DE69534247T2

DE69534247T2 - Manipulation der protoporphyrinogen oxidase enzyme-aktivität in eukaryotische organismen

Info

Publication number: DE69534247T2
Application number: DE69534247T
Authority: DE
Inventors: Eric Russell Ward; Sandra Volrath
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: SK161096A3; PL183091B1; MX9606459A; US5767373A; DE69534247D1; HUT76353A; CN1263856C; CZ296023B6; AU5010199A; SK284895B6; RU2266332C2; RU2192468C2; RO120003B1; AU750445B2; PT769059E; EP0769059B1; CN1150820A; JP3673925B2; CN1193096C; PL317759A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Manipulation der enzymatischen Aktivität, die für die Umwandlung von Protoporphyrinogen IX in Protoporphyrin IX in einem Biosyntheseweg verantwortlich ist, der allen eukaryotischen Organismen gemeinsam ist. Nach einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Entwicklung von Herbizidresistenz in Pflanzen, Pflanzengeweben und Samen. Nach einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Entwicklung von Diagnostika und Behandlungen von Defizienzien bei dieser enzymatischen Aktivität von Tieren, insbesondere Menschen.
Die Biosynthesewege, die zur Produktion von Chlorophyll und Häm führen, teilen eine Reihe von gemeinsamen Schritten. Chlorophyll ist ein Licht aufnehmendes Pigment, das in allen grünen photosynthetisierenden Organismen vorhanden ist. Häm ist ein Cofaktor von Hämoglobin, Cytochromen, Oxygenasen P450 mit gemischter Funktion, Peroxidasen und Katalasen (siehe z.B. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York (1975)) und ist daher eine notwendige Komponente für alle aeroben Organismen.
Der letzte gemeinsame Schritt bei der Chlorophyll- und Hämbiosynthese ist die Oxidation von Protoporphyrinogen IX zu Protoporphyrin IX. Protoporphyrinogen-Oxidase (hierin als "Protox" bezeichnet) ist das Enzym, das diesen letzten Oxidationsschritt katalysiert (Matringe et al., Biochem. J. 260: 231 (1989)).
Das Protox-Enzym wurde entweder teilweise oder vollständig aus einer Reihe von Organismen gereinigt; diese umfassen die Hefe Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois und Labbe, in Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, Herausg. McGraw Hill: New York, S. 235–285 (1990)), Gersteetioplasten (Jacobs und Jacobs, Biochem. J. 244: 219 (1987)) und Mausleber (Dailey und Karr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Gene, die Protox codieren, wurden aus zwei prokaryotischen Organismen isoliert, Escherichia coli (Sasarman et al., Can J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) und Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem., 269: 813 (1994)). Diese Gene teilen keine Sequenzähnlichkeit, noch teilen ihre vorausgesagten Proteinprodukte eine Aminosäuresequenzidentität. Das E. coli-Protein hat etwa 23 kDa und steht mit der Zellmembran in Verbindung. Das B. subtilis-Protein hat 51 kDa und ist eine lösliche, zytoplasmische Aktivität.
Derzeit ist zu wenig über das Protox-Enzym bekannt, um eine Isolierung von für Protox codierenden Genen aus höheren eukaryotischen Organismen (z.B. Tiere, Pflanzen und alle anderen vielzelligen Organismen als die niederen eukaryotischen Organismen, wie z.B. Hefe, einzellige Algen, Protozoen usw.) unter Anwendung bekannter Ansätze durchführen zu können.
Viele der Standardtechniken zur Isolierung neuer Proteine und Gene basieren insbesondere auf der Annahme, dass die in der Primärstruktur (d.h. Aminosäure- und DNA-Sequenz) bekannten Proteinen und Genen, die dieselbe Funktion haben, signifikant ähnlich sein werden. Solche Standardtechniken umfassen Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die den konservierten Aminosäuresequenz-Motiven entsprechen. Es würde nicht erwartet, dass diese Techniken zur Isolierung von eukaryotischen Protoxgenen unter Verwendung der derzeitigen Strukturinformation, die auf prokaryotische Protoxgene beschränkt ist, nützlich sein würden, da selbst unter den bekannten prokaryotischen Protoxgenen und -proteinen keine signifikante Strukturähnlichkeit besteht.
Ein anderer Ansatz, der zur Isolierung von biosynthetischen Genen in anderen Stoffwechselwegen aus höheren Eukaryoten verwendet wurde, ist die Komplementierung von mikrobiellen Mutanten, die bezüglich der interessierenden Aktivität defizient sind. Für diesen Ansatz wird eine Bibliothek von cDNAs aus dem höheren Eukaryoten in einen Vektor kloniert, der eine Expression der cDNA in dem mikriobiellen Wirt steuern kann. Der Vektor wird dann transformiert oder in anderer Weise in die mutante Mikrobe eingeführt, und es werden Kolonien selektiert, die phänotypisch nicht länger Mutante sind.
Diese Strategie wurde zur Isolierung von Genen aus höheren Eukaryoten durchgeführt, welche bei verschiedenen Stoffwechselwegen involviert sind, einschließlich Histidinbiosynthese (z.B. US-Patent 5,290,926 und WO 94/026909 von Ward et al., die hier in ihrer Gesamtheit durch Referenz aufgenommen werden), Lysinbiosynthese (z.B. Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), Purinbiosynthese (z.B. Aimi et al., J. Biol. Chem. 265: 9011 (1990)) und Tryptophanbiosynthese (z.B. Niyogi et al., Plant Cell 5: 1011 (1993)). Trotz der Verfügbarkeit mikrobieller Mutanten, von denen beschrieben ist, dass sie bezüglich der Protoxaktivität defektiv sind (z.B. E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) und Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)) ist die Anwendung dieser Technik zur Isolierung von cDNAs, die eukaryotische Protox-Enzym-Aktivität codieren, auf der Basis der verfügbaren Information bestenfalls nicht voraussagbar.
Dafür gibt es verschiedene Gründe. Erstens, die eukaryotische Protox-cDNA-Sequenz kann in der mutanten Mikrobe nicht in adäquaten Leveln exprimiert werden, z.B. weil die Codonverwendung mit den Verwendungpräferenzen des mikrobiellen Wirts inkonsistent ist. Zweitens, das primäre Translationsprodukt aus der klonierten eukaryotischen codierenden Sequenz kann kein funktionelles Polypeptid produzieren, z.B. wenn die Aktivität eine posttranslationale Modifikation, z.B. Glycosylierung, erfordert, welche durch die Mikrobe nicht durchgeführt wird. Drittens, das eukaryotische Protein kann seine aktive Konformation im mikrobiellen Wirt nicht annehmen, z.B. wenn das Protein normalerweise zu einem spezifischen organellen Membransystem geleitet wird, das dem mikrobiellen Wirt spezifischerweise fehlt. Diese letzte Möglichkeit ist für das Pflanzen-Protox-Enzym besonders wahrscheinlich, welches in der Pflanzenzelle mit Organellen assoziiert ist, die in den mikrobiellen Wirten, die im Komplementierungsassay verwendet werden, nicht vorliegen. Das Pflanzen-Protox-Enzym ist insbesondere sowohl mit der Chloroplastenhülle als auch mit Thylakoidmembranen (Matringe et al., J. Biol. Chem. 267: 4646 (1992)) assoziiert und erreicht diese Membransysteme wahrscheinlich als Resultat eines post-translationalen Targetingmechanismus, der sowohl eine N-terminale Transitsequenz als auch intrinsische Eigenschaften des reifen Polypeptids involviert (siehe z.B. Kohorn und Tobin, Plant Cell 1: 159 (1989); Le et al., Plant Cell 3: 709 (1991); Li et al., J. Biol. Chem. 267: 18999 (1992)).
Das Protox-Enzym spielt bekannterweise bei bestimmten humanen Krankheitszuständen eine Rolle. Patienten, die an Porphyria cutanea toarda hereditaria, einer autosomalen dominanten Störung, leiden, die sowohl durch neuropsychiatrische Symptome wie auch durch Hautläsion gekennzeichnet ist, haben verringerte Level an Protoxaktivität (Brenner und Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)). Infolge des Fehlens an Wissen bezüglich des humanen Protox-Enzyms und seines entsprechenden Gens sind Optionen zum Diagnostizieren und Behandeln dieser Krankheit derzeit sehr begrenzt.
Die Verwendung von Herbiziden zur Bekämpfung unerwünschter Vegetation, wie z.B. Unkraut oder Pflanzen in Kulturpflanzen bzw. Erntepflanzen, wurde fast allgemeine Praxis. Der relevante Markt übersteigt jährlich eine Milliarde Dollar. Trotz dieser extensiven Verwendung bleibt die Unkrautbekämpfung für Landwirte ein bedeutendes und teures Problem.
Eine wirksame Verwendung von Herbiziden erfordert ein "Sound-Management". Beispielsweise sind Zeit der Anwendung und Verfahren der Anwendung und die Stufen der Unkrautpflanzenentwicklung kritisch, um eine gute Unkrautbekämpfung mit Herbiziden zu erhalten. Da verschiedene Unkrautspezies gegenüber Herbiziden resistent sind, wird die Produktion von wirksamen Herbiziden zunehmend wichtig.
Unglücklicherweise können Herbizide, die eine größere Wirksamkeit, ein breiteres Unkrautspektrum und einen schnelleren Abbau in Erde aufweisen, auch eine große Nutzpflanzentoxizität haben. Eine Lösung, die auf dieses Problem angewendet wurde, war die Entwicklung von Nutz- bzw. Kulturpflanzen, die gegenüber Herbiziden resistent oder tolerant sind. Kulturpflanzenhybride oder -Varietäten, die gegenüber Herbiziden resistent sind, ermöglichen die Verwendung der Herbizide ohne begleitendes Risiko einer Schädigung der Nutzpflanze. Die Resistenzentwicklung kann eine Aufbringung eines Herbizids auf eine Nutzpflanze ermöglichen, bei der seine Verwendung vorher infolge der Empfindlichkeit der Nutzpflanze bzw. Kulturpflanze gegenüber dem Herbizid ausgeschlossen oder begrenzt war (z.B. auf eine Vorauflaufverwendung). Beispielsweise betrifft das US-Patent Nr. 4,761,373 von Anderson et al. Pflanzen, die gegenüber verschiedenen Imidazolinon- oder Sulfonamid-Herbiziden resistent sind. Die Resistenz wird durch ein verändertes Acetohydroxysäuresynthase(AHAS)-Enzym verliehen. Das US-Patent Nr. 4,975,374 von Goodman et al. betrifft Pflanzenzellen und Pflanzen, die ein Gen enthalten, das für eine Glutaminsynthetase(GS)-Mutante codiert, welche gegenüber einer Inhibierung durch Herbizide resistent ist, von denen bekannt ist, dass sie GS hemmen, z.B. Phosphinothricin und Methioninsulfoxim. Das US-Patent Nr. 5,013,659 von Bedbrook et al. betrifft Pflanzen, die eine Acetolactatsynthase-Mutante exprimieren, welche den Pflanzen Resistenz gegenüber einer Inhibierung durch Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht. Das US-Patent Nr. 5,162,602 an Somers et al. offenbart Pflanzen, die gegenüber einer Inhibierung durch Cyclohexandion- und Aryloxyphenoxypropansäure-Herbizide tolerant sind. Die Toleranz wird durch eine veränderte Acetylcoenzym A-Carboxylase (ACCase) verliehen.
Das Protox-Enzym dient als Ziel für eine Vielzahl von herbiziden Verbindungen. Die Herbizide, die Protox inhibieren, umfassen viele verschiedene strukturelle Molekülklassen (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase und Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Diese herbiziden Verbindungen umfassen die Diphenylether {z.B. Acifluorfen, 5-[2-Chlor-4-(trifluormethyl)phenoxy]-2-nitrobenzoesäure; seinen Methylester; oder Oxyfluorfen, 2-Chlor-1-(3-ethoxy-4-nitrophenoxy)-4-(trifluorbenzol)}, Oxidiazole (z.B. Oxidiazon, 3-[2,4-Dichlor-5-(1-methylethoxy)phenyl]-5-(1,1-dimethylethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyclische Imide (z.B. S-23142, N-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid; Chlorphthalim, N-(4-Chlorphenyl)-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid), Phenylpyrazole (z.B. TNPP-ethyl, Ethyl-2-[1-(2,3,4-trichlorphenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), Pyridinderivate (z.B. LS 82-556) und Phenopylat und seine O-Phenylpyrrolidono- und Piperidinocarbamatanaloga. Viele dieser Verbindungen hemmen kompetitiv die normale Reaktion, die durch das Enzym katalysiert wird, wirken offensichtlich als Substratanaloga.
Der vorausgesagte Wirkmodus für Protox-inhibierende Herbizide involviert die Akkumulation von Protoporphyrinogen IX im Chloroplasten. Es wird davon ausgegangen, dass diese Akkumulation zur Leckage von Protoporphyrinogen IX in das Cytosol führt, wo es durch Peroxidaseaktivität zu Protoporphyrin IX oxidiert wird. Wenn Protoporphyrin IX Licht ausgesetzt wird, kann es die Bildung von Singulett-Sauerstoff in Cytosol bewirken. Dieser Singulett-Sauerstoff kann wiederum zur Bildung von anderen reaktiven Sauerstoffspezies führen, welche eine Lipidperoxidation und ein Membranreissen verursachen können, was zum schnellen Zelltod führt (Lee et al., Plant Physiol. 102: 881 (1993)).
Nicht alle Protox-Enzyme sind gegenüber Herbiziden empfindlich, welche Pflanzen-Protox-Enzyme inhibieren. Die beiden Protox-Enzyme, die durch Gene codiert werden, welche aus Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) und Bacillus subtilis (Dailey et al. J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)) isoliert wurden, sind gegenüber diesen Herbizideninhibitoren resistent. Außerdem wurden Mutanten der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii beschrieben, die gegenüber dem Phenylimidherbizid S-23142 resistent sind (Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata et al., In Research in Photosynthesis, Band III, N. Murata, Herausg. Kluwer: Netherlands, S. 567–570 (1992)). Wenigstens eine dieser Mutanten scheint eine veränderte Protoxaktivität zu haben, die nicht nur gegenüber dem herbiziden Inhibitor, auf dem die Mutante selektiert worden war, sondern auch gegenüber anderen Klassen von Protoxinhibitoren resistent ist (Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c: 339 (1993), Sato et al., in ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, Herausg., ACS Press: Washington, D. C. (1994)). Es wurde auch eine mutante Tabakzelllinie beschrieben, die gegenüber dem Inhibitor S-21432 resistent ist (Che et al., Z. Naturforsch. 48c: 350 (1993).
Erfindungsgemäß wird ein isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt, das für eine Protoporphyrinogen-Oxidase codiert, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 und 10, ausgewählt ist. Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes DNA-Molekül bereit, das für eine Protoporphyrinogen-Oxidase codiert, die die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz hat, außer dass:

a. das Alanin als Aminosäure 220 durch eine Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Valin, Threonin, Leucin und Cystein ausgewählt ist, ersetzt ist; und/oder
b. das Glycin als Aminosäure 221 durch Serin ersetzt ist; und/oder
c. das Tyrosin als Aminosäure 426 durch eine Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Cystein, Isoleucin, Leucin, Valin und Threonin ausgewählt ist, ersetzt ist.

Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes DNA-Molekül bereit, das für eine Protoporphyrinogen-Oxidase codiert, die die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Sequenz hat, außer dass:

a. das Alanin als Aminosäure 166 von SEQ ID NO: 6 durch Valin ersetzt ist; und/oder
b. das Glycin als Aminosäure 167 von SEQ ID NO: 6 durch Serin ersetzt ist; und/oder
c. das Tyrosin als Aminosäure 372 von SEQ ID NO: 6 durch Cystein ersetzt ist.

Weiter wird eine Expressionskassette bereitgestellt, umfassend einen Promotor, der funktionell mit dem isolierten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung verknüpft ist. Noch weiter bereitgestellt wird ein rekombinanter Vektor, der die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung umfasst. Ebenfalls bereitgestellt wird eine Wirtszelle, die in stabiler Weise unter Verwendung eines Vektors gemäß der Erfindung transformiert ist, wobei die Wirtszelle fähig ist, das DNA-Molekül zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Pflanzenzelle bereit, die ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei das DNA-Molekül in der Pflanzenzelle exprimiert wird und bei der Pflanzenzelle Toleranz gegenüber einem Herbizid in einem Ausmaß verleiht, das natürlich auftretende Protoxaktivität inhibiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Bereitstellung einer Pflanze bereit, die gegenüber Protoporphyrinogen-Oxidase inhibierenden Herbiziden tolerant ist, umfassend:

a. Bereitstellen einer Expressionskassette, die einen Pflanzen-funktionellen Promotor funktionell gebunden an eine DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst;
b. Transformieren von Pflanzenmaterial mit der Expressionskassette und
c. Regenerieren einer Pflanze aus dem Pflanzenmaterial.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Kontrolle des Wachstums einer unerwünschten Vegetation bereit, umfassend Anwenden auf eine Population der Pflanzen der vorliegenden Erfindung und die erwünschte Vegetation einer wirksamen Menge eines Protoporphyrinogen-Oxidase-inhibierenden Herbizids.
Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auf ein isoliertes DNA-Molekül, das für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)- Enzym aus einem eukaryotischen Organismus codiert, wobei dieser vorzugsweise ein höherer eukaryotischer Organismus ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf isolierte DNA-Moleküle, die für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)-Enzym aus einer Pflanzenquelle oder humanen Quelle codieren.
Die Anmeldung offenbart isolierte DNA-Moleküle, die für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)-Enzym aus dikotylen Pflanzen, speziell aus Arabidopsis-Pflanzen, codieren, z.B. solche, die in SEQ ID NOS: 1, 3 und 9 angegeben sind.
Auch offenbart sind isolierte DNA-Moleküle, die für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)-Enzym aus monokotylen Pflanzen, speziell aus Maispflanzen, codieren, z.B. solche, die in SEG ID NOS: 5 und 7 angegeben sind. Auch offenbart wird ein isoliertes DNA-Molekül, das für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)-Enzymprotein aus einer dikotylen Pflanze codiert, wobei das Protein die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS, 2, 4 und 10 ausgewählt ist. Außerdem wird noch ein isoliertes DNA-Molekül offenbart, das für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)-Enzymprotein aus einer Monokotylen-Pflanze codiert, wobei das Protein die Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 6 und 8 ausgewählt sind.
Unter Verwendung der Information, die durch die vorliegende Anmeldung bereitgestellt wird, kann die DNA, die die Sequenz für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)-Enzym aus einem beliebigen eukaryotischen Organismus codiert, unter Verwendung von Standardverfahren erhalten werden. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Sonden, die fähig sind, in spezifischer Weise an eine eukaryotische DNA-Sequenz, die für eine Protoporphyrinogen-Oxidase-Aktivität codiert, oder an die entsprechende mRNA zu hybridisieren, und auf Verfahren zum Detektieren dieser DNA-Sequenzen in eukaryotischen Organismen unter Verwendung der offenbarten Sonden.
Die Anmeldung bezieht sich außerdem auf Expressionskassetten und rekombinante Vektoren, die diese Expressionskassetten umfassen, die im wesentlichen einen Promotor umfassen, aber speziell einen Promotor, der in einer Pflanze aktiv ist, funktionell mit einem DNA-Molekül, das für das Protoporphyrinogen-Oxidase-(Protox)-Enzym aus einem eukaryotischen Organismus codiert, gebunden umfasst. Die Expressionskassette kann außerdem eine Signalsequenz funktionell mit dem DNA-Molekül verknüpft umfassen, wobei diese Signalsequenz fähig ist, das Protein, das durch das genannte DNA-Molekül codiert wird, in den Chloroplasten oder die Mitochondrien zu targetieren.
Außerdem betrifft die vorliegende Anmeldung Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen mit veränderter Protox-Aktivität, die gegenüber einer Inhibierung durch ein Herbizid bei Leveln, welche normalerweise für die natürlich vorkommende Protox-Aktivität in der Pflanze inhibitorisch sind, resistent oder zumindest tolerant sind. Die Anmeldung bezieht sich insbesondere auf Pflanzen, denen die veränderte Protox-Aktivität durch Überexpression des Wildtyp-Protox-Enzyms oder durch Expression eines DNA-Moleküls, das für ein Herbizid-tolerantes Protox-Enzym codiert, verliehen wird. Das genannte Herbizid-tolerante Protox-Enzym kann eine modifizierte Form eines Protox-Enzyms sein, das natürlicherweise in einem Eukaryoten oder einem Prokaryoten vorkommt; oder es kann eine modifizierte Form eines Protox-Enzyms sein, das natürlicherweise in dieser Pflanze vorkommt; oder das genannte Herbizid-tolerante Protox-Enzym kann in einem Prokaryonten natürlicherweise vorkommen. Pflanzen, die durch die vorliegende Anmeldung offenbart werden, umfassen monokotyle und dikotyle Pflanzen, speziell aber Hybridpflanzen. Bevorzugt sind solche Pflanzen, die potenzielle Ziele für Protox-inhibierende Herbizide wären, insbesondere landwirtschaftlich wichtige Nutzpflanzen wie Mais und andere Getreidepflanzen wie Weizen, Hafer, Roggen, Sorghum, Reis, Gerste, Hirse, Rasen und Futtergräser und dergleichen wie auch Baumwolle, Tabak, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Ölsamenraps und Sojabohnen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Vermehrung von Material einer Pflanze gemäß der Erfindung, insbesondere Pflanzensamen, behandelt mit einer schützenden Beschichtung, speziell aber einer schützenden Beschichtung, die eine Präparation umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Herbiziden, Insektiziden, Fungiziden, Bakteriziden, Nematiziden, Mollusciziden oder Gemischen davon besteht.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben und Pflanzensamen und auf die transgene Nachkommenschaft davon, die ein Protox-Enzym enthält, das gegenüber einer Inhibierung durch ein Herbizid bei einer Konzentration, die die natürlich vorkommende Protox-Aktivität inhibiert, resistent oder tolerant ist. Die genannte Resistenz oder Toleranz kann erhalten werden, indem in den genannten transgenen Pflanzen ein DNA-Molekül exprimiert wird, das entweder für eine modifizierte Form eines Protox-Enzyms, das natürlicherweise in einem Eukaryoten vorkommt, oder eine modifizierte Form eines Protox-Enzyms, das natürlicherweise in der Pflanze vorkommt, oder ein Protox-Enzym, das natürlicherweise in einem Prokaryoten vorkommt, oder ein Protox-Enzym, das eine modifizierte Form eines Proteins ist, das natürlicherweise in einem Prokaryoten vorkommt, codiert.
Die Anmeldung bezieht sich außerdem auf die Herstellung von transgenen Maispflanzen, transgenem Maisgewebe oder transgene Maissamen und die transgene Nachkommenschaft davon, die in stabiler Weise mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, umfassend einen geeigneten Promotor funktionell in Pflanzen an ein Strukturgen geknüpft, das für ein nicht-modifiziertes prokaryotisches Protox-Enzym codiert, welches gegenüber dem Herbizid resistent ist.
Die Anmeldung betrifft außerdem die Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen, transgenem Pflanzengewebe und transgenen Pflanzensamen und die transgene Nachkommenschaft davon, die in stabiler Weise mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, umfassend einen geeigneten Promotor funktionell in Pflanzen mit einem Strukturgen verknüpft, das für ein nicht-modifiziertes eukaryotisches Protox-Enzym codiert. Dies resultiert in einer Überexpression des nicht-modifizierten Protox in der Pflanze, die ausreicht, um eine Inhibierung des Enzyms durch das Herbizid zu überwinden.
Die Anmeldung bezieht sich außerdem auf die Produktion von Pflanzen, die ein verändertes Protox-Enzym exprimieren, welches gegenüber einer Inhibierung durch ein Herbizid bei einer Konzentration, die normalerweise die Aktivität des nicht veränderten Wildtyp-Protox inhibiert, tolerant ist. In dieser Ausführungsform kann die Pflanze in stabiler Weise mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden, das ein Strukturgen umfasst, welches für das resistente Protox codiert, oder sie kann durch direkte Selektionstechniken hergestellt werden, wodurch Herbizid-resistente Linien isoliert, charakterisiert und entwickelt werden.
Die Anmeldung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Kontrolle des Wachstums unerwünschter Vegetation, umfassend Anwenden bzw. Aufbringen auf eine Population einer Pflanze mit einer veränderten Protox-Aktivität, die gegenüber einer Inhibierung durch ein Herbizid bei Leveln, die normalerweise für die natürlich vorkommende Protox-Aktivität in der genannten Pflanze inhibitorisch sind, resistent ist, eine wirksame Menge eines Protox-inhibierenden Herbizids. Pflanzen, die in der beschriebenen Weise zu schützen sind, sind speziell solche, die potenzielle Ziele für Protox inhibierende Herbizide wären, insbesondere landwirtschaftlich wichtige Nutzpflanzen, z.B. Mais und andere Getreidenutzpflanzen, wie Weizen, Hafer, Roggen, Sorghum, Reis, Gerste, Hirse und Futtergräser und dergl. wie auch Baumwolle, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Ölsamenraps und Sojabohnen.
Herbizide, die sich als Protox-Inhibitoren qualifizieren, sind solche, die aus der Gruppe bestehend aus Aryluracil, Diphenylether, Oxadiazol, Imid, Phenylpyrazol, Pyridinderivat, Phenopylat und O-Phenylpyrrolidino- und Piperidinocarbamat-Analoga des genannten Phänopylats ausgewählt sind.
Die Anmeldung bezieht sich auch auf die rekombinante Produktion des Protox-Enzyms und Verfahren zur Verwendung rekombinant produzierten Protox. Die Anmeldung bezieht sich somit außerdem auf Wirtszellen, speziell aber auf Zellen, die aus der Gruppe, bestehend aus Pflanzenzellen, Tierzellen, Bakterienzellen, Hefezellen und Insektenzellen, ausgewählt sind, welche in stabiler Weise mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das einen geeigneten Promotor, der in der jeweiligen Wirtszelle funktionell ist und funktionell mit einem Strukturgen verknüpft ist, das für ein nicht modifiziertes oder modifiziertes eukaryotisches Protox-Enzym codiert, umfasst, wobei die Wirtszelle fähig ist, das DNA-Molekül zu exprimieren.
Die Anmeldung stellt ferner Verfahren zur Verwendung gereinigten Protox bereit, um auf neue Herbizide durchzumustern, die die Aktivität von Protox beeinträchtigen, und um Herbizid-resistente Protox-Mutanten zu identifizieren.
Die Anmeldung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Analyse einer Chemikalie bezüglich der Fähigkeit, die Aktivität eines Protox-Enzyms aus einer Pflanze zu inhibieren, umfassend:

(a) Kombinieren des Protox-Enzyms und Protoporphyrinogen IX in einem ersten Reaktionsgemisch unter Bedingungen, bei denen das Protox-Enzym fähig ist, die Umwandlung des Protoporphyrinogen IX in Protoporphyrin IX zu katalysieren;
(b) Kombinieren der genannten Chemikalie, des Protox-Enzyms und Protoporphyrinogen IX in einem zweiten Reaktionsgemisch unter denselben Bedingungen wie im ersten Reaktionsgemisch;
(c) Anregen des ersten und des zweiten Reaktionsgemisches bei etwa 350 bis etwa 410 nm,
(d) Vergleichen der Fluoreszenz des ersten und des zweiten Reaktionsgemisches bei etwa 622 bis etwa 635 nm;

Die Anmeldung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren, das zur Identifizierung eines modifizierten Protox-Enzyms bereitgestellt wird, welches gegenüber einem Protox-Inhibitor resistent ist, das in einer Zellpopulation vorhanden ist, umfassend die Schritte:

(a) Kultivieren der genannten Population in Gegenwart des Protox-Inhibitors in Mengen, die die nicht modifizierte Form des Protox-Enzyms hemmen;
(b) Selektieren solcher Zellen aus Schritt (a), deren Wachstum nicht inhibiert ist; und
(c) Isolieren und Identifizieren des Protox-Enzyms, das in den Zellen vorliegt, die aus Schritt (b) selektiert wurden.

Gene, die für verändertes Protox codieren, können in Pflanzenzell-Transformationsverfahren als selektierbare Marker eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft somit außerdem ein Verfahren zum Selektieren von Pflanzen, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen, die mit einem Transgen von Interesse transformiert wurden, aus nicht transformierten Pflanzen, umfassend die Schritte:

(a) Transformieren einer Pflanze, eines Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle mit einem Transgen von Interesse, das geeignet ist, durch die Pflanze exprimiert zu werden, und einem Gen, das für ein verändertes Protox codiert, das gegenüber einem Protox-Inhibitor resistent ist;
(b) Transferieren der so transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen auf ein Medium, das den Protox-Inhibitor umfasst; und
(c) Selektieren der Pflanzen oder Pflanzenzellen, die in dem Medium überleben.

Die Anmeldung betrifft außerdem Sonden und Verfahren zum Detektieren des Vorliegens und der Form des Protox-Gens und zur Quantifizierung von Level der Protoxtranskripte in einem Organismus. Diese Verfahren können eingesetzt werden, um Krankheitszustände zu diagnostizieren, die mit einer veränderten Form des Protox-Enzyms oder veränderten Expressionsleveln des Protox-Enzyms assoziiert sind.
Die Anmeldung betrifft außerdem ein isoliertes DNA-Molekül, das für eine eukaryotische Form von Protoporphyrinogen-Oxidase (im folgenden als "Protox" bezeichnet) codiert, wobei das Enzym die Oxidation von Protoporphyrinogen IX zu Protoporphyrin IX katalysiert. Die DNA, die Sequenzen codiert, und die entsprechenden Aminosäuresequenzen für Protox-Enzyme aus Arabidopsis thaliana sind als SEQ ID NOS: 1–4 und 9–10 angegeben. Die codierenden DNA-Sequenzen und die entsprechenden Aminosäuresequenzen für Mais-Protox-Enzyme sind als SEQ ID NOS: 5–8 angegeben.
Eine beliebige gewünschte eukaryotische DNA, die für das Protox-Enzym codiert, kann erfindungsgemäß isoliert werden. Ein zur Isolierung einer für eukaryotisches Protox codierenden Sequenz angenommenes Verfahren wird durch Beispiel 1 repräsentiert. In diesem Verfahren werden cDNA-Klone, die für ein Protox-Enzym codieren, aus einer Bibliothek von cDNA-Klonen identifiziert, die von dem interessierenden Eukaryoten stammen, und zwar auf der Basis ihrer Fähigkeit, Protox-Enzym-Aktivität einem mutanten Wirtsorganismus zu liefern, dem diese Aktivität fehlt. Geeignete Wirtsorganismen zur Verwendung in diesem Verfahren sind solche, die verwendet werden können, um cDNA-Expressions-Bibliotheken durchzumustern, und für welche Mutanten, die bezüglich Protox-Aktivität defizient sind, entweder verfügbar sind oder routinemäßig erzeugt werden können. Solche Wirtsorganismen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) und Saccharomyces cerevisiae (Carmadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)).
Alternativ können eukaryotische für Protox codierende Sequenzen nach gut bekannten Techniken auf der Basis ihrer Sequenzhomologie zu den durch die vorliegende Erfindung beschriebenen für Protox codierenden Sequenzen von Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOS. 1, 3 und 9) und Zea mays (SEQ ID NOS. 5 und 7) isoliert werden. In diesen Techniken wird die ganze oder ein Teil der bekannten für Protox codierenden Sequenz als Sonde verwendet, welche selektiv an die anderen für Protox codierenden Sequenzen, die in einer Population von klonierten genomischen DNA-Fragmenten oder cDNA-Fragmenten (d.h. genomische cDNA-Bibliotheken) aus einem ausgewählten Organismus hybridisieren, verwendet. Eine derartige Technik beinhaltet eine Hybridisierungsdurchmusterung von plattierten DNA-Bibliotheken (entweder Plaques oder Kolonien; siehe z.B. Sambrock et al., Molecular Cloning, Herausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und eine Amplifikation durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die den Sequenzdomänen entsprechen, die unter bekannten Protoxaminosäuresequenzen konserviert sind (siehe z.B. Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Herausg. Academic Press (1990)). Diese Verfahren sind zur Isolierung von für Protox codierenden Sequenzen aus Organismen, die mit dem Organismus verwandt sind, aus dem die Sondensequenz abgeleitet ist, besonders gut geeignet. Es würde z.B. erwartet, dass die Anwendung dieser Verfahren unter Verwendung der codierenden Arabidopsis- oder Zea mays-Sequenz als Sonde für die Isolierung von für Protox codierende Sequenzen aus anderen Pflanzenspezies besonders gut geeignet ist.
Durch die vorliegende Erfindung wird gelehrt, dass die isolierten eukaryotischen Protoxsequenzen nach Standardtechniken der Gentechnologie manipuliert werden können, um so an einen gewünschten Zweck angepasst zu sein. Beispielsweise kann die gesamte Protox-Sequenz oder es können Teile davon als Sonden verwendet werden, die geeignet sind, spezifisch an für Protox codierende Sequenzen und Messenger-RNA zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielzahl von Bedingungen zu erreichen, umfassen solche Sonden Sequenzen, die unter den für Protox codierenden Sequenzen einzigartig sind und vorzugsweise eine Länge von wenigstens 10 Nukleotiden und am vorteilhaftesten eine Länge von wenigstens 20 Nukleotiden haben. Solche Sonden können verwendet werden, um die für Protox codierenden Sequenzen aus einem gewählten Organismus über das gut bekannte Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren und zu analysieren. Diese Technik kann zur Isolierung zusätzlicher für Protox codierender Sequenzen aus einem gewünschten Organismus oder als diagnostischer Assay zur Bestimmung des Vorliegens von für Protox codierenden Sequenzen in einem Organismus und zur Assoziierung veränderter codierender Sequenzen mit besonderen ungünstigen Zuständen, z.B. autosomale dominante Störung bei Menschen, die sowohl durch neuropsychiatrische Symptome als auch Hautläsionen charakterisiert ist und gesenkte Level an Protox-Aktivität aufweist, nützlich sein (Brenner und Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).
Für Protox spezifische Hybridisierungssonden können auch verwendet werden, um den Ort des nativen eukaryotischen Protoxgens (der nativen eukaryotischen Protox-Gene) im Genom eines ausgewählten Organismus unter Verwendung von Standardtechniken, die auf der selektiven Hybridisierung der Sonde an genomische Protoxsequenzen basieren, zu kartieren. Diese Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, eine Identifizierung von DNA-Polymorphismen, die in der Protoxsondensequenz identifiziert oder enthalten sind, und eine Verwendung solcher Polymorphismen, um eine Segregation des Protoxgens bezüglich anderer Marker bekannter Kartenposition in einer Kartierungspopulation, die aus einer Selbstbefruchtung eines Hybrids von zwei polymorphen Elternlinien stammt, zu verfolgen (siehe Helentjaris et al., Plant Mol. Biol. 5: 109 (1985). Sommer et al., Biotechniques, 12: 82 (1992); D'Ovidio et al., Plant Mol. Biol. 15: 169 (1990)). Während davon ausgegangen wird, dass eine beliebige eukaryotische Protoxsequenz als Sonde zur Kartierung von Protoxgenen aus einem beliebigen eukaryotischen Organismus nützlich ist, sind bevorzugte Sonden solche Protoxsequenzen aus Organismen, die mit dem ausgewählten Organismus näher verwandt sind, und die am meisten bevorzugten Sonden sind die Protoxsequenzen aus dem gewählten Organismus. Eine Kartierung von Protoxgenen in dieser Art wird bei Pflanzen zu Züchtungszwecken als besonders nützlich angesehen. Durch Kenntnis der genetischen Kartenposition eines mutanten Protoxgens, das Herbizidresistenz verleiht, können z.B. flankierende DNA-Marker aus einer genetischen Referenzkarte identifiziert werden (siehe z.B. Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). Während einer Introgression des Herbizidresistenzmerkmals in eine neue Züchtungslinie können diese Marker dann verwendet werden, um den Grad der Protox-verknüpften flankierenden chromosomalen DNA zu überwachen, die nach jeder Runde der Rückkreuzung noch in dem Rückkreuzungselter vorliegt.
Protox-spezifische Hybridisierungssonden können auch verwendet werden, um Level an Protox-mRNA in einem Organismus unter Verwendung von Standardtechniken, z.B. Northern-Blot-Analyse quantitativ zu bestimmen. Diese Technik kann als diagnostischer Assay zum Detektieren veränderter Level an Protoxexpression einsetzbar sein, welche mit besonderen ungünstigen Zuständen, wie z.B. autosomaler dominanter Störung bei Menschen, die sowohl durch neuropsychiatrische Symtome als auch durch Hautläsionen charakterisiert ist, und die gesenkte Spiegel an Protox-Aktivität haben, assoziiert sein können (Brenner und Bloomer, New Engl., J. Med. 302: 765 (1980)).
Zur rekombinanten Produktion des Enzyms in einem Wirtsorganismus kann die für Protox codierende Sequenz in eine Expressionskassette insertiert werden, die für den gewählten Wirt entwickelt wurde und in den Wirt eingeführt wurde, wo sie rekombinant produziert wird. Die Wahl spezifischer regulatorischer Sequenzen, z.B. Promotor, Signalsequenz, 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen und Enhancer, liegt im Rahmen des Fachwissens des Fachmanns auf diesem Gebiet. Das resultierende Molekül, das die einzelnen Elemente in geeignetem Leseraster verknüpft enthält, kann in einen Vektor insertiert werden, der fähig ist, in die Wirtszelle transformiert zu werden. Geeignete Expressionsvektoren und Verfahren zur rekombinanten Produktion von Proteinen sind für Wirtsorganismen, wie z.B. E. coli (z.B. Studier und Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989)), Hefe (siehe z.B. Schneider und Guarente, Meth. Enzymol. 194: 373 (1991)) und Insektenzellen (siehe z.B. Luckow und Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)), gut bekannt. Spezifische Beispiele umfassen Plasmide, z.B. pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) und Baculovirus-Expressionsvektoren, z.B. solche, die aus dem Genom von Autographica californica-nukleärem Polyhedrosis-Virus (AcMNPV) stammen. Ein bevorzugtes Baculovirus/Insekten-System ist pVI11392/Sf21-Zellen (Invitrogen, La Jolla, CA).
Rekombinant produziertes eukaryotisches Protox-Enzym ist für eine Vielzahl von Zwecken einsetzbar. Es kann z.B. verwendet werden, um in vitro enzymatische Protox-Aktivität zuzuführen. Es kann auch in einem in vitro-Assay verwendet werden, um bekannte Herbizidchemikalien, deren Target nicht identifiziert worden war, durchzumustern, um zu bestimmen, ob sie Protox inhibieren. Ein derartiger in vitro-Assay kann auch als ein allgemeinerer Screen eingesetzt werden, um Chemikalien zu identifizieren, welche Protox-Aktivität inhibieren und welche daher Herbizidkandidaten sind. Alternativ kann rekombinant produziertes Protox-Enzym verwendet werden, um seine Assoziation mit bekannten Inhibitoren weiter zu charakterisieren, um neue inhibitorische Herbizide wie auch gegenüber Herbizid tolerante Formen des Enzyms rational zu entwickeln.
Typischerweise wird der inhibitorische Effekt auf Protox bestimmt, indem die Fluoreszenz nach Anregung bei 395 bis 410 nm bei etwa 622 bis 635 nm gemessen wird (Jacobs und Jacobs, Enzyme 28: 206 (1982); Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Dieser Assay basiert auf der Tatsache, dass Protoporphyrin IX ein fluoreszierendes Pigment ist und Protoprophyrinogen IX nicht fluoeszierend ist. Proteinextrakte werden aus ausgewählten subzellulären Fraktionen, z.B. Etioplasten, Mitochondiren, Mikrosomen oder Plasmamembran, durch differenzielle Zentrifugation hergestellt (siehe z.B. Lee et al., Plant Physiol. 102: 881 (1993); Prado et al., Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson und Moore, in Plant Organelles, Reid, Herausg. S. 1–12, Jacobs und Jacobs, Plant Physiol. 101: 1181 (1993)). Protoporphyrinogen wird durch Reduktion von Protoporphyrin mit Natriumamalgam hergestellt, wie es von Jacobs und Jacobs beschrieben wurde (1982). Reaktionsgemische bestehen typischerweise aus 100 mM Hepes (pH 7,5), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, etwa 2 M Protoporphyrinogen IX und etwa 1 mg/ml Proteinextrakt. Vor der Initiation der enzymatischen Reaktion werden Inhibitorlösungen in verschiedenen Konzentrationen, z.B. 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM zu dem Enzymextrakt gegeben. Sobald der Proteinextrakt zugesetzt ist, wird die Fluoreszenz für mehrere Minuten gemessen und die Steigung der Steigung (Reaktionsreaktion) wird aus einem Linearitätsbereich errechnet. IC₅₀ wird bestimmt, indem die Steigung (slope) der inhibierten Reaktion mit einer Kontrollreaktion verglichen wird.
Die Anmeldung bezieht sich außerdem auf die Verwendung von Protox in einem Assay zur Identifizierung Inhibitor-resistenter Protoxmutanten. Ein typischer Assay ist wie folgt:

(a) Inkubieren einer ersten Probe von Protox und einem Substrat, Protoporphyrinogen IX, in Gegenwart einer zweiten Probe, die einen Protoxinhibitor umfasst;
(b) Messung der enzymatischen Aktivität des Protox aus Schritt (a);
(c) Inkubieren einer ersten Probe eines mutierten Protox und seines Substrats in Gegenwart einer zweiten Probe, die denselben Protoxinhibitor umfasst;
(d) Messen der enzymatischen Aktivität des mutierten Protox aus Schritt (c) und
(e) Vergleichen der enzymatischen Aktivität des mutierten Protox mit der, die durch das nicht mutierte Protox bereitgestellt wird.

