CN101407807B - 对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对染色体进行加工处理而改变细胞遗传特性的方法，包括用微束光切割染色体和用微束光转运切割后的染色体或其片段的步骤，用微束光对切割后的染色体或片段进行焊接的步骤，进一步还可包括将焊接后的染色体或片段转入受体细胞的步骤。本发明提供的方法简单、操作方便，无需像常规方法那样为每一次切割或连接设计专门的酶，对染色体的处理和其他操作在无任何机械性接触下进行，可最大限度地保持所处理和转运的染色体的既有状态与结构。本发明方法可用于对染色体进行修复；或除去有缺陷的染色体；或是构造出新型结构的染色体，从而使有关病变物种恢复正常的生命活动；或获得品质优良的新物种。

Description

对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法及其应用

技术领域

本发明属于细胞遗传学技术领域，特别涉及一种对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法及其应用。

背景技术

染色体是遗传物质的载体，由核酸和蛋白质组成。控制自然界各种物种的形态、生理和生化等特征的结构基因呈直线排列在染色体上。每一个染色体含有一个脱氧核糖核酸(DNA)分子，每个DNA分子含有很多个基因。染色体的DNA分子中含有四种核苷酸，核苷酸排列顺序的不同决定了遗传信息的差异。对于自然界的各种物种来说，每一物种的染色体的结构及数目是相对稳定的。基因控制着该物种的所有生命活动，且特定的基因控制特定生命活动的某一环节。如果某一物种的染色体发生变异(如点突变、数目异常、移位、转位、倒置、镶嵌等)，或出现缺陷缺失，其生命活动与生命表现也将不正常。另一方面，如将某一物种的染色体或染色体片段转移到其他生物细胞内，则可能使受体细胞表现出该供体物种的某些生理活动和表型。受体生物也便能产生具有供体特征的生物分子、细胞、组织和器官，从而改变受体生物的遗传特性。此外，如果改变细胞的染色体结构或数目，也会改变其遗传特性。由于一个复杂的生理现象，往往是多个基因共同作用的结果，单个基因可能只对现象中的某一环节发生作用，而一段染色体便为一个或多个基因群，故染色体技术比基因技术更能完整地改变生物的遗传特性。在转基因技术广泛用于改变生物遗传特性、产生新的物种或用于治疗基因缺陷疾病的今天，可以期望，染色体技术将会比转基因技术在各个方面有更广泛的应用。

但是目前的染色体技术相当复杂，比如要获取一段染色体，早期的技术需要先期埋下可以用来切割的位点，再采用某些酶的作用以实现对有关DNA核苷酸序列进行切割与连接。由于每一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且只能在特定的位点上切割DNA分子，故这种技术的使用有很大的局限性。目前使用更多的方法的是微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)，这种技术把供体细胞用秋水仙胺和细胞松弛素B处理，制备成含有一条或几条染色体的微囊，然后再将微囊与受体细胞融合，从而把微囊内的染色体转移到受体细胞。类似的办法还有细胞拆合技术。这些技术在操作时也存在不容忽视的缺陷，如难以控制和获得所需要的染色体、不能修复处理和不能除去有缺陷的染色体等。为此，人们试图以微束的激光作为剪切工具对染色体进行切割。尽管用激光可对各种染色体或染色体的各个部位进行剪切，但到目前为止，仅限于将某些染色体片段剪切下来移走用于作克隆，或作DNA转移，而未见报道可对染色体的变异或缺失进行修复处理或补充正常的技术。可以设想，如能对变异的染色体加以修复，该生物细胞也便可恢复其正常的生命活动与功能。而且，如果将某些特定的外源染色体或染色体片段转入受体细胞，使其基因得以表达并在细胞分裂中逐代传递，就可改变受体细胞的生物遗传特性，获得新的物种细胞。这些技术，无论是科学上还是应用上，都有十分重要的意义与作用。

发明内容

本发明的目在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法。

本发明的另一目的在于提供上述对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，包括用微束光切割染色体和用微束光转运切割后的染色体或片段步骤，其特征在于：包括用微束光对切割后的染色体或片段进行焊接步骤。

上述对切割后染色体或片段进行焊接是将两要焊接起来的染色体或染色体片段转运到一起并使两要焊接部位对接，然后将微束光在能量密度为5×10⁵J/m²～200×10⁶J/m²的情况下，对准要焊接部位持续照射1～80秒。

