FR3059870A1 - Plantes de lin a haute teneur en omega-3 - Google Patents

Plantes de lin a haute teneur en omega-3 Download PDF

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Veronique Tramcourt
Vivien Sarazin
Xavier Guillot
Patrice Laboulet
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Andre Laboulet Ets
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Andre Laboulet Ets
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/58—Linaceae, e.g. flax

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la teneur en acide gras C18:3, ou acide alpha-linolénique, d'une graine de lin, ainsi que les plantes qui en résultent, et ce via l'augmentation de l'expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au sein de la plante.

Description

® RÉPUBLIQUE FRANÇAISE
INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE © N° de publication :
(à n’utiliser que pour les commandes de reproduction) (© N° d’enregistrement national
059 870
62255
COURBEVOIE © Int Cl8 : A 01 H5/00 (2017.01), A 01 H 1/04, 1/06, A 23 K 10/ 30, A 23 L 33/115
DEMANDE DE BREVET D'INVENTION A1
(22) Date de dépôt : 09.12.16. © Demandeur(s) : ETABLISSEMENTS ANDRE LABOU-
(© Priorité : LET Société par actions simplifiée — FR.
@ Inventeur(s) : TRAMCOURT VERONIQUE, SARA-
ZIN VIVIEN, GUILLOT XAVIER et LABOULET
(43) Date de mise à la disposition du public de la PATRICE.
demande : 15.06.18 Bulletin 18/24.
(© Liste des documents cités dans le rapport de
recherche préliminaire : Se reporter à la fin du
présent fascicule
(© Références à d’autres documents nationaux ® Titulaire(s) : ETABLISSEMENTS ANDRE LABOU-
apparentés : LET Société par actions simplifiée.
©) Demande(s) d’extension : (© Mandataire(s) : REGIMBEAU.
W PLANTES DE LIN A HAUTE TENEUR EN OMEGA-3.
La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la teneur en acide gras C18:3, ou acide alphalinolénique, d'une graine de lin, ainsi que les plantes qui en résultent, et ce via l'augmentation de l'expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au sein de la plante.
FR 3 059 870 - A1
ι
PLANTES DE LIN A HAUTE TENEUR EN OMEGA-3
La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la teneur en acide gras C18:3, ou acide alpha-linolénique, d’une graine de lin, ainsi que les plantes qui en résultent, et ce via l’augmentation de l’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au sein de la plante.
La culture du lin est l’une des plus anciennes cultures utilitaires, les premières traces de son utilisation datant de 8000 av. JC en Turquie. Sa dénomination Linum usitatissimum, traduit du latin « lin le plus utile », fait référence à ses multiples débouchés. Actuellement, le lin est utilisé dans les domaines de l’industrie textile (fibre), alimentaire (graine et huile) et chimique (huile). Les particularités de la graine de lin résident dans sa teneur en huile (de 35 à 45%) et le profil en acides gras de son huile à dominance d’acide alpha-linolénique (C18:3, 48 à 65%). La triple insaturation de cet acide gras confère à l’huile une grande réactivité vis-à-vis de l’oxygène et donc une forte siccativité. Cette aptitude de l’huile à polymériser et à sécher rapidement lorsqu’elle est déposée en couche mince est intéressante pour des applications oléochimiques. Cependant dans le cadre d’une utilisation alimentaire, cette réactivité chimique induit une dégradation organoleptique rapide de l’huile.
Les graines de lin sont utilisées en alimentation humaine et animale, (respectivement 5% et 18% dans l’Union Européenne). Mais dans ces domaines, la France présente un profil différent de ses homologues européens. En effet les récentes évolutions liées aux demandes des éleveurs, des organisations de santé et surtout des consommateurs, ont conduit à un changement drastique de son utilisation. Ainsi, en France 75 à 95% des graines de lin produites et utilisées sur le territoire le sont en alimentation animale. Cette tendance s’explique donc par une demande croissante en aliments riches en Oméga-3 (œufs, viande, lait). A ce niveau, la filière Bleu-Blanc-Cœur s’est donnée pour mission de promouvoir et de contrôler la qualité des produits alimentaires issus des filières (notamment du lin oléagineux) pour assurer aux consommateurs une haute qualité dans le domaine animal, environnemental et de la santé humaine. Pour les Oméga-3 chez le lin, c’est-à-dire l’acide alpha-linolénique (ALA), dans cette filière alimentaire Bleu-BlancCœur, la limite basse acceptée est à 48% de C18:3 dans l’huile du lot récolté. En dessous de cette limite basse le prix de référence subit une décote de 30 euros/tonne. A contrario, à partir d’une teneur en C18:3 de 56%, une prime de 3 euros/tonne est appliquée par rapport au prix de référence. Dès 60% elle est de 15 euros/tonne en plus du prix de référence. Cette prime peut atteindre 30 euros/tonne par rapport au prix de référence pour une teneur supérieure à 62% en C18:3. On comprend aisément l’intérêt de disposer de lin haut producteur de C18:3. En 2013, la France produisait plus de 16 000 tonnes de graines de lin oléagineux sur 8 510 hectares, ce qui ne suffisait qu’à couvrir la moitié de ses besoins.
La production de graines de lin oléagineux est un marché de niche mais qui tend à un fort développement dans les années à venir. Actuellement les contrats entre producteurs, collecteurs et industriels, ont fixé un prix minimal pour l’agriculteur de 350€/t (Oméga-3 < 56%). Le cours du lin oléagineux varie souvent, mais on peut retenir qu’il est actuellement assez élevé (525€/t début février 2015).
L’huile de lin, de par ses propriétés siccatives, est principalement utilisée en oléochimie. Elle entre dans la composition de vernis, de peintures, d’encres et comme agent de revêtement. En France, l’huile de lin fut interdite dans l’alimentation humaine de 1906 à 2008, en raison de sa conservation difficile. Depuis, l’arrêté ministériel du 12/07/2010 paru suite aux avis favorables émis par l’Agence Française de Sécurité Sanitaire - Arrêté du 12 juillet 2010 modifiant l'arrêté du 4 décembre 2008 fixant les conditions d'utilisation de l'huile de lin pour un usage alimentaire dans: JORF n°0166 du 21 juillet 2010, texte n°37, pp. 13441 des Aliments (saisines n°2008-SA-0392 et n°2010-SA-0109) - a autorisé sa consommation en tant qu’huile vierge. Cependant pour être commercialisée, l’huile de lin vierge doit être conditionnée dans des récipients opaques de faible capacité (250mL), et avoir subi un inertage sous azote. L’arrêté précise également que la durée de conservation de l’huile doit être inférieure à trois mois après ouverture. De ce fait, en France la production annuelle en huile de lin reste faible.
Le lin oléagineux voit sa place renforcée dans le cadre des évolutions sociales en cours, en raison de ses atouts agronomiques et environnementaux, auxquels s’ajoute la haute qualité de son huile et de ses fibres. II s’agit d’une culture « verte » que l’on peut introduire en version d’hiver ou de printemps dans une large gamme d’assolements. Le lin pourrait reconquérir une sole de 20 à 30 000 hectares en France avec le développement de la valorisation des graines entières en alimentation animale, fondée sur la mise en avant du respect de l’environnement et de l’équilibre nutritionnel du consommateur. D’autres marchés exigeants en qualité, basés sur l’utilisation directe des produits du lin en alimentation humaine (suite à l’arrêté du 12 juillet 2010) pourraient également participer à un regain de vitalité pour cette filière.
Afin d’améliorer les teneurs en ALA des graines de lin, les sélectionneurs effectuent une sélection généalogique classique prenant pour base le croisement des lignées à plus haute teneur en acide alpha-linolénique. La sélection se fait ensuite au sein de la descendance de ces croisements en prenant en compte des critères multiples tels que la résistance à la verse, le rendement, la teneur en huile, en plus de la teneur en ALA.
II est considéré par l’ensemble de la profession qu’il existe une barrière métabolique naturelle empêchant d’obtenir des teneurs supérieures à 66,7% d’ALA dans les graines de lin oléagineux.
Les inventeurs de la présente invention ont réalisé une surexpression de l’enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans une graine au sein d’une plante de lin, ce qui conduit à une augmentation considérable du contenu en acide gras C18:3 dans la graine.
La surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en
C18:3 dans la graine, dernière enzyme de la voie de biosynthèse de C18:3, a pour résultat d’augmenter les niveaux de cet acide gras produit par la plante.
Une augmentation significative de la quantité de C18:3 dans les graines des plantes de lin est observée chez des plantes surexprimant la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Les graines des plantes surexprimant la A15désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine contiennent plus de C18:3 que celles de plantes ne surexprimant pas cette enzyme.
Dans des conditions environnementales défavorables, les plantes selon l’invention, surexprimant la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, produisent plus de C18:3 que des plantes ne surexprimant pas la Δ15 désaturase dont la quantité de C18:3 dans la graine est beaucoup plus faible.
La surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine chez des plantes selon l’invention permet de s’affranchir de conditions de culture particulières et spécifiquement orientées vers la surproduction d’acide gras par la graine de lin, en particulier d’acide alpha-linolénique C18:3.
La présente invention concerne donc :
Une méthode pour accroître la quantité d’acide alpha-linolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum, ladite méthode comprenant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante.
La méthode selon l’invention est caractérisée en qu’elle comprend une modification du gène de la Δ15 désaturase .
La méthode selon l’invention est aussi caractérisée en ce que la modification du gène de la Δ15 désaturase comprend une modification au niveau de la région promotrice dudit gène.
C’est un objet de l’invention que de fournir une méthode selon l’invention, caractérisée en ce que la modification au niveau de la région promotrice dudit gène est une mutation.
Dans la méthode selon l’invention, la mutation est caractérisée en ce que la mutation est une délétion.
La méthode selon l’invention est aussi caractérisée en ce que le gène comprend la SEQ ID N°1.
La méthode selon l’invention est aussi caractérisée en ce que la délétion vise une séquence comprise entre les positions 10 et 20 de la SEQ ID N°2.
La méthode selon l’invention est aussi caractérisé en ce que la délétion vise une séquence comprise entre les positions 12 et 17 de la SEQ ID N°2. Les nucléotides des positions 12 et 17 sont compris dans la délétion.
La méthode selon l’invention est aussi caractérisée en que la délétion comprend la séquence AAAGGG.
II est ainsi illustrée, sur la séquence de la SEQ ID N°2 correspondant à la plante standard, la partie soulignée et en gras correspondant à la portion de séquence délétée chez la plante VL8.29.3 (ou HT3) dans laquelle la séquence complète correspond à la SEQ ID N°1.
La méthode selon l’invention est aussi caractérisée en ce qu’elle comprend la transformation d'une cellule végétale de Linum usitatissimum avec au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine et est sous le contrôle d’un promoteur assurant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante et la culture de la plante à maturité.
La méthode selon l’invention est aussi caractérisée en ce que le au moins un acide nucléique comprend un acide nucléique selon SEQ ID N°1.
La méthode selon l’invention est aussi caractérisée en ce que la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante est réalisée par introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase.
L’invention vise aussi une méthode dans laquelle l’introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante est obtenue par fusion de protoplastes.
L’invention vise aussi une méthode dans laquelle l’introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante est obtenue par sauvetage d’embryon.
