CN1545549A - 为建立人类胚胎干细胞(hESC)系进行的内细胞团分离 - Google Patents

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菲鲁扎·拉杰什·帕里克
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萨蒂什·马哈德奥罗·托泰
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莎伊拉贾·阿努帕姆·萨克塞纳
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Abstract

本发明涉及一种分离内细胞团的方法，步骤包括：将含有透明带、滋养外胚层和内细胞团的胚泡阶段的胚胎固定，用激光消融在胚泡阶段的胚胎上打孔，然后通过该孔从胚泡阶段的胚胎中取出内细胞团。激光消融技术是通过非－接触式二极管实现的。从胚泡阶段的胚胎中分离出的内细胞团用来构建人胚胎干细胞系。

Description

为建立人类胚胎干细胞(hESC)系进行的内细胞团分离
相关申请
本申请要求以申请日为2001年8月23日，序列号60/314,323的美国临时申请为优先权。
发明领域
本发明涉及一种采用非接触式二极管激光技术，从哺乳动物处于胚泡阶段的胚胎中分离内细胞团，从而建立人类胚胎干细胞系的方法。
背景技术
人体干细胞的分离能产生有前景一大批新的治疗方法。人们期望从此类细胞得到的生物学治疗，即通过组织再生和修复以及通过遗传物质的靶向传递，能够治疗大范围的医学疾病。分析和评估在临床上使用人类干细胞的安全性对于这种尝试是至关重要的。
胚胎干(ES)细胞是特殊类型的细胞，其既能复制自身(自我更新)，又能产生分化的功能性特化细胞类型。这些干细胞能变成身体中几乎所有的特异性体细胞，并因此可能产生一大批组织和器官如心脏、胰脏、神经组织、肌肉、软骨等的替代细胞。
干细胞具有在人工培养的条件下无限分裂和增生的能力。科学家们利用干细胞的这两种性质从干细胞中生产出几乎是无限数量的绝大多数类型的人类细胞，这就为通过细胞替换来治疗疾病的方法铺平了道路。事实上，细胞治疗具有治疗任何与细胞功能障碍或损伤相关疾病的潜力，这些疾病包括中风，糖尿病，心脏病发作，脊髓损伤，癌症或AIDS等。干细胞所具有的修复或替代病态或受伤组织的治疗潜力，引起了科学、医学和/生物技术投资界的极大兴趣。
来自于多种哺乳动物胚胎的ES细胞已在实验室中被成功培养。Evans和Kaufman(1981)以及Martin(1981)展示了直接从小鼠胚泡中获得的永久性的胚胎细胞系是可能的。Thomson等(1995和1996)成功地从恒河猴和狨猴获得了永久的细胞系。多能细胞系也已经从几种家畜或试验动物中预先植入的晶胚中得到，这样的动物包括牛(Evans等，1990)，猪(Evans等，1990，Notarianni等，1990)，绵羊和山羊(Meinecke-Tillmann和Meinecke，1996，Notarianni等，1991)，兔(Giles等，1993，Graves等，1993)，水貂(Sukoyan等，19992)，大鼠(Lannaccona等，1994)和Hamster(Doetschman等，1988)。最近，Thomson等(1998)和Reubinoff等(2000)报道了人类ES细胞系的获取。这些人类的ES细胞和恒河猴的ES细胞系相类似。
在人类胚泡的ICM中发现了ES细胞，这是在受精后第4天到第7天，胚胎生长的早期阶段。胚泡是指在着床前胚胎发育的阶段，它包含两种细胞。
1.滋养外胚层：处于外层，提供额外的胚胎膜。
2.内细胞团(ICM)：形成胚胎本身。
