ES2220935T3 - Reguladores de la transcripcion vegetal a partir de circovirus. - Google Patents
Reguladores de la transcripcion vegetal a partir de circovirus.Info
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Abstract
LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A REGULADORES DE TRANSCRIPCION Y A SECUENCIAS TIPO REGULADOR DE TRANSCRIPCION DE ORIGEN CIRCOVIRUS. COMO SE UTILIZA EN LA ESPECIFICACION, SE CONSIDERA QUE EL GRUPO CIRCOVIRUS INCLUYE VIRUS DE ATROFIA DE TREBOL SUBTERRANEO (SCSV), VIRUS DE PUTREFACCION FOLIAR DE COCO (CFDV), VIRUS SUPERIOR RACIMOSO DE BANANA (BBTV), VIRUS ENANO DE ASTRAGALO (MDV) Y VIRUS AMARILLO NECROTICO DE JUDIA HABA (FBNYV). LOS REGULADORES DE TRANSCRIPCION Y LAS SECUENCIAS TIPO REGULADOR DE TRANSCRIPCION DE LA PRESENTE INVENCION SON UTILES EN INGENIERIA GENETICA DE VEGETALES Y EN PARTICULAR EN PLANTAS LEGUMINOSAS PARA FACILITAR O CONTROLAR LA EXPRESION DE GENES EXTRAÑOS. LOS REGULADORES DE TRANSCRIPCION Y SECUENCIAS TIPO REGULADOR DE TRANSCRIPCION DE LA PRESENTE INVENCION SON TAMBIEN UTILES EN FACILITAR DIFERENTES NIVELES DE EXPRESION EN DIFERENTES TIPOS DE TEJIDO DE VEGETAL.
Description
Reguladores de la transcripción vegetal a partir
de circovirus.
La presente invención se refiere generalmente a
un nuevo conjunto de reguladores de la transcripción y secuencias de
tipo reguladoras de la transcripción operables en plantas. De forma
más particular, la presente invención se dirige a reguladores de la
transcripción y a secuencias de tipo reguladoras de la transcripción
de origen vírico e, incluso más particularmente, de origen
circovírico. Los reguladores de la transcripción y las secuencias de
tipo reguladoras de la transcripción, de la actual invención, son
útiles en ingeniería genética de plantas, y en particular en plantas
leguminosas para facilitar o controlar la expresión de genes
foráneos. Los reguladores de la transcripción y las secuencias de
tipo reguladoras de la transcripción, de la presente invención,
también son útiles facilitando niveles diferentes de expresión en
diferentes tipos de tejidos vegetales.
Los datos bibliográficos de las publicaciones
citadas en esta memoria descriptiva se recogen al final de la
descripción. Los números de identidad de las secuencias (SEQ ID
N^{OS}) para las secuencias nucleotídicas citadas en la memoria
descriptiva se definen después de la bibliografía.
A lo largo de esta memoria descriptiva, excepto
que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra
"comprende", o variaciones tales como "que comprende",
implica la inclusión de un elemento citado o un número entero o
grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de
cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.
Los reguladores de la transcripción son
moléculas, y generalmente moléculas a base de nucleótidos, que
facilitan y modulan la expresión de secuencias genéticas en la
transcripción. Los reguladores de la transcripción incluyen
promotores y secuencias de terminación y de poliadenilación, entre
otros efectores y agentes que facilitan la transcripción.
Los promotores son secuencias nucleotídicas
específicas a las que se une el ARN polimerasa para iniciar la
síntesis de ARN en las células. Los promotores contienen el sitio de
partida para la síntesis de ARN, y contienen las señales genéticas
para iniciar la síntesis de ARN mediada por polimerasas. Además, se
supone que las proteínas que se unen al ADN, específicas de las
secuencias, inhiben o estimulan la iniciación de la síntesis de ARN
uniéndose de forma próxima al promotor y efectuando la unión de la
polimerasa al promotor. Las secuencias terminadoras se refiere a las
secuencias de terminación y de poliadenilación, y son necesarias
para la transcripción de ARNm funcionales. Las secuencias de
terminación están localizadas en dirección (es decir, hacia el
extremo 3') de un gen, y son reconocidas por el ARN polimerasa como
una señal para detener la síntesis de ARNm. Las secuencias de
poliadenilación son señales necesarias para la poliadenilación de
moléculas de ARNm eucariota después de la transcripción.
Un promotor vírico ampliamente usado para
facilitar la expresión génica foránea en plantas es el promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell et al.,
1985), que deriva de un virus de plantas que posee un ADN de doble
cadena. El uso de este promotor en plantas y en células vegetales
está bien documentado (Benfey y Chua, 1990; Higgins y Spencer,
1991). Sin embargo, a pesar de la aparente utilidad de este
promotor, no es funcional en todas las plantas, y es particularmente
poco operable en plantas leguminosas. Por lo tanto, existe la
necesidad de identificar otros promotores, tales como los de origen
vírico, que sean operables en plantas y particularmente en plantas
leguminosas. También existe una necesidad de modular niveles de
expresión de genes y otras secuencias genéticas dentro de las
células vegetales.
En consecuencia, un aspecto de la presente
invención se dirige a un constructo genético que comprenda un
promotor circovírico o secuencia de tipo promotora, y que sea
operable en una célula vegetal.
En un aspecto relacionado de la presente
invención, se proporciona un constructo genético que comprende un
promotor circovírico o una secuencia de tipo promotora y una
secuencia de terminación y/o de poliadenilación, secuencias las
cuales son operables en una célula vegetal.
Un circovirus es un virus de plantas con un ADN
de una sola cadena (ss), no geminado (Tabla 1), distinto de los
caulimovirus que tienen un genoma de doble cadena, y de los
geminivirus, los otros únicos virus de plantas con ADNss conocidos,
que tienen partículas geminadas (Chu et al., 1994). Como se
usa aquí, se considera que el grupo de circovirus incluye el virus
de la atrofia del trébol subterráneo (SCSV) (Chu y Helms, 1988), el
virus de la caída foliar del cocotero (CFDV) (Rohde et al.,
1990), el virus del copo racimoso del banano (BBTV) (Thomas y
Dietzgen, 1991; Harding et al., 1991; 1993; Burns et
al., 1993), el virus de enanismo de arveja lechosa (MDV) (Isogai
et al., 1992; Sano et al., 1993) y el virus de
amarilleo necrótico del haba (FBNYV) (Katul et al.,
1993).
En una realización particularmente preferida, el
circovirus contemplado para uso según la presente invención
comprende más de dos componentes o segmentos de ADN.
La presente invención se dirige particularmente y
se describe en lo sucesivo con referencia al virus de la atrofia del
trébol subterráneo (en lo sucesivo abreviado como "SCSV") como
un representante del grupo de los circovirus. Sin embargo, esto se
hace con la comprensión de que la referencia a SCSV incluye la
referencia a todos los otros miembros adecuados del grupo de
circovirus a los que se extiende la actual invención. Los miembros
preferidos del grupo de los circovirus tales como SCSV comprenden
más de dos componentes o segmentos de ADN. La referencia en lo
sucesivo a "SCSV" también incluye y se extiende a todos los
mutantes de origen natural o inducidos artificialmente, derivados,
partes, fragmentos, homólogos o análogos del virus, que aún retengan
al menos una secuencia promotora y/o de terminación y/o de
poliadenilación adecuada.
En consecuencia, una realización particularmente
preferida de la presente invención contempla un constructo genético
que comprende un promotor de SCSV o una secuencia de tipo promotora,
y que es operable en una célula vegetal.
Un aspecto relacionado de la presente invención
se dirige a un constructo genético que comprende un promotor de SCSV
o una secuencia de tipo promotora y una secuencia de terminación y/o
de poliadenilación, secuencias las cuales son operables en una
célula vegetal.
La expresión "constructo genético" se usa en
su sentido más amplio para incluir cualquier molécula de ácido
nucleico recombinante tal como una molécula de ácido nucleico
aislada, un vector, un vector de expresión o un vector binario.
Puede comprender solamente el promotor del circovirus, o puede
contener uno o más promotores en asociación con secuencias
reguladoras y/o informadoras.
El constructo genético puede ser ADN de doble
cadena o de una sola cadena, en forma lineal o circular cerrada
covalentemente. Como se establece anteriormente, puede comprender
sólo el promotor o la secuencia de tipo promotora, o puede tener
otras secuencias reguladoras de la transcripción heterólogas u
homólogas y/o secuencias génicas estructurales heterólogas
incluyendo promotores asociados con SCSV. Por "homóloga" se
quiere decir una secuencia génica asociada naturalmente con el
promotor de SCSV. "Heteróloga" significa un gen "foráneo"
con relación al promotor, o un gen no asociado normalmente de otro
modo con el promotor de SCSV. En una realización preferida, el gen
foráneo también es foráneo para SCSV. Los ejemplos de genes foráneos
incluyen genes que facilitan la resistencia a insectos u otras
infestaciones de plagas, potencian la resistencia a insecticidas o
herbicidas, promueven la resistencia a la congelación, alteran el
color de la flor o de los pétalos, disminuyen la velocidad de
envejecimiento, especialmente en flores cortadas, aumentan o
potencian los niveles de ciertas proteínas y/o ribozimas. Más
particularmente, los genes foráneos incluyen:
- a)
- un gen de resistencia frente a virus, bacterias, hongos, nemátodos y otros patógenos de las plantas;
- b)
- un gen de resistencia a virus de las plantas, que incluye un gen sintético procedente del virus del mosaico de la alfalfa, del virus de la atrofia del trébol subterráneo, del virus del moteado del trébol subterráneo, del virus de la hoja roja del trébol subterráneo, del virus de enrollamiento de la hoja de la patata, del virus del bronceado del tomate, del virus del mosaico amarillo del haba, del virus del mosaico blanco del trébol, virus de las venas amarillas del trébol, de los virus x, y, s, m y a de la patata, del virus del mosaico del pepino, del virus de la atrofia desigual del arroz y del virus del enanismo amarillo de la cebada, y contra los mismos;
- c)
- un gen para mejorar el valor nutritivo de las plantas, tales como el gen SF8 del girasol con alto contenido en azufre;
- d)
- un gen de resistencia al hinchamiento;
- e)
- un gen de tipo anticuerpo;
- f)
- un gen proteínico que inactiva la tionina y ribosoma de cereales;
- g)
- un gen de resistencia a insectos, que incluye el gen de la toxina BT y el gen de inhibidor de proteinasa procedente de Nicotiana alata;
- h)
- un gen marcador seleccionable, tal como los que confieren resistencia a canamicina, fosfinotricina, espectinomicina e higromicina;
- i)
- un gen informador, tal como GUS, CAT y genes de tipo pigmentos;
- j)
- un gen que codifica una proteína reguladora que modula la expresión de un gen en las células vegetales.
La presente invención contempla además un
constructo genético que comprende dos genes heterólogos enlazados
operablemente al mismo o diferentes promotores circovíricos
operables en una célula vegetal. Preferiblemente, el promotor o
diferentes promotores proceden de un circovirus con un genoma que
comprende más de dos componentes o segmentos. Lo más preferible, el
promotor o diferentes promotores proceden de SCSV y, en particular,
se seleccionan de los segmentos 1 a 7 de SCSV como se definen
mediante los SEQ ID N^{os} 1 a 7 (véase más abajo). Los
constructos genéticos también pueden comprender una secuencia de
terminación o de poliadenilación enlazada operablemente a uno o
ambos de los genes heterólogos. En una realización, la secuencia de
terminación y/o de poliadenilación es la misma para cada gen. En una
realización alternativa, la secuencia de terminación y/o de
poliadenilación es diferente para cada gen. Lo más preferible, la
secuencia de terminación y de poliadenilación se selecciona de
segmentos 1 a 7 de SCSV como se definen mediante los SEQ ID N^{os}
1 a 7 (véase más abajo). En aún otra realización, al menos una
secuencia de terminación y de poliadenilación proviene del gen MeA 3
de Flaveria bidentis (véase más abajo).
La expresión "regulador de la transcripción"
se usa en su sentido más amplio para incluir secuencias promotoras,
de terminación y de poliadenilación, y otros efectores y agentes que
facilitan la transcripción de secuencias genéticas. En cuanto a los
promotores contemplados por la presente invención, las secuencias de
terminación y de poliadenilación pueden ser de origen SCSV, y se
pueden asociar naturalmente con un promotor correspondiente
procedente de SCSV, o se pueden asociar con otro promotor de SCSV.
Como alternativa, las secuencias de terminación y/o de
poliadenilación pueden derivar de fuentes que no sean de SCSV. Un
terminador particularmente preferido comprende la secuencia
nucleotídica 3' del gen MeA 3 de Flaveria bidentis, que
codifica una enzima NADP-málica de la fotosíntesis
C4 (Hatchi, 1987). En la Figura 15 se muestra la secuencia
nucleotídica de la región terminadora del gen MeA. La combinación de
un promotor de SCSV con, por ejemplo, la secuencia terminadora del
gen MeA de F. bidentis da como resultado un nivel elevado de
expresión, especialmente en plantas monocotiledoneas, con relación a
constructos sin la secuencia terminadora.
