JP2008099706A - ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株の樹立のための内部細胞塊の単離 - Google Patents

Abstract

【課題】動物由来抗体または動物由来血清の使用が排除され、安全であり、簡単であり、かつ商業的に実行可能である、免疫手術の扱いにくい手順を行うことなくレーザ切除技術を使用する、内部細胞塊（ＩＣＭ）の単離を提供する。
【解決手段】ヒト胚性幹細胞株を樹立するための方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）レーザ切除により胚盤胞期胚中に透明帯と栄養外胚葉とを通る開口部を作製し、該開口部を通して該胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を取り出すことによって、該胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を単離する工程；（ｂ）フィーダーのない条件下で該内部細胞塊の細胞を培養して、内部細胞塊由来の塊を生成する工程；および （ｃ）前記内部細胞塊由来の塊を培養して、単離されたヒト胚性幹細胞株を生成する工程；を包含する方法。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
本出願は、米国において２００１年８月２３日に出願された仮出願番号６０／３１４，３２３に対する優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株を樹立するために、非接触ダイオードレーザ技術を使用して胚盤胞期哺乳動物胚に由来する内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離する方法に関する。

（発明の背景）
ヒト幹細胞を単離することによって、顕著な数の新規な治療剤についての期待が提供される。組織再生および組織修復を介してそのような細胞から誘導される生物学的治療および遺伝物質の標的化送達を介してそのような細胞から誘導される生物学的治療は、広範な医学的状態の処置において有効であると予期される。臨床状況におけるヒト幹細胞の安全性を分析し評価する努力は、この努力にとって非常に重要である。

胚性幹細胞（ＥＳ）細胞は、それ自体が複製し得（自己再生）かつ機能的に特化した分化細胞型を生成し得る、特殊な種類の細胞である。これらの幹細胞は、身体のほとんどすべての特化した細胞になることが可能であり、従って、広範な組織群および器官群（例えば、心臓、膵臓、神経組織、筋肉、軟骨など）のための置換細胞を生成する能力を有し得る。

幹細胞は、培養中に無限に分裂しかつ増殖する能力を有する。科学者は、幹細胞のこれらの２つの特性を使用して、ほとんどのヒト細胞型の外観上無限の供給を幹細胞から生成し、細胞置換による疾患の処置のために下準備をする。実際、細胞治療は、細胞機能不全または細胞損傷に関係する任意の疾患（発作、糖尿病、心臓発作、脊髄損傷、癌およびＡＩＤＳを含む）を処置する潜在能力を有する。罹患組織もしくは損傷組織を修復または置換するために幹細胞を操作する潜在能力のために、科学的、医学的、および／またはバイオテクノロジーの投資団体において、大量の実験が行われた。

種々の哺乳動物胚由来のＥＳ細胞が、実験室において首尾良く増殖されている。ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ（１９８１）ならびにＭａｒｔｉｎ（１９８１）は、永久胚細胞株をマウス胚盤胞から直接誘導することが可能であることを示した。Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９５および１９９６）は、アカゲザルおよびマルモセットザルから永久細胞株を首尾良く誘導した。多能性細胞株もまた、いくつかの家畜種および実験動物種（例えば、ウシ（Ｅｖａｎｓら、１９９０）、ブタ（Ｅｖａｎｓら、１９９０；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９０）、ヒツジおよびヤギ（Ｍｅｉｎｅｃｋｅ−ＴｉｌｌｍａｎｎおよびＭｅｉｎｅｃｋｅ、１９９６；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９１）、ウサギ（Ｇｉｌｅｓら、１９９３、Ｇｒａｖｅｓら、１９９３）、ミンク（Ｓｕｋｏｙａｎら、１９９２）、ラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎａら、１９９４）、ならびにハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８））の着床前胚から誘導されている。近年、Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら（２０００）は、ヒトＥＳ細胞株の誘導を報告している。これらのヒトＥＳ細胞は、アカゲザルＥＳ細胞株と似ている。

ＥＳ細胞は、ヒト胚盤胞（受精４日後から７日後まで続く、発生中の胚の初期段階）のＩＣＭ（内部細胞塊）において見出される。胚盤胞は、２つの細胞型を含む、着床前の胚発生期である。この２つの細胞型は、つまり、
１．栄養外胚葉（外胚膜を与える外側の膜）、および
２．内部細胞塊（ＩＣＭ）（適切な胚を形成する）
である。

正常な胚発生において、ＥＳ細胞は、７日目より後に消滅し、３つの胚組織層を形成し始める。しかし、胚盤胞期の間にＩＣＭから抽出されたＥＳ細胞は、実験室において培養され得、そして適切な条件下で無限に増殖し得る。この未分化状態で増殖中のＥＳ細胞は、３つのすべての胚組織層の細胞へと分化する能力を保持する。最終的には、この内部細胞塊の細胞は、胚組織すべてを生じる。ＥＳ細胞が胚盤胞のＩＣＭから誘導され得るのは、この胚形成期（発生第１週の終わり付近）である。

胚盤胞からＥＳ細胞を単離してそのＥＳ細胞を培養中で増殖する能力は、その細胞が由来する胚盤胞の完全性と状態とに大部分依存するようである。簡単に述べると、別個の内部細胞塊を有する大きな胚盤胞は、最も効率的にＥＳ細胞を生じる傾向がある。胚性幹細胞株を樹立するための内部細胞塊（ＩＣＭ）の単離のために、いくつかの方法が使用されている。最も一般的な方法は、以下の通りである。

