BG64394B1 - Манипулиране на протопорфириноген оксидазната ензимна активност в еукариотични организми - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до нови еукариотични ДНК последователности, кодиращи природна протопорфириногеноксидаза (протокс) или модифицирани форми на ензима, които са хербицидно толерантни, и до растения с изменена протокс активност,придаваща толерантност спрямо хербициди. Растенията могат да се селекционират или създадат специално за резистентност спрямо протокс инхибитори чрез мутация на природния протокс ген в резистентна форма или чрез повишени нива на експресията му, или могат да бъдат трансформирани с модифицирани еукариотични или прокариотични кодиращи последователности, или див тип прокариотични протокс последователности, които са хербицидно толерантни. Изобретението се отнася също до диагностика и други приложения на новата еукариотична протокс последователност, до растителни гени,кодиращи див тип и изменен протокс, до пречистен растителен протокс, до методи за изолирането му от растения и за приложението на кодиращи протокс гени. а

Description

Изобретението се отнася предимно до манипулиране на ензимната активност, отговорна за превръщането на протопорфириноген IX в протопорфирин IX по време на биосинтезата на веществата, обща за всички еукариотични организми. В един аспект, изобретението е приложимо за развиване на хербицидна резистентност в растения, растителни тъкани и семена. В друг аспект, изобретението е приложимо за развиване на диагностиката и лечението при недостатъчност на тази ензимна активност при животни, и по-специално при хора.

Биосинтетичните пътища, които водят до получаване на хлорофил и хем споделят множество общи етапи. Хлорофилът е пигмент, който присъства във фотосинтезиращите организми и който може лесно да се получи от тях. Хемът е кофактор на хемоглобин, цитохроми, Р450 смесено- функциониращи оксигенази, пероксидази и каталази /виж, напр. Lehninger,Biochemistry, Worth Publishers, New York (1975), и поради това е необходим компонент за всички аеробни организми.

Последният общ етап в синтезата на хемоглобина и хема е окисляването на протопорфириноген IX в протопорфирин IX. Протопорфирин оксидаза (означена тук като “протокс”) е ензим, който катализира този последен етап на окисляване (Matringe et al., Biochem. J. 260:213 (1989)).

Ензимът протокс е пречистен частично или изцяло от много организми, включително дрождите Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, в Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.H.Dayley, ed McGraw Hill: New York, pp.235-285 (1990), ечемичени етиопласти (Jacobs and Jacobs, Biochem. J.244:219 (1987)), и миши черен дроб (Dailey and Karr, Biochem. 26:2697 (1987)). Гени, кодиращи протокс, са изолирани от два прокариотични организма, Echerichia coli (Sasarman et al., Can J.Microbiol. 39:1155 (1993)) и Bacillus subtilis (Dayley et al., J.Biol. Chem.269:813 (1994)). Тези гени не притежават секвенционно сходство, нито пък техните предполагаеми протеинови продукти проявяват сходство в аминокиселинната последователност. Е. coli протеинът е приблизи телно 21 kDa и се асоциира с клетъчната мембрана. B.subtilis протеинът е 51 kDa и е разтворим, с цитоплазматична активност.

Понастоящем твърде малко е известно за протокс ензима, така че да стане възможно изолиране на протокс кодиращи гени от висши еукариотични организми (напр. животни, растения и всички други многоклетъчни ядрени организми, различни от низши еукариотични организми като дрожди, от едноклетъчни водорасли, протозоа и др.) с помощта на известни похвати.

По-специално, много от стандартните техники за изолиране на нови протеини и гени са основани на предположението, че те ще са значително сходни по първичната си структура (напр. аминокиселина или ДНК последователност) с известни протеини и гени, които имат еднаква функция. Такива стандартни техники включват хибридизация на нуклеинови киселини и амплификация чрез полимеразна верижна реакция с помощта на олигонуклеотидни праймери, съответстващи на съхранени мотиви от аминокиселинни последователности. Тези техники не би трябвало да се очаква, че са полезни за изолиране на еукариотични протокс гени с помощта на известната понастоящем информация за структурата, която е ограничена до прокариотични протокс гени, доколкото няма значимо структурно сходство дори сред известните прокариотични протокс гени и протеини.

Друг подход, който е използван за изолиране на биосинтетични гени в други пътища на метаболизма у висши организми, е комплементацията на микробни мутанти, с недостатъчност на желаната активност. За този подход, сДНК библиотека от висшия еукариот се клонира във вектор, който може да насочи експресията на сДНК в микробен гостоприемник. Векторът след това се трансформира или с други думи се включва в мутантен микроб, и се прави подбор на колонии, които фенотипно не са вече мутантни.

Този подход е разработен за изолирани гени от висши еукариоти, които са включени в няколко метаболитни пътища, включително биосинтезата на хистидин (напр. US . 5290926 и WO 946 026909 на Ward et al., включени в приложената литературна справка), биосинтезата на лизин (напр. Aimi et al., Mol.Gen. Genet.228:287 (1991)), и синтезата на триптофан (напр.

Niyogy et al., Plant cell 5:1011 (1993)). Обаче, независимо от наличието на микробни мутанти, за които се счита, че са с недостатъчност на протокс активност ( напр. Е coli (Sasarman etal., J.Gen. Microbiol. 113:297 (1979), Salmonella typhimurium (Xu et al., J.Bacteriol 174:3953 (1992)), и Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys Res Comm. 106:724 (1982)), прилагането на тази техника за изолиране на сДНКи, кодиращи еукариотична протокс ензимна активност е в най-добрия случай непредсказуемо на базата на наличната информация. За това има няколко причини. Най- напред, еукариотичната протокс сДНК последователност може да не бъде експресирана на съответни нива в мутантния микроб, например поради използването на кодон, несъвместим с предпочитанията на микробния гостоприемник. Второ, първичният транслационен продукт от клониранната еукариотична кодираща последователност може да не продуцира функционален полипептид, например ако активността изисква пост- транслационно модифициране, като гликозилиране, което не се осъществява от микроорганизма. Трето, еукариотичният протеин може да не успее да приеме своята активна конформация в микробния гостоприемник, например ако протеинът обикновено е насочен към специфична мембранна система на дадена органела, която в гостоприемника липсва.Тази последна възможност е особено сходна на растителния протокс ензим, който е асоцииран в растителната клетка с органели, които не присъстват в микробния гостоприемник, използван в комплементационното изпитване. По- специално, растителният протокс ензим се асоциира както с хлоропластната обвивка, така и с тилакоидни мембрани (Matringe et al., J.Biol. Chem., 267:4646 (1992)) и вероятно достига такива мембранни системи като резултат от пост- транслационно насочващ механизъм, включващ една Nкрайна транзитна (междинна) последователност, и присъщи за зрелия полипептид свойства (виж, напр. Kohorn and Tobin, Plant Cell 1:159 (1989);Liet al., Plant Cell 3:709 : 709 (1991); Li etal., J. Biol. Chem.267:267: (1992)).

Известно е, че протокс ензимът играе роля в определени условия при заболяване на човека. Пациенти, страдащи от variegate porphyria, едно автозомно доминантно нарушение, характеризиращо се с невропсихиатрични симптоми и лезии на кожата, притежават понижени нива на протокс активност (Brenner and Bloomer, New Engl/ J.Med.302:765 (1980)). Благодарение на знания за човешкия протокс ензим и съответстващия му ген, възможностите за диагностика и лечение на това заболяване понастоящем са много ограничени.

Използването на хербициди за контрол на нежелана вегетация, напр. на плевели или растения в пшеницата, е станало вече почти универсална практика. Съответната продажба възлиза на билион долари годишно. Освен това интензивно използване, контролът върху плевелите остава значим и скъп проблем за фермерите.

Ефективната употреба на хербициди изисква правилен мениджмънт. Например, времето и метод за приложение и стадия на развитие на плевела са критични за постигане на добър резултат на контролиране на плевелите с хербициди. Доколкото някои плевели са резистентни на хербициди, производството на ефективни хербициди става все по-необходимо.

За съжаление, хербициди, които проявяват по-висок потенциал, въздействие върху поширок спектър плевели и по-бързо разграждане в почвата, може също да притежават и повисока фитотоксичност. Едно решение на проблема е да се създадат растения, резистентни или толерантни на хербициди. Пшенични хибриди или сортове, резистентни на хербициди позволяват използването на хербициди без риск от увреждане на реколтата. Създаването на резистентност може да позволи прилагане на хербицид върху пшеницата, където тяхната употреба по-рано е била възпрепятствана или ограничена, дължащо се на чувствителността на пшеницата спрямо хербицида. Например, US 4 761 373 на Anderson at al. е насочен към растения, резистентни на различни имидазолинон или сулфонамидни хербициди. Резистентността се потвърждава с изменен ацетохидроксиацид синтазен (AHAS) ензим. US 4 975 374 на Goodman et al. се отнася до растителни клетки, съдържащи ген, кодиращ мутантна глутамин синтетазна (GS) резистентност по отношение на инхибиране от хербициди, за които се знае, че инхибират GS, напр. фосфинотрицин и метионин сулфоксимин. US 5 013 659 на Bedbrook et al., е насочен към растения, които експресират мутантна ацетолактат синтетаза, която ги превръща в резистентни по отношение на ин хибиране от хербициди на основата на сулфонилуреата. US 5 162 602 на Somers et al, описва растения, толерантни на инхибиране от хербициди на основата на циклохександион и арилоксифеноксипропанова киселина. Устойчивостта се потвърждава с една изменена ацетил коензим А карбоксилаза (АССаза).

Протокс ензимът служи като мишена за различни хербицидни съединения. Хербицидите, които инхибират протокса, включват много различни структурни класове молекули (Duke et al., Weeds Sci.39.-465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). Тези хербицидни съединения включват дифенилетери { напр. ацифлуорфен, 5-[ 2- хлоро-

4- (трифлуорометил) фенокси]-2- нитробензоена киселина; нейни метилови естери; или оксифлуорен, 2-хлоро-1 - (З-етокси-4-нитрофенокси)-4- (трифлуоробензен)}, оксидиазоли, (напр. оксидиазон, 3- [2,4- дихлоро-4-(1- метилетокси) фенил]-(5- 5 (1,1-диметилетил)-1,3,4-оксадиазол- 2- (ЗН)-он), цикло имиди (напр. S- 23142, М-(4-хлорофенил)-3,4,5,6-тетрахидрафталимид), фенил пиразоли (напр. ТМРР-етил, етил 2-[1-(2,3,4- трихлорофенил)-4- нитропиразолил-

5- окси] пропионат; М&В 39279), пиридинови производни (напр. LS 82- 556) и фенопилат и неговите О-енилпиролидино- и пиперидинокарбаматни аналози. Много от тези съединения конкурентно инхбират обичайната реакция, катализирана от ензима, очевидно действайки като субстратни аналози.

Предполагаемият начин на действие на протокс-инхибиращите хербициди включва натрупване на протопорфириноген IX в хлоропласта. Счита се, че това натрупване води до изтичане на протопорфириноген IX в клетъчната среда, където се окислява от пероксидаза до протопорфирин ЕХ. Изложен на въздействието на светлината, протопорфирин IX може да причини образуване на атомен кислород в клетъчната среда. Този кислород на свой ред може да доведе до формиране на други реактивни на кислород видове, което може да причини липидно окисление до получаване на прекисно съединение и разрушаване на мембраната, което води до бърза клетъчна смърт (Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993)).

He всички протокс ензими са чувствителни на хербициди, които инхибират расти телни протокс ензими. И двата протокс ензима, кодирани от гени, изолирани от Escherichia coli (Sasermanetal., Can. J.Microbiol.39:1155 (1993)) и Bacillus subtilis (Dailey et al., J.Biol. Chem. 269:813 (1994), са резистентни на тези инхибитори на хербициди. В допълнение, докладвано е за мутанти на едноклетъчното водорасло Chlamidomonas reinhardtii, резистентни на фениламидния хербицид S- 23142 (Kataoka et al., J.Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata et al., In Research in Photosynthesis, Vol. Ill, N. Murata, ed.Kluwer: Nethwrlands, pp. 567-570 (1992)). Поне един от тези мутанти очевидно притежава изменена протокс активност, която е резистентна не само на хербицидния инхибитор, за който е селекциониран, но също и на други класове протокс инхибитори (Oshio et al., Z.Naturforsch. 48c:339 (1993); Sato et al., In ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Докладвано е и за клетъчна линия от тютюн, резистентна на инхибитора S- 21432 (Che et al„Z. Naturforsch. 48c: 350 (1993).

Изобретението предлага изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от еукариотични организми, за предпочитане висши еукариотични организми. По-специално, изобретението предлага изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазният ензим от растителен или човешки източник.

Предпочитани в обхвата на изобретението са изолирани ДНК молекули, кодиращи протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от двусемеделни (Dicotiledonae) растения, поспециално от растението Arabidopsis, като тези, показани на SEQ ID NOS: 1,3 и 9.

Предпочитани са също изолирани ДНК молекули, кодиращи протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от едносемеделни (Monocotiledonae) растения, по-специално от царевични растения, като тези, показани на SEQ ID N0S: 5 и 7. Специално предпочитани в рамките на изобретението е изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген (протокс) ензимен прдшегн от двусемеделни растения, който протеин включва аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID Nos 2,4 и 10. Предпочитана е и една изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазен (протокс) ензимен протеин от едносемеделно рас тение, който включва аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NOS 6 и 8.

С помощта на информацията, предоставена от изобретението, ДНК кодиращата последователност за протопорфириноген оксидазния (протокс) ензим от който и да е еукариотичен организъм може да бъде получена с помощта на стандартни методи. Така, един от вариантите на изобретението предоставя сонди, способни на специфична хибридизация към еукариотична ДНК последователност, кодираща протопорфириноген оксидазна активност или към съответната тРНК и методи за установяване на тези ДНК последователности в еукариотични организми с помощта на сондите съгласно изобретението.

Настоящето изобретение по-нататък предлага експресионни касети и рекомбинантни вектори, включващи посочените експресионни касети, съдържащи по същество промотор, и по-специално промотор, който се активира в растение, оперативно свързан към ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от еукариотичен организъм съгласно изобретението. Експресионната касета съгласно изобретението може в допълнение да съдържа сигнална последователност, оперативно свързана с посочената ДНК молекула, където сигналната последователност е способна да насочи към дадена мишена протеина, кодиран от посочената ДНК молекула в хлоропласта или в митохондрията.

Освен това, изобретението предвижда растения, растителни клетки, растителни тъкани и семена на растения с променена протокс активност, които са резистентни или поне толерантни на инхибиране от хербицид на нива, които нормално са инхибитори на природно срещаната протокс активност в растението. По-специално, изобретението предлага растения, чиято изменена протокс активност е потвърдена от супер-експресия на дивия тип ензим или от експресията на ДНК молекула, кодираща хербицид толерантен протокс ензим. Този хербицид толерантен протокс ензим може да бъде модифицирана форма на протокс ензим, който се среща обикновено в еукариотични или прокариотични организми; или модифицирана форма на протокс ензим, който обикновено се среща в прокариота. Растенията, обхванати от изобретението включват ед носемеделни или двусемеделни растения, и поспециално хибридни растения. Предпочитат се онези растения, които биха били потенциални мишени за протокс инхибиращи хербициди и по-специално, зърнени култури като царевица, пшеница, овес, ръж, сорго, ориз, ечемик, просо, торф и фуражни треви, и други подобни, а така също и памук, тютюн, захарна тръстика, захарно цвекло, зеле и соя.

Настоящето изобретение по-нататьк обхваща размножителен материал на растение, съгласно изобретението, за предпочитане семена на растението, третирано със защитно покритие и по- специално покритие, което съдържа продукт от групата, състояща се от хербициди, инсектициди, бактерициди, нематоциди, молюстициди или смеси от тях.

Изобретението е насочено още и към методи за получаването на растения, растителни клетки и растителни семена и тяхно трансгенно потомство, което съдържа протокс ензим резистентен на или толерантен на инхибиране от хербицида в концентрация, която инхибира природно срещаната протокс активност. Посочената резистентност или толерантност може да бъде получена чрез експресиране в посоченото трансгенно растение или на ДНК молекула, кодираща модифицирана форма на протокс ензим, който обикновено се среща в еукариотите, или модифицирана форма на протокс ензим, който обикновено се среща, в посоченото растение, или протокс ензим, който обикновено се среща, в прокариоти, или протокс ензим, който е модифицирана форма на протеина, който обикновено се среща в прокариотите.

Един специфичен вариант на изобретението е насочен към получаване на трансгенни царевични растения, царевична тъкан или царевични семена и техни трансгенни растения, които са стабилно трансформирани с рекомбинантна ДНК молекула, включваща подходящ промотор, функционален за растенията, оперативно свързан към структурен ген, кодиращ немодифициран прокариотичен протокс ензим, резистентен на хербицида.

Освен това, изобретението е насочено и към получаване на трансгенни растения, растителни клетки, растителна тъкан и семена на растенията, както и техни трансгенни потомства, които са стабилно трансформирани с рекомбинантна ДНК молекула, включваща под ходящ промотор, функционален за растенията и оперативно свързан към структурен ген кодиращ един немодифициран еукариотичен протокс ензим. Това води до суперекспресия на немодифицирания протокс в растението, достатъчна да избегне инхибирането на ензима от хербицида.

Настоящето изобретение включва и получаване на растения, които експресират изменен протокс ензим, толерантен на инхибиране от хербицид при концентрация, която обикновено инхибира активността на дивия тип, непроменен протокс. В този вариант на изпълнение, растението може да бъде стабилно трансформирано с рекомбинантна ДНК молекула, включваща структурен ген, кодиращ резистентността на протокс, или получено чрез директни селекционни техники, при които са изолирани, охарактеризирани, и развити хербицид резистентни линии.

Изобретението по-нататък е насочено към метод за контролиране растежа на нежелана вегетация, който включва прилагане към растителна популация с изменена протокс активност, резистентна на инхибиране от хербицида при нива, които обикновено са инхибитори на природната протокс активност в посоченото растение, на ефективно количество протокс- инхибиращ хербицид. Растения за защита по желания начин са онези, които биха били потенциални мишени на протокс инхибиращи хербициди, и по-специално важни селскостопански растения като например, царевица и други зърнени култури като пшеница, овес, ечемик, ръж, сорго, просо, торф и фуражни треви, и други подобни, както и памук, захарна тръстика, захарно цвекло, зеле и соя. Хербициди с качеството на протокс инхибитори са онези, подбрани от групата, състояща се от арилурацил, дифенилетер, оксидазол, имид, фенил пиразол, пиридинови производни, фенопилат и 0-фенилпиролидино- и пиперидинокарбамат аналози на посочения фенопилат.

Изобретението включва също получаването на протокс ензима по рекомбинантен път, и методи за приложение на рекомбинантно получения протокс. Изобретението се отнася още и до гостоприемникови клетки, по- специално клетки, подбрани от групата, състояща се от растителни клетки, бактериални клетки, дрождеви клетки и клетки на насекоми, стабилно трансформирани с рекомбинантна ДНК моле кула, която включва промотор, функционален за съответния гостоприемник, оперативно свързан към структурния ген, кодиращ един немодифициран или модифициран еукариотичен протокс ензим, където посоченият гостоприемник е способен да експресира посочената ДНК молекула.

Изобретението по-нататък предоставя методи за приложение на пречистен протокс за скрининг на нови хербициди, които въздействат на активността на протокса, и за идентифициране на хербицид-резистентни протокс мутанти.

По-специално, изобретението е насочено към метод за изпитване на химически вещества за инхибиране активността на растителен протокс ензим, който включва:

(а) комбиниране на посочения протокс ензим и протопорфириноген IX в първа реакционна смес при условия, при които посоченият протокс ензим е способен да катализира превръщането на дадения протопорфириноген IX в протопорфирин IX;

b) комбиниране на посочените химически вещества, посочения протокс ензим и протопорфириноген IX във втора реакционна смес при същите условия, както при първата реакционна смес;

c) възбуждане на посочената първа и посочената втора реакционни смеси при около 395 до около 410 пМ;

d) сравняване на флуоресценцията на посочената първа и посочената втора реакционна смеси при около 622 до около 635 пМ;

където посочените химически вещества са способни да инхибират активността на посочения протокс ензим, ако флуоресценцията на посочената втора реакционна смес е значително по-малка от флуоресценцията на посочената първа реакционна смес.

В друг вариант на изпълнение на изобретението се предоставя метод за идентифициране на модифицирани протокс ензими, резистентни на протокс инхибитора, присъстващ в популация от клетки, включващ етапите на:

a) култивиране на дадената популация в присъствието на посочения протокс инхибитор в количества, които инхибират немодифицирана форма на дадения протокс ензим;

b) подбор на онези клетки от етап а), чийто растеж не е инхибиран; и

c) изолиране и идентифициране на про токс ензима, присъстващ в клетките, подбрани в етап Ь).

В методите за трансформиране на растителните клетки може да бъдат използвани гени, кодиращи променен протокс ензим. Така настоящето изобретение предоставя метод за селекциониране на растения, растителни тъкани или клетки, трансформирани с желания трансген от нетрансформирани клетки, включващ следните етапи:

a) трансформиране на растение, растителна тъкан или растителна клетка с желан трансген, който се поддава на експресия от растението, и ген, кодиращ една променена протокс резистентност спрямо протокс инхибитор;

b) трансфер на така трансформираното растение или растителни клетки в среда, съдържаща протокс инхибитора; и

c) подбор на растения или растителни клетки, които оцеляват в средата.

Изобретението по-нататък е насочено към сонди и методи за установяване присъствието и формата на протокс гена и количественото определяне нивата на протокс транскрибти, които се асоциират с една променена форма на протокс ензима или променени нива на експресия на протокс ензима.

В един аспект, настоящето изобретение е насочено към изолирана ДНК молекула, която кодира еукариотична форма на протопорфириноген оксидаза (обозначена тук като “протокс”), ензимът който катализира окисляването на протопорфириноген IX в протопорфирин IX. ДНК кодиращите последователности и съответстветните им аминнкиселинни последователности за протокс ензими от Arabidopsis thaliana са предложени като SEQ ID NOS 1-4 и 9-10. ДНК кодиращите последователности и съответните им аминокиселинни последователности за царевични протокс ензими са предложени като SEQ ID N0S5-8.

Съгласно изобретението може да бъди изолирана която и да е желана ДНК кодираща протокс ензима. В пример 1 е представен един метод, чрез който се счита, че може да бъде изолирна еукариотична протокс кодираща последователност. Съгласно този метод, сДНК клонове, кодиращи протокс ензим се идентиичцират от библиотека на сДНК клонове, получени от желаният еукариот на базата на тяхната способност да снабдяват с протокс ензимна активност мутантният гостоприемни ков организъм с недостатъчност на такава активност. Подходящи за тази цел са такива гостоприемници, които може да бъдат използвани за скрининг на сДНК експресионни библиотеки и за което са на разположение или по рутинен път могат да бъдат получени мутанти, дефицитни на протокс активност. Такива гостоприемници са, но без да се ограничават до, E.coli (Sasarman et al., J.Gen.Microbiol. 113297 (1979)), almonella typhimurium (Xu et al., J.Bacteriol 174:3953(1992), и Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106-724 (1982)).

Обратно, еукариотични протокс кодиращи последователности могат да бъдат изолирани съобразно добре познати техники, основаващи се на тяхната секвенционна хомоложност спрямо Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nos. 1. 3 и 9) и Zea mays (SEQ ID Nos. 5 и 7) протокс кодиращи последователности, както посочва настоящето изобретение. Съгласно тези техники, цялата или част от познатата протокс кодираща последователност се използва като сонда, която селективно се хибридизира към техните протокс кодиращи последователности, присъстващи в популация от клонирани геномни ДНК фрагменти или сДНК фрагменти (напр. геномни или сДНК библиотеки) от избран организъм. Такива техники включват хибридизационен скрининг на посяти ДНК библиотеки (във вид на плаки или колонии; виж, напр Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) и амплификация c PCR. c помощта на олигонуклеотидни праймери, съответстващи на секвенционни области, съхранени между познати протокс аминокиселинни последователности (виж, напр. Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Тези методи са специално пригодени за изолиране на протокс кодиращи последователности от организми, свързани с организма, от който е получена последователността на сондата. Например, приложение на тези методи с помощта на Arabiodopsis или Zea mays кодиращи последователности като сонда би се очаквало да бъдат добре пригодени за изолиране на протокс кодиращи последователности от други растителни видове.

Изолираните еукариотични протокс последователности, съгласно настоящето изобретение могат да бъдат манипулирани съгласно стандартни техники на генното инженерство. Например цялата протокс последователност или част от нея може да бъде използвана като сонди, способни специфично да се хибридизират към протокс кодиращи последователности и информационни РНК. За постигане на специфична хибридизация при различни условия, такива сонди включват последователности, които са уникални сред протокс кодиращи последователности имат дължина поне 10 нуклеотида, за предпочитане поне 20 нуклеотида в дължина. Такива сонди могат да бъдат използвани за амплифициране и анализ на протокс кодиращи последователности от подбран организъм чрез добре познатия метод на полимеразна верижна реакция (PCR). Тази техника може да бъде полезна за изолиране на допълнителни протокс кодиращи последователности от желан организъм или като диагностично средство за определяне присъствието на протокс кодиращи последователности, в даден организъм и за асоцииране на променени кодиращи последователности при определени неблагоприятни условия като автозомни доминантни нарушения у хора, характеризиращи се както с неврофизиологични симптоми, така и с кожни лезии, притежават понижени нива на протокс активност (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).

Протокс специфични хибридизационни сонди може също да бъдат използвани за картиране локалиацията на природни еукариотични гени в генома на избран организъм с помощта на стандартни техники, основаващи се на селективна хибридизация на сондата спрямо геномни протокс последователности. Тези техники включват, но не са ограничени до, идентифициране на ДНК полиморфизъм, идентифициран или съдържащ се в протокс последователността, и приложението на такъв полиморфизъм за последване на сегрегация на протокс гена, релативен на други маркери от известна позиция на картата в картирана популация, получена от самоопрашванена хибрид от две полиморфни родителски линии (виж Hanp.Helentjaris et al., Plant Mol. Biol.5: 109 (1985), Sommer et al.,Biotechniques 12: 82 (1992); D’ Ovidio et al., Plant Mol.Biol. 15: 169 (1990)). Докато която и да е от еукариотичните протокс последователности се възприема като приложима за картиране на протокс гени от който и да е еукариотичен организъм, предпо читани содни са онези протокс последователности от организми по-близко родствени към избрания организъм, като особено предпочитани са такива протокс последователности от избрания организъм. Картирането на протокс гени по този начин се счита, че е особено приложимо при селекциониране на растения. Например, чрез познаване позициите на генетичната карта на мутантен протокс ген, който потвърждава хербицидната резистентност, могат да бъдат идентифицирани фланкиращи ДНК маркери от референтна генетична карта (виж напр. Helentjaris, Trends Genet. 3:217 (1987)). При интрогресия (получаване на гени от друг вид при междувидова хибридизация) , хербицидната резистентност преминава в новата селекционна линия, като тези маркери след това могат да се използват за наблюдаване разпространението на протокс- свързаната хромозомна ДНК, която все още присъства във възстановения родител след всеки етап от обратното кръстосване.

Протокс специфичните хибридизационни сонди също могат да бъдат използвани за количествено определяне нивата на протокс тРНК в даден организъм с помощта на стандартни техники като например Northern blot анализ. Тази техника може да е приложима като диагностична проба за установяване променените нива на протокс експресия, които могат да са свързани с определени неблагоприятни условия като автозомно доминантно нарушение у хора, характеризиращо се с невропсихиатрични симптоми и кожни лезии, при което има понижени нива на протокс активност (Benner and Bloomer, New Engl. J.Med. 302: 765 (1980)).