El gen extraño también puede estar en la
orientación antisentido para facilitar niveles reducidos de
productos génicos vegetales endógenos. A este respecto, "gen"
puede tener diez pares de bases de longitud, cientos de pares de
bases de longitud, o puede ser un gen de longitud completa o casi
completa, pero en una orientación inversa con relación al promotor.
El gen extraño también se puede colocar en la orientación del
"sentido" para la cosupresión de un gen diana.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un constructo genético que comprende un promotor de SCSV
o secuencia semejante a promotor operable en una célula vegetal, y
al menos un sitio de restricción de endonucleasa en dirección de
dicho promotor para facilitar la inserción de un gen heterólogo de
forma que dicho gen esté enlazado operablemente a dicho promotor. En
una realización alternativa, el constructo genético comprende un
promotor de SCSV, o secuencia semejante a promotor, operable en una
célula vegetal, y un gen heterólogo enlazado operablemente a dicho
promotor. En ambas realizaciones, el término "gen" incluye
aquellos que se dirigen a la síntesis de oligonucleótidos, tales
como los útiles en técnicas de antisentido así como ribozimas.
En aún una realización adicional de la presente
invención, se contempla un constructo genético que comprende un
promotor de SCSV, o secuencia semejante a promotor, operable en una
célula vegetal, y al menos un sitio de restricción de endonucleasa
en dirección de dicho promotor para facilitar la inserción de un gen
heterólogo de forma que dicho gen esté enlazado operablemente a
dicho promotor, y una secuencia de terminación y/o de
poliadenilación situada de forma que la misma secuencia esté en el
extremo 3' con relación a dicho gen heterólogo para facilitar la
expresión de dicho gen heterólogo. Preferiblemente, la secuencia de
terminación procede de SCSV. Como alternativa, la secuencia
terminadora procede del gen MeA 3 de F. bidentis.
Las plantas contempladas por la presente
invención incluyen especies tanto monocotiledoneas como
dicotiledoneas. La presente invención también se extiende a plantas
leguminosas y no leguminosas, aunque se prefieren las plantas
leguminosas.
El genoma de SCSV comprende al menos siete
componentes distintos de ADNss circular descritos como segmentos
1-7. El tamaño de estos segmentos oscila de
alrededor de 988 hasta alrededor de 1022 nucleótidos. Cada uno de
los siete componentes de ADN de SCSV contiene un marco de lectura
abierta principal del sentido vírico, y una región no codificante de
diversas longitudes que contiene una raíz potencial conservada y una
estructura de bucle (Figuras. 1 y 2; Tabla 2). Cada unidad de
transcripción contiene una caja TATA típica y una señal de
poliadenilación para comenzar y terminar la transcripción,
respectivamente (Figura 2, Tabla 2).
Debido a que los ADN son circulares, las
secuencias en estas regiones no codificantes comprenden los
promotores y las señales terminadoras que varían con los diferentes
componentes de ADN (Tabla 2). Las cajas TATA y los bucles de tallo
de las dos proteínas génicas asociadas a replicasa en los segmentos
2 y 6 son bastante diferentes de aquellos de los otros genes. Por el
contrario, los tallos-bucles y cajas de TATA son las
mismas en los segmentos 1, 3, 4, 5 y 7. Todos los ADN, excepto
aquellos de los segmentos 2 y 6, también comparten una secuencia
común (conocida como la región común) en la región no codificante
(Figuras 1 y 2).
Por lo tanto, la presente invención se extiende a
cada uno de los siete promotores y a las secuencias de terminación y
de poliadenilación en los segmentos 1-7 de SCSV. Las
secuencias nucleotídicas de los segmentos 1-7 se
muestran en la Figura 6, y se definen en las SEQ ID
NO:1-7, respectivamente.
El segmento 5 se identificó como el gen
proteínico de revestimiento basado en una secuencia de aminoácido
N-terminal y los datos de composición de aminoácidos
(Chu et al., 1993a). Los segmentos 2 y 6 codifican proteínas
que contienen los motivos característicos de unión a NTP, y de este
modo se predice que son genes proteínicos asociados a la replicación
(RAP) víricos putativos. Los 4 componentes de ADN restantes no están
relacionados entre sí o con el segmento 2, 5 y 6, basado en su
secuencia de aminoácidos deducida distinta. Los ADN de SCSV no
tienen homología significativa de secuencia nucleotídica con los
genomas de geminivirus, aunque existe cierta homología al nivel de
aminoácidos deducidos.
Se ha demostrado la competencia replicativa de
SCSV (Chu et al., 1993b). Puesto que el ADN del virión de
SCSV es de una sola cadena, y los transcriptos tienen el sentido
vírico, el primer suceso biosintético probable después del
desrevestimiento es la síntesis del ADN de forma replicativa usando
ADN polimerasa del hospedante (los ADN de SCSV tienen la capacidad
de autocebarse en la síntesis de ADNds [Chu y Helms, 1988]). Se
piensa que la ARN polimerasa del hospedante se une a los promotores
que inician la transcripción de ARN seguido de la síntesis de las
proteínas víricas requeridas para la multiplicación de los
virus.
En una realización particularmente preferida de
la presente invención, se contempla un promotor de SCSV, o secuencia
semejante a promotor, que comprende una secuencia nucleotídica
seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 y/o constructos
genéticos que comprenden a las mismas.
Una "secuencia semejante a promotor" como se
usa aquí incluye cualquier mutante funcional, derivado, parte,
fragmento, homólogo o análogo de un promotor de SCSV de origen
natural. Las secuencias semejantes a promotores contempladas aquí
incluyen sustituciones sencillas o múltiples nucleotídicas,
eliminaciones y/o adiciones a un promotor de SCSV, con tal de que
dichas secuencias semejantes a promotores retengan al menos 35%,
preferiblemente al menos 45%, más preferiblemente al menos 55%,
incluso más preferiblemente al menos 65-70%, y aún
más preferiblemente al menos 85-95% o más de la
actividad promotora, comparado con el promotor de SCSV de tipo
silvestre correspondiente.
En aún otra realización, se proporciona un
constructo genético que comprende un promotor de SCSV, o secuencia
semejante a promotor, y que es operable en una célula vegetal,
correspondiendo dicho promotor o secuencia semejante a promotor a
todo o parte de una cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 7, o capaz de
hibridarse en un intervalo de condiciones restrictivas, que oscila
desde condiciones muy restrictivas a poco restrictivas, hasta al
menos una de las SEQ ID NO: 1 a 7. Convenientemente, un mutante,
derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo de un promotor de
SCSV se define como funcional en una célula vegetal, y es capaz de
hibridarse en un intervalo de condiciones al menos desde elevadas
hasta poco restrictivas a al menos una de SEQ ID NO: 1 a 7.
En una realización particularmente preferida, el
constructo genético comprende además una secuencia de terminación
y/o de poliadenilación procedente de SCSV, o de una fuente que no es
SCSV, y que potencia o facilita de otro modo la expresión de un gen
enlazado operablemente a dicho promotor.
Para los fines de la definición del nivel de
restricción, se puede hacer referencia convenientemente a Sambrook
et al (1989) que se incorpora aquí como referencia, en el que
las etapas de lavado de las páginas 9.52-9.57 se
consideran de restricción elevada. Una baja restricción se define
aquí como 0,1-0,5% p/v de SDS a
37-45ºC durante 2-3 horas.
Dependiendo de la fuente y de la concentración de ácido nucleico
implicado en la hibridación, se pueden emplear condiciones
alternativas de restricción, tal como condiciones restringentes del
medio que se considera aquí que son 0,25-0,5% p/v de
SDS a \geq 45ºC durante 2-3 horas, o condiciones
muy restrictivas como se describe por Sambrook et al
(1989).
Otra realización de la presente invención
contempla un método para expresar un gen extraño en una célula
vegetal, comprendiendo dicho método introducir en dicha célula
vegetal un constructo genético que comprende un promotor de SCSV o
secuencia semejante a un promotor operable en dicha célula vegetal y
enlazado operablemente a dicho gen extraño. En una realización
adicional, se usan múltiples promotores de SCSV para hacer funcionar
a uno o más transgenes sin antagonismo. En aún una realización
adicional, el promotor de SCSV está asociado con el gen de segmento
2 de SCSV a fin de potenciar la expresión del gen extraño. En otra
realización, los constructos genéticos comprenden además una o más
secuencias de terminación y/o de poliadenilación que están
localizadas en el extremo 3' del gen extraño. Estas secuencias
potencian o facilitan de otro modo la expresión del gen extraño. El
segmento de terminación y/o de poliadenilación puede ser de SCSV o
de otra fuente tal como el gen MeA de F. bidentis.
En aún otra realización adicional, la presente
invención contempla una planta transgénica que contiene un promotor
de SCSV o una secuencia semejante a promotor como se define aquí
anteriormente en su genoma, y opcionalmente una secuencia de
terminación y/o de poliadenilación para potenciar la expresión de un
gen en dirección de dicho promotor. Preferiblemente, la planta
transgénica muestra características alteradas debido a la expresión
de una secuencia genética tal como un gen, oligonucleótido o
ribozima en dirección del promotor de SCSV.
La presente invención se describe adicionalmente
mediante referencia a las siguientes figuras y/o ejemplos no
limitantes. La referencia aquí a una región promotora de SCSV se
abrevia como "S" para SCSV, el número de segmento del genoma
(por ejemplo 1, 3, 4, 5 y 7), y "nc" para la región no
codificante. Por ejemplo, el promotor procedente del segmento 1 del
genoma de SCSV se define como "S1nc". Las secuencias
terminadoras para segmentos particulares del genoma de SCSV se
indican, por ejemplo, según lo siguiente: "SC1Tr" o
"SC5Tr" para las secuencias terminadoras para los segmentos 1 y
5, respectivamente. Los constructos genéticos que comprenden un
promotor de SCSV, un gen informador tal como GUS y una
secuencia terminadora tal como la procedente de SCSV, se abrevian
como "SCSV:GUS:SCTr" o "SCSV:GUS:SCSVTr".
Los promotores y secuencias de terminación específicos se definen
como antes, por ejemplo "S4nc:GUS:SC1Tr o
S4nc:GUS:Me3", "S4nc:GUS:Me3". En el último
constructo, se usa la secuencia terminadora procedente del gen MeA
de Flaveria bidentis, denominado aquí como "Me3".
En las Figuras:
La Figura 1 muestra las estructuras y unidades de
transcripción encontradas en un componente de ADN representativo de
un geminivirus típico y SCSV, los cuales contienen ambos un genoma
de ADNss.
La Figura 2 muestra los siete segmentos de ADN
encontrados en el genoma de SCSV en una forma lineal, que indica las
posiciones de la estructura del tallo-bucle, la
región común, la ventana de lectura abierta (ORF), la caja TATA y
las señales de terminación y de poliadenilación en cada ADN.
La Figura 3 muestra la construcción de los siete
vectores de expresión de fusión de la región no codificante de ADN
de SCSV: \beta-glucuronidasa (GUS) para la
transformación en plantas de tabaco. Los fragmentos de PCR
amplificados se clonaron separadamente en frente del gen GUS en pHW9
en los sitios BamHI (B) y NcoI (N) según se indica. Los
vectores pHW9 recombinantes resultantes se cortaron en el sitio
EcoRI, y se clonaron en el sitio EcoRI para el vector
binario PGA470 receptor.
La Figura 4 muestra la construcción de los
vectores de expresión de la fusión de los segmentos 5 y 7 del
promotor:GUS, y sus derivados de eliminación para estudios de
protoplastos. Los ADN que corresponden a las regiones no
codificantes de longitud completa se obtuvieron mediante PCR y se
clonaron en pKGO enfrente de GUS mediante ligación del extremo romo
en el sitio SalI según se indica. Los derivados de
eliminación se obtuvieron digiriendo los clones pKGO que contienen
la secuencia de longitud completa con HindIII o PstI en el vector y
las enzimas de restricción apropiadas sobre la secuencia de SCSV
según se indica. Los constructos de pKGO eliminados se religaron
después del llenado de los extremos, según se requiera.
La Figura 5 muestra la construcción del vector
pTAB10 binario recombinante (pBS150) que contiene el gen de fusión
del promotor de segmento 7 (57nc):GUS para la transformación
en plantas de trébol subterráneo. El casete de expresión
57nc:GUS se separó por escisión a partir del constructo de
pKGO (Fig. 4) mediante digestión con HindIII y BamHI,
y se ligaron los extremos romos al pTAB10 en el sitio EcoRI
después del llenado de los extremos de los ADN.
La Figura 6 muestra las secuencias completas de
los siete círculos de ADN de SCSV. Se subraya la secuencia de la
región no codificante en cada ADN usado en la construcción de los
casetes de expresión.
La Figura 7 muestra la expresión de GUS detectada
mediante tinción histoquímica sobre hojas de tabaco y de trébol
subterráneo transgénicos transformadas con el casete de expresión de
fusión del promotor de seg 7 de SCSV (S7nc):GUS.
