TWI607085B - 操縱聚果糖生合成及提高植物生質量之技術 - Google Patents

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Description

操縱聚果糖生合成及提高植物生質量之技術 發明領域
本發明係有關於植物內的聚果糖生合成之修飾，以及，更特別地，有關於操縱光合細胞中的聚果糖生合成的方法，以及有關於相關的核酸和建構物。
本發明亦有關增加植物生質量，以及，更特別地，有關於提高生質量產量及/或產量穩定性的方法，包括：植物內的嫩芽及/或根部的成長，以及有關於相關的核酸和建構物。
 發明背景
聚果糖為一類型的水溶性碳水化合物，其等之主要的功能是要提供為了植物生長保留之容易得到的能源。聚果糖係與草類之各種各樣的有利的特徵有關聯的，例如：寒冷與乾旱的耐受性、增加的分蘗存活(tiller survival)、提高的殘存率(persistence)、在切割或放牧之後的良好的再生長、自壓力之改善的復原性、早春生長以及增加的營養品質。
草類與穀類植物內的聚果糖合成及新陳代謝是複雜的。聚果糖係由附著至蔗糖的直線的或分支的果糖鏈所組成。植物聚果糖的鏈長度範圍落在3個高至數百個果糖單元。不同類型的聚果糖能根據存在的連接類型予以區分。於多年生黑麥草(perennial ryegrass)中已經辨識出3個類型的聚果糖：胰島素、菊糖新生系列(inulin neoseries)和左聚醣新生系列，以及涉及此聚果糖的特性之四種果糖轉移酶(FT)酵素。該酵素1-SST(蔗糖：蔗糖1-果糖轉移酶)催化聚果糖生合成之第一步驟，同時剩餘的酵素使生長的果糖鏈(1-FFT：聚果糖：聚果糖1-果糖轉移酶、6G-FFT: 6-葡萄糖果糖轉移酶，以及6-SFT：蔗糖：果糖6-果糖轉移酶)延長。該等酵素1-FEH或6-FEH(果糖外水解酶(fructoexohydrolase))係藉由釋放果糖分子來減少聚果糖鏈的長度。
細菌僅使用一種FT酵素，其含有1-SST與1-FFT活性二者，以合成高分子量聚果糖聚合物。多數的細菌的果糖轉移酶生產左聚醣類型的聚果糖(左聚糖蔗糖酶)，其係特徵在於果糖分子之β-2,6連接，縱然已經自一些細菌單離出會生產胰島素型(β-2,1連接)之聚果糖的菊粉蔗糖酶(inulosucrases)。
已經於基因轉殖的植物中表現至少3種細菌左聚糖蔗糖酶，包括：來自枯草桿菌的SacB基因、來自液化澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的SacB基因，以及來自變種鏈球菌(Streptococcus mutans)的FTF基因。植物內此等細菌左聚糖蔗糖酶的表現導致數千DP之非常高分子量聚果糖的合成(關於回顧參見Cairns，2003)。
聚果糖代表15%的植物物種內之主要的非結構性碳水化合物以及在草料的品質上扮演關鍵的角色。放牧高的聚果糖飲食之反芻家畜顯示出改良的動物表現。
於草類中，莖與葉鞘內之聚果糖的位準及組成已經透過經改造的FT基因的表現而增加。
然而，藉由操縱途徑中的酵素的活性來操縱生化途徑可以是困難的，因為各種各樣的酵素以及其等的基質可以互相作用的方式。
因而，擁有改良的操縱生化途徑的方法會是所欲的，特別地於植物內。舉例而言，擁有操縱植物內的聚果糖生合成的方法會是所欲的，包括：牧草物種，例如，黑麥草、牛毛草(Festuca)，和臂形草(Brachiaria)；甘蔗和其他的草；以及高梁和其他的穀類植物，例如，小麥和玉蜀黍；藉此促進以下的生產，舉例而言：‧具有改良的牧草品質及/或產量之牧草，導致改良的放牧地的產生、改良的動物的產生及/或降低的環境污染；‧具有提高的生質量產量之能源草類與作物，例如：柳枝稷(switchgrass)、芒、高梁(穀類、草料和能源高梁)、甘蔗和能源甘蔗，例如用於生物乙醇的生產；以及‧具有增加的穀粒及/或生質量產量之穀類植物，例如：小麥、米、玉蜀黍、大麥。
已經單離出某些物種的植物之核酸序列，其等編碼一些涉及聚果糖生合成途徑之酵素。舉例而言，本申請人的PCT/AU01/00705說明了來自黑麥草和牛毛草的果糖轉移酶的同源物。然而，對於植物內的聚果糖生合成之修飾有用的材料繼續存在一需求，以及對改造不同的植物的部分內之聚果糖的累積也存在一需求。
國際專利申請案PCT/AU2009/001211說明了對於植物內之修飾的聚果糖生合成有用的建構物。然而，該等建構物較佳地包括一融合基因，其編碼2或更多個聚果糖生合成酵素之轉譯融合，組成融合的該等基因較佳地對應於植物的聚果糖生合成基因。
本發明的一目的是要克服，或是至少減輕與先前技藝有關聯的困難或不足的一或更多個者。
 發明概要
申請人發現到以下是可能的：藉由使用一建構物而於光合細胞中的聚果糖生合成的途徑之空間的改編來營養提升植物(如：牧草)及/或增加植物生質量，該建構物包括一啟動子，或其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一基因，其編碼一細菌FT酵素，或是其之功能性活性片段或變異體。使用此加工，驅動聚果糖的累積於葉片內是可能的，葉片此植物的器官為家畜主要吃的，以及葉片通常不會累積聚果糖。因而，聚果糖(尤其顯示出高的聚合程度(‘高DP聚果糖’)之該等)的累積提供放牧動物更易得到的營養。聚果糖累積在莖與葉鞘內，且葉聚果糖只有在CO2同化作用勝過生長的期間內形成。牧草可以藉由令合成蔗糖的光合細胞中的聚果糖基因表現而營養提升，因此驅動了聚果糖優先地在葉片內累積以及提供了更多的能源給放牧家畜。
牧草中的聚果糖顯著地貢獻了放牧反芻動物的飼料中之容易可得到的能源。瘤胃中的發酵過程要求相當多容易可得到的能源。瘤胃中的容易可得的能源之改良能增加瘤胃消化的效率。瘤胃消化之增加的效率會導致餵養給反芻動物之草料蛋白質之改良的轉化成為牛奶或肉，以及會導致含氮的廢料之減少。
申請人亦已發現到本發明的方法可以藉由改編光合細胞而促進延長的壽命，舉例而言，藉由延遲葉子的衰老，以協助增加植物生質量。
申請人已發現到包括一基因之建構物，該基因編碼一細菌FT基因，或是其之功能性活性片段或變異體，可以提供一建構物優秀的結果，其包括編碼2或更多個聚果糖生合成酵素的轉譯融合之融合基因。使用，舉例而言，含有1-SST與1-FFT活性二者的一細菌FT基因，比起融合個別的基因，可以是在技術上較不困難的，以及可以導致一建構物，其比包括融合基因之建構物更容易被導入至植物內及/或執行的更好。
舉例而言，藉由表現一細菌FT基因，例如，含有1-SST與1-FFT活性二者，可以減輕與此等基因獨立地併入至該植物基因組內的表現模式之相關聯的困難之問題，導致蔗糖分子直接地轉化成聚果糖，其等顯示出低的聚合程度(‘低DP聚果糖’)以及高的聚合程度(‘高DP聚果糖’)。再者，FT蛋白質可以形成有效的聚果糖生合成之新陳代謝通道。
光合細胞中之FT基因的表現導致光合細胞中低的和高的DP果糖的累積，此可以導致放開了光合作用的抑制機轉，促進太陽能的捕獲以及增加的CO2固定。
因而，申請人已經發現到改編光合細胞用於延長的壽命以及提高的聚果糖生合成可促進太陽能的捕獲以及增加植物生質量的生產，包括嫩芽及/或根部的成長。
再者，因為低的和高的DP果糖的累積已經與植物對非生物性壓力(例如，寒冷與乾旱)之耐受性有關聯；以及因為提高的根部的成長和延遲的葉子的衰老亦已經牽連植物之乾旱壓力的耐受性，所以改編光合細胞用於延長的壽命以及提高的聚果糖生合成可以促進產量穩定性和植物之非生物性壓力的耐受性。
於是，於一態樣中，本發明提供了一種操縱一植物的光合細胞中的聚果糖生合成的方法，該方法包括：將有效量的基因建構物導入至該植物之內，該基因建構物包括一啟動子，或是其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一核酸，其編碼一細菌果糖轉移酶(FT)酵素，或是其之功能性活性片段或變異體。
關於‘操縱聚果糖生合成’一般而言意指於一轉形的植物內之增加的聚果糖生合成，相對於未轉形之對照植物。然而，關於一些申請案，相對於未轉形之對照植物，使該轉形的植物內的聚果糖生合成下降或者不然修飾該轉形的植物內的聚果糖生合成可以是所欲。舉例而言，相對於未轉形之對照植物，使該轉形的植物內之聚果糖生合成途徑中之某些酵素的活性增加或減少可以是所欲的。
關於‘光合細胞’係意指發生光合作用之一植物的該等細胞。此等細胞一般而言含有色素葉綠素以及不然知道為綠色的細胞。多數的光合細胞係被包含於植物的葉。較佳地，本發明的基因建構物係表現於維管束鞘細胞之內，更佳地於葉肉的及/或薄壁組織維管束鞘細胞內。
關於‘有效量’係意指足夠以於該植物內，或是於一植物、植物種子或從該處衍生的其他植物部分導致可辨識出的表現型性狀的量。此等的量能由適當地有技能的人考慮到植物的類型、投藥的途徑以及其他的相關因素而容易地決定。此一人會容易地能夠決定適合的量以及投藥的方法。參見，舉例而言，Maniatis等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor，其之整體揭示係併入本文中作為參考資料。
關於‘基因建構物’係意指一重組型核酸分子。
關於‘啟動子’係意指一核酸序列，其足以指導一操作地連接的核酸序列之轉錄。
關於‘操作地連接’係意指該(等)核酸和一調節序列(例如，一啟動子)係被連接，以此一方式使得該核酸於適合的條件下得以表現，舉例而言，當適合的分子(例如，轉錄活化子蛋白質)係被結合至該調節序列時。較佳地，一操作地連接的啟動子係在有關聯的核酸之上游。
關於‘上游’係意指沿著該核酸的3’->5’的方向。
關於‘核酸’係意指能夠攜帶遺傳資訊之核苷酸的鏈。該術語一般而言係提及基因或是其之功能性活性片段或變異體以及或者該有機體之基因組內之其他的序列，其影響其之表現型。術語‘核酸’可以包括DNA(例如，cDNA或基因組DNA)以及RNA(例如，mRNA或微RNA)，其為單股的或者雙股的，選擇性地含有合成性、非天然的或者經改變的之核苷酸的鹼基，合成性核酸及其等之組合。
關於‘編碼一細菌果糖轉移酶(FT)酵素的核酸’或者‘細菌果糖基轉移酶基因’係意指編碼通常存在於一細菌內的酵素的核酸，其藉由自含有蔗糖的糖類將果糖基部分轉移至受體分子來催化寡及/或多聚果糖之合成。該細菌FT酵素可以包括左聚糖蔗糖酶活性及/或生產左聚醣(levan)型的聚果糖。該細菌FT酵素可以包括菊粉蔗糖酶活性及/或生產胰島素型聚果糖。一較佳的細菌FT可以包括蔗糖：蔗糖1-果糖轉移酶(1-SST)以及聚果糖：聚果糖1-果糖轉移酶(1-FFT)酵素活性二者。可以使用SacB、Lsc或者FTF基因。SacB或者Lsc基因為特別佳的。
關於和啟動子有關的‘功能性活性片段或變異體’係意指能夠指導操作地連接的核酸之轉錄的片段或變異體(例如：類似物、衍生物或者突變體)。此等變異體包括天然存在的對偶基因的變異型以及非天然存在的變異型。該等核苷酸的一或更多者之添加、刪失、取代以及衍生化為預期的，只要修飾不會導致該片段或變異體的功能活性損失。較佳地，該功能性活性片段或變異體具有該片段或變異體所對應之以上提及的序列之相關的部分之至少大概80%的同一性，更佳為至少大概90%的同一性，甚至更佳為至少大概95%的同一性，最佳為至少大概98%的同一性。較佳地，該片段具有至少20個核苷酸的大小，更佳地至少50個核苷酸，更佳地至少100個核苷酸，更佳地至少200個核苷酸，更佳地至少300個核苷酸的大小。
關於和編碼一細菌FT酵素的核酸有關的‘功能性活性’係意指該片段或變異體(例如：類似物、衍生物或者突變體)能夠藉由本發明的方法於植物內操縱聚果糖生合成，舉例而言，藉由被轉譯成能夠參與聚果糖生合成途徑的一酵素。此等變異體包括天然存在的對偶基因的變異型以及非天然存在的變異型。該等核苷酸的一或更多者之添加、刪失、取代以及衍生化為預期的，只要修飾不會導致該片段或變異體的功能活性損失。較佳地，該功能性活性片段或變異體具有該片段或變異體所對應之以上提及的序列之相關的部分之至少大概80%的同一性，更佳為至少大概90%的同一性，甚至更佳為至少大概95%的同一性，最佳為至少大概98%的同一性。此等功能性活性變異體及片段包括，舉例而言，具有的守恆性核酸變化之該等。
關於‘守恆性核酸變化’係意指核酸取代，其等導致編碼的蛋白質內之胺基酸的守恆，由於遺傳密碼的簡併。此等功能性活性變異體及片段亦包括，舉例而言，具有核酸變化之該等，該核酸變化導致對應的胺基酸序列中的一或更多個殘基之守恆性胺基酸取代。
關於‘守恆性胺基酸取代’係意指由相同等級的另一者之胺基酸的取代，該等等級如下：
非極性的：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met Phe、Trp
未荷電極性的：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性的：AspGlu
鹼性的：Lys、Arg、His
如下也可以做出其他的守恆性胺基酸取代：
芳香族的：Phe、Tyr、His
質子予體：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
質子受體：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
特別佳的片段和變異體包括一或更多個守恆的蔗糖結合/水解領域。此等領域的實例係顯示於第1圖中以及包括LDVWDSWP、QEWSGSA、LRDPH和DEIER。
特別佳的片段和變異體包括一催化核心。關於“催化核心”係意指該多肽之內部的區域，不包括信號胜肽以及N端可變異區和C端可變異區，該內部的區域含有守恆的蔗糖結合及/或水解領域。催化核心的一實例係顯示於第1圖中以及可以包括來自枯草桿菌的SacB蛋白之胺基酸殘基65-468。
特別佳的片段和變異體包括缺少一信號胜肽之該等。關於“信號胜肽”係意指一N端信號序列。一信號胜肽的實例係顯示於第1圖中以及可以包括來自枯草桿菌的SacB蛋白之胺基酸1-27。
特別佳的片段和變異體具有適應用於植物之密碼子使用，包括用於單子葉植物與雙子葉植物的轉譯起始。
特別佳的片段和變異體具有去活化的或者移除的隱藏的剪切位址及/或RNA去穩定序列要素。
較佳地，編碼一細菌FT的核酸係從來自一細菌物種之基因或複數個基因予以單離或是對應於來自一細菌物種之基因或複數個基因，該細菌物種係選自於以下所構成的群組：桿菌、乳酸桿菌以及鏈球菌，包括：枯草桿菌、液化澱粉芽胞桿菌、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)及變種鏈球菌。甚至更佳地，編碼一細菌FT酵素的核酸係自以下所單離出或是對應於以下：來自枯草桿菌或液化澱粉芽胞桿菌的SacB基因、來自約氏乳酸桿菌的Lsc基因或是來自變種鏈球菌的FTF基因。
於一特別佳的具體例中，該SacB基因可以包括一序列，其係選自於以下所構成的群組：顯示於第2圖中的序列和編碼顯示於第3圖中的多肽序列之核苷酸序列；以及其之功能性活性片段和變異體。
於一特別佳的具體例中，該Lsc基因可以包括一序列，其係選自於以下所構成的群組：顯示於第4圖中的序列和編碼顯示於第5圖中的多肽序列之核酸序列；以及其之功能性活性片段及變異體。
已經報導表現細菌左聚糖蔗糖酶的基因轉殖的植物，於一些實例中，會顯示出異常的發展表現型。縱然申請人不希望被理論限制，此可能由左聚糖蔗糖酶酵素與聚果糖聚合物之不適當的分室作用所引起。一細菌SacB基因於基因轉殖的菸草以及馬鈴薯植物中之細胞溶質的表現顯示出對於植物的發展為特別破壞性的(Caimi等人，1997)。然而，表現融合至液泡定標信號之一細菌果糖轉移酶的植物可累積聚果糖，對於植物的發展沒有任何可識別的作用(Ebskamp等人，1994，Ye等人，2001)。
為了降低異常的發展表現型的可能性，該細菌FT基因可以予以修飾來改變其之定標信號序列以指導該等細菌FT蛋白質往高的聚果糖位準存在的隔間。
更特別地，可以創造一嵌合序列，藉此細菌FT基因的N-信號胜肽可以被移除以及被次細胞定標序列(較佳地為一液泡定標信號序列)所取代。
於一較佳的具體例中，該液泡定標信號序列可以是來自一基因或者對應至一基因，該基因編碼先原儲藏蛋白(preprosporamin protein)，例如，甘藷的SPOR531。
於一特別佳的具體例中，該液泡定標信號序列可以包括選自於以下所構成的群組之序列：以第6圖的粗底線顯示之序列和編碼以第7圖的粗底線顯示之多肽的核酸序列；以及其之功能性活性片段及變異體。
