KR101209345B1 - 변형된 카로테노이드 수준을 갖는 형질전환 파인애플 식물및 그 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형질전환된 세포에서 카로테노이드의 축적, 및 일부 구체예에서는, 이들 세포의 색을 조절하는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 이용하여 파인애플 세포를 형질전환시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 형질전환된 세포로부터 파인애플 식물을 재생시키는 것을 제공한다. 또한, 본 발명은 도입된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 포함하는 파인애플 세포와 식물을 제공한다.

형질전환 파인애플

Description

변형된 카로테노이드 수준을 갖는 형질전환 파인애플 식물 및 그 생산 방법 {TRANSGENIC PINEAPPLE PLANTS WITH MODIFIED CAROTENOID LEVELS AND METHODS OF THEIR PRODUCTION}

37 C.F.R.§1.71(e)에 따라, 출원인은 이 명세서의 일부가 저작권 보호를 받는 내용을 함유함을 알린다. 저작권자는 특허 문서 또는 특허 개시의 어느 것에 의한 복제가 특허청 특허 파일 또는 기록에서 나타나는 것에 반대하지 않지만, 그외에는 무엇이든 모든 저작권을 보유한다.

본 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 통합되는 2002년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 제60/431,323호의 이익을 주장한다.

많은 과일과 야채는 우수한 건강에 기여하는 다수의 식물 화합물을 함유한다. 유행병학적, 임상적, 및 실험적 연구는 다양한 카로테노이드가 관상 심장 질병(Barton-Duell (1995) Endocrinologist, 5: 347-356), 일부 암(Giovannucci (1999) J. Natl. Cancer Inst., 91:317-331), 및 연령-관련 반점 변성(Seddon et al. (1994) J. Am. J. Med.Assoc., 272: 1413-1420)을 비롯한 만성 질병의 개시를 감소시킴을 제안한다. 따라서, 식물에서 유전적 조작에 의한 카로테노이드 생합성의 조절은 작물의 영양 품질에 영향을 준다.

파인애플 식물(브로멜리아세 과(bromeliaceae)의 아나나스 코모서스(Ananas Comosus))은 단단한 가시가 있는 가장자리를 가진 휘어진 잎과 작은 미성숙 꽃의 조밀한 타원형 헤드를 가진 짧은 줄기를 가진 열대성 단자엽 식물이다. 파인애플 식물의 많은 변종의 과일은 사람들이 소비한다. 이들 변종 중 일부는 스무스 케이엔, 레드 스페니쉬, 페로레라, 페르남부코, 및 프리마베라를 포함한다. 상기 식물은 자가양립형이 아니며, 연속적인 과일 세대사이의 기간이 길다. 그 결과, 과일 품질 및 다른 작물학적 형질을 개선하기 위한 종래의 육종은 어려웠다.

전술한 개시로부터, 변형된 카로테노이드 수준을 갖는 형질전환 파인애플 식물이 바람직함이 명백하다. 특히, 과일 조직에서 증가된 카로테노이드 수준을 갖는 파인애플 식물은 이 중요한 작물의 영양적 품질을 개선할 것이다. 또한, 변형된 색을 갖는 유전적으로 형질전환된 파인애플 식물은 특히 제품 분화를 위해 바람직하다. 이들 및 본 발명의 다양한 다른 특징은 하기 설명을 완전히 검토하면 명백해질 것이다.

본 발명은 파인애플 식물에서의 카로테노이드 생성에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 파인애플 세포 또는 식물에서 카로테노이드 생합성을 조절하는 발현 조절자를 이용하여 파인애플 세포 또는 식물을 유전적으로 형질전환시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 파인애플 식물 색, 특히 과일 조직 색을 바꾸는 방법에 더하여, 파인애플 세포에서의 카로테노이드 축적을 조절하는 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 파인애플 세포에서 카로테노이드의 축적을 조절하는 도입된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 포함하는 파인애플 세포를 제공한다. 이들 파인애플 세포로부터 재생된 파인애플 식물 또한 제공된다.

한 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 파인애플 세포(예, 배발생 세포, 기관형성 세포, 배발생 캘러스 세포, 기관형성 캘러스 세포, 등)에서 카로테노이드 축적을 조절하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 파인애플 세포내로 도입하는 것을 포함한다. 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자가 없는 파인애플 세포에서 카로테노이드의 축적에 비하여, 파인애플 세포에서 카로테노이드의 축적을 증가시키거나 감소시킴으로써 파인애플 세포에서 카로테노이드의 축적을 조절한다. 일부 구체예에서, 파인애플 세포는 하나 이상의 분열조직 세포(예, 비-정상(non-apical) 분열조직 세포 등)를 배양함으로써 생산된 기관형성 세포이다. 이들 구체예의 일부에서는, 배양은 분열조직 세포를 배양하여 하나 이상의 슈트(shoot)를 생산하고, 이들 슈트로부터의 하나 이상의 외식편(explant)을 배양하여 기관형성 세포를 생산하는 것을 포함한다.

하나 이상의 파인애플 세포에서 카로테노이드 축적을 조절하는 방법은 선택적으로 파인애플 세포(예, 배발생 세포, 기관형성 세포 등)로부터 하나 이상의 파인애플 식물을 재생시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 파인애플 세포는 파인애플 세포의 집단을 포함하며, 상기 방법은 추가로 (i) 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 포함하는 파인애플 세포의 집단중 하나 이상의 구성원을 선별하는 단계; (ii) 상기 구성원으로부터 하나 이상의 파인애플 식물을 재생시키는 단계; 및 (iii) 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자가 없는 파인애플 식물에서의 카로테노이드의 축적에 비하여 변화된 카로테노이드의 축적에 대해 파인애플 식물을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 카로테노이드의 축적의 변화는 파인애플 식물의 과일 조직에 특이적이다. 상기 방법은 또한 선택적으로 파인애플 식물을 미세증식시키는 것을 포함한다.

다른 태양에서, 본 발명은 파인애플 식물 색을 바꾸는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자가 파인애플 식물에서 하나 이상의 색상을 갖는 카로테노이드(예, 리코펜, β-카로틴 등)의 축적을 조절하는 하나 이상의 파인애플 식물 내로 도입하여 파인애플 식물의 색을 변화시키는 것을 포함한다. 즉, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자가 없는 파인애플 식물에서 색을 갖는 카로테노이드의 축적에 비하여 파인애플 식물에서 색을 갖는 카로테노이드의 축적을 증가시키거나 감소시킨다. 일반적으로, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 파인애플 세포 내로 도입되며 이로부터 파인애플 식물이 재생된다. 일부 구체예에서, 변화된 색은 실질적으로 파인애플 식물의 과일 조직에 특이적이다. 선택적으로, 이들 방법은 파인애플 식물을 미세증식시키는 것을 추가로 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 도입된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 포함하는 파인애플 세포(예, 배발생 세포, 기관형성 세포, 배발생 캘러스 세포, 기관형성 캘러스 세포 등)를 제공한다. 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자가 없는 파인애플 세포에서의 카로테노이드의 축적에 비하여 파인애플 세포에서 카로테노이드의 축적을 증가시키거나 감소시킨다. 본 발명은 상기 파인애플 세포로부터 재생된 파인애플 식물을 추가로 제공한다.

본 발명의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 선택적으로 유기(예, DNA, RNA 등) 또는 무기 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하며, 이 핵산 분절은 파인애플 세포 또는 식물의 게놈내로 안정하게 통합된다. 일반적으로, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절 하나 이상을 포함하며, 상기 핵산 분절은 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절 하나 이상을 포함하며, 상기 핵산 분절은 카로테노이드 생합성 폴리펩티드의 과일-특이적 발현을 촉진하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 일반적으로 예를 들어, 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제, 피토엔 신타제, 피토엔 탈포화제, ζ-카로틴 탈포화제, 리코펜 β-사이클라제, 리코펜 ε-사이클라제, β-카로틴 하이드록실라제, ε-하이드록실라제 등으로부터 선택적으로 선택되는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드(예, 식물 카로테노이드 생합성 폴리펩티드, 박테리아 카로테노이드 생합성 폴리펩티드, 인공적으로 발생된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 등)를 암호화하는 핵산 분절 하나 이상을 포함한다. 더욱이, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 선택적으로 파인애플 세포 또는 식물에 이종성이거나 또는 파인애플 세포 또는 식물의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 하나 이상에 상동성인 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절 하나 이상을 포함한다.

카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 다양한 방식으로 본 발명의 형질전환 파인애플 세포 및 식물에서 카로테노이드 축적을 일으키는 다른 구체예를 포함한다. 예를 들어, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 선택적으로 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 적어도 일부에 해당하는 센스 또는 안티센스 핵산 분절 하나 이상을 포함한다. 센스 및 안티센스 핵산 분절은 예를 들어, 카로테노이드 생합성 경로로부터의 선택된 카로테노이드 생합성 효소의 발현을 억제하여 억제된 효소의 기질인 카로테노이드의 축적을 일으키기 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는, 형질전환된 세포에서 발현될 때 표적화된 카로테노이드 생합성 유전자의 발현 증가를 일으키는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 전사 인자 하나 이상을 암호화하는 핵산 분절 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 프로모터 및/또는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 인핸서를 암호화하는 핵산 분절 하나 이상을 포함하며, 상기 핵산 분절은 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 하나 이상의 프로모터 및/또는 하나 이상의 인핸서와 상동성 재조합하여 원하는 대로 상기 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킨다.

본 발명의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 임의의 전달 기법을 이용하여 파인애플 세포 또는 식물내로 도입된다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 아그로박테리움-매개된 전달을 이용하여 파인애플 세포 또는 조직내로 도입되는 하나 이상의 핵산 분절을 포함한다. 다른 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 예를 들어, 화분-매개 전달, 파인애플 세포의 원형질체 하나 이상으로 핵산의 직접 전달, 유전자총(microprojectile bombardment), 미세주입, 꽃의 거대주입, 단결정-매개 주입, 레이저 천공, 초음파처리 등으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 전달 기법을 이용하여 파인애플 세포 또는 식물내로 도입되는 핵산 분절 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 파인애플 식물내로 주입된다.

도 1A-C는 카로테노이드 생합성 경로의 태양을 도식적으로 보여준다.

I. 정의

본 발명을 상세히 개시하기 전에, 본 발명은 특정 구체예에 한정되지 않음이 이해되어야 한다. 여기서 이용되는 용어는 단지 특정 구체예를 개시할 목적이며 제한하고자 하는 의도는 아님이 이해되어야 한다. 단위, 접두사, 및 기호는 달리 특 정되지 않으면 국제 단위 시스템(SI)에 의해 제안된 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 이용될 때, 단수 형태는 또한 그 내용이 명확히 다르게 표시하지 않으면 복수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"는 또한 둘 이상의 세포(예, 조직의 형태 등) 등을 포함한다. 또한, 달리 표시되지 않으면, 여기서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기에 정의된 용어 및 그 문법적 변화는 그 전체가 명세서를 참고하여 보다 완전히 정의된다.

용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체(예, 일반적인 DNA 또는 RNA 중합체), PNA, 변형된 올리고뉴클레오티드(예, 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드와 같은, 용액내의 생물학적 RNA 또는 DNA에 일반적이지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드) 및/또는 기타를 비롯한 뉴클레오티드의 스트링에 해당될 수 있는 단량체 단위의 임의의 물리적 스트링을 포함한다. 핵산은 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있다. 달리 표시되지 않으면, 본 발명의 특정 핵산 서열은 명백하게 나타낸 서열에 더하여 상보성 서열을 포함한다. 용어 핵산은 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 유전자, cDNA, RNAi, 및 유전자에 의해 암호된 mRNA와 상호교환적으로 이용된다.

"핵산 서열"은 핵산 분절에서 뉴클레오티드의 순서 및 정체를 말한다.

"폴리뉴클레오티드"는 내용에 따라, 뉴클레오티드(A,C,T,U,G 등 또는 자연 발생 또는 인공적인 뉴클레오티드 유사체)의 중합체 또는 뉴클레오티드의 중합체를 나타내는 문자 스트링이다. 주어진 핵산 또는 상보성 핵산은 임의의 특정된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 결정될 수 있다.

두 핵산은 그들이 동일한 서열을 갖거나 또는 한 핵산이 다른 핵산에 상보적일 때, 또는 한 핵산이 다른 핵산의 하위서열일 때, 또는 한 서열이 자연 또는 인공 조작에 의해 다른 서열로부터 유래될 때 "상응한다".

용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 핵산의 임의 분절을 광범위하게 나타내기 위해 이용된다. 따라서, 유전자는 암호 서열 및 선택적으로 그들의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 유전자는 또한 선택적으로 예를 들어, 다른 단백질을 위한 인식 서열을 형성하는 비발현 DNA 또는 RNA 분절을 포함한다. 유전자는 대상 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지 또는 예측 서열 정보로부터의 합성을 비롯한 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있으며, 원하는 파라미터를 갖도록 고안된 서열을 포함할 수 있다.

용어 "핵산 분절"은 적어도 25 뉴클레오티드 길이, 대개 적어도 100 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 적어도 200 뉴클레오티드 길이, 전형적으로 적어도 300 뉴클레오티드 길이, 더욱 전형적으로 적어도 400 뉴클레오티드 길이, 그리고 가장 전형적으로는 적어도 500 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드 또는 그 전사가능한 유사체를 말한다. 예시적으로, 핵산 분절은 전길이 유전자(예, 피토엔 신타제 등과 같은 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자), 또는 그러한 유전자의 하위서열을 포함할 수 있다.

용어 "T-DNA"는 움직일 수 있고 아그로박테리움으로부터 식물 세포내로 전달될 수 있어서 핵산 분절을 식물 세포내로 도입할 수 있는 핵산 분절을 말한다.

용어 "연결된"은 일반적으로 서로 인접한 핵산 분절을 말하며, 필요할 경우 두 아미노산 암호 영역을 동일한 해독 프레임으로 인접하게 연결시킨다. 용어 "연결된"은 또한 서로 동시-분리되는 핵산을 포함한다. 또한, 용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 둘 이상의 핵산 분절 사이의 기능적 연결을 말한다. 예를 들어, 프로모터 및 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절은 프로모터 서열이 핵산 분절의 전사를 개시하고 매개할 때 작동가능하게 연결된다.

용어 "카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자"는 그것이 도입되는 세포에서 카로테노이드 생합성에 직접 또는 간접적으로 영향을 주는 유기 또는 무기 분자를 말한다. 예를 들어, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 그것이 도입되고 발현되는 세포에서 카로테노이드의 축적을 증가시키는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절일 수 있다.

용어 "발현"은 본 발명의 핵산 분절로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 축적을 말한다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드, 예, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드로의 번역을 말할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 예를 들어 카로테노이드 생합성 폴리펩티드는 뿌리, 종자, 과일 등과 같은 미리선택된 식물 저장 기관에서 발현되어 상기 식물 저장 기관에서 하나 이상의 카로테노이드(예, 자연적으로 생산된 카로테노이드)의 축적 증가를 야기한다. 따라서, 용어 "과일-특이적 발현"은 예를 들어, 형질전환된 파인애플 식물의 "실질적으로 과일 조직에 특이적인" 카로테노이드의 축적 변화에 영향을 주기 위해, 본 발명의 파인애플 식물의 과일 조직에 실질적으로 제한되는 도입된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드의 발현을 말한다.

용어 "프로모터"는 유전자를 위한 발현 조절 요소를 제공하며 RNA 폴리머라제가 특이적으로 결합하여 그 유전자의 RNA 합성(전사)을 개시하는 DNA 서열 또는 DNA 서열의 그룹상의 인식 부위를 말한다. 용어 "구성적 프로모터"는 연합된 유전자의 연속적인 전사를 허용하는 비조절 프로모터를 말한다. 용어 "유도성 프로모터"는 세포외 분자(예, 그 유전자에 의해 암호화되는 효소의 기질)과 같은 다른 물질 또는 유도체의 존재하에서, 연합된 유전자의 전사를 허용하는 조절되는 프로모터를 말한다.

용어 "선택성 마커"는 그 발현에 의해, 암호화되는 폴리펩티드에 더하여 마커 유전자를 포함하는 핵산 분절(예, T-DNA)과 같은 마커 유전자를 포함하는 세포를 확인할 수 있도록 하는 유전자를 포함한다. 예시적으로, 선택성 마커 유전자 생성물은 형질전환된 세포에 제초제 내성을 부여하여 세포 집단을 유효량의 제초제에 노출시킬 경우 단지 형질전환된 것들만 생존하도록 할 수 있다.

용어 "센스 핵산 분절"은 일반적으로 암호 핵산 분절을 말한다. 대조적으로, 용어 "안티센스 핵산 분절"은 일반적으로 센스 핵산 분절의 보체를 말한다.

용어 "전사 인자"는 전사 과정(즉, DNA 분절의 RNA 카피를 만듬)을 조절하는 임의의 인자를 말한다. 대개 그것은 효소 또는 다른 단백질, 조효소, 비타민, 또는 다른 유기 분자이다.

용어 "인핸서"는 인핸서가 유전자로부터 좀 떨어진 거리에 위치할때에도 그 유전자의 발현에 긍정적으로 영향을 주는 DNA 서열을 말한다.

두 핵산은 그들 각각으로부터의 서열이 후손 핵산에서 결합될 때 "재조합된다".

핵산 분절은 그것이 게놈 내로 비-일시적으로 도입될 때 파인애플 식물 또는 세포의 게놈내로 "안정하게 통합"한다. 예를 들어, 파인애플 염색체내로 영구히 통합되는 이종성 핵산 분절은 상응하는 파인애플 세포 또는 식물의 게놈내로 안정하게 통합된다.

용어 "형질전환"은 핵산 분절이 식물 또는 식물 세포내로 전달 또는 도입되는 것을 말하며, 그 도입이 핵산 분절의 유전적으로 안정한 유전을 야기하거나 그 핵산 분절이 식물 또는 식물 세포의 게놈에서 일시적으로 존재하도록 한다. 형질전환된 핵산 분절을 포함하는 파인애플 세포 또는 식물은 "형질전환", "재조합" 또는 "형질전환된" 파인애플 세포 또는 식물로 불린다.

핵산 분절과 같은 폴리뉴클레오티드 서열은, 그것이 다른 종으로부터 기원하거나 또는 동일한 종으로부터 기원한 것이 그 원래 또는 본래 형태로부터 변형된 경우, 유기체 또는 두번째 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 "이종성"이다. 예를 들어, 이종성 암호 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 그 프로모터가 유래한 것과 상이한 종으로부터의 암호 서열, 또는 동일한 종으로부터 유래한, 자연 발생 대립유전자 변이체와 상이한 암호 서열을 말한다.

