PT1589807E

PT1589807E - Plantas transgénicas de ananás com níveis modificados de carotenóides e métodos da sua produção

Info

Publication number: PT1589807E
Application number: PT03790354T
Authority: PT
Inventors: Thomas R Young; Ebrahim Firoozabady
Original assignee: Del Monte Fresh Produce Company
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2012-02-02
Also published as: WO2004052085A1; IL168840A; EP1571899A4; WO2004053082A3; IL168921A; AU2003293407A1; AU2003302775B2; EP1571899A2; US8049067B2; JP2006508681A; EP1589807B1; KR101209345B1; AU2003302775A1; AU2003293407B2; DK1589807T3; ES2376868T3; KR20050084157A; EP1589807A1; ATE531805T1; WO2004053082A2

Description

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DESCRIÇÃO "Plantas transgénicas de ananás com níveis modificados de carotenóides e métodos da sua produção"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Muitos frutos e vegetais contêm uma diversidade de fitoquimicos que contribuem para uma boa saúde. Estudos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais sugerem que vários carotenóides reduzem o surgimento de doenças crónicas, incluindo doença cardíaca coronária (Barton-Duell (1995) Endocrinologistr 5: 347-356), certos cancros (Giovannucci (1999) J. Natl. Câncer Inst., 91: 317-331), e degeneração macular relacionada com a idade (Seddon et al. (1994) J. Am. J. Med. Assoe., 272: 1413-1420). Assim, a modulação da biossíntese de carotenóides em plantas através de manipulação genética deve afectar a qualidade nutricional da colheita.

As plantas de ananás (Ananas comosus da família Bromeliaceae) são plantas monocotiledóneas tropicais que têm folhas recurvadas rígidas de margens espinhosas e caules curtos com cabeças densas oblongas de pequenas flores abortivas. O fruto de muitas variedades de plantas de ananás é utilizado para consumo humano. Algumas destas variedades incluem Smooth Cayenne, Red Spanish, Perolera, Pernambuco e Primavera. A planta é auto-incompatível, com longos períodos entre sucessivas gerações de frutos. Em consequência, o melhoramento convencional para melhorar a qualidade da fruta e outras características agronómicas tem sido difícil. A partir da discussão anterior, é aparente que são desejáveis plantas transgénicas de ananás com níveis de carotenóides modificados. Em particular, plantas de ananás possuindo elevados níveis de carotenóides em tecidos de frutos aumentariam a qualidade nutricional desta importante cultura. Mais, plantas de ananás geneticamente transformadas possuindo uma coloração alterada são desejáveis, inter alia, para diferenciação do produto. Estas e uma variedade de outras características do presente invento tornar-se-ão evidentes após uma revisão completa da seguinte divulgação. 2

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SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a carotenogénese em plantas de ananás. Mais especificamente, este invento proporciona métodos de transformação genética de células ou plantas de ananás com reguladores da expressão que modulam a biossintese de carotenóides nessas células ou plantas; em particular, o invento proporciona métodos de controlo da acumulação de carotenóides em células de ananás além de métodos de alteração da coloração da planta de ananás, especialmente coloração do tecido dos frutos tal como definido nas reivindicações. Além disso, a invenção proporciona células de ananás que incluem reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides introduzidos que controlam a acumulação de carotenóides nessas células, e também plantas de ananás que são regeneradas a partir dessas células de ananás tal como definido nas reivindicações.

Num aspecto, o invento refere-se a métodos de controlo da acumulação de carotenóides em pelo menos uma célula de ananás (p.ex., uma célula embriogénica, uma célula organogénica, uma célula de calo embriogénico, uma célula de calo organogénico, ou semelhante) tal como definido nas reivindicações. Os métodos incluem a introdução de pelo menos um regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides na célula de ananás. 0 regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides controla a acumulação de carotenóides na célula de ananás através do aumento ou da diminuição da acumulação de carotenóides na célula de ananás relativamente a uma acumulação de carotenóides numa célula de ananás sem o regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides. Em certas concretizações, a célula de ananás é uma célula organogénica produzida através da cultura de pelo menos uma célula meristemática (p.ex., uma célula meristemática não apical, etc.). Nalgumas destas concretizações, a cultura compreende a cultura de células meristemáticas para produzir pelo menos um rebento, e cultura de pelo menos um explante do rebento para produzir a célula organogénica.

Os métodos de controlo da acumulação de carotenóides em pelo menos uma célula de ananás incluem ainda opcionalmente a 3

ΕΡ 1 589 807/PT regeneração de pelo menos uma planta de ananás a partir da célula de ananás (p.ex., uma célula embriogénica, uma célula organogénica, etc.). Em certas concretizações, por exemplo, a célula de ananás inclui uma população de células de ananás e os métodos incluem ainda: (i) selecção de um ou mais membros da população de células de ananás que incluem o regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides; (ii) regeneração de uma ou mais plantas de ananás a partir dos membros; e, (iii) pesquisa das plantas de ananás quanto a uma acumulação de carotenóides que esteja alterada relativamente a uma acumulação de carotenóides numa planta de ananás sem o regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides. Nalgumas concretizações, a acumulação de carotenóides alterada é substancialmente específica de tecidos de frutos das plantas de ananás. Os métodos incluem ainda também opcionalmente micropropagação de plantas de ananás.

Noutro aspecto, o presente invento refere-se a métodos de alteração da coloração de plantas de ananás tal como definido nas reivindicações. Os métodos incluem a introdução de pelo menos um regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides em pelo menos uma planta de ananás na qual o regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides controla a acumulação de pelo menos um carotenóide colorido (licopeno) na planta de ananás para alterar a coloração da planta de ananás. Isto é, o regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides aumenta a acumulação do carotenóide colorido licopeno na planta de ananás relativamente à acumulação do carotenóide colorido numa planta de ananás sem o regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides. Tipicamente, os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides são introduzidos em pelo menos uma célula de ananás a partir da qual a planta de ananás é regenerada. Nalgumas concretizações, a coloração alterada é substancialmente específica de tecidos de frutos da planta de ananás. Opcionalmente, estes métodos incluem ainda micropropagação da planta de ananás.

Ainda noutro aspecto, o presente invento proporciona uma célula de ananás (p.ex., uma célula embriogénica, uma célula 4

ΕΡ 1 589 807/PT organogénica, uma célula de calo embriogénico, uma célula de calo organogénico, ou semelhante) que inclui pelo menos um regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides introduzido tal como definido nas reivindicações. 0 regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides aumenta ou diminui a acumulação de carotenóides na célula de ananás relativamente a uma acumulação de carotenóides numa célula de ananás sem o regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides. 0 invento proporciona ainda uma planta de ananás que é regenerada a partir da célula de ananás tal como definido nas reivindicações.

Os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides do invento são moléculas orgânicas (p.ex., ADN, ARN, etc.).

Os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides incluem diferentes concretizações que efectuam acumulação de carotenóides nas células e plantas transgénicas de ananás do presente invento de vários modos. Em particular, os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides incluem pelo menos um segmento de ácido nucleico com sentido ou anti-sentido que corresponde a pelo menos uma porção de pelo menos um gene de um polipéptido biossintético de carotenóides endógeno. Os segmentos de ácido nucleico com sentido e anti-sentido podem ser utilizados, por exemplo, para suprimir a expressão de uma enzima biossintética de carotenóides seleccionada a partir da via de biossintese de carotenóides para efectuar a acumulação de carotenóides que sejam substratos da enzima suprimida.

Os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides são introduzidos em células ou plantas de ananás utilizando essencialmente qualquer técnica de distribuição. Nalgumas concretizações, por exemplo, os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides incluem pelo menos um segmento de ácido nucleico que é introduzido em células ou tecidos de ananás utilizando distribuição mediada por Agrobacteríum. Noutras concretizações, os reguladores da expressão de polipéptidos 5

ΕΡ 1 589 807/PT biossintéticos de carotenóides incluem pelo menos um segmento ácido nucleico que é introduzido em células ou plantas de ananás utilizando pelo menos uma técnica de distribuição de ácidos nucleicos seleccionada a partir de, p.ex., distribuição mediada por pólen, transferência directa de ácidos nucleicos para pelo menos um protoplasto da célula de ananás, bombardeamento de microprojécteis, microinjecção, macroinjecção de inflorescência, impregnação mediada por filamentos, perfuração laser, ultra-sons, etc. Em certas concretizações, os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides são injectados em plantas de ananás.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1A-C mostram esquematicamente aspectos de uma via biossintética de carotenóides.

DISCUSSÃO DETALHADA DO INVENTO

I. DEFINIÇÕES

Antes de descrever o presente invento em detalhe, deve entender-se que este invento não está limitado a concretizações particulares. Deve entender-se também que a terminologia aqui utilizada é apenas para fins de descrição de concretizações particulares, não se pretende que seja limitante. As unidades, os prefixos e os símbolos são indicados nas formas sugeridas pelo Sistema Internacional de Unidades (SI), a menos que especificado em contrário. Os intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem o intervalo. Tal como se utilizam neste fascículo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem também referentes plurais a menos que o contexto dite claramente em contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui também duas ou mais células (p.ex., na forma de um tecido, etc.), e semelhantes. Mais, a menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o que é vulgarmente entendido por um vulgar perito na técnica a que o invento de refere. Os termos abaixo definidos, e as 6

ΕΡ 1 589 807/PT variantes gramaticais destes, são mais inteiramente definidos através de referência ao fascículo na sua totalidade. 0 termo "ácido nucleico" engloba qualquer cordão físico de unidades monoméricas que possam corresponder a um cordão de nucleótidos, incluindo um polímero de nucleótidos (p.ex., um polímero de ADN ou ARN típico), PNA, oligonucleótidos modificados (p.ex., oligonucleótidos compreendendo nucleótidos que não são típicos do ARN ou ADN biológico em solução, tal como oligonucleótidos 2'-O-metilados), e/ou semelhantes. Um ácido nucleico pode ser, p.ex., de cadeia simples ou de cadeia dupla. A menos que indicado em contrário, uma determinada sequência de ácido nucleico deste invento engloba sequências complementares, além da sequência explicitamente indicada. 0 termo ácido nucleico é utilizado alternadamente com, p.ex., oligonucleótido, polinucleótido, gene, ADNc, ARNi, e ARNm codificados por um gene.

Uma "sequência de ácido nucleico" refere-se à ordem e identidade dos nucleótidos num segmento de ácido nucleico.

Um "polinucleótido" é um polímero de nucleótidos (A, C, T, U, G, etc. ou análogos de nucleótidos de ocorrência natural ou artificiais) ou um cordão de caracteres representando um polímero de nucleótidos, dependendo do contexto. O ácido nucleico dado ou o ácido nucleico complementar pode ser determinado a partir de qualquer sequência polinucleotídica especificada.

Dois ácidos nucleicos "correspondem" quando têm a mesma sequência ou quando um ácido nucleico é complementar ao outro ou quando um ácido nucleico é uma subsequência do outro ou quando uma sequência é derivada, através de manipulação natural ou artificial da outra. O termo "gene" é amplamente utilizado para referir qualquer segmento de um ácido nucleico associado a uma função biológica. Assim, os genes incluem sequências de codificação e, opcionalmente, as sequências reguladoras necessárias para a sua expressão. Os genes incluem opcionalmente também segmentos de ADN ou ARN não expressos que, por exemplo, formam locais de reconhecimento para outras proteínas. Os 7

ΕΡ 1 589 807/PT genes podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo clonagem a partir de uma fonte de interesse ou síntese a partir de informação de uma sequência conhecida ou prevista, e podem incluir sequências desenhadas para ter os parâmetros desejados. 0 termo "segmento de ácido nucleico" refere-se a um polinucleótido ou análogo passível de transcrição deste, de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento, habitualmente pelo menos 100 nucleótidos de comprimento, geralmente pelo menos 200 nucleótidos de comprimento, tipicamente pelo menos 300 nucleótidos de comprimento, mais tipicamente pelo menos 400 nucleótidos de comprimento, e mais tipicamente pelo menos 500 nucleótidos de comprimento. Para ilustrar, um segmento de ácido nucleico pode incluir um gene inteiro (p.ex., um gene que codifica um polipéptido biossintético de carotenóides, tal como fitoeno-sintetase ou semelhante), ou uma subsequência de um tal gene. 0 termo "ADN-T" refere-se a um segmento de ácido nucleico que pode ser mobilizado e transferido de uma Agrobacterium para uma célula vegetal para deste modo introduzir o segmento de ácido nucleico na célula vegetal. 0 termo "ligado" refere-se geralmente a segmentos de ácido nucleico que são contíguos uns aos outros e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de aminoácidos, contíguas e no mesmo enquadramento de leitura. 0 termo "ligado" engloba também ácidos nucleicos que co-segregam uns com os outros. Mais, o termo "operativamente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor e um segmento de ácido nucleico que codifica um polipéptido estão operativamente ligados quando a sequência do promotor inicia e medeia a transcrição do segmento de ácido nucleico. 0 termo "regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides" refere-se a uma molécula orgânica ou inorgânica que afecta directamente ou indirectamente a biossíntese de carotenóides em células nas quais é introduzido. Por exemplo, um regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides pode ser um 8

ΕΡ 1 589 807/PT segmento de ácido nucleico que codifica um polipéptido biossintético de carotenóides que aumenta a acumulação de carotenóides em células nas quais é introduzido e expresso. 0 termo "expressão" refere-se à transcrição e acumulação de ARN com sentido (ARNm) ou anti-sentido derivado dos segmentos de ácido nucleico do invento. A expressão pode referir-se também à tradução de ARNm num polipéptido, p.ex., um polipéptido biossintético de carotenóides. Nalgumas concretizações do invento, por exemplo, os polipéptidos biossintéticos de carotenóides são expressos em órgãos de armazenamento das plantas pré-seleccionados, tais como raízes, sementes, frutos, etc., conduzindo a maior acumulação de um ou mais carotenóides (p.ex., carotenóides produzidos naturalmente) nesse órgão de armazenamento da planta. Portanto, o termo "expressão específica do fruto" refere-se à expressão de, p.ex., polipéptidos biossintéticos de carotenóides introduzidos que estão substancialmente limitados a tecidos dos frutos das plantas de ananás do invento, p.ex., de modo a efectuar uma acumulação alterada de carotenóides que é "substancialmente específica de tecidos dos frutos" das plantas de ananás transformadas. 0 termo "promotor" refere-se a um local de reconhecimento numa sequência de ADN ou grupo de sequências de ADN que proporcione um elemento de controlo da expressão para um gene e ao qual a ARN-polimerase se liga especificamente e inicia a síntese de ARN (transcrição) desse gene. O termo "promotor constitutivo" refere-se a um promotor não regulado que permite a transcrição contínua de um gene associado. 0 termo "promotor indutível" refere-se a um promotor regulado que permite a transcrição de um gene associado na presença de outra substância ou indutor, tal como uma molécula extracelular (p.ex., um substrato de uma enzima que é codificado pelo gene). 0 termo "marcador seleccionável" inclui a referência a um gene cuja expressão permite identificar células que compreendem o gene marcador, tal como um segmento de ácido nucleico (p.ex., um ADN-T) que inclui o gene marcador para além de um polipéptido codificado. Para ilustrar, um produto génico de um marcador seleccionável pode conferir resistência 9

ΕΡ 1 589 807/PT a herbicidas em células transformadas de tal modo que, após exposição de uma população de células a uma quantidade eficaz do herbicida, apenas as células que foram transformadas permanecem viáveis. 0 termo "segmento de ácido nucleico com sentido" refere-se geralmente a um segmento de ácido nucleico de codificação. Em contraste, o termo "segmento de ácido nucleico anti-sentido" refere-se tipicamente a um complemento de um segmento de ácido nucleico com sentido. O termo "factor de transcrição" refere-se a qualquer factor que controle o processo de transcrição (i.e., a produção de uma cópia de ARN de um segmento de ADN) . Habitualmente é uma enzima ou outra proteína, uma coenzima, uma vitamina, ou outra molécula orgânica. 0 termo "estimulador" refere-se a uma sequência de ADN que influencia positivamente a expressão de um gene, mesmo se o estimulador estiver posicionado a alguma distância desse gene.

Dois ácidos nucleicos são "recombinados" quando sequências de cada um dos dois ácidos nucleicos são combinadas num ácido nucleico descendente.

Um segmento de ácido nucleico "integra-se estavelmente" no genoma de uma planta ou célula de ananás quando é introduzido não transientemente nesse genoma. Por exemplo, um segmento de ácido nucleico heterólogo que está permanentemente incorporado num cromossoma de ananás está estavelmente integrado no genoma da célula ou planta de ananás correspondente. O termo "transformação" refere-se à transferência ou introdução de um segmento de ácido nucleico numa planta ou célula vegetal, quer a introdução resulte em hereditariedade geneticamente estável do segmento de ácido nucleico ou apenas numa presença transiente do segmento de ácido nucleico no genoma da planta ou célula vegetal. As células ou plantas de ananás que incluem os segmentos transformados de ácido 10

ΕΡ 1 589 807/PT nucleico são referidas como células ou plantas de ananás "transgénicas", "recombinantes" ou "transformadas".

Uma sequência polinucleotidica, tal como um segmento de ácido nucleico, é "heteróloga" a um organismo, ou uma segunda sequência polinucleotidica, se for originária de outra espécie, ou, se sendo da mesma espécie, for modificada em relação à sua forma original ou nativa. Por exemplo, um promotor operativamente ligado a uma sequência de codificação heteróloga refere-se a uma sequência de codificação de uma espécie diferente da qual é derivado o promotor, ou, se for da mesma espécie, a uma sequência de codificação que é diferente de variantes alélicas de ocorrência natural.