Las Figuras 8A a 8F son representaciones
fotográficas de la tinción histoquímica para la actividad GUS en
plantas transgénicas - campo brillante. Las exposiciones de campo
brillante de trozos de hoja teñidos (L), secciones del tallo (S),
raíces (R), y polen (P) de plantas de tabaco transformadas con los
constructos de fusión GUS que contienen las regiones promotoras de
SCSV para los fragmentos 1, 3, 4, 5 y 7 denominados como regiones
promotoras S1nc, S3nc, S4nc, S5nc y S7nc, y de plantas no
transformadas (NT). La coloración azul indica expresión de GUS. En
cada hoja, tallo o raíz se representa un transformante independiente
(excepto los dos trozos de raíces de S5nc de la parte superior que
no se pudieron separar fácilmente) y las muestras de polen fueron
mezclas de dos o más transformantes. La Fig. 8a muestra la expresión
diferencial de GUS en plantas transformadas con regiones S4nc o S5nc
comparado con una planta no transformada (NT).
Las Figuras 9A a 9E son representaciones
fotográficas que muestran la tinción histoquímica para actividad GUS
en plantas transgénicas - campo oscuro. Las secciones delgadas
transversales (T) y longitudinales (L) de trozos de tallo teñidos,
embebidos, de plantas de tabaco transformadas con los constructos de
fusión GUS que contienen los componentes 1 (S1nc), 3 (S3nc), 4
(S4nc), 5 (S5nc), y 7 (S7nc) de las regiones promotoras, vistas con
un campo oscuro. Los cristales rosas indican la expresión GUS. Los
trozos de tallo usados para las secciones transversales y
longitudinales representan transformantes independientes. Los
aumentos son: 375X en S1nc T y L, S3nc L, S4nc T, S5nc T y L, y S7nc
L; 480X en S3nc T; 200X en S4nc L; y 300X en S7nc T.
La Figura 10 es una representación gráfica de un
ensayo fluorométrico para la expresión GUS. El ensayo fluorométrico
resulta de extractos de hoja de plantas de tabaco transformadas con
los constructos de fusión GUS que contienen el componente 1 (S1nc),
3 (S3nc), 4 (S4nc), 5 (S5nc), y 7 (S7nc) de las regiones promotoras.
Cada columna representa un transformante independiente. Las
actividades GUS se midieron con Labsystems Fluoroskan a 5 ó 10
minutos de intervalos durante 60 minutos (o 30 minutos para S4nc)
usando
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG) como sustrato. Los índices de actividad de GUS se expresan
como unidades fluorométricas (Fl.U.) por minuto por mg de proteína.
1000 Fl.U. es aproximadamente igual a 825 pmoles de
4-metilumbeliferona (MU).
La Figura 11 es una representación diagramática
del constructo del promotor (S2nc) del segmento 2 de SCSV capaz de
dirigir la expresión de GUS en protoplastos del tabaco. Se fusionó
un fragmento de ADN de segmento 2 procedente de
NcoI-XBaI a un vector GUS sin promotor, pKGO. Pr,
promotor, seg 2, segmento 2 de SCSV.
Las Figuras 12a y 12b son representaciones
diagramáticas que muestran constructos de vectores de expresión
SCSV:GUS:SCSV Tr. Las secuencias de terminación/
poliadenilación para el segmento 3 de SCSV (SC3Tr) y segmento 5
(SC5Tr) se amplificaron mediante PCR y se cortaron con las enzimas
de restricción respectivas, y entonces se clonaron en el vector pKGO
recombinante según se indica. El constructo SC3Tr se clonó como un
fragmento EcoRI-XhoI en el vector pKGO que contiene
S1nc:GUS:OCS3' para obtener S1nc:GUS:SC3Tr. El
constructo SSC5TR se obtuvo como un fragmetno EcoRV en el
vector pKGO que contiene S4nc:GUS:OCS3' para obtener
S4nc:GUS:S5Tr.
Las Figuras 13A a 13D son representaciones
fotográficas que muestran la expresión de GUS en tejidos de plantas
de patata dirigida por el promotor de segmento 4 de SCSV (S4nc). A,
tallo; B, hoja; C, estolón; y D. tubérculo.
La Figura 14 es una representación fotográfica de
la expresión de GUS en hoja de algodón dirigida por el promotor de
segmento 7 de SCSV (S7nc).
La Figura 15 es una representación de la
secuencia terminadora de MeA3 del gen MeA de Flaveria bidentis
(Me3). El codón stop se muestra en tipo de cara en cursiva al
comienzo de la secuencia. Esta secuencia se sometió a ingeniería
genética en el constructo quimérico para incluir un sitio
EcoRI: GAATTCGTTTAG.... Los constructos quiméricos
contuvieron de este modo una secuencia que comienza AATTCGTTTAG.
La Figura 16 es una representación diagramática
de los vectores de expresión de GUS (ME20 y ME29) que contienen los
elementos reguladores del gen MeA de Flaveria bidentis
indicado.
La Figura 17 es una representación diagramática
de la construcción del plásmido de S4nc pBS237 que contiene el
casete de expresión S4nc:GUS:Me3'. Se digirió el plásmido
pBS218 con EcoR1 para eliminar la región OCS3', y se ligó con
un EcoR1.
La Figura 18 es una representación diagramática
de la construcción del plásmido pBS246 que contiene el casete de
expresión S1nc:nptII:SC3Tr. El fragmento SalI-SalI
tiene aproximadamente 8,5-9 kpb; B_{L} tiene
aproximadamente 0,5 kpb; B_{R} tiene aproximadamente 0,6 kpb; el
SC1nc:nptII:SC3Tr tiene alrededor de 1,7 kpb.
Las Figuras 19a-c son
representaciones diagramáticas de la construcción del plásmido
pKHAN4 a partir de pKHAN2 y pKSB.bar1. pKHAN4: un segmento
HindIII-EcoR1 que contiene S7nc (572 pb), la región
codificante nptII (978 pb) y el extremo 3' de vicillina (276 pb) de
pKHAN2 se insertó en el plásmido binario pKSB.bar1 para producir
pKHAN4:pKHAN2. La región codificante nptII (978 pb, fragmento
BamHI-SmaI) procedente de p35SKN se clonó en el sitio
Asp718 (que se hizo romo con el fragmento Klenow) de pKHAN1 para
crear pKHAN2. Pro de SCSV = S7nc; pKSB. Bar 1: pTAB10.MCSori1B
digerido con EcoR1 según se ligan juntos.
La Figura 20 es una representación fotográfica de
una selección de plantas de tabaco resistente a canamicina en medio
de regeneración transformadas con vectores binarios que contienen el
promotor 35S:NPTII:secuencia terminadora 35S (35SPrm:NPTII:35STrm) o
el casete de expresión S1nc:NPTII:SC3Tr. (En las Figuras, las
abreviaturas son 35S Principalmente NPTII35STrm y SC1 Principalmente
NPTII Sc3 Trm, respectivamente.
La Figura 21 es una representación diagramática
de un vector de clonación que utiliza señales reguladoras de
transcripción de ADN de SCSV.
La Figura 22 es una representación diagramática
de un constructo dimérico de segmento 2 de SCSV pBS2. Este
constructo se creó clonando una pareja repetida del segmento 2 de
ADN de SCSV (que contiene una unidad de transcripción seg 2
funcional completa) en el sitio del poliligador de pGEM7 que
entonces se clonó en una versión reducida del vector binario de
pMCP3 (Khan et al., 1994).
En la Tabla 19 se muestra un resumen de las
actividades de transcripción facilitadas por los elementos
reguladores de transcripción de SCSV.
Para la determinación de la secuencia se usó el
aislado clínico F de SCSV (Chu et al. 1993a). Se crearon
clones de longitud completa de los componentes del genoma de SCSV a
partir del ADN de forma replicativa (RF) como se describe por Chu
et al. (1993a). Se crearon otros clones a partir de la RF
mediante PCR con cebadores específicos de SCSV diseñados a partir de
secuencias conocidas.
Se usó el método de terminación de cadena con
didesoxi (Sanger et al., 1977) para secuenciar moldes de
ADNss de M13 (Sambrook et al., 1989) o moldes de ADNds
preparados mediante el método de CTAB (Del Sal et al., 1989)
a partir de los clones descritos anteriormente. El análisis de la
secuencia se llevó a cabo usando el Paquete de Programa de Ordenador
para Análisis de Secuencia del Wisconsin Genetics Computer Group
(Devereaux et al., 1984).
Las técnicas de manipulación de ADN usadas fueron
como se describe por Sambrook et al. (1989). Las regiones no
codificantes completas de los 7 segmentos de ADN de SCSV se
amplificaron mediante PCR usando cebadores específicos (véase la
Tabla 8) con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
apropiadas para clonar en vectores del plásmido. Los fragmentos de
ADN amplificados se clonaron separadamente en los respectivos
vectores de expresión en dirección del gen informador de GUS sin
promotor en la orientación apropiada para producir los constructos
de fusión del promotor de SCSV-GUS como se muestran
en las Figuras 3 y 4. Se usó el vector de expresión pHW9 (Fig. 3)
seguido de la clonación en el vector binario pGA470 (An et
al., 1985) para la transformación del tabaco. Se usó el vector
de expresión pKGO para la expresión de GUS en protoplastos (Fig. 4),
y se usó el vector binario pTAB10 para la transformación de trébol
subterráneo (Fig. 5). El pKGO se construyó clonando el fragmento
XhoI de pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989) que contiene el
gen GUS y la secuencia terminadora de OCS en el sitio SalI de
pJKKm (Kirschman y Cramer, 1988). Como controles se usaron los
plásmidos correspondientes que contienen el promotor 35S fusionado a
GUS. Los empalmes de los clones se comprobaron mediante
secuenciación. Como control se usó un constructo de GUS sin
promotor.
Se obtuvieron derivados de eliminación de los
promotores de segmentos 5 y 7 de SCSV digiriendo la secuencia no
codificante de longitud completa con una enzima apropiada para
producir la eliminación deseada (Fig. 4).
Para investigar el fenómeno de la
transactivación, se separó por escisión el casete de expresión
S5nc:GUS de constructos de pKGO recombinantes, y se clonó en
un plásmido pGEM que contiene la región codificante RAP seg 2
expresada a partir del promotor 35S. El plásmido resultante que
contiene tanto el promotor SCSV:GUS como el promotor
35S:casetes de expresión seg 2 RAP se electroporó en
protoplastos.
Los plásmidos recombinantes se extrajeron de
E. coli mediante lisis alcalina seguida de la purificación a
través de columnas Qiagen como se describe en el Manual Para
Plásmidos de Qiajen.
Se usaron cultivos de células en suspensión para
aislar protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia (Last et
al. 1991) y trébol subterráneo, variedad Woogenellup (Chu et
al. 1993b). Los plásmidos purificados se electroporaron en
protoplastos de trébol subterráneo o Nicotiana
plumbaginifolia como se describe por Taylor y Larkin (1988). Los
protoplastos se cosecharon 3 días más tarde y se analizaron
fluorométricamente para determinar la actividad transitoria de GUS
usando como sustrato el
4-metil-umbeliferil-\beta-glucurónido
(véase más abajo). Todos los experimentos se realizaron usando
muestras duplicadas por tratamiento.
Se transformaron separadamente constructos
binarios pGA470 recombinantes que contienen los diversos casetes de
expresión de promotor de SCSV:GUS en la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens (Hoekema et al. 1983)
mediante electroporación como se describe por Nagel et al.
(1990). Se transformó Nicotiana tobacum variedad
Wisconsin 38, y se regeneró como se describe mediante Ellis et
al. (1987).
El vector binario pTAB10 recombinante que
contiene el constructo de fusión S7nc:GUS (pBS150) se
transformó en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens (Lazo
et al. 1991) mediante emparejamiento triparental (Ditta et
al. 1980). Se transformó trébol subterráneo, variedad Larisa,
mediante transformación mediada por Agrobacterium, y se
regeneró como se describe por Khan et al. (1994).
Se lisaron los protoplastos mediante ultrasonidos
en presencia de 0,3% v/v de Tritón X-100
inmediatamente después de la cosecha. Se determinó la actividad de
GUS del extracto soluble en un ensayo fluorométrico usando el
sustrato
4-metil-umbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG) (Jefferson et al., 1987). La fluorescencia se midió
usando un espectrofotómetro Labsystem Fluoroskan II.
La expresión de GUS en tejidos transgénicos
intactos se detectó mediante tinción histoquímica en ácido
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-glucurónico
(X-gluc) (Jefferson et al., 1987), y mediante
ensayo fluorométrico del extracto soluble usando MUG.
Se determinaron las secuencias completas de los 7
círculos conocidos de ADN de SCSV (Fig. 6). Cada ADN contiene una
región no codificante con señales (cajas TATA) para la actividad
promotora (Tabla 2). Estas secuencias no se han descrito o aislado
antes. La comparación de las secuencias de las regiones no
codificantes que comprenden estos promotores mostró que los
segmentos 3 y 5 son muy similares, compartiendo 258 nucleótidos
conservados de una media de 491 nucleótidos en las regiones no
codificantes de los ADN. Las secuencias 3, 4, 5 y 7 contenían 170
bases conservadas entre ellas, mientras que sólo se conservaron 152
bases entre los segmentos 1, 3, 4, 5 y 7. Las variaciones de
secuencias en las regiones no codificantes de los ADN de SCSV
sugieren que la transcripción y replicación de los diferentes genes
de SCSV pueden estar reguladas diferentemente.