上述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，还可包括将焊接后的染色体或片段转入受体细胞。

上述将焊接后的染色体或片段转入受体细胞可以采用两种方法实现：

方法一

首先采用能量密度为10×10⁶J/m²～400×10⁶J/m²的微束光在受体细胞上打孔，然后采用功率密度为10×10⁹W/m²～200×10⁹W/m²的微束光挟带选定的染色体或片段通过打出的小孔导入受体细胞。

方法二

将焊接后的染色体或片段转入受体细胞包括下述步骤：首先采用能量密度为10×10⁶J/m²～400×10⁶J/m²的微束光在受体细胞上打孔，然后采用微管操控技术将选定的染色体或片段吸入微管，将微管对准由微束光打出的小孔，将选定的染色体或片段导入受体细胞；或者，直接将微管插入受体细胞，将选定的染色体或片段射入。

上述方法二种中所述的微管操控技术是在微动操控仪协助下，通过内径为0.2～100微米的微管，对微小物体或微量液体进行吸入或射出的操控作用。

上述用微束光切割染色体是采用微束光，选定要切割的染色体部位，将光束焦点聚焦到染色体上，根据要处理处理的染色体的性质和粗细的不同，在能量密度为10×10⁶J/m²～400×10⁶J/m²的情况下，沿着要切割的直线或者曲线移动照射实施切割，必要时进行来回反复照射切割。

上述用微束光转运切割后的染色体或片段是采用微束光，利用其光镊作用，将拟要转运的染色体或切割下来的染色体片段罩于微束光斑中，然后移动光束或移动承载染色体的载物台，在功率密度为10×10⁹W/m²～200×10⁹W/m²情况下，挟带处于其光束中的染色体一起移动至所设想的位置。

上述方法中所涉及的微束光的光束直径为0.6～3微米，波长为193nm～2940nm。所述染色体包括人的各种染色体、各种动物以及植物与微生物的染色体。

本对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法可应用于：对染色体进行修复；或除去有缺陷的染色体；或是构造出新型结构的染色体，从而使有关病变物种恢复正常的生命活动；或获得品质优良的新物种。

本发明的作用原理是：微束激光在一定条件下具有光镊作用，即可以非机械接触的方式挟持微小物体从而实现对微小物体作空间悬浮、翻转、搬运等作用。当改变其功率密度时，微束激光还可利用光生热作用或光化作用实现对被照射物的微切割、穿孔或微焊接。由于激光束可聚焦到微米大小，故其所具有的有关切割、穿孔或焊接等加工处理相当精细，且对光束的控制通过电脑操控的光电过程可相当灵活方便。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

(1)全程用微束光完成对染色体处理，实现对染色体的切割、转运、焊接、转入受体细胞等过程，可按操作者意愿精确控制获得或加工出所需要的染色体，操作方便、快速、准确，灵活性好。

(2)无须像常规方法那样为每一次切割或连接设计专门的酶，大大简化了染色体处理的步骤，本方法易于实现，处理成本较低。

(3)对染色体的处理和其他操作仅用微束光技术在无任何机械性接触下进行，可最大限度地保持所处理的染色体的既有状态与结构。

(4)本方法可较好地用于对变异染色体修复改正或补充正常，或是将外源染色体或染色体片断转入受体细胞而改变细胞遗传特性，应用范围较广，

附图说明

图1是利用本发明方法处理果蝇染色体过程的显微镜视图(圆圈部分表示处理的目标区域)，其中：

图1(a)显示了需要切割的果蝇染色体；

图1(b)显示了微束光从一果蝇染色体上切割出一片段；

图1(c)显示了另一微束光将切割出的片段捕获；

图1(d)显示了用微束光转移切割出的片段到另一染色体的附近；

图1(e)显示了将该片段与另一染色体要焊接的位置对齐；

图1(f)显示了用第三种微束光将两者焊接在一起。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

(1)制备果蝇唾腺染色体样品：取果蝇三龄幼虫唾腺于一载玻片上，用1mol/L盐酸解离一分钟后，用滴管吸去盐酸，吸取少许蒸馏水换洗三次，最后一次让腺体在蒸馏水中停留20分钟，使唾腺细胞充分吸水膨胀，让染色体分散开；

(2)将样品玻片置于一倒置显微镜下，移动显微镜载物台，在显微镜视中找到需要切割的染色体(见图1(a))。将一波长为337nm的脉冲氮分子激光通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光，将其输出能量调节为132微焦耳(μJ)，在能量密度为168×10⁶J/m²情况下对准染色体要切割的部位照射，把其切割下来(见图1(b))。停止该激光照射并将其关断。