在正常的胚胎发育过程中，ES细胞在第7天之后消失，并开始形成三个胚胎组织层。然而，从胚泡阶段的ICM中提取的ES细胞在实验室中能够被体外培养，并在合适的条件下可以无限繁殖。在这种未分化状态下的ES细胞保持了分化成所有三个胚胎组织层细胞的能力。最后，内细胞团的细胞产生了所有的胚胎组织。在胚胎形成阶段中，即接近胚泡生长的第一周周末时，可从胚泡的ICM获得ES细胞。
从胚泡中分离ES细胞并使其在培养物中生长的可能性似乎主要取决于该胚泡的完整性及其条件状况。简而言之，尺寸大且具有明显的内细胞团的胚泡易于最有效地产生ES细胞。为建立胚胎干细胞系，人们已经采用了几种方法来分离细胞内团(ICM)。大多数普通的方法如下：
1.胚泡的天然孵育
在这种方法中，将胚泡置于培养液上进行天然孵育。胚泡的孵育通常发生在第6天。受孵育的胚泡的内细胞团(ICM)生长出生长晕(outgrowth)。采用机械方式除去该生长晕，随后使其继续生长以建立胚胎干细胞系。然而，该方法有着几个缺点。首先，滋养外胚层细胞在所提供的培养条件下增生非常快，很多情况下抑制了内细胞团的生长晕。其次，当用机械方式除去内细胞团的生长晕时，可能会将滋养外胚层细胞分开。第三，人类胚泡发生自然孵育的百分比非常低。
2、显微外科方法：
另一种分离内细胞团的方法是被称为显微外科的机械抽吸术。在这种方法中，采用显微操作器系统，通过固定吸液管(holding pipette)夹持并放置胚泡，使内细胞团(ICM)处于9点钟的位置。采用有斜面形状的活检针抽吸内细胞团(ICM)，并将其嵌入囊胚腔中。由于分离完整内细胞团的可能性很低，且细胞多次发生解体，因此该方法的缺点是非常大的。其过程是非常乏味的，而且可能导致对胚胎的严重破坏。细胞水平上的操作要求采用具有微米精度的工具以减少破坏和污染。
3、免疫外科法：
这是一种分离内细胞团(ICM)的常规方法。采用补体介导的细胞溶解方法分离内细胞团(ICM)。在该方法中，使胚泡曝露于酸性tyrode溶液或链霉蛋白酶溶液中，以除去胚泡的透明带(壳)。然后将无带的胚胎曝露于人类表面抗体中达30分钟到1小时。然后将胚胎曝露于豚鼠的补体中以溶解滋养外胚层。采用精细牵引(drawn)的巴斯德吸液管重复性机械式的移液方法，从内细胞团(ICM)中除去补体介导的已被溶解的滋养外胚层细胞。近期文献中报道的所有胚胎干细胞系都是通过该方法获得的。然而，该方法具有几个缺点。首先，胚胎长时间地曝露于酸性的tyrode溶液或链霉蛋白酶溶液中，导致了对胚胎的有害作用，并因此使胚胎本身的发育能力降低。其次，该方法需要花费1.5到2.0小时的时间，因此是一种很费时的方法(Narula等，1996)。第三，每一胚泡的内细胞团(ICM)的收率很低。第四，该方法中采用的抗体和补体要求苛刻的储存条件。最后，由于使用了源自于动物的抗体和补体，该方法有将源于动物的病毒和细菌传播给人类的危险。在该方法中，使用了两种动物血清，一种是兔的抗人类抗血清，另一种是豚鼠的补体血清。
直到今天，我们研究的人类细胞系主要是采用免疫外科学的方法获得的，在该方法中采用了动物的抗血清和补体。
现存细胞系可能存在的其它缺点如下：
1.在培养胚胎干细胞时需要使用饲养层细胞，从而产生混合物的细胞群，因此需要将胚胎干细胞从饲养层细胞组分中分离出来，这一过程会影响细胞的扩增。
2.从饲养层细胞中产生的转录污染了胚胎干细胞(ESC)，因此不能在商业规模上加以应用，而仅能用于研究。