Se han demostrado directamente las actividades
promotoras de dos regiones no codificantes de ADN de SCSV mediante
expresión transitoria de GUS usando constructos de fusión de
promotor de SCSV:GUS en protoplastos de trébol subterráneo
(Tabla 3) y del tabaco (Tabla 4). Estos resultados mostraron que los
promotores de ambos segmentos 5 y segmento 7 son funcionales en
ausencia de otros componentes de ADN de SCSV. Los promotores de SCSV
también son funcionales en protoplastos tanto de un hospedante
natural (trébol subterráneo) como de un no hospedante (tabaco). En
protoplastos del tabaco, el promotor del segmento 7 fue similar en
actividad al promotor 35S, mientras que el promotor del segmento 5
(proteína de revestimiento) mostró consistentemente actividad
alrededor de la mitad que la del promotor 35S de CaMV (Tabla 4). Sin
embargo, la actividad de ambos promotores fue mayor en protoplastos
de trébol subterráneo, mostrando la actividad del promotor del
segmento 7 hasta varias veces la del promotor 35S (Tabla 3),
sugiriendo que los promotores de SCSV funcionan mejor en ciertas
leguminosas que el promotor 35S ampliamente usado. La actividad del
promotor del segmento 7 también pareció ser más variable en
protoplastos de trébol subterráneo que los otros ensayados.
También se construyeron (Fig. 4) plásmidos que
contienen diversos derivados de eliminación de la secuencia no
codificante de los segmentos 5 y 7 fusionados a GUS, y se
electroporaron en protoplastos (Tabla 5). Los ensayos de GUS de
protoplastos transfectados por estos constructos mostraron que ni el
bucle del tallo ni la región común fueron necesarios para promover
la actividad, aunque esta última se necesitó para la actividad
completa (Tabla 5). La secuencia de ADN requerida para la actividad
promotora de alto nivel parece ser menor que 300 pb que es más
pequeña que la requerida para otros promotores, tales como el
promotor 35S (Odell et al., 1985).
Cuando se coelectroporaron con un constructo de
promotor 35S:gen RAP seg 2, las actividades de GUS accionadas por el
promotor seg 5 aumentaron aparentemente en alrededor de 2 veces
tanto en protoplastos de trébol subterráneo como de tabaco (Tabla
6). La actividad del promotor del segmento 7 también se puede
incrementar cuando se coelectropora con el constructo 35S:seg 2 RAP,
pero son necesarios experimentos adicionales para confirmar
esto.
También se observó aparentemente la
transactivación de la actividad de GUS cuando el constructo
S5nc:GUS se coelectroporó con un plásmido de vector binario
(pBS2) que contiene una pareja repetida (dímero) del ADN de segmento
2 (Tabla 6). En la Figura 22 se muestra un mapa del constructo
dimérico del segmento 2 de SCSV-pBS2. Este
constructo se creó clonando una pareja repetida del ADN del segmento
2 de SCSV (que contiene una unidad de transcripción seg 2 completa
funcional) en el sitio del poliligador de pGEM7 que entonces se
clonó en una versión reducida del vector binario pMCP3 (Khan et
al., 1994). Los resultados sugieren que ambos promotores de SCSV
se expresaron concurrentemente. De este modo, se pueden usar
diferentes promotores de SCSV en combinación con un promotor de 35S,
o se pueden usar simultáneamente para facilitar la expresión
concurrente de múltiples transgenes en las plantas. Por el
contrario, se ha observado actividad transgénica reducida cuando se
usa el promotor 35S en transgenes de múltiples copias o múltiples
transgenes (Linn et al., 1990; Matzke y Matzke, 1991; Scheid
et al., 1991; Carvalho et al., 1992).
Se ha encontrado que todos los promotores de
SCSV, excepto aquellos de los segmentos 2 y 6, son capaces de
accionar la expresión de transgenes en plantas de tabaco (Fig. 7).
El nivel de actividad de los promotores medido por el ensayo de MUG
varió de una planta a otra, y de un promotor a otro, pero
generalmente es menor que el del promotor 35S (Tabla 7).
La tinción histoquímica de tejidos de tabaco
transgénicos intactos mostró que la actividad del promotor S4nc
parece ser constitutiva, y se detectó actividad de GUS en todos los
órganos de la planta. Los otros se restringen generalmente a los
tejidos vasculares, aunque también se detectó expresión en el
polen.
En plantas de trébol subterráneo transgénicas que
expresan el constructo génico S7nc:GUS, la tinción
histoquímica mostró que la actividad GUS se encuentra en las hojas,
tallos y pecíolos. La distribución de la actividad GUS es
principalmente constitutiva, aunque en algunos tejidos la actividad
se encuentra con mucho en los tejidos vasculares (Figura 7). En
estas plantas, el nivel de actividad del promotor también varía de
una planta a otra, pero la actividad es generalmente comparable a la
del promotor 35S.
Estos resultados indican que los promotores de
SCSV proporcionan una elección de promotores que se puede usar
independiente o simultáneamente para controlar la expresión de uno o
más genes extraños en una amplia variedad de plantas y tipos de
tejidos. Las leguminosas son una diana importantísima de aplicación.
La actividad de estos promotores también se puede potenciar por la
presencia del producto génico seg 2. De este modo, parece que estos
promotores tienen ventajas significativas con respecto al promotor
35S de CaMV, tanto en los niveles de expresión, tamaño y en la
superación de algunas características negativas del promotor 35S.
Serían aplicables en una amplia variedad de aplicaciones
transgénicas.
Compilado de los datos presentados en el Sexto
Congreso Internacional de Patología de Plantas, Montreal, Julio de
1993. FBNYV = virus de amarillamiento necrótico de la haba, MDV =
virus de enanismo de arveja lechosa, SCSV = virus de la atrofia del
trébol subterráneo, BBTV = virus del copo racimoso del banano, CFDV
= virus de la caída foliar del cocotero.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Todos los experimentos se realizaron usando
muestras duplicadas por tratamiento. La actividad GUS se midió
usando un espectrofotómetro Labsystem Fluoroskan II, y se presenta
tanto en actividad absoluta (Act) como un porcentaje de la actividad
de 35S:GUS (% de 35S).
Los constructos se representan como
"promotor:gen informador". Por ejemplo, "35S:GUS"
es el promotor 35S y el gen informador GUS. "S5nc" y
"S7nc" son los promotores de los segmentos 5 y 7,
respectivamente, de SCSV.
Todos los experimentos se realizaron usando
muestras duplicadas por tratamiento. La actividad GUS se midió
usando un espectrofotómetro Labsystem Fluoroskan II, y se presenta
tanto en actividad absoluta (Act) como un porcentaje de la actividad
de 35S:GUS (% de 35S).
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Los niveles se expresan como porcentajes de la
actividad de la secuencia no codificante de longitud completa
respectiva.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se estudiaron plantas transgénicas de tabaco
transformadas con los cinco casetes de fusión del promotor de SCSV
(Segmentos 1, 3, 4, 5 y 7):GUS para determinar la actividad
de GUS tanto en los ensayos histoquímicos (Figs. 8 y 9) como
fluorométricos (Fig. 10). Las muestras tomadas de plantas que se
hicieron crecer en material de vidrio joven y de tejido cultivado
produjeron el mismo patrón de expresión de GUS. La actividad de GUS
se observó en todas las partes de la planta, incluyendo raíces,
tallos, hojas, pecíolos, y todas las partes de la flor. El
constructo del promotor 5 dio una expresión de GUS relativamente
menor en el polen que otros promotores. Los resultados de los
ensayos fluorométricos confirmaron los datos previos mostrando que
el promotor del segmento 4 fue el mayor expresor, con una actividad
10 veces o más mayor que la del resto (Fig. 10), pero aún es menor
que la del promotor 35S. Los niveles de expresión de los promotores
de segmento 1, 3, 5 y 7 fueron comparables a los del promotor rolC
específico de floema en tabaco (Schmulling et al., 1989;
Sugaya et al., 1989). Las plantas transformadas con el
constructo GUS sin promotor no expresaron GUS por ninguno de los
métodos de ensayo. Los ensayos histoquímicos mostraron que la
expresión de todos los constructos del promotor fue la mayor en
tejidos vasculares, siendo los mayores expresores más constitutivos
que los expresores menores que están más limitados vascularmente
(Fig. 8). En general, los constructos de los promotores 1, 3, 5 y 7
se expresan mayormente en los tejidos vasculares. En particular, la
expresión de GUS por los constructos del promotor 1 y 3 están
restringidos principalmente a tejidos de floema. Sin embargo, para
todos los promotores, la tinción histoquímica de las hojas mostró
que la expresión de GUS en estos tejidos a menudo está enrojecida
(constitutiva y limitada vascularmente), y es variable entre las
hojas de la misma planta. La microscopía del campo oscuro
(Jacobsen-Lyon et al., 1995) también mostró
que ninguno estará estrictamente limitado de forma vascular (Fig.
9).
Se caracterizaron además veinte plantas
transgénicas de trébol subterráneo que expresan el gen del promotor
del seg 7:GUS mediante ensayos histoquímicos (Tabla 9). Estos
ensayos mostraron que la actividad de GUS se observaron en todas las
partes de la planta, incluyendo las raíces, tallos, hojas y
pecíolos. La expresión de GUS fue la mayor en los tejidos
vasculares, siendo algunas hojas más constitutivas y enrojecidas que
otros órganos, y siendo las plantas que expresan GUS de forma
elevada más constitutivas que las que expresan de forma escasa. Las
muestras tomadas a partir de plantas que se hicieron crecer en
material de vidrio y de tejido cultivado produjeron el mismo patrón
de expresión de GUS.
Los experimentos mostraron que las regiones no
codificantes procedentes de los ADN de segmento 2 y 6 de SCSV fueron
incapaces de llevar a cabo la expresión del gen GUS en tabaco
transgénico. Estas regiones tienen una longitud de 179 y 159
nucleótidos, respectivamente, y es probable que se requieran
secuencias adicionales para la actividad del promotor. Para estudiar
esta hipótesis, se construyó una nueva secuencia del promotor de
segmento 2 que consta del fragmento de ADN procedente de los
nucleótidos 526 a 46, y se fusionó al vector pKGO de GUS sin
promotor (Fig. 11). El constructo de fusión se electroporó en
protoplastos de tabaco. Se detectó actividad de GUS en protoplastos
de tabaco electroporado a niveles similares a los del constructo del
promotor de segmento 5:GUS (Tabla 10).
También se transformó en plantas de tabaco, como
se describe en el Ejemplo 4, un vector binario que contiene el ADN
de fusión del promotor SRnc:GUS. La tinción histoquímica de
varias plantas de tabaco transformadas mostró que la expresión de
GUS fue principalmente vascular. Estos resultados mostraron que la
secuencia adicional procedente de la región codificante de ADN de
segmento de 2 de SCSV es necesaria para la función del promotor.
Puesto que el segmento 6 de SCSV es una variante del segmento 2, es
de esperar que un constructo similar, que comprende la región no
codificante y parte de la región codificante de este ADN, producirá
un promotor activo. De este modo, es de esperar que todos los
promotores de SCSV sean adecuados para accionar la expresión génica
en plantas.
La expresión génica eficaz requiere no sólo un
promotor, sino también secuencias nucleotídicas específicas en el
extremo 3' de la región codificante del gen, conocidos como las
señales de terminación y de poliadenilación (Messing et al.,
1983; Joshi 1987b; Gil y Proudfoot, 1984; Rothnie et al.,
1994). Estas secuencias especiales se requieren para señalar al
ARN polimerasa para que detenga la transcripción, y para permitir el
procesamiento posterior del transcripto de ARN. La actividad de las
señales de terminación y de poliadenilación puede afectar a la
eficacia de la transcripción y a la estabilidad del ARN que se
transcribe. Algunas secuencias de terminación/poliadenilación
ampliamente usadas incluyen aquellas procedentes de los genes NOS
(Depicker et al., 1982), OCS (Janssen y Gardner, 1989) y 35S
de CaMV (Pietrzak et al., 1986).