핵산은 그들이 공통된 조상 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 "상동성"이다. 상동성은 종종 둘 이상의 핵산 사이의 서열 유사성으로부터 추론 된다. 이것은 둘 이상의 후손 서열이 돌연변이 및 자연 선택의 결과로서 시간에 따라 공통된 조상 서열로부터 벗어날 때 자연적으로 발생한다. 인공적으로 상동성인 서열은 다양한 방식으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열을 드 노보(de nove)로 합성하여 선택된 모 핵산 서열과 서열이 상이한 핵산을 생성할 수 있다. 인공적인 상동성은 또한 한 핵산 서열을, 클로닝 또는 화학적 돌연변이유발동안 일어날 때처럼, 다른 서열과 인공적으로 재조합하여 상동성 후손 핵산을 생산함으로써 형성될 수 있다. 인공적인 상동성은 또한 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여, 핵산의 매우 유사한 스트레치의 빈도와 길이를 증가시키는 한편 암호된 유전자 생성물에 대한 아미노산 서열의 변화를 최소화시키는 방식으로, 비유사한 핵산 사이의 암호 서열의 일부 또는 모두를 합성적으로 조절하여 생성될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 인공적인 상동성은 적어도 3 염기쌍 길이의 동일한 서열 스트레치의 빈도를 증가시키는 것을 목적으로 한다. 더욱 바람직하게는, 적어도 4 염기쌍 길이의 동일한 서열 스트레치의 빈도를 증가시키는 것을 목적으로 한다. 두 핵산은 그들이 서열 유사성을 나타낼 때 공통된 조상을 가지는 것으로 일반적으로 추정된다. 하지만, 상동성을 확립하는 데 필요한 서열 유사성의 정확한 수준은 다양하다. 일반적으로, 본 발명의 목적을 위해서는, 두 핵산 서열은 그들이 두 서열 사이에서, 즉 두 서열을 따라 어디서든, 직접적인 재조합이 발생할만큼 충분한 서열 동일성을 공유할때 상동성인 것으로 간주된다.

용어 "암호화하는"은 하나 이상의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 상기 용어는 출발 또는 중지 코돈을 필요로 하지 않는다. 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 제공되는 임의의 해독 프레임으로 암호될 수 있다.

용어 "벡터"는 세포에서 복제할 수 있고/있거나 또는 다른 핵산 분절이 작동적으로 연결되어 이들 분절의 복제를 야기할 수 있는 염색체외 요소를 말한다. 그러한 요소는 많은 뉴클레오티드 서열이 적절한 3' 비번역 서열과 함께 핵산 분절(예, 하나 이상의 프로모터와 카로테노이드 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 것)을 세포내로 도입할 수 있는 구조체내로 연결 또는 재조합된, 임의의 공급원으로부터 유래한, 자가복제성 서열, 게놈 통합성 서열, 파아지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형의 단일 또는 이중쇄 DNA 또는 RNA일 수 있다. 플라스미드는 예시적인 벡터이다. 벡터 또는 벡터 시스템(예, 이중 벡터 시스템, 삼중 벡터 시스템 등)은 카로테노이드 생합성 효소를 암호화하는 유전자에 더하여, 예를 들어, 파인애플 세포 또는 식물의 형질전환을 촉진하는 것들, 형질전환된 파인애플 세포에서 포함된 유전자의 발현의 증가를 허용하는 것들(예, 프로모터), 형질전환된 파인애플 세포의 선별을 촉진하는 것들(예, 선택성 마커, 리포터 유전자 등) 등과 같은 요소들을 포함할 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 벡터내에서 유전자에 작동적으로 연결될 때 그 유전자(예, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자)의 발현을 조절할 수 있는 염색체외 요소를 말한다.

용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 중합체(예, 펩티드 또는 단백질)를 말한다. 중합체는 추가로 표지, 켄쳐, 차단기 등과 같은 비아미노산 요소를 포함할 수 있으며 선택적으로 당화 등과 같은 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 천연 또는 비천연성일 수 있으며 비치환, 비변형, 치환 또는 변형될 수 있다.

용어 "카로테노이드 생합성 폴리펩티드"는 카로테노이드 생합성 경로에서 하나 이상의 단계를 촉매하는 생물촉매 또는 효소를 말한다. 카로테노이드 생합성 폴리펩티드는 예를 들어, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제, 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제, 피토엔 신타제, 피토엔 탈포화제, ζ-카로틴 탈포화제, 리코펜 β-사이클라제, 리코펜 ε-사이클라제, β-카로틴 하이드록실라제, ε-하이드록실라제 등을 포함한다.

"폴리펩티드 서열"은 폴리펩티드의 아미노산의 순서 및 정체를 말한다.

용어 "인공적으로 발생한 카로테노이드 생합성 폴리펩티드"는 하나 이상의 다양성 생성 기법을 이용하여 생성된 단백질-촉매 또는 효소(예, 피토엔 신타제 등)를 말한다. 예를 들어, 본 발명의 실시에 이용된 인공적으로 발생된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드는 하나 이상의 모 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 둘 이상의 핵산을 재조합시켜(예, 회귀성 재조합 등), 또는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 돌연변이시켜(예, 부위 지시된 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 임의 돌연변이유발, 회귀성 앙상블 돌연변이유발 등을 이용) 선택적으로 생산된다. 모 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 전사 및 번역의 기작을 통해 모 카로테노이드 생합성 폴리펩티드, 예, 비인공적으로 발생되거나 자연적으로 발생한 피토엔 신타제에 해당하는 아미노산 서열을 생산하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자를 포함한다. 용어 "인공적으로 발 생된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드"는 또한 둘 이상의 부모로부터 유래한 확인가능한 성분 서열(예, 기능성 도메인 등)을 포함하는 키메라 효소를 포함한다. 본 발명의 실시에 이용된 인공적으로 발생된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드는 일반적으로 예를 들어, 자연 발생 카로테노이드 생합성 폴리펩티드보다 더 큰 효율로 생성물을 생성하도록 발생된다.

용어 "내인성"은 유기체 또는 시스템내에서 천연적으로 생산되거나 합성되는 물질을 말한다. 파인애플 식물 또는 세포에서, 예를 들어 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자는 상기 식물 또는 세포내에서 천연 생산된다(예, 발현된다).

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에서, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 시각적 관찰에 의해 측정할 때, 최대 상응을 위해 배열되고 비교될 때, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 퍼센티지를 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다.

"높은 서열 유사성" 영역은 최대 상응을 위해 배열될 때(예, 수동적으로, 또는 디폴트 파라미터에 맞춰진 일반적인 프로그램 BLAST를 이용하여), 두번째 선택 영역에 대해 90% 이상 동일한 영역을 말한다. "낮은 서열 유사성" 영역은 최대 상응을 위해 배열될 때(예, 수동적으로, 또는 디폴트 파라미터에 맞춰진 BLAST를 이용하여), 두번째 선택 영역에 대해 30% 이하, 더욱 바람직하게는 40% 이하 동일하다.

두 핵산 또는 폴리펩티드에 있어서, "실질적으로 동일한"이란 예를 들어 서 열 비교 알고리즘을 이용하거나 시각적으로 관찰하여 측정할 때, 최대 상응을 위해 배열되고 비교될 때, 적어도 60%, 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 90-95%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 바람직하게는, 실질적 동일성은 적어도 약 50 잔기 길이의 서열 영역, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100 잔기 영역에 걸쳐 존재하며, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 150잔기에 걸쳐 서열이 실질적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 상기 서열은 암호 영역의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.

"하위서열" 또는 "단편"은 핵산 또는 아미노산의 전체 서열의 임의의 일부이다.

용어 "게놈"은 유기체의 염색체 핵산을 말한다. 여기서 이용될 때, 게놈은 또한 색소체(plastid) 게놈(예, 엽록체 게놈 등)을 포함한다.

용어 "아그로박테리움"은 T-DNA를 움직이고 파인애플 세포와 같은 식물 세포내로 선택적으로 전달할 수 있는 아그로박테리움의 종, 하위종, 또는 균주를 말한다. 예를 들어, 아그로박테리움은 선택적으로 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)이지만, 더욱 일반적으로는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefacience)이다.

용어 "배발생 세포"는 배발생 조직 또는 배발생 캘러스로부터의 세포를 말한다.

용어 "배발생 캘러스"는 분화되지 않았으며 주요 구조가 없지만, 배를 생산하고 식물로 발생할 수 있는 보다 분화된 조직(예, 배발생 조직)을 형성할 가능성 이 있는 조직 또는 세포를 말한다.

용어 "배발생 조직"은 미성숙 체세포 배를 포함하는 조직화된 구조를 갖는 조직을 말한다. 미성숙 체세포 배는 이들을 성숙 배지에서 배양하여 성숙시킬 수 있다. 성숙 체세포 배는 발아 배지로 이동시 식물로 발생할 수 있다. 성숙 체세포 배는 형태학적으로 그리고 발생학적으로 접합성 배를 닮으며, 적절한 성장 배지로 옮겨질 때 뿌리와 슈트 폴(pole)을 가진 묘목으로 발아할 수 있는 체세포로부터 유래되는 구조이다. "체세포"는 생식체외의 다세포 기관의 세포이다.

용어 "기관형성 세포"는 기관형성 조직으로부터의 세포를 말한다.

"기관형성 캘러스"는 예를 들어, 조직배양에서 하나의 기관형성 세포로부터 생겨날 수 있는 상대적으로 미분화된 세포의 불규칙적인 덩어리를 갖는 조직을 말한다.

용어 "기관형성 조직"은 기관형성을 진행하도록, 즉 완전한 식물을 생산하기 위해 뿌리를 발생하도록 이어서 유도될 수 있는 슈트와 같은 식물 기관을 형성하도록 유도될 수 있는 조직을 말한다.

용어 "분열조직"은 분열할 수 있으며 유사한 세포 또는 조직 및 기관을 생산하도록 분화하는 세포를 형성할 수 있는 세포를 포함하는 형성성 식물 조직을 말한다.

용어 "분열조직 세포"는 식물 분열조직으로부터의 세포를 말한다.

용어 "비-정상(non-apical) 분열조직 세포"는 정상 분열조직으로부터 유래하지 않지만 측생 또는 엽액 분열조직으로부터 그리고 비정상 분열조직 외식편의 배 양시 분열조직성이 된 세포로부터 유래할 수 있는 분열조직 세포를 말한다.

용어 "파인애플 식물"은 브로멜리아세 과, 예, 아나나스 코모서스로부터의 식물을 말한다. 용어 "파인애플 세포"는 파인애플 식물로부터의 세포를 말한다.

용어 파인애플 식물의 "재생"은 뿌리가 난 슈트를 포함하는 파인애플 식물의 형성을 말한다.

용어 "유효량"은 배발생 또는 기관형성성인 캘러스 또는 조직의 생산과 같은 원하는 결과를 얻는 데 충분한 양을 말한다.

용어 "카로테노이드"는 탄화수소의 카로틴 클래스 및 그들의 산소화 유도체(즉, 잔토필)를 말한다.

용어 "카로테노이드 생합성 경로" 또는 "카로틴생성"은 하나 이상의 카로테노이드의 생산을 야기하는, 촉매 활성, 일반적으로 효소-매개 활성의 조합을 말한다.

용어 "선별하는"은 하나 이상의 대상 특성, 예, 선택성 마커, 증가 또는 감소된 카로테노이드 수준, 색 변화 등을 갖는 것으로 하나 이상의 식물 또는 세포를 확인하는 과정을 말한다. 예를 들어, 선별 과정은 특정 유전자형을 갖는 유기체의 성장이 선호될 조건하에 유기체를 놓는 것을 포함할 수 있다. 추가의 예시로서, 집단의 하나 이상의 구성원의 하나 이상의 특성을 결정하기 위하여 집단을 스크린할 수 있다. 집단의 하나 이상의 구성원이 대상 특성을 보유한 것으로 확인되면, 그것을 선별한다. 선별은 집단의 구성원의 분리를 포함할 수 있으나, 이것이 필수적이지는 않다. 또한, 선별 및 스크리닝은 종종 동시적일 수 있다.

용어 "스크리닝"은 한 집단을 다른 그룹들로 분리하는 과정을 말한다. 스크리닝 과정은 일반적으로 하나 이상의 식물 또는 세포의 하나 이상의 특성을 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일반적인 스크리닝 과정은 하나 이상의 집단의 하나 이상의 구성원의 하나 이상의 특성이 결정되는 것을 포함한다.

"집단"은 적어도 두개의 상이한 세포 또는 식물의 모음을 말한다.

II. 개요

본 발명은 일반적으로 파인애플 세포와 식물을 유전적으로 형질전환시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 파인애플은 특히 기존의 변종에 비하여 개선된 영양적 특성을 갖는다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 외인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 파인애플 세포 또는 식물내로 선택적으로 도입함으로써 얻어진 유전적으로 형질전환된 파인애플 세포와 식물을 제공한다. 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 파인애플 세포에서 카로테노이드 축적을 조절하며, 일부 구체예에서는 또한 이들 세포의 색을 조절한다. 카로테노이드 수준을 변형시키는 것에 더하여, 과일 당도, 산도, 질감, 및 숙성 특성과 같은 소비자들이 관심있는 다른 형질 또한 본 발명의 방법에 따라 변형될 수 있다. 선택적으로, 박테리아 질병에 대한 개선된 내성, 바이러스 질병에 대한 개선된 내성, 및/또는 곤충 및 선충류에 대한 개선된 내성과 같은 다른 작물학적 특성 또한 본 발명의 세포와 식물내로 조작된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 외식편 물질을 아그로박테리움 세포와 접촉시켜 유전적으로 형질전환된, 적합한 파인애플 외식편 물질의 사용을 포함한 다. 아그로박테리움 세포는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절의 파인애플 세포내로의 전달을 매개한다. 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 세포 또는 식물내로 전달하는 다른 기법이 또한 선택적으로 이용된다. 본 발명은 추가로 아그로박테리움 세포와의 공동배양을 위한 배발생 또는 기관형성 세포의 형성을 유도하는 단계에 적합한 배양 배지를 제공한다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 형질전환된 배발생 세포를 선별하고 그들로부터 배를 형성시킨다. 배는 발아되어 슈트를 형성하고 뿌리가 나서 완전한 식물을 생산할 수 있다.

파인애플 식물을 형질전환시키고 재생시키기 위한 다양한 기관형성 방법 또한 선택적으로 이용된다. 예를 들어, 본 발명은 기관형성 파인애플 세포를 생산하기 위해 분열조직 파인애플 세포(예, 비정상 분열조직 세포 등)를 배양시키는 것을 포함하는, 형질전환된 파인애플 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 또한 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 기관형성 파인애플 세포내로 도입하여 형질전환된 기관형성 파인애플 세포를 생산하는 것을 포함한다. 추가의 예시로서, 본 발명은 또한 분열조직 파인애플 세포를 배양하여 슈트를 생산하는 것을 포함한, 형질전환된 파인애플 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 또한 슈트로부터의 외식편을 배양하여 기관형성 파인애플 세포를 생산하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 외식편은 비정상 분열조직 파인애플 세포를 포함한다. 또한, 이들 방법은 또한 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 기관형성 파인애플 세포내로 도입하여 형질전환된 기관형성 파인애플 세포를 생산하는 것을 포함한다. 이들 기관형성 방법은 일반적으로 형질전환된 기관형성 파인애플 세포로 부터 파인애플 식물을 재생시키는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 이들 및 다른 태양은 모두 하기에 설명된다.

III. 카로테노이드

본원의 몇가지 구체예에서, 파인애플 세포의 색 및/또는 카로테노이드의 축적은 이들 세포에서 카로테노이드 발현을 조절함으로써 조절된다. 카로테노이드는 탄화수소(카로틴)의 한 클래스 및 그들의 산소화 유도체(잔토필)이다. 이들 40-탄소(C40) 테르페노이드의 각각은, 이소프레노이드 단위의 배열이 분자의 중심에서 역전되어 두 개의 중심 메틸기가 1,6-위치 관계에 있으며 나머지 비-말단 메틸기가 1,5-위치 관계에 있는, 8개의 연결된 이소프렌(C5) 단위를 포함한다. α-카로틴, β-카로틴, 아포카로테날(β-아포-8'-카로테날), 리코펜(ψ,ψ-카로틴), 및 칸타잔틴(4,4'-디케토-β-카로틴)과 같은 카로테노이드는 음식 착색제로서 널리 이용되며, 많은 카로테노이드는 프로-비타민 A 활성을 나타낸다. 속명 및 약자가 본 명세서 전체에서 이용될 것이며, IUPAC-추천 반체계적 명칭은 대개 속명이 먼저 언급된 후 괄호안에 주어질 것이다.

식물내의 카로테노이드는 색소체에서 이소펜테닐 디포스페이트 합성을 일으키는 메발로네이트-독립적 경로를 통해 형성된 이소프레노이드이다 (Fraser et al. (2002) "Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1092-1097). 널리 퍼져 있는 이소프레노이드 경로로부터 유래된 제라닐제라닐 디포스페이트는 토코페롤과 필로퀴논에 더하여 카로테노이드의 전구체이다. 특히, 제라닐제라닐 디포스페이트는 이소펜테닐 디포스페이트 및 선택적으로 디메틸알릴 디포스페이트, 제라닐 디포스페이트, 또는 파네실 디포스페이트에 관련되는 다양한 반응에서 생산될 수 있다. 도 1A-C는 카로테노이드 생합성의 태양을 도식적으로 예시한다. 나타난 대로, 20-탄소 원자 전구체인 제라닐제라닐 디포스페이트(I)가 피토엔(7,8,11,12,7',8',11',12'-옥타하이드로-ψ,ψ-카로틴)(II)으로 이량체화되는 것이 효소 피토엔 신타제(A)에 의해 촉매되는, 카로테노이드 생합성의 첫번째 단계이다. 피토엔(II)은 그 자체는 무색이지만, 색을 갖는 카로테노이드의 전구체이다. 다음 두 효소(피토엔 탈포화제(B) 및 ζ-카로틴 탈포화제(C))는 중간체 피토플루엔(7,7',8,8',11,12-헥사하이드로-ψ,ψ-카로틴)(III)을 통하여 피토엔(II)을 탈포화시키고, 중간체 뉴로스포렌(7,8-디하이드로-ζ,ζ-카로틴)(V)을 통하여 ζ-카로틴(7,8,7',8'-테트라하이드로-ζ,ζ-카로틴)(IV)을 탈포화시킨다.