Geron建立了一种方法，该方法中人类胚胎干细胞(hESC)系在缺乏饲养层细胞的条件下进行培养(XU等，2001)。在条件培养液(conditionedmedium)中的细胞外基质上培养hESC，使其在生长环境中以未分化状态进行扩展。hESC不包含来自培养物中其它细胞的癌源的异种成分。而且，这种hESC细胞以及其衍生物的生产方法更适合于商业化应用。在这种方法中，无须在支持培养物的工作基底(ongoing basis)上提供饲养层细胞，并可采用机械方法进行细胞传代。然而，该方法的主要缺点在于采用免疫外科方法分离内细胞团(ICM)，该免疫外科学方法中采用含有异源成分的饲养层来获得最初的胚胎干细胞。这就可能导致来源于动物的病毒和细菌的污染。
为简化内细胞团分离的方法并使其安全化，本发明的科学家们提出一种采用非接触式激光分离内细胞团的新方法，该方法中未使用动物的抗血清和补体。
在辅助繁殖中采用激光技术：
随着辅助繁殖技术(ART)的出现，人们已经采用几种方法来提高受精质量，促进胚泡孵育(Cohen等，1990)并进行卵裂球活检(Tarin和Handyside，1993)。通常使用的方法有化学法(Gordon和Talansky，1986)，机械法(Depypere等，1988)和激光法(Feichtinger等，1992)，从而在透明带上产生孔(Gordon，1988)。近来，通过显微镜的物镜聚焦的红外1.48μm的二极管激光束可对小鼠和人类的透明带进行快速，简易且非接触式的显微打孔，这种方法在常规的培养条件下也能有很高的精确度(Rink等，1994)。由于对透明带糖蛋白基质进行高度定位的热依赖型击穿，从而实现了打孔效果(Rink等，1996)。与采用308nm氙-氯受激准分子激光器对致密的小鼠胚胎造成的有害结果(Neev等，1993)相反，红外区域的激光打孔方法并不影响小鼠(Germond等，1995)或人类(Antinori等，1994)胚胎的存活。
现在，激光作为帮助受精和辅助孵育的工具正被人们深入研究。近期的报道表明采用1.48μm二极管激光对小鼠透明带进行显微打孔是高度安全的，且不会影响小鼠的神经解剖学和神经化学性质，同时也改善了受精情况(Germond等，1996)。Obruca和他的同事们于1994年首先报道了人类体外受精(IVF)中采用激光辅助的孵育获得了成功。在该研究中，当胚胎处于2到4个细胞的阶段时，在透明带(ZP)中打出20到30个微孔，并立即移植。该研究中包括了来自于两个不同中心的以前接受体外受精(IVF)失败的病人。与对照组(6％)相比，激光辅助的孵育组中每个胚胎的移植成功率更高(14.4％)。每一移植的受孕率也得到了提高(40％比16.2％)。
在另一种研究中，采用Er：YAG激光使来自于病人的胚胎变薄，胚胎学家能使ZP精确地减少50％，这在采用酸性蒂罗德溶液时是很难实现的。胚胎附近存在酸蒂罗德溶液也可能是有害的。激光-孵育组中的临床受孕率为42.7％，而对照的未孵育组中的受孕率则为23.1％。由于这一数据看起来很有前景，因此激光-辅助孵育的迹象(indication)得到了扩大。激光-处理组中首次进行体外受精(IVF)的妇女的临床受孕率达39.6％，而对照的未孵育组中则为19％(Parikn等，1996)。
近十年来，人们正在对内细胞团(ICM)的分离进行研究，原因是ICM对建立胚胎干细胞系是很有用的，而胚胎干细胞系具有发展成为人体内的大多数特异性细胞的能力，如血，皮肤，肌肉和神经细胞。它们也具有在体外培养下无限分裂和增生的能力。
本发明涉及采用激光消融技术而不是繁琐的免疫外科过程对内细胞团(ICM)进行分离的方法。因此，本发明中并不采用来自动物的抗体或血清，该方法是安全，简单，快速的，并可在商业上加以应用。
本发明避免了常规的内细胞团(ICM)分离方法的相关缺点。采用本发明的方法分离的内细胞团(ICM)是完整的，细胞没有受到破坏和损害。本发明因此提供了分离内细胞团(ICM)的快速可靠和非损伤性的方法。该方法也完全破坏了滋养外胚层，因此使内细胞团(ICM)受到的污染最小化，从而确保了内细胞团(ICM)的纯度。