（１．胚盤胞の自然孵化）
この手順において、胚盤胞が、フィーダー層上に配置した後に自然に孵化させられる。胚盤胞の孵化は、通常は６日目に生じる。孵化した胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）は、成長物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を発生する。この成長物は、機械的に取り出され、その後、胚性幹細胞株を樹立するために増殖される。しかし、この手順は、いくつかの不利益を有する。第１に、栄養外胚葉細胞が、所定の培養条件において非常に速く増殖し、しばしば、内部細胞塊の成長物を抑制する。第２に、内部細胞塊の成長物を機械的に取り出す間に、栄養外胚葉細胞を単離する可能性が存在する。第３に、ヒトにおいて自然に孵化する胚盤胞の割合は、非常に低い。

（２．顕微手術）
内部細胞塊を単離するための別の方法は、顕微手術と呼ばれる機械的吸引である。このプロセスにおいて、胚盤胞は、マイクロマニピュレータシステムを使用して保持ピペットにより保持され、そして内部細胞塊（ＩＣＭ）が９時の位置にあるように配置される。内部細胞塊（ＩＣＭ）は、角度の付いた形状である生検針を使用して吸引され、胞胚腔中に挿入される。この手順もまた、不利である。なぜなら、完全な内部細胞塊を単離する可能性が低く、かつしばしば、細胞が分解するからである。これは、非常に冗漫な手順であり、胚に深刻な損傷を生じ得る。細胞レベルでの操作には、マイクロメートルの精度を備える道具が必要であり、それにより、損傷および混入が最小に抑えられる。

（３．免疫手術）
これは、内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離するために一般的に使用される手順である。内部細胞塊（ＩＣＭ）は、補体媒介溶解により単離される。この手順において、胚盤胞が、胚盤胞の透明帯（殻）を除去するために、酸性タイロード溶液またはプロナーゼ酵素溶液のいずれかに曝露される。その後、透明帯を含まない胚が、ヒト表面抗体に約３０分間〜１時間曝露される。この後、胚は、栄養外胚葉を溶解するために、モルモット補体に曝露される。この補体媒介溶解された栄養外胚葉細胞は、細く引かれたパスツールピペットを用いる機械的ピペッティングを反復することによって、内部細胞塊（ＩＣＭ）から取り除かれる。文献中にて現在報告されている胚性幹細胞株はすべて、この方法により誘導されている。しかし、この方法は、いくつかの不利点を有する。第１に、胚が、酸性タイロードまたはプロナーゼに長期間曝露されて、胚に対して有害な影響が引き起こされ、それにより、適切な胚の生存度が減少する。第２に、この方法は、時間がかかる手順である。なぜなら、この方法は、約１．５時間〜２．０時間かかるからである（Ｎａｒｕｌａら、１９９６）。第３に、胚盤胞１つ当たりの内部細胞塊（ＩＣＭ）の収量が、低い。第４に、この手順において使用される抗体および補体について、重要な貯蔵条件が必要とされる。最後に、この方法は、動物起源のウイルスおよび細菌がヒトに伝達する危険を包含する。なぜなら、動物由来の抗体および補体が、このプロセスにおいて使用されるからである。このプロセスにおいて、２つの動物血清が使用される。一方は、ウサギ抗ヒト抗血清であり、他方は、モルモット補体血清である。

現在まで研究されたヒト細胞株は、動物ベースの抗血清および補体が使用された免疫手術方法を使用して主に誘導されている。

既存の細胞株についての他の起こり得る不利点は、以下の通りである：
１．ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株を培養するためにフィーダー細胞を使用すると、混合細胞集団が生成され、この混合細胞集団は、フィーダー細胞成分から胚性幹細胞（ＥＳＣ）を分離することを必要とし、これにより、スケールアップを損なわれる。

２．胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、フィーダー細胞からの転写物により汚染され、そして商業的スケールでは使用され得ない。この胚性幹細胞は、研究目的のためにのみ使用され得る。

Ｇｅｒｏｎは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株がフィーダー細胞の非存在下で培養される手順を確立した（ＸＵら、２００１）。このｈＥＳＣは、馴化培地において細胞外マトリックス上で培養され、この増殖環境において、非分化状態で増殖された。このｈＥＳＣは、その培養物中の他の細胞由来の癌性起源の外因性成分を含まなかった。また、ｈＥＳＣ細胞およびその誘導体の生成は、商業的生成のためにより適切であった。このプロセスにおいて、培養物を支持するために継続状態でフィーダー細胞を生成する必要がなく、細胞の継代が、機械的に行われ得た。しかし、この手順の主な不利点は、外因性成分を含むフィーダー層を使用して胚性幹細胞の初期誘導が行われる免疫手術法によって、内部細胞塊（ＩＣＭ）が単離されることである。これにより、動物起源のウイルスおよび細菌による混入が起こり得るという問題が生じる。

内部細胞塊単離手順を簡単にして安全にするために、本発明の科学者らは、非接触レーザを使用して内部細胞塊を単離する新規な方法を発表する。この方法において、動物ベースの抗血清および補体の使用は、排除されている。