Un autre objet de l’invention concerne une méthode pour accroître la quantité d’acide alpha-linolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum, comprenant la détection de la présence d'un élément génétique, en particulier une séquence d’acide nucléique, lié à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante dans une plante donneuse et le transfert de l’élément génétique, en particulier une séquence d’acide nucléique, lié à la surexpression de la Δ15 désaturase ainsi détectée, depuis la plante donneuse vers une plante receveuse.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’élément génétique, en particulier la séquence d’acide nucléique, lié à la surexpression de la Δ15 désaturase est identique ou complémentaire à la séquence présente dans l’échantillon de Linum usitatissimum VL8.29.3 déposé sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
La méthode selon l’invention est caractérisée en ce que la détection est réalisée à l’aide d’au moins un marqueur moléculaire.
La méthode selon l’invention est caractérisée en ce que le au moins un marqueur moléculaire comprend une mutation au niveau de la région promotrice du gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante.
La méthode selon l’invention est caractérisée en ce que la mutation est une délétion.
La méthode selon l’invention est caractérisée en ce que le marqueur moléculaire comprend la séquence SEQ ID N°1. Une telle séquence peut être trouvée dans l’échantillon de Linum usitatissimum VL8.29.3 déposé sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
L’invention vise encore une méthode pour accroître la quantité d’acide alphalinolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum, comprenant la fourniture d’une population de plantes et la sélection des individus de la population qui présentent une expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine la plus élevée possible.
Dans un mode de réalisation de la méthode selon l’invention, la population de plantes est une population de plantes mutantes.
La méthode selon l’invention est caractérisée en ce que ladite méthode comprend la sélection, au sein d’une population de plantes, d’au moins une plante présentant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en
C18:3 dans la graine par rapport à l’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine des plantes parents.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode selon l’invention est caractérisée en ce que l’introgression comprend :
a) La fourniture d’une plante présentant un niveau d’expression donné de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine,
b) La fourniture d’une plante présentant un niveau d’expression accru de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine par rapport à la plante fournie en a),
c) Le croisement de la plante fournie en a) avec la plante fournie en b),
d) La génération d’une progéniture issue du croisement c),
e) La sélection au sein de la progéniture d’au moins une plante présentant un niveau d’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine supérieur à celui de la plante fournie en b).
Dans un mode particulier, la méthode telle que décrite ci-avant comprenant une étape supplémentaire de croisement de la plante sélectionnée en e) avec la plante fournie en b) suivie d’une étape supplémentaire de sélection au sein de la progéniture obtenue d’au moins une plante présentant un niveau d’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine supérieur à celui de la plante sélectionnée en e).
Dans un mode particulier les plantes a et b) sont des plantes de lin Linum usitatissimum.
Une plante présentant un niveau d’expression accru de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine par rapport à la plante fournie en a), peut être la plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
L’invention vise encore une méthode de sélection de plante de Linum usitatissimum, caractérisée en ce qu'elle comprend la recherche d'un allèle du gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine possédant une mutation résultant en un accroissement de la quantité d’acide alphalinolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum.
L’invention concerne encore une plante susceptible d'être obtenue par une méthode selon l’un des modes de réalisation précédents.
L’invention concerne aussi l’utilisation d'une plante susceptible d'être obtenue par une méthode selon l’un des modes de réalisation précédents ou d’une partie d'une telle plante, pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation humaine ou animale.
L’invention vise enfin aussi une plante de Linum usitatissimum, caractérisée en ce que la teneur, en % en poids, en acide alpha-linolénique (C18:3) de l’huile des graines de la plante est supérieure à 66.7%, particulièrement supérieure à 67%, plus particulièrement supérieure à 67.5%, plus particulièrement encore supérieure à 68%, plus particulièrement encore supérieure à 69%, plus particulièrement encore supérieure à 70%, plus particulièrement encore supérieure à 70.5%, plus particulièrement encore supérieure à 71%, plus particulièrement encore supérieure à 72 %, plus particulièrement encore supérieure à 72,5 % et plus particulièrement encore supérieure à 73 %. La teneur, en % en poids, en acide alpha-linolénique (C18:3) de l’huile des graines de la plante est inférieure à 76%, particulièrement inférieure à 75%, plus particulièrement inférieure à 74%.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce que le taux de germination est supérieur à 90%.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce que le rendement est compris entre 85 et 110% de la valeur moyenne de variétés de référence témoins suite à évaluation dans des conditions similaires en France.
Dans un cas particulier l’invention est caractérisée en ce que le rendement est compris entre 85 et 110%, entre 90 et 110%, entre 95 et 110%, voire entre 100 et 110% de la valeur d’au moins une variété de référence témoin choisie dans le groupe consistant en FESTIVAL, inscription CTPS France 2010, et OMEGALIN, inscription CTPS France 2012 et évaluées en France dans des conditions similaires. De manière particulière, la valeur de référence peut être obtenue en faisant la moyenne du rendement des deux variétés témoins en questions évaluées en France dans des conditions similaires.
Les conditions d’évaluation correspondent aux conditions de culture normalisées de lin en France mises en oeuvre dans le cadre de l’évaluation des variétés de lin selon les critères de VATE nécessaires à l’inscription au catalogue national par exemple par le CTPS/GEVES voire Terres Inovia dans le réseau Comportement.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce qu’elle comprend une modification du gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce que la modification du gène de la Δ15 désaturase comprend une modification au niveau de la région promotrice dudit gène.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce que la modification au niveau de la région promotrice dudit gène est une mutation.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce que la mutation est une délétion.
Une plante selon l’invention est caractérisée en que le gène comprend la SEQ ID
N°1.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce que la délétion vise une séquence comprise entre les positions 10 et 20 de la SEQ ID N°1.
Une plante selon l’invention est caractérisée en ce que la délétion vise une séquence comprise entre les positions 12 et 17 de la SEQ ID N°1.
Une plante selon l’invention est caractérisée en que la délétion comprend la séquence AAAGGG.
Avantageusement, une plante selon l’invention est une progéniture de la plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposé sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
Cette plante contient tous les éléments génotypiques causatifs du phénotype de l’invention nécessaire pour le transfert à toute autre plante de lin dépourvue de ces éléments afin d’assurer la conversion en un plante de lin à hauteur teneur en acide gras C18:3.
ίο
Dans le contexte de la présente invention, l’expression « rendement compris entre 85 et 110% de la valeur de variétés de référence témoins suite à évaluation dans des conditions similaires en France » s’entend comme suit.
Le rendement peut être compris entre 85 et 110%, entre 86 et 110%, entre 87et 5 110%, entre 88 et 110 %, entre 89 et 110%, entre 90 et 110%, entre 91 et 110%,92 et 110%, entre 93 et 110%, entre 95 et 110%, entre 96 et 110%, entre 100 et 110%, en particulier entre 101 et 110 % de la valeur de variétés de référence témoins suite à évaluation dans des conditions similaires en France. La valeur de variétés de référence peut s’entendre comme la valeur moyenne d’une ou de plusieurs variétés témoins suite à évaluation dans des conditions similaires en France.
La plante selon l’invention est cultivée dans les conditions environnementales et agroclimatiques données correspondant aux conditions de cultures normalisées de lin, en France, mises en oeuvre dans le cadre de l’évaluation des variétés de lin selon les critères de VATE nécessaires à l’inscription au catalogue national par exemple par le CTPS/GEVES.
Les conditions de culture peuvent aussi correspondre à celles du réseau officiel « comportement lin graine » de Terres Inovia qui sont assez proches de celles du CTPS/GEVES.
Dans tous les cas le rendement annoncé peut être obtenu, cependant le protocole 20 Terres Inovia donne de meilleurs résultats tant pour les plantes selon l’invention que pour les plantes de référence et ce, compte tenu des traitements accessoires et des supplémentations mis en oeuvre.
II est entendu, quelles que soient les conditions de cultures mise en oeuvre, qu’il s’agit des mêmes pour les plantes selon l’invention et pour les plantes faisant office de variétés témoins qui sont cultivées toutes dans la même zone et dans les mêmes conditions afin de pouvoir comparer leur rendement.
Les essais sont conduits selon les pratiques agricoles classiques dans des conditions environnementales et agroclimatiques données. Les essais sont généralement conduits en 3 à 6 répétitions.
Ces épreuves permettent de décrire la valeur culturale d’une plante dans les principaux contextes environnementaux et agroclimatique rencontrés en France ainsi que la valeur d’usage des produits de récolte issus.
Ces essais permettent d’évaluer le rendement ainsi qu’un certain nombre de caractères, et de fournir des échantillons pour l’appréciation de la valeur technologique. Dans le cadre de la présente invention, la caractéristique servant de référentiel de comparaison est le rendement tel que mesuré selon le protocole indiqué ci-avant (CTPS/GEVES).
Le rendement obtenu est comparé à celui obtenu dans les mêmes conditions avec une ou des variétés de référence témoins du marché avant ou au moment du dépôt de la présente demande. Dans le cas d’utilisation de plus d’une variété de référence, le rendement de comparaison est la moyenne du rendement desdites variétés de référence.
Le rendement s’entend en rendement en graines (en quintaux par hectare) et ce pour une teneur en eau des graines d’environ 6 à 9 % en poids. Ce rendement est ainsi comparé, dans les conditions de culture normalisées énoncées ci-avant, à des variétés témoins telles que FESTIVAL, inscription CTPS France 2010, et OMEGALIN, inscription CTPS France 2012 pour des lins de printemps.
Dans un mode particulier, une méthode selon l’invention est une méthode pour augmenter la quantité d’acide gras C18:3 dans la graine d’une plante de lin, laquelle méthode comprend la transformation d'une cellule végétale avec au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, générant ainsi une plante qui surexprime la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, et la culture de la plante à maturité.
La présente invention concerne ainsi une méthode pour augmenter la quantité d’acide gras C18:3 dans la graine d’une plante de lin ladite méthode comprenant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine qui se traduit par une augmentation des quantités C18:3.
Dans un autre mode de réalisation, la méthode selon la présente invention vise à augmenter la quantité d’acide gras C18:3 dans la graine d’une plante de lin, laquelle méthode comprend la transformation d'une cellule végétale avec au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, générant ainsi une plante qui surexprime la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine , et la culture de la plante à maturité.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique comprend la séquence SEQ ID N°1.
Dans une telle méthode selon la présente invention le au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est sous le contrôle d’un promoteur assurant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Dans un mode de réalisation, le promoteur comprend une mutation.
Dans un mode de réalisation particulier, la mutation comprend une délétion.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique comprend la SEQ ID N°1.
Dans un autre mode préférentiel de réalisation de la présente invention le au moins un acide nucléique comprend un acide nucléique choisi dans le groupe constitué parSEQIDN°1.
Dans un mode de réalisation de la présent invention, la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine d’une plante de lin est réalisée par introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du
C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante de lin.
Les plantes selon l’invention présentent ainsi une augmentation des quantités d’acide gras alpha-linolénique C18:3.
C’est aussi un objet de la présente invention que de fournir une méthode dans laquelle l’introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la
Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de la plante de lin est obtenue par fusion de protoplastes.
C’est aussi un objet de la présente invention que de fournir une méthode dans laquelle l’introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de la plante de lin est obtenue par sauvetage d’embryon.