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发明目的
1.本发明的目的之一在于提供一种内细胞团的分离方法，该方法采用激光消融技术而不经历免疫外科学的繁琐过程。
2.本发明的另一目的在于采用激光消融技术而不采用任何动物产生的抗体和血清对ICM进行分离，因此防止了动物有机体传播到人类的可能性，从而能被安全地在商业规模上加以应用。
3.本发明的另一目的在于采用非接触式二极管激光，从处于胚泡阶段的哺乳动物胚胎中分离出内细胞团(ICM)。
4.本发明的另一目的在于采用简单，短时且容易可行的方法分离出内细胞团(ICM)，而不影响/破坏内细胞团(ICM)。
5.本发明的再一个目的是通过完全清除滋养外胚层的方法来确保内细胞团(ICM)的纯度，且不影响/破坏内细胞团(ICM)。
6.本发明的再一个目的在于分离出与常规方法相比，收率和纯度更高的内细胞团(ICM)。
通过后续的描述，本发明的以上目的和其它目的将变得更加明显。
发明详述
本发明涉及采用对透明带(ZP)和滋养外胚层(TE)的激光消融法分离内细胞团(ICM)，并为建立胚胎干细胞系而抽吸出内细胞团。在本发明中，所采用的非接触式二极管激光对细胞的显微外科来说是一种高度精确和可靠的工具。该系统采用了最新的光纤技术而得到目前最简洁的激光系统。在装配有显微操纵器的反向显微镜上通过落射荧光口装配/插入1.48μm的二极管非接触式Saturn激光系统。采用引导激光来瞄准主要的消融激光，当激光待发和准备射出时由一系列的LEDs通知使用者。采用一个二-次级-操作(two-second-operation)窗口减少意外射出激光的可能性。随着所要求的孔大小的变化，激光的斑直径有所不同。
进行体外受精(IVF)治疗的夫妻自愿捐献出多余的人类胚胎。在征得这些夫妻的书面的自愿同意之后，将这些胚胎用于研究。在本发明中，为分离内细胞团而采用胚泡阶段的胚胎。将胚泡置于35mm培养皿中无Ca++/Mg++的胚胎活检培养液的50微升液滴中，并用矿物油覆盖。安装显微操纵器来进行胚胎活检。将胚泡置于胚胎活检培养液中，将盛有胚泡的培养皿置于显微镜的加热台上。使胚泡位于场地的中心。将胚泡固定在把持的吸液管中，使内细胞团处于3点钟的位置。使内细胞团附近的透明带和滋养外胚层位于激光束的目标点位置上。透明带和滋养外胚层的一小部分被激光消融。然后轻轻地将活检吸液管插入穿过透明带和滋养外胚层上的孔，并轻轻地抽吸内细胞团。在完整的内细胞团分离之后，用胚胎干细胞(ESC)培养液洗涤细胞数次。然后将细胞置于具有胚胎干细胞培养液的培养层上以建立胚胎干细胞系。随后对胚胎干细胞进行细胞表面标记，比如SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81，OCT-4以及碱性磷酸酯酶。同时也确定胚胎干细胞的染色体组型。
a)体外胚泡的生长
在开始此项研究之前已经获得了伦理委员会的批准。在个人捐献者完成不孕治疗之后，我们获得了捐献者为进行此项研究而捐献多余胚胎的的书面同意。
为获得可用的胚胎而通常对不孕病人采取治疗方案如下：
从中-黄体阶段开始，每天用gnRH激动剂类似物抑制的方法诱发卵巢过度排卵，以500-900mg的剂量给药9-12天。在采用合适剂量(取决于年龄和卵巢体积)的人类更年期促性腺激素(hMG)或重组的促卵泡激素(FSH)(Gonal-F，Recagon)适当地抑制卵巢之后，再对卵巢进行刺激。通过对剂量进行必要的调节来产生可控的卵巢刺激。按要求进行血清β-雌二醇(E2)测定试验。从周期的第7天开始，每日进行阴道超声波检查。当有3或4个卵泡的最大直径达到17mm时，采用人类绒毛膜促性腺激素5000-10000 I.U.进行给药。34-36小时之后通过阴道进行抽吸。然后向卵母细胞的胞质内注入精子。
