JP2003507019A - 除草剤寛容性プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、大豆、小麦、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、イネ、ソルガム及びサトウキビからのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素についてコードする新規のＤＮＡ配列を提供する。さらに、本発明は、除草剤寛容性をもつ修飾された形態のプロトックス酵素を教示している。本書で教示されている除草剤寛容性あるプロトックス酵素を発現する植物も同様に提供されている。これらの植物は、耐性形態への未変性プロトックス遺伝子の突然変異を介してプロトックス阻害物質に対する耐性を得るように工学処理することもできるし、或いは又、除草剤寛容性形態の植物プロトックス酵素をコードする遺伝子を用いて形質転換させることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（「プロトックス」）の除
草剤寛容性形態をコードするＤＮＡ分子に関する。本発明はさらに、除草剤寛容
性植物ならびに、これらの除草剤寛容性形態のプロトックスに基づく組織培養選
択方法及び除草剤利用方法にも関する。

【０００２】 本発明は、未修飾の天然に発生する植物プロトックス酵素を阻害する化合物に
対する耐性をもつ修飾された形態の植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
（プロトックス）酵素及びかかる阻害物質耐性植物プロトックス酵素についてコ
ードするＤＮＡ分子を提供する。

【０００３】 明確さを期して、該明細書で使用するいくつかの用語を以下のように定義し提
示する：「〜と会合された／操作可能な形でリンクされた」：これは、物理的又
は機能的に関係づけられた２つのＤＮＡ配列を意味する。例えば、１つのプロモ
ータ又は調節ＤＮＡ配列は、それらが操作可能な形でリンクされているか又は調
節ＤＮＡ配列がコーディング又は構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を与えるこ
とになるような形で位置づけされている場合に、１つのＲＮＡ又はタンパク質に
ついてコードするＤＮＡ配列と「会合されている」と言われている。

【０００４】 「キメラ遺伝子」：これは、その中で１つのプロモータ又は調節ＤＮＡ配列が
、１つのｍＲＮＡについてコードするか又は１つのタンパク質として発現されて
いるＤＮＡ配列と操作可能な形でリンクされているか又は会合させられ、そのた
め調節ＤＮＡ配列が会合されたＤＮＡ配列の転写又は発現を調節できるようにな
っている組換え型ＤＮＡ配列のことである。キメラ遺伝子の調節ＤＮＡ配列は通
常、自然界に見い出されるような会合されたＤＮＡ配列に対し操作可能な形では
リンクされていない。

【０００５】 「コーディングＤＮＡ配列」： タンパク質を産生するべく１つの生体内で翻
訳されるＤＮＡ配列。

【０００６】 「〜に対応する」： 本発明においては「に対応する」という語は、さまざま
なプロトックス酵素のアミノ酸配列が表１Ａ中にあるように互いに整列させられ
たとき、表１Ａ中の或る列挙された位置に「対応する」アミノ酸が、表１Ａ中の
これらの位置と整列するものの必ずしも特定のプロトックス酵素のアミノ酸配列
との関係において数値的に正確なこれらの位置にあるとはかぎらないアミノ酸で
ある、ということを意味する。同様にして、特定のプロトックス酵素（例えば大
豆プロトックス酵素）のアミノ酸配列が基準プロトックス酵素（例えば配列番号
２に与えられているシロイヌナズナ プロトックス−１配列）のアミノ酸配列と
整列させられた時点で、配列番号２のいくつかの列挙された位置に「対応する」
大豆プロトックス配列内のアミノ酸は、配列番号２のこれらの位置と整列するも
のの必ずしも大豆プロトックス酵素のアミノ酸配列の数値的に正確なこれらの位
置にあるとはかぎらないアミノ酸である。

【０００７】 「除草剤」： 植物、植物細胞、植物種子又は植物組織を殺すか又はその成長
を抑制するのに使用される化学物質。

【０００８】 「異種ＤＮＡ配列」： 天然に発生する ＤＮＡ配列の天然に発生しない多重
コピーを含めた、それが中に導入される宿主細胞と天然に会合していないＤＮＡ
配列。

【０００９】 「同種ＤＮＡ配列」： それが導入される宿主細胞と天然に会合していないＤ
ＮＡ配列。

【００１０】 「同種細胞質性」： これは、全ての色素体が遺伝的に同一である植物、植物
組織又は植物細胞を意味する。異なる組織又は発達段階において、色素体は、例
えば葉緑体、原色素体、エチオプラスト、アミロプラスト、有色体などといった
さまざまな形をとることができる。

【００１１】 「阻害物質」： 植物の成長又は存続に不可欠である生合成酵素、受容体、シ
グナル形質導入タンパク質、構造遺伝子産物又は輸送タンパク質といったタンパ
ク質の酵素活性を、不活性化させる化学物質。本発明では、阻害物質というのは
、プロトックスの酵素活性を不活性化する化学物質である。「除草剤」という用
語は、本書では、植物、植物細胞、植物種子又は植物組織に適用された場合の阻
害物質を定義づけるために使用されている。

【００１２】 「分離された」： 本発明においては、分離された核酸分子又は分離された酵
素というのは、人間の手によりその自然環境から離れて存在し従って天然産物で
はない核酸分子又は酵素のことである。分離核酸分子又は酵素は、精製された形
態で存在してもよいし或いは又例えば遺伝子導入宿主細胞といったような非自然
環境内で存在することもできる。

【００１３】 「最小プロモータ」： 上流側活性化の無い場合不活性であるか又は大幅に低
減されたプロモータ活性をもつプロモータ要素特にＴＡＴＡ要素である。適切な
転写因子の存在下で、最小プロモータは、転写を可能にするように機能する。

【００１４】 「修飾された酵素活性」： １つの植物内で天然に発生するもの（すなわち、
人間がかかる活性を直接的又は間接的に操作することのない状態で天然に発生す
る酵素活性）とは異なる酵素活性で、天然に発生する酵素活性を阻害する阻害物
質に対する寛容性をもつ。

【００１５】 「核酸分子」： 任意の供給源から分離されうる１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ又は
ＲＮＡの線形セグメント。本発明においては、核酸分子は、好ましくはＤＮＡの
セグメントである。

【００１６】 「植物」： 任意の植物又は任意の発達段階にある植物の一部分を意味する。
これには、切り枝、細胞又は組織又は組織培養及び種子も内含される。本発明に
関連して使用される場合、「植物組織」という語は、植物全体、植物細胞、植物
器官、植物種子、原形質体、カルス、細胞培養及び、組織及び／又は機能単位の
形に組織された植物細胞のあらゆるグループを内含するが、これらに制限される
わけではない。

【００１７】 「プラストーム」： 色素体のゲノム。

【００１８】 「プロトックス−１」： 葉緑体プロトックス 「プロトックス−２」： ミトコンドリアプロトックス 「著しい増加」： 測定技術において固有の誤差余裕よりも大きい酵素活性の
増大、好ましくは、阻害物質の存在下での野生型酵素の活性の約２倍以上の増大
、より好ましくは、約５倍以上の増大、最も好ましくは約１０倍以上の増大。

【００１９】 「実質的に類似の」： 核酸に関しては、基準核酸分子と少なくとも６０パー
セントの配列同一性をもつ核酸分子のことを表わす。好ましい実施形態において
は、実質的に類似のＤＮＡ配列は、基準ＤＮＡ配列と少なくとも８０％の同一性
をもつ。より好ましい実施形態においては、実質的に類似のＤＮＡ配列は、基準
ＤＮＡ配列に対し少なくとも９０％の同一性をもつ。又最も好ましい実施形態で
は、実質的に類似のＤＮＡ配列は、基準ＤＮＡ配列に対し少なくとも９５％の同
一をもつ。実質的に類似のヌクレオチド配列は、標準的に基準核酸分子又はその
フラグメントに対し次の条件下でハイブリッド形成する： ５０℃で７％のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭでｐＨ７.０のＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥ
ＤＴＡによるハイブリダイゼーション； ５０℃でＺ×ＳＳＣ、１％のＳＤＳに
よる洗浄。タンパク質又はペプチドに関しては、実質的に類似のアミノ酸配列は
、基準タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性
をもち基準タンパク質又はペプチドと実質的に同じ活性をもつアミノ酸配列であ
る。

【００２０】 「寛容性／耐性」： 阻害物質又は除草剤に露呈されたときに正常な成長又は
機能を続行できる能力。

【００２１】 「形質転換」： 異種ＤＮＡを細胞、組織又は植物内に導入するためのプロセ
ス。形質転換された細胞、組織又は植物は、形質転換プロセスの最終産物のみな
らずその遺伝子導入後代も包含するものと理解される。

【００２２】 「輸送ペプチド」： ポリペプチド前駆体を形成する、ＤＮＡ分子によってコ
ードされたタンパク質と合わせて翻訳されるシグナルポリペプチド。例えば葉緑
体といった細胞内の選択された部位への輸送プロセスにおいて、輸送ペプチドは
、ポリペプチド前駆体の残りの部分から分割されて活性又は成熟タンパク質を提
供することができる。

【００２３】 「形質転換された」： これは、その中に異種ＤＮＡが導入された植物といっ
たような生体を意味する。ＤＮＡ分子はその植物のゲノム内に安定した形で組込
まれることができ、ここで、植物のゲノムは核ゲノム、色素体ゲノム、及びミト
コンドリアゲノムを包含する。形質転換された植物内では、ＤＮＡ分子は同じく
、染色体外分子としても存在することができる。かかる染色体外分子は、自己複
製している可能性がある。「形質転換されていない」植物というのは、野生型生
体すなわち、異種ＤＮＡ分子を含まない植物を意味する。

【００２４】 「トランスプラストーム」： 形質転換された色素体ゲノム。

【００２５】 ヌクレオチドは、以下のような標準略称を用いてその塩基により表示される：
アデニン（Ａ）、サイトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びグアニン（Ｇ）。アミ
ノ酸も同様に、次のような標準略称により表示される：アラニン（ａｌａ；Ａ）
、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（
Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタ
ミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、
イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（ｌｙｓ；Ｋ）
、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐ
ｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファ
ン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。さら
に、（Ｘａａ；Ｘ）は任意のアミノ酸を表す。

【００２６】 本発明は、未修飾の天然に発生する植物プロトックス酵素を阻害する化合物に
対する耐性をもつ修飾された形態の植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
（プロトックス）酵素、及びかかる阻害物質耐性植物プロトックス酵素について
コードするＤＮＡ分子を開示している。

【００２７】 かくして、１つの態様においては、本発明は、野生型除草剤感受性プロトック
スを形質転換するのに用いられるＤＮＡ構成体の中に取込まれる能力をもつ植物
プロトックス酵素をコードするＤＮＡ分子において、ＤＮＡ構成体との形質転換
の時点で植物がそのＤＮＡ分子を含有しかくして該植物は天然に発生する植物プ
ロトックスを阻害する除草剤の適用に対する耐性をもつことになるような形で、
野生型ＤＮＡ分子との関係における少なくとも１つの点突然変異を有しているＤ
ＮＡ分子を開示している。

【００２８】 特に、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活
性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子において
、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵素の阻害物質に対して耐性を
もち、前記修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｃ） Δ₁をアルギニン以外のアミノ酸、特にロイシン又はシステインとする
、ＡＰΔ₁Ｆ、 （ｄ） Δ₂をロイシンとする、ＦΔ₂Ｓ、 （ｅ） Δ₃をイソロイシンとする、ＹΔ₃Ｇ、 （ｆ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 （ｇ） Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするＴΔ₁₆Ｇ及び、Δ₁₇をアラニン以
外のアミノ酸とするＹＶΔ₁₇Ｇ というアミノ酸部分配列のうちの少なくとも１つのを含んで成り、天然に発生す
る形態の前記酵素をコードするヌクレオチド配列が１つの植物から誘導されてい
る、核酸分子に関する。

【００２９】 好ましい実施形態においては、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ（プロトックス）活性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列
を含む核酸分子において、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵素の
阻害物質に対して耐性をもち、前記修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｃ） Δ₁をアルギニン以外のアミノ酸、特にロイシンとする、ＡＰΔ₁Ｆ、 （ｄ） Δ₂をロイシンとする、ＦΔ₂Ｓ、 （ｅ） Δ₃をイソロイシンとする、ＹΔ₃Ｇ、 （ｆ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 （ｇ） Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするＴΔ₁₆Ｇ及び、Δ₁₇をアラニン以
外のアミノ酸とするＹＶΔ₁₇Ｇ、 から成るグループの中から選択された少なくとも１つのアミノ酸部分配列を含ん
で成り、前記修飾された酵素をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１
、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列
番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号３６において記されている
ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対し、 （ｉ） ７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭのＮａＰＯ₄、ｐＨ
７.０、１ｍＭのＥＤＴＡ中で５０℃でのハイブリダイゼーション；及び、 （ｉｉ） ２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中で５０℃での洗浄、という条件下でハイ
ブリッド形成する、核酸分子に関する。

【００３０】 さらに好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス
）活性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子にお
いて、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵素の阻害物質に対して耐
性をもち、前記修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｃ） Δ₁をロイシンとする、ＡＰΔ₁Ｆ （ｄ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 というアミノ酸部分配列のうちの少なくとも１つを含んで成り、天然に発生する
形態の前記酵素をコードするヌクレオチド配列が１つの植物から誘導されている
、核酸分子である。

【００３１】 好ましいのは、前記修飾された酵素がアミノ酸部分配列 ＫＡΔ₁₈Ｆを含み、
ここでΔ₁₈がアラニン以外のアミノ酸である核酸分子である。

【００３２】 さらに好ましいのは、Δ₁₈がトレオニン又はバリンである核酸分子である。 同様に好ましいのは、前記修飾された酵素が、アミノ酸部分配列 ＱΔ₁₉Ｈを含
み、ここでΔ₁₉が、ロイシン以外のアミノ酸である核酸分子である。

【００３３】 同様に好ましいのは、Δ₁₉がセリンである核酸分子である。

【００３４】 同様に好ましいのは、前記修飾された酵素がアミノ酸部分配列 ＡＰΔ₁Ｆを含
み、ここでΔ₁がロイシン又はシステインである核酸分子である。

【００３５】 同様に好ましいのは、前記修飾された酵素がアミノ酸部分配列 Δ₇ＩＧを含ん
で成り、ここでΔ₇がヒスチジン又はアラニン、ただし特にヒスチジンである、
核酸分子である。同様に好ましいのは、前記修飾された酵素がΔ₁₆をセリンとす
るアミノ酸部分配列ＴΔ₁₆Ｇ及びΔ₁₇をトレオニンとするアミノ酸部分配列ＹＶ
Δ₁₇Ｇを含んで成る核酸分子である。

【００３６】 本発明はさらに、本発明に従った修飾された酵素が、 （ｅ） Δ₁₁をプロリン以外のアミノ酸とするＱΔ₁₁Ｓ、 （ｆ） Δ₁₂をトレオニン以外のアミノ酸とするＩＧＧΔ₁₂、 （ｇ） Δ₁₃をセリン以外のアミノ酸とするＳＷＸＬΔ₁₃、 （ｈ） Δ₁₄をアスパラギン以外のアミノ酸とするＬΔ₁₄Ｙ、 （ｉ） Δ₁₅をチロシン以外のアミノ酸とするＧΔ₁₅ＸＧＬ、 から成るグループの中から選択された少なくとも１つの付加的アミノ酸部分配列
をさらに含んで成る核酸分子を提供する。 好ましいのは、前記付加的な部分配列がＱΔ₁₁Ｓであり、ここでΔ₁₁がプロリン
以外のアミノ酸である核酸分子である。 さらに好ましいのは、Δ₁₁がロイシンである核酸分子である。

【００３７】 同様に好ましいのは、前記付加的な部分配列がＩＧＧΔ₁₂であり、ここでΔ₁₂ がトレオニン以外のアミノ酸である核酸分子である。 同様に好ましいのは、Δ₁₂がイソロイシン又はアラニンである核酸分子である。
同様に好ましいのは、前記付加的な部分配列がＳＷＸＬΔ₁₃であり、ここでΔ₁₃ がセリン以外のアミノ酸である核酸分子である。 同様に好ましいのは、Δ₁₃がロイシンである核酸分子である。

【００３８】 同様に好ましいのは、前記付加的な部分配列がＬΔ₁₄Ｙであり、ここでΔ₁₄が
アスパラギン以外のアミノ酸である核酸分子である。 同様に好ましいのは、Δ₁₄がセリンである核酸分子である。

【００３９】 同様に好ましいのは、前記付加的な部分配列がＧΔ₁₅ＸＧＬであり、Δ₁₅がチ
ロシン以外のアミノ酸である核酸分子である。 同様に好ましいのは、Δ₁₅がシステインである核酸分子である。

【００４０】 特に好ましいのは、野生型除草剤感受性プロトックスを含有する植物を形質転
換するのに使用されるＤＮＡ構成体の中に取込まれる能力をもつ植物プロトック
ス酵素をコードする核酸分子において、ＤＮＡ構成体との形質転換の時点で植物
がそのＤＮＡ分子を含有し、かくして該植物は天然に発生する植物プロトックス
を阻害する除草剤の適用に対する耐性をもつことになるような形で、上述のよう
に植物プロトックスをコードする野生型ＤＮＡ分子との関係における少なくとも
１つの点突然変異を有している核酸分子であって、シロイヌナズナ、トウモロコ
シ、小麦、大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、イネ、ソルガム及びサト
ウキビから成るグループの中から選択された植物から得ることができる核酸分子
である。

【００４１】 このようなＤＮＡ分子の配列は、配列番号９（小麦）、１１（大豆）、１５（
綿花）、１７（テンサイ）、１９（セイヨウアブラナ）、２１（イネ）、２３（
ソルガム）及び３６（サトウキビ）に記されている。好ましいのは、トウモロコ
シ又は綿花から得ることのできる核酸分子である。

【００４２】 同じく本発明に含まれるのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロ
トックス）活性を有し、以上で言及した本発明に従ったヌクレオチド配列によっ
てコードされる修飾された酵素である。

【００４３】 本発明は、さらに、植物内で阻害物質耐性植物プロトックスを発現できるキメ
ラ遺伝子及び修飾された形態の天然に発生するプロトックス遺伝子を内含する。

【００４４】 特に、本発明は、本発明に従った核酸分子に操作可能な形でリンクされた植物
中で活性であるプロモータを含むキメラ遺伝子に関する。

【００４５】 本発明はさらに、本発明に従ったキメラ遺伝子を含む組換え型ベクター分子を
も内含する。

【００４６】 阻害物質耐性植物プロトックス酵素をコードする遺伝子は、植物全体の中でプ
ロトックス阻害性除草剤に対する耐性を付与するため及び植物細胞形質転換方法
における選択可能なマーカーとして、使用可能である。従って本発明は同様に、
これらの修飾されたプロトックス酵素をコードする植物発現可能遺伝子を含有す
る、その子孫を含めた植物、植物組織及び植物種子をも内含している。これらの
植物、植物組織及び植物種子は、通常は植物中の天然に発生するプロトックス活
性にとって阻害性あるレベルのプロトックス阻害物質に対する耐性を有する。

【００４７】 特に、本発明は、本発明に従った核酸分子を含む植物細胞に関する。

【００４８】 本発明はさらに、本発明に従った核酸分子を含む、その後代を含めた植物、植
物組織、植物細胞又は植物種子において、前記核酸分子がそれらの中で発現され
るか又は、天然に発生するプロトックス活性の阻害物質に対する寛容性をそれに
付与する、植物、植物組織、植物細胞又は植物種子にも関する。

【００４９】 本発明により包含されている植物には、特に、プロトックス阻害活性除草剤に
とっての潜在的標的となるもの、特に、トウモロコシといったような作物学的に
重要な作物及び、大麦、小麦、ソルガム、ライ麦、オート麦、芝生及び飼料牧草
、アワ及びイネといったようなその他の穀物作物が含まれる。同じく含まれるの
は、サトウキビ、大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ及びタバコといった
ようなその他の作物植物である。

【００５０】 好ましいのは、本発明に従った核酸分子を含む、シロイヌナズナ、 大豆、綿
花、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、イネ、及び
サトウキビから成るグループの中から選択される、その後代を含めた植物、植物
組織、植物細胞、又は植物種子である。

【００５１】 本発明は同様に、色素体形質転換及び植物色素体の中での本発明に従った核酸
分子の発現にも関する。好ましい実施形態においては、除草剤耐性植物を得るた
めに、以上で記述した修飾された植物プロトックス酵素が、植物色素体内で発現
させられる。

【００５２】 特に、本発明は、本発明に従った核酸分子に操作可能な形でリンクされた、植
物色素体内で機能的なプロモータ、特にｃ/ｐＰ遺伝子プロモータを含むキメラ
遺伝子に関する。

【００５３】 さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、（ａ）その自然の状態で、
色素体輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードする植物から分離されたＤＮＡ
分子、又は、該色素体輸送ペプチドによりその植物の色素体に対し先天的にター
ゲティングされている成熟酵素（なおここで該ＤＮＡ分子は、それが機能的色素
体輸送ペプチドをコードしないような形で修飾されている）；及び（ｂ）１つの
色素体の中でＤＮＡ分子を発現する能力をもち、本発明に従ったＤＮＡ分子に操
作可能な形でリンクされているプロモータ、を含むキメラ遺伝子にも向けられて
いる。該ＤＮＡ分子は、未変性色素体輸送ペプチドコーディング配列の少なくと
も一部分がＤＮＡ分子から欠如しているという点で、修飾されている可能性があ
る。代替的には、ＤＮＡ分子は、未変性色素体輸送ペプチドコーディング配列の
単数又は複数のヌクレオチドが突然変異を受け、かくして、コードされた色素体
輸送ペプチドを非機能的にするという点で修飾される可能性もある。本発明は同
様に、かかるキメラ遺伝子を含有する葉緑体ゲノムに対し同種細胞質性の植物に
も関する。好ましい実施形態においては、ＤＮＡ分子は、除草剤化合物によって
天然に阻害される酵素をコードする。この場合、かかる植物は、本発明に従った
ＤＮＡ分子によってコードされる酵素を天然に阻害する除草剤に対し耐性をもつ
。本発明のさらなる実施形態は、本発明に従った核酸分子を内含する前述の要素
の一部又は全てを含む色素体形質転換ベクターに関する。

【００５４】 さらに含まれているのは、本発明に従った色素体形質転換ベクターを含む植物
色素体である。

【００５５】 本発明は同様に、本発明に従ったＤＮＡ分子を用いてその色素体ゲノムを形質
転換することによって除草剤に対する耐性が付与された植物、及びかかる植物を
得る方法にも向けられている。本発明はさらに、本発明に従った植物色素体を含
む、その後代を含めた植物、植物組織、植物細胞又は植物種子において、前記修
飾された植物プロトックス酵素が前記植物、植物組織、植物細胞又は植物種子の
中で発現されかかる植物、植物組織、植物細胞又は植物種子に対して、天然に発
生するプロトックス活性の阻害物質に対する寛容性を付与する、植物、植物組織
、植物細胞又は植物種子にも関する。

【００５６】 本発明は、さらに、本書で提供されている植物色素体酵素の阻害物質耐性形態
を産生する、本発明のプロセスを用いて予め形質転換された形質導入植物又はそ
の後代に由来する、例えば植物組織、原形質体、細胞、カルス、器官、植物種子
、胚芽、花粉、卵細胞、接合体といったような植物材料ならびに例えば花、茎、
果実、葉、根といったようなその他のあらゆる生殖材料及び植物部分を含めた植
物の生産方法にも関する。かかる植物は、耐性プロトックスをコードする構造遺
伝子を用いて安定した形で形質転換され得、又、除草剤耐性系統を分離し特徴づ
けし開発する直接的選択技術により調製することも可能である。

【００５７】 本発明はさらに、除草剤寛容性形態の植物プロトックスをコードする本発明の
ＤＮＡ分子で形質転換された植物細胞を選択する方法をも提供している。該方法
は、そのＤＮＡ分子がコードするプロトックスが耐性をもつ除草剤による阻害に
対しその成長が感受性を有するような植物細胞の中に該ＤＮＡ分子を導入し、か
くして形質転換された植物細胞を形成する段階を含んで成る。その成長が選択さ
れた除草剤に対し感受性をもつ形質転換された植物細胞は、形質転換されていな
い植物細胞の成長を阻害する除草剤濃度での選択によって同定される。

【００５８】 本発明は同様に、植物細胞のプラストームの中に上述のキメラ遺伝子を導入す
る段階；植物細胞の色素体内でコードされた酵素を発現する段階； 及び酵素の
活性を天然に阻害する除草剤化合物に対する耐性をもつ細胞を選択しかくして耐
性細胞が形質転換済み色素体を含むようにする段階を含んで成る、トランスプラ
ストミック植物細胞の新しい選択方法をも提供している。好ましい実施形態にお
いては、酵素は、除草剤化合物により天然に阻害され、遺伝子導入植物は、酵素
の活性を天然に阻害する除草剤化合物の量に基づいて成長することができる。