За рекомбинантно получаване на ензима в гостоприемников организъм, протокс кодиращата последователност може да бъде инсертирана в експресионна касета, конструирана за избрания гостоприемник и въведена в гостоприемника, където той продуцира рекомбинантно. Изборът на специфични регулаторни последователности като промотор, сигнална последователност., 5’ и 3’ нетранслирани последователности, и енхансер, е във възможностите на специалиста в областта. Получената в резултат молекула, съдържаща отделните елементи, свързани към определена четяща рамка, могат да бъдат инсертирани във вектор, който може да бъде трансформиран в гостоприемниковата клетка. Подходящи вектори за експресия и методи за получаване на протеини по рекомбинантен път са добре известни за гостоприемникови организми като Е. coli (Виж, напр. Stubier and Moffatt, J.Mol. Biol. 189:113 (1986); Brosius, DNA 8 759 (1989)),дрожди (виж, напр., Schneider and Guarente, Meth. Enzymol. 194:373 (1991)) и клетки на насекоми (виж, Hanp.Luckow and Summers, Bio Technol. 6:47 (1988)). Специфичните примери обхващат плазмиди като pBluescript (Stratagene, La Jolla, СА), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, LaJolla, СА) и бакуловирусни вектори на експресия, напр. като получените от генома на Dutographica califomica ядрено полихедрозисен вирус (AcMNPV). Предпочитана бакуловирус/ инсектицидна система са pVIl 1392/ Sf21 клетки (Invitrogen, LaJolla, СА).

Полученият по рекомбинантен път еукариотичен протокс ензим е приложим за различни цели. Например, той може да се използва за осигуряване на протокс ензимната активност in vitro. Може да бъде използван освен това и в in vivo изпитване за скрининг на известни хербициди, за които не е определено дали инхибират протокса. Такива in vivo изпитвания могат да бъдат използвани като пообщо скриниране за идентифициране на съединения, които инхибират протокс активността и които поради това са кандидат хербициди. Обратно, получен по рекомбинантен път протокс ензим може да бъде използван за понататъшно охарактеризиране на неговото асоцииране с известни инхибитори за рационално конструиране на нови инхибиторни хербициди, като хербицид толерантни форми на ензима.

Обикновено, инхибиторният ефект на протокса се определя чрез измерване на флуоресценцията при 622 до 635 пт, след възбуждане при около 395 до 410 пМ (виж, напр. Jacobs and Jacobs, Enzyme 28: 206 (1982); Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Тава изпитване се основава на факта, че протопорфирин IX е флуоресцентен пигмент, а протопорфирин IX е нефлуоресцентен. Протеинови екстракти се получават от подбрани субклетъчни фракции, напр. етиопласти, митохондрии, микрозоми, или плазмени мембрани, чрез диференциално центрофугиране (виж, напр. Lee et al., Plant Physiol. 102: 881 (1993); Prado et al, Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson and

Moore, in Plant Organelles. Reid, ed., pp-1-12; Jacobs, Plant Physiol. 101:1181 (1993)). Протопорфириноген се получава чрез редукция на протопорфирин с натриева амалгама както е описано от Jacobs, and Jacobs. (1982). Реакционните смеси обикновено се състоят от 100 mM Hepes (pH 7. 5), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, около 2 М Протопорфириноген IX и около 1 mg/ml протеинов екстракт. Инхибторни разтвори в различни концентрации, напр. 1 пПр 100 uM, 10 иМ, 1иМ, 100 пМ, 10 пМ, 1 пМ, 100 рМ се добавят към ензимния екстракт преди инициирането на ензимната реакция. След като веднъж протеиновият екстракт е добавен, наблюдава се флуоресценция в продължение на няколко минути, и скоростта на реакцията се изчислява от участъка на линеарност. 1С₅₀ се определя чрез сравняване скоростта на реакцията на инхибиране спрямо контролната реакция.

Друг вариант на настоящето изобретение включва използването на протокс в проба за идентифициране на инхибитор- резистентните протокс мутанти. Обичайните изследвания са следните:

a) инкубиране на първа проба от протокс и неговия субстрат, протопорфириноген IX, в присъствие на втора проба, включваща протокс инхибитор;

b) измерване на ензимната активност на протокса от етап (а);

c) инкубиране на първата проба от мутиралия протокс и неговия субстрат в присъствието на втора проба, съдържаща същия протокс инхибитор;

d) измерване на ензимната активност на мутиралия протокс от етап (с); и

e) сравняване на ензимната активност на мутиралия протокс с тази на немутиралия протокс.

Реакционната смес и условията на протичане на реакцията са същите, както за изследването за идентифициране на инхибитори на протокс (инхибиторна проба) със следните модификации. Първо, протокс мутант, получен както е описано по-горе, е заместен в една от реакционните смеси за дивия тип протокс от инхибиторната проба. Второ, един инхибитор или див тип протокс присъства в двете реакционни смеси. Трето, мутиралата активност (ензимна активност в присъствие на инхибитор и мутирал протокс) и немутиралата активност (ензимна активност в присъствие на инхибитор и див тип протокс) се сравняват за определяне дали се наблюдава значително повишаване на ензимната активност в мутиралата активност при сравнение с немутиралата активност. Мутирала активност е която и да е измерена ензимна активност на мутиралия протокс ензим, независимо от присъствието на подходящ субстрат и инхибитора. Немутирала активност е която и да е измерена ензимна активност на дивия тип протокс ензим независимо от присъствието на подходящ субстрат и инхибитора. Значителното повишение е определено като едно повишаване на ензимната активност, което е по-голямо от размера на грешката, допустима за дадената техника на измерване, за предпочитане повишение от около 2 пъти от активността на дивия тип ензим в присъствие на инхибитор, по-добре повишаване от около 5 пъти, и най-добре повишение повече от около 10 пъти.

Хербицидът, който инхибира протокс, включва много различни структурни класове молекули (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Phisiol. 35: 70 (1989), включително дифенилетери {напр. ацифлуорофен, 5-[2-хлоро-4-(трифлуорометил) фенокси] - 2- нитробензоена киселина; нейният метилов естер; или оксифлуорфен, 2-хлоро-1 - (З-етокси-4-нитрофенокси) -4(трифлуоробензен)}, оксидазоли (напр. оксидазон, 3-[2,4-дихлоро-5-(1-метилетокси) фенил] -

5-(1,1 -диметилетил) -1,3,4-оксадиазол-2- (ЗН) он), цикло имиди (напр. S-23142, N-(4- хлоро2- флуоро- 5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрахидрофталимид; хлорофталим,М-(4-хлорофенил)- 3,4,5,6- тетрахидрофталимид), фенил пи разоли (като напр. TNPP- етил 2-[1- (2,3,4трихлорофенил)-4-нитропиразолил-5-окси] [пропионат:39279). пиридинови производни (като LS 82-556) и фенопилат и неговите 5 О-фенилпиролидино- и пиперидинокарбаматни аналози.

Дифенилетерите със специално значение са онези, притежаващи общата формула:

където R е -COONa (формула II), - CON 15 HSO₂CH₃ (формула III) или -СООСН₂ СООС₂Н₅ (формула IV): виж Maigrot el al., Brighton Crop Protection Conference - Weeds: 47-51 (1989)).

Допълнителни желани диефенилетери са 20 тези, където R е NOCH₂COOCH₃

ССН₂ОСН₃ (Формула Iva; виж Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference - Weeds: 53-58 (1989)).

Допълнително желан дифенилетер е този с формулата:

(Формула IVb; бифенокс, виж Dest et al., Proc Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)).

От особено значение е класът хербициди, известни като имиди, притежаващи обща формула:

о А- о	Cv ОЯ N— ОН	CFjyV° V' О OR	HFjC 1 О
		(ФорнрщУЛ!)	i-Pc|i«fnQ IX)

Ct 'П-⁰'· Ήί λ

CHj фоьмуц ixa)

(виж Hemper etal., (1995) in “Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry”, Ragdale et al., eds. Amer. Chem Soc, Washington, D.C., pp.42-48 (1994)).

и където R] е H, Cl, или F, Rj e Cl и R₃ e оптимално заместен етер, тиоетер, естер, амино или алкилна група. Обратно, R₂h R₃ заедно може да се формат 5-или 6-членно хетероциклено ядро. Примери за имидни хербициди от особен интерес са

(Формула X)

(формула XI)

Н₅С₂ООССНгО

OCHFz ((1>ормула XII) (Виж Мигга <7 й/.. 2?.· (ч7,44.--7 ( ><·/? Prtflccfiun Confr-rettce- Wrrdx: .!?- 4() ο

(формула ХШ) (формула XIV·

ОСНСйСН СЦ| oAh

Hc»c-ctfe ο

Хербицидната активност на горните съединения е описана в Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference. Weeds (British Crop Protection Council) (Формули XII и XVI). Proceedings of the 1993 Brighton Crop 20 Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (Формули XII и XIII). USA (формула XV]

Patent № 4746352 (Формула XI) и Abstracts of the Weeds Science Society of America vol. 33, pp. 9 (1993) (формула XIV).

Най-предпочитаните имидни хербициди са тези, класифицирани като арилурацилови и притежаващи общата формула:

COOR където R обозначава групата (С_{2 6}-алкенилокси)карбонил-С₁₄-алкил, както е описано в US 5 183 492, включен в литературната справка.

(формула XVII)

От особена значимост са хербицдите с обща формула:

(формула XVIII, лшарщипмин;

Виж Ши/гг л‘, SrifAtoH I'rap ίίΐ.'ί.ΐ.Λνκΐ’ Ufvrf» ρο. Λ· ίΓΑΐ.ί,.ι

/формуъя XIX; кярфснФряздИ) lisr ijKC ί.· ji . Brighi&ii Ct-vc .hvayvmi

(формула XX) (ΊΛIni. Pai. ГиЬ1. ШСХМчкДО.

Wu ν.ΜΟίϋΰ. ιι USFat. \o. лОДЯСУна bhejinj.

N -фенил пиразол и

ί Формули ХХЬ нши|м1с»аф*нк ж 6Ζ1 ли' ‘'the Petdcsdc Mamd**, fth ed.. by CЛ.

Ifcnrthm., Onlrtb Crop Vcw^tintlQwMl.SlBIYytl*)!));

и З-заместени-2-арил- 4, 5, 6, 7- тетрахидроиндазоли (Lyga et al. Pesticide Sci 42:2936 (1994)).

Нивата на хербицидите, които обикновено са инхибитори на протокс активността, включват норми на приложения, известни за специалистите, които зависят частично от външни фактори като околна среда, време и метод на прилагане. Например, в случая с имидните хербициди, представени с формули от V до IX, по- специално тези, представени с формули от X до XVII, нормите на прилагане варират от 0. 0001 до 10 kg/ha, за предпочитане от 0. 005 до 2 kg/ha. Тази доза или концентрация на хербицида може да бъде различна, в зависимост от желаното действие и използваното съединение, и може да бъде определено с методите, известни в областта.

Изобретението по-нататък е насочено към растения, растителни тъкани и семена на растения, толерантни към хербициди, които инхибират природно срещаната протокс активност в тези растения, където толерантността се дължи на изменена протокс ензимна активност. Представителните растения включват тези от тях, към които споменатите хербициди са при30 ложими за тяхното нормално очаквано предназначение. Предпочитат се такива важни селскостопански растения, като напр. покритосеменни и голосеменни растения като памук, соя, ряпа, захарно цвекло, царевица, ориз, пшеница, ечемик, овес, ръж, сорго, просо, торф, фураж, торфени треви и др.

Под “изменена протокс ензимна активност” се разбира протокс ензимна активност, различна от тази, която обикновено се среща в растенията (напр. протокс активност, която се среща при липса на директно или индиректно манипулиране на тази активност от страна на човека), която е резистентна на хербицидите, инхибиращи природно срещаната активност. Изменение на протокс ензимната активност може да бъде постигната съгласно изобретението чрез повишаване експресията на дивия тип, хербицид-сензитивен протокс, експресиращ един изменен, хербицид-толерантен еукариотичен протокс ензим в растението, експресиращо модифицирана или немодифицирана бактериална форма на протокс ензима, която е хербицид резистентен в растението, или чрез комбинация от тези техники.

Постигането на изменена протокс ензимна активност посредством повишаване на експресията води до нива на протокса в растителната клетка най- малкото достатъчни да бъде заобиколена инхибицията на растежа, причинено от хербицида. Нивото на експресирания протокс е обикновено поне два пъти, за предпочитане пет пъти и най-вече поне десет пъти по-голямо от природно експресираното количество. Повишената експресия може да се дължи на множеството копия на дивия тип протокс ген; множеството от срещани протокс кодиращи последователности в рамките на протокс гена (напр. ген амплификация) или на мутация в некодиращата, регулаторна последователност на ендогенния протокс ген в растителната клетка. Растения, свързващи такава променена протокс ензимна активност може да бъдат получени чрез пряка селекция. Този метод е известен в областта. Виж, напр. Somers et al. in US 5 162 602 and Anderson et al. in US 4 761373 и литературата, цитирана там. Тези растения също могат да бъдат получени посредством генно инженерни техники, познати в областта.

Повишена експресия на чувствителен на хербицид протокс може да бъде осъществена още и чрез стабилно трансформиране на растителна клетка с рекомбинантна или химерна ДНК молекула, съдържаща промотор, способен да води експресията на асоцииран структурен ген в растителна клетка, присъединен към хомоложен или хетероложен структурен ген, кодиращ протокс. Под “хомоложен” се разбира онзи протокс ген, който е изолиран от организъм, таксономично идентичен на мишенната растителна клетка. Под “хетероложен” се разбира онзи протокс ген, който е получен от организъм, таксономично отличим от мишенната растителна клетка. Хомоложни протокс гени могат да бъдат получени чрез допълване на бактериален или дрождев мутант с сДНК експресионна библиотека от мишенното растение. Виж, напр. пример 1 и Snustad et al, Genetics 120: 11111114 (1988) (царевична глутамин синтаза); Delauney et al., Mol Genet.221-305 (1990) соева - пиролин- 5- карбоксилат редуктаза; Frisch et al., Mol.Gen. Genet.G 228:287- 293 (1991) (царевична дихидродипиколинат синтетаза); Eller et al., Plant Mol.Biol.l 18: 557- 566 (1992) (хлоропластна 3-изопропилмалат дехидрогеназа); Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88:1731-1735 (1991); Minet et al., Plant J.. 2:417- 422 (1992) (дихидрооротат дехидрогеназа) и литература та, цитирана там. Други познати методи включват скрининг на геномни или сДНК библиотеки на висши растения, например, за последователности, които се хибридизират кръстосано със специфични сонди от нуклеинови киселини, или чрез скрининг на експресионни библиотеки за получаване на протокс ензими, които реагират кръстосано със специфични антитяло сонди. Един предпочитан метод включва допълване на един E.coli hemG ауксотрофен мутант с царевична или Arabidopsis thalina сДНК библиотека.

Примери на промотори, способни да функционират в растения или растителни клетки, напр. онези, способни да водят експресия на асоциирани структурни гени като напр. протокс в растителни клетки, обхващат вируса на мозаичната болест по цветното зеле (CaMV) 19S или 35S промотори и CaMV двойни промотори; нопалин синтетазни промотори; свързани с патогенезата (PR) протинови промотори; малки субединици на рибулоза бисфосфат карбоксилазни (ssuRUBISCO) промотори и др. подобни. Предпочитани са оризовият актинов промотор (McElroy et al., MolGen. Genet. 231: 150 (1990)), царевичен убиквитинов промотор (ЕР 0 342 926; Taylor et al., Plant Cell Rep. 12: 491 (1993)), и Pr-1 промотор от тютюн, Arabidopsis, или царевица ( виж Междунар. патентна публ. NPCT/IB95/ 00002 на Ryals et.al., включена изцяло в приложената литературна справка). Предпочита се също и 35S промотора и един усилен или удвоен 35S промотор като този, описан от Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987) и удвоеният 35S промотор, клониран в pCGN2113, депозиран като АТСС 40587, които са описани в ЕР-А 0 392 225, релевантно разкритие на които е направено в приложената литературна справка. Промоторите сами по себе си могат да бъдат модифицирани за манипулиране на промоторната сила с оглед повишение на протокс експресията, в съответствие с известни в областта методики. За получаване на химерни ДНК структури съгласно изобретението, към протокс кодиращата последователност могат да бъдат сляти сигнални или транзитни пептиди с оглед насочване транспортирането на експресирания протокс ензим към желаното място на действие. Примери за сигнални пептиди включват онези, присъединени към растителните свързани с патогенезата протеини, като напр. PR.-l, PR- 2 и др. подобни. Виж, напр. Payne et al., Plant Mol.Biol. 11:89- 94 (1988). Примери за транзитни пептиди са напр. описаните от Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 (1991) Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (19087); Vorst et al., Gene 65:59 (1988), и митохондриални транзитни пептиди, описани от Boutry et al., Nasture 328:340-342 (1987). Счита се съгласно изобретението, че хлоропластни и митохондриални транзитни пептиди са специално приложими, тъй като протокс ензимната активност обикновено се среща в митохондриите и хлоропластите. Особено предпочитани са хлоропластните транзитни пептиди, тъй като инхибицията на протокс ензимната активност в хлоропластите се счита като първична основа за действието на протокс инхибиращите хербициди (Witkowski and Hailing, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lenen et al., Pestic. Biochem. Physiol., 37:239 (1990); Duke et al., Weed Sci.39: 465 (1991)). Включени са също и последователности, които водят до локализация на кодирания протеин в различни участъци на вакуолата. Виж, напр. Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10362-10366 (1991) and Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:21- 53 (1991). Релевантно разкрити, тези публикации са включени в приложената към настоящето описание литературна справка.

Химерните ДНК структури от изобретението могат да съдържат множество копия на протокс структурните гени. В допълнение, структурите може да включват кодиращи последователности за маркери и кодиращи последователности за други пептиди като напр. сигнални или транзитни пептиди, всеки в определена четяща рамка с другите функционални елементи в ДНК молекулата. Получаването на такива структури е във възможностите на специалиста в областта.

Полезните за целта маркери съдържат пептиди, предоставящи хербицидна, антибиотична или лекарствена резистентност, като напр. резистентност спрямо хигомицин, канамицин, С418, гентамицин, линкомицин, метотрексат, глифосфат, фосфинотрицин, или подобни. Тези маркери могат да бъдат използани за подбор на клетки, трансформирани с химерните ДНК структури съгласно изобретението от нетрансформирани клетки. Други полезни маркери са пептидни ензими, които могат лесно да бъдат открити чрез визуални реакции, напр. цветна реакция, като луцифераза, β- глюкуронидаза или β-галактозидаза. Изменена протокс ензимна активност може да бъде постигната още и чрез генериране или идентифициране на модифицирани форми на изолираната еукариотична протокс кодираща последователност, притежаваща поне едно амино киселинно заместване, добавяне или делеция, което кодира изменена протокс ензимна резистентност спрямо хербицид, който инхибира неизменена, природно срещана форма (напр. форми, които се срещат обикновено в даден еукариотичен организъм без да бъде манипулиран, както директно чрез рекомбинантна ДНК методика или индиректно чрез селекция напр. от човека). Гени, кодиращи такива ензими могат да бъдат получени чрез множество известни похвати. Първата от тях включва директна или индиректна мутагенеза на микроорганизми. Например, микроорганизми, които може да бъде подлагани на генетично манипулиране като Е. coli или S. cerevisiae, могат да бъдат подложени на случайна мутагенеза in vivo, например чрез UV светлина или етил или метил метан сулфонат. Мутагенетичните процедури са описани, например от Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Shrman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); and US 4 975 374 (Goodman et al.). Микроорганизмите, подбрани за мутагенеза, съдържат обикновено чувствителен на хербицид еукариотичен протокс ген и са в зависимост от протокс активността, дължаща се на този ген. Мутиралите клетки са култивирани в присъствие на хербицида при концентрации, които инхибират немодифицирания протокс ензим. Колонии от мутирали микроорганизми, които са се развили по- добре от немутиралите в присъствие на инхибитора (т. е. проявили резистентност спрямо инхибитора), се подбират за по-нататъшен анализ. Протокс гените от тези колонии се изолират или чрез клониране, или чрез амплификация с полимеразна верижна реакция, и се уточняват техните последователности. Последователности, които кодират един изменен протокс ензим след това се клонират обратно в микроорганизма за потвърждаване способността им да придават резистентност към инхибитора.

Друг (втори) метод за получаване на мутанти хербицид- резистентни апели на еукариотичния протокс ензим включва директна селекция в растения. Например, въздействието на протокс инхибитор като онези, описани по-горе, върху инхибирането на развитието на растения като Arabidopsis, соя или царевица, може да бъде определено чрез посяване на семена, предварително стерилизирани чрез известни техники, върху минимална хранителна среда, съдържаща повишено количество концентрация на инхибитора. Такива концентрации са 0.001,0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 и 3000 части на милион (ppm). По-ниските дози при които може да се установи значително инхибиране на растежа, се използва за последващи експерименти.

Мутагенезата на растителен материал може да се използва за повишаване честотата, при която се срещат резистентни алели в подбраните популации. Мутирал семенен материал може да бъде получен от различни източници, включително химична или физична мутагенеза на семена, или химична или физична мутагенеза на полен (Neuffer, In maize for Biological Research. Sheridan, ed. Univ. Press. Grand Fores, ND., pp. 61-64 (1982)), които след това се използват за оплождане на растенията и получените в резултат М! мутантни семена се събират обикновено, за Arabinosis. М₂ семена (Lehle Seeds, Tucson, AZ), т. е. поколение на семена на растения, култивирани от химични мутанти на семена, като етил метан сулфонат, или с физични агенти, като гама лъчи или бързи неутрони, се посяват при плътност до 10 000 семена/паничка (10 cm в диаметър) върху минимална хранителна среда съдържаща подходяща концентрация от инхибитора за подбор на резистентността. Прорастъците, които продължават да се развиват и остават зелени 7-21 дни след посяването, се трансплантират в почвата и растат до зрялост и образуване на семена. Поколението на тези семена след това се тестуват за резистентност на хербицида. Ако придобитата резистентност е доминантна, растения чиито семена се разпадат по схемата 3:1:: резистентност: чувствителност се приемат за хетерозиготни по отношение резистентността в поколение М₂. Растения, които всички са резистентни, се приемат за хомозиготни по отношение ре зистентността в поколението М₂. Такава мутагенеза на интактни семена и скрининга на техните поколения семена М₂ може да бъде проведен и върху други видове, например соеви семена (виж, напр. US Patent No 5 084 082 (Sebasrian)). Скринингьт на мутантни семена за хербицидна толерантност се осъществява също като резултат от оплождане с мутантен полен, получен с въздействието на химични или физични средства.

Могат да бъдат възприети два подхода, с които да се потвърди, че генетичната основа на резистентността е изменението на протокс гена. Първо, алели на протокс гена от растения, проявяващи резистентност спрямо инхибитора могат да бъдат изолирани с помощта на PCR с праймери, основани или на съхранени участъци в Arabinosis и царевична протокс сДНК последователност, показана на SEQ ID Nos: ,3, 5,7 о- долу, или за предпочитане, основани на непроменена протокс генни последователности от растенията, използвани за получаване на резистентни алели. След съгласуване на алелите за определяне присъствието на мутации в кодиращите последователности, алелите могат да бъдат тествани за тяхната способност да придадат резистентност спрямо инхибитора у растения, в които вероятните причиняващи резистентността алели са трансформирани. Тези растения може да са Arabinosis или които и да са други растения, чието развитие се влияе от инхибитора. Второ, протокс гените могат да бъдат картирани по отношение на известни рестрикционни фрагменти с различна дължина (RFLP₃) (Виж, например, Chang et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 6856-6860 (1988); Natetal., Plant Cell 1: 699705 (1989). Признаците на резистентност могат да бъдат картирани независимо с помощта на същите маркери. Ако резистентността се дължи на мутация в протокс гена, признаците на резистентност ще се картират при позиция, която не би могла да се отличи от позицията на протокс гена.

Третият метод за получаване на хербицид- резистентни алели на протокс, се основава на подбор на растителни клетъчни култури. Тъканно-културални експланти, напр. зародиши, листни дискове, а така също и активно растящи калуси или суспензионии култури на желаното растение, се култивират върху дефинирана хранителна среда в отсъствие на хем и при повишени концентрации на инхибиторният хербицид или аналогов инхибитор, подходящ за употреба в лабораторна среда. Варирането в степента на растежа се провежда на различни култури. При определени култури, се появяват бързо растящи колонии, които продължават да растат дори в присъствието на нормални концентрации от инхибитора. Честотата, с която такива бързо растящи варианти се появяват може да бъде повишена чрез въздействие с химичен или физичен мутаген преди излагането на тъканите или клетките на въздействието на хербицида. Предполагаеми причиняващи резистентността алели на протокс гена са изолирани и тестувани както е описано в следващите параграфи. Онези алели, идентифицирани като причинители на хербицидната резистентност, след това могат да бъдат конструирани за оптимална експресия и да бъдат трансформирани в растението. Обратно, от тъканните или клетъчни култури, съдържащи тези алели могат да бъдат регенерирани растения, съдържащи тези алели.

Четвърти метод включва мутагенезис на див тип, хербицид-сензитивни протокс гени в бактерии или дрожди, последвано от култивиране на микроорганизма върху среда без хем, но която съдържа инхибиторни концентрации на инхибитора и след това подбор на онези клонове, които растат в присъствието на инхибитора. По-специално, растителна сДНК, като тази на Arabidopsis или царевична сДНК кодиращи протокс се клонира в микроорганизъм, който в друг случай не притежава протокс активност. Примери за такива микроорганизми включват Е. coli, S. Typhimurium и S. cerevisiae ауксотрофни мутанти, включително щамът Е. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979), S. typhimurium, щам TE2483 или TT13680 _Xi et al., J. Bacteriol. 174:3953 (1992)), и хем 14-1 дрождев мутант (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)). Трансформираният микроорганизъм след това се подлага на in vivo мутагенеза чрез която и да е от множеството ензимни или химични методи, известни на специалистите в областта, напр. натриев бисулфит (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457-468 (1983); олигонуклеотид-насочена сатурационна мутагенеза (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad/ Sci. USA, 83: 710-714 (1986); или различни похвати, основани на полимеразни реакции (виж, напр. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64: 313-319 (1988); и Leung et al., Technique 1& 11-15 (1989). Взимат се колонии, които се развиват в присъствие на нормални инхибиторни концентрации на инхибитора и се пречистват чрез повторна рестрикция. Техните плазмиди се пречистват и тестуват за способността им да придават резистентност спрямо инхибитора чрез ретрансформирането им в микроорганизъм, в който липсва протокс. След това се определят ДНК последователности на протокс сДНК инсерти от плазмиди, които преминават този тест.

След като веднъж хербицид резистентните алели бъдат идентифицирани, те могат да бъдат обработени по генно-инженерен път за оптимално експресиране в зърнени растения. Това може да включва увеличаване на кодиращата последователност на резистентният алел за оптимална експресия в желаните видове зърнените растения. Методите за модифициране на кодиращи последователности за постигане оптимална експресия в определени зърнени растения са добре известни (виж, напр. Perlak et al., Proc. Natl. Acad.Csi. USA 88: 3324 (1991); Koziel et al., Bio/technol. 11: 194 (1993)). Генно-инженерното модифициране на протокс алелите за оптимална експресия може да включва също оперативно свързване на подходящи регулаторни последователности (като промотори, сигнални последователности, транскрибционни терминатори). Предпочитани промотори биха били онези, които придават високо ниво на конститутивна експресия или, още попредпочитани са онези, които придават специфично високо ниво на експресия в тъканите, податливи на увреждане от хербицида.

