JP5827942B2 - フルクタン生合成の操作および植物バイオマスの増強 - Google Patents
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Description
・牧草地の生産性の改善、動物の生産性の改善および/または環境汚染の抑制をもたらす、牧草品質および/または収量が改善された飼料草、
・バイオエタノール生産用等のバイオマス収量が増強されたスイッチグラス、Miscanthus属、ソルガム(穀物、飼料およびエネルギー用ソルガム)、サトウキビおよびエネルギー用サトウキビ等、バイオエネルギー用草本および作物、
・穀物および/またはバイオマス収量が増加したコムギ、イネ、トウモロコシ、オオムギ等、穀類
の生産を促進することが望ましい。
電荷なし、極性:Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:Lys、Arg、His
他の保存されたアミノ酸置換を次の通り行ってもよい。
プロトンドナー:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトンアクセプター:Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
特に好ましい断片および変異体は、1または複数の保存されたスクロース結合/加水分解ドメインを含む。このようなドメインの例を図1に示すが、これはLDVWDSWP、QEWSGSA、LRDPHおよびDEIERを含む。
(a)植物の光合成細胞においてフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む遺伝的構築物と、
(b)植物の老化を操作することができる遺伝的構築物と、
を植物に導入するステップを含む方法が提供される。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法であって、上記方法は、細菌フルクトシルトランスフェラーゼ(FT)酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を上記植物に導入するステップを含む、方法。
(項目2)
上記プロモーターが構成的、組織特異的および誘導性プロモーターからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記プロモーターが光調節プロモーターである、項目2に記載の方法。
(項目4)
上記細菌FT酵素がスクロース:スクロース1−フルクトシルトランスフェラーゼ(1−SST)酵素活性およびフルクタン:フルクタン1−フルクトシルトランスフェラーゼ(1−FFT)酵素活性の両方を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
細菌FT酵素をコードする上記核酸がSacB、LscおよびFTF遺伝子からなる群より選択される、項目4に記載の方法。
(項目6)
植物における生化学的経路の生産性を増強する方法であって、上記方法は、FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を上記植物に導入するステップを含む、方法。
(項目7)
植物におけるバイオマスを増強する方法であって、上記方法は、1または複数のフルクタン生合成酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を上記植物に導入するステップを含む、方法。
(項目8)
形質転換植物を選抜する方法であって、上記方法は、1または複数のフルクタン生合成酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を上記植物に導入するステップと、バイオマスが増強された植物を選抜するステップとを含む、方法。
(項目9)
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、遺伝的構築物。
(項目10)
上記プロモーターが構成的、組織特異的および誘導性プロモーターからなる群より選択される、項目9に記載の遺伝的構築物。
(項目11)
上記プロモーターが光調節プロモーターである、項目10に記載の遺伝的構築物。
(項目12)
上記細菌FT酵素がスクロース:スクロース1−フルクトシルトランスフェラーゼ(1−SST)酵素活性およびフルクタン:フルクタン1−フルクトシルトランスフェラーゼ(1−FFT)酵素活性の両方を含む、項目9に記載の遺伝的構築物。
(項目13)
細菌FT酵素をコードする上記核酸がSacB、LscおよびFTF遺伝子からなる群より選択される、項目12に記載の遺伝的構築物。
(項目14)
植物におけるバイオマスを増強する方法であって、有効量の
(a)上記植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、遺伝的構築物と、
(b)上記植物の老化を操作することができる遺伝的構築物と
を上記植物に導入するステップを含む、方法。
(項目15)
上記プロモーターが光調節プロモーターである、項目14に記載の方法。
(項目16)
老化を操作することができる上記遺伝的構築物が、サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したmyb遺伝子プロモーターもしくは改変されたmyb遺伝子プロモーターまたはそれらの機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
項目9に記載の遺伝的構築物を含み、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成特徴が改変された、またはバイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
(項目18)
非形質転換対照植物と比べてバイオマスが少なくとも約50%増加した、項目17に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
(項目19)
非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が少なくとも約50%増加した、項目17に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
細菌フルクタン生合成遺伝子の単離
図1は、Bacillus subtilisから得られたSacBタンパク質の略図を提示する。示されている4個の異なる領域は、N末端シグナル配列、N末端可変領域、触媒コアおよびC末端可変領域である。構造的には、細菌イヌロスクラーゼおよびレバンスクラーゼの多くは、N末端シグナルペプチド、触媒三連構造を共有する。この配列は配列改変の際に除去される。スクロース結合に関与する残基は触媒コア配列内部に位置するが、これは改変の際に手をつけずにおく。
・翻訳開始等、コドン使用の単子葉植物および双子葉植物への適応、
・潜在性スプライス部位およびRNA不安定化配列エレメントの除去、
・単子葉植物および双子葉植物の液胞ターゲティング配列ならびに植物1−SST特異的膜貫通ドメイン等、推定細胞内ターゲティング配列を用いてコード配列をさらに改変する。
細菌フルクタン生合成遺伝子の改変
細菌FT遺伝子の特異的細胞区画へのターゲティング
細菌FT遺伝子をサイトゾルから離れてスクロースおよびフルクタンの両方が蓄積する区画に方向付けるため、サツマイモ(Ipomoea batatas)のプレプロスポラミンタンパク質(SPOR531)由来の推定液胞ターゲティング配列を用いてSacBおよびLscのコード配列を改変する。スポラミン前駆体のプロペプチドは、スポラミンの液胞へのターゲティングに必要とされる(Hattoriら、1985年)。スポラミンの液胞ターゲティング情報はアミノ末端プロペプチドにコードされ、これは図5および図6に示されている。
SOSUIソフトウェアは、Lolium perenne 1−SST遺伝子の二次構造を予測するためにも用いた。N末端に膜貫通ドメインを示唆するこの構造を図13に示す。膜貫通ドメインコード配列およびタンパク質配列をそれぞれ図14および図15に示す。
双子葉植物における安定的な形質転換のためのベクターの作製
発現構築物の合成
双子葉植物に形質転換するための、光合成(photosyntheic)プロモーター、実施例2に示されている改変された細菌フルクタン生合成遺伝子およびNOSターミネーター配列を利用した発現構築物を人工合成する。
各合成発現カセットを、Gateway法に使用可能なpDONORベクター内に配置して、植物の形質転換用の最終的な目的ベクターに組み換える。
AtRbcS::SPOR−SacB::NOS(図28A)
AtRbcS::SPOR−Lsc::NOS(図28B)
AtRbcS::Lp1−SST−SacB::NOS(図28c)
AtRbcS::Lp1−SST−Lsc::NOS(図28d)