Cada uno de los segmentos (o componentes) de ADN
de SCSV contenía una secuencia terminadora que comprende una
secuencia de señal de terminación y poliadenilación en la región no
codificante (Tabla 11; Figura 2). Para demostrar la actividad de las
señales de terminación/poliadenilación en ADN de SCSV, se
construyeron vectores de expresión de GUS que contienen la señal de
poliadenilación y de terminación del segmento 3 o del segmento 5
(Fig. 12), y se sometieron a expresión transitoria y protoplastos de
tabaco. La secuencia terminadora respectiva se amplificó mediante
PCR con varios sitios de restricción incorporados en los cebadores
(Fig. 12). Los fragmentos terminadores amplificados se cortaron con
las enzimas de restricción indicadas, y se clonaron en el plásmido
recombinante pKGO que contiene tanto los constructos del promotor
S1nc o S4nc:GUS:OCS3', a partir de los cuales se ha borrado
la secuencia OCS3' (Fig. 12). Los constructos resultantes
S1nc:GUS:SC3Tr (el promotor del segmento 1 aquí tiene una
eliminación del fragmento HindIII de nucleótidos
641-782 que no tiene efecto sobre la actividad de
GUS) y S4nc:GUS:S5Tr se electroporaron en protoplastos de
tabaco, y se analizaron para determinar la actividad de GUS. Los
resultados mostraron que la actividad de GUS aumentó 2 a 3 veces
cuando se usó la secuencia de terminación/poliadenilación de SCSV en
lugar de la secuencia de terminción/poliadenilación de OCS
habitualmente usada, en el mismo constructo (Tabla 12). En el mismo
experimento, el constructo S1nc:GUS:S3Tr produjo una
actividad aproximadamente dos veces mayor que el constructo
35S:GUS:OCS3' (Tabla 12). Estos resultados indican que cada
uno de los componentes de ADN de SCSV contiene una secuencia de
señal de terminación y de poliadenilación diferente que se puede
usar en diversas combinaciones con los promotores de SCSV para
regular y/o potenciar la expresión de genes foráneos en plantas. Al
igual que con la secuencia de SCSV, las secuencias de
terminación/poliadenilación de SCSV son ventajosas con respecto a
las secuencias de terminación/poliadenilación actualmente
disponibles por sus tamaños pequeños (160-170
nucleótidos) y la disponibilidad de un amplio intervalo de
reguladores de la transcripción con potencias diferentes y
especificidades de tejidos para la manipulación genética. Los
resultados también muestran que el uso de un promotor de SCSV, en
combinación con una secuencia terminadora de SCSV, da mayores
niveles de expresión génicas que los constructos que usan el
promotor 35S en combinación con una de las secuencias terminadoras
de la transcripción habituales.
Se usó un vector binario pGA470, que contiene el
constructo de fusión S4nc:GUS:NOS clonado en pHW9 (Figura 3),
para transformar plantas de patata. El pHW9 deriva de pHW8 (Dolferus
et al., 1994) en el cual se inserta el poliligador de
pGEM3zf(+). El vector binario recombinante se transformó en la cepa
LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación
(Nagel et al., 1990). Se transformaron variedades cultivadas
de patata Atlantic y Sebago, y se regeneraron esencialmente como se
describe por Wenzler et al. (1989) excepto por las siguientes
modificaciones. Se usaron trozos de tallo en lugar de trozos de hoja
para la transformación, y se usaron 10 mg/l de bencilaminopurina
(BAP) en lugar de 2,24 mg/l durante el cocultivo. Después del
cocultivo, el medio de la etapa 1 se suplementó con 100 mg/l de
cefotaxima y nada de canamicina o carbenicilina. El medio de la
etapa II contenía 2 mg/l de BAP, 5 mg/l de GA3, 100 mg/l de
canamicina y 100 mg/l de cefotaxima.
Se transfirieron seis plantas transformadas, que
comprenden 5 variedades cultivadas Atlantic y una variedad cultivada
de Sebago, y se hicieron crecer en un invernadero durante
10-11 semanas hasta que se formaron pequeños
tubérculos. Se estudiaron tejidos procedentes de diferentes partes
de las plantas, mediante tinción GUS histoquímica. Los resultados
mostraron que GUS se expresó de forma elevada en todas las partes de
las plantas, incluyendo raíces, estolones, tubérculos, tallos y
hojas, pero la expresión fue predominantemente vascular, incluyendo
los elementos de floema y algunos elementos de xilema (Fig. 13). Al
igual que en otros hospedantes transgénicos, la expresión de GUS en
tejidos nos vasculares de materiales vegetales muy activos para GUS,
especialmente tubérculos jóvenes, son más evidentes que en tejidos
menos activos cuando se compara con plantas transformadas con el
constructos 35S:GUS:NOS, y la expresión de GUS
dirigida por el promotor SCSV en tubérculos fue al menos tan elevada
como la del constructo 35S:GUS.
Se usó el vector binario pGA470, que contiene el
constructo de fusión S7nc:GUS:NOS clonado en pHW9, para
transformar plantas de algodón. El vector binario recombinante se
transformó en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens,
mediante emparejamientos triparentales. Se transformó la variedad
cultivada coker 315 de algodón (Gossypium hirsutum), y se
regeneró como se describe por Cousins et al. (1991).
Las plantas transformadas se hicieron crecer en
un invernadero, y se analizaron tejidos de hojas procedentes de 18
plantas transgénicas independientes para determinar la actividad de
GUS mediante tinción histoquímica. La actividad de GUS varió entre
plantas. Cinco de estas plantas mostraron una fuerte expresión de
GUS, en un intervalo similar a la expresión de GUS accionada por el
promotor 35S, y fue predominantemente en los tejidos vasculares
(Fig. 14). La actividad de GUS fue especialmente fuerte en glándulas
llenas de gosipol. Al igual que en otros hospedantes transgénicos,
la tinción de GUS en tejidos altamente expresados también era
constitutiva.
Entonces se tiñeron una variedad de tejidos
procedentes de estas plantas, y se observó la expresión vascular en
todos los órganos, incluyendo raíces, tallos, pecíolos, pétalos y
otras partes florales vascularizadas. La expresión parece ser
particularmente elevada en capullos de flores jóvenes. Se realizaron
los plantones de una de las líneas para determinar la actividad de
GUS. Todas las 10 progéneres se tiñeron fuertemente en raíces y
hojas, indicando que el gen que se heredó y que la línea
probablemente contenía más de un sitio de inserción
independiente.
Se caracterizó adicionalmente la estabilidad de
la expresión de GUS accionada por los diversos promotores de SCSV en
tabaco y trébol subterráneo transgénicos, en plantones de generación
T1 de plantas de trébol subterráneo y de tabaco.
En el tabaco, los plantones T1 procedentes de 10
líneas transgénicas independientes se estudiaron mediante tinción
histoquímica. Los resultados mostrados de la expresión del gen GUS
accionado por los cinco promotores (segmentos 1, 3, 4, 5 y 7) fue
estable en los plantones T1, manteniéndose el patrón de expresión en
todos los casos entre los tejidos de plantas T0 y T1 de la misma
edad. En tallos muy jóvenes, en los que los tejidos vasculares no
están bien diferenciados, la expresión de todos los otros promotores
fue muy elevada, y se detectó en todos los tejidos de los tallos.
Con la edad aparece una limitación gradual vascular, y con el
aumento de la diferenciación de los haces vasculares. Al igual que
con las plantas T0, la expresión de GUS mediada por el promotor de
segmento 4 fue más constitutiva que las otras.
Se estudiaron cincuenta plantones T1 de
2-3 meses, procedentes de 15 plantas de trébol
subterráneo transgénicas independientes, que expresan el constructo
de fusión S7nc:GUS, para determinar la actividad de GUS
mediante ensayos histoquímicos y fluorométricos. Los resultados
mostraron que la expresión del ges GUS accionada por el promotor de
segmento 7 fue estable en plantones T1, manteniéndose el patrón de
expresión entre tejidos de plantas T0 y T1 de la misma edad. Se
encontró que la expresión de GUS generalmente se segrega a la
relación esperada de 3:1. Los resultados preliminares de los ensayos
fluorométricos confirmaron los datos histoquímicos, sugiriendo que
el constructo del promotor de segmento 7 tuvo una actividad de GUS
en cierto modo menor que la del promotor 35S en hojas y pecíolos
(Tabla 13). Sin embargo, la actividad de GUS en tallos de trébol
subterráneo fue 3 veces mayor que en pecíolos, y 6 veces mayor que
en hojas (Tabla 14). La edad de las plantas en el momento del ensayo
fue de 2 a 3 meses.
El constructo de promotor SCSV:GUS usado
(Tabla 15) derivó del plásmido pKGO de GUS sin promotor (Figura 4;
pJKKmf(-) K1W1 GUS:OCS) descrito previamente, mientras que el
constructo del promotor 35S:GUS fue pGUS. El pGUS deriva de
la clonación del gen Gus a partir de pKIWI101 en el vector de
expresión pDH51 de plantas (Pietrzak et al., 1986).
Para la expresión transitoria de GUS en tejidos
de haba de soja, los constructos de GUS se introdujeron en tejidos
mediante bombardeo de partículas usando el sistema de suministro de
partículas Bio-Rad Biolistic
PDS-1000/He, como antes. Se disparó 50 \mul de
suspensión que contiene 3 mg de una relación 1:1 de 1 y 5 \mu
partículas de oro más 6 \mug de ADN sobre placas que contienen 3
hojas cada una. Las hojas completamente extendidas en estos
experimentos se prepararon a partir de plantas de haba de soja de 24
días, variedad Wayne. Después del bombardeo de partículas, se
analizó la actividad de GUS 24 horas después mediante infiltración a
vacío de las hojas con X-Gluc (Craig, 1992).
Los resultados (Tabla 15) mostraron que, en la
expresión transitoria en hojas de haba de soja, el promotor de
segmento 4 de SCSV fue más activo (25-35
manchas/hojas) que el promotor 35S (10-15
manchas/hoja) cuando se dispararon los plásmidos respectivos en
hojas de haba de soja.
Las siete secuencias no codificantes de SCSV se
clonaron en el vector pHW9 de GUS sin promotor. Los vectores
binarios que contienen cada uno uno de los siete constructos de
fusión del promotor de SCSV:GUS se transformaron en tejidos
de tabaco mediante transferencia de genes mediada por
Agrobacterium. A las 2-3 semanas después de
la transformación, los callos que contienen primordios de brotes
transformados se sometieron a tinción histoquímica de GUS. Se
observó la mejor expresión en callos transformados con el segmento 1
seguido de los constructos S4nc:GUS:OCS. Este resultado
sugiere que el promotor de segmento 1 es el más adecuado para la
expresión del gen marcador seleccionable, y que el promotor de
segmento 4 es el mejor para la expresión génica.
En Flaveria bidentis (Chitty et
al., 1994), el gen MeA es el gen que codifica la enzima
NADP-málica adaptada para la fotosíntesis de C4. La
estructura y las secuencias putativas del promotor y de señal de
terminación/poliadenilación de la transcripción de este gen se ha
aislado, y se ha determinado la secuencia terminadora (Fig. 15). Las
actividades potenciales del elemento promotor putativo (secuencias
MeA 5' [Mea 5'] y las secuencias terminadoras MeA 3' [MeA 3']) del
gen MeA F. bidentis se estudiaron en plantas transgénicas de
F. bidentis usando vectores de expresión de GUS (Fig. 16). En
estos experimentos se usó una región larga de la secuencia
terminadora de MeA 3' (MeA 3'L = 5,5 kb a partir de codón stop). En
la Fig 16, el cassette de expresión de GUS ME 20 se ligó al vector
binario pGA470 (An et al., 1985), mientras que el ME29 se
clona en pGA482 (An, 1986). Las plantas se transformaron con estos
vectores como se describe por Chitty et al. (1994).
El estudio de la actividad de GUS de las plantas
transformadas mediante tinción histoquímica y ensayos fluorométricos
mostró que la secuencia MeA 3' del gen es necesaria para un nivel
elevado de expresión de GUS en hojas de plantas de F.
bidentis transgénicas (Tabla 16). Las secuencias 5' del gen no
parece que contribuyan a la expresión génica en las hojas, pero
parece que dirigen la expresión en meristemos y tallos en presencia
de una secuencia adecuada de señal de terminación/poliadenilación de
la transcripción, tal como la OCS 3' (Tabla 16).
Debido a que la mayoría de los elementos de
control génico están localizados en el extremo 5', la actividad de
la secuencia de MeA 3' se ensayó en combinación con el promotor de
SCSV S4nc con vista a aumentar la expresión génica dirigida por los
promotores de SCSV. Para estos experimentos, se usó una región corta
de la secuencia terminadora de MeA 3' (MeA 3'S; 900 bases a partir
del codón stop), para preparar vectores de expresión de GUS que
contienen el promotor de S4nc con la secuencia de señal de
terminación/poliadenilación de la transcripción de OCS 3', del
segmento 5' de SCSV 3' (SC5Tr) o de MeA 3'. Estos constructos
derivaron del plásmido pKGO de GUS sin promotor descrito
anteriormente, y el plásmido recombinante pBS237, que contiene el
constructo S4nc:GUS:MeA3', se presenta en la Fig. 17. La
actividad de GUS conferida por estos constructos se ensayó en callos
de arroz japonés variedad Taipei 309. Los constructos se
introdujeron en los callos de arroz mediante bombardeo de
partículas, usando el sistema de suministro de partículas
Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He
(Bio-Rad Laboratories), y se comparó con los
resultados obtenidos en tejidos de dicotiledóneas tales como hojas
de haba de soja y protoplastos de tabaco (Tabla 17). Para los
experimentos de bombardeo con partículas del arroz, se dispararon 4
mg de una relación 1:1 de partículas de oro de 1 y 5 micrómetros más
5 \mug de ADN en un total de 50 \mul sobre seis placas de callo.