L’élément génétique correspond à une séquence nucléotidique correspondant à celle présente dans la plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
La présente invention concerne aussi une méthode pour la production de plante présentant une quantité d’acide gras C18:3 dans la graine d’une plante de lin accrue, méthode comprenant la détection de la présence d'un élément génétique, en particulier une séquence d’acide nucléique, lié à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans une plante de lin donneuse et le transfert de l’élément génétique, en particulier une séquence d’acide nucléique, lié à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine ainsi détecté, depuis la plante de lin donneuse vers une plante de lin receveuse.
La surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de la plante de lin se traduit par une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin.
Dans un mode de réalisation particulier d’une méthode selon l’invention, la détection est réalisée à l’aide d’au moins un marqueur moléculaire.
Dans une forme alternative de réalisation d’une méthode selon l’invention, la détection est réalisée par la mesure de l’activité enzymatique de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans la plante de lin donneuse.
La présente invention concerne aussi une méthode pour augmenter la quantité d’acide gras C18:3 dans la graine d’une plante de lin comprenant la fourniture d’une population de plantes de lin et la sélection des individus de la population qui présentent une expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine la plus élevée possible.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la population de plantes est une population de plantes mutantes.
De manière particulière, la population de plantes mutantes est obtenue par TILLING.
De manière particulière, la population de plantes mutantes est obtenue par CRISPR/Cas9.
C’est aussi un objet de la présente invention que de fournir une méthode qui comprend la sélection, au sein d’une population de plantes de lin, d’au moins une plante présentant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine par rapport à l’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine des plantes de lin parents.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, l’introgression comprend :
a) La fourniture d’une plante de lin présentant un niveau d’expression donné de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine,
20b) La fourniture d’une plante de lin présentant un niveau d’expression accru de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine par rapport à la plante fournie en a),
c) Le croisement de la plante fournie en a) avec la plante fournie en b),
d) La génération d’une progéniture issue du croisement c),
25e) La sélection au sein de la progéniture d’au moins une plante présentant un niveau d’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, supérieur à celui de la plante fournie en b).
Dans un mode particulier, la méthode décrite ci avant comprend une étape supplémentaire de croisement de la plante sélectionnée en e) avec la plante fournie en b) suivie d’une étape supplémentaire de sélection au sein de la progéniture obtenue d’au moins une plante présentant un niveau d’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine supérieur à celui de la plante sélectionnée en e).
C’est aussi un objet de la présente invention que de fournir une méthode de sélection de plante de lin, caractérisée en ce qu'elle comprend la recherche d'un allèle du gène de l'enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine possédant une mutation résultant en une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin.
Dans un mode de réalisation, la mutation correspond à une séquence nucléotidique similaire à celle présente dans la plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
La présente invention concerne enfin une plante de lin susceptible d'être obtenue par une méthode selon l’un des modes de réalisation décrit ici.
Enfin, la présente invention concerne aussi l’utilisation d'une plante de lin telle qu’obtenue par une méthode selon l’un des modes de réalisation décrits ici, ou d’un dérivé d'une telle plante, pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation humaine, l’alimentation animale ou la préparation de biocarburants.
L’invention vise aussi une plante obtenue ou susceptible d’être obtenue à partir d’une plante donneuse comprenant un élément génétique contrôlant la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, en particulier à partir de la plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016, par introgression dudit élément génétique dans une plante receveuse.
Un objet de la présente invention est donc l'utilisation d'au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, et de la protéine codée Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, pour l'obtention d'une plante de lin qui présente au moins une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin via la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
L'invention fournit un procédé d'obtention d’une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine d’une plante de lin, comprenant l'étape consistant à surexprimer la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans des cellules de ladite plante.
La surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans les cellules de la plante peut être obtenue par divers moyens à la disposition de l’homme du métier, que ce soit par transgénèse, par transformation, par introgression, par sélection, par sélection assistée par marqueurs, par mutagénèse aléatoire ou dirigée suivie ou non de sélection, par exemple.
Un objet particulier de l'invention est un procédé de production d'une plante de lin, ou d'une partie d'une plante de lin, présentant une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin, lequel procédé comprend la transformation d'une cellule végétale avec au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, et générer à partir d'une telle cellule, une plante qui surexprime la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine .
La méthode selon l’invention pour améliorer la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin comprend la transformation d'une cellule végétale de lin avec au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine , et la génération à partir d'une telle cellule, d’une plante de lin qui surexprime la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine .
Dans un mode de réalisation particulier, le au moins acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de la plante de lin est sous le contrôle d’un promoteur assurant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Un autre objet de l'invention est un procédé de production d'une cellule végétale de lin, une plante de lin ou partie de plante de lin, présentant une quantité accrue d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin, lequel procédé comprend l'étape consistant à transformer une cellule végétale de lin avec au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, et l'étape supplémentaire de génération d'une plante à partir de celle-ci qui surexprime la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Cette stratégie de surexpression d’une séquence génétique représente une nouvelle amélioration génétique qui permet aux plantes de dépasser leur potentiel maximal de production de C18:3.
Dans un mode de réalisation particulier d’une méthode selon l’invention, l’acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est sous le contrôle d’un promoteur assurant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de la plante.
Un autre objet de l'invention est une cellule végétale, une plante ou partie de plante, qui est transgénique pour au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de la plante et qu'il surexprime.
Un acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être n’importe quel acide nucléique encodant l’enzyme fonctionnelle de telle manière que lorsqu’introduit dans une cellule hôte et sous le contrôle d’un promoteur adéquat, la quantité de Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine et/ou son activité enzymatique au sein de la cellule sont augmentées.
A titre d’exemple, un acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être l’acide nucléique selon la séquence SEQ ID N°1.
Cette séquence SEQ ID N°1 correspond à un acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine à proprement parler et comprend une portion promotrice mutée.
Une telle séquence peut être trouvée dans la plante Linum usitatissimum VL8.29.3 5 déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
Plus particulièrement, dans le cadre de la présente invention l’acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine :
i) a une séquence présentant au moins 55 % d’homologie avec la SEQ ID N°1 ou sa séquence complémentaire, ou ii) a une séquence qui s'hybride à la SEQ ID N°1 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions de stringence, et qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine a une séquence présentant au moins 60%, au moins 65%, au moins 70 %, au moins 75%, au moins 80 %, au moins 85%, au moins 90 %, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, voire au moins 99% d’homologie avec la SEQ ID N°1.
L'acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine à transférer afin de surexprimer la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut également être un acide nucléique homologue de la plante hôte choisi parmi les acides nucléique de plantes, de microorganismes ou d’algues.
Un acide nucléique convenable peut être trouvé dans la plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposé sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
Le terme «homologue» ou « homologie » se rapporte à tout acide nucléique, ou protéine, ayant une ou plusieurs modification(s) de séquence par rapport à tout ou partie de la séquence de SEQ ID N°1 tout en conservant la plupart ou la totalité de l'activité de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine .
Dans un mode de réalisation de la présente invention, la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans les plantes peut être obtenue en utilisant la séquence SEQ ID N°1.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, l’acide nucléique codant la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine comprend un acide nucléique choisi dans le groupe constitué par SEQ ID N°1.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine a une séquence présentant au moins 60%, au moins 65%, au moins 70 %, au moins 75%, au moins 80 %, au moins 85%, au moins 90 %, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d’homologie avec la séquence d’un acide nucléique choisi dans le groupe constitué par SEQ ID N°1.
La présente invention propose en outre une cassette d'expression comprenant un promoteur exprimable dans une plante fonctionnellement lié à une région codante contenant au moins un acide nucléique codant pour une Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, dans lequel ledit promoteur n'est pas un promoteur de Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine. Ledit promoteur peut être un promoteur 35S, un promoteur d'ubiquitine ou un promoteur d'actine, par exemple.
Le terme «transgénique» signifie que la cellule végétale ou de la plante comprend dans son génome au moins un acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine qui est étranger à cette plante ou cellule de plante, ou qui comprend dans son génome au moins une séquence codante endogène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du
C18:2 en C18:3 dans la graine fonctionnellement liée à au moins une région de régulation, par exemple, un promoteur, qui n'est pas présent dans le gène endogène de cette plante ou cellule végétale. En général, l'acide nucléique étranger est intégré de manière stable dans le génome de telle sorte que le polynucléotide est transmis aux générations successives. Le terme transgénique inclut aussi le cas dans lequel la cellule végétale ou la plante comprend dans son génome deux ou plus de deux acides nucléiques endogènes ou exogènes de l’espèce de la cellule ou de la plante codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine ; permettant ainsi une surexpression de la Lasparate-oxydase. Le terme «surexpression» est ici destiné à signifier à la fois une augmentation de la quantité de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine par rapport à la quantité exprimée dans une plante contrôle, et une expression ectopique de cette enzyme, dans un tissu ou un compartiment et/ou à un stade de développement où il n'est normalement pas exprimé. Elle englobe la situation dans laquelle la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est endogène ou hétérologue, c'est à dire quand il s'agit d'un organisme, tel qu'une plante, différente de la cellule hôte, ou dans laquelle au moins une région de régulation de transcription de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine n'est pas présente dans le gène endogène. La quantité et/ou l’activité de la protéine Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine exprimée dans une cellule végétale peut être déterminée par toute technique de dosage connue et à la disposition de l’homme du métier. Plus particulièrement l’activité Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être évaluée via une analyse en Chromatographie en phase gazeuse (CPG) en analysant le % de C 18:2 et C 18:3 dans l'huile.
Le terme «surexpression» signifie aussi que l’activité enzymatique de la L-asparteoxydase produite au sein de la cellule hôte après introduction de la séquence codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, à quantité égale d’enzyme produite, est supérieure à l’activité enzymatique de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 de la cellule hôte avant l’introduction de ladite séquence. Une telle suractivité spécifique peut être due à une différence de structure primaire, secondaire ou tertiaire de la protéine due à une différence dans la séquence nucléique l’encodant.
La surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine se traduit par une augmentation de la quantité d’acide alphalinolénique dans la graine de la plante de lin.
Par l’expression «plante contrôle», dans le cadre de l'invention, on entend une plante de lin qui a le même fond génétique qu’une plante de lin selon la présente invention dans lequel la plante contrôle ne dispose pas de l’acide nucléique ou de l’élément génétique permettant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine selon la présente invention ; surexpression liée à une augmentation de la quantité d’acide alphalinolénique dans la graine de la plante de lin.
Une plante contrôle est cultivée pour la même durée de temps et dans les mêmes conditions qu’une plante selon la présente invention.
L’expression «variété», «cultivar» ou «obtention végétale» est ici entendue selon la définition de l'UPOV. Ainsi, une plante contrôle peut être une variété, lignée pure ou un hybride, à condition d’avoir le même fond génétique que la plante selon la présente invention à l'exception de l’acide nucléique, ou de l’élément génétique, permettant l’amélioration de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin selon de la présente invention et liée à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Dans les méthodes ou les plantes de l'invention, l'acide nucléique ou l’élément génétique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être hétérologue par rapport à la plante dans laquelle il est introduit ou peut appartenir à la même espèce, et ce dans la mesure où il peut être exprimé dans les plantes en des quantités supérieures à la quantité classiquement produite par une plante non transformée ou une plante qui ne contenait pas la séquence ou l’élément introduit ou introgressé. Ainsi, toute séquence nucléotidique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être utilisée, par exemple une séquence de type sauvage pour le gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, une séquence mutée au niveau de la portion codante de l’enzyme entraînant une activité spécifique plus élevée ou une séquence mutée au niveau de la région promotrice entraînant une plus forte production de la protéine et donc une surexpression de l’enzyme, voire une combinaison des deux cas de figure et du coup une meilleur conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine..