（補助生殖におけるレーザ技術の使用）
補助生殖技術（ＡＲＴ）の出現に伴い、受精を改善し、胚盤胞孵化を容易にし（Ｃｏｈｅｎら、１９９０）、そして割球生検を実施する（ＴａｒｉｎおよびＨａｎｄｙｓｉｄｅ，１９９３）ための、いくつかの方法が使用されている。透明帯中に孔を作製する（Ｇｏｒｄｏｎ、１９８８）ために一般的に使用される方法は、化学的方法（ＧｏｒｄｏｎおよびＴａｌａｎｓｋｙ，１９８６）、機械的方法（Ｄｅｐｙｐｅｒｅら、１９８８）およびレーザ方法（Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒら、１９９２）である。近年、顕微鏡対物鏡を通して焦点を合わせる１．４８μｍ赤外ダイオードレーザビームが、マウスおよびヒトの透明帯に、迅速にかつ簡単にかつ接触せずに微小孔作製することが可能であることが示され、従来の培養条件下で、高い精度が維持された（Ｒｉｎｋら、１９９４）。この孔作製効果は、透明帯の糖タンパク質マトリックスの非常に局所的な熱依存性破壊に起因することが示された（Ｒｉｎｋら、１９９６）。３０８ｎｍキセノン−塩素エクシマーレーザにより誘導される緊密マウス胚に対する有害な影響（Ｎｅｅｖら、１９９３）とは対照的に、赤外領域における孔作製プロセスは、マウスにおいて（Ｇｅｒｍｏｎｄら、１９９５）も、ヒトにおいても（Ａｎｔｉｎｏｒｉら、１９９４）、胚生存に影響を与えなかった。

現在、レーザが、受精を補助するためおよび補助孵化における道具として調査されている。近年の報告は、マウス透明帯に微小孔作製するために１．４８μｍダイオードレーザを使用すると、非常に安全であり、マウス中に神経解剖学特性および神経化学特性に影響を与えない（Ｇｅｒｍｏｎｄ、１９９６）ことを示す。Ｏｂｒｕｃａおよび同僚は、１９９４年にヒトＩＶＦにおけるレーザ補助孵化の成功を最初に報告した。この研究において、胚が２細胞期〜４細胞期である時に２０ミクロン〜３０ミクロンの孔が透明帯（ＺＰ）中に作製され、そして胚芽がすぐに移植された。２つの別個のセンターから来た以前に体外受精（ＩＶＦ）に失敗している患者が、この研究に含まれた。コントロール群（６％）に対して高い１つの胚当たりの移植率がレーザ補助孵化群（１４．４％）において存在した。１回の移植当たりの妊娠率もまた、改善された（１６．２％に対して４０％）。

別の研究において、Ｅｒ：ＹＡＧレーザが、反復して体外受精（ＩＶＦ）を受けている患者由来の胚の透明帯（ＺＰ）を薄くするために使用された。ＺＰを薄くするためのレーザを使用することにより、胎生学者は、ＺＰの正確な５０％減少を達成可能である。これは、酸性タイロード溶液を用いては非常に困難である。胚付近に酸性タイロード溶液が存在することはまた、有害でもあり得る。レーザ孵化群における臨床的妊娠率は、コントロール非孵化群における２３．１％と比較して、４２．７％であった。このデータは、有望であるように見えたので、レーザ補助孵化の適応が拡大された。最初に体外受精（ＩＶＦ）を受けた助成は、コントロール非孵化群における臨床的妊娠率１９％に対して、レーザ処置群において３９．６％の臨床的妊娠率を生じた（Ｐａｒｉｋｈら、１９９６）。

最近１０年間の間に、内部細胞塊（ＩＣＭ）の単離に関する研究が進行中である。なぜなら、内部細胞塊の単離は、胚性幹細胞株を樹立する際に有用であり、この胚性幹細胞株は、その後、人体中の特化した細胞（血液細胞、皮膚細胞、筋肉細胞および神経細胞）のほとんどへと発生する能力を有するからである。これらの胚性幹細胞株はまた、培養中に無限に分裂しかつ増殖する能力も有する。

本発明は、免疫手術の扱いにくい手順を行うことなくレーザ切除技術を使用する、内部細胞塊（ＩＣＭ）の単離に関する。従って、本発明において、動物由来抗体または動物由来血清の使用が排除され、そしてこの手順は、安全であり、簡単であり、かつ商業的に実行可能である。

