CN111676239B

CN111676239B - 甜樱桃PaMADSs基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途

Info

Publication number: CN111676239B
Application number: CN202010581450.XA
Authority: CN
Inventors: 齐希梁; 李明; 刘聪利; 宋露露
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111676239A

Abstract

本发明公开了甜樱桃PaMADSs基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途。本发明系统分析了4个定位在细胞核上的E类MADS‑box蛋白在甜樱桃果实成熟和软化中的作用，发现PaMADS7基因通过ABA信号途径调控甜樱桃果实的成熟和直接激活多聚半乳糖醛酸酶基因的表达而调控甜樱桃果实软化，由此确定PaMADS7基因在调控甜樱桃果实成熟软化中的新用途，本发明还发现PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因具有调控甜樱桃果皮着色的用途。本发明进一步提供了调控甜樱桃果实成熟软化或果实着色的方法。

Description

甜樱桃PaMADSs基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途

技术领域

本发明涉及甜樱桃PaMADSs基因的新用途，尤其涉及甜樱桃PaMADSs基因在调控果实着色或果实成熟软化中的新用途，属于PaMADSs基因的新用途领域。

背景技术

欧洲甜樱桃(Prunus avium L.)是一种重要的经济果树，广泛栽种在全球各地的暖温带地区，果实色泽鲜艳，风味鲜美，营养丰富，含有碳水化合物、蛋白质、维生素、铁、钙、钾等人体必需的营养元素和矿物质等，深受消费者喜爱(Kelley DS,Adkins Y,LaugeroKD.2018.A review of the health benefits of cherries.Nutrients 10,368)。然而甜樱桃果实在成熟过程中容易软化变质，导致果实品质下降、不耐贮藏及货架期短，给果农、中间商和消费者造成严重的经济损失(Zhu D,Liang J,Liu H,Cao X,Ge Y,LiJ.2018.Sweet cherry softening accompanied with moisture migration and lossduring low-temperature storage.Journal of the Science of Food andAgriculture,98,3651-3658)。因此，研究甜樱桃果实成熟软化的作用机理，通过分子标记辅助选择加快培育硬度高的甜樱桃新品种是解决上述问题的重要途径。然而关于调控甜樱桃果实成熟软化的分子机制匮乏，目前仅发现几个基因与甜樱桃果实成熟软化有关(AlkioM,Jonas U,Declercq M.,Van Nocker S,Knoche M.2014.Transcriptional dynamics ofthe developing sweet cherry(Prunus avium L.)fruit:sequencing,annotation andexpression profiling of exocarp-associated genes.Horticulture Research 1,11.)。因此，需要明晰甜樱桃果实成熟软化的分子机理，为提高果实的贮藏能力提供有力的科学依据(Wani AA,Singh P,Gul K,Wani MH,Langowski HC.2014.Sweet cherry(Prunusavium):Critical factors affecting the composition and shelf life.FoodPackaging and Shelf Life 1,86-99.)。

甜樱桃果实成熟软化是一个重要而复杂的过程，涉及到多种生理生化的变化，如叶绿素降解、色素积累、乙烯合成和细胞壁降解等(Giovannoni JJ.2004.Geneticregulation of fruit development and ripening.The Plant Cell 16,170-180.Seymour GB,

L,Chapman NH,Knapp S,Martin C.2013a.Fruitdevelopment and ripening.Annual Review of Plant Biology 64,219-241.)。研究证实果实成熟软化由多基因通过多个代谢途径调控，如乙烯代谢途径、花青素和类胡萝卜素生物合成途径、细胞壁代谢以及一些转录因子，包括ERFs、MADS-box、MYB、NAC、SBP和bHLH(ZhuM,Chen G,Zhou S,Tu Y,Wang Y,Dong T,Hu Z.2013.A new tomato NAC(N AM/A TAF1/2/CUC2)transcription factor,SlNAC4,functions as a positive regulator of fruitripening and carotenoid accumulation.Plant and Cell Physiology 55,119-135.).