Os ácidos nucleicos são "homólogos" quando são derivados, naturalmente ou artificialmente, de uma sequência ancestral comum. A homologia é frequentemente inferida a partir da semelhança de sequência entre dois ou mais ácidos nucleicos. Isto ocorre naturalmente uma vez que duas ou mais sequências descendentes se desviam de uma sequência ancestral comum ao longo do tempo em resultado de mutação e selecção natural. Sequências artificialmente homólogas podem ser geradas de vários modos. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico pode ser sintetizada de novo para produzir um ácido nucleico que difira em sequência de uma sequência de ácido nucleico parental seleccionada. Pode também ser criada homologia artificial através de recombinação artificial de uma sequência de ácido nucleico com outra, tal como ocorre, p.ex., durante clonagem ou mutagénese química, para produzir um ácido nucleico descendente homólogo. Pode também ser criada homologia artificial utilizando a redundância do código genético para ajustar sinteticamente algumas ou todas as sequências de codificação entre ácidos nucleicos de outro modo diferentes de modo a aumentar a frequência e o comprimento de trechos de ácidos nucleicos altamente semelhantes ao mesmo tempo que se minimizam as alterações resultantes nas sequências de aminoácidos dos produtos génicos codificados. De preferência, tal homologia artificial dirige-se ao aumento da frequência de trechos idênticos de sequência de pelo menos três pares de bases de comprimento. De maior preferência, dirige-se ao aumento da frequência de trechos idênticos de sequência de pelo menos quatro pares de 11

ΕΡ 1 589 807/PT bases de comprimento. Geralmente assume-se que dois ácidos nucleicos têm ancestralidade comum quando demonstram semelhança de sequência. No entanto, o nível exacto de semelhança de sequência necessário para estabelecer homologia varia na técnica. Em geral, para os fins desta divulgação, duas sequências de ácido nucleico são consideradas homólogas quando partilham uma identidade de sequência suficiente para permitir que ocorra recombinação directa entra as duas sequências, isto é, em qualquer parte ao longo das duas sequências. O termo "de codificação" refere-se a uma sequência polinucleotídica codificando um ou mais aminoácidos. 0 termo não requer um codão de início ou terminação. Uma sequência de aminoácidos pode ser codificada em qualquer enquadramento de leitura proporcionado por uma sequência polinucleotídica. 0 termo "vector" refere-se a um elemento extra-cromossómico que é capaz de se replicar numa célula e/ou ao qual podem estar operativamente ligados outros segmentos de ácido nucleico de modo a levar à replicação desses segmentos. Tais elementos podem ser sequências de replicação autónoma, sequências que se integrem no genoma, sequências fágicas ou nucleotídicas, ADN linear ou circular, de cadeia simples ou dupla ou ARN, derivado de qualquer fonte, em que várias sequências nucleotídicas foram unidas ou recombinadas numa construção que é capaz de introduzir numa célula segmentos de ácido nucleico (p.ex., que incluem um ou mais promotores e um ou mais genes que codificam enzimas biossintéticas de carotenóides) juntamente com sequências não traduzidas a 3' apropriadas. Um plasmídeo é um vector exemplar. Os vectores ou sistemas vector (p.ex., sistemas vector binários, sistemas vector ternários, ou semelhantes) podem incluir elementos para além de, p.ex., um gene que codifica uma enzima biossintética de carotenóides, tais como os que facilitam a transformação de uma célula ou planta de ananás, os que permitem uma maior expressão dos genes incluídos (p.ex., promotores) em células de ananás transformadas, os que facilitam a selecção de células de ananás transformadas (p.ex., marcadores seleccionáveis, genes repórter, etc.), ou semelhantes. 0 termo "vector de expressão" refere-se a um elemento extra-cromossómico que é capaz de regular a 12

ΕΡ 1 589 807/PT expressão de um gene (p.ex., um gene codificando um polipéptido biossintético de carotenóides) quando operativamente ligado ao gene dentro do vector. 0 termo "polipéptido" refere-se a um polímero compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácidos (p.ex., um péptido ou uma proteína). 0 polímero pode compreender adicionalmente elementos não aminoácidos tais como marcadores, extintores, grupos de bloqueio, ou semelhantes e pode compreender opcionalmente modificações tais como glicosilação ou semelhantes. Os resíduos de aminoácidos do polipéptido podem ser naturais ou não naturais e podem ser não substituídos, não modificados, substituídos ou modificados. 0 termo "polipéptido biossintético de carotenóides" refere-se a um biocatalisador ou uma enzima que catalisa pelo menos um passo na via biossintética de carotenóides. Polipéptidos biossintéticos de carotenóides incluem, p.ex., pirofosfato de geranilgeranilo-sintetases, difosfato de isopentenilo-isomerases, fitoeno-sintetases, fitoeno-dessaturases, ζ-caroteno-dessaturases, licopeno-p-ciclases, licopeno-s-ciclases, β-caroteno-hidroxilases, ε-hidroxilases, e semelhantes.

Uma "sequência polipeptídica" refere-se à ordem e identidade dos aminoácidos num polipéptido. O termo "polipéptido biossintético de carotenóides artificialmente evoluído" refere-se a um catalisador proteico ou enzima (p.ex., uma fitoeno-sintetase ou semelhante) criado utilizando uma ou mais técnicas geradoras de diversidade. Por exemplo, polipéptidos biossintéticos de carotenóides artificialmente evoluídos empregues na prática do presente invento são opcionalmente produzidos através de recombinação (p.ex., através de recombinação recursiva ou semelhante) de dois ou mais ácidos nucleicos codificando um ou mais polipéptidos biossintéticos de carotenóides parentais, ou através de mutação de um ou mais ácidos nucleicos que codificam polipéptidos biossintéticos de carotenóides (p.ex., utilizando mutagénese dirigida ao local, mutagénese de cassete, mutagénese aleatória, mutagénese recursiva de 13

ΕΡ 1 589 807/PT conjunto, ou semelhante). Um ácido nucleico codificando um polipéptido biossintético de carotenóides parental inclui um polinucleótido ou gene que, através dos mecanismos de transcrição e tradução, produz uma sequência de aminoácidos correspondendo a um polipéptido biossintético de carotenóides parental, p.ex., uma fitoeno-sintetase não artificialmente evoluída ou de ocorrência natural. O termo "polipéptido biossintético de carotenóides artificialmente evoluído" engloba também enzimas quiméricas que incluem sequências de componentes identificáveis (p.ex., domínios funcionais, etc.) derivados de dois ou mais progenitores. Os polipéptidos biossintéticos de carotenóides artificialmente evoluídos empregues na prática do presente invento são tipicamente evoluídos, p.ex., para produzir produtos com maior eficiência que os polipéptidos biossintéticos de carotenóides de ocorrência natural. O termo "endógeno" refere-se a uma substância que é produzida ou sintetizada de forma nativa dentro de um organismo ou sistema. Numa planta ou célula de ananás, por exemplo, um gene de um polipéptido biossintético de carotenóides endógeno é produzido de forma nativa (p.ex., expresso) dentro da planta ou célula.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou que têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou de nucleótidos que são os mesmos quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando um algoritmo de comparação de sequências ou através de inspecção visual.

Uma região de "elevada semelhança de sequência" refere-se a uma região que é 90% ou mais idêntica a uma segunda região seleccionada quando alinhadas para correspondência máxima (p.ex., manualmente ou, p.ex., utilizando o programa BLAST comum regulado para parâmetros por defeito). Uma região de "baixa semelhança de sequência" é 30% ou menos idêntica, de preferência, 40% ou menos idêntica a uma segunda região seleccionada, quando alinhadas para correspondência máxima 14

ΕΡ 1 589 807/PT (p.ex., manualmente ou utilizando BLAST regulado com parâmetros por defeito). A frase "substancialmente idêntica", no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 60%, de preferência 80%, de maior preferência 90-95% de identidade de nucleótidos ou de resíduos de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando, p.ex., um algoritmo de comparação de sequências ou através de inspecção visual. De preferência, existe identidade substancial ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, de maior preferência ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e ainda de preferência as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos. Nalgumas concretizações, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento das regiões de codificação.

Uma "subsequência" ou "fragmento" é qualquer porção de uma sequência inteira de ácidos nucleicos ou aminoácidos. O termo "genoma" refere-se aos ácidos nucleicos cromossómicos de um organismo. Tal como aqui se utiliza, o genoma inclui também o genoma de plastos (p.ex., genoma de cloroplastos, etc.). O termo "Agrobacterium" refere-se a espécies, subespécies ou estirpes da bactéria Agrobacterium que são capazes de mobilizar e selectivamente transferir ADN-T para uma célula vegetal, tal como uma célula de ananás. Por exemplo, a Agrobacterium é opcionalmente Agrobacterium rhizogenes, mas mais tipicamente é Agrobacterium tumefaciens. O termo "célula embriogénica" refere-se a uma célula de um tecido embriogénico ou calo embriogénico. O termo "calo embriogénico" refere-se a tecido ou células que são indiferenciados e sem estrutura significativa mas com o potencial para formar um tecido mais diferenciado 15

ΕΡ 1 589 807/PT (p.ex., tecido embriogénico) que pode produzir embriões e germinar em plantas. 0 termo "tecido embriogénico" refere-se a tecido possuindo estruturas organizadas que incluem embriões somáticos imaturos. Os embriões somáticos imaturos podem ser maturados através da sua cultura num meio de maturação. Os embriões somáticos maduros podem ser desenvolvidos em plantas após transferência para um meio de germinação. Um embrião somático maduro é uma estrutura derivada por fim de células somáticas que se assemelha a um embrião zigótico morfologicamente e em termos de desenvolvimento, e que é capaz de germinar numa plântula com ambos os polos de raiz e caule, quando transferida para um meio de crescimento adequado. Uma "célula somática" é uma célula de um organismo multicelular diferente dos gâmetas. 0 termo "células organogénica" refere-se a uma célula de tecido organogénico. 0 termo "calo organogénico" refere-se a tecido possuindo uma massa irregular de células relativamente indiferenciadas, que podem surgir a partir de, p.ex., uma única célula organogénica em cultura de tecidos. 0 termo "tecido organogénico" refere-se a tecido que é capaz de ser induzido a sofrer organogénese, isto é, a formar um órgão vegetal tal como o caule que pode então ser induzido a desenvolver raizes para produzir uma planta completa. 0 termo "meristema" refere-se a um tecido formador da planta que compreende células capazes de se dividir e dar origem a células semelhantes ou a células que se diferenciam para produzir tecidos e órgãos. O termo "célula meristemática" refere-se a uma célula de um meristema da planta. 0 termo "célula meristemática não apical" refere-se a uma célula meristemática que não é do meristema apical, mas pode ser de meristemas laterais ou axilares e de células que 16

ΕΡ 1 589 807/PT após cultura de um explante de um meristema não apical se tornaram meristemáticas. O termo "planta de ananás" refere-se a uma planta da família Bromeliaceae, p.ex., Ananas comosus. O termo "célula de ananás" refere-se a uma célula de uma planta de ananás. O termo "regeneração" de uma planta de ananás refere-se à formação de uma planta de ananás que inclui um rebento com raiz. O termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para alcançar um resultado desejado tal como a produção de um calo ou tecido que é embriogénico ou organogénico. O termo "carotenóides" refere-se à classe de carotenos de hidratos de carbono e aos seus derivados oxigenados (i.e., xantofilas). O termo "via biossintética de carotenóides" ou "carotenogénese" refere-se à combinação de actividades catalíticas, tipicamente mediada por enzimas, que resulta na produção de um ou mais carotenóides. O termo "selecção" refere-se a um processo no qual uma ou mais plantas ou células são identificadas como possuindo uma ou mais propriedades de interesse, p.ex., um marcador seleccionável, níveis de carotenóides aumentados ou diminuídos, alteração da coloração, etc. Por exemplo, um processo de selecção pode incluir a colocação de organismos sob condições em que o crescimento destes com um determinado genótipo será favorecido. Para melhor ilustrar, pode-se pesquisar uma população para determinar uma ou mais propriedades de um ou mais membros da população. Se um ou mais membros da população é/são identificados como possuindo uma propriedade de interesse, estes são seleccionados. A selecção pode incluir o isolamento de um membro de uma população, mas isto não é necessário. Adicionalmente, a selecção e pesquisa podem ser, e frequentemente são, simultâneas. 17

ΕΡ 1 589 807/PT Ο termo "pesquisa" refere-se a um processo para separação de uma população em diferentes grupos. Os processos de pesquisa incluem tipicamente a determinação de uma ou mais propriedades de uma ou mais plantas ou células. Por exemplo, processos de pesquisa típicos incluem aqueles nos quais uma ou mais propriedades de um ou mais membros de uma ou mais populações é/são determinadas.

Uma "população" refere-se a uma colecção de pelo menos duas células ou plantas diferentes.

II. VISÃO GERAL O presente invento refere-se geralmente a métodos para transformar geneticamente células e plantas de ananás. Os ananases transgénicos do invento têm, inter alia, melhores qualidades nutricionais relativamente a variedades pré-existentes. Mais especificamente, o invento proporciona células e plantas de ananás geneticamente transformadas obtidas através da introdução selectiva de reguladores exógenos da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides nessas células ou plantas. Os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides controlam a acumulação de carotenóides em células de ananás e, nalgumas concretizações, também a coloração dessas células. Além da modificação dos níveis de carotenóides, outras características de interesse para os consumidores, tais como características de doçura, acidez, textura, e amadurecimento da fruta podem também ser modificadas de acordo com os métodos aqui descritos. Outras características agronómicas tais como melhor resistência a doenças bacterianas, melhor resistência a doenças virais, e/ou melhor resistência a insectos e nemátodes podem também ser modificadas nas células e plantas do invento.

Nalgumas concretizações, os métodos do invento incluem a utilização de material de explante de ananás adequado, que é geneticamente transformado através do contacto do material de explante com células de Agrobacterium. As células de Agrobacterium medeiam a transferência de segmentos de ácido nucleico que, p.ex., codificam polipéptidos biossintéticos de carotenóides, para células de ananás. Outras técnicas para 18

ΕΡ 1 589 807/PT distribuição de reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides para células ou plantas são também opcionalmente utilizadas. A presente divulgação proporciona ainda meios de cultura adequados para os passos de indução da formação de células embriogénicas ou organogénicas para co-cultura com células de Agrobacterium. Em certas concretizações, por exemplo, as células embriogénicas transformadas são seleccionadas e são formados embriões a partir destas. Os embriões podem germinar para formar rebentos e enraizados para produzir plantas completas. Várias abordagens organogénicas à transformação e regeneração de plantas de ananás são também opcionalmente utilizadas. Por exemplo, o invento refere-se a métodos de produção de células de ananás transformadas que incluem cultura de células de ananás meristemáticas (p.ex., células meristemáticas não apicais, etc.) para produzir células organogénicas de ananás. Estes métodos incluem também a introdução de reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides nas células organogénicas de ananás para produzir células organogénicas de ananás transformadas. Para ilustrar melhor, o invento refere-se também a métodos de produção de células de ananás transformadas que incluem a cultura de células de ananás meristemáticas para produzir rebentos. Estes métodos incluem também a cultura de explantes a partir dos rebentos para produzir células organogénicas de ananás. Estes explantes podem compreender células meristemáticas de ananás não apicais. Adicionalmente, estes métodos incluem também a introdução de reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides nas células organogénicas de ananás para produzir células organogénicas de ananás transformadas. Estes métodos organogénicos incluem tipicamente ainda a regeneração de plantas de ananás a partir de células organogénicas de ananás transformadas. Todos estes e outros aspectos do presente invento são descritos abaixo.

III. CAROTENÓIDES A coloração de, e/ou acumulação de carotenóides, em células de ananás é controlada através do controlo da expressão dos carotenóides nessas células. Os carotenóides 19

ΕΡ 1 589 807/PT são uma classe de hidratos de carbono (carotenos) e seus derivados oxigenados (xantofilas). Cada um destes terpenóides de 40 carbonos (C40) inclui oito unidades de isopreno (C5) unidas nas quais a disposição das unidades isoprenóides está invertida no centro da molécula para que os grupos metilo centrais estejam num relação 1,β-posicional e os restantes grupos metilo não terminais estejam numa relação 1,5-posicional. Os carotenóides, tais como α-caroteno, β-caroteno, apocarotenal (β-apo-S'-carotenal), licopeno (ψ, ψ— caroteno), e cantaxantina (4,4'-diceto-p-caroteno) são amplamente utilizados como agentes corantes de alimentos, e muitos carotenóides exibem actividade pró-vitamina A. Nomes triviais e abreviaturas serão utilizados ao longo desta divulgação, sendo tipicamente dados os nomes sistemáticos recomendados pela IUPAC dentro de parênteses após a primeira menção de um nome trivial.

Os carotenóides nas plantas são isoprenóides formados através de uma via independente de mevalonato, que é responsável pela síntese de difosfato de isopentenilo em plastos (Fraser et al. (2002) "Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional Phytoene synthase in a fruit-specific manner", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99: 1092-1097). 0 difosfato de geranilgeranilo, derivado da via ubíqua de isoprenóides, é o precursor de carotenóides para além dos tocoferóis e filoquinona. Em particular, o difosfato de geranilgeranilo pode ser produzido em várias reacções que envolvem difosfato de isopentenilo e, opcionalmente, difosfato de dimetilalilo, difosfato de geranilo, ou difosfato de farnesilo. As Figuras 1A-C ilustram esquematicamente aspectos da biossíntese dos carotenóides. Tal como mostrado, a dimerização do precursor de 20 átomos de carbono, difosfato de geranilgeranilo (I) em fitoeno (7,8,11,12,7',8',11',12'-octa-hidro-ψ,ψ-caroteno) (II) é o primeiro passo envolvido na biossíntese de carotenóides, catalisado pela enzima fitoeno-sintetase (A). O fitoeno (II) é por si só incolor, mas é um precursor de carotenóides coloridos. As duas enzimas seguintes (fitoeno-dessaturase (B) e ζ-caroteno-dessaturase (C)) dessaturam o fitoeno (II) através do intermediário fitoflueno (7,7',8,8',11,12-hexa-hidro-ψ,ψ-caroteno) (III), e ζ-caroteno (7,8,7',8'-tetra-hidro-ζ,ζ-caroteno) (IV) através do intermediário 20

ΕΡ 1 589 807/PT neurosporeno (7,8-di-hidro-ζ,ζ-caroteno) (V), respectivamente. O produto da ζ-caroteno-dessaturase (C) é licopeno (ψ,ψ-caroteno) (VI), que pode a partir daí sofrer ciclização em β-caroteno (β,β-caroteno) (IX) ou α-caroteno (XII). O licopeno confere a cor vermelha característica de vários frutos, tais como os tomates maduros. Tal como mostrado na Figura 1B, a ciclização do licopeno (VII) para produzir β-caroteno (IX) ocorre através do intermediário γ-caroteno (VIII) numa reacção catalisada pela licopeno^-ciclase (D). O beta-caroteno é frequentemente utilizado como corante de produtos, tais como margarina e manteiga, como precursor para a produção de vitamina A, e foi recentemente implicado como tendo efeitos preventivos contra certos tipos de cancro. A hidroxilação do β-caroteno catalisada pela β-caroteno-hidroxilase (E) produz zeatantina ( β,β-θ3Γθίθηο-3,3'-diol) (X). A zeaxantina é um pigmento amarelo que é frequentemente utilizado com corante na indústria aviária. A Figura 1C ilustra esquematicamente a ciclização do licopeno (VII) para produzir α-caroteno (XII) através do intermediário δ-caroteno (ε,ψ-caroteno) (XI), que é catalisada pela licopeno-ε-ciclase (F) e licopeno^-ciclase (D). A hidroxilação do a-caroteno (XII) para produzir luteína (3,3'-di-hidroxi-a-caroteno) (XIII) é catalisada pela β-caroteno-hidroxilase (E) e ε-hidroxilase (G) . Diferentes ciclases podem também ser incorporadas na via biossintética, conduzindo a diferentes padrões de ciclização e mais derivações da estrutura dos carotenóides podem ser alcançadas através de outras enzimas modificadoras a jusante.