本発明は、従来の内部細胞塊（ＩＣＭ）単離方法に関係する欠点を取り除く。本発明により単離された内部細胞塊（ＩＣＭ）は、その細胞に対していかなる破壊も損傷も生じることなく、インタクトであることが見出される。従って、本発明は、内部細胞塊（ＩＣＭ）の単離のための迅速で信頼性があり非侵襲的な方法を提供する。この方法はまた、栄養外胚葉を完全に破壊し、それにより、内部細胞塊（ＩＣＭ）の汚染を最小にし、そのようにして内部細胞塊の純度を確保する。
・本発明はまた、以下を提供する：
・（項目１） 非接触ダイオードレーザ技術を使用してヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株を樹立するために内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離する方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ｉ）３５ｍｍペトリ皿において、ミネラルオイルで覆われた５０μｌの従来型胚生検培地中に胚盤胞を配置する工程；
（ｉｉ）加熱ステージを備える顕微鏡と、保持ピペットを保持するためのツールホルダと、吸引ピペットと、空気シリンジとからなる、マイクロマニピュレータシステムを設ける工程；
（ｉｉｉ）上記胚盤胞を含む上記（ｉ）のペトリ皿を、上記（ｉｉ）の加熱ステージ上に配置し、上記胚盤胞を視野の中心に調整する工程；
（ｉｖ）単離されるべき内部細胞塊（ＩＣＭ）が３時の位置にある様式で上記空気シリンジを通して吸引することによって、９時の位置に上記保持ピペットを用いて上記胚盤胞を固定する工程；
を包含する、方法。
・（項目２） 項目１に記載の方法であって、３パルス〜５パルスの１．４８マイクロダイオードレーザを使用して透明帯をレーザ切除して、上記透明帯中に存在する糖タンパク質マトリックス中に孔を作製することによって、上記透明帯を溶解する工程をさらに包含する、方法。
・（項目３） 項目１に記載の方法であって、１．４８マイクロダイオードレーザ使用して栄養外胚葉細胞を細胞溶解により切除することによって、内部細胞塊（ＩＣＭ）に近接する上記栄養外胚葉細胞を除去する工程をさらに包含する、方法。
・（項目４） 項目１に記載の方法であって、内部細胞塊（ＩＣＭ）を吸引する工程をさらに包含し、上記吸引工程は、以下の工程：
（ｉ）内部細胞塊（ＩＣＭ）に近接している透明帯および栄養外胚葉細胞中にある孔を通して上記吸引ピペットを胚盤胞に近接させる工程；
（ｉｉ）上記項目４（ｉ）の空気シリンジを通して穏やかに吸引することによって、上記内部細胞塊（ＩＣＭ）を上記吸引ピペット中に吸引する工程；
（ｉｉｉ）上記項目４（ｉｉ）の吸引された内部細胞塊（ＩＣＭ）を、下記項目５の培養液滴中にゆっくり放出する工程；
を包含する、方法。
・（項目５） 項目１に記載の方法であって、胚性幹細胞を培養する工程をさらに包含し、上記培養工程は、以下の工程：
（ｉ）上記単離された内部細胞塊（ＩＣＭ）を、胚性幹細胞培地の微小液滴中で数回洗浄する工程；
（ｉｉ）胚性幹細胞の樹立のために、培地の存在下にフィーダー層を含むプレート上に上記内部細胞塊（ＩＣＭ）を配置する工程；
を包含する、方法。
・（項目６） 項目１に記載の方法であって、上記胚生検培地が、Ｃａ ^＋＋ ／Ｍｇ ^＋＋ を含まない、方法。
・（項目７） 項目５（ｉｉ）に記載の方法であって、上記使用される培地が、胚性幹細胞培地である、方法。
・（項目８） 項目５（ｉｉ）に記載の方法であって、上記使用されるプレートが、０．５％ゼラチンでコートされたプレートである、方法。
・（項目９） 項目５に記載の方法であって、上記胚性幹細胞培地が、
（ｉ）ピルビン酸ナトリウムを含まず、高グルコース含量（７０％〜９０％）である、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と、
（ｉｉ）ウシ胎仔血清（１０％〜３０％）と、
（ｉｉｉ）β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）と、
（ｉｖ）非必須アミノ酸（１％）と、
（ｖ）２ｍＭ Ｌ−グルタミンと、
（ｖｉ）塩基性線維芽細胞増殖因子（４ｎｇ／ｍｌ）と
の組み合わせである、方法。
・（項目１０） 項目５（ｉｉ）に記載の方法であって、上記フィーダー層が、マウス起源またはヒト起源である、方法。
・（項目１１） 内部細胞塊を単離するための方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ｉ）透明帯と、栄養外胚葉と、内部細胞塊とを有する、胚盤胞期胚を固定する工程；
（ｉｉ）レーザ切除によって、上記胚盤胞期胚中に開口部を作製する工程；および
（ｉｉｉ）上記開口部を通して上記胚盤期胚から上記内部細胞塊を取り出す工程；
を包含する方法。
・（項目１２） 項目１１に記載の方法であって、上記開口部が、上記透明帯を通る、方法。
・（項目１３）
項目１１に記載の方法であって、上記開口部が、上記透明帯と上記栄養外胚葉とを通る、方法。
・（項目１４） 項目１１に記載の方法であって、上記レーザ切除が、非接触ダイオードレーザを使用して達成される、方法。
・（項目１５） 項目１４に記載の方法であって、上記非接触ダイオードレーザが、１．４８μｍの連続ダイオードレーザである、方法。
・（項目１６） 項目１１に記載の方法であって、上記内部細胞塊が、上記開口部を通して導入された吸引ピペットを使用する吸引によって取り出される、方法。
・（項目１７） 項目１１に記載の方法であって、動物から生成された抗体および血清の非存在下で実施される、方法。
・（項目１８） ヒト胚性幹細胞株を樹立するための方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ｉ）レーザ切除により胚盤胞期胚中に開口部を作製し、上記開口部を通して上記胚盤胞期胚から内部細胞塊を取り出すことによって、胚盤胞期胚から内部細胞塊を単離する工程；
（ｉｉ）胚性幹細胞培地およびマウス不活化胚性線維芽細胞フィーダー層の存在下で上記内部細胞塊を培養して、内部細胞塊由来の塊を生成する工程；
を包含する、方法。
・（項目１９） 項目１８に記載の方法であって、上記胚性幹細胞培地が、
（ｉ）上記胚性幹細胞培地のうちの約７０％〜約９０％の量のダルベッコ改変イーグル培
地であって、ピルビン酸ナトリウムを含まず高グルコース含量を含む、ダルベッコ改変イーグル培地と；
（ｉｉ）上記胚性幹細胞培地の体積のうちの１０％〜３０％の量のウシ胎仔血清と；
（ｉｉｉ）上記胚性幹細胞培地の総モルに基づいて約０．１マイクロモルの量のβ−メルカプトエタノールと；
（ｉｖ）上記胚性幹細胞培地の体積のうちの約１％の量の非必須アミノ酸と；
（ｖ）上記胚性幹細胞培地の総モルに基づいて約２マイクロモルの量のＬ−グルタミンと；
（ｖｉ）上記胚性幹細胞培地１ｍｌ当たり約４ｎｇの量の塩基性線維芽細胞増殖因子と；
から本質的になる、方法。
・（項目２０） 項目１８に記載の方法であって、
上記内部細胞塊由来の塊を取り出す工程；
上記内部細胞塊由来の塊を機械的に分解する工程；および
上記機械的に分解された内部細胞塊由来の塊を新鮮なフィーダー細胞上に再配置する工程；
をさらに包含する、方法。
・（項目２１） ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株を樹立するために内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離する方法であって、上記方法は、実施例を参照して実質的に本明細書中に記載されそして付随する写真にて実質的に示される非接触ダイオードレーザ技術を使用する、方法。