Рекомбинантните ДНК молекули могат да бъдат въведени в растителната клетка по много известни начини. За специалиста в областта изборът на метода зависи от типа на растението, напр. едно- или двусемеделно, подложено на трансформация. Подходящи методи за трансформиране на растителни клетки са напр. микроинжектиране (Crossway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986), Agrobacterium опосредствана трансформация (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915-921 (1988)), насочен генен трансфер (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984)), и балистично ускорение на частици с помощта на съоръже ния, доставени от Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (виж напр. Sanford et al., USA Patent 4 945 050; and McCabe et al., Biotechnology 6: 923926 (1988)). Виж също Weissingen et al., Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Sanford et al. Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (onion); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988) (соя); McCabe et al., Bio/ Technology 6: 923-926 (1988) (соя); Datta et al., Bio/Technology 8: 736-740 (1990) (ориз); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 43054309 (1988) (царевица); Klein et al., Bio/Technology 6: 559-563 (1988) (царевица); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988) (царевица); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833-839 (1990); and Godon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) (царевица).

По-нататък в обхвата на изобретението са трансгенни растения, по-специално трансгенни растения, трансформирани посредством описаните по-горе методи и тяхното безполово и/ или полово поколение, което е все още резистентно или поне толерантно на инхибиране чрез хербицид при нива, които обикновено са инхибитори на природно срещана протокс активност в растението.

Трансгенното растение съгласно изобретението може да бъде двусемеделно или едносемеделно растение. Предпочитани са едносемеделните растения от семейство Graminaceae, включващо растенията Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Bromus, Orizae, Avena, Hordeum, Secale и Setaria.

Особено предпочитани са трансгенните царевица, пшеница, ечемик, сорго, ръж, овес, торфени треви и ориз.

Сред двусемеделните растения - соя, памук, тютюн, захарно цвекло, ряпа и слънчоглед са особено предпочитани.

Изразът тук “поколение” се разбира, че включва както “полово”, така и “безполово” получено поколение на трансгенни растения. Това определение означава също, че включва всички мутанти и варианти, получавани чрез известни методи, като например клетъчна фузия или подбор на мутанти и които все още проявяват характеризиращите свойства на първоначално трансформираното растение, заедно с всички продукти от кръстосване и сливане на трансформирания растителен материал.

Друг обект на изобретението се отнася до пролиферативния материал на трансгенните растения.

Пролиферативният материал на трансгенни растения се определя съгласно изобретението като какъвто и да е растителен материал, който може да бъде размножен полово или безполово in vivo или in vitro. Специално предпочитани в обхвата на изобретението са протопласти, клетки, калуси, тъкани, органи, семена, зародиши, полен, зародишни клетки, зиготи, заедно с какъвто и да е материал за размножаване, получен от трансгенни растения.

Части на растения, като например цветове, стъбла, листа, корени, произхождащи от трансгенните растения или техни потомства, по-рано трансформирани посредством метода по изобретението и поради това състоящи се поне частично от трансгенни клетки, са също обект на настоящето изобретение.

Преди растителният размножителен материал /плодове, грудки, зърна, семена/, поспециално семена да бъдат продавани като търговски продукти, те обикновено се третират със защитно покритие, включващо хербициди, инсектициди, фунгициди, бактерициди, нематоциди, молюсцициди или смеси от няколко от тези препарати, по желание заедно с някои носители, повърхностно активни вещества или подобряващи приложението аджуванти, обичайно използвани за целта, за да обезпечат защита срещу разрушения, причинени от бактерии, гъби или паразити.

За третиране на семената, защитното покритие може да бъде приложено спрямо семената или чрез импрегниране на грудките или зърната с течна форма, или чрез покриването им с комбинирана влажна или суха форма. В допълнение, при специални случаи, са възможни и други методи на приложение , напр. третиране, насочено към пъпките или плодовете.

Семената съгласно изобретението, включващи ДНК последователност, която кодира протеин от еукариотично растение, съдържащо протопорфириноген оксидазна (протокс) активност съгласно изобретението, може да бъдат третирани със защитни покрития, включващи вещества за третиране на семената, Като например, каптан, карбоксин, тиарам (TMTD®), металаксил (Apron®) и пиримифосметил (Actellic®) и други, които са общоприети за третиране на семена.

Друг обект на настоящето изобретение е да се предостави размножителен материал за култивиране на растения, по-специално семена на растения, които са третирани със защитно покритие, обичайно приложимо за третиране на семена.

Когато хербицид резистентен протокс алел е получен чрез директна селекция в зърнено растение или растителна клетъчна култура, от която зърненото растение може да бъде регенерирано, то може да бъде развито в търговски необходим сорт с помощта на традиционните методи за селекция за развитие на хербицид толерантни растения без необходимостта от обработване по генно инженерен път на алела и от трансформирането му в растението. Обратно, хербицид резистентният алел може да бъде изолиран, генетично манипулиран и след това трансформиран в желан сорт.

Гени, кодиращи изменена протокс резистентност на протокс инхибитор също може да бъдат използвани като селективни маркери в методите за трансформация на растителни клетки. Например, растения, растителни тъкани или растителни клетки трансформирани с трансген могат също да бъдат трансформирани с ген, кодиращ един изменен протокс, способен на експресиране от растението. Трансформираните по този начин клетки се прехвърлят в среда, съдържаща протокс инхибитора, където ще оцелеят само трансформираните клетки. Протокс инхибиторите, за които се счита, че са особено приложими като селективни агенти, са дифенилетери {напр. ацифлуорфен, 5- [2-хлоро-4-(трифлуорометил)фенокси] -2-нитробензоена киселина; нейният метилов естер; или оксифлуорфен, 2-хлоро-1 - (З-етокси-4-нитрофенокси) -4- (трифлуоробензен)}, оксидазоли (като напр. оксидазин, 3-[2,4-дихлоро-5-(1-метилетокси) фенил] -5-(1,1 -диметилетил) -1,3,4-оксадиазол-2-(ЗН)-он), циклични имиди (напр. S23142, N- (4-хлоро-2-флуоро-5-пропаргилоксифенил) -3,4,5,6-тетрахидрофталимид; хлорофталим, N-(4-хлорофенил)-3,4,5,6-тетрахидрофталимид), фенил пиразоли (като напр. TNPPетил, етил 2- [1-(2,3,4-трихлорофенил)-4-нитропиразолил-5-окси] пропионат; М&В 39279), пиридинови производни (като LS 82-556), и фенопилат и неговите О-фенилпиролидино- и пиперидинокарбаматни аналози. Методът е приложим спрямо която и да е растителна клетка, способна на трансформиране с изменен про токс-кодиращ ген, и може да бъде използван с който и да е желан ген. Експресията на трансгена и на протокс гена може да бъде проведена със същия промотор, функционален в растителните клетки, или с отделни промотори.

Изобретението по- нататък ще бъде описано, позовавайки се на следващите подробни примери. Тези примери се предоставени само за целите на илюстрацията и не следва да се тълкуват ограничително.

Депозити

Следните векторни молекули са депозирани в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, USA на посочените подолу дати:

Протокс-1, в pBluescript SK вектор, е депозиран на 5 април 1994 като pWDC-2 (#В-21238).

Протокс-2, в pFL61 вектор, е депозиран на 5 април 1994 като pWDC-1 (NRRL #В-21237).

МгПротокс-1, в pBluescript SK вектор, депозиран на 20 май 1994 като pWDC-4 в NRRL(#B-21260), показано на SEQ ID N0:5.

MznpoTokc-1, в pBluescript SK вектор, повторно депозиран на 11 юли 1994 като pWDC-4e NRRL (#B-2160N), показано на SEQ ID N0:5.

МгПротокс-2, в pBluescript SK вектор, депозиран на 20 май 1994 като pWDC-З в NRRL (#В-21259), показано на SEQ ID N0:7.

Протокс-3, в pFL61 вектора, е депозиран на 10 юни 1994 катоpWDC-5 (NRRL#В-21280).

pMzC-1 Vai, в pBluescript SK вектор, е депозиран на 30 септември 1994 при означение pWDC-8 и му е даден депозитен номер NRRL #21340.

pAraC-2 Cys, в pFL61 вектора, е депозиран на 14 ноември 1994 при обозначение pWDC-7 и му е даден депозитен номер NRRL # 21339N.

Примери за изпълнение на изобретението

Използвани са добре известните стандартни техники на молекулярно клониране и рекомбинантни ДНК техники, описани от Т. Maniatis, Е. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) и от T. J. Silhary, M. L. Berman, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Пример 1

Изолиране на Arabidopsis сДНК, кодираща протокс гени чрез функцонално, допълване на един мутант на Е. coli

Получена е и е амплифицирана една с ДНК библиотека Arabidopsis thaliana (Landsberg) в плазмидния вектор pFL61 (Minet et al., Plant J. 2: 417-422 (1922)). Втора сДНК библиотека от Arabidopsis (Columbia) в UniZap ламбда вектор (Stratagene) е закупена и амплифицирана като pBluescript плазмиди чрез in vivo изрязване от щока на фага. Мутантът Е. coli hemG SASX38 (Sasarman et al., J. Gen Microbiol. 113: 297 (1979)) се получава и съхранява върху L хранителна среда, съдържаща 20 mg/ml хематин (United States Biochemicals). Плазмидните библиотеки се трансформират в SASX38 чрез електропорация с помощта на Bio-Rad Gene Pulser и при условията на производителя. Клетките се посяват върху L агар, съдържащ 100 mg/ml ампицилин при плътност приблизително 500 000 трансформанти/10 cm паничка. Клетките се инкубират при 37СС за 40 h на слаба светлина и се подбират за способността им да се развиват без добавяне на екзогенен хем. Хем прототрофи се възстановяват при честота 400/ 10’ от pFL61 библиотека и при честота 2/10 ⁷ от библиотека Bluescript. Плазмидна ДНК е изолирана от 24 колонии за секвенционен анализ. Всеки от 24-те е трансформиран в SASX38 за проверка на способността за допълване.

Секвенционният анализ показа два класа предполагаеми протокс клона. Девет са от типа, обозначен като “Протокс-1”. Всеки е получен от същия ген, и два са клонове с пълна дължина. сДНК е 1719 Ьр в дължина и кодира протеин с молекулно тегло 57.7 kDa. N-крайната пептидна последователност притежава основната характеристика на хлоропластен транзитен пептид с приблизително 60 аминокиселини. Изследване на базата данни с програмата GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Res, 12: 387-395 (1984)) показва хомоложност c Вас. Subtilis hem Y (protox) протеин (Hansson and Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Двата протеина са сходни на 53%, 31% идентични с участъците на висока хомоложност, включително предложеният динуклеотиден участък на свързване на hem Y протеина (Dailey et al., J. Biol. Hem. 269: 813 (1994)).

Останалите 15 сДНК клона са от типа, обозначен като “Протокс-2”. Те също очевидно възникват от самостоятелен ген. Очевидно пълната дължина на сДНК е 1738 Ьр и кодира протеин с молекулно тегло 55.6 kD. Аминокраят е своето рода характеристика на митохондриалния транзитен пептид. Протокс-2 протеина притежава лимитирана хомоложност спрямо Протокс-1 (53% сходство, 28% идентичност) и спрямо протокс от Вас. subtilis (50% сходство, 27% идентичност).

Протокс-1, в pBluescript SK вектора, е депозиран на 5 април 1994 като pWDC-2 (NRRL #В-21238).

Протокс-2, в pFL61 вектора, е депозиран на 5 април 1994 г. като pWC-1 (NRRL # В-21237).

Arabidopsis сДНК кодираща протокс-1, която се съдържа в pWDC-2 и протокс-2, съдържаща се в pWDC-Ι са показани на SEQ ID Nos: 1 и 3, съответно, по-долу.

Пример 2

Изолиране на царевична сДНК кодираща, протокс гени чрез функционално допълване на един мутант на Е. coli сДНК библиотека на Zea Mays (В73) в ламбда UniZap е закупена от Stratagene и превърната в pBluescript библиотека чрез in vivo изрязване. Втора приготвена по обичайния начин UniZap царевична сДНК библиотека е закупена от Clontech и по сходен начин е превърната в pBluescript плазмиди. Подбора на функционални протокс гени от царевица се осъществява точно както е описано в Arabidopsis библиотеките по-горе в Пример 1.

Два прототрофа на хема в 10’ трансформанти се изолират от Stratagene библиотека, за повторно допълване и съгласуване. Тези сДНК са идентични и доказано хомоложни на Arabidopsis протокс-1. Този царевичен клон, обозначен като МгПротокс 1, е непълен. сДНК е с дължина 1698 Ьр и кодира само вероятния зрял протокс ензим; няма транзитна пептидна последователност и няма иницииращ метионинов кодон. Генът е 68% идентичен на Arab Протокс-1 при нуклеотидно ниво и 78% идентичен (87 % сходен) на аминокиселинно ниво (показано на таблица 1).

Получен е отделен хем прототроф в 10’ от библиотеката на Clontech, за повторно допълване и съгласуване. сДНК очевидно е пълна, има дължина 2061 и кодира протеин от 59 kDa. Този клон е царевичен хомолог на Arabidopsis Протокс-2 и е обозначен като МгПротокс-2. Генът е 58% идентичен на Arab Протокс-2 на нуклеотидно ниво и 58% идентичен (76% сходен ) на аминокиселинно ниво (показано на таблица 2). 5

Царевичният клон притежава N-крайна последователност, която е с 30 аминокиселини подълга от клона на Arabidopsis. Както с клоновете на Arabidopsis, хомологията между двата царевични протокс гена е твърде ниска, само с 31 % идентичност между двете протеинови последователности .

МгПротокс-1, в pBluescript SK вектор, е депозиран на 20 май 1994 като pWDC-4 в NRRL (#В21260), показано на SEQ ID N0:5.

МгПротокс-1 вектор, в pBluescript SK вектор, депозиран отново на 11 юли 1994 като WDC-4 в NRRL (#В-21260М), е показан на SEQ ID N0: 5.

MzIIpoTokc-2, в pBluescript SK вектор, депозиран на 20 май 1994 като pWDC-4 в NRRL (#В - 21260N), е показан на SEQ ID N0: 7.

Пример 3

Изолиране на допълнителни протокс гени, основано на секвенционна хомология на познати протокс кодиращи последователности Фагова или плазмидна библиотека се посява при плътност приблизително 10 000 плаки върху 10 cm петриева паничка, и филтърните посявки се изготвят след култивиране на растенията в продължение на една нощ при 37 С. Плаките се сондират с една от сДНК ите, представени на SEQ ID Nos: 1,3,5 или 7, белязани с ³²P-dCTP по метода на случайно праймиране с помощта на Prime Time kum (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Условията на хибридизация са 7% додецил сулфат (SDS), 0.5 NaPO₄ pH 7.0,1 тМ EDTA при 50 С. След хибридизация в продължение на една нощ, филтрите се промиват с 2xSSC, 1 % SDS. Позитивно хибридизиралите се плаки се откриват чрез авторадиографиране. След пречистване до единични плаки, сДНК инсертите се изолират, и техните последователности се определят по метода ва верино терминиране с помощта на дидезокси терминатори, белязани с флуоресцентни оцветители (Applied Biosystems, Inc., Foster City, СА).

Стандартният експериментален протокол, описан по-горе, може да бъде използван от специалиста в областта за получаване на протокс гени с хомоложна последователност на известните кодиращи протокс последователности от които и да са други еукариоти, по-специално други висши растения.

Едно подреждане на предполагаемите аминокиселини последователности от съответните протеини, кодирани от последователностите, показани на SEQ ID Nos: 2 и 6 , е показано на таблица 1. Едно подреждане на предполагаемите аминокиселинни последователности от съответните протеини, кодирано от последователностите, показани на SEQ ID Nos: 4 и 8 е показано на таблица 2.

Сравнение на Arabidopsis (SEQ ID No. 2) и царевични (SEQ ID No. 6) Протокс-1 аминокиселинни последователности

Процент на сходство: 87. 137 Процент на идентичност: 78. 008

Протокс-1. Pep х Mzprotox-1. Pep

GGITITTDCV7 VGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII IGO - . I I I; 11 I I i I IJ I Μ I I I I: I . . ::: I I I I:. I , 11 I I .

- . , .NSADCVVVGGCtLSGZCTAQALATRH.-GVGbVLVTEARARPGGNIT 44

101 T. . REEWGFLWEEGPNSFQPSDPMi.TMWDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 140 I I I 'Г : I I I I I I I I I I I I I I ; J I I . I I I 11 I I I II : I 11.1 I I I I I I

TVZRPEEGYLWEEGFNSFVPSDPVLTMAVDSGLKDPLVFGOPNAPRFVLW 94

149 NCKLRPVPSKL'TX>LrFFbl.MG16GXIRA<SFGAI<GIMS9PGReBSVBEFV 19B

- I I I 11 I I I I - i I i · I I I I I I . I I : I I I J I I I I 111 . I I I I I I i I I I I r

EGKLRPVPSkPAi:r.prFDl₁HS:PGKLRAGLGAI_<GIRPPPPGREESVEErV

199 RRkGGUEVFERLlii'J CSGV'i'AGQflS^Ll iKAAFGKVHKLEQKGGStlGG 24 У . I I I I I I I I I I I I I . . i I I I I ! I 1.1 I . ; J i I I I I I: I I:. I I I H I I

145 RRtiLGAEVFERLLEPECSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVMRlEETGGSIIGG 194

249 TFKAIQERKNAP:<AUKH?RLPKPQGQ4VGSFRKGLRMLPEAXSARLGSKV

I ! I. J JI I ... Il!-I I : I I I I I . Η I I; I I I I I I 11 I : I I . .. J I I I I

195 TIKTIQERSXNPKpyRPARLPXPKGQTVASFRKGUMLPNAITSSLGSKV 244

299 KLSWXLSGrrXLISGGYNLTYtri’DGLVSVQSKSVVMTVPSKVaSGLLRP 348 111111-:111 : · II I . I I I I : I : I I II - Jf I : I I: I 1. 11 I .: I I I

245 KLSHKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGVVSVQAKSVIMTIPSYVASNIERP 294

349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPXEAIRTECLIDGELkGFGQIHPRTQ 393 11..11:111::.....I I I - :! I I I : I I I - I I I 111 I I . I I I 1111 I - I

295 L.SSDAADALSR.FYY?? VAAVTVS YPKEAIRKeCLIDGELQGFGQLHPRSC 344

399 GVEIlGTIYSSSLFI?RRAPPGR.ILLLNYIGGSTHTGILSKSEGEI.VEAVD 44« I I I I I I I I II I I I I I I I I I · I I: I I ' I I I I I. ’ll I 1:11.1:1 I I IГ1 I

345 GVE'rLGTIYSSSLFPNRAPOGRVLLLNYIGGATHTGIVSKTESZLVEAVD 394

449 FDLRKMLIKPNSTOPLKLGVRVWPQAIPQFEvGHFDILDTAKSSLTSSGY 190

J I IГI I I I.....Ill I ' ¹ I I I Μ I I I I I I I I I : 1: I : . | | . . I . . : I I

395 ROLRKHLIHSTAVDPLVi.GVRVWPQAIPQFLVGRLDmEAAKAALDRGGY 444

99 EGU'LGGNrVAGVALGRCVEGAYETMEVHUFHSRYAYK* 538 : I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . ' ::.:1:.:11111

445 OGLFLGGHYVAGVAt.GRCVEGAYESASQrSDyi.TKYAYK* 464

Идентичните остатъци са отбелязани с вертикална черта между двете последователности, подреждането е представено с помощта на GAP програмата, описано в Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984).

Таблица 2

Сравнение на Arabidopsis (SEQ ID No. 4) и царевични (SEQ ID No. 8) протокс-2 аминокиселинни последователности

Процент на сходство: 75. 889 Процент на идентичност: 57. 905

Протокс-2. Pep х Mzprotox-2. Pep

............................МASGAVAD. HQ1EAVSGKHVAV 21 . 1 I : I : . 1..::.111

MLALTASASSASSHPYRHASAUTRRRKLRAVLAMAGSUDPRAAPARSVAV 50

VGAGVStLДЛА' YKr.F.PUGLUVTVFEAPGRVGRKbRSVMQWGI.IfrDeGAVT 71 ‘

I I I I I i......;i: . I : IiI 11 I I .: I . I I I : I - :.1::,.(11:

VGAGVSGLAAAYRLRUGGVNvrVFEAADRAGGKl RTNSEGGFVWCEGANT 109

MTEAEPEVGSbLDDL.GLREKQyFP1SOKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121 111:1 I -:.1: I I I 11.:1 I I: I I I -1 11 I I :: I. I.:: 1.: I I . I:.

101 HTEGE*EASRlIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPAbIPSDPISl.MK 150

122 55УЬ5ТаЗКГ0И.ЬЕРПНКК. , . .KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167

I I I I I I .11: .:::11 I |:ll -1:111:. *1 11:. I : 111 I. I

151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRHSGKVSEEHLSESVGSFCERKFGRE 200

168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDbWHVEKSrGSIIVGAIRTKFA 217

I I I I :: I I I I : i 11 I : I 1: 111:: I - I I . 111 :1 :.: 11 :11 11 1 .1 : I

201 VVDYFVDPFVAGISAGDPESLSIRHArpALWHLERKYGSVIVGAILSKLA 250

210 AKGGKSRDTK$S£GTKKGSRGSFSFKGGHQILPt>TLCKSI,SaDEINI_lDSlt 267

III:. . . .. I . I .:: -. I -1 I IL. И I I I :. I ..::.1::.1:..

251 AKGDPVKTRHDSSGKRRHRRVSFSFHGGMOSLIHALUHEVGDDWVKbGTE 300

268 VLSIS,.YHSGSRQENWSLSCVSKNETQRQ-..NPHYDAVIMTAPLCTVK 312

I I I I . ::: .. ;.1 It I . I . : . . : : : I . ; I I 11 ί I I I I : 11 :

301 VL$LACTFDGVPALGRWSISVDSKDSCDKOLASHQTFDAVlHTAPl>SklVR 350

313 EMKVMKGGQPFQLHFLPElHYMpLSVLITTFTKEKVKftPLEGFGVLIPSK 362

II. I I I.I. I :111 .::1:111:::1-1 . 1:. I I :)11 Hill I I I

351 ЙМКЕТКббАРУУЬОЕЕРКНиТЕРЕЗЕМУТАГККСОУККРЬЕСЕбЧЬТРУК 400

363 E .OKHGFKTLGTLFSSIWPDRSPSUVULYTTFIGGSRNQKLAKASTDEL 411

I I I ЕI: I I I 111 I I r I Η I I I . I . I I 1 I I I : I I I : I .: 11 I I I

401 EOQKHGl-KTLGTLFSSKrtFPDPAPODQYl.YTrrVGGSHNROLAGAPTSrL 4 50

-l 12 KQVVTSDLQRLUiVEGtfVSVNHYYWRKAfTIA’DSSYnyVHEAIDKHENIJ 4 61 I I : I I I I I . -· I I t I 1 I : I - I - I 11 I I I I I : . I . I I : F 11 : I I I :

kQ).VT$DI.KKLLGVEGQPTFVK«VYWGNAFP1.YGhDVSSVLEA1EKmEKH 500 •1(i2 LPGFFYAGNHRGGbSVGKSIASGCKAADLVlSYLKSCSNDKKrWDSL* 509

I 111 r I I I I -.:11.11. I I I I : 11 I I I · I I I 1 I I ......:

bMl bPyFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAAOI.rtl ^YbESHTKHKHSU*- - - 545

Пример 4

Изолиране на контаминиращ дрождев Протокс клон от една Arabidopsis сДНК библиотека

В усилието да бъдат идентифицирани някои редки сДНК с протокс активност, се провежда втори скрининг на pFL61 Arabidopsis библиотека както по-горе, като отново се получават стотици комплементарни клона. Приблизително 600 от тях се поставят на решетести панички и се инкубират на 28 ПС за 18 h. Дупликатни филтълни проби се изготвят върху Colony/ Plaque (NEN) мембрани съгласно инструкциите на производителя. Протокс-1 и протокс-2 след това се отделят от техните вектори чрез разграждане с EcoRI/XhoI и Nol, съответно. Инсертите се разделят с гел електрофореза в 1.0% SeaPlaque GTG (FMC) агароза, изрязват се и се бележат с ³²Р със случаен прайминг (Life Technologies). Един комплект от лифтинги се хибридизира с всяка сонда. Условията на хибридизиране и промиване са такива, каквито са описани в Churck and Gilbert, 1984.

Колонии (~ 20), които не показват ясна хибридизация с Протокс-1 или Протокс-2, се ампилифицират в течна култура и се изготвя плазмидна ДНК. Тази ДНК се разгражда с Notl, дупликатните проби се пропускат през 1.0% агарозен гел и след това се оцветяват по Southern върху Gene Screen Plus (NEN) филтър (New England Nuclear). Сонди от познатите Протокс гени се бележат и се хибридизират както по-горе. Налице са два идентични клона, които не са нито Протокс-1, нито Протокс-2. Показано е, че този клон отново допълва мутанта SASx38, макар той да се развива много бавно и се означава като Протокс-3.

Протокс 3, във вектора pFL61, е депозиран на 8 юни 1994 като pWDC-5 (NRRL #В21280). Установено е, че кодиращата последователност е получена от дрождева ДНК, която присъства в малко количество в Arabidopsis сДНК библиотека. Дрождевата ДНК, кодираща протокс-3 и съдържаща се в pWDC-5 е описана в SEQ ID No: 9 по-долу.

Пример 5

Демонстриране на чувствителността на растителен протокс клон спрямо протокс инхибиторни хербициди в бактериална система

Течни култури на Протокс-1/ SASX38, npoTokc-2/SASX38 и Bluescript/XLl-Blue се култивират в Lamp¹⁰⁰. Еднакви части от по 1 стотна от всяка култура се посяват върху среда Lamp¹⁰⁰, съдържаща различни концентрации (1.0 М - 10 тМ) от протокс инхибиращ арилурацилов хербицид от формула XVII. Дупликатни комплекси от паничките се инкубират о _х за 18 h при 37 С на слабо осветление или в пълна тъмнина.

Щамът Е. coli XLl-Blue, който е протокс ⁺, показа отсъствие на чувствителност спрямо хербицида при която и да е концентрация, което се съгласува с докладваната резистентност на нативния бактериален ензим спрямо сходни хербициди. Протокс-1/SASX38 е ясно чувствителен, с поле от бактерията, почти напълно елиминирана при концентрация на инхибитора възлизаща на 10 пМ. Протокс-2/ SASX38 също е чувствителен, но само при висока концентрация (10 М) от хербицида. Въздействието на хербицида върху двата растителни щама е по-драматично при слабо осветление, но е също очевидно върху паничките, съхранявани изцяло на тъмно. Токсичността на хербицида е изцяло елиминирана при добавяне на 20 mg/ml хематин към паничките.

Различната хербицидна толерантност между двата растителни Протокс щама вероятно е резултат на различна експресия от тези два плазмида, вместо която и да е наследствена разлика в ензимната чувствителност. ПроTokc-1/SASX38 се развива много по-бавно, отколкото npoTokc-2/SASX38, в която и да е хемдефицитна среда. В допълнение, МгПротокс-2/ SASX38 щамът с темпове на развитие, сравними с щама Arab Протокс-1/SASX38, е също много чувствителен спрямо хербицида при ниските (10- 100 пМ) концентрации. Изходната концентрация на дрождевия Протокс-3 клон показва, че е също и чувствителен на хербицид.