Em geral, a via para a biossintese dos carotenóides tem sido estudada numa variedade de organismos e a via biossintética tem sido elucidada em organismos desde as bactérias até plantas superiores. Em folhas, por exemplo, os carotenóides estão habitualmente presentes nos grana dos cloroplastos onde proporcionam uma função fotoprotectora. O beta-caroteno e a luteína são os carotenóides predominantes, com violaxantina e neoxantina presentes em quantidades menores. Os carotenóides acumulam-se em cromoplastos em desenvolvimento de pétalas de flores, habitualmente com o desaparecimento das clorofilas. Tal como nas pétalas das 21

ΕΡ 1 589 807/PT flores, os carotenóides surgem nos cromoplastos dos frutos à medida que se desenvolvem a partir dos cloroplastos. Os carotenóides estão também localizados em cromoplastos em raízes de cenoura e tubérculos de batata. O beta-caroteno é o principal pigmento presente tanto nas cenouras como nas batatas-doces comerciais, estando habitualmente presentes apenas pequenas quantidades de xantofilas. Ver, p.ex., Britton, "Biosynthesis of carotenoids", págs. 133-182, em T. W. Goodwin (Ed.), Plant Pigments, Academic Press, Inc. (1988).

Os investigadores mostraram também que a sobre-expressão ou inibição da expressão do gene da fitoeno-sintetase (Psyl) de plantas em plantas transgénicas pode alterar os níveis de carotenóides nos frutos. Ver, p.ex., Bird et al. (1991) Biotechnology 9: 635-639; Bramley et al. (1992) Plant J. 2: 343-349; e Fray et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 589-602. Genes da biossíntese de carotenóides foram também clonados a partir de uma variedade de organismos incluindo Erwinia uredovora (Misawa et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6704-6712; Erwinia herbicola (Pedido WO 91/13078, Armstrong et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei., USA 87: 9975-9979); R. capsulatus (Armstrong et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 254-268, Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421); e Thermus thermophilus (Hoshino et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59: 3150-3153).

Os carotenóides e a carotenogénese são ainda descritos, p.ex., em Britton et al. (Eds.) "Carotenoids: Spectroscopy", Vol. 1, Springer-Verlag (1995), Britton et al. (Eds.) "Carotenoids: Synthesis", Birkhãuser Verlag (1996), Britton et al. (Eds.) "Carotenoids", Vol. la: "Isolation and Analysis", Springer-Verlag (1995), Pfander et al. (Eds.) "Key to Carotenoids", 2nd ed., Springer-Verlag (1987), Passwater et al. (Eds.) "Beta-Carotene and Other Carotenoids: The Antioxidant Family That Protects against Câncer and Heart Disease and Strengthens the Immune System", Keats Publishing, Inc. (1999), Bauerfeind (Ed.) "Carotenoids as Colorants and Vitamin a Precursors: Technological and Nutritional Applications", Academic Press, Inc. (1981), Abelson et al. (Eds.) "Carotenoids: Chemistry, Separation, Quantitation, and Antioxidation", Vol. 213, Academic Press, Inc. (1992), and 22

ΕΡ 1 589 807/PT 22 ΕΡ 1 589 807/PT Abelson et al. (Eds.) Biossynthesis", Vol. Detalhes adicionais proporcionados, p.ex., immune response", J. 'Carotenoids: Metabolism, Genetics, and 214, Academic Press, Inc. (1993). em relação aos carotenóides são em Bendich (1989) "Carotenoids and the Nutr., 119: 112-115, Britton (1995) "Structure and properties of carotenoids in relation to function", FASEB J. , 9: 1551-1558, Di Mascio et al. (1989) "Licopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxigen quencher", Arch. Biochem. Biophys., 274: 532-538, Di

Mascio et al. (1991) "Antioxidant defense Systems: the role of carotenoids, tocopherols, and thiols", Am. J. Clin. Nutr., 53: 194S-200S, Mangels et al. (1993) "Carotenoids content of fruits and vegetables: an evaluation of analytic data", J. Am. Diet. Assoe., 93: 284-296, Nishino (1998) "Câncer prevention by carotenoids", Mutat. Res., 402: 159-163, Ong et al. (1992) "Natural sources of carotenoids from plants and oils", Meth. Enzymol., 213: 142-167, Pfander (1992) "Carotenoids: an overview", Meth. Enzymol., 213: 3-13, and

Snodderly (1995) "Evidence for protection against age-related macular degeneration by carotenoids and antioxidant vitamins", Am. J. Clin. Nutr., 62 (supl): 1448S-1461S.

IV. SEQUÊNCIAS ALVO CODIFICANDO POLIPÉPTIDOS BIOSSINTÉTICOS DE CAROTENÓIDES

Os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides incluem uma variedade de moléculas inorgânicas ou orgânicas. Os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides podem ser segmentos de ácido nucleico que codificam polipéptidos biossintéticos de carotenóides. Essencialmente, qualquer um desses segmentos de ácido nucleico é opcionalmente utilizado para transformar as células ou plantas de ananás de acordo com os métodos aqui descritos. Concordantemente, não foi tentado identificar todos os ácidos nucleicos conhecidos que podem ser utilizados. Os segmentos de ácido nucleico relacionados com carotenogénese que são opcionalmente introduzidos nas células ou plantas de ananás codificam tipicamente, p.ex., difosfato de isopentenilo-isomerases, pirofosfato de geranilgeranilo-sintetases, fitoeno-sintetases, fitoeno-dessaturases, ζ-caroteno-dessaturases, licopeno-β-ciclases, licopeno-s-ciclases, β- 23

ΕΡ 1 589 807/PT caroteno-hidroxilases, ε-hidroxilases, ou semelhantes. A informação de referência relativa a genes exemplares da biossintese de carotenóides e sequências relacionadas que são opcionalmente utilizados na realização dos métodos aqui descritos é proporcionada abaixo.

Um organismo capaz da síntese de carotenóides e uma fonte de genes para tal esforço biossintético é Erwinia herbicola. Erwinia herbicola é um membro de um género de bactérias Gram-negativas da família Enterobacteriaceae que são anaeróbios facultativos. O género Erwinia é vulgarmente dividido em três grupos. Dos três, o grupo herbicola inclui espécies (p.ex., Erwinia herbicola) que formam tipicamente pigmentos amarelos que se verificou serem carotenóides. Estas bactérias existem como saprófitas à superfície das plantas e como organismos secundários em lesões causadas por muitos patogénios de plantas. Podem também ser verificados no solo, na água e como patogénios oportunistas em animais, incluindo humanos. 0 pedido Internacional Publicado No. WO 91/13078 (publicado a 5 de Setembro de 1991) descreve a utilização de genes de Erwinia herbicola para a preparação de várias moléculas de carotenóides em vários organismos mono e multicelulares. Mais particularmente, o Pedido Internacional Publicado No. WO 91/13078 descreve a produção aumentada de fitoeno em plantas superiores utilizando um vector que inclui o promotor constitutivo CaMV 35S do vírus do mosaico da couve-flor e transferência de ADN mediada por Agrobacterium tumef adens. A transferência do gene codificando a fitoeno-sintetase ligado no seu terminal N ao péptido de trânsito (sinal) da ribulose-bisfosfato-carboxilase-oxigenase (RUBISCO ou RBCS) de tabaco foi também relatada como um método de transporte da enzima para cloroplastos de plantas onde os carotenóides são geralmente sintetizados. O Pedido Internacional Publicado No. WO 91/13078 descreve ainda a utilização de Agrobacterium tumefaciens para transferência de um gene que inclui o péptido de trânsito de cima e o gene para a licopeno-ciclase, que converte licopeno em β-caroteno em plantas para obter nvveis aumentados de β-caroteno nos cloroplastos. Adicionalmente, o Pedido de Patente Europeia No. 0393690 AI (publicado a 24 de Outubro de 1990) relata a 24

ΕΡ 1 589 807/PT utilização de ADN a partir de outra espécie de Erwinia, Erwínia uredovora 20D3 (ATCC 19321), para a preparação de moléculas de carotenóides. Para melhor ilustrar, o presente invento utiliza também opcionalmente ADN de Erwinia herbicola EHO-10 (ATCC 39368 e também referida como Escherichia vulneris), que codifica a enzima fitoeno-sintetase para a acumulação de moléculas de carotenóides em órgãos de armazenamento de plantas superiores, tais como tecidos de frutos de plantas de ananás.

Informação adicional relativa a sequências relacionadas com carotenóides que são opcionalmente utilizadas nos métodos aqui descritos é proporcionada como se segue:

Difosfato de Isopentenilo-Isomerases

Sequências codificando difosfato de isopentenilo-isomerases que são opcionalmente utilizadas para transformar células ou plantas de ananás foram isoladas a partir de, p.ex., R. Capsulatus (Hahn et al. (1996) J. Bacteriol. 178: 619-624 e as referências ai citadas), Nos. de Entrada U48963 e X82627, Clarkia xantiana No. de Entrada U48962, Arabidopsis thaliana No. de Entrada U48961, Schizosaccharmoyces pombe No. de Entrada U21154, Homo sapiens No. de Entrada X17025, e Kluyveromyces lactis No. de Entrada X14230.

Pirofosfato de Geranilgeranilo-Sintetases

Sequências codificando pirofosfato de geranilgeranilo-sintetases que são opcionalmente utilizadas nas transformações aqui descritas incluem as de, p.ex., E. Uredovora, Misawa et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6704-6712 e Pedido WO 91/13078; e de fontes vegetais, incluindo tremoço branco (Aitken et al. (1995) Plant Phys. 108: 837-838), pimento (Badillo et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27: 425-428) e Arabidopsis (Scolnik e Bartely (1994) Plant Physiol 104: 1469-1470; Zhu et al. (1997) Plant cell Physiol. 38: 357- 361) . 25

ΕΡ 1 589 807/PT

Fitoeno-Sintetases

Sequências codificando fitoeno-sintetases que são opcionalmente aqui utilizadas incluem aquelas correspondendo a, p.ex., número de Entrada AF220218 correspondendo a ARNm da fitoeno-sintetase de Citrus unshiu (Kim et ai. "Isolation of a cDNA codinq phytoene synthase from Citrus", não publicado), número de Entrada AB037975 correspondendo a ARNm de Citrus unshiu para a fitoeno-sintetase (Ikoma et ai. (2001) "Expression of a phytoene synthase gene and characteristic accumulation of carotenoids during citrus fruit development", Physiol. Plantarum. 111: 232-238), número de Entrada AF152892 correspondendo a ARNm da fitoeno-sintetase de Citrus x paradisi (Costa et ai. "Developmental expression of carotenoids genes in Citrus", não publicado), número de Entrada X68017 correspondendo ao ARNm de psyl de C. annuum para a fitoeno-sintetase (Romer et ai. (1993) "Expression of the genes coding the early carotenoids biosynthetic enzymes in Capsicum annuum", Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (3): 1414-1421), número de Entrada L23424 correspondendo ao ARNm da fitoeno-sintetase (PSY2) de Lycopersicon esculentum (Bartley et al. (1993) "cDNA cloning, expression during development, and genome mapping of PSY2, a second tomato gene coding phytoene synthase", J. Biol. Chem. 268 (34): 25718-25721), número de Entrada Z37543 correspondendo ao ARNm de PSY1 de C. melo para a f itoeno-sintetase (Karvouni et al. (1995) "Isolation and characterization of a melon cDNA clone coding phytoene synthase", Plant Mol. Biol. 27(6) : 1153-1162), e número de Entrada M84744 correspondendo ao ARNm da fitoeno-sintetase de tomate (Bartley et al. (1992) "A tomato gene expressed during fruit ripening encodes an enzyme of the carotenoids biossynthesis pathway", J. Biol. Chem. 267(8): 5036-5039). m

Outras fontes ilustrativas de sequências de fitoeno-sintetases incluem, p.ex., E. Uredovora, Rhodohacter capsulatuSf e outras plantas (Misawa et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6704-6712, Entrada No. D90087, Pedido WO 91/13078, Armstrong et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 254-268, Armstrong "Genetic Analysis and regulation of carotenoids biossynthesis", em Blankenship et al. (Eds.), "Anoxigenic photosynthetic bactéria; advances 26

ΕΡ 1 589 807/PT photosynthesis", Kluwer Academic Publishers, Armstrong et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 9975-9979, Armstrong et al. (1993) Methods Enzymol. 214: 297-311, Bartley et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 27518-27521, Bartley et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 5036-5039, Bramley et al. (1992) Plant J. 2: 291-343, Ray et al. (1992) Plant Mol. Biol. 19: 401-404, Ray et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 10587, Romer et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421, Karvouni et al. (1995) Plant Molecular Biology 27: 1153-1162, Entradas Nos. U32636, Z37543, L37405, X95596, D58420, U32636, Z37543, X78814, X82458, S71770, L27652, L23424, X68017, L25812, M87280, M38424, X69172, X63873, X60441, e Armstrong (1994) J. Bacteriol. 176: 4795-4802 e as referências ai citadas).

Fitoeno-Dessaturases

Sequências codificando fitoeno-dessaturases exemplares que são opcionalmente utilizadas para transformar células ou plantas de ananás de acordo com os métodos do invento incluem aquelas correspondendo a, p.ex., número de Entrada X68058 correspondendo ao ARNm de pdsl de C. annuum para a fitoeno-dessaturase (Hugueney et al. (1992) "Characterization and molecular cloning of a flavoprotein catalyzing the synthesis of fitofluene and zeta-carotene in Capsicum chromoplasts", Eur. J. Biochem. 209(1): 399-407), número de Entrada X59948 correspondendo ao ARNm de L. esculentum para a fitoeno-dessaturase (Pecker et al. (1992) "A single polypeptide catalyzing the conversion of phytoene to zeta-carotene is transcriptionally regulated during tomato fruit ripening", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89(11): 4962-4966), número de Entrada L39266 correspondendo ao ARNm da fitoeno-dessaturase de Zea mays (Hable et al. (1995) "Maize phytoene desaturase maps near the viviparous 5 locus", Plant Physiol. 108(3): 1329-1330), número de Entrada M88683 correspondendo ao ARNm da fitoeno-dessaturase de Lycopersicon esculentum (Giuliano et al. (1993) "Regulation of carotenoids biossynthesis during tomato development", Plant Cell 5(4): 379-387), e número de Entrada M64704 correspondendo ao ARNm da fitoeno-dessaturase de Soja (Bartley et al. (1991) "Molecular cloning and expression in photosynthetic bactéria of a soybean cDNA coding for phytoene desaturase, an enzyme of the carotenoids 27

ΕΡ 1 589 807/PT biossynthesis pathway", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88(15): 6532-6536).

Outras fontes ilustrativas de sequências de fitoeno-dessaturases incluem, p.ex., as de fontes bacterianas incluindo E. uredovora, Misawa et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 6704-6712, e Pedido WO 91/13078(Nos. de Entrada L37405, X95596, D58420, X82458, S71770, e M87280)/ e de fontes vegetais, incluindo milho (Li et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 269-279), tomate (Aracri et al. (1994) Plant Physiol. 106: 789), e Capisum annuum (pimentos) (Hugueney et al. (1992) J. Biochem. 209: 399-407), Nos. de Entrada U37285, X59948, X78271, e X68058). ζ-Caroteno-Dessaturases

Sequências codificando zeta-caroteno-dessaturases que são opcionalmente aqui utilizadas incluem aquelas correspondendo a, p.ex., número de Entrada AJ319762 correspondendo ao ARNm de Citrus sinensis para a zeta-caroteno-dessaturase (gene zds) (Marcos et al. "Characterization of Pinalate, a novel Citrus sinensis variety with a fruit-specific alteration that results in yellow pigmentation and decreased ABA content", não publicado), número de Entrada AB072343 correspondendo ao ARNm de Cit-ZCD de Citrus unshiu para a zeta-caroteno-dessaturase (Kasai et al. "Citrus unshiu zeta-carotene desaturase", não publicado), número de Entrada AF195507 correspondendo ao ARNm da zeta-caroteno-dessaturase de Lycopersicon esculentum (Bartley et al. (1999) "Zeta-carotene desaturase (Accession

No. AF195507) from tomato", Plant Physiol. 121(4): 1383),

número de Entrada X89897 correspondendo ao ARNm de C. annuum para a zeta-caroteno/neurosporeno-desidrogenase (Breitenbach et al. (1999) "Catalytic properties of an expressed and purified higher plant type zeta-carotene desaturase from Capsicum annuum", Eur. J. Biochem. 265(1): 376-383), e número de Entrada AF047490 correspondendo ao ARNm do precursor da zeta-caroteno-dessaturase de Zea mays (Luo et al. (1999) "A

Maize cDNA Coding Zeta Caroteno Desaturase (Accession No. AF047490)", Plant Physiol. 120(4): 1206). 28

ΕΡ 1 589 807/PT

Licopeno-β-Ciclases

Sequências codificando licopeno^-ciclases exemplares que são opcionalmente utilizadas para transformar células ou plantas de ananás de acordo com os métodos do invento incluem aquelas correspondendo a, p.ex., número de Entrada AY094582 correspondendo ao gene da licopeno-beta-ciclase de Citrus sinensís (Xu et al. "Molecular cloning of lycopene beta-cyclase gene from Red flesh navel orange by using Tail-PCR", não publicado), número de Entrada AF240787 correspondendo ao gene da licopeno-beta-ciclase de Citrus sinensís (Xu et al. "Molecular cloning of licopeno beta-ciclase gene from orange (Citrus sinensís)", não publicado), número de Entrada AF254793 correspondendo ao ARNm da licopeno-beta-ciclase especifica de cromoplastos de Lycopersicon esculentum (Ronen et al. (2000) "An alternative pathway to beta-carotene formation in plant chromoplasts discovered by map-based cloning of beta and old-gold color mutations in tomato", Proc. Natl. Acad. Scí. USA 97(20): 11102-11107), número de Entrada X86452 correspondendo ao ARNm de L. esculentum para a licopeno-beta-ciclase (Cunningham et al. (1996) "Functional analysis of the beta and epsilon lycopene cyclase enzymes of Arabidopsis reveals a mechanism for control of cyclic carotenoids formation", Plant Cell 8(9): 1613-1626).

