-860). Vea también los Ejemplos.

Por lo tanto, las plantas, semillas y tejidos no transgénicos que comprenden un alelo mutante SIPP2CI en uno o más tejidos y que comprenden uno o más de los fenotipos conferidos por una proteína S1PP2C1 de función reducida o de pérdida de función de acuerdo con la invención (por ejemplo, tolerancia a la sequía mejorada como se ha descrito anteriormente) y los procedimientos para generar e identificar dichas plantas se engloban en el presente documento. También se proporciona un procedimiento para generar y/o identificar un alelo mutante SIPP2CI adecuado para generar plantas tolerantes a la sequía y/o un procedimiento para generar una planta que comprenda una tolerancia a la sequía mejorada, que comprende las etapas de:

(a) mutagenizar semillas de plantas (por ejemplo, mediante mutagénesis EMS) para generar una población M1 o proporcionar semillas de plantas mutagenizadas o proporcionar plantas que comprendan una variación natural,

(b) opcionalmente, autofertilizar las plantas de a) una o más veces para generar una familia M2, M3 o M4, (c) preparar el ADN de las plantas de a) o b) y agrupar el ADN de los individuos,

(d) Amplificación por PCR de todo o parte del gen diana de SIPP2CI (genómico o ADNc), o una variante del mismo, a partir de los grupos de ADN,

(e) detectar la presencia de alelos SIPP2C1 mutados en los productos de amplificación de la PCR y, por tanto, también en los grupos de ADN,

(f) la selección de las correspondientes plantas individuales que comprenden el alelo o los alelos mutantes SIPP2C1,

(g) opcionalmente, secuenciar el alelo mutante SIPP2C1 de la planta;

(h) fenotipado de las plantas de f), o de su progenie, para la tolerancia a la sequía y/o la sensibilidad al ABA, y

(i) seleccionando plantas tolerantes a la sequía, y opcionalmente

(j) reproducción con la planta de i) para generar una planta cultivada tolerante a la sequía que tenga buenas características agronómicas.

La etapa (a) también puede consistir simplemente en proporcionar dichas plantas.

En la etapa (c), alternativamente, se puede agrupar el tejido de la planta y aislar el ADN de las muestras de tejido agrupadas, para obtener un conjunto de ADN de diferentes individuos.

En la etapa (d) los cebadores que amplifican todo o parte del gen diana, SÍPP2CÍ (SEQ ID NO: 1) o una variante del mismo, se diseñan utilizando procedimientos estándar, como CODDLE (http://www.proweb.org/doddle). Los cebadores pueden diseñarse para amplificar, por ejemplo, al menos unos 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 800 pb o al menos unos 1000 pb o más del gen diana, es decir, del SEQ ID NO: 1, o de una variante de SEQ ID NO: 1, o de la secuencia genómica de SEQ ID NO: 1 (es decir, que comprende además intrones, por ejemplo, para el tomate SEQ ID NO:11 de los nucleótidos 2676-4975). La secuencia genómica puede ser fácilmente aislada y su secuencia determinada como se describe en los Ejemplos. Preferentemente, el cebador amplifica un fragmento que comprende todo o parte de un dominio conservado de la proteína S1PP2C1, por ejemplo, el dominio C-terminal o el dominio putativo de unión al magnesio descrito.

En el caso de especies vegetales distintas del tomate, puede ser conveniente identificar primero la secuencia del gen SÍPP2CÍ endógeno para poder diseñar buenas secuencias de cebadores. La secuencia puede identificarse in siÍico o, por ejemplo, diseñando cebadores de PCR degenerados y amplificando toda o parte de la variante del gen SÍPP2CÍ (ortólogo del gen SÍPP2C1 del tomate) del genoma de la especie vegetal. La secuencia del gen SÍPP2C1 endógeno se utiliza entonces preferentemente para diseñar cebadores adecuados para el TILLING.

La etapa (e) puede hacer uso de nucleasas Sl, como CEL1, para detectar desajustes entre el producto de amplificación de PCR, es decir, entre el producto de PCR SÍPP2CÍ de tipo salvaje y el producto de PCR SÍPP2CÍ mutante que forman heterodúplex. Alternativamente, la etapa (e) puede utilizar CSCE o HRM para la detección. En el CSCE se forman homodúplex (fragmentos WT/WT o mutantes/mutantes) y heterodúplex (fragmentos mutantes/WT). Debido al desajuste formado, los heterodúplex migran a una velocidad diferente que los homodúplex a través de los capilares, lo que permite identificar los grupos que contienen una mutación dentro del fragmento diana. La HRM es también una técnica no enzimática. Durante la amplificación por PCR de los fragmentos del gen diana, las moléculas LCgreen Plus+TM se incorporan entre cada par de bases recocidas de la molécula de ADN de doble cadena, que -al ser capturadas en la molécula- emitirán fluorescencia. Un LightScanner registra la intensidad de la fluorescencia mientras la placa se calienta progresivamente. A cierta temperatura, los productos de la PCR comienzan a fundirse y a liberar el LCgreen Plus+TM, por lo que la fluorescencia disminuye. Los grupos de ADN que contienen una mutación (heterodúplex) se identifican porque su temperatura de fusión es inferior a la de los homodúplex.

La etapa (j) puede incluir procedimientos tradicionales de reproducción y procedimientos de selección fenotípica y/o asistida por marcadores. De esta manera se pueden generar muchas variedades diferentes tolerantes a la sequía.

