RU2004108209A

RU2004108209A - Выделение внутренней клеточной массы для создания линий эмбриональных стволовых клеток человека (hesc)

Info

Publication number: RU2004108209A
Application number: RU2004108209/13A
Authority: RU
Inventors: Фируза Раджеш ПАРИКХ (IN); Фируза Раджеш ПАРИКХ; Сатиш Махадеорао ТОТЕЙ (IN); Сатиш Махадеорао ТОТЕЙ; Шаиладжа Анупам САКСЕНА (IN); Шаиладжа Анупам САКСЕНА
Original assignee: Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт., Лтд (In); Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт., Лтд
Priority date: 2001-08-23
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2005-04-20
Also published as: US20080064099A1; US20070048864A2; JP2008099706A; JP2005514004A; CA2458362A1; IL160351A; SG172471A1; US7294508B2; CN1545549A; IL160351A0; EP1421181A1; RU2291703C2; KR20040030161A; ZA200304132B; WO2003018783A1; BR0212098A; US20030104616A1; AU2002334378B2; JP2008194055A

Claims

1. Способ получения внутренней клеточной массы бластоцисты человека, включающий стадии

(i) выделения бластоцисты, имеющей блестящую оболочку, трофобласт и внутреннюю клеточную массу;

(ii) создание отверстия в эмбрионе на стадии бластоцисты путем лазерной абляции; и

(iii) выделение внутренней клеточной массы из бластоцисты через отверстие.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отверстие проходит через блестящую оболочку.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что отверстие проходит через блестящую оболочку и трофобласт.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что лазерную абляцию проводят с применением бесконтактного диодного лазера.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что бесконтактный диодный лазер представляет собой непрерывный 1,48 мкм диодный лазер.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что внутреннюю клеточную массу выделяют путем аспирации с применением аспирационной пипетки, проводимой через отверстие.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение клеток внутренней клеточной массы проводится в отсутствии антител и сыворотки животного происхождения.

8. Способ создания линий эмбриональных стволовых клеток человека, включающий стадии

(а) выделение клеток внутренней клеточной массы из эмбриона на стадии бластоцисты путем создания отверстия в эмбрионе на стадии бластоцисты при помощи лазерной абляции, и удаления клеток внутренней клеточной массы из эмбриона на стадии бластоцисты через отверстие;

(b) культивирование внутренней клеточной массы в присутствии среды для эмбриональных стволовых клеток и инактивированного питающего слоя для получения масс, производных внутренней клеточной массы; и

(c) культивирование масс, производных внутренней клеточной массы с получением линии выделенных эмбриональных стволовых клеток человека.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что среда для эмбриональных стволовых клеток включает

(а) модифицированную по Дюльбекко среду Игла с высоким содержанием глюкозы в количестве от около 70 до около 90% и без пирувата натрия;

(b) эмбриональную бычью сыворотку в количестве от 10 до 30% по объему среды для эмбриональных стволовых клеток;

(с) бета-меркаптоэтанол в количестве около 0,1 микромоля на основании общего количества моль среды для эмбриональных стволовых клеток;

(d) не-незаменимые аминокислоты в количестве около 1% по объему среды для эмбриональных стволовых клеток;

(е) L-глютамин в количестве 2 микромоль, на основании общего количеств моль среды для эмбриональных стволовых клеток; и

(f) основной фактор роста фибробластов в количестве около 4 нанограмм на миллилитр среды для эмбриональных стволовых клеток.

10. Способ по п.8, дополнительно включающий механическое разделение масс, производных внутренней клеточной массы по стадии (b) и повторного посева механически разделенных масс, производных внутренней клеточной массы на питающий слой.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделенную бластоцисту со стадии (а) помещают в стандартную среду для биопсии эмбрионов.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что среда для биопсии эмбрионов не содержит Са++/Mg++.

13. Способ по п.1, дополнительно включающий систему микроманипулятора, включающую микроскоп с нагревающимся предметным столиком, удерживающую пипетку, аспирационную пипетку и воздушный шприц, при этом выделенную бластоцисту со стадии (а) помещают на нагревающийся предметный столик, микроманипуляторную систему располагают таким образом, чтобы бластоциста находилась в центре поля зрения микроскопа, и бластоцисту закрепляют удерживающей пипеткой путем подсасывания посредством воздушного шприца так, чтобы внутренняя клеточная масса находилась напротив удерживающей пипетки.

14. Способ по п.2, отличающийся тем, что отверстие создают при помощи лазерной абляции с применением 1,48 мкм диодного лазера.