Пример 6

Подбор на растителни протокс гени, резистентни на протокс-инхибиращи хербициди в експресионна система на Е. coli

Инхибирането на растителни протокс ензими в бактериална система е приложимо за мащабно изследване на хербицид-резистентни мутации в растителните гени. Изходната доза за отговор в експериментите, осъществени чрез посявка от течна култура, води до висока честота на “резистентни” колонии дори при високи концентрации на хербицида. Тази резистентност не произхожда от плазмида, основава се на ретрансформационно/хербицид сензитивно изпитване. Трансформирането на Протокс плазмида в SASX38 мутанта и посяването му директно върху панички, съдържащи хербицид, редуцира този съществуващ проблем почти напълно.

Растителните протокс плазмиди се подлагат на мутация по различни начини, с помощта на публикувани процедури за химически съединения (като натриев бисулфит (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457-468 (1983); метоксиламин (Kadonaga et al., Nucleic acids Res. 13: 1733-1745 (1985); олигонуклеотид- насочена сатурационна мутазенеза (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 710-714 (1986); или различни полимеразни методики (виж напр. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-1592 (1982); Shiraishi etal., Gene 64: 313-319 (1988); and Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)). Очакваните промоторни мутанти от мутагенезата на целия плазмид се отстраняват чрез повторно клониране на кодиращата последователност в див тип вектор и повторно тестуване. Показано е, че по-висока експресия като че води до по-добро култивиране в отсъствие на хербицид, при това визуално изследване за мутанти на кодираща последователност също е възможно.

Всеки растителен протокс ген експресиращ хербицидна резистентност в бактериалната система може да бъде конструирана за оптимална експресия и трансформирана в растения с помощта на стандартни техники, както е описано по-горе. Получените в резултат растения след това може да бъдат третирани с хербицид за потвърждаване и количествено определяне нивото на резистентност, което се дължи на въведения протокс ген.

Пример 7

Структури за експресия на хербицидрезистентни микробни протокс гени в растения

Кодиращите последователности за протокс гена на В. subtilis hem Y (Hansson and Hederstedt, J. Bacteriol. 174: 8081 (1992); Dayley et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)) и за протокс гена на Е. coli hemG (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) се изолират от лабораторни щамове чрез PCR амплификация при стандартни условия и фланкиращи праймери, конструирани от публикуваните последователности. Знае се, че тези гени кодират хербицид-резистентни форми на протокс ензима.

С помощта на стандартни техники за припокриване на PCR фузия (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John & Sons, Inc. (1994)), двата бактериални гена се сливат до две Arabidopsis хларапластни транзитни пептидни последователности (CTPs). Първата е СТР от ацетохидрокси кисела синтетаза (AHAS, Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987)), които следва да позволят въвеждане до стромата на хлоропласта. Втората е Arabidopsis пластоцианинов ген (Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)), който е транзитен пептид от две части. Амино крайната част от този СТР насочва протеина към хлоропласта, където карбокси края завършва в тилакоидните мембрани. Всички четири сливания на гена са клонирани зад 2X35S промотора в бинарно експресионен вектор, конструиран за получаване на трансгенни растения чрез трансформация на агробактериум.

След изолиране Arabidopsis и царевични протокс сДНК, хлоропластният транзитен пептид от Протокс-1 или МгПротокс-1 също може да бъде слят с двата бактериални протокс протеина по същия начин както по- горе.

Векторите, описани по-горе, след това могат да бъдат трансформирани в желаните растителни видове и получените в резултат трансформанти се изпитват за повишена резистентност към хербицида.

Пример 8

Участък превключващ между Arabidopsis/B. subtilis гени за получаване на химерен, хербицид резистентен протокс.

Един подход, който може да бъде използван за получаване на протокс ген, който е едновременно хербицид резистентен и способен да предостави ефективна протокс ензимна активност в растения, е да бъдат слети части (част) на бактериален и растителен протокс ген. Получените в резултат гени след това може да бъдат изследвани за такива, които са способни да предоставят хербицид резистентна протокс активност в растителната клетка. Например, Arabidopsis/B. subtilis (hemY) протокс пептидни последователности са колинеарни с участъци с висока хомоложност. HemY кодиращата последователност е клонирана в pBluescript и тестувана за способност да експресира хербицид-резистентна протокс активност в 5ASX38. Протокс-1/hemY химерни гени са конструирани с помощта на фузионни PCR техники, последвано от свързване обратно във вектора pBluescript. Изходното изменение е приблизително в средата на протеините. Тези сливания се тестуват за протокс функциониране чрез допълване, и след това се допълват за хербицидна резистентност чрез посяване върху хербицид с интактни Протокс-1 и hemY контроли.

Пример 9

Получаване на хербицид-толерантни растения чрез суперекспресия на растителни протокс гени

За експресия Arabidopsis или царевичен протеин в трансгенни растения, подходящи сДНК с пълната им дължина се инсертират в растителния експресионен вектор pCGN1761 ENX, който е получен от pCGN1761 както следва: pCGN1761 се разгражда при неговия уникален EcoRI сайт, и се присъединява към двойно верижен ДНК фрагмент, включен в два олигонуклеотида от последователността 5’ААТ ТАТ GAT GTA ACG TAG GAA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T3’ (SEQ ID NO: 11) и 5’ AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T3’ (SEQ ID NO: 12). Полученият плазмид, pCGN1761ENX, съдържа уникални EcoRI, Notl, и Xhol сайтове, които са разположени между удвоения 35S промотор от вируса на мозаичната болест по цветното зеле (Kay et al., Science 236: 1299-1302 (1987)) и 3’ нетранслирани последователности от гена tml на Agrobacterium tumefacience. Този плазмид е разграден и присъединен към фрагмент, получен от разграждане на един от плазмидите с рестрикционни ензими, носещ протокс сДНК, такъв който носи пълната протокс сДНК. От този плазмид е изрязан един Xbal фрагмент, включващ протокс сДНК от Arabidopsis фланкирана от удвоения 35S промотор и 3’ нетранслираните последователности на гена tml от A. tumefaciens. Този Xbal фрагмент е инсертиран в бинарния вектор рС1В200 при неговия уникален Xbal сайт, който е разположен между Т-ДНК гранични последователности. Полученият в резултат плазмид, обозначен като рС1В200 протокс, е трансформиран в щам на A. tumefaciens CIB542. Виж, напр. Uknes et al., Plant Cell 5: 159-169 (1993).

Листни дискове от Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc се инфектират c A. tunefaciens CIB542, който носи pCIB200IGPD както е описано от Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). Резистентни на канамицин покълнеци от 15 независими листни диска се прехвърлят в среда за вкореняване, след което се прехвърлят в почвата и получените в резултат растения се развиват до пълна зрелост в оранжерия. Семената от тези растения се събират и посяват в MS агарна среда, съдържаща канамицин. Множество отделни резистентни на канамицин покълнеци от всеки първичен трансформант се култивират до зрелост в оранжерията и техните семена се събират. Тези семена се отглеждат върху агарна среда, съдържаща канамицин.

Растителните линии, които водят до изключително канамицин резистентни покълнеци, са хомоложни на инсертирания ген и се подлагат на по-нататъшен анализ. Листните дискове от всеки от 15-те независими трансгенни линии се изрязват и се поставят върху MS агар, съдържащ различни повишаващи се концентрации от протокс инхибиторен хербицид.

След три седмици, два комплекса от 10 диска от всяка линия се претеглят и резултатите се записват. Трансгентните линии са порезистентни на инхибитора от дивия тип, нетрансформираните растения се подбират за понататъшен анализ.

РНК се екстрахира от листата на всяка такава линия. Общата РНК от всяка независима хомоложна линия, и от нетрансгенните контролни растения, се отделя чрез агарозна гел електрофореза в присъствието на формалдехид (Ausubel et al., Currnt protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Гелът се оцветява върху найлонова мембрана (Ausubel et al., supra.) и се хибридизира c радиоактивно белязана Arabidopsis протокс сДНК.

Филтърът се авторадиографира и интензивните РНК ивици, съответстващи на протокс трансгена се откриват във всички хербицид-толерантни трансгенни растителни линии.

За по-нататъшна оценка на резистентността на протокс-суперекспресиращата линия, растенията се култивират в оранжерия и се третират с различни концентрации от протокс-инхибиращ хербицид.

Пример 10

Култивиране на суспензионни култури от клетки на тютюн

Среда:

МХ1: Тази среда се състои от соли на Murashige and Skoog (“MS”, T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962) малки соли и Fe-EDTA Gibco # 500-117; 4. 3 g/1), 100 mg/1 мио-инозитол, 1 mg/1 никотинова киселина, 1 mg/1 пиридоксин-HCl, 10 mg/1 тиамин-Hcl, 2-3 g/1 захароза, 0.4 mg/1 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина, и 0.04 mg/1 1 кинетин, pH 5.8. Тази среда се стерилизира чрез автоклавиране.

N6: Тази среда включва микроелементи, макроелементи и Fe-EDTA както е описано от С-С. Chu et al., Scientia Sinica 18: 659 (1975), и следните органични съединения: ПиридоксинНс1 (0.5 mg/1), тиамин-Hcl (0.1 mg/1), никотинова киселина (0.5 mg/Ι), глицин (2.0 mg/Ι) и захароза (30.0 g/Ι). Разтворът се автоклавира. Крайното pH е 5.6.

Бележки: Микроелементите са изготвени като 10 х концентриран разтвор, а щокът от микроелементи като 1000 х концентриран разтвор. Щокът от витамини обикновено се изготвя като 100 х концентриран разтвор.

Суспенсия от култивирани клетки на Nicotiana tabacum, линия S3 [Harms and DiMaio, J. Plant Physiol. 137, 513-519, 1991] се култивира в течна културална среда MX1. 100 mlови Ерленмайерови колби, съдържащи 25 ml среда МХ1, се инокулират с 10 ml от клетъчната култура, предварително култивирана в продължение на 7 дни. Клетките се инкубират на 25 С на тъмно и на орбитален шейкър при 100 rpm (2 cm throw). Клетките се субкултивират в интервали от по 7 дни чрез инокулиране на еднакви проби в прясна хранителна среда, чрез отдекантиране или отпипетиране на около 90% от клетъчната суспенсия, последвано от повторно напълване с прясна среда за получаване на желания обем от суспенсията. 5-8 g от прасната клетъчна маса се продуцират в рамките на 10 дни култивиране от един инокулум от 250- 350 mg клетки.

Пример 11

Получаване на клетъчни култури от тютюн, толерантни на хербицидни протокс инхибитори чрез посяване на клетки върху твърда селекционна среда

Клетките се култивират предварително както в пример 1. Събират се, като бъдат оставени да седиментират, или чрез краткотрайно центрофугиране при 500 х g, и зрялата културална среда се отстранява. След това клетките се разреждат с прясна културална среда за получаване на плътност на клетките, достатъчна за посяване, около 10 000 колонии формиращи единици за ml. За посяване, клетките в малък обем от средата (прибл. 1 ml) се разпръскват по повърхността на твърдата културална среда (MX 1,0. 8% arap), съдържаща желаната концентрация от инхибитора. Около 20 - 30 ml от средата се използват за 10 cm Петриева паничка. Подходящата концентрация на инхибитора се определя от кривата за отговора на дадена доза (пример 14) и е поне двукратно по-висока от 1С₅₀ на чувствителните див тип клетки.

Паничките с културата, съдържащи клетки, разпръснати върху селекционната среда, се инкубират при нормални условия за развитие при 25-28 С на тъмно до формиране на клетъчните колонии. Възникналите клетъчни колонии се прехвърлят в прясна хранителна среда, съдържаща инхибитора в желаната концентрация.

В предпочитана модификация на описания метод, предкултивационната суспенсия от култивираните клетки най- напред се разпръсква в малък обем течна среда на повърхността на твърдата среда. Добавя се равно количество топла течна агарна среда (1.2-1.6% о агар), съхранявана разтопена при около 40 С и паничката внимателно, но незабавно се завърта за разпръскване на клетките върху повърхността на средата и за смесване на клетките с агарната среда преди средата да се втвърди.

Обратно, клетките се смесват с разтопена агарна среда преди разпръскването им върху повърхността на селекционната среда. Този метод притежава преимуществото, че клетките са залети и имобилизирани в тънък слой от твърда среда на повърхността на селекци онната среда. Това позволява по- добра аерация на клетките в сравнение със залетите клетки в целия обем от 20 - 30 ml.

Пример 12

Получаване на клетъчни култури от тютюн, толерантни на хербицидния протокс инхибитор чрез култивиране на клетки в течна селективна среда

Клетъчни култури като тези от пример 10 се инокулират при подходяща плътност на клетките в течна среда МХ1, съдържаща желаната концентрация от хербицидния протокс инхибитор. Клетките се инкубират и растат както в пример 10. Клетките се култивират отново с помощта на прясна среда, съдържаща желаната инхибиторна концентрация след период от 7-10 дни.

В зависимост от използваната инхибиторна концентрация, развитието на клетките може да бъде по-бавно, отколкото при отсъствие на инхибитор.

Пример 13

Получаване на клетки от тютюн с повишени нива на протокс ензима

За получаване на клетъчни култури или калуси с повишени нива на протокс ензима, суспенсионни култури или калуси се прехвърлят поетапно до повишаване концентрациите на хербицидния протокс инхибитор. По-специално, преминава се през следните етапи:

Клетъчните колонии, възникнали от посятите клетки в пример 11 се прехвърлят в течна: N1 среда, съдържаща същата концентрация от протокс инхибитора, както се постъпва при селекцията в пример 11 за формиране на суспенсионни култури. Обратно, подбраните клетъчно културални суспенсии от пример 12 се култивират отново в течна МХ1 среда, съдържаща същата концентрация от протокс инхибитора както при селекцията съгласно пример 12.

Културите се култивират отново 1-20 пъти през седмични интервали и след това се култивират в МХ1 среда, съдържаща следващата по-висока хербицидна концентрация. Клетките се култивират за 1 - 10 субкултури в среда, съдържаща тази по-висока концентрация от хербицида, след което се прехвърлят в МХ1 среда, съдържаща следващата по стойност по-висока концентрация от хербицида.

Обратно, части от подбран калус по пример 11 се прехвърлят върху твърда МХ1 сре да, заместена с желаната хербицидна концентрация. Прехвърлянето в по-висока хербицидна концентрация следва процедурата, описана в предходния параграф с изключение на това, че се използва твърда хранителна среда.

Пример 14

Измерване развитието на клетките в суспенсионни култури в зависимост от дозата хербицид

За получаване на кривата на развитието в зависимост от дозата хербицид, се измерва растежа на клетките при различни концентрации от хербицида. Клетъчно културалните суспенсии от диви тютюневи S3 клетки, чувствителни на хербицидния протокс инхибор и хербицид толерантни селекционирани или трансгенни клетки, предварително се култивира в течна среда както в пример 11 при висока плътност в продължение на 2 - 4 дни. Клетките се промиват отделно от средата и се добавя прясна хранителна среда без хербицид за получаване на желаната клетъчна плътност (около 150 mg PW клетки за ml от суспенсията). Проба от 2.5 ml от клетъчната суспенсия, съдържаща приблизително 250-300 mg FW клетки, след това се инокулира в приблизително 30 ml течна среда с желаната концентрация на хербицида, съдържаща се в Ерленмайерови колби. Внимава се да се инокулира с еднакво количество клетки в една и съща колба. Всяка колба съдържа еднакъв обем среда. 3-6 колби се инокулират с различни концентрации на хербицида, като се започне от нула (= контрола), 0.1 ppb, 0.3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1000 ppb, 3000 ppb и 10000 ppb. Различни проби от инокулирани клетки също се взимат по време на инокулирането, за да се определи масата клетки, инокулирани за колба.

След това клетките се инкубират при контролирани условия при 28 С на тъмно за 10 дни. Клетките се събират чрез отливане съдържимото на всяка колба върху дискове от филтърна хартия, прикрепени към вакуумно съоръжение за отстраняване на цялата течност и за получаване на маса от съответно изсушени пресни клетки. Последните се претеглят. Сухото тегло на пробите може да бъде получено след изсушаване.

Клетъчният растеж се определя и експресира в рамките на 10 дни и се изразява като процент относително клетъчният растеж в отсъствие на хербицид съгласно формулата:

(крайната маса на клетки, развивали се в присъствие на хербицид минус масата на инокулума х 100 разделено на крайната маса от клетки, развивали се без хербицид минус масата на инокулума). Стойността на IC_J0ce определя по данните от графиката (относително клетъчната маса срещу хербицидната концентрация). 1С₃₀ определя концентрацията на хербицида, при която растежа на клетките е 50% от контролния растеж (клетките се развиват в отсъствие на хербицид).

В една модификация на метода, няколко парченца от калуса, получени от хербицид резистентна клетъчна култура, както е описано в примери 11 и 13, се прехвърлят върху твърда културална среда, съдържаща различни концентрации от хербицида. Относителен ръст се определя след култивационен период от 2-6 седмици чрез претегляне на парченцата от калуса и сравняването им с контролата в среда без хербицид. Независимо от това, суспенсионният метод се предпочита поради неговата по- висока точност.

Пример 15

Определяне на кръстосана толерантност

За определяне обхвата, при който клетките показват толерантност спрямо аналогични или други хербициди, пример 14 се повтаря при култивиране на клетките при повишени концентрации от подбрани хербициди. Относителният растеж на клетките и тяхната IC_J0 степен се определя за всеки хербицид за сравнение.

Пример 16

Определяне стабилността на хербицид толерантния фенотип във времето

За определяне дали хербицид толерантният фенотип от клетъчната култура се съхранява във времето, клетките се прехвърлят от хербицид съдържаща среда в среда без хербицид. Клетките се култивират, както е описано в пример 10 в отсъствие на хербицид за период от 3 месеца, при подходящи интервали (7-10 дни за суспенсионни култури; 3-6 седмици за калусни (култури). Познато количество от клетки след това се прехвърля обратно в хербицид съдържаща среда и се култивира в продължение на 10 дни (суспенсионни култури) или 4 седмици (калусни култури). Относителния, растеж се определя както в пример 14.

Пример 17

Индуциране и култура на ембриогенен калус от тъкан на скутелума от житни

От самоопрашили се житни растения от инбредната линия Funk 2717 се събират класове 12-14 дни след опрашването. Отстранява се шумата и класовете се стерилизират за около 15 min при разклащане в 20% разтвор от търговския продукт за избелване Chlorox с няколко капки детергент за по-добро овлажняване. След това класовете се изплакват няколко пъти със стерилна вода. Всички по-нататъшни етапи се осъществяват асептично в стерилен въздушен поток. Ембриони с дължина 1.5-2 mm се отстраняват от зърната с шпатула и се поставят с оста надолу в MS културална среда, съдържаща 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина (2,4-D) в количество 2 mg/1 и 3% захароза, втвърдена с 0.24% Gerlite*.

Ембриогенният калус се формира върху скутелумната тъкан от зародиша в рамките на 2-4 седмици от началото на култивирането при около 28 С на тъмно. Калусът се отстранява от експланта и се прехвърля в прясна твърда MS среда, съдържаща 2 mg/1 2,4-D. Субкултивирането на ембриогенния калус се повтаря на седмични интервали. Субкултивират се само части от калуса с ембриогенна морфология.

Пример 18

Подбор на клетъчни култури от зърнени растения, толерантни на хербицидни протокс инхибитори

а) подбор с помощта на ембриогенен калус: Ембриогенен калус от пример 17 се прехвърля в среда за съхранение на калуси, състояща се от среда N6, която съдържа 2 mg/1

2,4-D, 3% захароза и протокс инхибитор при концентрация, достатъчна да задържи растежа, но която не въздейства на ембриогенезата на културата, и се втвърдява с 0.24% Gerlite“. За повишаване честотата на хербицид толерантните мутации, културите могат да бъдат третирани преди селекцията с химичен мутаген, като напр. етилметан сулфонат, или физичен мутаген, напр. UV светлина, при концентрация под концентрацията, при която се наблюдава инхибиране на растежа, както е определена по пример 14. Културите се инкубират на тъмно. След 14 дни калусите се прехвърлят в прясна среда със същия състав. Подлагат се на субкултивиране само култури с желаната ембриогенна морфология, известни като рехав ембриогенен калус с морфология Тип II. Културите се размножават чрез субкултивиране на седмични интервали за две до десет субкултури върху прясна хранителна среда, където се субкултивират само най-бързо развиващите се култури. Бързо развиващите се калуси след това се прехвърлят в среда за съхранение на калуса, съдържаща протокс инхибиторен хербицид при подходяща концентрация както е определено на пример 11. Когато калусът расте добре при дадената хербицидна концентрация, обикновено след около 5 до 10 субкултури, калусът се прехвърля в среда за съхранение, съдържаща трикратно повисока концентрация от инхибитора, и се субкултивира до получаване на добре развиваща се култура. Този процес се повтаря с помощта на среда, съдържаща протокс инхибитор при концентрация 10-кратно по-висока от оригиналната подходяща концентрация, и отново със среда, съдържаща 20-кратно и 40-кратно по-висока концентрация.

След получаване на достатъчно добре развит калус, той се прехвърля в регенерационна среда, подходяща за съзряване на зародиша и за регенерация на растението. Ембриогенният калус, развиващ се върху всяка от хербицидните концентрации, се прехвърля в регенерационна среда.

Ь) Подбор с участието на ембриогенни суспенсионни култури:

Ембриогенни суспенсионни култури от зърнена инбредна линия Funk 2717 се изготвя съгласно пример 24 и се съхранява чрез субкултивиране в седмични интервали в прясна течна N6 среда, съдържаща 2 mg/1 2,4-D. За повишаване честотата на хербицидните толерантни мутации, културите могат същевременно да бъдат третирани с химичен мутаген, напр. етилметан сулфонат, при концентрация под тази, при която може да бъде установено инхибиране, както е определено в пример 14. За селекциониране, културите се прехвърлят в течна N6 среда, съдържаща 2 mg/1 2,4-D и концентрация на инхибитора, достатъчна да забави развитието, но да не въздейства на ембриогенезата на културата. Културите се развиват на шейкер при 120 rpm при 28 С на тъмно. На седмични интервали, хранителната среда се отстранява и се добавя прясна хранителна среда. Културите се разреждат с хранителна среда в съответствие с тяхното развитие за съхраняване на около 10 ml от клетките за 50 ml среда. При всяка следваща субкултура, културите се оглеждат и само бързо растящите от тях с желана рехава морфология се отделят за следващо субкултивиране. След 2 до 10 субкултури в среда N6, културите повишават скоростта на растежа си поне дву- до трикратно повече за всяка седмична субкултура. След това културите се прехвърлят в среда N6, съдържаща 2 mg/1 2,4-D и трикратно по-висока доза от инхибитора в сравнение с използваната отначало. Растящите култури повторно се субкултивират в тази среда за други две до десет субкултури, както е описано по-горе. Бързорастящите култури с желаната рехава ембриогенна молфология се подбират за по-нататъшно субкултивиране. Бързорастящите култури след това се прехвърлят в среда N6, съдържаща 2,4-D и десетократно по-висока концентрация на инхибитора в сравнение с използваната в началото, и процесът на субкултивиране на растящи култури с желана рехава ембриогенна морфология се повтаря за две до 10 субкултури, докато се получат бързорастящи култури. Тези култури след това се прехвърлят в среда N6, съдържаща 2 mg/1 2,4-D и 30кратно по-висока концентрация на инхибитора от използваната в началото.

За регенерация на растенията, от всяка ембриогенна суспенсионна култура, селекционирана с отбелязаното ниво на хербицидна концентрация, културите най-напред се прехвърлят в среда N6, втвърдена с 0.24% Gerlite^R и съдържаща 2 mg/1 2,4-Du, незадължително, концентрацията на инхибитор, при която културите са се развивали за продуциране на ембриогенен калус. Ембриогенният калус се подлага на субкултивиране в прясна среда за съхраняване на калуси до получаване на достатъчно количество калуси за регенерация. На субкултивиране се подлагат само култури с желаната ембриогенна морфология.

Пример 19

Регенерация на зърнени растения от селекционирани калуси или суспенсионна култура

От селекционирани ембриогенни калусни култури от пример 13 се регенерират растения чрез прехвърлянето им в прясна регенерационна среда. Използваните регенерационни среди са: 0N6 среда, състояща се от среда N6, която не съдържа 2,4-3, или N61, състояща се от 0.25 mg/1 2,4-D и 2,4-D и 10 mg/1 кинетин (6-фурфуриламинопурин), или N62, състояща се от среда N6, която съдържа 0.1 mg/1 2,4-D и 1 mg/1 кинетин, всички втвърдени с 0.24%

Gerlite^R. Културите се развиват при 28°С на светло (16 h на ден от 10-100 μ Einsteins/m² sec от флуоресцентни лампи с бяла светлина). Културите се субкултивират всеки две седмици върху прясна хранителна среда. Прорастъците се развиват в рамките на 3 до 8 седмици. Прорастъци с поне 2 cm дължина се отделят от прилежащия му калус и се прехвърля в среда за развиване на корени. Използват се различни среди за развитие на корени. Състоят се от N6 или MS среда, без витамини с обичайното количество соли или със соли, редуцирани до една втора, захароза, редуцирана до 1 g/Ι, и понататък без регулиращи растежа съединения или съдържаща 0.1 mg/l α-нафталеноцетна киселина. След като веднъж корените се развият в достатъчен размер, прорастъците се прехвърлят в поддържаща смес, състояща се от вермикулит, торфено блато и градинска почва. При трансплантирането всички останали калуси се отстраняват, целият агар се изплаква и листата се притискат наполовина, прорастъците се развиват в оранжерия, покривана в продължение на няколко дни с прозрачно пластмасово покривало за запазване на влажността и за растеж в сянка. След аклиматизиране, растенията се пресаждат и се развиват до зрялост. При цъфтеж растенията се опрашват, предимно чрез самоопрашване.

Пример 20

Конструиране на растителни трансформационни вектори

Известни са множество трансформационни вектори за трансформация на растенията и гените по настоящето изобретение могат да бъдат използвани във връзка с който и да е от тези вектори. Подборът на вектори ще зависи от предпочитаната техника за трансформация и видовете, които се цели да бъдат трансформирани. За конкретните видове се предпочитат различни антибиотични или хербицид селективни маркери. Селекционните маркери, които обикновено се използват при трансформация включват гена nptll, който придава резистентността към канамицин и сродни антибиотици (Messing & Vierra, Gene 19: 259-168 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), генът bar, който придава резистентност към хербицида фосфинотрицин (White etal., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990), генът hph, който придава резистентност спрямо антибиотика хигромицин (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), и генът dhfr, който придава резистентност спрямо метотрексат (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)).

(1) Конструиране на вектори, подходящи за трансформиране на Agrobacterium

За трансформиране на Agrobacterium tumefaciens са подходящи много вектори. Те обик-новено носят поне една Т-ДНК гранична последователност и включват вектори като pBIN19 (Bevan Nucl. Acids Res. (1984)). Подолу е описано конструирането на два типични вектора.

