JP2005514004A - ヒト胚性幹細胞(hESC)株の樹立のための内部細胞塊の単離 - Google Patents
ヒト胚性幹細胞(hESC)株の樹立のための内部細胞塊の単離 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、米国において2001年8月23日に出願された仮出願番号60/314,323に対する優先権を主張する。
本発明は、ヒト胚性幹細胞(hESC)株を樹立するために、非接触ダイオードレーザ技術を使用して胚盤胞期哺乳動物胚に由来する内部細胞塊(ICM)を単離する方法に関する。
ヒト幹細胞を単離することによって、顕著な数の新規な治療剤についての期待が提供される。組織再生および組織修復を介してそのような細胞から誘導される生物学的治療および遺伝物質の標的化送達を介してそのような細胞から誘導される生物学的治療は、広範な医学的状態の処置において有効であると予期される。臨床状況におけるヒト幹細胞の安全性を分析し評価する努力は、この努力にとって非常に重要である。
1.栄養外胚葉(外胚膜を与える外側の膜)、および
2.内部細胞塊(ICM)(適切な胚を形成する)
である。
この手順において、胚盤胞が、フィーダー層上に配置した後に自然に孵化させられる。胚盤胞の孵化は、通常は6日目に生じる。孵化した胚盤胞の内部細胞塊(ICM)は、成長物(outgrowth)を発生する。この成長物は、機械的に取り出され、その後、胚性幹細胞株を樹立するために増殖される。しかし、この手順は、いくつかの不利益を有する。第1に、栄養外胚葉細胞が、所定の培養条件において非常に速く増殖し、しばしば、内部細胞塊の成長物を抑制する。第2に、内部細胞塊の成長物を機械的に取り出す間に、栄養外胚葉細胞を単離する可能性が存在する。第3に、ヒトにおいて自然に孵化する胚盤胞の割合は、非常に低い。
内部細胞塊を単離するための別の方法は、顕微手術と呼ばれる機械的吸引である。このプロセスにおいて、胚盤胞は、マイクロマニピュレータシステムを使用して保持ピペットにより保持され、そして内部細胞塊(ICM)が9時の位置にあるように配置される。内部細胞塊(ICM)は、角度の付いた形状である生検針を使用して吸引され、胞胚腔中に挿入される。この手順もまた、不利である。なぜなら、完全な内部細胞塊を単離する可能性が低く、かつしばしば、細胞が分解するからである。これは、非常に冗漫な手順であり、胚に深刻な損傷を生じ得る。細胞レベルでの操作には、マイクロメートルの精度を備える道具が必要であり、それにより、損傷および混入が最小に抑えられる。
これは、内部細胞塊(ICM)を単離するために一般的に使用される手順である。内部細胞塊(ICM)は、補体媒介溶解により単離される。この手順において、胚盤胞が、胚盤胞の透明帯(殻)を除去するために、酸性タイロード溶液またはプロナーゼ酵素溶液のいずれかに曝露される。その後、透明帯を含まない胚が、ヒト表面抗体に約30分間〜1時間曝露される。この後、胚は、栄養外胚葉を溶解するために、モルモット補体に曝露される。この補体媒介溶解された栄養外胚葉細胞は、細く引かれたパスツールピペットを用いる機械的ピペッティングを反復することによって、内部細胞塊(ICM)から取り除かれる。文献中にて現在報告されている胚性幹細胞株はすべて、この方法により誘導されている。しかし、この方法は、いくつかの不利点を有する。第1に、胚が、酸性タイロードまたはプロナーゼに長期間曝露されて、胚に対して有害な影響が引き起こされ、それにより、適切な胚の生存度が減少する。第2に、この方法は、時間がかかる手順である。なぜなら、この方法は、約1.5時間〜2.0時間かかるからである(Narulaら、1996)。第3に、胚盤胞1つ当たりの内部細胞塊(ICM)の収量が、低い。第4に、この手順において使用される抗体および補体について、重要な貯蔵条件が必要とされる。最後に、この方法は、動物起源のウイルスおよび細菌がヒトに伝達する危険を包含する。なぜなら、動物由来の抗体および補体が、このプロセスにおいて使用されるからである。このプロセスにおいて、2つの動物血清が使用される。一方は、ウサギ抗ヒト抗血清であり、他方は、モルモット補体血清である。
1.ヒト胚性幹細胞(hESC)株を培養するためにフィーダー細胞を使用すると、混合細胞集団が生成され、この混合細胞集団は、フィーダー細胞成分から胚性幹細胞(ESC)を分離することを必要とし、これにより、スケールアップを損なわれる。