【００５９】 もう１つの態様においては、本発明は、除草剤寛容性形態の植物プロトックス
をコードする本発明に従ったＤＮＡ分子で形質転換される除草剤寛容性をもち、
作物学的に有用な植物が栽培されてきた場所において成長する望ましくない植生
を制御するための方法に向けられている。該方法には、天然に発生するプロトッ
クス活性を阻害する有効量の除草剤を、保護すべき場所に適用することが含まれ
ている。特に、本発明は、上述の植物の個体群に対し、酵素の阻害物質を有効量
だけ適用する段階を含んで成る、望ましくない植生の成長を制御するための方法
に向けられている。好ましい実施形態においては、本発明は、望ましくない植生
の成長を制御するための方法において、前記プロトックス阻害性除草剤が、アリ
ルウラシル、ジフェニルエーテル、オキシジアゾールイミド好ましくは構造式Ｖ
、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＸａ、又はＩＸｂのイミド、フ
ェニルピラゾール、好ましくは構造式ＸＸＩＶのフェニルピラゾール、ピリジル
ピラゾール、好ましくは構造式ＸＸＩＩＩａ又はＸＸＩＩＩｂのピリジルピラゾ
ール、ピリジン誘導体、３−置換−２−アリル−４，５，６，７−テトラヒドロ
インダゾール、フェノピレート、及び該フェノピレートのｏ−フェニルピロリジ
ノ−及びピペリジノカルバメート類似体から成るグループの中から選択されてい
る方法に関する。

【００６０】 本発明はさらに、植付けされた作物種子又は植物の１作物群を内含する畑の中
の雑草の成長を選択的に抑制するための方法において、 （ａ） 本発明に従った植物又は植物種子である除草剤寛容性作物又は作物種子
を植付けする段階、及び （ｂ） 天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で、畑の中の作物又は作
物種子及び雑草に対してプロトックス阻害性除草剤を塗布する段階、 を含んで成り、除草剤が作物の成長を著しく抑制することなく雑草の成長を抑制
するような方法にも関する。

【００６１】 １つの態様においては、本発明は、サトウキビからのプロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ（ここでは「プロトックス」と呼ぶ）をコードする分離されたＤ
ＮＡ分子に向けられている。サトウキビプロトックス酵素についての部分的ＤＮ
Ａコーディング配列及び、対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６及び
３７として提供されている。

【００６２】 従って、さらに本発明に含まれているのは、サトウキビ植物からのプロトポル
フィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素タンパク質をコードする分離
されたＤＮＡ分子において、タンパク質が配列番号３７に与えられているアミノ
酸配列を含むＤＮＡ分子である。

【００６３】 もう１つの態様においては、本発明は、サトウキビプロトックス酵素をコード
し、以下のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で配列番号３６に示されたコ
ーディング配列に対しハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む分離された
ＤＮＡ分子に向けられている： （ｉ） ７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭのＮａＰＯ₄、ｐＨ
７.０、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でのハイブリダイゼーション、及び （ｉｉ） ２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中５０℃での洗浄。

【００６４】 本発明はさらに、植物プロトックス酵素の阻害物質耐性形態をコードする遺伝
子の存在を検出し、植物組織内の阻害物質耐性プロトックスの写しのレベルを測
定するためのプローブ及び方法にも向けられている。これらの方法は、本書に開
示されているような植物プロトックス酵素の阻害物質耐性形態をコードする遺伝
子を含有しかつ／又は発現する植物又は植物組織について同定又はスクリーニン
グするためにも使用できる。

【００６５】 本発明に従ったプロトックス配列全体又はその一部分は、プロトックスコーデ
ィング配列及び伝令ＲＮＡに対し特異的にハイブリッド形成する能力をもつプロ
ーブとして使用できる。さまざまな条件下で特異的なハイブリダイゼーションを
達成するためには、かかるプローブは、プロトックスコーディング配列の中でユ
ニークでありかつ好ましくは長さが少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましく
は少なくとも２０ヌクレオチドである配列を内含する。かかるプローブは、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の周知のプロセスを介して、選ばれた生体からのプ
ロトックスコーディング配列を増幅し分析するために使用することができる。こ
の技術は、所望の生体から付加的なプロトックスコーディング配列を分離するた
め、又は１つの生体内のプロトックスコーディング配列の存在を決定するための
診断検定として有用でありうる。

【００６６】 ハイブリッドの安定性に影響を及ぼす因子が、ハイブリダイゼーションの緊縮
性を決定する。このような因子の１つは、「ＤＮＡプローブ」George H. Keller
及び Mark M. Manak, Macmillian Publisher Ltd. １９９３、第１節；分子ハイ
ブリダイゼーション技術：ｐ８ ff.に提出された式に従って容易に計算できる融
点Ｔ_mである。

【００６７】 好ましいハイブリダイゼーション温度は、計算された融点Ｔｍより約２５℃低
い温度の範囲内、好ましくは、計算された融点Ｔ_mよりも約１２〜１５℃低い温
度の範囲内にあり、オリゴヌクレオチドの場合には、融点Ｔ_mより約５〜１０℃
低い温度の範囲内にある。

【００６８】 本発明に含まれるのは、以上で定義されているような本発明に従ったＤＮＡ分
子に対して、ただし好ましくは長さが少なくとも１０ヌクレオチドのプロトポル
フィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素の配列の隣接部分を含むＤＮ
Ａ分子から得ることのできるオリゴヌクレオチドプローブに対して中位の緊縮性
条件下でハイブリッド形成するＤＮＡ分子である。

【００６９】 本発明はさらに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における、少なくとも１０
ヌクレオチドの長さのｍＲＮＡ又は植物プロトックス遺伝子に特異的にハイブリ
ッド形成する能力をもつヌクレオチドプローブの使用をも実施する。

【００７０】 さらなる実施形態においては、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ活性をコードする真核性ＤＮＡ配列又はそれぞれのｍＲＮＡに対し特異的に
ハイブリッド形成する能力をもつプローブ及び、本発明に従ったプローブを用い
て真核生物内のＤＮＡ配列を検出する方法を提供する。

【００７１】 本発明に従ったプロトックス特異的ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノ
ミックプロトックス配列に対するプローブの選択的ハイブリダイゼーションに基
づく（標準的技術を用いて、選ばれた生体のゲノム内の未変性真核性プロトック
ス遺伝子（単複）の場所をマッピングするためにも使用することができる。これ
らの技術には、プロトックスプローブ配列内に同定又は含有されたＤＮＡ多形現
象の同定、及び２つの多形性親系統のハイブリッドの自家受精由来のマッピング
個体群内の既知のマップ位置のその他のマーカーとの関係におけるプロトックス
遺伝子の隔離を追従するためのかかる多形現象の利用、が含まれる（例えばHele
ntjaris et al., Plant Mol. Biol. ５：１０９（１９８５），Sommer et al, B
iotechniques １２：８２（１９９２）； D'Ovidio et al., Plant Mol.Biol.
１５；１６９（１９９０）を参照のこと）。任意の真核生物からのプロトックス
遺伝子をマッピングするためのプローブとしてあらゆる真核性プロトックス配列
が有用であると考えられるが、好ましいプローブは、選ばれた生体に対する関係
がより密である生体からのプロトックス配列であり、最も好ましいプローブは、
選ばれた生体からのプロトックス配列である。この要領でのプロトックス遺伝子
のマッピングは、育種を目的とする植物において特に有用である。例えば除草剤
耐性を付与する突然変異体プロトックス遺伝子の遺伝子マップ位置を知ることに
より、フランキングＤＮＡマーカーを、基準遺伝子マップから同定することがで
きる（例えば、Helentjaris, Trends Genet.３：２１７（１９８７）を参照のこ
と）。新しい育種系統の中に除草剤耐性という形質の遺伝子を移入する間、各々
の戻し交雑ラウンドの後反復親の中になおも存在するプロトックスリンクされた
フランキング染色体ＤＮＡの範囲を監視するために、これらのマーカーを使用す
ることができる。

【００７２】 本発明に従ったプロトックス特異的ハイブリダイゼーションプローブは同様に
、ノーザンブロット分析といったような標準技術を用いて１つの生体内のプロト
ックスｍＲＮＡレベルを定量するのに使用することもできる。この技術は、プロ
トックス活性のレベルの低下と結びつけられる、神経精神病学的症候及び皮ふ病
巣の両方により特徴づけされる人間における常染色体優性障害といったような特
定の不利な条件と結びつけることのできるプロトックス発現レベルの改変を検出
するための診断検定として有用でありうる（Brenner and Bloomer, New Eng.J.M
ed. ３０２：７６５（１９８０））。

【００７３】 本発明のさらなる実施形態は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロ
トックス）酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ部分を含むＤＮＡ分子
を産生する方法において、 （ａ） 植物プロトックス遺伝子又はｍＲＮＡに対し特異的にハイブリッド形成
する能力をもつヌクレオチドプローブを調製する段階であって、該プローブが少
なくとも１０ヌクレオチドの長さの本発明に従ったプロトックス タンパク質の
ためのコーティング配列の隣接部分を含む段階； （ｂ） 段階（ａ）に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選ばれ
た生体からのクローニングされたゲノミックＤＮＡフラグメント又はｃＤＮＡフ
ラグメントの個体群内のその他のプロトックスコーティング配列についてプロー
ブ探査する段階；及び （ｃ） プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素活性をも
つタンパク質をコードするＤＮＡ部分を含むＤＮＡ分子を分離し増殖させる段階
、 を含んで成る方法にある。

【００７４】 本発明のさらなる実施形態は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロ
トックス）酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ部分を含むあらゆる植
物からのＤＮＡ分子を分離する方法にある。 （ａ） 植物プロトックス遺伝子又はｍＲＮＡに対し特異的にハイブリッド形成
する能力をもつヌクレオチドプローブを調製する段階であって、該プローブが少
なくとも１０ヌクレオチドの長さの本発明に従ったプロトックス タンパク質の
ためのコーティング配列の隣接部分を含む段階； （ｂ） 段階（ａ）に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選ばれ
た生体からのクローニングされたゲノミックＤＮＡフラグメント又はｃＤＮＡフ
ラグメントの個体群内のその他のプロトックスコーティング配列についてプロー
ブ探査する段階；及び （ｃ） プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素活性をも
つタンパク質をコードするＤＮＡ部分を含むＤＮＡ分子を分離し増殖させる段階
、 を含んで成る方法にある。

【００７５】 本発明はさらに、プロトポルフォリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵
素活性を示すタンパク質についてコードする基本的に純粋なＤＮＡ配列を産生す
る方法において： （ａ） 適切なクローニング活性を用いて適切な供給源生体からゲノミック又は
ｃＤＮＡライブラリを調製する段階； （ｂ） 本発明に従ったプローブ分子を用いてライブラリをハイブリッド形成す
る段階；及び （ｃ） プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）のためのアミ
ノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を潜在的に含有するクローンであるライブ
ラリからのＤＮＡクローンに対するプローブの正のハイブリダイゼーションを同
定する段階、 を含んで成る方法をも含む。

【００７６】 本発明はさらに、プロトポルフォリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵
素活性を示すタンパク質についてコードする基本的に純粋なＤＮＡ配列を産生す
る方法において： （ａ） ゲノミック又はｃＤＮＡライブラリから全ＤＮＡを調製する段階； （ｂ） 本発明に従ったプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス
）のアミノ酸配列の低縮退部分を表わすプライマーとのＰＣＲ反応のための鋳型
として段階（ａ）のＤＮＡを使用する段階、 を含んで成る方法を含む。

【００７７】 本発明のさらなる目的は、 （ａ） 本発明に従ったプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス
）の第１の試料及びその基質をインキュベートする段階； （ｂ） 段階（ａ）からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトック
ス）の未阻害反応性を測定する段階； （ｃ） 阻害物質化合物を含む第２の試料の存在下でプロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ（プロトックス）の第１の試料及びその基質をインキュベートする
段階； （ｄ） 段階（ｃ）からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトック
ス）酵素の阻害された反応性を測定する段階；及び （ｅ） プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素の阻害さ
れた反応性を未阻害反応性と比較する段階、 を含んで成る、プロトポルフォリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素活
性の阻害物質を同定するための検定にある。

【００７８】 本発明のさらなる目的は： （ａ） プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素阻害物質
を含む第２の試料の存在下でプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトッ
クス）酵素の第１の試料及びその基質をインキュベートする段階； （ｂ） 段階（ａ）からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトック
ス）酵素の突然変異を受けていない反応性を測定する段階； （ｃ） プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素阻害物質
を含む第２の試料の存在下で、突然変異を受けたプロトポルフィリノーゲンオキ
シダーゼ（プロトックス）酵素の第１の試料及びその基質をインキュベートする
段階； （ｄ） 段階（ｃ）からの突然変異を受けたプロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ（プロトックス）酵素の突然変異を受けた反応性を測定する段階；及び （ｅ） プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素の突然変
異を受けた反応性を受けていない反応性と比較する段階、 を含んで成る、阻害物質耐性をもつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プ
ロトックス）突然変異体を同定するための検定にある。

【００７９】 本発明のさらなる目的は、本発明に従った方法により得られたプロトックス酵
素阻害物質にある。

【００８０】 宿主生体内の酵素の組換えによる産生のためには、選ばれた宿主のために設計
された発現カセットの中に本発明に従ったプロトックスコーティング配列を挿入
し、それが組換えにより産生される宿主の中に導入することができる。プロモー
タ、シグナル配列、５′及び３′未翻訳配列及びエンハンサといったような特異
的調節配列の選択は、当業者の技能レベル内に入るものである。適切な読取り枠
内にリンクされた個々の要素を含む結果として得られた分子を、宿主細胞の中に
形質転換される能力をもつベクターの中に挿入することができる。タンパク質の
組換え型産生のための適切な発現ベクター及び方法は、E.Coli（例えば Studier
及びMoffatt, J.Mol.Biol.１８９：１１３（１９８６）； Brosius, DNA ８：７
５９（１９８９）参照）、酵母（例えば、Schneider 及びGuarente, Meth. Enzy
mol.１９４：３７３（１９９１）参照）及び昆虫細胞（例えばLuckow及びSummer
s, Bio/Technol. ６：４７（１９８８）参照）といったよな宿主生体について周
知である。特定的な例としては、pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA)、pF
LAG (International Biotechnologies, Inc.,New Haven, CT), pTrcHis (Invitr
ogen, La Jolla, CA)といったようなプラスミド及び、例えばAutographica cali
fornica核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のゲノムから誘導されたものとい
ったバキュロウイルス発現ベクターが含まれる。好ましいバキュロウイルス／昆
虫系はｐＶｌ １１３９２／Ｓｆ２１細胞（Invitrogen, La Jolla, CA）である
。

【００８１】 組換えによって産生された真核性プロトックス酵素は、さまざまな目的のため
に有用である。例えばin vitroでプロトックス酵素活性を供給するためにそれを
使用することができる。同様に、プロトックスを阻害するか否かを見極めるため
その標的が同定されていない既知の除草剤化学物質をスクリーニングする目的で
in vitro検定においてそれを使用することもできる。かかるin vitro検定は同様
に、プロトックス活性を阻害し従って除草剤候補である化学物質を同定するため
のより一般的なスクリーンとしても使用することができる。組換えによって産生
された真核プロトックス酵素は同様に、阻害物質耐性プロトックス突然変異体を
同定するための検定においても使用することができる（その全体が本書に参考と
して内含されているＷＯ９５／３４６５９として１９９５年１２月２１日に公示
された１９９５年６月８日付けの国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２号を参
照のこと）。代替的には、新しい阻害性除草剤ならびに除草剤寛容性形態の酵素
を合理的に設計する目的で、既知の阻害物質とのその会合をさらに特徴づけする
ために、組換えにより産生されたプロトックス酵素を使用することができる。

【００８２】 もう１つの態様においては、本発明は、この酵素の阻害物質耐性形態を生成す
るべくあらゆる真核性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（本書では「プロ
トックス」と呼ぶ）酵素のアミノ酸配列に対して行なうことのできる修飾につい
て教示している。好ましくは、真核性プロトックス酵素は、植物プロトックス酵
素である。本発明は、本書に教示されている修飾をもつ阻害物質耐性プロトック
ス酵素、これらの修飾された酵素をコードするＤＮＡ分子、及び植物内でこれら
の修飾された酵素を発現する能力をもつキメラ遺伝子に向けられている。

【００８３】 本発明は、少なくとも１つのアミノ酸修飾をもつ修飾された真核性プロトポル
フィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードする分離されたＤＮＡ分
子において、アミノ酸修飾がプロトックス阻害物質に対する耐性を付与する特性
をもつ、すなわち修飾されたプロトックスが天然に発生する真核性プロトックス
を阻害する量で阻害物質に対する寛容性をもつＤＮＡ分子を開示している。本書
で使用する「阻害する」という語は、対象化合物が無い場合に見られる活性レベ
ルに比べて対象化合物の存在下で見られる酵素活性が減少することを意味し、こ
こでその減少の百分率レベルは、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは
少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。

【００８４】 特に、修飾されたプロトックスが天然に発生するプロトックス活性を阻害する
量で除草剤に対する寛容性をもつ植物プロトックス、特に、修飾されたプロトッ
クスが天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で除草剤に対する寛容性を
もつ少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するシロイヌナズナプロトックス酵素、
トウモロコシプロトックス酵素、小麦プロトックス酵素、大豆プロトックス酵素
、綿花プロトックス酵素、テンサイプロトックス酵素、セイヨウアブラナプロト
ックス酵素、イネプロトックス酵素、ソルガムプロトックス酵素及びサトウキビ
プロトックス酵素から成るグループの中から選択されたプロトックスである、修
飾された真核プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコード
するＤＮＡ分子が開示されている。

【００８５】 本書で使用されているように、「実質的に保存されたアミノ酸配列」という表
現は、異なる供給源からのプロトックス酵素を含むポリペプチドの間のアミノ酸
相同性領域を意味する。本発明においては、それぞれ１〜１９と呼称された１７
個の実質的に保存されたアミノ酸部分配列が表１Ｂに示されている。当業者であ
れば、本書に定義づけされた実質的に保存されたアミノ酸配列を構成する部分配
列を同定するために、表１Ａで行なわれたように、異なる供給源からのプロトッ
クス酵素のアミノ酸配列を整列させることができるだろう。換言すると、１つの
供給源からの一定の与えられた部分配列が異なる供給源からの相同な部分配列に
「対応する」。このとき当業者は、同定された部分配列が本出願で開示され請求
されている特徴を有するか否かを決定することができるだろう。

【００８６】 従って、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）
活性をもつ酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を含み、野生
型除草剤感受性プロトックスを含有する植物を形質転換するのに使用される核酸
構成体の中に取込まれる能力をもつ核酸分子において、核酸構成体との形質転換
の時点で植物が除草剤寛容性を有することになるような形で植物プロトックスを
コードする野生型ヌクレオチド配列との関係において少なくとも１つの点突然変
異をヌクレオチド配列が有している核酸分子を開示している。

【００８７】 本発明の１つの好ましい実施形態は、 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性をもつ修飾され
た酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を含む核酸分子におい
て、修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素の阻害物質に対して耐性
をもち、該修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁をアルギニン以外のアミノ酸特にロイシン又はシステインとする、
ＡＰΔ₁Ｆ、 （ｂ） Δ₂をロイシンとする、ＦΔ₂Ｓ、 （ｃ） Δ₃をイソロイシンとする、ＹΔ₃Ｇ、 （ｄ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 （ｅ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｆ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｇ） Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするＴΔ₁₆Ｇ及び、Δ₁₇をアラニン以
外のアミノ酸とするＹＶΔ₁₇Ｇ というアミノ酸部分配列のうちの少なくとも１つの含む核酸分子に向けられてい
る。

【００８８】 （表１Ｂ：部分配列１〜１０及び１８〜１９及び１６〜１７）。

【００８９】 好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性
をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を含む
核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素の阻害
物質に対する耐性をもち、該修飾された酵素がΔ₁をロイシン又はシステインと
するアミノ酸部分配列ＡＰΔ₁Ｆを含んでいる、核酸分子である。

【００９０】 好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性
をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を含む
核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素の阻害
物質に対する耐性をもち、該修飾された酵素がΔ₂をロイシンとするアミノ酸部
分配列 ＦΔ₂Ｓを含んでいる核酸分子である。

【００９１】 好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性
をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を含む
核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素の阻害
物質に対する耐性をもち、該修飾された酵素が、Δ₃をイソロイシンとするアミ
ノ酸部分配列 ＹΔ₃Ｇを含んでいる核酸分子である。

【００９２】 好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性
をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を含む
核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素の阻害
物質に対する耐性をもち、該修飾された酵素が、Δ₇をヒスチジン又はアラニン
、ただし特にヒスチジンとするアミノ酸部分配列 Δ₇ＩＧを含んでいる核酸分子
である。

【００９３】 さらに好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス
）活性をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列
を含む核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素
の阻害物質に対する耐性をもち、該修飾された酵素が、Δ₁₈をアラニン以外のア
ミノ酸であるものとするアミノ酸部分配列ＫＡΔ₁₈Ｆを含んでいる核酸分子であ
る。最も好ましくは、Δ₁₈はトレオニン又はバリンである。

【００９４】 好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性
をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を含む
核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素の阻害
物質に対する耐性をもち、該修飾された酵素が、Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸
とするアミノ酸部分配列ＱΔ₁₉Ｈを含んでいる核酸分子である。

【００９５】 本発明のもう１つの好ましい実施形態は、プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ（プロトックス）活性をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離され
たヌクレオチド配列を含む核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生す
るプロトックス酵素の阻害物質に対して耐性をもち、該修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ； （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ； （ｃ） Δ₁をアルギニン以外のアミノ酸ただし特にロイシン又はシステインと
する、ＡＰΔ₁Ｆ； （ｄ） Δ₂をロイシンとする、ＦΔ₂Ｓ； （ｅ） Δ₃をイソロイシンとする、ＹΔ₃Ｇ； （ｆ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 （ｇ） Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするＴΔ₁₆Ｇ及び、Δ₁₇をアラニン以
外のアミノ酸とするＹＶΔ₁₇Ｇ、 というアミノ酸部分配列のうちの少なくとも１つのを含んで成り、 （表１Ｂ：部分配列１〜１０及び１８〜１９；及び１６〜１７）、 さらに該修飾された酵素が、第１のアミノ酸部分配列そしてさらに： （ｃ）（ｄ） Δ₁₁をプロリン以外のアミノ酸とするＱΔ₁₁Ｓ； （ｂ）（ｅ） Δ₁₂をトレオニン以外のアミノ酸とするＩＧＧΔ₁₂； （ｅ） Δ₁₃をセリン以外のアミノ酸とするＳＷＸＬΔ₁₃； （ｆ） Δ₁₄をアスパラギン以外のアミノ酸とするＬΔ₁₄Ｙ；及び （ｇ） Δ₁₅をチロシン以外のアミノ酸とするＧΔ₁₅ＸＧＬ、 から成るグループの中から選択された少なくとも１つの付加的アミノ酸部分配列
を含んで成る核酸分子に向けられている。

【００９６】 本発明のもう１つの好ましい実施形態は、プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ（プロトックス）活性をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離され
たヌクレオチド配列を含む核酸分子において、該修飾された酵素が天然に発生す
るプロトックス酵素の阻害物質に対して耐性をもち、該修飾された酵素が、Δ₇
をチロシン以外のアミノ酸とするアミノ酸部分配列 Δ₇ＩＧ；Δ₁₂をトレオニン
以外のアミノ酸とするアミノ酸部分配列 ＩＧＧΔ₁₂；及びΔ₁₃をセリン以外の
アミノ酸とするアミノ酸部分配列 ＳＷＸＬΔ₁₃を含んでいる核酸分子に向けら
れている。最も好ましくは、Δ₇は、イソロイシンであり、Δ₁₂はイソロイシン
であり、Δ₁₃はロイシンである。

【００９７】 本発明のさらにもう１つの好ましい実施形態は、プロトポルフィリノーゲンオ
キシダーゼ（プロトックス）活性をもつ修飾された酵素をコードする植物から分
離されたヌクレオチド配列を含み、該修飾された酵素が天然に発生するプロトッ
クス酵素の阻害物質に対する耐性をもち、ヌクレオチド配列はさらに、 （ａ） 核酸配列が、Δ₁をロイシンとするアミノ酸部分配列ＡＰΔ₁Ｆをコード
する配列を有する； （ｂ） 核酸配列が、Δ₂をロイシンするアミノ酸部分配列ＦΔ₂Ｓをコードする
配列を有する； （ｃ） 核酸配列が、Δ₃をイソロイシンとするアミノ酸部分配列ＹΔ₃Ｇをコー
ドする配列を有する； （ｄ） 核酸配列が、Δ₇をアラニン又はヒスチジンとするアミノ酸部分配列
Δ₇ＩＧをコードする配列を有する； （ｅ） 核酸配列が、Δ₃アラニン以外但し好ましくはシステイン又はイソロイ
シン、より好ましくはイソロイシンとするアミノ酸部分配列ＹΔ₃Ｇをコードす
る配列を有し、核酸配列が同様に： （１） Δ₁₁をプロリン以外のアミノ酸とする、部分配列ＱΔ₁₁Ｓ； （２） Δ₁₂をトレオニン以外のアミノ酸とする、部分配列ＩＧＧΔ₁₂； （３） Δ₁₃をセリン以外のアミノ酸とする、部分配列 ＳＷＸＬΔ₁₃； （４） Δ₁₄をアスパラギン以外のアミノ酸とする部分配列ＬΔ₁₄Ｙ； （５） Δ₁₅をチロシン以外のアミノ酸とする、部分配列ＧΔ₁₅ＸＧＬ、 から成るグループのうちの１つをコードする配列を有する； （ｆ） 核酸配列が、Δ₇をチロシン以外但し好ましくはトレオニン、アラニン
又はヒスチジン、より好ましくはアラニン又はヒスチジンそして最も好ましくは
ヒスチジンとするアミノ酸部分配列 Δ₇ＩＧをコードする配列を有し、核酸配列
が同様に： （１） Δ₁₁をプロリン以外のアミノ酸とする、部分配列ＱΔ₁₁Ｓ； （２） Δ₁₂をトレオニン以外のアミノ酸とする、部分配列ＩＧＧΔ₁₂； （３） Δ₁₃をセリン以外のアミノ酸とする、部分配列 ＳＷＸＬΔ₁₃； （４） Δ₁₄をアスパラギン以外のアミノ酸とする部分配列ＬΔ₁₄Ｙ； （５） Δ₁₅をチロシン以外のアミノ酸とする、部分配列 ＧΔ₁₅ＸＧＬ、 から成るグループのうちの１つをコードする配列を有する、 （ｇ） 核が、Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするアミノ酸部分配列ＴΔ₁₆Ｇ
をコードする配列を有し、核酸配列が同様にΔ₁₇をアラニン以外のアミノ酸とす
るアミノ酸部分配列ＹＶΔ₁₇Ｇをコードする配列を有する； （ｈ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とするＫＡΔ₁₈Ｆ； （ｉ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とするＱΔ₁₉Ｈ、 という条件のうちの少なくとも１つが満たされていることを特徴としている核酸
分子に向けられている。

