CN114807217B - Cnr基因及其编码的蛋白质在调控植物果实中类黄酮类化合物合成中的应用 - Google Patents
Cnr基因及其编码的蛋白质在调控植物果实中类黄酮类化合物合成中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了调控CNR基因表达或调控CNR蛋白含量的物质在调控植物果实中类黄酮类化合物合成或制备调控植物果实中类黄酮类化合物合成的产品中的应用。CNR基因可为如下任一种：d1)核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的DNA分子；d2)编码序列是如SEQ ID No.7所示的DNA分子；d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于番茄且编码CNR蛋白的DNA分子；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码CNR蛋白的DNA分子。本发明实施例表明，通过对CNR基因基因进行过表达或敲除可以调控类黄酮类化合物在植物果实中的类黄酮类化合物含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及调控CNR基因表达或调控CNR蛋白含量的物质在调控植物果实中类黄酮类化合物合成或制备调控植物果实中类黄酮类化合物合成的产品中的应用。
背景技术
类黄酮(Flavonoid)是一类在植物界广泛存在的多功能酚类化合物。类黄酮类化合物是吡喃环的衍生物，基本结构单元为一个杂环-吡喃环连接两个芳香环共同组成的C6-C3-C6结构。依据糖苷配基核心的性质可分为以下几大类：查尔酮类(Chalcones)、黄酮醇类(Flavonols)、黄酮类(Flavones)、黄烷醇类(Favandiols)、原花色素类(Proanthocyanidins)、花色苷类(Anthocyanins)和橙酮类(aurones)。
类黄酮类化合物存在于所有陆生植物的各个器官，花、果实和种子的颜色就主要来自类黄酮类化合物。类黄酮类化合物对番茄果实的颜色有重要影响。番茄果皮中最丰富的类黄酮类化合物之一是黄色的柚皮素查尔酮，成熟时它在角质层中积累，并在番茄红素产生之前的破色时期使番茄果实呈现黄色。除了柚皮素查尔酮之外，芦丁和山奈酚芸香苷等化合物也在成熟番茄果实的外果皮中积累。类黄酮类化合物在植物内结构具有多样性，数量分布具有差异性。除了一些特定的基因型外，类黄酮类化合物主要在外果皮中积累，其他组织中类黄酮生物合成基因的表达量较低。
类黄酮类化合物具有多种生物学功能。大多数植物色素是类黄酮类化合物，这些化合物参与生长素的运输调节、有助于植物抵御生物和非生物胁迫，而且与花粉的吸引力和种子的传播密切相关。在番茄果实中，类黄酮类化合物还可以改善角质层的功能，具体表现在影响角质层的刚度和易裂性，并最终影响果实的采后特性。类黄酮类化合物作为一种自由基清除剂，在医疗保健领域也有很大的应用价值，如治疗炎症、心血管疾病和癌症等。
发明内容
本发明的目的之一在于提供CNR基因的应用。
本发明提供了调控CNR基因表达或调控CNR蛋白含量的物质在调控植物果实中类黄酮类化合物合成或制备调控植物果实中类黄酮类化合物合成的产品中的应用。
本发明还提供了CNR基因、CNR蛋白或下述的相关生物材料在调控植物果实中类黄酮类化合物合成或制备调控植物果实中类黄酮类化合物合成的产品中的应用。
所述调控植物果实中类黄酮类化合物合成可为如下至少一种：
(1)调控植物果实中类黄酮类化合物含量，例如提高或降低植物果实中类黄酮类化合物含量；
(2)调控植物类黄酮通路基因表达，例如提过或降低植物类黄酮通路基因表达。
所述类黄酮类化合物可选自柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚芸香苷和芦丁中的至少一种。所述类黄酮通路基因可选自SlMYB12基因、SlCHS2基因、SlCHS1基因、SlCHI3基因、SlF3H基因、SlFLS基因和Sl3GT基因中的至少一种。
所述CNR基因可为如下任一种：
d1)核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的DNA分子；
d2)编码序列是如SEQ ID No.7所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于番茄且编码CNR蛋白的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码CNR蛋白的DNA分子。
所述CNR蛋白可为如下任一种：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质；
(a2)将(a1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加/或截短(翻译提前终止)且具有相同功能的蛋白质；
(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1xSSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
上述应用中，调控CNR蛋白活性或含量的物质可为敲除CNR蛋白的编码基因的物质和/或调控CNR蛋白的编码基因表达的物质。
上述应用中，所述调控CNR基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控CNR基因表达可为抑制或降低CNR基因表达，所述抑制或降低CNR基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(gene knockout)是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述调控CNR基因表达的物质可为抑制或降低CNR基因表达的试剂。所述抑制或降低CNR基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂，例如下述实施例制备的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SlCNR。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本发明还提供了CNR基因的相关生物材料，所述相关生物材料为所述生物材料为下述任一种：