補助生殖技術(ART)の出現に伴い、受精を改善し、胚盤胞孵化を容易にし(Cohenら、1990)、そして割球生検を実施する(TarinおよびHandyside,1993)ための、いくつかの方法が使用されている。透明帯中に孔を作製する(Gordon、1988)ために一般的に使用される方法は、化学的方法(GordonおよびTalansky,1986)、機械的方法(Depypereら、1988)およびレーザ方法(Feichtingerら、1992)である。近年、顕微鏡対物鏡を通して焦点を合わせる1.48μm赤外ダイオードレーザビームが、マウスおよびヒトの透明帯に、迅速にかつ簡単にかつ接触せずに微小孔作製することが可能であることが示され、従来の培養条件下で、高い精度が維持された(Rinkら、1994)。この孔作製効果は、透明帯の糖タンパク質マトリックスの非常に局所的な熱依存性破壊に起因することが示された(Rinkら、1996)。308nmキセノン−塩素エクシマーレーザにより誘導される緊密マウス胚に対する有害な影響(Neevら、1993)とは対照的に、赤外領域における孔作製プロセスは、マウスにおいて(Germondら、1995)も、ヒトにおいても(Antinoriら、1994)、胚生存に影響を与えなかった。
本発明は、透明帯(ZP)および栄養外胚葉(TE)のレーザ切除と、内部細胞塊の吸引を使用する、胚性幹細胞株を樹立するための内部細胞塊の単離に関する。本発明において、使用される非接触ダイオードレーザは、細胞顕微手術のための非常に正確かつ信頼性のある道具である。このシステムは、最新のファイバーオプティクス技術を組込んでおり、現在利用可能な最も小型のレーザシステムを提供する。1.48μmダイオード非接触Saturn Laser Systemが、マイクロマニピュレータを取付けた倒立顕微鏡に、エピ蛍光ポートを介して取付けられている/埋め込まれている。パイロットレーザが、メイン切除レーザを標的化するために使用され、一連のLEDが、そのレーザが準備され発射準備された時を使用者に知らせる。2秒操作ウィンドウが、レーザを偶発的に発射する可能性を減らすために使用される。このレーザのスポット直径は、必要な孔径により変化され得る。
施設内倫理委員会の承認が、この研究を開始する前に得られた。不妊治療の完了後にこの研究のために余剰の胚を寄贈することに関して、書面による事前同意が、個々のドナーから得られた。
卵巣の過剰排卵が、毎日のgnRHアゴニストアナログ抑制により始まった。この抑制は、中黄体期に開始し、約9日〜12日間、用量500mg〜900mgで投与した。卵巣刺激が、ヒト閉経期ゴナドトロピン(hMG)または組換え卵胞刺激ホルモン(FSH)(Gonal−F,Recagon)を、年齢および卵巣体積に依存して適切な用量で用いて開始された。この用量はまた、制御された卵巣刺激を生じるために必要なように調整された。血清中β−エストラジオール(E2)測定を、必要な場合は実行した。膣超音波処置を、7日目から始めて毎日実施した。3つ以上の卵胞が少なくとも最大直径17mmである場合は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン5000I.U.〜10000I.U.を投与した。経膣吸引を、34時間〜36時間後に実施した。その後、卵母細胞を、細胞質内精子注入に供した。
本発明は、非接触ダイオードレーザを使用する、胚性幹細胞の樹立のために内部細胞塊を単離するための独特な方法に関する。このレーザは、細胞顕微手術のための非常に正確かつ信頼性のある道具である。このシステムは、最新のファイバーオプティクス技術を組込んでおり、現在利用可能な最も小型のレーザシステムを提供する。1.48μmダイオード非接触Saturn Laser Systemは、マイクロマニピュレータを取付けたZeiss倒立顕微鏡に、エピ蛍光ポートを介して取付けられていた。
胚盤胞期胚が、35mmペトリ皿中にある50μl生検培地(Ca++/Mg++を含まない)滴中に個別に配置された。この胚は、内部細胞塊が3時の位置のままであるように、保持ピペットに固定される。内部細胞塊付近の透明帯および栄養外胚葉が、照準地点に位置決めされる。1.48μm連続ダイオードレーザが、透明帯(ZP)に開口するために使用された。透明帯は、卵母細胞を保護する糖タンパク質層である。この波長にて、この糖マトリックスの局所的熱溶解によって、孔が誘導された。一旦透明帯が溶解されると、3回のパルスを与えて熱分解を引き起こすことによって、栄養外胚葉細胞が切除される。透明帯および栄養外胚葉の両方の切除の後、レーザ切除された孔を通して、内径30ミクロン〜35ミクロンを備える吸引ピペットが導入され、穏やかな吸引によって、ICMが取り出された。