采用直径为40-60μm的玻璃固定吸液管来固定卵子。将有活力的精子置于聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)液滴中，并用矿物油覆盖。在约3点钟的位置，用外径大致为5-6μm，内径为3-4μm的注射用针刺穿透明带。用注射用显微吸液管切掉精子的尾部以固定所选的精子。固定吸液管固定卵母细胞，而直接将精子直接注射到卵母细胞的中心。
培养16-18小时后对卵母细胞的受精情况进行检测。此时受精的卵母细胞具有生殖核(也称为单细胞胚胎)。然后将单细胞胚胎转移到预先平衡好的新鲜ISM-1培养液中，并在37℃下，中5％CO2浓度的空气中进行培养。第二天将胚胎转移到ISM-2培养液中。胚胎每隔一天被转移到新的ISM-2培养液中。从第5天起，检测胚胎的胚泡生长情况。在治疗完成之后，多余的胚泡被夫妻们捐献出来，用于本研究工作。
b)激光器的安装
本发明涉及为建立胚胎干细胞，对采用非接触式二极管激光进行内细胞团分离的独特方法进行描述。激光是用于细胞的显微外科的高精度和高可靠性工具。该系统采用最新的光纤技术建立了目前可用的最简洁的激光系统。装配有显微操纵器的Zeiss反向显微镜通过落射荧光口装配1.48μm的二极管非接触式Saturn激光系统。
采用引导激光瞄准主要的消融激光，当激光待发和准备射出激光束时，由一系列的LEDs显示给使用者。采用一个二-次级-操作(two-second-operation)窗口减少意外射出激光的可能性。根据所要求切除的孔的大小改变激光的直径。
c)激光消融和内细胞团的分离
将胚泡阶段的胚胎分别置入放置在35mm培替氏培养皿中的50μl活检培养液(无Ca++/Mg++)液滴中。采用固定吸液管固定胚胎，使内细胞团保持在3点钟的位置，并使内细胞团附近的透明带和滋养外胚层位于靶点位置上。采用连续的1.48μm二极管激光对透明带(ZP)进行打孔，该透明带是保护卵母细胞的糖蛋白层。在此波长下，孔是由于糖蛋白基质的热分解而产生的。一旦透明带发生了分解，就给予3个脉冲以产生光分解作用的，从而消融滋养外胚层。在透明带和滋养外胚层都被消融之后，内径为30-35微米的抽吸吸液管通过激光融解得到的孔进入，并轻轻地抽吸移出ICM。
d)人类胚胎干细胞(hESC)的培养
在进行培养之前，在ES培养液中彻底清洗抽吸出的ICM，该ES培养液是分离胚胎干细胞系的优选培养液。
以下是当本发明采用培养层的方式。在该方法中，存在小鼠的失活胚胎纤维原细胞培养层的条件下，内细胞团被培养在96孔板中。胚胎纤维原细胞培养层优选从12.5到13.5天大的C57BL/6小鼠或C57BL/6XSJLF-1小鼠或远系繁殖(out bred)的CD1小鼠或从人类羊水中获得，并以用作培养层。通过γ照射(3500rads)使胚胎纤维原细胞失活。在0.5％明胶涂覆的板上，用由Dulbecco’s改性的Eagle’s培养液(无丙酮酸钠，高含量葡萄糖)(70-90％)，胎牛血清(10-30％)，β-巯基乙醇(0.1mM)，非必需的氨基酸(1％)，L-谷氨酰胺2mM，基本纤维原细胞生长因子(4ng/ml)组成的ES培养液培养小鼠胚胎纤维原细胞培养层。然后将内细胞团置于失活的小鼠胚胎纤维原细胞上。4-7天之后，采用消毒过的烧制打磨吸液管从生长晕中移出ICM衍生的团块，采用机械方法进行分离，并置于新鲜的饲养层细胞上。采用补充有1％小鸡血清的0.5％胰岛素-EDTA溶液进行进一步的分离。
按照Thomson等(1998)，Reubinoff等(2000)中所述的方法，确定得到的细胞系的染色体组型，并几种表面标记来表征，比如SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，OCT-4，碱性磷酸酯酶，TRA-1-81，TRA-1-60。