Avantageusement, une séquence, codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, utilisée pour transformer les cellules ou les plantes selon l'invention comprend un acide nucléique de la SEQ ID N°1.
Un mode de réalisation de l'invention comprend la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans une plante de lin, en surexprimant la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine codée par un acide nucléique choisi dans le groupe constitué par SEQ ID N°1, dans des cellules de plantes de lin.
L'homme du métier sait comment identifier des séquences d’acide nucléique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au sein de différentes espèces, par comparaison de SEQ ID N°1 avec les séquences d'autres espèces, avec un programme d'ordinateur tels que BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) et DB rapide avec les paramètres par défaut. L’homme du métier pourra aussi utiliser les une des séquences d’acide nucléique choisie dans le groupe constitué par SEQ ID N°1 afin de réaliser des comparaisons de séquences afin d’identifier et trouver des séquences codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine convenables.
Ces algorithmes sont décrits dans «Les méthodes actuelles de séquençage et synthèse méthodes et applications», pages 127-149, 1988, enAlabama R. Liss, Inc.
Les séquences homologues sont de préférence définies comme suit :
i) des séquences d'ADN qui montrent une similarité ou identité d'au moins 55 %, de préférence au moins 70 %, de préférence au moins 80%, encore plus préférablement au moins 90 %, plus préférentiellement et encore au moins 95% avec la séquence SEQ ID N°1 ;
ii) des séquences qui s'hybrident avec la séquence de SEQ ID N°2, avec sa séquence complémentaire, dans des conditions d'hybridation de stringence, par exemple de stringence faible, ou iii) des séquences codant pour une enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N°1, ou une séquence d'acides aminés homologue, par exemple, n'importe quelle séquence d'acides aminés avec une activité enzymatique Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine et ayant au moins 60 %, de préférence au moins 70 %, de préférence au moins 80%, encore plus préférablement au moins 90%, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence de la SEQ ID N°1.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue s'hybride spécifiquement à des séquences complémentaires de la séquence SEQ ID N°1 dans des conditions rigoureuses. Les paramètres qui définissent les conditions de stringence dépendent de la température (Tm) à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. Des conditions d'hybridation à faible stringence sont celles dans lesquelles l'hybridation est observée en utilisant une température d'hybridation de 5 à 10 °C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation sont des solutions de force ionique élevée, par exemple une solution 6 x SSC.
Les termes «similarité de séquence» ou «identité de séquence» ou encore «homologie de séquence» sont utilisés ici de manière interchangeable et signifient dans le contexte de deux ou plusieurs séquences d’acides nucléiques ou protéiques qui sont les mêmes ou ont un pourcentage spécifié de résidus d'acides aminés ou de nucléotides qui sont les mêmes, lorsque comparées et alignées pour une correspondance maximale, comme mesuré en utilisant l'un des algorithmes de comparaison de séquences suivants ou par inspection visuelle, si deux séquences devant être comparées entre elles ont des longueurs différentes, une identité de séquence concerne de préférence le pourcentage des résidus de nucléotides de la séquence la plus courte, qui sont identiques aux résidus nucléotidiques de la séquence plus longue. L'identité de séquence peut être déterminée de manière classique avec l'utilisation de programmes informatiques comme le programme Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 pour Unix, Genetics
Computer Group, University Research Park, 575 Sciences Drive Madison, WI 53711). Bestfit utilise l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), afin de trouver le segment ayant l'identité de séquence la plus élevée entre les deux séquences. Ouand on utilise Bestfit ou tout autre programme d'alignement de séquence pour déterminer si une séquence particulière présente, par exemple, 95% d'identité avec une séquence de la présente invention, de référence, les paramètres sont de préférence adaptés de telle manière que le pourcentage d'identité est calculé sur la longueur entière de la séquence de référence et que les écarts d'homologie allant jusqu'à 5 % du nombre total des nucléotides dans la séquence de référence sont permises.
Une séquence d’acides nucléiques est homologue à une séquence, telle que la séquence (séquence codante, CDS) représentée sur la SEC ID N°1 par exemple, telle qu'utilisée ici, quand il comprend une séquence nucléotidique qui diffère de cette séquence, par une mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour un polypeptide ayant l'activité de l'enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine. Une protéine est homologue à la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine représentée dans la SEC ID N°1, quand elle comprend une séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEC ID N°1, par mutation, insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs des acides aminés, du moment qu'elle est un polypeptide ayant l'activité de l'enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
La Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est une enzyme qui catalyse la réaction chimique de conversion de l’acide linoléique (C18:2 ω6) en acide linolénique (C18:3 ω3).
L'expression «l'activité de l'enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine » ou «l'activité enzymatique Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine », telle qu'utilisée ici, se réfère en particulier à son activité de déshydrogénation du carbone situé en positioin delta-15 (ie le 15eme carbone le plus proche du groupe hydroxyle) de l’acide linoléique qui peut être déterminée par l’analyse CPG du profil en acide gras de l’huile transestérifiée extraite de graines de lin. Un protocole détaillé de mesure est décrit dans la section expérimentale plus après.
L’acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est généralement inséré, en simple ou multiples exemplaires, dans une construction nucléotidique, appelée cassette d'expression, dans laquelle il est lié de manière fonctionnelle à des éléments permettant son expression, plus particulièrement sa surexpression et éventuellement sa régulation.
Parmi ces éléments, on peut notamment citer les promoteurs de transcription, des activateurs et / ou terminateurs.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule végétale est transformée avec une cassette d'expression comprenant au moins une séquence nucléotidique codant la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine et un promoteur spécifique d'un tissu. L’expression dans les tissus contenant de la lignine ou en inflorescences peut être d'un intérêt particulier, ainsi que l'expression sélective ou préférentielle dans les fleurs ou les graines. Un promoteur spécifique de la racine peut également être utile. L'expression dans les tissus des racines peut être accomplie en utilisant le gène de chitinase acide (Samac et al., 1990), ou les sous-domaines spécifiques profonds du promoteur CaMV35S qui ont été identifiés (Benfield et al., 1989).
Parmi les promoteurs de transcription qui peuvent être employés, on peut citer : un promoteur 35S, ou le promoteur 35S à double constitutive (pd35S) du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), comme décrit dans Kay et al, 1987 ; un promoteur PCRU de la cruciférine de radis qui dirige l'expression des séquences associées uniquement dans les semences de la plante transgénique ; les PGEA1 et PGEA6 promoteurs qui correspondent à la région 5’ non codante des gènes de la protéine de stockage de graines (GEA1 et GEA6, respectivement) d'Arabidopsis thaliana qui dirigent une expression spécifique dans les graines ; le promoteur chimérique PSP (Ni et al., 1995) qui est une fusion d'une triple répétition d'un élément activateur de la transcription du promoteur du gène de l'octopine synthase dans Agrobacterium tumefaciens ; un promoteur d'actine de riz, suivi éventuellement par l'intron actine de riz (PAR- IAR), par exemple ; le promoteur contenu dans le plasmide pAct1-F4 (Mc Elroy et al, 1991) la HMGW promoteur de blé (de haut poids moléculaire gluténine) ; le promoteur du gène de la zéine du maïs (P-zéine) contenu dans le plasmide p63, qui dirige l'expression dans l'albumen des graines.
D'autres promoteurs exprimables dans une plante convenables conformément à la présente invention comprennent, mais ne sont pas limités à : des promoteurs provenant de la famille de l'ubiquitine (par exemple, le promoteur de l'ubiquitine du maïs du document EP 0 342 926), un promoteur actine du riz tels que le promoteur décrit par Mc Elroy et al., (déjà mentionné ci-dessus) ou le promoteur décrit dans US 5,641,876 ; un quelconque des promoteurs de la veine virus de la mosaïque du manioc (WO 97/48819), l'un quelconque de la série de promoteurs pPLEX de trèfle souterrain Stunt virus (WO 96/06932), ou un promoteur de l'alcool déshydrogénase, par exemple, pADH 1S (numéros d'accession GenBankX04049, X00581).
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut notamment citer l'extrémité 3’ du gène de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens.
La cassette d'expression peut être insérée dans un vecteur nucléotidique, tel qu'un plasmide, qui peut en outre comprendre un gène marqueur, par exemple un gène permettant de sélectionner une plante transformée d'une plante qui ne contient pas l'ADN étranger transfecté. En tant que gène marqueur, celui-ci peut en particulier être constitué d'un gène qui confère une résistance à un antibiotique ou une résistance à un herbicide, ou une résistance à un acide aminé par exemple.
Le vecteur ainsi construit peut être utilisé pour transformer des cellules hôtes, selon des techniques connues de l'homme du métier.
On peut notamment citer des méthodes de transfert direct de gènes dans des cellules végétales, telles que la transformation par Agrobacterium tumefaciens, la micro-injection directe dans des embryoïdes de plante (Neuhaus et al., 1987), l'infiltration sous vide (Bechtold et al.,1993) ou l'électroporation (Chupeau et al., 1989), ou en variante, la précipitation directe à l'aide de PEG (Schocher et al., 1986) ou le bombardement de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt, en utilisant un pistolet (Fromm M. et al., 1990), par exemple.
Selon un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées avec un vecteur tel que défini ci-dessus, transféré dans un hôte cellulaire susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration, dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire utilisé est une souche bactérienne, telle que Agrobacterium tumefaciens, ou Agrobacterium rhizogenes par exemple.
Les plantes de lin ainsi obtenues surexpriment la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
De telles plantes de lin ou parties d'une plante sont avantageusement obtenues par le procédé décrit ci-dessus, dans lequel une cellule végétale est transformée avec au moins un acide nucléique qui code pour l'enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, et mises en culture, grâce à quoi on obtient une plante qui surexprime la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Les plantes transgéniques selon l’invention englobent à la fois les plantes de la première génération ainsi que leurs descendants contenant la cassette d'expression permettant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine selon l'invention (variétés lignées ou variétés hybrides, en particulier).
Les parties de la plante comprennent tout tissu ou organe, telles que des racines, des fleurs, des tiges, des feuilles, des fruits, des organes de réserve ou des graines.
La présente invention comprend en particulier les graines qui présentent une expression accrue de Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, obtenue par une surexpression spécifique d'une séquence de codage de Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la cassette d'expression de l'invention est utilisée pour surexprimer la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine d’une plante de lin. Cette utilisation conduit à une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin.
Comme évoqué plus avant, l’acide nucléique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au sein des plantes selon l’invention peut appartenir à la même espèce et ce dans la mesure où il peut être exprimé dans les plantes en des quantités supérieures à la quantité classiquement produite par une plante qui ne contenait pas la séquence nucléotidique ou l’élément génétique introduit. Ainsi, toute séquence nucléotidique codant pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être utilisée, par exemple, une séquence de type sauvage pour le gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, une séquence mutée d’une séquence sauvage qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, ou encore une séquence mutée du promoteur du gène d’une Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine sauvage ou mutée qui induit une augmentation de la quantité de Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, ou de la stabilité de l’ARN messager de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, ou une expression d’une Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine ayant une activité enzymatique supérieure, ce par rapport à la quantité et/ou l’activité de Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine qui étaient produites ou exprimées au sein de la plante hôte avant de recevoir la séquence introduite.