c1)抑制CNR基因表达或降低CNR蛋白含量的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
c8)含有CNR基因的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
可选地，根据上述的相关生物材料，c1)所述的核酸分子为特异sgRNA或表达所述特异sgRNA的DNA分子，其靶点序列如SEQ ID No.1-4中的至少一种所示。
可选地，根据上述的相关生物材料，c2)所述的表达盒为含有表达所述特异sgRNA的DNA分子的表达盒，所述特异sgRNA的靶点序列如SEQ ID No.1-4中的至少一种所示。
可选地，根据上述的相关生物材料，c3)所述的重组载体为含有表达所述特异sgRNA的DNA分子的表达盒，所述特异sgRNA的靶点序列如SEQ ID No.1-4中的至少一种所示，例如下述实施例制备的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SlCNR。
可选地，根据上述的相关生物材料，c8)所述的重组载体为含有SEQ ID No.5所示的DNA分子的载体，例如下述实施例制备的pCAMBIA1300-35S-GFP-SlCNR。
上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本发明还提供了植物育种的方法，所述方法为M1或M2，
所述M1包括提高出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量，得到具有下述至少一种特性的植物：
1)与所述出发植物相比，植物果实中类黄酮类化合物含量降低，
2)与所述出发植物相比，植物类黄酮通路基因表达降低；
所述M2包括降低出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量，得到具有下述至少一种特性的植物：
1)与所述出发植物相比，植物果实中类黄酮类化合物含量增高，
2)与所述出发植物相比，植物类黄酮通路基因表达提高。
可选地，提高出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量的效果。具体可包括：在出发植物中导入CNR基因或含有CNR基因的载体。含有CNR基因的载体例如为下述实施例制备的pCAMBIA1300-35S-GFP-SlCNR。
可选地，降低出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑、CRISPR/Cas9技术编辑等本领域熟知的方法，达到降低出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量的效果。具体可包括用CRISPR/Cas9技术编辑(删除或者替换)出发植物基因组DNA中的CNR基因中的外显子序列。更具体可包括：在出发植物中导入上述特异sgRNA、上述表达特异sgRNA的DNA分子或含有上述表达特异sgRNA的DNA分子的载体。含有上述表达特异sgRNA的DNA分子的载体例如为下述实施例制备的pCAMBIA1300-35S-GFP-SlCNR。
所述导入可为通过化学转化法、遗传转化发或电击转化法等任何已知的转化方法将载体转化至出发植物。导入的核酸分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到出发植物染色体中，也可以是由载体在染色体外表达。
本发明还提供了制备果实类黄酮类化合物含量提高的植物的方法，所述方法为M3、M4或M5，
M3包括用“CTCTCTGGTAGGAGT”替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CTCTCTGGTAGGAAGCTAGT”，得到果实类黄酮类化合物含量提高的植物；
M4包括用“CTCTCTGGTAGGT”替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CTCTCTGGTAGGAAGCTAGT”，用“GTCGGCACATCCTTCTTTGCC”替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“GTCGGCACATCCTTCTTGCC”，并用“CCAGAAGGCGATTCTGTCAGCAAT”替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CCAGAAGCGATTCTGTCAGCAAT”，得到果实类黄酮类化合物含量提高的植物；
M5包括用“CTCTCTGGTAGT”替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CTCTCTGGTAGGAAGCTAGT”，得到果实类黄酮类化合物含量提高的植物。
所述替换为纯合型替换，即同源染色体中发生相同的替换。
上文中，所述植物为茄科植物、番茄属植物或番茄。
本发明实施例表明，CNR基因参与了类黄酮类化合物的合成，通过对CNR基因基因进行过表达或敲除可以调控类黄酮类化合物在植物果实中的类黄酮类化合物含量。在植物中过表达CNR基因，可降低植物果实中的类黄酮类化合物含量。敲除植物CNR基因，可提高植物果实中的类黄酮类化合物含量。
附图说明
图1为实施例1三种纯合CRISPR/Cas9-SlCNR植株的编辑情况。
图2为实施例1Western blot检测CRISPR/Cas9-SlCNR果实中SlCNR蛋白的表达水平。
图3为实施例1 Western blot检测OverExperssion-SlCNR果实中SlCNR蛋白的表达水平。
图4为实施例2芦丁质量浓度-吸光度值标准曲线。
图5为实施例2不同季节AC及CRISPR/Cas9-SlCNR番茄成熟果实的果皮总黄酮含量。
图6为实施例2标准品质谱峰图。
图7为实施例2不同季节野生型AC及CRISPR/Cas9-SlCNR番茄成熟果实果皮的柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚芸香苷和芦丁的含量。
图8为实施例3成熟番茄的外果皮总黄酮含量