Se han publicado amplios protocolos para llevar a cabo el TILLING, véase, por ejemplo, http://blocks.fhcrc.org/~steveh/TILLING_publications.html y Till et al. (2006) Nature Protocols 1:2465-2477 Till et al. (2006) Methods Mol Biol. 323:127-135 y Till et al. (2003) Methods Mol Biol. 236:205 -220.

Una vez que se ha identificado una planta que comprende un alelo mutante que confiere el fenotipo deseado, este alelo puede transferirse a otras plantas mediante técnicas tradicionales de reproducción, por ejemplo, cruzando la planta con otra y recogiendo la progenie del cruce. En la etapa (j), el alelo puede ser utilizado para generar plantas que sean tolerantes a la sequía y que proporcionen buenas características agronómicas.

Como se ha mencionado, se entiende que otros procedimientos de mutagénesis y/o selección pueden utilizarse igualmente para generar plantas mutantes según la invención. Las semillas pueden, por ejemplo, ser irradiadas o tratadas químicamente para generar poblaciones mutantes. También se puede utilizar la secuenciación directa del gen SÍPP2CÍ para examinar poblaciones de plantas mutagénicas en busca de alelos mutantes. Por ejemplo, el cribado KeyPoint es un procedimiento basado en la secuencia que puede utilizarse para identificar plantas que comprenden alelos mutantes de SÍPP2CÍ (Rigola et al. PloS One, marzo de 2009, Vol 4(3):e4761).

Así, se proporcionan plantas mutantes no transgénicas que producen niveles más bajos de proteína S1PP2C1 de tipo salvaje (funcional) en uno o más tejidos (particularmente al menos en el tejido foliar), o que carecen completamente de proteína S1PP2C1 funcional en tejidos específicos o que producen una proteína S1PP2C1 no funcional en ciertos tejidos, por ejemplo, debido a mutaciones en uno o más alelos SÍPP2CÍ endógenos. Estos mutantes pueden ser generados por procedimientos de mutagénesis, como el TILLING o sus variantes, o pueden ser identificados por EcoTILLING o por cualquier otro procedimiento. Los alelos SÍPP2CÍ que codifican la proteína S1PP2C1 no funcional o de funcionalidad reducida pueden ser aislados y secuenciados o pueden ser transferidos a otras plantas por procedimientos tradicionales de reproducción.

En una realización se proporciona una planta que tiene una mayor tolerancia a la sequía debido a que el alelo mutante de las plantas de tomate 2, 3, 5, 7 o 10 del ejemplo 4 está presente en el genoma, y la progenie y partes de la misma que comprenden el alelo.

Se proporciona cualquier parte de la planta, o de su progenie tolerante a la sequía, incluidos los frutos cosechados, los tejidos u órganos cosechados, las semillas, el polen, las flores, etc.

También se proporcionan kits para detectar si una planta comprende o no un alelo mutante SIPP2C1 según la invención. Dicho kit puede comprender cebadores de PCR o sondas de detección del alelo en una muestra de tejido. La planta (y la semilla correspondiente) que comprende uno o más alelos mutantes de SIPP2C1 según la invención puede comercializarse y/o etiquetarse como que tiene una "tolerancia a la sequía" (mejorada) o que es "resistente a la sequía".

Preferentemente, las plantas mutantes tolerantes a la sequía también tienen otras buenas características agronómicas, es decir, no tienen un número reducido de frutos y/o un rendimiento reducido en comparación con las plantas de tipo salvaje y/o la calidad del producto no se reduce. Preferentemente, el rendimiento y/o la tasa de supervivencia de dichas plantas es mayor bajo estrés por sequía tanto a largo como a corto plazo. En la presente invención la planta es una tomatera y el fruto es un fruto de tomate, como un tomate de procesado, un tomate fresco de mercado de cualquier forma o tamaño o color. Así, también se proporcionan productos cosechados de plantas o partes de plantas que comprenden uno o dos alelos mutantes de SIPP2C1. Esto incluye los productos transformados posteriores, como la pasta de tomate, el ketchup, el zumo de tomate, la fruta de tomate cortada, la fruta en conserva, la fruta seca, la fruta pelada, etc. Lo mismo ocurre con otras especies vegetales.

Las plantas, o partes de plantas, que comprenden uno o más alelos mutantes de SIPP2C1 y que son tolerantes a la sequía pueden ser cultivos de hortalizas (por ejemplo, el tomate).

Una expresión in vivo diferente de los alelos SIPP2C1 de tipo salvaje (o variantes, incluyendo los ortólogos) también puede conducir a que las plantas tengan una tolerancia a la sequía significativamente mayor. Por ejemplo, pueden identificarse alelos de SIPP2C1 de tipo salvaje que comprenden promotores que tienen un patrón de expresión diferente, especialmente una expresión reducida, que los alelos que se encuentran en las plantas de tomate cultivadas (por ejemplo, en parientes salvajes del tomate) e introgresar (transferir mediante cruce) al tomate cultivado. O pueden identificarse o generarse alelos que tengan mutaciones en el promotor SIPP2C1 y utilizarse para generar plantas que tengan una mayor tolerancia a la sequía.