ζ-카로틴 탈포화제(C)의 생성물은 리코펜(ψ,ψ-카로틴)(VI)이며, 이것은 이후에 고리화를 진행하여 β-카로틴(β,β-카로틴)(IX) 또는 α-카로틴(XII)이 될 수 있다. 리코펜은 숙성 토마토와 같은 다양한 과일에 특징적인 붉은 색을 부여한다. 도 1B에 나타난 것처럼, β-카로틴을 생성하기 위한 리코펜(VII)의 고리화는 리코펜 β-사이클라제(D)에 의해 촉매되는 반응에서 중간체 γ-카로틴(VIII)을 통해 발생한다. 베타-카로틴은 마가린 및 버터와 같은 제품의 착색제로서, 비타민 A의 생산을 위한 전구체로서 자주 이용되며, 최근에는 일부 암에 대한 예방 효과를 갖는 것으로 생각되고 있다. β-카로틴 하이드록실라제(E)에 의해 촉매되는 β-카로틴의 하이드록시화는 제탄틴(β,β-카로틴-3,3'-디올)(X)을 생산한다. 제탄틴은 가금류 산업에서 착색제로 종종 이용되는 노란색 색소이다. 도 1C는 리코펜 ε-사이클라제(F)와 리코펜 β-사이클라제(D)에 의해 촉매되는, 중간체 δ-카로틴(ε,ψ-카로틴)(XI)을 통한 α-카로틴(XII)을 생산하기 위한 리코펜(VII)의 고리화를 예시한다. α-카로틴(XII)의 하이드록시화에 의한 루테인(3,3'-디하이드록시-α-카로틴)(XIII)의 생산은 β-카로틴 하이드록실라제(E)와 ε-하이드록실라제(G)에 의해 촉매된다. 다른 사이클라제를 또한 생합성 경로에 포함시켜, 다른 고리화 패턴을 유도할 수 있으며, 카로테노이드 구조의 추가의 유도체화는 다른 하위 변형 효소에 의해 이루어질 수 있다.

일반적으로, 카로테노이드의 생합성을 위한 경로는 다양한 유기체에서 연구되었으며 생합성 경로는 박테리아 내지 고등 식물 범위의 유기체에서 밝혀졌다. 예를 들어, 잎에서, 카로테노이드는 대개 그들이 광보호적 기능을 제공하는 엽록체의 그라나에 존재한다. 베타-카로틴 및 루테인은 주요 카로테노이드이며, 비올라잔틴과 네오잔틴이 더 작은 양으로 존재한다. 카로테노이드는 꽃잎의 발생중인 잡색체에 축적되며, 대개 클로로필이 사라진다. 꽃잎에서처럼, 카로테노이드는 그들이 엽록체로부터 발생함에 따라 과일 잡색체에서 나타난다. 카로테노이드는 또한 당근 뿌리 및 감자 괴경의 잡색체에 위치한다. 베타-카로틴은 당근 및 고구마에 존재하는 주요 색소이며, 단지 소량의 잔토필이 존재한다. 예를 들어, T. W. Goodwin (Ed.), Plant Pigments, Academic Press, Inc. (1988)의 Britton, "Biosynthesis of carotenoids," p.133-182를 참고한다.

연구자들은 또한 형질전환 식물에서 식물 피토엔 신타제(Psy1) 유전자의 과 다 발현 또는 발현 억제가 과일에서 카로테노이드 수준을 변화시킬 수 있음을 보여주었다. 예를 들어, Bird et al. (1991) Biotechnology 9: 635-639; Bramley et al. (1992) Plant J. 2: 343-349; 및 Fray et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 589-602를 참고한다. 카로테노이드 생합성 유전자는 또한 어위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) (Misawa et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6704- 6712); 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola) (출원 WO 91/13078호, Armstrong et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 9975-9979); 알. 캡슐라투스(R.capsulatus) (Armstrong et al. (1989) Mol. Gen. Genet 216: 254-268, Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421); 및 테르무스 설모필러스(Thermus thermophilus) (Hoshino et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59: 3150-3153)를 비롯한 다양한 유기체로부터 클론되었다.

카로테노이드 및 카로테노이드생성은 추가로 예를 들어 Britton et al. (Eds.) Carotenoids: Spectroscopy, Vol.1, Springer-Verlag (1995), Britton et al. (Eds.) Carotenoids: Synthesis, Birkhuser Verlag (1996), Britton et al. (Eds.) Carotenoids, Vol. 1a: Isolation and Analysis. Springer-Verlag (1995), Pfander et al. (Eds.) Key to Carotenoids, 2nd ed., Springer-Verlag (1987), Passwater et al. (Eds.) Beta-Carotene and Other Carotenoids: The Antioxidant Family That Protects against Cancer and Heart Disease and Strengthens the Immune System, Keats Publishing, Inc.(1999), Bauerfeind (Ed.) Carotenoid as Colorants and Vitamin a Precursors: Technological and Nutritional Applications, Academic Press, Inc.(1981), Abelson et al. (Eds.) Carotenoids: Chemistry, Separation, Quantitation, and Antioxidation, Vol. 213, Academic Press, Inc. (1992), 및 Abelson et al. (Eds.) Carotenoids: Metabolism, Genetics, and Biosynthesis, Vol. 214, Academic Press, Inc. (1993)을 참고한다. 카로테노이드에 관한 추가 상세 사항은 예를 들어, Bendich (1989) "Carotenoids and the immune response," J. Nutr., 119: 112-115, Britton (1995) "Structure and properties of carotenoids in relation to function," FASEB J., 9: 1551-1558, Di Mascio et al. (1989) "Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher," Arch. Biochem. Biophys., 274: 532-538, Di Mascio et al. (1991) "Antioxidant defense systems: the role of carotenoids,tocopherols, and thiols, "Am. J. Clin. Nutr., 53: 194S-200S, Mangels et al. (1993) "Carotenoid content of fruits and vegetables: an evaluation of analytic data, "J. Am. Diet. Assoc., 93: 284-296, Nishino (1998) "Cancer prevention by carotenoids,"Mutat.Res., 402: 159-163, Ong et al. (1992) "Natural sources of carotenoids from plants and oils, "Meth. Enzymol., 213: 142-167, Pfander (1992) "Carotenoids: an overview," Meth. Enzymol., 213: 3-13, 및 Snodderly (1995) "Evidence for protection against age-related macular degeneration by carotenoids and antioxidant vitamins, "Am. J. Clin. Nutr., 62 (suppl): 1448S-1461S를 참고한다.

IV. 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 표적 서열

본 발명의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 선택적으로 다양한 무기 또는 유기 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절이다. 본질적으로 임의의 그러한 핵산 분절은 선택적으로 본 발명의 방법에 따라 파인애플 세포 또는 식물을 형질전환시키기 위해 이용된다. 따라서, 이용될 수 있는 공지 핵산 모두를 확인하기 위한 시도는 하지 않는다. 선택적으로 파인애플 세포 또는 식물내로 도입되는 카로테노이드생성-관련 핵산 분절은 일반적으로 예를 들어, 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제, 피토엔 신타제, 피토엔 탈포화제, ζ-카로틴 탈포화제, 리코펜 β-사이클라제, 리코펜 ε-사이클라제, β-카로틴 하이드록실라제, ε-하이드록실라제 등을 암호한다. 예시적인 카로테노이드생합성 유전자 및 여기서 개시된 방법을 실시하는 데 선택적으로 이용되는 관련 서열에 관한 참고 정보는 하기에 제공된다.

카로테노이드 합성을 할 수 있는 한 유기체 및 그러한 생합성 노력을 위한 유전자의 공급원은 어위니아 허비콜라이다. 어위니아 허비콜라는 다른 환경에서도 살수 있는 혐기성 미생물인 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 과의 그람-음성 박테리아의 속의 구성원이다. 어위니아 속은 일반적으로 세 그룹으로 나뉜다. 셋 중에서, 허비콜라 그룹은 일반적으로 카로테노이드로 밝혀진 노란색 색소를 형성하는 종(예, 어위니아 허비콜라)를 포함한다. 이들 박테리아는 식물 표면상에 부패성 물질을 필요로 하는 생물로서 그리고 많은 식물 병원균에 의해 야기된 병변에서 이차 유기체로서 존재한다. 그들은 또한 토양, 물에서 그리고 사람을 비롯한 동물에 서 병원균으로 발견될 수 있다.

공개 국제 출원 WO91/13078호(1991.9.5 공개)는 몇몇 단세포 및 다세포 기관에서 몇가지 카로테노이드 분자의 제조를 위해 어위니아 허비콜라로부터의 유전자를 이용한 것을 개시한다. 더욱 구체적으로는, 공개 국제 출원 WO91/13078호는 구성적 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV 35S 프로모터를 포함하는 벡터 및 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 DNA 전달을 이용하여 고등 식물에서 피토엔의 생산을 증가시키는 것을 개시한다. 그 N-말단에 연결된 피토엔 신타제 암호 유전자를 담배 리불로스 비스포스페이트 카복실라제-옥시게나제(RUBISCO 또는 RBCS)의 트랜싯(시그널) 펩티드로 전달하는 것은 또한 카로테노이드가 일반적으로 합성되는 식물 엽록체내로 효소를 수송하는 방법으로 보고되었다. 공개 국제 출원 WO91/13078호는 추가로 상기 트랜싯 펩티드 유전자, 및 식물에서 리코펜을 β-카로틴으로 전환시켜 β-카로틴의 엽록체 수준을 증가시키는 리코펜 사이클라제를 위한 유전자를 포함하는 유전자를 전달시키기 위해 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하는 것을 개시한다. 또한, 유럽 특허 출원 제 0 393 690 A1호(1990.10.24 공개)는 카로테노이드 분자를 제조하기 위해 다른 어위니아 종, 어위니아 우레도보라 20D3(ATCC 19321)으로부터의 DNA의 이용을 보고한다. 추가의 예시로, 본 발명은 또한 선택적으로 어위니아 허비콜라 EHO-10(ATCC 39368, 에스케리챠 불네리스(Escherichia vulneris)로도 불림)로부터의 DNA를 이용하며, 이 DNA는 파인애플 식물의 과일 조직과 같은 고등 식물 저장 기관에서 카로테노이드 분자의 축적을 위한 효소 피토엔 신타제를 암호한다.

여기서 개시된 방법에 선택적으로 이용되는 카로테노이드-관련 서열에 관한 추가 정보는 하기와 같이 제공된다.

이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제

파인애플 세포 또는 식물을 형질전환하기 위해 선택적으로 이용되는 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제 암호 서열은 예를 들어 알. 캡슐라투스 (Hahn et al. (1996) J. Bacteriol. 178: 619-624 및 그 안에 인용된 참고문헌), 기탁 번호 U48963 및 X82627, 클라르키아 크산티아나(Clarkia xantiana) 기탁 번호 U48962, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 기탁 번호 U48961, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharrnoyces pombe) 기탁 번호 U21154, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 기탁 번호 X17025, 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 기탁 번호 X14230로부터 분리되었다.

제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제

여기서 개시된 형질전환에서 선택적으로 이용되는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제 암호 서열은 예를 들어 이. 우레도보라 Misawa et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6704-6712 및 출원 WO91/13078호; 및 백색 루피너스 (Aitken et al. (1995) PlantPhys. 108 : 837-838), 피망 (Badillo et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27: 425-428) 및 아라비돕시스 (Scolnik and Bartely (1994) Plant Physiol 104: 1469-1470; Zhu et al. (1997) Plant Cell Phvsiol. 38: 357-361)을 비롯한 식물 공급원으로부터의 것들을 포함한다.

피토엔 신타제

여기서 선택적으로 이용되는 피토엔 신타제 암호 서열은 예를 들어, 시트러스 운쉬우(Citrus unshiu) 피토엔 신타제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF220218 (Kim et al. "Isolation of a cDNA encoding phytoene synthase from Citrus, "미공개), 피토엔 신타제를 위한 시트러스 운쉬우 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AB037975 (Ikoma et al. (2001) "Expression of a phytoene synthase gene and characteristic carotenoid accumulation during citrus fruit development, "Physiol. Plantarum. 111: 232-238), 시트러스 엑스 파라디시(Citrus x paradisi) 피토엔 신타제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF152892(Costa et al. "Developmental expression of carotenoid genes in Citrus," 미공개), 피토엔 신타제를 위한 씨. 앤넘(C. annuum) psy1 mRNA에 해당하는 기탁 번호 X68017 (Romer et al. (1993) "Expression of the genes encoding the early carotenoid biosynthetic enzymes in Capsicum annuum," Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (3):1414-1421), 리코페르시콘 에스쿠렌툼(Lycopersicon esculentum) 피토엔 신타제(PSY2) mRNA에 해당하는 기탁 번호 L23424 (Bartley et al.(1993)" cDNA cloning, expression during development, and genome mapping of PSY2, a second tomato gene encoding phytoene synthase," J. Biol. Chem. 268 (34): 25718-25721), 피토엔 신타제를 위한 씨. 멜로(C. melo) PSY1 mRNA에 해당하는 기탁 번호 Z37543 (Karvouni et al. (1995) "Isolation and characterisation of a meloncDNA clone encoding phytoene synthase," Plant Mol. Biol. 27 (6): 1153-1162), 및 토마토 피토엔 신세타제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 M84744 (Bartley et al. (1992) "A tomato gene expressed during fruit ripening encodes an enzyme of the carotenoid biosynthesis pathway," J. Biol. Chem. 267 (8): 5036-5039)에 해당하는 것들을 포함한다.

피토엔 신타제 서열의 다른 예시적인 공급원은 예를 들어, 이. 우레도보라, 로도박터 캡슐라투스, 및 다른 식물을 포함한다 (Misawa et al. (1990) J Bacteriol. 172: 6704-6712, 기탁 번호 D90087, 출원 WO 91/13078호, Armstrong et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 254-268, Armstrong "Genetic Analysis and regulation of carotenoid biosynthesis," in Blankenship et al. (Eds.), Anoxygenic photosynthetic bacteria: advances in photosynthesis, Kluwer Academic Publishers, Armstrong et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci USA 87: 9975-9979, Armstrong et al. (1993) Methods Enzvmol. 214: 297-311, Bartley et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 27518-27521, Bartley et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 5036-5039, Bramley et al. (1992) Plant J. 2: 291-343, Ray et al. (1992) Plant Mol. Biol. 19: 401-404, Ray et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 10587, Romer et al. (1994) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 196: 1414-1421, Karvouni et al. (1995) Plant Molecular Biology 27: 1153-1162, 기탁 번호 U32636, Z37543, L37405, X95596, D58420, U32636, Z37543, X78814, X82458, S71770, L27652, L23424, X68017, L25812, M87280, M38424, X69172, X63873, X60441, 및 Armstrong (1994) J. Bacteriol. 1 76: 4795-4802 및 그 안에 인용된 참고문헌).

피토엔 탈포화제

본 발명의 방법에 따라 파인애플 세포 또는 식물을 형질전환시키기 위해 선택적으로 이용되는 예시적인 피토엔 탈포화제 암호 서열은 예를 들어, 피토엔 탈포화제를 위한 씨. 앤넘 pds1 mRNA에 해당하는 기탁 번호 X68058 (Hugueney et al. (1992) "Characterization and molecular cloning of a flavoprotein catalyzing the synthesis of phytofluene and zeta-carotene in Capsicum chromoplasts, "Eur. J. Biochem. 209(1): 399-407), 피토엔 탈포화제를 위한 엘. 에스쿨렌툼 mRNA에 해당하는 기탁 번호 X59948 (Pecker et al. (1992) "A single polypeptide catalyzing the conversion of phytoene to zeta-carotene is transcriptionally regulated during tomato fruit ripening," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (11): 4962-4966), 제아 메이스(Zea mays) 피토엔 탈포화제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 L39266 (Hable et al. (1995) "Maize phytoene desaturase maps near the viviparous5 locus," Plant Physiol. 108 (3): 1329-1330), 리코페르시콘 에스쿨렌툼 피토엔 탈포화제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 M88683 (Giuliano et al. (1993) "Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato development, "Plant Cell 5 (4): 379-387), 및 대두 피토엔 탈포화제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 M64704 (Bartley et al. (1991) "Molecular cloning and expression in photosynthetic bacteria of a soybean cDNA coding for phytoene desaturase, an enzyme of the carotenoid biosynthesis pathway, "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(15): 6532-6536)에 해당하는 것들을 포함한다.

피토엔 탈포화제 서열의 다른 예시적인 공급원은 예를 들어, 이. 우레도보라 Misawa et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6704-6712, 및 출원 WO 91/13078호 (기탁 번호 L37405, X95596, D58420, X82458, S71770, 및 M87280)를 비롯한 박테리아 공급원으로부터의 것들; 및 옥수수(Li et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 269-279), 토마토 (Aracri et al. (1994) Plant Physiol. 106: 789), 및 카피섬 앤넘(Capisum annuum)(피망) (Hugueney et al. (1992) J. Biochem. 209: 399-407), 기탁 번호 U37285, X59948, X78271, 및 X68058)을 비롯한 식물 공급원으로부터의 것들을 포함한다.

ζ-카로틴 탈포화제

여기서 선택적으로 이용되는 제타-카로틴 탈포화제 암호 서열은 예를 들어, 제타-카로틴 탈포화제(zds 유전자)를 위한 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis) mRNA에 해당하는 기탁번호 AJ319762 (Marcos et al. "Characterization of Pinalate, a novel Citrus sinensis variety with a fruit-specific alteration that results in yellow pigmentation and decreased ABA content," 미공개), 제타-카로틴 탈포화제를 위한 시트러스 운쉬우(Citrus unshiu) Cit-ZCD mRNA에 해당하는 기탁 번호 AB072343 (Kasai et al. "Citrusunshiu zeta-carotene desaturase," 미공개), 리코페르시콘 에스쿠렌툼 제타-카로틴 탈포화제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF195507 (Bartley et al. (1999) "Zeta-carotene desaturase (Accession No. AF195507) from tomato," Plant Physiol. 121 (4): 1383), 제타-카로틴/뉴로스포렌 디하이드로게나제를 위한 씨. 앤넘 mRNA에 해당하는 기탁 번호 X89897 (Breitenbach et al. (1999) "Catalytic properties of an expressed and purified higher plant type zeta-carotene desaturase from Capsicumannuum," Eur. J. Biochem. 265(1): 376-383), 및 제아 메이스 제타-카로틴 탈포화제 전구체 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF047490 (Luo et al. (1999) "A Maize cDNA Encoding Zeta Carotene Desaturase (기탁 번호 AF047490)," Plant Physiol. 120 (4): 1206)에 해당하는 것들을 포함한다.

리코펜 β-사이클라제

본 발명의 방법에 따라 파인애플 세포 또는 식물을 형질전환시키기 위해 선택적으로 이용되는 예시적인 리코펜 β-사이클라제 암호 서열은 예를 들어, 시트러스 시넨시스 리코펜 베타-사이클라제 유전자에 해당하는 기탁 번호 AY094582 (Xu et al. "Molecular cloning of lycopene beta-cyclase gene from Red flesh navel orange by using Tail-PCR," 미공개), 시트러스 시넨시스 리코펜 베타-사이클라제 유전자에 해당하는 기탁 번호 AF240787 (Xu et al. "Molecular cloning of lycopene beta-cyclase gene from orange (Citrus sinensis)," 미공개), 리코페르시콘 에스쿠렌툼 잡색체-특이적 리코펜 베타-사이클라제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF254793 (Ronen et al. (2000) "An alternative pathway to beta-carotene formation in plant chromoplasts discovered by map-based cloning of beta and old-gold color mutations in tomato, "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(20): 11102-11107), 리코펜 베타-사이클라제를 위한 엘. 에스쿠렌툼에 해당하는 기탁 번호 X86452 (Cunningham et al. (1996) "Functional analysis of the beta and epsilon lycopene cyclase enzymes of Arabidopsis reveals a mechanism for control of cyclic carotenoid formation," Plant Cell 8(9): 1613-1626)에 해당하는 것들을 포함한다.