El ADN estaba formado con una relación molar 4:1 de cada uno de los
vectores que contiene el gen GUS al vector que contiene el gen
marcador seleccionable. El vector que contiene el marcador
seleccionable fue pTRA151 (Zheng et al., 1991). Cada placa
contenía 50-100 callos secundarios recientes
derivados de embriones maduros. cuarenta horas después del bombardeo
de ADN, se detectó la actividad de GUS colocando los callos en una
disolución de X-Gluc al 0,3% p/v en 100 mM de tampón
de fosfato. Se contaron las manchas azules después de la incubación
toda la noche.
Para la expresión transitoria de GUS en tabaco y
haba de soja, sólo se introdujeron los constructos de GUS en
protoplastos y tejidos de hojas, respectivamente. Después de la
electroporación, los protoplastos de tabaco se analizaron para
determinar la actividad de GUS como se describió previamente. Los
constructos se introdujeron en tejidos de haba de soja mediante
bombardeo de partículas como se describe anteriormente.
Los resultados mostraron que en los tejidos de
arroz monocotiledóneas, se obtenía una actividad 16 veces mayor que
el constructo de MeA 3' comparada con el terminador de SCSV (Tabla
17). En experimentos similares, un constructo de GUS altamente
expresado, que contiene el cassette promotor:GUS:NOS de
ubiquitina (Christensen et al., 1992), tiene una actividad
alrededor de 4 veces mayor que la del constructo
SC4:GUS:MeA3'.
En los tejidos dicotiledóneos, se obtuvieron
actividades similares con ambos de estos constructos en protoplastos
de tabaco y en hojas de haba de soja. Sin embargo, ambos tenían una
actividad 2 veces mayor que la obtenida con el terminador de OCS en
protoplastos de tabaco (Tabla 17).
Estos resultados sugieren que la secuencia de
MeA3' se puede usar para permitir la expresión génica dirigida por
promotores de SCSV en monocotiledóneas.
Se analizó en plantas de tabaco la idoneidad del
uso de los promotores de SCSV para accionar un gen marcador
seleccionable como base para seleccionar plantas transgénicas
después de la transformación y regeneración. El marcador
seleccionable usado es el gen de resistencia a canamicina,
nptII. Se construyeron vectores binarios, que contienen un
segmento 1 de SCSV (pBS246) (Fig. 18) o un promotor de segmento 7 de
SCSV (pKHAN4) (Fig. 19) fusionado al gen de nptII, a partir
del pART27 (Gleave, 1992) y pKSB.bar1 (Figura 19), respectivamente.
Estos se transformaron separadamente en plantas de tabaco (Ellis
et al., 1987), y las plantas transgénicas putativas se
seleccionaron en selección de canamicina usando 100 \mug/ml de
canamicina (Fig. 20). La resistencia a canamicina se confirmó en
plantas transgénicas mediante ensayo de transferencia de mancha para
la actividad del gen nptII (McDonnell et al., 1987) y la
supervivencia de las plantas transgénicas en 100 \mug/ml de
canamicina en un medio formador de raíces. Los resultados mostraron
que el constructo del promotor de segmento de SCSV produjo al menos
tantas plantas resistentes a canamicina como el constructo del
promotor 35S usado en el mismo experimento, y por lo tanto es tan
eficaz como el promotor 35S para selecciona plantas de tabaco
transgénicas basadas en la resistencia a canamicina (Tabla 18). El
tabaco transformado con pKHAN4 es resistente a 100 \mug/ml de
canamicina en el medio de regeneración, y 50 \mug/ml de canamicina
en el medio formador de raíces. En la Figura 19 se muestran los
mapas de restricción de pKSB.barl y pKHAN2 usados para producir
pKHAN4.
Se ha construido un nuevo vector de expresión,
que comprende un promotor de segmento 4 de SCSV y un terminador de
segmento 5 de SCSV que accionan cualquier gen útil de interés (pICAN
1) (Fig. 21), a partir del derivado de pGEM, y el cassette de
expresión resultante se puede insertar en los vectores binarios
pBS246 y pKHAN4. Los vectores binarios resultantes se pueden usar
entonces para transformar plantas de importancia económica,
especialmente algodón, trébol subterráneo, patata y trébol blanco,
bajo selección de canamicina. Se pueden construir otros vectores
binarios a partir de diferentes combinaciones de promotores y
terminadores de SCSV para producir un intervalo completo de sistemas
de vectores binarios para la expresión génica de plantas.
Las plantas se analizaron dos meses después de
transferir a las plantas al invernadero desde el cultivo de tejidos.
Se determinó la resistencia a basta (fosfinotricina - [PPT])
pintando basta a 1 gm de PPT/litro sobre hojas jóvenes totalmente
sin doblar, y la reacción se analizó después de una semana.
| R | sin daño; |
| MR | daño moderado a la hoja; |
| S | muerte de la hoja; |
| N.d. | no determinada |
- Las plantas tenían 2-3 meses cuando se ensayaron.
- Los resultados muestran la expresión diferencial en diferentes tejidos.
- Las plantas tenían 2-3 meses cuando se ensayaron.
- Los resultados muestran la expresión diferencial en diferentes tejidos.
An, G. (1986). Development of plant
promoter expression vectors and their use for analysis of
differential activity of nopaline synthase promoter in transformed
cells. Plant Physiol. 81, 86-91.
An, G., Watson, B.D.,
Stachel, S., Gordon, M.P. and Nester, E.W.
(1985). New cloning vehicles for transformation of higher
plants. EMBO J. 4, 277-284.
Benfey, P.N. and Chua, N.-H.
(1990). The cauliflower mosaic virus 35S promoter:
combinatorial regulation of transcription in plants. Science
250, 959-966.
Burns, T.M., Harding, R.M.,
Hafner, G., Beetham, P. and Dale, J.L.
(1993). Single-stranded DNA genome
organisation of banana bunchy top virus. IXth International Congress
of Virology, Glasgow, Abstract W62-8.
Chitty, J.A., Burbank, R.T.,
Marchall, J.S., Chen, Z. and Taylor, W.C.,
Genetic Transformation of the C^{4} Plant, Flaveria
bidentis, The Plant Journal 6: 949-956,
1994.
Chu, P., Boevink, P., Surin,
B., Larkin, P., Keese, P and Waterhouse, P.
(1994). Non-germinated single stranded DNA
plant viruses. In "Pathogenesis and host-parasite
specificity in plant diseases: Vol III. Viruses and Viroids".
Pergamon Press.
Chu, P.W.G. and Helms, K.
(1988). Novel virus-like particles containing
circular single-stranded DNA associated with
subterranean clover stunt disease. Virology 167,
38-49.
Chu, P.W.G., Keese, P., Qiu,
B.S., Waterhouse, P.M. and Gerlach, W.L.
(1993a). Putative full-length clones of the
genomic DNA segments of subterranean clover stunt virus and
identification of the segment coding for the viral coat protein.
Virus Research 27, 161-171.
Chu, P.W.G., Qiu, B.S., Li.,
Z-y and Larkin, P. (1993b).
Replication of subterranean clover stunt virus in pea and
subterranean clover protoplasts. Virus Research 27,
173-183.
Christensen, A.H., Sharrock, R.A.
and Quail, P.H. (1992). Maize polyubiquitin genes:
structure, thermal perturbation of expression and transcript
splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by
electroporation. Plant Mol. Biol. 18,
675-689.
Cousin, Y,L., Lyons, B.R. and
Llewellyn, D.J. (1991). Transformation of an
Australian cotton cultivar: prospects for cotton improvement through
genetic engineering. Aus. J. PI. Physiol. 18,
481-494.
Craig, S., (1992) The GUS Reporter
Gene - Application to light and transmission electron microscopy. In
GUS protocols: using the GUS gene as a reporter of gene expression.
S.R. Gallagher, Ed. Academic Press, Inc., Page 115.
Das, A. (1993). Control of
transcription termination by RNA-binding proteins.
Ann. Rev. Biochem. 62, 893-930.
de Carvalho, F., Gheysen, G.,
Kushnir, S., Van Montagu, M., Inze, D. and
Castresana, C. (1992). Suppression of
\beta-1,3-glucanase transgene
expression in homozygous plants. The EMBO J. 11,
2595-2602.
Depicker, A., Satchel, S.,
Dhaese, P., Zambryski, P. and Goodman, H.
(1982). Nopaline synthase:transcript mapping and DNA
sequence. J.Mol. Appl. Genet. 1, 561-575.
Del Sal, G., Manfioletti, G. and
Schnider, C. (1989). The CTAB-DNA
precipitation method: a common mini-scale
preparation of template DNA from pagemids, phages or plasmids
suitable for sequencing. Biotechniques 7,
514-518.
Devereaux, J., Haeberli, P. and
Smithies, O. (1984). A comprehensive set of sequence
analysis programs for the VAX. Nucleic acids Res. 12,
387-395.
Ditta, G., Stanfield, S.,
Corbin, D. and Helsinki, D.R. (1980). Broad
host range DNA cloning system for gram-negative
bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347-7351.
Dolferus, R., Jacobs, M.,
Peacock, J.W., and Dennis, L.S. (1994).
Differential interactions of promoter elements in stress responses
of the Arabidopsis Adh Gene. Plant Physiol. 105,
1075-1087.
Ellis, J.G., Llewellyn, D.J.,
Dennis, E.S. and Peacock, W.J. (1987). Maize
Adh-1 promoter sequences control anaerobic
regulation: addition of upstream promoter elements from constitutive
genes is necessary for expression in tobacco. EMBO J. 6,
11-16.
Gil, A. and Proudfoot, N.J.
(1984). Nature 312, 473-474.
Gil, A. and Proudfoot, N.J.
(1984). A sequence downstream of AAUAAA is required for
rabbit \beta-globin mRNA 3'-end
formation.
Gleave, A. P. (1992). A versatile
binary vector system with a T-DNA organisational
structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the
plant genome. Plant Molecular Biology 20,
1203-1207.
Harding, R.M., Burns, T.M. and
Dale, J.L. (1991). Virus-like
particles associated with banana bunchy top disease contain small
single-stranded DNA. J. Gen. Virol. 72,
225-230.
Harding, R.M., Burn, T.M.,
Hafner, G., Dietzgen, R.G. and Dale, J.L.
(1993). Nucleotide sequence of one component of the banana
bunchy top virus genome contains a putative replicase gene. J.
Gen. Virology 74, 323-328.
Hatch, M.D. (1987) C4
photosynthesis: A unique blend of modified biochemistry, anatomy and
ultrastructure. Biochim. Biophys. Acta
895:81-106.
Higgins, T.J.V. and Spencer, D.
(1991). The expression of a chimeric cauliflower mosaic virus
(CaMV) 35S-pea vicilin gene in tobacco. Plant
Sci. 74, 89-98.
Hoekema, A., Hirsch, P.R.,
Hooykaas, P.J.J. and Schilperoott, R.A. (1983).
A binary plant vector strategy based on separation of vir- and
T-region of the Agrobacterium tumefaciens
Ti-plasmid. Nature 303,
179-180.
Isogai, M., Sano, Y. and
Kojima, M. (1992). Identification of the unique DNA
species in the milk vetch dwarf virus-infected
leaves. Ann. Phytopath. Soc. Japan 58,
631-632, Abstract.
Jacobsen-Lyon, K.
Jesen, E.O., Jorgensen, J-E.,
Marcker, K.A., Peacock, W.J. and Dennis, E.S.
(1995). Symbiotic and nonsymbiotic hemoglobin genes of
Casurina glauca. Plant Cell 7, 213-223.
Janssen, B.J. and Gardner, R.C.
(1989). Localised transient expression of GUS i leaf discs
following co-cultivation with Agrobacterium.
Plant Mol. Biol. 14, 61-72.
Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and
Bevan, M.W. (1987). GUS fusions:
b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene
fusion marker in higher plants. EMBO J. 6,
3901-3907.
Joshi, C.P. (1987). Putative
polyadenylation signals in nuclear genes of higher plants: a
compilation and analysis. Nucleic Acids Research. 15,
9627-9640.
Katul, L., Vetten, H.J.,
Maiss, E., Makkouk, K.M. Lesemann, D.-E. and
Casper, R. (1993). Characterisation and serology of
virus-like particles associated with faba bean
necrotic yellows. Ann. Appl. Biol. 123,
629-647.
Khan, M.R.I., Tabe, L.M.,
Heath, L.C., Spencer, D. and Higgins, T.J.V.
(1994). Agrobacterium-mediated transformation
of subterranean clover (Trifolium subterraneum L.). Plant
Physiol 105, 81-88.
Kirschman, J.A. and Cramer, J.H.
(1988). Two new tools:multi-purpose cloning
vectors carry kanamycin or spectinomycin/streptomycin resistance
markers. Gene 58, 163-165.
Last, D.I., Brettell, R.I.S.,
Chaudhury, A.M., Chamberlain, D.A., Larkin,
P.J., Marsh, E.L., Peacock, J.W. and Dennis,
E.S. (1991). pEmu: an improved promoter for gene expression
in cereal cells. Theor Appl Genet 81,
581-588.
Lazo, G.R., Stein, P.A. and
Ludwig, R.A. (1991). A DNA
transformation-competent Arabidopsis genomic library
in Agrobacterium. Biotechnol. 9, 963-967.