Das Reaktionsgemisch und die Reaktionsbedingungen sind dieselben wie die für den Assay zur Identifizierung von Protoxinhibitoren (Inhibitorassay) mit den folgenden Modifikationen. Erstens, eine Protox-Mutante, die wie oben beschrieben erhalten wurde, wird in einer der Reaktionsgemische für das Wildtyp-Protox des Inhibitorassays eingesetzt. Zweitens, ein Inhibitor des Wildtyp-Protox liegt in beiden Reaktionsgemischen vor. Drittens, die mutierte Aktivität (Enzymaktivität in Gegenwart von Inhibitor und mutiertem Protox) und nicht-mutierte Aktivität (Enzymaktivität in Gegenwart von Inhibitor und Wildtyp-Protox) werden verglichen, um zu bestimmen, ob bei der mutierten Aktivität im Vergleich zu der nicht-mutierten Aktivität eine signifikante Erhöhung der Enzymaktivität beobachtet wird. Die mutierte Aktivität ist ein Maß für die enzymatische Aktivität des mutierten Protox-Enzyms in Gegenwart eines geeigneten Substrats und des Inhibitors. Nicht mutierte Aktivität ist ein Maß der enzymatischen Aktivität des Wildtyp-Protox-Enzyms in Gegenwart eines geeigneten Substrats und des Inhibitors. Eine signifikante Zunahme ist als Zunahme der enzymatischen Aktivität definiert, die größer ist als die Fehlergrenze, die der Messtechnik eigen ist, vorzugsweise ist sie eine Erhöhung um das etwa 2-Fache der Aktivität des Wildtyp-Enzyms in Gegenwart des Inhibitors, bevorzugter eine etwa 5-fache Erhöhung, am bevorzugtesten eine Erhöhung, die größer als das etwa 10-Fache ist.
Die Herbizide, die Protox inhibieren, umfassen viele unterschiedliche strukturelle Molekülklassen (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase und Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)), einschließlich der Diphenylether {z.B. Acifluorifen, 5-[2-Chlor-4-(trifluormethyl)phenoxy]-2-nitrobenzoesäure; seinen Methylester; oder Oxyfluorfen, 2-Chlor-1-(3-ethoxy-4-nitrophenoxy)-4-(trifluorbenzol)}, Oxidiazole (z.B. Oxidiazon, 3-[2,4-Dichlor-5-(1-methylethoxy)phenyl]-5-(1,1-dimethylethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyclischer Imide (z.B. S-23142, N-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid; Chlor phthalim, N-(4-Chlorphenyl)-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid), Phenylpyrazole (z.B. TNPP-ethyl, Ethyl-2-[1-(2,3,4-trichlorphenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), Pyridinderivate (z.B. LS 82-556) und Phenopylat und seiner O-Phenylpyrrolidino- und Piperidinocarbamat-Analoga.
Die Diphenylether von besonderer Bedeutung sind die mit der allgemeinen Formel
worin R für -COONa (Formel II), -CONHSO₂CH₃ (Formel III) oder -COOCH₂COOC₂H₅ (Formel IV; siehe Maigrot et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds; 47–51 (1989)) steht.
Zusätzliche Diphenylether von Interesse sind solche, in denen R für
(Formel IVa; siehe Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53–58 (1989)) steht.
Ein weiterer interessierender Diphenylether ist einer mit der Formel
(Formel IVb; Bifenox, siehe Dest et al., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27: 31 (1973))
Von Bedeutung ist auch die Klasse der Herbizide, die als Imide bekannt sind und die allgemeine Formel
haben, worin Q für
steht (siehe Hemper et al. (1965) in "Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry", Ragdale et al., Herausg. Amer. Chem. Soc., Washington, D. C., S. 42–48 (1994))
und R₁ für H, Cl oder F steht, R₂ für Cl steht und R₃ eine optimal substituierte Ether-, Thioether-, Ester-, Amino- oder Alkylgruppe ist. Alternativ können R₂ und R₃ zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden. Beispiele für Imid-Herbizide von besonderem Interesse sind:
Die herbizide Aktivität der obigen Verbindungen wird in Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Councel) (Formel X und XVI), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (Formel XII und XIII), US-Patent Nr. 4,746,352 (Formel XI) und Abstract of the Weed Science Society of America, Bd. 33, S. 9 (1993) (Formel XIV) beschrieben.
Die am stärksten bevorzugten Imid-Herbizide sind die, die als Aryluracile klassifiziert werden und die allgemeine Formel:
haben, worin R für die Gruppe (C_2-6-Alkenyloxy)carbonyl-C_1-4-alkyl steht, wie sie im US-Patent Nr. 5,183,492 offenbart sind, das hier durch Referenz aufgenommen wird.
Wichtige Herbizide haben auch die allgemeine Formel:
N-substituierte Pyrazole der allgemeinen Formel:
N-Phenylpyrazole, z.B.:
und 3-substituierte 2-Aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazole (Lyga et al., Pesticide Sci. 42: 29–36 (1994)).
Herbizidlevel, die normalerweise für die Aktivität von Protox inhibitorisch sind, umfassen Anwendungsraten, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und die teilweise von äußeren Faktoren, z.B. Umgebung, Anwendungszeit und -verfahren abhängen. Im Fall der Imidherbizide, die durch die Formeln V bis IX dargestellt werden, und insbesondere von solchen, die durch die Formeln X bis XVII dargestellt werden, liegt z.B. der Bereich der Anwendungsraten bzw. Aufbringungsraten von 0,0001 bis 10 kg/ha, vorzugsweise von 0,005 bis 2 kg/ha. Diese Dosierungsrate oder Konzentration des Herbizids kann in Abhängigkeit von der gewünschten Wirkung und der besonderen verwendeten Verbindung unterschiedlich sein und kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Die Anmeldung bezieht sich außerdem auf Pflanzen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen, die gegenüber Herbiziden tolerant sind, welche die natürlich vorkommende Protoxaktivität in diesen Pflanzen inhibieren, wobei die Toleranz durch eine veränderte Protox-Enzym-Aktivität verliehen wird. Repräsentative Pflanzen umfassen beliebige Pflanzen, auf welche diese Herbizide zu ihrem normalerweise angestrebten Zweck angewendet werden. Bevorzugt sind agronomisch wichtige Nutzpflanzen, d.h. Angiosperme und Gymnosperme, z.B. Baumwolle, Soja, Raps, Zuckerrübe, Mais, Reis, Weizen, Gerste, Hafer, Roggen, Sorghum, Hirse, Rasen, Futter-, Rasen-Gräser und dergleichen.
Mit "veränderter Protox-Enzym-Aktivität" ist eine enzymatische Protox-Aktivität gemeint, die sich von der unterscheidet, die natürlicherweise in einer Pflanze auftritt (d.h. Protox-Aktivität, die natürlicherweise in Abwesenheit einer direkten oder indirekten Manipulation einer solchen Aktivität durch den Menschen auftritt), die gegenüber Herbiziden resistent ist, die die natürlich vorkommende Aktivität inhibieren. Eine veränderte Protox-Enzym-Aktivität kann einer Pflanze gemäß der Erfindung verliehen werden, indem die Expression an Wildtyp-, Herbizid-empfindlichem Protox erhöht wird, ein verändertes, Herbizid-tolerantes, eukaryotisches Protox-Enzym in der Pflanze exprimiert wird, eine nicht modifizierte oder modifizierte bakterielle Form des Protox-Enzyms, das Herbizid-resistent ist, in der Pflanze exprimiert wird, oder durch eine Kombination dieser Technik.
Das Erreichen einer veränderten Protox-Enzym-Aktivität durch erhöhte Expression führt zu einem Protoxlevel in der Pflanzenzelle, der zumindest ausreichend ist, um eine durch das Herbizid bewirkte Wachstumsinhibierung zu überwinden. Der Level an exprimiertem Protox ist im allgemeinen wenigstens die 2-fache, vorzugsweise 5-fache und bevorzugter mindestens 10-fache Menge der nativ exprimierten Menge. Eine erhöhte Expression kann die Folge von Mehrfachkopien eines Wildtyp-Protox-Gens, des mehrfachen Auftretens der für Protox codierenden Sequenz innerhalb des Protoxgens (d.h. Genamplifikation) oder einer Mutation in der nicht codierenden, regulatorischen Sequenz des endogenen Protoxgens in der Pflanzenzelle sein. Pflanzen, die eine solche veränderte Protox-Enzym-Aktivität enthalten, können durch direkte Selektion von Pflanzen erhalten werden. Dieses Verfahren ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Somers et al. in US 5,162,602 und Anderson et al. in US 4,761,373 und die darin zitierten Referenzen. Diese Pflanzen können auch über Techniken der Gentechnologie, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erhalten werden.
Eine erhöhte Expression gegen Herbizid empfindlichen Protox kann auch erreicht werden, indem eine Pflanzenzelle mit einem rekombinanten oder chimären DNA-Molekül in stabiler Weise transformiert wird, welches einen Promotor, der zur Steuerung der Expression eines assoziierten Strukturgens in einer Pflanzenzelle fähig ist, verknüpft mit einem homologen oder heterologen Strukturgen, das Protox codiert, umfasst. Mit "homolog" ist gemeint, dass das Protoxgen aus einem Organismus, der taxonomisch mit der Zielpflanzenzelle identisch ist, isoliert wird. Mit "heterolog" ist gemeint, dass das Protoxgen aus einem Organismus erhalten wird, der sich taxonomisch von der Zielpflanzenzelle unterscheidet. Homologe Protoxgene können erhalten werden, indem eine auxotrophe Bakterien- oder Hefe-Mutante mit einer cDNA-Expressionsbibliothek aus der Zielpflanze komplementiert wird. Siehe z.B. Beispiel 1 und Snustad et al., Genetics 120: 1111–1114 (1988) (Maisglutaminsynthase); Delauney et al., Mol. Genet. 221: 299–305 (1990), (Sojabohnen-Pyrrolin-5- carboxylat-Reduktase); Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287–293 (1991) (Mais-Dihydrodipicolinat-Synthase); Eller et al., Plant Mol. Biol. 18: 557–566 (1992) (Raps-Chloroplasten-3-isopropylmalatdehydrogenase); Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 1731–1735 (1991); Minet et al., Plant J. 2: 417–422 (1992) (Dihydroorotatdehydrogenase) und darin zitierte Referenzen. Andere bekannte Verfahren umfassen Screening genomischer oder cDNA-Bibliotheken höherer Pflanzen, z.B. nach Sequenzen, die mit spezifischen Nukleinsäuresonden kreuzhybridisieren, oder Screening von Expressionsbibliotheken auf die Produktion von Protox-Enzymen, die mit spezifischen Antikörpersonden kreuzreagieren. Ein bevorzugtes Verfahren involviert Komplementieren einer auxothrophen E. coli-hemG-Mutante mit einer Mais- oder Arabidopsis thaliana-cDNA-Bibliothek.
Beispiele für Promotoren, die fähig sind, in Pflanzen oder Pflanzenzellen zu funktionieren, d.h. solche, die fähig sind, eine Expression der assoziierten Strukturgene, z.B. Protox, in Pflanzenzellen zu steuern, umfassen die Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 19S- oder 35S-Promotoren und die doppelten CaMV-Promotoren; Nopalinsynthase-Promotoren; mit Pathogenese-verwandte(PR)-Protein-Promotoren; kleine Untereinheit von Ribulosebisphosphatcarboxylase(ssuRUBISCO)-Promotoren und dergleichen. Bevorzugt sind der Reis-Actinpromotor (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150 (1991)), der Mais-Ubiquitin-Promotor ( EP 0 342 926 ; Taylor et al., Plant Cell Rep. 12: 491 (1993)) und der Pr-1-Promotor aus Tabak, Arabidopsis oder Mais (siehe die Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/IB95/00002 von Ryals et al., die hier in ihrer Gesamtheit durch Referenz aufgenommen wird). Bevorzugt sind auch der 35S-Promotor und ein verstärkter oder doppelter 35S-Promotor, z.B. der bei Kay et al., Science 236: 1299–1302 (1987) beschriebene und der doppelte 35S-Promotor, der in pCGN2113 kloniert wurde, hinterlegt als ATCC 40587, diejenigen, die in EP-A 0 392 225 offenbart sind, deren relevante Offenbarungen hier durch Referenz in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden. Die Promotoren selbst können nach fachbekannten Verfahren modifiziert werden, um die Promotorstärke zur Erhöhung der Promotorstärke zur Erhöhung der Protoxexpression zu manipulieren.
Signal- oder Transitpeptide können in den chimären DNA-Konstrukten der Erfindung an die für Protox codierende Sequenz fusioniert werden, um den Transport des exprimierten Protox-Enzyms zu der gewünschten Wirtstelle zu steuern. Beispiele für Signalpeptide umfassen die, die nativ mit den mit der Pflanzenpathogenese verbundenen Proteine verknüpft sind, z.B. PR-1, PR-2 und dergleichen. Siehe z.B. Payne et al., Plant Mol. Biol. 11: 89–94 (1988). Beispiele für Transitpeptide umfassen die Chloroplasten-Transitpeptide, z.B. die, die von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (1988) beschrieben sind; und mitochondriale Transitpeptide, z.B. die, die in Boutry et al., Nature 328: 340–342 (1987) beschrieben sind. Chloroplasten- und mitochondriale Transitpeptide werden in der vorliegenden Erfindung als besonders nützlich angesehen, da die enzymatische Protox-Aktivität typischerweise in den Mitochondrien und Chloroplasten auftritt. Zur Verwendung am meisten bevorzugt sind Chloroplasten-Transitpeptide, da eine Inhibierung der enzymatischen Protox-Aktivität in den Chloroplasten als die primäre Grundlage für die Wirkung von Protox-inhibierenden Herbiziden angesehen wird (Witkowski und Halling, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lehnen et al., Pestic. Biochem. Physiol. 37: 239 (1990); Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991)). Mit umfasst werden auch Sequenzen, die zu einer Lokalisierung des codierten Proteins in verschiedenen zellulären Kompartimenten, z.B. der Vakuole, führen. Siehe z.B. Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10362–10366 (1991) und Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21–53 (1991). Die relevanten Offenbarungen dieser Publikationen werden hier in ihrer Gesamtheit durch Referenz aufgenommen.
Das chimäre DNA-Konstrukt (die chimären DNA-Konstrukte) der Erfindung können viele Kopien eines Promotors oder viele Kopien der Protox-Strukturgene enthalten. Außerdem kann das Konstrukt (können die Konstrukte) codierende Sequenzen für Marker und codierende Sequenzen für andere Peptide, z.B. Signal- oder Transitpeptide, jeweils im geeigneten Leseraster mit den anderen funktionellen Elementen im DNA-Molekül umfassen. Die Herstellung solcher Konstrukte liegt im Rahmen des Fachwissens eines Fachmanns.
Nützliche Marker umfassen Peptide, die Herbizid-, Antibiotika- oder Arzneimittel-Resistenz bereitstellen, z.B. Resistenz gegenüber Hygromycin, Kanamycin, G418, Gentamycin, Lincomycin, Methotrexat, Glyphosat, Phosphinothricin oder dergleichen. Diese Marker können verwendet werden, um Zellen, die mit den chimären DNA-Konstrukten der Erfindung transformiert wurden, von nicht transformierten Zellen zu selektieren. Andere nützliche Marker sind peptidische Enzyme, die in einfacher Weise durch eine sichtbare Reaktion detektiert werden können, z.B. eine Farbreaktion, z.B. Luciferase, β-Glucuronidase oder β-Galactosidase.
Veränderte Protox-Enzym-Aktivität kann auch durch die Erzeugung oder Identifizierung von modifizierten Formen der isolierten für eukaryotisches Protox codierenden Sequenz, die wenigstens eine Aminosäuresubstitution, -additon oder -deletion hat, die für ein verändertes Protox-Enzym codiert, das gegenüber einem Herbizid resistent ist, das die unveränderte, natürlich auftretende Form (d.h. Formen, die natürlicherweise in einem eukaryotischen Organismus auftreten, ohne dass diese vom Menschen entweder direkt über rekombinante DNA-Methodologie oder indirekt über selektive Züchtung usw. manipuliert wurden) inhibiert. Gene, die solche Enzyme codieren, können durch zahlreiche Strategien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erhalten werden. Eine erste allgemeine Strategie involviert direkte oder indirekte Mutageneseverfahren an Mikroben. Beispielsweise kann ein genetisch manipulierbare Mikrobe, z.B. E. coli oder S. cerevisiae, in vivo einer statistischen Mutagenese, z.B. mit UV-Licht oder Ethyl- oder Methylmethansulfonat unterworfen werden. Mutageneseverfahren werden z.B. in Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); und im US-Patent 4,975,374 (Goodman et al.) beschrieben. Die Mikrobe, die zur Mutagenese selektiert wurde, enthält ein normal gegen Herbizid empfindliches eurkaryotisches Protoxgen und ist von der durch dieses Gen verliehenen Protoxaktivität abhängig. Die mutagenisierten Zellen werden in Gegenwart des Herbizids bei Konzentrationen, die das nicht modifizierte Protox-Enzym inhibieren, wachsen gelassen. Kolonien der mutagenisierten Mikrobe, die in Gegenwart des Inhibitors besser wachsen als die nicht mutagenisierte Mikrobe (d.h. Resistenz gegenüber dem Inhibitor aufweisen), werden zur weiteren Analyse selektiert.
Die Protox-Gene aus diesen Kolonien werden entweder durch Klonieren oder durch Polymerasekettenreaktions-Amplifikation isoliert und ihre Sequenzen werden geklärt. Sequenzen, die für ein verändertes Protox-Enzym codieren, werden dann zurück in die Mikrobe kloniert, um ihre Fähigkeit, Inhibitorresistenz zu verleihen, zu bestätigen.
Ein zweites Verfahren zum Erhalten von mutanten Herbizid-resistenten Allelen des eukaryotischen Protox-Enzyms involviert eine direkte Selektion in Pflanzen. Beispielsweise kann der Effekt eines Protox-Inhibitors, z.B. solche wie die oben beschriebenen, auf die Wachstumsinhibierung von Pflanzen, z.B. Arabidopsis, Sojabohne oder Mais, durch Plattieren von Samen, die durch fachbekannte Methoden sterilisiert wurden, auf Platten auf einem einfachen Minimalsalzmedium, das steigende Konzentrationen des Inhibitors enthält, bestimmt werden. Solche Konzentrationen liegen im Bereich von 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 und 3000 Parts per Million (ppm). Die niedrigste Dosis, bei der eine signifikante Wachstumsinhibierung reproduzierbar detektiert werden kann, wird für nachfolgende Experimente verwendet.
Eine Mutagenese von Pflanzenmaterial kann ausgenutzt werden, um die Häufigkeit zu erhöhen, bei der resistente Allele in der selektierten Population auftreten. Mutagenisiertes Samenmaterial kann aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich chemischer oder physikalischer Mutagenese oder Samen oder chemische oder physikalischer Mutagenese oder Pollen, stammen (Neuffer, in Maize for Biological Research, Sheridan, Herausg. Univ. Press, Grand Forks, ND, S. 61–64 (1982)), der dann verwendet wird, um Pflanzen zu befruchten; die resultierenden M₁-Mutantensamen werden gesammelt. Für Arabidopsis werden typischerweise M₂-Samen (Lehle Seeds Tucson, AZ), d.h. Nachkommensamen von Pflanzen, die aus Samen gewachsen sind, welche mit Chemikalien, wie z.B. Ethylmethansulfoant, oder mit physikalischen Mitteln, z.B. gamma-Strahlen oder schnelle Neutronen, mutagenisiert wurden, in Dichten von bis zu 10.000 Samen/Platte (10 cm Durchmesser) auf Minimalsalzmedium, das eine geeignete Inhibitorkonzentration enthält, plattiert, um auf Resistenz zu selektieren. Keimpflanzen, die weiter wachsen und 7 bis 21 Tage nach dem Plattieren grün bleiben, werden in Erde umgepflanzt und bis zur Reife und zum Samenansatz wachsen gelassen. Die Nachkommenschaft dieser Samen wird auf Resistenz gegenüber dem Herbizid getestet. Wenn das Resistenzmerkmal dominant ist, werden Pflanzen, deren Samen 3:1::resistent:empfindlich aufspalten, als heterozygot für die Resistenz in der M₂-Generation angesehen. Pflanzen, bei denen alle Samen resistent sind, werden als homozygot bezüglich der Resistenz in der M₂-Generation angesehen. Eine solche Mutagenese an intakten Samen und ein Screening ihrer M₂-Nachkommensamen kann auch an anderen Spezies, z.B. Sojabohnen, durchgeführt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,084,082 (Sebastian)). Mutante Samen bzw. mutantes Saatgut, das auf Herbizidtoleranz durchgemustert werden soll, kann auch als Resultat einer Bestäubung mit Pollen, die durch chemische oder physikalische Mittel mutagenisiert wurden, erhalten werden.
Es können zwei Ansätze durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die genetische Basis für die Resistenz ein verändertes Protoxgen ist. Erstens, Allele des Protoxgens aus Pflanzen, die Resistenz gegenüber dem Inhibitor aufweisen, können unter Verwendung von PCR mit Primern, die entweder auf konservierten Regionen in den Arabidopsis- und Mais-Protox- cDNA-Sequenzen, die unten in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 gezeigt sind, basieren oder bevorzugter auf den nicht veränderten Protox-Gensequenzen aus der Pflanze, die zur Erzeugung resistenter Allele verwendet wird, basieren, isoliert werden. Nach Sequenzierung der Allele, um das Vorliegen von Mutationen in der codierenden Sequenz zu bestimmen, können die Allele auf ihre Fähigkeit, Resistenz gegenüber dem Inhibitor an Pflanzen zu verleihen, in welche die vermeintlichen Resistenz verleihenden Allele transformiert wurden, getestet werden. Diese Pflanzen können entweder Arabidopsis-Pflanzen oder eine beliebige andere Pflanze, deren Wachstum gegenüber den Inhibitoren empfindlich ist, sein. Zweitens, die Protoxgene können bezüglich bekannter Resistriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs) kartiert werden (siehe z.B. Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 6856–6860 (1988); Nam et al., Plant Cell 1: 699–705 (1989)). Das Resistenzmerkmal kann in unabhängiger Weise unter Verwendung derselben Marker kartiert werden. Wenn Resistenz auf einer Mutation in diesem Protoxgen beruht, wird das Resistenzmerkmal zu einer Position kartiert werden, die von der Position eines Protoxgens nicht unterscheidbar ist.
Ein drittes Verfahren zum Erhalt von Herbizid-resistenten Allelen von Protox ist durch Selektion in Pflanzenzellkulturen. Explantate von Pflanzengewebe, z.B. Embryos, Blattscheiben usw., oder aktiv wachsende Callus- oder Suspensionskulturen einer Pflanze von Interesse werden auf einem definierten Medium, dem Häm fehlt, in Gegenwart steigender Konzentrationen des inhibitorischen Herbizids oder eines analogen Inhibitors, der zur Verwendung in einer Laborumgebung geeignet ist, wachsen gelassen. Unterschiedliche Wachstumsgrade in verschiedenen Kulturen werden aufgezeichnet. In bestimmten Kulturen entstehen schnell wachsende Variantenkolonien, die selbst in Gegenwart von normalerweise inhibitorischen Konzentrationen an Inhibitor weiter wachsen. Die Häufigkeit, mit der solche schneller wachsenden Varianten auftreten, kann durch Behandlung mit einem chemischen oder physikalischen Mutagen vor Aussetzen der Gewebe oder Zellen dem Herbizid erhöht werden. Vermeintliche Resistenz-verleihende Allele des Protox-Gens werden isoliert und getestet, wie es in den vorangehenden Abschnitten beschrieben wurde. Solche Allele, die als Herbizidresistenz verleihend identifiziert wurden, können dann zur optimalen Expression angeordnet werden und in die Pflanze transformiert werden. Alternativ können Pflanzen aus den Gewebe oder Zellkulturen, die diese Allele enthalten, regeneriert werden.