리코펜 ε-사이클라제

여기서 선택적으로 이용되는 리코펜 ε-사이클라제 암호 서열은 예를 들어, 시트러스 엑스 파라디시 리코펜 입실론-사이클라제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF486650 (Costa et al. (2002) direct submission to Horticultural Sciences, University of Florida, Gainesville, FL, USA), 스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea) 리코펜 입실론-사이클라제 (lec) mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF463497 ( DeSouza et al. "Production of Lutein in Microorganisms," 미공개), 락투카 사티바(Lactuca sativa) 리코펜 입실론-사이클라제 mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF321538 (Cunningham et al. (2001) "One ring or two? Determination of ring number in carotenoids by lycopene varepsilon-cyclases," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(5): 2905-2910), 및 리코펜 입실론-사이클라제를 위한 리코페르시콘 에스쿠렌툼 mRNA에 해당하는 기탁 번호 Y14387 (Ronen et al. "Regulation of expression of the gene for lycopene epsilon cyclase during fruit ripening of tomato," 미공개)에 해당하는 것들을 포함한다.

β-카로틴 하이드록실라제

본 발명의 방법에 따라 파인애플 세포 또는 식물을 형질전환시키기 위해 선택적으로 이용되는 예시적인 β-카로틴 하이드록실라제 암호 서열은 예를 들어, 오 리자 사티바(Oryza sativa) 염색체 10 BAC OSJNBa0053C23 게놈 서열에 해당하는 기탁 번호 AC092389 (Buell et al. "Oryza sativa chromosome 10 BACOSJNBa0053C23 genomic sequence," 미공개), 비티스 비니페라(Vitis vinifiera) 베타-카로틴 하이드록실라제(bch1) 유전자에 해당하는 기탁 번호 AF499108 (Young et al. "Isolation, characterization and heterologous expression of a beta-carotene hydroxylase from grapevine (Vitis vinifera)," 미공개), 시트러스 운쉬우 베타-카로틴 하이드록실라제(CHX2) mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF315289 (Kim et al. (2001) "Isolation and characterization of cDNAs encoding beta-carotene hydroxylase in Citrus," Plant Sci. 161(5): 1005-1010), 및 시트러스 운쉬우 베타-카로틴 하이드록실라제(CHX1) mRNA에 해당하는 기탁 번호 AF296158 (Kim et al. (2001) "Isolation and characterization of cDNAs encoding beta-carotene hydroxylase in Citrus," Plant Sci. 161 (5): 1005-1010)에 해당하는 것들을 포함한다.

ε-하이드록실라제

여기서 선택적으로 이용되는 입실론-하이드록실라제 암호 서열은 예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 염색체 1, 바텀 암(bottom arm) 완전 서열에 해당하는 기탁 번호 AE005173 (Theologis et al. (2000) "Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana," Nature 408 (6814): 816-820) 및 아라비돕시스 탈리아나 염색체 1, 톱 암(top arm) 완전 서열에 해당하는 기탁 번호 AE005172 (Theologis et al. (2000) "Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana," Nature 408 (6814): 816-820)에 해당하는 것들을 포함한다.

또한, 카로테노이드생성 미생물로부터의 카로테노이드 생합성 효소 클러스터를 위한 핵산 서열은 기탁 번호 M87280 (어위니아 허비콜라 Eho1O), D90087 (어위니아 우레도보라), U62808 (플라보박테리움(Flavobacterium)), D58420 (아그로박테리움 아우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)) 및 M90698 (어위니아 허비콜라 Ehol3)와 같이 GenBank^®로부터 얻을 수 있다.

V. 인공적으로 생성된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드

본 발명의 일부 구체예에서, 인공적으로 생성된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드는 형질전환 파인애플 세포와 식물에서 카로테노이드 축적을 조절하기 위해 이용된다. 예를 들어, 전술한 예시적인 표적 카로테노이드 생합성 서열중 임의의 것은 촉매 효율 증가, 기질 특이성 증가 및/또는 기타와 같은 원하는 형질 또는 특성을 얻기 위해 인공적으로 생성될 수 있다. 다양한 인공적 다양성 생성 과정이 이용가능하며 당업계에서 개시되며, 인공적으로 생성되는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 이들 과정은 별도로 또는 조합하여 이용되어 핵산의 변이체뿐만 아니라 핵산 변이체에 의해 암호화되는 카로테노이드 생합성 단백질의 변이체를 생산할 수 있다. 개별적으로 그리고 총체적으로, 이들 과정은 개별 카로테노이드 생합성 핵산 및 단백질을 조작하거나 신속하게 생성하는 확실하고 널리 적용가능한 방법을 제공하며, 전체 카로테노이드 경로 또는 그 경로의 선 택된 일부를 제공한다. 이들 과정의 생성물은 본 발명의 형질전환 방법에 이용될 수 있다.

특히, 여기서 개시되거나 또는 당업계에 공지된 다양성 생성 과정의 임의의 것의 결과는 촉매 효율 증가 등과 같은 바람직한 특성을 갖거나 부여하는 카로테노이드 생합성 효소를 암호화하는 핵산에 대해 선별되거나 스크린되는 하나 이상의 핵산의 생성일 수 있다. 이것은 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 분석에 의해, 자동화되거나 자동화가능한 포맷에서 검출될 수 있는 임의의 활성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 관련(또는 심지어는 무관한) 특성을 실시자의 판단에 따라 연속으로 또는 평행하게 평가할 수 있다.

본 발명의 형질전환 방법에 선택적으로 이용되는 인공적으로 생성된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드는 많은 다른 기법을 이용하여 유래될 수 있다. 예시적으로, 둘 이상의 모 서열에서 유래한 확인가능한 성분들(예, 단백질 도메인)을 비롯한 키메라 효소가 이용될 수 있다. 예를 들어, 다른 피토엔 신타제의 도메인을 키메라 후손 피토엔 신타제에 포함시키기 위해 확인하고 선택할 수 있다. 다양한 서열 비교 알고리즘 및 키메라 효소 고안에 유용한 다른 도구들이 하기에 추가로 개시된다.

인공적으로 생성된 효소는 추가로 카세트 돌연변이유발, 부위-지시된 돌연변이유발(예를 들어, Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229: 1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237: 1-7; 및 Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin) 참고), 화학적 돌연변이유발, 에러-프론 PCR, 부위-포화 돌연변이유발, 회귀성 앙상블 돌연변이유발 등과 같은 다양한 돌연변이유발 방법을 이용하여 개발될 수 있다. 예시적으로, 에러-프론 PCR은 핵산 변이체를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 에러-프론 PCR을 이용하여, DNA 폴리머라제의 복사 확실성이 낮은 조건하에서 PCR을 실시하여 높은 비율의 점 돌연변이가 PCR 생성물의 전체 길이를 따라 얻어지도록 한다. 그러한 기법의 예는 추가로 예를 들어, Leung et al. (1989) Technique 1: 11-15 및 Caldwell et al. (1992) PCR Methods Applic. 2: 28-33에 개시된다. 예시적인 돌연변이유발 기법을 추가로 예시하기 위하여, 카세트 돌연변이유발은 이중쇄 DNA 분자의 작은 영역을, 예를 들어, 천연 서열과 상이한 합성 올리고뉴클레오티드 카세트로 치환하는 과정에서 선택적으로 이용된다. 합성 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 완전하게 및/또는 부분적으로 임의화된 천연 서열(들)을 함유할 수 있다. 카세트 돌연변이유발에 관련되는 추가의 상세 사항은 예를 들어, Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34: 315-323에 개시된다. 분자 다양성을 돌연변이유발에 의해 생성하는 다른 예시적인 방법은 단백질 돌연변이유발을 위한 알고리즘을 이용하여 표현형적으로 관련된 돌연변이의 다양한 집단을 생산하며 그 구성원은 아미노산 서열이 상이한 회귀성 앙상블 돌연변이유발과정이다. 이 방법은 피드백 기작을 이용하여 조합적인 카세트 돌연변이유발의 연속적인 라운드를 모니터한 다. 이 접근법의 예는 Arkin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815에 개시된다. 상기에 언급한 돌연변이 기법은 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에서 다양성을 생산하기 위해 선택적으로 이용되는 일부 과정을 예시하기 위해 제공된다. 돌연변이유발을 통해 다양성을 생성하는 다른 다수의 접근법은 공지되어 있으며 또한 본 발명의 방법에 적합하다.

전술한 것과 같은 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 선택적으로 회귀성 서열 재조합 프로토콜과 같은 다양한 재조합 반응을 위한 기질로서 이용된다. 이들 기법의 다수는 예를 들어, Chang et al. (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17: 793-797, Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391: 288-291, Crameri et al. (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology 15: 436-438, Crameri et al. (1996) "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling" Nature Biotechnology 14: 315-319, Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13: 549-553, 및 Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370: 389-391을 비롯한 다양한 문헌에서 개시된다.

전술한 다양성 생성 과정의 다수(예, 키메라 효소 고안 및 합성, 회귀성 서열 재조합 등)는 출발 서열중에서 상동성의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 서열 비교와 상동성 결정의 과정에서, 한 서열, 예, 재조합될 유전자 서열의 한 단편 또는 그 하위서열은 다른 시험 핵산 서열이 비교될 기준으로 이용될 수 있다. 이 비교는 서열 비교 알고리즘의 도움으로 또는 시각적 관찰에 의해 이루어질 수 있다. 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라, 하위서열 코디네이트를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 특정한다. 이어서 알고리즘은 특정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대하여 시험 핵산 서열을 위한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

본 발명의 목적을 위하여, 적합한 서열 비교를 예를 들어, Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443의 상동성 배열 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444의 유사성 조사 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)중의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 시각적 관찰에 의해 실시될 수 있다. 일반적으로, Current Protocols in Molecular Biology. F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (2001년까지 보충됨)를 참고한다. 퍼센트 서열 동일성과 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 다른 예시적인 서치 알고리즘은 예를 들어, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410에 개시된 기본적인 국소 배열 서치 툴(BLAST) 프로그램이다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는 www.ncbi.nlm.nih.gov의 생명공학 정보를 위한 국립 센터를 통해 이용가능하다.

돌연변이유발, 라이브러리 구성 및 다른 다양성 생성 방법을 위한 키트는 시판된다. 예를 들어, 키트는 예를 들어, Stratagene (예, QuickChange^TM 부위-지시된 돌연변이유발 키트, 및 Chameleon^TM 이중쇄, 부위-지시된 돌연변이유발 키트), Bio/Can Scientific, Bio-Rad (예를 들어, 전술한 컨켈 방법을 이용), Boehringer Mannheim Corp., Clonetech Laboratories, DNA Technologies, Epicentre Technologies (예, 5 프라임 3 프라임 키트), Genpak Inc., Lemargo Inc., Life Technologies (Gibco BRL), New England Biolabs, Pharmacia Biotech, Promega Corp., Quantum Biotechnologies, Amersham International plc, 및 Anglian Biotechnology Ltd로부터 구입할 수 있다.

VI. 핵산 제조

전술한 것과 같은 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절은 일부 DNA 합성 기법, DNA 증폭, 뉴클레아제 분해 등을 비롯한 다양한 방법 또는 그 조합을 이용하여 제조할 수 있다. 핵산 데이터베이스로부터 이용가능한 서치가능한 서열 정보를 핵산 분절 및 벡터 선별 및/또는 고안 과정동안 이용할 수 있다. Genbank^®, Entrez^®, EMBL, DDBJ, GSDB, NDB 및 NCBI는 접근가능한 공공 데이터베이스/서치 서비스의 예이다. 이들 데이터베이스는 일반적으로 게놈 정보 생성 및/또는 저장에 특화된 다양한 회사로부터의 계약에 기초하거나 인터넷을 통해서 이용가 능하다. 이들 및 다른 도움이 되는 자료는 쉽게 이용가능하며 공지되어 있다.

본 발명의 임의의 방법에 이용하기 위한 폴리뉴클레오티드의 서열은 또한 맥삼-길버트, 생거 디데옥시, 및 하이브리드화법에 의한 서열결정을 비롯한 당업계에 공지된 기법을 이용하여 쉽게 결정할 수 있다. 이들 과정의 일반적인 설명을 위해서는, 예를 들어, Stryer, Biochemistry, 4th Ed., W. H. Freeman and Company (1995) 및 Lewin, Genes VI, Oxford University Press (1997)를 참고한다. 또한, Maxam and Gilbert (1977) "A New Method for Sequencing DNA," Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 560-564, Sanger et al. (1977) "DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors, "Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-5467, Hunkapiller et al. (1991) "Large-Scale and Automated DNA Sequence Determination," Science 254: 59-67, 및 Pease et al. (1994) "Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA Sequence Analysis," Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 5022-5026를 참고한다.

전술한 카로테노이드 생합성 효소를 암호화하는 핵산 분절은 예를 들어, Matteucci et al.(1981) J. Am. Chem.Soc., 103: 3185의 포스포트리에스테르 방법을 이용하는 화학적 기법에 의해 합성할 수 있다. 물론, 암호 서열을 화학적으로 합성함으로써, 천연 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 것들을 적절한 염기로 치환함으로써 임의의 원하는 변형을 간단히 만들 수 있다. 하지만, 전술한 서열을 비롯한 핵산 분절이 일반적으로 바람직하다. 더욱이, 카로테노이드 생합성 효소를 암호화하는 핵산 분절은 선택적으로 이들 유전자를 함유하는 기존의 재조합 DNA 분자(플라스미드 벡터)로부터 얻어진다. 이들 플라스미드의 일부는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC) (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852)로부터 이용가능하다.

본 발명의 핵산 분절 및 구조체 또는 벡터는 분자 클로닝 기법과 같은 공지된 많은 기법에 의해 제조할 수 있다. 발현 벡터와 같은 재조합 핵산의 구성에 적합한 다양한 클로닝 및 생체외 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 사용하기 위한 적합한 벡터는 하기에 추가로 개시된다. 돌연변이유발을 비롯한 여기서 유용한 분자 생물학적 기법을 개시하는 일반적인 교과서는 Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.(1999) ("Berger"); Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2000) ("Sambrook"); 및 Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (2000년까지 보충됨) ("Ausubel")를 포함한다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), Qβ-레플리카제 증폭 및 다른 RNA 폴리머라제 매개 기법(예, NASBA)를 비롯한 생체외 증폭 방법을 통해 당업자를 안내하기에 충분한 기법의 예는 Berger, Sambrook, and Ausubel, 및 Mullis et al. (1987) 미국 특허 제4,683,202호; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds.), Academic Press Inc. (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (1990) Chemical and Engineering News 36-47; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace, (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89: 117, 및 Sooknananand Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564에 개시된다. 생체외 증폭된 핵산을 클로닝하는 추가 방법은 또한 Wallace et al.의 미국 특허 제5,426,039호에 개시된다. PCR에 의해 큰 핵산을 증폭시키는 방법은 Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 및 그 안에 인용된 참고문헌에 개시되며, 여기서는 최대 40 kb의 PCR 앰플리콘이 생성된다. 당업자는 또한 본질적으로 임의의 RNA가 제한 분해, 역전사효소 및 폴리머라제를 이용한 PCR 연장 및 서열결정에 적합한 이중쇄 DNA로 전환될 수 있음을 이해할 것이다. 상기한 Ausubel, Sambrook and Berger를 참고한다.

본 발명의 벡터 구조체내로 포함시키기 위한 핵산 서열의 분리는 공지된 임의의 수의 기법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 공지 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 유전자를 확인할 수 있다. 프로브를 이용하여 게놈 DNA 또는 cDNA와 하이브리드시켜 동일하거나 상이한 종에서 상동성 유전자를 분리할 수 있다. 다르게는, 효소에 대해 생성된 항체를 이용하여 상응하는 암호 서열을 위해 mRNA 발현 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.

다르게는, 대상 핵산(예, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자)은 증폭 기법을 이용하여 핵산 샘플로부터 증폭될 수 있다. 예를 들어, 폴리 머라제 연쇄 반응(PCR) 기법을 이용하여 게놈 DNA, cDNA, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 원하는 유전자의 서열을 증폭시킬 수 있다. PCR과 다른 생체외 증폭 방법은 또한 예를 들어, 발현될 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 클로닝하기 위해, 또는 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검출하거나 핵산 서열결정하거나 또는 다른 목적을 위한 프로브로서 이용할 핵산을 만들기 위해 유용할 수 있다. PCR의 일반적인 개요를 위해서는 상기한 Innis를 참고한다.

폴리뉴클레오티드는 또한 기술 문헌에서 개시된 대로 공지된 기법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, Carruthers et al. (1982) Cold Spring Harbor Sump. Quant. Biol. 47: 411-418, 및 Adams et al. (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661를 참고한다. 이어서 상보성 쇄를 합성하고 적절한 조건하에서 쇄를 어닐링시키거나, 또는 적절한 프라이머 서열을 이용하여 DNA 폴리머라제를 이용하여 상보성 쇄를 첨가함으로써 이중쇄 DNA 분절을 얻을 수 있다.

예를 들어, 생체외 증폭 방법에서 프로브로서, 또는 유전자 프로브로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 Beaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Letts. 22 (20): 1859-1862에 의해 개시된 고체상 포스포르아미디트 트리에스테르 방법에 따라, 예를 들어 Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168에 개시된 대로 자동화된 합성기를 이용하여 화학적으로 합성된다. 본 발명의 핵산 구조체 또는 벡터에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 또한 주문 제작될 수 있고 공지된 다양한 시판 공급원으로부터 주문될 수 있다.

VII. 벡터

본질적으로 임의의 벡터 또는 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 형질전환된 파인애플 세포와 식물을 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분절은 플라스미드 또는 플라스미드 시스템의 형태(예, 이중 시스템, 삼중 시스템, 셔틀 벡터 시스템 등)인 벡터에 작동적으로 연결된다. 본 발명에 사용하기 위해 선택적으로 적응되는 일부 예시적인 플라스미드 시스템은 예를 들어, Hamilton의 미국 특허 제5,977,439호(1999.11.2 허여됨), Torisky et al.의 미국특허 제5,929,306호(1999.7.27 허여됨), Hoekema et al.의 미국 특허 제5,149,645호(1992.9.22 허여됨), Kawasaki의 미국특허 제6,165,780호(2000.12.26 허여됨), Rogers et al.의 미국특허 제6,147,278호(2000.11.14 허여됨), Comai의 미국특허 제4,762,785호(1988.8.9 허여됨), 및 Comai의 미국특허 제 5,068,193호(1991.11.26 허여됨)에 개시된다.