MADS-box基因是一个高度保守的转录因子家族，与植物生殖器官发育相关，调控花器官发生、开花时间、胚胎发育和果实发育成熟等(Theiβen G,Melzer R,RümplerF.2016.MADS-domain transcription factors and the floral quartet model offlower development:linking plant development and evolution.Development 143,3259-3271.)。SEPALLATA(SEP)基因家族作为MADS-box家族的一类成员，在果实发育和成熟过程中起重要作用(Karlova R,Chapman N,David K,Angenent GC,Seymour GB,de MaagdRA.2014.Transcriptional control of fleshy fruit development andripening.Journal of Experimental Botany 65,4527-4541.)。迄今为止，SEP亚家族成员是否在甜樱桃果实成熟软化过程中起重要作用，哪一个(或几个基因)起作用，又是如何调控甜樱桃果实软化的分子机理等问题仍属空白，因此亟待需要对樱桃SEP亚家族成员影响果实成熟软化的基因功能及分子机理展开研究，为提高甜樱桃果实的贮藏能力提供新的方向或方法。

发明内容

本发明的主要目的是提供甜樱桃PaMADSs基因在调控果实着色或果实成熟软化中的新用途

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了甜樱桃PaMADSs基因在调控果实着色中的新用途，其中，所述的PaMADSs基因优选是PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因。

本发明提供了一种延迟甜樱桃果实着色的方法，包括：将甜樱桃中PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因进行沉默或抑制其表达，能够有效延迟或抑制甜樱桃果实着色，进而提高甜樱桃果实的贮藏期。

本领域技术人员可以通过常规的沉默基因的方法将甜樱桃中PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因进行沉默或抑制其表达，包括：将PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因的靶基因片段与pTRV2载体可操作性的连接后得到干扰载体，将该干扰载体转化到农杆菌中，再通过农杆菌介导法转化到樱桃组织或细胞中，能够有效沉默甜樱桃中PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因的表达。

相反的，本发明提供了一种促进甜樱桃果实着色的方法，包括：将甜樱桃中PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因在甜樱桃中进行过表达或超表达，能够促进甜樱桃果实着色。譬如：将PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化甜樱桃，使PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因在甜樱桃植物中进行过表达；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，PaMADSs基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

本发明进一步提供了甜樱桃PaMADSs基因在调控果实成熟软化中的新用途，其中，所述的PaMADSs基因优选是PaMADS7基因。

相应的，本发明提供了一种延迟甜樱桃果实成熟软化的方法，包括：将甜樱桃中PaMADS7基因进行沉默或抑制其表达，能够有效延迟或抑制甜樱桃果实成熟软化，进而显著提高甜樱桃果实的贮藏期。

本领域技术人员可以通过常规的沉默基因的方法将甜樱桃中PaMADS7基因进行沉默或抑制其表达，包括：将PaMADS7基因的靶基因片段与pTRV2载体可操作性的连接后得到干扰载体，将该干扰载体转化到农杆菌中，再通过农杆菌介导法转化到樱桃组织或细胞中，能够有效沉默甜樱桃中PaMADS7基因的表达。

本发明通过试验发现，PaMADS2基因、PaMADS4基因、PaMADS7基因的不同的靶标片段的基因沉默效率相差较大，当PaMADS2基因的靶标片段为PaMADS2-1(其核苷酸序列为SEQID NO.1所示)，PaMADS4基因的靶标片段为PaMADS4-2(其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)，PaMADS4基因的靶标片段为PaMADS7-3(其核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示)，基因沉默效率达90％以上。

相应的，含有PaMADS2基因、PaMADS4基因、PaMADS7基因的靶标片段的干扰载体也属于本发明的保护范畴。

更进一步的，本发明提供了一种促进甜樱桃果实成熟软化的方法，包括：将PaMADS7基因在甜樱桃中进行过表达，促进甜樱桃提前成熟软化；譬如：将PaMADS7基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化甜樱桃，使PaMADS7基因在甜樱桃中进行过表达从而促进甜樱桃果实提前成熟软化；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，PaMADS7基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

将所述基因引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将所述基因提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick etal.Plant Cell Reports.1986.5:81-84)。

本发明整体技术方案的详述

本发明针对每个基因(PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5、PaMADS7)分别设计了3条靶标序列；以甜樱桃cDNA为模板分别扩增出4个PaSEPs基因的靶标片段，利用In-FusionTM HDCloning kit(Clontech,Mount-ain View,CA,United States)分别将4个PaSEPs基因的靶标片段构建接到经EcoRI和KpnI双酶切线性化的pTRV2构建上，分别命名为pTRV2-PaMADS2、pTRV2-PaMADS4、pTRV2-PaMADS7和pTRV2-PaMADS5，并转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性菌株，经PCR鉴定，双酶切鉴定和测序正确后，分别将pTRV2-PaMADS2、pTRV2-PaMADS4、pTRV2-PaMADS7和pTRV2-PaMADS5载体转入农杆菌菌种GV3101中备用。甜樱桃果实的VIGS方法参照齐希梁等的方法(齐希梁等，2018)进行，并进行六次生物学重复。