实施例
下列实施例的目的在于阐释本发明而非限定本发明的范围。
实施例1
采用胚泡阶段的人类胚胎共24个进行内细胞团的分离。在胚泡培养培养液(ISM-2培养液，Medicult，Denmark)中多次洗涤胚胎。然后将各个胚胎放入50μl不含Ca++/Mg++的胚胎活检培养液(EB 10培养液，Scadinavian)液滴中。用矿物油覆盖该微小的液滴。安装显微操作器，采用外径为75μm，内径为15μm的玻璃固定吸液管来固定胚胎。采用外径为约49μm，内径为35μm的活检吸液管抽吸内细胞团。采用引导激光定位主要的消融激光。将胚胎固定在固定吸液管上，使内细胞团保持在3点钟的位置，内细胞团附近的透明带和滋养外胚层处于靶点位置。由于透明带的局部热分解而产生了小孔。通过给予3个脉冲导致的光分解来消融滋养外胚层细胞。在透明带和滋养外胚层的消融完成之后，引导活检吸液管穿过激光消融的孔并吸出内细胞团。在ES培养液中洗涤内细胞团数次，并将其置于含有或不含有培养细胞的96孔板中。以下的数据以表格的形式列出。
表1：采取本发明的激光消融技术得到，并在小鼠饲养层细胞存在的条件下所培养的hESC细胞系的概况
用于激光消融的胚泡数目 移出的内细胞团总数 使用小鼠饲养层细胞的情况下
采用的ICM的数目 建立的ES细胞系的数目
    24     18     14     4
类似地，用分离内细胞团的常规方法，如采用免疫外科方法进行试验，该试验可如下所述：
实施例2
采用常规的免疫外科方法并和新发明的激光消融方法相比较，目的是确定分离内细胞团的效率。
为分离内细胞团，采用21个胚泡阶段的人类胚胎进行试验。用胚泡培养液(ISM-2培养液)然后用ES培养液洗涤胚胎数次。然后在37℃，5％CO2浓度的空气中，将处于胚泡阶段的各个胚胎置于1∶50抗-人类抗体(δ)的50μl微小液滴中，存放30分钟。在用ES培养液进行培养之后，将胚泡阶段的胚胎洗涤4次，随后在37℃，5％CO2浓度的空气中，将胚泡再次置于浓度为1∶10的豚鼠补体的50μl微小液滴中。培养之后，采用细孔玻璃吸液管在ES培养液中洗涤胚泡阶段的胚胎数次，以除去滋养外胚层。然后用ES培养液洗涤内细胞团，并在含有或不含饲养层细胞的条件下在96孔板中进行培养。数据列于下表：
    表2：采用免疫外科方法，在使用或不使用小鼠饲养层细胞的条件下所培养的hESC细胞系的概况
用于激光消融的胚泡的数目 移出的内细胞团总数 使用小鼠饲养层细胞 不使用小鼠饲养层细胞
采用的ICM的数目 建立的ES细胞系的数目 采用的ICM的数目 建立的ES细胞系的数目
    21     14     12     3     2     0
尽管采用两种方法分离内细胞团并未表现出任何明显的不同。然而，通过激光消融方法分离内细胞团具有独特的优点。该方法避免使用抗体和来源于动物的血清。用激光消融法分离内细胞团可以进一步在含有或不含饲养层的的条件下进行培养。然而，在无饲养层存在的条件下培养内细胞团将进一步消除ES细胞受到动物病毒或细菌污染的可能性，并可在商业上用于人体移植研究。在当前的试验中，人们正努力在不含饲养层细胞的条件下建立ES细胞系。
优选实施方式的详述
结合显微照片对本发明的优选实施方式进行阐释。
本发明的图1(a)到1(g)涉及从一个胚胎的胚泡分离内细胞团(ICM)，图2(a)到2(g)涉及从另一个胚胎的胚泡分离内细胞团(ICM)。图3，4和5涉及在不同阶段的饲养层细胞上培养ICM。
图1(a)显示了人类胚泡的显微照片，该胚泡用玻璃固定吸液管固定，使ICM位于3点钟的位置。
图1(b)显示了其中部分透明带和滋养外胚层被激光消融的显微照片。
图1(c)显示了当该胚泡的透明带和滋养外胚层被消融后，靠近该胚泡的抽吸吸液管的显微照片，