예를 들어, 발현 카세트의 형태의, 여기서 개시된 핵산 분절은 일반적으로 전사의 5'-3' 방향, 전사 및 번역 개시 영역, 대상 DNA 서열(예, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자), 및 파인애플 식물에서 기능하는 전사 및 번역 종결 영역을 포함한다. 종결 영역은 전사 개시 영역과 천연이거나, 대상 DNA 서열과 천연이거나, 또는 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다. 편리한 종결 영역은 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 종결 영역과 같은 에이.투메파시엔스의 Ti-플라스미드로부터 이용가능하다. 또한 Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 262: 141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671-674; Sanfacon et al., (1991), Genes Dev., 5: 141-149; Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2: 1261-1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91: 151-158; Ballas et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7891- 7903; 및 Joshi et al., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627-9639를 참고한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 카로테노이드 생합성 유전자는 발현을 위해 엽록체와 같은 색소체에 표적화될 것이다. 카로테노이드 생합성 유전자가 색소체내로 직접 삽입되지 않는 이 방식에서, 발현 카세트는 추가로 대상 유전자를 색소체로 보낼 트랜싯 펩티드를 암호화하는 유전자를 함유할 것이다. 그러한 트랜싯 펩티드는 공지되어 있다. 예를 들어, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol Chem. 264: 17544-17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res Commun. 196:1414-1421 ; 및, Shah et al. (1986) Science 233: 478-481를 참고한다. 본 발명에 유용한 식물 카로테노이드 유전자는 천연 또는 이종성 트랜싯 펩티드를 이용할 수 있다.

본 발명의 구조체는 또한 대상 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 식물 번역 컨센서스 서열(Joshi, C. P., (1987), Nucleic Acids Research, 15: 6643-6653), 인트론 (Luehrsen and Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet., 225: 81-93) 등과 같은 다른 필요한 조절자를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서는, 5' 리더 서열이 발현 카세트 구조체에 포함된다. 그러한 리더 서열은 번역을 증가시키기 위해 작용할 수 있다. 번역 리더는 공지되어 있으며 하기를 포함한다: 피코르나바이러스 리더, 예를 들어 EMCV 리더(엔세팔로미오카 디티스(Encephalomyocarditis) 5' 비암호 영역)(Elroy-Stein et al.(1989) PNAS USA 86: 6126-6130); 포티바이러스(potyvirus) 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 에치 바이러스) (Allison et al., (1986); MDMV 리더(옥수수 왜소 모자이크 바이러스); Virology, 154: 9-20), 및 사람 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP), (Macejak, D. G., and Sarnow, P., (1991), Nature, 353: 90-94; 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA로부터의 비번역 리더 (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., and Gehrke, L., (1987), Nature, 325: 622-625; 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV),(Gallie, D. R. et al., (1989), Molecular Biology of RNA, pages 237-256; 및 옥수수 백화 반점 바이러스 리더 (MCMV) (Lommel, S. A. et al., (1991), Virole 81: 382-385. 또한, Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiology. 84: 965-968를 참고한다.

대상 DNA 서열이 발현될 곳에 따라, 파인애플 식물의 선호 코돈을 갖거나 또는 다르게는 엽록체 선호 코돈을 갖는 서열을 합성하는 것이 바람직할 수 있다. 파인애플 식물 선호 코돈은 대상 특정 식물 종에서 가장 대량으로 발현되는 단백질에서 가장 자주 이용되는 코돈으로부터 결정될 수 있다. 유럽 특허 출원 번호 제0359472호 및 0385962호; 국제 출원 WO 91/16432호; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328; 및 Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498을 참고한다. 이 방식으로, 파인애플 식물에서의 발현을 위해 뉴클레오티드 서열을 최적화할 수 있다. 유전자 서열의 모두 또는 임의의 부분을 최적화하거나 합성할 수 있음이 인식된다. 즉, 합성 또는 부분적으로 최적화된 서열 을 또한 이용할 수 있다. 엽록체 선호 유전자의 구성을 위해서는, 미국 특허 제5,545,817호를 참고한다.

발현 카세트를 제조할 때, 다양한 DNA 단편을 조작하여, 적절한 배향으로 그리고 적절한 판독 프레임에 적합하도록 DNA 서열을 제공할 수 있다. 이 목적을 위하여, 어댑터 또는 링커를 이용하여 DNA 단편을 연결할 수 있으며 또는 다른 조작이 관련되어 편리한 제한 부위, 과다한 DNA의 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공할 수 있다. 이 목적을 위하여, 생체외 돌연변이 유발, 프라이머 회복, 분해, 어닐링, 재절개, 결찰 등을 이용할 수 있으며, 이때 삽입, 결실 또는 치환, 예, 전좌 및 역위가 관련될 수 있다.

본 발명의 벡터는 또한 일반적으로 프로모터와 같은 발현 조절 요소를 포함한다. 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 암호 유전자는 발현 벡터에 작동적으로 연결되어 프로모터 서열이 RNA 폴리머라제 결합 및 폴리펩티드 암호 유전자의 발현을 지시하도록 한다. 폴리펩티드 암호 유전자를 발현하는데 유용한 것은 예를 들어, Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3: 2719 및 Odell et al. (1985) Nature 313: 810 (1985)에 개시된 유도성, 바이러스성, 합성, 구성적 프로모터, 및 예를 들어, Chua et al. (1989) Science 244: 174-181에 개시된 대로 시간적으로 조절되거나, 공간적으로 조절되거나, 공간 및 시간적으로 조절되는 프로모터이다.

발현 벡터 및 예를 들어 폴리펩티드 암호 유전자가 작동적으로 연결될 미리선택된 기관-증가된 프로모터의 선택은 원하는 기능적 특성, 예, 단백질 발현의 위치 및 타이밍에 의존한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 벡터는 파인애플 식물내로 통합되며, 복제를 지시할 수 있으며, 또한 그것이 작동적으로 연결된 핵산 분절에 포함된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 암호 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 전체 발현 벡터가 숙주 식물 게놈내로 통합되지는 않으며 일부만 통합됨은 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 벡터는 표현의 용이성을 위해 통합되는 것으로 말한다.

본 발명의 일부 구체예에서, 구조체는 연결된 핵산 서열에 더하여, 프로모터, 인핸서 요소 및 시그널링 서열과 같은 요소를 포함한다. 예시적인 프로모터는 CaMV 프로모터, 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제-옥시게나제 작은 서브유닛 유전자로부터의 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 및 rolD 프로모터를 포함한다. 예시적인 인핸서 요소는 예를 들어 2001년 8월 7일에 McBride et al.에 허여된 미국 특허 제6,271,444호에 개시된다. 예시적인 시그널링 서열은 엽록체 트랜싯 펩티드와 같은 조직-특이적 트랜싯 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며 이에 한정되지 않는다 (예, Zhang et al. (2002) Trends Plant Sci 7(1): 14-21).

일부 구체예에서, 파인애플 식물의 모든 조직에서 암호된 서열의 발현을 지시하는 강하게 또는 약하게 구성적인 식물 프로모터를 이용할 수 있다. 그러한 프로모터는 대부분의 환경 조건 및 발생 또는 세포 분화의 상태하에서 활성이다. 구성적 프로모터의 예는 아그로박테리움 투메파시엔스의 T-DNA로부터 유래된 1'- 또는 2'-프로모터 및 공지된 다양한 식물 유전자로부터의 다른 전사 개시 영역을 포함한다. 유전자의 과다발현이 불필요할 경우, 보다 낮은 발현 수준을 위해 약한 구성적 프로모터를 이용할 수 있다. 높은 수준의 발현이 필요한 경우에는, 예를 들어, t-RNA 또는 다른 pol III 프로모터 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모 터와 같은 강한 pol II 프로모터를 이용할 수 있다.

다르게는, 식물 프로모터는 환경적 조절을 받을 수 있다. 그러한 프로모터는 여기서 "유도성" 프로모터로 불린다. 유도성 프로모터에 의한 전사를 일으킬 수 있는 환경적 조건의 예는 병원균 공격, 혐기성 조건, 또는 빛의 존재를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 구조체내로 통합된 프로모터는 "조직-특이적"이며, 따라서 원하는 유전자가 과일-조직과 같은 일부 조직에서만 발현되는 발생 조건하에에 있다. 파인애플 식물에 내인성인 하나 이상의 핵산 서열이 구조체내로 통합되는 구체예에서, 이들 유전자로부터의 내인성 프로모터(또는 그 변이체)는 형질감염된 식물에서 유전자의 발현을 지시하기 위해 이용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 또한 여기서 개시된 인공적으로 발생한 핵산을 비롯한 이종성 구조 유전자의 발현을 지시하기 위해 이용될 수 있다.

전술한 프로모터에 더하여, 식물에서 작동하는 박테리아 기원의 프로모터는 옥토핀 신타제 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터 및 천연 Ti 플라스미드로부터 유래된 다른 프로모터(Herrara-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209-213 참고)를 포함한다. 바이러스 프로모터는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 및 19S RNA 프로모터를 포함한다(Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812). 다른 식물 프로모터는 리불로스 1,3-비스포스페이트 카복실라제 작은 서브유닛 프로모터 및 파세올린 프로모터를 포함한다. E8 유전자 및 다른 유전자로부터의 프로모터 서열 또한 이용될 수 있다. E8 프로모터의 분리 및 서열은 Deikman and Fischer (1988) EMBO J. 7: 3315-3327에 상세히 개시된다.

본 발명의 구조체를 제조할 때, 프로모터 및 결합된 핵산 분절외의 서열 또한 이용될 수 있다. 정상적인 폴리펩티드 발현을 원하면, 암호 영역의 3'-말단에서 폴리아데닐화 영역을 포함시킬 수 있다. 폴리아데닐화 영역은 천연 유전자로부터, 다양한 다른 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA로부터 유래될 수 있다.

파인애플 식물에서 유전자의 발현에 유용한 일반적인 벡터는 공지되어 있으며 Rogers et al. (1987) Meth. in Enzemol., 153: 253-277 (1987)에 의해 개시된 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도(Ti) 플라스미드로부터 유래된 벡터를 포함한다. 이들 벡터는 식물 통합성 벡터로서, 형질전환시 상기 벡터는 파인애플 식물의 게놈내로 벡터 DNA의 일부를 통합시킨다. Ti 플라스미드에 기초한 통합 벡터의 경우, 숙주 식물 염색체내로 통합된 영역은 Ti 플라스미드의 우측 및 좌측 경계 사이에 있는 영역이다.

여기서 유용한 예시적인 에이.투메파시엔스 벡터는 Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11 및 Berger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 8402-8406의 pKYLX6 및 pKYLX7 플라스미드이다. 플라스미드 pKYLX6은 중간 구조체를 위해 고안된 이. 콜리 벡터이고, 플라스미드 pKYLX7은 클론된 유전자의 통합을 위해 고안된 에이. 투메파시엔스 벡터이다. 변형된 벡터 pKYLX61과 pKYLX71은 원래의 HindIII-SstI 단편 다중 클로닝 부위 영역대신 HindIII, XhoI, BamHI, PstI 및 SstI 부위를 함유한다. 여기서 유용한 다른 벡터는 Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, Calif.)에서 구입할 수 있는 플라스미드 pBI101.2이다. 플라스미드 pKYLX7, pKYLX71 및 pB7101.2는 vir 유전자를 갖는 다른 벡터를 갖는 에이. 투메파시엔스에서 이용되는 이중 벡터이다. 삼중 벡터 시스템을 비롯한 다른 벡터 시스템 또한 선택적으로 여기서 이용된다. 다른 식물 형질전환 시스템은 형질전환시 종양보다는 잔털이 난 뿌리를 유도하는 아그로박테리움 리조제네스에 기초한다. 예를 들어 국제 공개 WO 88/02405호(1988.4.7 공개)는 에이.리조제네스 균주 A4 및 그것의 Ri 플라스미드를 에이.투메파시엔스 벡터 pARC8 또는 pARC16과 함게 이용하여 식물을 형질전환시키는 것을 개시한다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 하기에 추가로 개시된다.

레트로바이러스 발현 벡터의 이용 또한 고려된다. 여기서 이용될 때, 용어 "레트로바이러스 발현 벡터"는 레트로바이러스 게놈의 긴 말단 반복(LTR) 영역으로부터 유래된 프로모터 서열을 포함하는 DNA 분자를 말한다. 본 발명의 카로테노이드 생성물의 일부는 음식 생산과 색에 관련되므로, 레트로바이러스 발현 벡터는 바람직하게는 진핵 세포에서는 복제 불가능해야한다. 레트로바이러스 벡터의 구성 및 이용은 예를 들어, 국제 공개 WO 87/00551호 및 Cocking et al. (1987) Science 236: 1259-62에서 Verma에 의해 개시되었다.

일부 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 암호 유전자를 발현시키기 위해 이용되는 벡터는 형질전환된 파인애플 세포상에 선택성 표현형을 부여하는 식물 선택성 마커를 포함한다. 삽입될 DNA 절편상의 선택성 식물 마커 유전자는 대개 선택 배지에서 형질전환된 배발생 또는 기관형성 조직 또는 캘러스의 생존 및 출현을 허용하는 기능을 암호할 것이다. 대개, 선택성 마커 유전자는 항생제 내성을 암호할 것이며, 적합한 유전자는 항생제 스펙티노마이신에 대한 내성을 암호화 하는 것들(예, aadA 유전자), 스트렙토마이신 내성을 암호화하는 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제(SPT) 유전자, 카나마이신 또는 제네티신 내성을 암호화하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPTII) 유전자, 히그로마이신 내성을 암호화하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT) 유전자, 아세토락테이트 신타제(ALS)의 작용을 억제하는 작용을 하는 제초제, 특히 설포닐우레아타입 제초제에 대한 내성을 암호화하는 유전자(예, 그러한 내성을 야기하는 돌연변이, 특히 S4 및/또는 Hra 돌연변이를 함유한 아세토락테이트 신타제(ALS) 유전자), 포스피노트리신 또는 바스타와 같은, 글루타민 신타제의 작용을 억제하는 제초제에 대한 내성을 암호화하는 유전자(예, bar 유전자), 또는 공지된 다른 그러한 유전자를 포함한다. bar 유전자는 제초제 바스타에 대한 내성을 암호하고, nptII 유전자는 항생제 카나마이신 및 제네티신에 대한 내성을 암호하며, ALS 유전자는 제초제 클로르설푸론에 대한 내성을 암호한다. 설포닐우레아 타입 제초제에 대한 내성에 기초한 선별이 바람직하다. 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 β-글루쿠로니다제(GUS)에 기초한 선별 마커가 또한 선택적으로 이용되며, 추가로 Mantis et al. (2000) "Comparing the utilityof -glucuronidase and green fluorescent protein for detection of weak promoter activity in Arabidopsis thaliana, " Plant Molecular Biology Reporter 18: 319-330에 개시된다.

원하는 내성 유전자를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 선별하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 마커가 설포닐우레아 내성이면, 선별 배지는 일반적으로 적절한 농도의 설포닐우레아 타입 제초제(예, 1-1000 ㎍/L, 바람직하게는 약 5-100 ㎍/L 범위의 클로르설푸론)를 함유한다. NPTII 유전자를 함유하는 제네티신 내성 파인애플 세포 또는 조직의 선별을 위해서는, 제네티신은 일반적으로 10-50 mg/L 로 배지에 포함된다. aadA 유전자를 함유하는 스펙티노마이신 내성 세포 또는 조직은 일반적으로 200-1000 mg/L 스펙티노마이신을 함유하는 배지에서 선별된다.

많은 카로테노이드가 색을 갖기 때문에, 이들 카로테노이드 생성물은 그들의 특징적인 스펙트럼 및 다른 분석 방법에 의해 가시화되고 측정될 수 있다. 따라서, 카로테노이드 생합성 효소를 암호화하는 유전자를 마커 유전자로 이용하여 형질전환체의 시각적 선별을 가능하게 할 수 있다. 특히, 그러한 형질전환된 세포는 일반적으로 증가된 카로테노이드 수준으로 인해 노란색 내지 오렌지색 내지 적색 범위의 색을 나타낸다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 질량 분광법, 박층 크로마토그래피(TLC), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 모세관 전기영동(CE), NMR 분광법, 및 종래의 하이브리드화 기법을 비롯한 다른 분석 기법을 이용하여 형질전환된 파인애플 세포를 선별할 수 있다.

상보성 코헤시브(cohesive) 말단 또는 블런트(blunt) 말단을 통해 DNA를 벡터에 작동적으로 연결시키위해 다양한 방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 상보성 동종중합체 트랙트를 삽입될 핵산 분절 및 벡터에 첨가할 수 있다. 이어서 상기 벡터와 핵산 분절을 상보성 동종중합체 테일 사이의 수소 결합에 의해 연결시켜 재조합 DNA 분자를 형성한다.

다르게는, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 링커를 이용하여 핵산 분절을 통합 발현 벡터에 연결시킬 수 있다. 박테리오파아지 T4 DNA 리가제와 같은 블런트-말단 핵산 분자의 결찰을 촉매할 수 있는 효소의 존재하에서 블런트-말단의 핵산 분절을 과량의 합성 링커 분자와 항온처리하여 합성 링커를 블런트-말단 핵산 분절에 부착시킨다. 따라서, 상기 반응의 생성물은 그들의 말단에 합성 링커 서열을 보유한 핵산 분절이다. 이어서 이들 핵산 분절을 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 합성 링커의 말단과 융화성인 말단을 생성하는 효소로 절단된 통합 발현 벡터내로 결찰시킨다. 다양한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유한 합성 링커는 New England BioLabs (Beverly, MA)를 비롯한 많은 공급원으로부터 시판된다.

도입된 DNA 분절은 파인애플 식물에서 카로테노이드 수준을 변형시키기 위한 것에 더하여, 추가로 새로운 파인애플 식물 형질을 제공하기 위해, 기존의 파인애플 식물 형질을 개량하기 위해, 또는 다르게는 파인애플 식물에 의해 나타나는 표현형의 발현을 개량하기 위해 선택된 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 그러한 추가의 형질은 제초제 내성, 살충제 내성, 질병 내성, 환경 내성(예, 열, 추위, 가뭄, 염도), 형태, 성장 특성, 영양 함량, 맛, 수율, 원예적 특성, 소비자(품질) 형질 등을 포함한다. 도입될 수 있는 유전자의 예는 특정 질병 또는 파인애플의 페스트에 대한 내성을 부여하거나 민감성을 감소시키는 것들을 포함한다. 예는 푸사리오시스, 벚나무깍지벌레로 인한 시듬, 마블링 질병, 및 선충류에 대한 민감성을 감소시키는 것을 포함한다.

VIII. 카로테노이드 생합성 조절 전략

도입될 기능성 유전자는 변형된 파인애플 과일 색과 같은 원하는 표현형을 부여하는 폴리펩티드를 암호화하는 구조 유전자일 수 있다. 다르게는, 기능성 유전자는 파인애플 식물내에서 내인성 유전자의 전사 및/또는 발현을 억제, 증가, 또는 다르게는 변형시키기 위해 전사 및/또는 번역 조절에서 역할을 하는 조절 유전자일 수 있다. 일부 구체예에서는, 예를 들어, 도입된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 전사 인자를 암호화하는 핵산 분절이며, 이것은 형질전환된 세포에서 발현될 때 표적화된 카로테노이드 생합성 유전자의 발현 증가를 일으킨다. 다른 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 프로모터 및/또는 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 인핸서를 암호화하는 핵산 분절을 포함하며, 이 핵산 분절은 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 프로모터 및/또는 인핸서와 상동성 재조합하여 원하는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킨다.