将含有TRV::00(空白对照)和TRV::PaMADS2、TRV::PaMADS4、TRV::PaMADS5、TRV::PaMADS7的农杆菌菌株GV3101分别侵染甜樱桃栽培种‘早大果’。侵染14天后提取果实的mRNA进行半定量PCR检测。结果发现，与TRV::00侵染的甜樱桃果实相比，TRV::PaMADS2、TRV::PaMADS4、TRV::PaMADS5、TRV::PaMADS7侵染的甜樱桃果实中都有1个靶标片段对应的PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5、PaMADS7的表达量显著降低，基因沉默效率达90％以上；这些基因沉默效率达90％以上的靶基因片段分别为PaMADS2-1(SEQ ID NO.1)、PaMADS4-2(SEQ IDNO.5)、PaMADS5-2(SEQ ID NO.8)和PaMADS7-3(SEQ ID NO.12)(图4A)，表明PaMADS2、PaMADS4、PaMADS7和PaMADS5基因分别被有效的沉默。

表型观察TRV::PaMADS2、TRV::PaMADS4、TRV::PaMADS5、TRV::PaMADS7和TRV::00侵染15天和25天后甜樱桃果实的颜色等成熟特征，结果显示：侵染15天和25天后，TRV::PaMADS5侵染的甜樱桃果实与对照TRV::00相比，果实表型没有明显缺陷。与对照相比，TRV::PaMADS2和TRV::PaMADS4侵染的甜樱桃果实15天后，表皮呈浅红色或红色，而TRV::00侵染的果实的表皮颜色呈深红色；侵染25天后，TRV::PaMADS2和TRV::PaMADS4侵染的甜樱桃果实表皮颜色呈深红色，而TRV::00侵染的果实的表皮颜色呈黑红色。与对照TRV::00相比，TRV::PaMADS7侵染的甜樱桃果实15天和25天后，果表皮分别呈浅绿色和黄绿色。上述结果表明，沉默PaMADS2和PaMADS4可延迟果实着色，沉默PaMADS7可显著抑制果实着色和成熟，暗示PaMADS2、PaMADS4和PaMADS7可能参与了甜樱桃果实的成熟调控。

为了确定PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5和PaMADS7是否调控甜樱桃果实成熟。本发明进一步分析了与甜樱桃果实成熟软化的特征指标，包括花青素含量、ABA含量、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)、可溶性固形物和果实硬度。同时还检测分析了与成熟有关的一些基因的表达量，包括ABA合成与降解的关键基因(PaNCED1和PaCYP707A2)，细胞壁代谢相关基因(PG1、EXP和Wiv-1)，花青素生物合成相关基因(PAL、CHI、ANS、DFR)。

测定结果显示，TRV::PaMADS2、TRV::PaMADS4和TRV::PaMADS5侵染的甜樱桃果实中ABA含量、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)、可溶性固形物和果实硬度的特征指标以及PaNCED1、PaCYP707A2、PG1、EXP和Wiv-1基因表达量，与对照TRV::00相比，都没有显著差别。同样地，TRV::PaMADS5侵染的甜樱桃果实的花青素含量及PAL、CHI、ANS和DFR基因的表达量，与对照TRV::00相比，都没有显著差别；然而，与对照TRV::00相比，TRV::PaMADS2与TRV::PaMADS4侵染的甜樱桃果实的花青素含量及PAL、CHI、ANS、DFR基因的表达量都显著降低，表明PaMADS2与PaMADS4基因影响甜樱桃的果皮着色。但是TRV::PaMADS7侵染的甜樱桃果实与对照TRV::00相比，花青素成分、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)、ABA含量和可溶性固形物显著降低，果实硬度显著提高，同时成熟相关的标记基因PaNCED1PG1、EXP、Wiv-1PAL、CHI、ANS、DFR的表达量显著降低，而ABA降解基因PaCYP707A2显著提高。这表明PaMADS7调控甜樱桃果实的成熟软化，而且PaMADS7调节蛋白可能是甜樱桃果实成熟代谢过程中ABA途径上游的蛋白因子。

本发明进一步构建了酵母单杂交载体并验证了PaMADS7直接与PaPG1基因启动子；为了确定PaMADS7是如何调控PaPG1基因的表达，本发明进一步构建了双荧光素酶报告系统，该系统包含PaPG1基因启动子驱动Luc基因表达(萤火虫萤光素酶，为报告基因)和CaMV35S启动子驱动REN基因表达(海肾萤光素酶，为内参基因)的报告载体以及CaMV35S启动子PaMADS7表达的效应载体，通过在烟草中瞬时转化报告载体和效应载体，2天后，使用双荧光素酶报告试剂盒在荧光素酶仪测量LUC和REN的活性。试验结果显示，与空载对照相比，PaMADS7基因表达的效应载体转化的烟草中LUC/REN相对比值显著提高，表明PaMADS7直接激活PaPG1表达。综上表明PaMADS7直接与PaPG1启动子结合并正向调控PaPG1基因表达从而调控甜樱桃果实成熟软化。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“RNA干扰”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1 PaSEPs家族的进化树分析结果。