SECUENCIAS SEQ ID NO 1: Secuencia de ADNc del alelo SIPP2CI de tipo salvaje del tomate

SEQ ID NO 2: secuencia proteica de la proteína S1PP2C1 codificada por SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO 3 y 4: cebadores 1 y 2 para amplificar el ADNc de SIPP2CI (Q PCR)

SEQ ID NO 5 y 6: par de cebadores para amplificar el ADNc de la actina

SEQ ID NO 7 y 8: par de cebadores para amplificar el ADNc de la ubiquitina

SEQ ID NO 9 y 10: par de cebadores para amplificar el ADNc de SIPP2CI de longitud completa

SEQ ID NO 11: secuencia genómica del alelo SIPP2CI de tipo salvaje de tomate; los elementos reguladores de la transcripción (por ejemplo, elementos promotores) están comprendidos en los nucleótidos 1-2675; las secuencias codificadoras de la proteína (exones) consisten en los nucleótidos 2676 - 3419 (exón 1), 4247­ 4351 (exón 2) y 4632-4975 (exón 3). El ARN primario se representa en los nucleótidos 2591-5050.

SEQ ID NO 12 y 13: cebadores utilizados para detectar las mutaciones de SIPP2CI en plantas de tomate mutagenizadas (véase el ejemplo 4)

SEQ ID NO 14: ADNc putativo de SIPP2C1 de patata (denominado aquí StPP2C1 )

SEQ ID NO 15: proteína putativa S1PP2C1 de la patata (denominada aquí StPP2C1)

LEYENDAS DE LA FIGURA

Fig. 1: A) Los niveles relativos de ARNm de SIPP2C1 en la hoja (barras grises oscuras) de las líneas transgénicas (T6OE, T34OE, T55OE) son 25 veces mayores en comparación con el tipo salvaje (Wt). B) Los niveles relativos de ARNm de SIPP2C1 en los ovarios polinizados (barras de color gris claro) en T55^oe son similares a los del tipo salvaje, mientras que los niveles en T6^oe y T34^oe son menores en comparación con el tipo salvaje. C) Los niveles relativos de ARNm en las líneas transgénicas T12^cs y T35cs son menores tanto en las hojas (barras grises oscuras) como en los ovarios no polinizados (barras grises claras) en comparación con el tipo salvaje y T18. Se muestran los valores medios de las réplicas biológicas con SE, los niveles de tipo salvaje se fijaron en uno.

Fig. 2: A) La germinación de las semillas se ve menos inhibida por el ABA en las líneas de sobreexpresión T6^oe y T55^oe y más en las líneas de co-supresión T12cs y T35cs en comparación con el tipo salvaje (Wt). La línea T34^oe se comporta de forma atípica. Las líneas grises oscuras representan líneas de sobreexpresión, las líneas grises claras representan líneas de co-supresión y la línea negra representa el tipo salvaje. B) El crecimiento de las raíces es más inhibido por el ABA en las líneas de co-supresión T12^cs (blanco) y T35cs (gris claro) en comparación con T18 (gris oscuro) y el tipo salvaje (negro). C) El crecimiento de las raíces se ve menos inhibido por el ABA en la línea de sobreexpresión T34^oe (gris oscuro), pero más en T6^oe (blanco) y T55^oe (gris claro), en comparación con el tipo salvaje (negro). El porcentaje medio de crecimiento de las raíces se representa con la DE. D) Nueve días después del inicio de la retención de agua, las líneas de co-supresión no están marchitas en absoluto, mientras que el tipo salvaje muestra un marchitamiento moderado y las líneas de sobre-expresión muestran un marchitamiento severo. Los siguientes Ejemplos no limitantes describen el uso de genes SIPP2C1 para modificar fenotipos de plantas. A menos que se indique lo contrario en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo según los protocolos estándar descritos en Sambrook et al. (1989) Clonación molecular: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressy Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYy en Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. EJEMPLOS EJEMPLO 1 - aislamiento y caracterización de S1PP2C1

1.1 Materiales y procedimientos

1.1.1 Material vegetal

Plantas de tomate (Solanum lycopersicum L. cv. Moneymaker) se cultivaron en condiciones de invernadero de marzo a octubre bajo un ritmo de 16/8h día-noche. Las luces suplementarias (luces de sodio de alta presión de 600 vatios, Philips, Eindhoven, Países Bajos) se encendieron por debajo de 200 W/m2 y se apagaron por encima de 300 W/m2 . La temperatura se mantuvo por encima de 20°C durante el periodo de luz y 17°C durante el periodo de oscuridad con el sistema PRIVA Integro versie 724. Las plantas se regaron a diario y se abonaron semanalmente. Se diseccionaron tejidos de hojas y ovarios de plantas de tomate adultas y raíces e hipocótilos de plántulas de 10 días. Los tejidos se recogieron entre las 11.00 y las 13.00 horas y se congelaron directamente en nitrógeno líquido.

1.1.2 Análisis de la expresión del gen SIPP2C1 y Q-PCR

El cDNA-AFLP se realizó como se describe en Vriezen et al. (2008, New Phytologist, 177:60-76, ver página 61 y 62), comparando ovarios polinizados con ovarios tratados con ácido giberélico (GA3). Se recortó del gel un fragmento de expresión diferencial de 326 pb y el ADN eluido se volvió a amplificar en las mismas condiciones que se utilizaron para la amplificación selectiva. El fragmento se ligó en un fagémido digerido por EcoRV con cola T pBluescri ptII SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) y se secuenció utilizando el kit de inicio rápido CEQ DTCS y el sistema de análisis de ADN CEQ2000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.).