图9为实施例3成熟番茄的外果皮中柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚芸香苷和芦丁的含量。
图10为实施例4类黄酮通路关键基因在野生型AC、CRISPR/Cas9-SlCNR、OverExperssion-SlCNR成熟番茄果实中的表达情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特别说明，采用Student’s t.test法进行差异性分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
SlCNR基因genbank登录号为NC_0154392018年8月8日(序列如SEQ ID No.5所示)，SlCNR蛋白genbank登录号为NP_001306237，2020年5月14日(序列如SEQ ID No.6所示)，其CDS核苷酸序列如SEQ ID No.7所示(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001306237.1)。
番茄(Solanum lycopersicum)野生型AC(Ailsa Craig)种子、SlCNR基因编辑(CRISPR/Cas9-SlCNR)番茄种子(记载于Gao et al，2019)、SlCNR基因过表达(OverExpression-SlCNR)番茄种子由本实验室保存，于北京市上庄花卉基地规范种植，待番茄果实成熟(破色7-8天)后，取各株系成熟果实的各组织，液氮速冻后，存于-80℃，用于后续实验。
高保真PCR Mix(金牌Mix)和普通PCR Mix、质粒提取试剂盒、琼脂糖购于北京擎科新业生物技术有限公司。
芦丁(rutin)标准品、山奈酚芸香苷(kaempferol-3-rufinoside)标准品和柚皮素(naringenin)标准品购于Sigma-Aldrich公司，柚皮素查尔酮(naringenin chalcone)标准品购于同田生物公司(http：//www.tautobiotech.com/)。
SlCNR特异性抗体，由本实验室自行制备，制备方法：扩增SlCNR的CDS序列并构建pET30a-His-SlCNR原核表达载体，使pET30a-His-SlCNR原核表达载体表达His-SlCNR融合蛋白，使用镍-琼脂糖凝胶树脂纯化His-SlCNR融合蛋白，用纯化后的His-SlCNR蛋白免疫小鼠获得SlCNR特异性抗血清(免疫方法按常规免疫方法进行)。将抗血清与不同浓度CNR-His纯化蛋白孵育，可检测到6ng的SlCNR蛋白，说明抗体灵敏度达到要求。
下述实施例所使用的SlCNR蛋白质免疫印迹Western Blot检测方法，具体如下。
1.蛋白提取——丙酮法
1)将番茄组织冻样研磨成粉末，称取约0.5g，放入2mL离心管中；
2)加入1.3mL 10％三氯乙酸溶液，剧烈振荡，16000×g，4℃，3min；
3)弃上清，加入1mL 0.1M乙酸铵溶液，涡旋振荡，16000×g，4℃，3min；
4)弃上清，加入1mL 80％丙酮溶液，涡旋振荡，16000×g，4℃，3min；
5)弃上清，放置通风橱15-30min干燥；
6)加入1mL Tris饱和酚，振荡溶液，随后再加1mL A液，混匀，室温静置5min；
7)16000×g，室温，3min，转移上清至新的2mL离心管；
8)加0.1M乙酸铵溶液1mL，混匀，放置于-20℃过夜；
9)16000×g，4℃，3min，弃上清；
10)加入1mL甲醇，振荡，4℃，16000×g，3min，弃上清；
11)加入1mL 80％丙酮溶液，振荡，4℃，16000×g，3min，弃上清；
12)通风橱干燥后，加入100μLSDS buffer溶液，溶解沉淀；
13)BCA法测定蛋白浓度，随后定量加入5×SDS Loading Buffer至1×，100℃沸水浴5min，变性后蛋白置于4℃储存。
丙酮法提取蛋白相关试剂的配制：
1)10％三氯乙酸：500g三氯乙酸中加入227mL蒸馏水，混匀，得到100％三氯乙酸溶液，以100％三氯乙酸∶丙酮＝1∶9[v/v]的比例，配制成10％三氯乙酸溶液；
2)0.1M乙酸铵：称取3.854g乙酸铵，加400mL甲醇，蒸馏水定容500mL；
3)80％丙酮：以水∶丙酮＝1∶4[v/v]的比例，配制成80％丙酮溶液；
4)A液：30g蔗糖，2g SDS，2.42g Tris，5％β-巯基乙醇(现用现加)，用HCl调pH至8.0，蒸馏水定容100mL；
5)SDS buffer溶液：称取Tris 6.05g，SDS 1.4g，用HCl调pH至7.0，蒸馏水定容100mL。
2.蛋白的Westem Blot检测
1)制备浓缩胶为4％，分离胶为10％的两块SDS-PAGE电泳胶；
2)取25μg变性后蛋白上样，电泳设定条件80V、30min，随后120V、60min；
3)将蛋白湿法转膜到硝酸纤维素膜(NC膜)上，转膜条件为4℃、100V、75min；
4)蛋白转膜结束后，用1×丽春红溶液将NC膜染色3min，蒸馏水清洗NC膜，可看到清晰的红色条带，说明转膜成功；
5)确认蛋白及Maker均转上NC膜后，用TBST溶液洗去丽春红染液；
6)将两张膜放入小盒中，分别加入20mL封闭液，室温孵育2h；
7)去除封闭液，分别加10mL新的封闭液，其中一个以1∶10000比例加入SlCNR抗体，另一个以1∶5000比例加入ACTIN抗体，4℃过夜孵育；
8)去除封闭液，用TBST溶液洗3次，时间分别为15min，10min，10min；
9)再分别加入10mL封闭液，均以1∶10000比例加入二抗，室温孵育1h；
10)去除封闭液，用TBST溶液洗3次，时间分别为15min，5min，5min，随后用蒸馏水洗3次，每次5min；
11)用滤纸擦干NC膜，涂上发光液，暗处反应3min，显影仪显影，分析蛋白条带。
SDS-PAGE和Western Blot相关试剂的配制：
1)浓缩胶缓冲液：6.05g Tris，使用HCl将pH调至6.8，蒸馏水定容100mL；
2)分离胶缓冲液：18.15g Tris，使用HCl将pH调至8.8，蒸馏水定容100mL；
3)Tris-甘氨酸电泳缓冲液：3.03g Tris、14.4g甘氨酸、1g SDS，蒸馏水定容1L；
4)转膜缓冲液：3.03g Tris、14.4g甘氨酸，甲醇200mL，蒸馏水定容1L；