图2 PaSEPs基因的表达模式分析。

图3 PaSEPs基因的亚细胞定位分析结果。

图4 TRV介导PaMADSs基因沉默的表型观察结果。

图5 PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5和PaMADS7沉默的果实中的花青素含量和花青素合成相关基因的变化。

图6 PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5和PaMADS7沉默的果实中内源可溶性糖成分、可溶性固形物、果实硬度和细胞壁代谢基因表达结果。

图7 PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5、PaMADS7基因沉默的甜樱桃果实中ABA含量和PaNCED1、PaCYP707A2表达分析。

图8外施ABA加快PaMADS7基因被沉默的甜樱桃果实成熟软化结果。

图9 PavMADS7直接正调控PavPG1基因表达结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料及数据处理方法

1.植物材料

欧洲甜樱桃栽培品种“早大果”来自中国农业科学院郑州果树研究所樱桃种质资源圃，砧木为‘ZY-1’，树龄8年，树体生长正常。

ABA处理：TRV::PaMADS7侵染甜樱桃果实7天后，进行外施ABA处理(每个果实注射0.5mM ABA，以注射无菌水作对照)。

2.数据处理

使用Microsoft Excel 2010软件对所获数据处理并绘图；使用SPSS17.0软件进行相关性分析和差异显著性(P<0.05)分析。

试验例1 PaSEPs家族的进化树分析

为了获得甜樱桃果实的SEP亚家族基因成员，本试验分别以拟南芥的四个SEP基因(AtSEP1,AtSEP2,AtSEP3,和AtSEP4)为Query序列，在甜樱桃基因组数据库(http://cherry.kazusa.or.jp/map.html)中进行BLAST寻找，获得4个SEP基因家族成员，分别命名为PaMADS2(Pav_sc0000358.1_g630)、PaMADS4(Pav_sc0000176.1_g060)、PaMADS5(Pav_sc0000091.1_g150)和PaMADS7(Pav_sc0000661.1_g410)，然后利用生物信息学软件MEGA6.0对甜樱桃和其他果树中已经获得的SEP基因的家族成员进行进化树分析。

进化树分析结果显示4个SEP家族成员分别聚类到不同的分枝上，且PaMADS2、PaMADS4、PaMADS7位于一个主枝上，而PaMADS5位于另一个主枝上(图1)。PaMADS2和PaMADS4聚类到SEP4家族中，PaMADS7聚类到SEP1/2家族中，PaMADS5聚类到SEP3家族中(图1)。然而从进化树上看，PaMADS2、PaMADS4、PaMADS7和PaMADS5与其他树种已经报道的SEP家族成员(SlMADS-RIN、MaMADS1、MaMADS2、MdMADS8、MdMADS9和FaMADS9)相聚较远(图1)，无法确定甜樱桃SEP亚家族基因的功能。

试验例2 p-GFP-PaSEP亚细胞定位载体的构建及蛋白定位分析试验

为了确定4个PaMADSs家族的在细胞的何种部位发挥作用，构建了4个PaMADSs家族蛋白在CaMV 35S启动子下启动表达融合蛋白PaMADSs-GFP。以甜樱桃果实的cDNA为模板，设计PaSEPs基因编码区序列的特异性引物PaMADSs-g-F\R(表1)，进行PCR扩增，分别获得4条PaSEPs基因片段(PaMADS2、PaMADS4、PaMADS7和PaMADS5)，利用同源重组的方法分别将4条全长的PaSEPs基因(去除终止密码子)构建到亚细胞定位载体pCAMBIA1302-GFP上Nco I和Spe I酶切位点之间，获得p-GFP-PaSEPs重组载体，电击转化根癌农杆菌，通过农杆菌介导的方法注射本生烟的叶片，2天后，通过荧光共聚焦显微镜观察PaSEPs-GFP的亚细胞位置。

表1引物序列信息。

激光共聚焦显微镜观察发现4个PaMADS蛋白均定位在细胞核中(图3)，由此推测PaMADSs可能是转录因子，在细胞核中发挥作用。

试验例3 PaMADSs基因的靶标基因片段转化甜樱桃果实、基因定量分析及果实成分含量分析试验

1.VIGS-PaSEPs重组载体的构建与VIGS技术瞬时转化甜樱桃果实

pTRV2-PaSEPs载体的构建采用In-Fusion Cloning技术。分别设计带有16个重叠区域(与经EcoRI和KpnI线性化的pTRV2片段互为反向互补的接头)的PaPaSEPs基因特异性引物对PaMADSs-RNAi-F1-3/R1-3(表1)，靶标片段的选择是仅沉默单一PaSEP基因的序列，不沉默其他PaSEPs家族序列。