Ein viertes Verfahren involviert eine Mutagenese von gegen Herbizid empfindlichen Wildtyp-Protoxgenen in Bakterien oder Hefe, gefolgt von einem Kultivieren der Mikrobe auf Medium, dem Häm fehlt, das aber inhibitorische Konzentrationen des Inhibitors enthält, und danach Selektieren solcher Kolonien, die in Gegenwart des Inhibitors wachsen. Spezifischer, eine Pflanzen-cDNA, z.B. Arabidopsis- oder Mais-cDNA, die für Protox codiert, wird in eine Mikrobe kloniert, der ansonsten Protoxaktivität fehlt. Beispiele für solche Mikroben umfassen auxotrophe E. coli-, S. typhimurium- und S. cerevisiae-Mutanten, einschließlich E. coli-Stamm SASX38 (Sasaman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979), S. typhimurium-Stamm TE2483 oder TT13680 (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) und die hem14-1-Hefemutante (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)). Die transformierte Mikrobe wird dann einer in vivo-Mutagenese, z.B. die unmittelbar oben beschriebene, unterworfen, oder wird einer in vitro-Mutagenese durch ein Beliebiges verschiedener chemischer oder enzymatischer Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z.B. Natriumbisulfit (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457–468 (1983); Methoxylamin (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res, 13: 1733–1745 (1985); Oligonukleotid-spezifischer Sättigungsmutagenese (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83: 710–714 (1986); oder verschiedenen Polymerasemisinkorporations-Strategien (siehe z.B. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 79: 1588–1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64: 313–319 (1988); und Leung et al., Technique 1: 11–15 (1989)) unterworfen. Kolonien, die in Gegenwart von normalerweise inhibitorischen Konzentrationen an Inhibitor wachsen, werden herausgenommen und durch wiederholtes "restreaking" gereinigt. Ihre Plasmide werden gereinigt und auf die Fähigkeit, Assistenz gegenüber dem Inhibitor zu verleihen, getestet, indem sie in die Mikrobe, der Protox fehlt, retransformiert werden. Die DNA-Sequenzen von Protox-cDNA-Inserts aus Plasmiden, die diesen Test bestehen, werden dann bestimmt.
Sobald ein Herbizid-resistentes Protox-Allel identifiziert ist, kann es zur optimalen Expression in einer Nutzpflanze bzw. Kulturpflanze genetisch verändert werden. Dies kann ein Verändern der codierenden Sequenz des Resistenzallels zur optimalen Expression in der Nutzpflanzenspezies von Interesse umfassen. Verfahren zur Modifizierung codierender Sequenzen zur Erreichung einer optimalen Expression in einer besonderen Kulturpflanzenspezies sind gut bekannt (siehe z.B. Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 (1991); Koziel et al., Bio/Technol. 11: 194 (1993)). Eine gentechnische Manipulation des Protox-Allels zur optimalen Expression kann auch eine funktionelle Verknüpfung der geeigneten regulatorischen Sequenzen (d.h. Promotor, Signalsequenz, transkriptionale Terminatoren) umfassen. Bevorzugte Promotoren werden solche sein, die hohe Level konstitutiver Expression verleihen, oder bevorzugter solche, die eine spezifische Expression auf hohem Level in den Geweben verleihen, die gegenüber einer Schädigung durch das Herbizid anfällig sind.
Die rekombinanten DNA-Moleküle können in einer Reihe von fachbekannten Wegen in die Pflanzenzelle eingeführt werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird einsehen, dass die Wahl des Verfahrens vom Pflanzentyp, d.h. Monokotyle oder Dikotyle, der Ziel einer Transformation ist, abhängen wird. Geeignete Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen umfassen Mikroinjektion (Crossway et al., BioTechniques 4: 320–334 (1986)), Elektroporation (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602–5606 (1986), durch Agrobacterium vermittelte Transformation (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915–921 (1988), direkten Gentransfer (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722 (19984)) und ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen, die von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware verfügbar sind (siehe z.B. Sanford et al., US-Patent 4,945,050; und McCabe et al., Biotechnology 6: 923–926 (1988)). Siehe auch Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: 421–477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27–37 (1987) (Zwiebel); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671–674 (1988) (Sojabohne), McCabe et al., Bio/Technology 6: 923–926 (1988 (Sojabohne); Datta et al., Bio/Technology 8: 736–740 (1990) (Reis); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305–4309 (1988) (Mais); Klein et al., Bio/Technology 6: 559–563) (1988) (Mais); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440–444 (1988) (Mais); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833–839 (1990); und Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990) (Mais).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden außerdem transgene Pflanzen, insbesondere transgene fertile Pflanzen, die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren transformiert wurden, und ihre asexuelle und/oder sexuelle Nachkommenschaft, die gegenüber einer Inhibierung durch ein Herbizid in Leveln, die normalerweise für die natürlich vorkommende Protoxaktivität in der Pflanze inhibitorisch sind, resistent oder zumindest tolerant sind, mit umfasst. Ganz speziell bevorzugt sind Hybridpflanzen, die gegenüber einer Inhibierung durch ein Herbizid bei Leveln, die normalerweise für die natürlich vorkommende Protoxaktivität in der Pflanze inhibitorisch sind, resistent oder zumindest tolerant sind.
Die transgene Pflanze gemäß der Erfindung kann eine dikotyle oder eine monokotyle Pflanze sein. Bevorzugt sind monokotyle Pflanzen der Familie der Graminaceae, die Lolium-, Zea-, Triticum-, Triticale-, Sorghum-, Saccharum-, Bromus-, Oryzae-, Avena-, Hordeum-, Secale- und Setaris-Pflanzen umfasst.
Speziell bevorzugt sind transgener Mais, Weizen, transgene Gerste, Sorghum, Roggen, Hafer, Rasen, Gräser und Reis.
Unter den dikotylen Pflanzen sind hier Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Zuckerrohr, Ölsamenraps und Sonnenblume besonders bevorzugt.
Der Ausdruck "Nachkommenschaft" ist so zu verstehen, dass er sowohl "asexuell" als auch "sexuell" erzeugte Nachkommenschaft von transgenen Pflanzen umfasst. Diese Definition soll auch alle Mutanten und Varianten, die durch bekannte Verfahren, wie z.B. Zellfusion oder Mutantenselektion, erhältlich sind und die noch die charakteristischen Eigenschaften der ursprünglichen transformierten Pflanze aufweisen, zusammen mit allen Kreuzungs- und Fusionsprodukten des transformierten Pflanzenmaterials umfassen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft das Proliferationsmaterial von transgenen Pflanzen.
Das Proliferationsmaterial von transgenen Pflanzen ist für die Erfindung als ein beliebiges Pflanzenmaterial definiert, das in vivo oder in vitro sexuell oder asexuell vermehrt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Protoplasten, Zellen, Kalli, Gewebe, Organe, Samen, Embryos, Pollen, Eizellen, Zygoten, zusammen mit einem beliebigen anderen sich vermehrenden Material, das aus transgenen Pflanzen erhalten wurde, besonders bevorzugt.
Teile von Pflanzen, z.B. Blumen, Stengel, Früchte, Blätter, Wurzeln, die von transgenen Pflanzen oder ihrer Nachkommenschaft, die vorher mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens transformiert wurden und daher wenigstens zum Teil aus transgenen Zellen bestehen, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Bevor das Pflanzenvermehrungsmaterial [Frucht, Knolle, Körner, Samen], speziell aber Saatgut, als handelsübliches Produkt verkauft wird, wird es üblicherweise mit einer schützenden Beschichtung, die Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluscizide oder Gemische von verschiedenen dieser Präparationen, wenn es gewünscht wird, zusammen mit weiteren Trägern, oberflächenaktiven Mitteln oder die Aufbringung fördernden Adjuvanzien, die üblicherweise auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, behandelt, um Schutz gegenüber einer Schädigung zu verleihen, welche durch bakterielle, fungale oder tierische Schädlinge verursacht wird.
Um das Saatgut zu behandeln, kann die schützende Beschichtung entweder durch Imprägnieren der Knollen oder Körner mit einer flüssigen Formulierung oder Beschichten dieser mit einer kombinierten nassen oder trockenen Formulierung auf die Samen aufgebracht werden. Außerdem sind in speziellen Fällen andere Verfahren der Aufbringung auf Pflanzen möglich, z.B. eine Behandlung, die auf die Knospen oder die Frucht gerichtet ist.
Das Pflanzensaatgut gemäß der Erfindung, das eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein Protein aus einem Eukaryoten codiert, das Protoporphyrinogen-Oxidase(Protox)-Aktivität gemäß der Erfindung hat, kann mit einer samenschützenden Beschichtung behandelt werden, die eine Samenbehandlungsverbindung, z.B. Captan, Carboxin, Thiram (TMTD^®), Methalaxyl (Apron^®) und Pirimiphos-Methyl (Actellic^®) und andere, die üblicherweise bei der Samenbehandlung eingesetzt werden, umfasst.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Pflanzenvermehrungsmaterial für kultivierte Pflanzen, speziell aber Pflanzensamen, der mit einer samenschützenden Beschichtung behandelt ist, welche üblicherweise in der Samenbehandlung verwendet wird.
Wenn ein Herbizid-resistentes Protox-Allel über direkte Selektion in einer Kulturpflanze oder Pflanzenzellkultur, aus welcher eine Kulturpflanze regeneriert werden kann, erhalten wird, kann es unter Verwendung traditioneller Züchtungstechniken in kommerzielle Varietäten bewegt werden, um eine gegen Herbizid tolerante Kulturpflanze ohne die Notwendigkeit zur gentechnischen Veränderung des Allels und Transformieren desselben in die Pflanze zu entwickeln. Alternativ kann das Herbizid-resistente Allel isoliert, zur optimalen Expression genetisch manipuliert und dann in die gewünschte Varietät transformiert werden.
Gene, die für verändertes Protox codieren, welches gegenüber einem Protox-Inhibitor resistent ist, können auch als selektierbare Marker in Pflanzenzelltransformationsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise können Pflanzen, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen, die mit einem Transgen transformiert sind, auch mit einem Gen transformiert werden, das für ein verändertes Protox codiert, welches geeignet ist, durch die Pflanze exprimiert zu werden. Die so transformierten Zellen werden auf Medium übertragen, das den Protox-Inhibitor enthält, wobei nur die transformierten Zellen überleben werden. Protox-Inhibitoren, die als besonders nützliche selektive Mittel angesehen werden, sind die Diphenylether {z.B. Acifluorfen, 5-[2-Chlor-4-trifluormethyl)phenoxy]-2-nitrobezoesäure; ihr Methylester; oder Oxyfluorfen, 2-Chlor-1-(3-ethoxy-4-nitrophenoxy)-4-(trifluorbenzol)}, Oxidiazole, (z.B. Oxidiazon, 3-[2,4-Dichlor-5-(1-methylethoxy)phenyl]-5-(1,1-dimethylethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyclische Imide (z.B. S-23142, N-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid; Chlorphthalim, N-(4-chlorphenyl)-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid), Phenylpyrazole (z.B. TNPP-ethyl, Ethyl-2-[1-(2,3,4-trichlorphenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), Pyridinderivate (z.B. LS 82-556) und Phenopylat und seine O-Phenylpyrrolidino- und Piperidinocarbamat-Analoga. Das Verfahren ist auf eine beliebige Pflanzenzelle anwendbar, die fähig ist, mit einem veränderten für Protox codierenden Gen transformiert zu werden und kann mit einem beliebigen Transgen von Interesse verwendet werden. Eine Expression des Transgens und des Protox-Gens kann durch denselben funktionellen Promotor, der bei Pflanzenzellen funktionell ist oder durch getrennte Promotoren gesteuert werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden detaillierten Beispiele weiter beschrieben. Diese Beispiele werden nur zur Erläuterung bereitgestellt und sollen keine Beschränkung darstellen, wenn nichts anderes spezifiziert ist.
Hinterlegungen
Die folgenden Vektormoleküle wurden beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern, Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, an den unten angegebenen Daten hinterlegt:
Protox-1, im pBluescript SK-Vektor, wurde am 5. April 1994 als pWDC-2 (#B-21238) hinterlegt.
Protex-2, im pFL61-Vektor, wurde am 5. April 1994 als pWDC-1 (NRRL #B-21237) hinterlegt.
MzProtox-1, im pBluescript-SK-Vektor, hinterlegt am 20. Mai 1994 als pWDC-4 mit der NRRL (#B-21260), gezeigt in SEQ ID NO: 5.
MzProtox-1, im pBluescript-SK-Vektor, am 11. Juli 1994 erneut hinterlegt als pWDC-4, mit der NRRL (#B-21260N), in SEQ ID NO: 5 gezeigt.
MzProtox-2, im pBluescript-SK-Vektor, am 20. Mai 1994 hinterlegt als pWDC-3 mit der NRRL (# B-21259), gezeigt in SEQ ID NO: 7.
Protox-3, im pFL61-Vektor, wurde am 10. Juni 1994 als pWDC-5 (NRRL #B-21280) hinterlegt.
pMzC-1 Val, im pBluescript-SK-Vektor, wurde am 30. September 1994 unter der Bezeichnung pWDC-8 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung NRRL #21340.
pAraC-2Cys, im pFL61-Vektor, wurde am 14. November 1994 unter der Bezeichnung pWDC-7 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung NRRL #21339N.
BEISPIELE
Rekombinante Standard-DNA und molekulare Klonierungstechniken, die hier verwendet wurden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY (1982) und von T. J. Silheavy, M. L. Berman und L. W. Enquiest, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984), beschrieben.
Beispiel 1: Isolierung von Arabidopsis-cDNAs, die für Protoxgene codieren, durch funktionelle Komplementierung einer E. coli-Mutante
Eine Arabidopsis thaliana(Landsberg)-cDNA-Bibliothek im Plasmidvektor pFL61 (Minet et al., Plant J. 2: 417–422 (1992)) wurde erhalten und amplifiziert. Eine zweite Arabidopsis (Columbia)-cDNA-Bibliothek im UniZap-lambda-Vektor (Stratagene) wurde gekauft und als pBluescript-Plasmide durch in vivo-Massenausschneiden des Phagenstamms amplifiziert. Die E. coli-hemG-Mutante SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)) wurde erhalten und auf L-Medium, das 20 mg/ml Hematin (United States Biochemicals) enthielt, gehalten. Die Plasmidbibliotheken wurden durch Elektroporation unter Verwendung des Bio-Rad-Gene-Pulsers und den Bedingungen des Herstellers in SASX38 transformiert. Die Zellen wurden an L-Agar, der 100 mg/ml Ampicillin enthielt, in einer Dichte von etwa 500.000 Transformanten/10 cm-Platten plattiert. Die Zellen wurden bei 37°C für 40 h bei geringem Licht inkubiert und auf die Fähigkeit, ohne Zusatz von exogenem Häm zu wachsen, selektiert. Hämprototrophe wurden mit einer Häufigkeit von 400/10⁷ aus der pFL61-Bibliothek und mit einer Häufigkeit von 2/10⁷ aus der pBluescript-Bibliothek isoliert. Plasmid-DNA wurde zur Sequenzanalyse aus 24 Kolonien isoliert. Jede der 24 wurde in SASX38 retransformiert, um die Fähigkeit, zu komplementieren, zu beweisen.
Eine Sequenzanalyse zeigte zwei Klassen vermeintlicher Protox-Klone. Neun gehörten zum Typ, der "Protox-1" genannt wurde. Jeder war von dem selben Gen abgeleitet und zwei waren Volllängenklone. Die cDNA hat eine Länge von 1719 bp und codiert für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 57,7 kDa. Die N-terminale Peptidsequenz hat Merkmale, die für ein Chloroplastentransitpeptid mit etwa 60 Aminosäuren charakteristisch sind. Eine Datenbanksuche mit dem GAP-Programm (Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387–395 (1984) zeigt Homologie mit dem B. subtilis-hemY(Protox)-Protein (Hansson und Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Die zwei Proteine sind zu 53% ähnlich, zu 31% identisch, mit Regionen hoher Homologie, einschließlich der vorgeschlagenen Dinukleotid-bindenden Domäne des hemY-Proteins (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)).
Die anderen 15 cDNA-Klone gehörten zu dem Typ, der "Protox-2" genannt wird. Diese scheinen auch aus einem einzelnen Gen zu entstehen. Die offensichtlich Volllängen-cDNA hat eine Länge von 1738 bp und codiert für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 55,6 kD. Der Amino-Terminus ist irgendwie für ein mitochrondriales Transitpeptid charakteristisch. Das Protox-2-protein hat begrenzte Homologie zu Protox-1 (zu 53% ähnlich, zu 28% identisch) und zu dem B. subtilis-Protox (zu 50% ähnlich, zu 27% identisch).
Protox-1, im pBluescript-SK-Vektor, wurde am 5. April 1994 als pWDC-2 hinterlegt (NRRL #B-21238).
Protox-2, im pFL61-Vektor, wurde am 5. April 1994 als pWDC-1 hinterlegt (NRRL #B-21237).
Die Arabidopsis-cDNA, die für Protox-1 codiert, enthalten in pWDC-2, und Protox-2, enthalten in pWDC-1, sind unten in SEQ ID NOS: 1 bzw. 3 angegeben.
Beispiel 2: Isolierung von Mais-cDNAs, die Protoxgene codieren, durch funktionelle Komplementierung einer E. coli-Mutante
Eine Zea Mays(B73-Inzucht)-cDNA-Bibliothek in lambda-UniZap wurde von Stratagene gekauft und durch in vivo-Massenausschneiden in eine pBluescript-Bibliothek umgewandelt. Eine zweite in üblicher Weise hergestellte UniZap-Mais-cDNA-Bibliothek wurde von Clontech bezogen und in ähnlicher Weise in pBluescript-Plasmide umgewandelt. Eine Selektion auf funktionelle Protoxgene aus Mais war genau wie für die Arabidopsis-Bibliotheken oben in Beispiel 1 beschrieben.
Zwei Häm-Prototrophe in 10⁷ Transformanten wurden aus der Stratagene-Bibliothek isoliert, welche zur Rekomplementierung gezeigt wurde, und sequenziert. Diese cDNAs waren identisch und erwiesen sich zu Arabidopsis Protox-1 homolog. Dieser Maisklon, MzProtox-1 genannt, ist unvollständig. Die cDNA ist 1698 bp lang und codiert nur für das vermeintliche reife Protox-Enzym; es gibt keine Transitpeptidsequenz und kein Methionininitiationscodon. Das Gen ist zu 68% identisch zu Arab Protox-1 auf dem Nukleotidlevel und ist auf dem Aminosäurelevel zu 78% identisch (87% ähnlich) (in Tabelle 1 gezeigt).
Ein einzelner Häm-Prototroph in 10⁷ Transformanten wurde aus der Clontech-Bibliothek erhalten, zur Rekomplementierung gebracht und sequenziert. Die cDNA scheint vollständig zu sein, hat eine Länge von 2061 bp und codiert für ein Protein mit 59 kDa. Dieser Klon ist ein Maishomologes von Arabidopsis-Protox-2 und wird MzProtox-2 genannt. Das Gen ist auf dem Nukleotidlevel zu 58% identisch mit Arab Protox-2, und auf dem Aminosäurelevel zu 58% identisch (76% ähnlich) (in Tabelle 2 gezeigt). Der Maisklon hat eine N-terminale Sequenz, die 30 Aminosäuren länger ist als der Arabidopsis-Klon. wie bei den Arabidopsis-Klonen ist die Homologie zwischen den zwei Mais-Protox-Genen ziemlich niedrig mit nur 31% Identität zwischen den zwei Proteinsequenzen.
MZProtox-1, im pBluescript-SK-Vektor, hinterlegt am 20. Mai 1994 als pWDC-4 mit der NRRL (#B-21260), gezeigt in SEQ ID NO: 5.
MzProtox-1, im pBluescript-SK-Vektor, am 11. Juli 1994 wieder hinterlegt als pWDC-4 mit der NRRL (#B-21260N), gezeigt in SEQ ID NO: 5.
MzProtox-2, im pBluescript-SK-Vektor, am 20. Mai 1994 als pWDC-3 mit der NRRL (#B-21259) hinterlegt, gezeigt in SEQ ID NO: 7.
Beispiel 3: Isolierung von zusätzlichen Protox-Genen auf der Basis von Sequenzhomologie zu bekannten, für Protox codierenden Sequenzen
Eine Phagen- oder Plasmid-Bibliothek wird in einer Dichte von etwa 10.000 Plaques auf einer 10 cm-Petrischale plattiert, und es werden Filterlifts der Plaques nach Wachstum der Pflanzen bei 37°C über Nacht durchgeführt. Die Plaquelifts werden mit einer der cDNAs, die in SEQ ID NOS: 1, 3, 5 oder 7 angegeben sind, markiert mit 32P-dCTP, durch das statistische Priming-Verfahren mit Hilfe eines PrimeTime-Kits (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) sondiert. Die Hybridisierungsbedingungen sind 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, pH 7,0, 1 mM EDTA mit 50°C. Nach Hybridisierung über Nacht werden die Filter mit 2 × SSC, 1% SDS gewaschen. Positiv hybridisierende Plaques werden durch Autoradiographie detektiert. Nach Reinigung zu Einzelplaques werden cDNA-Inserts isoliert und ihre Sequenzen werden durch das Kettenterminierungsverfahren unter Verwendung von Didesoxyterminatoren, markiert mit Fluoreszenzfarbstoffen (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), bestimmt.
Das oben beschriebene experimentelle Standardprotokoll kann von einem Fachmann verwendet werden, um Protoxgene zu erhalten, die im wesentlichen zu den bekannten für Protox codierenden Sequenzen aus einem beliebigen anderen Eukaryoten, insbesondere einer anderen höheren Pflanzenspezies, homolog sind, zu erhalten.
Eine Anordnung der vorausgesagten Aminosäuresequenzen der jeweiligen Proteine, die durch die in SEQ ID NOS: 2 und 6 gezeigten Sequenzen codiert werden, ist in Tabelle 1 angegeben. Eine Anordnung der vorausgesagten Aminosäuresequenzen der jeweiligen Proteine, die durch die in SEQ ID NOS: 4 und 8 gezeigten Sequenzen codiert werden, ist in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 1
Vergleich der Arabidopsis-(SEQ ID NO: 2)- und Mais-(SEQ ID NO: 6)-Protox-1-Aminosäuresequenzen