Linn, F., Heidmann, I.,
Saedler, H. and Meyer, P. (1990). Epigenetic
changes in the expression of the maize Z1 gene in Petunia
hybrida: Role of numbers of integrated gene copies and state of
methylation. Mol. Gen. Genet. 222,
329-336.
McDonnell, R.E., Clark, R.D.,
Smith, W.A. and Hinchee, M.A. (1987). A
simplified method for the detection of neomycin phosphotransferase
II activity in transformed plant tissues. Plant Mol. Biol.
Rep. 5, 380-386.
Matzke, M.A. and Matzke, A.J.M.
(1991). Differential inactivation and methylation of a
transgene in plants by two suppressor loci containing homologous
sequences. Plant Mol. Biol. 16, 821-830.
Messing, J., Geraghty, D.,
Heidecker, G., Hu, N-T., Kridl,
J. and Rubenstein, I. (1983). Plant gene structure.
In: "Genetic engineering of plants. An agricultural
perspective."Kosuge, T., Meredith, C.P. and
Hollaender, A. (eds). Plenum Press, New York. pp
211-277.
Nagel, R., Elliot, A.,
Masel, A., Birch., R.G. and Manners, J.M.
(1990). Electroporation of binary Ti plasmid vector into
Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. FEMS
Microbiology Letters 67, 325-328.
Odell, J.T., Nagy, F. and
Chua, N.-H. (1985). Identification of DNA sequences
required for activity of cauliflower mosaic virus 35S promoter.
Nature 313, 810.
Pietrzak, M., Shillito, R.D.,
Hohn, T. and Potrykus, I. (1986). Expression in
plants of two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast
transformation with a new plant expression vector. Nucleic Acids
Res. 14, 5857-5868.
Richardson, J. P. (1993).
Transcription termination. Critical Review in Biochem. and Mol.
Biol. 28, 1-30.
Rhode, W., Randles, J.W.,
Langridge, P. and Hanold, D. (1990). Nucleotide
sequence of a circular single-stranded DNA
associated with coconut foliar decay virus. Virology 176,
648-651.
Rothnie, H.M., Reid, J. and
Hohn, T. (1994). The contribution of AAUAAA and the
upstream element UUUGUA to the efficiency of mRNA
3'-end formation in plants. EMBO J. 13,
2200-2210.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and
Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York.
Sanger, F., Nicklen, S. and
Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with
chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74, 5463-5467.
Sano, Y., Isogai, M., Satoh,
S. and Kojima. M. (1993). Small
virus-like particles containing
single-stranded DNAs associated with milk vetch
dwarf disease in Japan. 6th Int. Cong. of Plant Path.,
Montreal, Canada, July 28 - August 6, 1993. Abs. 17.1.27.
Scheid, O.M., Paszkowski, J. and
Potrykus, I. (1991). Reversible inactivation of a
transgene in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 228,
104-112.
Schmulling, T., Schell, J. and
Spena, A. (1989). Promoters of the rolA, B, and C
genes of Agrobacterium rhizogenes are differentially regulated in
plants. Plant Cell 1, 665-670.
Sugaya, S., Hayakawa, K.,
Handa, T. and Uchimiya, H. (1989).
Cell-specific expression of the rolC gene of the
TL-DNA of Ri plasmid in transgenic tobacco plants.
Plant Cell Physiol. 30, 649-653.
Taylor, B.H. and Larkin, P.J.
(1988). Analysis of electroporation efficiency in plant
protoplants. Aust. J. Biotech.1,52-57.
Thomas, J.E. and Dietzgen, R.G.
(1991). Purification, characterization and serological
detection of virus-like particles associated with
banana bunchy top disease in Australia. J. Gen. Virol. 72,
217-224.
Wenzler, H., Mignery, G.,
May, G. and Park, W. (1989). A rapid and
efficient transformation method for the production of large numbers
of transgenic potato plants. Plant Science 63,
79-85.
Zheng, Z., Hayashimoto, A.,
Li, Z. and Murai, N. (1991). Hygromycin
resistance gene cassette for vector construction and selection of
transformed rice protoplasts. Plant Physiol. 97,
832-835.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS PROMOTORES DE PLANTAS Y SUS USOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 1 LITTLE COLLINS STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MELBOURNE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: VICTORIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: AUSTRALIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 3000
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: DISQUETE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: AU PROVISIONAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 07 DE NOVIEMBRE DE 1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PM7770/94
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 DE AGOSTO DE 1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: HUGHES DR, E. JOHN L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: EJH/EK
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN TELEFÓNICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: +61 3 9254 2777
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: +61 3 9254 2770
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1001 BASES PARES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1022 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 991 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1002 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 998 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1017 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 988 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (25)
1. Un constructo genético que comprende un
promotor circovírico a partir de un circovirus que comprende un
genoma de ADN en múltiples componentes, siendo dicho promotor
operable en una célula vegetal, y un gen heterólogo enlazado
operablemente a dicho promotor.
2. Un constructo genético según la reivindicación
1, en el que dicho gen heterólogo se inserta en un sitio de
endonucleasa de restricción en dirección de dicho promotor.
3. Un contracto genético según la reivindicación
1 o reivindicación 2, en el que el genoma del circovirus comprende
más de dos componentes o segmentos de ADN.
4. Un constructo genético según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que el circovirus se selecciona
del grupo que consta de virus la atrofia del trébol subterráneo
(SCSV), virus del copo racimoso del banano (BBTV), virus de enanismo
de arveja lechosa (MDV) y virus del amarilleamiento necrótico del
haba (FBNYV).
5. Un constructo genético según la reivindicación
4, en el que el circovirus es el virus de atrofia del trébol
subterráneo (SCSV).
6. Un constructo genético según la reivindicación
5, en el que el promotor se selecciona de uno de los segmentos 1 a 7
de SCSV (SEQ ID N^{os}: 1 a 7), o es capaz de hibridarse a estos
en condiciones de baja restricción.
7. Un constructo genético según la reivindicación
6, en el que el promotor se selecciona de uno de los segmentos 1,
3-5 y 7 de SCSV (SEQ ID N^{os}. 1,
3-5 y 7), o es capaz de hibridarse a ellos en
condiciones de baja restricción.
8. Un constructo genético según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además una secuencia de
terminación y/o de poliadenilación, estando dicha secuencia
operablemente enlazada a dicho gen heterólogo.
9. Un constructo genético según la reivindicación
8, en el que la secuencia de terminación y/o de poliadenilación es
de origen SCSV.
10. Un constructo genético según la
reivindicación 8 ó 9, en el que la secuencia de terminación y/o de
poliadenilación se selecciona de uno de los segmentos 1 a 7 de SCSV
(SEQ ID N^{os}: 1 a 7), o es capaz de hibridarse a los mismos en
condiciones de baja restricción.
11. Un constructo genético según la
reivindicación 8, en el que la secuencia de terminación y/o de
poliadenilación procede del gen MeA de Flaveria bidentis.
12. Un constructo genético según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el constructo comprende
dos genes heterólogos enlazados operablemente al mismo o a
diferentes promotores circovíricos.
13. Un constructo genético según una cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el constructo comprende
dos genes heterógolos, cada uno de los cuales está enlazado
operablemente al mismo o a diferentes promotores circovíricos, y una
secuencia de terminación y/o de poliadenilación, que puede ser la
misma o diferente, enlazada operablemente a uno o ambos genes
heterólogos.
14. Un constructo genético según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el gen heterólogo, o cada
uno de ellos, se selecciona de:
- a)
- un gen de resistencia frente a virus, bacterias, hongos, nemátodos y otros patógenos de las plantas;
- b)
- un gen de resistencia a virus de las plantas, que incluye un gen sintético procedente del virus del mosaico de la alfalfa, del virus de la atrofia del trébol subterráneo, del virus del moteado del trébol subterráneo, del virus de la hoja roja del trébol subterráneo, del virus de enrollamiento de la hoja de la patata, del virus del bronceado del tomate, del virus del mosaico amarillo del haba, del virus del mosaico blanco del trébol, virus de las venas amarillas del trébol, de los virus x, y, s, m y a de la patata, del virus del mosaico del pepino, del virus de la atrofia desigual del arroz y del virus del enanismo amarillo de la cebada;
- c)
- un gen para mejorar el valor nutritivo de las plantas;
- d)
- un gen de resistencia al hinchamiento;
- e)
- un gen de tipo anticuerpo;
- f)
- un gen proteínico que inactiva la tionina y ribosoma de cereales;
- g)
- un gen de resistencia a insectos;
- h)
- un gen marcador seleccionable;
- i)
- un gen informador;
- j)
- un gen que codifica una proteína reguladora que modula la expresión de un gen en las células vegetales.
15. Un constructo genético según la
reivindicación 14, en el que:
- (i)
- el gen para mejorar el valor nutricional de las plantas es el gen SF8 de girasol con alto contenido en azufre;
- (ii)
- el gen de resistencia a insectos es el gen de la toxina BT o el gen inhibidor de proteinasa procedente de Nicotiana alata;
- (iii)
- el gen marcador seleccionable es el gen que confiere resistencia a canamicina, fosfinotricina, espectinomicina e higromicina;
- (iv)
- el gen informador es el gen GUS, CAT y el gen de pigmentos.
16. Un constructo genético que comprende dos o
más genes heterógolos enlazados operablemente al mismo o a
diferentes promotores circovíricos operables en una célula vegetal,
en el que cada promotor circovírico procede de un circovirus que
comprende un genoma de ADN de múltiples componentes y es operable en
una célula vegetal.
17. Un constructo genético según la
reivindicación 16, en el que promotor se define además en una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.
18. Un constructo genético según la
reivindicación 16 ó 17, que comprende además una secuencia de
terminación y/o de poliadenilación enlazada operablemente a uno o
más de dichos genes heterólogos.
19. Un constructo genético según la
reivindicación 18, en el que la secuencia de terminación y/o de
poliadenilación es como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11.
20. Un constructo genético según la
reivindicación 18 ó 19, en el que las secuencias de terminación y/o
de poliadenilación son las mismas para cada gen.
21. Un constructo genético según la
reivindicación 18 ó 19, en el que las secuencias de terminación y/o
de poliadenilación son diferentes para cada gen.
22. Un constructo genético según una cualquiera
de las reivindicaciones 16 a 21, en el que los genes heterólogos se
seleccionan del grupo que consta de:
- a)
- un gen de resistencia frente a virus, bacterias, hongos, nemátodos y otros patógenos de las plantas;
- b)
- un gen de resistencia a virus de las plantas, que incluye un gen sintético procedente del virus del mosaico de la alfalfa, del virus de la atrofia del trébol subterráneo, del virus del moteado del trébol subterráneo, del virus de la hoja roja del trébol subterráneo, del virus de enrollamiento de la hoja de la patata, del virus del bronceado del tomate, del virus del mosaico amarillo del haba, del virus del mosaico blanco del trébol, virus de las venas amarillas del trébol, de los virus x, y, s, m y a de la patata, del virus del mosaico del pepino, del virus de la atrofia desigual del arroz y del virus del enanismo amarillo de la cebada;
- c)
- un gen para mejorar el valor nutritivo de las plantas;
- d)
- un gen de resistencia al hinchamiento;
- e)
- un gen de tipo anticuerpo;
- f)
- un gen proteínico que inactiva la tionina y ribosoma de cereales;
- g)
- un gen de resistencia a insectos;
- h)
- un gen marcador seleccionable;
- i)
- un gen informador;
- j)
- un gen que codifica una proteína reguladora que modula la expresión de un gen en las células vegetales.
23. Un constructo genético según la
reivindicación 22, en el que:
- (i)
- el gen para mejorar el valor nutricional de las plantas es el gen SF8 de girasol con alto contenido en azufre;
- (ii)
- el gen de resistencia a insectos es el gen de la toxina BT o el gen inhibidor de proteinasa procedente de Nicotiana alata;
- (iii)
- el gen marcador seleccionable es el gen que confiere resistencia a canamicina, fosfinotricina, espectinomicina e higromicina;
- (iv)
- el gen informador es el gen GUS, CAT y el gen de pigmentos.
24. Un método para expresar un gen foráneo en una
célula vegetal, comprendiendo dicho método introducir en dicha
célula vegetal un constructo genético según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23.
25. Una planta transgénica que comprende el
constructo genético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
23.