图1(d)显示了用抽吸吸液管开始抽吸ICM的显微照片。
图1(e)显示了抽吸过程中抽吸吸液管内的大部分ICM的显微照片。
图1(f)显示了从胚泡中移出后的ICM的显微照片。
图1(g)显示了ICM分离后留存的滋养外胚层和透明带的显微照片。
图2(a)显示了另一个人类胚泡的显微照片，该胚泡受到玻璃固定吸液管的固定，使ICM位于3点钟的位置上。
图2(b)显示了透明带和滋养外胚层被激光消融之后，内细胞团的微小前突的显微照片。
图2(c)显示了用激光消融透明带和邻近的滋养外胚层细胞之后，位于ICM附近的抽吸吸液管的显微照片。
图2(d)显示了通过抽吸吸液管用轻微的吸力正在抽吸出ICM的显微照片。
图2(e)显示了抽吸吸液管内的ICM的大部分的显微照片。
图2(f)显示了从胚泡中移出的ICM的显微照片。
图2(g)显示了从胚泡中分离出ICM之后的滋养外胚层和透明带的显微照片。
图3(a)显示了已分离的内细胞团，植于幼鼠胚胎纤维原饲养层细胞(第3天)培养物上的显微照片。
图3(b)显示了已分离的内细胞团，植于幼鼠胚胎纤维原饲养层细胞(第7天)培养物上的显微照片。
图4显示了另一个胚胎的已分离的内细胞团，在幼鼠的胚胎纤维原饲养层细胞(第5天)培养物上显微照片。
图5显示了从激光消融方法分离得到的内细胞团中获得的胚胎干细胞系的显微照片。
本领域的技术人员应该理解，本发明非常适合于实现目标，获得以上提到的目的和优点。文中对本发明的最具有实践性和最优选的实施方式进行了展示和描述。应该认识到，可在本发明的范围内作适当的变更。应该理解，本发明并不受限于所公开的细节，而应该扩展到权利要求书所定义的范围内。

Claims (21)

1.一种采用非-接触式二极管激光技术，分离内细胞团(ICM)从而建立人类胚胎干细胞(hESC)系的方法，包括以下步骤：
(i)将35mm培养皿中的胚泡置入被矿物油覆盖的50微升常规的胚胎活检培养液中；
(ii)安装微操作系统，该微操作系统由带有加热台的显微镜，夹持固定吸液管的工具夹，抽吸吸液管和空气注射器组成；
(iii)放置上述(i)中的培养皿，将胚泡装载于上述(ii)中的加热台上，并调节胚泡，使其位于视野的中央；
(iv)通过空气注射器进行抽气，用固定吸液管固定胚泡，使其位于9点钟的位置，使被分离的内细胞团(ICM)位于3点钟的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的方法进一步包括采用1.48微米二极管激光的3-5个脉冲对透明带进行激光消融，从而分解透明带，在透明带上的糖蛋白基质上产生小孔。
3.根据权利要求1所述的方法，进一步采用1.48微米的二极管激光进行消融，通过细胞分解而去除内细胞团(ICM)附近的滋养外胚层细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的方法进一步包括抽吸内细胞团(ICM)，该抽吸内细胞团的步骤又包括：
(i)使抽吸吸液管穿过内细胞团附近的透明带和滋养外胚层细胞上的孔而靠近胚泡；
(ii)通过上述权利要求4(i)中的空气注射器的微小吸力，将内细胞团(ICM)抽吸到抽吸吸液管内；
(iii)将上述权利要求4(ii)中抽吸出的内细胞团(ICM)缓慢释放到下述权利要求5的培养物液滴中。
5.根据权利要求1所述的方法，所述的方法进一步包括培养胚胎干细胞，该培养的步骤又包括：
(i)在胚胎干细胞培养液的微小液滴中洗涤分离出的内细胞团(ICM)数次；
(ii)为培育胚胎干细胞，将内细胞团(ICM)置于含有培养液存在下的饲养层的板上。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的胚胎活检培养液中不含Ca++/Mg++。