培養の前に、吸引されたICMが、ES培地中で徹底的に洗浄された。ES培地は、胚性幹細胞の単離のために好ましいことが見出された。下記に提供されるのが、フィーダー層を使用して本発明が実行された場合の手順である。このプロセスにおいて、内部細胞塊が、非働体化マウス胚性線維芽細胞フィーダー層の存在下で、96ウェルプレートにおいて培養された。胚性線維芽細胞フィーダー層は、好ましくは、12.5日齢〜13.5日齢のC57BL/6マウスもしくはC57BL/6XSJL F−1マウスもしくは異系交配CD1マウスからか、またはヒト羊水から得られ、フィーダー層として使用された。胚性線維芽細胞フィーダー層は、γ照射(3500rad)により非働体化された。このマウス胚性線維芽細胞フィーダー層は、ES培地を含む、0.5%ゼラチンコートプレート上で培養された。このES培地は、ピルビン酸ナトリウムを含まず、高グルコース含量(70%〜90%)である、ダルベッコ改変イーグル培地と、ウシ胎仔血清(10%〜30%)と、β−メルカプトエタノール(0.1mM)と、非必須アミノ酸(1%)と、2mM L−グルタミンと、塩基性線維芽細胞増殖因子(4ng/ml)とからなった。その後、内部細胞塊は、マウス非働体化胚性線維芽細胞上に配置された。4日〜7日間後、ICM由来の塊が、火炎加工した滅菌ピペットを用いて成長物から取り出され、機械的に解離され、そして新鮮なフィーダー細胞上に配置された。1%トリ血清を補充した0.5%トリプシン−EDTAを用いて、さらなる解離が実行された。
合計24個の胚盤胞期のヒト胚を、内部細胞塊の単離のために使用した。胚を、胚盤胞培養培地(ISM−2培地,Medicult,Denmark)中で数回洗浄した。その後、個々の胚盤胞を、Ca++/Mg++を含まない胚生検培地(EB 10培地、Scandinavian)の50μl滴中に配置した。微小滴を、ミネラルオイルで覆った。マイクロマニピュレータを配置した。外径75μmおよび内径15μmを備えるガラス製保持ピペットを使用して、胚を確保した。外径ほぼ49μmおよび内径35μmを備える生検ピペットを、内部細胞塊の吸引のために使用した。パイロットレーザを使用して、メイン切除レーザを標的化するために使用した。内部細胞塊を3時の位置のままにし、内部細胞付近の透明帯および栄養外胚葉が照準地点に位置決めされるように、胚を保持ピペットに固定した。透明帯の局所的熱溶解によって孔を誘導した。3回パルスを与えて熱分解を引き起こすことによって、栄養外胚葉細胞を切除した。透明帯および栄養外胚葉の両方を切除した後、レーザ切除した孔を通して、生検ピペットを導入し、内部細胞塊を取り出した。その後、内部細胞塊を、ES培地中で数回洗浄し、そしてフィーダー細胞の存在下または非存在下において、96ウェルディッシュ中に配置した。以下のデータが、表形式で示される。
(マウスフィーダー細胞を使用して本発明のレーザ切除技術を使用して発生させた、hESC株の概要)
(実施例2)
この目的は、従来の方法(すなわち、免疫手術)を用いる内部細胞塊単離の効率を決定することであり、新規に発明されたレーザ切除方法と比較した。
本発明の好ましい実施形態が、添付の写真に示される
本発明の図1(a)〜1(g)は、ある胚の胚盤胞から内部細胞塊(ICM)を単離することに関する。図2(a)〜2(g)は、別の胚の胚盤胞からの内部細胞塊(ICM)の単離に関する。図3、図4、および図5は、種々の段階のフィーダー細胞上でICMを培養することに関する。
Claims (21)
- 非接触ダイオードレーザ技術を使用してヒト胚性幹細胞(hESC)株を樹立するために内部細胞塊(ICM)を単離する方法であって、該方法は、以下の工程:
(i)35mmペトリ皿において、ミネラルオイルで覆われた50μlの従来型胚生検培地中に胚盤胞を配置する工程;
(ii)加熱ステージを備える顕微鏡と、保持ピペットを保持するためのツールホルダと、吸引ピペットと、空気シリンジとからなる、マイクロマニピュレータシステムを設ける工程;
(iii)該胚盤胞を含む上記(i)のペトリ皿を、上記(ii)の加熱ステージ上に配置し、該胚盤胞を視野の中心に調整する工程;
(iv)単離されるべき内部細胞塊(ICM)が3時の位置にある様式で該空気シリンジを通して吸引することによって、9時の位置に該保持ピペットを用いて該胚盤胞を固定する工程;
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、3パルス〜5パルスの1.48マイクロダイオードレーザを使用して透明帯をレーザ切除して、該透明帯中に存在する糖タンパク質マトリックス中に孔を作製することによって、該透明帯を溶解する工程をさらに包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、1.48マイクロダイオードレーザ使用して栄養外胚葉細胞を細胞溶解により切除することによって、内部細胞塊(ICM)に近接する該栄養外胚葉細胞を除去する工程をさらに包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、内部細胞塊(ICM)を吸引する工程をさらに包含し、該吸引工程は、以下の工程:
(i)内部細胞塊(ICM)に近接している透明帯および栄養外胚葉細胞中にある孔を通して前記吸引ピペットを胚盤胞に近接させる工程;
(ii)上記請求項4(i)の空気シリンジを通して穏やかに吸引することによって、該内部細胞塊(ICM)を該吸引ピペット中に吸引する工程;
(iii)上記請求項4(ii)の吸引された内部細胞塊(ICM)を、下記請求項5の培養液滴中にゆっくり放出する工程;