Prozentwert der Ähnlichkeit: 87,137; Prozentwert der Identität: 78,008
Protox-1.Pep x Mzprotox-1.Pep

Identische Reste sind durch den vertikalen Strich zwischen den zwei Sequenzen gekennzeichnet. Eine Anordnung wird unter Verwendung des GEAP-Programms, das von Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387–395 (1984) beschrieben ist, durchgeführt.
Tabelle 2
Vergleich der Arabidopsis-(SEQ ID NO: 4)- und Mais-(SEQ ID NO: 8)-Protox-2-Aminosäuresequenzen

Prozentwert der Ähnlichkeit: 75,889; Prozentwert der Identität: 57,905
Protox-2.Pep x Mzprotox-2.Pep

Beispiel 4: Isolierung eines kontaminierenden Hefe-Protox-Klons aus einer Arabidopsis-cDNA-Bibliothek
In einem Ansatz, seltene cDNAs mit Protox-Aktivität zu identifizieren, wurde ein zweiter Screen der pFL61-Arabidopsis-Bibliothek wie vorher durchgeführt, was wiederum zu hunderten von komplementären Klonen führte. Etwa 600 von diesen wurden einzeln auf "gridded" Platten aufgetragen und bei 28°C für 18 h inkubiert. Mit Kolonien/Plaques-Screen(NEN)-Membranen wurden zweifache Filterlifts nach den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Die Protox-1- und Protox-2-cDNAs wurden durch Verdau mit EcoRI/XhoI bzw. durch NotI aus ihren Vektoren entfernt. Die Inserts wurden durch Gelelektrophorese in 1,0% SeaPlaque GTG(FMC)-Agarose getrennt, ausgeschnitten und durch Zufallspriming ³²P-markiert (Life Technologies). Ein Satz an Lifts wurde mit jeder Sonde hybridisiert. Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren wie von Church und Gilbert, 1984, beschrieben.
Kolonien (ungefähr 20), die keine klare Hybridisierung an Protox-1 oder Protox-2 zeigen, wurden in Flüssigkultur amplifiziert und Plasmid-DNA wurde hergestellt. Die DNAs wurden mit NotI verdaut, doppelte Proben wurden an einem 1,0% Agarosegel laufen gelassen und dann wurde ein Southern-Blotting an einem Gene Screen Plus(NEN)-Filter [New England Nuclear] durchgeführt. Sonden der zwei bekannten Protoxgene wurden wie vorher markiert und hybridisiert. Es gab zwei identische Klone, die nicht Protox-1 oder Protox-2 waren. Es wurde gezeigt, dass dieser Klon zu der SASX38-Mutante rekomplementierte, obgleich er sehr langsam wuchs, er wurde Protox-3 genannt.
Protox-3, im pFL61-Vektor, wurde am 8. Juni 1994 als pWDC-5 (NRRL #B-21280) hinterlegt. Von dieser codierenden Sequenz wurde bestimmt, dass sie sich von Hefe-DNA ableitete, die als geringere Verunreinigung in der Arabidopsis-cDNA-Bibliothek vorlag. Die Hefe-DNA, die für Protox-3 codiert, war in pWDC-5 enthalten und ist in SEQ ID NO: 9 unten angegeben.
Beispiel 5: Beweis der Pflanzen-Protox-Klon-Empfindlichkeit für Protox-inhibierende Herbizide in einem bakteriellen System
Flüssigkulturen von Protox-1/SASX38, Protox-2/SASX38 und pBluescript/XL1-Blue wurden in L amp¹⁰⁰ wachsen gelassen. Einhundert Mikroliter-Aliquots jeder Kultur wurden auf L amp¹⁰⁰-Medium, das verschiedene Konzentrationen (1,0 nM bis 10 mM) eines für Protox inhibierenden Aryluracil-Herbizids der Formel XVII enthielt, plattiert. Es wurden doppelte Sätze an Platten für 18 Stunden bei 37°C entweder bei wenig Licht ("low light") oder in kompletter Dunkelheit inkubiert.
Der Protox⁺-E. coli-Stamm XL-1-Blue zeigt bei keiner Konzentration Empfindlichkeit gegenüber dem Herbizid, was mit der beschriebenen Resistenz des nativen bakteriellen Enzyms gegen ähnliche Herbizide übereinstimmt. Protox-1/SASX38 war deutlich empfindlich, wobei der Bakterienrasen durch geringe Inhibitorkonzentrationen wie 10 nM fast vollständig eliminiert wurde. Protox-2/SASX38 war ebenfalls empfindlich, aber nur bei einer höhen Konzentration (10 M) des Herbizids.
Der Effekt des Herbizids auf beide Pflanzenprotoxstämme war bei geringem Licht am dramatischsten, trat aber auch auf Platten auf, die ganz im Dunklen gehalten wurden. Die Toxizität der Herbizide wurde durch den Zusatz von 20 mg/ml Hematin zu den Platten vollständig eliminiert.
Die unterschiedliche Herbizidtoleranz zwischen den zwei Pflanzen-Protox-Stämmen ist wahrscheinlicher das Resultat einer unterschiedlichen Expression aus diesen zwei Plasmiden als einer inhärenten Differenz bei der Enzymempfindlichkeit. Protox-1/SASX38 wächst in einem beliebigen Häm-defizienten Medium viel langsamer als Protox-2/SASX38. Außerdem ist der MzProtox-2/SASX38-Stamm mit einer Wachstumsrate, die mit der von Arab-Protox-1/SASX38 vergleichbar ist, bei niedrigeren Konzentrationen (10 bis 100 nM) gegenüber einem Herbizid auch sehr empfindlich. Eine Anfangscharakterisierung des Hefe-Protox-3-Klons zeigte, dass er gegenüber einem Herbizid empfindlich ist.
Beispiel 6: Selektion auf Pflanzen-Protox-Gene, die gegenüber Protox-inhibierenden Herbiziden empfindlich sind, im E. coli-Expressionssystem
Inhibierung von Pflanzen-Protox-Enzymen in einem bakteriellen System ist für ein Screening auf Herbizid-resistente Mutationen in Pflanzengenen in großem Maßstab einsetzbar. Anfängliche Dosis-Antwort-Experimente, die durch Plattieren aus Flüssigkulturen durchgeführt wurden, führen zu "resistenten" Kolonien mit hoher Frequenz, selbst bei hohen Herbizidkonzentrationen. Diese Resistenz basierte nicht auf dem Plasmid, sondern basierte auf einem Retransformations/Herbizid-Empfindlichkeits-Assay. Eine Transformierung von Protox-Plasmiden in die SASX38-Mutante und direktes Plattieren auf Platten, die Herbizid enthalten, reduziert dieses Hintergrundproblem fast vollständig.
Die Pflanzen-Protox-Plasmide werden auf verschiedenen Wegen mutagenisiert, wobei veröffentlichte Verfahren für eine chemische Mutagenese (z.B. Natriumbisulfit (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457–468 (1983); Methoxylamin (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13: 1733–1745 (1985); Oligonukleotid-spezifische Sättigungsmutagenese (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 710–714 (1986); oder verschiedene Polymerase-Misincorporation-Strategien (siehe z.B. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588–1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64: 313–319 (1988); und Leung et al., Technique 1: 11–15 (1989)) veröffentlicht wurden. Die erwarteten Up-Promotor-Mutanten aus einer Ganzplasmid-Mutagenese werden eliminiert, indem die codierende Sequenz erneut in einen Wildtyp-Vektor kloniert wird und erneut getestet wird. Unter der Annahme, dass eine höhere Expression wahrscheinlich zu einem besseren Wachstum in Herbizid-Abwesenheit führt, ist auch ein visueller Screen auf Mutanten der codierenden Sequenz möglich.
Ein beliebiges Pflanzen-Protoxgen, das Herbizidresistenz in dem Bakteriensystem exprimiert, kann für eine optimale Expression manipuliert werden und in Pflanzen transformiert werden, wobei Standardtechniken, wie sie hierin beschrieben wurden, verwendet werden. Die resultierenden Pflanzen können dann mit Herbizid behandelt werden, um den Resistenzlevel, der durch das eingeführte Protoxgen verliehen wird, zu bestätigen und quantitativ zu bestimmen.
Beispiel 7: Konstrukte zur Expression von Herbizid-resistentem mikrobiellen Protox-Gen (Herbizid-resistenten mikrobiellen Protox-Genen) in Pflanzen
Die codierenden Sequenzen für das B. subtilis-Protox-Gen hemY (Hansson und Hederstedt, J. Bacteriol. 174: 8081 (1992); Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)) und für das E. coli-Protox-Gen hemG (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) wurden durch PCR-Amplifikation unter Standardbedingungen und flankierenden Primern, die aus den veröffentlichten Sequenzen entwickelt wurden, aus Laborstämmen isoliert. Von diesen Genen ist bekannt, dass sie für Herbizid-resistente Formen des Protox-Enzyms codieren.
Unter Verwendung von Standardtechniken der überlappenden PCR-Fusion (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)) wurden beide bakterielle Gene an zwei unterschiedliche Arabidopsis-Chloroplasten-Transit-Peptidsequenzen (CTPs) fusioniert. Die erste war die CTP aus der Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS, Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987)), die in das Stroma des Chloroplasten eintreten gelassen werden sollte.
Die zweite war die aus dem Arabidopsis-Plastocyanin-Gen (Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)), die ein zweigeteiltes Transit-Peptid hat. Der aminoterminale Teil dieser CTP targetiert das Protein in den Chloroplasten, wohingegen der Carboxyterminus es in die Thylakoidmembranen führt. Alle vier Genfusionen wurden hinter dem 2 × 35S-Promotor in einem binären Expressionsvektor, der zur Produktion von transgenen Pflanzen durch Agrobacterium-Transformation konzipiert ist, kloniert.
Nach Isolierung der Arabidopsis- und Mais-Protox-cDNAs kann auch das Chloroplasten-Transit-Peptid aus Protox-1 oder MzProtox-1 in der gleichen Weise wie oben mit den zwei bakteriellen Protoxproteinen fusioniert werden.
Die oben beschriebenen Vektoren können dann in die gewünschte Pflanzenspezies transformiert werden und die resultierenden Transformanten auf erhöhte Resistenz gegenüber Herbizid untersucht werden.
Beispiel 8: Domänenschalten zwischen Arabidopsis/B. subtilis-Genen, um chimäres, Herbizid-resistentes Protox zu erzeugen
Ein Ansatz, der zur Erzeugung eines Protoxgens eingesetzt werden kann, welches Herbizid-resistent ist und auch fähig ist, wirksame enzymatische Protox-Aktivität in einer Pflanze bereitzustellen, besteht darin, einen Teil (Teile) eines bakteriellen und Pflanzen-Protox-Gens zu verschmelzen. Die resultierenden chimären Gene können dann auf solche durchgemustert werden, die fähig sind, in einer Pflanzenzelle Herbizid-resistente Protox-Aktivität bereitzustellen. Beispielsweise sind die Arabidopsis- und die B. subtilis(hemY)-Protox-Peptidsequenzen mit Regionen hoher Homologie vernünftig colinear. Die codierende hemY-Sequenz wird in pBluescript kloniert und auf ihre Fähigkeit, Herbizid-resistente Protox-Aktivität in SASX38 zu exprimieren. Chimäre Protox-1/hemY-Gene werden unter Verwendung von Fusions-PCR-Techniken konstruiert, gefolgt von einer Ligation zurück in den pBluescript-Vektor. Der ursprüngliche Austausch erfolgt etwa in der Mitte der Proteine. Diese Fusionen werden auf Protox-Funktion durch Komplementierung getestet und dann durch Plattierung auf Herbizid mit intakten Protox-1- und hemY-Kontrollen auf Herbizid-Resistenz untersucht.
Beispiel 9: Produktion von Herbizid-toleranten Pflanzen durch Überexpression von Pflanzen-Protex-Genen
Um das Arabidopsis- oder Maisprotein in transgenen Pflanzen zu exprimieren, wurde die geeignete Volllängen-cDNA in den Pflanzenexpressionsvektor pCGN1761ENX, der wie folgt von pCGN1761 abgeleitet wird, insertiert. pCGN1761 wurde an seiner einmal vorkommenden EcoRI-Stelle verdaut und an ein doppelsträngiges DNA-Fragment ligiert, das aus zwei Oligonucleotiden der Sequenz 5'AAT TAT GAC GTA ACG TAG GAA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T 3' (SEQ ID NO: 11) und 5' AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3' (SEQ ID NO: 12) bestand. Das resultierende Plasmid pCGN1761ENX enthielt einmal vorkommende EcoRI-, NotI- und XhoI-Stellen, die zwischen einem duplizierten 35S-Promotor aus Blumenkohlmosaikvirus (Kay et al., Science 236: 1299–1302 (1987)) und den 3'-untranslatierten Sequenzen des tml-Gens von Agrobacterium tumefaciens liegen. Dieses Plasmid wird verdaut und an ein Fragment, das aus einem Restriktionsenzymverdau von einem der Plasmide, die eine Protox-cDNA tragen, stammt, ligiert, so dass es die vollständige Protox-cDNA trägt. Aus diesem Plasmid wird ein XbaI-Fragment ausgeschnitten, das die Arabidopsis-Protox-cDNA, flankiert von einem duplizierten 35S-Promotor, und die 3'-untranslatierten Sequenzen des tml-Gens von A. tumefaciens umfasst. Dieses XbaI-Fragment wird in den binären Vektor pCIB200 an seiner einmal vorkommenden XbaI-Stelle, die zwischen T-DNA-Grenzsequenzen liegt, insertiert. Das resultierende Plasmid, das pCIB200protox genannt wird, wird in den A. tumefaciens-Stamm CIB542 transformiert. Siehe z.B. Uknes et al., Plant Cell 5: 159–169 (1993).
Blattscheiben von Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc werden mit A. tumefaciens CIB542, das pCIB200IGPD beherbergt, infiziert, wie es von Horsch et al., Science 227: 1229 (1985) beschrieben ist. Kanamycin-resistente Schösslinge aus 15 unabhängigen Blattscheiben werden in Wurzelbildungsmedium übertragen, dann in Erde umgepflanzt und die resultierenden Pflanzen werden zur Reife im Gewächshaus wachsen gelassen. Samen aus diesen Pflanzen werden gesammelt und auf MS-Agarmedium, das Kanamycin enthält, keimen gelassen. Mehrere einzelne Kanamycin resistente Keimlinge aus jeder unabhängigen Primärtransformante werden im Gewächshaus zur Reife wachsen gelassen und ihre Samen werden gesammelt. Diese Samen werden auf MS-Agarmedium, das Kanamycin enthält, keimen gelassen.
Pflanzenlinien, die zu ausschließlich Kanamycin-resistenten Keimlingen führen, sind für das insertierte Gen homozygot und werden einer weiteren Analyse unterzogen. Blattscheiben von jeder der 15 unabhängigen transgenen Linien werden mit einer Papierstanzvorrichtung ausgeschnitten und auf MS-Agar, der unterschiedliche steigende Konzentrationen eines Protox-inhibierenden Herbizids enthält, gelegt.
Nach drei Wochen wurden zwei Sätze von 10 Scheiben aus jeder Linie gewogen und die Resultate wurden aufgezeichnet. Transgene Linien, die gegenüber dem Inhibitor resistenter sind als nicht-transformierte Wildtyp-Pflanzen werden für eine weitere Analyse selektiert.
RNA wird aus Blättern jeder dieser Linien extrahiert. Gesamt-RNA aus jeder unabhängigen homozygoten Linie und aus nicht-transgenen Kontrollpflanzen wird durch Agarosegelelektrophorese in Gegenwart von Formaldehyd getrennt (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Das Gel wird auf Nylonmembran (Ausuebel et al., oben) aufgetragen und mit der radioaktiv markierten Arabidopsis-Protox-cDNA hybridiziert. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind wie von Church und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991–1995 (1984) beschrieben. Der Filter wird autoradiographiert und intensive RNA-Banden, die dem Protoxtransgen entsprechen, werden in allen Herbizid-toleranten transgenen Pflanzenlinien detektiert.
Um die Resistenz der Protox-überexprimierenden Linie weiter zu beurteilen, werden Pflanzen im Gewächshaus wachsen gelassen und mit verschiedenen Konzentrationen eines Protox-inhibierenden Herbizids behandelt.
Beispiel 10: Wachstum von Tabakzellensuspensionskulturen
Medien:
MX1: Dieses Medium besteht aus Murashige- und Skoog("MS", T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15: 473–497, 1962)-Hauptsalzen, -Nebensalzen und Fe-EDTA (Gibco # 500-1117; 4,3 g/l), 100 mg/l Myoinositol, 1 mg/l Nikotinsäure, 1 mg/l Pyridoxin-HCl, 10 mg/l Thiamin-HCl, 2–3 g/l Saccharose, 0,4 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und 0,04 mg/l Kinetin, pH 5,8. Das Medium wird durch Autoklavieren sterilisiert.
N6: Dieses Medium umfasst Makroelemente, Mikroelemente und Fe-EDTA, wie sie von C-C. Chu et al., Scientia Sinica 18: 659 (1975) beschrieben sind, und die folgenden organischen Verbindungen: Pyridoxin-HCl (0,5 mg/l), Thiamin-HCl (0,1 mg/l), Nikotinsäure (0,5 mg/l), Glycin (2,0 mg/l) und Saccharose (30,0 g/l). Die Lösung wird autoklaviert. Der End-pH ist 5,6.
Bemerkungen: Makroelemente werden als 10-fach konzentrierte Stammlösung hergestellt und Mikroelemente werden als 1000-fach konzentrierte Stammlösung hergestellt. Eine Vitaminstammlösung wird normalerweise 100-fach konzentriert hergestellt.
In Suspension kultivierte Zellen von Nicotiana tabacum, Linie S3 [Harms und DiMaio, J. Plant Physiol. 137, 513–519, 1991] werden in flüssigem Kulturmedium MX1 wachsen gelassen. 100 ml-Erlenmeyer-Kolben, die 25 ml Medium MX1 enthalten, werden mit 10 ml einer Zellkultur, die vorher 7 Tage lang gewachsen war, inokuliert. Zellen werden bei 25°C im Dunklen auf einem Planetenschüttler bei 100 Upm (2 cm Abstand) inkubiert. Zellen werden in 7 Tagesintervallen durch Inokulieren einer Aliquotprobe in frisches Medium, durch Dekantieren oder Abpipettieren von etwa 90% der Zellsuspension, gefolgt von Ergänzen mit frischem Medium unter Erhalt des gewünschten Suspensionsvolumens, subkultiviert. 5–8 g Frischgewicht an Zellmasse werden innerhalb von 10 Wachstumstagen aus einem Inokulum von 250–350 mg Zellen produziert.
Beispiel 11: Produktion von Tabakzellkulturen, die gegenüber herbiziden Protox-Inhibitoren tolerant sind, durch Plattieren von Zellen auf verfestigtem Selektionsmedium
Zellen werden wie im Beispiel 10 vorwachsen gelassen. Zellen werden geerntet, indem Zellen sedimentieren gelassen werden oder aber durch kurze Zentrifugation bei 500 × g geerntet; das verbrauchte Kulturmedium wird entfernt. Zellen werden dann mit frischem Kulturmedium verdünnt, um so eine Zelldichte zu erhalten, die zur Zellplattierung geeignet ist, etwa 10.000 Kolonien bildende Einheiten pro ml. Zum Plattieren werden Zellen in einem kleinen Volumen an Medium (etwa 1 ml) gleichmäßig auf verfestigtem Kulturmedium (MX1, 0,8% Agar), das die gewünschte Konzentration des Inhibitors enthält, verteilt. Pro 10 cm-Petrischale werden etwa 20–30 ml Medium verwendet. Die geeignete Inhibitorkonzentration wird aus einer Dosis-Antwort-Kurve (Beispiel 14) bestimmt und ist wenigstens zweimal höher als der IC₅₀-Wert von empfindlichen Wildtyp-Zellen.
Kulturplatten, die Zellen auf Selektionsmedium verteilt enthalten, werden unter normalen Wachstumsbedingungen bei 25–28°C im Dunklen inkubiert, bis Zellkolonien gebildet sind. Auftauchende Zellkolonien werden in frisches Medium, das den Inhibitor in der gewünschten Konzentration enthält, übertragen.
In einer bevorzugten Modifikation des beschriebenen Verfahrens wird die vorgewachsene Suspension von kultivierten Zellen zuerst in einem kleinen Volumen an flüssigem Medium oben auf dem verfestigten Medium verteilt. Eine gleiche Menge an warmem flüssigen Agarmedium (1,2–1,6% Agar), das bei etwa 40°C geschmolzen gehalten wird, wird zugesetzt und die Platte wird leicht, aber unverzüglich verquirlt, um die Zellen gleichmäßig über die Mediumoberfläche zu verteilen und Zellen und Agarmedium zu vermischen, bevor sich das Medium verfestigt.
Alternativ werden die Zellen mit dem geschmolzenen Agarmedium vor dem Verteilen auf dem Selektionsmedium vermischt. Dieses Vermischen hat den Vorteil, dass die Zellen eingebettet werden und in einer dünnen Schicht verfestigten Mediums auf dem Selektionsmedium immobilisiert werden. Im Vergleich zum Einbetten von Zellen in das Gesamtvolumen von 20–30 ml wird für eine bessere Belüftung gesorgt.
Beispiel 12: Produktion von Tabakzellkulturen, die gegenüber einem herbiziden Protox-Inhibitor tolerant sind, durch Wachsen von Zellen in flüssigem Selektionsmedium
Zellen, die wie in Beispiel 10 kultiviert worden waren, werden bei einer geeigneten Zelldichte in flüssiges Medium MX1, das die gewünschte Konzentration eines herbiziden Protox-Inhibitors enthält, inokuliert. Zellen werden inkubiert und wie im Beispiel 10 wachsen gelassen. Zellen werden subkultiviert, wie es in Abhängigkeit von der Wachstumsrate geeignet ist, wobei nach einem Zeitraum von 7–10 Tagen frisches Medium verwendet wird, das die gewünschte Inhibitorkonzentration hat.
In Abhängigkeit von der verwendeten Inhibitorkonzentration kann das Zellwachstum langsamer sein als in Abwesenheit von Inhibitor.
Beispiel 13: Produktion von Tabakzellen mit erhöhten Leveln an Protox-Enzym
Um Zellkulturen oder Callus mit erhöhten Leveln an Protox-Enzym zu erhalten, werden Suspensionskulturen oder Callus schrittweise in zunehmend höhere Konzentrationen an herbizidem Protox-Inhibitor transferiert. Es werden insbesondere die folgenden Schritte durchgeführt:
Zellkolonien, die auf plattierten Zellen von Beispiel 11 auftreten, werden in flüssiges MX1-Medium transferiert, das dieselbe Konzentration an Protox-Inhibitor enthält, wie sie bei der Selektion nach Beispiel 11 verwendet wird, um Suspensionskulturen zu bilden. Alternativ werden selektierte Zellsuspensionskulturen von Beispiel 12 in flüssiges MX1- Medium subkultiviert, das dieselbe Konzentration an Protox-Inhibitor enthält, wie sie zur Selektion nach Beispiel 12 verwendet wird.
Kulturen werden in wöchentlichen Intervallen 1–20-mal subkultiviert und werden dann in MX1-Medium, das die nächsthöhere Herbizidkonzentration enthält, subkultiviert. Die Zellen werden für 1–10 Subkulturen in Medium kultiviert, dass dieser höhere Konzentration an Herbizid enthält. Die Zellen werden dann in MX1-Medium transferiert, das die nächsthöhere Konzentration an Herbizid enthält.
Alternativ werden Stücke von selektiertem Callus von Beispiel 11 in verfestigtes MX1-Medium, das mit der gewünschten Herbizidkonzentration supplementiert ist, transferiert. Eine Übertragung zu höheren Herbizidkonzentrationen folgt dem Verfahren, das in dem vorangehenden Paragraph ausgeführt ist, ausgenommen, dass verfestigtes Medium verwendet wird.
Beispiel 14: Messung des Herbiziddosis-abhängigen Wachstums von Zellen in Suspensionskulturen
Um eine Dosis-Antwort-Kurve zu erhalten, wird das Zellwachstum bei verschiedenen Herbizidkonzentrationen bestimmt. Suspensionskulturzellen von gegen herbiziden Protox-inhibitorempfindlichen Wildtyp-Tabakzellen S3 und Herbizid-toleranter, selektierter oder transgener Zellen S3 und Herbizid-toleranter, selektierter oder transgener Zellen wurden wie in Beispiel 11 bei einer hohen Zelldichte für 2–4 Tage in flüssigem Medium vorwachsen gelassen. Die Zellen werden von verbrauchtem Medium frei gewaschen und frisches Medium ohne Herbizid wird zugesetzt, um die gewünschte Zelldichte zu ergeben (etwa 150 mg FW-Zellen pro ml Suspension). Eine Probe von 2,5 ml Zellsuspension, die etwa 250–300 mg FW-Zellen enthält, wird dann in etwa 30 ml flüssiges Medium gewünschter Herbizidkonzentration, das in 100 ml Erlenmeyer-Kolben enthalten war, inokuliert. Es wird darauf geachtet, dieselbe Menge an Zellen in jedem Kolben zu inokulieren. Jeder Kolben enthält ein gleiches Mediumvolumen. 3–6 Replikatkolben werden pro Herbizidkonzentration inokuliert. Die Herbizidkonzentration wird von Null (= Kontrolle), 0,1 ppb, 0,3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1000 ppb, 3000 ppb und 10.000 ppb ausgewählt. Mehrere Proben an inokulierten Zellen werden zur Zeit der Inokulierung entnommen, um die Masse an inokulierten Zellen pro Kolben zu bestimmen.
Zellen werden dann zum Wachstum unter kontrollierten Bedingungen bei 28°C im Dunklen für 10 Tage inkubiert. Die Zellen werden geerntet, indem die Inhalte jedes Kolbens auf eine Filterpapierscheibe, die mit einer Vakuumsaugvorrichtung angeschlossen ist, gegossen werden, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen und eine Masse aus vernünftig trocknen frischen Zellen zu erhalten. Die frische Zellmasse wird gewogen. Das Probentrockengewicht kann nach Trocknung erhalten werden.
Das Zellwachstum wird bestimmt und als Zellzunahme innerhalb von 10 Tagen ausgedrückt und als Prozentwert bezüglich der Zellen, die in Abwesenheit von Herbizid gewachsen sind, gemäß der folgenden Formel ausgedrückt: (Endmasse von mit Herbizid-gewachsenen Zellen minus Inokulummasse × 100, geteilt durch die Endmasse von Zellen, die ohne Herbizid gewachsen sind, minus Inokulummasse). IC₅₀-Werte werden aus Diagrammen aufgetragener Daten (relative Zellmasse vs. Herbizidkonzentration) bestimmt. IC₅₀ bezeichnet die Herbizidkonzentration, bei der das Zellwachstum 50% des Kontrollwachstums ist (Zellen, die in Abwesenheit von Herbizid gewachsen sind).
In einer Modifikation des Verfahrens werden mehrere Callusstücke, die aus einer Herbizid-resistenten Zellkultur stammen, wie sie in den Beispielen 11 und 13 erhalten wurden, auf verfestigtes Callus-Kulturmedium, das die unterschiedlichen Herbizidkonzentrationen enthält, übertragen. Das relative Wachstum wird nach einem Kulturzeitraum von 2–6 Wochen bestimmt, indem Callus-Stücke gewogen werden und mit einer Kontrollkultur, die in Medium ohne Herbizid gewachsen ist, verglichen werden. Allerdings ist das Suspensionsverfahren wegen seiner größeren Genauigkeit bevorzugt.
Beispiel 15: Bestimmung der Kreuztoleranz
Um den Grad zu bestimmen, zu dem Zellentoleranz gegenüber analogen oder anderen Herbiziden zeigen, wird Beispiel 14 wiederholt, indem Zellen in steigenden Konzentrationen ausgewählter Herbizide wachsen gelassen werden. Das relative Wachstum der Zellen und ihres IC₅₀-Werts wird zum Vergleich für jedes Herbizid bestimmt.
Beispiel 16: Bestimmung der Stabilität des Herbizidtoleranzphänotyps über die Zeit
Um zu bestimmen, ob der Herbizid-tolerante Phänotyp einer Zellkultur im Lauf der Zeit aufrechterhalten werden kann, werden Zellen aus Herbizid-haltigem Medium in Medium ohne Herbizid transferiert. Die Zellen werden wie in Beispiel 10 beschrieben, in Abwesenheit von Herbizid über einen Zeitraum von 3 Monaten wachsen gelassen, wobei ein regelmäßiges Subkultivieren in geeigneten Intervallen (7–10 Tage für Suspensionskulturen; 3 bis 6 Wochen für Callus-Kulturen) angewendet wird. Eine bekannte Menge an Zellen wird dann zurück in Herbizid-haltiges Medium übertragen und für 10 Tage (Suspensionskulturen) oder 4 Wochen (Callus-Kulturen) kultiviert. Das relative Wachstum wird wie in Beispiel 14 bestimmt.
Beispiel 17: Induktion und Kultur von embryogenem Callus aus Maisscutellumgewebge
Ähren werden von selbstbestäubten Maispflanzen der Inzuchtlinie Funk 2717 12–14 Tage nach Bestäubung geerntet. Spelzen werden entfernt und die Ähren werden für etwa 15 min durch Schütteln in einer 20%igen Lösung handelsüblicher Chlorox-Bleiche mit einigen Tropfen Detergens, das zur besseren Benetzung zugesetzt wird, sterilisiert. Ähren werden dann mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Alle weiteren Schritte werden aseptisch unter einer sterilen Luftströmungshaube durchgeführt. Embryos mit einer Länge von 1,5–2,5 mm werden mit einem Spatel von den Körnern entfernt und mit der Embryoachse nach unten in MS-Kulturmedium gelegt, das 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 3% Saccharose enthält und mit 0,24% Gelrite^® verfestigt ist.
Embryogener Callus bildet sich auf dem Scutellumgewebe der Embryos innerhalb von 2–4 Wochen Kultur bei etwa 28°C im Dunklen. Der Callus wird vom Explantat entfernt und in frisches verfestigtes MS-Medium, das 2 mg/l 2,4-D enthält, transferiert. Die Subkultur von embryogenem Callus wird in wöchentlichen Intervallen wiederholt. Nur Callusteile, die embryogene Morphologie haben, werden subkultiviert.
Beispiel 18: Selektion von Maiszellkulturen, die gegenüber herbiziden Protox-Inhibitoren resistent sind.