Конструиране на рС1В200 рС1В2001

Бинарните вектори рС1В200 и рС1В2001 се използват за конструирането на рекомбинантни вектори, необходими за трансформиране на Agrobacterium. Постъпва се по следния начин: pTJS75kan се създава чрез разграждане на pTJS75 с Narl (Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol. 164: 446-455 (1985)), което позволява изрязването на тетрациклин резистентният ген, последвано от инсерция на едни Accl фрагмент от pUC4K, който носи един NPTII (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990). Линкерите Xhol се лигатират към EcoRV фрагмента от рС1В7, който съдържа лява и дясна Т-ДНК граници, растителен селективен nos/nptil химерен ген и pUC полилинкер (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)), и разграден с Hhol фрагмент се клонира в разграден с Sall pTJS75kan за създаване на рС1В200 (виж също ЕР 0 332 104, пример 19 (1338). рС1В200 съдържа следните уникални полилинкерни сайтове на рестрикция: EcoRI, Sstl, Kpnl, BgHI, Xbal и Sall. pCIB2001 е производно на pCIB200, който е създаден чрез инсерция в полилинкера на допълнителни сайтове на рестрикция. Уникалните рестрикционни сайтове в полилинкера на рС1В2001 са EcoRI, Sstl, Kpnl, BgHI, Xbal, Sall, Mlul, Bell, Avril, Apal, Hpal и Stul. pCIB2001, в допълнение към тези уникални сайтове притежава също и такива за растителна и бактериална канамицинова селекция, лява и дясна ТДНК граници за медиирана от Agrobacterium трансформация, получена от RK2 trfA функция за мобилизация между Е. coli и други гостоприемници, и OriT и OriV функции също от RK2. рС1В2001 полилинкерът е подходящ за клониране от растителни експресионни касети, съдържащи техните собствени регулаторни сигнали.

Конструиране на pCIBlO и техните хигромицин селективни производни

Бинарният вектор pCIBlO съдържа ген кодиращ резистентност спрямо канамицин за селекция в растения, Т-ДНК лява и дясна гранични последователности и включва последователности от дивия гостоприемников плазмид pRK252, който позволява репликацията им както в Е. coli, така и в Agrobacterium. Техните структури са описани от Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987). Конструирани са различни производни на pCIBlO, които включват гена за хигромицин В фосфотрансфераза, описан от Gritz. et al., Gene 25: 179-188 (1983)). Тези производни позволяват селекция на трансгенни растителни клетки само върху игромицин (рС1В743), или хигромицин и канамицин (pCIB715, pCIB717) [Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)].

(2) Конструиране на вектори, подходящи за трансформация, различна от Agrobacterium

Трансформация без използването на Agrobacterium tumefaciens нарушава изискването за Т-ДНК последователности в избрания трансформационен вектор и съответните вектори, в които липсват тези последователности, могат да бъдат използвани в допълнение към вектори, като описаните по-горе, които съдържат Т-ДНК последователности. Трансформационни техники, които не са зависими от Agrobacterium, включват трансформация чрез бомбардиране с частички, протопластно сливане (напр. PEG и електропорация) и микроинжектиране. Изборът на вектора зависи най-вече от предпочитанията за видовете, които следва да бъдат трансформирани. По-долу са описани структурите на някои типични вектори.

Конструиране на рС1В3064 рС1В3064 е получен от вектора pUC, подходящ за директни генни трансферни техники в комбинация със селекция от хербицида баста (или фосфинотрицин). Плазмидът рС1В246 включва промотора CaMV 35S, операционно слят с GUS гена от Е. coli и CaMV 35S транскрибционният терминатор и е описан в заявка за патент по РСТ, публикувана под номер WO 93/07278. Промотора 35S на този вектор съдържа две ATG последователности 5' от из ходния сайт. Тези сайтове са мутирали с помощта на стандартни PCR техники по начин, според който да бъдат отстранени ATG и да бъдат създадени рестрикционните сайтове Sspl и Pvull. Новите сайтове на рестрикция са 96 и 37 Ьр нагоре от уникалния сайт Sall и 101 и 42 Ьр нагоре от актуалния изходен сайт. Полученото в резултат производно на рС1В246 е обозначено рС1В3025. Генът GUS след това се изрязва от рС1В3025 чрез разграждане със Sall и Sacl, краищата им са завършени сляпо и отново са свързани за получаване на плазмида рС1В3060. Плазмидът рЛТ82 е получен от John Innes Centre, Norwick и малкият 400 bp Smal фрагмент, съдържащ гена bar Streptomyces viridochromogenes се изрязва и инсертира в Нра! мястото (сайта) на pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Така се получава pCIB3064, който съдържа генът bar под контрола на промотора CaMV 35S и терминатор за хербицидна селекция, ген за резистентност спрямо ампицилин (за подбор в Е. coli) и полилинкер с уникалните сайтове Sph, Pstl, Hindlll и BamHI. Този вектор е подходящ за клониране на растителни експресионни касети, съдържащи техни собствени регулаторни сигнали.

Конструиране на pSOG19 и pSOG35 pSOG35 е вектор за трансформация, който използва Е. coli генът за дихидрофолат редуктаза (DHFR), като селективен маркер, придаващ резистентността към метотрексат. PCR се използва за амплификация на промотора 35S (~ 800 Ьр), интрон 6 от царевичен Adhl ген ( 550 bp) [Lou et al, Plant J. 3: 393-403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12: 39834000, 1984] и 18 bp от GUS нетранслирана лидерна последователност от pSOGlO. 250 bp фрагмент, кодиращ генът за дихидрофолат редуктаза тип П от Е. coli също е амплифициран чрез PCR и тези два PCR фрагмента се комбинират с фрагмента Sacl-Pstl от рВ1221 (Clontech), който включва вектора pUC19 и терминатора за нопалин синтетаза. Комбинирането на тези фрагменти генерира pSOG19, който съдържа промотора 35S във фузия с интронната последователност 6, лидерът GUS, генът DHFR и терминаторът за нопалин синтетаза. Заместването на GUS лидера в pSOG19 с лидерната последователност от вируса на мозаичната хлороза по царевицата (MCMV) води до получаване на вектора pSOG35. pSOG19 и pSOG35 носят гена pRC за ампицилинова резистентност и притежават сайтовете Hindlll, Sphl, Pstl и EcoRI, подходящи за клониране на чужди последователности.

pSOG 10 5

Този β-глюкуронидазен (GUS) вектор на експресия е получен от плазмида рВ1121, закупен от Clontech Laboratories, Palo Alto, California. Интронът 6 от царевичния Adhl ген е маплифициран чрез PCR от плазмида р428, описан в Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81: 4125-4128 (1987), c помощта на олигонуклеотидните праймери SON0003 и SON0004.

SON0003: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3’

SON0004: 5’-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3’

Продуктът от PCR реакцията се разгражда с рестрикционната ендонуклеаза BamHI, разцепвайки BamHI сайта, добавен в 5' края на всеки PCR праймер. Полученият в резултат ДНК фрагмент се пречиства върху агарозен гел и се лигатира в BamHI сайта на рВ1121, който е разположен между CaMV35S промотора и гена GUS. Присъединената по този начин ДНК се трансформира в Е. coli и се клонира с Adhl интрона 6 в същата ориентация, както е установено с рестрикционен анализ за гена GUS.

pSOG 19

Този хидролат редуктазен (DHFR) експресионен вектор е получен чрез фузия на 35S промотор и Adhl интраон 6 от pSOG 10 към DHFR ген от плазмида рНСО, описан в Bourous and Jarry, EMBOJ. 2: 1099-1104 (1983). Промоторът 35S и Adhl интрон 6 са получени чрез PCR амплификация на фрагмента от pSOGlO с помощта на праймерите SON0031 и SON0010.

SON0031: 5’-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3’

SON0010: 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’

Полученият в резултат фрагмент е кон- DHFR кодиращият участък е получен струиран с рестрикционни ендонуклеази Pstl и чрез PCR амплификация на рНСО с помощта BspHI и е пречистен върху агарозен зел. на праймерите SON0016 и SON0017.

SON0016: 5’-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3’

SON0017: 5’-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3’

Полученият в резултат фрагмент е конструиран с рестрикционните ендонуклеази Nsol и Sacl и пречистен върху агарозен гел.

Двата фрагмента, описани по-горе са свързани във векторен фрагмент, изготвен от рВП 21 чрез разграждане с рестрикционните ендонуклеази Pstll и Sacl и пречистен върху 3 kb фрагмента, съдържащ Nos терминиращ участък и pUC19 участъка от рВИ 21 върху агарозен гел. Това трипосочно свързване слива 35S промотор - Adhl интрон 6 - DHFR ген-NOS терминатора в правилна посока и ориентация за функционална експресия в растения.

pSOG 30

Този GUS експресионен вектор е получен от pSOG 10 чрез инсерция на лидера от вируса на мозаичната полест по царевицата (MCMV), описан в Lommel et al., Virology 181: 382-385 (191), в 35S-GUS ген нетранслирания лидер чрез трипосочно свързване.

Синтезират се и се линеаризират двете вериги на 17 bp MCMV капсидна протеинова лидерна последователност плюс подходящи места на рестрикционни ендонуклеази. Полученият в резултат двойно верижен фрагмент се разгражда с BamHI и Ncol и се пречиства върху акриламиден гел.

Кодиращият участък на GUS гена се амплифицира чрез PCR с помощта на праймерите SON0039 и SON0041 и рВН 21 като мат45 рица.

SON0039: 5’-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3’ SON0041: 5’-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3’

Тези праймери добавят един Ncol сайт към 5'-края на GUS и Sacl сайт към 3’ края на GUS. Полученият в резултат фрагмент се разгражда с рестрикционни ендонуклеази Ncol и Sacl и се пречиства върху агарозен гел.

GUS генът се отстранява от плазмида pSOG 10 чрез разграждане с рестрикционната ендонуклеаза Sacl и частично разграждане с рестрикционна ендонуклеаза BamHI. Полученият в резултат вектор, който притежава BamHI и Sacl сайтовете, в които да се реинсертира кодиращ участък зад 35S промотор - Adhl интрон 6, се пречиства върху агарозен гел.

Тези три описани по-горе фрагмента се свързват в трипосочна връзка за получаване на генно сливане със структурата: 35S промотор - Adhl интрон 6 - MCMV лидер - GUS Nos терминатор, всички в структурата на вектора pUC19.

pSOG 35

DHFR селективният маркерен вектор е идентичен на pSOG 19, с изключение на това, че MCMV лидерът е инсертиран в нетранслирания лидер на DHFR гена за усилване на транслацията. Той е създаден в два етапа. Първо GUS кодиращият участък в pSOG32, вектор идентичен на pSOG30 с изключение на това, че съдържа модифициран Adh промотор вместо 35S, се замества с DHFR кодиращ участък от pSOG 19 чрез изрязване на GUS с Ncol и Sacl и присъединяване в DHFR като един Ncol-Sacl фрагмент. Това води до получаване на вектор pSOG33, който притежава генната структура Adh промотор - Adhl интрон 6MCMV лидер - DHFR кодиращ участък - Nos терминатор, с Bglll сайт между промотора и интрона и Sacl сайт между кодиращия участък и терминатора. Фрагментът Bglll-Sacl се изолира чрез разграждане с рестрикционни ендонуклеази и пречист-ване на агарозен гел, и се присъединява в BamHI и Sacl местата от pSOG30, замествайки Adhl интрон Z6-MCMV лидер-GUS кодиращият участък от pSOG30 с Adhl интрон 6-MCMV лидер-DHFR кодиращ участък от pSOG33.

Пример 21

Конструиране на растителни експресионни касети

Гениите последователности, които са предназначени за експресия в трансгенни растения, най-напред се събират в експресионни касети зад подходящ промотор и нагоре от подходящ транскрибционен терминатор. Тези експресионни касети след това лесно могат да бъдат прехвърлени в растителни вектори за експресия, описани по-горе в пример 19.

Подбор на промотори

Изборът на промотора, използван в експресионните касети, ще определи пространството и преходността на образеца на експресия на трансгена в трансгенното растение. Избраните промотори ще експресират трансгени в специфични клетъчни типове (като листни епидермални клетки, мезофилни клетки, коренови кортикални клетки) или в специфични тъкани или органи (корени, листа или цветове, напр.) и тази селекция ще се отрази на желаното локализиране на експресията на трансгена. Обратно, избраният промотор може да насочи експресията на гена под светлинно-индуциран или друг временно регулиран промотор. Друга алтернатива е тази избраният промотор да бъде химически регулиран. Това би предоставило възможността от включване на експресия на трансгена само когато е желателно и е причинено от въздействие с химичен агент.

Транскрибционни терминатори

Множество транскрибционни терминатори са подходящи за приложение в експресионните касети. Те са отговорни за терминиране на транскрибцията зад трансена и неговата правилна полиаденилация. Подходящи транскрибционни терминатори са онези, които са известни, че функционират в растенията и включват терминатора CaCV 355, tml терминатор, нопалин синтетазния терминатор и терминатора rbcS Е9 от грах. Те могат да бъдат използвани както в едносемеделни, така и в двусемеделни растения.

Съгласуване за усилване или регулиране на експресията

Установено е за много последователности от транскрибционната единица, че усилват генната експресия и поради което могат да бъдат използвани заедно с гените от настоящето изобретение за повишаване експресията им в трансгенни растения. Например, установено е, че интроните от царевичния Adhl ген значително повишават експресията на природния ген под неговия сроден промотор при индуциране в царевични клетки. Установено е, че интрон 1 е особено ефективен и повишава експресията при сливане на структури с хлорамфеникол ацетилтрансферазния ген (Callis et al., Genes

Develop. 1: 1183-1200 (1987)). В същата експериментална система, интронът от царевичния bronzel ген притежава сходен ефект при повишаване на експресията (Callis et al., supra). Интронните последователности са включени по рутинен начин в растителните вектори за трансформация, обикновено с нетранслирания лидер.

Известни са множество нетранслирани лидерни последователности, получени от вируси, за повишаване на експресията, и те са особено ефективни в клетки на двусемеделни. По-специално, показано е, че ефективни за повишаване експресията са лидерни последователности от вируса на мозаичната болест по тютюна (TMV, “W-последователност”), вируса на мозаичната болест по царевицата (MCMV) и вируса на мозаичната болест по люцерната (AMV) (напр. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 86938711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

Насочване на гениите продукти към вътрешността на клетките

Известно е, че в растенията съществуват множество механизми за насочване на гениите продукти и в известна степен са охарактеризирани и последователностите, контролиращи функционирането на тези механизми. Например, насочването на гениите продукти към хлоропластите е контролирано от сигнална последователност, намерена при аминокрая на различни протеини и който е разцепен по време на импорта на зрелия продукт от хлоропласта (напр. Comai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Тези сигнални последователности могат да бъдат сляти към хетероложни генни продукти за осъществяване импорта на хетероложните продукти в хлоропласта (van den Broeck et al., Nature 313: 358-363 (1985)). ДНК кодираща подходящите сигнални последователности могат да бъдат изолирани от 5' края на сДНК, кодиращи протеините RUBISCO, CAB, EPSP синтетазният ензим, протеина GS2 и много други протеини, за които е известно, че са локализирани в хлоропластите.

Други генни продукти са локализирани в други органели, като напр. митохондриите и пероксизомите (напр. Unger et al., Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). сДНК, кодираща тези продукти могат също да бъдат манипулирани, за да въздействат на насочването на хетероложни генни продукти към тези органели. Примери за подобни последователности са яд рено-кодираните АТФази и специфичните аспартат амино трансферазни изоформи за митохондриите. Насочването към клетъчни протеинови тела е описано от Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 6512-6516 (1985).

Охарактеризирани са и други последователности, които причиняват насочването на гениите продукти към други клетъчни части. Аминокрайните последователности са отговорни за насочване към ER, апопласта и екстрацелуларното секретиране от алеуронови клетки (Koehler & Но, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). В допълнение, аминокрайни последователности, заедно с карбоксикрайни последователности са отговорни за вакуоларното насочване на генни продукти (Schinski et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).

Чрез сливане на подходящите насочващи последователности, описани по-горе, към желани трансгенни последователности, става възможно да бъде насочен генният продукт към която и да е органела или клетъчен отдел. За насочване към хлоропласта например, хлоропластна сигнална последователност от гена RUBISCO, гена САВ, синтетазният ген EPSP, или GS2 гена, се слива с в рамката на аминокрая ATG от трансгена. Избраната сигнална последователност следва да включва познат сайт на разцепване, а при сливането трябва да се има предвид всяка аминокиселина след сайта на разцепване, които са необходими за целта. В някои случаи това изискване може да бъде изпълнено чрез добавяне на малко количество аминокиселини между сайта на разцепване и трансгена ATG или обратно, чрез заместване на някои аминокиселини вътре в трансгенната последователност.

Сливанията, създадени за хлоропластен импорт могат да бъдат тествани за ефективността на хлоропластно потребление чрез in vitro транслация на in vitro транскрибирани структури, последвано от in vitro хлоропластно потребление с техниките (описани от Bartlett et al. In; Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molekular Biology, Elsevier, pp 1081-1091 (1982); Wasmann et al. Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Тези техники са добре познати на специалистите в областта и са еднакво приложими за митохондрии и пероксизоми. Изборът на насочването, необходимо за експресия на трансгените, зависи от клетъчната локализация на необходимия пре курсор като изходен пункт за конкретния цикъл на обмяна. Тя обикновено е цитозолна или хлоропластна, макар в някои случаи да е митохондриална или пероксизомна. Продуктите на трансгенна експресия обикновено не изисква насочване към ER, апопласта или вакуолата.

Описаните по-горе механизми на клетъчно насочване може да бъде използвано не само заедно с техни сродни промотори, а също и заедно с хетероложни промотори така, че да въздейства на специфичното клетъчно насочване под транскрибционно регулиране на промотор, който има експресионен образец различен от промотора, от който се получават сигналите за насочването.

Пример 22

Трансформация на двусемеделни растения Трансформационни техники за двусемеделни растения са добре известни на специалистите в областта и включват основани на Agrobacterium техники и техники, които не изискват Agrobacterium. He-Agrobacterium техниките включват потребление на екзогенен генетичен материал директно от протопластите или клетките. Това може да бъде осъществено чрез PEG или медиирано от електропорация потребление, разпределение чрез частично бомбардиране, или микроинжектиране. Примери за такива техники са описани от Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), and Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987). Във всеки случай трансформираните клетки са регенерирани до цели растения с помощта на известни в областта стандартни техники.

Медиираната от Agrobacterium трансформация се предпочита за трансформация на двусемеделни поради високата ефективност на трансформацията и широката приложимост върху много и различни видове. Много зърнени видове са рутинно трансформируеми с Agrobacterium, включително тютюн, домати, памук, картофи, соя, люцерна и топола (ЕР 0 317 511 (памук), ЕР 0 249 432 (домати, Calgene), WO 87/07299 (Brassica (зеле), Calgene), US 4 795 855 (топола)). Трансформацията с Agrobacterium обикновено включва трансфера на бинарния вектор, носител на желаната чужда ДНК (напр. рС1В200 или рС1В2001) в подходящ щам Agrobacterium, което може да е в зависимост от комплементните vir гени, носени от гостоп риемниковия щам Agrobacterium както в коезидентен Ti плазмид, така и хромозомно (напр. щам CIB542 за рС1В200 и pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)). Трансферът на рекомбинантния бинарен вектор в Agrobacterium се осъществява от трипарентална процедура на съзряване с помощта на Е. coli, носещ рекомбинантния бинарен вектор, хелперен Е. coli щам, който носи плазмид като pRK2013 и който е способен да мобилизира рекомбинантния бинарен вектор да насочи щама Agrobacterium. Обратно, рекомбинантният бинарен вектор може да бъде прехвърлен в Agrobacterium чрез ДНК трансформация (Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).

Трансформирането на растителните видове чрез рекомбинантен Agrobacterium обикновено включва едновременно култивиране на Agrobacterium-a с експланти от растенията и следва протоколи, добре известни в областта. Трансформираните тъкани се регенерират върху селективна среда, носеща антибиотика или маркера за хербицидна резистентност, присъстващ между бинарните плазмидни Т-ДНК граници.

Пример 23

Трансформация на едносемеделни растения

Трансформацията на повечето едносемеделни видове растения вече също е рутинно. Предпочитани техники включват директен генен трансфер в протопласти с помощта на PEG или електропорационни техники, и частично бомбардиране в калусни тъкани. Трансформации могат да бъдат предприети с отделни ДНК видове или множество ДНК видове (напр. котрансформация) и тези две техники са подходящи за използване съгласно настоящето изобретение. Ко-трансформацията може да има преимуществото да заобиколи векторната структура и да генерира трансгенни растения с несвързани локуси за желания ген и за селективния маркер, позволявайки отстраняването на селективния маркер в последващи генерации, което следва да бъде считано като желано. Но недостатък на този метод е получаването на по-ниска от 100% честота на интеграция на отделни ДНК видове в генома (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)).

Патентните описания ЕР 0 292 435 (на Ciba-Geigy), ЕР 0 392 225 (Ciba-Geigy) и WO 93/07278 (Ciba-Geigy) описват техники за по лучаване на калус и протопласти от елитни инбредни линии царевица, трансформация на протопласти с помощта на PEG електропорация, и регенерация на царевични растения от трансформираните протопласти. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) and Fromm et al., Biotechnology 8: 833-839 (1990) са публикували техники за трансформация на получена от А188 царевична линия с помощта на частично бомбардиране. Нещо повече, описание WO 93/07278 (Ciba-Geigy) and Koziel et al., Biotechnology 11:194-200 (1993) описват техники за трансформация на елитни царевични линии чрез частично бомбардиране. Тази техника използва незрели царевични зародиши с

1.5-2.5 mm дължина, изрязани от царевичен клас 14-15 дни след опрашването и PDS - ЮООНе съоръжение Biolistics за бомбардиране.

Трансформирането на ориз може да бъде осъществено чрез директни ген трансферни техники с участието на протопласти или частично бомбардиране. Протопластмедиираната трансформация е описана за типовете Japonica и типовете Indica (Zhang et al., Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Двата типа са също рутинно трансформируеми с помощта на частично бомбардиране (Christou et al., Biotechnology 9: 957962 (1991)).

Патентно описание ЕР 0 332 581 (Ciba Geigy) описва техники за продуциране, трансформация и регенерация на протопласти на Pooideae. Тези техники позволяват трансформирането на Dactylis и пшеница. Нещо повече, трансформирането на пшеница е описано от Vasil et al., Biotechnology 10: 667-674 (1992)) и частично бомбардиране на клетки от типа С с продължително регенериращ се калус и също Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-15558 (1993)) и Weeks et al., Plant Physiol. 102M 1077-1084 (1993) c помощта на частично бомбардиране на незрял ембрион и незрял получен от зародиша калус. Предпочитаните техники за трансформация на пшеница, обаче, включват трансформиране на пшеницата чрез частично бомбардиране на незрял зародиш и включва високо захарозен или високо малтозен етап преди доставянето на гена. Преди бомбардирането ембриони (0.75-1 mm), независимо от броя им, се посяват в среда MS с 3% захароза (Murashige & Skoog, Physiologya Plantarum 15: 473-497 (1962)) и 3 mg/1 2,4-D за индуциране на соматични зародиши, които се оставят да престоят на тъмно. В деня, избран за бомбардиране, зародишите се отделят от индукционната среда и се поставят върху осмотична среда (напр. индукционна среда с добавени захароза или малтоза в съответно желана концентрация, обикновено 15%). Зародишите се оставят да плазмолизират в продължение на 2-3 h и след това се бомбардират. Типичното количество е двадесет зародиша за паничка, но това количество не е критично. Един подходящ плазмид, носещ ген (като рС1В3064 или pSG35) преципитира върху микрометърни златни частици с помощта на стандартни процедури. Всяка паничка с ембриони се бомбардира със съоръжение на DuPont Biolistics с помощта на ударно налягане от “1000 psi и стандартен екран с 80 отвора. След бомбардирането, зародишите се поставят обратно на тъмно за възстановяване за около 24 h (все още осмотично). След 24 h, ембрионите се отстраняват от осмотичната и се поставят в индуктивна среда, където стоят около месец преди регенерацията. Приблизително месец по-късно ембрионалните експланти с развит ембриогенен калус се прехвърлят в регенерационна среда (MS + 1 mg/1 NAA, 5 mg/1 GA), понататък съдържаща подходящ селекционен агент (10 mg/Ι баста в случая на pCIB3064 2 mg/1 метотрексат в случая на pSOG35). След приблизително един месец, развитите покълнеци се прехвърлят в по-големи стерилни контейнери, известни като “GA7s”, които съдържат MS, 2% захароза и същата концентрация от селекционния агент. Патентно описание 08/ 147161 описва методи за трансформация на пшеница и е включен в приложената литературна справка.

Пример 24

Подбор на растителни протокс гени, резистентни на протокс-инхибиторни хербициди в експресионна система на Е. coli

Плазмидът pWDC-4, кодиращ царевичен хлоропластен протокс ензим, се трансформира в щам XLl-Red, резултат на случайна мутагенеза (Stratagene, La Jolla, СА).

Трансформантите се посяват на среда L, съдържаща 50 g/ml ампицилин и се инкубират в продължение на 48 h при 37 С. Полетата с трансформирани клетки се изстъргват от паничките и плазмидната ДНК се изготвя с помощта на кит Wizardd Megaprep (Promega, Madison, WI). Плазмидната ДНК, изолирана от този щам се предполага, че съдържа приблизително 2000 нуклеотида (виж Greener et al., Strategies 7(2): 32-34 (1994)).

Мутиралата плазмидна ДНК се трансформира в hemG мутант SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979) и се посява върху среда L, съдържаща 100 g/ml ампицилин и същата среда, съдържаща различни концентрации от протокс-инхибиращ хербицид. Паничките се инкубират в продължение на 2-3 дни при 37 С. Плазмидната ДНК се изолира от всички колонии, които растат в присъствие на хербицидни концентрации, които ефективно убиват дивия щам. Изолираната ДНК след това се трансформира в SASX38 и се посява отново върху хербицид за потвърждение на това, че резистентността е с плазмиден произход.

Мутиралата pWDC-4 плазмидна ДНК отново се изолира от резистентни колонии и протокс кодиращата последователност се изрязва чрез разграждане с EcoRI и Xhol. Изрязаната протокс кодираща последователност след това се реклонира във вектора pBluescript, който не е подлаган на мутация и отново се тестува за резистентност на протокс-инхибиращ хербицид по същия начин, като е описано погоре.

Този процес елиминира некодиращи секвенционни мутации, които придават резистентност като свръхпромоторни мутанти (т.е. мутанти, чиято резистентност се дължи на мутации, причиняващи експресия на немодифициран протокс) и оставя само мутанти, чиято резистентност се дължи на мутации в протокс кодиращите последователности. Определя се ДНК последователността за всички вероятни хербицид-толерантни протокс гени, идентифицирани посредством този процес и се идентифицират мутации чрез сравняване с дивия тип pWDC-4 протокс последователността.

С помощта на процедурите, описани погоре, е установена устойчива мутация, която превръща С в Т при нуклеотиди 498 в pWDC-4 последователност (SEQ ID No. 5). Тази промяна превръща GCT кодон за аланин при аминокиселина 166 (SEQ ID No. 6) в GTT кодон за валин и води до протокс ензим, който е поне 10Х по-устойчив на протокс-инхибиращ хербицид в бактериални проби. pMzC-lVal, в pBluescript SK вектор, е депозиран в Agricultural Research Culture Collection на 30 септември, 1994 и е обозначен pWDC-8, с депозитен номер NRRL #21340.

Същата методика е използвана за скрининг на хербицид-резистентни форми на Arabidopsis протокс-1 ген в различни вектори. Установена е една устойчива мутация С в Т като изменението е в нуклеотид 689 в pWDC-2 последователността (SEQ ID No. 1); този плазмид е означен pAraC-lVal. Това изменение е идентично на pMzC-lVal мутанта по-горе, превръщащ GCT кодон за аланин при аминокиселина 220 (SEQ ID No. 2) в GTT кодон за валин при съответната позиция в Arabidopsis протокс протеинова последователност.