於一特別佳的具體例中，編碼細菌FT酵素的核酸可以是SPOR:SacB嵌合序列。較佳地，SPOR:SacB嵌合序列可以包括選自於以下所構成的群組之序列：顯示於第8圖中的序列以及編碼顯示於第9圖中的多肽序列之核酸序列；以及其之功能性活性片段及變異體。
於一特別佳的具體例中，編碼細菌FT酵素的核酸可以是SPOR:Lsc嵌合序列。較佳地，SPOR:Lsc嵌合序列可以包括選自於以下所構成的群組之序列：顯示於第9圖中的序列以及編碼顯示於第12圖中的多肽序列之核酸序列；以及其之功能性活性片段及變異體。
於一特別佳的具體例中，該基因建構物可以包括選自於以下所構成的群組之序列：顯示於第8圖與第11圖中的序列以及編碼顯示於第9圖與第12圖中的多肽之核酸序列；以及其之功能性活性片段及變異體。
於另一個較佳的具體例中，可以創造一嵌合序列，藉此細菌FT基因的N-信號胜肽可以被移除以及被果糖轉移酶酵素(例如，1-SST)的穿膜領域之所取代。
於一特別佳的具體例中，該穿膜領域可以包括選自於以下所構成的群組之序列：以第15圖中的粗斜體字顯示的序列以及編碼以第16圖中的粗斜體字顯示的多肽之核酸序列；以及其之功能性活性片段及變異體。
於一特別佳的具體例中，該基因建構物可以包括選自於以下所構成的群組之序列：顯示於第17圖與第20圖中的序列以及編碼顯示於第18圖與第21圖中的多肽之核酸序列；以及其之功能性活性片段及變異體。
關於‘嵌合序列’係意指一藉由表現一融合基因所重組生產的雜種(hybrid)，該融合基因包括2或更多個連接的核酸，其等原來編碼個別的蛋白質，或是其之功能性活性片段或變異體。
關於‘融合基因’係意指被連接的2或更多個核酸，以此一方式來允許該融合蛋白的表現，較佳地作為一轉譯融合。此典型地涉及自編碼第一蛋白質的核酸序列移除終止密碼子，接而符合框架地附加第二蛋白質的核酸序列。該融合基因接而藉由一細胞而表現為一單一蛋白質。可以改造該蛋白質以包括原始的蛋白質二者之完全的序列，或是任一者或二者之功能性活性片段或變異體。
該基因建構物也可以包括一核酸序列，其編碼介於2個連接的核酸之間的一連接子。一‘連接子，為任何的化學物、合成物、碳水化合物、脂質、多肽分子(或其等之組合)，其係位處於一融合蛋白內之二個鄰接的活性片段之間以及連接到融合蛋白內之二個鄰接的活性片段。本發明之較佳的連接子為一可撓性的連接子，例如，由一或更多個胺基酸殘基所組成的多肽鏈，其係藉由胺基酸鍵連接至該二活性片段。舉例而言，(Gly4 Ser)3連接子可以被放在該融合蛋白內的二活性片段之間的位置。
本發明的建構物與方法中使用的啟動子可以是一構成性的、組織專一性或可誘導性啟動子。於一較佳的具體例中，該啟動子可以是受光調節的啟動子，更佳地一光合作用啟動子。關於‘受光調節的啟動子’係意指能夠對光刺激反應而媒介基因表現之啟動子。關於‘光合作用啟動子’係意指能夠媒介一基因的表現之啟動子，該基因編碼涉及植物內的光合作用的途徑之蛋白質。
於成熟的葉片內比葉鞘與莖內累積較少的聚果糖。為了特別地增加葉片內之生合成的位準，已經策劃出一策略性方法，其係協同地表現聚果糖生合成基因於光合細胞中。縱然申請人不希望被理論限制，使用光調節的或者光合作用的啟動子可以提供以下的優點：
‧光合作用的啟動子於一大群的細胞內為活性的，包括葉片、上部和外部的莖(>55%的細胞)；
‧其等於蔗糖生產細胞(葉肉的以及薄壁組織維管束鞘細胞)內為活性的；
‧其等的表現模式在時間上以及空間上係與蔗糖的累積重疊；
‧果糖轉移酶活性會從來源移除蔗糖，藉此預防對於光合作用的回饋抑制作用，以及可以促進CO2固定的增加；特別佳的受光調節的啟動子包括核酮酸-1,5-雙磷酸羧酶/加氧酶(oxygtenase)小次單元(RbcS)啟動子和葉綠素a/b結合蛋白質(CAB)啟動子，以及其之功能性活性片段及變異體。
受光調節的啟動子可以是來自任何適合的植物物種，其包括單子葉植物[例如：玉蜀黍、米、小麥、大麥、高梁、甘蔗、能源甘蔗、牧草(如：牛毛草、黑麥草、臂形草、雀稗(Paspalum)、狼尾草(Pennisetum)、能源草類(如：柳枝稷、芒)]、雙子葉植物(例如：阿拉伯芥(Arabidopsis)、大豆、油菜(canola)、棉花、苜蓿與菸草)，以及裸子植物。
關於單子葉植物的轉形，較佳地該受光調節的啟動子係自一單子葉植物的物種予以單離或是對應於來自一單子葉植物的物種之啟動子，更特別地小麥(Triticum)物種或黑麥草(Lolium)物種，甚至更特別地普通小麥或多年生黑麥草(Lolium perenne)。
關於雙子葉植物的轉形，較佳地該受光調節的啟動子係自一雙子葉植物的物種予以單離或是對應於來自一雙子葉植物的物種之啟動子，更特別地阿拉伯芥物種，甚至更特別地阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)。
於一特別佳的具體例中，該RbcS啟動子包括選自於以下所構成的群組之序列：以第23至26圖中的任一者之小寫字型斜體字顯示的序列，以及其之功能性活性片段及變異體。
於另一個特別佳的具體例中，該RbcS啟動子可以包括選自於以下所構成的群組之序列：以第29至36圖中的任一者之小寫字型斜體字顯示的序列，以及其之功能性活性片段及變異體。
本發明的基因建構物可以藉由任何適合的技術予以導入至該等植物內。用於將本發明的基因建構物併入至植物細胞內的技術(舉例而言：藉由轉導、轉染、轉形或者基因定標)為熟悉此藝者所熟知的。此等技術包括：農桿菌(Agrobacterium)媒介的導入、根瘤菌(Rhizobium)媒介的導入、電穿孔至組織、細胞和原生質體、原生質體的融合、注射至生殖的器官內、至未成熟的胚胎內以及高速噴射導入至細胞、組織、癒合組織(calli)、未成熟與成熟的胚胎內、基因槍(biolistic)轉形、晶鬚轉形，以及其等之組合。技術的選擇會主要地取決於要被轉形的植物的類型，以及可以由適當地有技能的人容易地決定。
可以選擇併入本發明的基因建構物的細胞，如以下說明的，以及接而於適合的培養基中培養以再生轉形的植物，使用本技藝中熟知的技術。培養條件，例如：溫度、pH及類似物，對熟悉此藝者會是明顯的。生成的植物可以使用本技藝中熟知的方法予以有性或是無性繁殖，來生產轉形植物之相繼的世代。
本發明的方法可以應用至各種各樣的植物，包括：單子葉植物[例如，草類(如：草料和能源草類，包括：多年生黑麥草(perennial ryegrass)、高牛毛草、義大利黑麥草(Italian ryegrass)、紅牛毛草、柳條蘆(reed canarygrass)、大藍莖草、互花米草(cordgrass)、狼尾草(napiergrass)、濱麥屬、野生甘蔗、芒、柳枝稷(switchgrass))、玉米或玉蜀黍、米、小麥、大麥、高梁、甘蔗、黑麥、燕麥)和能源作物(如：能源甘蔗、能源高梁)]、雙子葉植物[例如：阿拉伯芥(Arabidopsis)、菸草、大豆、油菜、苜蓿、馬鈴薯、木薯、三葉草(如：白三葉草、紅三葉草、地中海三葉草)、蔬菜芥屬(vegetable brassicas)、萵苣、菠菜]以及裸子植物。
於本發明另外的態樣中，提供了能夠於一植物的光合細胞中操縱聚果糖生合成之基因建構物，該基因建構物包括一受光調節的啟動子，或是其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一核酸，其編碼一細菌FT酵素，或是其之功能性活性片段或變異體。
於一較佳的具體例中，如本發明之基因建構物可以是一載體。
關於‘載體’係意指一基因建構物，其被使用來轉移遺傳物質至一標的細胞。
該載體可以是任何適合類型的以及可以是病毒的或者非病毒的。該載體可以是一表現載體。此等載體包括：染色體、非染色體以及合成性核酸序列，如：植物病毒的衍生物；細菌的質體；來自根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之Ti質體的衍生物；來自髮根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)之Ri質體的衍生物；噬菌體DNA；酵母人工染色體；細菌的人工染色體；二元的細菌人工染色體；自質體和噬菌體DNA之組合所衍生的載體。然而，可以使用任何其他的載體，只要其於該植物細胞內為可複製的或整合的或者可存活的。
於本發明的此態樣之較佳的具體例中，該基因建構物可以進一步包括：一終止子；被操作地連接的該啟動子、基因及終止子。
該啟動子、基因及終止子可以是任何適合類型的以及可以是該標的植物細胞之內源性的或者可以是外源性的，但有條件是其等於該標的植物細胞內為功能性的。
可以使用於本發明的基因建構物內之各種各樣的終止子亦為熟悉此藝者所熟知的。該終止子可以是來自如同啟動子序列之相同的基因或者來自不同的基因。特別適合的終止子為聚腺苷酸化信號，例如，(CaMV)35S聚A，以及來自胭脂鹼(nopaline)合成酶(nos)及章魚肉鹼合成酶(ocs)基因的其他終止子。
該基因建構物，除了啟動子、該基因和終止子，可以包括對於核酸的表現所必需的另外的元素，以不同的組合，舉例而言，載體主幹、複製起點(ori)、多重選殖的位址、間隔子序列、增強子、內含子(例如，玉蜀黍泛蛋白Ubi內含子)、抗生素的抗性基因與其他的可選擇標誌基因[例如：新黴素磷酸轉移酶(nptII)基因、潮黴素磷酸轉移酶(hph)基因、膦基丁胺酸乙醯轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase)(bar或者pat)基因]，以及報導基因(例如，β-尿苷酸酶(GUS)基因(gusA)]。該基因建構物亦可以含有用於轉譯起始之核糖體結合位址。該基因建構物亦可以包括用於擴增的表現之適合的序列。
特別地，該基因建構物可以進一步包括一核酸序列，其編碼於2個連接的核酸之間的一連接子，如上文中討論的。
熟悉此藝者會明瞭該基因建構物之各種各樣的組份係被操作地連接，以便導致該核酸的表現。用於操作地連接本發明的基因建構物之組份的技術為熟悉此藝者所熟知的。此等技術包括使用舉例而言包括一或更多個限制酵素位址之連接子，例如，合成性連接子。
較佳地，該基因建構物為實質純化的或者單離的。關於‘實質純化的’係意指該基因建構物沒有該等基因，於該有機體(本發明的核酸或啟動子係自其所衍生)之天然存在的基因組內，該等基因係位於該核酸或啟動子的側邊。該術語因而包括，舉例而言，併入至一載體之內的基因建構物；併入至獨立自主複製質體或病毒之內的基因建構物；或者併入至一原核生物或真核生物的基因組DNA之內的基因建構物；或者其存在為與其他序列無關之個別的分子(如：藉由PCR或者限制內切酶消化生產的cDNA或基因組或cDNA片段)。其也可以包括一基因建構物，其為編碼額外的多肽序列之雜種基因的一部分。較佳地，該實質純化的基因建構物為至少大概90%純的，更佳為至少大概95%純的，甚至更佳為至少大概98%純的。
術語“經單離的”係意指自其之原始的環境(如：天然的環境，設若其為天然存在的)移除的材料。舉例而言，一種存在於活著的植物內的天然存在的核酸不是經單離的，但是從天然系統中之共存的材料的一些或者全部所分離之相同的核酸是經單離的。此等核酸可以是一載體的部分及/或此等核酸可以是一組成物的部分，以及仍然是經單離的，因為此一載體或組成物不是其之天然環境的部分。
作為替代方案來使用可選擇標誌基因以提供經轉形的宿主細胞之選擇的表現型性狀，經轉形的細胞中之基因建構物的存在可以藉由本技藝中熟知的其他技術來決定，例如：PCR(聚合酶連鎖反應)、南方墨點雜交分析、組織化學分析(如：GUS分析)、薄層層析法(TLC)、北方和西方墨點雜交分析。
申請人亦發現到本發明的方法可以導致該轉形的植物內之提高的生質量，相對於未轉形之對照植物。此提高的生質量可以依序使用作為辨識出轉形的植物之選擇工具。此具有以下的優點，於一些可能不需要包括抗生素的抗性或者其他的標誌來選擇轉形體的狀況下，此等標誌之隨後的移除(及無標誌的植物之創造)可能出現困難。
關於‘提高生質量’或者‘提高的生質量’係意指於該轉形的植物內之生質量產量(包括：嫩芽及/或根部的成長)的提高、增加，或是增加的穩定性，相對於未轉形之對照植物。舉例而言，一或更多個生長特徵於該轉形的植物內可以是提高的、增加的或者更安定的，相對於未轉形之對照植物，該一或更多個生長特徵係選自於以下所構成的群組：總體的葉面積、累積的葉面積、葉的生長動力學(亦即，葉隨著時間之數目)、嫩芽的數目、分蘗的數目、根部的數目、根部的質量或重量、嫩芽的質量或重量、根部的長度、嫩芽的長度、匍匐莖的長度、塊莖的數目、塊莖的重量、花的數目、果實的數目、種子的數目、種子的重量、果實的重量、開花植物的百分比以及每朵花之或每播種面積種子產量。
此技術特別地合適於的植物，其等為實質遺傳上一致的或遺傳上完全相同的或者在轉形之前於生質量顯示出小的表現型差異。
於是，於本發明另外的態樣中，提供了一種提高植物內的生質量的方法，該方法包括：將有效量的基因建構物導入至該植物之內，該基因建構物包括一啟動子，或是其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一核酸，其編碼一細菌FT酵素，或是其之功能性活性片段或變異體。較佳地，該啟動子係受光調節的啟動子。
本發明的方法、核酸及基因建構物可以組合以其他的遺傳操縱方法，或是其他經轉移的核酸和基因建構物來使用，藉此堆疊性狀。因而，可以生產帶有複合基因(stacked genes)(或是複合性狀(stacked traits))之基因轉殖的植物、植物細胞、植物種子或其他植物部分。舉例而言，本發明的技術可以組合以除草劑抗性技術(如：草丁膦(glufosinate)、草甘膦)、昆蟲抗性技術(如：蘇力菌(Bacillus thuringiensis))或延遲衰老的技術。該等核酸和基因建構物可以藉由任何適合的技術予以導入至該植物內，如上文中討論的，以及可以同時地、相繼地或者分別地予以導入。
於本發明再另外的態樣中，提供了一種提高植物內的生質量的方法，該方法包括：將有效量的下者導入至該植物內：
(a)　一能夠操縱該植物的光合細胞中的聚果糖生合成的基因建構物，該基因建構物包括一啟動子，或是其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一核酸，其編碼一細菌FT酵素，或是其之功能性活性片段或變異體；以及
(b)　一能夠操縱該植物中的衰老之基因建構物。
該等基因建構物可以藉由任何適合的技術予以導入至該植物內，如上文中討論的，以及可以同時地、相繼地或者分別地予以導入。
較佳地，能夠操縱聚果糖生合成之基因建構物為如上文中討論的。
較佳地，能夠操縱植物中的衰老之基因建構物為能夠操縱該植物的光合細胞中的衰老。
較佳地，能夠操縱衰老的基因建構物包括myb基因啟動子或者經修飾的myb基因啟動子，或是其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一基因，其編碼涉及細胞分裂素的生合成之酵素，或是其之功能性活性片段或變異體。
適合的基因建構物或載體係說明於國際專利申請案PCT/AU01/01092以及美國專利申請案11/789,526之中，其等之整體揭示係併入本文中作為參考資料。
“操縱衰老”一般而言係有關延遲該轉形的植物或者該轉形的植物之細胞或器官(如光合細胞)內的衰老，相對於未轉形之對照植物。然而，關於一些申請案，促進植物內的衰老或者不然修飾植物內的衰老可以為所欲的。可以，舉例而言，藉由利用反訊息基因而促進或者不然來修飾衰老。
該myb基因啟動子可以是任何適合類型的。較佳地，該myb基因啟動子為myb32基因啟動子。較佳地，該myb基因啟動子係來自阿拉伯芥(Arabidopsis)，更佳地來自阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)。最佳地，該myb基因啟動子可以包括一核苷酸序列，其係選自於以下所構成的群組：顯示於PCT/AU01/01092之中的序列辨識編號：1之序列，以及其之功能性活性片段及變異體。
一適合的啟動子係說明於Li等人的文章中，Cloning of three MYB-like genes from Arabidopsis(PGR 99-138)Plant Physiology 121:313(1999)，其之整體揭示係併入本文中作為參考資料。