7.根据权利要求5(ii)所述的方法，其中所采用的培养液为胚胎干细胞培养液。
8.根据权利要求5(ii)所述的方法，其中所采用的板为覆盖0.5％明胶的板。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述的胚胎干细胞介质培养液是由下列介质培养液组成的混合物：
(i)Dulbecco’s改性的Eagle’s培养液(DMEM)，其不含丙酮酸钠但具有高浓度的葡萄糖(70-90％)；
(ii)胎牛血清(10-30％)
(iii)β-巯基乙醇(0.1mM)
(iv)非-必需的氨基酸(1％)
(v)L-谷氨酰胺2mM
(vi)基本纤维原细胞生长因子(4ng/ml)。
10.根据权利要求5(ii)所述的方法，其中所述的饲养层是鼠源或人源。
11.分离内细胞团的方法，包括下列步骤：
(i)固定处于胚泡阶段，具有透明带，滋养外胚层和内细胞团的胚胎；
(ii)用激光消融法在胚泡阶段的胚胎内产生小孔；并
(iii)通过小孔，从处于胚泡阶段的胚胎中移出内细胞团。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的孔穿过透明带。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述的孔穿过透明带和滋养外胚层。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述的激光消融法是采用非接触式二极管激光实现的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述的非接触式激光为连续的1.48μm的二极管激光。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述内细胞团的移出是采用被引导的抽吸吸液管，穿过小孔进行抽吸而实现的。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述的方法在不含动物来源的抗体和血清的条件下进行。
18.建立人类胚胎干细胞系的方法，包括以下步骤：
(i)通过用激光剥离消融法在胚泡阶段的胚胎上产生小孔，从处于胚泡阶段的胚胎中分离内细胞团，并通过孔，从处于胚泡阶段的胚胎中移出内细胞团；
(ii)在胚胎干细胞培养液和失活的小鼠胚胎纤维原细胞饲养层的存在下培养内细胞团，以产生内细胞团衍生的团块。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的胚胎干细胞培养液基本上由下列的物质组成：
(i)Dulbecco’s改性的Eagle’s培养液，含量为胚胎干细胞培养液的约70％到约90％，Dulbecco’s改性的Eagle’s培养液中不存在丙酮酸钠但具有高含量的葡萄糖；
(ii)胎牛血清，含量为胚胎干细胞培养液体积的10％到30％；
(iii)β-巯基乙醇，含量为根据胚胎干细胞培养液总摩尔数所确定的0.1微摩尔；
(iv)非-必需的氨基酸，含量为胚胎干细胞培养液体积的约1％；
(v)L-谷氨酰胺，含量为根据胚胎干细胞介质培养液总摩尔数所确定的2微摩尔；以及
(vi)基本纤维原细胞生长因子，含量为每毫升胚胎干细胞培养液中为4ng。
20.根据权利要求18所述的方法，进一步包括下列步骤：移出内细胞团衍生的团块，采用机械方法分离内细胞团衍生的团块，并将机械法分离的内细胞团衍生的团块再次置于新鲜的饲养层细胞上。
21.采用如实施例所描述并结合显微照片所阐述的利于非接触式二极管激光技术，为建立人类胚胎干细胞(hESC)系而分离内细胞团(ICM)的方法。
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