Comme indiqué plus avant, la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être obtenue par divers moyens à la disposition de l’homme du métier, que ce soit par transgénèse, par transformation, par introgression, par sélection, par sélection assistée par marqueurs, par mutagénèse aléatoire ou dirigée suivie ou non de sélection, par exemple.
Dans un mode de réalisation particulier de la méthode selon la présente invention, la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de la plante de lin est réalisée par introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
L’expression « élément génétique » ou « matériel génétique » utilisée ici se réfère à tout gène, groupe de gènes, QTL, locus, allèle, fragment chromosomique, séquence nucléotidique, séquence nucléique qui est capable de contribuer à l’augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin, en influant sur l'expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au niveau de l'ADN lui-même, tant au niveau de la traduction, de la transcription et/ou de l'activation d'un produit de polypeptide final, c'est à dire, pour réguler le métabolisme de la plante conduisant à l'expression phénotypique du génotype.
Dans le contexte de la présente invention, les termes «introgression», «introgressé» et «introgresser» désignent le processus par lequel un ou des éléments génétiques tels qu’un gène ou des gènes, un ou des QTL, un ou des allèles, un ou des fragments chromosomiques, ou une ou plusieurs séquences nucléiques présents dans le génome d'une espèce, variété ou un cultivar sont déplacés et transférés de manière stable dans le génome d'une autre espèce, variété ou cultivar, par croisement sexuel. Le transfert peut être naturel ou artificiel. Le processus peut éventuellement être complété par rétrocroisement avec un parent récurrent, dans ce cas, l'introgression se réfère à l'introduction d’un ou plusieurs éléments génétiques, tels qu’un ou plusieurs gènes, un ou plusieurs allèles, un ou plusieurs QTL, un ou plusieurs fragments chromosomiques ou une ou plusieurs séquences nucléiques d'une espèce dans le pool génétique de l'autre par rétrocroisement répété d'un hybride interspécifique avec l'un de ses parents. Une introgression peut également être décrite comme l’intégration stable d’un matériel génétique hétérologue dans le génome d'une plante receveuse par croisement sexuel entre plantes d’espèce identique ou proche, c’est-à-dire sexuellement compatibles. La notion de sexuellement compatible s’entend en ce que la fertilisation d’une fleur d’une plante par le pollen d’une autre plante donne lieu à la fécondation de l’ovule et à la production d’un fruit contenant une ou plusieurs graines capable de germer et de donner une nouvelle plante. La notion de sexuellement compatible s’entend aussi des cas ou la viabilité de l’embryon formé est assurée par une ou des techniques de sauvetage d’embryon. L’homme du métier dispose de diverses méthodes de sauvetage d’embryon qu’il peut utiliser en fonction des espèces mise en jeu.
Il est ainsi proposé selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, une méthode pour augmenter la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine chez une plante de lin comprenant la fourniture d’une population de plantes de lin, y compris la fourniture d'une population de plantes de lin issues de croisements, et la sélection des individus de la population qui présentent une expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine la plus élevée possible.
La population de plantes de lin peut être une population de plantes mutantes générée par mutagénèse chimique ou par tout autre moyen capable d’induire une ou plusieurs mutations au sein du génome des plantes ainsi traitées telle que TILLING ou CRISPR/Cas9. Le traitement de mutagénèse résulte en l'introduction volontaire de mutations par l'action d'agents mutagènes chimiques ou physiques dans une séquence ADN, agents qui peuvent être un traitement chimique comme par exemple un traitement à l’éthyl méthanesulfonate (EMS).
De manière avantageuse, une population TILLING peut être utilisée pour la sélection d’individus qui présentent une expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine la plus élevée possible.
Typiquement la technologie TILLING repose sur la mutagénèse de graines suivie d’un phénotypage et d’un génotypage afin d’identifier les mutations et le ou les allèles associés à un phénotype donné, préférentiellement un phénotype avantageux. La génération de population TILLING peut être réalisée comme suit. Des graines MO sont mutagénéisées par un traitement à l'ethylmethanosulfonate (EMS). Les plantes M1 issues des graines MO sont autofécondées, l'ADN est extrait des familles M2 pour un screening haut débit des mutations et les graines M3 sont récoltées et conservées. L'ADN des familles M2 est poolé 8 fois et amplifié pour un gène cible. Les produits d'amplification sont incubés avec une endonucléase qui coupe préférentiellement les mésappariements dans les hétéroduplex entre sauvage et mutant. Les produits de digestion sont soumis à une électrophorèse en gel de séquence. La technologie LI-COR permet un marquage fluorescent double brin (IRDye 700 et 800) qui permet une confirmation visuelle rapide car les mutations sont détectées sur les deux brins complémentaires et ainsi facilement distinguées des artéfacts. Après détection d'une mutation dans un pool, l'ADN des familles individuelles est rapidement criblé par déconvolution du pool afin d'identifier la famille portant la mutation.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, l’introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est obtenue par fusion de protoplastes.
Ainsi dans un tel mode de réalisation de l’invention, pour augmenter de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin, la fusion de protoplastes peut être utilisée pour le transfert d’au moins un élément génétique à partir d'une plante donneuse vers une plante receveuse. La fusion de protoplastes est une union induite ou spontanée, comme une hybridation somatique, entre deux ou plusieurs des protoplastes (les parois cellulaires sont éliminées par traitement enzymatique) afin de produire une cellule unique bi- ou multi- nucléée. La cellule fusionnée, qui peut aussi être obtenue avec les espèces végétales qui ne peuvent être croisées sexuellement dans la nature, est cultivée dans une plante hybride présentant la combinaison de caractéristiques souhaitables. Plus précisément, un premier protoplaste peut être obtenu à partir d'un plante selon l’invention et qui présente une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin et une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine. Un deuxième protoplaste peut être obtenu à partir d'une plante qui comprend des caractéristiques de valeur commerciale. Les protoplastes sont ensuite fusionnés au moyen de procédures de fusion de protoplastes traditionnelles, qui sont connues dans la technique.
Alternativement, le sauvetage d'embryon peut être utilisé dans le transfert d'un élément génétique, en particulier un acide nucléique, permettant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine d’une plante donneuse selon l’invention vers une plante receveuse selon l’invention. Le sauvetage d'embryons peut être utilisé en tant que procédure pour isoler des embryons à partir de croisements dans lequel les plantes ne parviennent pas à produire des graines viables. Dans ce processus, l’ovule fécondé ou immature d'une plante est un tissu de culture pour créer de nouvelles plantes.
C’est ainsi un objet de la présente invention que de fournir une méthode dans laquelle l’introgression d’un élément génétique codant pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est obtenue par sauvetage d’embryon.
La présente invention concerne également une méthode pour la production de plantes de lin présentant une quantité d’acide alpha-linolénique accrue dans la graine de la plante de lin, comprenant la détection de la présence d'un élément génétique, en particulier une séquence d’acide nucléique, liée à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans une plante de lin donneuse et le transfert de l’élément génétique, en particulier une séquence d’acide nucléique, liée à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine ainsi détecté, depuis la plante donneuse vers une plante de lin receveuse. Le transfert de la séquence d'acide nucléique peut être réalisé par un quelconque des procédés précédemment décrits ici.
Le transfert peut être réalisé par une technique choisie parmi transgénèse, introgression, fusion de protoplastes, restauration d’embryon.
Un exemple de réalisation d'un tel procédé comprend le transfert par introgression de l’élément génétique, en particulier la séquence d'acide nucléique, lié à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine à partir d'une plante donneuse vers une plante receveuse par croisement sexuel des plantes. Ce transfert peut donc avantageusement être réalisé en utilisant des techniques de croisement et de sélection traditionnelles.
Dans un mode de réalisation particulier de la méthode selon l’invention, la détection de la présence d’un élément génétique lié à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est réalisée à l’aide d’au moins un marqueur moléculaire.
Dans un autre mode de réalisation de la méthode selon l’invention, la détection de la présence de l’élément génétique lié à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine est réalisée par la mesure de l’activité enzymatique de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans la plante donneuse.
Selon certains mode de réalisation, l’élément génétique responsable de la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine peut être introgressé dans les variétés commerciales de plantes d’intérêt agronomique à l'aide de la sélection assistée par marqueurs (SAM) qui implique l'utilisation d'un ou plusieurs des marqueurs moléculaires pour l'identification et la sélection des plantes de la descendance qui contiennent l’élément génétique, gène ou pluralité de gènes, séquences d’acide nucléique codant pour la caractéristique souhaitée de surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine .
Dans le contexte de la présente invention, une telle identification et une telle sélection sont basées sur la sélection de gènes, d’éléments génétiques ou de séquences d’acides nucléiques ou des marqueurs qui y sont associés.
Les plantes obtenues selon ces modes de réalisation peuvent avantageusement tirer la majorité de leurs traits de la plante receveuse, et tirer au moins un caractère phénotypique d’augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin donneuse, grâce à la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
Comme discuté ci-dessus, les techniques de croisement traditionnelles peuvent être utilisées pour l’introgression de séquence d'acide nucléique responsable de la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, liée à une augmentation de la quantité d’acide alphalinolénique dans la graine de la plante de lin au sein d’une plante de receveuse.
Dans certains modes de réalisation, une plante de lin donneuse qui présente une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine et comprenant une séquence d'acide nucléique responsable d’une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, est croisée avec une plante receveuse qui, dans certains modes de réalisation peut présenter des caractéristiques commercialement souhaitables.
La population de plantes qui en résulte (représentant les hybrides F1) est alors autofécondée produisant des semences F2. Les plantes F2 issues de graines F2 sont ensuite criblées en vue de déterminer les plantes présentant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, associée à une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin; ceci par des méthodes connues de l'homme du métier.
Les lignées de plantes présentant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, associée à une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin peuvent être développées en utilisant les techniques de sélection récurrente et rétrocroisement, autofécondation, et/ou dihaploïdes, ou toute autre technique utilisée pour faire des lignées parentales. Dans un procédé de sélection récurrente et rétrocroisement, l'augmentation de l’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, associée à une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin peut être introgressée dans une plante receveuse cible (le parent récurrent) en croisant le parent récurrent avec une première plante donneuse, qui diffère du parent récurrent et qui est appelée ici le «parent non récurrent». Le parent récurrent est une plante qui ne présente pas une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, associée à une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin mais peut posséder des caractéristiques commerciales souhaitables.
Le parent non récurrent peut être n'importe quelle variété végétale ou lignée pure qui est sexuellement compatible avec le parent récurrent.
Les plantes de la descendance d'un croisement entre le parent récurrent et le parent non récurrent sont rétrocroisées au parent récurrent. La population de plantes qui en résulte est ensuite criblée pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, associée à une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin.
La sélection assistée par marqueurs (SAM) peut être mise en oeuvre en utilisant des sondes d'hybridation ou des polynucléotides, afin d'identifier les plantes qui comprennent une séquence d'acide nucléique ou tout élément génétique entraînant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, associée à une augmentation de la quantité d’acide alphalinolénique dans la graine de la plante de lin.
À la suite de criblage, les plantes hybrides F1 qui présentent une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, associée à une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin, sont ensuite sélectionnées et rétrocroisées avec le parent récurrent pour un certain nombre de générations afin de permettre à la plante de devenir de plus en plus consanguine. Ce processus peut être effectué pour deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, ou plus générations.