關於“經修飾的myb基因啟動子”係意指通常與myb基因關聯的啟動子，該啟動子係被修飾以刪除或者去活化該啟動子內的一或更多個根部專一性要素及/或花粉專一性要素。
較佳地，該經修飾的myb基因啟動子為經修飾的myb32基因啟動子。較佳地，該經修飾的myb基因啟動子係從來自阿拉伯芥(Arabidopsis)，或更佳地為阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)之予以修飾的myb基因啟動子。
一適合的啟動子，其可以依據本發明予以修飾的，係說明於Li等人的文章中，Cloning of three MYB-like genes from Arabidposis(PGR 99-138) Plant Physiology 121:313(1999)，其之整體揭示係併入本文中作為參考資料。
關於“根部專一性要素”係意指3-7個核苷酸的一序列，較佳地4-6個核苷酸的一序列，更佳地5個核苷酸的一序列，其指導一植物的根部內之任何的關聯的基因之表現。
較佳地，該根部專一性要素包括一致序列ATATT或AATAT。
關於“花粉專一性要素”係意指3-7個核苷酸的一序列，較佳地4-6個核苷酸的一序列，更佳地4或5個核苷酸的一序列，其指導一植物的花粉內之關聯的基因之表現。
較佳地，該花粉專一性要素包括一致序列，其係選自於以下所構成的群組：TTTCT、AGAAA、TTCT以及AGAA。
一根部的或者花粉專一性要素可以藉由添加、刪失、取代或者衍生化該要素內的一或更多個核苷酸予以去活化，以至於其不再具有較佳的一致序列。
較佳地，該經修飾的myb基因啟動子可以包括選自於以下所構成的群組之核苷酸序列：顯示於US 11/789,526的序列辨識編號：2、3和4中之序列，以及其等之功能性活性片段及變異體。
關於一“基因，其編碼涉及細胞分裂素的生合成之酵素”係意指一基因，其編碼涉及細胞分裂素的合成之酵素，此等裂殖素、玉米素及苄腺嘌呤，舉例而言，一基因，其編碼異戊基轉移酶(ipt)，或是類ipt基因，例如，sho基因(如來自牽牛花)。較佳地，該基因是異戊烯基轉移酶(ipt)基因或者sho基因。於一較佳的具體例中，該基因係來自一物種，其係選自於以下所構成的群組：農桿菌，更佳地根瘤農桿菌；蓮花，更佳地日本蓮花(Lotus japonicas)；以及牽牛花，更佳地矮牽牛(Petunia hybrid)。
最佳地，該基因可以包括一核苷酸序列，其係選自於以下所構成的群組：顯示於US 11/789,526的序列辨識編號：5、7及9中之序列、編碼顯示於US 11/789,526的序列辨識編號：6、8及10中之該等多肽的序列，以及其等之功能性活性片段及變異體。
本發明亦提供了一種用於選擇轉形的植物的方法，該方法包括：將有效量的基因建構物導入至該植物之內，該基因建構物包括一啟動子，或是其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一核酸，其編碼一細菌FT酵素，或是其之功能性活性片段或變異體，以及選擇具有提高的生質量之植物。較佳地，該啟動子為受光調節的啟動子。
於本發明之另外的態樣中，提供了具有經修飾的聚果糖生合成特徵或者提高的生質量之經轉殖的植物細胞、植物、植物種子或其他植物部分，相對於未轉形之對照植物；該植物細胞、植物、植物種子或其他植物部分包括如本發明的基因建構物或載體。
關於“經修飾的聚果糖生合成特徵”係意指該轉形的植物顯示出增加的聚果糖生合成及/或含有增加位準的可溶性碳水化合物，相對於未轉形之對照植物。
於一較佳的具體例中，該具有提高的生質量之經轉殖的植物細胞、植物、植物種子或其他植物部分具有至少大概15%之增加的生質量，更佳為至少大概25%，更佳為至少大概35%，更佳為至少大概50%，相對於未轉形之對照植物。
舉例而言，生質量可以增加介於大概15%和500%之間的，更佳地介於大概25%和300%之間，更佳地介於大概35%和200%之間，更佳地介於大概50%和100%之間，相對於未轉形之對照植物。
於一較佳的具體例中，該具有經修飾的聚果糖生合成特徵之經轉殖的植物細胞、植物、植物種子或其他植物部分具有至少(least)大概15%的可溶性碳水化合物之增加，更佳為至少大概25%，更佳為至少大概35%，更佳為至少大概50%，相對於未轉形之對照植物。
舉例而言，可溶性碳水化合物可以增加介於大概15%和500%之間，更佳地介於大概25%和300%之間，更佳地介於大概35%和200%之間，更佳地介於大概50%和100%之間，相對於未轉形之對照植物。
較佳地，該經轉殖的植物細胞、植物、植物種子或其他植物部分係藉由依據本發明的方法所生產的。
本發明亦提供了一種經轉殖的植物、植物種子或其他植物部分，其係自本發明的植物細胞所衍生，以及包括本發明的基因建構物或載體。
本發明亦提供了一種經轉殖的植物、植物種子或其他植物部分，其係自本發明的植物所衍生，以及包括本發明的基因建構物或載體。
較佳地，該經轉殖的植物細胞、植物、植物種子或其他植物部分為黑麥草物種，更佳地多年生黑麥草或斑黑麥草(Lolium arundinaceum)。
較佳地，該經轉殖的植物細胞、植物、植物種子或其他植物部分為穀粒，更佳地小麥(Triticum)物種，更佳地小麥(普通小麥(Triticum aestivum))。
舉例而言，本發明實現基因轉殖的多年生黑麥草(perennial ryegrass)的植物的生產，該植物具有葉片內之增加的聚果糖、強有力的生長和對非生物性壓力之更大的耐受性，供用於放牧動物之改良的營養。
本發明也實現基因轉殖的小麥植物的生產，該小麥植物具有增加的聚果糖、強有力的生長，和對非生物性壓力之耐受性，供用於增加的可用的碳水化合物之質量，如：用於生物燃料的生產或者動物飼料。
關於‘植物細胞’係意指任何的自體繁殖的細胞，其係由有半滲透性的膜所連接以及含有一質體。此一細胞亦要求一細胞壁，設若另外的繁殖是所欲的。如本文中使用的植物細胞包括，但無限制：藻類、藍細菌、種子懸浮液培養物、胚胎、分生區域、癒合組織、葉、根部、嫩芽、配子體、孢子體、花粉與小孢子。
關於‘基因轉殖的’係意指任何的細胞，其包括用技巧插入至一細胞內的DNA序列，以及變成從那個細胞發展出的有機體的基因組之部分。當使用於本文中，該等基因轉殖的有機體一般而言為基因轉殖的植物以及DNA(轉殖基因)係用技巧插入至細胞核的基因組或者質體的基因組。
 較佳實施例之詳細說明 具體例的詳細說明
本發明現在將參照附隨的實例以及圖示更完全的說明。應該了解到，然而，接著的說明僅僅為作例證的以及於任何方面不應視為本發明以上討論之概括的表述的限制。
圖式簡單說明
於圖示中：第1圖：來自枯草桿菌，GH68家族的成員，的SacB蛋白質之示意的表示，所顯示之4個不同的區域為：N端信號序列；N-端可變異區；催化核心；以及C-端可變異區，胺基酸殘基，包括催化三分體(D86、D247與E342)以及蔗糖結合(W85、W163與R246)；第2圖：來自枯草桿菌的SacB基因之核苷酸序列(左聚糖蔗糖酶)，編碼N端信號胜肽的核苷酸序列為黑體的；第3圖：來自枯草桿菌的SacB蛋白質之胺基酸序列(左聚糖蔗糖酶)，N端信號胜肽為黑體的；第4圖：來自約氏乳酸桿菌NCC 533的Lsc基因之核苷酸序列(菊粉蔗糖酶)，編碼N端信號胜肽的核苷酸序列為黑體的；第5圖：來自約氏乳酸桿菌NCC 533的Lsc蛋白質之胺基酸序列(菊粉蔗糖酶)，N端信號胜肽為黑體的；第6圖：來自甘藷(I. batatas)的SPOR531，先原儲藏蛋白之核苷酸序列，液泡定標信號序列係以粗底線予以顯示；第7圖：來自甘藷的SPOR531，先原儲藏蛋白之胺基酸序列，液泡定標信號序列係以粗底線予以顯示；第8圖：SPOR:SacB嵌合核苷酸序列，SacB的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；第9圖：SPOR:SacB嵌合蛋白質序列，SacB的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；第10圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.ip/sosui/之SPOR-SacB融合蛋白的二級結構預測；第11圖：SPOR:Lsc嵌合核苷酸序列，Lsc的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；第12圖：SPOR:Lsc嵌合蛋白序列，Lsc的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；第13圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之SPOR-Lsc融合蛋白的二級結構預測；第14圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之Lp1-SST的二級結構預測；第15圖：來自多年生黑麥草之Lp1-SST核苷酸序列，Lp1-SST穿膜領域編碼序列係以粗斜體字予以顯示；第16圖：來自多年生黑麥草之Lp1-SST蛋白序列，Lp1-SST穿膜領域係以粗斜體字予以顯示；第17圖：Lp1-SST-SacB嵌合核苷酸序列，SacB的N端信號編碼序列已經由Lp1-SST穿膜領域編碼序列(以粗斜體字表示)所取代；第18圖：Lp1-SST-SacB嵌合蛋白序列，SacB的N端信號序列已經由Lp1-SST穿膜領域(以粗斜體字表示)所取代；第19圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之Lp1-SST-SacB融合蛋白的二級結構預測；第20圖：Lp1-SST-Lsc嵌合核苷酸序列，Lsc的N端信號編碼序列已經由Lp1-SST穿膜領域編碼序列(以粗斜體字表示)所取代；第21圖：Lp1-SST-Lsc嵌合蛋白序列，Lsc的N端信號序列已經由Lp1-SST穿膜領域(以粗斜體字表示)所取代；第22圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之Lp1-SST-Lsc融合蛋白的二級結構預測；第23圖：AtRbcS::SPOR-SacB::NOS表現卡匣之核苷酸序列；第24圖：AtRbcS::SPOR-Lsc::NOS表現卡匣之核苷酸序列；第25圖：AtRbcS::Lp1-SST-SacB::NOS表現卡匣之核苷酸序列；第26圖：AtRbcS::Lp1-SST-Lsc::NOS表現卡匣之核苷酸序列；第27圖：Gateway pDestination載體；第28圖：用於雙子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體：A. AtRbcS::SPOR-SacB::NOS；B. AtRbcS::SPOR-Lsc::NOK C. AtRbcS::Lp1-SST-SacB::NOS以及D. AtRbcS::Lp1-SST-Lsc::NOS；第29圖：TaRbcSp::SPOR-SacB::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；第30圖：TaRbcSp::SPOR-SacB::TaRbcst TaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；第31圖：TaRbcSp::SPOR-Lsc::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；第32圖：TaRbcSp::SPOR-Lsc::TaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；第33圖:TaRbcSp::Lpl-SST-SacB::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；第34圖:TaRbcSp::Lpl-SST-SacB::TaRbcstTaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；第35圖:TaRbcSp::Lpl-SST-Lsc::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；第36圖:TaRbcSp::SPOR-Lsc::TaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；第37圖:Gateway pDestination載體pBS:ubi::bar::NOS；第38圖:用於單子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體:A. TaRbcS::SPOR-SacB::TaRbcS以及B.TaRbcS::SPOR-SacB::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；第39圖:用於單子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體:A. TaRbcS::SPOR-Lsc::TaRbcS以及B.TaRbcS::SPOR-Lsc::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；第40圖:用於單子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體:A. TaRbcS::Lpl-SST-SacB::TaRbcS以及B.TaRbcS::Lpl-SST-SacB::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；第41圖:用於單子葉植物的轉形之GatewaypDestination載體：A. TaRbcS::Lp1-SST-Lsc:: TaRbcS以及B. TaRbcS:: Lp1-SST-Lsc:: TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；第42圖：菸草之葉肉衍生的原生質體之單離：A)-B)4-6週的活體外葉子材料之解剖；預酵素的消化；C)4-6週的活體外葉子材料之消化；16小時孵育；D)原生質體懸浮液之收穫；E)富含原生質體中間相之分離；F)-G)完整的、富含葉綠體的原生質體；第43圖：用於暫時性表現分析的菸草之葉肉衍生的原生質體之單離：A)-B)完整的、富含葉綠體的原生質體；C)液體濃化培養基內之原生質體的培養；D)可存活的原生質體；單離48小時後；第44圖：用於安定的轉形的菸草之葉肉衍生的原生質體之單離：A)-B)完整的、富含葉綠體的原生質體；C)原生質體包埋的海溶菌斑瓊脂糖栓(sea plaque agarose plug)，第0天；D)可存活的原生質體；單離和包埋後6天；E)-F)包埋的和釋放的原生質體衍生之微癒合組織；單離和包埋後4週；第45圖：來自菸草的葉肉原生質體衍生之微癒合組織的嫩芽之再生：A)釋放的微癒合組織於液體生長培養基A內，單離和包埋後6-7週；B-C)癒合組織於固化的生長培養基上之增殖；D)-E)自葉肉的原生質體衍生的癒合組織之嫩芽誘導以及再生；F)自再生的嫩芽之根部的發展；G)-H)於溫室圍阻下之植物的生長和發展；第46圖：未轉形之原生質體的存活力之評估；單離後48小時；第47圖：PEG-轉形的原生質體的存活力之評估；單離和轉染後48小時；第48圖：菸草葉花盤之農桿菌媒介的的轉形：A)轉形的葉花盤之共同栽培，第0天；B)嫩芽之第1階段的起始；共同栽培後3天；第49圖：經轉形的菸草葉花盤內之gfp表現的偵測：A)未轉形的葉花盤，白光；B)未轉形的葉花盤，gfp2濾片；C)未轉形的葉花盤，gfp3濾片；D)&G)Turbo gfp-轉形的葉花盤，白光；E)&H)Turbo gfp-轉形的葉花盤，gfp2濾片；F)&I)Turbo gfp-轉形的葉花盤，gfp3濾片；第50圖：RT-PCR樣品與對照的電泳。