추가로 예시하기 위하여, 다양한 DNA 구조체를 많은 기법에서 이용하여 내인성 식물 유전자의 발현을 억제할 수 있으며, 예를 들어, 센스 또는 안티센스 억제 또는 리보자임이 있다. 유전자 발현의 안티-센스 RNA 억제는 예를 들어 Sheehy et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 8805-8809, 및 Hiatt et al.의 미국특허 제4,801,340호를 참고한다. 내인성 유전자의 발현을 조절하기 위한 센스 억제의 사용의 예는 Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289, 및 미국특허 제 5,034,323호를 참고한다.

촉매적 RNA 분자 또는 리보자임 또한 유전자 발현을 억제하기 위하여 이용될 수 있으며, 억제될 유전자로부터 카로테노이드 생합성 경로에서 상부에 있는 선택 된 카로테노이드의 축적을 일으키기 위해 이용된다. 사실상 임의의 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 이루고 특정 위치에서 포스포디에스테르 백본을 절단하여 표적 RNA를 기능적으로 불활성화시키는 리보자임을 고안하는 것이 가능하다. 이 절단을 실시할 때, 리보자임 자체는 변화되지 않으며, 따라서 재생가능하며 다른 분자를 절단할 수 있어, 진정한 효소가 된다. 안티센스 RNA내의 리보자임 서열의 포함은 그들에게 RNA-절단 활성을 부여하여 구조체의 활성을 증가시킨다.

리보자임의 많은 클래스가 확인되었다. 한 클래스의 리보자임은 자가-절단 및 복제를 식물에서 할 수 있는 많은 작은 원형 RNA로부터 유래된다. 상기 RNA는 단독으로(비로이드 RNA) 또는 헬퍼 바이러스와 함께(위성 RNA) 복제한다. 예로는 아보카도 선블로취 비로이드로부터의 RNA 및 담배 링스폿 바이러스, 루체른 일시 스트리크 바이러스, 벨벳 담배 반점 바이러스, 가지 노디플로럼 반점 바이러스 및 지하 클로버 반점 바이러스로부터의 위성 RNA를 포함한다. 표적 RNA-특이적 리보자임의 고안 및 이용은 Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591에 개시된다.

안티센스 억제의 경우, 도입된 서열은 또한 일차 전사 생성물 또는 완전히 프로세스된 mRNA에 비하여 전체 길이일 필요가 없다. 일반적으로, 더 높은 상동성을 이용하여 더 짧은 서열의 이용을 보상할 수 있다. 더욱이, 도입된 서열은 동일한 인트론 또는 엑손 패턴을 가질 필요가 없으며, 비암호화 분절의 상동성은 동일하게 효과적일 수 있다. 정상적으로는, 약 30 또는 40 뉴클레오티드와 약 2000 뉴클레오티드 사이의 서열이 이용되지만, 적어도 약 100 뉴클레오티드의 서열이 바람직하며, 적어도 약 200 뉴클레오티드의 서열이 더욱 바람직하며, 적어도 약 500 뉴 클레오티드의 서열이 특히 바람직하다.

추가로 예시하기 위하여, 전사후 유전자 사일런싱(PTGS)로도 알려진, RNA 간섭(RNAi)은 또한 파인애플 세포와 식물에서 카로테노이드 축적을 조절하기 위해 선택적으로 이용된다. RNAi는 메신저 RNA를 파괴하여 표적 유전자의 효과를 선택적으로 제거하는 세포 기작이다. 표적화된 mRNA를 파괴함으로써, 단백질 합성이 간섭되며, 따라서 표적 유전자를 효과적으로 "잠재운다". 일부 구체예에서는, 이 과정은 이중쇄 RNA(dsRNA)에 의해 개시되며, 이때 한 쇄는 실질적으로 표적 mRNA 서열과 실질적으로 동일하다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 파인애플 세포내로 도입된 핵산 분절을 포함하여 이중쇄 dsRNA의 생산을 야기하며, 이것은 이어서 RNAi 과정의 일부로서 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단된다. 이 결과 표적 mRNA가 파괴되어, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 내인성 유전자와 같은 표적 유전자의 발현을 효과적으로 잠재운다. RNAi에 관한 추가의 상세 사항은 예를 들어 2003년 6월 3일에 Graham에 허여된 "GENETIC CONSTRUCTS FOR DELAYING OR REPRESSING THE EXPRESSION OF A TARGET GENE" 제목의 미국특허 제6,573,099호 및 Arenz et al. (2003) "RNA interference: from an ancient mechanism to a state of the art therapeutic application ?" Naturwissenschaften. 90(8): 345-59, Wang et al. (2003) "RNA interference: antiviral weapon and beyond, "World J Gastroenterol. 9(8): 1657-61, 및 Lavery et al. (2003) "Antisense and RNAi: powerful tools in drug target discovery and validation" Curr Opin Drug Discov Devel. 6 (4): 561-9에 개시된다. 표적 유 전자 사일런싱을 일으키기 위해 이용될 수 있는 주문 핵산 분절은 또한 Ambion, Inc. (Austin, TX, USA), Benitec Australia Limited (St Lucia, AU)과 같은 다양한 공급자로부터 시판된다.

종종 도입될 기능성 유전자는 그들의 천연 형태로부터 변형될 것이다. 예를 들어, 전술한 센스 및 안티-센스 구조체는 종종 전사가능한 분절의 5' 말단의 프로모터 서열에 작동적으로 연결되고 전사가능한 분절의 3' 말단의 다른 유전자의 3' 서열(폴리아데닐화 서열 포함)에 작동적으로 연결된 천연 유전자의 전사체의 모두 또는 일부를 갖는다. 당업자에게 명백한 것처럼, 프로모터 서열은 이미 개시된 많은 식물 활성 서열중 하나일 수 있다. 다르게는, 다른 식물-활성 프로모터 서열은 전사가능한 분절에 특이적으로 연결되도록 유도될 수 있다. 프로모터는 파인애플에 내인성이거나, 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(Odell et al.(1985) Nature 313: 810-812), 유비퀴틴 1 프로모터 (Christiensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689), 또는 Smas 프로모터 (Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661-676)와 같은 외인성 공급원으로부터 유래할 수도 있다. 첨가될 3' 말단 서열은 바람직하게는, 노팔린 신타제 또는 옥토핀 신타제 유전자로부터, 또는 다르게는 다른 식물 유전자로부터, 또는 덜 바람직하게는 임의의 다른 진핵 유전자로부터 유래될 수 있다.

전술한 대로, 카로테노이드의 생산은 예를 들어, 카로테노이드 생합성 효소를 암호화하는 핵산 분절(예, 첫번째 대상 유전자)로 형질전환된 파인애플 세포와 식물에서 증가될 수 있다. 선택적으로, 일단 이 생합성 활성이 이들 도입된 카로테 노이드 생합성 유전자의 발현에 의해 증가되면, 상기 경로는 특정 카로테노이드의 생산과 축적을 위해 전환될 수 있다. 상기 전환은 일반적으로 하나 이상의 두번째 대상 유전자의 이용을 포함한다. 예시적으로, 두번째 유전자는 특정 카로테노이드의 생산을 강화하기 위한 효소를 암호하거나, 또는 다르게는 특정 카로테노이드의 축적을 위한 경로를 정지시키는 유전자를 암호할 수 있다. 특정 카로테노이드의 생산을 강화하기 위해, 원하는 카로테노이드를 위한 경로에서 카로테노이드 생합성 유전자의 발현이 이용된다. 예를 들어, 어위니아 및 로도박터 종을 비롯한 박테리아와 같은, 식물외의 소스로부터의 카로테노이드 생합성 유전자를 비롯한, 표적 파인애플 식물에 천연이거나 외인성인 유전자를 이들 방법에서 선택적으로 이용한다. 이들 목적을 위해 이용될 수 있는 예시적인 카로테노이드 생합성 유전자는 상기에서 추가로 개시된다. 특정 카로테노이드 화합물을 축적시키기 위한 상기 경로를 정지시키기 위해, 두번째 유전자는 억제된 유전자에 의해 암호화되는 효소가 원하는 카로테노이드 화합물을 변형시킬 수 있는 표적 식물에게 유전자(예, 천연 또는 외인성)의 전사 억제를 제공할 것이다. 억제는 억제될 유전자의 센스(동시억제) 또는 안티센스 배향으로의 상기 유전자의 전사에 의해 이루어질 수 있다. 파인애플 식물에서 카로테노이드 축적을 조절하기 위한 다른 센스 및 안티센스 전략은 상기에서 언급된다.

추가의 예시로서, 제아크산틴, 제아크산틴 디글루코시드, 칸타크산틴 및 아스타크산틴과 같은 β-카로틴 유래 카로테노이드의 고 수준의 축적을 위해 파인애플 식물의 카로테노이드 조성을 변화시키기 위해, α-카로틴, 및 루테인과 같은 α-카로틴으로부터의 유도체인 다른 카로테노이드의 축적을 방지하기 위해 리코펜 ε-사이클라제의 억제가 이루어질 수 있다. 리코펜 ε-사이클라제의 억제에 더하여, 두번째 유전자의 발현 증가를 이용하여 특정 β-카로틴 유래 카로테노이드의 축정 증가를 이룰 수 있다. 예를 들어, β-카로틴 하이드록실라제 발현 증가는 제아크산틴의 생산에 유용한 반면, β-카로틴 하이드록실라제 및 케토-도입 효소 발현의 증가는 아스타크산틴의 생산에 유용하다. 다르게는, 리코펜을 축적하기 위하여, 리코펜 β-사이클라제 또는 리코펜 ε-사이클라제와 리코펜 β-사이클라제의 억제를 일으켜 리코펜이 α- 및 β-카로틴으로 전환되는 것을 감소시킬 수 있다.

다양한 유전자를 선택적으로 이용하여 파인애플 세포와 식물에서 카로테노이드 생합성을 원하는 대로 전환시킬 수 있다. 이들은 제아크산틴의 생산을 위한 β-카로틴 하이드록실라제 또는 crtZ (Hundle et al. (1993) FEBS Lett. 315: 329-334, 기탁 번호 M87280); 칸타잔틴의 생산을 위한 crtW (Misawa et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 6575-6584, WO 95/18220호, WO 96/06172호) 또는 β-C-4-옥시게나제(crtO ; Harker et al. (1997) FEBS Lett. 404: 129-134)와 같은 케토-도입 효소를 암호화하는 유전자; 아스타잔틴의 생산을 위한 crtZ 및 crtW 또는 crtO; 루테인의 생산을 위한 ε-사이클라제와 ε-하이드록실라제; 루테인과 제아크산틴의 생산을 위한 ε-하이드록실라제와 crtZ; β-카로틴의 생산 증가를 위한 안티센스 리코펜 ε-사이클라제(기탁 번호 U50738); 리코펜의 생산을 위한 안티센스 리코펜 ε-사이클라제와 리코펜 β-사이클라제(Hugueney et al. (1995) Plant J. 8: 417-424, Cumiingham Jr et al. (1996) Plant Cell 8: 1613-1626, Scolnik et al. (1995) Plant Physiol. 108: 1343, 기탁 번호 X86452, L40176, X81787, U50739 및 X74599) ; 피토엔의 생산을 위한 안티센스 식물 피토엔 탈포화제; 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

이 방식에서, 상기 경로는 임의의 특정 대상 카로테노이드 화합물의 고 생산을 위해 변형될 수 있다. 그러한 화합물은 α-크립토잔틴, β-크립토잔틴, ζ-카로틴, 피토플루엔, 뉴로스포란 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법을 이용하여, 카로테노이드 경로의 임의의 대상 화합물을 파인애플 식물의 과일과 같은 선택된 저장 기관에서 고 수준으로 생산할 수 있다.

선택적으로, 상기 경로는 또한 예를 들어, 전구체 화합물이 조절되는 특정 카로테노이드로 전환되는 것을 방지하는 안티센스 DNA 서열로 파인애플 세포를 형질전환시켜 특정 카로테노이드의 수준을 감소시키기 위해 조작될 수 있다.

예를 들어 첫번째 대상 유전자, 또는 첫번째 및 두번째 대상 유전자 둘다를 포함하는 파인애플 식물을 생산하는 임의의 전략은 본 발명에서 선택적으로 이용된다. 예를 들어, 두번째 대상 유전자를 이용하여 첫번째 대상 유전자가 도입되는 것과 동시에 파인애플 식물을 형질전환시킬 수 있다(동시형질전환). 선택적으로, 두번째 대상 유전자를 이미 첫번째 대상 유전자로 형질전환된 파인애플 식물내로 도입하거나, 또는 다르게는 첫번째 대상 유전자를 발현하는 형질전환된 파인애플 식물과 두번째 대상 유전자를 발현하는 형질전환된 파인애플 식물을 교배시켜 두 유전자 모두 갖는 후손을 생산할 수 있다.

IX. 파인애플 외식편 공급원

본질적으로 임의의 파인애플 변종은 여기서 개시된 방법에 따라 형질전환될 수 있다. 일부 구체예에서, 파인애플 외식편 물질은 스무스 케이엔(Smooth Cayenne) 그룹, 스패니쉬(Spanish) 그룹 (예, 레드 스패니쉬), 페로레라(Perolera) 그룹, 페르남부코(Pernambuco) 그룹, 및 프리마베라(Primavera) 그룹의 것들을 비롯한, 사람이 소비하기 위해 일반적으로 이용되는 변종들로부터 얻어진다. 캔에 넣은 파인애플, 다른 가공된 파인애플 제품, 및 신선한 파인애플의 생산에 이용하기 위한 가장 중요한 변종은 스무스 케이엔이다. 이들 다수의 변종내에는, 다른 지형적 영역에서 확립되었으며 이들 위치에서의 생산에 적응된 많은 클론이 있다. 스무스 케이언 클론중에는 캔에 든 파인애플과 신선한 파인애플의 생산을 위해 광범위하게 이용되어온 챔파카 클론이 있다.

초기 외식편은 꽃 형성 전에 식물의 주요 또는 엽액 분열조직(정상(apices)), 및 과일의 부관의 주요 또는 엽액 분열조직을 비롯한, 식물의 임의의 분열조직 영역일 수 있다. 이들 영역은 식물로부터 절개되어 여기서 개시되고 공지된 표준 방법에 의해 멸균되어 인공 배지에서 멸균 배양물을 확립할 수 있다. 그러한 배양물은 연속적인 증식 단계에 의해 연장된 기간동안(예, 수주, 수개월 또는 수년) 유지될 수 있다. 생체외 슈트 배양의 확립과 유지를 위한 적합한 배지는 예를 들어, DeWald et al. (1988) Plant Cell Reports, 7: 535-537; Wakasa et al. (1978) Japan J Breed 28: 113-121; Mathews and Rangan (1981) Scientia Hort 14: 227-234; Srinivasa et al.(1981) Scientia Hort 15:23S-238; Fitchet (1990) Acta Hort 275: 267-274; Bordoloi and Sarma (1993) J Assam Science Society 35: 41- 45; 및 Firoozabady and Moy (2003) "Regeneration of pineapple plants via somatic embryogenesis and organogenesis," In Vitro에 개시된다.

본 발명의 일부 구체예에서, DNA 전달을 위한 표적인 파인애플 세포는 먼저 생체외에서 성장된 파인애플 슈트의 줄기의 일부 또는 잎의 기저 부분(즉, 잎 기부)으로부터 얻어지며, DNA 전달 단계에 앞서 배양으로 증식된다. 여기서 이용될 때, 용어 "잎 기부"는 파인애플 슈트의 줄기에 연결되는 잎의 부분을 말한다.

배발생 캘러스 또는 조직, 또는 기관형성 캘러스 또는 조직의 유도를 위하여, 잎 또는 잎 기부와 같은 멸균 외식편을 합성 식물 호르몬의 선택된 조합을 포함하는 특정 인공 배지상에 옮기며, 상기 배지는 예를 들어 옥신, 시토키닌, 지베렐린, 및 앱시스산을 포함한다. 예시적으로, 합성 옥신은 일반적으로 예를 들어, 피클로람(4-아미노-3,5,6-트리클로로-2-피리딘카르복실산), 디캄바(3,6-디클로로-2-메톡시벤조산), 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산), 인돌-3-아세트산(IAA), 인돌 부티르산(IBA), NAA(2-나프탈렌 아세트산), NOA(나프톡시아세트산) 등으로부터 선택된다. 이용될 수 있는 예시적인 시토키닌은 BA(벤질 아데닌), BAP(벤질 아미노퓨린), TDZ(티디아주론), 제아틴, 키네틴 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 배발생 및 기관형성 세포 배양은 공지되어 있다. 예를 들어, 체세포성 배발생 세포 배양 및 본 발명에 사용하도록 적응된 다른 태양에 관한 추가의 상세 사항은 예를 들어, 1999년 9월 14일에 Firoozabady et al.에 허여된 제목 "GENETICALLY TRANSFORMED PINEAPPLE PLANTS AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION"의 미국 특허 제5,952,543호 및 그안에 인용된 참고문헌 및 Firoozabady et al. (2002) Molecular Breeding에 제공된다. 기관형성 세포 배양에 관한 추가의 상세 사항은 예를 들어 2001년 5월 17일에 공개된 Graham et al.의 국제 공개 출원 WO 01/33943호 "A METHOD OF PLANT TRANSFORMATION", 1999년 6월 1일에 Liu et al.에 허여된 제목 "METHOD FOR REGENERATION OF SALVIA SPECIES"의 미국 특허 제5,908,771호, 2001년 6월 5일에 Tuli et al.에 허여된 제목 "TISSUE CULTURE PROCESS FOR PRODUCING A LARGE NUMBER OF VIABLE COTTON PLANTS IN VITRO"의 미국 특허 제6,242,257호, Croy (Ed.) Plant Molecular Biology Labfax, Bios Scientific Publishers Ltd. (1993), Jones (Ed.) Plant Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1995), 및 그안에 인용된 참고문헌에 개시된다.

당업자는 많은 다른 타입의 배발생 및 기관형성 세포는 여기서 개시된 핵산 분절의 전달 및 형질전환 사건의 선별을 위한 표적 세포로서 이용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분절은 그들이 배형성 또는 기관형성을 진행함에 따라 잎, 잎 기부, 또는 줄기 부분의 세포로 전달될 수 있다. 또한, 핵산 분절은 선택적으로 그들이 배발생 캘러스 또는 조직 또는 기관형성 캘러스 또는 조직으로 생겨난 후 즉시 세포로 전달된다. 추가 옵션으로서, 핵산 분절은 배발생 또는 기관형성 물질이 선택된 기간동안 생체외에서 유지되고 증식된 후 배발생 또는 기관형성 세포로 전달될 수 있다.