De manière générale, la présente invention concerne un procédé d'obtention de plante de lin présentant une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin qui peut comprendre :
(a) fournir une plante de lin présentant un niveau d’expression donné de la
Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine ;
(b) fournir une seconde plante de lin présentant un niveau d’expression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine supérieur à celui de la plante fournie en (a) ;
(c) effectuer un croisement de la plante fournie en (a) avec la plante fournie en (b), pour produire des plantes de la descendance F1 ;
(d) sélectionner des plantes de la descendance F1 qui présentent une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine par rapport à la plante fournie en (a) ;
(e) croiser les plantes sélectionnées en (d) avec la plante fournie en (a) pour produire des plantes de descendance de rétrocroisement ;
(f) sélectionner des plantes de la descendance de rétrocroisement qui présentent une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine par rapport aux plantes sélectionnées en (d);
(g) répéter les étapes (e) et (f) deux ou plusieurs fois de suite;
(h) éventuellement autoféconder les plantes issues de rétrocroisement afin d'identifier les plantes homozygotes et (i) effectuer un croisement d'au moins une plante de la descendance de rétrocroisement ou des plantes auto-fécondées avec une autre plante fournie en (a) pour produire une plante présentant une augmentation de la quantité d’acide alphalinolénique dans la graine de la plante de lin lorsque cultivée dans les mêmes conditions environnementales.
Comme indiqué, la dernière génération de rétrocroisement peut être auto-fécondée afin de fournir des individus homozygotes présentant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine et une augmentation de la quantité d’acide alpha-linolénique dans la graine de la plante de lin.
Conformément à un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'étape de sélection comprend la sélection d'individus qui contiennent chacun un allèle du gène qui code pour une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
La présente invention concerne aussi une méthode de sélection de plante, caractérisé en ce qu'elle comprend la recherche d'un allèle du gène de l'enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine possédant une mutation résultant en une augmentation de la quantité d’acide alphalinolénique dans la graine de la plante de lin.
De plus, selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'étape de sélection comprend la sélection à l'aide d'un marqueur moléculaire pour l’allèle du gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine.
En outre, selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'étape de sélection comprend la sélection en mesurant l'activité de l'enzyme Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine dans les jeunes plantes et en sélectionnant celles présentant une activité élevée de l'enzyme.
Dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne un procédé de sélection de plante de lin présentant une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine comprenant les étapes suivantes :
(a) fournir une population de plantes de lin ;
(b) mesurer l’activité de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de chaque individu de la population de plantes fournie ;
(c) sélectionner la ou les plantes présentant l’activité Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine la plus élevée.
Dans un mode de réalisation particulier, la population de plante est une population de TILLING ou issue de modification par CRISPR/Cas9.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la population de plantes est une population issue de croisements intraspécifiques ou interspécifiques.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la population de plantes est une population de variétés commerciales.
Dans le contexte de la présente invention, l’expression «surexpression» en référence à la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine se réfère au fait que la séquence nucléique d’ADN encodant la protéine est transcrite en ARN en quantité accrue et/ou que les ARN de la protéine sont traduits en protéine en quantité accrue et/ou que la quantité ou l’activité spécifique de la protéine traduite est accrue. Au final, la notion d’expression ou de surexpression fait référence à l’activité enzymatique de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au sein de la plante et au fait qu’elle soit due à une plus grande synthèse de la protéine et/ou à activité spécifique plus importante.
Dans le contexte de la présente invention, les expressions «croisement sexuel» et «reproduction sexuée» se réfèrent à la fusion des gamètes pour produire une descendance (par exemple par fécondation, de manière à produire des semences par pollinisation chez les plantes). Un «croisement sexuel» ou «fertilisation croisée» est dans certains modes de réalisation, la fécondation d'un individu par un autre (par exemple, la pollinisation croisée des plantes). Le terme «autofécondation» fait référence à certains modes de réalisation de la production de semences par autofécondation ou auto-pollinisation, c’est-à-dire que pollen et ovules sont de la même plante.
Par l’expression «caractère», on entend dans le cadre de la présente une caractéristique ou un phénotype, par exemple le rendement, la biomasse ou la vitesse de germination. Un caractère peut être hérité de manière dominante ou récessive, ou peut être monogénique ou polygénique.
Par l’expression «plante donneuse», dans le cadre de l'invention, on entend une plante qui fournit au moins un élément génétique lié à une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du 08:2 en 08:3 dans la graine.
Par l’expression «plante receveuse», dans le cadre de la présente invention, on entend une plante qui reçoit au moins un élément génétique lié à une surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du 08:2 en 08:3 dans la graine.
Dans le cadre de la présente invention, les expressions «marqueur génétique», «marqueur d'ADN» ou «marqueur moléculaire» sont interchangeables et font référence à une caractéristique du génome d'un individu (par exemple un nucléotide ou une séquence de d’acide nucléique qui est présent dans le génome d'un individu), qui est liée à un ou plusieurs loci d'intérêt. Les marqueurs génétiques comprennent, par exemple, des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), des indels (c-à-d insertions/suppressions), des répétitions de séquences simples (SSR), des polymorphismes de restriction de longueur des fragments (RFLP), ou des longueurs des fragments amplifiés (AFLP) par exemple. Les marqueurs génétiques peuvent, par exemple, être utilisés pour localiser des loci génétiques contenant des allèles qui contribuent à la variabilité des caractéristiques phénotypiques.
L'expression «marqueur génétique» peut également faire référence à une séquence de polynucléotides complémentaires d'une séquence génomique, telle qu'une séquence d'un acide nucléique utilisé comme sonde. Un marqueur génétique ou moléculaire peut être physiquement situé dans une position sur un chromosome qui est distale ou proximale par rapport à un ou des loci génétiques avec lequel ou lesquels il est lié (c'est à dire est intragénique ou extragénique, respectivement). Dans certains modes de réalisation de la présente invention, les un ou plusieurs marqueurs génétiques comprennent entre un et dix marqueurs, et dans certains modes de réalisation, les un ou plusieurs marqueurs génétiques comprennent plus d'une dizaine de marqueurs génétiques.
Dans le cadre de la présente invention, le terme «génotype» fait référence à la constitution génétique d'une cellule ou un organisme. Comme cela est connu dans la technique, un génotype peut se rapporter à un seul locus ou à de multiples loci. Dans certains modes de réalisation, le génotype d'un individu se rapporte à un ou plusieurs gènes qui sont liés par le fait que l'un ou plusieurs des gènes sont impliqués dans l'expression d'un phénotype d'intérêt (par exemple un caractère tel que défini ici). Ainsi, dans certains modes de réalisation, un génotype comporte un ou plusieurs allèles présents chez un individu à un ou plusieurs loci pour un caractère.
Dans le cadre de la présente invention, le terme «gène» se réfère à une unité héréditaire comprenant une séquence d'ADN qui occupe un emplacement spécifique sur un chromosome et qui contient l'instruction génétique pour une caractéristique ou un trait particulier dans un organisme.
Dans le cadre de la présente invention, les termes «acide nucléique» ou «oligonucléotide» ou «polynucléotide» ou «séquence nucléique» ou des équivalents grammaticaux de ceux-ci, signifient au moins deux nucléotides liés de manière covalente ensemble. Les oligonucléotides sont typiquement d'environ 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25 18, 20, 30, 40, 50 ou jusqu'à environ 100 nucléotides de long. Les acides nucléiques, séquences nucléiques et les polynucléotides sont des polymères de n'importe quelle longueur, y compris les plus grandes longueurs, par exemple, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10000, etc. Un acide nucléique de la présente invention contiendra généralement des liaisons phosphodiester, bien que dans certains cas, des analogues d'acide nucléique sont inclus qui peuvent avoir des squelettes alternatifs comprenant, par exemple, phosphoramidate, phosphorothioate, phosphorodithioate, ou les liaisons O-methylphosphoroamidite (voir Eckstein, 1991), et des squelettes peptidiques et les liens d'acides nucléiques. Des mélanges d'acides nucléiques naturels et d'analogues peuvent être utilisés.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression «phénotype» ou «caractère phénotypique» fait référence à l'apparence ou toute autre caractéristique détectable d'un individu, résultant de l'interaction de son génome, protéome et/ou métabolome avec l'environnement.
Dans le contexte de la présente invention, une «plante» est une plante à n'importe quel stade de développement, en particulier une plante à graines.
Dans le contexte de la présente invention, une «cellule de plante» est une unité structurale et physiologique d'une plante, comprenant un protoplaste et une paroi cellulaire. La cellule végétale peut être sous forme d'une cellule unique isolée ou une cellule cultivée, ou comme une partie d'unité organisée supérieure telle que, par exemple, un tissu végétal, un organe végétal ou une plante entière. Une cellule de plante peut être capable de régénérer une plante ou ne pas être capable de régénérer une plante.
Dans le contexte de la présente invention, l’expression «matériel végétal» se réfère aux feuilles, tiges, racines, fleurs ou parties de fleurs, les fruits, le pollen, les ovules, les zygotes, graines, boutures, cellulaires ou cultures de tissus, ou à toute autre partie ou produits d'une plante, plus particulièrement des graines.
Telle qu'utilisée ici, l'expression «partie de plante» désigne une partie d'une plante, comprenant des cellules simples et des tissus cellulaires telles que les cellules de plantes qui sont intactes dans des plantes, des amas de cellules, et des cultures de tissu à partir duquel les plantes peuvent être régénérées ou pas. Des exemples de parties de plantes comprennent, mais ne sont pas limités à, des cellules individuelles et des tissus de pollen, les ovules, les feuilles, les embryons, les racines, bouts de racine, anthères, les fleurs, les fruits, les tiges, les pousses et les graines, ainsi que des greffons, porte-greffes, protoplastes, calii, et analogues, plus particulièrement des graines.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme «population» désigne un ensemble génétiquement hétérogène de plantes partageant une dérivation génétique commune.
La Figure 1 représente le schéma de croisement et de sélection à partir de lignées L1, L2 et L3 croisées avec le mutant M48.
EXEMPLE
Le Demandeur a mis en place en 2001 un programme visant à dépasser la limite des 66,7% d’ALA dans les huiles extraites des graines de lin par le biais de la mutagénèse non-dirigée. Pour cela la technique du bombardement par des rayons Gamma (400Gr) a été retenue. Plusieurs lignées appartenant au Demandeur ont été soumise à ce traitement avec pour résultat l’obtention de plusieurs lignées transformées ayant des teneurs en ALA proche de 70%. Cependant les rendements de ces lignées étaient trop faibles pour en espérer une exploitation commerciale.
Ces lignées ont donc servi de géniteurs pour des croisements avec d’autres lignées possédant des qualités agronomiques supérieures.
A la suite d’une sélection généalogique, de nouvelles variétés combinant le caractère haute teneur en ALA (supérieur à 66,7%) à des qualités agronomiques fortes ont été fixées. Les rendements de ces variétés sont comparables à ceux des témoins utilisés pour les inscriptions. Il en va de même pour la germination des semences issues de ces variétés à haute teneur en ALA. Ces deux derniers éléments sont importants car il s’agit des défauts principaux de Lutéa (lin à graines jaunes), l’une des variétés inscrites au catalogue français ayant la plus haute teneur en ALA (63,5% en moyenne).