此步骤中，对染色体的切割亦可使用308nm的脉冲准分子激光，微束光的直径控制在2微米，能量密度控制在400×10⁶J/m²。

再或者使用193nm的准分子激光，微束光的直径控制在0.6微米，能量密度控制在10×10⁶J/m²。

(3)将另一波长为1064nm的连续单模Nd:YAG激光转换进显微镜，通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光，将其输出功率调节为50mW，在功率密度为63×10⁹W/m²情况下，利用其光镊效应将已切割下来的染色体片段捕获，然后移动显微镜载物台，使该染色体片段转运接近第二条染色体(见图1(c)～(d))，然后使之对准并衔接到第二染色体要连接的部位(见图1(e))；

此步骤中，微束光还可采用波长为2940nm，功率密度为200×10⁹W/m²，相应输出功率为160mW的Er:YAG激光。

此步骤中，微束光的功率密度还可采用10×10⁹W/m²，相应其输出功率调节为8mW。

(4)启动导入波长为337nm的脉冲氮分子激光，在通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光情况下，将其输出能量调节为120微焦耳(μJ)，能量密度为152×10⁶J/m²，对准两染色体要焊接的部位照射18秒，使两染色体牢固焊接在一块(见图1(f))。

此步骤中，可将微束光的能量密度调节为5×10⁵J/m²，焊接时间相应调整为80秒。

此步骤中，可将微束光的能量密度调节为200×10⁶J/m²，焊接时间相应调整为1秒。

(5)采用波长为337nm，能量密度为210×10⁶J/m²的微束光在一选定的受体细胞上打孔，然后采用微管操控技术将上述(4)步骤中焊接好的染色体吸入微管，将微管对准由微束光打出的小孔插入受体细胞，将吸持的染色体片段射入。

此步骤中，微管的直径选择在0.2～100微米。

此步骤中，还可采用能量密度为10×10⁶J/m²，400×10⁶J/m²以及能量密度在此范围内的微束光打孔。

实施例2

(1)制备淋巴细胞染色体样品：取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞。然后收集细胞，低渗处理，使细胞胀大，染色体伸展。接着除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。

(2)将样品置于一倒置显微镜下，移动显微镜载物台，在显微镜视场中找到需要切割的染色体。将一波长为337nm的脉冲氮分子激光通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光，将其输出能量调节为100微焦耳(μJ)，在能量密度为127×10⁶J/m²情况下对准染色体要切割的部位照射，把其切割下来。停止该激光照射并将其关断；

(3)将另一波长为1064nm的连续单模Nd:YAG激光转换进显微镜，通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光，将其输出功率调节为40mW，在功率密度为51×10⁹W/m²情况下，利用其光镊效应将已切割下来的染色体片段捕获，然后移动显微镜载物台，使该染色体片段转运接近第二条染色体，然后使之对准并衔接到第二染色体要连接的部位；

(4)启动导入波长为337nm的脉冲氮分子激光，在通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光情况下，将其输出能量调节为80微焦耳(μJ)，(能量密度为102×10⁶J/m²，对准两染色体要焊接的部位照射10秒，使两染色体牢固焊接在一块；

(5)采用波长为337nm，能量密度为250×10⁶J/m²，光束直径为2微米的微束光在一受体细胞上打孔，然后将波长为1064nm的激光转换至显微镜，在功率密度为80×10⁹W/m²的情况下，利用光镊作用挟带已焊接好的染色体通过打出的小孔导入受体细胞。

此步骤中，挟带染色体的激光的能量密度还可选用10×10⁹W/m²、200×10⁹W/m²以及此范围内的其他值。

实施例3

(1)制备大蒜染色体样品：选择并剪取大蒜健壮的根尖，将其放在培养皿中，加0.2％秋水仙素水溶液室温下处理2小时后，将根尖放入0.075mol/L的KCl溶液中低渗处理20min，然后用蒸馏水冲洗2次，放入2.5％纤维素酶和2.5％果胶酶的等量混合液(PH5.0-5.5)，25℃恒温2-2.5小时作解离。或放入已经再60℃水浴锅中处理15min，当根尖的伸长区变透明而分生区呈米黄色时即取出。再用蒸馏水冲洗后，放在预冷的载玻片上，去根冠，取分生区1～2mm。加一滴固定液迅速用镊子捣碎，边捣边加，吹气，使之铺开，在酒精灯上微烤，或放入烘箱70℃-80℃；