（参考文献）

（発明の目的）
１．扱いにくい免疫手術手順を行うことなく、レーザ切除技術を使用して、内部細胞塊を単離するプロセスを開発することが、本発明の目的である。

２．動物が生成したいかなる抗体および血清も使用することなくレーザ切除技術を使用しＩＣＭを単離し、それによって動物生物からヒトへと伝達する可能性を防ぐことが、本発明の別の目的であり、従って、商業的規模で安全に使用され得る。

３．非接触ダイオードレーザを使用して胚盤胞期の哺乳動物胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離することが、本発明の別の目的である。

４．簡単かつ短時間かつ容易に実行可能な方法によって、内部細胞塊（ＩＣＭ）に影響を与えず／破壊せずに内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離することが、本発明の別の目的である。

５．栄養外胚葉を完全に破壊し、それにより内部細胞塊（ＩＣＭ）の汚染を最小にすることによって、内部細胞塊（ＩＣＭ）の純度を確保することが、本発明のなお別の目的である。

６．従来の方法により単離された内部細胞塊（ＩＣＭ）と比較して高収量かつ高純度の内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離することが、本発明のなお別の目的である。

本発明のこれらの目的および他の目的は、これに続く説明からより容易に明らかになる。

（発明の詳細）
本発明は、透明帯（ＺＰ）および栄養外胚葉（ＴＥ）のレーザ切除と、内部細胞塊の吸引を使用する、胚性幹細胞株を樹立するための内部細胞塊の単離に関する。本発明において、使用される非接触ダイオードレーザは、細胞顕微手術のための非常に正確かつ信頼性のある道具である。このシステムは、最新のファイバーオプティクス技術を組込んでおり、現在利用可能な最も小型のレーザシステムを提供する。１．４８μｍダイオード非接触Ｓａｔｕｒｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍが、マイクロマニピュレータを取付けた倒立顕微鏡に、エピ蛍光ポートを介して取付けられている／埋め込まれている。パイロットレーザが、メイン切除レーザを標的化するために使用され、一連のＬＥＤが、そのレーザが準備され発射準備された時を使用者に知らせる。２秒操作ウィンドウが、レーザを偶発的に発射する可能性を減らすために使用される。このレーザのスポット直径は、必要な孔径により変化され得る。

体外受精（ＩＶＦ）処置を受けているカップルが、余剰のヒト胚を自発的に寄贈する。これらの胚は、これらのカップルからの書面にて自発的同意を得た後に、研究目的のために使用される。本発明において、胚盤胞期の胚が、内部細胞塊の単離のために採取される。この胚盤胞は、３５ｍｍペトリ皿中に、Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を含まない胚生検培地の５０μｌ滴の状態で配置され、ミネラルオイルで覆われる。マイクロマニピュレータが、胚生検手順を実施するために配置される。この胚盤胞は、胚生検培地中に配置され、この胚盤胞を含むペトリ皿が、顕微鏡の加熱ステージ上に配置される。この胚盤胞は、視野の中心に位置決めされる。この胚盤胞は、内部細胞塊が３時の位置にあるように、保持ピペットに固定される。内部細胞塊付近の透明帯および栄養外胚葉が、レーザビームの照準地点に位置決めされる。透明帯および栄養外胚葉の小片が、レーザ切除される。その後、生検ピペットが、この透明帯および栄養外胚葉中の孔を通して穏やかに挿入され、内部細胞塊が、穏やかに吸引される。この完全な内部細胞塊を単離した後、この細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）培地を用いて数回洗浄される。その後、この細胞は、胚性幹細胞培地を含むフィーダー層上に、胚性幹細胞株を樹立するために配置される。その後、胚性幹細胞は、細胞表面マーカー（例えば、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ−４およびアルカリホスファターゼ）について特徴付けされる。この胚性幹細胞はまた、核型決定される。

（ａ）インビトロでの胚盤胞の発生）
施設内倫理委員会の承認が、この研究を開始する前に得られた。不妊治療の完了後にこの研究のために余剰の胚を寄贈することに関して、書面による事前同意が、個々のドナーから得られた。