【００９８】 好ましくは、前記核酸配列は、Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするアミノ酸
部分配列ＴΔ₁₆Ｇをコードする配列を有し、前記核酸配列は同様に、Δ₁₇をアラ
ニン以外のアミノ酸とするアミノ酸部分配列ＹＶΔ₁₇Ｇをコードする配列を有す
る。好ましくは、核酸配列は、Δ₁₆をセリンとするアミノ酸部分配列 ＴΔ₁₆Ｇ
をコードする配列を有し、前記核酸配列は又、Δ₁₇をトレオニンとするアミノ酸
部分配列 ＹＶΔ₁₇Ｇをコードする配列を有する。

【００９９】 同様に好ましいのは、配列番号６のアミノ酸８８に対応する位置で発生するア
ルギニンがもう１つのアミノ酸で置換されている植物プロトックスを含む修飾さ
れたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードし、修飾
されたプロトックスが、天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で除草剤
に対する寛容性をもつＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、アルギニンがロイ
シン又はシステインで置換されているＤＮＡ分子である。

【０１００】 同様に好ましいのは、配列番号６のアミノ酸１５９に対応する位置において発
生するシステインがロイシンで置換されている植物プロトックスを含む修飾され
たプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ
分子である。

【０１０１】 同様に好ましいのは、配列番号６のアミノ酸１７５に対応する位置で発生する
アラニンがもう１つのアミノ酸で置換されている植物プロトックスを含む修飾さ
れたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードし、修飾
されたプロトックスが、天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で除草剤
に対する寛容性をもつＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、アラニンがバリン
又はトレオニンで置換されているＤＮＡ分子である。

【０１０２】 同様に好ましいのは、配列番号６のアミノ酸３３７に対応する位置で発生する
ロイシンがもう１つのアミノ酸で置換されている植物プロトックスを含む修飾さ
れたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードし、修飾
されたプロトックスが、天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で除草剤
に対する寛容性をもつＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、ロイシンがセリン
で置換されているＤＮＡ分子である。

【０１０３】 同様に好ましいのは、配列番号１６のアミノ酸４２８に対応する位置において
発生するチロシンがヒスチジン又はアラニン、好ましくはヒスチジンで置換され
ている植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子である。

【０１０４】 同様に好ましいのは、配列番号２のアミノ酸２２０に対応する位置において発
生するアラニンがイソロイシン又はチロシン、好ましくはイソロイシンで置換さ
れている植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子である。

【０１０５】 同様に好ましいのは、配列番号２のアミノ酸４２６に対応する位置において発
生するチロシンがアラニンで置換されている植物プロトックスを含む修飾された
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分
子である。

【０１０６】 同様に好ましいのは、配列番号６のアミノ酸３４７に対応する位置において発
生するロイシンがセリンで置換されており、配列番号６のアミノ酸４５３に対応
する位置において発生するアラニンがトレオニンで置換されている植物プロトッ
クスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）
をコードするＤＮＡ分子である。

【０１０７】 本発明はさらに、第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換をもつ植物プロ
トックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトック
ス）をコードし、該第１のアミノ酸置換がプロトックス阻害物質に対する耐性を
付与する物性をもち、第２のアミノ酸置換が第１のアミノ酸置換により付与され
た耐性を増強する特性をもつＤＮＡ分子、ただし特に、該植物がトウモロコシ、
小麦、大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、イネ、ソルガム、サトウキビ
、及びシロイヌナズナから成るグループの中から選択されている植物プロトック
スを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）を
コードするＤＮＡ分子を開示している。好ましいのは、 第１のアミノ酸置換が （ａ） 配列番号６のアミノ酸８８におけるアルギニンに対応する位置； 配列番号６のアミノ酸１７５におけるアラニンに対応する位置；及び （ｃ） 配列番号６のアミノ酸３３７におけるロイシンに対応する位置、 からなるグループの中から選択された位置で起こる、請求項２５に記載の核酸分
子。

【０１０８】 特に好ましいのは、第１のアミノ酸置換が、 （ａ） 配列番号６のアミノ酸８８におけるアルギニンに対応する位置； （ｂ） 配列番号６のアミノ酸１６４におけるアラニンに対応する位置； （ｃ） 配列番号６のアミノ酸１６５におけるグリシンに対応する位置； （ｄ） 配列番号６のアミノ酸３７０におけるチロシンに対応する位置； （ｅ） 配列番号６のアミノ酸１５９におけるシステインに対応する位置； （ｆ） 配列番号６のアミノ酸４１９におけるイソロイシンに対応する位置； （ｇ） 配列番号１０のアミノ酸３５６におけるバリンに対応する位置； （ｈ） 配列番号１０のアミノ酸４２１におけるセリンに対応する位置； （ｉ） 配列番号１０のアミノ酸５０２におけるバリンに対応する位置； （ｊ） 配列番号１０のアミノ酸２１１におけるアラニンに対応する位置； （ｋ） 配列番号１０のアミノ酸２１２におけるグリシンに対応する位置； （ｌ） 配列番号１０のアミノ酸４６６におけるイソロイシンに対応する位置； （ｍ） 配列番号１２のアミノ酸３６９におけるプロリンに対応する位置； （ｎ） 配列番号１２のアミノ酸２２６におけるアラニンに対応する位置； （ｏ） 配列番号１２のアミノ酸４３２におけるチロシンに対応する位置； （ｐ） 配列番号１２のアミノ酸５１７におけるバリンに対応する位置； （ｑ） 配列番号１６のアミノ酸４２８におけるチロシンに対応する位置； （ｒ） 配列番号１６のアミノ酸３６５におけるプロリンに対応する位置； （ｓ） 配列番号１８のアミノ酸４４９におけるチロシンに対応する位置； （ｔ） 配列番号６のアミノ酸１７５におけるアラニンに対応する位置；及び （ｕ） 配列番号６のアミノ酸３３７におけるロイシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こり、かつ 第２のアミノ酸置換が： （ａ） 配列番号２のアミノ酸３０５におけるセリンに対応する位置； （ｂ） 配列番号２のアミノ酸２４９におけるトレオニンに対応する位置； （ｃ） 配列番号２のアミノ酸１１８におけるプロリンに対応する位置； （ｄ） 配列番号２のアミノ酸４２５におけるアスパラギンに対応する位置；及
び （ｅ） 配列番号２のアミノ酸４９８におけるチロシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こるＤＮＡ分子である。

【０１０９】 特に好ましいのは、第１のアミノ酸置換が： （ａ） 配列番号６のアミノ酸８８におけるアルギニンに対応する位置； （ｂ） 配列番号６のアミノ酸１７５におけるアラニンに対応する位置；及び （ｃ） 配列番号６のアミノ酸３３７におけるロイシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こり、かつ第２のアミノ酸置換が （ａ） 配列番号２のアミノ酸３０５におけるセリンに対応する位置； （ｂ） 配列番号２のアミノ酸２４９におけるトレオニンに対応する位置； （ｃ） 配列番号２のアミノ酸１１８におけるプロリンに対応する位置； （ｄ） 配列番号２のアミノ酸４２５におけるアスパラギンに対応する位置；及
び （ｅ） 配列番号２のアミノ酸４９８におけるチロシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こるＤＮＡ分子である。

【０１１０】 特に好ましいのは、配列番号６の残基８８に対応する位置で発生するアルギニ
ンがシステイン又はロイシンで置換されているＤＮＡ分子である。

【０１１１】 より好ましいのは、配列番号６の残基１５９に対応する位置において発生する
システインがロイシンで置換されているＤＮＡ分子である。

【０１１２】 特に好ましいのは、配列番号６の残基１７５に対応する位置で発生するアラニ
ンがトレオニン及びバリンから成るグループの中から選択されたアミノ酸で置換
されているＤＮＡ分子である。

【０１１３】 特に好ましいのは、配列番号６の残基３３７に対応する位置で発生するロイシ
ンがセリンで置換されているＤＮＡ分子である。

【０１１４】 さらに好ましいのは、配列番号１６の残基４２８に対応する位置において発生
するチロシンがヒスチジン又はアラニンで置換されているＤＮＡ分子である。 本発明はさらに、２重アミノ酸置換をもつ植物プロトックスを含む修飾されたプ
ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子
において、両方のアミノ酸置換がプロトックス阻害物質に対する耐性が存在する
ためにそこに必要とされているＤＮＡ分子に向けられている。好ましいのは、植
物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロ
トックス）をコードし、該植物がトウモロコシ、小麦、大豆、綿花、テンサイ、
セイヨウアブラナ、イネ、ソルガム、サトウキビ、及びシロイヌナズナから成る
グループの中から選択されているＤＮＡ分子である。より好ましいのは、植物が
トウモロコシである植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子である。

【０１１５】 好ましいのは、２重アミノ酸置換を有し、１つのアミノ酸置換が、配列番号６
のアミノ酸３４７においてロイシンに対応する位置で起こり、第２のアミノ酸置
換が、配列番号６のアミノ酸４５３においてアラニンに対応する位置で起こるＤ
ＮＡ分子である。

【０１１６】 特に好ましいのは、配列番号６のアミノ酸３４７に対応する位置で発生するロ
イシンがセリンにより置換され、配列番号６のアミノ酸４５３に対応する位置で
発生するアラニンがトレオニンで置換される、２重アミノ酸置換を有するＤＮＡ
分子である。

【０１１７】 本発明はさらに、植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子において、該植物プロ
トックスが配列番号３７から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含むＤ
ＮＡ分子にも向けられている。

【０１１８】 本発明はさらに、本発明に従った真核生物からのプロトポルフィリノーゲンオ
キシダーゼ（プロトックス）酵素をコードするＤＮＡ分子に対し操作可能な形で
リンクされた基本的に１つのプロモータ，ただし特に植物の中で活性であるプロ
モータを含む発現カセット及びそれを含む組換え型ベクターにも向けられている
。本発明に従った発現カセットは、さらに、ＤＮＡ分子に操作可能な形でリンク
されかつ葉緑体又はミトコンドリア内へＤＮＡ分子によりコードされたタンパク
質をターゲッティングする能力をもつシグナル配列を含む。

【０１１９】 本発明は、本発明に従った真核生物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ（プロトックス）酵素をコードする異種ＤＮＡ分子に対し操作可能な形でリ
ンクされた基本的に１つのプロモータただし特に植物の中で活性であるプロモー
タを含む発現カセットを含んで成るキメラ遺伝子に関する。好ましいのは、ＰＮ
Ａ分子がサトウキビからのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトック
ス）酵素をコードしているキメラ遺伝子である。

【０１２０】 より好ましいのは、配列番号３７に記されている配列を含むサトウキビからの
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードする異種ＤＮ
Ａ分子に操作可能な形でリンクされた植物中で活性なプロモータを含むキメラ遺
伝子である。

【０１２１】 特に好ましいのは、ＤＮＡ分子が、プロトックス−１活性をもつサトウキビか
らのタンパク質をコードするキメラ遺伝子、好ましくは、タンパク質がＳ３７に
記されたアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。

【０１２２】 本発明は同様に、酵素の対応する未修飾バージョンを阻害するレベルで除草剤
に対する耐性をもつ、本発明に従った真核生物からのプロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ（プロトックス）酵素をコードするＤＮＡ分子に操作可能な形でリ
ンクされた、基本的に１つのプロモータ、ただし特に１つの植物中で活性なプロ
モータを含む発現カセットを含むキメラ遺伝子を実施している。好ましいのは、
シロイヌナズナ、 サトウキビ、大豆、大麦、綿花、タバコ、テンサイ、セイヨ
ウアブラナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、ライ麦、オート麦、芝生及び飼料
牧草、アワ、青刈飼料及びイネから成るグループの中から選択された植物からの
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵素をＤＮＡ分子がコ
ードするキメラ遺伝子である。より好ましいのは、大豆、綿花、タバコ、テンサ
イ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、ライ麦、オート麦、芝
草及びイネから成るグループの中から選択された植物からのプロトポルフィリノ
ーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をＤＮＡ分子がコードするキメラ遺伝子で
ある。特に好ましいのは、シロイヌナズナ、 大豆、綿花、テンサイ、セイヨウ
アブラナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム及びイネから成るグループの中から選
択された植物からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）酵
素をＤＮＡ分子がコードしているキメラ遺伝子である。

【０１２３】 本発明に包含されているのは、プロトックス阻害物質に対する耐性を付与する
特性をもつ少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する真核性プロトックスを含む修
飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードする
本発明に従ったＤＮＡ分子に操作可能な形でリンクされた植物内で活性なプロモ
ータを含むキメラ遺伝子である。

【０１２４】 同様に本発明に包含されているのは、第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸
置換をもち；該第１のアミノ酸置換がプロトックス阻害物質に対する耐性を付与
する特性をもち；第２のアミノ酸置換が第１のアミノ酸置換により付与された耐
性を増強する特性をもつ、植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードする本発明に従ったＤＮＡ分子
に操作可能な形でリンクされた植物内で活性なプロモータを含むキメラ遺伝子で
ある。好ましいのは、ＤＮＡ分子に操作可能な形でリンクされかつ葉緑体又はミ
トコンドリア内にＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質をターデティングす
る能力をもつシグナル配列をさらに含むキメラ遺伝子である。

【０１２５】 本発明に従ったキメラ遺伝子は、その上、本発明のＤＮＡ分子に操作可能な形
でリンクされ、かつ葉緑体の中にＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質を
ターゲティングする能力をもつシグナル配列をさらに含んでいてよい。本発明に
従ったキメラ遺伝子はその上、本発明のＤＮＡ分子に操作可能な形でリンクされ
かつ、ミトコンドリアの中にＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質をター
デティングする能力をもつシグナル配列をさらに含むことができる。

【０１２６】 同じく本発明に包含されているのは、以上で言及されている、宿主ゲノム内に
安定した形で組込まれたＤＮＡ分子のいずれかである。

【０１２７】 本発明はさらに、本発明に従った植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
（プロトックス）又はその機能的に等価の誘導体を含む組換え型ＤＮＡ分子に関
する。

【０１２８】 本発明はさらに、本発明の組換え型ＤＮＡ分子を含む組換え型ＤＮＡベクター
に関する。

【０１２９】 本発明のさらなる目的は、宿主細胞内に安定した形で形質転換される能力をも
つ、本発明に従ったキメラ遺伝子を含む組換え型ベクターである。

【０１３０】 本発明のさらなる目的は、植物、植物種子、植物組織又は植物細胞内に安定し
た形で形質転換される能力をもち、本発明に従ったキメラ遺伝子を含んで成る組
換え型ベクターである。好ましいのは、本発明に従ったキメラ遺伝子を含み、植
物内に安定した形で形質転換される能力をもつ組換え型ベクターである。ベクタ
ーで安定した形で形質転換された植物、植物種子、植物組織又は植物細胞は、プ
ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子
を発現する能力をもつ。好ましいのは、ベクターで安定した形で形質転換された
植物、植物種子、植物組織又は植物細胞が、酵素の対応する未修飾バージョンを
阻害するレベルで除草剤に対する耐性をもつ植物からのプロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子を発現する能力をもつ
。

【０１３１】 好ましいのは、配列番号３７に記された配列を含むサトウキビからのプロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードする異種ＤＮＡ分子に
操作可能な形でリンクされた、植物中で活性なプロモータを含む本発明のキメラ
遺伝子を含んで成り、宿主細胞内に安定した形で形質転換される能力をもつ組換
え型ベクターである。

【０１３２】 好ましいのは、第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換をもち、該第１の
アミノ酸置換がプロトックス阻害物質に対する耐性を付与する特性をもち第２の
アミノ酸置換が第１のアミノ酸置換により付与された耐性を増強する特性をもつ
植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プ
ロトックス）をコードするＤＮＡ分子に操作可能な形でリンクされた植物内で活
性なプロモータを含む本発明のキメラ遺伝子を含んで成り、植物細胞内に安定し
た形で形質転換される能力をもつ組換え型ベクターである。

【０１３３】 同様に本発明に包含されているのは、本発明に従ったベクターで安定した形で
形質転換され、ＤＮＡ分子を発現する能力をもつ宿主細胞である。好ましいのは
、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞及び昆虫細胞から成るグループの中から選択さ
れた宿主細胞である。

【０１３４】 本発明はさらに、植物内で天然に発生するプロトックス活性を阻害する除草剤
に対する寛容性をもち、該寛容性が本書で教示されているような修飾された阻害
物質耐性プロトックス酵素を発現する遺伝子によって付与されている、植物及び
その後代、植物組織及び植物種子にも向けられている。代表的植物としては、こ
れらの除草剤をその通常意図された目的のために適用できるあらゆる植物が内含
される。好ましいのは、作物学的に重要な作物、すなわち、シロイヌナズナ、サ
トウキビ、大豆、大麦、綿花、タバコ、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウモロ
コシ、小麦、ソルガム、ライ麦、オート麦、トマト、ジャガイモ、芝草及び飼料
牧草、アワ、青刈飼料及びイネなどといった被子植物及び裸子植物である。より
好ましいのは、作物学的に重要な作物すなわちシロイヌナズナ、綿花、大豆、セ
イヨウアブラナ、テンサイ、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、オート麦、ライ
麦、ソルガム、アワ、芝、青刈飼料、芝草といった被子植物及び裸子植物である
。特に好ましいのは、作物学的に重要な作物、すなわちシロイヌナズナ、大豆、
綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム及びイネと
いったような被子植物及び裸子植物である。

【０１３５】 好ましいのは、第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換をもち、該第１の
アミノ酸置換がプロトックス阻害物質に対する耐性を付与する特性をもち第２の
アミノ酸置換が第１のアミノ酸置換により付与された耐性を増強する特性をもつ
植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プ
ロトックス）をコードするＤＮＡ分子を含み、ここで該ＤＮＡ分子が植物内で発
現され天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で除草剤に対する寛容性を
該植物に付与するような植物である。好ましいのは、ＤＮＡ分子が対応する天然
に発生するプロトックスコーティング配列に置き換わっている植物である。本発
明に含まれるのは、天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で除草剤に対
する寛容性を植物に付与する、本発明に従ったキメラ遺伝子を含む植物及びその
後代である。

【０１３６】 本発明により包含されているのは、本発明に従った少なくとも１つのキメラ遺
伝子で安定した形で形質転換された植物及びその後代、種子及び培養された組織
を含む遺伝子導入植物組織である。好ましいのは、植物組織内で酵素の対応する
未修飾バージョンを阻害するレベルで除草剤に対する耐性をもつプロトポルフィ
リノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子に操作可能な
形でリンクされた、基本的に１つのプロモータただし特に植物中で活性であるプ
ロモータを含む発現カセットを含んで成る少なくとも１つのキメラ遺伝子で安定
した形で形質転換された、植物、種子及び培養組織を含めた遺伝子導入植物組織
である。

【０１３７】 本発明はさらに、植物内で天然に発生するプロトックス活性を阻害する除草剤
に対し寛容性をもち、該寛容性が、野生型除草剤感受性プロトックスの発現を増
大させることによって付与される、植物、植物組織、植物種子、及び植物細胞に
向けられている。その結果、植物細胞内のプロトックス酵素のレベルは、少なく
とも除草剤によってひき起こされる成長阻害を克服するのに充分なものとなる。
一般に、発現された酵素のレベルは、天然に発現される量の少なくとも２倍、好
ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍である。発現の増大
は、野生型プロトックス遺伝子の多重コピー、遺伝子内のコーティング配列の多
重出現（すなわち遺伝子増幅）又は植物細胞内の内因性遺伝子の非コーディング
調節配列内の突然変異に起因する可能性がある。かかる改変された遺伝子活性を
もつ植物は、当該技術分野において既知の方法により植物内で直接的選択によっ
て得られる（例えば米国特許第５，１６２，６０２号及び米国特許第４，７６１
，３７３号及びその中の引用参考文献を参照）。これらの植物は同様に、当該技
術分野において既知の遺伝子工学技術により得ることができる。除草剤感受性プ
ロトックス遺伝子の発現の増大は、プロトックス酵素をコードする同種又は異種
の構造遺伝子に操作可能な形でリンクされた植物細胞の中で会合された構造遺伝
子の発現を駆動する能力をもつプロモータを含む組換え型又はキメラＤＮＡ分子
で植物細胞を安定した形で形質転換させることによっても達成可能である。

【０１３８】 本発明の組換え型ＤＮＡ分子は、当該技術分野で認知された数多くの方法で植
物細胞中に導入され得る。当業者であれば、方法の選択が形質転換のためにター
ゲティングされた植物のタイプすなわち単子葉植物か双子葉植物かによって左右
される可能性があるということを認識するだろう。 植物細胞を形質転換させる適切な方法には、微量注入（Crossway et al., Bio T
echnique ４：３２０−３３４(１９８６)）、電気穿孔法（Riggs et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA ８３：５６０２−５６０６(１９８６)）、Agrobacterium
を媒介とする形質転換（Hinchee et al, Biotechnology ６：９１５−９２１(１
９８８)）、直接的遺伝子移入（Paszkowski et al, EMBO J. ３：２７１７−２
７２２(１９８４)）、Agracetus Inc., Madison, Wisconsin 及びDupon, Inc.,
Wilmington, Delaware より入手可能な装置を用いた弾道粒子加速（例えば、San
ford et al., 米国特許第４，９４５，０５０号；及びMcCabe et al., Biotechn
ology ６：９２３−９２６(１９８８)を参照のこと）、原形質体形質転換／再生
方法（Ciba-Geigy Corp.,に対する１９９４年９月２７日付け米国特許第５，３
５０，６８９号を参照のこと）、及び花粉形質転換（米国特許第５，６２９，１
８３号参照）が含まれる。同様に、Weissinger et al., Annual Rev. Genet. ２
２：４２１−４７７(１９８８)； Sanford et al., Particulate Science and T
echnology 5:27-37(1987)（タマネギ）；Christou et al., Plant Physiol. ８
７：６７１−６７４(１９８８)(大豆)；McCabe et al., Bio/Technology ６：９
２３−９２６(１９８８)(大豆)；Datta et al., Bio/Technology ８：７３６−
７４０(１９９０)(イネ）；Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８５
：４３０５−４３０９(１９８８)(トウモロコシ)；Klein et al., Bio/Technolo
gy, ６：５５９−５６３(１９８８)（トウモロコシ）；Klein et al., Plant Ph
ysiol. ９１：４４０−４４４(１９８８)（トウモロコシ）；Fromm et al., Bio
/Technology ８：８３３−８３９(１９９０)；Gordon-Kamm et al., Plant Cell
２：６０３−６１８(１９９０)（トウモロコシ）；及び米国特許第５，５９１
，６１６号及び５，６７９，５５８号（イネ）も参照のこと。

【０１３９】 本発明の範囲内に含まれるのは、通常は植物内の天然に発生するプロトックス
活性にとって阻害性あるレベルの除草剤による阻害に対する耐性又は少なくとも
寛容性をなおも有している、遺伝子導入植物、特に前述のプロセスを用いて形質
転換された遺伝子導入稔性植物、及びそれらの無性及び／又は有性後代である。
後代植物にはさらに、親植物とは異なる遺伝子背景をもち、もどし交雑プログラ
ムの結果として得られ、なおも本発明に従った除草剤耐性形質をそのゲノム内に
含む植物も内含されている。特に好ましいのは、通常は植物中の天然に発生する
プロトックス活性にとって阻害性あるレベルの除草剤による阻害に対する耐性又
は少なくとも寛容性をもつハイブリッド植物である。

【０１４０】 本発明に従った遺伝子導入植物は、双子葉植物であっても単子葉植物であって
もよい。好ましいのは、Lolium、 Zea、 Triticum、 Triticale、 Sorghum、 Sa
ccharum、 Bromus、 Oryzae、 Avena、 Hordeum、 Secale及びSetaria 植物を含
むGraminacee科の単子葉植物である。より好ましいのは、遺伝子導入トウモロコ
シ、小麦、大麦、ソルガム、ライ麦、オート麦、サトウキビ、芝草及び飼料牧草
、アワ及びイネである。特に好ましいのは、トウモロコシ、小麦、ソルガム、ラ
イ麦、オート麦、芝草及びイネである。

【０１４１】 双子葉植物のうち、ここでは、シロイヌナズナ、大豆、綿花、テンサイ、セイ
ヨウアブラナ、タバコ、トマト、ポテト及びヒマワリがより好まれる。特に好ま
しいのは、大豆、綿花、タバコ、テンサイ、トマト、ジャガイモ及びセイヨウア
ブラナである。

【０１４２】 「後代」という表現は、遺伝子導入植物の「無性」及び「有性」的に生成され
た後代の両方を包含するものとして理解される。この定義づけは同様に、例えば
細胞融合又は突然変異体選択のための既知のプロセスを用いて得ることができし
かも、当初の形質転換植物の特徴的特性をなおも示す全ての突然変異体及び変異
体、ならびに形質転換された植物材料の全ての交雑及び融合産物を内含すること
とされている。これには又、後代植物がなおも本発明に従った除草剤耐性形質を
含むかぎりにおいて、戻し交雑プログラムの結果として得られる後代植物も内含
される。