Licopeno-ε-ciclases

Sequências codificando licopeno-ε-ciclases que são opcionalmente aqui utilizadas incluem aquelas correspondendo a, p.ex., número de Entrada AF486650 correspondendo ao ARNm da licopeno-épsilon-ciclase de Citrus x paradisi (Costa et al. (2002) submissão directa a Horticultural Sciences, University of Florida, Gainesville, FL, USA), número de Entrada AF463497 correspondendo ao ARNm da licopeno-épsilon-ciclase (lec) de Spinacia oleracea (DeSouza et al. "Production of Lutein in Microorganisms", não publicado), número de Entrada AF321538 correspondendo ao ARNm da licopeno-épsilon-ciclase de Lactuca sativa (Cunningham et al. (2001) "One ring or two? Determination of ring number in carotenoids by lycopene varepsilon-cyclases", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98(5): 2905-2910), e número de Entrada Y14387 correspondendo ao ARNm de Lycopersicon esculentum para 29

ΕΡ 1 589 807/PT licopeno-épsilon-ciclase (Ronen et al. "Regulation of expression of the gene for lycopene epsilon cyclase during fruit ripening of tomato", não publicado). β-Caroteno-Hidroxilases

Sequências codificando β-caroteno-hidroxilases exemplares que são opcionalmente utilizadas para transformar células ou plantas de ananás de acordo com os métodos do invento incluem aquelas correspondendo a, p.ex., número de Entrada AC092389 correspondendo à sequência genómica BAC OSJNBa0053C23 do cromossoma 10 de Oryza sativa (Buell et al. "Oryza sativa chromosome 10 BAC OSJNBa0053C23 genomic sequence", não publicado), número de Entrada AF499108 correspondendo ao gene da beta-caroteno-hidroxilase (bchl) de Vitis vinifera (Young et al. "Isolation, characterization and heterologous expression of a beta-carotene hydroxylase from grapevine (Vitis vinifera)", não publicado), número de Entrada AF315289 correspondendo ao ARNm da beta-caroteno-hidroxilase (CHX2) de Citrus unshiu (Kim et ai. (2001) "Isolation and characterization of cDNAs coding beta-carotene hydroxylase in Citrus", Plant Sei. 161(5): 1005-1010), e número de Entrada AF296158 correspondendo ao ARNm da beta-caroteno-hidroxilase (CHX1) de Citrus unshiu (Kim et al. (2001) "Isolation and characterization of cDNAs coding beta-carotene hydroxylase in Citrus", Plant Sei. 161(5): 1005-1010) . ε-Hidroxilases

Sequências codificando épsilon-hidroxilases que são opcionalmente aqui utilizadas incluem aquelas correspondendo a, p.ex., número de Entrada AE005173 correspondendo à sequência completa do braço inferior do cromossoma 1 de Arabidopsis thaliana (Theologis et al. (2000) "Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana", Nature 408(6814): 816-820) e número de Entrada AE005172 correspondendo à sequência do braço superior do cromossoma 1 de Arabidopsis thaliana. Theologis et al. (2000) "Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana", Nature 408(6814): 816-820. 30

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Adicionalmente, as sequências de ácido nucleico para grupos de enzimas biossintéticas de carotenóides de microorganismos carotenogénicos podem ser obtidas em GenBank®, tal como o No. de Entrada M87280 (Erwinía herbicola EholO), D90087 (Erwinia uredovora) , U62808 (Flavobacterium), D58420 (Agrobacterium aurantiacum) e M90698 (Erwinia herbicola Ehol3).

V. POLIPÉPTIDOS BIOSSINTÉTICOS DE CAROTENÓIDES

ARTIFICIALMENTE EVOLUÍDOS

Polipéptidos biossintéticos de carotenóides artificialmente evoluídos podem ser utilizados para modular a acumulação de carotenóides em células e plantas de ananás transgénicas. Por exemplo, qualquer uma das sequências biossintéticas de carotenóides alvo exemplares descritas acima podem ser artificialmente evoluídas para adquirirem características ou propriedades desejados, tais como maior eficiência catalítica, maior especificidade de substrato, e/ou semelhantes. Uma variedade de procedimentos geradores de diversidade artificial está disponível e descrita na arte, que pode ser utilizada para produzir polipéptidos biossintéticos de carotenóides artificialmente evoluídos. Estes procedimentos podem ser utilizados separadamente ou em combinação para produzir variantes de um ácido nucleico, bem como variantes de proteínas biossintéticas de carotenóides codificadas pelas variantes de ácido nucleico. Individualmente e colectivamente, estes procedimentos proporcionam modos robustos, amplamente aplicáveis de conceber ou evoluir rapidamente ácidos nucleicos e proteínas biossintéticos de carotenóides individuais, ou mesmo toda a via de carotenóides ou proteínas seleccionadas da via. Os produtos destes procedimentos podem ser utilizados nos métodos de transformação aqui descritos. como maior

Em particular, o resultado de qualquer um dos procedimentos geradores de diversidade aqui descritos ou de outro modo conhecidos na arte pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos que são tipicamente seleccionados ou pesquisados quanto a ácidos nucleicos codificando enzimas biossintéticas de carotenóides com, ou que conferem, propriedades desejáveis, tais como maior eficiência 31

ΕΡ 1 589 807/PT catalítica, etc. Isto pode incluir a identificação de qualquer actividade que possa ser detectada, por exemplo, num formato automático ou automatizável, através de qualquer um dos ensaios conhecidos na técnica. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, à descrição do praticante.

Os polipéptidos biossintéticos de carotenóides artificialmente evoluídos que são opcionalmente utilizados nos métodos de transformação aqui descritos podem ser derivados utilizando muitas técnicas diferentes. Para ilustrar, podem ser utilizadas enzimas quiméricas incluindo componentes identificáveis (p.ex., domínios proteicos) derivados de duas ou mais sequências parentais. Por exemplo, podem ser identificados e seleccionados domínios em diferentes fitoeno-sintetases para inclusão numa fitoeno-sintetase quimérica descendente. Vários algoritmos de comparação de sequências e outras ferramentas que são úteis para o desenho de enzimas quiméricas são descritos mais abaixo.

Enzimas artificialmente evoluídas podem ser adicionalmente desenvolvidas utilizando vários métodos mutagénicos, tais como mutagénese de cassete, mutagénese dirigida ao local (ver, p.ex., Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis", Science 229: 1193-1201; Cárter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237: 1-7; e Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" em Nucleics Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. e Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)), mutagénese química, PCR tendente a erro, mutagénese de saturação do local, mutagénese recursiva de conjunto, e semelhantes. Para ilustrar, a PCR tendente a erro pode ser utilizada para gerar variantes de ácido nucleico. Utilizando a PCR tendente ao erro, por exemplo, a PCR é efectuada sob condições onde a fidelidade de cópia da ADN-polimerase é baixa, tal que é obtida uma elevada taxa de mutações pontuais ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Exemplos de tais técnicas são ainda descritos em, p.ex., Leung et al. (1989) Technique 1: 11-15 e Caldwell et al. (1992) PCR Methods Applic. 2: 28- 32

ΕΡ 1 589 807/PT 33. Para melhor ilustrar uma técnica mutagénica exemplar, a mutagénese de cassete é opcionalmente utilizada num processo que substitui uma pequena região de uma molécula de ADN de cadeia dupla com, p.ex., uma cassete oligonucleotidica sintética que difere da sequência nativa. 0 oligonucleótido sintético pode conter, p.ex., uma sequência ou sequências nativas completamente e/ou parcialmente aleatórias. Detalhes adicionais relativos à mutagénese de cassete são descritos em, p.ex., Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34: 315-323. Outro método exemplar de fenotipicamente sequência de mecanismo de sucessivos de criação de diversidade molecular mutagenicamente é um processo de mutagénese recursiva de conjunto no qual um algoritmo para mutagénese de proteínas é utilizado para produzir diversas populações de mutantes aparentados, cujos membros diferem na aminoácidos. Este método utiliza um retroalimentação para monitorizar ciclos mutagénese de cassete combinatória. Exemplos desta abordagem encontram-se em Arkin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 7811-7815. As técnicas mutagénicas referidas acima são simplesmente proporcionadas para ilustrar certos procedimentos que são opcionalmente utilizados para produzir diversidade em ácidos nucleicos que codificam polipéptidos biossintéticos de carotenóides. Muitas outras abordagens à criação de diversidade através de mutagénese são bem conhecidas e são também adequadas para os métodos aqui descritos.

Os ácidos nucleicos que codificam polipéptidos biossintéticos de carotenóides, tais como os descritos acima, são também opcionalmente utilizados como substratos para uma variedade de reacções de recombinação, tal como um protocolo de recombinação recursiva de sequências. Muitas destas técnicas são descritas em várias publicações incluindo, p.ex., Chang et al. (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17: 793-797, Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391: 288-291, Crameri et al. (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15: 436-438, Crameri et al. (1996) "Improved 33

ΕΡ 1 589 807/PT green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling" Nature Biotechnology 14: 315-319, Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13: 549-553, e Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370: 389-391.

Muitos dos procedimentos geradores de diversidade descritos acima (p.ex., desenho e síntese de enzimas quiméricas, recombinação recursiva de sequências, etc.), incluem a determinação de níveis de homologia entre as sequências de partida. Por exemplo, nos processos de comparação de sequências e determinação de homologia, uma sequência, p.ex., um fragmento ou subsequência de uma sequência génica a recombinar, pode ser utilizado como referência contra a qual são comparadas outras sequências de ácido nucleico de teste. Esta comparação pode ser alcançada com a ajuda de um algoritmo de comparação de sequências ou através de inspecção visual. Quando é empregue um algoritmo, são introduzidas num computador sequências de teste e de referência, são designadas as coordenadas da subsequência, conforme necessário, e são especificados os parâmetros do programa do algoritmo de sequências. O algoritmo calcula então a percentagem de identidade de sequência para a sequência ou sequências de ácido nucleico de teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros especificados do programa.

Para fins do presente invento, podem ser executadas comparações adequadas das sequências, p.ex., através do algoritmo de homologia local de Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, através do método de pesquisa de semelhança de Pearson & Lipman (1988) Proc. Nat '1. Acad. Sei. USA 85: 2444, através de implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou através de inspecção visual. Ver geralmente, "Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma joint-venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (com suplementos ao longo de 2001). Outro exemplo de algoritmo de pesquisa que 34

ΕΡ 1 589 807/PT é adequado para a determinação da percentagem de identidade de sequências e semelhança de sequências é o algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) , que é descrito em, p.ex., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. O suporte lógico para efectuar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information na world wide web em ncbi.nlm.nih.gov.

Estojos para mutagénese, construção de bibliotecas e outros métodos de geração de diversidade estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, os estojos estão disponíveis em, p.ex., Stratagene (p.ex., o estojo de mutagénese dirigida ao local QuickChange™, e o estojo de mutagénese dirigida ao local de cadeia dupla Chameleon”) , Bio/Can Scientific, Bio-Rad (p.ex., utilizando o método de Kunkel referido acima), Boehringer Mannheim Corp., Clonetech Laboratories, DNA Technologies, Epicentre Technologies (p.ex., o estojo 5 prime 3 prime), Genpak Inc., Lemargo Inc., Life Technologies (Gibco BRL) , New England Biolabs, Pharmacia Biotech, Promega Corp., Quantum Biotechnologies, Amersham International plc, e Anglian Biotechnology Ltd.

VI. PREPARAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO

Segmentos de ácido nucleico que codificam polipéptidos biossintéticos de carotenóides, tais como os descritos acima, podem ser preparados utilizados vários métodos ou combinações destes, incluindo certas técnicas de síntese de ADN, amplificação do ADN, digestão com nucleases, etc. A informação de sequências pesquisável que está disponível em base de dados de ácidos nucleicos pode ser utilizada durante os processos de selecção e/ou desenho de segmentos de ácido nucleico e vectores. Genbank®, Entrez®, EMBL, DDBJ, GSDB, NDB e a NCBI são exemplos de bases de dados/serviços de pesquisa públicos que podem ser acedidos. Estas bases de dados estão geralmente disponíveis através da internet ou com base num contrato a partir de uma variedade de companhias especializadas na geração e/ou armazenamento de informação genómica. Estes e outros recursos úteis estão facilmente disponíveis e são conhecidos dos peritos na técnica. 35

ΕΡ 1 589 807/PT A sequência de um polinucleótido a utilizar em qualquer um dos métodos do presente invento pode também ser facilmente determinada utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica, incluindo Maxam-Gilbert, Didesoxi de Sanger, e Sequenciação através de métodos de Hibridação. Para descrições gerais destes processos consultar, p.ex., Stryer, "Biochemistry", 4th Ed., W.H. Freeman and Company (1995) e Lewin, "Genes VI", Oxford University Press (1997). Ver também, Maxam e Gilbert (1977) "A New Method for Sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sei. 74: 560-564, Sanger et al. (1977) "DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors", Proc. Natl. Acad. Scí. 74: 5463-5467, Hunkapiller et al. (1991) "Large-Scale and Automated DNA Sequence Determination", Science 254: 59-67, e Pease et al. (1994) "Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA Sequence Analysis", Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 5022-5026.

Os segmentos de ácido nucleico que codificam as enzimas biossintéticas de carotenóides descritas acima podem ser sintetizados através de técnicas químicas, por exemplo, utilizando o método de fosfotriéster de Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185. Claro que, através da síntese química da sequência de codificação, quaisquer modificações desejadas podem ser feitas simplesmente através da substituição das bases apropriadas por aquelas codificando a sequência de resíduos de aminoácidos nativa. No entanto, são tipicamente preferidos segmentos de ácido nucleico incluindo as sequências discutidas anteriormente. Além disso, os segmentos de ácido nucleico codificando enzimas biossintéticas de carotenóides são opcionalmente obtidos a partir de moléculas de ADN recombinantes existentes (vectores plasmídicos) contendo esses genes. Alguns destes plasmídeos estão disponíveis em American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852.

Os segmentos de ácido nucleico e as construções ou os vectores para utilizar no presente invento podem ser preparados através de várias técnicas conhecidas na técnica, tais como técnicas de clonagem molecular. Uma ampla variedade de métodos de clonagem e amplificação in vitro adequados para a construção de ácidos nucleicos recombinantes, tais como vectores de expressão, é bem conhecida dos peritos na 36

ΕΡ 1 589 807/PT técnica. Vectores adequados para utilizar no presente invento são descritos mais abaixo. Textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular úteis aqui, incluindo mutagénese, incluem Berger e Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology, Vol. 152,

Academic Press, Inc. (1999) ("Berger"); Sambrook et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", 2a Ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2000) ("Sambrook"); e "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (Eds.), "Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates", Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (com suplmentos ao longo de 2000) ("Ausubel"). Exemplos de técnicas suficientes para orientar os peritos na técnica ao longo dos métodos de amplificação in vitro, incluindo a reacção em cadeia da polimerase (PCR), a reacção em cadeia da ligase (LCR), amplificação por C^-replicase e outras técnicas mediadas por ARN-polimerase (p.ex., NASBA) encontram-se em Berger, Sambrook, e Ausubel, bem como Mullis et al. (1987) Pat. U.S. No. 4683202; "PCR Protocols A Guide to Methods and Applications" (Innis et al., eds.), Academic Press Inc. (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (1990) "Chemical and Engineering News" 36-47; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad.

Scl. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clln. Chem. 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu e Wallace, (1989)

Gene 4: 560; Barringer et al. (1990) Gene 89: 117, e

Sooknanan e Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Métodos adicionais de clonagem de ácidos nucleicos amplificados in vitro são também descritos na Pat. U.S. No. 5426039 para Wallace et al. Os métodos de amplificação de ácidos nucleicos grandes através de PCR são resumidos em Cheng et al. (1994)

Nature 369: 684-685 e nas referências ai citadas, nos quais são gerados amplicões de PCR de até 40 kb. Um perito apreciará também que essencialmente qualquer ARN pode ser convertido num ADN de cadeia dupla adequado para digestão de restrição, expansão por PCR e sequenciação utilizando transcriptase reversa e uma polimerase. Ver, Ausubel, Sambrook e Berger, todos supra. 0 isolamento de uma sequência de ácido nucleico para inclusão numa construção vector para utilizar no invento pode 37

ΕΡ 1 589 807/PT ser alcançado através de várias técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, sondas oligonucleotidicas baseadas em sequências conhecidas podem ser utilizadas para identificar o gene desejado numa biblioteca de ADNc ou ADN genómico. As sondas podem ser utilizadas para hibridar com sequências de ADN genómico ou de ADNc para isolar genes homólogos da mesma espécie ou de espécies diferentes. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos criados contra uma enzima para pesquisar uma biblioteca de expressão de ARNm quanto à correspondente sequência de codificação.

Alternativamente, os ácidos nucleicos de interesse (p.ex., genes codificando polipéptidos biossintéticos de carotenóides) podem ser amplificados a partir de amostras de ácidos nucleicos utilizando técnicas de amplificação. Por exemplo, a tecnologia de reacção em cadeia da polimerase (PCR) pode ser utilizada para amplificar as sequências de genes desejados directamente a partir de ADN genómico, a partir de ADNc, a partir de bibliotecas genómicas ou de bibliotecas de ADNc. PCR e outros métodos de amplificação in vitro podem também ser úteis, por exemplo, para clonar sequências de ácido nucleico que codificam para proteínas a expressar, para produzir ácidos nucleicos para utilizar como sondas para detectar a presença do ARNm desejado em amostras, para sequenciação de ácido nucleico, ou para outros fins. Para uma perspectiva geral da PCR, ver Innis, supra.