(2)将样品玻片置于一倒置显微镜下，移动显微镜载物台，在显微镜视场中找到需要切割的染色体。将一波长为337nm的脉冲氮分子激光通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光，将其输出能量调节为125微焦耳(μJ)，在能量密度为159×10⁶J/m²情况下对准染色体要切割的部位照射，把其切割下来，停止该激光照射并将其关断；

(3)将另一波长为1064nm的连续单模Nd:YAG激光转换进显微镜，通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光，将其输出功率调节为52mW，在功率密度为66×10⁹W/m²情况下，利用其光镊效应将已切割下来的染色体片段捕获，然后移动显微镜载物台，使该染色体片段转运接近第二条染色体，然后使之对准并衔接到第二染色体要连接的部位；

(4)启动导入波长为337nm的脉冲氮分子激光，在通过显微镜物镜聚焦成直径为1微米的微束光情况下，将其输出能量调节为126微焦耳(μJ)，即能量密度为160×10⁶J/m²，对准两染色体要焊接的部位照射7秒，使两染色体片断牢固焊接在一块。

(5)采用波长为337nm，能量密度为320×10⁶J/m²，光束直径为3微米的微束光在一选定的受体细胞上打孔，然后采用微管操控技术将上述(4)步骤中焊接好的染色体吸入微管，将微管对准由微束光打出的小孔，将选定的染色体片段导入受体细胞。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，包括用微束光切割染色体和用微束光转运切割后的染色体或片段步骤，其特征在于：包括用微束光对切割后的染色体或片段进行焊接步骤；所述对切割后染色体或片段进行焊接是将两要焊接起来的染色体或染色体片段转运到一起并使两要焊接部位对接，然后将微束光在能量密度为5×10⁵J/m²～200×10⁶J/m²的情况下，对准要焊接部位持续照射1～80秒。

2.根据权利要求1所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，其特征在于：还包括将焊接后的染色体或片段转入受体细胞。

3.根据权利要求2所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，其特征在于：将焊接后的染色体或片段转入受体细胞包括下述步骤：首先采用能量密度为10×10⁶J/m²～400×10⁶J/m²的微束光在受体细胞上打孔，然后采用功率密度为10×10⁹W/m²～200×10⁹W/m²的微束光挟带选定的染色体或片段通过打出的小孔导入受体细胞。

4.根据权利要求2所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，其特征在于：将焊接后的染色体或片段转入受体细胞包括下述步骤：首先采用能量密度为10×10⁶J/m²～400×10⁶J/m²的微束光在受体细胞上打孔，然后采用微管操控技术将选定的染色体或片段吸入微管，将微管对准由微束光打出的小孔，将选定的染色体或片段导入受体细胞；或者，直接将微管插入受体细胞，将选定的染色体或片段射入。

5.根据权利要求4所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，其特征在于：所述微管操控技术是在微动操控仪协助下，通过内径为0.2～100微米的微管，对微小物体或微量液体进行吸入或射出的操控作用。

6.根据权利要求1所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，其特征在于：所述用微束光切割染色体是采用微束光，选定要切割的染色体部位，将光束焦点聚焦到染色体上，根据要处理的染色体的性质和粗细的不同，在能量密度为10×10⁶J/m²～400×10⁶J/m²的情况下，沿着要切割的直线或者曲线移动进行来回反复照射实施切割。

7.根据权利要求1所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，其特征在于：所述用微束光转运切割后的染色体或片段是采用微束光，利用其光镊作用，将拟要转运的染色体或切割下来的染色体片段罩于微束光斑中，然后移动光束或移动承载染色体的载物台，在功率密度为10×10⁹W/m²～200×10⁹W/m²情况下，挟带处于其光束中的染色体或切割下来的染色体片段一起移动至所设想的位置。

8.根据权利要求1～7任一项所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法，其特征在于：微束光的光束直径为0.6～3微米，波长为193nm～2940nm。

9.根据权利要求1～8任一项所述的对染色体进行处理而改变细胞遗传特性的方法的应用，其特征在于：用于对染色体进行修复；或除去有缺陷的染色体；或是构造出新型结构的染色体，从而使细胞恢复其正常的生命活动与功能；或获得品质优良的新物种细胞。

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