5)10％过硫酸铵(AP)：称取0.05g过硫酸铵，蒸馏水0.5mL溶解，现用现配；
6)10％SDS溶液：10g SDS，蒸馏水100mL溶解，室温保存；
7)4％浓缩胶：蒸馏水1.815mL、浓缩胶缓冲液0.75mL、30％丙烯酰胺0.405mL、10％SDS 20μL、10％AP 10μL、TEMED 1.8μL，混匀；
8)10％分离胶：蒸馏水4mL、分离胶胶缓冲液2.5mL、30％丙烯酰胺3.3mL、10％SDS0.1mL、10％AP 50μL、TEMED 6μL，混匀；
9)Tris缓冲盐溶液(10×TBS)：称取8.8g的NaCl，加200mL 1M Tris-HCl(pH＝7.5)溶液，蒸馏水定容1000mL；
11)TBST缓冲液：取100mL Tris缓冲盐溶液(10×TBS)，蒸馏水稀释至1×，再加入500μL吐温20；
12)封闭液：称取2g脱脂奶粉，加入40mL TBST缓冲液，混匀；
13)10×丽春红：称取2g丽春红、30g三氯乙酸、30g磺基水杨酸，蒸馏水定容100mL。
14)5×SDS-PAGE Loading buffer：0.5M Tris-HCl(pH＝6.8)1.2mL、10％SDS2mL、0.5％溴酚蓝、2mL甘油1mL、β-巯基乙醇0.5mL、蒸馏水3.3mL。
下述实施例所使用的番茄成熟果实类黄酮化合物的提取与测定具体如下。
1.类黄酮化合物的提取
番茄果实在成熟时期(破色7-8天)被采摘后，将各组织迅速用液氮冷冻，保存至-80℃冰箱直至测定。测定前将样品冷冻干燥。称取冻干样品0.1g左右于5mL 80％甲醇溶液中，室温条件下提取2h，转速200rpm。将混合物在1400×g离心20min，将上清液倒入15mL容量瓶中。在相同条件下重新提取沉淀物。将上清液合并定容后用于测定总黄酮含量。
2.总黄酮的测定
以芦丁为标准品，采用紫外-可见分光光度法测定番茄果实总黄酮，步骤稍加改动。取0.5mL提取液(即类黄酮化合物的提取中的合并上清液)于试管中，加入蒸馏水0.98mL，加入0.06ml 5％的NaNO2溶液，摇匀后放置6min，加入0.06mL 10％的AlCl3·6H2O溶液，摇匀后放置6min，继续加入2mol/L的NaOH溶液0.4mL，摇匀后放置15min，于510nm处测定其吸光度。总黄酮含量由用芦丁标准品制备的校准曲线进行计算。
3.类黄酮化合物四种单体的测定
待测定的四种单体分别为芦丁(rutin)、山奈酚芸香苷(kaempferol-3-mtinoside)、柚皮素(naringenin)和柚皮素查尔酮(naringenin chalcone)，将标准品分别用色谱级甲醇溶解，-20℃保存母液。标准品与待测样品(即类黄酮化合物的提取中的合并上清液)均过0.45μm尼龙滤膜，流动相配制后超声30min除气。进样前将标准品浓度调整为200ppb，样品稀释10倍。利用超高效液相色谱对样品进行分离，色谱条件如表1所示，流动相梯度如表2所示。高效液相色谱后接质谱进行检测，质谱条件如表3所示，标准品结果如表4所示，每个样品做两次技术重复。根据质谱信息定性，以峰面积外标法定量。
表1超高效液相色谱条件表
表2超高效液相流动相梯度表
表3质谱条件表
表4标准品质谱结果
实施例1、SlCNR基因编辑番茄和SlCNR基因过表达番茄制备
一、SlCNR基因编辑番茄制备
1.SlCNR基因编辑番茄制备
采用CRISPR/CAS9技术制备SlCNR基因编辑番茄，靶点序列如下，划线处为PAM。
T1：5’-CTCTCTGGTAGGAAGCTAGTTGG-3’(SEQ ID No.1)；
T2：5’-GTCGGCACATCCTTCTTGCCAGG-3’(SEQ ID No.2)；
T3：5’-GGTCCAGCTAGTCACGTGACGTC-3’(SEQ ID No.3)；
T4：5’-GGTCTTCGCTAAGACAGTCGTTA-3’(SEQ ID No.4)。
将编码上述靶点序列对应的sgRNA片段采用金门克隆插入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体获得pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SlCNR。采用农杆菌将pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-SlCNR转化至野生型番茄。在通过测序检测获得SlCNR基因编辑植株。具体制备方法参考GaoY，Zhu N，Zhu X F，Wu M，Jiang C Z，Grierson D，Luo Y B，Shen W，Zhong S L，Fu D Q，Qu GQ.Diversityand redundancy of the ripening regulatory networks revealed by thefruitENCODE and the new CRISPR/Cas9 CNR and NOR mutants[J].HorticultureResearch，2019，6(1)：10)。
上述获得的SlCNR基因编辑植株，期间经历无菌播种、外植体获取、预培养、侵染、共培养、抗性筛选、继代培养、生根培养、土壤栽培等过程，收集SlCNR基因编辑(CRISPR/Cas9-SlCNR)番茄种子用于后续实验。
2.基因验证
采用全式金EasyPlant Genomic DNA Kit试剂盒(货号EE111-01)提取基因编辑植株及野生型番茄叶片DNA。
以叶片DNA为模板，参照表5的PCR体系及表6的PCR程序，进行编辑位点的扩增。引物序列为：
正向引物：5’-TTTATCTGGCTTCCTCACTC-3’，
反向引物：5’-TGTTGCTGTTGTACTTTCGT-3’。
测序引物为CNR-T：5’-CTAACAAATGGGAAGGGAAGAGA-3’
取5μL PCR产物进行核酸电泳，得到符合预期大小的600bp左右的PCR产物。将剩余的PCR产物直接送至公司进行测序。
表5 PCR体系
表6 PCR反应程序
将不同编辑株系与野生型进行序列比对，发现各株系均产生纯合基因编辑方式，且编辑方式与其母本相同，slcnr#16、slcnr#22、slcnr#23的具体编辑位置和编辑情况如图1所示，其中划线部分为相应的靶点序列。
slcnr#16的编辑情况为SlCNR基因的第548-552位缺失5个核苷酸。