(実施例4)
単子葉植物における安定的な形質転換のためのベクターの作製
発現構築物の合成
単子葉植物の形質転換用の、パンコムギ光合成プロモーター(TaRbcsp)、実施例2に示されている改変された細菌フルクタン生合成遺伝子およびTaRbcSターミネーター配列を利用した発現構築物を人工合成する。光合成プロモーターの使用はフルクタンを蓄積する組織において遺伝子を発現させ、一方改変された配列はタンパク質を特異的植物細胞区画に標的化させる。
Triticum属の光合成プロモーターによって駆動される改変された細菌FT遺伝子を含む単子葉植物形質転換のための構築物の作製
各合成発現カセットを、Gateway法に使用可能なpDONORベクター内に配置して、植物の形質転換用の最終的な目的ベクターに組み換える。
TaRbcS::SPOR−SacB::TaRbcS(図38A)
TaRbcS::SPOR−SacB::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S(図B);
TaRbcS::SPOR−Lsc::TaRbcS(図39A)
TaRbcS::SPOR−Lsc::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S(図39B)
TaRbcS::Lp1−SST−SacB::TaRbcS(図40A)
TaRbcS::Lp1−SST−SacB::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S(図B)
TaRbcS::Lp1−SST−Lsc::TaRbcS(図41A)
TaRbcS::Lp1−SST−Lsc::TaRbcS+AtMYB32::IPT::35S(図41B)
(実施例5)
双子葉植物用構築物 − N.tabacumプロトプラストおよびA.thaliana
直接送達バージョン(プロトプラストにおける一過性発現)ならびにシロイヌナズナ(A.thaliana)およびタバコ(N.tabacum)への安定的な送達のためのバイナリー形質転換ベクターバージョンの、次の構築物を作製した。
1.AtRbcS::1−SST−SacB*
2.AtRbcS::SPOR−SacB*
3.AtRbcS::1−SST−Lsc*
4.AtRbcS::SPOR−Lsc*
*細菌レバンスクラーゼおよびイヌロスクラーゼ配列は、次の仕方で改変する:
・細菌N−シグナルペプチドの除去、
・翻訳開始等、コドン使用の単子葉植物および双子葉植物への適応、
・潜在性スプライス部位およびRNA不安定化配列エレメントの除去、
・単子葉植物および双子葉植物の液胞ターゲティング配列ならびに植物1−SSTおよびFFT特異的膜貫通ドメイン等、推定細胞内ターゲティング配列を用いてコード配列をさらに改変する。
ポリエチレングリコールを介したタバコ葉肉由来プロトプラストの形質転換
本実施例は、上文に記載されている発現カセットのタバコプロトプラストへの送達を説明する(図42〜45を参照)。
A.葉肉由来プロトプラストを得るためのin vitroシュート培養物の消化
酵素溶液
K4培地[0.3Mではなく0.4Mスクロースを含むK3培地]に溶解した1.0%(w/v)セルラーゼ「Onozuka」R10および1.0%(w/v)Macerozyme(登録商標)R10。酵素標品の混入デンプンをペレット化させるため、スピンダウンする(Sorvall遠心分離機、SS34ローター;7,000rpmで10分間)。KOHでpH5.6に調整し、濾過滅菌(0.2μm孔径)する。4℃で長くて3〜4週間保存する。
・固形MS培地とNicotiana tabacumシュート培養物の入った400ml培養容器
・90×20mm滅菌ペトリ皿
・ピンセット
・メス
・滅菌メス刃;#11または#22 。
・酵素溶液;K4培地に溶解した1%セルラーゼおよび1%マセロザイム
・滅菌水 。
1.プレート底部をたっぷりと覆うのに十分な量の酵素溶液(15mlで十分と思われる)を滅菌90×20mmペトリ皿にデカントする。
2.4〜6週目のシュート培養物から健常で十分に開いた葉を2〜4枚、空の90×20mmペトリ皿に移す。
3.1枚の葉の背軸面を上にして、周囲の葉組織の断裂を最小限に抑えつつ鋭利な滅菌刃を確実に用いて慎重に主脈を除去する。これを残り3枚の葉に繰り返す。1回当たり少量の葉材料(最大4枚)を取り扱い、層流による乾燥効果を最小限に抑える。
4.半分にした葉を穏やかに積み重ね、鋭利な滅菌刃を用いて1〜2mm片にスライスする。
5.葉切片を酵素溶液の入ったペトリ皿に慎重に移す(背軸面を下に)。皿をParafilm(登録商標)で封じ、16〜18時間、25℃、暗所で振盪せずに一晩インキュベートする。
材料
・滅菌5mlピペット
・滅菌10mlピペット
・ピペットボーイ
・滅菌したプロトプラスト濾過ユニット:100mlガラスビーカー上に載せた100μmステンレス鋼メッシュ篩
・滅菌14mlプラスチック製丸底遠心チューブ
・Clements Orbital 500卓上遠心分離機
・ウォーターバス 。
・消化中のNicotiana tabacum葉の入った90×20mm滅菌ペトリ皿(複数可)
・0.6%Sea Plaque(商標)アガロースを含む、1:1混合のK3:H固形培地 。
・オートクレーブしたW5溶液
・オートクレーブしたK3溶液 。
6.一晩消化した標本を穏やかに撹拌して酵素溶液中にプロトプラストを遊離させる。
7.プレートをやや傾け、消化中の懸濁液(酵素溶液および植物デブリ)を移し易くする。10ml滅菌ピペットを用いて消化中の懸濁液を滅菌したプロトプラスト濾過ユニットに移し、プロトプラスト懸濁液を植物デブリから分離する。
8.濾過ユニットを穏やかにタップして篩内にたまった余分な液体を出す。
9.プロトプラスト懸濁液を穏やかに混合し、14ml滅菌プラスチック製丸底遠心チューブに分配し、約8mlまで(最大9ml)充填する。
10.懸濁液を再分配して均一な容量分配を得る(最大9ml)。
11.各懸濁液に1.5mlのW5溶液を慎重に重層する。
W5溶液を分注し易くするため、懸濁液の入ったチューブを傾けて置き、ピペットチップをチューブ開口部近くの壁面に触れさせ、その後懸濁液面のすぐ上までゆっくりと下げる。一滴ずつ加えながら、ピペットチップが可能な限り懸濁液面に近づいた状態を確実に維持しつつW5溶液をゆっくりと分注する。これを正確に行えば、プロトプラスト懸濁液の撹拌、ひいてはW5溶液との混合は最小限となるであろう。
12.慎重に蓋をし、チューブを5分間、70gで遠心分離する(Clements Orbital 500卓上遠心分離機、スイングアウトローター、400rpm)。プロトプラストは、界面に浮遊している筈である。
13.プロトプラストの入ったチューブを直立に維持し、滅菌5mlピペットをプロトプラスト層のすぐ上のポイントまで慎重に下げて、下相を可能な限り取らないよう界面におけるプロトプラストを採取する。
W5溶液も同時に採取される。
14.プロトプラストを採取し、「1本」の新しい14ml遠心チューブに移す。プロトプラスト採取が完了したら、ピペッティングで穏やかに吸って吐くことによりプロトプラスト懸濁液を穏やかに混合する。
15.プロトプラスト懸濁液の100μlアリコートを取り分け、900μlのW5溶液の入ったチューブに移すことにより、プロトプラスト収量を決定する。血球計算板でプロトプラストを計数し、1ml当たりのプロトプラスト数を決定する。
16.1ml当たり約1×106(最大1.5×105)個のプロトプラストを得るのに必要な全容量を算出する。新しい14ml丸底遠心チューブにプロトプラスト懸濁液を分配し、等容量が得られたことを確実にする。
17.10mlピペットを用いて、プロトプラストの入った各チューブを全容量最大10mlまでW5溶液で充填する。プロトプラストが乱れるのを最小限に抑えるため、充填の際チューブ壁に沿わせてW5溶液を散布する。
18.蓋をし、蓋閉めしたチューブを穏やかに1回反転することによってプロトプラストを再懸濁する。
19.プロトプラストをペレット化し[70g(Clements Orbital 500卓上遠心分離機、400rpm)5分間でスピンする]、その後W5溶液を全て除去して純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。
20.穏やかに振盪することによりプロトプラスト懸濁液を再懸濁する。
21.プロトプラストの入った各チューブを全容量5mlまでW5溶液で充填し、室温で最短で1時間、最長で4時間インキュベートする。
22.1〜4時間のインキュベーション時間の間に、単離プロトプラストに直接遺伝子導入するための調製物に次の構成要素を構成する。
DNA形質転換