Podem também ser sintetizados polinucleótidos através de técnicas bem conhecidas tal como descrito na literatura técnica. Ver, p.ex., Carruthers et al. (1982) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 47: 411-418, e Adams et al. (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661. Segmentos de ADN de cadeia dupla podem então ser obtidos através de síntese da cadeia complementar e ligação das cadeias uma à outra sob condições apropriadas, ou através da adição da cadeia complementar utilizando ADN-polimerase com uma sequência iniciadora apropriada.

Os oligonucleótidos para utilizar como sondas, p.ex. em métodos de amplificação in vitro, para utilizar como sondas de genes são tipicamente sintetizados quimicamente de acordo com o método de fase sólida de fosforamidite-triéster 38

ΕΡ 1 589 807/PT descrito por Beaucage e Caruthers (1981) Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, p.ex., utilizando um sintetizador automático, tal como descrito em Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acíds Res. 12: 6159-6168. Os oligonucleótidos para utilizar nas construções de ácido nucleico ou vectores do presente invento podem também ser feitos à medida e encomendados a partir de uma variedade de fontes comerciais conhecidas dos peritos na técnica.

VII. VECTORES

Essencialmente qualquer vector ou sistema de vectores pode ser utilizado para criar as células e plantas de ananás transformadas do invento. Os segmentos de ácido nucleico que codificam polipéptidos biossintéticos de carotenóides podem ser operativamente ligados a vectores na forma de plasmideos ou de sistemas de plasmideos (p.ex., um sistema binário, um sistema ternário, um sistema de vectores vaivém, etc.). Certos sistemas plasmidicos exemplares que são opcionalmente adaptados para utilizar no presente invento são descritos em, p.ex., Pat. U.S. Nos. 5977439 para Hamilton (concedida a 2 de Novembro de 1999), 5929306 para Torisky et al. (concedida a 27 de Julho de 1999), 5149645 para Hoekema et al. (concedida a 2 de Setembro de 1992), 6165780 para Kawasaki (concedida a 26 Dezembro de 2000), 6147278 para Rogers et al. (concedida a 14 de Novembro de 2000), 4762785 para Cornai (concedida a 9 de Agosto de 1988), e 5068193 para Cornai (concedida a 26 Novembro de 1991).

Os segmentos de ácido nucleico aqui descritos, p.ex., na forma de cassetes de expressão incluem tipicamente na direcção de transcrição 5'-3', uma região de inicio da transcrição e da tradução, uma sequência de ADN de interesse (p.ex., um gene codificando um polipéptido biossintético de carotenóides), e uma região de terminação da transcrição e da tradução funcional em plantas de ananás. A região de terminação pode ser nativa com a região de inicio da transcrição, pode ser nativa com a sequência de ADN de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação da octopina-sintetase e da nopalina-sintetase. Ver 39

ΕΡ 1 589 807/PT também, Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 262: 141- 144/ Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671-674; Sanfacon et al., (1991), Genes Dev. , 5: 141-149; Mogen et al., (1990), Plant

Cell, 2: 1261-1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91: 151-158;

Bailas et al., (1989), Nucleic Acíds Res. , 17: 7891-7903; e

Joshi et al., (1987), Nucleic Acids Res. , 15: 9627-9639).

Os genes biossintéticos de carotenóides podem ser direccionados para plastos, tais como cloroplastos, para expressão. Deste modo, quando o gene biossintético de carotenóides não é directamente inserido no plasto, a cassete de expressão conterá adicionalmente um gene codificando um péptido de trânsito para dirigir o gene de interesse para o plasto. Tais péptidos de trânsito são conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Von Heijne et ai. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126/ Clark et ai. (1989) J. Biol Chem. 264: 17544-17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968/ Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e, Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Os genes de carotenóides de plantas úteis no invento podem utilizar péptidos de trânsito nativos ou heterólogos.

As construções para utilizar no invento incluem também quaisquer outros reguladores necessários tais como sequências de consenso de tradução de plantas (Joshi, C. P., (1987),

Nucleic Acids Research, 15: 6643-6653), intrões (Luehrsen e

Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet., 225: 81-93) e semelhantes, operativamente ligados à sequência nucleotidica de interesse.

Nalgumas concretizações, as sequências líder a 5' são incluídas na construção da cassete de expressão. Tais sequências líder podem actuar aumentando a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, o líder de EMCV (região não codificadora a 5' de Encephalomyocarditis) (Elroy-Stein et ai. (1989) PNAS USA 86: 6126-6130); líderes de potyvírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus da Gravura do Tabaco) (Allison et al., (1986); líder de MDMV (Vírus do Mosaico do

Milho Anão); Virology, 154: 9-20), e proteína de ligação à cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G., e Sarnow, P., (1991), Nature, 353: 90-94); líder não traduzido do ARNm da proteína de revestimento do vírus do 40

ΕΡ 1 589 807/PT mosaico da alfafa (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., e Gehrke, L., (1987), Nature, 325: 622-625; líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV), (Gallie, D. R. et al., (1989), "Molecular Biology of RNA", páginas 237-256; e líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lommel, S. A. et al., (1991), Virology, 81: 382-385. Ver também, Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiology, 84: 965-968.

Dependendo de onde se pretende que a sequência de ADN de interesse seja expressa, pode ser desejável sintetizar a sequência com codões preferidos da planta de ananás, ou alternativamente, com codões preferidos de cloroplastos. Os codões preferidos da planta de ananás podem ser determinados a partir dos codões de frequência mais elevada nas proteínas expressas em maior quantidade na espécie vegetal de interesse em particular. Ver, Pedido de Patente Europeia No. 0359472 e 0385962; Pedido Internacional No. WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 3324-3328; e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498. Deste modo, as sequências nucleotídicas podem ser optimizadas para expressão em plantas de ananás. É reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência génica pode ser optimizada ou sintética. Isto é, sequências sintéticas ou parcialmente optimizadas podem também ser utilizadas. Para a construção de genes preferidos de cloroplastos, ver p.ex., Pat. U.S. No. 5545817.

Na preparação de cassetes de expressão, os vários fragmentos de ADN podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de ADN na orientação correcta e, conforme apropriado, no enquadramento de leitura correcto. Para este fim, podem ser empregues adaptadores ou ligadores para unir os fragmentos de ADN ou podem estar envolvidas outras manipulações para proporcionar locais de restrição convenientes, remoção de ADN supérfluo, remoção de locais de restrição, ou semelhantes. Para este fim, pode ser empregue mutagénese in vitro, reparação por iniciadores, restrição, ligação, ressecção, união, ou semelhantes, quando podem estar envolvidas inserções, deleções ou substituições, p.ex., transições e transversões.

Os vectores para utilização no invento também incluem tipicamente elementos de controlo da expressão, tais como 41

ΕΡ 1 589 807/PT promotores. Os genes codificando polipéptidos biossintéticos de carotenóides são operativamente ligados ao vector de expressão para permitir que a sequência promotora dirija a ligação da ARN-polimerase e a expressão do gene codificando o polipéptido. Úteis na expressão do gene codificando o polipéptido são promotores que sejam indutíveis, virais, sintéticos, constitutivos tais como os descritos em, p.ex., Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3: 2719 e Odell et al. (1985) Nature 313: 810 (1985) e temporalmente regulados, espacialmente regulados, e espácio-temporalmente regulados tais como os descritos em, p.ex., Chua et al. (1989) Science 244: 174-181. A escolha de que vector de expressão e, p. ex., a que promotor aumentado no órgão pré-seleccionado, um gene codificando um polipéptido está operativamente ligado depende das propriedades funcionais desejadas, p.ex. da localização e do momento de expressão da proteína. Um vector que seja útil na prática do presente invento integra-se no genoma de plantas de ananás, é capaz de dirigir a replicação, e também a expressão do gene codificando polipéptidos biossintéticos de carotenóides incluído no segmento de ácido nucleico a que está operativamente ligado. É bem conhecido na arte que o vector de expressão inteiro não se integra no genoma da planta hospedeira, mas que apenas se integra uma porção. Contudo, dir-se-á que o vector se integra para facilidade de expressão.

Nalgumas concretizações do presente invento, as construções incluem elementos para além das sequências de ácido nucleico unidas, tais como promotores, elementos estimuladores, e sequências de sinalização. Promotores exemplares incluem o promotor de CaMV, um promotor do gene da subunidade pequena da ribulose-1,5-bisfosfato-carboxilase-oxigenase, um promotor da ubiquitina, e um promotor de rolD. Elementos estimuladores exemplares são descritos em, p.ex., Pat. U.S. No. 6271444, que foi concedida a 7 de Ago. de 2001 a McBride et al. Sequências de sinalização exemplares incluem, mas não se limitam a, sequências de ácido nucleico codificando péptidos de trânsito específicos de tecido, tais como péptidos de trânsito de cloroplastos (ver, p.ex., Zhang et al. (2002) Trends Plant Scí. 7(1): 14-21). 42

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Em certas concretizações, pode ser empregue um promotor vegetal fortemente ou fracamente constitutivo que dirigirá a expressão directa das sequências codificadas em todos os tecidos de uma planta de ananás. Tais promotores são activos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor 1' ou 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumefadens, e outras regiões de inicio da transcrição de vários genes de plantas conhecidos dos peritos. Em situações em que a sobre-expressão de um gene é indesejável, podem ser utilizados promotores constitutivos fracos para menores níveis de expressão. Em casos em que se pretendem elevados níveis de expressão, pode ser utilizado um promotor forte, p.ex., um t-ARN ou outro promotor de pol III, ou um promotor de pol II forte, tal como o promotor do virus do mosaico da couve-flor,.

Alternativamente, um promotor de plantas pode estar sob controlo ambiental. Tais promotores são aqui referidos como promotores "indutíveis". Exemplos de condições ambientais que podem afectar a transcrição por promotores indutíveis incluem ataque de patogénios, condições anaeróbicas, ou a presença de luz.

Nalgumas concretizações, os promotores incorporados nas construções do presente invento são "específicos de tecido" e, como tal, sob controlo do desenvolvimento por o gene desejado ser expresso apenas em certos tecidos, tais como tecidos dos frutos. Em concretizações nas quais uma ou mais sequências de ácido nucleico endógenas à planta de ananás são incorporadas na construção, os promotores endógenos (ou variantes destes) destes genes podem ser empregues para dirigir a expressão dos genes na planta transfectada. Promotores específicos de tecido podem também ser utilizados para dirigir a expressão de genes estruturais heterólogos, incluindo os ácidos nucleicos artificialmente evoluídos aqui descritos.

Além dos promotores observados acima, promotores de origem bacteriana que operam em plantas incluem o promotor da octopina-sintetase, o promotor da nopalina-sintetase e outros 43

ΕΡ 1 589 807/PT promotores derivados de plasmídeos Ti nativos (ver, Herrara-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209-213). Promotores virais incluem os promotores de ARN 35S e 19S do virus do mosaico da couve-flor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812) . Outros promotores de plantas incluem o promotor da subunidade pequena da ribulose-1,3-bisfosfato-carboxilase e o promotor da faseolina. A sequência promotora do gene E8 e de outros genes pode também ser utilizada. O isolamento e a sequência do promotor E8 são descritos em detalhe em Deikman e Fischer (1988) EMBO J. 7: 3315-3327.

Na preparação das construções para utilizar no invento, podem também ser empregues sequências diferentes da do promotor e do segmento de ácido nucleico conjunto. Se for desejada a expressão normal do polipéptido, pode ser incluída uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região de codificação. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais, ou de ADN-T.

Os vectores típicos úteis para expressão de genes em plantas de ananás são bem conhecidos na técnica e incluem vectores derivados do plasmídeo indutor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descritos por Rogers et al. (1987) Meth. In Enzymol., 153: 253-277 (1987). Estes vectores são vectores que se integram nas plantas por na transformação os vectores integrarem uma porção do ADN do vector no genoma da planta de ananás. Para vectores integrantes baseados no plasmídeo Ti, a região integrada nos cromossomas da planta hospedeira é aquela entre os bordos direito e esquerdo do plasmídeo Ti.

Vectores exemplares de A. tumefaciens úteis aqui são os plasmídeos pKYLX6 e pKYLX7 de Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11 e Berger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86: 8402-8406. O plasmídeo pKYLX6 é um vector de E. coli desenhado para construções intermediárias, enquanto o plasmídeo pKYLX7 é um vector de A. tumefaciens desenhado para integração de genes clonados. Os vectores modificados pKYLX61 e pKYLX71 contêm locais HindIII, Xhol, BamHI, PstI e SstI em vez da região do local de clonagem múltipla do fragmento original HindIII-SstI. Outro vector útil aqui é o plasmídeo 44 ΕΡ 1 589 807/ΡΤ ρΒΙ101.2 que está disponível em Clontech Laboratories, Inc., Paio Alto, Calif. Os plasmídeos pKYLX7, pKYLX71 e pB7101.2 são vectores binários que são utilizados em A. tumefaciens com outro vector possuindo um gene vir. Outros sistemas de vectores são também opcionalmente aqui utilizados incluindo, p.ex., sistemas de vectores ternários. Outro sistema de transformação de plantas baseia-se em Agrobacterium rhizogenes que induz raízes pilosas em vez de um tumor na transformação. Ver, p.ex., Publicação Internacional No. WO 88/02405 (publicada a 7 de Abr. de 1988) que descreve a utilização da estirpe A4 de A. rhizogenes e o seu plasmídeo Tri juntamente com os vectores de A. tumefaciens pARC8 ou pARC16 para transformar plantas. A transformação mediada por Agrobacterium é descrita mais abaixo. A utilização de vectores de expressão retrovirais está também contemplada. Tal como aqui se utiliza, o termo "vector de expressão retroviral" refere-se a uma molécula de ADN que inclui uma sequência promotora derivada da região de repetição terminal longa (LTR) de um genoma de retrovírus. Como alguns dos produtos carotenóides do invento estão associados à produção e coloração de alimentos, o vector de expressão retroviral é de preferência incompetente para replicação em células eucarióticas. A construção e utilização de vectores retrovirais tem sido descrita, p.ex., por Verma em Publicação Internacional No. WO 87/00551, e em Cocking et al. (1987) Science 236: 1259-62. O vector utilizado para expressar o gene codificando um polipéptido biossintético de carotenóides pode incluir um marcador seleccionável vegetal que confira um fenótipo seleccionável na célula de ananás transformada. 0 gene do marcador seleccionável vegetal no segmento de ADN a inserir codificará habitualmente uma função que permite a sobrevivência e emergência do tecido ou calo embriogénico ou organogénico transformado num meio selectivo. Habitualmente, o gene do marcador seleccionável codificará resistência a antibióticos, com genes adequados incluindo aqueles codificando para resistência ao antibiótico espectinomicina (p.ex., o gene aadA), o gene da estreptomicina-fosfotransferase (SPT) codificando para resistência a estreptomicina, o gene da neomicina-fosfotransferase (NPTII) 45

ΕΡ 1 589 807/PT codificando resistência a canamicina ou geneticina, o gene da higromicina-fosfotransferase (HPT) codificando para resistência a higromicina, genes codificando para resistência a herbicidas que actuam inibindo a acção da acetolactato-sintetase (ALS), em particular herbicidas do tipo sulfonilureia (p.ex., o gene da acetolactato-sintetase (ALS) contendo mutações conduzindo a tal resistência, em particular as mutações S4 e/ou Hra), genes codificando para resistência a herbicidas que actuam inibindo a acção da glutamina-sintetase, tal como fosfinotricina ou basta (p.ex., o gene bar), ou outros genes desses conhecidos na técnica. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptll codifica resistência aos antibióticos canamicina e geneticina, e o gene ALS codifica resistência ao herbicida clorsulfuron. A selecção com base na resistência a herbicidas do tipo sulfonilureia é preferida. Marcadores seleccionáveis baseados na proteína fluorescente verde (GFP) ou β-glucuronidase (GUS) são também opcionalmente utilizados e são melhor descritos em, p.ex., Mantis et al. (2000) "Comparing the utility of β-glucuronidase and green fluorescent protein for detection of weak promotor activity in Arabidopsis thaliana", Plant Molecular Biology Repórter 18: 319-330.

Os métodos para seleccionar células vegetais transformadas incorporando um gene de resistência desejado são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, se o marcador for resistência a sulfonilureia, o meio de selecção contém geralmente um herbicida do tipo sulfonilureia numa concentração apropriada (p.ex., clorsulfuron no intervalo de 1-1000 pg/l, de preferência cerca de 5-100 pg/l). Para selecção de células ou tecido de ananás resistentes a geneticina que contenham o gene NPTII, a geneticina é tipicamente incluída no meio a 10-50 mg/1. As células ou tecidos resistentes a espectinomicina contendo o gene aadA são tipicamente seleccionados em meio contendo 200-1000 mg/1 de espectinomicina.

Uma vez que muitos carotenóides são coloridos, estes produtos carotenóides podem ser visualizados e determinados através do seu espectro característico e outros métodos analíticos. Portanto, genes codificando enzimas biossintéticas de carotenóides podem ser utilizados como 46

ΕΡ 1 589 807/PT genes marcadores para permitir selecção visual dos transformantes. Em particular, tais células transformadas apresentam geralmente cores variando de amarelo a laranja a vermelho em resultado dos níveis crescentes de carotenóides. Nalgumas concretizações, podem ser utilizadas outras técnicas analíticas para seleccionar células de ananás transformadas incluindo, p.ex., espectrometria de massa, cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC), electroforese capilar (CE), espectroscopia de RMN, e técnicas de hibridação convencionais.

Foi desenvolvida uma variedade de métodos para ligar operativamente ADN a vectores através de terminais coesivos complementares ou extremidades cegas. Por exemplo, tractos homopoliméricos complementares podem ser adicionados ao segmento de ácido nucleico a inserir e ao vector. O vector e o segmento de ácido nucleico são então unidos através de pontes de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de ADN recombinantes.

Alternativamente, podem ser utilizados ligadores sintéticos que incluam um ou mais locais de endonucleases de restrição para unir o segmento de ácido nucleico ao vector de expressão integrante. Os ligadores sintéticos são unidos a segmentos de ácido nucleico terminados de forma cega através da incubação dos segmentos de ácido nucleico terminados de forma cega com um grande excesso de moléculas ligadoras sintéticas na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação de moléculas de ácido nucleico terminadas de forma cega, tais como a ADN-ligase do bacteriófago T4. Assim, os produtos da reacção são segmentos de ácido nucleico possuindo sequências ligadoras sintéticas nas suas extremidades. Estes segmentos de ácido nucleico são então clivados com a endonuclease de restrição apropriada e ligados num vector de expressão integrante que foi clivado com uma enzima que produza terminais compatíveis com os do ligador sintético. Ligadores sintéticos contendo uma variedade de locais de endonucleases de restrição estão comercialmente disponíveis em várias fontes incluindo New England BioLabs (Beverly, MA).