Para el análisis cuantitativo de la PCR se aisló el ARN con el Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Se realizaron mediciones fotométricas de ARN para equilibrar las concentraciones de ARN de las diferentes muestras. Cantidades iguales de ARN fueron tratadas con DNAse libre de RNAse (RQ1, Promega, Madison, USA). El ARN (0,5 pg) se transcribió a la inversa (RT) utilizando un kit de síntesis de ADNc (iScripttm, Bio-rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo.

Los cebadores de la PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) para cuantificar los niveles de transcripción del ARNm de SIPP2C1 se diseñaron utilizando un programa informático (Beacon Designer Software, Premier Biosoft International, CA, USA), y se comprobó su homología cruzada con otras secuencias de PP2C.

El par de cebadores 1 y 2 amplifica el siguiente fragmento del transcrito de SIPP2C1 (174 pb)

5 ' TCGGAAGGAGAAGATTACGATGGGAAGAGTATTAACTGGGAGAAAGTTATGACGGA

GAGTTTCCGTAAAATGGACGAAAAGGTGAACAAGGAAGGGGCGGAGATGGCGACGATA

GGATCAACGGCGGTGGTAGCGGTGGTGGGAGTGGAGGAATTTGTTGTTGCGAATTGTG

GA 3 '

Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador de 96 pocillos (Bio-Rad iCycler, laboratorios Bio-rad) utilizando la mezcla SYBR green (iB-SYBR Green supermix, laboratorios Bio-rad). El programa de PCR comenzó con 3 minutos a 95°C y luego 40 ciclos que consistían en 15 segundos a 95°C y 45 segundos a 57°C y finalmente se determinó la temperatura de fusión del producto amplificado para verificar la presencia de un producto específico. Se utilizaron cinco microlitros de ADNc diluido 25 veces por muestra. Siempre se realizaron réplicas técnicas y biológicas.

Tanto el ARNm de actina como la ubiquitina se utilizaron como genes de control interno.

También se incluyó ARN diluido tratado con DNasa en la Q-PCR como control de la contaminación del ADN genómico.

1.1.3 Transformación de plantas

Para generar líneas transgénicas de SIPP2C1, la región codificante de SIPP2C1 (SEQ ID NO: 1) fue amplificada por PCR y clonada en el vector pDONR. Los cebadores de PCR utilizados para amplificar el ADNc completo de S1PP2C1 se diseñaron como sigue:

Cebador 1 (directo): 5' CACCTGCAGTCACCGTCTTCACATTAAAAT 3' (SEQ ID NO: 9)

Cebador 2 (inverso): 5' ATTTGTATGGGAAGCTTAACTATCA 3' (SEQ ID NO: 10) Utilizando la clonación Gateway se clonó el SIPP2C1 detrás del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor en el vector pAD625 (de Folter et al. 2006, The Plant Journal 47: 934-946) que también contiene un terminador de nopalina sintasa (3'nos). Las plantas de tomate transgénicas se generaron mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciensy cultivo de tejidos como se describe en De Jong et al. (2008, supra).

1.1.4 Experimento de estrés híd rico

Las macetas de las líneas transgénicas de tipo salvaje y SlPP2C1 de la misma edad y tamaño, fueron saturadas con agua al inicio del experimento. Se utilizaron varias plantas por línea. Las plantas no recibieron agua durante diez días. El marchitamiento de las hojas se evaluó visualmente cuando se observaron los primeros signos de marchitamiento (marchitamiento leve o marchitamiento moderado) en el control de tipo salvaje en el día 8 y 9, respectivamente. Se utilizó una escala del 1 al 4, siendo 4 el grado de marchitamiento grave, 3 el grado de marchitamiento moderado, 2 el grado de marchitamiento leve y 1 el grado de marchitamiento nulo.

Las fotografías representadas en la Figura 2D fueron tomadas nueve días después del inicio del experimento.

1.1.5 Ensayo de germinación de semillas y de crecimiento de raíces

Germinación de las semillas:

Las semillas de las líneas transgénicas fueron cosechadas, secadas y almacenadas a 4 grados Celsius. Las semillas se esterilizaron en lejía diluida (4% (p/v) de hipoclorito) que contenía 0,1% (v/v) de Tween-20, se lavaron y se sembraron en un medio 1/2MS (2,25 mg de sales basales MS suministradas con 1% (p/v) de sacarosa, y vitaminas Nitsch, Duchefa, Haarlem, Países Bajos) que contenía, 0, 1, 3, 10 o 30 pM de ABA (Acros, Geel, Bélgica). Se utilizaron al menos 40 semillas por concentración de ABA.

Las placas se colocaron en una cámara de crecimiento a 25°C bajo un ritmo de 16/8h día-noche. La germinación de las semillas (protrusión de la radícula) se anotó después de diez días y se calcularon los porcentajes de germinación de las semillas.

Crecimiento de las raíces:

Las semillas se esterilizaron como se ha descrito anteriormente y se sembraron en agua con 1pM de GA3 . Después de la protrusión de la radícula, se colocaron diez semillas de cada línea en un medio 1/2MS que contenía 0, 5, 10 o 40 pM de ABA. Se midieron las raíces y las placas se colocaron en posición vertical y se cultivaron en las condiciones descritas anteriormente. Siete días después de la transferencia se midió de nuevo la longitud de la raíz y se calculó el crecimiento de la raíz como porcentaje del crecimiento de la raíz en comparación con el medio 1/2MS sin ABA (100%). Los experimentos se realizaron tres veces y se muestran los valores medios más la DE. Se realizaron pruebas t de Student para comprobar la significación (p<0,05).