【０１４３】 本発明のもう１つの目的は、遺伝子導入植物の増殖材料に関する。遺伝子導入
植物の増殖材料は、本発明に関しては、in vivo又はin vitroで有性的又は無性
的に生殖しうるあらゆる植物材料として定義づけされる。本発明の範囲内で特に
好ましいのは、原形質体、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚芽、花粉、卵細
胞、接合体、ならびに遺伝子導入植物から得られるその他のあらゆる生殖材料で
ある。

【０１４４】 植物の一部分は、例えば、本発明のプロセスを用いて先に形質転換され従って
少なくとも部分的に遺伝子導入細胞で構成されている遺伝子導入植物又はその後
代に由来する花、茎、果実、葉、根も同様に本発明の１つの目的である。

【０１４５】 本発明のもう１つの目的は、本発明のプロセスを用いて先に形質転換され従っ
て本発明に従ったＤＮＡで植物、植物部分を形質転換させることによって植物プ
ロトックス酵素の阻害物質耐性形態を産生する遺伝子導入植物又はその後代に由
来する植物、原形質体、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚芽、花粉、卵細胞
、接合体ならびにその他のあらゆる生殖材料、植物の一部分例えば花、茎、果実
、葉、根を産生する方法にある。好ましいのは、本発明に従った組換え型ベクタ
ー分子で宿主細胞を形質転換する段階を含んで成る、プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ（プロトックス）活性をもつ真核生物からのタンパク質をコードす
る分離されたＤＮＡ分子を含む宿主細胞の産生方法である。さらに好ましいのは
、本発明に従った組換え型ベクター分子で植物細胞を形質転換する段階を含んで
成る、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性をもつ真核
生物からのタンパク質をコードする分離されたＤＮＡ分子を含む植物細胞の産生
方法である。好ましいのは、本発明に従った組換え型ベクター分子で親植物を形
質転換させる段階及び植物育種技術が関与する遺伝子導入親植物の後代に対して
除草剤寛容性形質を移入させる段階を含んで成る、プロトポルフィリノーゲンオ
キシダーゼ（プロトックス）活性をもつ真核生物からのタンパク質をコードする
分離されたＤＮＡ分子を含む遺伝子導入親植物の遺伝子導入後代の産生方法であ
る。

【０１４６】 好ましいのは、耐性プロトックス酵素をコードする構造遺伝子で安定した形で
形質転換された、植物プロトックス酵素の阻害物質耐性形態を産生する植物、植
物組織、植物種子及び植物部分の産生方法である。特に好ましいのは、本発明に
従ったＤＮＡで安定した形で形質転換された植物、植物組織、植物種子及び植物
部分の産生方法である。特に好ましいのは、除草剤耐性系統を分離し特徴づけし
開発する直接的選択技術によって調製された、植物プロトックス酵素の阻害物質
耐性形態を産生する植物、植物組織、植物種子及び植物部分の産生方法である。

【０１４７】 上述の遺伝子導入種子及び植物内に工学処理された遺伝的材料は、有性生殖又
は栄養成長により伝えられ、かくして後代植物内で維持され伝播される。一般に
、この維持及び伝播には、耕うん、播種又は収獲といったような特定の目的に合
うように開発された既知の農業的方法が使用される。養液栽培又は温室技術とい
ったような専門的プロセスも応用できる。成長する作物は、昆虫又は感染によっ
てひき起こされる攻撃及び損傷、ならびに雑草植物による競合を受けやすいこと
から、雑草、植物疾病、昆虫、線虫及び収量を改善するのに不利なその他の条件
を制御するための措置が講じられている。これには、土壌の耕うん又は雑草及び
感染した植物の除去といった機械的措置ならびに除草剤、殺真菌剤、生殖体撲滅
薬、殺線虫剤、成長調節薬、発熱剤及び殺虫剤といったような農薬の散布が含ま
れる。

【０１４８】 本発明に従った遺伝子導入植物及び種子の有利な遺伝的特性はさらに、有害生
物寛容性、除草剤寛容性Ｒ又はストレス寛容性といったような改善された特性、
改善された栄養価、増大した収量又は倒伏又は実こぼれによる損失を減少させる
改善された構造をもつ植物の開発を目指した植物育種においても使用可能である
。さまざまな育種段階は、交雑すべき系統の選択、親系統の受粉の誘導又は適切
な後代植物の選択といったような明確な人間の介入により特徴づけられている。
所望の特性に応じて、異なる育種措置が講じられる。関連する技術は当該技術分
野において周知のものであり、ハイブリダイゼーション、同系交配、もどし交配
、多系交配、品種配合、種間ハイブリダイゼーション、異数体技術などが含まれ
るが、これらに制限されるわけではない。ハイブリダイゼーション技術には、機
械的、化学的又は生化学的手段による雄又は雌の不稔植物を生み出すための植物
の不妊化も含まれる。異なる系統の花粉と雄不稔植物の他家受粉は、雄不稔であ
るものの雌稔性の植物のゲノムが確実に両親系統の特性を均等に得られるように
する。かくして、本発明に従った遺伝子導入種子及び植物は、例えば、除草剤又
は殺虫薬処理といった従来の方法の有効性を増大させるか又はその修飾された遺
伝的特性による方法を無しですますことができるようにする改善された植物系統
の育種のために使用することができる。代替的には、その遺伝的「装備」が最適
化されたために、匹敵する不利な開発条件を寛容できなかった産物に比べて優れ
た質の収獲産物を生み出す、改善されたストレス寛容性をもつ新しい作物を得る
ことができる。

【０１４９】 種子の生産においては、種子の発芽品質及び均質性が不可欠の産物特徴である
が、一方、農家が収獲し販売する種子の発芽品質及び均質性は重要ではない。１
つの作物をその他の作物及び雑草の種子を含まない状態に保ち、種子伝染病を制
御し、優れた発芽の種子を生産することは困難であるため、純粋種子の培養、調
質及び販売技術の経験が豊かな種子生産者によって、かなり高価で明確に規定さ
れた種子生産実践方法が開発されてきた。かくして、農家が自らの作物から収獲
した種子を使用する代りに、特定の品質規準を満たす保証種子を購入するのが一
般的な慣行となっている。種子として使用すべき繁殖材料は、慣習的に、除草剤
、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫薬、軟体動物駆除剤、又はその混合物を含
む保護剤コーティングで処理される。慣習的に使用される保護剤コーティングに
は、カプタン、カルボキシン、チイラム（ＴＭＴＤ（商標））、メタラキシル（
Apron（商標））及びピリミフォス−メチル（Actellic（商標））が含まれる。
望まれる場合、これらの化合物は、細菌、真菌又は動物の有害生物によりひき起
こされる損害に対する保護を提供するべく処方技術分野で慣習的に利用されてい
るさらなる担体、界面活性剤又は適用促進用アジュバンドと合わせて処方される
。保護剤コーティングは、繁殖材料に液体製剤を含浸させるか又は乾式又は湿式
の組合せ製剤でコーティングすることによって適用できる。つぼみ又は果実に向
けられた処置といったようなその他の適用方法も同様に可能である。

【０１５０】 かくして本発明のさらなる目的は、栽培植物のための植物生殖材料、特に種子
処置において慣習的に用いられる種子保護剤コーティングで処理された植物種子
を提供することにある。

【０１５１】 本発明のさらなる態様は、本発明に従った遺伝子導入植物、遺伝子導入植物材
料又は遺伝子導入種子の使用を特徴とする、以上で例示した方法といったような
新しい農業方法を提供することにある。本発明に含まれているのは、除草剤に対
する耐性を付与するべく１つの植物内で除草剤標的タンパク質の除草剤耐性形態
を発現するのに充分な量で本発明に従ったキメラ遺伝子を含む遺伝子導入植物又
はその後代が使用される農業方法である。

【０１５２】 本発明の方法に従って形質転換された植物から後代を育種するためには、以下
のような方法を使用することができる： すなわち、以下で記す例中に記述され
ているとおりに生産されたトウモロコシ植物は、当該技術分野において既知のと
おり、温室内の鉢の中又は土の中で成長させられ、開花できる。成熟した雄穂か
ら花粉を得、同一植物、同胞植物又はいずれかの望ましいトウモロコシ植物の穂
に受粉するために使用される。同様にして、形質転換された植物上に発達した穂
には、同一植物、同胞植物又はいずれかの望ましいトウモロコシ植物から得た花
粉を受粉することができる。この方法によって得られた形質転換された後代は、
導入された遺伝子（単複）及び／又は付随するＤＮＡ（遺伝子型）又は付与され
た表現型の存在によって、未形質転換後代と区別することができる。形質転換さ
れた後代は同様にして、望ましい形質をもつあらゆる植物について通常行なわれ
るように、その他の植物に対し交配させてもよいし又は自家受粉させてもよい。
同様にして、この方法によって生産されたタバコ又はその他の形質転換された植
物も、所望の特徴をもつ後代を生産するため当該技術分野において既知である通
りに自家受粉又は交雑させることができる。同様にして、当該技術分野において
既知の方法と本発明の組合せによって生産されたその他の遺伝子導入生体を、所
望の特徴をもつ後代を生産する目的で当該技術分野において既知の通りに育種す
ることもできる。

【０１５３】 本発明の修飾された阻害物質耐性プロトックス酵素は、その天然に発生する対
応物（すなわち組換え型ＤＮＡ方法を介して直接的に又は人間による選択的育種
などを介して間接的に操作されることなく植物内に天然に発生する 阻害物質感
受性形態）に比べて少なくとも１つのアミノ酸置換、付加又は欠失を有する。

【０１５４】 プロトックス酵素の阻害物質耐性形態を生成するため又は阻害物質耐性を増強
させるために修飾させ得るアミノ酸の位置は、シロイヌナズナ、トウモロコシ、
大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、イネ、ソルガム、小麦及びサトウキ
ビからの植物プロトックス−１の場合に関して表１Ａ中に太文字で示されている
。当業者であれば、酵素の阻害物質耐性形態を生成するべく本発明に従って修飾
されるアミノ酸の整列及び同定を可能にするためプロトックス酵素配列と充分類
似する構造をもつあらゆる植物 プロトックス遺伝子に対して同等の変更を加え
ることができるということがわかるだろう。かかる付加的な植物プロトックス遺
伝子は、その関連部分が本書に参考として内含されている、１９９５年６月８日
付けで提出され１９９５年１２月２１日付けでＷＯ９５／３４６５９号として公
示された国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２号の中で記述されている通りの
標準技術を用いて得ることができる。

【０１５５】 本書で教示されている除草剤耐性プロトックスコーディング配列をコードする
ＤＮＡ分子を、作物植物内での最適な発現のために遺伝子工学処理することがで
きる。これには、問題の作物種における最適な発現のため、耐性対立遺伝子のコ
ーティング配列を改変することが含まれていてよい。特定の作物種内での最適な
発現を達成するべくコーティング配列を修飾する方法は、周知のものである（例
えば、Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：３３２４（１９９１
）；Koziel et al., Bio/technol. １１：１９４（１９９３）を参照のこと）。

【０１５６】 最適な発現のためにプロトックスコーディング配列を遺伝子工学処理すること
には、同様に、適切な調節配列（すなわちプロモータ、シグナル配列、転写ター
ミネータ）を操作可能な形でリンクすることも内含され得る。植物又は植物細胞
を機能させる能力をもつプロモータ（すなわち植物細胞内のプロトックスといっ
たような会合された構造遺伝子の発現を駆動する能力をもつプロモータ）の例と
しては、カリフラワモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ又は３５Ｓ プロモー
タ及びＣａＭＶ２重プロモータ；ノパリンシンターゼプロモータ；病原関連性（
ＰＲ）タンパク質 プロモータ；リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ｓｓ
ｕＲＵＢＩＳＣＯ）プロモータ、ＥＰＡ０５５９ ６０３を参考としたBrassica
からの熱ショックタンパク質プロモータ（ｈｓｐ８０ プロモータ）、シロイヌ
ナズナアクチンプロモータ、そしてＷＯ９５／１４０９８を参考としたSuper Ma
s プロモータなど内含される。好ましいプロモータは、高レベルの構成性発現を
付与するプロモータ、又はより好ましくは、除草剤による損傷を受ける可能性の
ある組織内の特異的な高レベル発現を付与するプロモータである。好ましいプロ
モータは、イネアクチンプロモータ（McElroy et al., Mol. Gen. Genet.２３１
：１５０（１９９１））、トウモロコシユビキチンプロモータ（ＥＰ ０３４２
９２６；Taylor et al., Plant Cell Rep.１２：４９１（１９９３））及びタバ
コ、シロイヌナズナ又はトウモロコシからのＰＲ−１プロモータ（その全体が本
書に参考として内含されているRyals et al に対する米国特許第５，６１４，３
９５号を参照のこと）である。プロモータ自体は、当該技術分野で認識されてい
る手順に従って、プロトックス発現を増大させるようにプロモータを操作するべ
く修飾され得る。

【０１５７】 発明人らは、同じく、阻害物質耐性プロトックスコーティング配列と共に使用
するためのもう１つの好ましいプロモータが、未変性プロトックス遺伝子と会合
されたプロモータ（すなわち、プロトックスプロモータ； その全体が本書に参
考として内含されている「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子からの
プロモータ」という題の同時係属共同所有米国特許出願第０８／８０８，３２３
号参照）であるということも発見した。シロイヌナズナプロトックス−１遺伝子
からのプロモータ配列は、配列番号１３に記されており、トウモロコシプロトッ
クス−１遺伝子からのプロモータ配列は配列番号１４の中に記されていおり、テ
ンサイプロトックス−１遺伝子からのプロモータ配列は配列番号２６の中で記さ
れている。

【０１５８】 プロトックスプロモータ自体は、阻害物質耐性プロトックスコーティング配列
の発現に適していることから、本書で教示されている修飾は、異種調節配列をも
つキメラ遺伝子を構築する必要なく植物細胞ゲノム内に存在する未変性プロトッ
クス遺伝子に対し直接行なうことができる。かかる修飾は同種組換えといったよ
うな定方向突然変異誘発技術を介して行なうことができ、結果として得られる除
草剤耐性表現型に基づいて選択できる（例えば例１０、Pazkowski et al., EMBO
J. ７：４０２１−４０２６（１９８８）、及び米国特許第５,４８７,９２２号
、特に第１８〜１９欄及び例８を参照）。このアプローチがもつ付加的な利点は
、天然プロトックスプロモータを含有する以外に、結果として得られる修飾され
た遺伝子が、未変性遺伝子の一部であるシグナル又は輸送ペプチドコーティング
配列といったようなその他のあらゆる調節要素も内含することになる、という点
にある。

【０１５９】 核ゲノムの形質転換の場合、シグナル又は輸送ペプチドは、発現されたプロト
ックス酵素を所望の作用位置まで直接輸送するべく本発明のキメラＤＮＡ構成体
の中でプロトックスコーティング配列に融合され得る。シグナルペプチドの例と
しては、植物病原関連性タンパク質例えばＰＲ−１、ＰＲ−２などに先天的にリ
ンクされたものが内含される。例えば、Payne et al., Plant Mol. Biol.１１：
８９−９４（１９８８）を参照のこと。輸送ペプチドの例としては、Von Heijne
et al., Plant Mol. Biol. Rep.９；１０４−１２６（１９９１）；Mazur et a
l., Plant Physiol.８５：１１１０（１９８７）；Vorst et al., Gene６５：５
９（１９８８）に記述されているもののような葉緑体輸送ペプチド及びBoutry e
t al., Nature ３２８：３４０−３４２（１９８７）に記述されているもののよ
うなミトコンドリア輸送ペプチドが内含される。葉緑体及びミトコンドリア輸送
ペプチドは、プロトックス酵素活性が標準的にミトコンドリア及び葉緑体の内部
で起こることから、本発明では特に有用であると考えられている。葉緑体内のプ
ロトックス酵素活性がプロトックス阻害性除草剤の作用のための主要な根拠であ
ると考えられていることから、使用するのに最も好ましいのは、葉緑体輸送ペプ
チドである。（Witdowski and Halling, Plant Physiol. ８７：６３２（１９８
８）；Lehnen et al., Pestic, Biochem. Physiol.３７：２３９（１９９０）；
Duke et al., Weed Sci.３９：４６５（１９９１））。同様に内含されるのは、
液胞といったようなさまざまな細胞区画にコード化されたタンパク質を局在化さ
せる結果となる配列である。例えばNeuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA ８８：１０３６２−１０３６６（１９９１）及びChrispeels, Ann. Rev. Pla
nt Physiol. Plant Mol. Biol. ４２：２１−５３（１９９１）を参照のこと。
これらの公示物の関連ある開示は、本書にその全体が参考として内含されている
。

【０１６０】 本発明のキメラ遺伝子は、プロトックス構造遺伝子の多重コピー又はプロモー
タの多重コピーを含み得る。さらに、構成体（単複）は、各々ＤＮＡ分子内のそ
の他の機能的要素を伴って適切な読取り枠内にある、マーカーのためのコーディ
ング配列及びシグナル又は輸送ペプチドといったようなその他のペプチドのため
のコーティング配列を内含できる。かかる構成体の調製は、当業者の通常の技能
レベル内に入る。

【０１６１】 有用なマーカーとしては、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８
、ゲンタマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、グリホセート、ホスフ
ィノトリシンなどに対する耐性といったような除草剤、抗生物質又は薬物耐性を
提供するペプチドが内含される。これらのマーカーは、未形質転換細胞から本発
明のキメラＤＮＡ構成体で形質転換された細胞を選択するのに使用することがで
きる。その他の有用なマーカーは、例えばルシフェラーゼ、β−グルクロンダー
ゼ又はβ−ガラクトシダーゼといった、例えば色反応などの可視反応によって容
易に検出され得るペプチド酵素である。

【０１６２】 選択的な利点を形質転換された細胞に備えることによって中に所望のヌクレオ
チド配列を取込むことのできる遺伝的に形質転換された細胞の正の選択方法は、
本書にＷＯ９４／２０６２７として参考として内含されている。 作物植物を再生するもとになる作物植物又は植物細胞培養中の未変性遺伝子の定
方向突然変異を介して除草剤耐性プロトックス対立遺伝子が得られる場合、修飾
されたコーディング配列を遺伝子工学処理しそれを植物内に形質転換する必要な
く、除草剤寛容性作物を開発するため伝統的な育種技術を用いて市販の品種の中
にそれを移動させることができる。代替的には、除草剤耐性遺伝子を分離し、最
適な発現のために遺伝子工学処理し、次に所望の品種へと形質転換させることが
できる。

【０１６３】 プロトックス阻害物質に対する耐性をもつ改変されたプロトックスをコードす
る遺伝子も同様に、植物細胞形質転換方法における選択可能なマーカーとして使
用できる。例えば、トランスジーンで形質転換された植物、植物組織又は植物細
胞を、その植物により発現されうる改変されたプロトックスをコードする遺伝子
で形質転換させることもできる。このように形質転換された細胞は、形質転換さ
れた細胞のみが存続することになる、プロトックス阻害性除草剤を含有する培地
に移される。選択的作用物質として特に有用であると考えられているプロトック
ス阻害性除草剤は、ジフェニルエーテル｛例えばアシフルオルフェン、５−［２
−クロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−ニトロ安息香酸；そ
のメチルエステル；又はオキシフルオルフェン、２−クロロ−１−（３−エトキ
シ−４−ニトロフェノキシ）−４−（トリフルオロベンゼン）｝、オキシジアゾ
ール、（例えば、オキシジアゾン、３−[２，４−ジクロロ−５−（１−メチル
エトキシ）フェニル]−５−（１，１−ジメチルエチル−１，３，４−オキサジ
アゾール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えば、Ｓ-２３１４２、Ｎ−
（４−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３，４，５
，６−テトラヒドロフタルイミド；クロロフタリム、Ｎ−（４−クロロフェニル
）−３，４，５，６−テトラヒドロフタリミド）、フェニルピラゾール（例えば
、ＴＮＰＰ−エチル、エチル２−［１−（２，３，４−トリクロロフェニル）−
４−ニトロピラゾリル−５−オキシ］プロピオネート；Ｍ＆Ｂ３９２７９）、ピ
リジン誘導体（例えばＬＳ８２−５５６）、及びフェノピレートおよびそのＯ−
フェニルピロリジノ及びピペリジノカルバメート類似体及び国際特許出願ＷＯ９
２/０４８２７；ＥＰ５３２１４６に開示されている通りの２環トリアゾロン）
である。

【０１６４】 該方法は、改変されたプロトックスコーディング遺伝子によって形質転換され
る能力をもつあらゆる植物細胞に応用可能であり、有利なあらゆるトランスジー
ンと共に用いることができる。トランスジーン及びプロトックス遺伝子の発現は
、植物細胞上で機能的な同一のプロモータ又は別のプロモータにより駆動され得
る。

【０１６５】 本発明の修飾された阻害物質耐性プロトックス酵素は、天然に発生するプロト
ックス活性を阻害する除草剤に対する耐性を有する。プロトックスを阻害する除
草剤としては、ジフェニルエーテル｛例えばアシフルオルフェン、５−［２−ク
ロロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−２−ニトロ安息香酸；そのメ
チルエステル；又はオキシフルオルフェン、２−クロロ−１−（３−エトキシ−
４−ニトロフェノキシ）−４−（トリフルオロベンゼン）｝、オキシジアゾール
、（例えば、オキシジアゾン、３−[２，４−ジクロロ−５−（１−メチルエト
キシ）フェニル]−５−（１，１−ジメチルエチル−１，３，４−オキサジアゾ
ール−２−（３Ｈ）−オン）、環状イミド（例えば、Ｓ−２３１４２、Ｎ−（４
−クロロ−２−フルオロ−５−プロパルギルオキシフェニル）−３，４，５，６
−テトラヒドロフタリミド；クロロフタリム、Ｎ−（４−クロロフェニル）−３
，４，５，６−テトラヒドロフタリミド）、フェニルピラゾール（例えば、ＴＮ
ＰＰ−エチル、エチル２−［１−（２，３，４−トリクロロフェニル）−４−ニ
トロピラゾリル−５−オキシ］プロピオネート；Ｍ＆Ｂ３９２７９）、ピリジン
誘導体（例えばＬＳ８２−５５６）、及びフェノピレートおよびそのＯ−フェニ
ルピロリジノ−及びピペリジノカルバメート類似体を含めた、数多くの異なる構
造クラスの分子が含まれる（Duke et al., Weed Sci. ３９：４６５(１９９１)
；Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. ４３：１９３(１９９２)
；Matringe et al.,FEBS Lett. ２４５：３５(１９８９)；Yanase and Andoh, P
esticide Biochem. Physiol. ３５：７０(１９８９)）。

【０１６６】 特に有意なジフェニルエーテルは以下の一般構造式を有するものである：

【０１６７】

【化１】

【０１６８】 なお式中、Ｒは、−ＣＯＯＮａ（化ＩＩ）、−ＣＯＮＨＳＯ₂ＣＨ₃（化ＩＩＩ）
、−ＣＯＯＣＨ₂ＣＯＯＣ₂Ｈ₅（化ＩＶ； Maigrot et al., Brighton Crop Pro
tection Conference - Weeds：４７−５１(１９８９)参照）に等しい。

【０１６９】 有利なさらなるフェニルエーテルは、Rが以下のものに等しいものである：

【０１７０】

【化２】

【０１７１】 （化ＩＶａ： Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference - Weed
s：５３−５８(１９８９)参照） 有利な付加的なジフェニルエーテルは以下の構造式を有するものである：

【０１７２】

【化３】

【０１７３】 （化ＩＶｂ：ビフェノックス、Dest et al., Proc. Northeast Weed Sci. Conf.
２７：３１(１９７３)参照） 有利なさらなるジフェニルエーテルは以下の構造式を有するものである：

【０１７４】

【化４】

【０１７５】 （化ＩＶｃ：オキシフルオルフェン、Yih and Swithenbank, J. Agric. Food Ch
em., ２３：５９２(１９７５)参照） 有利なさらにもう一つのジフェンリエーテルは以下の構造式を有するものであ
る：

【０１７６】

【化５】

【０１７７】 （化ＩＶｄ：ラクトフェン、C. Tomlin（編）, British Crop Protection Counc
il, Surrey(１９９４)の「The Pesticide Manual」第１０版６２３頁を参照のこ
と） 同様に有意なのは、以下の一般構造式を有し、イミドとして知られているクラ
スの除草剤である：

【０１７８】

【化６】

【０１７９】 なお式中Ｑは、以下の構造式のいずれかに等しく：

【０１８０】

【化７】

【０１８１】

【化８】

【０１８２】 （「第８回国際殺虫剤化学会議議事録」中のHemper et al.(１９９５)、Ragdale
et al., Amer. Chem. Soc, Washington, D.C., pp. ４２−４８U１９９４）を
参照） かつ、Ｒ₁はＨ、Ｃｌ又はＦに等しく、Ｒ₂はＣｌに等しく、Ｒ３は最適な形で置
換されたエーテル、チオエーテル、エステル、アミノ又はアルキル基に等しい。
代替的には、Ｒ₂及びＲ₃は共に５又は６成員の複素環を形成することができる。
特に有利なイミド除草剤の例は以下の通りである：

【０１８３】

【化９】

【０１８４】 （化ＶＩＩａ：フルチアセト−メチル、Miyazawa et al., Brighton Crop Prote
ction Conference-Weeds, p. ２３−２８(１９９３)参照）