100%(v/v)エタノールで沈殿および洗浄することによりプラスミドDNAを滅菌し、層流フード内で乾かす[70%エタノールにおけるプラスミドDNAの沈殿も可能であるが、DNAペレットは乾かすのにさらに時間がかかる]。一過性形質転換のため、終濃度0.7μg/μlになるようDNAペレットを30μlの滅菌再蒸留水に再懸濁する。DNAの物理的構造は、一過性のためにはスーパーコイルとなるべきであり、安定的な形質転換のためには直鎖化するべきである(対象遺伝子の外側で)。形質転換プラスミドDNAにキャリアーDNA(例えば、魚精子DNA)を添加すると、通常、より良好で安定的な形質転換頻度が得られる。安定的な形質転換のため、上に示す通り10μgの直鎖化プラスミドDNAおよび40μgの剪断した魚精子DNAを共沈殿し、乾かし、30μlの滅菌再蒸留水に溶解する。
15mM MgCl2、0.1%(w/v)モルホリノエタンスルホン酸(MES)および0.5Mマンニトール。蒸留水に溶解した後、KOHでpH5.8に調整し、オートクレーブする。4℃で保存する。
0.4Mマンニトールおよび0.1M Ca(NO3)2中の40%(w/v)PEG4000。PEGを0.4Mマンニトールおよび0.1M Ca(NO3)2に溶解する(これら2種の構成要素の終濃度は、PEGの容量のため低くなる)。pH8〜9に調整し、オートクレーブする(pHはこの溶液中で安定化するのに数時間、例えば一晩かかり、オートクレーブ後にpH6〜7に下がる)。
・滅菌1mlピペット
・滅菌5mlピペット
・滅菌10mlピペット
・ピペットボーイ
・滅菌14mlプラスチック製丸底遠心チューブ
・Clements Orbital 500卓上遠心分離機
・ウォーターバス
・50×10mmペトリ皿 。
・単離プロトプラスト懸濁液、ペレット化の入った14ml丸底遠心チューブ
・0.6%Sea Plaque(商標)アガロースを含む1:1混合のK3:H固形培地 。
・オートクレーブしたW5溶液
・オートクレーブしたK3溶液
・オートクレーブしたH溶液
・40%PEG溶液
・形質転換バッファー
・30μlの滅菌再蒸留水に溶解した10μgの形質転換DNA 。
1.プロトプラストをペレット化し[70g(Clements Orbital 500卓上遠心分離機、400rpm)で5分間スピンする]、その後W5溶液を全て除去し、純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。
2.1mlピペットを用いて、300μl(約7滴)の形質転換バッファーを単離プロトプラストの入った各14ml丸底遠心チューブに加える(滴下する)。
3.チューブ底を穏やかにタップすることによってペレットを慎重に再懸濁する。
4.各プロトプラスト懸濁液に10μg(30μl)の形質転換DNAを加え、その後300μl(1mlピペットを分注に用いる場合、約7滴)の予熱したPEG溶液を加える。チューブ底を穏やかにタップすることによってプロトプラスト懸濁液を混合する。
形質転換バッファーへのプロトプラスト再懸濁と形質転換DNAおよびPEGの添加との間の時間間隔は、最短を維持しなければならない。
5.形質転換混合物を15分間、室温で撹拌せずにインキュベートする。
6.10mlピペットを用いて、次の間隔で10mlのW5溶液を各チューブに徐々に加える。
7.プロトプラストをペレット化し[70g(Clements Orbital 500卓上遠心分離機、400rpm)で10分間スピンする]、その後全W5溶液を除去し、純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。次に進む前に、全チューブ底を1回タップする。
8.合計容量が最大5mlとなるよう、等容量のK3培地およびH培地(各溶液2.5ml)にプロトプラストペレットを再懸濁する。
9.液体K3:H+プロトプラスト懸濁液の混合液を50×10mmペトリ皿の中央にゆっくりと移す。
10.全皿をParafilm(登録商標)で封じ、一過性発現解析に進む前にプロトプラストを24〜72時間、薄明かりの下で24℃にて培養する。
11.次の「パートIII.葉肉由来プロトプラストの培養および植物体の再生」に続ける。
ステップ1&2のため、プロトプラストの入った各チューブは、一度に1チューブで取り扱わなければならない。
・滅菌1mlピペット
・滅菌5mlピペット
・滅菌10mlピペット
・ピペットボーイ
・Clements Orbital 500卓上遠心分離機
・ウォーターバス
・50×10mmペトリ皿
・オートクレーブしたステンレス鋼製スパチュラ
培地
・単離プロトプラスト懸濁液、ペレット化の入った14ml丸底遠心チューブ
・0.6%Sea Plaque(商標)アガロースを含む1:1混合のK3:H固形培地、40℃
・オートクレーブしたK3溶液
・20mlのA培地の入った250ml培養容器
・固形MS Morpho培地の入った12ウェルCostar(登録商標)プレート
・固形MS Morpho培地の入った250ml培養容器
・固形MS培地の入った250ml培養容器 。
1.プロトプラストペレットの近くに0.5mlのK3培地を加えて、プロトプラストを再懸濁する。
2.K3+プロトプラスト懸濁液の混合液を50×10mmペトリ皿の中央にゆっくりと移す。
3.次に進む前に、プロトプラストの入った全チューブに対しステップ1および2を繰り返す。
4.一度に1プレートで、予熱した0.6%Sea Plaque(商標)アガロースを含む1:1混合のK3:H培地を5ml加える。穏やかな旋回運動でプレートを1回だけ振盪して培地中のプロトプラスト懸濁液を均等に分布させる。全プレートに対しこれを繰り返す。
5.培地が固形化するまで(外気温に依存して10〜30分間)、プレートを放置し手をつけない。
6.全皿をParafilm(登録商標)で封じ、プロトプラストを24時間、完全な暗所で24℃にて培養し、続いて6日間連続的な薄明かり(5μmol・m−2s1、Osram L36 W/21 Lumilux白チューブ)の下で培養すると、最初の、そして複数の細胞分裂が行われる。
7.滅菌スパチュラを用いて、プロトプラストを含むsea plaqueアガロースプラグを四分円に分割し、適切な抗生物質を添加した20mlのA培地の入った250mlプラスチック製培養容器内に置く(250ml容器につき1個の四分円)。ロータリーシェーカー上で80rpm、1.25cm throw、24℃、連続的な薄明かりでインキュベートする。
8.2週間毎に液体A培地+適切な抗生物質を交換し、プロトプラスト由来コロニーの生長をモニターする。
9.プロトプラスト由来コロニーが直径約2〜3mmになったとき(液体A培地中で5〜6週間インキュベーション)、コロニーをMS Morpho固形培地の入った24ウェルCostar(登録商標)プレートの個々のウェルに移す。
10.プレート(複数可)を1〜2週間、24℃で連続的な薄明かり(5μmol・m−2s−1、Osram L36 W/21 Lumilux白チューブ)の下でインキュベートすると、カルスは増殖して直径8〜10mmのサイズに達する。
11.プロトプラスト由来カルスが直径約1〜2cmになったとき、カルスを固形MS Morpho培地の入った個々の250ml培養容器に移す。容器を24℃で16時間・明/8時間・暗条件下(20μmol・m−2s−1、Osram L36 W/21 Lumilux白チューブ)でインキュベートする。1〜2週間以内に、複数のシュートを目視できるようになる。
12.長さ3〜4cmのシュートを固形MS培地の入った250ml培養容器に移し、根形成を助長する。容器を24℃、16時間・明/8時間・暗条件下(20μmol・m−2s−1、Osram L36 W/21 Lumilux白チューブ)でインキュベートする。3週間以内に、根形成の徴候を目視できるようになる。
13.確立された根システムを備える小植物を、タバコ葉肉プロトプラストの供給源としてのin vitro植物培養物として維持する。
エバンスブルー染色を用いたタバコプロトプラスト生存率の評価
図46および図47を参照。
・エバンスブルー染色(EVB;6,6’−[(3,3’−ジメチル1[1,1’−ビフェニル]−4,4’−ジイル)ビス(アゾ)ビス[4−アミノ−5−ヒドロキシ−1,3−ナフタレンジスルホン酸]四ナトリウム塩)
・非蛍光色素
・作用方法:生細胞は、エバンスブルーを排除する能力を細胞膜に保持し、その本来の色を保つ。塩または浸透圧ストレスにより損傷を受けた細胞は、エバンスブルーを排除することができず紺青に染色され、検鏡により容易に識別できる。
・染色方法:エバンスブルー原液を等容量のプロトプラスト懸濁液に加えて穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートし、その後顕微鏡で可視化する。
(実施例8)
Nicotiana tabacumプロトプラストにおける遺伝子発現解析
実験目標:トランスフェクトしたタバコプロトプラストにおけるクローニングした遺伝子AtRbcS::1−SST−SacBおよびAtRbcS::SPOR−SacBの発現をRT−PCRを用いて試験した。
i)トランスフェクトしたプロトプラスト(試料9A):AtRbcS::1−SST−SacB