徑1和13：1kb+DNA階梯，徑2：來自2 μL cDNA之sacB轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自經轉染的原生質體1(樣品9A)的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑3：來自1 μL cDNA的sacB轉錄品之擴增(樣品9A)，徑4：沒有反轉錄酶執行的對照反應(樣品9A)，徑5：沒有模板執行的對照反應(sacB引子)，徑6：來自2 μL cDNA之sacB轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自經轉染的原生質體1(樣品12A)的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑7：來自1 μL cDNA的sacB轉錄品之擴增(樣品12A)，徑8：沒有反轉錄酶執行的對照反應(樣品12A)，徑9：來自2 μL cDNA的18S轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自未經轉染的原生質體的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑10：來自1 μL cDNA的18S轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自未經轉染的原生質體的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑11：沒有反轉錄酶執行的對照反應(未經轉染的原生質體)，徑12：沒有模板執行的對照反應(18S引子)。
實施例
實施例1
細菌聚果糖生合成基因之單離
第1圖呈現來自枯草桿菌的SacB蛋白質之示意的表示。所顯示之4個不同的區域為：N端信號序列；N端可變異區；催化核心；以及C端可變異區。結構上，多數的細菌菊粉蔗糖酶與左聚糖蔗糖酶共有N端信號胜肽，一催化三分體。此序列係在該序列的修飾期間內被移除。涉及蔗糖結合之殘基係座落在催化核心序列的內部以及在修飾期間內保持為未觸及的。
第2-5圖中各別地提供了細菌左聚糖蔗糖酶(SacB)與菊粉蔗糖酶(Lsc)的核苷酸與蛋白質序列。然而，未了轉形至植物之內，該細菌左聚糖蔗糖酶與菊粉蔗糖酶序列亦以以下的方式予以修飾：‧該細菌的N-信號胜肽之移除；‧密碼子使用之適應作用，包括用於單子葉植物與雙子葉植物的轉譯起始；‧隱藏的剪切位址以及RNA去穩定序列要素的移除；‧該編碼序列進一步地用推定的次細胞定標序列予以修飾，包括用於單子葉植物與雙子葉植物的液泡定標信號序列，以及包括植物1-SST-專一性穿膜領域。
以下的實施例中指示出此等變化的要點。
實施例2
細菌的聚果糖生合成基因之修飾將細菌FT基因定標至特定的細胞隔間
為了指示細菌FT基因遠離細胞溶質以及前往累積蔗糖與聚果糖二者的隔間，編碼序列SacB和Lsc係用來自甘藷(Ipomoea batatas)的先原儲藏蛋白(SPOR531)之推定的液泡定標信號序列予以修飾。儲藏蛋白(sporamin)的前驅物之原胜肽為將儲藏蛋白定標至液泡所必須的(Hattori等人，1985)。儲藏蛋白之該液泡定標資訊係編碼於原胜肽的胺端以及係於第5圖與第6圖中指出的。
序列修飾涉及從SacB和Lsc細菌聚果糖(fuctan)之生合成基因二者移除N-信號胜肽以及添加SPOR531的液泡定標信號(各別地為第7-8圖與第10-11圖)。
該等經修飾的蛋白質之使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之次細胞的定位和拓樸學的預測指示出由液泡定標信號所觸發之穿膜的定位(第9圖與第12圖)。
從Lp1-SST蛋白質添加穿膜領域至細菌FT基因
也使用SOSUI軟體來預測多年生黑麥草1-SST基因的二級結構。此結構，指出在N端的一穿膜領域，係於第13圖中指示出。穿膜領域編碼與蛋白質序列係各別地於第14圖與第15圖中指出。
序列修飾涉及從SacB和Lsc細菌聚果糖(fuctan)之生合成基因二者移除N-信號胜肽以及添加Lp1-SST穿膜領域(各別地為第16-17圖與第19-20圖)。SacB和Lsc之經修飾的序列係使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI予以評估次細胞(subsellular)的定位和蛋白質拓樸學，以及其等預測的二級結構係各別地呈現於第18圖與第21圖中。
實施例3
產生用於在雙子葉植物內安定的轉形之載體表現建構物的合成
表現建構物係被人工合成，其係使用光合作用(photosyntheic)啟動子，實施例2中表示的經修飾的細菌聚果糖生合成基因以及NOS終止子序列用於轉形至雙子葉植物之內。
使用一光合作用啟動子以於累積聚果糖的組織中表現該等基因，同時該等經修飾的序列將該蛋白質定標至特定的植物細胞隔間。
核酮酸-1,5-雙磷酸羧酶/加氧酶小次單元(RbcS)為較高等的植物內之良好地定特徵的光調節的基因。事先已經選殖出阿拉伯芥核酮酸-1，5-雙磷酸羧酶/加氧酶小次單元(AtRbcS)啟動子序列之1700 bp片段。設計引子以從AtRbcS啟動子來擴增含有TATA信號之更小的片段供使用於表現載體中。
新近預測的經修飾的細菌聚果糖生合成基因之序列係被人工合成，改變植物內供表現的密碼子使用，以及將隱藏的剪切位址和RNA去穩定序列要素移除，以最佳化其等於該植物細胞內之性能。
第23-26圖各別地代表表現卡匣AtRbcS::SPOR-SacB::NOS、AtRbcS::SPOR-Lsc::NOSAtRbcS::Lp1-SST-SacB::NOS和AtRbcS::Lp1-SST-Lsc::NOS，以及尚未讓密碼子最佳化或者移除去穩定要素。
生成由阿拉伯芥光合作用啟動子所驅動之建構物供用於雙子葉植物的轉形，該建構物含有經修飾的細菌FT基因
將各個合成的表現卡匣放置於一閘道賦能的(Gateway enabled)pDONOR載體內用於重組至用於轉形至植物內的最終的目標載體之內。
已經產生一含有35Sp:hph:35St可選擇標誌卡匣之閘道賦能的目標載體pPZP200_35Sp_hph_35St_R4/R3(第27圖)。
閘道LR重組反應生產了以下的目標載體用於轉形至雙子葉植物之內：AtRbcS::SPOR-SacB::NOS(第28A圖)；AtRbcS::SPOR-Lsc::NOS(第28B圖)；AtRbcS::Lp1-SST-SacB::NOS(第28c圖)以及AtRbcS：：Lp1-SST-Lsc：：NOS(第28d圖)。
實施例4產生用於在單子葉植物內安定的轉形之載體表現建構物的合成
表現建構物係被人工合成，其係使用光合作用(photosyntheic)啟動子(TaRbcsp)，實施例2中表示的經修飾的細菌聚果糖生合成基因，以及TaRbcS終止子序列用於轉形至單子葉植物之內。使用一光合作用啟動子以於累積聚果糖的組織中表現該等基因，同時該等經修飾的序列將該蛋白質定標至特定的植物細胞隔間。
事先已經選殖出麵包小麥(普通小麥)、TaRbcS調節序列(啟動子與終止子)(Zeng,等人，1995；Sasanuma,2001)。來自先前公開的、含有來自TaRbcS基因(NCBI寄存編號AB042069)的TATA信號之序列695 bp啟動子的片段係被擴增供使用於表現載體中。
新近預測的經修飾的細菌聚果糖生合成基因之序列係被人工合成，改變植物內供表現的密碼子使用，以及將隱藏的剪切位址和RNA去穩定序列要素移除，以最佳化其等於該植物細胞內之性能。
使用以上概述的方法，合成表現卡匣以產生基因轉殖的植物，其等含有兩個聚果糖生合成基因以及LXRTM技術。LXRTM技術係根據一表現卡匣，其含有一個候選者基因(IPT)用於延遲葉子的衰老於AtMYB32基因啟動子的控制之下。該表現卡匣AtMYB3p：：IPT：：35St係說明於國際專利申請案PCT/AU01/01092之中。基因轉殖的LXRTM植物之表現型可以包括於與植物年齡相關聯的葉的變黃以及葉綠素喪失之減少，導致增加的光合作用的能力、造成改良的分蘗和植物的生質量。
2種技術的整合係經由該等光合作用的啟動子之活化的延長而導致聚果糖之增加的表現，以及可以藉由增加植物內的生產力之範圍而對於各種各樣的應用之效能具有顯著的影響。
第29-36圖各別地代表表現卡匣TaRbcS::SPOR-SacB::TaRbcS、TaRbcS::SPOR-SacB::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S、TaRbcS::SPOR-Lsc::TaRbcS、TaRbcS::SPOR-Lsc::TaRbcS　+　AtMYB32::IPT::　35S、TaRbcS::Lp1-SST-SacB::TaRbcS、TaRbcS::Lp1-SST-SacB::TaRbcS + AtMYB32::IPT::35S、TaRbcS::Lp1-SST-Lsc::TaRbcS和TaRbcS::Lp1-SST-Lsc::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S，以及尚未讓密碼子最佳化或者移除去穩定要素。
生成由小麥光合作用啟動子所驅動之建構物供用於單子葉植物的轉形，該建構物含有經修飾的細菌FT基因
將各個合成的表現卡匣放置於一閘道賦能的pDONOR載體內用於重組至用於轉形至植物內的最終的目標載體之內。
已經產生一含有Ubi::bar::NOS可選擇標誌卡匣之閘道賦能的目標載體pBS::Ubi::bar::NOS_R4/R3(第37圖)。閘道LR重組反應生產以下的目標載體用於轉形至單子葉植物之內：TaRbcS::SPOR-SacB:: TaRbcS(第38A圖)；TaRbcS::SPOR-SacB:: TaRbcS+AtM YB32::IPT::35S(第B圖)；TaRbcS::SPOR-Lsc:: TaRbcS(第39A圖)；TaRbcS::SPOR-Lsc:: TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S(第39B圖)；TaRbcS::Lp1-SST-SacB:: TaRbcS(第40A圖)；TaRbcS::Lp1-SST-SacB:: TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S(第B圖)；TaRbcS::Lp1-SST-Lsc:: TaRbcS(第41A圖)以及TaRbcS:: Lp1-SST-Lsc:: TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S(第41B圖)。
實施例5
雙子葉植物-菸草的原生質體與阿拉伯芥(A. thaliana)的建構物
製造以下的建構物用於直接的遞送(原生質體中之暫時性表現)的版本以及用於安定的遞送至阿拉伯芥(Arabidopsis)(阿拉伯芥(A. thaliana))與菸草(tobacco)(菸草(N. tabacum))之二元的轉形載體的版本。
1. AtRbcS::1-SST-SacB*
2. AtRbcS::SPOR-SacB*
3. AtRbcS::1-SST-Lsc*
4. AtRbcS::SPOR-Lsc*
*該細菌左聚糖蔗糖酶與菊粉蔗糖酶序列係以以下的方式予以修飾：‧的移除的該細菌的N-信號胜肽；‧密碼子使用之適應，包括：用於單子葉植物與雙子葉植物的轉譯起始‧隱藏的剪切位址和RNA去穩定序列要素的移除‧該編碼序列進一步地用推定的次細胞定標序列予以修飾，包括用於單子葉植物與雙子葉植物的液泡定標信號序列，以及包括植物1-SST-和FFT-專一性穿膜領域。
實施例6
菸草的葉肉衍生的原生質體之聚乙二醇媒介的轉形
此實施例說明上文中說明的表現卡匣之遞送至菸草原生質體(參見第42-45圖)。
I.用於直接的基因轉移之葉肉衍生的原生質體之單離
A.活體外嫩芽培養物之消化以出產葉肉衍生的原生質體
酵素溶液
將1.0%(w/v)纖維素酶"小野(Onozuka)"R10和1.0%(w/v) Macerozyme R10溶解於K4培養基[培養基K3，0.4 M蔗糖代替0.3 M]之內。旋轉向下(索福(Sorvall)離心機，SS 34轉子；以7,000 rpm歷時10 min.)俾以將酵素製備物的污染澱粉製成丸狀。用KOH調整pH 5.6以及過濾滅菌(0.2 μm孔徑)。儲存於4℃下不超過3-4週。
材料
‧含有固化的MS培養基之400 ml培養容器，和菸草的嫩芽培養物
‧90 x 20 mm無菌的培養皿
‧鑷子
‧解剖刀
‧無菌的解剖刀刀片；#11或#22
溶液
‧酵素溶液；溶解於K4培養基之內的1%纖維素酶和1% Macerozyme
‧無菌水
程序
1.輕輕倒出足以豐富地覆蓋平盤基部的體積之酵素溶液至無菌的90 x 20 mm培養皿之內；15 ml應該足夠。
2.將4-6週的嫩芽培養物之2-4片健康的、完全展開的葉子轉移至空的90 X 20 mm培養皿。
3.用背軸面向上，小心地移除1片葉子的中脈，確保使用鋒利的、無菌的刀片來使的of圍繞葉的組織之撕裂減到最少。重複剩餘的3片葉子。
在任何一次操作小量的葉子材料(最大量4)以使層流的乾燥化效應減到最少。
4.溫和地堆疊葉子對半(halves)，以及，用一鋒利、無菌的刀片，切成1-2 mm長條。
5.小心地將葉子節段轉移至含有酵素溶液的培養皿內(背軸面朝下)。用Parafilm將盤密封，以及於黑暗中不振盪、在25℃下孵育隔夜歷時16-18小時。
B.葉肉衍生的原生質體之單離
材料
‧無菌的5 ml吸量管
‧無菌的10 ml吸量管
‧吸量管輔助器(Pipette boy)
‧滅菌的原生質體之過濾單元：擱在一100 ml玻璃燒杯上的100 μm不鏽鋼篩目篩
‧無菌的14 ml塑膠圓底離心管
‧克萊門斯(Clements)軌道式500工作臺離心機
‧水浴
培養基
‧90 x 20 mm無菌的培養皿(dish/es)，含有消化的菸草葉子
‧固化的K3:H培養基之1:1混合物，含有0.6% Sea PlaqueTM瓊脂糖
溶液
‧經高壓蒸汽滅菌的W5溶液
‧經高壓蒸汽滅菌的K3溶液
程序
6.溫和地攪動隔夜消化物以釋放原生質體至酵素溶液內。
攪動應該為溫和的，可是徹底的，以及以從左到右的(水平的)移動方式執行。
7.稍微地使平盤成角度移動以輔助轉移消化的懸浮液(酵素溶液和植物碎片)。使用10 ml無菌的吸量管，將消化的懸浮液轉移至一滅菌的原生質體之過濾單元以令原生質體懸浮液與植物碎片分離。
8.　溫和地輕敲過濾單元以釋放篩子內捕捉的過量的液體。
9.　溫和地混合該原生質體懸浮液以及分佈至14 ml無菌的塑膠圓底離心管之內，裝滿至大概8 ml(最大量9 ml)。
10.　使懸浮液再次分佈以獲得一致分佈的體積(max. 9 ml)。
11.　用1.5 ml W5溶液小心地覆蓋各懸浮液。
為了輔助分配W5溶液，將裝滿懸浮液的管子放置於一角度以及允許微量吸管觸及接近管子開口的壁表面，在緩慢地降下至恰好到該懸浮液表面之上之前。緩慢地分配W5溶液，一滴一滴地添加，確保使微量吸管保持盡可能的接近該懸浮液表面。原生質體懸浮液之最小的攪動以及，因而，設若正確地執行會產生與W5溶液的混合。
12.　小心地替換蓋子以及在70g離心歷時5分鐘(克萊門斯軌道式500工作臺離心機，甩平式轉子，400 rpm)。原生質體會浮動在中間相。
13.　保持裝滿原生質體的管子向上，小心地將無菌的5 ml吸量管降低至恰好到的原生質體層上方之處以及收集在中間相的原生質體，盡可能少取到下方相。
會同時收集W5溶液。
14.　收集且轉移原生質體至一個新的14 ml離心管。一旦完成原生質體的收集，藉由溫和地上下地吸量管吹吸而溫和地混合原生質體懸浮液。
15.　藉由將移除100 ul分量的原生質體懸浮液且轉移至含有900 ul W5溶液的管子來決定原生質體之產量。於血球計計數原生質體以及決定每毫升的原生質體的數目。
16.　計算要獲得每毫升大概1 X 106(最大量1.5 x 105)的原生質體必須的總體積。使原生質體懸浮液分佈於新的14 ml圓底離心管中，確保獲得均等體積。
17.　使用10 ml吸量管，用W5溶液將含有原生質體的管子裝滿到多至10 ml的總體積。為了使原生質體的瓦解減到最少，當裝滿時沿著管壁噴灑W5溶液。
18.　替換蓋子以及藉由溫和地上下顛倒加蓋的管子一次來使原生質體再次懸浮。
19.　在移除全部的W5溶液之前將原生質體製成丸狀[旋轉70g(克萊門斯軌道式500工作臺離心機，400 rpm)歷時5 min.]，留下純的原生質體懸浮液。