1.2 Resultados

1.2.1 Expresión de SIPP2C1 durante el cuajado del fruto (datos no mostrados)

El gen SIPP2C1 se expresa de forma diferencial durante el cuajado del fruto (Vriezen et al. 2008, supra). SIPP2C1 se expresa en mayor medida en el pericarpio de los ovarios no polinizados y en menor medida tras la polinización y el tratamiento con GA3. La expresión en los óvulos/placenta no parece cambiar. Confirmamos la expresión de SIPP2C1 en los tejidos del ovario de tomate mediante pCr cuantitativa. De nuevo se observó que los niveles de ARNm de SIPP2C1 son más altos en el pericarpio que en los óvulos o la placenta en el tejido de control. En el pericarpio, pero también en la placenta, se encontró un menor nivel de ARNm de SIPP2C1 tres días después de la polinización. En los óvulos los niveles de ARNm no cambiaron. El gen SIPP2C1 se expresa en los ovarios maduros no polinizados en la antesis a un nivel relativamente alto en comparación con los tejidos vegetativos como la hoja, la raíz y el hipocótilo. En los botones florales y en los ovarios tres días antes de la antesis el nivel de ARNm de SIPP2C1 es comparable al de la hoja, y es mucho menor que en los ovarios en la antesis (control, Ct). Tres días después de la polinización, los niveles de ARNm de SIPP2C1 en el ovario se redujeron a aproximadamente el 50% del nivel en los no polinizados.

1.2.2 Análisis funcional de SIPP2C1

Sobreexpresión de SIPP2C1

El enfoque de sobreexpresión (OE) dio como resultado tres líneas de tomate transgénico con niveles de ARNm de SIPP2C125 veces más altos de media en las hojas (líneas de sobreexpresión T6^oe, T34^oe y T55^oe, Fig. 1A). En los ovarios polinizados, los niveles de ARNm de SIPP2C1 de estas líneas no fueron superiores a los del tipo salvaje (Fig. 1B). Por el contrario, T6^oe y T34^oe mostraron una fuerte reducción de los niveles de ARNm de SIPP2C1 en comparación con el tipo salvaje. T55^oe tenía niveles de ARNm similares a los del tipo salvaje en los ovarios polinizados. Los niveles de ARNm de SIPP2C1 en los ovarios no polinizados de estas líneas transgénicas eran comparables a los niveles de ARNm en los ovarios polinizados y no se representan aquí.

SiIenciamiento de SIPP2C1

Además, se obtuvieron dos líneas (líneas de co-supresión T12CS y T35CS) que tenían niveles de ARNm de SIPP2C1 más bajos en las hojas y en los ovarios no polinizados, en comparación con el tipo salvaje (Fig 1C), indicando que la construcción de sobreexpresión llevó a la co-supresión de SlPP2C1 en estas líneas. La línea T18 tiene niveles de ARNm comparables a los del tipo salvaje en ambos tejidos.

Sensibilidad al ABA

La caracterización fenotípica de las líneas transgénicas reveló un cambio en la sensibilidad al ABA. La figura 2A muestra el porcentaje de germinación de las semillas en medios que contienen diferentes concentraciones de ABA. Las líneas de co-supresión T12^cs y T35^cs tienen porcentajes de germinación más bajos con 1pM y 3 pM de ABA, mientras que las líneas de sobreexpresión T6^oe y T55^oe tienen porcentajes de germinación ligeramente superiores al tipo salvaje. La línea T34^oe, que es una línea de sobreexpresión en las hojas, se comportó de forma diferente a las otras líneas de sobreexpresión y mostró una menor germinación de las semillas con ABA en comparación con el tipo salvaje.

El crecimiento de las raíces después de la germinación es reducido por el ABA en el tipo salvaje. En la Figura 2B se puede observar que el crecimiento de las raíces en las líneas de co-supresión T12^cs y T35^cs fue inhibido más fuertemente que en el tipo salvaje o T18. La línea de sobreexpresión T34OE fue menos sensible a la inhibición del crecimiento de la raíz por ABA que el tipo salvaje (Fig. 2C). El crecimiento de las raíces de las líneas T6OE y T55OE fue más sensible al a Ba .

Así, la co-supresión de SIPP2C1 lleva a que las plantas tengan una sensibilidad al ABA significativamente mayor que las de tipo salvaje (la germinación de las semillas se inhibe más y el crecimiento de las raíces se inhibe más que en las de tipo salvaje), mientras que la sobreexpresión lleva a que las plantas tengan una sensibilidad al ABA reducida, indicando que SIPP2C1 codifica un regulador negativo del ABA.

Tolerancia a la sequía

La Figura 2 D muestra que a los 9 días las plantas de tipo salvaje tienen un marchitamiento moderado, las líneas cosupresoras no muestran ningún marchitamiento y las líneas sobre-expresoras muestran un marchitamiento severo. A los 9 días, las líneas de sobreexpresión estaban muy marchitas (puntuación media de marchitamiento = 3,6), mientras que las líneas de co-supresión mostraban poco marchitamiento (puntuación 1,25) y los controles mostraban un marchitamiento moderado (puntuación = 3,0). El experimento se repitió una vez (datos no mostrados). Así, el marchitamiento se redujo en las líneas co-supresoras en un 58% en comparación con el control de tipo salvaje.