X. 핵산 분절 DNA 전달

본 발명의 형질전환 파인애플 세포는 다양한 발생 단계, 예를 들어, 기관형성 또는 배발생의 다양한 단계에서 형질전환된다. 또한, 본 발명의 핵산 분절은 많 은 공지 방식으로 파인애플 세포내로 도입될 수 있다. 개략적으로, 식물 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은 미세주입(Crossway et al.(1986) BioTechniques 4:320-334), 전기천공(Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606), 아그로박테리움-매개 형질전환 (Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6: 915-921), 충격 입자 가속화 또는 유전자 총(Sanford et al. 미국 특허 제 4,945,050호; 및 McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926), 화분-매개 전달(Zhou et al. (1983) Methods Enzymol. 101: 433, De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Chapman et al. (Eds. ), Longman, p.197; Hess (1987) Intern. Rev. Cymol. 107: 367; 및 Luo et al. (1989) Plant Mol. Biol. Rep. 7: 69), 파인애플 세포의 원형질체로의 직접 핵산 전달(Caboche et al. (1984) Comptes Rendus Acad. Sci. 299, series 3: 663), 미세주입 (Crossway et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179 and Reich et al. (1986) Bio/technol. 4: 1001), 꽃의 거대주입 (De la Pena et al. (1987) Nature 325: 274), 단결정-매개 함침 (Dunahay (1993) Biotechniques 15: 452-460 및 Frame et al. (1994) The Plant Journal 6: 941-948), 레이저 천공 (Weber (1988) Naturwissenschaften 75: 35), 및 초음파처리 (Zhang et al. (1991) Bio/technol. 9: 994)를 포함한다.

추가로 예시하기 위하여, 아그로박테리움-매개 전달은 핵산 분절이 전체 식물 조직으로 도입될 수 있어 원형질체로부터 본래의 식물의 재생을 필요로 하지 않으므로, 유전자를 식물 세포내로 도입하기 위해 널리 적용되는 시스템이다. 식물 세포내로 DNA를 도입하기 위해 아그로박테리움-매개 발현 벡터를 이용하는 것은 공지되어 있다. 예를 들어, Fraley et al.(1985) Biotechnology, 3:629 및 Rogers et al.(1987) Methods in Enzymology,153:253-277에 의해 개시된 방법을 참고한다. 또한, T-DNA의 통합은 즉히 적은 재배열을 야기하는 상대적으로 정확한 과정이다. 전달될 DNA의 영역은 경계 서열에 의해 정의되며, 간섭 DNA 또는 핵산 분절은 대개 Spielmann et al. (1986) Mol. Gen. Genet., 205:34와 Jorgensen et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:471에 의해 개시된 대로 식물 게놈내로 삽입된다.

전술한 것과 같은 현대적인 아그로박테리움 형질전환 벡터는 아그로박테리움뿐만 아니라 이. 콜리에서 복제할 수 있어, Klee et al.에 의해 Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell,(Eds), Springer-Verlag(1985) pp.179-203에 개시된 대로 편리한 조작을 허용한다.

더욱이, 아그로박테리움-매개 유전자 전달을 위한 벡터에서의 최근의 기술적 진전은 벡터에서 유전자의 배열과 제한 부위를 개선시켜 다양한 폴리펩티드 암호 유전자를 발현할 수 있는 벡터의 구성을 촉진한다. 예를 들어, Rogers et al. (1987) Methods in Enzymology,153:253에 의해 개시된 벡터는 삽입된 폴리펩티드 암호 유전자의 직접 발현을 위한 프로모터와 폴리아데닐화 부위에 의해 인접된 편리한 다중-링커 영역을 가지며 본 발명의 목적에 적합하다. 적합한 벡터는 상기에서 보다 상세히 개시된다.

본 발명의 일부 구체예에서, 이종성 핵산 분절은 T-DNA 요소내에 외인성 DNA를 보유한 아그로박테리움 균주를 이용하여 도입된다. 재조합 T-DNA 요소는 아그로 박테리움 세포로부터 식물 세포로의 DNA 전달을 위해 필요한 독성 기능을 함유한 Ti-플라스미드의 일부일 수 있으며, 또는 T-DNA 요소는 독성 기능을 보유한 다른 플라스미드와 구별되는 플라스미드상에 존재할 수 있다(이중 벡터로 불림). 이. 콜리 및 아그로박테리움 둘다에서 복제할 수 있는 이들 다양한 이중 벡터가 전술한 참고문헌에 개시된다. 동시배양의 한 방법에서, 아그로박테리움을 2-7 × 10⁸ 세포/mL의 농도까지 성장시키며 동시배양 전에 1-6 × 10⁸ 세포/mL, 바람직하게는 1-6 × 10⁸ 세포/mL로 희석시킨다. 아그로박테리움은 일반적으로 1-5일동안, 바람직하게는 2-3일동안 파인애플 조직과 동시배양된다.

적합한 아그로박테리움 균주는 아그로박테리움 투메파시엔스 및 아그로박테리움 리조제네스를 포함한다. 야생형 균주를 이용할 수 있는 한편, Ti 플라스미드의 종양 유도 서열이 제거된 두 종의 "무독성의" 유도체가 바람직하다. 적합한 아그로박테리움 투머파시엔스 균주는 예를 들어, Hood et al. (1986) J. Bacteriol., 168: 1291-1301)에 의해 개시된 EHA101, Hoekema et al. (1983) Nature, 303: 179-80)에 의해 개시된 LBA4404, 및 Koncz and Schell (1986) Mol. Gen. Genet., 204: 383-96)에 의해 개시된 C58 (pMP90)을 포함한다. 바람직한 아그로박테리움 리조제네스 균주는 15834이며, Birot et al. (Biochem, 25: 323-35)에 의해 개시된다.

파인애플 배발생 또는 기관형성 조직 또는 캘러스 및 DNA 분절을 보유한 아그로박테리움 세포는 적합한 동시배양 배지에서 동시배양되어 T-DNA가 식물 세포로 전달되도록 한다. 핵산 분절을 보유한 아그로박테리움 균주가 제조된 후, 이것은 대개 캘러스 또는 조직과 항온처리하기 앞서 배양된다. 아그로박테리움은 당업계에 공지된 방법에 따라 고체 또는 액체 배지상에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,262,316호를 참고한다.

추가의 옵션으로서, 식물 원형질체의 형질전환은 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공, 및 이들 처리의 조합에 기초한 방법을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet., 199: 183; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet., 199: 178; Fromm et al. (1986) Nature, 319: 791; Uchimiya et al. (1986) Mol. Gen. Genet., 204: 204; Callis et al. (1987) Genes and Development, 1: 1183; Marcotte et al. (1988) Nature, 335: 454; Wang et al. (1992) Bio/Technology. 10: 691-696; 및 Fennell et al. (1992) Plant Cell Reports, 11: 567-570를 참고한다.

원형질체로부터 성공적으로 재생될 수 없는 식물 종을 형질전환시키기 위해서는, 본래의 세포 또는 조직내로 핵산 분절을 도입하기 위한 다른 방식을 이용할 수 있다. 예를 들어, "입자 총" 또는 고속 유전자총 기법을 이용할 수 있다. 그러한 기법을 이용하여, 핵산 분절은 Klein et al. (1987) Nature, 327: 70; Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 8502; 및 McCabe et al. (1988) Biotechnology, 6: 923; 및 Vasil et al. (1992) Bio/Technology, 9: 667-674에서 개시된 대로 작은 금속 입자의 표면상에서 세포벽을 통과하여 세포질 내로 전달된다. 상기 금속 입자는 세포의 몇몇 층을 통과하여 조직 외식편내의 세포의 형질전환을 허용한다. 조직 외식편의 형질전환은 원형질체 단계를 통과할 필요를 없애주 며 따라서 형질전환 식물의 생산을 빠르게 한다.

핵산 분절은 또한 Zhou et al. (1983) Methods in Enzymology, 101: 433; Hess (1987) Intern Rev. Cytol., 107: 367; Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Reporter, 6: 165 에 의해 개시된 대로 화분내로 직접 DNA를 전달시킴으로써 식물내로 도입될 수 있다. 폴리펩티드 암호 유전자의 발현은 Pena et al. (1987) Nature, 325:274에 개시된 대로 식물의 생식 기관내로 핵산 분절을 주입함으로써 얻어질 수 있다. 핵산 분절은 또한 Neuhaus et al. (1987) Theor. Apl. Genet., 75: 30; 및 Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54 (1986)에 의해 개시된 대로 미성숙 배의 세포내로 직접 주입되고 건조된 배의 재수화가 이루어질 수도 있다.

다르게는, 식물 색소체가 직접 형질전환될 수 있다. 엽록체의 적합한 형질전환은 고등식물에서 보고되었으며, 예를 들어 Svab et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 913-917; Staub et al. (1993) Embo J. 12: 601-606를 참고한다. 상기 방법은 선택성 마커를 함유한 핵산 분절의 입자 총 전달 및 상동성 재조합을 통한 상기 핵산의 색소체 게놈으로의 표적화를 이용한다. 그러한 방법에서는, 색소체 유전자 발현은 색소체 유전자 프로모터의 사용에 의해, 또는 T7 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 것과 같은 선택성 프로모터 서열로부터의 발현을 위해 위치된 침묵성 색소체-태생의 트랜스유전자의 트랜스 활성화에 의해 이루어질 수 있다. 침묵성 색소체 유전자는 핵 발현 구조체로부터 특이적 RNA 폴리머라제의 발현 및 상기 폴리머라제를 트랜싯 펩티드를 이용하여 색소체로 표적화시킴으로써 활성화된다. 조직-특이적 발현은 적합한 식물 조직 특이적 프로모터로부터 발현된, 핵-암호되고 색소체-지시된 특이적 RNA 폴리머라제의 이용에 의해 그러한 방법에서 얻어질 수 있다. 그러한 시스템은 McBride et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 7301-7305를 참고한다.

XI. 형질전환 파인애플 식물의 재생 및 미세증식

핵산 분절의 전달 후, 배발생 또는 기관형성 세포는 일반적으로 그 발현 생성물이 선별 제제의 작용을 방지할 수 있는 유전자(예, 선별 마커)를 수용하지 않은 파인애플 세포의 성장을 방지할 수 있는 선별 제제(예, 제초제 등)를 포함할 수 있는 배지로 전달된다. 선별 마커는 상기에서 더 개시된다. 배양 기간 후, 정상적으로 성장하는 배발생 또는 기관형성 캘러스 또는 조직은 그 성장이 느리거나 종결된 배발생 또는 기관형성 캘러스 또는 조직으로부터 분리된다.

단일 식물 원형질체 또는 다양한 외식편으로부터 식물의 재생은 공지되어 있다. 예를 들어, Weissbach et al. (Eds.), Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc. (1988)를 참고한다. 일부 구체예에서, 재생 및 성장 과정은 형질전환된 세포 및 슈트의 선별, 형질전환된 슈트의 뿌리내기 및 토양에서 묘목의 성장의 단계를 포함한다. 예시적으로, 아그로박테리움에 의해 도입된 유전자를 함유하는 식물을 잎 외식편으로부터 재생시키는 것은 Horsch et al. (1985) Science, 227: 1229-1231에 의해 개시된 대로 이루어질 수 있다. 이 과정에서, 형질전환체는 Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803에 의해 개시된 대 로, 선별 제제의 존재하에서, 그리고 형질전환될 식물 종에서 슈트의 재생을 유도하는 배지에서 성장된다. 이 과정은 일반적으로 2 내지 4주내에 슈트를 생산하며 이들 형질전환된 슈트는 이어서 선별 제제 및 박테리아 성장을 막는 항생제를 함유한 적절한 뿌리-유도 배지로 옮겨진다. 파인애플의 경우, 잎 기부는 기관형성 물질을 생산하기 위해 이용될 수 있으며 (Firoozabady and Moy (2003) "Regeneration of pineapple plants via somatic embryogenesis and organogenesis," In Vitro, in press), 그리고 이어서 이 물질은 아그로박테리움에 노출되어 아마도 선별시에, 형질전환 기관형성 물질을 생산할 수 있다. 이들 물질은 이어서 슈트와 완전한 식물을 생산하도록 유도된다. 일부 구체예에서, 배발생 캘러스의 형질전환은 형질전환된 식물 슈트를 형성하는데 바람직하다. 묘목을 형성하기 위해 선별 제제의 존재하에서 뿌리내린 형질전환된 슈트는 이어서 토양 또는 다른 배지로 이식되어 뿌리의 생산을 허용한다.

식물 재생, 미세증식, 및 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 다른 태양에 관련된 추가의 상세사항은 예를 들어 미국 특허 제5,952,543호 및 WO 01/33943호(상기 참고), 미국 특허 제5,591,616호, 6,037,522호, 유럽 특허 출원 제 604662호(A1) 및 672752호(A1), 및 WO 01/12828호에 제공된다. 또한, Kyte et al., Plants from Test Tubes: An Introduction to Micropropagation, Timber Press, Inc. (1996), Hudson et al., Hartmann and Kester's Plant Propagation: Principles and Practices 7th Ed., Pearson Education (2001), Bajaj (Ed.) High-Tech and Micropropagation I, Springer-Verlag New York, Inc. (1992), Jain, In Vitro Haploid Production in Higher Plants, Kluwer Academic Publishers (1996), 및 Debergh et al. (Eds.), Micropropagation: Technology an Application, Kluwer Academic Publishers (1991)를 참고한다.

선택적으로, 본 발명의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 공지의 많은 방법에 의해, 형질전환된 파인애플 세포 배양물 또는 형질전환된 파인애플 식물 조직(예, 과일 조직 등)로부터 회수되고 정제될 수 있다. 일부 경우에는, 상기 단백질은 기능성 생성물을 회수하기 위해서는 재접힘이 필요할 것이다. 상기한 참고문헌에 더하여, 예를 들어 Sandana,Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc. (1997); 및 Bollag et al., Protein Methods, 2nd Ed., Wiley-Liss, NY (1996); Walker, The Protein Protocols Handbook, Humana Press, NJ (1996); Harris and Angal, Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Springer Verlag (1993); 및 Janson et al., Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd Ed., Wiley-VCH (1998)에 개시된 것들을 비롯한 다양한 정제 방법이 공지되어 있다.

XII. 실시예

하기 실시예는 본 발명을 제한하기 위해서가 아니라 예시하기 위해서 제공된다.

배지는 문자와 숫자로 표시되며, 문자는 사용된 배지 성분을 나타내며, 이어지는 숫자는 특정 성분의 농도를 나타낸다. 예를 들어, B2N2는 6-벤질아미노 퓨린(BA 또는 B) 및 α-나프탈렌 아세트산(NAA 또는 N)을 함유하는 MS 배지이다. 성분 농도를 비롯한, 이들 실시예에서 언급된 배지 조성에 대한 구체적인 상세사항은 하기에 제공된다.

실시예 1: 오렌지(Tangerine)로부터의 피토엔 신타제 유전자(PSY)의 파인애플(형질전환 라인 16.5.9)내로의 도입

1. 감귤(Citrus)로부터 PSY 유전자의 분리

i. 프라이머 고안

PSY-Naval(기탁 번호 Gi 5959859)의 서열 정보에 기초하여 두 프라이머를 고안하였다:

전방 프라이머 PSY-F: 5' aaa ctg cag atg tct gtt aca ttg ctg tgg-3'

역방 프라이머 PSY-R: 5'-gat atc tta agc ctt act ggt ata tat tct tg-3'

ii. RNA 분리

트리졸 용액(Invitrogen, Inc., CA, USA)를 이용하여 오렌지 잎 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 추출은 제조자의 과정에 따라 실시하였다.

iii. 역전사 반응

20 ㎕의 반응 부피중의 1 ㎍의 전체 RNA와 1 ㎕의 10 μM PSY-R 프라이머로 역전사를 실시하였다.

iv. PSY 유전자를 분리하기 위한 PCR

하기 반응물에서 PSY-F와 PSY-R 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다:

PSY-F(10 μM) : 1 ㎕

PSY-R(10 μM) :1 ㎕

역 반응 :1 ㎕

DNTPs (10 mM):1 ㎕

1O× 완충액: 2.5 ㎕

Pfu DNA 폴리머라제 : 0.2 ㎕

25 ㎕가 되도록 하는 물

PCR 프로그램은 변성을 위해 2분동안 92℃, 및 이어서 92℃에서 30초, 55℃에서 20초 및 72℃에서 1.5분의 35 사이클이었다.

v. PCR 단편의 클로닝

PCR 반응 생성물 또는 단편을 0.8% 아가로즈 젤에서 전개시켰다. PCR 단편을 잘라내고 퀴아젠 젤 정제 키트(Qiagen, Inc., CA, USA)를 이용하여 정제하였다. 이어서 단편을 pGEM-Teasy 벡터(Promega Corp., WI, USA)내로 클로닝하였다. T7 및 M13-R 프라이머를 이용하여 서열결정하였다.

2. 슈트 배양물의 확립

코스타리카의 들에서 성장한 델몬트 골드 MD-2 파인애플의 부관으로부터 분리한 분열조직을 이용하여 슈트 배양물을 확립하였다. 요약하면, 부관의 잎을 손으 로 제거하여 버리고, 부관의 코어 또는 줄기(~ 3 × 5 cm)를 물에서 세척하고, 표면을 25분동안 교반하면서 33% 클로록스와 0.05% 트윈20으로 멸균하고 멸균수로 두번 세척하였다. 주요 잎을 하나씩 제거하여 측생 분열조직과 부관 끝부분 분열조직을 코어로부터 잘라내었으며 그동안 도구들은 자주 불꽃으로 살균하였다. 분열조직 돔, 2-3 작은 주요 잎, 및 줄기 코어 1 cm³를 비롯한 부관 끝부분 분열조직 외식편을 슈트 배양 배지 B2N2±CC상에 놓았다. 측생 분열조직을 또한 1 cm³의 줄기 코어를 따라 분리하여 동일한 배지에서 배양하였다. CC(카브(carb)와 세포탁심 각각 500 mg/L)를 이용하여 내인성 미생물 오염체를 죽였다. 배양물을 28℃에서 연속광하에서 항온처리하였다. 배양 개시 후 9일 째에, 조직을 B2N2＋N 상에서 2차배양하였다. 니스타틴(N, 40 mg/L)을 이용하여 내인성 효모 및 진균류 오염물을 죽였다. 20일 후, 부관 끝부분 잎은 길게 성장하였으며, 이들을 제거하여 부관 끝부분 분열조직의 성장을 촉진시키고 신선한 B2N2＋NA 배지로 옮겼다. 암피실린 B(A, 5 mg/L)을 이용하여 임의의 잔류 내인성 효모 및 진균류 오염물을 죽였다. 추가 2주 후, 싹이 형성되고(외식편 당 2-3개) 이어서 새로운 작은 슈트가 생성되어 슈트 덩어리를 형성하였다. 배양 개시로부터 4개월 후, 슈트 덩어리를 액체 B1.5N.5 배지로 옮기고 매달 2차배양하면서 유지하였다.