Os segmentos de ADN introduzidos podem conter adicionalmente um ou mais genes que são então escolhidos para 47

ΕΡ 1 589 807/PT proporcionar novas características da planta de ananás, para aumentar uma caracteristica existente da planta de ananás, ou para de outro modo modificar a expressão de fenótipos exibidos pela planta de ananás, isto é, além de modificar os níveis de carotenóides nas plantas de ananás. Tais características adicionais incluem resistência a herbicida, resistência a pesticida, resistência a doença, tolerância ambiental (p.ex., calor, frio, seca, salinidade), morfologia, características de crescimento, teor nutricional, sabor, rendimento, características de horticultura, características do consumidor (qualidade) e semelhantes. Exemplos de genes que podem ser introduzidos incluem os que conferem resistência ou reduzem a susceptibilidade a determinadas doenças ou pestes do ananás. Exemplos incluem os que reduzem a susceptibilidade a Fusariose, definhamento por cochonilha, doença do marmoreio e nemátodes.

VIII. ESTRATÉGIAS DE MODULAÇÃO DA BIOSSÍNTESE DE CAROTENÓIDES

Os genes funcionais a introduzir podem ser genes estruturais que codificam polipéptidos que conferem o fenótipo desejado, tais como uma coloração modificada do fruto do ananás. Alternativamente, os genes funcionais podem ser genes reguladores que têm papéis no controlo da transcrição e/ou tradução para suprimir, aumentar, ou de outro modo modificar a transcrição e/ou expressão de genes endógenos dentro das plantas de ananás. Os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides introduzidos podem ser segmentos de ácido nucleico que codificam factores de transcrição de polipéptidos biossintéticos de carotenóides, que quando expressos em células transformadas efectuam elevada expressão dos genes biossintéticos de carotenóides alvo. Noutros exemplos, os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides incluem segmentos de ácido nucleico que codificam promotores de polipéptidos biossintéticos de carotenóides e/ou estimuladores de polipéptidos biossintéticos de carotenóides, cujos segmentos de ácido nucleico recombinam de modo homólogo com promotores e/ou estimuladores de genes de polipéptidos biossintéticos de carotenóides endógenos para aumentar ou diminuir a expressão dos genes conforme desejado. 48

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Para melhor ilustrar, podem ser utilizadas várias construções de ADN em várias técnicas para suprimir a expressão de genes vegetais endógenos, p.ex., supressão com sentido ou anti-sentido ou ribozimas. A inibição por ARN anti-sentido da expressão génica foi mostrada; ver, p.ex., Sheehy et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85: 8805-8809, e Hiatt et al. Pat. U.S. No. 4801340. Para exemplos da utilização da supressão com sentido para modular a expressão de genes endógenos ver, Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289, e Pat. U.S. No. 5034323.

Moléculas de ARN catalítico ou ribozimas podem também ser utilizadas para inibir a expressão génica, o que é opcionalmente utilizado para efectuar a acumulação de carotenóides seleccionados que estão a montante na via biossintética de carotenóides do gene que é inibido. É possível desenhar ribozimas que emparelhem especificamente com virtualmente qualquer ARN alvo e clivem a estrutura fosfodiéster numa localização específica, inactivando deste modo funcionalmente o ARN alvo. Na realização desta clivagem, a ribozima não é ela própria alterada, e é assim capaz de se reciclar e clivar outras moléculas, tornando-se numa verdadeira enzima. A inclusão de sequências de ribozima dentro de ARN anti-sentido confere-lhes actividade de clivagem de ARN, aumentando deste modo a actividade das construções.

Foram identificadas várias classes de ribozimas. Uma classe de ribozimas é derivada de vários pequenos ARN circulares que são capazes de se auto-clivarem e replicarem em plantas. Os ARN replicam-se sozinhos (ARN viróides) ou com um vírus ajudante (ARN satélite). Exemplos incluem ARN de viróide da mancha solar do abacateiro e os ARN satélite do vírus da mancha anelar do tabaco, vírus das riscas transientes da luzerna, vírus do mosqueado do tabaco aveludado, vírus do mosqueado de Solanum nodiflorum, e vírus do mosqueado do trevo subterrâneo. O desenho e a utilização de ribozimas específicas de ARN alvo estão descritos em Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591. 49

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Para supressão anti-sentido, a sequência introduzida também não necessita de ser inteira relativamente ao produto de transcrição primário ou ao ARNm totalmente processado. Geralmente, pode ser utilizada uma homologia mais elevada para compensar a utilização de uma sequência mais curta. Além disso, a sequência introduzida não necessita de ter o mesmo padrão de intrões ou exões e a homologia de segmentos não codificadores pode igualmente eficaz. Normalmente, deve ser utilizada uma sequência de entre cerca de 30 ou 40 nucleótidos e cerca de 2000 nucleótidos, embora seja preferida uma sequência de pelo menos cerca de 100 nucleótidos, uma sequência de pelo menos cerca de 200 nucleótidos é mais preferida, e uma sequência de pelo menos cerca de 500 nucleótidos é especialmente preferida.

Para melhor ilustrar, a interferência por ARN (ARNi), também conhecida como Silenciamento de Genes Pós-Transcrição (PTGS), é também opcionalmente utilizada para modular a acumulação de carotenóides em células e plantas de ananás. O RNAi é um mecanismo celular que nega selectivamente o efeito de um gene alvo através da destruição do ARN mensageiro. Através da destruição do ARNm alvo, a síntese proteica é interrompida, "silenciando" deste modo eficazmente o gene alvo. Em certas concretizações, este processo é iniciado através de ARN de cadeia dupla (ARNcd), onde uma cadeia é substancialmente idêntica à sequência de ARNm alvo. Concordantemente, nalgumas concretizações do invento, os reguladores da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides compreendem segmentos de ácido nucleico que são introduzidos em células de ananás para desencadear a produção de ARNcd de cadeia dupla, que é então clivado em pequenos ARN de interferência (siARN) como parte de um processo de ARNi. Isto resulta na destruição do ARNm alvo, silenciando deste modo eficazmente a expressão de um gene alvo, tal como um gene endógeno codificando um polipéptido biossintético de carotenóides. Detalhes adicionais relativos ao ARNi são descritos em, p.ex., Pat. U.S. No. 6573099, intitulado "GENETIC CONSTRUCTIONS FOR DELAYING OR REPRESSING THE EXPRESSION OF A TARGET GENE", que foi concedida a 3 de Junho de 2003 a Graham, e, p. ex., em Arenz et al. (2003) "RNA interference: from an ancient mechanism to a state of the art therapeutic application?" Naturwissenschaften. 90(8): 345-59, 50

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Wang et al. (2003) "RNA interference: antiviral weapon and beyond", World J. Gastroenterol. 9(8): 1657-61, and Lavery et al. (2003) "Anti-sense and RNAi: powerful tools in drug target discovery and validation" Curr. Opin. Drug Discov. Devei. 6(4): 561-9. Segmentos de ácido nucleico à medida que podem ser utilizados para realizar silenciamento de genes alvo estão também comercialmente disponíveis em vários fornecedores, tais como Ambion, Inc. (Austin, TX, USA), Benitec Australia Limited (St Lucia, AU), e semelhantes.

Frequentemente os genes funcionais a introduzir serão modificados a partir da sua forma nativa. Por exemplo, as construções com sentido e anti-sentido referidas acima têm frequentemente todo ou uma porção do transcrito do gene nativo operativamente ligado a uma sequência promotora na extremidade 5' do segmento passível de transcrever e operativamente ligado à sequência 3' de outro gene (incluindo sequências de poliadenilação) na extremidade 3' do segmento passível de transcrever. Tal como é aparente aos peritos na técnica, a sequência promotora pode ser uma de muitas sequências vegetais activas já descritas. Alternativamente, outras sequências promotoras activas em plantas podem ser derivadas especificamente para serem ligadas ao segmento passível de transcrever. O promotor pode ser endógeno ao ananás, ou pode ser de uma fonte exógena tal como um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), o promotor da ubiquitina 1 (Christiensen et al. (1992) Plant Mol. Blol. 18: 675-689), ou o promotor Smas (Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661-676) . A sequência da extremidade 3' a adicionar pode ser derivada a partir, de preferência, dos genes da nopalina-sintetase ou da octopina-sintetase, ou alternativamente de outro gene vegetal, ou de menor preferência a partir de qualquer outro gene eucariótico.

Tal como descrito acima, a produção de carotenóides pode ser elevada em células e plantas de ananás transformadas com segmentos de ácido nucleico (p.ex., um primeiro gene de interesse) que, p.ex., codifiquem enzimas biossintéticas de carotenóides. Opcionalmente, uma vez aumentada esta actividade biossintética através de expressão destes genes de biossíntese de carotenóides introduzidos, a via pode ser 51

ΕΡ 1 589 807/PT desviada para a produção e acumulação de carotenóides específicos. O desvio inclui tipicamente a utilização de pelo menos um segundo gene de interesse. Para ilustrar, o segundo gene pode codificar uma enzima para forçar a produção de um determinado carotenóide ou alternativamente pode codificar um gene para parar a via para a acumulação de um determinado carotenóide. Para forçar a produção de um determinado carotenóide, é utilizada a expressão de um gene da biossíntese de carotenóides na via para o carotenóide desejado. Genes nativos ou exógenos à planta de ananás alvo são opcionalmente utilizados nestes métodos, incluindo, p.ex., genes de biossíntese de carotenóides de fontes diferentes de plantas, tais como bactérias, incluindo espécies de Erwinia e Rhodobacter. Genes exemplares de biossíntese de carotenóides que podem ser utilizados para estes fins são descritos mais acima. Para parar a via para acumular um determinado composto carotenóide, o segundo gene proporcionará a inibição da transcrição de um gene (p.ex., nativo ou exógeno) à planta alvo em que a enzima codificada pelo gene inibido é capaz de modificar o composto carotenóide desejado. A inibição pode ser alcançada através de transcrição do gene a inibir na orientação com sentido (co-supressão) ou anti-sentido do gene. Outras estratégias com sentido e anti-sentido para modular a acumulação de carotenóides em plantas de ananás são referidas acima.

Para melhor ilustrar, para alterar a composição de carotenóides de uma planta de ananás para a acumulação de níveis mais elevados de carotenóides derivados de β-caroteno, tais como zeaxantina, zeaxantina-diglucósido, cantaxantina, e astaxantina, a inibição de licopeno-ε-ciclase pode ser alcançada para prevenir a acumulação de α-caroteno e outros carotenóides que são derivados do α-caroteno, tais como luteína. Além da inibição da licopeno-ε-ciclase, a expressão aumentada de um segundo gene pode ser utilizada para maior acumulação de um determinado carotenóide derivado de β-caroteno. Por exemplo, a expressão aumentada de β-caroteno-hidroxilase é útil para a produção de zeaxantina, enquanto a expressão aumentada da β-caroteno-hidroxilase e de enzimas de introdução de ceto é útil para a produção de astaxantina. Alternativamente, para acumular licopeno, a inibição de licopeno^-ciclase ou de licopeno-ε-ciclase e licopeno-β- 52

ΕΡ 1 589 807/PT ciclase pode ser realizada para reduzir a conversão de licopeno em α e β-caroteno. É opcionalmente utilizada uma variedade de genes de modo a desviar a biossintese de carotenóides em células e plantas de ananás conforme desejado. Estes incluem, mas não se limitam a, β-caroteno-hidroxilase ou crtZ (Hundle et al. (1993) FEBS Lett. 315: 329-334, No. de Entrada M87280) para a produção de zeaxantina; genes codificando enzimas de introdução de ceto, tais como ascrtW (Misawa et al. (1995) J.

Bacteriol. 177: 6575-6584, WO 95/18220, WO 96/06172) ou β-C- 4-oxigenase (crtO; Harker et al. (1997) FEBS Lett. 404: 129-134) para a produção de cantaxantina; crtZ e crtW ou crtO para a produção de astaxantina; ε-ciclase e ε-hidroxilase para a produção de luteína; ε-hidroxilase e crtZ para a produção de luteina e zeaxantina; licopeno-s-ciclase anti-sentido (No. de Entrada U50738) para produção aumentada de β-caroteno; licopeno-s-ciclase anti-sentido e licopeno-β-ciclase (Hugueney et al. (1995) Plant J. 8: 417-424,

Cunningham Jr. et al. (1996) Plant Cell 8: 1613-1626, Scolnik et al. (1995) Plant Physiol. 108: 1343, Nos. de Entrada X86452, L40176, X81787, U50739 e X74599) para a produção de licopeno; fitoeno-dessaturase vegetal anti-sentido para a produção de fitoeno; e semelhantes.

Deste modo, a via pode ser modificada para a elevada produção de qualquer composto carotenóide particular de interesse. Tais compostos incluem, mas não se limitam a, a-criptoxantina, β-criptoxantina, ζ-caroteno, fitoflueno, neurosporano, etc. Utilizando os métodos do invento, qualquer composto de interesse na via dos carotenóides pode ser produzido a elevados níveis em órgãos de armazenamento seleccionados, tais como o fruto das plantas de ananás.

Opcionalmente, a via pode também ser manipulada para diminuir os níveis de um determinado carotenóide, p.ex., através da transformação da célula de ananás com sequências de ADN anti-sentido que previnam a conversão do composto precursor no carotenóide particular a regular.

Qualquer estratégia para a produção de uma planta de ananás que inclua, p.ex., um primeiro gene de interesse, ou 53

ΕΡ 1 589 807/PT ambos um primeiro e um segundo gene de interesse é opcionalmente utilizada no presente invento. Por exemplo, um segundo gene de interesse pode ser utilizado para transformar uma planta de ananás ao mesmo tempo que o primeiro gene de interesse é introduzido (co-transformação). Opcionalmente, o segundo gene de interesse pode ser introduzido numa planta de ananás que foi já transformada com um primeiro gene de interesse, ou alternativamente, plantas de ananás transformadas, uma expressando o primeiro gene de interesse e uma expressando o segundo gene de interesse, podem ser cruzadas para produzir descendência possuindo ambos os genes.

IX. FONTES DE EXPLANTES DE ANANÁS

Essencialmente qualquer variedade de ananás pode ser transformada de acordo com os métodos aqui descritos. Nalgumas concretizações, o material de explante de ananás é obtido a partir de variedades que são tipicamente utilizadas para consumo humano, incluindo as do grupo Cayenne Smooth, do grupo Spanish (p.ex., Red Spanish), do grupo Perolera, do grupo Pernambuco, e do grupo Primavera. A variedade mais importante para utilizar na produção de ananás enlatado, outros produtos processados de ananás, e ananás fresco é a Smooth Cayenne. Dentro de muitas destas variedades existe um grande número de clones que foi estabelecido em diferentes áreas geográficas, e que estão adaptados à produção nestas localizações. Entre os clones de Smooth Cayenne estão os clones de Champaka que foram utilizados extensivamente para produção de ananás enlatado e fresco. 0 explante inicial pode ser qualquer região meristemática de uma planta, incluindo os meristemas principais ou axilares (ápices) da planta antes da formação da flor, e os meristemas principais ou axilares da coroa do fruto. Estas regiões podem ser excisadas da planta e esterilizadas através de métodos padrão tais como aqui descritos e bem conhecidos dos vulgares peritos para estabelecer culturas estéreis num meio artificial. Tais culturas podem ser mantidas durante um período de tempo prolongado (p.ex., semanas, meses ou anos) através de uma série de passos de propagação. Meios adequados para estabelecimento e manutenção de culturas de rebentos in vitro 54

ΕΡ 1 589 807/PT são descritos, p.ex., em De Wald et al. (1988) Plant Cell Reports, 7: 535-537; Wakasa et al. (1978) Japan J. Breed 28: 113-121; Mathews e Rangan (1981) Sclentla Hort. 14: 227-234; Srinivasa et al. (1981) Sclentla Hort. 15: 23S-238; Fitchet (1990) Acta Hort. 275: 267-274; Bordoloi e Sarma (1993) J. Assam Science Society 35: 41-45; e Firoozabady e Moy (2003) "Regeneration of pineapple plants via somatic embryogenesis and organogenesis", In Vitro, no prelo.

Em certas concretizações do presente invento, as células de ananás que são o alvo para distribuição de ADN são primeiro obtidas a partir da porção basal das folhas (i.e., base das folhas) ou secções do caule dos rebentos de ananás criados in vitro, e proliferadas em cultura antes do passo de distribuição de ADN. Tal como aqui se utiliza, o termo "base da folha" refere-se à porção da folha que está ligada ao caule de um rebento de ananás.

Para indução de calo ou tecido embriogénico, ou calo ou tecido organogénico, explantes estéreis tais como folhas ou bases de folhas são transferidos para meios artificiais específicos que incluem combinações seleccionadas de hormonas vegetais sintéticas, que podem incluir, p.ex., auxinas, citocininas, giberelinas, e ácido abscísico. Para ilustrar, são tipicamente seleccionadas auxinas sintéticas a partir de, p.ex., picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloro-2-piridinocarboxílico), dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico), 2,4-D-(ácido 2,4-diclorofenoxiacético), ácido indol-3-acético (IAA), ácido indolbutírico (IBA), NAA (ácido 2-naftalenoacético), NOA (ácido naftoxiacético), ou semelhantes. Citocininas exemplares que podem ser utilizadas incluem, mas não se limitam a, BA (benziladenina) , BAP (benzilaminopurina), TDZ (tidiazuron), zeatina, cinetina, ou semelhantes. As culturas de células embriogénicas e organogénicas é bem conhecida na técnica. Por exemplo, detalhes adicionais relativos à cultura de células somáticas embriogénicas e outros aspectos que são adaptados para utilizar nos métodos do presente invento são proporcionados, p.ex., em Pat. U.S. No. 5952543, intitulado "GENETICALLY TRANS FORMED PINEAPPLE PLANTS AND METHODS FOR THE IR PRODUCTION", que foi concedida a 14 de Setembro de 1999 a Firoozabady et al. e nas referências aí citadas e Firoozabady 55

ΕΡ 1 589 807/PT et al. (2002) submetido a Molecular Breeding. Detalhes adicionais relativos à cultura de células organogénicas são descritos, p.ex., no Pedido Internacional Publicado No. WO 01/33943, intitulado "A METHOD OF PLANT TRANSFORMATION", por Graham et al., que foi publicado a 17 de Maio de 2001, Pat. U.S. No. 5908771, intitulada "METHOD FOR REGENERATION OF SALVIA SPECIES", que foi concedida a 1 de Junho de 1999 a Liu et al., Pat. U.S. No. 6242257, intitulada "TISSUE CULTURE PROCESS FOR PRODUCING A LARGE NUMBER OF VIABLE COTTON PLANTS IN VITRO", que foi concedida a 5 de Junho de 2001 a Tuli et al., Croy (Ed.) Plant Molecular Biology Labfax, Bios Scientific Publishers Ltd. (1993), Jones (Ed.) "Plant Transference and Expression Protocols", Humana Press (1995), e nas referências aí citadas.