Estos datos indican que la regulación a la baja de SIPP2C1 conduce a que las plantas tengan una tolerancia a la sequía significativamente mayor en comparación con el tipo salvaje.

Debate

Dos de las líneas transgénicas que albergaban una construcción de sobreexpresión tenían niveles más bajos de ARNm de SIPP2C1 tanto en las hojas como en los ovarios. El silenciamiento del ARN por co-supresión es un fenómeno bien aceptado, aunque el mecanismo no se entiende completamente. Se ha sugerido que la co-supresión es inducida por los transcritos de ARN-película de las copias de transgenes con repetición invertida, dando lugar a ARNsi que se incorporan a la vía del ARNi (Tomita et al. 2004, FEBS Lett. 2004 Ago 27;573(1-3):117-20 Wang y Metzlaff 2005, Curr Opin Plant Biol. 8(2): 216-22). El análisis de Southern blot (datos no mostrados) reveló que en las dos líneas de co-supresión de SIPP2C1 había múltiples inserciones, lo que podría haber dado lugar a una estructura tipo horquilla que podría silenciar el gen SIPP2C1 endógeno.

Las tres líneas con un nivel de ARNm de SIPP2C125 veces mayor en la hoja no tenían niveles de ARNm de SIPP2C mayores en los ovarios. Esto podría explicarse en parte por el nivel relativamente alto de ARNm del gen endógeno en los ovarios, que es siete veces mayor que en la hoja. Por lo tanto, la contribución del transgén a los niveles totales de expresión de SIPP2C1 en los ovarios podría haber sido muy pequeña. Cabe destacar que en las líneas T6OE y T34OE el nivel de ARNm de SIPP2C1 en el ovario es incluso menor (10-50%) que en el tipo salvaje. Sin embargo, ya se ha informado del control específico de los niveles de ARNm endógeno en un tejido mediante un transgén. Tomita et aI. (2004, supra) mostraron que en la misma planta el gen NtFAD3 estaba co-suprimido en la hoja pero sobre-expresado en la raíz, resultando en fenotipos equivalentes en hojas y raíces. Se desconocen los mecanismos por los que se produce la regulación específica del tejido de la co-supresión, pero el nivel del transcrito endógeno parece ser importante (Tomita et al. 2004, supra).

Las dos líneas transgénicas de tomate con niveles reducidos de ARNm en hoja y ovario también mostraron respuestas de hipersensibilidad al ABA durante la germinación de la semilla y el crecimiento de la raíz y una mayor tolerancia al estrés hídrico. Esto indica que el gen SIPP2C1 es un regulador negativo de la cascada de señalización del ABA en el tomate. Además, las tres líneas transgénicas con niveles relativamente altos de ARNm de SIPP2C1 en la hoja también se marchitaron más.

EJEMPLO 2 - Mutantes TILLING que comprenden una mayor tolerancia a la sequía y que comprenden alelos mutantes SIPP2C1

2.1 Población de Tomate TILLING

Para el tratamiento de mutagénesis se utilizó una línea endogámica altamente homocigótica utilizada en la reproducción comercial de tomates de transformación con el siguiente protocolo. Tras la germinación de las semillas en papel Whatman® húmedo durante 24 horas, ~20.000 semillas, divididas en 8 lotes de 2.500 respectivamente, se remojaron en 100 ml de agua ultrapura y metanosulfonato de etilo (EMS) a una concentración del 1% en matraces cónicos. Los frascos se agitaron suavemente durante 16 horas a temperatura ambiente. Por último, el EMS se enjuagó con agua corriente. Tras el tratamiento EMS, las semillas se sembraron directamente en el invernadero. Del 60% de las semillas que germinaron, se trasplantaron 10600 plántulas en el campo. De las 8810 líneas M1 que dieron frutos, se cosecharon dos frutos por planta. Se aisló el ADN de las semillas procedentes del primer fruto, constituyendo el stock de ADN de la población M2. Estas se autofertilizaron y se aislaron las semillas M3 de los frutos y las semillas se utilizaron para el aislamiento del ADN y constituyen el banco de ADN de la población M3. 2.2 Gen S1PP2C1 diana para la amplificación por PCR de la población TILLING

La secuencia genómica que contiene la región transcrita completa, incluyendo la región codificante (COD), la región del extremo 5'no traducido (5'UTR) y la región del extremo 3'(3'UTR) se determinó mediante PCR con ADN genómico de tomate como plantilla y cebadores diseñados en los flancos de la secuencia S1PP2C1 de tomate. Mediante la comparación de la secuencia del gen genómico con la secuencia del ADNc de SIPP2C1 se determinó la ubicación, el número y el tamaño de los intrones y exones de este gen.

La secuencia genómica se representa en la SEQ ID NO: 11. El ARN primario (región transcrita) va desde el nucleótido 2591-5050, comprendiendo un 5'UTR (2591-2675), el exón 1 (2676-3419), el intrón 1 (3420 - 4246), el exón 2 (4247-4351), el intrón 2 (4352 - 4631), el exón 3 (4632 - 4975) y el 3'UTR (4976 - 5050).