slcnr#22的编辑情况为SlCNR基因的第547-553位缺失7个核苷酸，第580-581位之间插入一个核苷酸T，第695-696位之间插入一个核苷酸G。
slcnr#23的编辑情况为SlCNR基因的第546-553位缺失8个核苷酸。
基因编辑之后，CNR的DNA序列突变，导致翻译提前终止，蛋白呈现截短。
为了避免后续Cas9蛋白的影响，对纯系编辑的每个植株进行了Cas9基因的PCR验证，所用引物为正向引物：5’-CGACTTCCTCGAGGCCAAGG-3’，反向引物：5’-GGTGATGGACTGGTGGATGAGAG-3’。
选取Cas9-free的植株(slcnr#16、slcnr#22、slcnr#23)用于后续研究。
3.Western Blot验证
提取本实验中用到的三个基因编辑株系，即slcnr#16、slcnr#22、slcnr#23的成熟果实的果皮总蛋白，利用SlCNR特异性抗体，利用Western Blot进行SlCNR蛋白检测。
结果如图2所示，以野生型AC为阳性对照的泳道可以检测出大小为15KD左右的蛋白信号(CNR)，但在三个不同基因编辑(#16、#22和#23)株系的成熟果实果皮中均不能检测出SlCNR蛋白信号，说明实验中所用编辑果实为SlCNR蛋白缺失材料。
二、SlCNR基因过表达番茄制备
1)SlCNR基因过表达载体的构建
将SlCNR基因DNA全长连接至pCAMBIA1300-35S-GFP载体中，生成pCAMBIA1300-35S-GFP-SlCNR过表达载体。
2)SlCNR基因过表达载体转化
将pCAMBIA1300-35S-GFP-SlCNR过表达载体转化至农杆菌GV3101中，利用农杆菌介导的叶盘转化法将该载体转化至番茄叶片外植体中，经过芽诱导、芽伸长、生根后移栽到土中，获得转基因T0代植物。抽提以上T0代植物苗期叶片的基因组DNA，使用Hyg-F/R引物进行PCR扩增和鉴定。上述的引物序列如下：Hyg-F：5′-ATGTTGGCGACCTCGTATTGGG-3′；Hyg-R：5′-CGTTATGTTTATCGGCACTT-3′。能够扩增520bp的片段的T0代植物即为将pCAMBIA1300-35S-GFP-SlCNR过表达载体成功载入的植株，将其命名为T0代阳性植物，即为SlCNR基因过表达株系。
3)Western Blot验证
提取本实施例中用到的两个SlCNR过表达株系，即OE21、OE24的成熟果实的果皮总蛋白，利用SlCNR特异性抗体进行SlCNR蛋白检测。
结果如图3所示，以AC为阴性对照，1和2分别代表SlCNR基因过表达株系(OverExperssion-SlCNR)的不同植株，表明基因过表达番茄的成熟果实中，同时含有植株本底表达的SlCNR蛋白(CNR)及过表达载体表达的GFP-SlCNR蛋白(GFP-CNR)，实验所用植株均为SlCNR基因过表达阳性植株。
实施例2、SlCNR基因编辑番茄的类黄酮化合物检测
一、检测SlCNR基因编辑番茄成熟果实果皮的总黄酮含量
以测定不同浓度(10，20，30，40，50，60，70μg/mL)芦丁标准品溶液在510nm处的吸光值，绘制得到芦丁质量浓度-吸光度值标准曲线(图4所示)。结果显示相关系数R2＝0.9991，大于0.99，说明该线性方程可靠，可用于总黄酮含量计算。
对2019年不同季节收获的AC、slcnr#22和slcnr#23成熟番茄的果皮总黄酮含量进行了测定，根据标准曲线计算结果如图5所示，秋：秋季收获，即当年8-12月生长成熟的番茄；春：春季收获，即当年1-5月生长成熟的番茄；AC为野生型；#22、#23分别表示slcnr#22和slcnr#23。具体数据如表7所示。
表7果皮总黄酮含量的具体数据
结果表明，无论是春季还是秋季收获的番茄，与野生型AC相比，基因编辑植株slcnr#22和slcnr#23的总黄酮含量都有显著的提高，特别是春季的番茄提高两倍多。野生型番茄果实在不同季节总黄酮含量差异不显著，都约为4mg/gDW(Dry Weight，干重)左右，但是春季收获的slcnr#22和slcnr#23的总黄酮含量约为11mg/gDW左右，明显高于6mg/gDW左右的秋季果实。这个结果初步说明SlCNR基因编辑提高了成熟果实总黄酮含量。
二、检测SlCNR基因编辑番茄成熟果实果皮的四种单体含量的变化
为了更加精确的探究类黄酮物质的代谢变化，探究类黄酮化合物单体的变化情况，利用UPLC-MS对番茄果实中含量较高的芦丁(rutin)、山奈酚芸香苷(kaempferol-3-rutinoside)、柚皮素(naringenin)和柚皮素查尔酮(naringenin chalcone)四种单体进行了测定。四种标准品的出峰时间及峰面积积分的结果如图6所示，a为芦丁；b为山奈酚芸香苷；c为柚皮素查尔酮；d为柚皮素，液相分离效果较好，标准品具有较为稳定的出峰时间，且技术重复效果好。
依据标准品质谱峰图，对样品测定后进行分析，结果如图7所示。具体数据如表8-表11所示。
表8果皮柚皮素的含量具体数据
表9果皮柚皮苷查尔酮的含量具体数据
表10果皮山奈酚芸香苷的含量具体数据
表11果皮芦丁的含量具体数据
结果表明，类黄酮单体的变化趋势与总黄酮基本相同，即四种单体在SlCNR基因编辑的番茄果实中含量都显著高于野生型，从而进一步确定了SlCNR对番茄果实类黄酮化合物代谢的影响。无论是春季还是秋季的番茄，与AC相比，基因编辑植株slcnr#22和slcnr#23的四种单体含量都有显著的提高。并且，AC在不同季节的四种单体含量差异不显著，但是春季收获的slcnr#22和slcnr#23的四种单体含量明显高于秋季果实，尤其是芦丁和山奈酚芸香苷增加倍数更为明显，说明这四种单体的在成熟果实中的含量均受到SlCNR的负调控。
实施例3、成熟番茄的外果皮类黄酮化合物检测
对2019春季收获的AC、SlCNR基因编辑番茄slcnr#16和slcnr#23，SlCNR基因过表达番茄OE21和OE24的外果皮(peel)进行取样，分别对总黄酮含量、四种类黄酮单体含量进行测定。
一、SlCNR基因编辑及过表达番茄成熟果实外果皮的总黄酮含量
对SlCNR表达情况不同的三种番茄外果皮的总黄酮含量如图8所示，采用Duncan检验，标有不同字母的数据彼此之间存在显着差异。具体数据如表12所示。野生型AC果实外果皮(peel)的总黄酮含量约为14mg/g DW，显著高于整个果皮(pericarp)的总黄酮含量(4mg/g DW，图5)。
表12外果皮总黄酮含量具体数据