20.　藉由溫和地振盪而使原生質體懸浮液再次懸浮。
21.　用W5溶液將各個含有原生質體的管子裝滿至總體積5 ml，以及在室溫下孵育歷時最小量1小時以及最大量4小時。
22.　在1-4小時孵育的時間期間內，安排以下的組分於製備用於直接的基因轉移至經單離的原生質體之內：．從-20℃儲存移除40%PEG溶液以及儲存在室溫下。在繼續進行直接的基因轉移之30分鐘之前，將PEG溶液孵育在熱水的燒杯內。
‧於微波爐內熔化固化的K3:H培養基。一旦完全地融化，放置於40℃水浴中直到準備好使用為止。
II.　使用聚乙二醇之直接的基因轉移至原生質體轉形DNA
質體DNA係藉由沉澱及用100%(v/v)乙醇予以清洗來滅菌，以及於一層流操作台內予以乾燥[質體DNA用70%乙醇沉澱也是可能的，但是DNA小丸會需要更長時間來乾燥]。DNA小丸係以0.7 μg/μl的最終濃度再次懸浮於30 μl無菌的二次蒸餾水之中用於暫時性轉形。DNA的物理結構應該是多重盤繞的用於暫時性的轉形，以及線性化的-有興趣的基因的外部-用於安定的轉形。添加載體DNA(如：魚類精液DNA)至該經轉形的質體DNA通常提供更好的安定轉形之頻率。用於安定的轉形之10 μg的線性化的質體DNA以及40 μg的修剪的魚類精液DNA係如以上指出的予以共沉澱、予以乾燥以及溶解於30 μl的無菌的二次蒸餾水之內。
轉形緩衝液
15 mM MgCl2、0.1%(w/v)嗎福啉乙磺酸(MES)以及0.5 M甘露醇。在溶解於蒸餾水中之後，用KOH調整pH 5.8以及高壓蒸汽滅菌。儲存於4℃下。
PEG溶液
配於0.4 M甘露醇及0.1 M Ca(NO3)2中之40%(w/v)PEG 4000。將PEG溶解於0.4 M甘露醇和0.1 M Ca(NO3)2中(由於PEG的體積，此等2種組分的最終濃度會是降低的)。
調整pH 8-9以及高壓蒸汽滅菌(pH會花費數小時，如：隔夜，以於此溶液中穩定以及在高壓蒸汽滅菌之後會掉至pH 6-7)。
材料
‧無菌的1 ml吸量管
‧無菌的5 ml吸量管
‧無菌的10 ml吸量管
‧吸量管輔助器
‧無菌的14 ml塑膠圓底離心管
‧克萊門斯軌道式500工作臺離心機
‧水浴
‧50x10 mm培養皿
培養基
‧14 ml圓底離心管，含有經單離的原生質體懸浮液，製成丸狀的
‧固化的K3:H培養基之1:1混合物，含有0.6% Sea PlaqueTM瓊脂糖
溶液
‧經高壓蒸汽滅菌的W5溶液
‧經高壓蒸汽滅菌的K3溶液
‧經高壓蒸汽滅菌的H溶液
‧40% PEG溶液
‧轉形緩衝液
‧10 ug轉形DNA，溶解於30 ul無菌的二次蒸餾水之內。
程序
1.在移除全部的W5溶液之前將原生質體製成丸狀[旋轉70g(克萊門斯軌道式500工作臺離心機，400 rpm)歷時5 min.]，留下純的原生質體懸浮液。
2.使用1 ml吸量管，添加(逐滴地)300 μl(大概7滴)的轉形緩衝液至含有經單離的原生質體之各個14 ml圓底離心管。
3.藉由溫和地輕敲管子的基部而小心地使小丸再次懸浮。
4.在添加300 μl(大概7滴，當使用1 ml吸量管來分配時)預加溫的PEG溶液之前，添加10 μg(30 μl)的轉形DNA至各原生質體懸浮液。藉由溫和地輕敲管子的基部來混合原生質體懸浮液。
介於再次懸浮轉形緩衝液中的原生質體以及添加轉形DNA和PEG之間的時間的間隔應維持在最小量。
5.在室溫下孵育轉形混合物歷時15分鐘、不攪動。
6.使用10 ml吸量管，以以下的間隔逐步地添加10 ml W5溶液至各管子：
‧1 ml(大概12滴)逐滴地至各管子。溫和地將全部的管子上下顛倒來混合。
‧1 ml(大概12滴)逐滴地至各管子。溫和地將全部的管子上下顛倒來混合。
‧1 ml(大概12滴)逐滴地至各管子。溫和地將全部的管子上下顛倒來混合。
‧2 ml如同緩流一般至各管子。溫和地將全部的管子上下顛倒來混合。
‧2 ml如同緩流一般至各管子。溫和地將全部的管子上下顛倒來混合。
‧3 ml如同緩流一般至各管子。溫和地將全部的管子上下顛倒來混合。
為了輔助分配，於一10 ml吸量管內收集在各個間隔必須的總體積以用必須的體積之W5溶液裝滿各管子，在分配之前。在各個間隔重複。
7.　在移除全部的W5溶液之前，將原生質體製成丸狀[旋轉70g(克萊門斯軌道式500工作臺離心機，400 rpm)歷時10 min.]，留下純的原生質體懸浮液。在繼續進行之前，輕敲全部的管子的基部一次。
用於暫時性的轉形
8.　使原生質體之小丸再次懸浮於均等體積的K3培養基與H培養基內高至總體積5 ml(2.5 mL的各溶液)。
9.　緩慢地將該液體K3:H+原生質之-懸浮液-混合物轉移至50 x 10 mm培養皿的中央。
10.　在繼續進行暫時性表現分析之前，將全部的盤用Parafilm予以密封以及在24℃下於暗光下培養原生質體歷時24-72小時。
用於安定的轉形
11.　繼續以下的“第III部分.葉肉衍生的原生質體之培養以及植物的再生”。
III.　葉肉衍生的原生質體之培養以及植物的再生
關於步驟1&2，各個含有原生質體的管子必須每次處理1個管子。
材料
‧無菌的1 ml吸量管
‧無菌的5 ml吸量管
‧無菌的10 ml吸量管
‧吸量管輔助器
‧克萊門斯軌道式500工作臺離心機
‧水浴
‧50 x 10 mm培養皿
‧經高壓蒸汽滅菌的不鏽鋼刮勺
培養基
‧14 ml圓底離心管，含有經單離的原生質體懸浮液，製成丸狀的
‧固化的K3:H培養基之1:1混合物，含有0.6% Sea PlaqueTM瓊脂糖；40℃
‧經高壓蒸汽滅菌的K3溶液
‧250 ml培養容器，含有20 ml A培養基
‧12-井Costar平盤，含有固化的MS形態培養基(Morpho medium)
‧250 ml培養容器，含有固化的MS形態培養基
‧250 ml培養容器，含有固化的MS培養基
程序
1.添加0.5 ml K3培養基接近原生質體之小丸以再次懸浮原生質體。
2.緩慢地將該K3+原生質體-懸浮液-混合物轉移至50 x 10 mm培養皿的中央。
3.在繼續進行之前，全部含有原生質體的管子重複步驟1和2。
4.添加含有0.6% Sea PlaqueTM瓊脂糖之5 ml預加溫的K3:H培養基之1:1混合物，每次1個平盤。以溫和的旋轉式移動，只振盪平盤一次以使原生質體懸浮液均勻地分佈於培養基之內。重複全部的平盤。
5.留下平盤停滯、未觸及的，直到培養基已經固化為止(10-30分鐘，取決於周圍的溫度)。
6.將全部的盤用Parafilm予以密封以及在24℃下於完全的黑暗下培養原生質體歷時24小時，接著於連續式暗光下63天(5 μmol m-2s1，Osram L36 W/21 Lumilux白色管子)，發生第一及多重的細胞分裂。
7.使用一無菌的刮勺，將含有原生質體之海溶菌斑瓊脂糖栓劃分為象限以及將放置到250 ml塑膠的培養容器內，含有補充合適的抗生素之20 mL的A培養基(每250 ml容器1個象限)。於連續式暗光下、在24℃下、以80 rpm和1.25 cm拋送(throw)於旋轉式振盪機上孵育。
8.每2週取代液體A培養基+合適的抗生素，監控原生質體衍生的群落之生長。
9.　當原生質體之衍生的群落直徑大概為2-3 mm(5-6週的孵育於液體A培養基)時，將群落轉移至含有固化的MS形態培養基之24-井Costar平盤之個別的井之內。
10.　於連續式暗光下、於24℃下孵育平盤歷時1-2週(5 μmol m-2 s1，Osram L36 W/21 Lumilux白色管子)，其中癒合組織增殖以及到達直徑8-10 mm的大小。
11.　當原生質體衍生的癒合組織直徑大概為1-2 cm時，將癒合組織轉移至含有固化的MS形態培養基之個別的250 ml培養容器。於16小時光亮/8小時黑暗條件下、在24。C下孵育容器(20 μmol m-2 s1，Osram L36 W/21 Lumilux白色管子)。於1-2週之內，多重的嫩芽應為可見的。
12.　將長度3-4 cm的嫩芽轉移至含有固化的MS培養基之250 ml培養容器中以助長根部的形成。於16小時光亮/8小時黑暗條件下、在24℃下孵育容器(20 μmol m-2 s1，Osram L36 W/21 Lumilux白色管子)。於3週之內，根部形成的徵兆應為可見的。
13.　具有已建立的根部系統之小植株應被維持為活體外植物培養物作為菸草的葉肉原生質體之來源。
實施例7
使用伊凡氏藍染色(EVANS BLUE STAIN)之菸草的原生質體的存活力之評估
參見第46圖與第47圖。
背景的資訊
‧伊凡氏藍染色(EVB；6,6’-[(3,3’-二甲基1[1,1’-聯苯]-4,4’-二基)雙(偶氮基)雙[4-胺基-5-羥基-1,3-萘二磺酸]四鈉鹽)。
‧非螢光染料。
‧作用的方法：活著的細胞保留把排除伊凡氏藍在質膜外的能力，以及保持其等的天然的顏色。被鹽類或者滲透的應力損傷的細胞無法把伊凡氏藍排除在外，被染色成深藍色，以及容易地根據顯微鏡的檢查予以區分。
‧製備的方法：400mg/l儲備溶液(溶劑：0.65M甘露醇)
‧染色的方法：將伊凡氏藍儲備溶液添加至均等體積之原生質體的懸浮液，溫和地混合以及在顯微鏡的視像化之前在室溫下孵育歷時10分鐘。
‧偵測的方法：Leica MZFL III光解剖顯微鏡。
實施例8
菸草的原生質體之基因表現分析
實驗的目的：於轉染的菸草原生質體內之選殖的基因AtRbcS::1-SST-SacB和AtRbcS::SPOR-SacB的表現係使用RT-PCR來試驗
材料與方法：指定的3平盤的原生質體
i)　經轉染的原生質體(樣品9A)：AtRbcS::1-SST-SacB
ii)　經轉染的原生質體(樣品12A)：AtRbcS::SPOR-SacB
iii)　未經轉染的原生質體
涉及表現分析的步驟：
1.引子設計與PCR之最佳化
2.總RNA的單離
3. RT反應
4. qRT-PCR分析
引子設計與PCR產物的同一性：引子對係使用信標設計軟體(Premier Biosoft International)予以設計來擴增有興趣的基因以及該等基因序列為基因庫中可得到的。選擇基因的專一性引子，以使得生成的PCR產物的大小的範圍從200至250 bp。PCR產物係經由熔化曲線的分析辨識出以及大小係根據凝膠電泳。
總RNA的單離：總RNA係藉由PROMEGA之SV總RNA的單離系統從每個處理1×106的原生質體予以單離。
http://www.promega.com/tbs/tm048/tm048.pdf
總RNA的產量：
反轉錄酶反應
RT反應係藉由使用QIAGEN RT套組予以執行。4個RT反應係藉由使用引子混合物(QIAGEN)予以執行(9、12、對照以及WT菸草RNA)。
http://www1.qiagen.com/products/pcr/QuantiTectPcrSystems/QuantiTectRevTranscriptionKit.aspx#Tabs=t2
上述樣品的各個之複製物係進行使用基因專一性引子之RT反應。特別地，樣品9A及12A係使用反向sacB引子予以轉錄，以及對照(未經轉染的)樣品用反向18S引子予以轉錄。
PCR
反應係建立如下：
2x GoTaq綠總混合物(Green MasterMix)(Promega)10 μL
cDNA模板　2.0　μL
順向引子(10 μM)　0.5 μL
反向引子(10 μM)　0.5 μL
無核酸酶水　7.0 μL
反應：
步驟1：　95℃　2 min
步驟2： 95℃　30 sec
步驟3：　55℃　30 sec
步驟4：　72℃　60 sec
從步驟2循環25個週期(18S)或者從步驟2循環35個週期(sacB)
步驟5：　4℃　保持
反應產物在經由1x TBE緩衝液中的1%(w/v)瓊脂糖之電泳，用SYBR(50 μL/L)染色之後而於UV光下予以視像化。
sacB轉錄品之偵測係顯示於2個經轉染的原生質體cDNA樣品(9和12)中，同時所使用的方法係藉由來自未經轉染的原生質體cDNA樣品之18S的擴增予以確認(第50圖)。
經轉染的原生質體內之受光調節的啟動子的控制之下的嵌合sacB基因之表現係被觀察。無-RT對照與無模板對照沒有觀察到產物。sacB基因的表現可以於用樣品9A和12A中使用之載體轉染的原生質體中偵測到。
實施例9
根瘤農桿菌媒介的菸草葉花盤的轉形
此實施例說明了使用農桿菌之菸草葉花盤的安定轉形，該農桿菌攜帶用上文中說明的表現卡匣改造之二元載體(參見第48圖與第49圖)。
序言
使用根瘤農桿菌媒介的葉花盤的轉形為生產基因轉殖的植物之有效的方法。根瘤農桿菌為天然的雙子葉植物病原體，其含有感染植物以及併入該細菌的DNA至該植物基因組內之遺傳機轉。由於此能力，根瘤農桿菌能被採用作為使特定的興趣之DNA併入至菸草之選殖的媒介，舉例而言。
該方法能使用來產生一菸草內模型系統，以評估對於有興趣的基因為cDNA異源性的群落之功能。
材料和化學品
設備和儀器
使用具有水平流的層流操作台(系列HWS180，CLYDE-APAC，Evans Deakin Pty. Ltd.的部門，北伍德維裏，南澳大利亞5012，澳大利亞)，旋轉式振盪機(伊孚森(Infors)型RC-406，伊孚森AG，CH-4103 Bottmingen，瑞士)，具有甩平式轉子之工作臺離心機(克萊門斯軌道式500)，鑷子(彎曲，cat no. 2108/160，Crown Scientific，羅維爾，維多利亞3178，澳大利亞)，具有無菌的外科解剖刀刀片(尺寸11，cat no. 1838，Laboratory Supply Pty. Ltd.，米爾佩拉DC，新南威爾斯1891，澳大利亞)之解剖刀手柄(第3號，cat no. SHN3，Crown Scientific，羅維爾維多利亞3178，澳大利亞)。
儲備溶液
全部的培養液所需要之宏量元素、微量元素與維生素必須製備微濃縮的儲備液(宏量元素儲備液：10倍濃縮的；微量元素與維生素儲備液：100倍濃縮的)以輔助其等的添加。除了含有微量元素的儲備液之外，全部的儲備液係在室溫下製備。微量元素儲備液之製備要求組分在混合之前予以加熱。Na2-EDTA和FeS04 x 7 H2O必須在混合之前各自溶解於400 mL蒸餾水之內(為了1000 mL的總體積)。使溶解的溶液混合以及在大約60℃加熱直到溶液顏色變黃為止。允許溶液在添加剩餘的組分之前冷卻。用蒸餾水使溶液升至1000 mL。儲存全部的儲備液於4℃下。將激素[2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和裂殖素]溶解於1 M KOH中以及用蒸餾水予以稀釋以製備100 mg/升濃縮儲備液。
培養基
附錄1中提供了所使用的培養基之組成以其等之個別的成分的最終濃度：MS微量、MS宏量、B5維生素、羅莉亞伯大尼培養基(Lauria Bertani media)、清洗培養基、PC培養基、SEL培養基、RM培養基以及SEM培養基。
化學品
2,4-D: 2,4-二氯苯氧乙酸、活性碳；特美汀(Timentin)(能由相同的濃度之頭孢菌素(Cefotaxime)所取代)、BAP(6-苄胺嘌呤)、玉米素、AgNO3、立復黴素(Rifampicin)、瓊脂(Difco,細菌瓊脂(Bacto-Agar),cat. no: 0140-01)係使用作為膠化劑。其他的化學品(PEG 4000、Tween 80、KOH、NH40H、NaCI、KCI、Ca(NO3)2、MgCl2以及CaCl2)係自BDH購買；MES(2-[N-嗎福啉基]乙磺酸)係來自Sigma(Cat. NO.N-8250),硫酸康黴素(kanamycin sulphate)係來自Sigma；潮黴素B係自Calbiochem購買；Ca(OCl)2(-65%)和(phosphinotricin)係各別來自Roth和Riedel de Haen。蔗糖係自Fluka購買(cat. no: 84100)。Parafilm "M"(American National CanTM,格林威治,CT 06836，USA)係使用作為密封膠帶。使用無菌的拋棄式瓶上式過濾器(bottIe-top filters)(0.2 um vacucap 90 ； cat. no. 4622，Gelman Sciences Pty.Ltd. ,喬汀翰，維多利亞3192，澳大利亞)和拋棄式過濾單元(0.2 um；cat. no. 16534，Sartorius AG,37070哥廷根,德國)係使用於過濾器-滅菌。無菌的拋棄式吸量管:1 mL_(TRP；cat. no. 94001)5 mL_(TRP；cat. no. 94005)和10 ml_(TRP；cat. no. 94010)；全部來自Life Technologies Pty. Ltd.，墨爾格雷夫，3170澳大利亞，有螺旋帽之無菌的塑膠離心管(14 mL，TRP；cat. no.91016，Life Technologies Pty.Ltd.，墨爾格雷夫，3170澳大利亞)；無菌的塑膠培養皿(90 x 14 mm；cat. no. 82.9923.484，以及60x14 mm，cat. nO. 83.1801.011，Sarstedt Australia Pty. Ltd. ，TechnologyPark，南澳大利亞5095，澳大利亞以及90 x 20 mm；cat. no. 664160，Greiner Labortechnik GmbH，72636福利根豪森，德國)；以及可高壓蒸汽滅菌的培養容器(250 mL，cat. no. 75.9922.519，Sarstedt Australia Pty. Ltd，Technology Park，南澳大利亞5095，澳大利亞)。植物材料