El ADN de la población de TILLING de tomate descrita anteriormente se examinó para detectar polimorfismos de un solo nucleótido en el gen diana SIPP2C1 . Para ello se diseñaron pares de cebadores de PCR para amplificar fragmentos superpuestos de unos 400-500 pb de las secuencias codificantes (exón) del gen SIPP2C1 (SEQ ID NO: 1) o una secuencia que comprenda todo o parte del ácido nucleico que codifica el extremo terminal C de la proteína S1PP2C1 (ya que es probable que las mutaciones en el dominio catalítico den lugar a una función reducida o a la pérdida de función de la proteína), es decir, que codifique los aminoácidos 84-391 de SEQ ID NO: 2. Véase el ejemplo 4, donde se identificaron mutaciones en los aminoácidos 101-192.

Los pares de cebadores se utilizaron para amplificar las secuencias diana del ADN M2 o M3 de la población TILLING y los heterodúplex entre las secuencias diana mutantes y de tipo salvaje se detectaron utilizando CSCE o HRM como se describe a continuación. El número de identificación de las muestras de ADN está vinculado a los lotes de semillas de las plantas que llevan el alelo de tipo salvaje o el alelo mutado, ya sea en forma heterocigota u homocigota.

Las semillas fueron germinadas y la presencia de la mutación particular en plantas individuales fue confirmada por PCR utilizando cebadores que flanquean el sitio mutado y ADN genómico de estas plantas como plantillas. La secuenciación del ADN de los fragmentos identificó mutantes homocigóticos y heterocigóticos para la mutación esperada. Se seleccionan o se obtienen mutantes homocigóticos tras la autofertilización y la posterior selección y se determina el efecto de la mutación sobre la proteína correspondiente y el fenotipo de la planta.

Las plantas que comprenden una o más mutaciones en las secuencias diana se examinan fenotípicamente para la tolerancia a la sequía utilizando, por ejemplo, el ensayo descrito anteriormente y/o la evaluación de campo.

2.3 Electroforesis capilar sensible a la conformación (CSCE)

Las reacciones de PCR multiplex se realizan en un volumen de 10 pl con 0,15 ng, 4 veces de ADN genómico agrupado. Los cebadores marcados se añaden a la mezcla maestra de PCR a una concentración 5 veces inferior (1 pM) a la de los cebadores no marcados. Tras la PCR, las muestras se diluyen 10 veces. Antes de la ejecución del CSCE, se añaden 2 pl de los productos diluidos a 38 pl de agua MQ.

Las muestras se cargan en capilares de 50 cm (tiempo y tensión de inyección: 16 segundos, 10 KVolts; Tensión de funcionamiento: 15KVolts) del aparato ABI 3130x1 lleno de polímeros semidegradables de la siguiente composición: 5 g de polímero de análisis de conformación (CAP) (Applied Biosystems, 434037, 9%), 2,16 g de urea, 0,45 g de 20xTTE (national diagnostics, EC-871), completado con agua MQ hasta 9 g. El tampón de funcionamiento se prepara con 1x TTE diluido y 10% de glicerol. La temperatura del horno se ajusta a 18°C)

Los datos crudos se analizan con el software HeteroDuplex Analysis (HDA) de BioNumerics, El programa diferencia los patrones de picos de las moléculas hetero-dúplex (mutantes) y homo-dúplex (tipo salvaje) proporcionando así la posibilidad de seleccionar grupos de ADN que contengan una línea individual mutada en el gen diana.

2.4 Análisis de la curva de fusión de alta resolución (HRM)

Las PCRs de LCgreen se realizan en pools de 8x en placas FramStar de 96 pocillos (4titude, UK). Se mezclan 2pl (15 ng) de ADN agrupado con 2pl de tampón de reacción F-524 Phire™ 5x (FINNZYMES, Finlandia), 0,1pl de Phire™ Hot Start DNA Polymerase (FINNZYMES, Finlandia), 1 pl de LCGreen™ Plus+ (BioChem, EE.UU.), 0,25pl de cebadores 5mM y se completa hasta 10pl con agua MQ) según las recomendaciones del fabricante. Los grupos que contienen una mutación se examinan con un sistema LightScanner® (Idaho Technology Inc., EE.UU.). Los pools positivos se seleccionan analizando los perfiles de temperatura de fusión; cuando el pool contiene una mutación mostrará una temperatura de fusión más baja.

EJEMPLO 3 - Transferencia de alelos mutantes de SIPP2C1 a cultivares de tomate

Los mutantes TILLING que comprenden un alelo mutante SIPP2C1 se cruzan con diferentes líneas de tomate para transferir el alelo mutante a estas líneas, generando plantas de tomate con buenas características agronómicas y una tolerancia a la sequía significativamente mejorada.

Se desarrolla un marcador TaqMan® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) para identificar la presencia del nucleótido modificado. Este ensayo se utiliza para la selección en primer plano asistida por marcadores, que es eficaz para la transferencia de genes recesivos a un fondo necesario, por ejemplo las líneas parentales comerciales de tomate, ya que su transferencia clásica requiere generaciones recurrentes adicionales de selfing (Ribaut et al. Plant Molecular Biology Reporter 15:154-162).

EJEMPLO 4

Se examinó el ADN de la población M2 TILLING descrita en el Ejemplo 2.1 en busca de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen diana SIPP2C1 (como se describe en 2.2), en particular en busca de mutaciones en la secuencia que codifica los aminoácidos 101 a 192.