本试验针对每个基因(PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5、PaMADS7)分别设计了3条靶标序列；其中PaMADS2的3条靶基因序列分别为PaMADS2-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)、PaMADS2-2(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)和PaMADS2-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)；PaMADS4的3条靶基因序列分别为PaMADS4-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)、PaMADS4-2(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)和PaMADS4-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)；PaMADS5的3条靶基因序列分别为PaMADS5-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)、PaMADS5-2(核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)和PaMADS5-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示)；PaMADS7的3条靶基因序列分别为PaMADS7-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)、PaMADS7-2(核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示)和PaMADS7-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示)。

以甜樱桃cDNA为模板分别扩增出4个PaSEPs基因的靶标片段，利用In-FusionTMHD Cloning kit(Clontech,Mount-ain View,CA,United States)分别将4个PaSEPs基因的靶标片段构建接到经EcoRI和KpnI双酶切线性化的pTRV2构建上，分别命名为pTRV2-PaMADS2、pTRV2-PaMADS4、pTRV2-PaMADS7和pTRV2-PaMADS5，并转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性菌株，经PCR鉴定，双酶切鉴定和测序正确后，分别将pTRV2-PaMADS2、pTRV2-PaMADS4、pTRV2-PaMADS7和pTRV2-PaMADS5载体转入农杆菌菌种GV3101中备用。甜樱桃果实的VIGS方法参照齐希梁等的方法(齐希梁等，2018)进行，并进行六次生物学重复。

2.半定量RT-PCR检测和实时荧光定量PCR(qPCR)分析

提取甜樱桃果实样品的总RNA，并反转录成cDNA，以甜樱桃的Histone2(Pav_sc0000671.1)基因为内参，对不同样品的cDNA含量进行调节，然后分别利用PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5、PaMADS7基因特异性引物对PaMADSs-q-F\R(表1)检测沉默后相关PaSEPs基因的表达水平。

qPCR反应在ABI7500PCR热循环仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,UnitedStates)上进行，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)试剂盒进行反应，以甜樱桃的Histone2(Pav_sc0000671.1)基因为内参进行分析。并进行三次生物学重复，取平均值。

表型观察TRV::PaMADS2、TRV::PaMADS4、TRV::PaMADS5、TRV::PaMADS7和TRV::00侵染15天和25天后甜樱桃果实的颜色等成熟特征，结果显示：侵染15天和25天后，TRV::PaMADS5侵染的甜樱桃果实与对照TRV::00相比，果实表型没有明显缺陷(图4B)。与对照相比，TRV::PaMADS2和TRV::PaMADS4侵染的甜樱桃果实15天后，表皮呈浅红色或红色，而TRV::00侵染的果实的表皮颜色呈深红色；侵染25天后，TRV::PaMADS2和TRV::PaMADS4侵染的甜樱桃果实表皮颜色呈深红色，而TRV::00侵染的果实的表皮颜色呈黑红色。与对照TRV::00相比，TRV::PaMADS7侵染的甜樱桃果实15天和25天后，果表皮分别呈浅绿色和黄绿色(图4B)。上述结果表明，沉默PaMADS2和PaMADS4可延迟果实着色，沉默PaMADS7可显著抑制果实着色和成熟，暗示PaMADS2、PaMADS4和PaMADS7可能参与了甜樱桃果实的成熟调控。

3.TRV侵染的甜樱桃果实的果实硬度、可溶性固形物、可溶性糖、花青素含量和ABA含量的测定。

为了确定PaMADS2、PaMADS4、PaMADS5和PaMADS7是否调控甜樱桃果实成熟。我们分析了与甜樱桃果实成熟软化的特征指标，包括花青素含量、ABA含量、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)、可溶性固形物和果实硬度。同时我们还检测分析了与成熟有关的一些基因的表达量，包括ABA合成与降解的关键基因(PaNCED1和PaCYP707A2)，细胞壁代谢相关基因(PG1、EXP和Wiv-1)，花青素生物合成相关基因(PAL、CHI、ANS、DFR)。

果实硬度GY-4型硬度计测定，单位为kg·cm^-2。每次生物学重复随机选取5个果实，每个果实不同部位选2个点测定，并进行三次重复，取平均值。

可溶性固形物含量测定采用手持式糖度仪(PAL-1，爱拓，日本)测定可溶性固形物含量(％)，并重复三次，取平均值。

参考Shen et al.(2017)和Liu et al.(2013)的方法提取并测量甜樱桃果实中的可溶性糖(蔗糖，葡萄糖和果糖)，花青素和ABA含量，并进行六次生物学重复，每次生物学重复进行三次重复，取平均值。