【０１８５】

【化１０】

【０１８６】 （化Ｘ：スルフェントラゾン、Van Saun et al., Brighton Crop Protection Co
nference-Weeds, p. ７２−８２(１９９１)参照）

【０１８７】

【化１１】

【０１８８】 （Miura et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, p. ３５−４０
(１９９３)参照）

【０１８９】

【化１２】

【０１９０】 上述の化合物の除草剤活性については、１９９１年ブライトン作物保護（雑草
）会議議事録 (British Crop Protection Council)（化Ｘ及びＸＶＩ）、１９９
３年ブライトン作物保護（雑草）会議議事録 (British Crop Protection Counc
il)（化ＸＩＩ及びＸＩＩＩ）、米国特許第４，７４６，３５２号（化ＸＩ）及
びAbstracts of the Weed Science Society of America 第３３巻、ｐ ９(１９
９３)（化ＸＩＶ）に記述されている。

【０１９１】 最も好ましいイミド除草剤は、アリルウラシルとして分類されていて以下の一
般構造式を有するものである：

【０１９２】

【化１３】

【０１９３】 なお式中、Ｒは、本書に参考として内含されている米国特許第５，１８３，４９
２号に開示されている通りの（Ｃ_2-6−アルケニルオキシ）カルボニル−Ｃ_1-4−
アルキル基を意味する。

【０１９４】 同様に有意なのは、以下の一般構造式を有する除草剤、すなわち：

【０１９５】

【化１４】

【０１９６】 （Weiler et al.,ブライトン作物保護（雑草）会議, p. ２９−３４(１９９３)
参照）

【０１９７】

【化１５】

【０１９８】 （Van Saun et al., ブライトン作物保護（雑草）会議, p. １９−２２(１９９
３)参照） 下記の一般構造式をもつＮ置換ピラーゾール：

【０１９９】

【化１６】

【０２００】 なお式中、Ｒ₁は、単数又は複数のハロゲン原子により任意に置換されているＣ₁ −Ｃ₄−アルキルであり； R１は、各々任意には単数または複数のハロゲン原子により置換されているＣ₁−
Ｃ₄アルコキシ又は水素であり； Ｒ₁及びＲ₂は、共に−（ＣＨ₂）_n）−Ｘ−基を形成し、ここでＸはＲ₂において
結合されており； Ｒ₃は、水素又はハロゲンであり； Ｒ₄は、水素又はＣ₁−Ｃ₄−アルキルであり； Ｒ₅は、水素、ニトロ又は−ＣＯＯＲ₆或いは−ＣＯＮＲ₇Ｒ₈基であり； Ｒ₆は、水素又はＣ₁−Ｃ₆−アルキル、Ｃ₂−Ｃ₆−アルケニル又はＣ₂−Ｃ₆−ア
ルキニルである；（国際特許公報ＷＯ９４/０８９９９、ＷＯ９３/１０１００及
びScheringに譲渡された米国特許第５，４０５，８２９号を参照）。 以下の通りのＮ−フェニルピラゾール：

【０２０１】

【化１７】

【０２０２】 （C.R.Worthing（編）, British Crop Protection Council, Surrey(１９９１)
の「The Pesticide Manual」第９版６２１頁を参照のこと）； 及び、３−置換−２−アリル−４，５，６，７−テトラヒドロインダゾール（Ly
ga et al. Pesticide Sci. ４２：２９−３６(１９９４)）である。

【０２０３】

【化１８】

【０２０４】 同様に有意なのは、共に参考として本書に内含されているＷＯ９６/０１２５
４及びＷＯ９７/００２４６に記述されているタイプのフェニルピラゾールであ
る。（化ＸＸＩＩ）。

【０２０５】 同様に有意なのは、以下のようなピリジルピラゾールである：

【０２０６】

【化１９】

【０２０７】 同様に有意なのは以下の一般構造式を有するフェニルピラゾールである：

【０２０８】

【化２０】

【０２０９】 （Prosch, S.D. et al, ブライトン作物保護（雑草）会議: p. ４５−５０(１９
９７), (第１巻)参照） 付加的な有意な化合物は、共に本書にその全体が参考として内含されているＷＯ
９８／３３９２７及び米国特許第５，８５６，４９５号の中で記述されている。

【０２１０】 通常はプロトックス活性にとって阻害性ある除草剤のレベルには、当該技術分
野において既知の散布量が含まれており、これは一部には、散布環境、時間及び
方法といった外部因子によって左右される。例えば、構造式Ｖ−ＩＸにより表わ
されているイミド除草剤、より特定的には構造式Ｘ〜ＸＶＩＩにより表わされて
いるイミド除草剤の場合、散布量は０.０００１〜１０kg／ha好ましくは０.００
５〜２kg／haの範囲内にある。この除草剤の投薬量又は濃度は、所望の作用及び
使用される特定の化合物に応じて異なっていてよく、又当該技術分野において既
知の方法によって決定することができる。

【０２１１】 本発明のさらなる目的は、シロイヌナズナ、サトウキビ、大豆、大麦、綿花、
タバコ、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、ライ麦
、オート麦、芝草及び飼料牧草、アワ、青刈飼料及びイネなどから成るグループ
の中から選択された植物の個体群に対して有効量のプロトックス阻害性除草剤を
散布することを含んで成る、望ましくない植生の成長を制御するための方法にあ
る。好ましいのは、大豆、綿花、タバコ、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウモ
ロコシ、小麦、ソルガム、ライ麦、オート麦、芝草及びイネから成るグループの
中から選択された植物の個体群に対してプロトックス阻害性除草剤を有効量散布
することを含んで成る、望ましくない植生の成長を制御する方法である。特に好
ましいのは、シロイヌナズナ、大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウ
モロコシ、小麦、ソルガム及びイネから成るグループの中から選択された植物の
個体群に対する散布を含んで成る、望ましくない植生の成長を制御する方法であ
る。

【０２１２】 本発明はさらに、本発明のＤＮＡ分子に操作可能な形でリンクされた植物色素
体内で発現する能力をもつプロモータを含むキメラ遺伝子をも包含している。植
物色素体内で発現する能力をもつ好ましいプロモータは、同じ又は異なる種に由
来していてよく又その未変性産物が非緑色組織内に存在するものを含めた大部分
の色素体タイプの中で標準的に見い出されるような色素体遺伝子のコーディング
領域の上流側の５′フランキング領域から分離されたプロモータである。かかる
プロモータの例としては、タバコ ｃ/ｐＰ遺伝子プロモータ（本書に参考として
内含されているＷＯ９７／０６２５０）及びシロイヌナズナ ｃ/ｐＰＧＮプロモ
ータ（本書に参考として内含されている米国出願第０９／０３８，８７８号）と
いったようなｃ/ｐＰ遺伝子のプロモータがある。植物色素体内でＤＮＡ分子を
発現する能力のあるその他のプロモータは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによっ
て認識されるプロモータである。このタイプの好ましいプロモータは、バクテリ
オファージＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７遺伝子
１０プロモータといったような、単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼによって
認識されるプロモータである。植物色素体内でＤＮＡ分子を発現する能力をもつ
さらにもう１つのプロモータは、色素体１６ＳリボソームＲＮＡオペロンの調節
領域に由来する（共に本書に参考として内含されているHarris et al., Microbi
ol. Rev.５８：７００−７５４（１９９４）、Shinozaki et al., EMBO J. ５：
２０４３−２０４９（１９８６）を参照のこと）。Ｔ７ポリメラーゼをコードす
る遺伝子は好ましくは該ゲノム内に形質転換され、Ｔ７ポリメラーゼは、色素体
輸送ペプチドを用いて色素体内にターゲティングされる。色素体内のＤＮＡ分子
の発現は構成性であっても誘発性であってもよい。これらの異なる実施形態は、
本書に参考として内含されているＷＯ９８／１１２３５の中で広範に記述されて
いる。キメラ遺伝子は好ましくはさらに、植物色素体内で機能的な５′未翻訳配
列（５′ＵＴＲ）及び本発明のＤＮＡ分子に操作可能な形でリンクされた色素体
遺伝子３′未翻訳配列（３′ＵＴＲ）を含んで成る。好ましくは、３′ＵＴＲは
、色素体rps１６遺伝子３′未翻訳配列である。さらなる実施形態においては、
キメラ遺伝子は３′未翻訳配列の代りにポリ−Ｇトラクトを含む。

【０２１３】 本発明は同様に、同種組換えによる色素体ゲノム内への組込みのためのフラン
キング領域及び上述のキメラ遺伝子を含む色素体形質転換ベクターも包含してい
る。色素体形質転換ベクターは任意には少なくとも１つの葉緑体複製起源を含む
ことができる。本発明は同様に、ＤＮＡ分子が植物色素体内で発現可能である、
このような色素体形質転換ベクターで形質転換された植物色素体をも包含する。
本発明は同様に、この植物色素体を含むその後代を内含する植物又は植物細胞を
も包含している。好ましい実施形態においては、植物は、遺伝子導入色素体につ
いて同種細胞質性である。本発明で形質転換された植物は単子葉植物であっても
双子葉植物であってもよい。好ましい単子葉植物はトウモロコシであり、好まし
い双子葉植物はタバコである。その他の好ましい単子葉植物にはトマト及びジャ
イモがある。

【０２１４】 各々の植物細胞内に存在する円形色素体ゲノムの数千のコピーの一部分又は全
部の中に同種組換えにより遺伝子が挿入される色素体形質転換は、全可溶性植物
タンパク質の１０％を上回る可能性のある発現レベルを可能にするため核発現さ
れた遺伝子に比べ莫大なコピー数という利点を活用している。さらに色素体形質
転換は、大部分の植物において色素体でコードされた形質が花粉伝達性をもたな
いために、望ましいものとなっている。不注意にも遺伝子導入植物の野生類縁に
トランスジーンが漏出するという潜在的危険性は回避される。色素体形質転換技
術については、全て本書に参考として内含されている米国特許第５,４５１,５１
３，５,５４５,８１７，５,５４５,８１８，及び５,５７６,１９８号；ＰＣＴ出
願ＷＯ９５／１６７８３及びＷＯ９７／３２９７７；及びMcBride et al., Proc
.Natl.Acad. Sci. USA９１：７３０１−７３０５（１９９４）、の中で広範に記
述されている。微粒子銃を介した色素体形質転換は、当初単細胞緑藻類 Chlamyd
omonas reinhardtiiにおいて達成され（本書に参考として内含されているBaynto
n et al.（１９８８）Science ２４０：１５３４〜１５３７），シス作用性抗生
物質耐性遺伝子座（スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性）についての
選択又は非光合成突然変異体表現型の相補を使用したこのアプローチは、まもな
くNicotiana Tabacum への拡張された。（本書に参考として内含されているSvab
et al.(１９９０)Proc. Natl. Acad. Sci. USA８７）。

【０２１５】 タバコ葉緑体形質転換のための基本的技術には、選択可能な抗生物質耐性マー
カーをフランキングするクローニングされた色素体ＤＮＡの領域を伴う原形質体
内へのプラスミドＤＮＡのＰＥＧを媒介とした摂取又は葉組織の微粒子ボンバー
ドが関与する。「ターゲティング配列」と呼ばれる１〜１.５ｋｂのフランキン
グ領域は、色素体ゲノムとの同種組換えを容易にし、かくして１５６ｋｂのタバ
コ色素体ゲノムの特異的領域の置換又は修飾を可能にする。当初、スペクチノマ
イシン及び／又はストレプトマイシンに対する耐性を付与する葉緑体１６ＳｒＤ
ＮＡ及びｒｐｓ１２遺伝子内の点突然変異が、形質転換のための選択可能なマー
カーとして利用された（本書に参考として内含されている，Svab, Z., Hajdukie
wicz, P., 及び Maliga, P.(１９９０)Proc. Natl. Acad. Sci. USA８７，８５
２６−８５３０；Staub, J.M.,及び Maliga, P.(１９９２)Plant Cell４，３９
−４５，）。その結果、標的葉への１００回のボンバードにつき約１回の頻度で
安定した同種細胞質性形質転換体が得られた。これらのマーカーの間にクローニ
ング部位が存在したため、外来性遺伝子の導入のための色素体ターゲティングベ
クタを作り出すことができた（本書に参考として内含されている，Staub, J.M.,
及び Maliga, P., EMBO J.１２：６０１−６０６（１９９３）。形質転換頻度の
実質的な増大は、優性の選択可能なマーカーすなわちスペクチノマイシン解毒酵
素アミノグリコシド−３′−アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌ａａ
ｄＡ遺伝子で劣性のｒＲＮＡ又はｒ−タンパク質抗生物質耐性遺伝子を置換する
ことによって得られた（本書に参考として内含されている，Svab, Z., 及びMali
ga, P.（１９９３）Proc. Natl. Acad. Sci. USA９０，９１３−９１７）。これ
以前は、このマーカーは、緑藻類 Chlamydomonas reinhardtiiの色素体ゲノムの
高頻度形質転換のために使用され成功をおさめてきていた（本書に参考として内
含されている，Goldschmidt-Clermont, M.（１９９１）Nucl. Acids Res.１９，
４０８３−４０８９）。最近になって、タバコ及びコケPhyscomitrella patens
からの原形質体の色素体形質転換は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を媒介
としてＤＮＡ摂取を用いて達成されてきている（共に本書に参考として内含され
ている，O'Neill et al.（１９９３）Plant J.３：７２９−７３８；Koop et al
.(１９９６)Planta１９９：１９３−２０１）。

【０２１６】 好ましい実施形態においては、本発明は、未変性の又は修飾された小麦、大豆
、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、イネ、ソルガム、又はサトウキビプロト
ックス酵素をコードするＤＮＡ分子といったような、未変性の又は修飾されたプ
ロトックス酵素をコードする原核生物又は真核生物から分離されたＤＮＡ分子に
、操作可能な形でリンクされた植物色素体内での発現能力をもつプロモータを含
むキメラ遺伝子を包含している。かかるＤＮＡ分子は、上述のような色素体形質
転換ベクターの中に含まれ、遺伝子導入色素体ゲノムについて同種細胞質性の植
物が産生される。修飾されたプロトックス酵素をコードするＤＮＡ分子の植物色
素体内の発現は、好ましくは、天然に発生する プロトックス活性を阻害する量
で除草剤に対する寛容性植物に対し付与する。

【０２１７】 さらなる好ましい実施形態においては、本発明は、（ａ）色素体輸送ペプチド
を含むポリペプチドをその未変性状態でコードする植物から分離され、機能的色
素体輸送ペプチドをコードしないように修飾されているＤＮＡ分子及び、該色素
体輸送ペプチドにより該植物の色素体に先天的にターゲティングされている成熟
酵素；及び（ｂ）１つの色素体の中でＤＮＡ分子を発現する能力をもち、該ＤＮ
Ａ分子に操作可能な形でリンクされているプロモータ、を含んで成るキメラ遺伝
子を包含している。１つの好ましい実施形態においては、輸送ペプチドは突然変
異を受けており、かくして色素体といったような所望の細胞区画までＤＮＡ分子
によりコードされた酵素を適切に輸送することができない。もう１つの好ましい
実施形態においては、輸送ペプチドコーディング配列の一部分又は輸送ペプチド
コーディング配列全体が、ＤＮＡ分子から除去され、酵素が所望の細胞区画に適
切にターゲティングされるのを妨げる。

【０２１８】 上述のキメラ遺伝子は、色素体形質転換ベクター内に挿入され、従って本発明
は同様に、その色素体ゲノムがかかるベクターで形質転換され、かくしてＤＮＡ
分子が植物色素体内で発現可能であるような植物にも向けられている。かかる植
物は好ましくは遺伝子導入色素体について同種細胞質性である。

【０２１９】 好ましい実施形態においては、以上で記述されたＤＮＡ分子は、その野生型形
態において除草剤により阻害されているものの野生型酵素に比べ少なくとも１つ
のアミノ酸変更を含んでいる酵素をコードする。かかるアミノ酸変更はこの酵素
を、天然に野生型酵素を阻害する化合物に対する耐性をもつものにする。さらな
る好ましい実施形態においては、ＤＮＡ分子は、プロトポルフィリノーゲンオキ
シダーゼ（プロトックス）活性をもつ酵素をコードする。さらなる好ましい実施
形態においては、輸送ペプチドは、例３７〜４２にさらに例示されているように
ＤＮＡ分子から除去されている。本発明の遺伝子導入色素体について同種細胞質
性の植物は、（さらに例４４に示されているように）天然に発生するプロトック
ス活性を阻害する構造式ＸＶＩＩといったような大量の除草剤に対する耐性をも
つ。

【０２２０】 もう１つの好ましい実施形態においては、５−エノールピルビル−３−ホスホ
シキメートシンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）をコードするＤＮＡ分子の輸送ペ
プチドは、突然変異を受けるか除去される。結果として得られたＤＮＡ分子は、
植物色素体内での発現能力をもつプロモータに融合され、かかる構成体をその色
素体ゲノム内に宿す同種細胞質性植物が得られる。これらの植物は、ＥＰＳＰシ
ンターゼを天然に阻害する除草剤化合物特にグリホセートに対して耐性をもつ。
もう１つの好ましい実施形態においては、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ
）をコードするＤＮＡ分子の輸送ペプチドは突然変異を受けるか除去される。結
果として得られたＤＮＡ分子は、植物色素体内での発現能力をもつプロモータに
融合され、かかる構成体をその色素体ゲノム内に宿す同種細胞質性植物が得られ
る。これらの植物は、ＡＬＳを天然に阻害する除草剤化合物特にスルフォニル尿
素に対して耐性をもつ。もう１つの好ましい実施形態においては、アセトキシヒ
ドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）をコードするＤＮＡ分子の輸送ペプチドは、
突然変異を受けるか除去される。結果として得られたＤＮＡ分子は、植物色素体
内での発現能力をもつプロモータに融合され、かかる構成体をその色素体ゲノム
内に宿す同種細胞質性植物が得られる。これらの植物は、ＡＨＡＳを天然に阻害
する除草剤化合物特にイミダゾリノン及びスルフォンアミド除草剤に対して耐性
をもつ。もう１つの好ましい実施形態においては、アセチル補酵素Ａカルボキシ
ラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）をコードするＤＮＡ分子の輸送ペプチドは、突然変異を
受けるか除去される。結果として得られたＤＮＡ分子は、植物色素体内での発現
能力をもつプロモータに融合され、かかる構成体をその色素体ゲノム内に宿す同
種細胞質性植物が得られる。これらの植物は、ＡＣＣａｓｅを天然に阻害する除
草剤化合物特にシクロヘキサンジオン及びアリルフェノキシプロピオン酸除草剤
に対して耐性をもつ。もう１つの好ましい実施形態においては、グルタミンシン
ターゼ（ＧＳ）をコードするＤＮＡ分子の輸送ペプチドは、突然変異を受けるか
除去される。結果として得られたＤＮＡ分子は、植物色素体内での発現能力をも
つプロモータに融合され、かかる構成体をその色素体ゲノム内に宿す同種細胞質
性植物が得られる。これらの植物は、ＧＳを天然に阻害する除草剤化合物特にホ
スフィノトリシン及びメチオニンスルフォキシミンに対して耐性をもつ。

【０２２１】 本発明は同様に、（ａ）色素体輸送ペプチドを含むポリペプチドをその未変性
状態でコードする植物から分離され、機能的色素体輸送ペプチドをコードしない
ように修飾されているＤＮＡ分子及び、該色素体輸送ペプチドにより該植物の色
素体に先天的にターゲティングされている成熟酵素；及び（ｂ）１つの色素体の
中でＤＮＡ分子を発現する能力をもち、該ＤＮＡ分子に操作可能な形でリンクさ
れているプロモータ，を含んで成るキメラ遺伝子でその色素体ゲノムを形質転換
することにより除草剤耐性植物を得る方法にも向けられている。本発明において
使用される酵素の例は、以上で引用したが、かかる方法の適用可能性は、引用さ
れた例に制限されるわけではない。

【０２２２】 本発明はさらに、上述のキメラ遺伝子を植物細胞のプラストーム内に導入する
段階；植物細胞の色素体内でコードされた酵素を発現する段階及び、酵素の活性
を天然に阻害する除草剤化合物に対する耐性をもつ細胞を選択し、かくして耐性
細胞が形質転換された色素体を含むようにする段階を含んで成る、トランスプラ
ストーム植物細胞を選択するための新しい方法に向けられている。好ましい実施
形態においては、酵素は、除草剤化合物によって天然に阻害されており、遺伝子
導入植物は、酵素の活性を天然に阻害する一定量の除草剤化合物上で成長するこ
とができる。さらに好ましい実施形態においては、酵素は、プロトポルフィリノ
ーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性をもち、それがプロトックス阻害物質
に対する耐性を付与するような形で修飾される。

【０２２３】 本発明のさらなる態様は、不応性植物の色素体形質転換のための新しい方法で
ある。タバコ及びより低い植物種の色素体形質転換のために開拓された方法は、
色素体翻訳器官に優先的に影響を及ぼしかくして光合成従属栄養性形質転換体が
従属栄養性の未形質転換組織を外殖できるようにする、抗生物質耐性についての
非致死的選択に依存するものである。

【０２２４】 単子葉植物及びその他の双子葉植物の色素体形質転換で遭遇する問題には、複
数の因子が寄与している確率が高い。例えば、トウモロコシ葉緑体１６Ｓリボソ
ームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、Zea mays １６ＳｒＤＮＡ遺伝子内の位置１１３８
にＧが存在するために、スペクチノマイシンに対する耐性を天然に有している（
Harris et al.,１９９４）。かくして、Chlamydomonas 及びタバコにおいて選択
可能な葉緑体マーカーとして使用され成功してきたスペクチノマイシン及び／又
はストレプトマイシン耐性を付与する１６ＳｒＤＮＡ点突然変異（Boynton and
Gillham(１９９３)in Wu, R.[Ed.] Methods in Enzymology Vol２１７．Academi
c Press, San Diego, pp.５１０−５３６；Svab et al.(１９９０)Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A ８７：８５２６−８５３０）をトウモロコシのために利用す
ることは不可能である。トウモロコシにおける天然のスペクチノマイシン及びス
トレプトマイシン耐性は同様に、優性スペクチノマイシン及びストレプトマイシ
ン活性を結果としてもたらしタバコ葉緑体形質転換効率を１００倍増大させるこ
とのできる、アミノグリコシド３″−アデニルトランスフェラーゼをコードする
細菌ａａｄＡ 遺伝子の使用をも回避させる（Svab及びMaliga（１９９３）Proc.
Natl. Acad. Sci.U.S.A.９０：９１３−９１７）。カナマイシン（葉緑体形質
転換にとって有用であることが証明された他の唯一の抗生物質）の使用も同様に
、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする細菌ｎｐｔＩＩ 遺伝子
のボンバードの後のタバコにおいて葉緑体によりコードされる耐性に比べ核によ
りコードされる耐性が大きく上回わること（約５：１）に起因して、問題の生じ
るものである（Carrer et al.(１９９３）Mol. Gen. Genet.２４１；４６−５６
）。

【０２２５】 これは、自然発生的核耐性突然変異体の頻度が高いことならびに核ゲノム内へ
のnptＩＩの組込みの両方の結果としてもたらされるものであることが示されて
きた。nptＩＩは同じくトウモロコシ核形質転換にとってもきわめて有効な選択
可能なマーカーであることから、タバコにおいて見られたものと類似の背景レベ
ルを期待することが合理的である。自然発生的な耐性そして葉緑体ゲノム内への
相同を組込みではなくむしろ核ゲノム内への無作為な非正統的組換えによる選択
可能マーカーの組込みの著しい超過のため、真正の葉緑体形質転換体の回収は、
不可能とは言わないまでもむずかしいものとなる。

【０２２６】 タバコ以外の植物種における色素体形質転換で遭遇する問題のより根本的な理
由は、特にトウモロコシ及びシロイヌナズナにおける数多くの再生可能な培養植
物スクリーニングの非光合成性に関係するものであるかもしれない。タバコは、
培養された栄養組織が再生可能でありかつ、スクロースの存在下で光合成的に応
答能ある成熟した分化済み葉緑体を含有しているという点で例外である。従って
、タバコ色素体形質転換体を選択するための現行のシステムは、還元炭素供給源
及び無機炭素供給源の両方を使用できる形質転換された細胞のさらに高速の成長
率に依存している。その上、形質転換された細胞は、光の中の色素体タンパク質
合成の阻害の結果としてもたらされる葉緑体膜損傷をこうむらない。分化済み葉
緑体の中で高い活性をもつプロモータによって駆動される、優先的に光合成細胞
に作用する選択可能なマーカーのこの発現が、原色素体（例えば暗生長トウモロ
コシＩ型カルス体細胞胚）又はデンプン形成体／白色体（例えばシロイヌナズナ
根培養）を含む非緑色組織内で働く確率は低い。これらの植物内での色素体形質
転換は、全ての色素体タイプ内で強力な選択を与える選択可能マーカーを必要と
する。

【０２２７】 汎化された色素体形質転換のために好ましい選択可能なマーカーは、（１）核
形質転換された「エスケープ」を削除するべく色素体内のみで活性であり；（２
）光合成応答能又は完全に分化された葉緑体の存在によって左右されない作用様
式を有し；かつ（３）選択的作用物質のバルク濃度によってのみ決定されるので
はなくむしろ調整可能な外部パラメータ（例えば光）に共依存する耐性レベルを
有し、そのため、選択中選択圧力は、何千もの色素体ゲノムコピーの分離を容易
にするべく変動しうる。