Um perito na técnica reconhecerá que podem ser utilizados muitos tipos diferentes de células embriogénicas e organogénicas como células alvo para a distribuição de segmentos de ácido nucleico aqui descritos e selecção de eventos de transformação. Por exemplo, os segmentos de ácido nucleico do invento podem ser distribuídos às células da folha, da base da folha ou das secções do caule à medida que sofrem embriogénese ou organogénese. Mais, segmentos de ácido nucleico são opcionalmente distribuídos às células imediatamente após estas terem dado origem a calo ou tecido embriogénico ou calo ou tecido organogénico. Como opção adicional, os segmentos de ácido nucleico podem ser distribuídos a células embriogénicas ou organogénicas após o material embriogénico ou organogénico ter sido mantido e proliferado in vitro durante um período de tempo seleccionado.

X. DISTRIBUIÇÃO DO ADN DO SEGMENTO DE ÁCIDO NUCLEICO

As células de ananás transgénicas do presente invento são transformadas a vários estádios de desenvolvimento, p.ex., a vários estádios de organogénese ou embriogénese. Mais, os segmentos de ácido nucleico do invento podem ser introduzidos em células de ananás de vários modos reconhecidos na técnica. Numa perspectiva geral, métodos adequados de transformação de células vegetais incluem microinjecção (Crossway et al. (1986) BioTechnics 4: 320- 56

ΕΡ 1 589 807/PT 334), electroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 83: 5602-5606), transformação mediada por

Agrobacterium (Hinchee et ai. (1988) Biotechnology 6: 915- 921), aceleração de partículas balísticas ou bombardeamento de microprojécteis (Sanford et ai. Pat. U.S. No. 4945050/ e McCabe et ai. (1988) Biotechnology 6: 923-926), distribuição mediada por pólen (Zhou et al. (1983) Methods Enzymol. 101: 433, De Wet et al. (1985) em "The Experimental Manipulation of Ovule Tissues", Chapman et al. (Eds.), Longman, pág. 197;

Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. 107: 367; e Luo et ai. (1989) Plant Mol. Biol. Rep. 7: 69), transferência directa de ácidos nucleicos para protoplastos de células de ananás (Caboche et al. (1984) Comptes Rendus Acad. Sei. 299, série 3: 663), microinjecção (Crossway et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179 e Reich et al. (1986) Bio/technol. 4: 1001), macroinjecção de inflorescência (De la Pena et al. (1987)

Nature 325: 274), impregnação mediada por filamentos (Dunahay (1993) Biotechnics 15: 452-460 e Frame et al. (1994) The Plant Journal 6: 941-948), perfuração laser (Weber (1988)

Naturwissenschaften 75: 35), e ultra-sons (Zhang et al. (1991) Bio/technol. 9: 994).

Para melhor ilustrar, a transferência mediada por Agrobacterium é um sistema amplamente aplicável para introdução de genes em células vegetais porque os segmentos de ácido nucleico podem ser introduzidos em tecidos de plantas inteiras, evitando deste modo a necessidade de regeneração de uma planta intacta a partir de um protoplasto. A utilização de vectores de expressão mediada por Agrobacterium para introduzir ADN nas células vegetais é bem conhecida na técnica. Ver, p.ex., os métodos descritos por Fraley et al. (1985) Biotechnology, 3: 629 e Rogers et ai. (1987) Methods in Enzymology, 153: 253-277. Mais, a integração de ADN-T é um processo relativamente preciso resultando em poucos rearranjos. A região de ADN a transferir é definida através das sequências fronteira, e o segmento de ADN ou de ácido nucleico interveniente é habitualmente inserido no genoma da planta tal como descrito por Spielmann et al. (1986) Mol. Gen. Genet., 205: 34 e Jorgensen et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207: 471. 57

ΕΡ 1 589 807/PT

Os vectores de transformação de Agrobacterium modernos tais como os discutidos acima são capazes de replicação em E. coli bem como Agrobacterium, permitindo manipulações convenientes tal como descrito por Klee et al., em "Plant DNA Infectious Agents", Hohn e Schell, (Eds.)/ Springer-Verlag (1985) págs. 179-203.

Além disso, avanços tecnológicos recentes em vectores para transferência de genes mediada por Agrobacterium melhoraram a disposição dos genes e locais de restrição nos vectores para facilitar a construção de vectores capazes de expressar vários genes codificando polipéptidos. Por exemplo, os vectores descritos por Rogers et al. (1987) Methods in Enzymology, 153: 253, têm regiões multi-ligadoras convenientes flanqueadas por um promotor e um local de poliadenilação para expressão directa de genes codificando polipéptidos inseridos e são adequados para os presentes fins. Os vectores adequados são descritos em maior detalhe acima.

Em certas concretizações do invento, segmentos heterólogos de ácido nucleico são introduzidos utilizando estirpes de Agrobacterium possuindo o ADN exógeno num elemento de ADN-T. 0 elemento de ADN-T recombinante pode ser parte de um plasmídeo Ti que contém as funções de virulência necessárias para distribuição de ADN de células de Agrobacterium para células vegetais, ou o elemento de ADN-T pode estar presente num plasmídeo distinto de outro plasmídeo possuindo as funções de virulência (referidos como vectores binários). Uma variedade destes vectores binários, capazes de se replicarem tanto em E. coli como Agrobacterium, é descrita nas referências citadas acima. Num método de co-cultura, a Agrobacterium é criada até uma concentração de 2-7χ108 células/ml e é diluído até 1-6χ108 células/ml, de preferência 2-5χ108 células/ml antes da co-cultura. A Agrobacterium é tipicamente co-cultivada durante 1-5 dias, de preferência durante 2-3 dias com tecidos de ananás.

Estirpes de Agrobacterium adequadas incluem Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes. Embora possam ser utilizadas estirpes de tipo selvagem, derivados "desarmados" de ambas as espécies, nos quais as sequências 58

ΕΡ 1 589 807/PT indutoras de tumores do plasmídeo Ti foram removidas, são preferidos. Estirpess de Agrobacterium tumefaciens adequadas incluem, p.ex., EHA101, tal como descrito por Hood et al. ((1986) J. Bacteríol., 168: 1291-1301), LBA4404, tal como descrito por Hoekema et al. ((1983) Nature, 303: 179-80), e C58(pMP90), tal como descrito por Koncz e Schell ((1986) Mol. Gen. Genet., 204: 383-96). Uma estirpe de Agrobacterium rhizogenes preferida é 15834, tal como descrito por Birot et al. {Blochem., 25: 323-35).

Os tecidos ou calos embriogénicos ou organogénicos de ananás e as células de Agrobacterium possuindo o segmento de ADN são co-cultivados num meio de cultura adequado para permitir a transferência do ADN-T para as células vegetais. Após a estirpe de Agrobacterium possuindo o segmento de ácido nucleico ter sido preparada, é habitualmente cultivada antes da incubação com o calo ou tecido. O Agrobacterium pode ser cultivado em meio sólido ou liquido de acordo com métodos bem conhecidos dos peritos na técnica. Ver, p.ex., Pat. U.S. No. 5262316.

Como opções adicionais, a transformação de protoplastos vegetais pode ser alcançada utilizando métodos baseados em precipitação em fosfato de cálcio, tratamento com polietilenoglicol, electroporação e combinações destes tratamentos. Ver, p.ex., Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet., 199: 183; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet., 199: 178; Fromm et al. (1986) Nature, 319: 791; Uchimiya et al. (1986) Mol. Gen. Genet., 204: 204; Callis et al. (1987) Genes and Development, 1: 1183; Marcotte et ai. (1988) Nature, 335: 454; Wang et al. (1992) Bio/Technology, 10: 691-696; e Fennell et al. (1992) Plant Cell Reports, 11: 567-570.

Para transformar espécies vegetais que não podem ser regeneradas com sucesso a partir de protoplastos, podem ser utilizados outros modos para introduzir segmentos de ácido nucleico em células ou tecidos intactos. Por exemplo, pode ser utilizado um "canhão de partículas" ou tecnologia de microprojécteis de elevada velocidade. Utilizando tal tecnologia, segmentos de ácido nucleico são transportados através da parede celular para o citoplasma na superfície de pequenas partículas metálicas tal como descrito em Klein et 59

ΕΡ 1 589 807/PT al. (1987) Nature, 327: 70/ Klein et ai. (1988) Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A., 85: 8502; e McCabe et ai. (1988)

Biotechnology, 6: 923; e Vasil et al. (1992) Bio/Technology, 9: 667-674. As partículas metálicas penetram através de várias camadas de células e permitem assim a transformação de células dentro de explantes de tecido. A transformação de explantes de tecido elimina a necessidade de passagem através de um estádio de protoplasto e acelera assim a produção de plantas transgénicas.

Segmentos de ácido nucleico podem também ser introduzidos em plantas através da transferência directa de ADN para pólen tal como descrito por Zhou et al. (1983)

Methods in Enzymology, 101: 433; Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. , 107: 367; Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Repórter, 6: 165. A expressão de genes codificando polipéptidos pode ser obtida através de injecção do segmento de ácido nucleico em órgãos reprodutivos de uma planta tal como descrito por Pena et al. (1987) Nature, 325: 274. Os segmentos de ácido nucleico podem também ser injectados directamente nas células de embriões imaturos e a reidratação de embriões dessecados tal como descrito por Neuhaus et ai. (1987) Theor. Apl. Genet., 75: 30; e Benbrook et al., em

Proceedings Bio. Expo. 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., págs. 27-54 (1986).

Alternativamente, pode ser transformado directamente um plasto vegetal. A transformação estável de cloroplastos foi relatada em plantas superiores, ver, p.ex., Svab et ai. (1990) Proc. Nat '1. Acad. Sei. USA 87: 8526-8530; Svab et al. (1993) Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 90: 913-917; Staub et al. (1993) Embo J. 12: 601-606. 0 método utiliza a distribuição por canhão de partículas de segmentos de ácido nucleico contendo um marcador seleccionável e direccionamento do ácido nucleico para o genoma do plasto através de recombinação homóloga. Em tais métodos, a expressão de genes no plasto pode ser alcançada através da utilização de um promotor de um gene do plasto através de transactivação de um transgene silencioso originário do plasto posicionado para expressão a partir de uma sequência promotora selectiva tal como a reconhecida pela ARN-polimerase T7. O gene silencioso do plasto é activado através de expressão da ARN-polimerase 60

ΕΡ 1 589 807/PT específica a partir de uma construção de expressão nuclear e direccionamento da polimerase para o plasto através da utilização de um péptido de trânsito. A expressão específica do tecido pode ser obtida num tal método através da utilização de uma ARN-polimerase codificada no núcleo e dirigida para o plasto expressa a partir de um promotor específico de tecido vegetal adequado. Um tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei.,· USA 91: 7301-7305.

XI. REGENERAÇÃO E MICROPROPAGAÇÃO DE PLANTAS DE ANANÁS TRANSGÉNICAS

Após distribuição de segmentos de ácido nucleico, as células embriogénicas ou organogénicas são tipicamente transferidas para meios que podem incluir um agente selectivo (p.ex., um herbicida ou semelhante) que é capaz de prevenir o crescimento de células de ananás que não receberam um gene (p.ex., um marcador seleccionável) cujo produto de expressão é capaz de impedir a acção do agente selectivo. Os marcadores seleccionáveis são descritos mais acima. Após um período de cultura, o calo ou tecido embriogénico ou organogénico que continua a crescer normalmente é separado do calo ou tecido embriogénico ou organogénico cujo crescimento foi retardado ou terminado. A regeneração de plantas a partir de simples protoplastos vegetais ou de vários explantes é bem conhecida na técnica. Ver, p.ex., Weissbach et al. (Eds.), "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, Inc. (1988). Em certas concretizações, o processo de regeneração e crescimento inclui os passos de selecção de células e rebentos transformados, enraizamento dos rebentos transformados e crescimento das plântulas no solo. Para ilustrar. Para ilustrar, a regeneração de plantas contendo um gene introduzido por Agrobacterium a partir de explantes de folhas pode ser alcançada tal como descrito por Horsch et al. (1985) Science, 227: 1229-1231. Neste procedimento, os transformantes são criados na presença de um agente de selecção e num meio que induza a regeneração de rebentos na espécie vegetal a transformar tal como descrito por Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80: 4803. Este 61

ΕΡ 1 589 807/PT procedimento produz tipicamente rebentos em duas a quatro semanas e estes rebentos transformados são então transferidos para um meio de indução de raízes apropriado contendo o agente selectivo e um antibiótico para prevenir o crescimento bacteriano. Para o ananás, as bases das folhas podem ser utilizadas para produzir materiais organogénicos (Firoozabady e Moy (2003) "Regeneration of pineapple plants via somatic embryogenesis and organogenesis", In Vitro, no prelo), e depois estes materiais podem ser expostos a Agrobacterium para produzir, após selecção talvez, materiais organogénicos transgénicos. Estes materiais são então induzidos a produzir rebentos e plantas completas. Em certas concretizações, a transformação de calos embriogénicos é preferida para a formação de rebentos de planta transformados. Os rebentos transformados que enraizaram na presença do agente selectivo para formar plântulas são então transplantados para o solo ou outros meios para permitir a produção de raízes.

Detalhes adicionais relativos à regeneração de plantas, micropropagação, e outros aspectos que são adaptados para utilizar nos métodos do presente invento são proporcionados, p. ex., em Pat. U.S. No. 5952543 e WO 01/33943 (referenciada acima), Pat. U.S. Nos. 5591616, 6037522, Pedidos de Pat. Europeia No. 604662 (Al) e 672752 (Al), e WO 01/12828. Ver também, Kyte et al., "Plants from Test Tubes: An Introduction to Micropropagation", Timber Press, Inc. (1996), Hudson et al., "Hartmann and Kester's Plant Propagation: Principies and Practices" 7a Ed., Pearson Education (2001), Bajaj (Ed.) "High-Tech and Micropropagation I", Springer-Verlag New York, Inc. (1992), Jain, "In Vitro Haploid Production in Higher Plants", Kluwer Academic Publishers (1996), e Debergh et al. (Eds.), "Micropropagation: Technology and Application". Kluwer Academic Publishers (1991).

Opcionalmente, os polipéptidos biossintéticos de carotenóides do invento podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células de ananás transformadas ou de tecidos de plantas de ananás transformadas (p.ex., tecidos de fruto ou semelhante) através de qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica, incluindo sulfato de amónio ou precipitação em etanol, extracção com ácido, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia de 62

ΕΡ 1 589 807/PT fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite, e cromatografia de lectina. Nalguns casos será necessário que a proteína seja redobrada para recuperar um produto funcional. Além das referências observadas supra, uma variedade de métodos de purificação é conhecida na técnica, incluindo, p.ex., os expostos em Sandana, "Bioseparation of Proteins", Academic Press, Inc. (1997); e Bollag et al., Protein Methods, 2a Ed., Wiley-Liss, NY (1996); Walker, "The Protein Protocols Handbook", Humana Press, NJ (1996); Harris e Angal, "Protein Purification Applications: A Practical Approach", IRL Press (1990); Scopes, "Protein Purification: Principies and Practice", 3a Ed., Springer Verlag (1993); e Janson et al., "Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications", 2a Ed., Wiley-VCH (1998).

XII. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar o invento reivindicado.