ii)トランスフェクトしたプロトプラスト(試料12A):AtRbcS::SPOR−SacB
iii)非トランスフェクトプロトプラスト 。
1.プライマー設計およびPCRの最適化
2.全RNAの単離
3.RT反応
4.qRT−PCRアッセイ
プライマー設計およびPCR産物の同一性:ビーコン設計ソフトウェア(Premier Biosoft International)および遺伝子バンクにおいて利用できる遺伝子配列を用いてプライマー対を設計して対象遺伝子を増幅した。その結果生じるPCR産物のサイズが200〜250bpの範囲になるよう遺伝子特異的プライマーを選択した。融解曲線解析およびゲル電気泳動に基づくサイズによりPCR産物を同定した。
全RNA単離:1処理当たり1×106個のプロトプラストからPROMEGA製のSV全RNA単離システムにより全RNAを単離する。http://www.promega.com/tbs/tm048/tm048.pdf
QIAGEN RTキットを用いてRT反応を行った。プライマーミックス(QIAGEN)を用いることにより4通りのRT反応を行った(9、12、対照およびWTタバコRNA)。
http://www1.qiagen.com/products/pcr/QuantiTectPcrSystems/QuantiTectRevTranscriptionKit.aspx#Tabs=t2
上述の試料それぞれの複製物を、遺伝子特異的プライマーを用いたRT反応に付した。具体的には、試料9Aおよび12AはsacBリバースプライマーを用いて、対照(非トランスフェクト)試料は18Sリバースプライマーで転写した。
反応を次の通りセットアップした。
2×GoTaq(登録商標)Green MasterMix(Promega) 10μL
cDNA鋳型 2.0μL
フォワードプライマー(10μM) 0.5μL
リバースプライマー(10μM) 0.5μL
ヌクレアーゼを含まない水 7.0μL 。
ステップ1:95℃ 2分間
ステップ2:95℃ 30秒間
ステップ3:55℃ 30秒間
ステップ4:72℃ 60秒間
ステップ2から25サイクル(18S)、あるいはステップ2から35サイクル(sacB)
ステップ5:4℃ ホールド 。
Agrobacterium tumefaciensを介したタバコリーフディスクの形質転換
本実施例は、上文に記載の発現カセットを用いて遺伝子操作したバイナリーベクターを運ぶアグロバクテリウムを用いたタバコリーフディスクの安定的な形質転換を説明する(図48および図49を参照)。
Agrobacterium tumefaciensを介したリーフディスク形質転換の利用は、トランスジェニック植物を作出する効率的な方法である。A.tumefaciensは、植物に感染して細菌DNAを植物ゲノムに組み入れるための遺伝的機構を含む天然の双子葉植物病原体である。この能力の結果、A.tumefaciensを、例えば特定の対象DNAをタバコに組み入れるためのクローニング媒体として採用することができる。
装置および器具
水平流の層流フード(シリーズHWS180、CLYDE−APAC、Evans Deakin Pty.Ltd.の一部門、ウッドビルノース、南オーストラリア州5012、オーストラリア)、ロータリーシェーカー(Infors型RC−406、Infors AG、CH−4103ボットミンゲン、スイス)、スイングアウトローターを備える卓上遠心分離機(Clements Orbital 500)、ピンセット(先曲がり(bend)、cat no.2108/160、Crown Scientific、ロウビル、ビクトリア州3178、オーストラリア)、滅菌外科手術用メス刃(サイズ11、cat no.1838、Laboratory Supply Pty.Ltd.、ミルペラ(Milperra)DC、ニューサウスウェールズ州1891、オーストラリア)を備えるメス柄(No3、cat no.SHN3、Crown Scientific、ロウビル、ビクトリア州3178、オーストラリア)を用いた。
全培地に必要なマクロ成分、ミクロ成分およびビタミンは、それらを添加する際に有用となるよう、濃縮ストック(マクロ成分ストック:10倍濃縮;ミクロ成分およびビタミンストック:100倍濃縮)として調製する必要がある。ミクロ成分以外の全ストックは、室温で調製する。ミクロ成分ストックの調製は、混合前に構成要素の加熱を必要とする。Na2−EDTAおよびFeSO4×7H2Oは、混合前にそれぞれ400mLの蒸留水(全容量1000mLに対し)に溶解する必要がある。溶解した溶液を混合し、溶液が黄色に変色するまでca.60℃で加熱する。残りの構成要素を添加する前に溶液を冷ます。溶液を蒸留水で1000mLとする。全ストックを4℃で保存する。ホルモン[2,4−D(2,4−ジクロロフェノキシ酢酸)およびカイネチン]を1M KOHに溶解し、蒸留水で希釈して100mg/リットル濃縮ストックを調製する。
それらの個々の原料を終濃度で用いた培地の組成を別表1に示す:MSミクロ、MSマクロ、B5ビタミン、Lauria Bertani培地、洗浄培地、PC培地、SEL培地、RM培地およびSEM培地。
2,4−D:2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、活性炭、チメンチン(同じ濃度のセフォタキシムに代替可能)、BAP(6−ベンジルアミノプリン)、ゼアチン、AgNO3、リファンピシン、寒天(Difco、Bacto−Agar、cat.no:0140−01)はゲル化剤とし用いる。他の化学薬品(PEG4000、Tween80、KOH、NH4OH、NaCl、KCl、Ca(NO3)2、MgCl2およびCaCl2)は、BDHから購入し、MES(2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸(ethanesulfuric acid))はSigma(Cat.No.N−8250)から、カナマイシン硫酸塩はSigmaから、ハイグロマイシンBはCalbiochemから、Ca(OCl)2(ほぼ65%)およびホスフィノトリシン(phosphinotricin)は、Roth and Riedel de Haenからそれぞれ購入される。スクロースはFluka(cat.no:84100)から購入した。Parafilm(登録商標)「M」(American National Can(商標)、グリニッジ、コネチカット州06836、米国)は、封密用テープとして用いた。滅菌使い捨て瓶上型フィルター(0.2μm vacucap90;cat.no.4622、Gelman Sciences(登録商標)Pty.Ltd.、チェルトナム、ビクトリア州3192、オーストラリア)および使い捨てフィルターユニット(0.2μm;cat.no.16534、Sartorius AG、37070ゲッティンゲン、ドイツ)をフィルター滅菌に用いた。滅菌使い捨てピペット:1mL_(TRP(登録商標);cat.no.94001)、5mL_(TRP(登録商標);cat.no.94005)および10ml_(TRP(登録商標);cat.no.94010)は全てLife Technologies Pty. Ltd.、モルグレイブ、3170オーストラリア製であり、ねじ蓋付き滅菌プラスチック製遠心チューブ(14mL、TRP(登録商標);cat.no.91016、Life Technologies Pty.Ltd.、モルグレイブ、3170オーストラリア)、滅菌プラスチック製ペトリ皿(90×14mm;cat.no.82.9923.484および60×14mm、cat.no.83.1801.011、Sarstedt(登録商標)Australia Pty.Ltd.、テクノロジーパーク、南オーストラリア州5095、オーストラリアならびに90×20mm;cat.no.664160、Greiner Labortechnik GmbH、72636フリッケンハウゼン、ドイツ)およびオートクレーブ可能培養容器(250mL、cat.no.75.9922.519、Sarstedt Australia Pty.Ltd、テクノロジーパーク、南オーストラリア州5095、オーストラリア)を用いた。
A)N.tabacum cv.Petit Havana SR1の滅菌シュート培養物を利用することができる。これは、次亜塩素酸塩溶液[1.4%(w/v)Ca(OCl)2、0.05%(v/v)Tween80]中で15分間表面滅菌し、滅菌蒸留水中で3〜4回リンスした後、0.8%(w/v)寒天で固形化した半分に薄めたMS培地(別表1)上に発芽のため播種した、対応する種子から確立する。2〜3枚の葉をつけたシュートを切り出し、250mL培養容器内の0.8%(w/v)寒天で固形化したMS培地上で25℃、16h/d明期(20μmol・m−2s−1、Osram L36 W/21 Lumilux白チューブ)で培養する。根の生えたシュートを、6週間の間隔で使用前に茎切断として数回継代培養する。