a) Selektion unter Verwendung von embryogenem Callus: Embryogener Callus von Beispiel 17 wird auf Calluserhaltungsmedium übertragen, das aus N6-Medium besteht, welches 2 mg/l 2,4-D, 3% Saccharose und Protoxinhibitor in einer Konzentration, die zur Verzögerung von Wachstum ausreicht, die Embryogenität der Kultur aber nicht beeinträchtigt, enthält und mit 0,24% Gelrite^® verfestigt ist. Zur Erhöhung der Häufigkeit von Herbizid-toleranten Mutationen können Kulturen vor Selektion mit einem chemischen Mutagen, z.B. Ethylmethansulfonat, oder einem physikalischen Mutagen, z.B. UV-Licht, bei einer Konzentration gerade unterhalb der Konzentration, bei der eine Wachstumsinhibierung detektiert wird, wie sie in Beispiel 14 bestimmt wird, vorbehandelt werden. Kulturen werden im Dunklen bei 28°C inkubiert. Nach 14-tägigem Wachstum wird Callus auf frisches Medium derselben Zusammensetzung übertragen. Nur Kulturen mit der gewünschten embryogenen Morphologie, bekannt als brüchiger embryogener Callus mit Morphologie des Typs II werden subkultiviert. Kulturen werden vermehrt, indem sie in wöchentlichen Intervallen für 2–10 Subkulturen frisches Medium subkultivert werden, wodurch nur die am schnellsten wachsenden Kulturen subkultiviert werden. Der schnellwachsende Callus wird dann auf Calluserhaltungsmedium übertragen, das ein Protox-inhibierendes Herbizid einer geeigneten Konzentration in Beispiel 11 definiert enthält. Wenn Callus bei dieser Herbizidkonzentration gut wächst, wird der Callus, üblicherweise nach etwa 5–10 wöchentlichen Subkulturen, auf Calluserhaltungsmedium übertragen, das eine 3-fach höhere Konzentration an Inhibitor enthält, und subkultiviert, bis eine gute wachsende Kultur erhalten wird. Dieser Prozess wird unter Verwendung von Medium, das Protoxinhibitor in einer Konzentration, die 10 Mal höher als die ursprüngliche geeignete Konzentration, enthält, wiederholt und wiederum mit Medium, das 20-fach und 40-fach höhere Konzentrationen enthält. Wenn ausreichend Callus produziert worden ist, wird dieser auf Regenerationsmedium übertragen, das zur Embryoreifung und Pflanzenregeneration geeignet ist. Embryogener Callus, der auf jeder der verwendeten Herbizidkonzentrationen wächst, wird auf Regenerationsmedium übertragen.
b) Selektion unter Verwendung embryogener Suspensionskulturen: Embryogene Suspensionskulturen von Mais Funk-Inzuchtlinie 2717 werden entsprechend Beispiel 24 entwickelt und durch Subkultur in wöchentlichen Intervallen auf frisches flüssiges N6-Medium, das 2 mg/l 2,4-D enthält, gehalten. Zur Erhöhung der Häufigkeit von Herbizid toleranten Mutationen, können Kulturen zu diesem Zeitpunkt mit einem chemischen Mutagen, z.B. Ethylmethansulfonat, in einer Konzentration genau unter der Konzentration, an der eine Wachstumsinhibierung detektiert wird, wie es in Beispiel 14 bestimmt wird, behandelt werden. Zur Selektion werden die Kulturen auf flüssiges N6-Medium, das 2 mg/l 2,4-D und eine Konzentration an Inhibitor, die ausreichend, um das Wachstum zu verzögern, enthält, das aber die Embryogenität der Kultur nicht beeinträchtigt, übertragen. Kulturen werden an einem Schüttler mit 120 U/min bei 28°C im Dunklen wachsen gelassen. Das Medium wird in wöchentlichen Intervallen entfernt und frisches Medium wird zugesetzt. Die Kulturen werden mit Kulturmedium entsprechend ihrem Wachstum verdünnt, um etwa 10 ml gepacktes Zellvolumen pro 50 ml Medium aufrecht zu erhalten. Bei jeder Subkultur werden Kulturen untersucht und nur schnellwachsende Kulturen mit der gewünschten brüchtigen embryogenen Morphologie werden für eine weitere Subkultur zurückgehalten. Nach 2–10 Subkulturen in N6-Medium nehmen Kulturen durch wöchentliche Subkultur in der Wachstumsgeschwindigkeit wenigstens auf das 2- bis 3-Fache zu. Die Kulturen werden dann auf N6-Medium, das 2 mg/l 2,4-D und eine 3-fach höhere Dosis an Inhibitor als ursprünglich verwendet enthält, übertragen. Wachsende Kulturen werden wiederholt in diesem Medium für weitere 2–10 Subkulturen wie oben beschrieben subkultiviert. Schnellwachsende Kulturen mit der gewünschten krümmeligen embryogenen Morphologie werden zur weiteren Subkultur selektiert. Schnellwachsende Kulturen werden dann auf N6-Medium übertragen, das 2 mg 2,4-D und eine 30-fach höhere Konzentration an Inhibitor als ursprünglich verwendet enthält, und der Prozess der Subkultivierung wachsender Kulturen mit der gewünschten krümeligen embryogenen Morphologie wird für 2–10 Subkulturen wiederholt, bis schnellwachsende Kulturen erhalten werden. Diese Kulturen werden dann auf N6-Medium übertragen, das 2 mg/l 2,4-D und eine 30-fach höhere Konzentration an Inhibitor als ursprünglich verwendet enthält.