【０２２８】 好ましい実施形態においては、かかる選択可能なマーカー遺伝子には、色素体
輸送ペプチドをその天然の状態で有する色素体でターゲティングされた酵素をコ
ードする分離したＤＮＡ分子を含むキメラ遺伝子の使用が関与しており、ここで
該ＤＮＡ分子は、輸送ペプチドが欠如しているか又はその色素体に酵素をターゲ
ティングするように機能しないような形で修飾されており、かつＤＮＡ分子は植
物色素体内の発現能力をもつプロモータに対し操作可能な形でリンクされている
。好ましい実施形態においては、本発明のＤＮＡ分子は、除草剤により天然に阻
害される酵素をコードする。もう１つの好ましい実施形態においては、ＤＮＡ分
子は、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ（「プロトックス」）をコー
ドする。好ましい実施形態においては、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダ
ーゼ遺伝子は、シロイヌナズナからのものであり、さらに好ましい実施形態にお
いては、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ遺伝子は、シロイヌナズナ
からのものでありかつ少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、アミ
ノ酸置換が結果として、酵素の活性を天然に阻害する除草剤により阻害に対する
酵素の寛容性をもたらす。低濃度の除草剤は、色素体が局在化されたプロトック
ス酵素が阻害された時点で蓄積する感光性中間体に起因する野生型植物を殺すも
のと考えられている。これらの光増感化合物の産生は、その両生可能な培養組織
が非光合成性のものである植物の色素体形質転換にとって重要な因子である分化
された葉緑体又は活性の光合成を必要としない。

【０２２９】 もう１つの重要な特長は、非緑色色素体内での選択可能なマーカー遺伝子の発
現を得ることにある。好ましい実施形態においては、本発明は、緑色及び非緑色
の両方の組織の色素体の中で操作可能な形でリンクされたＤＮＡ分子を発現する
能力をもつプロモータの使用を包含している。特に、１つのこのようなプロモー
タは、色素体１６ＳリボソームＲＮＡオペロンの調節領域に由来する。もう１つ
の候補は、色素体clpＰ 遺伝子からのプロモータ及び５′ＵＴＲである。clpＰ
遺伝子産物は、葉緑体を含まないものを含めた全ての植物組織からの色素体の中
で構成的に発現される（Shanklin（１９９５）Plant Cell７：１７１３−２２）
。

【０２３０】 その他のＤＮＡ分子を、上述の方法を用いて、植物組織内に同時導入すること
もできる。好ましい実施形態においては、本発明の色素体形質転換ベクターには
、上述の通り形質転換体の選択を可能にするキメラ遺伝子及び植物色素体内の発
現能力をもつプロモータに融合された少なくとも１つのその他の遺伝子が含まれ
る。その他のかかる遺伝子は、例えば、昆虫有害生物又は真菌又は細菌病原体に
対する耐性を付与することができ、或いは又、単数または複数の付加価値をもつ
形質をコードすることもできる。

【０２３１】 配列リスト内の配列の簡単な説明 配列番号１： シロイヌナズナプロトックス−１タンパク質のためのＤＮＡコー
ディング配列 配列番号２： 配列番号１によりコードされたシロイヌナズナプロトックス−１
アミノ酸配列 配列番号３： シロイヌナズナプロトックス−２タンパク質のためのＤＮＡコー
ディング配列 配列番号４： 配列番号３によりコードされたシロイヌナズナプロトックス−２
アミノ酸配列 配列番号５： トウモロコシプロトックス−１タンパク質のためのＤＮＡコーデ
ィング配列 配列番号６： 配列番号５によりコードされたトウモロコシプロトックス−１ア
ミノ酸配列 配列番号７： トウモロコシプロトックス−２タンパク質のためのＤＮＡコーデ
ィング配列 配列番号８： 配列番号７によりコードされたトウモロコシプロトックス−２ア
ミノ酸配列 配列番号９： 小麦プロトックス−１タンパク質のための部分的ＤＮＡコーディ
ング配列 配列番号１０： 配列番号９によりコードされた部分的小麦プロトックス−１ア
ミノ酸配列 配列番号１１： 大豆プロトックス−タンパク質のためのＤＮＡコーディング配
列 配列番号１２： 配列番号１１によりコードされた大豆プロトックス−１アミノ
酸配列 配列番号１３： シロイヌナズナプロトックス−１遺伝子からのプロモータ配列 配列番号１４： トウモロコシプロトックス−１遺伝子からのプロモータ配列 配列番号１５： 綿花プロトックス−１タンパク質のためのＤＮＡコーディング
配列 配列番号１６： 配列番号１５によりコードされた綿花プロトックス−１アミノ
酸配列 配列番号１７： テンサイプロトックス−１タンパク質のためのＤＮＡコーディ
ング配列 配列番号１８： 配列番号１７によりコードされたテンサイプロトックス−１ア
ミノ酸配列 配列番号１９： セイヨウアブラナプロトックス−１タンパク質のためのＤＮＡ
コーディング配列 配列番号２０： 配列番号１９によりコードされたセイヨウアブラナプロトック
ス−１アミノ酸配列 配列番号２１： イネプロトックス−１タンパク質のための部分的ＤＮＡコーデ
ィング配列 配列番号２２： 配列番号２１によりコードされた部分的イネプロトックス−ア
ミノ酸配列 配列番号２３： ソルガムプロトックス−１タンパク質のための部分的ＤＮＡコ
ーディング配列 配列番号２４： 配列番号２３によりコードされた部分的ソルガムプロトックス
−アミノ酸配列 配列番号２５： トウモロコシプロトックス−１イントロン配列 配列番号２６： テンサイプロトックス１−遺伝子からのプロモータ配列 配列番号２７： Ｐｃｌｐ＿Ｐ１ａ−プラスチドclpP遺伝子プロモータトップス
トランドＰＣＲプライマー 配列番号２８： Ｐｃｌｐ＿Ｐ１ｂ−プラスチドclpP遺伝子プロモータボトムス
トランドＰＣＲプライマー 配列番号２９： Ｐｃｌｐ＿Ｐ２ｂ−プラスチドclpP遺伝子プロモータボトムス
トランドＰＣＲプライマー 配列番号３０： Ｔｒｐｓ１６＿Ｐ１ａ−プラスチドrps16遺伝子トップストラ
ンドＰＣＲプライマー 配列番号３１： Ｔｒｐｓ１６＿Ｐ１ｂａ−プラスチドrps16遺伝子ボトムスト
ランドＰＣＲプライマー 配列番号３２： ｍｉｎｐｓｂ＿Ｕ−プラスチドpsbA遺伝子トップストランドプ
ライマー 配列番号３３： ｍｉｎｐｓｂ＿Ｌ−プラスチドpsbA遺伝子ボトムストランドプ
ライマー 配列番号３４： ＡＰＲＴＸＰ１ａ−トップストランドＰＣＲプライマー 配列番号３５： ＡＰＲＴＸＰ１ｂ−ボトムストランドＰＣＲプライマー 配列番号３６： サトウキビプロトックス−１タンパク質のための部分的ＤＮＡ
コーディング配列 配列番号３７： 配列番号３６によりコードされた部分的サトウキビプロトック
ス−１アミノ酸配列 １． 寄託物 下記のベクター分子は、以下に表示する日付で、1815 North University Stre
et, Peoria, Illiois 61604, U.S.AにあるNorthern Regional Research Center
の農業研究課、特許培養コレクション（NRRL）に寄託された： ｐBluescriptＳＫベクター中の小麦プロトックス−１ａは、１９９６年３月１
９日にｐＷＤＣ−１３（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５４５）として寄託された。

【０２３２】 ｐBluescriptＳＫベクター中の大豆プロトックス−１は、１９９５年１２月１
５日にｐＷＤＣ−１２（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５１６）として寄託された。

【０２３３】 ｐBluescriptＳＫベクター中の綿花プロトックス−１は、１９９６年７月１日
にｐＷＤＣ−１５（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５９４）として寄託された。

【０２３４】 ｐBluescriptＳＫベクター中のテンサイプロトックス−１は、１９９６年７月
２９日にｐＷＤＣ−１６（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５９５Ｎ）として寄託された。

【０２３５】 ｐBluescriptＳＫベクター中のセイヨウアブラナプロトックス−１は、１９９
６年８月２３日にｐＷＤＣ−１７（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６１５）として寄託され
た。

【０２３６】 ｐBluescriptＳＫベクター中のイネプロトックス−１は、１９９６年１２月６
日にｐＷＤＣ−１８（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１６４８）として寄託された。

【０２３７】 ｐBluescriptＳＫベクター中のソルガムプロトックス−１は、１９９６年１２
月６日にｐＷＤＣ−１３（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５４９）として寄託された。

【０２３８】 ｐＭｕｔ−１プラスミド中の耐性変異体ｐＡｒａＣ−２Ｃｙｓは、１９９４年
１１月１４日、ｐＷＤＣ−７の呼称で、農業研究培養コレクションに寄託され、
ＮＲＲＬ＃２１３３９という寄託物呼称が付与された。

【０２３９】 シロイヌナズナプロトックス−１プロモータを含むＡｒａＰＴ１Ｐｒｏは、１
９９５年１２月１５日にｐＷＤＣ−１１（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５１５）として寄
託された。

【０２４０】 トウモロコシプロトックス−１コーディング配列の残りの部分に融合されたト
ウモロコシプロトックス−１プロモータを含有するプラスミドは、１９９６年３
月１９日に、ｐＷＤＣ−１４（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１５４６）として寄託された。

【０２４１】 テンサイプロトックス−１プロモータを含有するプラスミドは、１９９６年１
２月６日に、ｐＷＤＣ−２０（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６５０）として寄託された。

【０２４２】 実施例 本発明についてさらに、以下の詳細な例を参考にして説明する。これらの例は
、例示を目的として提供されているにすぎず、相反する規定のないかぎり、制限
的意味をもつものではない。ここで使用される標準的組換え型ＤＮＡ及び分子ク
ローニング技術は、当該技術分野において周知のものであり、Ausubel(編), Cur
rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.(１９９４
）；T. Maniatis, E.F. Fritsch 及び J. Sambrook, Molecular Cloning ；A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY（
１９８９）；及び T.J. Silhavy, M.L.Berman,及び L.W. Enquist, Experiments
with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N
Y(１９８４）によって記述されている。

【０２４３】 第Ａ節 植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）遺伝子
の分離及び特徴づけ 例１： トウモロコシプロトックス−１ コーディング配列に対する配列相同
性に基づく小麦プロトックス−１ｃＤＮＡの分離 Triticum aestivum（cv Kanzler）から調製した全ＲＮＡを、Lamda Uni-Zap
ベクター内でのカスタムｃＤＮＡライブラリ構築のためClontechに提出した。ｃ
ＤＮＡライブラリの約５０,０００pfuを、１０cmのペトリ皿１枚につき約５００
０pfuの密度で平板固定し、重複フィルタリフトをニトロセルロース膜上に作っ
た（Schleicher及びSchuell）。プラークリフトを、ランダムプライミング法（L
ife Technology）により３２Ｐ−ｄCＴＰで標識付けされたトウモロコシプロト
ックス−１ｃＤＮＡ（配列番号５：１９９５年１２月２１日付けでＷＯ９５／３
４６５９号として公示された１９９５年６月８日付けの国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９
５／００４５２の例２を参照のこと）を用いてプローブ探査した。ハイブリダイ
ゼーション条件は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭでｐＨ
７.０のＮａＰＯ₄ 、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃であった。洗浄条件は、２×Ｓ
ＳＣ、１％のＳＤＳ、５０℃であった。（その全体が本書に参考として内含され
ている，Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA８１；１９９１−１
９９５（１９８４））。ハイブリッド形成陽性プラークを精製し、ｐBluescript
プラスミド内にin vivoで切り出した。ｃＤＮＡインサートの配列を、螢光染料
で標識付けされたジデオキシターミネータを用いたチェーンターミネーション法
によって決定した（Applied Biosystems, Inc)。初期スクリーニング作業から得
られた、「小麦プロトックス−１」と呼称される最長小麦プロトックス−１ ｃ
ＤＮＡは、長さ１４８９−ｂｐのものであった。小麦プロトックス−１には、そ
の他の既知の植物プロトックスペプチド配列との比較を基準とした場合、輸送ペ
プチドのためのコーディング配列に成熟コーディング配列の約１２６個のアミノ
酸を加えたものが欠如している。

【０２４４】 より長い小麦プロトックス ｃＤＮＡを得るために２回目のスクリーンを行な
った。このスクリーンのために、ラムダUni-Zapベクターを用いて内部的に、Tri
ticum aestivum（cv Kanzler) ｃＤＮＡライブラリを調製した。上述のとおり、
ｃＤＮＡライブラリの約２００,０００pfuをスクリーニングしたが、ここでは、
プローブとして小麦プロトックス−１ ｃＤＮＡを使用し、かつハイブリダイゼ
ーション及び洗浄条件は５０℃ではなく６５℃であった。このスクリーニング作
業が得られた「小麦プロトックス−ｌａ」と呼ばれる最長の小麦ｃＤＮＡは、長
さ１８１１−ｂｐのものであった。

【０２４５】 このｃＤＮＡのヌクレオチド及びそれがコードするアミノ酸配列は、それぞれ
配列番号９及び１０に記されている。その他の既知の植物プロトックスペプチド
配列及び対応するゲノム配列との比較を基準とした場合、このｃＤＮＡは、全長
のものであるか又はわずかな輸送ペプチドコドンしか欠けていないものである（
表１Ａ）。この小麦タンパク質配列は、配列番号６に記されたトウモロコシプロ
トックス−１タンパク質配列と９１％同一（９５％類似）である。

【０２４６】 ｐBluescriptスクリーニングベクター内の小麦プロトックス−１ａは、１９９
６年３月１９日にｐＷＤＣ−１３（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５４５）として寄託された
。

【０２４７】 例２： シロイヌナズナプロトックス−１コーディング配列に対する配列相同
性に基づく大豆プロトックス−１ｃＤＮＡの分離 大豆から調製したLamda Uni-Zap ｃＤＮＡライブラリ（Cv Williams８２，エ
ピコチル）を Stratagene から購入した。ライブラリの約５０,０００pfuを、１
０cmのペトリ皿１枚につき約５０００pfuの密度で平板固定し、重複フィルタリ
フトをコロニー／プラークスクリーン膜上に作った（ＮＥＮ Dupont）。プラー
クリフトを、ランダムプライミング法（Life Technology）により３２Ｐ−ｄＣ
ＴＰで標識付けされたシロイヌナズナプロトックス−１ｃＤＮＡ（配列番号１：
１９９５年１２月２１日付けでＷＯ９５／３４６５９号として公示された１９
９５年６月８日付けの国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２の例１を参照のこ
と）を用いてプローブ探査した。ハイブリダイゼーション条件は、７％のドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭでｐＨ７.０のＮａＰＯ₄ 、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ，５０℃であった。洗浄条件は、２×ＳＳＣ，１％のＳＤＳ，５０℃であ
った。（Church及びGilbert(１９８４)。ハイブリッド形成陽性プラークを精製
し、ｐBluescriptプラスミド内にin vivoで切り出した。ＣＤＮＡインサートの
配列を、螢光染料で標識付けされたジデオキシターミネータを用いたチェーンタ
ーミネーション法によって決定した（Applied Biosystem, Inc）。「大豆プロト
ックス−１」と呼称される、得られた最長の大豆ｃＤＮＡは、その他の既知の植
物プロトックスペプチド配列との比較に基づき、全長のものである（表１Ａ）。
大豆プロトックス−１は、長さ１８４７−ｂｐで、５８.８ｋＤａのタンパク質
をコードする。このｃＤＮＡのヌクレオチド及びそれがコードするアミノ酸配列
は、それぞれ配列番号１１及び１２に記されている。大豆タンパク質は、シロイ
ヌナズナプロトックス−１タンパク質と７８％同一（８７％類似）である。

【０２４８】 ｐBluescriptスクリーニングベクター内の大豆プロトックス−１は、１９９５
年１２月１５日にｐＷＤＣ−１２（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５１６）として寄託された
。

【０２４９】 例３： トウモロコシプロトックス−１コーディング配列に対する配列相同性
に基づく綿花プロトックス−１ｃＤＮＡの分離 Grossypium hirsutum L. （７２時間暗生長された子葉）から調製したLamda U
ni-Zap ｃＤＮＡをアリゾナ州立大学植物学部のDick Trelease博士から入手した
（Ni W. 及びTrelease R.N. Arch. Biochem, Biophys, ２８９：２３７−２４３
（１９９１））。ライブラリの約５０,０００pfuを、１０cmのペトリ皿１枚につ
き約５０００pfuの密度で平板固定し、重複フィルタリフトをコロニー／プラー
クスクリーン膜上に作った（ＮＥＮ Dupont）。 プラークリフトを、ランダム
プライミング法（Life Technology）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識付けされた
トウモロコシプロトックス−１ｃＤＮＡ（配列番号５）を用いてプローブ探査し
た。ハイブリダイゼーション条件は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
，０.５ＭでｐＨ７.０のＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃であった。洗浄
条件は、２×ＳＳＣ，１％のＳＤＳ、５０℃であった。（Church及びGilbert(１
９８４)。ハイブリッド形成陽性プラークを精製し、ｐBluescriptプラスミド内
にin vivoで切り出した。ＣＤＮＡインサートの配列を、螢光染料で標識付けさ
れたジデオキシターミネータを用いたチェーンターミネーション法によって決定
した（Applied Biosystem, Inc）。「綿花プロトックス−１」と呼称される、得
られた最長の綿花ｃＤＮＡは、その他の既知の植物プロトックスペプチド配列と
の比較に基づき、全長のものであると思われる（表１Ａ）。綿花プロトックス−
１は、長さ１８２６−ｂｐで、５８.２ｋＤａのタンパク質をコードする。この
ｃＤＮＡのヌクレオチド及びそれがコードするアミノ酸配列は、それぞれ配列番
号１３及び１４に記されている。綿花タンパク質は、トウモロコシプロトックス
−１タンパク質と７７％同一（８６％類似）である。

【０２５０】 ｐBluescriptスクリーニングベクター内の綿花プロトックス−１は、１９９６
年７月１日にｐＷＤＣ−１５（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５９４）として寄託された。

【０２５１】 例４： シロイヌナズナプロトックス−１コーディング配列に対する配列相同
性に基づくテンサイプロトックス−１ｃＤＮＡの分離 Beta vulgarisから調製したLamda-Zap ｃＤＮＡライブラリをPlant Science
Institute, Philadelphia, PAの植物学部Phillip Rea博士から入手した（Yongch
eol Kim, Eugene J.Kim 及び Philip A. Rea, Plant Physiol. １０６：３７５
−３８２（１９９４））。ｃＤＮＡライブラリの約５０,０００pfuを、１０cmの
ペトリ皿１枚につき約５０００pfuの密度で平板固定し、重複フィルタリフトを
ニトロセルロース膜上に作った（Schleicher及びSchuell）。プラークリフトを
、ランダムプライミング法（Life Technology）により３２Ｐ−ｄｃＴＰで標識
付けされたシロイヌナズナプロトックス−１ｃＤＮＡ（配列番号１）を用いてプ
ローブ探査した。ハイブリダイゼーション条件は、７％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ），０.５ＭでｐＨ７.０のＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ，５０℃で
あった。洗浄条件は、２×ＳＳＣ，１％のＳＤＳ，５０℃であった。（Church及
びGilbert(１９８４)。ハイブリッド形成陽性プラークを精製し、ｐBluescript
プラスミド内にin vivoで切り出した。ｃＤＮＡインサートの配列を、螢光染料
で標識付けされたジデオキシターミネータを用いたチェーンターミネーション法
によって決定した（Applied Biosystem, Inc）。「テンサイプロトックス−１」
と呼称される、得られた最長のテンサイプロトックス−１ｃＤＮＡは、その他の
既知の植物プロトックスペプチド配列との比較を基準にした場合、全長のもので
ある（表１Ａ）。テンサイプロトックス−１は、長さ１９１０−ｂｐで、６０ｋ
Ｄａのタンパク質をコードする。このｃＤＮＡのヌクレオチド及びそれがコード
するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５及び１６に記されている。テンサイ
タンパク質は、シロイヌナズナプロトックス−１タンパク質と７３％同一（８２
％類似）である。

【０２５２】 ｐBluescriptスクリーニングベクター内のテンサイプロトックス−１は、１９
９６年７月２９日にｐＷＤＣ−１６（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１５９５N）として寄託さ
れた。

【０２５３】 例５： シロイヌナズナプロトックス−１コーディング配列に対する配列相同
性に基づくセイヨウアブラナプロトックス−１ｃＤＮＡの分離 Brassica napus（３〜４週間、成熟葉緑素）から調製したLamda Uni-Zap II
ｃＤＮＡライブラリを、Institut Fuet Allgemeine Btanik, Johonnes Gutenber
t-Universitaet Mainz, GermanyのGuenther Ochs博士から入手した（Guenther O
chs, Gevald Schock及びAloysius Wild, Plant Physiol. １０３：３０３−３０
４（１９９３））。ｃＤＮＡライブラリの約５０,０００pfuを、１０cmのペトリ
皿１枚につき約５０００pfuの密度で平板固定し、重複フィルタリフトをニトロ
セルロース膜上に作った（Schleicher及びSchuell）。 プラークリフトを、ラ
ンダムプライミング法（Life Technology）により３２Ｐ−ｄCＴＰで標識付けさ
れたシロイヌナズナプロトックス−１ｃＤＮＡ（配列番号１）を用いてプローブ
探査した。ハイブリダイゼーション条件は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ），０.５ＭでｐＨ７.０のＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ，５０℃であった
。洗浄条件は、２×ＳＳＣ，１％のＳＤＳ，５０℃であった。（Church及びGilb
ert(１９８４)。ハイブリッド形成陽性プラークを精製し、ｐBluescriptプラス
ミド内にin vivoで切り出した。ｃＤＮＡインサートの配列を、螢光染料で標識
付けされたジデオキシターミネータを用いたチェーンターミネーション法によっ
て決定した（Applied Biosystem, Inc）。「セイヨウアブラナプロトックス−１
」と呼称される、得られた最長のセイヨウアブラナプロトックス−１ｃＤＮＡは
、その他の既知の植物プロトックスペプチド配列との比較に基づき、全長のもの
である（表１Ａ）。セイヨウアブラナプロトックス−１は、長さ１７８４−ｂｐ
で、５７．３ｋＤのタンパク質をコードする。このｃＤＮＡのヌクレオチド及び
それがコードするアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７及び１８に記されてい
る。セイヨウアブラナタンパク質は、シロイヌナズナプロトックス−１タンパク
質と８７％同一（９２％類似）である。

【０２５４】 ｐBluescriptスクリーニングベクター内のセイヨウアブラナプロトックス−１
は、１９９６年８月２３日にｐＷＤＣ−１７（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１６１５）として
寄託された。

【０２５５】 例６ トルモロコシプロトックス−１コーディング配列に対する配列相同性に
基づくイネプロトックス−１ｃＤＮＡの分離 Oryza Sativa（５日間黄化させた苗条）から調製したLamda gt11ｃＤＮＡライ
ブラリを Clontech から購入した。ｃＤＮＡライブラリの約５０,０００pfuを、
１０cmのペトリ皿１枚につき約５０００pfuの密度で平板固定し、重複フィルタ
リフトをニトロセルロース膜上に作った（Schleicher及びSchuelle）。プラーク
リフトを、ランダムプライミング法（Life Technology）により３２Ｐ−ｄｃＴ
Ｐで標識付けされたトウモロコシプロトックス−１ｃＤＮＡ（配列番号５）を用
いてプローブ探査した。ハイブリダイゼーション条件は、７％のドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ），０.５ＭデでｐＨ７.０のＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ、
５０℃であった。洗浄条件は、２×ＳＳＣ，１％のＳＤＳ，５０℃であった。（
Church及びGilbert(１９８４)。ハイブリッド形成陽性プラークを精製し、Wizar
d Lambda-Prepキット（Promega）を用いてラムダＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡイ
ンサートを、標準技術を用いてｐBluescriptスクリーニングベクターへと、Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントを用いてサブクローニングした。ｃＤＮＡインサートの配列
を、螢光染料で標識付けされたジデオキシターミネータを用いたチェーンターミ
ネーション法によって決定した（Applied Biosystem, Inc）。「イネプロトック
ス−１」と呼称される、得られた最長の稲プロトックス−１ｃＤＮＡは、長さが
１２２４ｂｐであった。イネプロトックス−１には、その他の既知の植物プロト
ックスペプチド配列との比較を基準とした場合、輸送ペプチドのためのコーディ
ング配列に成熟コーディング配列の約１７２個のアミノ酸を加えたものが欠如し
ている（表１Ａ）。この部分的ｃＤＮＡのヌクレオチド及びそれがコードするア
ミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９及び２０に記されている。

【０２５６】 ｐBluescriptスクリーニングベクター内のイネプロトックス−１は、１９９６
年１２月６日にｐＷＤＣ−１８（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１６４８）として寄託された。