结果表明，SlCNR编辑成熟番茄果实#16和#23的外果皮的总黄酮显著高于野生型，而SlCNR过表达的两个株系的总黄酮显著低于野生型，进一步说明SlCNR对番茄成熟果实外果皮中总黄酮的积累起到负调控作用。
二、SlCNR基因编辑及过表达番茄成熟果实外果皮的类黄酮单体含量
成熟果实外果皮中类黄酮单体含量变化如图9所示，采用Duncan检验，标有不同字母的数据彼此之间存在显着差异。具体数据如表13-表16。
表13外果皮中柚皮素的含量具体数据
表14外果皮中柚皮苷查尔酮的含量具体数据
表15外果皮中山奈酚芸香苷的含量具体数据
表16外果皮中芦丁的含量具体数据
结果表明，各个株系中，都是芦丁和柚皮素查尔酮的含量占据优势。四种单体的变化趋势与总黄酮基本相同，即基因编辑的番茄slcnr#16和slcnr#23中的柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚云香苷和芦丁都显著高于野生型AC，分别有2-7倍的升高。相反，SlCNR基因过表达番茄OE21和OE24中，山奈酚云香苷和芦丁显著的低于野生型AC。进一步说明了SlCNR的存在抑制成熟果实中类黄酮化合物的积累。
实施例4、SlCNR基因编辑及过表达番茄成熟果实外果皮的类黄酮通路基因表达量检测
采用全式金TransZol Plant试剂盒(货号ET121-01)提取AC、SlCNR基因编辑番茄slcnr#16和slcnr#23，SlCNR基因过表达番茄OE21和OE24成熟果实外果皮的RNA，采用反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(货号AT311-02)将其反转录为cDNA，采用实时定量PCR测定类黄酮通路上的8个关键基因的表达量，引物如表17所示，PCR反应体系如表18所示，PCR反应程序如表19所示，采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。分析基因的表达量时以SlACTIN(登录号AB35991)作为内参基因，野生型AC中的表达量为1。利用Microsoft Excel 2013进行数据分析。
SlMYB12基因genbank登录号为NC_015438，2018年8月8日；SlCHS1基因genbank登录号为NC_015446，2018年8月8日；SlCHS2基因genbank登录号为NC_015442，2018年8月8日；SlCHI3基因genbank登录号为NC_015439，2018年8月8日；SlF3H基因genbank登录号为NC_015439，2018年8月8日；SlFLS基因genbank登录号为NC_015448，2018年8月8日；Sl3GT基因genbank登录号为XP 004249447，2018年8月8日。
表17类黄酮通路基因qRT-PCR引物
表18 qRT-PCR反应体系
表19 qRT-PCR反应程序
结果如图10所示，字母a，b，c，d，e代表统计上有显著差异，p＜0.05，对类黄酮通路上的7个关键基因进行测定后发现，slcnr#16和slcnr#23中相关基因发生显著上调，尤其slcnr#23上调更加明显。OE21和OE24的相关基因表达量降低，与野生型AC相比具有显著性差异。其中，类黄酮合成调控关键基因SlMYB12的表达量上升约4-6倍，说明其表达情况受到SlCNR的影响。结合化合物单体的含量可以看出，黄酮合成相关的SlFLS、SlCHS2、SlCHI3、SlF3H和Sl3GT等表达也在SlCNR基因编辑B7时期果实中表达显著升高。因此，随着这些关键基因表达量的升高，主要单体成分的自身含量及其下游产物的含量均有显著升高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> CNR基因及其编码的蛋白质在调控植物果实中类黄酮类化合物合成中的应用
<130> 213474
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctctctggta ggaagctagt tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 23
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<400> 3
ggtccagcta gtcacgtgac gtc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcttcgct aagacagtcg tta 23
<210> 5
<211> 2458
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 5
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ataaacaaag aagaaggtaa tttaagcttg agtgttgatt cattttgtgc aacatatggg 1200
aatcctaata tcaagaacca ataccaataa cacaggcaaa aactaataca tagagacacg 1260
aaagtacaac agcaacaatc aattttatac aatatcctat gcatatcatt tattttatca 1320
taaactgtga aaaagcaaaa gtgagtcttt taaatcgtga tataacaatg aatccaagac 1380
actactggat cttttaatta atccattgac atttctagac tattaacttt gaaatgtggt 1440
tattaagatt atggctacat ccaattaaga gatagttgtt aacctctagg tttccttgtt 1500
atggaacaaa agccaaatca agcaatgatg atgacttctt agaattaatc tcactgtcca 1560
atgggtcttc aagttgacca aaaaaatgtg aataaatatt gctaacatgg agaatggtct 1620
gtatggttgc gatagggctt cttgatcgtc ccttctttag gtagtagaag gtaagcttta 1680