Zur Pflanzenregeneration aus jeder embryogenen Suspensionskultur, die mit dem oben genannten Herbizidkonzentrationslevel selektiert wurden, werden die Kulturen zuest auf N6-Medium transferiert, das mit 0,24% Gelrite^® verfestigt ist und 2 mg/l 2,4-D und gegebenenfalls die Inhibitorkonzentration, in der die Kulturen gewachsen waren, enthält, transferiert, um embryogenen Callus zu produzieren. Der embryogene Callus wird auf frischem Calluserhaltungsmedium subkultiviert, bis eine ausreichende Callusmenge zur Regeneration erhalten ist. Nur Kulturen mit der gewünschten embryogenen Morphologie werden subkultiviert.
Beispiel 19: Regeneration von Maispflanzen aus ausgewählter Callus- oder Suspensionskultur
Pflanzen werden aus selektierten embryogenen Calluskulturen von Beispiel 13 durch Übertragung auf frisches Regenerationsmedium regeneriert. Die verwendeten Regenerationsmedien sind: 0N6-Medium, bestehend aus N6-Medium, dem 2,4–3 fehlt, oder N61, bestehend aus N6-Medium, enthaltend 0,25 mg/l 2,4-D und 10 mg/l Kinetin (6-Furfurylaminopurin), oder N62, bestehend aus N6-Medium, das 0,1 mg/l 2,4-D und 1 mg/l Kinetin enthält, wobei alle mit 0,24% Gelrite^® verfestigt wurden. Kulturen werden bei 28°C im Licht (16 h pro Tag mit 10–100 μEinsteins/m²·s aus weißen Fluoreszenzlampen) wachsen gelassen. Die Kulturen werden alle 2 Wochen auf frisches Medium subkultiviert. Innerhalb von 3–8 Wochen entwickeln sich Pflänzchen. Pflänzchen mit einer Größe von mindestens 2 cm werden vom anhaftenden Callus befreit und auf Wurzel-begünstigendes Medium transferiert. Es werden unterschiedliche Wurzel fördernde Medien verwendet. Die Medien bestehen aus N6- oder MS-Medium, denen Vitamine fehlen, mit der üblichen Menge an Salzen oder mit auf die Hälfte reduzierten Salzen, Saccharose, die auf 1 g/l reduziert ist, und denen außerdem entweder das Wachstum regulierende Verbindungen fehlen oder die 0,1 mg/l einer Naphthalinessigsäure enthalten. Sobald sich ausreichend Wurzeln entwickelt haben, werden die Pflänzchen auf ein Topfgemisch übertragen, das aus Vermiculit, Torfmus und Gartenerde besteht, umgepflanzt. Beim Umpflanzen wird der gesamte verbleibende Callus weggeschnitten, der gesamte Agar wird abgespült und die Blätter werden etwa auf die Hälfte zugeschnitten. Pflänzchen werden im Gewächshaus zuerst einige Tage mit einem umgekehrten klaren Kunststoffbecher bedeckt, um Feuchtigkeit zurückzuhalten und ein Wachsen unter Schatten zu ermöglichen, wachsen gelassen. Nach der Akklimatisierung werden die Pflanzen umgetropft und zur Reife wachsen gelassen. Peters-Dünger 20-20-20 [Grace Sierra] wird verwendet, um die Entwicklung gesunder Pflanzen sicherzustellen. Blühende Pflanzen werden bestäubt, vorzugsweise selbstbestäubt.
Beispiel 20: Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren
Zur Pflanzentransformation sind zahlreiche Transformationsvektoren verfügbar, und die Gene der Erfindung können in Verbindung mit beliebigen derartigen Vektoren eingesetzt werden. Die Vektorselektion zur Verwendung wird von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielspezies zur Transformation abhängen. Für bestimmte Zielspezies können unterschiedliche antibiotische oder herbizide Selektionsmarker bevorzugt sein. Selektionsmarker, die routinemäßig bei der Transformation verwendet werden, umfassen das nptII-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandten Antibiotika verleiht (Messing & Vierra, Gene 19: 259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184–187 (1993)), das bar-Gen, das Resistenz gegenüber dem Herbizidphosphinothricin verleiht (white et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990); Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625–631 (1990)), das hph-Gen, das Resistenz gegenüber dem Antibiotika Hygromycin verleiht (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929–2931) und das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099–1104 (1983)).
(1) Konstruktion von Vektoren, die zur Agrobacterium-Transformation geeignet sind.
Zur Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens sind viele Vektoren verfügbar. Diese tragen typischerweise wenigstens eine T-DNA-Grenzsequenz und umfassen Vektoren, z.B. pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Unten wird die Konstruktion von zwei typischen Vektoren beschrieben.
Konstruktion von pCIB200 und pCIB2001
Die binären Vektoren pCIB200 und pCIB2001 werden für die Konstruktion von rekombinanten Vektoren zur Verwendung mit Agrobacterium verwendet; sie wurden wie folgt konstruiert. pTJS75kan wurd durch NarI-Verdau von pTJS75 (Schmidhauser & Helsinki, J. Bacteriol. 164: 446–455 (1985)), der das Ausschneiden des Tetracyclin-Resistenzgens ermöglicht, gefolgt von Insertion eines AccI-Fragments aus pUC4K, das ein NPTII trägt (Messing & Vierra, Gene 19: 259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184–187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266–276 (1990)), geschaffen. XhoI-Linker wurden an das EcoRV-Fragment von pCIB7 ligiert, welches die linke und rechte T-DNA-Grenze, ein Pflanzen selektivierbares chimäres nos/nptll-Gen und den pUC-Polylinker enthält (Rothstein et al., Gene 53: 153–161 (1987)), ligiert; das XhoI-verdaute Fragment wurde in SalI-verdautes pTJS75kan kloniert, um pCIB200 zu erzeugen (siehe auch EP 0 332 104 , Beispiel 19 [1338]). pCIB200 enthält die folgenden einmal vorkommenden Polylinker-Restriktionstellen: EcoRI, SstI, KpnI, BgIII, XbaI und SalI. pCIB2001 ist ein Derivat von pCIB200, das durch die Insertion zusätzlicher Restriktionsstellen in den Polylinker gebildet wird. Einmal vorkommende Restriktionsstellen im Polylinker von pCIB2001 sind EcoRI, SstI, KpnI, BgIII, XbaI, SaII, MluI, BcII, AvrII, ApaI, HpaI und StuI. pCIB2001 hat zusätzlich zu diesen einmal vorkommenden Restriktionsstellen auch Pflanzen- und Bakterien-Kanamycinselektion, linke und rechte T-DNA-Grenzen zur Agrobacterium-vermittelten Transformation, die von RK2-abgeleitete trfA-Funktion zur Mobilisierung zwischen E. coli und anderen Wirten, und die OriT- und OriV-Funktionen ebenfalls aus RK2, der pCIB2001-Polylinker ist für Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten, geeignet.
Konstruktion von pCIB10 und Hygromycin-Selektionsderivaten davon
Der binäre Vektor pCIB10 enthält ein Gen, das für Kanamycinresistenz zur Selektion in Pflanzen codiert, rechte und linke T-DNA-Sequenzen und inkorporiert Sequenzen aus dem Plasmid pRK252 für einen weiten Wirtsbereich, der eine Replikation sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium ermöglicht. Seine Konstruktion ist bei Rothstein et al., Gene 53: 153–161 (1987) beschrieben. Es wurden verschiedene Derivate von pCIB10 konstruiert, die das Gen für Hygromycin B-Phosphotransferase inkorporieren, was von Gritz et al., Gene 25: 179–188 (1983)) beschrieben wurde. Diese Derivate ermöglichen eine Selektion von transgenen Pflanzenzellen an Hygromycin allein (pCIB743) oder Hygromycin und Kanamycin (pCI715, pCIB717) [Rothstein et al., Gene 53: 153–161 (1987)].
(2) Konstruktion von Vektoren, die für eine Nicht-Agrobacterium-Transformation geeignet sind
Transformation ohne die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens umgeht das Erfordernis für T-DNA-Sequenzen im gewählten Transformationsvektor und folglich können Vektoren, denen diese Sequenzen fehlen, zusätzlich zu Vektoren, z.B. den oben beschriebenen, die T-DNA-Sequenzen enthalten, verwendet werden. Transformationstechniken, die nicht auf Agrobacterium beruhen, umfassen Transformation über Partikelbeschuss, Protoplastenaufnahme (z.B. PEG und Elektroporation) und Mikroinjektion. Die Vektorwahl hängt in großem Maße von der bevorzugten Selektion nach der Spezies, die transformiert wird, ab. Unten wird die Konstruktion einiger typischer Vektoren beschrieben.
Konstruktion von pCIB3064
pCIB3064 ist ein von pUC abgeleiteter Vektor, der für direkte Gentransfertechniken in Kombination mit Selektion durch das Herbizid Basta (oder Phosphinothricin) geeignet ist. Das Plasmid pCIB246 umfasst den CaMV 35S-Promotor in funktioneller Fusion an das E. coli/GUS-Gen und den CaMV 35S-Transkriptionsterminator und ist in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/07278 beschrieben. Der 35S-Promotor dieses Vektors enthält zwei ATG-Sequenzen 5' von der Startstelle. Diese Stellen werden unter Verwendung von Standard-PCR-Techniken derart mutiert, dass die ATGs entfernt werden und die Restriktionsstellen SspI und PvuII gebildet werden. Die neuen Restriktionsstellen waren 96 und 37 bp von der einmal vorkommenden SalI-Stelle und 101 und 42 bp von der tatsächlichen Startstelle entfernt. Das resultierende Derivat von pCIB246 wurde pCIB3025 genannt. Das GUS-Gen wurde dann durch Verdau mit SalI und SacI herausgeschnitten und die Termini wurden geglättet und unter Bildung von Plasmid pCIB3060 religiert. Das Plasmid pJIT82 wird vom John Innes Cedntre Norwich erhalten, und das 400 bp-Smal-Fragment, das das bar-Gen von Streptomyces viridochromogenes enthält, wurde ausgeschnitten und in die HpaI-Stelle von pCIB3060 insertiert (Thompson et al., EMBO J. 6: 2519–2523 (1987)). Dieses erzeugte pCIB3064, das das bar-Gen unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und Terminators zur Herbizidselektion, ein Gen für Ampicillin-Resistenz (zur Selektion in E. coli) und einen Polylinker mit den einmal vorkommenden Stellen SphI, Pstl, HindIII und BamHI umfasst. Dieser Vektor ist für die Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten, geeignet.
Konstruktion von pSOG19 und pSOG35
pSOG35 ist ein Transformationsvektor, der das E. coli-Gen Dihydrofulatreduktase (DHFR) als selektierbaren Marker, der Resistenz gegen Methotrexat verleiht, verwendet. PCR wurde verwendet, um den 35S-Promotor (ungefähr 800 bp), Intron 6 aus dem Mais-Adh1-Gen (ungefähr 550 bp) [Lou et al., Plant J. 3: 393–403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12: 3983–4000, 1984] und 18 bp der untranslatierten GUS-Leadersequenz aus pSOG10 zu amplifizieren. Ein 250 bp-Fragment, das das E. coli Dihydrofolat-Reduktase-Typ II-Gen codiert, wurde ebenfalls durch PCR amplifiziert, und diese zwei PCR-Fragmente wurden mit einem Sacl-Pstl-Fragment aus pB1221 (Clontech), das die pUC19-Vektorhauptkette und den Nopalin-Synthaseterminator umfasste, kombiniert. Die Kombination bzw. der Zusammenbau dieser Fragmente erzeugte pSOG19, das den 35S-Promotor in Fusion mit der Intron 6-Sequenz, den GUS-Leader, das DHFR-Gen und den Nopalinsynthaseterminator enthält. Ein Ersetzen des GUS-Leaders in pSOG19 durch die Leadersequenz von chlorotischem Scheckungsvirus von Mais (MCMV) bildete den Vektor pSOG35. pSOG19 und pSOG35 tragen das pUC-Gen für Ampicillinresistenz und haben HindIII, SphI, PstI und EcoRI-Stellen, die für die Klonierung von Fremdsequenzen verfügbar sind.
pSOG 10
Dieser β-Glucuronidase(GUS)-Expressionsvektor stammte aus Plasmid pBI121, bezogen von Clonetech Laboratories, Palo Alto, Kalifornien. Intron 6 des Mais-Adh1-Gens wurde durch PCR aus Plasmid pB428, beschrieben in Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81: 4125–4128 (1987), unter Verwendung der Oligonukleotidprimer SON0003 und SON0004 amplifiziert.
Das PCR-Reaktionsprodukt wurde mit Restriktionsendonuclase BamHI verdaut, wobei die BamHI-Stelle an das 5'-Ende jedes PCR-Primers angefügt wurde. Das resultierende DNA-Fragment wurde an einem Agarosegel gereinigt und in die BamHI-Stelle von pBI121 ligiert, die zwischen dem CaMV35S-Promotor und dem GUS-Gen ist. Die ligierte DNA wurde in E. coli transformiert und Klone mit dem Adh1-Intron 6 in derselben Orientierung wie das GUS-Gen wurden durch Restriktionsverdau identifiziert.
pSOG 19
Dieser Dihydrofolat-Reduktase(DHFR)-Expressionsvektor wurde durch Fusionieren des 35S-Promotors und Adh1-Intron 6 von pSOG10 an das DHFR-Gen aus Plasmid pHCO, wie in Bourouis und Jarry, EMBO J. 2: 1099–1104 (1983) beschrieben, abgeleitet. Der 35S-Promotor und das Adh1-Intron 6 wurden durch PCr-Amplifikation des Fragments aus pSOG10 unter Verwendung der Primer SON0031 und SON0010 produziert.
Das resultierende Fragment wurde mit Restriktionsendonukleasen PstI und BspHI verdaut und an Agarosegel gereinigt.
Die für DHFR codierende Region wurde durch PCR-Amplifikation von pHCO unter Verwendung der Primer SON0016 und SON0017 produziert.
Das resultierende Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen NsoI und SacI verdaut und an einem Agarosegel gereinigt.
Die zwei oben beschriebenen Fragmente wurden in ein Vektorfragment ligiert, das aus pBI121 durch Verdau mit Restriktionsindonucleasen PstI und SacI und Reinigung des 3 kb-Fragments, das die Nos-Terminatorregion und pUC19-Region von pBI121 enthielt, an Agarosegel hergestellt worden war, liegiert. Diese Drei-Wege-Ligation fusionierte den 35S-Promotor-AdhI-Intron 6-DHFR-Gen-Nos-Terminator in korrekter Folge und Orientierung zur funktionellen Expression in Pflanzen.
pSOG30
Dieser GUS-Expressionsvektor wurde von pSOG 10 durch Insertion des chlorotischen Scheckungsvirus von Mais(MCMV)-Leaders, beschrieben in Lommel et al., Virology 181: 382–385 (1991,) in den 35S-GUS-Gen-nicht-translatierten Leader durch eine Drei-Wege-Ligation abgeleitet.
Beide Stränge der 17 bp-MCMV-Capsid-Protein-Leadersequenz plus geeigneter Restriktionsendonukleasestellen wurden synthetisiert und annealed. Das resultierende doppelsträngige Fragment wurde mit BamHI und NcoI verdaut und an einem Acrylamidgel gereinigt.
Die für das GUS-Gen codierende Region wurde durch PCR amplifiziert, wobei die Primer SON0039 und SON0041 und pBI121 als Matrize verwendet wurden.
Diese Primer fügten eine NcoI-Stelle an das 5'-Ende von GUS und eine SacI-Stelle an das 3'-Ende von GUS. Das resultierende Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und SacI verdaut und an einem Agarosegel gereinigt.
Das GUS-Gen wurde durch Verdau mit Restriktionsendonuklease SacI und partiellem Verdau mit Restriktionsendonuklease BamHI aus dem Plasmid pSOG 10 entfernt. Der resultierende Vektor, der eine BamHI-Stelle und SacI-Stelle hat, in den eine codierende Region hinter dem 35S-Promotor-Adh1-Intron 6 reinsertiert wurde, wurde an einem Agarosegel gereinigt.
Die drei oben beschriebenen Fragmente wurden in einer Dreiwegeligation ligiert, um eine Genfusion mit der folgenden Struktur zu produzieren: 35S-Promotor-Adh1-Intron 6-MCMV-Leader-GUS-Nos-Terminator, alle in der pUC19-Vektor-Hauptkette.
pSOG35
Der DHFR-selektierbare Markervektor ist mit pSOG19 identisch, außer dass der MCMV-Leader in den nicht-translatierten Leader des DHFR-Gens insertiert ist, um eine Translation zu verstärken. ER wurde in zwei Schritten gebildet. Zuerst wurde die für GUS codierende Region in pSOG32, ein Vektor identisch mit pSOG30, außer dass er einen modifizierten Adh-Promotor anstelle von 35S enthält, durch eine für DHFR codierende Region aus pSOG19 ersetzt, indem GUS mit NcoI und SacI ausgeschnitten wurde und als NcoI-SacI-Fragment in die DHFR ligiert wurde. Dies führte zu dem Vektor pSOG33, der die Struktur Adh-Promotor-Adh1-Intron 6-MCMV-Leader-DHFR-codierende Region-Nos-Terminator hat, wobei eine BglII-Stelle zwischen dem Promotor und Intron ist und eine SacI-Stelle zwischen der codierenden Region und dem Terminator ist. Das BglII-SacI-Fragment wurde durch Verdau mit Restriktionsendonuclease und Agarosegelreinigung isoliert und in die BamHI- und SacI-Stellen von pSOG30 ligiert, wobei die Adh1-IntronZ6-MCMV-Leader-GUS-codierende Region von pSOG30 durch Adh1-Intron 6-MCMV-Leader-DHFR-codierende Region von pSOG33 ersetzt wurde.
Beispiel 21: Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten
Gensequenzen, die zur Expression in transgene Pflanzen bestimmt sind, werden zunächst in Expressionskassetten hinter einem geeigneten Promotor und stromabwärts zu einem geeigneten Transkriptionsterminator angeordnet. Diese Expressionskassetten können dann in einfacher Weise auf die Pflanzentransformationsvektoren, beschrieben oben in Beispiel 19, übertragen werden.
Promotorselektion
Die Selektion eines Promotors, der in Expressionskassetten verwendet wird, wird das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des Transgens in der transgenen Pflanze bestimmen. Selektierte Promotoren werden transgene in spezifischen Zelltypen (z.B. Blattepidermzellen, Mesophyllzellen, Wurzelcortexzellen) oder in spezifischen Geweben oder Organen (Wurzeln, Blätter oder Blumen z.B.) exprimieren, und diese Selektion wird dem gewünschten Expessionsort des Transgens widerspiegeln. Alternativ kann der selektierte Promotor eine Expression des Gens unter einem durch Licht induzierten oder anderen zeitlich regulierten Promotor steuern. Eine weitere Alternative besteht darin, dass der ausgewählte Promotor chemisch reguliert wird. Dies würde die Möglichkeit der Induzierung einer Expression des Transgens nur wenn es gewünscht und durch Behandlung mit einem chemischen Inducer bewirkt wird, bereitstellen.
Transkriptionale Terminatoren
Eine Vielfalt von transkriptionalen Terminatoren ist zur Verwendung in Expressionskassetten verfügbar. Diese sind für die Termination der Transkription über das Transgen hinaus und seine korrekte Polyadenylierung verantwortlich. Geeignete transkriptionale Terminatoren und solche, von denen bekannt ist, dass sie in Pflanzen funktionieren, umfassen den CaMV 35S-Terminator, den tml-Terminator, den Nopalinsynthase-Terminator, den Erbsen-rbcS E9-Terminator. Diese können sowohl in Monocotylen wie auch Dicotylen eingesetzt werden.
Sequenzen für die Verstärkung oder Regulierung der Expression
Es wurden zahlreiche Sequenzen gefunden, die eine Genexpression innnerhalb der transkriptionalen Einheit verstärken, und diese Sequenzen können in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Genen eingesetzt werden, um ihre Expression in transgenen Pflanzen zu verstärken.
Es wurden verschiedene Intronsequenzen zur Verstärkung der Expression insbesondere in monocotylen Zellen beschrieben. Beispielsweise wurde festgestellt, dass die Introns des Mais-Adh1-Gens die Expression des Wildtypgens unter seinem verwandten Promotor bei Einführung in Maiszellen deutlich verstärken. Es wurde festgestellt, Dass Intron 1 besonders wirksam ist und die Expression in Fusionskonstrukten mit dem Chloramphenicolacetyltransferasegen verstärkt (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183–1200 (1987)). In dem selben experimentellen System hatte das Intron aus dem Mais-bronze1-Gen ähnliche Wirkung bei der Verstärkung der Extraktion (Callis et al., s.o.) Intronsequenzen wurden routinemäßig in Pflanzentransformationsvektoren, typischerweise im nicht-translatierten Leader, eingebaut.
Von einer Reihe nicht-translatierter Leadersequenzen, die von Viren stammen, ist auch bekannt, dass sie eine Expression verstärken und diese sind besonders in dicotylen Zellen wirksam. Es wurde spezifischer Weise gezeigt, dass Leadersequenzen von Tabakmosaikvirus (TMV, die "W-Sequenz"), chlorotischem Scheckungsvirus von Mais (MCMV) und Alfalfa-Mosaikvirus (AMV) bei der Verstärkung der Expression wirksam sind (z.B. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693–8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65–79 (1990)).
Targeting des Genproduktes innerhalb der Zelle
Es ist bekannt, dass in Pflanzen verschiedene Mechanismen zum Targeting von Genprodukten existieren und die Sequenzen, die das Funktionieren dieser Mechanismen kontrollieren, wurden in gewissem Detail charakterisiert. Beispielsweise wird das Targeting von Genprodukten zum Chloroplasten durch eine Signalsequenz kontrolliert, die am aminoterminalen Ende verschiedener Proteine gefunden wird und die während der Chloroplasteneinfuhr abgespalten wird, was das reife Protein liefert (z.B. Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104–15109 (1988)). Diese Signalsequenzen können an heterologe Genprodukte fusioniert werden, um die Einführung von heterologen Produkten in den Chloroplasten durchzuführen (van den Boreck et al., Nature 313: 358–363 (1985)). DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann vom 5'-Ende der cDNAs isoliert werden, die für das RUBISCO-Protein, das CAB-Protein, das EPSP-Synthaseenzym, das GS2-Protein und viele andere Proteine, von denen bekannt ist, dass sie in Chloroplasten lokalisiert sind, codieren.
Andere Genprodukte sind in anderen Organellen, z.B. den Mitochondrien und dem Peroxisom (z.B. Unger et al., Plant Molec. Biol. 13: 411–418 (1989)) lokalisiert. Die cDNAs, die für diese Produkte codieren, können auch manipuliert werden, um das Targeting heterologer Genprodukte zu diesen Organellen zu bewirken. Beispiele für solche Sequenzen sind die in kerncodierten ATPasen und spezifische Aspartataminotransferasen-Isoformen für Mitochondrien. Ein Targeting zu zellulären Proteinkörpern wurde von Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512–6516 (1985)) beschrieben.
Außerdem wurden Sequenzen charakterisiert, die das Targeting von Genprodukten auf andere Zellkompartimente bewirken. Aminoterminale Sequenzen sind für ein Targeting auf das ER, den Apoplasten und extrazelluläre Sekretion aus Aleuronzellen (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769–783 (1990)) verantwortlich. Außerdem sind aminotermainel Sequenzen in Verbindung mit carboxyterminalen Sequenzen für ein vakuoläres Targeting von Genprodukten verantwortlich (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357–368 (1990)).
Durch Fusion der geeigneten Targetingsequenzen, die oben beschrieben wurden, an Transgensequenzen von Interesse ist es möglich, das Transgenprodukt zu einer beliebigen Organelle oder einem beliebigen Zellkompartiment zu steuern. Zum Chloroplastentargeting beispielsweise wird die Chloroplastensignalsequenz aus dem RIBISCO-Gen, dem CAB-Gen, dem EPSP-Synthasegen oder dem GS2-Gen im Raster an das aminoterminale ATG des Transgen fusioniert. Die selektierte Signalsequenz sollte die bekannte Schaltungsstelle enthalten und die konstruierte Fusion sollte Aminosäuren nach der Spaltungsstelle berücksichtigen, welche für eine Spaltung notwendig sind. In einigen Fällen kann diese Forderung durch die Additon einer kleinen Anzahl von Aminosäuren zwischen der Spaltungsstelle und dem Transgen-ATG oder alternativ durch Ersetzen einiger Aminosäuren innerhalb der Transgensequenz erfüllt werden. Fusionen, die für die Chloroplasteneinfuhr konstruiert wurden, können auf Wirksamkeit der Chloroplastenaufnahme durch in vitro-Translation von in vitro-transkribierten Konstruktionen, gefolgt von einer in vitro-Chloroplastenaufnahme unter Verwendung von Techniken, die von Barlett et al. in "Delmann et al. (Herausg.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, S. 1081–1091 (1982); Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 446–453 (1986)) beschrieben wurden. Diese Konstruktionstechniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind gleichermaßen auf Miktochondrien und Peroxisomen anwendbar. Die Targetingwahl, die zur Expression von Transgenen erforderlich sein kann, wird von der zellulären Lokalisierung der Vorstufe abhängen, die als Ausgangspunkt für einen gegebenen Pfad erforderlich ist. Diese wird typischerweise im Cytosol oder im Chloroplasten sein, obgleich sie in einigen Fällen in den Mitochondrien oder im Peroxisom sein kann. Die Produkte der Transgenexpression werden normalerweise kein Targeting zum ER, zum Apoplast oder Vakuole erfordern.