A)可以使用菸草(N. tabacum cv. Petit Havana)SR1之無菌的嫩芽培養物。其等係從配於次氯酸鹽溶液[1.4%(w/v)Ca(OCl)2，0.05%(v/v) Tween 80]之對應之滅菌的種子表面歷時15 min.來建立，以及在無菌的蒸餾水之3-4次沖洗之後，於用0.8%(w/v)瓊脂固化的半強度MS培養基(附錄1)上平盤培養用於萌芽。將具有2-3葉的嫩芽切割以及生長於16h/d光、在25℃下、於0.8%(w/v)瓊脂-固化的MS培養基上、於250 mL培養容器之內(20 umol m-2s-1，Osram L36 W/21 Lumilux白色管子)。生根部的嫩芽在使用之前以6週的間隔予以繼代培養數次為莖插。
B)也能使用溫室生長的菸草(N. tobacum)，但是需要葉子表面滅菌，如以下說明的[I.B)]。播種無菌土壤內的種子確保其等沒有播種得太深以及其等保持潮濕的。生長於16h/d光下(20 umol m"2 s"1，Osram L36 W/21 Lumilux白色管子)條件25℃，用奧綠肥(Osmocote)緩慢釋放的肥料予以施肥。
C)使用於葉花盤的轉形之根瘤農桿菌菌株為AGL1。
I.製備根瘤農桿菌用於菸草葉花盤與載體pBinhph200之 轉形
在菸草轉形日期的2天之前著手經轉形的根瘤農桿菌菌株AGL1之預培養以確保無菌的條件被維持(參見附錄2之pBinhph200的身份識別卡)1.　用一接種環劃破-70℃冷凍的甘油細菌的儲備液的表面以及接種2 mL的LB(含有20 mg/mL立復黴素，加上10 mg/L觀黴素)於一無菌的管子中。以150 rpm在28℃下孵育歷時24小時。
2.　用0.25 mL的24小時預培養物來接種加上抗生素之4 mL的LB(於12 mL無菌的管子中)。在28℃下孵育歷時6-7小時。
3.　用0.025mL的6-7小時預培養物來接種沒有任何抗生素之25mL LB(於150 mL無菌的燒瓶)以及在28℃和150 rpm予以孵育隔夜。
4.　添加25mL的LB至25ml隔夜預培養物中以及以150 rpm在28℃下繼續生長歷時另外的90分鐘。
5.　將50ml預培養物轉移至離心管以及於克萊門斯工作臺離心機內在室溫下以2,000 rpm旋轉歷時12分鐘。
6.　移除上清液以及溫和地使小丸再次懸浮於20 mL的WM內。測量OD600。添加另外的WM至細菌的懸浮液來提供了0.45之最終的OD600。此製備係供使用於步驟III)1。
II.　葉花盤的製備
A)　使用菸草嫩芽培養物之葉花盤的製備
1.　於一層流內，從生長於MS培養基上的菸草植物收穫4-6片葉子。將葉子放置於含有WM之1.5x9 cm培養皿之內。使用一解剖刀，將中脈移除以及將葉組織切成~1cm2的方塊。該組織或葉花盤現在準備好用於用根瘤農桿菌(AGL1)之轉形。該等花盤應該於1小時內予以轉形。
B)　使用非無菌的菸草組織之葉花盤的製備
1.從溫室生長的菸草植物收穫4片幼葉(~8cm長)。
2.將葉子放置於含有70%乙醇之無菌的燒杯之內，用鋁箔予以覆蓋以及溫和地旋轉於一軌道式振盪機(Bio-Line軌道式振盪機，Edwards Instrument Company)上歷時1分鐘。
3.移除70%乙醇以及用1%Ca(OCl)2取代。旋轉組織歷時8分鐘。於無菌水中清洗葉子至少3次。
4.於一層流內，將中脈移除以及和且將剩餘的葉組織切成~1cm2的方塊。將製備的花盤放置於含有WM之1.5x9 cm培養皿之內。該等花盤現在準備好用於用根瘤農桿菌(AGL1)之轉形。
III.帶有根瘤農桿菌之葉花盤的孵育及共同栽培
1.用農桿菌培養物取代WM(從葉花盤的製備之最後的步驟)以及孵育歷時1-2分鐘。
2.移除細菌的懸浮液以及用WM短時間地沖洗外植片體。在平盤培養至PC培養基上之前，使外植片體於無菌的餐巾上吸乾。放置於生長房(16h/d光(20umol m-2s-1，Osram L36 W/21 Lumilux白色管子)條件25°C)內歷時3天的共同栽培。
IV.在農桿菌媒介的轉形之後的葉花盤之預再生
1.將外植片體(5個/平盤)轉移至SEL培養基以及送回生長房歷時另外的7天。
V.　再生
1.將外植片體(5個/平盤)轉移至RM以及送回生長房。嫩芽形成應發生在3-6週之內。在4週之後將外植片體轉移至新鮮的RM。
2.設若的癒合組織變得太大，以及特別地設若不是全部的嫩芽都與培養基接觸的話，使用資解剖刀來劃分癒合組織。暴露於挑選的嫩芽愈多愈好。
VI.嫩芽的延長以及根部的發展
1.在挑選8週之後，或是當未經轉形的對照外植片體於挑選死掉時，將綠的嫩芽(5個/平盤)轉移至9 x 2 cm培養皿內的SEM培養基(包括IBA(1 mg/L))。根部應出現於4-5週。
VII.　活體外小植株的發展
1.當根部出現時，將生根的小植株轉移至組織培養容器內的SEM培養基。
參考文獻
Stewart,C.N. Jr.,Adang,M.J.,All,J.N.,Rayner,P.L.,Ramachandran,S. and Parrott,W.A.(1996) Insect control and dosage effects in transgenic canola containing a synthetic Bacillus thuringiensis crylAc gene. Plant Physiol112: 115-120.
附錄
附錄1：儲備溶液與培養基
MS培養基　1公升
MS粉末　4.74 g
3%蔗糖　30 g
dH2O　往上至1L
用1M NaOH調整pH至5.8-6.0
高壓蒸汽滅菌
MS宏量(10x)
MS微量(100x)
將Na2-EDTA和FeSO4 x 7 H2O各別地溶解於400　ml ddH2O中，混合以及加熱(勿煮沸)。允許冷卻以及添加其他的微量鹽於剩餘的體積內。
MS維生素(100 x)
B5維生素(100 x)
RM培養基：再生培養基
高壓蒸汽滅菌
為了製備BAP和玉米素，稱粉末的重量至小容器內以及開始用0.5-1 mL的1 M KOH予以溶解。將該溶液轉移至ddH2O且裝滿至最終體積。
SEL培養基：選擇的培養基
高壓蒸汽滅菌
為了製備2,4-D，稱粉末的重量至小容器內以及開始用0.5-1 mL的1 M KOH予以溶解。將該溶液轉移至ddH2O且裝滿至最終體積。
SEM培養基
高壓蒸汽滅菌
WM培養基：清洗培養基
用KOH(1M)調整pH 5.8
高壓蒸汽滅菌
實施例10
使用攜帶二元載體的根瘤農桿菌之阿拉伯芥(ARABIDPOSIS)之安定的轉形，該二元載體係經由‘花浸漬(FLORAL DIP)’方法用相同的表現卡匣予以改造的.
電勝任根瘤農桿菌細胞之製備
實驗程序
1.於含有20 mg/L立復黴素和100 mg/L安比西林(ampicillin)的MGL瓊脂上劃出來自冷凍的-80℃甘油儲備液之根瘤農桿菌(AGL1菌株)的條紋，以及27℃孵育歷時2天。
2.測量5 ml MGL至50 ml Falcon管子且添加立復黴素至最終濃度20 mg/L以及安比西林100 mg/L。用根瘤農桿菌AGL1之單一的群落予以接種。
3.　孵育在27℃下歷時24 h通過一軌道式振盪機以150 rpm於一傾斜的支架(大約30度)中。
4.　在傍晚用500 ul的隔夜培養物接種至含有20 mg/L立復黴素和100 mg/L安比西林(amplicillin)(於500 ml燒瓶內)的100 ml MGL。
5.　在27℃下孵育隔夜通過一軌道式振盪機以150 rpm，直到獲得介於0.4-0.6(max. 0.6)之間的OD600讀數為止。設若過度生長，參見以下的註解。
6.　將細胞轉移至一經高壓蒸汽滅菌的JA10離心管以及冷凍於冰上歷時10 min。
7.　使用JA10轉子離心歷時10 min、9000 rpm、在4℃下。
8.　藉由傾倒至用於培養之500 ml燒瓶小心地丟棄上清液(小丸不是非常安定的)。
9.　添加20ml冰冷的10%甘油至JA10離心管內的小丸以及藉由震盪使小丸再次懸浮。
10.　將懸浮液傾倒至JA20離心管之內以及使用JA20轉子旋轉歷時10 min、10000 rpm、在4℃下。
11.　藉由傾倒至500 ml燒瓶而丟棄上清液。
12.　添加15 ml冰冷的10%甘油至小丸以及藉由吸量管吹吸使再次懸浮。用JA20轉子離心歷時10 min、10000 rpm、在4℃下。
13.　重複步驟11和12共2次。
14.　使小丸再次懸浮於1 ml冰冷的10%甘油(吸量管或者震盪)以及轉移至一無菌的微量離心管。
15.　於微量離心管內旋轉歷時3 min、13000 rpm、在4℃下。
16.　最後使小丸再次懸浮於1 ml 10%冰冷的甘油內。
17.　等分試樣50 ul批量至標示的1.7 ml微量試管，驟凍於液態氮內。
18.　自液態氮移開管子以及儲存勝任細胞於-80℃下。
註解
戴著乳膠手套同時處理根瘤農桿菌細菌的培養物。收集全部的細菌的廢料於500 ml燒瓶內以及高壓蒸汽滅菌。設若根瘤農桿菌100 ml培養物過度生長，用含有20 mg/L立復黴素之新鮮的MGL培養基予以稀釋1/3-1/4，以及孵育另外的1-2 h。
經由電穿孔之根瘤農桿菌的轉形
實驗程序
1.　將Gene pulser光析管支架預冷凍於冰上。
2.　將勝任農桿菌(AGL1)細胞的分量從-80℃移開以及於冰上解凍。
3.　打開Gene pulser後方的主開關。調整電壓至2.5 kV(使用‘提高’按鈕直到顯示器記錄‘2.5’為止)、電容25 μFD以及電阻600 Ω。
4.　添加0.1 ug的DNA以不小於50 ul的解凍細胞之體積。
5.藉由吸量管吹吸來混合以及將細胞/DNA混合物轉移至預冷凍的0.2 cm間隙Gene Pulser光析管。
6.小心地輕敲細胞至光析管的底部或者使細胞振盪至光析管的底部，以至於該等細胞觸及2個電極。
7.用紙巾乾燥該光析管的外部以及將其放置至光析管支架內。該光析管上的一缺口確保正確的定向。令光析管支架滑動至該箱內直到該光析管位於該箱的基部的接觸點之間為止。
8.藉由壓下2個紅色按鈕使細胞產生脈衝直到響起嗶嗶的聲音為止。當充電時機器會顯示CHG，以及當其放電時會發出嗶嗶的聲音。將細胞放回冰上歷時1 min以協助回收。
9.用一玻璃移液吸量管添加1 ml LB培養基至該光析管內的細胞中。
10.上下地混合該懸浮液接而轉移至一無菌的15 ml管子。
11.使用一傾斜的支架(大約30度)通過一軌道式振盪機以150 rpm在27℃下孵育歷時1至2小時。
12.添加9 mL的LB至該細胞懸浮液，徹底地混合以及平盤培養(plate out)100 μl的此培養物至含有20 mg/L立復黴素和合適的抗生素(如：100 mg/L觀黴素用於pPZP系列的載體)之LB平盤上。將100 μl的此懸浮液轉移至含有900 μl的LB肉湯之1.7 ml微量試管之內，徹底地混合以及平盤培養100 μl至含有合適的抗生素之另一個LB平盤上。從以上的懸浮液移除100 μl以及放置至新鮮的1.7 ml微量試管且添加900 μl的LB肉湯。徹底地混合以及平盤培養100 μl至含有合適的抗生素之另一個LB平盤上。
13.　用Parafilm來密封平盤以及孵育在27℃歷時2-3天直到單一大的群落變得可見為止。
經轉形的農桿菌之儲存
實驗程序
1.　於一50 ml無菌的管子中，將一單一的群落接種至含有20 mg/L立復黴素與合適的可選擇抗生素(亦即100mg/L觀黴素用於pZP系列以及50mg/L康黴素用於pBin系列)之5 ml LB肉湯內。最好在早上做此事，以使得能密切地監控以後的日子之生長程度。
2.　以250 rpm振盪於黑暗中在27℃下孵育管子歷時24-36小時。在最早的24小時孵育之後定期地觀察培養物的生長。一旦細胞活躍地生長(高度可見的)從孵育移開。在混濁的最早的徵兆之後會很快地發生快速的生長。生長的時間取決於個別的菌株與轉形體。
3.　應檢查各培養物以驗證AGL1含有所欲的二元載體。此係使用段落5.2中說明的流程實行。
4.　將500 μl的培養物等分至一光析管內。測量OD600讀數，在各個讀數之間用含有合適的抗生素之500 μl的LB肉湯使成為空白。
5.　允許培養物生長直到OD600讀數範圍落在0.8至1.0之間為止。
6.於一無菌的15 ml管子中，添加5.0 ml的培養物與5.0 mL的保存儲備液。在繼續進行步驟7之前徹底地混合。
7.等分試樣500 μl至完全標示的無菌低温保存管(cyrotubes)內。在驟凍於液態氮內之前將全部的管子上下顛倒。儲存於-80℃下直到需要為止。丟棄設若顯示為PCR陰性的任何的儲備液。
農桿菌的PCR的分析
1.添加1 μl的農桿菌培養物至無菌的PCR管子中之9 μl的無菌的MQH2O內。
2.在98℃下孵育細胞歷時5 mins。將管子轉移至冰。
3.添加10 μl的製備的2 x PCR主混合物。10 μl的2 x PCR主混合物含有以下：
10 x Dynazyme緩衝液　2 μl
10 mM dNTPs　1.0 μl
10 μM順向引子(10 μM)　1.0 μl
10 μM反向引子(10 μM)　1.0 μl
Dynazyme II聚合(polymerise)　1 μl
MQ水　3 μl
4.包括一正對照(50 ng的原始的質體DNA)與一負對照(無模板DNA)。使用標準的PCR條件進行總計35個週期1.95℃歷時3 mins2.94℃歷時30 secs3.55℃歷時30 secs4..72℃歷時1 mins5.72 ℃ 10 mins重複步驟2至4總計35次。
5.於1%瓊脂糖凝膠上分析PCR產物。
註解
戴著手套同時處理農桿菌。收集且高壓蒸汽滅菌全部的細菌及DNA廢料的廢料。Gene pulser光析管為可再用的：使蓋子浸泡於70% EtOH內以及於一密閉容器內用水高壓蒸汽滅菌光析管以移除農桿菌。光析管接而能儲存於70% EtOH內以及在乾燥之後重新使用。
阿拉伯芥於植物界的轉形
實驗程序
植物材料的製備
1.用種子培育混合物裝滿幼苗籃子以形成一土墩。用2層防鳥網覆蓋以及在各個端部用橡皮筋弄牢。藉由使籃子座落於一盤的水中來濕透土壤。播種充分的種子以獲得每籃~40株植物。
2.藉由將籃子放置於4℃下歷時2-3天來春化該種子。將籃子轉移至一生長箱於22℃下、於螢光(持續照明，55 μmol m-2s-1)下，以及供給Miracle-Gro或者Aquasol每週一次。
3.當主要的抽薹(bolt)出現時將其等移除，以及允許二次的抽薹生長直到大約2-10 cm高為止(此應該花費大約4-6天，該等植物應該有許多未開的花蕾以及很少長角果)。使用鑷子小心地將任何的長角果或者開的花移除。在注入的日子之前好好地灌溉植物，以至於氣孔會打開。在注入(infiltration)之前用水使土壤濕透以使得細菌溶液的吸收至土壤中減到最少。
4.　將細節輸入至LWS內以產生條碼。用LWS條碼細節來標示籃子。
根瘤農桿菌的製備
1.　於早晨用農桿菌保存儲備液之單一500 μl的起動培養物(段落5.1)來接種含有合適的可選擇抗生素(亦即100 mg/mL的觀黴素用於pPZP載體)之200 ml LB培養基。於軌道式振盪機以250 rpm在27℃下孵育歷時24小時。200 ml的培養物係足夠注入大約2籃的植物。