测定结果显示，TRV::PaMADS2、TRV::PaMADS4和TRV::PaMADS5侵染的甜樱桃果实中ABA含量、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)、可溶性固形物和果实硬度的特征指标以及PaNCED1、PaCYP707A2、PG1、EXP和Wiv-1基因表达量，与对照TRV::00相比，都没有显著差别(图6-7)。同样地，TRV::PaMADS5侵染的甜樱桃果实的花青素含量及PAL、CHI、ANS和DFR基因的表达量，与对照TRV::00相比，都没有显著差别(图5-7)；然而，与对照TRV::00相比，TRV::PaMADS2与TRV::PaMADS4侵染的甜樱桃果实的花青素含量及PAL、CHI、ANS、DFR基因的表达量都显著降低(图5)，表明PaMADS2与PaMADS4基因影响甜樱桃的果皮着色。

但是TRV::PaMADS7侵染的甜樱桃果实与对照TRV::00相比，花青素成分、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)、ABA含量和可溶性固形物显著降低，果实硬度显著提高，同时成熟相关的标记基因PaNCED1PG1、EXP、Wiv-1PAL、CHI、ANS、DFR的表达量显著降低，而ABA降解基因PaCYP707A2显著提高(图5-7)。表明PaMADS7调控甜樱桃果实的成熟软化，而且PaMADS7调节蛋白可能是甜樱桃果实成熟代谢过程中ABA途径上游的蛋白因子。

试验例4外施ABA加快PaMADS7基因被沉默的甜樱桃果实成熟软化试验

试验例3已经证实沉默PaMADS7基因的甜樱桃果实中ABA含量显著降低。为了进一步确定PaMADS7与ABA在甜樱桃果实成熟过程中的关系，本试验研究了在TRV::PaMADS7侵染的甜樱桃果实7天后，通过外源施加ABA否能将PaMADS7沉默的果实表型恢复到野生型。有趣的是，与ABA未处理的对照相比，ABA处理的TRV::PaMADS7侵染的甜樱桃果实中PaMADS7基因的表达量显著上调；而且ABA和花青素含量显著升高，果实硬度降低(图8)。同时ABA合成基因PaNCED1和PaNCED2以及细胞壁代谢相关基因PaPG1、PaEXP1和PaWiv-1的表达量显著上调，而PaCYP707A2基因的表达量显著下调(图8)。上述研究结果表明，外施ABA可以挽救沉默PaMADS7基因抑制果实成熟的缺陷表型，暗示PaMADS7位于ABA信号通路的上游，是通过调控ABA水平，进而在ABA介导的果实成熟软化中发挥重要的作用。

试验例5酵母单杂交载体构建与验证PaMADS7直接与PaPG1基因启动子结合试验

为明确PaMADS7蛋白如何影响甜樱桃果实软化，本试验构建了甜樱桃数据库中的PaPGs基因家族(PaPG1-5)启动子的诱饵融合载体pAbAi-PaPGs，转入Y1HGold菌株中构建诱饵菌株，检测鉴定正确后，将诱饵菌株Y1HGold(pAbAi-PaPGs)制作感受态。然后将PaMADS7基因全长构建到pGADT7载体，经酵母转化分别转入Y1HGold(pAbAi-PaPG1-5)菌株的感受态中，涂布在含有400ng/mL AbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上，观察酵母菌斑的生长情况。

本试验分别设计PaPG1-5基因特异性引物对PaPGs-Pro-F/R(表1)，以甜樱桃DNA为模板，扩增PaPG1-5基因的启动子片段，然后通过同源重组的方法克隆到pAbAi载体中，产生pAbAi-PaPG1-8重组质粒，将pAbAi-PaPG1-5重组质粒线性化，转入Y1HGold菌株中，并制作成感受态Y1HGold(pAbAi-PaPG1-5)。将PaMADS7基因全长构建到pGADT7载体上，形成pGADT7-PaMADS7重组质粒。将pGADT7-PaMADS7重组质粒分别转化到含有pAbAi-PaPG1-5的Y1HGold菌株的感7受态中，涂布在含有400ng/mL AbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上，观察酵母菌斑的生长情况。每隔培养组合至少进行四次生物学重复。