Втори устойчив ген съдържа едно изменение А в G при нуклеотид 1307 в pWDC-2 последователността (SEQ ID No. 1); този плазмид е означен pAraC-2Cys. Това изменение превръща ТАС кодона за тирозин при аминокиселина 426 (SEQ ID No. 2) в TGC кодон за цистеин. Съответният тирозинов кодон в царевичната протокс - 1 последователност при нуклеотидна позиция 1115-1117 (SEQ ID No. 5; аминокиселинна позиция 372 от SEQ ID No. 6) може по същия начин да бъде подложен на мутация за получаване на хербицид резистентна форма за този ензим.

Трети резистентен мутант притежава G в А изменение при нуклеотид 691 в последователността pWDC-2 (SEQ ID No. 1); този плазмид е означен като pAraC-3Ser. Тази мутация превръща GGT кодон за глицин при аминокиселина 221 (SEQ ID No. 2) в един AGT кодон за серин при кодонова позиция съседна на мутацията при рАгаС-1. Съответстващият глицинов кодон в царевичната протокс-1 последователност при нуклеотидна позиция 497-499 (SEQ ID No. 5; аминокиселинна позиция 167 от SEQ ID No. 6) може по сходен начин да мутира за получаване на хербицид резистентна форма на този ензим.

Всички описани по-горе мутации водят до получаване на протокс ензим, който е поне 10Х по-устойчив на протокс-инхибиращ ензим в бактериалната проба.

pAraC-2Cys, в pFL61 вектора, е депозиран на 14 ноември 1994 под означението pWDC7 в Agricultural Research Culture Collection и му е даден депозитен номер NRRL # 21339N.

Пример 25

Допълнителни хербицид-резистентни кодонови замествания в позиции, идентифицирани при случаен скрининг

Аминокиселините, идентифицирани като хебицид резистентни места при случайния скрининг се заместват от други аминокиселини и се тестват за функциониране и за хербицидна толерантност в бактериалната система. Олигонуклеотид-насочена мутагенеза на Arabidopsis протокс-1 последователност се осъществява с кит на Clontech, Palo Alto, СА, наречен Transformer Site-Directed Mutagenesis. След потвърждаване на промените в аминокиселините чрез секвенционен анализ, мутиралите плазмиди се трансформират в SASX38 и се посяват върху среда L-атр¹⁰⁰ за тестване за функционалност и върху различни концентрации от протокс-инхибиращ хербицид за тестване на толерантността.

Тази процедура се прилага при кодона за аланин при нуклеотиди 688-690 и при кодона за тирозин при нуклеотиди 1306-1308 от Arabidopsis протокс последователността (SEQ ID No. I). Полученият резултат показва, че аланиновият кодон при нуклеотиди 688-690 може да бъде изменен в кодон за валин, треонин, левцин или цистеин за получаване на хербицид-резистентен протокс ензим, който съхранява функционалността си. Резултатите показват още, че тирозиновият кодон при нуклеотиди 1306-1308 могат да бъдат изменени в кодон за цистеин, изолевцин, левцин, валин или треонин за получаване на хербицид-резистентен протокс ензим, който съхранява функционалността си.

Пример 26

Демонстрация на устойчива кръстосана толерантност, резултат от мутация, спрямо различни протокс-инхибиращи съединения

Устойчиви мутантни плазмиди, подбрани за резистентност спрямо отделен хербицид, се тестват срещу спектър от други протоксинхибиращи съединения. Резистентни мутантни плазмиди в SASX38 се посяват и изследват за способност да оцеляват в концентрации от всяко съединение, които са поне 10-кратно по-високи от леталните концентрации за SASX38 щам, съдържащ дивия тип плазмид.

Резултатите от тестването за кръстосана толерантност показват, че всяка от установените мутации допринася за толерантността спря мо различни протокс инхибиращи съединения. По-специално, резултатите показват, че 1) AraCl-Val мутациите водят до резистентност спрямо протокс инхибитори, включително, но без да се ограничава до тези с формули IV,

XI, XII, XIV, XV и XVII;

2) Ara-Cys мутацията придава резистентност спрямо протокс-инхибитори включително, но без необходимост от ограничение до тези с формули XI, XIII, XV и XVII; 3) MzClVal мутацията придава резистентност спрямо протокс инхибитори включително, но без да се ограничава до тези с формули XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI и XVII; 4) AraC-3Ser мутацията придава резистентност спрямо протокс инхибитори включително, но без да се ограничава до бифенокс и тези с формули IV,

XII, XIII, XIV, XV и XVII.

Пример 27

Получаване на хербицид толерантни растения чрез суперекспресия на растителни протокс гени

Arabidopsis протокс-1 кодиращите последователности от дивия тип и резистентните AraC-1 Vai гени се изрязват чрез частично разграждане с EcoRI и Xhol и се клонират в pCGN1761ENX растителен експресионен плазмид. Експресионните касети, съдържащи 2X35S-npoTokc генни фузии, се изрязват чрез разграждане с Xbal и клонират в бинарния вектор рС1В200. Тези бинарни протокс плазмиди се трансформират чрез електропорация в Agrobacterium и след това в Arabidopsis с помощта на вакуум инфилтрационния метод (Bechtold et al., 1993). Трансформантите се селекционират върху канамицин и Т2 поколението се генерира от множество независими линии. Това поколение се посява върху среда GM, съдържаща различни концентрации протокс-инхибиращ хербицид и се наблюдава за развитие и оцеляване. Множество трансгенни линии, суперекспресиращи както дивия тип, така и устойчивия мутантен протокс продуцират значително количество зелени покълнеци върху хербицидни концентрации, които са летални за празна векторна контрола.

Различни модификации на изобретението, описани тук, са очевидни за специалиста в областта и влизат в обхвата на патентните претенции.

СЕКВЕНЦИОНЕН ЛИСТИНГ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:

(i) ЗАЯВИТЕЛ:

(A) ИМ& СОВА- GEIGY AG (B) УЛИЦА: Klybeekstr. 141 (C) ГРАД: Basel (E) ДЪРЖАВА: Switzerland (F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP): 40X2 (G) ТЕЛЕФОН: +4161 & 1111 (X) ТЕЛЕФАКС: +4161696 79 76 (I) ТЕЛЕКС: 962991 (и) НАИМЕНОВАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: МАНИПУЛИРАНЕ НА ПРОТОПОРФИРИНОГЕН СКСИДАЗНАТА ЕНЗИМНА АКТИВНОСТ В ЕУКАРИОГИЧНИ ОРГАНИЗМИ (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 20 (fr) КОМПЮТЪРНО ЧИТАЕМА ФОРМА (A) СРЕДЕН КЛАС: флори gucfc.

(B) КОМПЮТЪР: ШМ PC coujMtibte (C) ОПЕРАТИВНО СИСТЕМА PC- DOS/ MS- DOS (D) СОфТУЕР: РяЬийп Release #1*0, Vertion # 1.2S (EPOJ (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO 1:

(ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

{А) ИМЕ,· КЛЮЧ: CDS (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ; 31. 16*4 (t>) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: /Забележки = “AraWdopm, ргстол-1 сДШЬ последователност от pWDC- 2* i»l ОПИСАНИЕ НА ПОСлЕДОвЛТЕАПОСГТЛ SEQ (D NO: 1:

TGACMAATT ОССЛЛТТСТС TGOGWTTCC AIG GAC TTA ТСТ CTT СТС OGT CQG 54

Mac Glu Leu Ser leu leu Arg Pro

5

ACG

ACT

CAA

TOG

CTT

CTT

COG

TCG

TTT

TCG

AAG

CCC

AAT

CTC

CGA

TTA

102

Thr

Thr

Gin

Ser

Lau

leu

Pro

Ser

Phe

Ser

lye

Pro

Asn

Leu

Arg

leu

10

15

20

AAT

GTT

TAT

AAG

CCT

CTT

AGA

CTC

COT

TOT

TCA

GTG

GCC

GGT

GGA

CCA

150

Asn

val

iyr

Lys

Pro

Ltu

Arg

leu

Arg

eye

Ser

Vai

AU

Gly

Gly

Pro

25

30

35

40

ACC

src

GGA

TCI

TCA

ада

ATC

6ЛА

GGC

GGA

GGA

GGC

ACC

AOC

ATC

ADG

198

Thr

V*1

Gly

Ser

Ser

Lys

He

Glu

Gly

Gly

Gly

Gly

Thr

Thr

lie

Thr

45

50

55

ACS

GAT

TOT

GTG

ATT

GTC

GGC

GGA

GCT

ATT

AST

GGT

CTT

TGC

ATC

GOT

246

Thr

A3P

Cys

Vai

ZU

Vai

Gly

Gly

Gly

XU

Sec

Gly

Leu

CyS

He

AU

GO

«5

7D

CAG GCG CTT ACT AC AAG CAT OCT SAT GCT GCT ODG AAT ΤΙΛ ATT GTG 294

Gin

Ale

Lau

AU

Thr

Lys

H13

Pro

Asp

Ala

AU

Pro

Asn

leu

He

Val

75

SO

85

ACC

GAG

GCT

AAG

GAT

OCT

OTT

GGA

GGC

AAC

ATT

ATC

ACT

CGT

GM

GAG

342

thr

Glu

Ale

Lys

Asp

Arg

Vai

Gly

Gly

Asn

He

lie

Thr

Arg

Glu

Glu

-

90

95

100

AAT

GGT

TTT

CTC

TGG

GM

GM

GGT

ooc

MT

AGT

TTC

CM

COG

TOT

GAT

390

Asn

Gly

Phe

leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

Ser

Asp

105

110

115

120

CCT

ATC

CTC

ACT

ASG

GIG

CTA

GAT

ACT

GGT

TTG

AAG

GAT

GAT

TTG

GTG

438

Pro

Met

Leu

Thr

Met

Vai

Vai

Asp

Ser

Gly

Leu

Itfs

AS₽

Asp

leu

val

125

130

135

TTG

GGA

GAT

CCT

ACT

GOG

CCA

ASS

TTT

GTG

TIG

TGG

AAT

GHS

AAA

TTG

485

leu

Gly

ASp

Pro

Thr

AU

Pro

Arg

Phe

val

leu

Tq>

АЗП

Gly

lys

Leu

140

145

150

AGS

COG

GTT

OCA

TCG

AAG

CTA

ACA

GAC

TTA

CCS

TTC

TTT

GAT

TIG

ATG

534

Arg

Pro

val

Pm

Ser

Lys

leu

Thr

Asp

leu

Pro

Phe

phe

Asp

Leu

Met

155

160

165

ACT

AIT

GGT

GGG

MG

ATT

AGA

GCT

GGT

TTT

GGT

GCA

CTT

GGC

ATT

QGA

Ser

Xie

Gly

Gly

LyS

lie

Arg

Ala

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

lie

Ar?

170

175

180

CCG

TCA

OCT

OCA

GGT

CGT

GAA

GAA

TCT

GIG

GAG

GAG

TTT

GTA

OGG

CGT

Pro

Ser

Pro

Pro

Gly

Arg

Gin

Glu

Ser

va)

Glu

Glu

phe

Vai

Arg

Arg

185

190

19S

208

AAC CTC GGT	GAT GAG GTT TTT GAG CGC CIG ATT GM COG TTT TGT TCA	67R
Asn	Leu Gly	Asp Glu Vai Phe Glu Arg Leu lie Glu	Pro phe Cys Ser 215
205	210
GCT	GTT TAT	GOT GGT GAT CCT	TCA. AAA CTG AGC ATG	AAA GCA GOG TIT	726
Gly	Vai Tyr	Ala Gly Asp PrO	sor т.уз i«u Ser net	Lya Ala Ala Phe
		220	225	230
GGG	AAG GIT	TGG AAA CTA GAG	CAA AAT GGT GGA A3C	ATA ATA GGT GCT	774
Gly	Lys val	Trp Lys Leu Glu	Gin Aan Gly Gly Ser	lie lie Gly Gly
	235		240	245
ACT	TTT AAG	GCA ATT CAG GAG	AGG AAA AAC GCT OOC	AAG QCA GAA OGA	022
ihr	Vhe Lys	Ala lie Gin Glu	Arg Lys Asn Ala Pro	Lys Ala Glu 'Arg
	250	255	260
GAC	COG CGC	CTG CCA AAA CCA	CAG GGC CM ACA GTT	GCT TCT TTC AGG	070
А.ЯВ	Pro Arg	Leu Pro Lys Pro	Gin Gly Gin Thr Vai	Gly Ser Phe Arg
265		270	275	280
?AG	GGA CTT	CGA ATG TTG CCA	GAA GGA ATA TCT GCA	AGA TTA GCT ACC	91B
	Gly Leu	Arg Met Leu Pro	Glu Ala lie Sex Mj	'jpg Leu Gly Ser
		285	290	295
AAA	GTT AAG	TTG TCT TGG AAG	CTC TOA GGT ATC ACT	AAG CTG GAG AGO	96$
Lys	Vai Lys	Leu Ser Trp Lys	Leu Ser Gly He Thr	lys Leu Gin Ser
		300	305	31Ό
GGA	GGA TAC	AAC TTA ACA TAT	GAG ACT OCA GAT GGT	TTA GTT TOC GTG	1014
Gly Gly Tyr	Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Asp Gly	Leu Val Ser Val
	31S		320	325
CAG	AGC AM	ACT GTT GTA ATG ACG GTG CCA TCT CAT GTT GCA ACT GGT	1062
Gin	Ser lys	Ser val Val Met Thr val Pro Ser Bis val Ala Ser Gly
	330	335	340.
CTC	TTG CGC	CCT CTT TCT GAA TCT OCT GCA AM GCA СТС TCA AAA CTA	1110
Leu	Leu Arg	Pro Leu Ser Glu	Ser Ala Ala Aan Ala	Leu Ser lys leu
345		350	355	360
TAT	TAC CCA	CCA GTT GCA GCA	CTA TCT ATC TOG TAC	CCG AM GM GCA	1158
Tyr	Tyr Pro	Pro Vai Ala Ala	Vai Ser He Ser Tyr	Pro Lys Glu Ala
		365	37D	37S
ATC	OGA ACA	GAA TGT TTG ATA	GAT GGT GAA CTA AAG	GCT TTT GGG CM	1206
He	Arg Thr	Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu lys	Gly Phe Gly Gift
		380	385	390
TTG	CAT OCA	CGC ACG CAA GGA	GTT GAA ACA TTA GGA	ACT ATC TAC AGC	1254
Leu	His Pro	Axg Thr Gin Gly	val Glu Thr Leu Gly	Thr lie Tyr Ser
	39b		400	405

гсс тса сте ттт сс* *лт сте <зс* ав occ «за ма лтт ттб ехе тго1302

Sei Ser Leu Phe Pro Ann Arg Ala Pre Pro Gly Arg lie Leu Zen Leu <10 <15<20

АЙС TAD AIT GOT GQ3 TCT АСА AAC ADC GGA ATI CIG TOT AAG TCI GAA1350

Asn Tyr lie Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Li· Leu Ser Lys SerGlu

425 430 435440

GET GAG TIL OTG GAA GCA GTT GAD АБА GAT ТИЗ MSG AAA ATG СТА ЯТТ1398

Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Aap Arg Asp Leu Ang Lye Met leuHe

445 450455

MGCC7AATTOSJeCGATCCACTTA*ATTftGSAGTrAOGffTATGGCCT 144« lys Pro Анп. Ser Thr Asp Pro Leu Lys leu Gly V*1 Arg Val Trp Pro

4« - 465470

CAAGOCATTCCTCAGTITCTAGntSGTCACTTTaTATCCTTGACACG 1494 Gin Л1А lie Pro Gin Phe Leu Val Gly His Phe Asp lie Leo Asp Thr

475 440485

GCT АЛД ТСА ТСГ CFA ACS 7CT TOO GGC ТДС GAA GGG CTA TO TIG GOT1542

Aia LyS Ser sex LUU Thr Ser sex Gly Tyr Glu Gly Leu Phe leu Sly

490 495500

GOT АЛТ ТЛС OTC OCT GOT OTA GCC ТГА GOT COT TOT OTA GAA GOT Ga1S90

Gly А4П Tyr val Ala Gly val Ala Leu Gly Arg Сул Val Glu GlyAla

505 510 515520

TAT GAA ADC GOG АТГ SMS OTC AAC AAC TTC MEG TOA CTS ®C SOT TAG1638

Tyr Glu Thr Ala lie Glu Val Asn Aan Phe Met Ser Arg Tyr AlaTyr

535 530S35

AAG TAAAEOTAAA Л£ЖПАААТС TOCCllGCTTG OGIGROTTTT КПАААТЖГГ1891 hys

TKSAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA1719 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NQ1 (0 С2КВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 537 амино Киселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: дшмярм (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: дретеим (*ϋ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:

wet Clu Leu Sfi-r »<*: r-ju Ar·.: Pro Thr Thr Gin se? Jeu Leu Pte Ser

6 lb

Phe

Ser

Lye

Pro

Asn

Leu

Arg

Leu

Asn

Vai

Tyr

Lys

Pro

Leu

Arg

Leu

20

25

30

Arg

Cys

Ser

Vai

Ala

Gly

Gly

Pro

Thr

Vai

Gly

Ser

ser

I#3

lie

Glu

35

40

45

Gly

Gly

Gly

Gly

Thr

Thr

lie

Thr

Thr

Asp

Cys

Val

lie

Val

Gly

Gly

50

55

60

Gly

lie

Ser

Gly

Leu

cys

He

Ala

Gin

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Pro

65

70

75

50

Agp

Ala

Ale

Pro

АЗП

Leu

lie

Vai

Thr

Glu

Ala

Lys

Asp

Arg

Val

Gly

05

90

»5

Gly

Mn

lie

lie

Thr

Arg

Glu

Glu

ASn

Gly

Phe

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

100

105

110

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

Ser

Asp

Pro

Met

Leu

Thr

Met

v&l

Val

Asp

115

120

125

Ser

Gly

leu

Lye

Asp

Asp

Leu

val

Leu

Gly

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro

Arg

130

135

140

Phe

val

Leu

Trp

Asn

Gly

Lye

leu

Arg

Pro

val

Pro

set

Lys

Leu

Thr

145

150

155

160

ASP

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

wee

Sex

lie

Gly

Gly

Lys

lie

Arg

Ala

165

l?0

175

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

He

Arg

Pro

Ser

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

180

185

190

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Vfcl

Arg

Arg

Asn

leu

Gly

ASp

Glu

val

Phe

Glu

195

200

205

Arg

Leu

lie

G1U

Pro

Phe

Cys

Sex

Gly

Vai

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

210

215

220

LyS

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

PM

Gly

Lys

Val

Trp

Lys

Leu

Glu

Gin

225

230

235

240

Asn

Gly

Gly

Ser

lie

lie

Gly

Gly

Thr

Phe

Lys

Ala

He

Gin

Glu

Arg

245

250

255

Ly3

Asn

Ala

Pro

Lys

Ala

Glu

Arg

Mp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Glh

260

265

270

Gly

Gin

Thr

val

Gly

Ser

Phe

Arg

LyS

Gly

Leu

Arg

Met

Leiu

Pro

Glu

275

280

285

Ala He Sex Ala Arq 1-jn Gly Sec Lys Vai I.ys Leu Ser lip Lye Leu 290 295 300

Ser Gly lie Tlir Lys Ιχϊυ Glu Ser Gly Gly Tyr Asn L@u Thr Tyr Glu 305 310 315 320

Thr

Pro

Asp

Gly

Leu

Val

Ser

Val

Gin

Ser

Lys

ser

vol

Val

Mat

Thr

325

330

335

VW

Pro

Ser

His

val

Ala

Ser

Gly

Leu

Leu

Arg

pro

Lev

Ser

Glu

Ser

340

345

350

Ala

Ala

Asn

Ale

Leu

Ser

Lys

Leu

Tyr

Tyr

Pro

pro

val

Ala

Ala

Val

355

360

365

Ser

lie

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

He

Arg

Thr

Glu

Cye

teu

He

Asp

370

375

380

Gly

Glu

LSU

LyS

Gly

Phe

Gly

Gin

Leu

His

Pro

Ax?

Thr

Gin

Gly

Val

385

390

395

400

Glu

Thr

Lev

Gly

Thr

lie

Tyr

Sex

Ser

Ser

Lev

Phe

Pro

Asn

Ax?

Ala

405

410

415

Pro

Pro

Gly

Arg

He

Leu

Leu

Leu

Asn

Tyr

He

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

420

425

430

Thr

Gly

He

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

435

440

445

Arg

Asp

Leu

Ax?

Lya

Met

LUu

He

lya

Pro

Asn

Ser

Thr

Asp

Pro

LSU

450

455

460

Lys

leu

Gly

VW.

Ax?

%1

Trp

Pro

Gin

Al*

lie

Pro

GlJl

Phe

Leu

val

465

470

475

480

Gly

ΗΪ9

Pte

Asp

lie

Leu

Aap

Thr

Ala

Lys

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

455

490

495

Gly

Tyr

Glu

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

500

505

510

Leu

Gly

Arg

Cys

Val

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu

Thr

Ala

lie

Glu

Val

ASn

515

520

52S

Asn

Phe

мес

Ser

Arg

Tyr

Ala

Tyr

LyS

530

535

;2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3:

(i)

ЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА: 1738 gBoflku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едвоверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: ливеариа (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ИМЕ/КЛЮН: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 70... 1596 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: / мбележка= *Arabidopsis porctox- 2 сДНК; посЛдовашелйасш cnijjWDC- 1* ix'i) Описание U-й, пос(\едрьс|Тсь^осТТа . ΐ© IUO?0 ? ТТТГГГАСТТ АТГГСССтСА CTGCTTTOGA CTCGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTOITG60

CAGATAGCA ATC QQG ТСГ GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GOGIQS

Mat Ala Ser Gly Ala V&1 'Ala Asp itjs Uln He GLu Ala

I 51C

GIT

•iCA

GGA

AAA

AGA

GTC

GCA

gtc

GTA

GOT

GCA

GGT

GTA

AST

GSA

CTT

156

vai

Sex

Gly

Lys

Axg

val

Ala

Val

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

leu

15

20

25

Gog

GOG

GCT

TAC

AAG

TTG

AAA

TCS

AGG

GCT

TTG

AAT

GTC

ACT

GTC

Ϊ7Τ

204

Ala

Ala

Ala

Tyr

Lye

Leu

Lys

Ser

Arg'

Gly

Leu

Asn

Val

Thr

val

phe

30

35

40

45

Gaa

GCT

GAT

GGA

AGA

GTA

GCT

GGG

AAG

TTG

AGA

AGT

GTT

ATC

CM

AAT

25?

Glu

Ala

Asp

Gly

Arg

Val

Gly

Gly

Lys

Leu

Arg

Sex

vai

Wat

Gin

Asn

50

55

60

GGT

TTG

ATT

TOG

GAT

Gaa

GGA

GCA

AAC

ACC

ATG

ACT

GAG

GCT

GAG

CCA

300

Gly

leu

Tie

Tzp

Asp

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Tbr

Glu

Ala

Glu

ExO

65

TO

75

GAA

Gn

G3G

ACT

ΊΤΑ

CTT

GAT

GAT

CTT

GGG

CTT

CGT

GAG

AAA

СЛЛ

<3A

346

Glu

val

Gly

Ser

Leu

Leu

ASP

ASp

Leu

Gly

tea

Arg

Glu

LyS

Gin

Gin

BQ

S5

90

ΊΤΤ

CCA

ATT

TCA

CAli

AAA

AAG

COG

TAT

ATT

CTG

CGG

AAT

GGT

GTA

OCT

396

Phe

F/Q

71«

Ser

Lys

Lys

Arc

Ty*

He

Val

Arg

АЯЛ

Gly

val

Pxu

IGO

J05

GTG

ATG

CTA CCT

ACC

AAT

CCC ATA GAG CTC CTC

ACA

act

AGT

GTC CTC

444

va)

Met

Leu

Pro

Thr

AS:i

Pro lie Gly Usu val

Thr

Ser

Ser

Val

Leu

tic

115

120

125

TCT

ACC

QAA TCT

AAG

TTT

CAA ATC TTG TTG GAA

CCA

m

TTA

TGG

AAG

492

Ser

Thr

Gin

ser

Lyu

Phe

Gin He Leu Leu Glu

Pro

Phe

Leu

Trp

Lys

130

135

140

AAA AAG

TOC

TCA

AAA

GTC

тел gat era tct oct

GAA

GAA

AGT

GTA

AGC

540

Lys Lys

Sex

Ser

LyS

val

Ser ASp Ala Ser Ala

Glu

Glu

Ser

Val

Sex

:45

150

155

GAG

TTC

TTT

CAA

CGC

CAT

TTT GGA CM GAG GTT GTT GaC

TAT

CTC

ATC

588

Glu

Phe

Phe

Gin Arg

His

Phe Gly Gin Glu V&l

Val

Asp ТУГ

Leu

Tie

160

165

170

GAC

OCT

TIT

GIT

GGT

GGA ACA AGT GCT GOG GAC

OCT

GAT

TCC

CTT

TCA

636

A3p

РГО

Phe

Vai

Gly

Gly Thr Ser Ala Ala Asp

Pro

ASp

ser

Leu

Ser

175

180

185

ATG AAG

CAT

TCT

TTC

OCA GAT CTC TGG MT GTA

(ЗЙ

AM

AGT TTP

GGC

684

Mat

LyS

Mi л

Ser

Phe

pro Asp Leu Trp Asn Vai

Glu

lys

Sex Phe

Gly

190

195

200

205

TCT

ATT

ΑΈΛ

GTC

GGT

GGA

ATC ASA ACA AAG TTT

OCT GCT

AAA GGT

GGT

732

Ser

He

lie

Vai

Gly

Ala

lie Arg Thr Lys Phe

Ala AU

Lyg Gly Gly

210

215

220

AAA

AGT

AGA

GAC

ACA

aAG

AGT TCT OCT GGC ACA

AAA AAG

GGT

TOG

OGT

780

Lys

Ser

Arg Asp

Thr

Lys

Ser SOr Pro Gly Thr

Lys Lys

Gly

Ser

Arg

225

230

235

GGG

TCA

TTC TCT

TTT

AAG

GGG 6® ATG CAG ATT

CTT OCT

GAT ACG

TTG

828

Gly

Ser

Phe Ser

Phe

Lys

Gly Gly Met Gin lie

leu

Pro

Asp

Thr

Leu

240

245

250

TGC

AAA AGT

CTC

TCA

CAT

GAT G№ ATC AAT TEA GAC

TCC

AAG GTA

CTC

876

Cys

Dps

Ser

Leu

Ser

His

Asp Glu lie Asn Leu

Asp

Ser

I#S

val

Leu

255

260

265

TCT

TTG

TCT

TAC

AAT

TCT

GO TCA AGA CAG GAG

AAC

TGG

TCA

TTA TCT

924

ser

Leu

Ser Tyr

ASH

Ser

Gly Ser Arg Gin Glu

Asn

Trp

Ser

Leu

Sex

2Щ

275

280

285

TCT

GTT

TOG CAT

AAT GAA ACG CAG AGA CAA AAC

OOC

CAT

TAT

GAT GCT

972

Cys

Vai

Ser

His

Азп

Glu

Thr Gin Arg Gin Asn

Pro

HiS

Tyr

Asp Ala

290

295

300

GTA ATT

ATG

ACG

GCT

OCT

CTG TGC MT GTC AAG GAG

ATG

AAG 6П ATG

1020

Vai

lie

Met

Thr

Ala

Pro

Jeu Cys Asn Val Lys Glu

Met

Lys Val Met

305

310

315

АЛА GGA GGA CAA СОС TTT CAG СТЛ AAC Lye Gly Gly Gin Pro Phe Gin Leu Asn 320325 atg αχ стс tog етт тгл лтс лсс аса

Het Pro Leu Ser Val Leu lie Thr Thr

335340

AGA CCT CTT GM GGC TTT O3G GIA CTC Atg Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu 350355

CAT GGT TTC AAA ACT CTA GOT ЛСА CTT His Gly Phe l^s Thr T^t Gly Thr Ltu 370

GAT OCT TCC CXT ACT GAC GTT CAT CTA Asp Arg Ser Pro Ser Asp Val Hi 5 Lou 385390

AGT AGG AAC CAfi GAA OTA GCC AAA GCT SOr Arg Asn Gin Glu Leu Ala Lys Ala 400405

GTT GTG ACT TCT GAC CTT CAG OGA CTG Val Vai Thr Ser Asp Leu Gin Arg Leu 415420

GTG TCT GTC AAC CAT TAG TAT TGG AGG Val Ser Val Asn His Tyr Tyr Tip Arg 43043b

AGC AGC TAT GAC TCA GTC ATG GAA GCA Ser Ser Tyr Asp Ser val Mat Glu Ala 450

CTA OCT GGG TTC TTC TAT GCA GOT AAT Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn 465470

GGG AAA TCA ATA GCA TCA GOT TGC AAA Gly Lys Ser lie Ala Ser Gly Cys Lye 480485

TAC CTG G№ TCT TGC TCA AAT GAC AAG 1603

Tyr Ix*u Glu Ser Cys Ser Адо Asp Lys 495500

TTT CTC CCC GAG ATT AAT TAC	1060
Phe leu Pro Glu lie Asn Tyr
330
TTC ACA AAG GAG AAA OTA AAG	1116
Phe Thr Lys Glu Lys Val lys 343
ATT CCA TCT AAG GAG CAA AAG	1154
lie Pro Ser Lys Glu Gin Lyg 360 365
TTT ТСЛ TCA ATG ATG TTT CCA	1212
Phe Sor Ser Het Mat Phe Pro 375 380
TAT >£A ACT TTT ATT GGT GGG	1260
Tyr Thr Thr Phe He Gly Gly 395
TCC ACT GAC GAA TTA AAA CAA	1308
Ser Thr Лзр Glu Leu Lys Gin 410
TTG GGG GTT GAA GGT GAA CCC	1356
Leu Gly val Glu Gly Glu Pro 425
AAA GCA TTC COG TTG TAT GAC	1404
Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Asp 440 445
AIT GAC AAG ATG GAG AAT GAT	1452
lie Asp Lys Met du Aan Asp 455 460
ατ CGA GOG GOG CTC TCT GTT	150Q
his Arg Gly Gly Leu Ser val 475
GCA GCT GAC CTT GTG ATC TCA	1548
Ala Ala Asp Leu Val Xie Ser 490
AAA CCA AAT GAC AQC ТГЛ TAACATIGTC Lya Pro Asti Asp Ser Leu 5D5

AAGGrrOSTC ССГПТТАТС ACTTACTTTG TAAACTTGrA AWGCMCA AGCCGCOGTG J 663

OGATTAQCCA ACAAGTCAGC AAAACCCAGA ТТСТСАТААЙ GCICaCTAAT ’ГСГАЙААТАА 1723

ACTATTTATG ТЛЛМ (2) ИНФОРМАЦ ИЯ ЗА SEQ Ю N04;

<ij СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАЕСШРИСГИЮк (A) ДЪЛЖИНА: 508 «мшю киселини (B) ТИП: Шшю киселина (D) ТОПОЛОГИЯ: шнмрш (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: npotmeuu (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ГО NO: 4:

Met

Ala

Ser

Gly

Ala

val

Ala

Asp

Я13

Gin

He

Glu

Ala

val

Ser

Gly

1

5

10

15

Ly«t

Atg

val

Ala

Val

Val

Gly

AU

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

20

25

30

Tyr

Lys

i-eu

LyS

Ser

Arg

Gly

Leu

МП

Val

Thr

Vol

Phe

Glu

Ala

Asp

35

40

45

C-ly

Arg

val

Gly

Gly

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Met

Gin

Asn

Gly

Leu

lie

SO

55

50

Ttp

Glu

Gly

Ma

A30

Tiir

ker.