2.　在室溫下以5500g離心500 ml離心瓶中之隔夜培養物歷時15 mins以製成丸狀的細胞。丟棄上清液，移除液體愈多愈好。使小丸再次懸浮於注入培養基(參見附錄1)內至大概0.7至0.9的OD600讀數。
農桿菌注入法(Agroinfiltration)
1.　將該農桿菌溶液的一半放置至一250 ml容器中。
2.　將籃子上下顛倒來使包括玫瑰花形的葉子之整個植物浸沒於該細菌的溶液內，以及溫和地振盪來逐出氣泡。共同栽培該等植物歷時2 mins。
3.　移開籃子且短時間地排掉，然而，應該保留圍繞植物之薄層的膜。用塑膠膜覆蓋植物以維持濕度以及送回生長房遠離直接的照明。將廢料溶液高壓蒸汽滅菌以及於一化學廢料圓桶內處置以正確的處置。
4.要被轉形的阿拉伯芥(A. thaliana)之全部的籃子均重複步驟1至3。
5.將細節輸入至LWS之內以產生條碼。用LWS條碼細節標示個別的籃子。
6.隔天，揭開罐子以及放回直接的照明。灌溉該等植物直到植物已經完全地發展長角果為止。
種子的收集
1.一旦植物已經變乾，移除結長角果的莖且將其等放置到一紙袋內，以及使其等在37℃下乾燥歷時一週。袋子用LWS條碼貼標籤。壓碎該等乾燥的長角果於紙袋內。此會粉碎該等長角果以及釋放種子。
2.將200微米之篩子放置在新的一張A4紙上以及傾倒種子和壓碎的長角果至其上。溫和地輕敲該篩子以允許該種子掉落在下面的紙張上。將剩餘在該篩子上的植物材料丟棄。重複此過程直到已經移除植物材料的多數為止(注意植物材料於隨後的步驟中可為污染的來源)。將種子放置到一1.7 ml微量離心管中以及用LWS條碼細節貼標籤。將該管子放置到小的馬尼拉紙的信封中以及用LWS條碼貼標籤。注意到此條碼會回溯到原始的轉形事件。
3.在將該等種子轉移到4℃用於儲存之前，將種子儲存於-20℃下歷時24小時。
陽性T1基因轉殖的阿拉伯芥植物的選擇種子的表面滅菌
1.於一層流操作台內工作，將種子(40 mg=~2000種子每個150x15 mm平盤)放置於一2.0 ml微量試管中待滅菌。
2.添加1000 μl 70%乙醇並留下歷時2mins。
3.移除乙醇以及添加1000 μl的種子滅菌溶液(4%氯:水:5% SDS以各別8:15:1的比率)且藉由震盪徹底地混合。
4.　將管子放置於雷泰(Ratek)‘摩天輪(ferris wheel)’上以確保種子和溶液的混合，留下歷時10mins。
5.　於層流內，移除滅菌溶液並用無菌水取代。震盪該(等)管子以及於一工作臺頂部離心機內旋轉歷時30秒以使種子沈積。將水移除並用另外的1 ml的無菌水取代。應該重複種子清洗的步驟直到沒有看到明顯的可見的氣泡為止(至少4次)。在最終的清洗之後，留下大概200 μl的水覆蓋種子。
T1轉形體的選擇
1.　製備具有選擇萌芽培養基(SGM)之150x15 mm平盤，該選擇萌芽培養基含有合適的可選擇抗生素(如8mg/L潮黴素用於PZP200系列)。包括特美汀(250 mg/L)以抑制農桿菌的生長。各個平盤大概需要125 mL的SGM。
2.　於一層流操作台內工作，以平行的方式移動一無菌的解剖刀橫越SGM瓊脂平盤的表面(參見第4圖)。此會幫助散佈種子。
3.　使用一無菌的1 ml吸管，移除其之末端，用吸量管移動滅菌的種子至一平盤上。用一無菌的拋棄式撒布機分佈種子。
4.　在4℃下冷處理該等種子歷時2天，以及接而於22℃生長於連續式螢光(55 umol m-2s-1)下。
5.　當推定的轉形體處於6-8片葉子階段時，其等能被轉移至土壤。用一對鑷子小心地從組織培養液移除植物確保根部保持完整。移植至潮濕的活體外混合土壤內使用ARASYSTEM(參見附錄2內的第5圖)。用一塑膠管覆蓋。創造新的LWS條碼以及貼標籤於管子。用塑膠的覆蓋物來覆蓋管子頂部歷時一些天以協助回收。
轉殖基因的整合之確認：鹼處理的葉組織作為基因組DNA的來源
在推定的轉形體已經轉移至土壤3天之後，個別的植物能使用以下的流程分子上用於該轉殖基因的存在定特徵。
1.　製備1x PCR緩衝液混合物用於待試驗之每次鹼處理的葉組織(細節參見以下)。
2.　於一1.7 ml微量試管中，添加200 ul的0.25 M NaOH至一小的幼葉(從T1植物移除的)。
3.　將管子浸沒在煮沸的水中歷時2 min。注意，為了預防蓋子在煮沸的期間內發出砰的響聲，所以用微量試管的蓋子鎖弄牢蓋子或者用細的針刺穿蓋子。
4.在煮沸之後，從水中移除該管子以及添加200 μl的0.25 M HCl和100 μl的0.25%(v/v) igepal[0.5 M Tris HCl pH 8.0]。將管子浸沒於煮沸的水中歷時另外的4 mins。
5.　移除鹼處理的葉子的小部分(~2 mm2)以及放置於預製備的PCR混合物內：10 x PCR反應緩衝液(包括Mg(SO4).7H2O)5.0 ml 10 mM dNTP’s　1.0 μl10 uM順向引子　1.0 μl10 uM反向引子　1.0 μlPWO DNA聚合酶　1.0 μl
MQ H2O　41.5 ul
6.　使用標準的PCR條件進行35個週期；1. 95℃歷時3 mins2. 94℃歷時30 secs3. 55℃歷時30 secs4.. 72℃歷時1 mins5. 72℃ 10 mins重複步驟2至4總計35次。
7.　分析PCR產物於1%瓊脂糖凝膠上。
注意設若第一次使用鹼處理的葉組織未擴增一插入子的話，再煮沸該組織歷時另外的2mins以及重複該轉殖基因的PCR擴增。設若此第二次PCR失敗，使用Qiagen植物基因組DNA萃取套組從葉組織萃取小量的基因組DNA。更新LWS。
種子的收集
1.　一旦植物已經變乾，移除結長角果的莖且將其等放置到一紙袋內，以及使其等在室溫下乾燥歷時一週。袋子用LWS條碼貼標籤。壓碎該等乾燥的長角果於紙袋內。此會粉碎該等長角果以及釋放種子。
2.將200微米之篩子放置在新的一張A4紙上以及傾倒種子和壓碎的長角果至其上。溫和地輕敲該篩子以允許該種子掉落在下面的紙張上。將剩餘在該篩子上的植物材料丟棄。重複此過程直到已經移除植物材料的多數為止(注意植物材料於隨後的步驟中可為污染的來源)。將種子放置到一1.7m1微量離心管中以及用LWS條碼細節貼標籤。將該管子放置到小的馬尼拉紙的信封中以及用LWS條碼貼標籤。注意到此條碼會回溯到原始的轉形事件。
3.在將該等種子儲存在4℃之前，將T2種子儲存於-20℃下歷時24小時(在選擇陽性基因轉殖的T2植物期間內幫助使真菌污染的機會下降)。
註解
與農桿菌接觸的全部的容器，包括ARASYSTEM盤、支架等等應該使用商業的漂白劑以及70%乙醇予以徹底地清潔。
取決於實驗，T1植物能使用於表現型定特徵，亦即報導基因分析，以及在超出T1階段可能不需要繼續此等品系。
同型接合的T3種子之產生
序言
以下詳述的流程說明使用來選擇攜帶一單一副本的轉殖基因之同型接合的植物的方法。使用注入的方法將該轉殖基因整合至阿拉伯芥之內係在子房受精之前發生於雌蕊。因而藉由注入而產生之攜帶該轉殖基因的任何的種子被認為是T1。T1種子的萌芽而產生T1植物，其依序產生T2種子。目標是每個建構物要獲得至少5種獨立的基因轉殖的植物，其具有一單一插入子以及表現該轉殖基因。關於T1種子所產生的各個LWS條碼代表了有區別的轉形事件。因各個T1植物係關於T2種子予以收穫，其等被給予一個新的LWS條碼數字。此LWS條碼會回溯到原始的轉形事件。
T2轉形體的選擇以產生T3種子
1.　於一層流操作台內工作，表面滅菌大概100個T2種子(參見段落7.1)。
2.　平盤培養大概25個種子每個平盤(總計4個)於含有250mg/L梯每匹定(timetin)和8mg/L潮黴素(用於pPZP200-35s-hph-35st之選擇劑)之選擇SGM培養基上。
3.　在4℃下冷處理該等種子歷時2天，接而轉移至生長房在22℃下、伴隨持續照明(55 umol. m-2.s-1)。
4.　在2週之後，執行對潮黴素抗性或敏感性之植物的分離分析。
5.　當推定的轉形體係處於6至8片葉子階段時，使用Arasystem將至少10個個別的植物轉移至土壤內。產生新的LWS條碼(回溯到原始的轉形)以及個別地用條碼貼標籤於各個植物。用塑膠膜覆蓋管子歷時一些天以輔助回收。
6.　為了確認各個個別的植物具有被併入的轉殖基因，使用鹼處理的葉組織的方法(段落7.3)。更新LWS。
7.　一旦植物已經變乾，移除結長角果的莖且將其等放置到一紙袋內，以及使其等在37℃下乾燥歷時一週。袋子用LWS條碼貼標籤。壓碎該等乾燥的長角果於紙袋內。此會粉碎該等長角果以及釋放種子。
8.將200微米之篩子放置在新的一張A4紙上以及傾倒種子和壓碎的長角果至其上。溫和地輕敲該篩子以允許該種子掉落在下面的紙張上。將剩餘在該篩子上的植物材料丟棄。重複此過程直到已經移除植物材料的多數為止(注意植物材料於隨後的步驟中可為污染的來源)。將種子放置到一1.7 ml微量離心管中以及用LWS條碼細節貼標籤。將該管子放置到小的馬尼拉紙的信封中以及用LWS條碼貼標籤。注意到此條碼會回溯到原始的轉形事件。
9.在將該等種子轉移至4℃用於儲存之前，將該種子儲存於-20℃下歷時24小時(在選擇陽性基因轉殖的T3植物期間內幫助使真菌污染的機會下降)。
分離分析
1.計算來自對潮黴素為抗性或敏感性之各個品系的T2植物之總數。
2.設若T-DNA被插入在一個位置，抗性對敏感性植物的比率應該為3:1。設若T-DNA位置被插入在2個位置，抗性對敏感性植物的比率應該為15:1。設若T-DNA被插入多於2個位置，抗性對敏感性植物的比率應該為>15:1。
3.使用卡方(Chi-square)(χ2)統計試驗來決定分離數據多好地符合特定的假設。
4.繼續栽培卡方分析指示出含有該轉殖基因的一單一副本之基因轉殖株。
5.更新LWS。
轉殖基因的整合之確認：鹼處理的葉組織作為基因組DNA的來源
1.各個T2植物收穫1小片葉子。
2.採用鹼處理的葉流程(段落7.3)以決定一轉殖基因的存在。
3.更新LWS。
同型接合的T3品系之選擇
1.繼續栽培指示出其等含有該轉殖基因的一單一插入之T2基因轉殖株。
2.收集T2種子(段落8.2)，以及更新LWS且產生新的條碼。
3.使~40個T3種子於SGM上萌芽。
4.在2週之後，計算來自對潮黴素為抗性或敏感性之各個品系的T3植物之總數。
5.同型接合的T3品系會由缺少敏感性植物所指示出。
6.當推定的轉形體係處於6至8片葉子的階段時，使用Arasystem轉移至少20個個別的植物至土壤內。產生新的LWS條碼以及個別地用條碼貼標籤於各個植物。用塑膠膜覆蓋管子歷時一些天以輔助回收。
7.為了進一步確認一品系關於一單一插入為同型接合的，使用鹼處理的葉組織的方法(段落7.3)來確認全部的植物含有一轉殖基因。更新LWS。
8.收穫來自推定的同型接合的品系之充分的材料以執行南方雜交來確認轉殖基因併入的數目。更新LWS。
9.從T3同型接合的品系收穫種子採用段落8.2中說明的流程。
參考文獻
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<210>　17<211>　1398<212>　DNA<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　17
<210>　18<211>　465<212>　PRT<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　18
<210>　19<211>　2352<212>　DNA<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　19
<210>　20<211>　783<212>　PRT<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　20
<210>　21<211>　2148<212>　DNA<213>　多年生黑麥草<400>　21
<210>　22<211>　405<212>　DNA<213>　多年生黑麥草<400>　22
<210>　23<211>　653<212>　PRT<213>　多年生黑麥草<400>　23
<210>　24<211>　72<212>　PRT<213>　多年生黑麥草<400>　24
<210>　25<211>　1545<212>　DNA<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　25
<210>　26<211>　216<212>　DNA<213>　多年生黑麥草<400>　26
<210>　27<211>　514<212>　PRT<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　27
<210>　28<211>　2499<212>　DNA<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　28
<210>　29<211>　832<212>　PRT<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　29
<210>　30<211>　3353<212>　DNA<213>　人工序列<220><223>　嵌合序列<400>　30
<210>　31
<211>　4307
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　31
<210>　32
<211>　3500
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　32
<210>　33
<211>　5234
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　33
<210>　34
<211>　2790
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　34
<210>　35
<211>　4683
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　35
<210>　36
<211>　3744
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　36
<210>　37
<211>　5637
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　37
<210>　38
<211>　2937
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　38
<210>　39
<211>　4830
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　39
<210>　40
<211>　3891
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　40
<210>　41
<211>　5784
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　嵌合序列
<400>　41
<210>　42
<211>　1702
<212>　DNA
<213>　阿拉伯芥
<400>　42
<210>　43
<211>　695
<212>　DNA
<213>　普通小麥
<400>　43
<210>　44
<211>　941
<212>　DNA
<213>　阿拉伯芥
<400>　44
<210>　45
<211>　588
<212>　DNA
<213>　阿拉伯芥
<400>　45
<210>　46
<211>　468
<212>　DNA
<213>　阿拉伯芥
<400>　46
<210>　47
<211>　419
<212>　DNA
<213>　阿拉伯芥
<400>　47
<210>　48
<211>　723
<212>　DNA
<213>　根瘤農桿菌
<400>　48
<210>　49
<211>　975
<212>　DNA
<213>　日本蓮花
<400>　49
<210>　50