【０２５７】 例７：トウモロコシプロトックス−１コーディング配列に対する配列相同性に
基づくソルガムプロトックス−１ｃＤＮＡの分離 Sorghum bicolor（３〜６日の緑色実生苗）から調製したLamda-Zap IIｃＤＮ
Ａライブラリをドイツストュッツガルト大学細胞生物学および免疫学研究所のKl
aus Pfizenmaier博士から入手した（Harald Wajant, Karl-Wolfgang Mundry及び
Klaus Pfizenmaier,Plant Mol. Biol.２６：７３５−７４７(１９９４)）。ｃＤ
ＮＡライブラリの約５０,０００pfuを、１０cmのペトリ皿１枚につき約５０００
pfuの密度で平板固定し、重複フィルタリフトをニトロセルロース膜上に作った
（Schleicher及びSchuelle）。プラークリフトを、ランダムプライミング法（Li
fe Technology）により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識付けされたトウモロコシプロト
ックス−１ｃＤＮＡ（配列番号５）を用いてプローブ探査した。ハイブリダイゼ
ーション条件は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭデｐＨ７.
０のＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ，５０℃であった。洗浄条件は、２×ＳＳＣ
，１％のＳＤＳ，５０℃であった。（Church及びGilbert(１９８４)。ハイブリ
ッド形成陽性プラークを精製し、ｐBluescriptプラスミド内にin vivoで切り出
した。ＣＤＮＡインサートの配列を、螢光染料で標識付けされたジデオキシター
ミネータを用いたチェーンターミネーション法によって決定した（Applied Bios
ystem, Inc）。「ソルガムプロトックス−１」と呼称される、得られた最長のソ
ルガムプロトックス−１ｃＤＮＡは、長さ１５９０ｄｐであった。ソルガムプロ
トックス−１には、その他の既知の植物プロトックスペプチド配列との比較を基
準とした場合、輸送ペプチドのためのコーディング配列に成熟コーディング配列
の約４４個のアミノ酸を加えたものが欠如している（表１Ａ）。この部分的ｃＤ
ＮＡのヌクレオチド及びそれがコードするアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２
１及び２２に記されている。

【０２５８】 ｐBluescriptスクリーニングベクター内のソルガムガムプロトックス−１は、
１９９６年１２月６日にｐＷＤＣ−１９（ＮＲＲＬ＃Ｂ２１６４９）として寄託
された。

【０２５９】 例８： トウモロコシプロトックス−１コーディング配列に対する配列相同性
に基づくサトウキビプロトックス−１ｃＤＮＡの分離 サトウキビから調製したLamda Zap II ｃＤＮＡライブラリをハワイ農業研究
センターのＵＳＤＡ/ＡＲＳのHenrik Albertから入手した。ｃＤＮＡライブラリ
の約５０,０００pfuを、１０cmのペトリ皿１枚につき約５０００pfuの密度で平
板固定し、重複フィルタリフトをニトロセルロース膜上に作った（Schleicher及
びSchuell）。プラークリフトを、ランダムプライミング法（Life Technology）
により３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識付けされたトウモロコシプロトックス−１ｃＤＮ
Ａ（配列番号５）を用いてプローブ探査した。ハイブリダイゼーション条件は、
７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭでｐＨ７.０のＮａＰＯ₄、
１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃であった。洗浄条件は、２×ＳＳＣ，１％のＳＤＳ、
５０℃であった。（Church及びGilbert(１９８４)。ハイブリッド形成陽性プラ
ークを精製し、ｐBluescriptプラスミド内にin vivoで切り出した。ＣＤＮＡイ
ンサートの配列を、螢光染料で標識付けされたジデオキシターミネータを用いた
チェーンターミネーション法によって決定した（Applied Biosystem, Inc）。「
サトウキビプロトックス−１」と呼称される、得られた最長のサトウキビｃＤＮ
Ａは、長さが６３３ｂｐであった。サトウキビプロトックス−１には、その他の
既知の植物プロトックスペプチド配列との比較を基準とした場合、輸送ペプチド
のためのコーディング配列に成熟コーディング配列の約３８２個のアミノ酸を加
えたものが欠如している（表１Ａ）。この部分的ｃＤＮＡのヌクレオチド及びそ
れがコードするアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６及び３７に記されている
。

【０２６０】 例９．細菌系におけるプロトックス阻害性除草剤に対する植物プロトックスク
ローン感受性の実証 Ｌamp¹⁰⁰中で、プロトックス−１／ＳＡＳＸ３８、プロトックス−２／ＳＡＳ
Ｘ３８及びｐBluescript／ＸＬ１−ブルーの液体培養を成長させた。各培養の１
００マイクロリットルのアリコートを、構造式ＸＶＩＩのプロトックス阻害性ア
リルウラシル除草剤をさまざまな濃度（１.０ｎＭ〜１０ｍＭ）で含有するＬamp ¹⁰⁰ 上に平板固定した。重複した平板セットを１８時間３７℃でインキュベート
した。

【０２６１】 プロトックス⁺ E.coli菌株ＸＬ１−ブルーは、いかなる濃度でも除草剤に対す
る感受性を全く示さず、これは、類似の除草剤に対する未変性細菌酵素の報告さ
れた耐性と一貫性をもつものであった。プロトックス−１／ＳＡＳＸ３８は、１
０ｎＭという低濃度の除草剤により細菌芝生がほぼ完全に選除された状態で、明
らかに感受性を有していた。プロトックス−２／ＳＡＳＸ３８も同様に感受性を
有していたが、それはより高濃度の除草剤（１０μＭ）のみにおいてであった。
除草剤は、ほぼ完全に暗所に維持された平板上でさえ有効であった。除草剤の毒
性は、平板に対し２０μｇ／mlのヘマチンを添加することによって完全に除去さ
れた。

【０２６２】 ２つの植物プロトックス菌株の間の異なる除草剤寛容性は、いずれかの固有の
酵素活性差ではなくむしろこれら２つのプラスミドからの発現差の結果である確
率が高い。プロトックス−１／ＳＡＳＸ３８は、あらゆるヘム欠損培地内でプロ
トックス−２／ＳＡＳＸ３８よりもはるかに緩慢に成長する。さらに、Ａrab プ
ロトックス−１−ＳＡＳＸ３８に匹敵する成長率をもつMzプロトックス−２／Ｓ
ＡＳＸ３８菌株は、同様に、より低い（１０〜１００ｎＭ）の濃度でも除草剤に
対して非常に感受性が強い。

【０２６３】 第Ｂ節： プロトックス阻害性除草剤に対する耐性をもつ植物プロトックス遺
伝子の同定及び特徴づけ 例１０： E.coli 発現系におけるプロトックス阻害性除草剤に対する耐性をも
つ植物プロトックス 遺伝子についての選択 プラスミドベクターｐＦＬ６１内のシロイヌナズナ（Landsberg)ｃＤＮＡライ
ブラリ（Minet et al., Plant J.２：４１７−４２２（１９９２））を入手し増
幅させた。E.coli hemＧ突然変異体ＳＡＳＸ３８（Sasarman et al., J.Gen, Mi
crobiol.１１３：２９７（１９７９））を入手し、２０μｇ／mlのヘマチンを含
有するＬ培地（United States Biochemicals）上に維持した。Bio-Rad 遺伝子パ
ルサー及びメーカーの条件書を用いた電気穿孔法により、プラスミドライブラリ
をＳＡＳＸ３８内に形質転換した。１０cmの平板１枚あたり約５００,０００の
形質転換体密度で１００μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ寒天上に、電気穿
孔を受けた細胞を平板固定した。その後、低い光の中で４０時間３７℃で細胞を
インキュベートし、外因性ヘムの添加無しで成長する能力について選択を行なっ
た。ヘム原栄養体を、ｐＦＬ６１ライブラリから４００／１０⁷の頻度で回収し
た。２２の相補的クローンの配列分析は、９つが、葉緑体プロトックス酵素を発
現すると予想されているプロトックス遺伝子である「プロトックス−１」と呼ば
れるタイプのものであることを示した。

【０２６４】 ｐＦＬ６１ライブラリは、シロイヌナズナのｃＤＮＡが双方向に挿入された酵
母発現ライブラリである。これらのｃＤＮＡは同様に細菌内でも発現され得る。
プロトックスｃＤＮＡは、見かけ上、ベクター内のNotlクローニング部位に対し
約１０アミノ酸分５′にある酵母色素体ゲノムＫ３′配列内の枠内ＡＴＧで開始
し、さらに３００ｂｐ上流側のlacZプロモータからか又は不確定の潜在細菌プロ
モータから発現される。葉緑体トランジット配列の有意な部分を内含していたプ
ロトックス−１ｃＤＮＡがE.coli ＳＡＳＸ３８菌株の成長を阻害したことから
、最少量の葉緑体トランジット配列しか付着していないクローンが、突然変異誘
発／除草剤選択実験のために選ばれた。このクローンｐＳＬＶ１９は、シロイヌ
ナズナプロトックス−１ｃＤＮＡのｂｐ−１５１で始まるＤＮＡ配列（配列番号
１）を伴って、推定上の葉緑体輸送ペプチドのわずか１７のアミノ酸のみを含有
する。

【０２６５】 プラスミドｐＳＬＶ１９は、無作為突然変異誘発菌株ＸＬ１−Red（Stratagen
e, La Jolla, CA）へと形質転換された。この形質転換を、５０μｇ／mlのアン
ピシリンを含有するＬ培地上で平板固定され、３７℃で４８時間ＦＣＢさせた。
形質転換された細胞の芝生を平板からかき取り、Wizard Megarepキット（Promeg
a, Madison, ＷＩ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。この突然変異誘発遺
伝子菌株から分離したプラスミドＤＮＡは、２０００ヌクレオチドあたり約１個
の無作為塩基変化を含むものと予測されている（Greener et al., Strategies７
（２）；３２−３４（１９９４）参照）。

【０２６６】 突然変異を受けたプラスミドＤＮＡをhemＧ 突然変異体ＳＡＳＸ３８へと形質
転換させ（Sasarman et al., J. Gen, Microbial. １１３；２９７（１９７９）
）、プロトックス阻害性除草剤をさまざまな濃度で含むＬ培地上に平板固定した
（構造式ＸＶＩＩ）。平板を３７℃で２日間インキュベートさせた。野生型菌株
を有効に殺した除草剤濃縮物の存在下で成長した全てのコロニーからプラスミド
ＤＮＡを分離した。その後、分離したＤＮＡをＳＡＳＸ３８へと形質転換させ、
再び除草剤上に平板固定して、観察された耐性が確実にプラスミドにより伝播さ
れるものであるようにした。このスクリーンを通過するプラスミドからのプロト
ックス コーディング配列を、Ｎｏｔ／消化により切り出し、突然変異誘発され
ていないベクター内に再クローニングし、除草剤寛容性を付与する能力について
再びテストした。その後、除草剤耐性を付与したプロトックスｃＤＮＡのＤＮＡ
配列を決定し、野生型シロイヌナズナプロトックス−１配列（配列番号１）との
比較により突然変異を同定した。

【０２６７】 最初の突然変異誘発実験から単一のコーディング配列突然変異体を回収した。
この突然変異体は、ただ単に成長率を増大させることのみによって、除草剤「耐
性」の増強を導いた。それは、ｐＳＬＶ１９の切形葉緑体トランジット配列中の
配列番号１内のヌクレオチド１９７においてＣからＡへの突然変異を含有し、配
列番号２のアミノ酸５６において、トレオニンのためのＡＣＧコドンをリシンの
ためのＡＡＧコドンへと変換し、細菌突然変異体のより良い相補を結果としても
たらす。このプラスミドは同様に、ＡＧＴ（Ｓer）がＡＧＣ（Ｓer）に変化して
いる状態で、ヌクレオチド１０５９に沈黙コーディング配列突然変異を含有する
。このプラスミドは、ｐＭｕｔ−１と呼称された。

【０２６８】 ｐＭｕｔ−１プラスミドを次に、上述のように突然変異誘発遺伝子ＸＬ−Ｒed
菌株へと形質転換させ、突然変異を受けたＤＮＡを分離し、突然変異誘発されな
かったｐＭｕｔ−１プロトックス遺伝子にとって致死的な除草剤濃度で平板固定
した。２日後に除草剤寛容性コロニーを３７℃で分離し、上述のように分析した
。多くのプラスミドが、除草剤耐性プロトックス コーディング配列を含有する
ことが示された。配列分析は、耐性細胞が２つのクラスに入ることを示した。同
定された１つの耐性突然変異は、配列番号１に示されているシロイヌナズナプロ
トックス−１配列内のヌクレオチド６８９においてＣからＴへの変化であった。
この変化は、配列番号２のアミノ酸２２０にあるアラニンのためのＧＣＴコドン
をバリンのためのＧＴＴコドンへと変換し、ｐＡraＣ−１Val と呼称された（表
１Ｂ：部分配列３参照）。

【０２６９】 第２の除草剤耐性突然変異体クラスには、シロイヌナズナプロトックス−１配
列内のヌクレオチド１３０７におけるＡからＧへの変化が含まれる。この変化は
、アミノ酸４２６にあるチロシンのためのＴＡＣコドンをシステインのためのＴ
ＧＣコドンへと変換し、ｐＡraＣ−２Ｃysと呼称された（表１Ｂ：部分配列７参
照）。

【０２７０】 第３の耐性突然変異体は、シロイヌナズナプロトックス−１配列内のヌクレオ
チド６９１においてＧからＡへの変化を有する。この突然変異は、アミノ酸２２
１にあるグリシンのためのＧＧＴコドンを、ｐＡraＣ−１内の突然変異に隣接す
るコドン位置にあるセリンのためのＡＧＴコドンへと変換する。このプラスミド
は、ｐＡraＣ−３Ser と呼称された（表１Ｂ：部分配列４を参照のこと）。

【０２７１】 ｐＭｕｔ−１プラスミドの中の耐性突然変異体ｐＡraＣ−２Ｃysは、１９９４
年１１月１４日に、農業研究培養コレクションにｐＷＤＣ−７という呼称で寄託
され、ＮＲＲＬ＃２１３３９Ｎという寄託呼称を与えられた。

【０２７２】 例１１： 無作為スクリーンにおいて同定された位置での付加的な除草剤耐性
コドン置換 無作為スクリーンにおいて除草剤耐性部位として同定されたアミノ酸をその他
のアミノ酸により置換させ、細菌系内の除草剤寛容性及び機能についてテストす
る。形質転換体部位特異的突然変異誘発キット（Clontech Pals Alto, CA）を用
いて、シロイヌナズナプロトックス−１配列のオリゴヌクレオチド特異的突然変
異誘発を実施する。配列分析によってアミノ酸変化を確認した後、突然変異を受
けたプラスミドをＳＡＳＸ３８へと形質転換させ、機能についてテストする目的
でＬ−amp¹⁰⁰培地上で又、寛容性についてテストする目的でさまざまな濃度のプ
ロトックス阻害性除草剤上で平板固定させた。

【０２７３】 この手順を、シロイヌナズナプロトックス−１配列（配列番号１）のヌクレオ
チド ６８８〜６９０でアラニンコドンに、又ヌクレオチド １３０６−１３０８
でチロシンコドンに適用する。結果は、ヌクレオチド６８８−６９０にあるアラ
ニンコドンがバリン（ｐＡｒＣ−１Val），トレオニン（ｐＡraＣ−１Ｔhr），
ロイシン（ｐＡraＣ−１Ｌeu），システイン（ｐＡraＣ−１Ｃys）又はイソロイ
シン（ｐＡraＣ−１Ｉle）のためのコドンへと変更されて、機能を保持した除草
剤耐性プロトックス酵素を生み出すとができるということを実証している（表１
Ｂ；部分配列３参照）。これらの結果はさらに、ヌクレオチド１３０６−１３０
８におけるチロシンコドンが、システイン（ｐＡraＣ−２Ｃys），イソロイシン
（ｐＡｒａＣ−２Ｉle），ロイシン（ｐＡraＣ−２Ｌeu），トレオニン（ｐＡra
Ｃ−２Ｔhr），メチオニン（ｐＡraＣ−２Ｍet）、バリン（ｐＡraＣ−２Ｖal）
又はアラニン（ｐＡraＣ−２Ａla）のためのコドンに変更されて、機能を保持し
た除草剤耐性プロトックス酵素を生み出すことができる（表１Ｂ；部分配列７参
照）ということを実証している。

【０２７４】 例１２： 以前に同定された耐性突然変異体の酵素機能及び／又は除草剤寛容
性を増大させる付加的な突然変異の分離 除草剤耐性プロトックス遺伝子を含有するプラスミドを、突然変異誘発遺伝子
菌株ＸＬ１−Ｒedへと形質転換させ、突然変異を受けたＤＮＡを上述のとおりに
分離する。突然変異を受けたプラスミドを、ＳＡＳＸ３８へと形質転換させ、形
質転換体を、もとの「耐性」突然変異体の成長を阻害するのに充分な除草剤濃度
（構造式ＸＶＩＩ）でスクリーニングする。寛容性コロニーを分離し、より高い
寛容性の表現型を上述のようにコーディング配列依存性のものとして確認する。
これらの突然変異体の配列を決定し、祖先配列と比べることで突然変異を同定す
る。

【０２７５】 この手順を上述のｐＡraＣ−１Ｖal 突然変異体に適用した。結果は、アミノ
酸３０５にあるセリンコドン（配列番号２）をロイシンのためのコドンに変化さ
せ、ｐＡraＣ−１Val 突然変異体単独よりも高いプロトックス阻害性除草剤に対
する耐性をもつ酵素を生成することができるということを実証している。この第
２の部位突然変異は、ＡraＣ３０５Ｌeuと呼称される（表１Ｂ；部分配列１３参
照）。同じ結果は、アミノ酸２４９におけるトレオニンコドンについても実証さ
れ、この場合、イソロイシン又はアラニンのいずれかへの変化は、より寛容性の
高い酵素を導く（表１Ｂ；部分配列１２を参照のこと）。これらの変化は、それ
ぞれＡraＣ２４９Ｉle及びＡraＣ２４９Ａlaと呼称される。

【０２７６】 この手順は又、上述のｐＡraＣ−２Ｃys 突然変異体にも適用された。結果は
、アミノ酸１１８にあるプロリンコドン（配列番号２）をロイシンのためのコド
ンに変化させ、ｐＡraＣ−１Ｃys 突然変異体単独よりも高いプロトックス阻害
性除草剤に対する耐性をもつ酵素を生成することができるということを実証して
いる。この突然変異は、ＡraＣ１１８Ｌeuと呼称される（表１Ｂ；部分配列１１
参照）。同じ結果は、アミノ酸３０５におけるトレオニンコドンについても実証
され、この場合、ロイシンへの変化は、より寛容性の高いｒＡraＣ−２Ｃys酵素
を導く（表１Ｂ；部分配列１３を参照のこと）。これらの変化は、上述のとおり
ｐＡraＣ−１Val 突然変異体で分離され、ＡraＣ３０５Ｌeuと呼称される。ｐＡ
raＣ−２Ｃys 突然変異体のＮＢ耐性を増強させる付加的な突然変異としては、
ＡraＣ４２５Ｓerと呼称されるアミノ酸４２５におけるアスパラギンからセリン
への変化（表１Ｂ；部分配列１４），及びＡraＣ４９８Ｃysと呼称されるアミノ
酸４９８におけるチロシンからシステインへの変化（表１Ｂ：部分配列１５）が
含まれる。

【０２７７】 これらの変化（表１Ｂ；部分配列１１〜１５）は、除草剤寛容性のみを付与す
るのに充分ではないが、むしろすでに突然変異体である酵素の機能及び／又は除
草剤寛容性を増強させることから、「第２部位」突然変異と呼ばれる。考えられ
る全ての置換の網羅的試験が実施されていないことから、これにより、除草剤寛
容性酵素を産生するのに、これらの部位におけるその他のアミノ酸置換で充分で
ある可能性が排除されるわけではない。

【０２７８】 例１３： 高度に機能的／高度に寛容性あるプロトックス酵素を作り出すため
の、同定済み耐性突然変異と同定済みの第２部位突然変異の組合せ 上述のＡraＣ３０５Ｌeu 突然変異は、ＡraＣ−１Val 及びＡraＣ−２Ｃys 突
然変異体プラスミドの両方の機能／除草剤耐性を増強させることがわかった。こ
の第２の部位突然変異の一般的有用性をテストしようとして、それをＡraＣ−２
Ｌew，ＡraＣ−２Val 及びＡraＣ−２Ｉle 突然変異と組合せ、除草剤寛容性に
ついてテストした。各々のケースにおいて、ＡraＣ３０５Ｌeuの変化は、プロト
ックス阻害性除草剤上の耐性プロトックス突然変異体の成長率を著しく増大させ
た。ＡraＣ−２Ｉle耐性突然変異体と第２部位突然変異体ＡraＣ２４９Ｉle又は
ＡraＣ１１８Ｌeuの組合せは同様に、より寛容性の高い突然変異体プロトックス
酵素を産生した。ＡraＣ２４９Ｉle 突然変異は、ＡraＣ−１（部分配列３）突
然変異を増強するものとして同定された第２部位突然変異が同様にＡraＣ−２（
部分配列７）突然変異体の耐性を増大し得るということを実証している。ＡraＣ
−Ｉle，ＡraＣ３０５Ｌeu 及びＡraＣ２４９Ｉle（表１Ｂ；部分配列７，１３
及び１２）を含有する３突然変異プラスミドも同様に、高度の機能性及び高度の
除草剤寛容性をもつプロトックス−１酵素を産生することが示されてきた。

【０２７９】 例１４： 除草剤寛容性を与えるように突然変異を受けることのできるトウモ
ロコシプロトックス−１遺伝子内の部位の同定 上述のＭｕｔ−１シロイヌナズナプロトックス−１プラスミドは、その他のプ
ラスミドが使用されるときに分離される頻繁なアッププロモータ突然変異体とは
異なり、それが真正コーディング配列 ＭＭＴ体を高頻度で与えるという点で、
突然変異誘発／スクリーニング実験において使用されたとき、非常に有効である
。トウモロコシプロトックス−１のための効率の良いプラスミドスクリーニング
系を作り出そうとして、トウモロコシｃＤＮＡを、シロイヌナズナｃＤＮＡとほ
ぼ同じ配列状況下でｐＭｕｔ−１ベクターへと工学処理した。ＰＣＲ融合をオー
バラップする標準的方法を用いて、ｐＭｕｔ−１シロイヌナズナクローン（上述
のような１つのミスセンス突然変異を伴う葉緑体輸送ペプチドの１７個のアミノ
酸を含む）の５′末端を、トウモロコシ配列（配列番号６）のアミノ酸 No.１４
から出発してトウモロコシプロトックス−１ｃＤＮＡ配列に融合させた。トウモ
ロコシｃＤＮＡの３′末端には変化はなかった。この融合の両端にＮotｌ制限部
位を配置し、キメラ遺伝子をｐＭｕｔ−１からのｐＦＬ６１プラスミドバックボ
ーンへとクローニングした。配列分析は、ヌクレオチド７４５〜７４７（配列番
号５）にあるＡＣＧコドンをＡＣＴコドンに変換する（共にトレオニンをコード
する）単一のヌクレオチドＰＣＲ誘導沈黙突然変異を明らかにした。このキメラ
Ａrab−トウモロコシプロトックス−１プラスミドをｐＭｕｔ−３と呼称した。

【０２８０】 上述のようにｐＭｕｔ−３プラスミドを突然変異誘発遺伝子ＸＬ１−Red菌株
に形質転換し、突然変異を受けたＤＮＡを分離し、突然変異誘発を受けていない
ｐＭｕｔ−３トウモロコシプロトックス遺伝子にとっては致死的であった除草剤
濃縮物（構造式ＸＶＩＩ）上で平板固定した。２日後に除草剤寛容性コロニーを
３７℃で分離し、上述の通りに分析した。この分析は、除草剤耐性プロトックス
コーディング配列を含有する多数のプラスミドを明らかにした。配列分析は、除
草剤寛容性トウモロコシプロトックス−１酵素という結果を個別にもたらす５つ
の単一塩基変化を示した。これらの突然変異のうちの３つは、シロイヌナズナプ
ロトックス１遺伝子の中の相同な位置において寛容性を付与することが以前に示
されたアミノ酸変化に対応している。３つのうちの２つは、アミノ酸１６４（配
列番号６）にあるアラニン（ＧＣＴ）をバリン（ＧＡＴ）又はトレオニン（ＡＣ
Ｔ）のいずれかに変換するｐＭｚＣ−１Ｖal及びｐＭｚｔ−１Ｔhrである。この
位置は、上述のｐＡraＣ−１突然変異に対応する（表１Ｂ；部分配列３を参照の
こと）。第３の類似の変化ｐＭｚＣ−３Ｓerは、アミノ酸１６５にあるグリシン
（ＧＧＴ）をセリン（ＡＧＴ）に変換し、これは上述のＡraＣ−３Ｓer 突然変
異に対応する（表１Ｂ；部分配列４参照）。これらの結果は、１つの植物プロト
ックス遺伝子内で同定された除草剤寛容性突然変異が同じくもう１つの種からの
同等の植物プロトックス遺伝子内でも除草剤寛容性を付与しうるという予想を検
証するのに役立つ。

【０２８１】 トウモロコシプロトックス−１スクリーンから分離された突然変異のうちの２
つは、それまで除草剤耐性部位として同定されたことのない残基におけるアミノ
酸の変化を結果としてもたらす。１つの変化（Ｍｚ１５９Ｐhe）は、トウモロコ
シプロトックス−１配列（配列番号６）のアミノ酸１５９においてシステイン（
ＴＧＣ）をフェニルアラニン（ＴＴＣ）に変換する（表１Ｂ；部分配列２参照）
。第２の変化（Ｍｚ４１９Ｔｒ）は、アミノ酸４１９においてイソロイシン（Ａ
ＴＡ）をトレオニン（ＡＣＡ）へと変換する（表１Ｂ；部分配列９）。

【０２８２】 付加的なアミノ酸置換を、トウモロコシ突然変異体部位のうちの３つにおいて
行ない、テストした。寛容性は、グリシン１６５がロイシン（ｐＭｚＣ−３Ｌeu
）に変化させられたとき、又はシステイン１５９がロイシン（Ｍｚ１５９Ｌeu）
又はリシン（Ｍｚ１５９Ｌys）に変化させられたときに実証された（表１Ｂ；部
分配列４及び２参照）。同様に、イソロイシン４１９からヒスチジン（Ｍｚ４１
９Ｈis），グリシン（Ｍｚ４１９Ｇly）又はアスパラジン（Ｍｚ４１９Ａsn）に
変化させることによって、寛容性酵素を作り出した（表１Ｂ；部分配列９参照）
。