Para ello se diseñó el siguiente par de cebadores de PCR para amplificar un fragmento de 277 pb de los nucleótidos 301-577 de la SEQ ID NO: 1:

Cebador directo: "3863" 5'- GTGACGTCTGTTCACATGGATC-3' (SEQ ID NO: 12)

Cebador inverso: "3861" 5' -TACGGAAACTCTCCGTCATAAC-3' (SEQ ID NO: 13)

El par de cebadores se utilizó para amplificar las secuencias diana del ADN M2 de la población Tilling. La secuencia diana amplificada comprende los nucleótidos 301 a 577 de la SEQ ID NO: 1, es decir, la región que codifica los aminoácidos 101 a 192 de SEQ ID NO: 2. Los heterodúplex entre la secuencia diana muíante y la de tipo salvaje se identificaron utilizando la HRM como se describe en el Ejemplo 2.3 (o 2.4).

Se identificaron diez plantas que contenían un SNP en la región diana y se secuenció el producto de la PCR de la secuencia diana para determinar la naturaleza y la posición del SNP. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

En base al análisis SIFT (Pauline C. Ng y Henikoff 2003, Nucleic Acid Research Vol. 31, pp 3812-3814) se predijo el efecto sobre la función de la proteína, véase la Tabla 2.

Tres plantas (plantas número 1, 4 y 6) contenían una mutación silenciosa en el gen SIPP2C1, mientras que cinco plantas (número 2, 3, 5, 7 y 10) contenían SNPs que conducían a sustituciones de aminoácidos. Las plantas 5 y 10 contenían mutaciones idénticas. En base al análisis SIFT, se predice que las plantas número 2, 5 y 10 comprenden mutaciones en el alelo SIPP2C1 que reducen o suprimen la función de la proteína PP2C1 y, por tanto, confieren una

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una planta no transgénica de la especie Solanum lycopersicum que comprende un alelo SIPP2C1 (proteína serina/treonina fosfatasa 2C de Solanum lycopersicum ) en su genoma, donde un alelo SIPP2C1 es un alelo que codifica una proteína que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2, caracterizada porque dicho alelo SlPP2C1 comprende una o más mutaciones en su secuencia de nucleótidos y por lo que, como resultado de dichas una o más mutaciones, la planta que comprende dicho alelo mutante en su genoma tiene una tolerancia a la sequía significativamente mayor en comparación con la planta que comprende un alelo SlPP2C1 de tipo salvaje en su genoma.

2. La planta según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha una o más mutaciones confieren pérdida de función o función reducida a la proteína SIPP2C1 codificada.

3. La planta según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho alelo mutante SlPP2C1 está presente en forma homocigótica.

4. La planta según una de las reivindicaciones precedentes, en la que los síntomas de marchitamiento de las hojas de dicha planta se reducen en al menos un 10% en comparación con los síntomas de marchitamiento de las hojas de una planta que comprende un alelo SlPP2C1 de tipo salvaje en su genoma cuando las plantas se exponen al mismo estrés por sequía.

5. La planta según una de las reivindicaciones precedentes, en la que la planta es una planta híbrida.

6. Un fruto o semilla o una parte de una planta según la reivindicación 3.

7. Uso de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína SIPP2C1 para la generación de plantas transgénicas o no transgénicas de la especie Solanum lycopersicum con mayor tolerancia a la sequía, caracterizado porque la proteína SIPP2C1 comprende al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

8. Una planta transgénica de Solanum lycopersicum que comprende integrado en su genoma un gen quimérico, en la que dicho gen quimérico comprende un promotor activo en las células vegetales unido de forma operable a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia sentido y/o antisentido de SEQ ID NO: 1 que al transcribirse silencia la expresión del gen SlPP2C1 endógeno y en la que dicha planta comprende una tolerancia a la sequía significativamente mejorada en comparación con una planta que carece de dicho gen quimérico, en la que dicho gen SlPP2C1 endógeno codifica una proteína que comprende al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

9. La planta según la reivindicación 8, en la que dicha secuencia reguladora de la transcripción se selecciona del grupo que consiste en: un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido y un promotor regulado por el desarrollo.

10. Una semilla de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 8-9 que comprende dicho gen quimérico.

11. La planta según la reivindicación 1, o las semillas, la progenie o los frutos de tomate de la misma, siendo dicha planta obtenible por TILLING, en la que la planta, las semillas, la progenie o los frutos de tomate comprenden un alelo mutante de SIPP2C1 en su genoma, caracterizada porque dicho alelo mutante codifica una proteína SIPP2C1 que tiene una función reducida o una pérdida de función en comparación con la proteína SIPP2C1 de tipo salvaje representada en la SEQ ID NO: 2.

12. La planta según la reivindicación 11, en la que dicha proteína SIPP2C1 comprende una sustitución de aminoácidos en Gly148, Ser171, Ala155 o Gly132.

13. La planta según la reivindicación 11 o 12 en la que dicha proteína SIPP2C1 comprende una sustitución de aminoácidos en Gly148 en Arginina, Ser171 en Leucina, Ala155 en Treonina o Gly132 en Serina.

14. La planta según la reivindicación 1, que comprende una o más mutaciones en la SEQ ID NO:1 por lo que la mutación da lugar a que la proteína SIPP2C1 codificada tenga una actividad reducida en comparación con la proteína funcional de tipo salvaje o ninguna actividad in vivo y/o in vitro.

15. La planta según la reivindicación 1, que comprende una o más mutaciones en la SEQ ID NO: 11 de los nucleótidos 2676 a 4975,

por lo que la mutación da lugar a que la proteína SIPP2C1 codificada tenga una actividad reducida en comparación con la proteína funcional de tipo salvaje o ninguna actividad in vivo y/o in vitro.