<211>　1053
<212>　DNA
<213>　矮牽牛
<400>　50
<210>　51
<211>　240
<212>　PRT
<213>　根瘤農桿菌
<400>　51
<210>　52
<211>　324
<212>　PRT
<213>　日本蓮花
<400>　52
<210>　53
<211>　350
<212>　PRT
<213>　矮牽牛
<400>　53
第l圖：來自枯草桿菌,GH68家族的成員,的SacB蛋白質之示意的表示,所顯示之4個不同的區域為：N端信號序列；N-端可變異區；催化核心；以及C-端可變異區,胺基酸殘基,包括催化三分體(D86、D247與E342)以及蔗糖結合(W85、Wl63與R246)；
第2圖：來自枯草桿菌的SacB基因之核苷酸序列(左聚糖蔗糖酶),編碼N端信號胜肽的核苷酸序列為黑體的；
第3圖：來自枯草桿菌的SacB蛋白質之胺基酸序列(左聚糖蔗糖酶),N端信號胜肽為黑體的；
第4圖：來自約氏乳酸桿菌NCC 533的Lsc基因之核苷酸序列(菊粉蔗糖酶)，編碼N端信號胜肽的核苷酸序列為黑體的；
第5圖：來自約氏乳酸桿菌NCC 533的Lsc蛋白質之胺基酸序列(菊粉蔗糖酶)，N端信號胜肽為黑體的；
第6圖：來自甘藷(I. batatas)的SPOR531，先原儲藏蛋白之核苷酸序列，液泡定標信號序列係以粗底線予以顯示；
第7圖：來自甘藷的SPOR531，先原儲藏蛋白之胺基酸序列，液泡定標信號序列係以粗底線予以顯示；
第8圖：SPOR:SacB嵌合核苷酸序列，SacB的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；
第9圖：SPOR:SacB嵌合蛋白質序列，SacB的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；
第10圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之SPOR-SacB融合蛋白的二級結構預測；
第11圖：SPOR:Lsc嵌合核苷酸序列，Lsc的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；
第12圖：SPOR:Lsc嵌合蛋白序列，Lsc的N端信號序列已經由SPOR的液泡定標信號(以粗底線表示)所取代；
第13圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之SPOR-Lsc融合蛋白的二級結構預測；
第14圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之Lp1-SST的二級結構預測；
第15圖：來自多年生黑麥草之Lp1-SST核苷酸序列，Lp1-SST穿膜領域編碼序列係以粗斜體字予以顯示；
第16圖：來自多年生黑麥草之Lp1-SST蛋白序列，Lp1-SST穿膜領域係以粗斜體字予以顯示；
第17圖：Lp1-SST-SacB嵌合核苷酸序列，SacB的N端信號編碼序列已經由Lp1-SST穿膜領域編碼序列(以粗斜體字表示)所取代；
第18圖：Lp1-SST-SacB嵌合蛋白序列，SacB的N端信號序列已經由Lp1-SST穿膜領域(以粗斜體字表示)所取代；
第19圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之Lp1-SST-SacB融合蛋白的二級結構預測；
第20圖：Lp1-SST-Lsc嵌合核苷酸序列，Lsc的N端信號編碼序列已經由Lp1-SST穿膜領域編碼序列(以粗斜體字表示)所取代；
第21圖：Lp1-SST-Lsc嵌合蛋白序列，Lsc的N端信號序列已經由Lp1-SST穿膜領域(以粗斜體字表示)所取代；
第22圖：使用膜蛋白軟體的二級結構預測SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/之Lp1-SST-Lsc融合蛋白的二級結構預測；
第23圖：AtRbcS::SPOR-SacB::NOS表現卡匣之核苷酸序列；
第24圖：AtRbcS::SPOR-Lsc::NOS表現卡匣之核苷酸序列；
第25圖：AtRbcS::Lp1-SST-SacB::NOS表現卡匣之核苷酸序列；
第26圖：AtRbcS::Lp1-SST-Lsc::NOS表現卡匣之核苷酸序列；
第27圖：Gateway pDestination載體；
第28圖：用於雙子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體：A.　AtRbcS::SPOR-SacB::NOS；B.　AtRbcS::SPOR-Lsc::NOS　C.　AtRbcS::Lp1-SST-SacB::NOS以及D.　AtRbcS::Lp1-SST-Lsc::NOS；
第29圖：TaRbcSp::SPOR-SacB::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；
第30圖：TaRbcSp::SPOR-SacB::TaRbcst TaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；
第31圖：TaRbcSp::SPOR-Lsc::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；
第32圖：TaRbcSp::SPOR-Lsc::TaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；
第33圖：TaRbcSp::Lp1-SST-SacB::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；
第34圖：TaRbcSp::Lp1-SST-SacB::TaRbcst TaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；
第35圖：TaRbcSp::Lp1-SST-Lsc::TaRbcst表現卡匣之核苷酸序列；
第36圖：TaRbcSp::SPOR-Lsc::TaRbcst+AtMYB32::IPT::35S表現卡匣之核苷酸序列；
第37圖：Gateway pDestination載體pBS:ubi::bar::NOS；
第38圖：用於單子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體：A. TaRbcS::SPOR-SacB:: TaRbcS以及B. TaRbcS::SPOR-SacB::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；
第39圖：用於單子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體：A. TaRbcS::SPOR-Lsc:: TaRbcS以及B. TaRbcS::SPOR-Lsc:: TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；
第40圖：用於單子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體：A. TaRbcS::Lp1-SST-SacB::TaRbcS以及B. TaRbcS::Lp1-SST-SacB:: TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；
第41圖：用於單子葉植物的轉形之Gateway pDestination載體：A. TaRbcS::Lp1-SST-Lsc::TaRbcS以及B. TaRbcS:: Lp1-SST-Lsc::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S；
第42圖：菸草之葉肉衍生的原生質體之單離：A)-B)4-6週的活體外葉子材料之解剖；預酵素的消化；C)4-6週的活體外葉子材料之消化；16小時孵育；D)原生質體懸浮液之收穫；E)富含原生質體中間相之分離；F)-G)完整的、富含葉綠體的原生質體；
第43圖：用於暫時性表現分析的菸草之葉肉衍生的原生質體之單離：A)-B)完整的、富含葉綠體的原生質體；C)液體濃化培養基內之原生質體的培養；D)可存活的原生質體；單離48小時後；
第44圖：用於安定的轉形的菸草之葉肉衍生的原生質體之單離：A)-B)完整的、富含葉綠體的原生質體；C)原生質體包埋的海溶菌斑瓊脂糖栓(sea plaque agarose plug)，第0天；D)可存活的原生質體；單離和包埋後6天；E)-F)包埋的和釋放的原生質體衍生之微癒合組織；單離和包埋後4週；
第45圖：來自菸草的葉肉原生質體衍生之微癒合組織的嫩芽之再生：A)釋放的微癒合組織於液體生長培養基A內，單離和包埋後6-7週；B-C)癒合組織於固化的生長培養基上之增殖；D)-E)自葉肉的原生質體衍生的癒合組織之嫩芽誘導以及再生；F)自再生的嫩芽之根部的發展；G)-H)於溫室圍阻下之植物的生長和發展；
第46圖：未轉形之原生質體的存活力之評估；單離後48小時；
第47圖：PEG-轉形的原生質體的存活力之評估；單離和轉染後48小時；
第48圖：菸草葉花盤之農桿菌媒介的的轉形：A)轉形的葉花盤之共同栽培，第0天；B)嫩芽之第1階段的起始；共同栽培後3天；
第49圖：經轉形的菸草葉花盤內之gfp表現的偵測：A)未轉形的葉花盤，白光；B)未轉形的葉花盤，gfp2濾片；C)未轉形的葉花盤，gfp3濾片；D)&G)Turbo gfp-轉形的葉花盤，白光；E)&H)Turbo gfp-轉形的葉花盤，gfp2濾片；F)&I)Turbo gfp-轉形的葉花盤，gfp3濾片；第50圖：RT-PCR樣品與對照的電泳。
徑1和13：1kb+DNA階梯，徑2：來自2 μL cDNA之sacB轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自經轉染的原生質體1(樣品9A)的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑3：來自1 μL cDNA的sacB轉錄品之擴增(樣品9A)，徑4：沒有反轉錄酶執行的對照反應(樣品9A)，徑5：沒有模板執行的對照反應(sacB引子)，徑6：來自2 μL cDNA之sacB轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自經轉染的原生質體1(樣品12A)的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑7：來自1 μL cDNA的sacB轉錄品之擴增(樣品12A)，徑8：沒有反轉錄酶執行的對照反應(樣品12A)，徑9：來自2 μL cDNA的18S轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自未經轉染的原生質體的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑10：來自1 μL cDNA的18S轉錄品之擴增，該cDNA係藉由來自未經轉染的原生質體的mRNA用基因專一性引子之反轉錄所產生，徑11：沒有反轉錄酶執行的對照反應(未經轉染的原生質體)，徑12：沒有模板執行的對照反應(18S引子)。

Claims (20)

  1. 一種用於選自於下列所組成之群組的方法：(A)操縱一植物的光合細胞中的聚果糖生合成，(B)提高一植物內之聚果糖生合成途徑的生產力，以及(C)提高一植物內之生質量；該方法包括：將有效量的基因建構物導入至該植物之內，該基因建構物包括一受光調節的啟動子，操作地連接至一編碼細菌果糖轉移酶(FT)酵素的核酸，其中該編碼細菌果糖轉移酶(FT)酵素的核酸係來自於其之一編碼N-信號胜肽的序列被移除且被一次細胞定標序列或一編碼果糖轉移酶酵素之穿膜領域的序列所取代的核酸。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該編碼N-信號胜肽的序列係被一次細胞定標序列所取代，且其中該次細胞定標序列包含一液泡定標序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該液泡定標信號序列係來自於一編碼先原儲藏蛋白(preprosporamin protein)的序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該編碼N-信號胜肽的序列係被一編碼果糖轉移酶酵素之穿膜領域的序列所取代。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該編碼N-信號胜肽的序列係被一編碼蔗糖：蔗糖1-果糖轉移酶(1-SST)之穿膜領域的序列所取代。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該細菌FT酵素包括1-SST與聚果糖：聚果糖1-果糖轉移酶(1-FFT)酵素活性二者。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中編碼細菌FT酵素之該核酸係選自於以下所構成的群組：SacB、Lsc以及FTF基因。
  8. 一種用於選擇經轉形的植物的方法，該方法包括：將有效量的基因建構物導入至該植物之內，該基因建構物包括一受光調節的啟動子，操作地連接至一編碼細菌FT酵素的核酸，其中該編碼細菌FT酵素的核酸係來自於其之一編碼N-信號胜肽的序列被移除且被一次細胞定標序列或一編碼果糖轉移酶酵素之穿膜領域的序列所取代的核酸，以及選擇具有提高的生質量之植物。
  9. 一種能夠操縱一植物的光合細胞中的聚果糖生合成之基因建構物，該基因建構物包括受光調節的一啟動子，操作地連接至一編碼細菌FT酵素的核酸，其中該編碼細菌FT酵素的核酸係來自於其之一編碼N-信號胜肽的序列被移除且被一次細胞定標序列或一編碼果糖轉移酶酵素之穿膜領域的序列所取代的核酸。
  10. 如申請專利範圍第9項之基因建構物，其中該編碼N-信號胜肽的序列係被一次細胞定標序列所取代，且其中該次細胞定標序列包含一液泡定標序列。
  11. 如申請專利範圍第10項之基因建構物，其中該液泡定標信號序列係來自於一編碼先原儲藏蛋白的序列。
  12. 如申請專利範圍第9項之基因建構物，其中該編碼N-信號胜肽的序列係被一編碼果糖轉移酶酵素之穿膜領域的序列所取代。
  13. 如申請專利範圍第12項之基因建構物，其中該編碼N-信號胜肽的序列係被一編碼1-SST之穿膜領域的序列所取代。
  14. 如申請專利範圍第9項之基因建構物，其中該細菌FT酵素包括1-SST與1-FFT活性二者。
  15. 如申請專利範圍第14項之基因建構物，其中編碼細菌FT酵素的該核酸係選自於以下所構成的群組：SacB、Lsc以及FTF基因。
  16. 一種提高植物內的生質量之方法，該方法包括：將以下之有效量導入至該植物內(a)一能夠操縱該植物的光合細胞中之聚果糖生合成的基因建構物，該基因建構物包括一受光調節的啟動子，操作地連接至一編碼細菌FT酵素的核酸；以及(b)一能夠操縱該植物中的衰老之基因建構物。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該能夠操縱衰老之基因建構物包括myb基因啟動子或者經修飾的myb基因啟動子，或是其之功能性活性片段或變異體，操作地連接至一基因，其編碼涉及細胞分裂素的生合成之酵素，或是其之功能性活性片段或變異體。
  18. 一種經轉殖的植物細胞，其相對於未轉形之對照植物細胞，具有經修飾的聚果糖生合成特徵或者提高的生質 量；該植物細胞包括如申請專利範圍第9項之基因建構物。
  19. 如申請專利範圍第18項之經轉殖的植物細胞，其相對於未轉形之對照植物細胞，具有至少大概50%之增加的生質量。
  20. 如申請專利範圍第18項之經轉殖的植物細胞，其相對於未轉形之對照植物細胞，具有至少大概50%之增加的可溶性碳水化合物。
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