生きている胚を得るために不妊症患者のために一般的に使用されるプロトコルは、以下の通りである：
卵巣の過剰排卵が、毎日のｇｎＲＨアゴニストアナログ抑制により始まった。この抑制は、中黄体期に開始し、約９日〜１２日間、用量５００ｍｇ〜９００ｍｇで投与した。卵巣刺激が、ヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈＭＧ）または組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（Ｇｏｎａｌ−Ｆ，Ｒｅｃａｇｏｎ）を、年齢および卵巣体積に依存して適切な用量で用いて開始された。この用量はまた、制御された卵巣刺激を生じるために必要なように調整された。血清中β−エストラジオール（Ｅ２）測定を、必要な場合は実行した。膣超音波処置を、７日目から始めて毎日実施した。３つ以上の卵胞が少なくとも最大直径１７ｍｍである場合は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン５０００Ｉ．Ｕ．〜１００００Ｉ．Ｕ．を投与した。経膣吸引を、３４時間〜３６時間後に実施した。その後、卵母細胞を、細胞質内精子注入に供した。

直径４０μｍ〜６０μｍのガラス製保持ピペットが、卵を確保するために使用された。運動能力のある精子が、一滴のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液中に配置され、そしてその上にミネラルオイルを重層された。外径ほぼ５μｍ〜６μｍおよび内経３μｍ〜４μｍを備える注入針が、ほぼ３次の位置にある透明帯を刺すために使用された。選択された精子は、注入マイクロピペットを用いて尾を切断することによって固定された。保持ピペットにより、卵母細胞が確保され、その卵母細胞の中心に、精子が直接注入された。

卵母細胞は、培養１６時間〜１８時間後に、受精について検査された。この時点で、受精した卵母細胞は、前核（一細胞胚とも呼ばれる）を有した。その後、一細胞胚は、予め平衡化された新鮮なＩＳＭ−１培地中に移され、空気中５％のＣＯ_２において３７℃にてインキュベートされた。翌日、胚は、ＩＳＭ−２培地へと移された。１日おきに、胚は、新鮮なＩＳＭ−２培地へと移された。５日目から先は、胚は、胚盤胞発生について検査された。この処置が終わった後、余剰な胚盤胞は、この研究作業のためにカップルから寄贈された。

（ｂ）レーザの調整）
本発明は、非接触ダイオードレーザを使用する、胚性幹細胞の樹立のために内部細胞塊を単離するための独特な方法に関する。このレーザは、細胞顕微手術のための非常に正確かつ信頼性のある道具である。このシステムは、最新のファイバーオプティクス技術を組込んでおり、現在利用可能な最も小型のレーザシステムを提供する。１．４８μｍダイオード非接触Ｓａｔｕｒｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍは、マイクロマニピュレータを取付けたＺｅｉｓｓ倒立顕微鏡に、エピ蛍光ポートを介して取付けられていた。

パイロットレーザが、メイン切除レーザを標的化するために使用され、一連のＬＥＤが、そのレーザが準備され発射準備された時を使用者に知らせる。２秒操作ウィンドウが、レーザを偶発的に発射する可能性を減らすために使用される。このレーザのスポット直径は、必要な孔径により変化され得る。

（ｃ）レーザ切除および内部細胞塊の単離）
胚盤胞期胚が、３５ｍｍペトリ皿中にある５０μｌ生検培地（Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を含まない）滴中に個別に配置された。この胚は、内部細胞塊が３時の位置のままであるように、保持ピペットに固定される。内部細胞塊付近の透明帯および栄養外胚葉が、照準地点に位置決めされる。１．４８μｍ連続ダイオードレーザが、透明帯（ＺＰ）に開口するために使用された。透明帯は、卵母細胞を保護する糖タンパク質層である。この波長にて、この糖マトリックスの局所的熱溶解によって、孔が誘導された。一旦透明帯が溶解されると、３回のパルスを与えて熱分解を引き起こすことによって、栄養外胚葉細胞が切除される。透明帯および栄養外胚葉の両方の切除の後、レーザ切除された孔を通して、内径３０ミクロン〜３５ミクロンを備える吸引ピペットが導入され、穏やかな吸引によって、ＩＣＭが取り出された。

（ｄ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養）
培養の前に、吸引されたＩＣＭが、ＥＳ培地中で徹底的に洗浄された。ＥＳ培地は、胚性幹細胞の単離のために好ましいことが見出された。下記に提供されるのが、フィーダー層を使用して本発明が実行された場合の手順である。このプロセスにおいて、内部細胞塊が、非働体化マウス胚性線維芽細胞フィーダー層の存在下で、９６ウェルプレートにおいて培養された。胚性線維芽細胞フィーダー層は、好ましくは、１２．５日齢〜１３．５日齢のＣ５７ＢＬ／６マウスもしくはＣ５７ＢＬ／６ＸＳＪＬ Ｆ−１マウスもしくは異系交配ＣＤ１マウスからか、またはヒト羊水から得られ、フィーダー層として使用された。胚性線維芽細胞フィーダー層は、γ照射（３５００ｒａｄ）により非働体化された。このマウス胚性線維芽細胞フィーダー層は、ＥＳ培地を含む、０．５％ゼラチンコートプレート上で培養された。このＥＳ培地は、ピルビン酸ナトリウムを含まず、高グルコース含量（７０％〜９０％）である、ダルベッコ改変イーグル培地と、ウシ胎仔血清（１０％〜３０％）と、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）と、非必須アミノ酸（１％）と、２ｍＭ Ｌ−グルタミンと、塩基性線維芽細胞増殖因子（４ｎｇ／ｍｌ）とからなった。その後、内部細胞塊は、マウス非働体化胚性線維芽細胞上に配置された。４日〜７日間後、ＩＣＭ由来の塊が、火炎加工した滅菌ピペットを用いて成長物から取り出され、機械的に解離され、そして新鮮なフィーダー細胞上に配置された。１％トリ血清を補充した０．５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて、さらなる解離が実行された。