-n-L

•:;1 u

Λ.:ζ.|

G&

Glu

Val

Gly

G5

70

7 b

so

Ser

Leu

Leu

Asp

Asp

Leu

Gly

LCu

Arg

Glu

Lys

Gin

Gin

Phe

Pro

Xie

85

90

95

S6r

Gin

Lys

Lys

Arg

Tyr

lie

Vai

Arg

Asn

Gly

Val

Pro

Val

Met

Leu

loo

105

1W

Pro

Thr

Asn

Pro

Ila

Glu

Leu

val

Thr

Ser

sax

val

Leu

ser

Thr

Gin

115

120

125

Ser

Lys

Phe

Gin

lie

Leu

Leu

Glu

Pro

Phe

Iau

Trp

lys

Lya

Lys

Ser

130

135

140

Ser

Lys

val

ser

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Glu

Ser

Val

Ser

GLu

Phe

Phe

150

155

160

Gl n

Arg

His

phe

Gly

Gin

Glu

Val

v$l

ASp

Tyr

Leu

lie

Asp

Pro

Phe

165

L?0

175

val

Gly

Gly

Thr

Ser

Ala

Ala

Asp

Pro

Asp

Ser

i^eu

Ser

Net

LyS

His

180

185

190

Ser

Phe

Pro

Asp

Leu

Trp

Mu

Val

Glu

Lys

Ser

Phe

Gly

Ser

He

I1C

		195				200				205
val	Gly Ala lie Arg Thr	LyS	Pile	Ala Ala	LyS	Gly Gly Iya	Ser Arg
	210				215				220
Asp	Thr	Lys Ser	Ser Pro	Gly	Thr	lys Lys	Gly	Ser	Arg Gly	Ser Phe
225				230				235			240
Sex	Phe	Lys Gly Gly Met	Gin	lie	Leu Pro	Asp	Thr	Leu cys	Lys Ser
				245			250				255
Leu	Ser	His	Asp	Glu lie	АЗП	Leu	Asp Ser	Lys	vw	Leu Ser	Leu Ser
			260				265			270
Tyr	Aan	Ser	Gly	Ser Arg Gin Glu	Asn Trp	Ser	Leu	Sex Cys	val Ser
		275				280				285
His	Asn	Glu	Thr	Gin Arg	Gin	Asn	Pro His	iyr	Asp	Ala Val	He Met
	290				295				300
Thr	Ala	Pre	Leu	Cys Asn	Val	Lys	Glu Met	lya	VW- Met Lys	Gly Gly
3Q5				310				315			320
Gin	Pro Phe	Gin	leu Asn	Phe	leu Pro Glu	lie	ASn	Tyr Met	Pro Leu
				325			330				335
Ser	val	leu	He	Thr Thr	Phe	Thr	Lys Glu Lys	Val	lys Arg	Pro Leu
			340				345			350
Glu Gly Ph· Gly	Val Leu	He	Pro	Ser Lys Glu Gin	LyS HiA Gly Phe
		355				300				365
Lys	Thr	Leu Gly	Thr Leu	Phe	Ser	Ser Net	Met	Phe Pro Asp	Arg Ser
	370				375				380
Pro	Ser	Asp val	His Leu	Tyr	Thr	Thr Phe	lie Gly Gly Ser	Arg Asu
385				390				395			400
Gin	Glu	Leu Ala	Lys Ala	Ser	Thr	Asp Glu	Leu	Lys	Gin Val	Val Thr
				405			410				415
Ser	Asp	Leu Gin	Arg Leu	Leu	Gly	val Glu Gly	Glu	Pro Val	Ser Val
			420				425			430
Asn	His	Tyr Tyr Trp Arg Lys	Ala	Phe Pro	Leu	Tyr	Asp Ser	Ser туг
		435				440				445
ASp	Ser	val	Met	Glu Ala	He	ASp	Lys Met	Glu	Asn	Asp leu	Pro Gly
	450				455				460
Phe	Phe	Tyr Ala Gly ЛЗП	His	Azq Gly Gly	LCu	ser	Val Gly	Lys Ser
4€S				470				475			4Θ0

Ϊ1« Ala Ser Gly Cys lys Ma Ala Asp Leu Vai Xie Ser Tyr Leu Glii 48$ 490 495

Sec Cya Ser Asn Asp lys Ly* Pro Asn Asp Ser Lee

500 505 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 5:

(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 16№ gBcflku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ. едновершкиа (D) ТОПОЛОГИЯ: линеярна (Й) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ΐϋ) ХИПОТЕТИЧНОСЕ не (hr) БЕЗСМИСЛЕНОТО не (ix) ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ; CD5 (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 2... 1453 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: /забелажка- “царевичен протокс-1 сДНК ( е непълна дължина); последователност от pWDC- 4 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ П> NO: 5:

G АКТ TOG GOG ОС TOC GTC GIG GIG GGC GGA GGC ATC W GGC CTO 46

Asn Ser Ala Asp Cys Vai val VS1 Gly Gly Gly lie Ser Gly leu 15 10 15

TGC

ADC

GOG

CAG

GOG

CTG

GCC

MX»

OGG

СЛС

GGC

GIC

GGG

GAC

GIG

CIT

cys

Thr

Ala

Gin

Ala

Leu

Ala

The

AX9

His

Gly

VW

Gly

Asp

Vai

Leu

20

25

30

GIC

AOG

GAG

GOO

CGC

GOC

OGC

CQC

GGC

GOC

AAC

ATT

ACC

MX

GTC

GAG

Vai

Thr

Glu

Ala

A«G

Ala

Arg

Pro

Gly

Gly

АЗП

lie

Thr

Thr

Vai

Glu

35

40

45

CGC

ccc

GAG

GM

GGG

TAC

CTO

TOG

GAG

GAG

GGT

CCC

AAC

ADC

TTC

CAS

Μς

Pro

G1U

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

SO

55

60

сос

TOC

GAC

CCC

GTT

СГС

ACC

ATO

QOC

GTO

GAC

AGO

QGA

CIC

AAG

GAT

Pro

Ser

Mp

Pro

Vai

Leu

Thr

Met

Ma

v«l

Asp

Ser

Gly

Leu

LyS

Asp

£5

70

75

GAC

TTG

GIT

ТТГ

GOG

GAC

CCA

AMT

GOG

CCG

OCT

TIC

GTG

CTG

TGG

GAS

286

Asp

Leu

V&1

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

Ala

РГО

Arg

Phe

Val

Leu

Tip

Glu

80

85

90

93

GGG

AAG

CTG

MSG

CCC

GTG

CCA

TOC

AAG

CCC

GOC

GAC

CTC

COG

TTC

tic

334

Gly

Lya

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

tya

Pro

Ala

ASp

leu

Pro

Phe

Phe

Ida

105

110

GAT

CIC

ATG

AfiC

ATC

CCA

GGG

AM!

crc

AfiG

GOC

Θ3Τ

CTA

GGC

GOG

CTT

382

Asp

Leu

Met

Ser

Xie

Fro

Gly

Lpa

leu

Ala

Gly

Leu

Gly

Ala

leu

115

120

125

GGC

ATC

CGC

COG

OCT

oct

CCA

GGC

CGC

GM

GAG

ГСА

GTG

ras

GAG

TTC

430

Gly

Xie

AX?

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

val

Glu

Glu

Phe

130

135

140

GTG

CGC

CGC

AAC

arc

GGT

GCT

GAS

GTC

ГСТ

GMS

CGC

CTC

ATT

OCT

478

val

Arg

Ar?

A*n

Xeu

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

lie

GLU

Pro

145

150

155

TIC

TGC

TEA

GOT

GTC

TAT

GCT

GOT

GAT

OCT

TCT

AAG

CTC

AGO

ATG

AMS

526

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

туг

Ala

Gly

Aap

Pro

Ser

Lye

Leu

Ser

Met

tya

160

165

170

175

GCT

OCA

TTT

GGS

A№

GET

TCG

OGG

TIG

GM

GM

ACT

GGA

GOT

MOT

ACCT

574

Ala

Ala

Ph·

Gly

LyS

vai

Tip

Arg

Lau

Glu

Glu

Thr

Gly

Gly

Ser

lie

180

185

190

An-

GGT

GGA

ACC

ATC

AAG

ACA

ATT

CAG

GAG

MSG

AGC

AAG

AAT

CCA

AM

622

ile

Gly

Gly

Thr

Ils

Lys

Thr

Ila

Gin

Glu

Arg

Sex

Lye

Aan

Pro

Lya

195

200

205

CCA

COS

AGS

GAT

GCC

OGC

CTT

COG

AAG

OCA

AM

GGG

CM3

ACA

GTT

GCA

670

PlO

Pro

Arg

*₽

Ala

Arg

Leu

Pro

I*»

Pro

X#·

Gly

Gin

Thr

val

Ala

210

215

220

ICT

TIC

AGG

ме

GGT

CTT

GCC

ATG

CTT

CCA

MT

GOC

ATT

ACA

TOC

AGC

718

Ser

Phe

Axg

t#s

Gly

leu

Ala

Mac

Lau

Pip

Asn

Ala

lie

Thr

Ser

Ser

225

230

235

TIG

GOT

ACT

AM

GTC

AM

CTA

ГСА

TGG

AM

GIC

ACG

AGC

ATT

ACA

AM

766

Leu

Gly

Ser

Lye

Val

Lye

Leu

Set

Trp

1^8

leu

Thr

Sex

lie

Thr

Lye

240

245

250

255

TCA

GAT

<ac

MG

GGA

TAT

GIT

TTG

gag

TAT

GM

ЛС6

Ora

GM

GGG

GTT

814

Ser

ASp

Asp

Lys

Gly

Tyr

Val

leu

Glu

Tyr

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

val

260

265

270

t?rr

TCG

GTG

CAG

GCT

MA

AST

GTT

ATC

ATG

ACT

ATT

ora

tea

TAT

GTT

862

val

ser

Val

Gin

Ala

Lys

Ser

Val

He

Met

Thr

lie

Pro

Ser

Tyr

val

275

280

285

GCT AGO AAC ATT TTG CGT ОСА CIT TCA ADC GAT GCT GCA GW GCT CTA910

Ala Ser Aan lie Leu Arg Pro Leu Ser Ser Азр Ala Ala Asp AlaLeu

290 295300

TCA AGA TTC TAT TAT CCA COG CTT GCT GCT CTA ACT Git TOG TAT CCA950

Set Arg ₽he Tyr Tyr Fro ЕГО Vai Ala Ala Vai Thr Vai Ser TyrPro

305 310315

AAG GAA GCA ATT AGA AAA GAA TOC TTA ATT GAT GGG GAA CTC CAG GGC1006

Lys Glu Ala lie Arg Lys Glu Cys Leu lie Asp Gly G1U Lev GiftGly

320 325 330335 m GGC CAG TIG CAT CCA OCT ACT CAA GQA GTT GftG АСА TTA GSA ACA1054

Phe Gly Gin Leu His pro Arg Ser Gin Gly Vai Glu Thr Leu GlyThr

340 345350

ATA TAC ACT TCC TCA СТС ТГГ OCA AAT OCT GCT OCT GAC GCT ASG CTG1102

Ila Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro A»n Arg Ala Pro Asp Gly Arg Vai

355 360365

TTA СТЕ CTA AAC TAC ATA GGA GCT GCT АСА ЛМС ACA GGA ATT GIT TCC1150

Leu Lau Leu Aan Tyr He Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly lie Vai Sex

370 375300

AAG ACT GAA ACT GAS CTG CTC GAA GCA GTT GAC OCT GAC CTC CGA AAA1190

Lys Thr Glu Ser Glu leu vai Glu Ala Vai Asp Arg Asp Leu Arg Lys

365 390395

MG СГТ АГА ААГ TOT ACA GCA CTG GAC OCT TTA CTC CTT GGT GTT CGA1246

Mat Leu lie Asn Ser Thr Ala Vai Asp Pro Leu vei Leu Gly Vbl Arg «00 405 410415

GTT TGG CCA CAA GOO ATA OCT CAG TTC CTO CTA GGA CAT CTT GAT CTT1294

Vai Trp Pro Gin Ala lie Pro Gin Phe Leu Vai Gly Hie Leu Asp Leu

420 425430

CTG GAA GCC GCA AAA GCT GCC CTG GAC CGA GCT GGC TAG GAT GGG CTG1342 laiu Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Leu

435 440445

TTC CTA GGA GQG AAC TAT CTT GCA GGA GIT GDC CTG GGC AGA TGC GTT1390

Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Vai Ala Gly val Ala Leu Gly Arg Cys VA1

450 455460

GAG ИС GOG TAT GAA AST GCC TOG CAA ATA TCT GAC TTC TTG AQC AAG1430

Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin lie Ser Asp Phe Leu Thr Lys

465 470475

TAT GOC TAC AAG TOATGAAAGA ACTOGAGOGC ТАСГЕСТТАА TCGTTTATGT1490

Tyr Ala Tyr Lys

SO

TGCAtWSATG ADGTGCCTCC GGGGMAANk МОМИИ ВДЯТОТТ АТТСГМТТТ теладгюс Атттстеггс ттттстлг аютмпйБ ттммтпа опстоеюс

AGATTSTTCT GTTCACIGCC СТТСАААЮА АЛТТПЛТГГ ТТСЖГГСТТТ TATGMSAGCr

GTGCTACTTA ААЛАААААЛЛ АШММ

1550

1610

1CT0

1698 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQID NO: 6:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(А) ДЪЛЖИНА 463 амшю кисцшш (B) ТИП: амино киселина (C) ТОПОЛОГИЯ: линеармк (И) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пропеят (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Ю NO: 6:

АЗП

Ser

Ala

ASp

Cys

val

Val

val

Gly

Gly

Gly

Xie

Ser

Gly

Leu

Cys

1

5

10

15

Thr

Ma

Gin

Ma

Leu

Ala

Thr

Arg

Hi*

Gly

val

Gly

Asp

Val

leu

val

20

25

30

Thr

Glu

Ala

Arg

Ala

Arg

Pro

GJy

Gly

Aen

lie

Thr

Thr

val

Glu

Arg

35

40

45

Pro

Glu

Glu

Gly

Tyr

Leu

Tip

g:

. 4-

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

SO 55 60 sar Asp Pro Vai Leu №t Met Ala Vai Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp 65 70 7580

Leu Vai Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Vai leu Trp Glu Gly 85 9095

Lys Leu Arg Pro val Pro Ser Lys Pw Ala Asp Leu Pro Phe Phe Asp 100 105110

LHu Met Ser lie Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala leu Gly

115 120125

He

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

val

Glu

Glu

Phe

Val

130

135

140

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

?ne

Glu

Arg

Leu

He

Glu

Pro

Phe

145

150

155

160

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

165

170

175

Ma Phe Gly Ly$ Val Tvp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Sei lie He IM 185190

Gly Gly Till He Lys Thr He Gin Glu Arg Ser Lys Asn Pro 1до Pro . 195 200205

Pro Arg Asp Ala Arg Leu Pro Lya Pro Lys Gly Gift Thr Vhl Ala Ser 210 215220

Phe Arg Lya Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala He Thr Ser SerLeu

225 230 235240

Gly Ser Lys Val lys Letl Ser Trp LyS Leu Thr Ser lie Thr LysSer

245 250255

Asp Asp Lye Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Glu Gily Val Vhl 260 265270

Ser Val Gin Ala Lys Ser Val He Met Thr He Pro Ser Tyr Val Ala 275 280285

Sex Asn He Leu Az? Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Sex 290 295300

Ar? Phe тух Tyr pro Pro Val Ala Ala Val Th! val Ser Tyr Pro Lys

305 31D 315320

Glu

Ala

He

Ax?

bys

Glu

CyS

Leu

He

Asp

Gly

Glu

leu

Gin

Gly

Fha

325

330

335

Gly

Gin

Leu

HIS

Pro

Az?

Sex

Gin

Gly

val

Glu

Bur

leu

Gly

Thr

Xie

340

345

350

туг

Ser

Ser

Ser

leu

Pte

Fro

Asn

Az?

Ala

Pm

Aap

Gly

Ax?

val

Leu

355

360

365

Leu

leu

ASn

Tyr

He

Gly

Gly

Ala

Thr

A*n

Thr

Gly

Xie

val

Ser

Lys

370

375

380

Thr

Glu

Ser

Glu

leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

Ax?

Asp

leu

Arg

Lys

Met

3B5

390

395

400

Leu

He

Asn

Ser

Thr

Ala

Val

Asp

Pro

leu

val

Leu

Gly

val

Ar?

val

405

410

415

Tip

Pro

(Un

Ala

He

Pio

Gin

she

Leu

val

Gly

Hxs

Leu

Asp

Leu

Leu

420

425

430

Glu

Ala

Ala

lys

Ala

Ala

Leu

Asp

Arg

Gly

Gly

Tyr

Asp

Gly

Leu

Phe

435

44Q

445

Leu Gly Gly Asn Tyr Vai Ala Gly VW Al* Leu Gly Arg Cw VW Gin «0 <55 «0

Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Xie Ser Asn Phe Leu Thr Lys Tyr

465 <70 <75 480

Ala Τγτ lys (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 7:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 2061 цШи бази (B) ТИП: нуклеинов» киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: лшмрш (ц) МОЛЕКУЛЕН ТИП: <ДНК (ili) ХИПОТЕТИЧЯОСГ: не (к) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: ме (к) ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ИМЕ/ КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 64... 1698 (D) ДРУГАИНфОРМАЦИЯ: / забележка- “Царевична протокс- 2 сДНК: nocsegofiamcABOcxa от pWDC* 3“ (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ И> N0:7:

СЮТОСТЛСС ТССАССТССЛ CGKCMCMG CWZCC0CA ТООЧИТОСЛ АЛСССТААСТ £0

I

CAA ATG СТС OCT TIG ACT GOC TCA GCC TCA TCC GQT TOG TOC CAT CCTIQS

Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser HisPro ¹ 5 1015

TAT CGC CAC GCC TCC GCC CAC ACT CCT OGC CCC СОС CTA CCT GCG GlC156

Tyr Arg Kis Ala Sex Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Axg al*val

2530

CTC GOG ATG GOG GGC ГСС GAC GAC CCC CGT GCA GOG OCC QCC AGA TOG204

Leu Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala AtqSer

4045

GTC GCC GTC GTC GGC GCC GGG GTC AGC GGG CTC GDG GOG [3Q5 _тдс ьгу:252

Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val SCr Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg

55 ¢0

сте

AGA

C«

AGC

GGC

Gig

AAC

GTA

ACG

GIG

TTC

GAM

GOG

GCC

GHC

AGG

300

Leu

Arg

Girt

sex

Gly

val

Азп

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Ala

Asp

Arg

65

70

75

GCG

GGA

GGA

AAG

ATA

OGG

ACC

MT

TOC

GAG

GGC

GGG

TIT

GXC

TGG

GAT

348

Ма

Gly

Gly

Lys

He

Arg

The

Asn

Ser

Glu

Gly

Gly

Phe

val

Trp

Asp

80

85

90

95

GAA

GGA

GOT

AAC

ACC

ATG

ACA

GAA

GOT

GM

TGG

GAG

GX

ACT

ASA

CTG

395

Glu

Gly

Ala

Asn

rhr

MM

Thr

Glu

Gly

Glu

Tip

Glu

Ma

Ser

Arg

Leu

100

105

110

АТГ

GAT

GKT

CTT

GGT

CTA

CM

GAC

AM

CAS

CAG

TAT

OCT

AAC

TCC

CM

444

lie

ASp

MP

leu

Gly

Leu

Gia

MP

lye

Gin

Gin

tyr

Pre

Asn

Ser

Gin

115

120

125

CAC

AMS

COT

TAC

ATT

GTC

AM

GAT

GSA

GCA

CCA

GCA

CIG

MT

CCT

TOG

492

His

LyS

Arg

тук

Xie

val

ItfS

Asp

Gly

Ala

Pro

Ala

LOU

He

PxO

Ser

130

135

140

GAT

CCC

AIT

TOG

CEA

ATG

AM

AGC

AST

OTT

CTT

TOG

ACA

MA

TCA

AAG

S40

A»p

Pro

He

Sax

Lau

Mec

lys

Ser

Ser

val

Leu

Ser

Thr

Lye

Sex

Lya

145

L5C

155

ЛТГ

GOG

TEA

TIT

TTT

GAA

CCA

TTT

CTC

TAC

AMS

AM

GCT

AAC

КЛ

AGA

588

He

Ala

Leu

Phe

She

Glu

Pro

Phe

Leu

Tyr

lys

lys

Ala

Mn

Thx

Aro

160

165

170

175

MC

TCT

GGA

AAA

GIG

ICT

GMS

GAG

CAC

TTG

AST

GAG

AGT

GTT

GGG

AGC

636

Asn

Ser

Gly

lya

val

Ser

Glu

Glu

Hie

Luu

Ser

Glu

Ser

vai

Gly

Ser

180

185

190

TTC

TOT

GM

OGC

слс

TTT

GSA

AGA

GAA

GTT

GTT

GAC

TAT

TTT

GTT

GW

664

Phe

Cys

G1U

Arg

H1S

Phe

Gly

Mg

Glu

Val

Val

Mp

Phe

vei

Asp

195

200

205

CCA

TTT

GTA

OCT

GGA

ACA

ACT

GO

GGA

GAT

CCA

GAG

TCA

cm

TCT

ATT

732

Pro

Phe

val

Ala

Gly

Thr

Sex

Ala

Gly

*4»

Pro

Glu

Ser

L8U

sar

He

210

215

220

GGT

CAT

GCA

TTC

CCA

GCA

TTG

TGG

AAT

TTG

GM

AGA

AAG

TAT

GGT

TCA

780

Arg

His

Ala

Phe

Pro

Ala

Leu

Trp

Aen

Leu

Glu

Arg

Lys

Tyr

Gly

Ser

223

230

235

GTT

ATT

GTT

GGT

GOC

ATC

TTG

TCT

AAG

CTA

GCA

GCT

AAA

GOT

GAT

OCA

828

Val

He

val

Gly

Ala

lie

Leu

Ser

Lys

Leu

Ala

Ala

iys

Gly

Asp

Pro

240

245

250

255

GTA

AAG

ACA

ACA

CAT

GAT

TCA

TCA

GGG

AAA

MSA

AGS

AAT

AGA

OGA

GIG

876

Val

Liya

Thr

Arg

His

Asp

Ser

Ser

Gly

LyS

Arg

Arg

Asn

Arg

Arg

val

260

265

270

TOG TTT ТСЛ TIT CAT GGT QGA An; ОС TCA СТЛ МА АЛТ GO CTT САС921

Ser Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gin sex Leu He Jurn Ala Leu His

275 280285

AAT QAA GTT GCA GAT GAT AM GIG AAG Ο'Γ GGT AGA GAA GTG TTG TCA972

Asn Glu V&1 Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val LeuSer

290 296300

TTG GCA TGT AO TTT GM GGA OTT OCT GCA CTA GGC ASG TOG TCA ΑΓΓ1020

Leu Ala Cya Thr Phe Asp Gly Pro Ala Leu Gly Arg Trp Serlie

305 310315

ICT GIT GAT TOG AAG GAT AGC GOT GAC AAG GAC CTT GOT AGT AAC СЛА1068 ser Val Asp Ser Цге Asp Ser Gly Asp Lys Asp leu Ala Sex AsnGin