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、胚性幹細胞を培養する工程をさらに包含し、該培養工程は、以下の工程:
(i)前記単離された内部細胞塊(ICM)を、胚性幹細胞培地の微小液滴中で数回洗浄する工程;
(ii)胚性幹細胞の樹立のために、培地の存在下にフィーダー層を含むプレート上に該内部細胞塊(ICM)を配置する工程;
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記胚生検培地が、Ca++/Mg++を含まない、方法。
- 請求項5(ii)に記載の方法であって、前記使用される培地が、胚性幹細胞培地である、方法。
- 請求項5(ii)に記載の方法であって、前記使用されるプレートが、0.5%ゼラチンでコートされたプレートである、方法。
- 請求項5に記載の方法であって、前記胚性幹細胞培地が、
(i)ピルビン酸ナトリウムを含まず、高グルコース含量(70%〜90%)である、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と、
(ii)ウシ胎仔血清(10%〜30%)と、
(iii)β−メルカプトエタノール(0.1mM)と、
(iv)非必須アミノ酸(1%)と、
(v)2mM L−グルタミンと、
(vi)塩基性線維芽細胞増殖因子(4ng/ml)と
の組み合わせである、方法。 - 請求項5(ii)に記載の方法であって、前記フィーダー層が、マウス起源またはヒト起源である、方法。
- 内部細胞塊を単離するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(i)透明帯と、栄養外胚葉と、内部細胞塊とを有する、胚盤胞期胚を固定する工程;
(ii)レーザ切除によって、該胚盤胞期胚中に開口部を作製する工程;および
(iii)該開口部を通して該胚盤期胚から該内部細胞塊を取り出す工程;
を包含する方法。 - 請求項11に記載の方法であって、前記開口部が、前記透明帯を通る、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記開口部が、前記透明帯と前記栄養外胚葉とを通る、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記レーザ切除が、非接触ダイオードレーザを使用して達成される、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記非接触ダイオードレーザが、1.48μmの連続ダイオードレーザである、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記内部細胞塊が、前記開口部を通して導入された吸引ピペットを使用する吸引によって取り出される、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、動物から生成された抗体および血清の非存在下で実施される、方法。
- ヒト胚性幹細胞株を樹立するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(i)レーザ切除により胚盤胞期胚中に開口部を作製し、該開口部を通して該胚盤胞期胚から内部細胞塊を取り出すことによって、胚盤胞期胚から内部細胞塊を単離する工程;
(ii)胚性幹細胞培地およびマウス不活化胚性線維芽細胞フィーダー層の存在下で該内部細胞塊を培養して、内部細胞塊由来の塊を生成する工程;
を包含する、方法。 - 請求項18に記載の方法であって、前記胚性幹細胞培地が、
(i)該胚性幹細胞培地のうちの約70%〜約90%の量のダルベッコ改変イーグル培地であって、ピルビン酸ナトリウムを含まず高グルコース含量を含む、ダルベッコ改変イーグル培地と;
(ii)該胚性幹細胞培地の体積のうちの10%〜30%の量のウシ胎仔血清と;
(iii)該胚性幹細胞培地の総モルに基づいて約0.1マイクロモルの量のβ−メルカプトエタノールと;
(iv)該胚性幹細胞培地の体積のうちの約1%の量の非必須アミノ酸と;
(v)該胚性幹細胞培地の総モルに基づいて約2マイクロモルの量のL−グルタミンと;
(vi)該胚性幹細胞培地1ml当たり約4ngの量の塩基性線維芽細胞増殖因子と;
から本質的になる、方法。 - 請求項18に記載の方法であって、
前記内部細胞塊由来の塊を取り出す工程;
該内部細胞塊由来の塊を機械的に分解する工程;および
該機械的に分解された内部細胞塊由来の塊を新鮮なフィーダー細胞上に再配置する工程;
をさらに包含する、方法。 - ヒト胚性幹細胞(hESC)株を樹立するために内部細胞塊(ICM)を単離する方法であって、該方法は、実施例を参照して実質的に本明細書中に記載されそして付随する写真にて実質的に示される非接触ダイオードレーザ技術を使用する、方法。
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