Chez les variétés à hautes teneurs en ALA, un marqueur génétique a été trouvé en amont d’un gène codant pour une désaturase responsable de la conversion du
C18:2 en C18:3 dans la graine de lin.
Irradiation des grains de lin et schéma de croisement
Trois lots de 1000 graines issues d’une lignée M1 standard ont été placées dans une chambre d’irradiation (Cobalt-60) et ont reçu une dose de rayon gamma de 400 Gy (10Gy/h).
Après 5 jours d’incubation à 25°C en boîte de pétri, les graines furent semées en 5 pots placés dans une serre. Le taux de survie fut de 15%. Les graines de chaque plante de cette population descendante M2, M3, M4... furent récoltées individuellement, puis analysées en CPG afin d’obtenir leurs profils en C18:3.
La plante M48 fut retenue pour sa très haute teneur en C18:3 (>70%). Après fixation par autopollinisations successives, la lignée M48 fut croisée avec trois autres lignées : L1, L2 et L3 (voir Figure 1).
L1, L2, L3 : lignées de lin oléagineux standard de la sélection Laboulet Semences.
M48 : lignée mutée à haute teneur sur fond génétique M1.
Dans la descendance de ces croisements, une fixation et sélection ont été effectuées durant les 10 générations suivantes, afin de créer des variétés à haute teneur en C18:3 et performantes au niveau agronomique.
HT1, HT2, HT3 : lignées fixées issues des croisements avec la lignée à haute teneur.
La plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016 correspond à la HT3.
Dosage des acides gras en CPG
La teneur des différents acides gras est importante pour les débouchés alimentaires des huiles. De ce fait la teneur en C18:3 des graines de lin est primordiale pour leur valeur commerciale.
Un bulk provenant d’une même plante est broyé, puis l’huile est extraite du broyât grâce à de l’isooctane et transestérifié avec une solution méthanolique d’hydroxyde de potassium. Les esters méthyliques d’acides gras sont ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse (CPG).
Le teneur en acide linolénique est déterminée par chromatographie gazeuse des esters méthyliques d’acides gras selon la norme de Organisation Internationale de
Normalisation, Animal and vegetable fats and oils 1505508:1990E.
Séquençage
Les extractions d’ADN génomique ont été réalisées selon le protocole du kit DNeasy
Plant Mini Kit (Qiagen).
Le génome complet des lignées HT1, HT2, VL8.29.3 et L1 ont été séquencés avec un séquenceur très haut débit Hiseq2500 (Illumina).
Positionnement de la délétion · Les génomes complets de HT1, HT2, HT3 (VL8.29.3) et L1 ont été séquencés et alignées.
• HT1, HT2, HT3 (VL8.29.3) sont les seuls à posséder une délétion (en comparaison à L1 et aux bases de données accessibles sur le lin) en amont d’une désaturase delta-15 expliquant la surexpression de celle-ci.
· Une publication sur des mutants de lin possédants des teneurs en C18:3 très faibles montre que des délétions dans la même zone ont conduit à une extinction génique de Lus10038321.g (Vrinten et al. 2005).
• Zone promotrice 5’ du gène Lus10038321.g -> omega-3 fatty acid désaturase; delta-15 désaturase (Linum usitatissimum clone LuBAC395P20, complété sequence).
Résultats de rendement et de teneur en graine en C18:3
Variétés Rdt (en grain net Quinal/ha) Rdt (%Temoin) C18:3 (% de la MG) Germination (%)
Eurodor (Variété Commerciale de lin jaune. Linea Lin 2000) 85.7 100 56.2 95
Lin ALA HT1 21.9 91.1 70,9 93
Lutea (variété commerciale) 18.5 76.9 62,8 89
Omegalin (variété commerciale. Terres de Lin) 23.4 97.3 66.3 .92
Festival (Variété commerciale. Laboulet Semences 24.7 102.7 60.9 96
Les variétés Omegalin et Festival sont les deux variétés témoins et le « 100% » de de rendement de référence auquel est comparé le rendement des autres plantes testées est la moyenne de ces deux (ie [102.7+97.3]/2).
On constate que la plante HT1 à haute teneur en C18:3 permet de maintenir un rendement en grains (en % par rapport à la moyenne des rendements des témoins) dans une gamme tout à fait compatible avec une utilisation agricole et en particulier en comparaison avec les variétés Eurodor, Omégalin, Festival et Lutéa cultivées en France dans les conditions agronomiques et environnementales identiques, à savoir selon la norme VATE GEVES comme expliqué dans la description.
Dépôt de matière biologique : Linum usitatissimum VL8.29.3 a été déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016.
SEQ ID 1 (correspondant à la plante mutée VL8.29.3).
AGAGCAAAAAAGTTGGGTGGTGTAGGCTAGTTTGTCTGAAATCAGTGTACATTTT
GCATTTCCATTTACTCTTCTCCATCCACTTGGCATCCTGCATTACTTCTTCTTCGT
TAGTTCTCACCAACCTACATACTCTTCGGTTATAAATACTGTGAGGCTGAAACCA
AAGGCCACTCAGTCTATTCATTATTATTCAAAAATATATATTGGGTTTGTTTGGTGC
AGATTACAGTGACTTCAAAACTGTGGCTCTGCACGACCAAACTATGAGCCCTCC
AAACTCAATGAGTCCCGCCACCAACGGCAGCACCAATGGTGTGGCTATCAATG
GGGCGAAGAAGCTACTCGATTTCGACCCGAGTGCTGCTCCCCCTTTCAAGATT
GCAGACATCCGTGCTGCAATCCCGCCGCATTGTTGGGTGAAGAACCCCTGGAG
GTCACTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTGGTCATCCTCAGCTTCGCCGTTG
CGGCGACAAAGCTGGACAGCTGGACTGTCTGGCCTCTCTACTGGATTGCTCAA
GGAACCATGTTCTGGGCAGTCTTTGTTCTTGGACATGATTGGTAATTTCACATGA
TCTTTCTGGTAATGTGGGTTTTCTTTTCTTATTGAAAAAGATTAAAACTTTTTATCT
GGGCTGTTGCATGCAGTGGCCATGGGAGCTTCTCAGACAGTTGGTTGTTGAAC
AACGTGATGGGACATATACTCCATTCCTCAATCCTCGTACCTTACCATGGATGGT
ATTGTAACTATTGTTCGATATTCGATTATGATTACTGTTCTTTCAGATGAAGAATCT
GTACCCTAATTGTTTTTTGTTACCAGGAGAATTAGCCACAAGACCCATCACCAGA
ATCACGGCAATGTGGAGAAAGATGAATCCTGGGTTCCAGTAAGTTGACATGCAG
TTTGCTCTAAAATGCAGAGTCCTCTGTTTTTTGTGTGTTCTTGTGCTTTAATGAC
GATGATAATGAAATTGAAATTTGTAATAGCTGCCGGAGAAGGTGTACAAGAGCTT
GGATACCGGCACCAAGTTCATGAGGTTCACCATCCCTCTCCCAATGTTTGCGTA
TCCTATCTACTTGGTAAGTAAACAGACTGACTCCAAAGTAGGAACTAATGACAAT
TTTGGACCCGACCTGGTTTGGTTGACTCGGGTCGATATGTTTCGGGTGGGTAAT
TACCCGATCTGGCGATGGGTGTGCGGCGGACATTGTCTTGCTCGTGGTCCACC
CCGCTCCCAACCCGCCCCATTCTTGACGAAAAAGATTTCGGAATATGTATCAAC
AGAAAAATCTAGTTTTTATGTTACTAGTTTTCTGTATTTCCATGTTTTTTCCTCAAT
TCTAGCCGGAATTTGAATTCAAACTGAAATCGGGTAATTCCGTCCATAACAAAAC
GGAATTGGGCAGCCGTAATTAGTTGAAACTAGACCTCAATTTTGGCGGAATTGG
ACCCGGCCATTTTTTACGTTTGCAAAACGGAAAACGTTTTTCTTTTGTAAAGCGC
AAAATGAAAAACGTATCTAGTGGAATTATTGGACCCATCTAGAATGGGTCCAATT
CCACCCCAATTTCGGCTCCAATTCATGCCCGGAAAACACTACTGTCATGCATTTT
AATCTTGTATGGTTTTACCCCAATGGATGCAGCGATGGATCCGGACGATTTTTAA
AATATTATCGGGTTAAATTTAAAAATATCTTAAAACTATAAGAAAAAAATAACCAATT
TTAAAGAATAAAAGAACTGGACACATATGACGGGTGTCGTGGATGGATGTACTTG
TCCCGCTCTATTAAAGGCTGATAATATACAGGTCAACGGTGAATGAAGGTTAGAT
GCGCTATTGGATTTGAATCCGATATGAAATGATAATTTTGGACACGATCTGTTTTG
GGTGGGTAATATTTGATCTAGGGATGGCTCGTGCTCCAAACCGCACCAAAACCG
CCTAATTCTCGACCAAAAAGATTTTATGAATACATATCAACAGAAAAATCTAGTTTT
CATGTTACTAGTTTTATGTACAACAATATTAGGTGTCGTTTTCCCAGCCTTTTTCTT
CAATTCCGGCCGGAATTCGCATTCAAACCGGAATTGGATGGAATCGGTATACCT
CGTCACGGATGCATTGTCAATTCCTAGTTAGTTTCATGGTTTTGAAACCAATCAAT
CTATTCTATATGGTTTTGATTAACAGTGGAGGAGAAGTCCGGGGAAGAAAGGGT
CGCATTTCAACCCATACAGTGACCTGTTCGCACCGAACGAGAGGACATCGGTCA
TGATTTCGACATTGTGCTGGACAGCCATGGCCTTACTCCTCTGCTACTCATCGTT
CATCTACGGCTTCCTTCCGGTCTTCAAAATCTACGGCGTCCCTTATCTAATATTC
GTGGCGTGGCTCGACATGGTGACCTACCTTCACCACCACGGGTACGAGCAGAA
GCTGCCGTGGTACAGAGGCAAAGAGTGGAGCTACCTACGTGGAGGGCTGACG
ACCGTCGATCGAGATTACGGGGTCATCAACAACATCCACCATGACATTGGCACC
CATGTTATTCACCATCTCTTCCCTCAAATGCCACACTATCACCTAGTCGAAGCGG
TAAGGAGGTCTTGATTATTAACTTAATGTTTTTGTTGTTATAATTTGAGTCCGATTC
TGGAGTCAGGGGATTTCCTTCTTGGATCCGATCCAGGATCAAGCTGGTCCCTTG
AATTTCTATATGATCTTATATTAATTAAGGATAATGTGGTCATATGTTTTTAAATATTT
TTGTTTACCATCATTTCCGATCACCGGAAAATGTCCTGAGCAGTTTTCCGGTCAC
TTTAACCTCCATTGACAAATTTTTTCACCCACATGATCACCCTAGCCGGGTTTAC
GTTTATTGAAAATTTTTATTTTTTTGAATTTTTTTTCGATGACCAACTGTACAACTTT
GTATTGAAAGTTGTATGGATCATACAAATGTGTATGTACAAAAGTATATTCTAAGTA
CTATACTAAGCATTACTTAGTATTACGTTTCTACAAACCTATAGAGAAATGCATACA
ATTTTGTATAGAACTTAGTATACACGTAGCTGTGAAATGTCAATTTCCCTCCGTAT
TTTCAGAGACAAGACATGATTTTTAGACTGGCAGATTTTTTTTATCGGATAGATTT
CTCCAACTTCAGATTCGGACTGGATTATTAACTATATTATTCATCAACTCTGACGT
TTGATGTTGCATGTGACAGACTCAGGCAGCGAAGCACGTGCTGGGGAAGTACT
ACAGAGAACCGAAGAAATCAGGGCCTTTCCCATTCCACTTGTTTGGGTACTTGG
TGAGGAGCCTGGGCGAGGATCACTACGTTAGCGATACAGGCGACGTCGTTTTC
TATCAATCTGACCCACATATTCCCAAGTTCCCTACCAGTGCCACCACCAAGTCCA
AATCTAGCTGATGATATTGGCTCTGATCTGATGTATGCTGCAGGCTGTTTTATTTT
GTCCTTTGTTCGTTTCTTTCTGCCAGAAACAAATTCTCTGTTTCTATGTTTCTCTG
TCTCTCCCACCCCAGCTTTCTTTCTGAGTATATCGTATAAAGTTTCAAGTGATTGT
AAGAGCAGGAAAGAAAAGAAGAAGAAGAATAATAA.