320 325 330335

ACC TTT GAT GCT GTT MA MG ACA GET CCA TTG TOL AAT CTC CGG AQG1116

Thr Pte Asp Ala Val He Met Thr Ala Pro lasu Ser Asn Val ArgArg

340 345350

ATG AMS TTC ADC AAA GGT GGA GCT COG GTT GTT CTT GAC ™ CTT OCT1164

Met Lys ₽h« 5br Lys Gly Gly Ala Pro Val val Lev Asp Pte LeuPro

355 360365

AAG MG GM TM CTA ΟΆ CIA TCI CTC MG GXG ACT GCT TTO AAG JU»G1212

Lys Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lyslys

370 375380

GAT GM GTC AAG AAA OCT CTG GAA GGA TTT GGG GTC TXft ATA OCT TAG12&J

ASp Asp vai Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Vttl LBQ Xie ProTyr

385 390395

ARG <9A GAG CAA AAA CAT GOT OTG AAA ACC СГГ GGG ACT СТС ГГТ TOC1308

Lya Glu Gia Gia Lys His Gly Leu tys Thr Lau Gly Thr leu PheSer

400 405 410415

TCA ATG MG TIC ОСА (Й£Г OGA OCT OCT GAT G£ CAA TKT TIA TM ACA1356

Ser Met Met phe Pro Asp Arg Ala Fro Asp Asp Gin Tyr leu TyrThr

42Q 425430

ACA TTT GTT GGG GGT fiGC CAC AAT AGA GAT CTT GCT GGA GCT OCA ACG1404

Thr Phe Val Gly Gly Ser His Aan Arg Asp Leu Ala Gly Ala ProThr

435 440445

TCT ATT CTG AAA CAA CTT GIG ЛОС TCI GAC CTT AAA AAA CTC TTG GGC1452

Ser He Leu Lys Gin Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu LeuGly

450 455460

OTA GAG GGG CAA CCA ACT TTT GTC AAG CAT GTA ТЛС TGG QGA AAT GCT1500 val Gly Gly Gin Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly А5ПAla

465 470475

1548

545

Lys Met

Glu

Lys

АЗП

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe

Tyr

Ala Gly

Asn

Ser

Lyu

500

•

505

510

GAT GGG

CTT

GCT

GTT

GCA

ЛОТ

GTT

ATA

GCT

TCA

AGC

AAG

GCT

GCT

Asp Gly

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Val

He

Ala

Sex

Gly Ser

LyS

AL&

Ma

515

520

S2S

GAC art

GCA ATC

TCA

TAT

CTT

G*A tct

CAC

ACC

AAG CAT

AAT

AAT

TCA

Asp Leu

Ala

He

Sec

Tyr

LtU

Glu sar

His

Thr

Lya His Asn

Agn

ser

1596

1644

1692

1745

CATCTACAGT ftSAAAOCGAT GCGTTGCWGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA 1805

ЛСССГЮТГГ GMCATOCAC CAGAMQGTA GTCACATGTG TMGTGSSAA AATGAfiGTTA1865

AAAACEATTA TCGOGGCCGA AATGHCCTT TTTCTTTTCC 1VACAAGTGG CCWCGKAC1925

TTGAlGTTGG AAATATATTT AAATTTCTTG AMTGTTTGA GAACACATGC GTGAO7№IA19B5

ATATTTGCCT ATiyJWm TAGCW?afft CTTGGCCAGA TTAIGCTTTA ΟΟΟΟΙΤΓΑΑΑ2045

МММАМЛ MAMA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NQ 8:

2061

0)

ЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (А)ДЪЛЖИНА:544 аминокиселини (В) ТИП: шино киселина (Q ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: протеин (χί) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ П> NO 8:

Mee

Leu

Ala

Leu

Thr

Ala

Ser

Ala

Ser

Sex

Ala

Ser

Ser

His

Pro

Tyr

1

5

10

15

Arg

His

Ala

Ser

Ala

His

Thr

Arg

Arg

Pro

Arg

Leu

Arg

Ala

val

Leu

20

25

30

Ala

нес

Ala

Gly

Ser

Asp

Asp

Pro

Arg

Ala

Ala

₽io

Ala

Arg

50r

Val

35

4(J

45

Ala val Val Gly Ala Gly Val

SO55

Arg Gin Sex Gly Val asn Val 6570

Gly	Gly	Lya	He	Arg	Thr	Asn
				85
Gly	Ala	ASA	Thr	Het	Thr	Glu
			100
Ляр	Asp	Leu	Gly	Iau	Gin	Asp
		115
lye	Arg	Tyr	lie	val	Lys	Asp
	130					135
Pro	He	Ser	Leu	Met	iys	Ser
145					150
Ala	Mu	Phe	Phe	Glu	Pro	Phe
				165
Ser	Gly	lys	Val	Ser	Glu	Glu
		180
Cys	Glu	Arg 195	His	Phe	Gly	Arg
Phe	val	Ala	Gly	Thr	Ser	Ala
	210				215
His	Ala	Eha	Pro	Ala	Leu	Tip
225					230
He	Val	Gly	Ala	Xie	Leu	Sex
				245
LyS	Thr	Arg	His	Asp	Ser	Ser

260

Phe Ser Phe His Gly Gly №t 27S

Glu Val Gly Хор Aap Asn val

290295

Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val

30531Q

Gly leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu val Eh* Glu Ala Ala Aq> Arg Ala

7560

Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu 90 ,95

Glu	Tip	Glu	Ala	Ser	Axg	Leu	He
105					110
Gin	flirt	Tyr	Pro	Asn	ser	GLn	Hie
			125
Ala	Pro	Ala	Lta	He	P»O	Ser	Asp
			140
val	Leu	ser	Thr	Lys	Ser	lys	He
		155					160
Tyr	LyB	lys	Ala	Asn	Thr	Arg	Asn
	170					175
Leu	Ser	Glu	Ser	val	Gly	ser	Phe
185					190
val	Val	Asp	Tyr	Phe	Val	Asp	Pro
				205
M*	EXO	Glu	Ser	Leu	Ser	lie	Arg
			220
leu	Gin	Arg	lye	Tyr	Gly	Ser	Val
		235					240
Leu	Ala	Ala	Lys	Gly	Asp	Pro	val
	250					255
lys	Arg	Arg	ASS-	Arg	Arg	Val	Ser
265					270
Ser	Leu	lie	AM	Ala	Leu	His	Asn
				285
Leo	Gly	Thr	Glu	Val	Leu	Ser	Leu
			300
Ala	Leu	Gly	Arg	Trp	Sex	He	Ser
		315					320

Val

Asp

Ser

tys

AS₽

Ser

Gly

Asp

[ys

Asp

Uu

Ala

Ser

Asn

Gin

Thr

325

330

335

Phe

Asp

Ala

val

Tie

Met

Thr

Ala

pro

Leu

Set-

ASS

Val

Arg

Arg

Met

340

345

350

Lys

Phe

Thr

lys

Gly

Gly

Ala

Pro

Val

Val

Leu.

Asp

Ebe

Leu

Pro

I#s

355

3«

3S5

Asp

Tyr

leu

Ped

Leu

Ser

leu

Mat

Vai

Thr

Ala

phe

Lys

Lys

Asp

370

375

380

Asp

Val

Lys

lys

FeO

leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

lie

Pro

туг

Lys

365

390

395

400

Glu

Gin

Gin

LyS

H1S

Gly

Leu

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

405

410

415

Met

Mat

Phe

Ped

Asp

Arg

Ala

Pro

M>

Asp

Gin

Tyr

Leu

ТУг

Thr

Thr

420

425

430

Phe

Val

Gly

Gly

Ser

His

Asn

Arg

ASp

Leu

Ala

Gly

AU

Pro

Thr

Ser

435

440

-

445

xle

Lau

lys

Gin

Leu

val

Thr

Ser

Leu

LyS

lys

Leu

leu

Gly

val

450

455

460

•Jly

Gin

Ped

Thr

vhe

Val

Lys

His

val

'x .

-iy

Asn

Ala

Phe

465

470

475

480

Pro

leu

Tyr

Gly

Hi »

Asp

Tyr

sar

Ser

val

Leu

Glu

Ala

lie

Glu

Lys

485

490

495

Met

Glu

Ly«

Αβη

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

Ser

X#S

ASp

500

505

510

Gly

Lea

Ala

Val

Gly

Ser

val

lie

AU

Ser

Gly

Ser

Igp

AU

Ala

ASP

515

520

525

Uu

Ala

He

Ser

Leu

Glu

Ser

HU

Thr

Lys

Hijt

Asn

Ann

Ser

EiS

530

535

540

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 9:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 1697 двойки бази (B) ТИП: нуклешюва киселина (€) ВЕРИХНОСГ: едшВерижма

Р) ТОПОЛОГИЯ: лшаф*

ОД МОЛЕКУЛЕН ТИП: <ДНК (Ш) ХИПОТЕТИЧНОСП ис (к) ВЕЗСМИСЛЕНОСТ не (к) ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ИМЕ/ КЛИН: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 29... 1501 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: / забележкв=* gpookgefi* протокс- 3 сДНК; йоследобатедносш. cmpWDC- 5* (») СПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ П>9:

TTGQCATTTG ССТТСйЛОСА АОШПСТ ATG TCA ATI GCA MT TCT GGA GGA52

Met Ser lie Ala He Cys Gly Gly

GGT

ATA

GCT

GST

СП

ACT

ЛСА

GCA

TTT

ТЛТ

CTT

GCT

AGA

TTG

ATT

CCA

100

Gly

lie

Ala

Gly

Leu

Ser

Thr

Ala

Phe

Tyr

Leu

Ala

Arg

Leu

lie

Pro

10

15

20

AAA

TCT

ACT

ATT

GAT

TTG

TAC

GAA

ΑΤΆ

CTT?

CCT

GGT

TTA

GGT

GGA

TCG

148

Lys

Cys

Thr

lie

ASP

Leu

Tyr

Glu

Ly.·,

V.y

Pro

Arg

Leu

Gly

61y

Tip

25

30

35

40

CTT

CAG

TCG

GTC

AAa

ATC

COG

TGT

GCA

GAT

TCT

OCA

ACA-

oa

ACG

GTT

19«

Leu

Gin

Ser

val

ifrS

lie

Pro

Cys

Ala

Asp

Ser

Pro

Thr

Gly

Ttir

Vhl

45

50

55

TTG

TTT

GAG

CAA

GGT

OCT

AGA

ACT

err

OCT

CCT

GCT

GGG

CTT

GCT

GGC

244

Leu

She

Glu

Gin

Gly

Pro

Arg

Thr

Leu

Arg

Pro

Ala

Gly

vu

Ala

Gly

¢0

¢5

70

TTA

GCA

AAC

тта

GAT

TTA

ATT

AGC

АВД

TIG

GGC

ATC

GAA

GAC

AM>

TTG

292

Leu

Ala

ASH

Leu

ASp

Leu

He

Ser

Lys

Leu

Gly

He

Glu

Asp

lys

Leu

75

80

85

TTA

AGG

ATT

TOG

AGC

AAT

TCT

OOC

AGC

GCA

AAA

AAC

CGA

TAT

MT

TAT

340

Leu

Arg

lie

Ser

Ser

Asn

Ser

Fro

Ser

Ala

Lys

Asn

Arg

Tyr

lie

Tyr

90

95

100

TAC

CCA

GAT

CGC

TTA

AM

GAA

ATT

oct

TCA

AGC

ATT

TTA

GGG

ACT

ATA

380

Tyr

Fro

Дф

Aug

Leu

Asn

Glu

lie

Pro

Ser

Ser

lie

Leu

Gly

Ser

lie

105

110

115

120

AAG

TCG

ATT

ATG

CAG

CCT

GCT

TTC

CCT

COG

ATC

OCT

TTG

GCT

ATG

ATC

436

Lys

Sex

He

Met

Gin

Pro

Ala

Leu

Arg

Pro

Net

Pro

Leu

Ala

Met

Met

12$ 130135 стг gag сос m сит мл юг mg cga Gat tcg aca gm gm мас gtg484

Leu Glu Pro the Arq Lys Ser Lys Arg Asp Ser Thr A»p Glu Ser Val

140 145150

GGT TCA TTT ATG ASA AGA ASA TTT &OT AAA AAC GTT ACS GAT MSA GTT532

Gly Ser the Met Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val

155 160165

ATG

AST

GCA

ATO

ATA

AAT

GGT

ATT

TAT

OCT

GST

GAT

TTG

AAT

GAT

TTG

580

Net

Ser

Ala

Mat

He

Asn

Gly

lie

Tyr

Ala

Gly

MP

Leu

Asn

A3₽

Leu

170

175

180

TCT

ATG

CAT

TCT

AGC

ATG

TTT

GGA

TTT

TTA

GCG

AAG

ATT

GM

AAA

AAG

528

Ser

Met

HAS

Ser

ser

Met

Phe

Gly

Phe

Leu

Ala

Lye

Ila

Glu

Lys

Ι«β

185

190

195

200

TAT

GGA

AAC

ATT

ACT

TTG

GGA

TTA

KIT

ASA

GCT

СП

CTT

GCA

OST

GAA

676

Tyr

Gly

ASH

lie

Thr

leu

Gly

Leu

Ila

Arg

Ala

Leu

Lau

Ala

Arg

Glu

205

210

213

АТЯ

TTA

TCT

OCT

GCT

as

AAA

GCT

TIG

GAA

AGC

AGC

ACT

ACT

CGC

AGA

724

lie

Leu

Ser

Pro

Ala

Glu

tya

Ala

leu

Glu

Ser

Sec

Thr

Thr

Arg

Arg

220

225

230

GCC

AAA

AAC

AGC

AQA

GCT

GTC

AM

OS

TAT

GAA

ATC

GAC

AMS

tat

OTT

1Ί2

Ala

iy*

Asn

Ser

Arg

Ala

val

lys

Gin

Tyr

Glu

He

ASp

Lye

туг

VUl

235

240

245

GCT

TTC

AAG

GM

GGG

ATT

GAG

ACT

АДТ

ACA

TIG

TCA

ATA

GCA

GAT

GM

820

Ala

the

Lys

Glu

Gly

Ila

Glu

Thr

II*

Thr

Leu

Ser

lie

Ale

Mp

G1U

250

255

260

TTA

AAA

AAA

ATG

OCG

AM

GTC

AAfi

ATA

CAT

ca

AAC

AM

COB

GCC

CM

868

lau

Iff·

Lys

Met

Pro

Am

iy«

He

His

leu

Asn

tye

Pro

Ala

GLn

265

270

27S

280

ACT

TTG

OTT

CCA

CAT

AM

ACT

CM3

TCT

CTT

GTA

GAC

GTC

AAT

GGT

CM

916

Thr

Leu

Vai

Pro

His

1УЗ

Thr

Gin

ser

Lau

vai

Mp

Val

Asn

Gly

Gin

285

290

295

GCT

TAC

GAG

TAT

GTT

GTG

TTT

GCA

AAC

TCT

TCT

osc

MT

TTA

GAG

AAT

964

Ala

Tyr

Glu

туг

val

Val

Phe

Ala

Asn

Ser

Ser

Arg

Asn

Leu

Glu

АДП

300

305

310

CTA

ATA

TCT

TOT

CCT

AM

ATG

GAA

ACT

OCG

ACG

TCG

AGT

GTT

TAT

GlC

1012

Leu

Ila

Ser

Cys

Pro

lys

Met

G1U

Thr

Pro

Thr

Ser

Ser

val

Tyr

Val

315

320

325

GTC

AAC

GTT

TAT

TAT

AAG

GAC

CCT

AAT

GTT

Ctt

OCA

ATC

OGT

GGT

TET

1060

val

Asn

vai

Tyr

Tyr

Lys

Asp

Pro

Asn

Vai

Lev

Pro

He

Arg

Gly

Phe

330 335340

QQG СТТ TIG MT CCA 1СЛ TGC ACT CCA MT MT COG MT CAT GTT СТГ1108

Gly Leu Leti lie Sic Cy? Thr Pro Asn Asn Pre Asn Kie Vat ]«et>

345 350 355360

GST ATC GTT TTT GAT ACT GAG CM AAC АЙС OCT GM MT GGA AX AAG1156

Gly lie val Phe Asp Ser Glu Gin Asn Asn fro Glu Asn Gly Ser Lys

365 370·375

OTC ACT GTC ATG MG GGA GGG TCT GCT TAT A£A AAA AAT ACT TCT TTG1204

Vai Thr Vai Het Met Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu

380 385390

ATT OCA ACC AAC CCC GAA GM GCC GlT. AAC MT GCT CTC MA GCT TTG1252 lie Fro Ihr Asn Pro Glu Glu Ala Vai Asn Asn Ala Leu Lye Ala Leu

395 400405

CAO CAT ACT TTA AAA ATA TCC AST AM» OCA ACA CTC ACS AAT GCA ACA1300

Gin His Thr Leu Lys lie Ser Sex lys Pro Thr Xeu Thr Asn AlaThr

410 415420

TTA CM OCA AAT TGC ATC OCT CAA TAT CGI GTT GGG CAT CM GAT AAT1348

Leu Gin Pro Asn Cys lie ^Pro Gin Tyr Arg Vai Gly His Gin AspAsn

425 43D 435440

СГТ АЛТ TCT TIG AAA TCT TGG ATT GAG AAA MT ATG GGA С-Г-С, CGA ATT139 6

Leu As·· C-cr Leu Lya Ser Trp i ie Glu Lys Asn Met Gly Gja Arglie

445 450' 455

CTT CIA ACT GSA ACT TGG TAT AAT GST GIT ACT АЯТ GGG GAT TGT ATI1444

Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Ann Gly Vai Ser tie Gly Aap CysXia

460 465470

MS AAT GSA CAT TCA ACA GCT CGA AM CTA GCA TCA TTG ATG MT TCT1492

Mat A«n Gly His Ser Thr Ala Arg Lys Leu Ala Ser Leu Mat amSer

475 480485

TCT TCT TGAGOGTta TAAATGHGA TMAMATTA GTATATAQXT CCTTTGMTA1548

Ser Sec

490

TTTTATGAGT TGAAAATGCO ACTTG1GAM TMT7TTGCA CMQOOCTTT TAiraCAGAC 1608

GTATATQCGA GGACATTCGA CAAACCTTTG ΜΑΤΤΑΛΑΜ TCATATGOCT TTTAGCITM 1665

GACATCAAGG TCATQMTM ΤΑΛΑΑΤΤΤΤ 1697 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: lib (i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 490«ммно Иаоемли (B) 1МП: «аш&кммшм (D) ТОПОЛОГИЯ: мтмряв (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: црммш <м) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Ю NO: 10:

Met

Ser

He Ala

lie Cys

Gly

Gly

Gly

He

Ala

Gly

leu

Ser

Thr

Ala

1

5

10

15

Phe

Tyr

leu Ala

Axg Leu

He

Pie

Lys

Cis

Thi

lie

*4»

Тяп

Tyr

Glu

20

25

30

LyS

Gly

Pro Arg

Leu Gly

Gly

Txp

£eu

Gin

Ser

Val

Lys

Ho

Pro

cys

35

40

45

Ala

Asp

Ser Pro

Thr Gly

Thr

val

Lbu

Phe

G1U

Gin

Gly

Pro

Aug

Thr

50

55

60

Leu

Arg

Pro Ala

Gly Val

Ala

Gly

Leu

Ala

Asn

Leu

M>

loti

He

Ser

65

70

75

80

Lys

lev

Gly lie

Glu Asp

Lys

leu

Leu

Arg

He

Ser

Ser

Asn

Ser

Pro

95

90

95

Ser

Ala

Lys Asn

Arg Tyr

rie

*r·..· 1 · .

τ-.·

* yr J

Arg

leu

Man

Glu

lie

100

JVu

110

Fra

Ser

Ser He

leu Gly

Ser

He

Lye

Ser

He

Nat

Gin

Pro

Ala

Leu

115

120

125

Axg

Pro

Met Pro

Leu Ala

Met

Met

leu

Glu

Pro

Pbe

Axg

lye

Ser

lys

130

135

140

Arg

Asp

s«r Thr

Asp Glu

Sax

val

Gly

Ser

Phe

Net

Acg

Axg

Axg

phe

145

150

155

160

Gly

lys

Asn Val

Thr Aqp

Arg

Val

Het

Ser

Ala

»tet

lit

Asn

Gly

He

165

170

175

Tyr

Ala

Gly Asp

Leu A»n

ASp

leu

Ser

Met

His

Ser

Ser

Net

Phe

Gly

ISO

165

190

Phe

Leu

Ala Lys

He Glu

tys

Lys

Tyr

Gly

ASn

Tie

Thr

leu

Gly

Leu

195

200

205

lie

Arg

Ala Leu

Leu Ala

Arg

Glu

He

Leu

Ser

Pro

Ala

Glu

Lys

ALa

210

215

220

Leu

Glu

Ser Ser

Thr Tht

Arg

Arg

Ala

Lye

A$n

Ser

Arg

Ala

vai

Lys

225

230

235

240

151.Г1	TYi	Glu He	Asp Lys 245	Tyr val Ala	Phe LyS Glp Gly 250	He Glu 255	Thr
Не	Thr	Leu Ser	He Ala	Asp GLv Leu	Lys lys Met Pro	Asn Val	Lys
		260		265		270
J Je	ILL·	Leu Asn	Lys Pro	А1Д Gin Thr	Leu val Pro His	xys Thr	Gin
		275		28Q	285
Ser	Leu	Val Αφ	val Asn	Gly Gin Ala	туг Glu туг Val	val Phe	Ala
	290			295	300
Asn	Ser	Ser Arg	Asn leu	Gltl ASn leu	Xie Ser Cys Pro	Lys Met	Glu
305			310	-	315		320
Thr	Pro	Thr Ser	Ser Val	Tyr Val val	Asn Val Tyr Tyr	Lys Asp Psp
			325		330	335
Asn	Val	Leu Pru	He Arg Gly Phe Gly	Leu Leu lie Pro Sex Cys Thr
		340		345		350
Pro	Asn	Asn Pro	Asn His	VM1 lau Gly	He Val Phe Asp Ser Glu Gin
		355		3«	365
Asn	Asn	Pro Glu	Asn Gly	Ser Lys Val	Thr val Mat Met.	Gly. Gly	S*r
	370			375	3BD
Ala	Tyr Thr Ly-S	Asn Ώιγ	Ser Leu He	Pro Thr Asn' Pro	Glu d-U	Ala
385			390		395		400
Val	Asn Asn Ala	Xeu Lys	Ala len Gin	His Thr Lyj	lie Ser	Ser
			405		410	415
Lys	Pep	Thr Leu	Thr Asn	Ala Thr Leu	Gift Pm Asn Cys	He Pro	Gin
		420		425		430
Tyr Arg	Val Gly	His Gin	Asp Asn leu	Asn Sac Leu Lys	Ser Trp	He
		435		440	445
Glu	lys	Asn Met	Gly Gly	Arg lie Leu	Leu The Gly Ser	Τηρ туг	Asn
	450			455	460
Gly	Val	Ser lie	Gly Asp	Cys He Met	Asn Gly His Ser Thr Ala	Arg
465			470		475		480
lys	Leu	Ala s«r	Leu Met	Asn Sec Ser	Ser
			48S		490

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NO; 11:

(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 41 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D} ТОПОЛОГИЯ: лимеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друса нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: олигоиуклеошид, използван за ковюпруираие на PCGN1761ENX (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ; не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (Jd) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Щ NO 11 AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG Т (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 12 (i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА; 40 двойки бази (B) ТИП; нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП; друса нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: олиаонуклеотид, използван за конструиране на

PCGN1761ENX (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: ме (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 12:

AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 13:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 31 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (Н) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: нраймер SONOOQ3 , използван за конструиране на pSOGlO (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: НЕ (й) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ Ю NO 13: CTCGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 14:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 31 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: нраймер SONOOD4 използвам за конструиране на pSOGlO (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (Й) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 14:

ACOGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATOGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NO: 15 :

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 26 двойки вози (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ, едвоверижна' (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SONOD31 използвам за конструиране на pSOG19 (iii) ХИПОТЕТИ.ЧНОСТ: ж (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:15:

CATGAGOGACTGACCACCCGCCGATC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА : SEQ П> NO: 16:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SONOOIO, използван за конструиране на pSOG19 (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (Xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Ю NO: 16:

AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 17:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SON0016, използван за конструиране на pSOG19 (iii) ХИПСУГЕГИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO. 17: GCTACCATGGCCACATAGAACACC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO; 18:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SON0017, използван за конструиране на PSOG19 (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (х!) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 18:

CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 19:

(ί) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 28 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: сдиоверижна' (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: ираймер SONOG39, използван за коструираве на pSOG30 (Hi} ХИПОТВТИЧНОСТ: не (ή) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (я) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ Ш N0:19: CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NO: 20:

(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едисверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друеа амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: ираймер SON0041, използван за коиспауиряме на pSOGJO (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ; не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (я) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 20:

ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC

Claims (13)

1. Патентни претенции

   1. Изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидаза, включваща аминокиселинна секвенция, избрана от групата, 5 съставена от SEQ ID No. 2, 4, 6, 8 и 10.
2. 2. Изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидаза, притежаваща секвенция, означена в SEQ ID No. 2, с изключение на това, че:

   а. аланинът в аминокиселина 220 е заместен с аминокиселина, избрана от групата, съставена от валин, треонин, левцин и цистеин; и/или

   б. глицинът в аминокиселина 221 е заместен със серии; и/или

   в. тирозинът в аминокиселина 426 е заместен с аминокиселина, избрана от групата, съставена от цистеин, изолевцин, левцин, валин и треонин.
3. 3. Изолирана ДНК молекула съгласно претенция 2, където аланинът в аминокиселина 220 от SEQ ID No. 2 е заместен с валин.
4. 4. Изолирана ДНК молекула съгласно претенция 2, където тирозинът в аминокиселина 426 от SEQ ID No. 2 е заместен с цистеин.
5. 5. Изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидаза, притежаваща секвенция, означена в SEQ ID No. 6, с изключение на това, че:

   а. аланинът в аминокиселина 166 от SEQ ID No. 6 е заместен с валин; и/или
6. 6. глицинът в аминокиселина 167 от SEQ ID No. 6 е заместен със серин; и/или

   в. тирозинът в аминокиселина 372 от SEQ ID No. 6 е заместен с цистеин.

   б. Експресионна касета, включваща промотор, свързан по оперативен път с изолираната ДНК молекула, съгласно която и да е претенция от 1 до 5.
7. 7. Рекомбинантен вектор, включващ експресионната касета, съгласно претенция 6.
8. 8. Клетка гостоприемник, трасформирана стабилно чрез използване на вектор, съгласно претенция 7, където споменатата клетка гостоприемник е способна да експресира споменатата ДНК молекула.
9. 9. Растителна клетка, включваща ДНК молекула от която и да е претенция от 1 до 5, където споменатата ДНК молекула се експресира в споменатата растителна клетка и дава възможност на споменатата растителна клетка да бъде толерантна към хербицид, в количества, които инхибират естествено срещаната се protox активност.
10. 10. Растение, включващо растителната клетка съгласно претенция 9.
11. 11. Метод за осигуряване на растение, което е толерантно към протопорфириноген оксидаза, инхибираща хербицидите, характеризиращ се с това, че включва:

    а. осигуряване на експресионна касета, включваща растителен опериращ промотор, свързан по оперативен път с ДНК секвенция, кодираща протопорфириноген оксидаза;

    б. трансформиране на растителен материал със споменатата експресионна касета; и

    в. регенериране на растение от споменатия растителен материал.
12. 12. Метод за контролиране на растежа на нежелано покълване, характеризиращ се с това, че включва прилагане към популацията от растения съгласно претенция 10 или на полученото чрез метода растение съгласно претенция 11, и на получените при нежелано покълване растения на ефективно количество от протопорфириноген оксидаза, инхибираща хербицида.
13. 13. Използване на ДНК секвенция, кодираща протопорфириноген оксидаза, за осигуряване на растения, които са толерантни към протопорфириноген оксидаза, инхибираща хербицидите.