3. 아그로박테리움 과의 동시배양을 위한 외식편의 전처리

신속하게 성장하는 슈트를 외식편으로 이용하였다. 긴 잎(＞15 mm)의 끝을 잘라 더 작은 외식편을 얻었다. 슈트를 세로로 4-6 부분으로 자르고 8일동안 P10T1.1B6(6% 바나나 펄프를 함유)에서 전처리하였다(배양하였다). 잎 기부 및 코어 부분을 제조하고 동시배양을 위해 아그로박테리움과 혼합하였다.

4. 아그로박테리움 투메파시엔스 배양 및 제조

이중 벡터 시스템을 함유한 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101를 형질전환을 위해 이용하였다. 상기 벡터 시스템은 클로르설푸론 내성을 부여하기 위한 surB 유전자 및 피토엔 신타제 유전자를 발현하기 위한 psy 유전자를 포함하는 벡터 pDM을 포함하였다. 박테리아를 동결 글리세롤로부터 꺼내고, 배양하고, 10 mg/L 테트라사이클린을 함유한 1.5% 박토아가로 고형화된 L-브로쓰 배지에서 유지하였다. 동시배양 하루전, 루프를 이용하여 고체 배지로부터 박테리아를 긁어내어 액체 MinAsuc 배지에 현탁하고 28℃에서 쉐이커(120 rpm)에서 하루동안 배양하였다. 박테리아 농도를, 동시배양하기 전에 분광계(Beckman DU-50)을 이용하여 측정하였으며, 4 × 10⁸ 세포/mL로 나타났다.

5. 동시배양 배지에서의 동시배양

박테리아를 4:1의 부피비(식물 조직: 아그로박테리움 세포)로 170 잎 기부 및 코어 부분과 혼합하고, 조직을 건조시키고 혼합물을 동시배양 배지 P10T2.2As300의 상부상의 7.0 cm 멸균 피셔브랜드 G6 유리 필터 서클에 놓았다. 플레이트를 파라필름으로 둘러싼 뒤 24℃의 조절된 환경 항온기에서 3일동안 어둠속 에 두었다.

6. 회수, 선별, 및 식물 재생

동시배양 후, 조직을 저광 조건(16시간/일)하에서 7일의 회수 기간동안 회수 배지 P10T1.1Carb500으로 옮겼다(15-20 조각/플레이트). 이어서 외식편을 17일동안 선별 배지 P10T2.2Carb300CS5로 옮기고 이어서 박테리아 성장이 나타날 때 P10T2.2Carb500CS5로 옮겨 높은 빛 강도하에서(16시간/일) 항온처리하였다. 카르베니실린을 이용하여 잔여 아그로박테리움을 죽이고 클로르설푸론(CS)을 이용하여 형질전환된 세포를 선별하였다. 선별 배지에서, 대부분의 조직은 3-6주내에 갈색이 되었지만, 때때로 조직의 일부 부분들은 건강하게 남아서 성장하기 시작하여 녹색의 건강한 형태발생 조직을 생산하였다. 형태발생 조직은 30일이내에 B3N.2Carb100CS10 배지에서 형질전환 슈트를 생산하였다. 이들은 이어서 신장을 위하여 B1Carb100CS10으로 옮겨졌다. 슈트의 일부를 용화시키고, 이어서 14일동안 B1A1%Carb100CS10으로 옮겨 신장된 정상 슈트를 생산하였다.

7. 형질전환의 확인

다양한 수단에 의해 슈트가 형질전환된 것을 확인하였다: 1. CS 내성 슈트 또는 슈트 초생은 치사 수준의 CS에서 건강하게 녹색으로 남아 있었으며, 2. CS 내성 슈트 또는 슈트 초생을 GUS 분석을 위하여 샘플채취하였다(2-5 mg/내성 조각). 형질전환된 조직은 청색으로 염색되었으며 비형질전환 조직은 청색으로 염색되지 않았다. 조직은 또한 예를 들어, PCR과 서던 블롯팅 분석을 이용하여 형질전환에 대해 분자적으로 시험할 수 있다.

8. 미세증식 및 형질전환 식물의 생산

개별 또는 작은 슈트 덩어리를 증식 및 성장을 위하여 GA-7 큐브내의 15 ml 액체 배지 B1Carb100CS20으로 옮겼다(2-3 덩어리/큐브). 선택적으로, 30일 후, 슈트 덩어리는 수 개월동안 B1.5N.5CS20(역선별 제제를 함유안함)에서 미세증식시키고 유지할 수 있다. 개별 슈트(4-6 cm 길이)를 분리하고 액체 뿌리내리기 배지 N.5IBA.5CS10 또는 N.5IBA.5CS20(역선별 제제를 함유안함)에서 2-4주동안 배양하여 완전한 식물을 생산하였다. 이어서 식물을 토양에 옮겨심고, 점차 찬기운에 쐬어 강하게 하여, 온실 조건으로 옮겼다.

실시예 2: 오렌지로부터의 피토엔 신타제 유전자(PSY)의 파인애플(13.18.2)로의 도입

1. 감귤로부터 PSY 유전자의 분리

실시예 1과 동일함.

2. 공급원 조직의 제조

i. 슈트 배양물의 확립

실시예 1과 동일함.

ii. 아그로박테리움 과 동시배양을 위한 외식편의 전처리

4개월동안 상기한 대로 배양한 신속하게 성장하는 슈트를 외식편으로 이용하였다. 긴 잎의 끝(＞15 mm)을 잘라 더 작은 외식편을 얻었다. 슈트를 세로로 3-8 부분으로 자르고 10일 동안 P2T10A 배지상에서 전처리하였다(배양하였다). 잎 기부와 코어 부분을 제조하고, 다른 전처리 배지로 옮기기 전에 62일동안 동일한 배지 에서 다시 전처리하였다. 슈트 초생을 함유한 형태발생 조직을 가진 부분을 24일동안 T1.1I.1 배지상에 2차배양하였다. 기관형성 조직을 이어서 22일동안 B3N.2 배지에서 2차배양하고, 이어서 3-5 mm 부분으로 자르고 7일동안 B2N2 배지에 놓고, 이어서 동시배양을 위하여 아그로박테리움과 혼합하였다.

3. 아그로박테리움 투메파시엔스 배양 및 제조

전술한 이중 벡터를 함유한 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101을 형질전환을 위하여 이용하였다. 전술한 대로, 벡터 pDM은 surB 유전자를 함유하며, 이 유전자는 클로르설푸론 내성을 부여하며, psy 유전자는 피토엔 신타제 유전자를 발현한다. 박테리아를 동결된 글리세롤에서 꺼내어, 배양하고 10 mg/L 테트라사이클린을 함유한 1.5% 박토아가로 고형화된 L-브로쓰에서 유지하였다. 동시배양 하루 전에, 박테리아를 루프를 이용하여 고체 배지로부터 긁어내고, 액체 MinAsuc 배지에 현탁시키고 28℃에서 쉐이커(120 rpm)에서 하루동안 배양하였다. 박테리아 농도를, 동시배양하기 전에 분광계(Beckman DU-50)을 이용하여 측정하였으며, 1.7 × 10⁹ 세포/mL로 나타났다.

4. 동시배양 배지에서의 동시배양

박테리아를 4:1의 부피비(식물 조직: 아그로박테리움 세포)로 혼합하고, 조직을 건조시키고 혼합물을 동시배양 배지 B3N.2AS300의 상부상의 7.0 cm 멸균 피셔브랜드 G6 유리 필터 서클에 놓았다. 플레이트를 파라필름으로 둘러싼 뒤 24℃의 조절된 환경 항온기에서 3일동안 어둠속에 두었다.

5. 회수, 선별, 및 식물 재생

동시배양 후, 조직을 저광 조건(16시간/일)하에서 7일의 회수 기간동안 회수 배지 B3N.2Carb500 및 B3N.2CEF400으로 옮겼다(20-25 조각/플레이트). 이어서 외식편을 25일동안 고강도 빛하에서(16시간/일) 선별 배지 B2N2CEF400CS5로 옮기고 이어서 매달 2차배양하면서 B3N.2CEF400CS5로 옮겼다. 세포탁심을 이용하여 잔여 아그로박테리움을 죽이고 클로르설푸론(CS)을 이용하여 형질전환된 세포를 선별하였다. 선별 배지에서, 대부분의 조직은 4-6주내에 갈색이 되었지만, 조직의 두 부분들은 건강하게 남아서 성장하기 시작하여 녹색의 건강한 형태발생 조직을 생산하였다. 식물을 실시예 1에 개시된 대로 재생시켰다.

6. 형질전환의 확인

실시예 1과 동일함.

7. 미세증식 및 형질전환 식물의 생산

실시예 1과 동일함.

배지 조성

최소 Asuc = MinAsuc

바람직함 범위

포타슘 포스페이트 이염기성 10.5 g/L 5-20 g/L

포타슘 포스페이트 일염기성 4.5g/1 2-8 g/L

암모늄 설페이트 1.0 g/1 0.5-3 g/L

소듐 시트레이트 디하이드레이트 0.5 g/L 0-2 g/L

마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 247 mg/L 0-1000 g/1

글루코스 2.0 g/L 1-30 g/L

MinAsuc

글루코스 대신 수크로스를 가진 MinA.

L-브로쓰:

트립톤	10 g/L
효모 추출물	5 g/L
NaCl	5 g/L
글루코스	1 g/L
pH	7.0-7.2
박토아가	15 g/L

조직 배양 배지를 위해서, pH는 약 5-7.5, 바람직하게는 약 5.6 범위여야 한다. 상기 배지는, 필터-멸균된 후 오토클레이브후에 첨가되는 특정 성분을 제외하고는 오토클레이브에 의해 멸균된다.

MS

MS 염 1×

B5 비타민 1×

수크로스 30 g/L

MES 600 mg/L

Gel-rite^® 2.5 g/L

pH 5.7

B1.5N.5

MS 배지 ＋

BA 1.5 mg/L

NAA 0.5 mg/L

B2N2

MS 배지 ＋

BA 2 mg/L

NAA 2 mg/L

B2N2 ＋ CC

MS 배지 ＋

BA 2 mg/L

NAA 2 mg/L

카르베니실린 500 mg/L

세포탁심 500 mg/L

B2N2CEF400CS5

MS 배지 ＋

BA 2 mg/L

NAA 2 mg/L

세포탁심 400 mg/L

클로르설푸론 5 ㎍/L

B2N2 ＋ N

B2N2 ＋

니스타틴 40 mg/L

B2N2 ＋ NA

B2N2 배지 ＋

니스타틴 40 mg/L

암포테리신 B 5 mg/L

B3N.2

MS＋

BA 3mg/L

NAA 0.2mg/L

B3N.2AS300

B3N.2 ＋

아세토시링온 300 μM

B3N.2CARB500

B3N.2 ＋

카르베니실린 500 mg/L

B3N.2CEF400

B3N.2 ＋

세포탁심 400 mg/L

B3N.2CEF400CS5

B3N.2Cef400 ＋

클로르설푸론 5 ㎍/L

P2T10A

Gel-rite 대신 한천을 갖는 MS ＋

피클로람 2 mg/L

티디아주론 10 mg/L

P10T1.1B6

MS＋

피클로람 10 mg/L

티디아주론 1.1 mg/L

바나나 펄프 6 %

P10T1.1CARB500

MS ＋

피클로람 10 mg/L

티디아주론 1.1 mg/L

카르베니실린 500 mg/L

P10T2.2

MS ＋

피클로람 10 mg/L

티디아주론 2.2 mg/L

P1OT2.2A

gel-rite 대신 한천을 갖는 P10T2.2

P10T2.2AS300

MS ＋

피클로람 10mg/L

티디아주론 2.2mg/L

아세토시링온 300 μM

P10T2.2CARB300CS5

MS ＋

피클로람 10mg/L

티디아주론 2.2 mg/L

카르베니실린 300 mg/L

클로르설푸론 5 ㎍/L

P10T2.2CARB500CS5

MS ＋

피클로람 10 mg/L

티디아주론 2.2 mg/L

카르베니실린 500 mg/L

클로르설푸론 5 ㎍/L

P10B.5

MS ＋

피클로람 10 mg/L

BA 0.5mg/L

N.5I.5 액체

Gel-rite없는 MS ＋

NAA 0.5mg/L

IBA 0.5mg/L

T1.1I.1

MS ＋

티디아주론 1.1mg/L

IBA 0.1mg/L

전술한 발명이 명확성과 이해를 위하여 다소 상세히 개시되었지만, 형태 및 상세 사항에 있어서 다양한 변화가 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다. 예를 들어, 상기한 모든 기술 및 장치는 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 본 출원에서 인용된 모든 문헌, 특허, 특허 출원, 또는 다른 문서는 각각의 개별 문헌, 특허, 특허 출원, 또는 다른 문서가 개별적으로 참고로 통합되는 것으로 나타내진 것과 동일한 정도로 그 전체가 참고로 통합된다.

Claims (97)

1. 파인애플 세포내로 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 도입하는 것을 포함하는, 하나 이상의 파인애플 세포내에서 카로테노이드의 축적을 조절하는 방법으로서,

   상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 상기 파인애플 세포내에서 카로테노이드의 축적을 조절하며, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제, 피토엔 신타제, 피토엔 탈포화제 (desaturase), ζ-카로틴 탈포화제, 리코펜 β-사이클라제, 리코펜 ε-사이클라제, β-카로틴 하이드록실라제, 및 ε-하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 핵산에 대해 센스 또는 안티센스 방향으로 하나 이상의 핵산 분절을 포함하며, 이 핵산 분절은 상기 파인애플 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 파인애플 세포는 배발생 세포, 배발생 캘러스 세포, 기관형성 세포, 또는 기관형성 캘러스 세포인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 피토엔, 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌, δ-카로틴, γ-카로틴, α-카로틴, β-카로틴, 아포카로테날, 리코펜, 칸타잔틴, 제아탄틴, 및 루테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 카로테노이드의 축적을 조절하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분절은 선택성 마커에 연결되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분절은 구성적 프로모터 (constitutive promoter), 조직-특이성 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 파인애플 세포는 하나 이상의 분열조직 세포(meristemic cell)를 배양하여 생성되는 기관형성 세포인 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 분열조직 세포는 비정단(non-apical) 분열조직 세포 인 것인 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 배양은 상기 분열조직 세포를 배양하여 하나 이상의 유아(shoot)를 생성하고, 상기 유아로부터 하나 이상의 외식편(explant)을 배양하여 상기 기관형성 세포를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
9. 하나 이상의 파인애플 식물 내로 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 도입하는 것을 포함하는, 파인애플 열매 색(coloration)을 변화시키는 방법으로서,

   상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 상기 파인애플 열매에서 하나 이상의 착색된 카로테노이드의 축적을 조절하여 상기 파인애플 열매의 색을 변화시키고, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제, 피토엔 신타제, 피토엔 탈포화제, ζ-카로틴 탈포화제, 리코펜 β-사이클라제, 리코펜 ε-사이클라제, β-카로틴 하이드록실라제, 및 ε-하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 핵산에 대해 센스 또는 안티센스 방향으로 하나 이상의 핵산 분절을 포함하며, 핵산 분절은 상기 파인애플 식물의 게놈 내로 안정하게 통합되는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 착색된 카로테노이드는 피토엔, 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌, δ-카로틴, γ-카로틴, α-카로틴, β-카로틴, 아포카로테날, 리코펜, 칸타잔틴, 제아탄틴, 및 루테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 상기 파인애플 식물이 재생되는 하나 이상의 파인애플 세포내로 도입되는 것인 방법.
12. 하나 이상의 도입된 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 포함하는 파인애플 세포로서,

    카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 상기 파인애플 세포에서 카로테노이드의 축적을 조절하고, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제, 피토엔 신타제, 피토엔 탈포화제, ζ-카로틴 탈포화제, 리코펜 β-사이클라제, 리코펜 ε-사이클라제, β-카로틴 하이드록실라제, 및 ε-하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 핵산에 대해 센스 또는 안티센스 방향으로 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 것인 파인애플 세포.
13. 제12항에 있어서, 상기 파인애플 세포는 배발생 세포, 배발생 캘러스 세포, 기관형성 세포, 또는 기관형성 캘러스 세포인 것인 파인애플 세포.
14. 제12항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 피토엔, 피토플루엔, ζ-카로틴, 뉴로스포렌, δ-카로틴, γ-카로틴, α-카로틴, β-카로틴, 아포카로테날, 리코펜, 칸타잔틴, 제아탄틴, 및 루테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 카로테노이드의 축적을 조절하는 것인 파인애플 세포.
15. 제12항의 상기 파인애플 세포로부터 생성되는 것인 파인애플 식물.
16. 제1항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하기에서 선택되는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 것인 방법:

    (a) 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 적어도 일부에 상응하는 센스 핵산 분절; 및

    (b) 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 적어도 일부에 상응하는 안티센스 핵산 분절.
17. 제1항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하며, 이는 상기 파인애플 세포에 발현되는 경우, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 표적 내인성 mRNA의 파괴를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 생성하는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 파인애플 세포는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 하나 이상의 제2 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 더 포함하는 것이며, 이는 상기 파인애플 세포에 발현되는 경우, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 표적 내인성 mRNA의 파괴를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 생성하는 것인 방법.
19. 제9항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하기에서 선택되는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 것인 방법:

    (a) 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 적어도 일부에 상응하는 센스 핵산 분절; 및

    (b) 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 적어도 일부에 상응하는 안티센스 핵산 분절.
20. 제9항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하며, 이는 상기 파인애플 세포에 발현되는 경우, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 표적 내인성 mRNA의 파괴를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 생성하는 것인 방법.
21. 제9항에 있어서, 상기 파인애플 식물은 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 하나 이상의 제2 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 더 포함하며, 이는 상기 파인애플 식물에 발현되는 경우, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 표적 내인성 mRNA의 파괴를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 생성하는 것인 방법.
22. 제12항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하기에서 선택되는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 것인 파인애플 세포:

    (a) 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 적어도 일부에 상응하는 센스 핵산 분절; 및

    (b) 하나 이상의 내인성 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 유전자의 적어도 일부에 상응하는 안티센스 핵산 분절.
23. 제12항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하며, 이는 파인애플 세포에 발현되는 경우, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 표적 내인성 mRNA의 파괴를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 생성하는 것인 파인애플 세포.
24. 제12항에 있어서, 상기 파인애플 세포는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 하나 이상의 제2 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자를 더 포함하며, 이는 상기 파인애플 식물에 발현되는 경우, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드를 암호화하는 표적 내인성 mRNA의 파괴를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 생성하는 것인 파인애플 세포.
25. 제1항에 있어서, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 리코펜의 축적을 조절하며, 상기 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 내인성 리코펜 β-사이클라제 또는 내인성 리코펜 ε-사이클라제 발현을 억제하는 RNA를 포함하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 카로테노이드 생합성 폴리펩티드 발현 조절자는 리코펜 β-사이클라제 또는 리코펜 ε-사이클라제의 코딩 영역에 상응하는 센스 핵산 분절인 것인 방법.
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