15. Способ по п.3, отличающийся тем, что отверстие создают путем лазерной абляции с применением 1,48 мкм диодного лазера, и оно распространяется до внутренней клеточной массы.

16. Способ по п.6, отличающийся тем, что клетки внутренней клеточной массы промывают один или более раз в среде для эмбриональных стволовых клеток и помещают на питающий слой в присутствии среды для эмбриональных стволовых клеток.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что питающий слой имеет мышиное или человеческое происхождение.

18. Способ по п.16, отличающийся тем, что питающий слой является питающим слоем эмбриональных фибробластов.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделенные клетки внутренней клеточной массы культивируют в условиях без питающего слоя.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что условия без питающего слоя включают внеклеточный матрикс.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что условия без питающего слоя дополнительно включают кондиционную среду.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделенная бластоциста является продуктом оплодотворения in vitro.

23. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделенная бластоциста является продуктом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида.

24. Способ по п.8, отличающийся тем, что питающий слой имеет мышиное или человеческое происхождение.

25. Способ по п.8, отличающийся тем, что питающий слой представляет собой питающий слой эмбриональных фибробластов.

26. Способ по п.10, отличающийся тем, что питающий слой имеет мышиное или человеческое происхождение.

27. Способ по п.10, отличающийся тем, что питающий слой представляет собой питающий слой эмбриональных фибробластов.

28. Способ создания линии эмбриональных стволовых клеток человека, включающий стадии:

(а) выделение бластоцисты человека, включающей внутреннюю клеточную массу;

(b) создание отверстия в бластоцисте путем лазерной абляции;

(с) выделение клеток из внутренней клеточной массы бластоцисты через отверстие;

(d) культивирование клеток для получения линии выделенных эмбриональных стволовых клеток человека.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что отверстие проходит через блестящую оболочку и трофобласт.

30. Способ по п.28, отличающийся тем, что лазерная абляция достигается с применением бесконтактного диодного лазера.

31. Способ по п.28, отличающийся тем, что клетки внутренней клеточной массы выделяют путем аспирации через отверстие.

32. Способ по п.28, отличающийся тем, что линию эмбриональных стволовых клеток человека создают в отсутствии антител и сыворотки животного происхождения.

33. Способ по п.28, отличающийся тем, что стадия (с) дополнительно включает помещение клеток внутренней клеточной массы на питающий слой, где образуются клеточные массы, производные внутренней клеточной массы.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что питающий слой представляет собой питающий слой эмбриональных фибробластов.

35. Способ по п.33, отличающийся тем, что питающий слой

имеет мышиное или человеческое происхождение.

36. Способ по п.33, отличающийся тем, что клеточные массы, производные внутренней клеточной массы, диссоциируют и пересевают на питающий слой.

37. Способ по п.28, отличающийся тем, что стадия (с) дополнительно включает помещение клеток внутренней клеточной массы в условия без питающего слоя, где образуются клеточные массы, производные внутренней клеточной массы.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что условия без питающего слоя включают помещение клеток внутренней клеточной массы на внеклеточный матрикс.

39. Способ по п.38, отличающийся тем, что клетки культивируют в присутствии кондиционной среды.

40. Способ по п.37, отличающийся тем, что клеточные массы, производные внутренней клеточной массы, диссоциируют и пересевают на внеклеточный матрикс.

41. Способ по п.40, отличающийся тем, что клетки культивируют в присутствии кондиционной среды.

42. Способ создания линии эмбриональных стволовых клеток человека, включающий стадии:

(а) выделение клеток внутренней клеточной массы из эмбриона на стадии бластоцисты путем создания отверстия в эмбрионе на стадии бластоцисты при помощи лазерной абляции и удаления клеток внутренней клеточной массы из эмбриона на стадии бластоцисты через отверстие;

(b) культивирование клеток внутренней клеточной массы в условиях без питающего слоя для получения масс, производных внутренней клеточной массы; и

(с) культивирование масс, производных внутренней клеточной массы, для получения линии выделенных человеческих эмбриональных стволовых клеток.

43. Способ по п.42, отличающийся тем, что условия без питающего слоя включают внеклеточный матрикс.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что условия без питающего слоя дополнительно включают кондиционную среду.

45. Способ по п.42, дополнительно включающий механическую диссоциацию масс, производных внутренней клеточной массы со стадии (b), и пересевание механически диссоциированных клеток в условия без питающего слоя.

46. Способ по п.45, отличающийся тем, что условия без питающего слоя включают внеклеточный матрикс.

47. Способ по п.46, отличающийся тем, что условия без питающего слоя дополнительно включают кондиционную среду.