试验结果发现，PaMADS7经Y1HGold(pAbAi-PaPG1)酵母转化后，酵母菌斑在含有400ng/mL AbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上正常生长，并且稀释一定倍数后，酵母菌斑个数逐渐减少，而PaMADS7经Y1HGold(pAbAi-PaPG2-8)酵母转化后的酵母菌斑在含有400ng/mLAbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上不能正常生长(图9B-C)。试验结果表明PaMADS7直接与PaPG1基因启动子结合。

试验例6双荧光素酶报告试验

为了确定PaMADS7是如何调控PaPG1基因的表达，本试验构建了双荧光素酶报告系统，该系统包含PaPG1基因启动子驱动Luc基因表达(萤火虫萤光素酶，为报告基因)和CaMV35S启动子驱动REN基因表达(海肾萤光素酶，为内参基因)的报告载体以及CaMV35S启动子PaMADS7表达的效应载体，通过在烟草中瞬时转化报告载体和效应载体，2天后，使用双荧光素酶报告试剂盒在荧光素酶仪测量LUC和REN的活性。

设计特异性引物PaPG1-Pro-F/R(表1)扩增PaPG1启动子序列，通过同源重组方法插入到pGreenII 0800-LUC载体中生成报告质粒。类似地通过同源重组方法将PaMADS7编码序列克隆到pGreenII 62-SK载体中作为效应质粒。将含有效应质粒和报告质粒的根癌农杆菌GV3101共转化烟草叶片。通过在烟草中瞬时转化报告载体和效应载体，2天后，使用双荧光素酶报告试剂盒在荧光素酶仪测量LUC和REN的活性。双荧光素酶报告实验至少进行了四个生物学重复。

试验结果显示，与空载对照相比，PaMADS7基因表达的效应载体转化的烟草中LUC/REN相对比值显著提高(图9E))，表明PaMADS7直接激活PaPG1表达。综上表明PaMADS7可直接与PaPG1启动子结合，并正向调控PaPG1基因表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 甜樱桃PaMADSs基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途