B)ガラス温室で育成したN.tobacumを利用してもよいが、後述[I.B)]の通り葉の表面滅菌が必要である。植え付けが深過ぎないこと、また湿り気が十分であることを確実にしつつ、種子を滅菌土壌に植える。16h/d明期(20umolm“2s”1、Osram L36 W/21 Lumilux白チューブ)条件下、25℃で培養し、Osmocoteスローリリース肥料を用いて施肥する。
C)リーフディスク形質転換に利用したAgrobacterium tumefaciens株はAGL1である。
形質転換したAgrobacterium tumefaciens株AGL1の前培養をタバコ形質転換日の2日前に開始し、滅菌条件が維持されていることを確実にする(pBinhph200のIDカードについては別表2を参照)。
1.−70℃で凍結したグリセロール細菌ストックの表面を接種(innoculation)用ループで掻き取り、滅菌チューブ内の2mLのLB(20mg/mLリファンピシン+10mg/Lスペクチノマイシンを含む)に接種する。24時間、28℃、150rpmでインキュベートする。
2.4mLのLB+抗生物質(12mL滅菌チューブ内)に0.25mLの前記24時間前培養物を接種する。6〜7時間、28℃でインキュベートする。
3.25mLの抗生物質なしLB(150mL滅菌フラスコ内)に0.025mlの前記6〜7時間前培養物を接種し、一晩28℃、150rpmでインキュベートする。
4.25mlの前記一晩前培養物に25mlのLBを加え、28℃でさらに90分間、150rpmで培養を継続する。
5.50mlの前培養物を遠心チューブに移し、Clements卓上遠心分離機において12分間、2,000rpm、室温でスピンする。
6.上清を除去し、ペレットを20mLのWMに穏やかに再懸濁する。OD600を測定する。細菌懸濁液にさらにWMを加え、最終OD600を0.45とする。この調製物をステップIII)の1に用いる。
A)タバコシュート培養物を用いたリーフディスクの調製
1.層流において、MS培地上で培養したタバコ植物体から4〜6枚の葉を収集する。葉をWMの入った1.5×9cmペトリ皿に置く。メスを用いて主脈を除去し、葉組織をほぼ1cm2四方に切る。この時点で、組織またはリーフディスクは、Agrobacterium tumefaciens(AGL1)による形質転換の準備が整った。ディスクは1時間以内に形質転換しなければならない。
B)非滅菌タバコ組織を用いたリーフディスクの調製
1.ガラス温室で育成したタバコ植物体から4枚の若い葉(ほぼ8cmの長さ)を収集する。
2.葉を70%エタノールの入った滅菌ビーカー内に置き、アルミホイルで覆い、円軌道シェーカー(Bio−Line円軌道シェーカー、Edwards Instrument Company)上で1分間、穏やかに旋回させる。
3.70%エタノールを除去し、1%Ca(OCl)2に交換する。組織を8分間旋回させる。葉を滅菌水中で少なくとも3回洗浄する。
4.層流において主脈を除去し、残りの葉組織をほぼ1cm2四方に切る。調製したディスクをWMの入った1.5×9cmペトリ皿内に置く。この時点でディスクは、Agrobacterium tumefaciens(AGL1)による形質転換の準備が整った。
1.WM(リーフディスク調製における最後のステップのもの)をアグロバクテリウム培養物に交換し、1〜2分間インキュベートする。
2.細菌懸濁液を除去し、外植片をWMで短時間リンスする。PC培地上に播く前に、滅菌ナプキンで外植片を拭き取る。3日間共存培養するため、育成室(16h/d明期(20μmol・m−2s−1、Osram L36 W/21 Lumilux白チューブ)条件、25℃)内に置く。
1.外植片(5/プレート)をSEL培地に移し、育成室にさらに7日間戻しておく。
1.外植片(5/プレート)をRMに移し、育成室に戻す。シュート形成は3〜6週間以内に起こるであろう。4週間後に外植片を新しいRMに移す。
2.カルスが大きくなり過ぎたら、特に培地に接触していないシュートがある場合、メスを用いてカルスを分割する。できるだけ多くのシュートを選抜に曝露させる。
1.選抜8週間後、あるいは選抜中の非形質転換対照外植片が死滅したとき、緑色のシュート(5/プレート)を9×2cmペトリ皿内のSEM培地(IBA(1mg/L)を含む)に移す。4〜5週間で根が出てくる筈である。
1.根が出たら、根の生えた小植物を組織培養容器内のSEM培地に移す。
Stewart、C.N.Jr.、Adang、M.J.、All、J.N.、Rayner、P.L.、Ramachandran、S.およびParrott、W.A.(1996年)Insect control and dosage effects in transgenic canola containing a synthetic Bacillus thuringiensis crylAc gene. Plant Physiol、112巻:115〜120頁 。
同じ発現カセットで改変したバイナリーベクターを有するAgrobacterium tumefaciensを用いたフローラルディップ法によるシロイヌナズナ(ARABIDPOSIS)の安定的な形質転換
電気的形質転換受容性のAgrobacterium tumefaciens細胞の調製
実験手順
1.−80℃凍結グリセロールストックから、Agrobacterium tumefaciens(AGL1株)を20mg/Lリファンピシンおよび100mg/Lアンピシリンを含むMGL寒天上に画線培養し、27℃で2日間インキュベートする。
2.5mlのMGLを50ml Falconチューブ内で測定し、リファンピシン20mg/Lおよびアンピシリン100mg/Lの終濃度となるよう加える。Agrobacterium tumefaciens AGL1のシングルコロニーを接種する。
3.150rpmの円軌道シェーカー上の傾いた試験管立てにおいて(ca.30度)27℃で24時間インキュベートする。
4.夕方、20mg/Lリファンピシンおよび100mg/Lアンピシリン(amplicillin)(500mlフラスコ内)を含む100mlのMGLに、500μlの一晩培養物を接種する。
5.27℃で一晩、150rpmの円軌道シェーカー上で0.4〜0.6(最大0.6)の間のOD600が得られるまでインキュベートする。過増殖した場合は下のコメントを参照。
6.オートクレーブしたJA10遠心チューブに細胞を移し、氷上で10分間冷やす。
7.JA10ローターを用いて10分間、9000rpm、4℃で遠心分離する。
8.培養に用いた500mlフラスコに注ぐことによって、上清を慎重に廃棄する(ペレットは非常に安定的というわけではない)。
9.20mlの氷冷10%グリセロールをJA10遠心チューブ内のペレットに加え、ボルテックス撹拌することによりペレットを再懸濁する。
10.懸濁液をJA20遠心チューブに注ぎ、JA20ローターを用いて10分間、10000rpm、4℃でスピンする。
11.500mlフラスコに注ぐことにより上清を廃棄する。
12.15mlの氷冷10%グリセロールをペレットに加え、ピペッティングにより再懸濁する。JA20ローターにおいて10分間、10000rpm、4℃で遠心分離する。
13.ステップ11および12を2回繰り返す。
14.ペレットを1mlの氷冷10%グリセロールに再懸濁し(ピペットまたはボルテックスによる)、滅菌マイクロチューブに移す。
15.微量遠心管において3分間、13000rpm、4℃でスピンする
16.最後に、ペレットを1mlの10%氷冷グリセロールに再懸濁する。
17.標識された1.7mlマイクロチューブに50μlバッチのアリコートを作成し、液体窒素中でスナップ凍結する。
18.液体窒素からチューブを取り出し、コンピテント細胞を−80℃で保存する。
A.tumefaciens細菌培養物を取り扱う間、ゴム手袋を着用する。全細菌廃棄物を500mlフラスコ内に集め、オートクレーブする。A.tumefaciensの100ml培養物が過増殖したら、20mg/Lリファンピシンを含む新しいMGL培地で1/3〜1/4希釈し、さらに1〜2時間インキュベートする。
実験手順
1.ジーンパルサーキュベットホルダーを氷上で予冷する。
2.コンピテントアグロバクテリウム(AGL1)細胞のアリコートを−80℃から取り出し、氷上で解凍する。
3.ジーンパルサー背面のメインスイッチを入れる。電圧を2.5kVに調整し(ディスプレイ上に「2.5」と記録されるまで「raise」ボタンを使う)、静電容量25μFDおよび抵抗600Ωにする。
4.50μl以上の容量の解凍した細胞に0.1μgのDNAを加える。
5.ピペッティングにより混合し、細胞/DNA混合液を予冷した0.2cm gapジーンパルサーキュベットに移す。
6.両方の電極に細胞が触れるよう、細胞をキュベット底面に慎重にタップまたは振盪する。
7.キュベットの外側をティッシュペーパーで乾かし、キュベットをキュベットホルダー内に置く。キュベット上の切れ込みは正確な方向付けを確実にする。キュベットがチャンバー底の接触点の間に収容されるまでキュベットホルダーをチャンバー内にスライドさせる。