樹立された細胞株は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（２０００）に記載されるようにして、核型決定され、そして、いくつかの細胞表面マーカー（例えば、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＯＣＴ−４、アルカリホスファターゼ、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−６０）について特徴付けられた。

以下の実施例は、本発明を例示することが意図され、本発明の範囲を限定することは意図されない。

（実施例１）
合計２４個の胚盤胞期のヒト胚を、内部細胞塊の単離のために使用した。胚を、胚盤胞培養培地（ＩＳＭ−２培地，Ｍｅｄｉｃｕｌｔ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で数回洗浄した。その後、個々の胚盤胞を、Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を含まない胚生検培地（ＥＢ １０培地、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ）の５０μｌ滴中に配置した。微小滴を、ミネラルオイルで覆った。マイクロマニピュレータを配置した。外径７５μｍおよび内径１５μｍを備えるガラス製保持ピペットを使用して、胚を確保した。外径ほぼ４９μｍおよび内径３５μｍを備える生検ピペットを、内部細胞塊の吸引のために使用した。パイロットレーザを使用して、メイン切除レーザを標的化するために使用した。内部細胞塊を３時の位置のままにし、内部細胞付近の透明帯および栄養外胚葉が照準地点に位置決めされるように、胚を保持ピペットに固定した。透明帯の局所的熱溶解によって孔を誘導した。３回パルスを与えて熱分解を引き起こすことによって、栄養外胚葉細胞を切除した。透明帯および栄養外胚葉の両方を切除した後、レーザ切除した孔を通して、生検ピペットを導入し、内部細胞塊を取り出した。その後、内部細胞塊を、ＥＳ培地中で数回洗浄し、そしてフィーダー細胞の存在下または非存在下において、９６ウェルディッシュ中に配置した。以下のデータが、表形式で示される。

（表１）
（マウスフィーダー細胞を使用して本発明のレーザ切除技術を使用して発生させた、ｈＥＳＣ株の概要）

同様に、従来の内部細胞塊単離方法を用いて（すなわち、免疫手術を使用して）、実験を行った。この実験は、以下のように報告され得る：
（実施例２）
この目的は、従来の方法（すなわち、免疫手術）を用いる内部細胞塊単離の効率を決定することであり、新規に発明されたレーザ切除方法と比較した。

２１個の胚盤胞期ヒト胚を、内部細胞塊の単離のために使用した。胚を、胚盤胞培養培地（ＩＳＭ−２培地）中で数回洗浄し、その後、ＥＳ培地中で数回洗浄した。その後、個々の胚盤胞期胚を、１：５０抗ヒト抗体（Ｓｉｇｍａ）の５０μｌ滴中に、空気中５％のＣＯ_２下に３７℃にて３０分間配置した。その後、胚盤胞期胚を、ＥＳ培地とともにインキュベートした後に４回洗浄した。その後、胚盤胞を、５０μｌのモルモット補体微小滴中に、濃度１：１０にて、空気中５％のＣＯ_２下に３７℃にて１０分間配置した。インキュベーション後、栄養外胚葉を除去するために、微細孔のあるガラスピペットを使用して、ＥＳ培地中で数回洗浄した。その後、単離された内部細胞塊を、ＥＳ培地を用いて数回洗浄し、そしてフィーダー細胞の存在下または非存在下において、９６ウェルディッシュ中に配置した。データが、表で示される。

上記の方法の両方を使用して内部細胞塊を単離しても、有意な差異は何ら示されなかったが、レーザ切除による内部細胞塊の単離は、明確な利点を有する。この方法は、動物起源の抗体および血清の使用を排除する。レーザ切除法による内部細胞塊の単離物は、フィーダー細胞の存在下または非存在下でさらに培養され得る。しかし、フィーダーのない条件における内部細胞塊の培養により、ＥＳ細胞株に動物ウイルスまたは動物細菌が混入する可能性がさらに排除され、その培養は、ヒト移植研究のために商業的に利用され得る。本実験において、フィーダー細胞の非存在下でＥＳ細胞を樹立するための努力が、なされた。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態が、添付の写真に示される
本発明の図１（ａ）〜１（ｇ）は、ある胚の胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離することに関する。図２（ａ）〜２（ｇ）は、別の胚の胚盤胞からの内部細胞塊（ＩＣＭ）の単離に関する。図３、図４、および図５は、種々の段階のフィーダー細胞上でＩＣＭを培養することに関する。

本発明は、本明細書中で上記された目的を実行し上記目標および利点を得るために十分に適合されることを、当業者は認識する。本発明は、本明細書中で、最も実際的でありかつ好ましい実施形態とみなされるものが示され記載されている。本発明の範囲内にあるようにこの実施形態からの逸脱がなされ得ることが、認識される。本発明は、開示される事項に限定されることなく、そして特許請求の範囲の範囲内にあるすべての等価物へと拡張することが、理解されるべきである。