<130> HN-2002-200517A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 281

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

aggttgccct cattattttc tccagtcgtg gcaaacttta tgaattctgt agcagtttga 60

gcatgctgaa aacgcttgaa aagtaccaaa ggtgcagcta tggctccctg gaagccaaca 120

aaccagtcaa tgagactcag aacagctatc aggaatatct gacgctgaaa gccagagtgg 180

aggtcctcca acaatctcaa agaaaccttc ttggggaaga tttggcccca ctgaacacaa 240

aggagcttga gcagcttgag catcaactgg aggcatcctt g 281

<210> 2

<211> 265

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

ggagcttgag cagcttgagc atcaactgga ggcatccttg aaccaaatta ggtcaacaaa 60

gactcagttt atgcttgatc agctttgtga tctccagaac aaggaacaaa tgctagttga 120

agctaacaaa gccttgagga ggaagatgga agaaactagt gggcaagctc cacctctatt 180

ggcatgggaa gctgctggcc atggccacaa caatgttcag catactcgcc ttcctcatca 240

tcctcactca caaggcttct tccat 265

<210> 3

<211> 284

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

cactcacaag gcttcttcca tccattggga aacaactcca cttcccaaat tggatacacc 60

cctttgggtt cagatcatca tgatccaatg aatgttggaa atcatggcca acatgtgaat 120

ggattcattc ctgggtggat gctttaactt tgatttcgca tgatcaagat gccaagatgt 180

ggcgaataaa atacatgtag cggaccatca tctcatgttg gatggagctt ttcttttttg 240

gttgattgta atcttctttc tatgccatgc aacatgtaat tagt 284

<210> 4

<211> 215

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

gccaaagcta aggaacaccc aaccaacaga gaaattaatt atgggaagag ggaaggtgga 60

gctgaagagg atcgagaaca acataaaccg acaggtgaca ttcacaaaaa gaagaaatgg 120

gttgctaaag aaggcgtacg agctctcagt tctatgtgat gctgaggttg ctcttgtcgt 180

cttctccacc cgcggcaagc tctatgagtt ctgca 215

<210> 5

<211> 307

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

gcaagctcta tgagttctgc agcggctcta gcatggagaa gacacttgag aggtatcaaa 60

gatgcagtta tagtgcattg gaagcgagtc aacctgctca ggattcacag agcagatacc 120

aagattatgt gaacctaaaa gcaaaagtag aggtcctaca gcgcacgcag agaaattttc 180

ttggggaaga tttgggtcat ttaggcacca aggagctcca gcagcttgag aatcaactcg 240

acatgtcctt gaggcaaatc aggtcaacaa agacccaagt tatgcaaggt cagatatctg 300

atcttct 307

<210> 6

<211> 279

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

ggtcagatat ctgatcttct gaggaaggaa cagatgctgc tggaagcaaa caatgaactg 60

agaaggaagc tggaagaatg taacgcagcc attgaaagat attcatggac aactaaggag 120

caaaatcaaa atgctcaatt tgagggattc cttgaccatt cacaatgcaa caatacattg 180

cagatcggct acaatcctcc tgcagtaaca gatcatcatg agctacaatc ctcaacgcaa 240

agtcatagtg gattattcgt ccctgggacg tggatgctc 279

<210> 7

<211> 200

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 7

agagtggagc tgaaaaggat tgagaacaag atcaacaggc aggtgacctt tgcgaagaga 60

aggaacgggc ttttgaagaa agcctacgag ctttccgttc tttgcgaggc tgaggttgct 120

ctcatcatct tctccaatag aggaaagctg tacgagtttt gcagtagctc aagcatgctc 180

aaaactcttg agaggtacca 200

<210> 8

<211> 340

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 8

cgttctttgc gaggctgagg ttgctctcat catcttctcc aatagaggaa agctgtacga 60

gttttgcagt agctcaagca tgctcaaaac tcttgagagg taccagaagt gcaactatgg 120

agcaccagag acaaatgtat ctgcaaggga ggccttggaa ttgagtagcc agcaggagta 180

tttgaagctc aaggcacgtt atgaagccct acaacgaaac caaaggaatc ttcttggaga 240

agatcttggc cctttaagca gcaaagagct tgaatcactt gaaaggcagc tggatatgtc 300

actgaagcag atcagatcga cacggaccca atacatgctg 340

<210> 9

<211> 291

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 9

cgacacggac ccaatacatg ctggatcagc tcacagatct tcagcgaaag gagcacatgc 60

taaatgaagc aaataagacc ctgaaacaaa ggttgtttga gggataccat gtaaattcac 120

tccaaatgaa tccaaatgct gacgagtacg gccggcaaca agctcaagct cacggcgatg 180

gcttcttcca tcccttagac tgcgagccga cgttacagat tggataccag aacgatccaa 240

tatcagtggt cacagcaggt ccaagcgtga gtaattacat ggcaggatgg t 291

<210> 10

<211> 241

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 10

atggggaggg gaagagtgga actcaagagg atagagaaca agataaacag gcaagtcaca 60

tttgcaaaga gaagaaatgg gcttctgaag aaagcctatg agctctctat tctctgtgat 120

gctgaggttg ctctcatcat cttctctaac cgtggcaagc tctatgagtt ctgtagcagc 180

tctagcatac tcaaaacact ggaaaggtac cagaagtgca gttatggtca agtggaagtc 240

a 241

<210> 11

<211> 239

<212> DNA

<213> Artifical sequencei

<400> 11

gttatggtca agtggaagtc aacaaacctg ccaaggaact tgagagcagc taccgcgagt 60

acttgaaact gaaaggtcga tttgagtccc tacaacgaac tcagagaaac cttcttggag 120

aagacttggg tcccttaaac acaaaggagc ttgagcagct tgagcgtcaa cttgagtcct 180

ccttgaagca agttaggtcc actaagactc agtatatgct ggaccaactt tctgacctt 239

<210> 12

<211> 250

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 12

gtatatgctg gaccaacttt ctgaccttca aaataaggaa cagatgttaa tagaagcaaa 60

cagggatttg acattgaagt tggatgacat tagttcaaga aaccaaatta gacaatcatg 120

ggaaggtgga aaccaggggg gtatggcata tgggacccag catgctcaat ctcaagggtt 180

cttccagccc ttggattgca atcccacctt gcaaataggg tactctaatg tggggtcaga 240

gcagatgagt 250

Claims

1.一种延迟甜樱桃果实成熟软化的方法，其特征在于，包括：将甜樱桃中PaMADS7基因进行沉默或抑制其表达；将PaMADS7基因的靶基因片段与pTRV2载体可操作性的连接后得到干扰载体，将该干扰载体转化到农杆菌中，再通过农杆菌介导法转化到樱桃组织或细胞中；所述PaMADS7基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示。

2.一种延迟甜樱桃果实着色的方法，其特征在于，包括：将甜樱桃中PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因进行沉默或抑制其表达；将PaMADS2基因、PaMADS4基因或PaMADS7基因的靶基因片段与pTRV2载体可操作性的连接后得到干扰载体，将该干扰载体转化到农杆菌中，再通过农杆菌介导法转化到樱桃组织或细胞中；其中，所述PaMADS2基因的靶基因片段为SEQ ID NO.1所示；PaMADS4基因的靶基因片段为SEQ ID NO.5所示；PaMADS7基因的靶基因片段为SEQ ID NO.12所示。