8.ビープ音がするまで両方の赤いボタンを押すことによって細胞にパルスを与える。この機械は、充電の間はCHGを表示し、放電の際にビープ音を出す。細胞を戻して1分間氷上に置いて回復を助ける。
9.ガラス製注入器を用いて1mlのLB培地をキュベット内の細胞に加える。
10.懸濁液を吸って吐いて混合し、滅菌15mlチューブに移す。
11.傾いた試験管立て(ca.30度)を用いて150rpmの円軌道シェーカー上で1〜2時間、27℃でインキュベートする。
12.9mlのLBを細胞懸濁液に加えて徹底的に混合し、20mg/Lリファンピシンおよび適切な抗生物質(例えば、pPZPシリーズのベクターに対しては100mg/Lスペクチノマイシン)を含むLBプレート上にこの培養物100μlを播く。この懸濁液100μlを900μlのLBブロスの入った1.7mlマイクロチューブに移し、徹底的に混合し、適切な抗生物質を含む別のLBプレート上にその100μlを播く。上述の懸濁液から100μlを取り分け、新しい1.7mlマイクロチューブ内に置き、900μlのLBブロスを加える。徹底的に混合し、その100μlを適切な抗生物質を含む別のLBプレート上に播く。
13.プレートをパラフィルムで封じ、大きなシングルコロニーが目視できるようになるまで27℃で2〜3日間インキュベートする。
実験手順
1.50ml滅菌チューブ内で20mg/Lリファンピシンおよび適切な選抜抗生物質(すなわち、pZPシリーズに対しては100mg/Lスペクチノマイシン、pBinシリーズに対しては50mg/Lカナマイシン)を含む5mlのLBブロスにシングルコロニーを接種する。翌日に増殖の程度を密接にモニターできるよう、この操作は早朝に行うとよい。
2.チューブを暗所において27℃で24〜36時間、250rpmで振盪しつつインキュベートする。インキュベーションの最初の24時間の後、培養物の増殖を定期的に観察する。細胞が活発に増殖したら(非常に目に見える)インキュベーションをやめる。濁りの最初の徴候が見えた直後に、急速な増殖が行われるであろう。増殖時間は、個々の株および形質転換体に依存する。
3.各培養物をチェックして、AGL1が望ましいバイナリーベクターを含むことを立証するべきである。この操作は、セクション5.2に記されているプロトコールを用いて行う。
4.キュベット内に培養物の500μlアリコートを作成する。適切な抗生物質を含む500μlのLBブロスでブランク作成して、各読み込み値の間からOD600読み込み値を測定する。
5.OD600読み込み値が0.8から1.0の間の範囲となるまで培養物を増殖させる。
6.滅菌15mlチューブ内に、5.0mlの培養物および5.0mlの保存ストックを加える。ステップ7に進む前に徹底的に混合する。
7.しっかりと標識した滅菌クリオチューブ内に500μlのアリコートを作成する。液体窒素中でスナップ凍結する前に全チューブを反転する。必要とされるまで−80℃で保存する。PCR陰性であることが示された場合、全ストックを廃棄する。
1.1μlのアグロバクテリウム培養物を滅菌PCRチューブ内の9μlの滅菌MQ H2Oに加える。
2.細胞を98℃で5分間インキュベートする。チューブを氷に移す。
3.10μlの調製済2×PCRマスターミックスを加える。10μlの2×PCRマスターミックスは、次のものを含む。
10×Dynazymeバッファー 2μl
10mM dNTP 1.0μl
10μMフォワードプライマー(10μM) 1.0μl
10μMリバースプライマー(10μM) 1.0μl
Dynazyme IIポリメラーゼ(polymerise) 1μl
MQ水 3μl
4.陽性対照(50ngのオリジナルプラスミドDNA)および陰性対照(鋳型DNAなし)を含む。標準PCR条件用いて合計35サイクル行う。
2.94℃、30秒間
3.55℃、30秒間
4.72℃、1分間
5.72℃、10分間
ステップ2〜4を合計35回繰り返す。
5.PCR産物を1%アガロースゲルで解析する。
アグロバクテリウムを取り扱う間、手袋を着用する。あらゆる細菌およびDNA廃棄物を集めてオートクレーブする。ジーンパルサーキュベットは再使用可能である。蓋は70%EtOHに浸し、キュベットは水を張って閉鎖した入れ物の中でオートクレーブしてアグロバクテリウムを除去する。その後、キュベットは70%EtOH中に保存し、乾かした後に再使用することができる。
実験手順
植物材料の調製
1.実生用方形ケース(punnet)に種子栽培ミックスを充填し、盛り土を形成する。2層の防鳥ネットで覆い、ゴムバンドで各端を固定する。トレイに張った水の中に方形ケースを入れることによって、土壌を水で満たす。方形ケース当たりほぼ40体の植物を得るのに十分な種子を播く。
2.方形ケースを4℃に2〜3日間置くことにより、種子を春化処理する。方形ケースを22℃、蛍光灯(連続照明、55μmol・m−2s−1)下の育成チャンバーに移し、1週間に1回、Miracle−GroまたはAquasolを与える。
3.一次花序(bolt)が現れたら摘心し、二次花序を概ね2〜10cmの丈になるまで生長させる(概ね4〜6日間かかり、植物体は多数の未開花の花蕾をつけ、長角果(silique)は殆どない筈である)。ピンセットを用いて長角果または開花した花を全て慎重に取り除く。気孔が開くよう浸潤前に植物に十分に水をやる。浸潤前に土壌を水で飽和させて細菌溶液が土壌に吸収されるのを最小限に抑える。
4.LWSに詳細を入力し、バーコードを作成する。LWSバーコード詳細によって方形ケースを標識する。
1.朝に、適切な選抜抗生物質(すなわち、pPZPベクターに対し100mg/mlのスペクチノマイシン)を含む200mlのLB培地に、アグロバクテリウム保存ストック(セクション5.1)の単一のスターター培養物500μlを接種する。250rpmの円軌道シェーカー上で24時間、27℃でインキュベートする。およそ2個の方形ケースの植物を浸潤させるには200mlの培養物で十分である。
2.一晩培養した培養物を500ml遠心分離ボトルにおいて5500g、室温、15分間遠心分離して細胞をペレット化させる。可能な限り液体を除去しつつ上清を廃棄する。OD600読み込み値が約0.7〜0.9となるようペレットを浸潤培地(別表1を参照)に再懸濁する。
1.アグロバクテリウム溶液の半量を250ml容器内に置く。
2.方形ケースを逆さにし、ロゼット葉を含む植物体全体を細菌溶液に浸漬し、穏やかに振盪して気泡を追い出す。植物を2分間共培養する。
3.方形ケースを取り出して短時間水を抜くが、植物の周りの薄い水膜はそのままにしておく。植物をプラスチックフィルムで覆って湿度を維持し、育成室に戻して直射光を避ける。廃液をオートクレーブし、正しい処分のための化学廃棄物ドラム缶に捨てる。
4.A.thalianaの全方形ケースに対してステップ1〜3を繰り返して形質転換する。
5.詳細をLWSに入力し、バーコードを作成する。個々の方形ケースをLWSバーコード詳細で標識する。
6.翌日、鉢の覆いを取って直射光に戻し置く。植物が十分に発達した長角果をつけるまで植物に水をやる。
1.植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってこれを紙袋の中に入れ、1週間37℃で乾かしておく。袋をLWSバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
2.200ミクロンの篩を新しいA4用紙1枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が除去されるまでこのプロセスを繰り返す(注記:植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る)。種子を1.7mlマイクロチューブ内に入れ、LWSバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、LWSバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象と関連することに留意する。
3.種子を4℃保存に移す前に、種子を−20℃で24時間保存する。
種子の表面滅菌
1.層流フードで作業しつつ、滅菌する種子(150×15mmプレートにつき、40mg=ほぼ2000個の種子)を2.0mlマイクロチューブ内に置く。
2.1000μlの70%エタノールを加え、2分間放置する。
3.エタノールを除去し、1000μlの種子滅菌用溶液(4%塩素:水:5%SDSがそれぞれ8:15:1の比率)を加えてボルテックス撹拌によって徹底的に混合する。
4.Ratek「観覧車(ferris wheel)」上にチューブを置き、種子と溶液を確実に混合し、10分間放置する。
5.層流において滅菌用溶液を除去して滅菌水に交換する。チューブ(複数可)をボルテックス撹拌し、ベンチトップ遠心分離機で30秒間スピンして種子を沈降させる。水を除去し、さらに1mlの滅菌水に交換する。種子洗浄ステップは、目視できる泡が出なくなるまで繰り返すべきである(少なくとも4回)。最後の洗浄の後、約200μlの水を残して種子を浸す。