ctccaactga aattgtatac aaaagattct tttgttttct ttgaagggag agacaaatac 1740
tggtaaggga aagaattaac ttttgcacat gcaaacagag attatccttc agacaaattt 1800
tttgttccaa attcatccat ctgacaacga ggtattctaa ataagattct acttcctatg 1860
aaagtatgta gtgtatctaa tcagccaaga aactgtagct gctgccacat ccacagccat 1920
ctcatgtatt ttctaatcag ctgctttcag attcccaagt ataggagtat atcattttct 1980
aatgagcagg ggcaaaacag agcttttaat gtgaattttc aattgttcgc atgatgaggt 2040
gcagatttca tctgttagca gagtttgatg atgctaagag gagttgccga aggcgtttgg 2100
caggtcacaa tgagcgccgc cgtaaaatta catatgactc tcatggagaa aatttgggct 2160
gaagaagcat cagcatcaat ggcagccaaa taacctactt tctgaagcaa cataaacaag 2220
atgtgggtta agcatgctct ctatcttctg tcaattcccg gatttctaag caaattgtta 2280
tttgtgacct tcaagtatct agctaatagt actttcattt cccttgtgta aagggaagga 2340
caaaaagaat aagccgttgg cactgtctgc tagtattcga aaaatgaaat atttgtagta 2400
tgaatgcata tccatgttga cattccaact cactttatga ggtttttatt attatttt 2458
<210> 6
<211> 411
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 6
atggaaacta acaaatggga agggaagaga agcattactg aagctgaaaa ggaagaggat 60
gaacatggaa gtgttgaaga ggatagcaaa agaaaaaggg tattgactct ctctggtagg 120
aagctagttg gtgaagggtc ggcacatcct tcttgccagg tcgatcagtg cactgcagat 180
atggcagatg ccaagccata ccatcgccgc cacaaggtgt gtgagttcca ttcaaagtct 240
ccaatagtac ttattagtgg actccagaag cgattctgtc agcaatgtag cagatttcat 300
ctgttagcag agtttgatga tgctaagagg agttgccgaa ggcgtttggc aggtcacaat 360
gagcgccgcc gtaaaattac atatgactct catggagaaa atttgggctg a 411
<210> 7
<211> 136
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 7
Met Glu Thr Asn Lys Trp Glu Gly Lys Arg Ser Ile Thr Glu Ala Glu
1 5 10 15
Lys Glu Glu Asp Glu His Gly Ser Val Glu Glu Asp Ser Lys Arg Lys
20 25 30
Arg Val Leu Thr Leu Ser Gly Arg Lys Leu Val Gly Glu Gly Ser Ala
35 40 45
His Pro Ser Cys Gln Val Asp Gln Cys Thr Ala Asp Met Ala Asp Ala
50 55 60
Lys Pro Tyr His Arg Arg His Lys Val Cys Glu Phe His Ser Lys Ser
65 70 75 80
Pro Ile Val Leu Ile Ser Gly Leu Gln Lys Arg Phe Cys Gln Gln Cys
85 90 95
Ser Arg Phe His Leu Leu Ala Glu Phe Asp Asp Ala Lys Arg Ser Cys
100 105 110
Arg Arg Arg Leu Ala Gly His Asn Glu Arg Arg Arg Lys Ile Thr Tyr
115 120 125
Asp Ser His Gly Glu Asn Leu Gly
130 135
Claims (7)
1.调控CNR基因表达或调控CNR蛋白含量的物质在调控植物果实中类黄酮类化合物合成或制备调控植物果实中类黄酮类化合物合成的产品中的应用；
所述CNR的氨基酸序列如序列7所示；
所述类黄酮类化合物选自柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚芸香苷和芦丁中的至少一种；
所述植物为番茄。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物果实中类黄酮类化合物合成为如下至少一种：
（1）调控植物果实中类黄酮类化合物含量；
（2）调控植物类黄酮通路基因表达；所述类黄酮通路基因选自SlMYB12基因、SlCHS2基因、SlCHS1基因、SlCHI3基因、SlF3H基因、SlFLS基因和Sl3GT基因中的至少一种。
3.CNR基因、CNR蛋白或相关生物材料在调控植物果实中类黄酮类化合物合成或制备调控植物果实中类黄酮类化合物合成的产品中的应用；
所述相关生物材料为下述任一种：
c1）抑制CNR基因表达或降低CNR蛋白含量的核酸分子；
c2）含有c1）所述核酸分子的表达盒；
c3）含有c1）所述核酸分子的重组载体、或含有c2）所述表达盒的重组载体；
c4）含有c1）所述核酸分子的重组微生物、或含有c2）所述表达盒的重组微生物、或含有c3）所述重组载体的重组微生物；