Os meios são designados com letras e números; as letras referem-se aos componentes dos meios utilizados, seguidas de um número que indica a concentração do componente particular. Por exemplo, B2N2 é um meio MS que contém 6-benzilamino-purina (BA ou B) e ácido α-naftalenoacético (NAA ou N) . Detalhes mais específicos relativos às composições dos meios referidos nestes exemplos, incluindo concentrações dos componentes, são proporcionados abaixo. EXEMPLO 1: INTRODUÇÃO DO GENE DA FITOENO-SINTE TASE (PSY) DE TANGERINA EM ANANÁS (LINHA TRANSGÉNICA 16.5.9)

1. ISOLAMENTO DO GENE PSY DE CITRUS i. Desenho dos iniciadores

Foram desenhados dois iniciadores com base na informação da sequência de PSY-Naval (No. de Entrada Gi 5959859):

Iniciador directo PSY-F: 5'-aaa ctg cag atg tct gtt aca ttg ctg tgg-3' 63

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Iniciador inverso PSY-R: 5'-gat ate tta age ctt act ggt ata tat tet tg-3'

ii. Isolamento do ARN ARN total foi extraído a partir de tecido da folha de Tangerina com solução de Trizol (Invitrogen, Inc., CA, USA). A extraeção foi efectuada de acordo com o procedimento do fabricante. iii. Reacção de Transcrição Reversa A transcrição reversa foi realizada com 1 pg de ARN total e 1 μΐ de iniciador PSY-R 10 μΜ em 20 μΐ de volume reaccional.

iv. PCR para isolar o gene PSY A PCR foi efectuada com seguinte reacção: PSY-F (10 μΜ): PSY-R (10 μΜ):

Reacção reversa: DNTP (10 mM): tampão 10*: ADN-polimerase Pfu: Água até O Programa de PCR foi: desnaturar. Depois, 35 ciclos 92°C durante 30 segundos 55°C durante 20 segundos 72°C durante 1,5 min. v. Clonagem do fragmento s iniciadores PSY-F e PSY-R na 1 μΐ 1 μΐ 1 μΐ 1 μΐ 2,5 μΐ 0,2 μΐ 25 μΐ

92 °C durante 2 minutos para de: de PCR O produto ou fragmento da reacção de PCR foi corrido num gel de Agarose a 0,8%. O fragmento de PCR foi cortado e purificado utilizando o estojo de purificação em gel de Qiagen (Qiagen, Inc., CA, USA). O fragmento foi então clonado no vector pGEM-Teasy (Promega Corp., WI, USA). A sequenciação foi feita utilizando os iniciadores T7 e M13-R. 64

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2. ESTABELECIMENTO DE CULTURAS DE REBENTOS

Meristemas isolados de coroas de ananases Del Monte Gold MD-2 criados no campo na Costa Rica foram utilizados para estabelecer culturas de rebentos. Resumidamente, folhas das coroas foram removidas à mão e descartadas, o centro ou o caule da coroa (»3x5 cm) foi lavado em água, a superfície esterilizada com Clorox a 33% mais Tween 20 a 0,05% com agitação durante 25 minutos e lavado duas vezes em água estéril. Os meristemas laterais e o meristema da ponta da coroa foram excisados do centro através da remoção das folhas primárias uma a uma, flamejando os utensílios frequentemente. O explante do meristema da ponta da coroa incluindo a cúpula do meristema, 2-3 pequenas folhas primárias, e 1 cm3 do centro do caule foram colocados no meio de cultura de rebentos B2N21CC. Os meristemas laterais foram também isolados juntamente com 1 cm3 do centro do caule e cultivados no mesmo meio. CC (500 mg/1 de cada de carbenecilina e cefotaxime) foram utilizados para matar a contaminação microbiana endógena. As culturas foram incubadas sob luz contínua a 28 °C. Nove dias após o início da cultura, os tecidos foram subcultivados em B2N2+N. Foi utilizada Nistatina (N, 40 mg/1) para matar contaminações endógenas de leveduras e fungos. Após 20 dias, as folhas da ponta da coroa tinham crescido, estas foram removidas para promover o crescimento do meristema da ponta da coroa e foram transferidas para meio fresco B2N2+NA. Foi também utilizada Ampicilina B (A, 5 mg/1) para matar quaisquer contaminações de leveduras e fúngicas endógenas residuais. Após mais duas semanas, estavam formadas gemas (2-3 por explante) e subsequentemente foram produzidos novos pequenos rebentos para formar um grupo de rebentos. Após um total de 4 meses desde o início da cultura, os grupos de rebentos foram transferidos e mantidos em meio B1.5N.5 líquido com subcultura mensal.

3. PRÉ-TRATAMENTO DE EXPLANTES PARA CQ-CULTURA COM AGROBACTERIUM

Os rebentos que cresceram rapidamente foram utilizados como explantes. As pontas das folhas longas (> 15 mm) foram 65

ΕΡ 1 589 807/PT cortadas para proporcionar explantes mais pequenos. Os rebentos foram cortados longitudinalmente em 4-6 secções e pré-tratados (cultivados) em P10T1.1B6 (contendo polpa de banana a 6%) durante 8 dias. Secções da base das folhas e do centro foram preparadas e foram misturadas com Agrobacterium para co-cultura.

4. CULTURA E PREPARAÇÃO DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS A estirpe de Agrobacterium tumefaciens GV3101 contendo um sistema vector binário foi utilizada para transformação. O sistema vector incluiu o vector pDM compreendendo um gene surB para conferir resistência a clorsulfuron, e o gene psy para expressão do gene da fitoeno-sintetase. As bactérias foram tiradas de glicerol congelado, cultivadas e mantidas em meio Caldo L solidificado com Bactoagar a 1,5% contendo 10 mg/1 de tetraciclina. Um dia antes da co-cultura, as bactérias foram raspadas do meio sólido utilizando uma ansa e suspensas em meio MinAsuc liquido e cultivadas durante um dia num agitador (120 rpm) a 28°C. A concentração de bactérias foi determinada, utilizando um espectrofotómetro (Beckman DU-50) antes da co-cultura, e mostrou-se ser de 4*108 células/ml.

5. CO-CULTURA EM MEIO DE CO-CULTURA

As bactérias foram misturadas na razão de volumes de 4:1 (tecido vegetal:células de Agrobacterium) com 170 secções da base das folhas e do centro, o tecido foi seco com papel absorvente e a mistura foi colocada em círculos de filtro de vidro estéril Fisherbrand G6 de 7,0 cm sobre o meio de co-cultura P10T2.2As300. As placas foram seladas com parafilme e colocadas numa incubadora de ambiente controlado a 24°C no escuro durante 3 dias.

6. RECUPERAÇÃO, SELECÇÃO, E REGENERAÇÃO DE PLANTAS

Após a co-cultura, os tecidos foram transferidos (15-20 peças/placa) para meio de recuperação P10T1.lCarb500 durante um período de recuperação de 7 dias sob condições de pouca luz (16 h/dia). Os explantes foram então transferidos para meio de selecção P10T2.2Carb300CS5 durante 17 dias depois 66

ΕΡ 1 589 807/PT para PI0T2.2Carb500CS5 à medida que era observado crescimento bacteriano e incubados sob elevada intensidade luminosa (16 h/dia). Foi utilizada carbenicilina para matar a Agrobacterium residual e clorsulfuron (CS) para seleccionar as células transformadas. Em meio de selecção, a maioria dos tecidos tornou-se castanha em 3-6 semanas, no entanto, ocasionalmente alguns sectores dos tecidos permaneceram saudáveis e começaram a produzir tecido morfogénico saudável verde. Os tecidos morfogénicos produziram rebentos transgénicos em meio B3N.2Carbl00CS10 em 30 dias. Estes foram então transferidos para BlCarblOOCSlO para alongarem. Alguns dos rebentos foram vitrifiçados, os quais foram então transferidos para BlAl%Carbl00CS10 durante 14 dias para produzir rebentos normais alongados.

7. CONFIRMAÇÃO DA TRANSFORMAÇÃO

Os rebentos foram confirmados estarem transformados através de vários meios: 1. os rebentos ou primórdios de rebentos resistentes a CS permaneceram saudáveis e verdes a niveis letais de CS, 2. os rebentos ou primórdios de rebentos resistentes a CS foram amostrados (2-5 mg/peça resistente) para um ensaio de GUS. Os tecidos transformados coraram de azul e os tecidos não transformados não coraram de azul. Os tecidos podem também ser testados molecularmente quanto à transformação utilizando, p.ex., PCR e análise Southern blotting.

8. MICROPROPAGAÇÃO E PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÉNICAS

Rebentos individuais ou pequenos grupos de rebentos foram transferidos para 15 ml de meio liquido BlCarbl00CS20 em cubos GA-7 (2-3 grupos/cubo) para propagação e crescimento. Opcionalmente, 30 dias depois, os grupos de rebentos podem ser micropropagados e mantidos em B1.5N.5CS20 (não contendo agentes contra-selectivos) durante vários meses. Os rebentos individuais (4-6 cm de comprimento) foram separados e cultivados em meio liquido de enraizamento N.5IBA.5CS10 ou N.5IBA.5CS20 (não contendo agentes contra-selectivos) durante 2-4 semanas para produzir plantas completas. As plantas podem então ser transplantadas para o 67

ΕΡ 1 589 807/PT solo, endurecido gradualmente e transferidas para as condições de estufa. EXEMPLO 2: INTRODUÇÃO DO GENE DA FITOENO-SINTE TASE (PSY) DE TANGERINA EM ANANÁS (13.18.2)

1. ISOLAMENTO DO GENE PSY DE CITRUS O mesmo que no Exemplo 1.

2. PREPARAÇÃO DOS TECIDOS FONTE i. Estabelecimento de culturas de rebentos O mesmo que no Exemplo 1. ii. Pré-tratamento de explantes para co-cultura com Agrobacterium

Os rebentos que cresceram rapidamente cultivados como acima durante 4 meses foram utilizados como explantes. As pontas das folhas longas (>15 mm) foram cortadas para proporcionar explantes menores. Os rebentos foram cortados longitudinalmente em 3-8 secções e pré-tratados (cultivados) em meio P2T10A durante 10 dias. Foram preparadas secções das bases das folhas e do centro que foram pré-tratadas no mesmo meio durante 62 dias antes da transferência para outro meio de pré-tratamento. As secções com tecidos morfogénicos contendo primórdios de rebentos foram subcultivadas em meio T1.1I.1 durante 24 dias. Os tecidos organogénicos foram então subcultivados em meio B3N.2 durante 22 dias, depois foram cortados em secções de 3-5 mm e colocados em meio B2N2 durante 7 dias, e depois misturados com Agrobacterium para co-cultura.

3. CULTURA E PREPARAÇÃO DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS A estirpe GV3101 de Agrobacterium tumefadens contendo os vectores binários, que é referida acima, foi utilizada para transformação. Tal como mencionado, o vector pDM contém o gene surB, que confere resistência a clorsulfuron e o gene psy expressa o gene da fitoeno-sintetase. As bactérias foram 68

ΕΡ 1 589 807/PT tiradas do glicerol congelado, cultivadas e mantidas em meio Caldo L solidificado com Bactoagar a 1,5% contendo 10 mg/1 de tetraciclina. Um dia antes da co-cultura, as bactérias foram raspadas do meio sólido utilizando uma ansa e suspensas em meio liquido MinAsuc e cultivadas durante um dia num agitador (120 rpm) a 28°C. A concentração de bactérias foi determinada, utilizando um espectrofotómetro (Beckman DU-50) antes da co-cultura, e mostrou-se ser de 1,7><109 células/ml.

4. CO-CULTURA EM MEIO DE CO-CULTURA

As bactérias foram misturadas na razão de volumes de 4:1 (tecido vegetal:células de Agrobacterium), o tecido foi seco com papel absorvente, e a mistura foi colocada em círculos de filtro de vidro estéril Fisherbrand G6 de 7,0 cm sobre o meio de co-cultura B3N.2AS300. As placas foram seladas com parafilme e colocadas numa incubadora de ambiente controlado a 24°C no escuro durante 3 dias.

6. RECUPERAÇÃO, SELECÇÃO, E REGENERAÇÃO

Após a co-cultura, os tecidos foram transferidos (20-25 peças/placa) para meio de recuperação B3N.2Carb500 e B3N.2CEF400 durante um período de recuperação de 7 dias sob condições de pouca luz (16 h/dia) . Os explantes foram então transferidos para meio de selecção B2N2CEF400CS5 sob elevada intensidade luminosas (16 h/dia) durante 25 dias e depois para B3N.2CEF400CS5 com subcultura mensal a partir daí. Foi utilizado cefotaxime para matar a Agrobacterium residual e clorsulfuron (CS) para seleccionar as células transformadas. Em meio de selecção, a maioria dos tecidos tornou-se castanha em 4-6 semanas, no entanto, dois sectores dos tecidos permaneceram saudáveis e começaram a crescer para produzir tecido morfogénico saudável verde. As plantas foram regeneradas tal como descrito no Exemplo 1.

6. CONFIRMAÇÃO DA TRANSFORMAÇÃO O mesmo que no Exemplo 1.

69 ΕΡ 1 589 807/PT 7. MICROPROPAGAÇÃO E PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÉNICAS O mesmo que no Exemplo 1.

COMPOSIÇOES DOS MEIOS

Asuc Mínimo = MinAsuc fosfato de potássio dibásico fosfato de potássio monobásico sulfato de amónio citrato de sódio di-hidrato sulfato de magnésio hepta-hidrato glicose preferido 10.5 g/1 4.5 g/1 1.0 g/1 0,5 g/1 247 rng/1 2.0 g/1 intervalo 5-20 g/1 2-8 g/1 0,5-3 g/1 0-2 g/1 0- 1000 g/1 1- 30 g/1

MinAsuc MinA mas com sacarose em vez de glicose.

Caldo L: Triptona 10 g/1 Extracto de Levedura 5 g/1 NaCl 5 g/1 Glicose 1 g/1 pH 7,0-7,2 Bacto Agar 15 g/1

Para os meios de cultura de tecidos, o pH deve estar no intervalo de cerca de 5-7,5, de preferência cerca de 5,6. O meio é utilizado após esterilização através de autoclavagem, excepto quanto a componentes específicos que são esterilizados por filtração e depois adicionados após a autoclavagem.

MS Sais MS vitaminas B5 Sacarose MES Gel-rite® PH 1χ 1χ 30 g/1 600 mg/1 2,5 g/1 5,7 70

ΕΡ 1 589 807/PT BI.5N.5

Meio MS + BA NAA 1,5 mg/1 0,5 mg/1 B2N2 Meio MS + BA NAA 2 mg/1 2 mg/1 B2N2 + CC Meio MS + BA NAA Carbenicilina Cefotaxime 2 mg/1 2 mg/1 500 mg/1 500 mg/1 B2N2CEF400CS5 Meio MS + BA NAA Cefotaxime Clorsulfuron 2 mg/1 2 mg/1 400 mg/1 5 gg/l B2N2 + N B2N2 + Nistatina 40 mg/1 B2N2 + NA Meio B2N2 + Nistatina Amfotericina B 40 mg/1 5 mg/1 B3N.2 MS + BA NAA 3 mg/1 0,2 mg/1 B3N.2AS300 B3N.2 + Acetoseringona 300 μΜ 71

ΕΡ 1 589 807/PT Β3Ν.2CARB500 B3N.2 + Carbenicilina 500 mg/1 B3N.2CEF400 B3N.2 + Cefotaxime 400 mg/1 B3N.2CEF400CS5 B3N.2Cef400 + Clorsulfuron 5 gg/l Ρ2Τ10Α MS com agar em vez de Gel-rite +

Picloram Tidiazuron 2 mg/1 10 mg/1 P10T1.1B6 MS + Picloram Tidiazuron Polpa de Banana 10 mg/1 1,1 mg/1 6 % P10T1.1CARB500 MS + Picloram Tidiazuron Carbenicilina 10 mg/1 1,1 mg/1 500 mg/1 P10T2.2 MS + Picloram Tidiazuron P10T2.2A 10 mg/1 2,2 mg/1 P10T2.2 com agar em vez de gel-rite P10T2.2AS300 MS + Picloram Tidiazuron Acetoseringona 10 mg/1 2,2 mg/1 300 μΜ 72

ΕΡ 1 589 807/PT P10T2.2CARB300CS5 MS + Picloram 10 mg/1 Tidiazuron 2,2 mg/1 Carbenicilina 300 mg/1 Clorsulfuron 5 gg/l P10T2.2CARB500CS5 MS + Picloram 10 mg/1 Tidiazuron 2,2 mg/1 Carbenicilina 500 mg/1 Clorsulfuron 5 gg/l PI0B. 5 MS + Picloram 10 mg/1 BA 0,5 mg/1 N.5I.5 LÍQUIDO MS sem Gel-rite + NAA 0,5 mg/1 IBA 0,5 mg/1 TI . 11.1 MS + Tidiazuron 1,1 mg/1 IBA 0,1 mg/1

Lisboa, 2012-01-23

Claims

ΕΡ 1 589 807/PT 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Método de controlo da acumulação de carotenóides em pelo menos uma célula de ananás, o método compreendendo a introdução de pelo menos um regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides na referida célula de ananás, em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides inibe a expressão de (i) uma licopeno-p-ciclase ou (ii) uma licopeno-p-ciclase e uma licopeno-s-ciclase na referida célula de ananás, e em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides compreende (i) um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-p-ciclase ou (ii) um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-p-ciclase, e um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-ε-ciciase.
2. Método de controlo da acumulação de carotenóides em pelo menos uma célula de ananás da reivindicação 1, em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides inibe a expressão de uma licopeno-p-ciclase e uma licopeno-ε-ciclase na referida célula de ananás, e em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides compreende um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-p-ciclase, e um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-s-ciclase.
3. Método da reivindicação 1, em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides controla a acumulação de licopeno. ΕΡ 1 589 807/PT 2/4
4. Método da reivindicação 1, em que a referida célula de ananás é uma célula organogénica produzida através da cultura de pelo menos uma célula meristemática não apical.
5. Método de alteração da coloração de uma planta de ananás, o método compreendendo a introdução de pelo menos um regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides em pelo menos uma planta de ananás, em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides controla a acumulação de pelo menos um carotenóide colorido na referida planta de ananás, alterando deste modo a referida coloração da referida planta de ananás, e em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides inibe a expressão de (i) uma licopeno-p-ciclase ou (ii) uma licopeno-p-ciclase e uma licopeno-s-ciclase e compreende (i) um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-p-ciclase ou (ii) um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-p-ciclase, e um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-e-ciclase.
6. Método de alteração da coloração de uma planta de ananás da reivindicação 5, em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides inibe a expressão de uma licopeno-p-ciclase e uma licopeno-ε-ciclase e compreende um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-β-ciclase, e um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-ε-ciclase.
7. Método da reivindicação 1, 2, 5 ou 6, em que a referida inibição da expressão é através de interferência de ARN. ΕΡ 1 589 807/PT 3/4
8. Método da reivindicação 5, em que o referido carotenóide colorido é licopeno.
9. Método da reivindicação 5, em que o referido requlador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides é introduzido em pelo menos uma célula de ananás a partir da qual a referida planta de ananás é reqenerada.
10. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o referido requlador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides controla a acumulação de carotenóides na referida célula de ananás através do aumento da acumulação de licopeno.
11. Célula de ananás que compreende pelo menos um regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides heterólogo, regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides que inibe a expressão de (i) uma licopeno^-ciclase ou (ii) uma licopeno-β-ciclase e uma licopeno-s-ciclase na referida célula de ananás, e compreende (i) um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-β-ciclase ou (ii) um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-β-ciclase, e um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno ε-ciclase.
12. Célula de ananás da reivindicação 11, em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides inibe a expressão de uma licopeno^-ciclase e uma licopeno-s-ciclase na referida célula de ananás, e compreende um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno^-ciclase, e um segmento de ácido nucleico numa orientação com sentido ou anti-sentido para pelo menos uma porção de um gene endógeno que codifica a referida licopeno-ε-ciclase. ΕΡ 1 589 807/PT 4/4
13. Célula de ananás da reivindicação 12, em que a referida inibição da expressão é através de interferência de ARN.
14. Célula de ananás da reivindicação 11, em que o referido regulador da expressão de polipéptidos biossintéticos de carotenóides controla a acumulação de licopeno.
15. Planta de ananás que é regenerada a partir da referida célula de ananás de qualquer uma das reivindicações 11 a 14. Lisboa, 2012-01-23