1.適切な選抜抗生物質(例えば、PZP200シリーズに対し8mg/Lのハイグロマイシン)を含む選抜発芽培地(SGM)を用いて150×15mmプレートを調製する。チメンチン(250mg/L)を入れて、アグロバクテリウムの増殖を阻害する。各プレート当たり約125mlのSGMが必要とされる。
2.層流フード内で作業しつつ、SGM寒天プレートの表面にわたって平行に滅菌メスをすべらせる(図4を参照)。この操作は種子を広げるのに役立つ。
3.先端を切り取った滅菌1mlチップを用いて、滅菌種子をピペットで取ってプレート上に置く。滅菌使い捨て延展器(spreader)を用いて種子を分布させる。
4.種子を4℃で2日間低温処理し、次に連続的な蛍光灯(55μmol・m−2s−1)下、22℃で育成する。
5.推定形質転換体は、6〜8葉ステージになったら土壌に移すことができる。ピンセット1本を用いて、根を確実にインタクトに保ちつつ植物を組織培養培地から慎重に取り出す。ARASYSTEMを用いて湿ったin−vitro混合土壌に移植する(別表2の図5を参照)。プラスチックチューブで覆う。新しいLWSバーコードを作成し、チューブを標識する。数日間チューブの上端をプラスチックラップで覆い、回復を助ける。
推定形質転換体を土壌に移して3日後、次のプロトコールを用いて個々の植物体を導入遺伝子の存在に関して分子的に特徴付けることができる。
1.試験するアルカリ処理した葉組織それぞれに対し、1×PCRバッファーミックスを調製する(詳細は後述を参照)。
2.1.7mlマイクロチューブ内で、200μlの0.25M NaOHを小型の若い葉(T1植物から採取)に加える。
3.チューブを沸騰水に2分間浸漬する。注記:煮沸の間に蓋がはじけ開くのを防ぐため、蓋をマイクロチューブ蓋ロックで固定する、あるいは蓋を細針で刺し通すこと。
4.煮沸後、チューブを水から取り出して、200μlの0.25M HClおよび100μlの0.25%(v/v)igepal[0.5M Tris HCl、pH8.0]を加える。チューブを沸騰水にさらに4分間浸漬する。
5.アルカリ処理した葉のごく一部(ほぼ2mm2)を取り出し、予め調製したPCRミックス中に置く。
10mM dNTP 1.0μl
10μMフォワードプライマー 1.0μl
10μMリバースプライマー 1.0μl
PWO DNAポリメラーゼ 1.0μl
MQ H2O 41.5μl
6.標準PCR条件を用いて35サイクルを行う。
2.94℃、30秒間
3.55℃、30秒間
4.72℃、1分間
5.72℃、10分間
ステップ2〜4を合計35回繰り返す。
7.PCR産物を1%アガロースゲルで解析する。
1.植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってこれを紙袋の中に入れ、1週間室温で乾かしておく。袋をLWSバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
2.200ミクロンの篩を新しいA4用紙1枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が取り除かれるまでこのプロセスを繰り返す(注記:植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る)。種子を1.7mlマイクロチューブ内に入れ、LWSバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、LWSバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象に関連することに留意する。
3.種子を4℃で保存する前に、T2種子を−20℃で24時間保存する(陽性トランスジェニックT2植物の選抜における真菌汚染の見込みを低減させるのに有用である)。
ARASYSTEMトレイ、ホルダー等を含む、アグロバクテリウムと接触したあらゆる入れ物は、市販の漂白剤および70%エタノールを用いて徹底的に消毒しなければならない。
序文
詳細に後述するプロトコールは、シングルコピーの導入遺伝子を有するホモ接合型植物の選抜に用いた方法を説明する。浸潤方法を用いた導入遺伝子のArabidopsis thalianaへの組み込みは、子房の受精前に雌しべで起こる。したがって、浸潤によって産生されたあらゆる種子で導入遺伝子を有するものはT1であると考えられる。T1種子が発芽してT1植物を産生し、これは次にT2種子を産生する。目標は、単一のインサートを有し導入遺伝子を発現する独立したトランスジェニック植物を、構築物につき少なくとも5個体得ることである。T1種子用に作成した各LWSバーコードは、別個の形質転換事象を表す。各T1植物のT2種子を収集するとき、新たなLWSバーコード番号を付与する。このLWSバーコードは、元々の形質転換事象に関する。
1.層流フード内で作業しつつ、約100個のT2種子を表面滅菌する(セクション7.1を参照)。
2.250mg/Lチメンチン(timetin)および8mg/Lハイグロマイシン(pPZP200−35s−hph−35stに対する選抜剤)を含む選抜SGM培地上に、1プレート当たり約25個の種子を播く(合計4枚)。
3.種子を4℃で2日間低温処理し、次に連続照明(55μmol.m−2.s−1)、22℃の育成室に移す。
4.2週間後、ハイグロマイシンに対して抵抗性または感受性を有する植物の分離解析を行う。
5.推定形質転換体が6〜8葉ステージになったら、Arasystemを用いて少なくとも10個体の植物を土壌に移す。新たなLWSバーコードを作成し(元々の形質転換と関連する)、各植物体をバーコードで個々に標識する。チューブをプラスチックフィルムで数日間覆って回復を助ける。
6.個々の植物それぞれが組み込まれた導入遺伝子を有することを確認するため、アルカリ処理した葉組織の方法を用いる(セクション7.3)。LWSをアップデートする。
7.植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってそれを紙袋に入れ、1週間37℃で乾かしておく。袋をLWSバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
8.200ミクロンの篩を新しいA4用紙1枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が取り除かれるまでこのプロセスを繰り返す(注記:植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る)。種子を1.7mlマイクロチューブ内に入れ、LWSバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、LWSバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象に関連することに留意すること。
9.種子を4℃保存に移す前に、種子を−20℃で24時間保存する(陽性トランスジェニックT3植物の選抜における真菌汚染の見込みの減少に役立つ)。
1.ハイグロマイシンに対して抵抗性または感受性のいずれかを有する各系統から得られたT2植物の総数を採点する。
2.T−DNAが1遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は3:1となる筈である。T−DNA遺伝子座が2遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は15:1となる筈である。T−DNAが3以上の遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は>15:1となる筈である。
3.カイ2乗(χ2)統計検定を用いて、分離データが特定の仮説にどの程度適合するか決定する。
4.導入遺伝子のシングルコピーを含むことをカイ2乗解析が示すトランスジェニック系統の育成を継続する。
5.LWSをアップデートする。
導入遺伝子組み込みの立証:ゲノムDNAソースとしてのアルカリ処理した葉組織
1.各T2植物につき小型の葉を1枚収集する。
2.アルカリ処理した葉のプロトコール(セクション7.3)に従い、導入遺伝子の存在を決定する。
3.LWSをアップデートする。
1.単一の導入遺伝子挿入を含むことを示すT2トランスジェニック系統の育成を継続する。
2.T2種子を採取し(セクション8.2)、LWSをアップデートして新たなバーコードを作成する。
3.ほぼ40個のT3種子をSGM上で発芽させる。
4.2週間後、ハイグロマイシンに対し抵抗性または感受性のいずれかを有する各系統由来のT3植物の総数を採点する。
5.ホモ接合型T3系統は、感受性植物の不在によって示されるであろう。