Die oben beschriebenen Mechanismen zum zellulären Targeting können nicht nur in Verbindung mit ihren verwandten Promotoren, sondern auch in Verbindung mit heterologen Promotoren verwendet werden, um ein spezifisches Zelltargetingziel unter der transkriptionalen Regulierung eines Promotors, der ein Expressionsmuster hat, das sich von dem des Promotors, aus dem das Targetingsignal stammt, unterscheidet, zu bewirken.
Beispiel 22: Transformation von Dikotylen
Transformationstechniken für Dikotylen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen Techniken auf der Basis von Agrobacterium und Techniken, die kein Agrobacterium erfordern. Nicht-Agrobacterium-Techniken involvieren die Aufnahme von exogenem genetischen Material direkt durch Protoplasten oder Zellen. Dies kann durch eine durch PEG oder Elektroporation vermittelte Aufnahme, durch Partikelbeschuss vermittelte Abgabe oder durch Mikroinjektion erreicht werden. Beispiele für diese Techniken werden von Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169–177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001–1004 (1986) und Klein et al., Nature 327: 70–73 (1987) beschrieben. In jedem Fall werden die transformierten Zellen unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zu ganzen Pflanzen regeneriert.
Durch Agrobacterium vermittelte Transformation ist eine bevorzugte Technik zur Transformation von Dikotylen, und zwar wegen ihrer hohen Transformationseffizienz und ihrer breiten Verwendbarkeit mit vielen verschiedenen Spezies. Die vielen Nutzpflanzenspezies, die routinemäßig durch Agrobacterium transformierbar sind, umfassen Tabak, Tomate, Sonnenblume, Baumwolle, Ölsamenraps, Kartoffel, Sojabohne, Lucerne und Pappel ( EP 0 317 511 (Baumwolle, EP 0 249 432 (Tomate, von Calgene), WO 87/07299 (Brassica, von Calgene), US 4,795,855 (Pappel)). Eine Agrobacterium-Transformation involviert typischerweise die Übertragung des binären Vektors, der die Fremd-DNA von Interesse trägt (z.B. pCIB200 oder pCIB2001) auf einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, der von dem Komplement an vir-Genen abhängen kann, das von dem Wirt Agrobacterium-Stamm entweder auf einem gleichzeitig vorliegenden Ti-Plasmid oder vom chromosomalen Stamm CIB542 für CIB200 und pCIB2001 getragen wird (Uknes et al., Plant Cell 5: 159–169 (1993)). Der Transfer des rekombinaten binären Vektors auf Agrobacterium wird durch ein triparentales Paarungsverfahren erreicht, wobei E. coli, das den rekombinanten binären Vektor trägt, einen Helfer E. coli-Stamm, der ein Plasmid, wie z.B. pRK2013 trägt und der fähig ist, den rekombinanten binären Vektor zu dem Ziel-Agrobacterium-Stamm zu bewegen, verwendet werden. Alternativ kann der rekombinante binäre Vektor durch DNA-Transformation auf Agrobacterium übertragen werden (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).
Eine Transformation der Zielpflanzenspezies durch rekombinantes Agrobacterium involviert üblicherweise eine Co-Kultivierung des Agrobacteriums mit Explantaten aus der Pflanze und folgt Protokollen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Transformiertes Gewebe wird auf selektierbarem Medium, das den Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenzmarker trägt, der zwischen den binären Plasmid-T-DNA-Grenzen vorliegt, regenerierg.
Beispiel 23: Transformation von Monokotylen
Eine Transformation der meisten monokotylen Spezies ist nun Routine geworden. Bevorzugte Techniken umfassen einen direkten Gentransfer in Protoplasten unter Verwendung von PEG- oder Elektroporationstechniken und Partikelbeschuss in Callusgewebe. Transformationen können mit einer einzelnen DNA-Spezies oder mehreren DNA-Spezies (d.h. Co-Transformation) durchgeführt werden und diese beiden Techniken sind zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet. Eine Co-Transformation kann den Vorteil haben, dass eine komplexe Vektorkonstruktion vermieden wird und dass transgene Pflanzen mit nicht verknüpften Loci für das Gen von Interesse und den selektierbaren Marker erzeugt werden, was die Entfernung der selektierbaren Marker in nachfolgenden Generationen ermöglicht, sollte dies als wünschenswert angesehen werden. Allerdings ist die Häufigkeit von weniger als 100%, mit der getrennte DNA-Spezies in das Genom integriert werden, ein Nachteil der Verwendung der Co-Transformation (Schocher et al., Biotechnology 4: 1093–1096 (1986)).
Die Patentanmeldungen EP 0 292 435 (von Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (von Ciba-Geigy) und WO 93/07278 (von Ciba-Geigy) beschreiben Techniken für die Herstellung von Callus und Protoplasten aus einer Eliteinzuchtlinie von Mais, Transformation von Protoplasten unter Verwendung von PEG oder Elektroporation und die Regeneration von Maispflanzen aus transformierten Protoplasten. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990)) und Fromm et al., Biotechnology 8: 833–839 (1990)) haben Techniken zur Transformation einer von A188-abgeleiteten Maislinie unter Verwendung von Partikelbeschuss publiziert. Darüber hinaus beschreiben die Anmeldung WO 93/07278 (von Ciba-Geigy) und Koziel et al., Biotechnology 11: 194–200 (1993)) Techniken für die Transformation von Mais-Eliteinzuchtlinien durch Partikelbeschuss. Diese Technik verwendet unreife Maisembryos mit einer Länge von 1,5 bis 2,5 mm, die 14 bis 15 Tage nach Bestäubung aus einer Maisähre ausgeschnitten wurden und eine PDS-1000HE Biolistics-Vorrichtung zum Beschuss.
Ein Transformation von Reis kann auch durch direkte Gentransfertechniken unter Verwendung von Protoplasten oder Teilchenbeschuss erfolgen. Protoplasten-vermittelte Transformation wurde für Japonica-Arten und Indica-Arten (Zhang et al., Plant Cell Rep. 7: 379–384 (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274–277 (1989); Datta et al., Biotechnology 8: 736–740 (1990)) beschrieben. Beide Arten sind unter Anwendung von Partikelbeschuss routinemäßig transformierbar (Christou et al., Biotechnology 9: 957–962 (1991)).
Die Patentanmeldung EP 0 332 581 (von Ciba-Geigy) beschreibt Techniken für die Bildung, Transformation und Regeneration von Pooideae-Protoplasten. Diese Techniken ermöglichen die Transformation von Dactylis und Weizen. Darüber hinaus wurde eine Weizentransformation von Vasil et al., Biotechnology 10: 667–674 (1992)) unter Verwendung von Partikelbeschuss in Zellen des Typs C-Langzeit-regenerierbarem Callus und auch von Vasil et al., Biotechnology 11: 1553–1558 (1993)) und Weeks et al., Plant Physiol. 1021: 1077–1084 (1993) unter Verwendung von Partikelbeschuss unreifer Embryos und unreifenen von Embryo stammendem Callus beschrieben. Eine bevorzugte Technik zur Weizentransformation beinhaltet allerdings die Transformation von Weizen durch Partikelbeschuss unreifer Embryos und beinhaltet entweder einen Schritt mit hohem Saccharose- oder hohem Maltosegehalt vor der Genabgabe. Vor Beschuss werden eine Reihe von Embryos (0,75–1 mm Länge) auf MS-Medium mit 3% Saccharose (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473–497 (1962)) und 3 mg/l 2,4-D zur Induktion von somatischen Embryonen, die im Dunklen ablaufen gelassen wird, gelegt. Am gewählten Tag des Beschusses werden die Embryos aus dem Induktionsmedium entfernt und auf das Osmotikum (d.h. Induktionsmedium mit in der gewünschten Konzentration, typischerweise 15%, zugesetzter Saccharose oder Maltose) gelegt. Die Embryos werden für 2–3 h plasmolysieren gelassen und dann beschossen. 20 Embryos pro Zielplatte ist typisch, obgleich nicht kritisch. Ein geeignetes Gen tragendes Plasmid (z.B. pCIB3064 oder pSG35) wird auf Goldpartikeln in Mikometergröße unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Jede Platte mit Embryos wird mit DuPont Biolistics-Heliium-Vorrichtung unter Verwendung eines Schussdrucks von ungefähr 1000 psi unter Verwendung eines Siebs mit 80 mesh beschossen. Nach dem Beschuss werden die Embryos zurück ins Dunkle gebracht, um sie sich für etwa 24 h (noch auf Osmotikum) erholen können. Nach 24 h werden die Embryos aus dem Osmotikum entfernt und zurück auf Induktionsmedium gelegt, wo sie etwa 1 Monat vor Regeneration bleiben. Etwa 1 Monat später werden die Embryoexplantate mit sich entwickelndem embryogenen Callus auf Regenerationsmedium (MS + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), das außerdem ein geeignetes Selektionsmittel enthält (10 mg/l basta im Fall von pCIB3064 und 2 mg/l Methotrexat im Fall von pSOG35) enthält, übertragen. Nach etwa 1 Monat werden die entwickelten Schösslinge in größere sterile Behälter, die als "Ga7s" bekannt sind, die MS halber Stärke, 2% Saccharose und dieselbe Konzentration an Selektionsmittel enthielten, transferiert. Die Patentanmeldung 08/147 161 beschreibt Verfahren zur Weizentransformation und wird hierdurch als Referenz aufgenommen.
Beispiel 24: Selektieren auf Pflanzen-Protoxgene, die gegenüber Protox-inhibierenden Herbiziden resistent sind, in E. coli-Expressionsystem
Das Plasmid pWDC-4, das für das chloroplastische MaisProtox-Enzym codiert, wird in den statistischen Mutagenesestamm XL1-Red (Stratagene, La Jolla, CA) transformiert. Die Transformation wird auf L-Medium, das 50 g/ml Ampicillin enthält, plattiert und für 48 h bei 37°C inkubiert. Rasen-transformierte Zellen werden von den Platten abgekratzt und Plasmid-DNA unter Verwendung des Wizard Megaprep-Kits (Promega, Madison, WI) hergestellt. Von Plasmid-DNA, die aus diesem Mutatorstamm isoliert wird, wird vorausgesagt, dass sie etwa eine statistische Basenänderung pro 2000 Nukleotide enthält (siehe Greener et al., Strategies 7(2): 32–34 (1994)).
Die mutierte Plasmid-DNA wird in die hemG-Mutant-SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979) transformiert und auf L-Medium, das 100 g/ml Ampicillin enthält, und auf dasselbe Medium, das verschiedene Konzentration an Protox inhibierendem Herbizid enthält, plattiert. Die Platten werden für 2 bis 3 Tage bei 37°C inkubiert. Plasmid-DNA wird aus allen Kolonien, die in Gegenwart von Herbizid-Konzentrationen, die den Wildtypstamm wirksam abtöten, wachsen, isoliert. Die isolierte DNA wird dann in SASX38 transformiert und erneut auf Herbizid plattiert, um sicherzustellen, dass die Resistenz auf dem Plasmid basiert.
Mutierte pWDC-4-Plasmid-DNA wird erneut aus resistenten Kolonien isoliert und die für Protox codierende Sequenz wird durch Verdau mit EcoRI und XhoI ausgeschnitten. Die ausgeschnittene für Protox codierende Sequenz wird dann erneut in einen nicht mutagenisierten pBluescript-Vektor kloniert und in der gleichen Weise wie oben beschrieben erneut auf Resistenz gegenüber Protox-inhibierendem Herbizid getestet.
Dieses Verfahren eliminiert nicht-codierende Sequenzmutation, die Resistenz verleihen, z.B. "up-promotor"-Mutanten (d.h. Mutanten, deren Resistenz auf Mutationen beruht, die erhöhte Expression von nicht modifiziertem Protox bewirken) und lässt nur Mutanten zurück, deren Resistenz auf Mutationen in der Protox-codierenden Sequenz beruhen. Die DNA-Sequenz für alle vermeintlichen Herbizid-toleranten Protoxgene, die durch dieses Verfahren identifiziert werden, wird bestimmt und Mutationen werden durch Vergleich mit der Wildtyp-pWDC-4-Protoxsequenz identifiziert.
Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens wurde eine Resistenzmutation, die ein C in ein T an Nukleotid 498 in der pWDC-4-Sequenz (SEQ ID NO: 5) umwandelt, identifiziert. Das Plasmid, das diese Mutation trägt, wurde pMzC-1Val bezeichnet. Diese Änderung wandelt ein GCT-Codon für Alanin bei Aminosäure 166 (SEQ ID NO: 6) in ein GTT-Codon für Valin um und führt zu einem Protox-Enzym, das im bakteriellen Assay gegenüber einem Protox-inhibierenden Herbizid wenigstens 10 Mal resistenter ist, pMzC-1Val im pBluescript-SK-Vektor wurde am 30. September 1994 unter der Bezeichnung pWDC-8 bei der Agricultural Research Culture Collection hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung NRRL #21340.
Die gleiche Strategie wurde angewendet, um auf Herbizid-resistente Formen des Arabidopsis-Protox-1-Gens in verschiedenen Vektoren durchzumustern. Eine Resistenzmutation, die identifiziert wurde, ist eine C-zu-T-Änderung an Nukleotid 689 in der pWDC-2-Sequenz (SEQ ID NO: 1); dieses Plasmid wird pAraC-1Val genannt. Diese Änderung ist identisch mit der obigen pMzC-1Val-Mutante, die ein GCT-Codon für Alanin an Aminosäure 220 (SEQ ID NO: 2) in ein GTT-Codon für Valin an der entsprechenden Position in der Arabidopsis-Protox-Proteinsequenz umwandelt.
Ein zweites resistentes Gen enthält eine A-zu-G-Änderung an Nukleotid 1307 in der pWDC-2-Sequenz (SEQ ID NO: 1); dieses Plasmid wird pAraC-2Cys genannt. Diese Änderung wandelt ein TAC-Codon für Tyrosin an Aminosäure 426 (SEQ ID NO: 2) in ein TGC-Codon für Cystein um. Das entsprechende Tyrosincodon in der Mais-Protox-1-Sequenz an der Nukleotidposition 1115–1117 (SEQ ID NO: 5; Aminosäureposition 372 von SEQ ID NO: 6) kann entsprechend mutiert werden, um eine Herbizid-resistente Form dieses Enzyms zu bilden.
Eine dritte resistente Mutante hat eine G-zu-A-Änderung an Nukleotid 691 in der pWDC-2-Sequenz (SEQ ID NO: 1); dieses Plasmid wird pAraC-3Ser genannt. Diese Mutation wandelt GGT-Codon für Glycin an der Aminosäure 221 SEQ ID NO: 2) in ein AGT-Kondon für Serin an der Codonposition, benachbart zu der Mutation in pAraC-1 um. Das entsprechende Glycincodon in der Mais-Protox-1-Sequenz an Nukleotidposition 497–499 (SEQ ID NO: 5; Aminosäureposition 167 von SEQ ID NO: 6) kann entsprechend mutiert werden, um eine Herbizid-resistente Form dieses Enzyms zu erzeugen.
Alle oben beschriebenen Mutationen resultieren in einem Protox-Enzym, das im bakteriellen Assay gegenüber Protox-inhibierenden Herbizid wenigstens 10 Mal resistenter ist.
pAraC-2Cys im pFL61-Vektor wurde am 14. November 1994 unter der Bezeichnung pWDC-7 bei der Agricultural Research Culture Collection hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung NRRL #21339N.
Beispiel 25: Zusätzliche Herbizid-resistente Codonsubstitutionen an Positionen, die bei der Zufallsauslese identifiziert werden.
Die Aminosäuren, die als Herbizidresistenzstellen bei der Zufallsauslese identifiziert wurden, werden durch andere Aminosäuren ersetzt und auf Funktion und Herbizidtoleranz im bakteriellen System getestet. Eine Oligonukleotid-spezifische Mutagenese der Arabidopsis-Protox-1-Sequenz wird unter Verwendung des Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA) durchgeführt. Nachdem Aminosäureänderungen durch Sequenzanalyse bestätigt wurden, werden die mutierten Plasmide in SASX38 transformiert und auf L-amp¹⁰⁰-Medium plattiert, um ihre Funktion zu testen und um bei verschiedenen Konzentrationen an Protox-inhibierendem Herbizid auf Toleranz zu testen.
Dieses Verfahren wurde auf das Alanincodon der Nukleotide 688–690 und auf das Tyrosincodon der Nukleotide 1306–1308 der Arabidopsis-Protox-Sequenz (SEQ ID NO: 1) angewendet. Die Resultate beweisen, dass das Alanincodon der Nukleotide 688–690 in ein Codon für Valin, Threonin, Leucin oder Cystein umgewandelt werden kann, um ein Herbizid-resistentes Protox-Enzym zu erhalten, das seine Funktion beibehält. Die Resultate beweisen außerdem, dass das Tyrosincodon der Nukleotide 1306–1308 in ein Codon für Cystein, Isoleucin, Leucin, Valin oder Threonin geändert werden kann, um ein Herbizid-resistentes Protox-Enzym zu erhalten, das seine Funktion beibehält.
Beispiel 26: Beweis der Kreuztoleranz-resistenten Mutationen gegenüber verschiedenen Protox-inhibierenden Verbindungen
Resistente Mutantenplasmide, selektiert auf Resistenz gegenüber einem einzelnen Herbizid, werden erneut bezüglich eines Spektrums anderer Protox-inhibierenden Verbindungen getestet. Der SASX38-Stamm, der das Wildtyp-Plasmid enthält, wird auf einem Bereich von Konzentration jeder Verbindung plattiert, um die lethale Konzentration für jede einzelne zu bestimmen. Resistente Mutantenplasmide in SASX38 werden plattiert und bezüglich der Fähigkeit, auf einer Konzentration jeder Verbindung, die wenigstens 10 × höher ist als die Konzentration, die für den SASX38-Stamm, der das Wildtyp enthält, lethal ist, zu überleben, einer Punktbewertung unterzogen.
Resultate aus der Kreuztoleranzuntersuchung zeigen, dass jede der identifizierten Mutationen Toleranz gegenüber einer Vielzahl von Protox-inhibierenden Verbindungen verleiht. Die Resultate zeigen insbesondere, dass 1) die AraC1-Val-Mutation Resistenz gegenüber Protox-Inhibitoren einschließlich der, aber nicht beschränkt auf die, die die Formel IV, XI, XIII, XIV, XV und XVII haben, verleiht; 2) die AraC-2Cys-Mutationresistenz gegenüber Protoxinhibitoren verleiht, welche solche mit den Formeln XI, XIII, XV und XVII umfassen, aber nicht auf diese beschränkt sind; 3) die MzC-1Val-Mutationresistenz gegenüber Protoxinhibitoren verleiht, die solche mit den Formeln XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI und XVII umfassen, aber nicht notwendigerweise auf diese beschränkt sind; 4) die AraC-3Ser-Mutationresistenz gegenüber Protoxinhibitoren verleiht, welche Bifenox und solche mit der Formel IV, XII, XIII, XIV, XV und XVII einschließen, aber notwendigerweise auf diese beschränkt sind.
Beispiel 27: Herstellung von Herbizid-toleranten Pflanzen durch Überexpression von Pflanzen-Protox-Genen
Die für Arabidopsis-Protox-1-codierenden Sequenzen sowohl aus Wild-Typ als auch aus resistenten mutanten AraC-1Val-Genen werden aus partiellen EcoRI- und XhoI-Verdau herausgeschnitten und in das Pflanzenexpressionsplasmid pCGN1761ENX kloniert. Die Expressionskassetten, die 2 × 35S-Protoxgenfusionen enthalten, werden durch Verdau mit XbaI herausgeschnitten und in den binären Vektor pCIB200 kloniert.
Diese binären Protoxplasmide werden durch Elektroporation in Agrobacterium und dann in Arabidopsis transformiert, wobei das Vakuum in Filtrationsverfahren (Bechtold et al., 1993) verwendet wird. Transformanten werden auf Kanamycin selektiert und T2-Samen werden aus einer Reihe unabhängiger Linien erzeugt. Dieser Samen wird auf GM-Medium, das verschiedenen Konzentrationen an Protox-inhibierendem Herbizid enthält, plattiert und bezüglich Keimung und Überleben einer Punktbewertung unterzogen. Mehrere transgene Linien, die entweder das Wildtyp-Protox oder die resistente Protoxmutante überexprimieren, produzieren signifikante Zahlen an grünen Keimlingen bei einer Herbizidkonzentration, die für die leere Vektorkontrolle lethal ist.
Verschiedene Modifikationen der hierin beschriebenen Erfindung werden dem Fachmann einfallen. Solche Modifikationen sollen in den Rahmen der beigefügten Ansprüche fallen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, das für eine Protoporphyrinogen-Oxidase codiert, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 und 10 ausgewählt ist.
Isoliertes DNA-Molekül, das für eine Protoporphyrinogen-Oxidase codiert, die die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz hat, außer daß: a. das Alanin als Aminosäure 220 durch eine Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Valin, Threonin, Leucin und Cystein ausgewählt ist, ersetzt ist; und/oder b. das Glycin als Aminosäure 221 durch Serin ersetzt ist; und/oder c. das Tyrosin als Aminosäure 426 durch eine Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Cystein, Isoleucin, Leucin, Valin und Threonin ausgewählt ist, ersetzt ist.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 2, worin das Alanin als Aminosäure 220 von SEQ ID NO: 2 durch Valin ersetzt ist.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 2, worin das Tyrosin als Aminosäure 426 von SEQ ID NO: 2 durch Cystein ersetzt ist.
Isoliertes DNA-Molekül, das für eine Protoporphyrinogen-Oxidase codiert, die die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Sequenz hat, außer daß a. das Alanin als Aminosäure 166 von SEQ ID NO: 6 durch Valin ersetzt ist; und/oder b. das Glycin als Aminosäure 167 von SEQ ID NO: 6 durch Serin ersetzt ist; und/oder c. das Tyrosin als Aminosäure 372 von SEQ ID NO: 6 durch Cystein ersetzt ist.
Expressionskassette, umfassend einen Promotor, der funktionell mit dem isolierten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 verknüpft ist.
Rekombinanter Vektor, der die Expressionskassette nach Anspruch 6 umfaßt.
Wirtszelle, die in stabiler Weise unter Verwendung eines Vektors nach Anspruch 7 transformiert ist, wobei die Wirtszelle fähig ist, das DNA-Molekül zu exprimieren.
Pflanzenzelle, die ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt, wobei das DNA-Molekül in der Pflanzenzelle exprimiert wird und der Pflanzenzelle Toleranz gegenüber einem Herbizid in einem Ausmaß verleiht, das natürlich auftretende Protox-Aktivität inhibiert.
Pflanze, die die Pflanzenzelle nach Anspruch 9 umfaßt.
Verfahren zur Bereitstellung einer Pflanze, die gegenüber Protoporphyrinogen-Oxidase inhibierenden Herbiziden tolerant ist, umfassend: a. Bereitstellen einer Expressionskassette, die einen Pflanzen-funktionellen Promotor funktionell gebunden an eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt; b. Transformieren von Pflanzenmaterial mit der Expressionskassette und c. Regenerieren einer Pflanze aus dem Pflanzenmaterial.
Verfahren zur Kontrolle des Wachstums einer unerwünschten Vegetation, umfassend Anwenden auf eine Population der Pflanzen nach Anspruch 10 oder erhältlich nach dem Verfahren nach Anspruch 11 und auf die unerwünschte Vegetation einer wirksamem Menge eines Protoporphyrinogen-Oxidase-inhibierenden Herbizids.
Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Bereitstellung von Pflanzen, die gegenüber Protoporphyrinogen-Oxidase-inhibierenden Herbiziden tolerant sind.