SEQ ID 2 (correspondant à la plante standard L1) :
AGAGCAAAAAAAAAGGGGTTGGGTGGTGTAGGCTAGTTTGTCTGAAATCAGTG
TACATTTTGCATTTCCATTTACTCTTCTCCATCCACTTGGCATCCTGCATTACTTC
TTCTTCGTTAGTTCTCACCAACCTACATACTCTTCGGTTATAAATACTGTGAGGCT
GAAACCAAAGGCCACTCAGTCTATTCATTATTATTCAAAAATATATATTGGGTTTGT
TTGGTGCAGATTACAGTGACTTCAAAACTGTGGCTCTGCACGACCAAACTATGA
GCCCTCCAAACTCAATGAGTCCCGCCACCAACGGCAGCACCAATGGTGTGGCT
ATCAATGGGGCGAAGAAGCTACTCGATTTCGACCCGAGTGCTGCTCCCCCTTT
CAAGATTGCAGACATCCGTGCTGCAATCCCGCCGCATTGTTGGGTGAAGAACC
CCTGGAGGTCACTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTGGTCATCCTCAGCTTC
GCCGTTGCGGCGACAAAGCTGGACAGCTGGACTGTCTGGCCTCTCTACTGGAT
TGCTCAAGGAACCATGTTCTGGGCAGTCTTTGTTCTTGGACATGATTGGTAATTT
CACATGATCTTTCTGGTAATGTGGGTTTTCTTTTCTTATTGAAAAAGATTAAAACT
TTTTATCTGGGCTGTTGCATGCAGTGGCCATGGGAGCTTCTCAGACAGTTGGTT
GTTGAACAACGTGATGGGACATATACTCCATTCCTCAATCCTCGTACCTTACCAT
GGATGGTATTGTAACTATTGTTCGATATTCGATTATGATTACTGTTCTTTCAGATGA
AGAATCTGTACCCTAATTGTTTTTTGTTACCAGGAGAATTAGCCACAAGACCCAT
CACCAGAATCACGGCAATGTGGAGAAAGATGAATCCTGGGTTCCAGTAAGTTGA
CATGCAGTTTGCTCTAAAATGCAGAGTCCTCTGTTTTTTGTGTGTTCTTGTGCTT
TAATGACGATGATAATGAAATTGAAATTTGTAATAGCTGCCGGAGAAGGTGTACA
AGAGCTTGGATACCGGCACCAAGTTCATGAGGTTCACCATCCCTCTCCCAATGT
TTGCGTATCCTATCTACTTGGTAAGTAAACAGACTGACTCCAAAGTAGGAACTAA
TGACAATTTTGGACCCGACCTGGTTTGGTTGACTCGGGTCGATATGTTTCGGGT
GGGTAATTACCCGATCTGGCGATGGGTGTGCGGCGGACATTGTCTTGCTCGTG
GTCCACCCCGCTCCCAACCCGCCCCATTCTTGACGAAAAAGATTTCGGAATATG
TATCAACAGAAAAATCTAGTTTTTATGTTACTAGTTTTCTGTATTTCCATGTTTTTTC
CTCAATTCTAGCCGGAATTTGAATTCAAACTGAAATCGGGTAATTCCGTCCATAA
CAAAACGGAATTGGGCAGCCGTAATTAGTTGAAACTAGACCTCAATTTTGGCGG
AATTGGACCCGGCCATTTTTTACGTTTGCAAAACGGAAAACGTTTTTCTTTTGTA
AAGCGCAAAATGAAAAACGTATCTAGTGGAATTATTGGACCCATCTAGAATGGGT
CCAATTCCACCCCAATTTCGGCTCCAATTCATGCCCGGAAAACACTACTGTCAT
GCATTTTAATCTTGTATGGTTTTACCCCAATGGATGCAGCGATGGATCCGGACGA
TTTTTAAAATATTATCGGGTTAAATTTAAAAATATCTTAAAACTATAAGAAAAAAATA
ACCAATTTTAAAGAATAAAAGAACTGGACACATATGACGGGTGTCGTGGATGGAT
GTACTTGTCCCGCTCTATTAAAGGCTGATAATATACAGGTCAACGGTGAATGAAG
GTTAGATGCGCTATTGGATTTGAATCCGATATGAAATGATAATTTTGGACACGATC
TGTTTTGGGTGGGTAATATTTGATCTAGGGATGGCTCGTGCTCCAAACCGCACC
AAAACCGCCTAATTCTCGACCAAAAAGATTTTATGAATACATATCAACAGAAAAAT
CTAGTTTTCATGTTACTAGTTTTATGTACAACAATATTAGGTGTCGTTTTCCCAGC
CTTTTTCTTCAATTCCGGCCGGAATTCGCATTCAAACCGGAATTGGATGGAATCG
GTATACCTCGTCACGGATGCATTGTCAATTCCTAGTTAGTTTCATGGTTTTGAAAC
CAATCAATCTATTCTATATGGTTTTGATTAACAGTGGAGGAGAAGTCCGGGGAAG
AAAGGGTCGCATTTCAACCCATACAGTGACCTGTTCGCACCGAACGAGAGGAC
ATCGGTCATGATTTCGACATTGTGCTGGACAGCCATGGCCTTACTCCTCTGCTA
CTCATCGTTCATCTACGGCTTCCTTCCGGTCTTCAAAATCTACGGCGTCCCTTAT
CTAATATTCGTGGCGTGGCTCGACATGGTGACCTACCTTCACCACCACGGGTAC
GAGCAGAAGCTGCCGTGGTACAGAGGCAAAGAGTGGAGCTACCTACGTGGAG
GGCTGACGACCGTCGATCGAGATTACGGGGTCATCAACAACATCCACCATGACA
TTGGCACCCATGTTATTCACCATCTCTTCCCTCAAATGCCACACTATCACCTAGT
CGAAGCGGTAAGGAGGTCTTGATTATTAACTTAATGTTTTTGTTGTTATAATTTGA
GTCCGATTCTGGAGTCAGGGGATTTCCTTCTTGGATCCGATCCAGGATCAAGCT
GGTCCCTTGAATTTCTATATGATCTTATATTAATTAAGGATAATGTGGTCATATGTTT
TTAAATATTTTTGTTTACCATCATTTTCGATCACCGGAAAATGTCCTGAGCAGTTT
TCCGGTCACTTTAACCTCCATTGACAAATTTTTTCACCCACATGATCACCCTAGC
CGGGTTTACGTTTATTGAAAATTTTTATTTTTTTGAATTTTTTTTCGATGACCAACT
GTACAACTTTGTATTGAAAGTTGTATGGATCATACAAATGTGTATGTACAAAAGTAT
ATTCTAAGTACTATACTAAGCATTACTTAGTATTACGTTTCTACAAACCTATAGAGA
AATGCATACAATTTTGTATAGAACTTAGTATACACGTAGCTGTGAAATGTCAATTTC CCTCCGTATTTTCAGAGACAAGACATGATTTTTAGACTGGCAGATTTTTTTTATCG GATAGATTTCTCCAACTTCAGATTCGGACTGGATTATTAACTATATTATTCATCAAC TCTGACGTTTGATGTTGCATGTGACAGACTCAGGCAGCGAAGCACGTGCTGGG GAAGTACTACAGAGAACCGAAGAAATCAGGGCCTTTCCCATTCCACTTGTTTGG
GTACTTGGTGAGGAGCCTGGGCGAGGATCACTACGTTAGCGATACAGGCGACG TCGTTTTCTATCAATCTGACCCACATATTCCCAAGTTCCCTACCAGTGCCACCAC CAAGTCCAAATCTAGCTGATGATATTGGCTCTGATCTGATGTATGCTGCAGGCTG TTTTATTTTGTCCTTTGTTCGTTTCTTTCTGCCAGAAACAAATTCTCTGTTTCTATG TTTCTCTGTCTCTCCCACCCCAGCTTTCTTTCTGAGTATATCGTATAAAGTTTCAA
GTGATTGTAAGAGCAGAAAAGAAAAGAAGAAGAAGAATAATAA.

Claims (6)

  1. REVENDICATIONS »
    1. Méthode pour accroître la quantité d'acide alpha-linolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum, ladite méthode comprenant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante, caractérisée en ce qu'elle comprend la transformation d’une cellule végétale de Linum usitatissimum avec au moins un acide nucléique qui code pour la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine et est sous le contrôle d'un promoteur assurant la surexpression de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante et la culture de la plante à maturité.
  2. 2. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le au moins un acide nucléique comprend un acide nucléique selon SEQ IO N°l.
  3. 3. Méthode de sélection de plante de Linum usitatissimum, caractérisée en ce qu'elle comprend la recherche d'un allèle du gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine possédant une mutation résultant en un accroissement de la quantité d'acide alpha-linolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum.
  4. 4. Plante de Linum usitatissimum, caractérisée en ce que la teneur, en % en poids, en acide alpha-linolénique (C18;3) de l'huile des graines de la plante est supérieure à 66.7%, que le taux de germination est supérieur à 90% et que le rendement est compris entre 85 et 110% de la valeur de variétés de référence témoins suite à évaluation dans des conditions similaires en France, caractérisée en ce qu'elle comprend une modification du gène de la Δ15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, que la modification du gène de la Δ15 désaturase est une mutation au niveau de la région promotrice dudit gène et que ladite mutation résulte d'un traitement volontaire de mutagénèse par Faction d’agents mutagènes chimiques ou physiques.
  5. 5. Plante selon la revendication 4, caractérisée en ce que le gène comprend la SEQ ID ΝΊ.
  6. 6. Utilisation d'une plante selon l'une des revendications 4 ou 5, ou d'une partie d'une telle plante, pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation humaine ou animale.
    1/1
    M48 X L1 M48 70.4%C18:3 64,2%C18:3 _1 70.4%C18:3
    M48 L3
    70.4%C18:3 X 63.2%C18:3
    Selfing & C18:3 Sélection Selfing & C18:3 Sélection
    Selfing &C18:3 Sélection
    I HT1 I
    F10 Sélection 70.9% C18:3 i_i
    I HT2 F10 Sélection 70.3% C18:3
    I HT3 I
    F10 Sélection 70.1%C18:3 I...................................................................I
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