c5）含有c1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2）所述表达盒的转基因植物细胞系；
c6）含有c1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2）所述表达盒的转基因植物组织；
c7）含有c1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2）所述表达盒的转基因植物器官；
c8）含有CNR基因的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；
所述CNR的氨基酸序列如序列7所示；
所述类黄酮类化合物选自柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚芸香苷和芦丁中的至少一种；
所述植物为番茄。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述调控植物果实中类黄酮类化合物合成为如下至少一种：
（1）调控植物果实中类黄酮类化合物含量；
（2）调控植物类黄酮通路基因表达；所述类黄酮通路基因选自SlMYB12基因、SlCHS2基因、SlCHS1基因、SlCHI3基因、SlF3H基因、SlFLS基因和Sl3GT基因中的至少一种。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：
c1）所述的核酸分子为特异sgRNA或表达所述特异sgRNA的DNA分子，其靶点序列如SEQID No.1-4中的至少一种所示。
6.植物育种的方法，其特征在于：所述方法为M1或M2，
所述M1包括提高出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量，得到具有下述至少一种特性的植物：
1）与所述出发植物相比，植物果实中类黄酮类化合物含量降低，
2）与所述出发植物相比，植物类黄酮通路基因表达降低；
所述M2包括降低出发植物中CNR基因表达和/或CNR蛋白含量，得到具有下述至少一种特性的植物：
1）与所述出发植物相比，植物果实中类黄酮类化合物含量增高，
2）与所述出发植物相比，植物类黄酮通路基因表达提高；
其中，所述CNR的氨基酸序列如序列7所示；
所述类黄酮类化合物选自山奈酚芸香苷和/或芦丁；
所述类黄酮通路基因选自SlMYB12基因、SlCHS2基因、SlCHS1基因、SlCHI3基因、SlF3H基因、SlFLS基因和Sl3GT基因中的至少一种；
所述植物为番茄。
7.制备果实类黄酮类化合物含量提高的植物的方法，其特征在于：所述方法为M3、M4或M5，
M3包括用“CTCTCTGGTAGGAGT”替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CTCTCTGGTAGGAAGCTAGT”，得到果实类黄酮类化合物含量提高的植物；
M4包括用“CTCTCTGGTAGGT” 替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CTCTCTGGTAGGAAGCTAGT”，用“GTCGGCACATCCTTCTTTGCC” 替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“GTCGGCACATCCTTCTTGCC”，并用“CCAGAAGGCGATTCTGTCAGCAAT” 替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CCAGAAGCGATTCTGTCAGCAAT” ，得到果实类黄酮类化合物含量提高的植物；
M5包括用“CTCTCTGGTAGT” 替换番茄基因组DNA中的CNR基因中的“CTCTCTGGTAGGAAGCTAGT”，得到果实类黄酮类化合物含量提高的植物；
所述CNR的氨基酸序列如序列7所示；
所述类黄酮类化合物选自柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚芸香苷和芦丁中的至少一种。
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| CN104619843A (zh) * | 2012-05-24 | 2015-05-13 | A.B.种子有限公司 | 用于使基因表达沉默的组合物和方法 |
| CN108409858A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-08-17 | 天津农学院 | 一种番茄果实转录因子cnr多克隆抗体及其制备方法 |
-
2022
- 2022-05-06 CN CN202210489595.6A patent/CN114807217B/zh active Active
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| Molecular and functional characterization of the SBP-box transcription factor SPL-CNR in tomato fruit ripening and cell death;Tongfei Lai等;Journal of Experimental Botany;第71卷(第10期);摘要，第2997页第1段，第3002页左栏最后1段，第3004页第1段，第3007页最后1段，图9，图S11-S13 * |
| Tongfei Lai等.Molecular and functional characterization of the SBP-box transcription factor SPL-CNR in tomato fruit ripening and cell death.Journal of Experimental Botany.2020,第71卷(第10期),摘要，第2997页第1段，第3002页左栏最后1段，第3004页第1段，第3007页最后1段，图9，图S11-S13. * |
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