図１（ａ）は、ＩＣＭが３時の位置にあるようにガラス保持ピペットを用いて確保された、ヒト胚盤胞の写真を示す。 図１（ｂ）は、透明帯および栄養外胚葉の一部がレーザにより切除されている（矢印）、写真を示す。 図１（ｃ）は、透明帯および栄養外胚葉が切除された後の、胚盤胞付近の吸引ピペットの写真を示す。 図１（ｄ）は、吸引ピペットを用いるＩＣＭの吸引開始の写真を示す。 図１（ｅ）は、吸引プロセスの間の吸引ピペット中にあるＩＣＭ部分の写真を示す。 図１（ｆ）は、胚盤胞から取り出された後のＩＣＭの写真を示す。 図１（ｇ）は、ＩＣＭ単離後に残っている残留栄養外胚葉および残留透明帯の写真を示す。 図２（ａ）は、ＩＣＭが３時の位置にあるようにガラス製保持ピペットを用いて確保された、別のヒト胚盤胞の写真を示す。 図２（ｂ）は、透明帯および栄養外胚葉がレーザ切除された後の、内部細胞塊のわずかな突出の写真を示す。 図２（ｃ）は、透明帯および近隣の栄養外胚葉細胞をレーザで切除した後の、ＩＣＭ付近の位置にある吸引ピペットの写真を示す。 図２（ｄ）は、おだやかな吸引により吸引ピペットを用いて吸引されている、ＩＣＭの写真を示す。 図２（ｅ）は、吸引ピペット中にあるＩＣＭ部分の写真を示す。 図２（ｆ）は、胚盤胞から取り出された後のＩＣＭの写真を示す。 図２（ｇ）は、胚盤胞からＩＣＭを単離した後の栄養外胚葉および透明帯の写真を示す。 図３（ａ）は、初代マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞上に播種された培養中の単離された内部細胞塊（３日目）の写真を示す。 図３（ｂ）は、初代マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞上に播種された培養中の単離された内部細胞塊（７日目）の写真を示す。 図４は、初代マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞上にある、別の胚の培養中の単離された内部細胞塊（ＩＣＭ）（５日目）の写真を示す。 図５は、レーザ切除法により単離された内部細胞塊に由来する胚性幹細胞の写真を示す。

Claims (14)

1. ヒト胚性幹細胞株を樹立するための方法であって、該方法は、以下の工程：
   （ａ）レーザ切除により胚盤胞期胚中に透明帯と栄養外胚葉とを通る開口部を作製し、該開口部を通して該胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を取り出すことによって、該胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を単離する工程；
   （ｂ）フィーダーのない条件下で該内部細胞塊の細胞を培養して、内部細胞塊由来の塊を生成する工程；および
   （ｃ）前記内部細胞塊由来の塊を培養して、単離されたヒト胚性幹細胞株を生成する工程；
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、細胞外マトリックスを含む、方法。
3. 請求項２に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、馴化培地をさらに含む、方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、前記工程（ｂ）の内部細胞塊由来の塊を機械的に解離する工程、および該内部細胞塊由来の塊の機械的に解離された細胞を、フィーダーのない条件下に再配置する工程、をさらに包含する、方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、細胞外マトリックスを含む、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、馴化培地をさらに含む、方法。
7. 単離されたヒト胚盤胞の内部細胞塊から細胞株を樹立するための方法であって、該胚盤胞は、透明帯と、栄養外胚葉と、内部細胞塊とを有し、該方法は、
   （ａ）レーザ切除によって、該胚盤胞中に該透明帯と該栄養外胚葉とを通る開口部を作製する工程；
   （ｂ）該開口部を通して該胚盤胞から該内部細胞塊に由来する細胞を、動物から生成された抗体および動物から生成された血清の非存在下での吸引により単離する工程；および
   （ｃ）該細胞を培養して、細胞株を樹立する工程
   を包含し、該内部細胞塊の単離された細胞が、フィーダーのない条件下で培養される、方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、細胞外マトリックスを含む、方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、馴化培地をさらに含む、方法。
10. 単離されたヒト胚盤胞からヒト胚性幹細胞株を樹立する方法であって、該ヒト胚盤胞は、内部細胞塊を含み、該方法は、
    （ａ）レーザ切除により該胚盤胞中に透明帯と栄養外胚葉とを通る開口部を作製する工程；
    （ｂ）該開口部を通して該胚盤胞から該内部細胞塊に由来する細胞を、動物から生成された抗体および動物から生成された血清の非存在下での吸引により単離する工程；および
    （ｃ）該細胞を培養して、単離されたヒト胚性幹細胞株を得る工程；
    を包含し、該工程（ｂ）が、前記内部細胞塊の細胞をフィーダーのない条件に配置する工程をさらに包含し、内部細胞塊由来の細胞塊が形成される、方法。
11. 請求項１０に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、前記内部細胞塊の細胞を細胞外マトリックスに配置することを包含する、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記細胞が、馴化培地の存在下で培養される、方法。
13. 請求項１０に記載の方法であって、前記内部細胞塊由来の細胞塊が、解離され、そして細胞外マトリックス上に再配置される、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記細胞が、馴化培地の存在下で培養される、方法。