6.推定形質転換体が6〜8葉ステージになったら、Arasystemを用いて少なくとも20個体の植物を土壌に移す。新たなLWSバーコードを作成し、各植物を個々にバーコードで標識する。チューブをプラスチックフィルムで数日間覆い回復を助ける。
7.系統の単一挿入がホモ接合型であることをさらに検証するため、アルカリ処理した葉組織の方法を用いて(セクション7.3)、全植物が導入遺伝子を含むことを確認する。LWSをアップデートする。
8.推定ホモ接合型系統から十分な材料を収集してサザンハイブリダイゼーションを行い、導入遺伝子の組み込み数を確認する。LWSをアップデートする。
9.セクション8.2に記されているプロトコールに従って、種子をT3ホモ接合型系統から収集する。
Claims (22)
- 植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法であって、
前記方法は、細菌フルクトシルトランスフェラーゼ(FT)酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含み、
ここで、細菌FT酵素をコードする前記核酸は、N−シグナルペプチドをコードする配列が除去され、細胞内ターゲティング配列またはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインをコードする配列に置き換えられたものであり、
前記光調節プロモーターは、リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット(RbcS)プロモーターである、方法。 - N−シグナルペプチドをコードする前記配列が、細胞内ターゲティング配列によって置き換えられており、そして前記細胞内ターゲティング配列は、液胞ターゲティング配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記液胞ターゲティング配列が、プレプロスポラミンタンパク質に由来する、請求項2に記載の方法。
- N−シグナルペプチドをコードする前記配列が、フルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインをコードする配列によって置き換えられている、請求項1に記載の方法。
- 前記フルクトシルトランスフェラーゼ酵素が、スクロース:スクロース1−フルクトシルトランスフェラーゼ(1−SST)である、請求項4に記載の方法。
- 前記細菌FT酵素が1−SST酵素活性およびフルクタン:フルクタン1−フルクトシルトランスフェラーゼ(1−FFT)酵素活性の両方を含む、請求項1に記載の方法。
- 細菌FT酵素をコードする前記核酸がSacB、LscおよびFTF遺伝子からなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- 植物におけるフルクタン生合成経路の生産性を増強する方法であって、
前記方法は、細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含み、
ここで、細菌FT酵素をコードする前記核酸は、N−シグナルペプチドをコードする配列が除去され、細胞内ターゲティング配列またはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインをコードする配列に置き換えられた配列を含み、
ここで、前記光調節プロモーターは、リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット(RbcS)プロモーターである、方法。 - 植物におけるバイオマスを増強する方法であって、
前記方法は、細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含み、
ここで、細菌FT酵素をコードする前記核酸は、N−シグナルペプチドをコードする配列が除去され、細胞内ターゲティング配列またはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインをコードする配列に置き換えられた配列を含み、
ここで、前記光調節プロモーターは、リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット(RbcS)プロモーターである、方法。 - 形質転換植物を選抜する方法であって、
前記方法は、細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップと、
バイオマスが増強された植物を選抜するステップとを含み、
ここで、細菌FT酵素をコードする前記核酸は、N−シグナルペプチドをコードする配列が除去され、細胞内ターゲティング配列またはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインをコードする配列に置き換えられた配列を含み、
ここで、前記光調節プロモーターは、リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット(RbcS)プロモーターである、方法。 - 植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、
細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含み、
ここで、細菌FT酵素をコードする前記核酸は、N−シグナルペプチドをコードする配列が除去され、細胞内ターゲティング配列またはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインをコードする配列に置き換えられた配列を含み、
ここで、前記光調節プロモーターは、リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット(RbcS)プロモーターである、遺伝的構築物。 - N−シグナルペプチドをコードする前記配列が、細胞内ターゲティング配列によって置き換えられ、
そして前記細胞内ターゲティング配列は、液胞ターゲティング配列を含む、請求項11に記載の遺伝的構築物。 - 前記液胞ターゲティング配列が、プレプロスポラミンタンパク質をコードする遺伝子に由来する、請求項12に記載の遺伝的構築物。
- N−シグナルペプチドをコードする前記配列が、フルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインをコードする配列によって置き換えられる、請求項11に記載の遺伝的構築物。
- 前記フルクトシルトランスフェラーゼ酵素が、1−SSTである、請求項14に記載の遺伝的構築物。
- 前記細菌FT酵素が1−SST酵素活性および1−FFT酵素活性の両方を含む、請求項11に記載の遺伝的構築物。
- 細菌FT酵素をコードする前記核酸がSacB、LscおよびFTF遺伝子からなる群より選択される、請求項16に記載の遺伝的構築物。
- 植物におけるバイオマスを増強する方法であって、有効量の
(a)前記植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、
細菌FT酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、
遺伝的構築物と、
(b)前記植物の老化を操作することができる遺伝的構築物と
を前記植物に導入するステップを含み、
ここで、前記光調節プロモーターは、リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット(RbcS)プロモーターである、方法。 - 老化を操作することができる前記遺伝的構築物が、サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したmyb遺伝子プロモーターもしくは改変されたmyb遺伝子プロモーターまたはそれらの機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、請求項18に記載の方法。
- 請求項11に記載の遺伝的構築物を含み、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成特徴が改変された、またはバイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
- 非形質転換対照植物と比べてバイオマスが少なくとも約50%増加した、請求項20に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
- 非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が少なくとも約50%増加した、請求項20に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
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