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|---|---|---|---|
| AUPM7770A AUPM777094A0 (en) | 1994-08-30 | 1994-08-30 | Novel plant promoters and uses therefor |
| AUPM777094 | 1994-08-30 | ||
| AUPM928194 | 1994-11-07 | ||
| AUPM9281A AUPM928194A0 (en) | 1994-11-07 | 1994-11-07 | Novel plant promoters and uses therefor - II |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US6489462B1 (en) | 1996-08-09 | 2002-12-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Sugarcane bacilliform virus promoter |
| US5994123A (en) * | 1996-08-09 | 1999-11-30 | Regents Of University Of Minnesota | Sugarcane bacilliform virus promoter |
| DE19730502A1 (de) * | 1997-07-16 | 1999-01-21 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung einer Virus-DNA als Promotor |
| ES2624549T3 (es) | 1998-04-08 | 2017-07-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisati | Métodos y medios para obtener fenotipos modificados |
| ES2340807T3 (es) * | 1999-12-13 | 2010-06-09 | Bioniche Life Sciences Inc. | Oligonucleotidos sinteticos utiles terapeuticamente. |
| PT1988099E (pt) | 2001-01-09 | 2013-01-31 | Bayer Cropscience Nv | Proteínas inseticidas de bacillus thuringiensis |
| ATE510015T1 (de) * | 2001-02-08 | 2011-06-15 | Hexima Ltd | Aus pflanzen stammende moleküle und diese codierende genetische sequenzen sowie verwendungen dafür |
| JP4500049B2 (ja) * | 2001-12-04 | 2010-07-14 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | フラビウイルスｎｓ１サブユニットワクチン |
| AU2003209814B2 (en) | 2002-03-14 | 2008-12-04 | Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation | Modified gene-silencing RNA and uses thereof |
| CN101508725B (zh) | 2002-03-22 | 2013-08-07 | 拜尔作物科学公司 | 新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质 |
| US7786349B2 (en) | 2003-04-09 | 2010-08-31 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for increasing the tolerance of plants to stress conditions |
| EP2333080B1 (en) | 2003-06-23 | 2014-07-23 | Bayer CropScience NV | Methods and means for delaying seed shattering in plants |
| US8049069B2 (en) | 2004-03-31 | 2011-11-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Genes involved in plant fibre development |
| ES2338443T3 (es) | 2004-09-24 | 2010-05-07 | Bayer Bioscience N.V. | Plantas resistentes al estres. |
| EP1904521B1 (en) | 2005-07-08 | 2013-08-21 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico Instituto | Novel bacterial proteins with pesticidal activity |
| CA2646476A1 (en) | 2006-03-21 | 2007-09-27 | Bayer Bioscience N.V. | Stress resistant plants |
| PL1999141T3 (pl) * | 2006-03-21 | 2011-10-31 | Bayer Cropscience Nv | Nowe geny kodujące białka owadobójcze |
| US8237017B2 (en) | 2006-05-12 | 2012-08-07 | Bayer Cropscience Nv | Stress-related microRNA molecules and uses thereof |
| MX2009010755A (es) * | 2007-04-05 | 2009-10-29 | Bayer Bioscience Nv | Plantas de algodon con tolerancia a insectos y metodos para identificarlas. |
| US9994621B2 (en) | 2007-06-01 | 2018-06-12 | Bayer Cropscience N.V. | Genes encoding insecticidal proteins |
| WO2009021288A1 (en) | 2007-08-14 | 2009-02-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved gene silencing methods |
| BRPI1010843A2 (pt) | 2009-06-08 | 2015-09-08 | Nunhems Bv | plantas tolerantes à seca |
| JP5925677B2 (ja) | 2009-06-15 | 2016-06-01 | アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー | キシロシルトランスフェラーゼ活性の欠損したベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物 |
| CA2766975A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for obtaining plants with enhanced glyphosate tolerance |
| EP2491119B1 (en) | 2009-10-20 | 2016-06-08 | Bayer CropScience NV | Methods and means to alter lipid biosynthesis by targeting multiple enzymes to suborganelle domains |
| MX344585B (es) | 2010-05-28 | 2016-12-20 | Nunhems Bv | Platas con un tamaño de fruto incrementado. |
| AU2011264075B2 (en) | 2010-06-09 | 2015-01-29 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| EP2580336B1 (en) | 2010-06-09 | 2017-05-10 | Bayer CropScience NV | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| EP2590996B1 (en) | 2010-07-08 | 2016-05-25 | Bayer CropScience NV | Glucosinolate transporter protein and uses thereof |
| BR112013030724B1 (pt) | 2011-05-31 | 2020-10-27 | Keygene N.V | gene quimérico, vetor, célula hospedeira, uso de uma molécula de ácido nucleico e método para produzir uma planta transgênica possuindo resistência almentada à praga de inseto |
| US9181532B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-10 | Icon Genetics Gmbh | Production of galactosylated N-glycans in plants |
| BR112014003919A2 (pt) | 2011-08-22 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Ag | métodos e meios para modificar um genoma de planta |
| WO2013050155A1 (en) | 2011-10-04 | 2013-04-11 | Icon Genetics Gmbh | Nicotiana benthamiana plants deficient in fucosyltransferase activity |
| US20150059018A1 (en) | 2011-10-19 | 2015-02-26 | Keygene N.V. | Methods and compositions for producing drimenol |
| WO2013095125A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-27 | Keygene N.V. | Method for producing a plant having enhanced disease resistance to nematodes |
| US9968041B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-05-15 | Bayer Cropscience Nv | Soybean ROD1 gene sequences and uses thereof |
| AU2013285456B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-08-02 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica ROD1 gene sequences and uses thereof |
| AU2013285460A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Nv | Brassica plants with modified seed oil composition |
| BR112015017830A2 (pt) | 2013-01-29 | 2017-11-21 | Bayer Cropscience Lp | processos e meios para aumentar a tolerância ao estresse e a biomassa em plantas |
| WO2014142647A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Wageningen Universiteit | Fungals strains with improved citric acid and itaconic acid production |
| CA2913068C (en) | 2013-05-23 | 2023-01-10 | Nomad Bioscience Gmbh | Process of providing plants with abiotic stress resistance |
| WO2014198885A1 (en) | 2013-06-14 | 2014-12-18 | Bayer Cropscience Nv | Plant fibers with improved dyeing properties |
| WO2015000914A1 (en) | 2013-07-01 | 2015-01-08 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means for modulating flowering time in monocot plants |
| AU2013399918A1 (en) | 2013-09-04 | 2016-03-03 | Bayer Cropscience Nv | Plants with increased growth over expressing a mitochondrial glycine decarboxylase complex subunit |
| EP3049517B1 (en) | 2013-09-24 | 2018-04-11 | Bayer CropScience NV | Hetero-transglycosylase and uses thereof |
| FR3017771B1 (fr) | 2014-02-24 | 2023-03-17 | Centre Nat Rech Scient | Plantes a rendement accru et methode d'obtention de telles plantes |
| CN106133140A (zh) | 2014-03-21 | 2016-11-16 | 拜尔作物科学公司 | 具有增加的葡糖胺含量的棉纤维 |
| EP3172327B1 (en) | 2014-07-22 | 2019-11-27 | NMC Inc. | Improved carbon fixation systems in plants and algae |
| WO2016050512A1 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants |
| EP3332010A1 (en) | 2015-08-07 | 2018-06-13 | Bayer CropScience NV | Root-preferential and stress inducible promoter and uses thereof |
| JP6978152B2 (ja) | 2015-09-04 | 2021-12-08 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 複相胞子生殖遺伝子 |
| EP3178313A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-14 | Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie | Gene and protein for the synthesis of oxidized zingiberene derivatives |
| CA3004624A1 (en) | 2015-12-15 | 2017-06-22 | Steven Engelen | Brassicaceae plants resistant to plasmodiophora brassicae (clubroot) |
| US20190082628A1 (en) | 2016-03-16 | 2019-03-21 | Basf Se | Plants comprising wheat g-type cytoplasmic male sterility restorer genes, molecular markers and uses thereof |
| WO2017158126A1 (en) | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Bayer Cropscience Nv | Plants comprising wheat g-type cytoplasmic male sterility restorer genes, molecular markers and uses thereof |
| US11666012B2 (en) | 2016-03-16 | 2023-06-06 | Basf Se | Plants comprising wheat G-type cytoplasmic male sterility restorer genes, molecular markers and uses thereof |
| US11021713B2 (en) | 2016-05-25 | 2021-06-01 | Cargill, Incorporated | Engineered nucleases to generate deletion mutants in plants |
| DK3472187T3 (da) | 2016-06-20 | 2022-04-25 | Univ Louisiana State | Grønalgebicarbonat-transporter og anvendelser deraf |
| EA201990286A1 (ru) | 2016-07-18 | 2019-07-31 | Басф Се | Растения, содержащие восстановительные гены от цитоплазматической мужской стерильности g-типа пшеницы, молекулярные маркеры и их применение |
| AU2017300616B2 (en) | 2016-07-18 | 2023-08-24 | Basf Se | Plants comprising wheat G-type cytoplasmic male sterility restorer genes, molecular markers and uses thereof |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| FR3059870A1 (fr) | 2016-12-09 | 2018-06-15 | Etablissements Andre Laboulet | Plantes de lin a haute teneur en omega-3 |
| CN111566121A (zh) | 2018-01-12 | 2020-08-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因 |
| EP3800996A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-04-14 | Basf Se | Plants comprising wheat g-type cytoplasmic male sterility restorer genes and uses thereof |
| WO2019224359A1 (en) | 2018-05-25 | 2019-11-28 | Basf Se | Plants comprising wheat g-type cytoplasmic male sterility restorer genes and uses thereof |
| MX2020012701A (es) | 2018-05-25 | 2021-02-15 | Basf Se | Plantas que comprenden genes restauradores para esterilidad citoplasmica masculina de tipo g en trigo y sus usos. |
| WO2019234231A1 (en) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | Basf Se | Plants comprising wheat g-type cytoplasmic male sterility restorer genes and uses thereof |
| BR112020026543A2 (pt) | 2018-06-27 | 2021-04-06 | Basf Se | Métodos para aumentar a razão de uma proteína, para aumentar a termotolerância, aumentar o rendimento, para produzir uma planta, para aumentar a termoestabilidade e produzir uma variante de proteína, variante de proteína, ácido nucleico, genes recombinantes, vetores, células, alelos nocaute e termoestável, planta, parte de planta ou semente, uso da variante de proteína, método de produção de alimentos e planta de cereal |
| CA3109236A1 (en) | 2018-08-13 | 2020-02-20 | Aarhus Universitet | Genetically altered lysm receptors with altered agonist specificity and affinity |
| AU2019321028A1 (en) | 2018-08-13 | 2021-03-04 | Aarhus Universitet | Genetically altered plants expressing heterologous receptors that recognize lipo-chitooligosaccharides |
| CN113544276A (zh) | 2018-12-06 | 2021-10-22 | 瓦赫宁根大学 | 基因改变植物nin-基因以对细胞分裂素应答的方法 |
| WO2020142598A2 (en) | 2019-01-04 | 2020-07-09 | Cargill, Incorporated | Engineered nucleases to generate mutations in plants |
| CN112639106A (zh) * | 2019-01-10 | 2021-04-09 | 孟山都技术公司 | 植物调控元件和其用途 |
| AU2020244191A1 (en) | 2019-03-21 | 2021-09-30 | University Of Essex Enterprises Limited | Methods of enhancing biomass in a plant through stimulation of RubP regeneration and electron transport |
| WO2020234468A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Nomad Bioscience Gmbh | Rna viral rna molecule for gene editing |
| JP2022533813A (ja) | 2019-05-29 | 2022-07-26 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 単為生殖のための遺伝子 |
| WO2021004838A2 (en) | 2019-07-05 | 2021-01-14 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Rubisco activase with reduced adp inhibition and uses thereof |
| US20220275390A1 (en) | 2019-08-02 | 2022-09-01 | The Trustees Of Princeton University | Rubisco-binding protein motifs and uses thereof |
| GB201911068D0 (en) | 2019-08-02 | 2019-09-18 | Univ Edinburgh | Modified higher plants |
| KR20220063175A (ko) | 2019-08-19 | 2022-05-17 | 오르후스 우니베르시테트 | 미생물총을 인지하고, 구축하기 위한 변형된 엑소폴리사카라이드 수용체들 |
| US20230022576A1 (en) | 2019-11-19 | 2023-01-26 | Protalix Ltd. | Removal of constructs from transformed cells |
| EP4110928A1 (en) | 2020-02-28 | 2023-01-04 | Cambridge Enterprise Limited | Methods, plants and compositions for overcoming nutrient suppression of mycorrhizal symbiosis |
| EP4153731A1 (en) | 2020-05-19 | 2023-03-29 | Aarhus Universitet | Lysm receptor motifs |
| WO2022074646A1 (en) | 2020-10-05 | 2022-04-14 | Protalix Ltd. | Dicer-like knock-out plant cells |
| WO2022101286A1 (en) | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie | Fusion protein for editing endogenous dna of a eukaryotic cell |
| AU2022280048A1 (en) | 2021-05-26 | 2023-12-21 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | C4 plants with increased photosynthetic efficiency |
| CA3225922A1 (en) | 2021-07-23 | 2023-01-26 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Blackleg resistant plants and methods for the identification of blackleg resistant plants |
| WO2023052562A1 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Basf Se | Wheat plants with an increased yield |
| WO2023052561A1 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Basf Se | Plants with improved properties |
| WO2023118541A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for modifying gene expression in cereal plants |
| WO2023201230A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-19 | The Regents Of The University Of California | Methods of screening for plant gain of function mutations and compositions therefor |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4306832C1 (de) * | 1993-03-04 | 1994-02-24 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung einer Virus-DNA als Promotor zur gewebespezifischen Expression von Genen in transgenen Pflanzen |
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| AUPN328595A0 (en) * | 1995-05-31 | 1995-06-22 | Queensland University Of Technology | Intergenic regions of banana bunchy top virus |
-
1995
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