【０２８３】 高い除草剤寛容性をもつシロイヌナズナプロトックス−１酵素を産生した個々
のアミノ酸変化を、上述のとおりに、部位特異的突然変異誘発によりトウモロコ
シプロトックス−１遺伝子内に工学処理した。細菌テストで、アミノ酸１６４（
配列番号６）にあるアラニン（ＧＣＴ）をロイシン（ＣＴＴ）に変化させること
により、寛容性の高いトウモロコシ酵素（ｐＭｚＣ−１Ｌeu）が産生されること
が実証された（表１Ｂ；部分配列３参照）。シロイヌナズナ内のＡraＣ−２部位
（表１Ｂ；部分配列７参照）に類似したいかなる突然変異もトウモロコシ無作為
スクリーンにおいて分離されなかった。しかしながら、この部位すなわちトウモ
ロコシ酵素内のチロシン３７０（配列番号６）をイソロイシン（ｐＭｚＣ−２Ｉ
le）又はメチオニン（ｐＭｚＣ−２Ｍet）のいずれかに変化させることで、まさ
に、除草剤寛容性酵素が産生された（表１Ｂ；部分配列７参照）。

【０２８４】 構造式ＸＶＩＩではなく構造式ＸＸＩＩＩａ及びＸＸＩＩＩｂを用いるという
点を除いて、この例において前述した通りに実施した付加的な突然変異スクリー
ンは、寛容性プロトックス酵素を付与する３つの付加的なアミノ酸変化を同定し
た。構造式ＸＸＩＩＩｂを用いたスクリーンは、アミノ酸８８（配列番号６）に
あるアルギニン（ＣＧＴ）をシステイン（ＴＧＴ）に変化させることによってき
わめて寛容性の高いトウモロコシ酵素（Ｍｚ８８Ｃys）（表１Ｂ；部分配列１参
照）が産生されることを実証した。構造式ＩＶｃを用いたもう１つのスクリーン
は、アミノ酸８８（配列番号６）にあるアルギニン（ＣＧＴ）をロイシン（ＣＴ
Ｔ）に変化させることで、きわめて寛容性の高いトウモロコシ酵素（Ｍｚ８８Ｃ
ys）（表１Ｂ；部分配列１参照）が産生されることを実証した。構造式ＸＸＩＩ
Ｉａを用いたもう１つのスクリーンは、アミノ酸３４７（配列番号６）にあるロ
イシン（ＴＴＡ）をセリン（ＴＣＡ）に変化させること及びアミノ酸４５３（配
列番号６）にあるアラニン（ＧＣＡ）をトレオニン（ＡＣＡ）に変化させること
の両方が、きわめて寛容性の高いトウモロコシ酵素（Ｍｚ３４７Ｓer４５３Ｔhr
）（表１Ｂ；部分配列１６及び１７参照）を産生することを実証した。以前に同
定した耐性突然変異体の酵素機能及び／又は除草剤寛容性を増大させる上述の第
２の部位突然変異とは異なる、Ｍｚ３４７Ｓer４５３Ｔhrは、除草剤寛容性のた
めに両方の突然変異が存在することを必要とする「２重突然変異体」である。

【０２８５】 この例において前述したとおりに実施した付加的な突然変異体スクリーンは、
寛容性プロトックス酵素を付与する２つの付加的なアミノ酸変化を同定した。構
造式ＸＸＩＶを用いたスクリーンは、アミノ酸１７５（配列番号６）にあるアラ
ニン（ＧＣＡ）をバリン（ＧＴＡ）又はトレオニン（ＡＣＡ）に変化させること
によってきわめて寛容性の高いトウモロコシ酵素（それぞれＭｚ１７５Val及び
Ｍｚ１７５Ｔhr）（表１Ｂ；部分配列１８参照）が産生されることを実証した。
構造式ＩＶｃを用いたもう１つのスクリーンは、アミノ酸３３７（配列番号６）
にあるロイシン（ＴＴＧ）をセリン（ＴＣＧ）に変化させることによって、きわ
めて寛容性の高いトウモロコシ酵素（Ｍｚ３３７Ｓer）（表１Ｂ；部分配列１９
参照）が産生されることを実証した。

【０２８６】 例１５： 除草剤寛容性を得るべく突然変異を受けることのできる小麦プロト
ックス−１内の部位の同定 小麦プロトックス−１のための効率の良いプラスミドスクリーニングシステム
を作り出すため、小麦ｃＤＮＡを、以上でトウモロコシｃＤＮＡについて記述し
た通りｐＭｕｔ−１ベクターへと工学処理した。このキメラＡrab−小麦プロト
ックス−１プラスミドをｐＭｕｔ−４と呼称した。ｐＭｕｔ−４ＤＮＡを突然変
異に付し、上述のとおり除草剤寛容性についてスクリーニングした。この分析は
、除草剤耐性プロトックスコーディング配列を含む多数のプラスミドを明らかに
した。配列分析は、除草剤寛容性小麦プロトックス−１酵素を個別に結果として
もたらす７個の単一の塩基変化を示した。これらの突然変異のうちの４つは、シ
ロイヌナズナ内及び／又はトウモロコシプロトックス−１遺伝子内の相同な位置
において寛容性を付与することが以前に示されているアミノ酸変化に対応してい
る。２つ、すなわちｐＷhtＣ−１Val及びｐＷhtＣ−１Ｔhrは、アミノ酸２１１
（配列番号１０）にあるアラニン（ＧＣＴ）をバリン（ＧＡＴ）及びトレオニン
（ＡＣＴ）にそれぞれ変換する。この位置は、上述のＰＡraＣ−１突然変異に対
応する（表１Ｂ；部分配列３参照）。第３の類似の変化すなわちｐＷhtＣ−３Ｓ
erは、アミノ酸２１２にあるグリシン（ＧＧＴ）をセリン（ＡＧＴ）に変換し、
これは上述のＡraＣ−３Ｓer 突然変異に対応している（表１Ｂ；部分配列４参
照）。４番目のＷht４６６Ｔhrは、アミノ酸４６６においてイソロイシン（ＡＴ
Ａ）をトレオニン（ＡＣＡ）に変換し、これはトウモロコシからのＭｚ４１９Ｔ
hr 突然変異体に対応する（表１Ｂ；部分配列９参照）。

【０２８７】 小麦プロトックス−１スクリーンから分離した突然変異のうちの３つは、除草
剤耐性部位として以前に同定されたことのない残基におけるアミノ酸変化を結果
としてもたらす。１つの変化（Ｗht３５６Ｌeu）は、小麦プロトックス−１配列
（配列番号１０）のアミノ酸３５６においてバリン（ＧＴＴ）をロイシン（ＣＴ
Ｔ）に変換する（表１Ｂ；部分配列６参照）。第２の変化（Ｗht４２１Ｐro）は
、アミノ酸４２１においてセリン（ＴＣＴ）をプロリン（ＣＣＴ）に変換する（
表１Ｂ；部分配列８参照）。第３の変化（Ｗht５０２Ａla）は、アミノ酸５０２
においてバリン（ＧＴＴ）をアラニン（ＧＣＴ）に変換する（表１Ｂ；部分配列
１０参照）。

【０２８８】 例１６： 除草剤寛容性を得るべく突然変異を受けることのできる大豆プロト
ックス−１内の部位の同定 大豆プロトックス−１のための効率の良いプラスミドスクリーニングシステム
を作り出すため、大豆ｃＤＮＡを、以上でトウモロコシｃＤＮＡについて記述し
た通りｐＭｕｔ−１ベクターへと工学処理した。このキメラＡrab−大豆プロト
ックス−１プラスミドをｐＭｕｔ−５と呼称した。ｐＭｕｔ−５ＤＮＡを突然変
異に付し、上述のとおり除草剤寛容性についてスクリーニングした。この分析は
、除草剤耐性プロトックスコーディング配列を含む多数のプラスミドを明らかに
した。配列分析は、除草剤寛容性大豆プロトックス−１酵素を個別に結果として
もたらす４個の単一の塩基変化を示した。これらの突然変異のうちの２つは、シ
ロイヌナズナ内及び／又は小麦プロトックス−１遺伝子内の相同な位置において
寛容性を付与することが以前に示されているアミノ酸変化に対応している。その
１つ、すなわちｐＳoyＣ−１Thrは、アミノ酸２２６（配列番号１２）にあるア
ラニン（ＧＣＡ）をトレオニン（ＡＣＡ）に変換する。この位置は、上述のＰＡ
raＣ−１ Ｔhr 突然変異に対応する（表１Ｂ；部分配列３参照）。第２の類似の
変化すなわちＳoy５１７Ａlaは、アミノ酸５１７にあるバリン（ＧＴＴ）をアラ
ニン（ＧＣＴ）に変換し、これは小麦からのＷht５０２Ａla 突然変異に対応し
ている（表１Ｂ；部分配列１０参照）。

【０２８９】 大豆プロトックス−１スクリーンから分離した突然変異のうちの２つは、除草
剤耐性部位として以前に同定されたことのない残基におけるアミノ酸変化を結果
としてもたらす。１つの変化（Ｓoy３６９Ｓer）は、大豆プロトックス−１配列
（配列番号１２）のアミノ酸３６９においてプロリン（ＣＣＴ）を、セリン（Ｔ
ＣＴ）に変換する（表１Ｂ；部分配列５参照）。第２の変化（Ｓoy３６９Ｈis）
は、この同じプロリン３６９をヒスチジン（ＣＡＴ）に変換する（表１Ｂ；部分
配列５参照）。

【０２９０】 高い除草剤寛容性をもつシロイヌナズナプロトックス−１酵素を産生した個々
のアミノ酸変化を、上述のとおりに、部位特異的突然変異誘発により、大豆プロ
トックス−１遺伝子内に工学処理した。細菌テストで、アミノ酸２２６（配列番
号１２）にあるアラニン（ＧＣＡ）をロイシン（ｐＳoyＣ−１Ｌeu）に変化させ
ることにより、寛容性の高い大豆酵素が産生されることが実証された（表１Ｂ；
部分配列３参照）。

【０２９１】 例１７： 除草剤寛容性を得るべく突然変異を受けることのできるテンサイプ
ロトックス−１内の部位の同定 テンサイプロトックス−１のための効率の良いプラスミドスクリーニングシス
テムを作り出すため、テンサイｃＤＮＡを、以上でトウモロコシｃＤＮＡについ
て記述した通りｐＭｕｔ−１ベクターへと工学処理した。このキメラＡrab−テ
ンサイプロトックス−１プラスミドをｐＭｕｔ−６と呼称した。ｐＭｕｔ−６Ｄ
ＮＡを突然変異に付し、上述のとおり除草剤寛容性についてスクリーニングした
。この分析は、除草剤耐性プロトックスコーディング配列を含む多数のプラスミ
ドを明らかにした。配列分析は、除草剤寛容性テンサイプロトックス−１酵素を
結果としてもたらす１つの単一塩基変化を示した。この変化（ｐＳugＣ−２Ｃys
）は、アミノ酸４４９にあるチロシン（ＴＡＣ）をシステイン（ＴＧＣ）に変換
し、シロイヌナズナ内のＡraＣ−２突然変異と類似している（表１Ｂ；部分配列
７参照）。

【０２９２】 高い除草剤寛容性をもつシロイヌナズナプロトックス１酵素を産生した個々の
アミノ酸変化を、上述のとおりに、部位特異的突然変異誘発により、サトウキビ
プロトックス−１遺伝子内に工学処理した。細菌テストで、アミノ酸４４９にあ
るチロシン（ＴＡＣ）をロイシン（ｐＳugＣ−２Ｌeu），イソロイシン（ｐＳug
Ｃ−２Ｉle），バリン（ｐＳugＣ−２Val）又はメチオニン（ｐＳugＣ−２Ｍet
）に変化させることにより、除草剤寛容性テンサイ酵素が産生されることを実証
した（表１Ｂ；部分配列７参照）。

【０２９３】 例１８： 除草剤寛容性を得るべく突然変異を受けることのできる綿花プロト
ックス−１内の部位の同定 綿花プロトックス−１のための効率の良いプラスミドスクリーニングシステム
を作り出すようにするため、綿花ｃＤＮＡを、以上でトウモロコシｃＤＮＡにつ
いて記述した通りｐＭｕｔ−１ベクターへと工学処理した。このキメラＡrab−
綿花プロトックス−１プラスミドをｐＭｕｔ−７と呼称した。ｐＭｕｔ−７ＤＮ
Ａを突然変異に付し、上述のとおり除草剤寛容性についてスクリーニングした。
この分析は、除草剤耐性プロトックスコーディング配列を含む多数のプラスミド
を明らかにした。配列分析は、除草剤寛容性綿花プロトックス−１酵素を個別に
結果としてもたらす３個の単一の塩基変化を示した。３つの突然変異体、すなわ
ちｐＣotＣ−２Ｃys，ｐＣotＣ−２Ｈis及びｐＣotＣ−２Ａrgは、アミノ酸４２
８（配列番号１６）にあるチロシン（ＴＡＣ）をシステイン（ＴＧＣ）、ヒスチ
ジン（ＣＡＣ）及びアルギニン（ＣＧＣ）にそれぞれ変化させる（表１Ｂ；部分
配列７参照）。アルギニンは、この以前に同定されたＡraＣ−２（部分配列７）
部位において寛容性を与える新規の置換である。第３の突然変異（Ｃot３６５Ｓ
er）は、アミノ酸３６５においてプロリン（ＣＣＴ）をセリン（ＴＣＴ）へと変
換する。

【０２９４】 この変化は、大豆突然変異 Ｓoy３６９Ｓerに対応する（表１Ｂ；部分配列５
参照）。

【０２９５】 例１９： さまざまなプロトックス阻害性化合物に対する耐性突然変異の交叉
寛容性の実証 単一のプロトックス阻害性除草剤に対する耐性に基づいて当初同定された耐性
突然変異体プラスミドを、その他のプロトックス阻害性化合物のスペクトルに対
しテストした。このテストのために、野生型プラスミドを含有するＳＡＳＸ３８
菌株を、各化合物の一定範囲の濃縮物上で平板固定して、各々についての致死的
濃度を決定する。ＳＡＳＸ３８内の耐性突然変異体プラスミドを平板固定し野生
型プラスミドを含有するＳＡＳＸ３８菌株にとって致死的である濃度よりも少な
くとも１０倍高い各化合物の濃度で存続する能力について評点をつける。

【０２９６】 表３Ａ及び３Ｂに例示されている細菌交差テストからの結果は、同定された突
然変異の各々が、さまざまなプロトックス阻害化合物に対する寛容性を付与する
ことを示している。 ２．第Ｃ節： 遺伝子導入植物内の除草剤耐性プロトックス遺伝子の発現 例２０： 同種組換え又は遺伝子変換によるプロトックス阻害性除草剤に対す
る寛容性をもつ植物の工学処理 記述した突然変異体コーディング配列は実際に、未変性プロトックスプロモー
タの制御下で発現されたとき除草剤寛容性を付与することから、その未変性の染
色体の場所におけるプロトックスコーディング配列に対するターゲティングされ
た変化は、除草剤寛容性植物及び植物細胞を生成するための代替的手段を表わし
ている。所望の突然変異を含んでいるもののそれ自体の発現シグナル（プロモー
タ又３′の未翻訳領域のいずれか）が欠如しているプロトックス ＤＮＡのフラ
グメントを、当該技術分野で認知された複数の方法のいずれか（例えばAgrobact
erium 形質転換，原形質体に対する直接的遺伝子移入、微粒子ボンバード）によ
り導入し、除草剤寛容性形質転換体を選択することができる。導入されたＤＮＡ
フラグメントは同様に、コードされたアミノ酸配列を変化させることなくin vit
roで部位特異的突然変異誘発により導入される（すなわち沈黙突然変異）診断用
制限酵素部位又はその他の配列多形現象を含んでいる。さまざまな選択可能マー
カー及び除草剤寛容性遺伝子について以前に報告されたように（例えば Paszdow
ski et al., ＥＭＢＯ J.７：４０２１−４０２６（１９８８）；Lee et al., P
lant Cell２；４１５−４２５（１９９０）；Risseeuw et al., Plant J.７：１
０９−１１９（１９９５）参照）、いくつかの形質転換は、プロトックス染色体
遺伝子座の中への突然変異体ＤＮＡの相同組込み又は未変性プロトックス染色体
配列を導入された突然変異体配列に変換したことの結果としてもたらされると考
えられている。これらの形質転換体は、その除草剤寛容性表現型の組合せ及びそ
のプロトックス染色体遺伝子座の中の診断用制限酵素部位の存在によって認識さ
れる。 ３．例２１： 植物形質転換ベクターの構築 植物の形質転換のために数多くの形質転換ベクターが利用可能であり、本発明
の遺伝子は、かかるベクターのいずれと合わせた形でも使用可能である。使用す
るベクターの選択は、好まれる形質転換技術及び形質転換のための標的種によっ
て左右されることになる。或る種の標的種にとっては、異なる抗生物質又は除草
剤選択マーカーが好適である可能性がある。形質転換において所定の手順に従っ
て使用される選択マーカーとしては、カナマイシン及び関連抗生物質に対する耐
性を付与するnptＩＩ 遺伝子（Messing & Vierra, Gene１９：２５９−２６８（
１９８２）；Bevan et al., Nature３０４：１８４−１８７（１９８３）），除
草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するbar遺伝子（White et al., Nuc
l Acids Res１８：１０６２（１９９０），Spencer et al., Theor Appl Genet
７９：６２５−６３１（１９９０），抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を
付与するhph遺伝子（Biochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol ４；２９２９−
２９３１）及び、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子（Bourou
is et al., ＥＭＢＯ J. ２（７）；１０９９−１１０４（１９８３））が含ま
れる。

【０２９７】 １．Agrobacterium 形質転換に適したベクターの構築 Agrobacterium tumefaciens を用いた形質転換のために、数多くのベクターを
利用することができる。これらは標準的に少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー
配列を支持し、ｐＢｌＮ１９（Bevan, Nucl. Acids Res.(１９８４））及びｐＸ
ＹＺといったようなベクターを内含する。以下では２つの標準的ベクターの構築
について記述する。

【０２９８】 ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１の構築；Agrobacterium と共に使用する
ための組換え型ベクターの構築について、バイナリーベクターｐＣＩＢ２００及
びｐＣＩＢ２００１を使用する。ｐＴＪＳ７５kan を、テトラサイクリン耐性遺
伝子の切り出しを可能にするｐＴＪＳ７５のＮarl 消化（Schmidhause & Helins
ki, J Bacteriol,１６４：４４６−４５５（１９８５））及びそれに続く、ＮＰ
ＴＩＩを支持するｐＵＣ４ｋからのＡcclフクラグメントの挿入（Messing & Vie
rra, Gene１９：２５９−２６８（１９８２）；Bevan et al., Nature３０４；
１８４−１８７（１９８３）；McBride et al., Plant Molecular Biology １４
：２６６−２７６（１９９０））により作り上げた。ＸhoＩリンカーを、植物選
択可能nos/nptＩＩキメラ遺伝子である左右のＴ−ＤＮＡボーダー及びｐＵＣポ
リリンカーを含有するｐＣＩＢ７のＥcoＲＶフラグメントに連結させ（Rothstei
n et al., Gene５３；１５３−１６１（１９８７）），ＸhoＩ消化したフラグメ
ントをＳalＩ消化したｐＴＪＳ７５kan 内にクローニングさせ、ｐＣＩＢ２００
を作り出した（ＥＰ０３３２ １０４，例１９も同様に参照のこと）。ｐＣＩＢ
２００は、EcoRl, Sstl, Kpnl, Bgill, Xbal及びSallといったユニークなポリリ
ンカー制限部位を含有する。ｐＣＩＢ２００１は、付加的な制限部位のポリリン
カーの中への挿入によって作り出されるｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩ
Ｂ２００１のポリリンカー内のユニークな制限部位は、EcoRl, Sstl, Kpnl, Bgl
ll, Xbal, Sall, Mlul, Bcll, Avrll, Apal, Hpal, 及びStul. である。ｐＣＩ
Ｂ２００１は、これらのユニークな制限部位を含むことに加えて、植物及び細菌
カナマイシン選択、Agrobacterium 媒介形質転換のための左右Ｔ−ＤＮＡボーダ
ー、E.coliとその他の宿主の間の可動化のためのＲＫ２−由来のtrfＡ官能基及
び同じくＲＫ２からのＯriＴ及びＯriＶ官能基をも有している。ｐＣＩＢ２００
１ポリリンカーは、それ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニ
ングのために適している。

【０２９９】 ｐＣＩＢ１０及びそのハイグロマイシン選択誘導体の構築；バイナリーベクタ
ーＰＣＩＢ１０は、植物内での選択のためにカナマイシン耐性をコードする遺伝
子、Ｔ−ＤＮＡ左右ボーダー配列を含有し、E.coli及びAgrobacterium の両方に
おけるその複製を可能にする宿主範囲プラスミドｐＲＫ２５２からの配列を取込
んでいる。その構築については、Rothstein et al., Gene５３：１５３−１６１
（１９８７）により記述されている。Gritz et al., Gene２５：１７９−１８８
（１９８３）により記述されているハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラ
ーゼのための遺伝子を取込んださまざまなｐＣＩＢ１０誘導体が構築されてきた
。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３），又はハイグロ
マイシンとカナマイシン（ｐＣＩＢ７−１５，ｐＣＩＢ７１７）上での遺伝子導
入植物細胞の選択を可能にする。

【０３００】 ＩＩ．非Agrobacterium 形質転換に適したベクターの構築 Agrobacterium tumefaciens を使用せずに形質転換することにより、選択され
た形質転換ベクター内のＴ−ＤＮＡ配列の必要性は回避され、その結果これらの
配列が欠如したベクターを、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する上述のもののようなベク
ターに加えて利用することが可能である。Agrobacterium に依存しない形質転換
技術には、粒子ボンバード、原形質体摂取（例えばＰＥＧ及び電気穿孔）及び微
量注入法を介した形質転換が含まれる。ベクターの選択は、形質転換の対象とな
っている種の好ましい選択によって大きく左右される。以下では、いくつかの標
準的ベクターの構築について記述する。

【０３０１】 ｐＣＩＢ３０６４の構築：ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ(又はホスフィ
ノトリシン)による選択と組合せた直接的遺伝子移入技術に適したｐＵＣ由来の
ベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６は、E.coli ＧＵＳ遺伝子に対する
操作的融合におけるＣａＭＶ３５Ｓプロモータ及びＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネ
ータを含み、ＰＣＴ公示済み出願ＷＯ９３／０７２７８の中で記述されている。
このベクターの３５Ｓプロモータは、出発部位から５′のところに２つのＡＴＧ
配列を含有している。これらの部位は、ＡＴＧを除去し制限部位ＳspＩ及びＰvu
ＩＩを生成するような形で、標準的ＰＣＲ技術を用いて突然変異に付された。新
しい制限部位は、ユニークなSalＩ部位から９６及び３７−ｂｐ離れたところ及
び実際の出発部位から１０１及び４２ｂｐ離れたところにあった。ｐＣＩＢ２４
６の結果としての誘導体は、ｐＣＩＢ３０２５と呼称された。次にＧＵＳ遺伝子
をＳalＩ及びＳacＩでの消化によりｐＣＩＢ３０２５から切り出し、末端を平滑
にし、再度連結してプラスミドｐＣＩＢ３０６０を生成した。John Innes Centr
e, NorwichからプラスミドｐＪＩＴ８２を入手し、Streptomyces viridochromog
enesからのbar 遺伝子を含む４００−ｂｐのＳmaＩ フラグメントを切り出し、
ｐＣＩＢ３０６０のＨpal 部位内に挿入した（Thompson et al., EMBO J.６：２
５１９−２５２３（１９８７））。こうして、ユニーク部位ＳphＩ，ＰstＩ，Hi
ndＩＩＩ及びBam ＨＩを伴うポリリンカー及び（E.coli内での選択のための）ア
ンピシリン耐性のための遺伝子である除草剤選択のためのＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ータ及びターミネータの制御下にあるba遺伝子を含むｐＣＩＢ３０６４が生成さ
れた。このベクターは、独自の調節信号を含有する植物発現カセットをクローニ
ングするのに適している。

【０３０２】 ｐＳＯＧ１９及びｐＳＯＧ３５の構築： ｐＳＯＧ３５は、メトトレキセート
耐性を付与する選択可能なマーカーとして E.Coli 遺伝子ジヒドロフォレートレ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）を利用する形質転換ベクターである。３５Ｓのプロモー
タ（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡdh１遺伝子からのイントロン６（〜５５０
ｂｐ）及びｐＳＯＧ１０からのＧＵＳ未翻訳リーダー配列１８ｂｐを増幅するた
めに、ＰＣＲを用いた。E. coli ジヒドロフォレートレダクターゼＩＩ型遺伝子
をコードする２５０ｂｐのフラグメントも同じくｐＣＲによって増幅させ、これ
ら２つのＰＣＲフラグメントを、ＰＵＣ１９ベクターバックボーン及びノパリン
シンターゼターミネータを含むｐＢ１２２１（Clontech） からのＳacＩ−Ｐst
Ｉフラグメントを集合させた。これらのフラグメント集合により、イントロン６
配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子と及びノパリンシンターゼターミネータ
と融合状態にある３５Ｓプロモータを含むｐＳＯＧ１９が生成された。トウモロ
コシ退緑斑紋ウイルス（ＭＣＭＶ）からのターダー配列でｐＳＯＧ１９内のＧＵ
Ｓリーダーを置き換えることで、ベクターｐＳＯＧ３５が生成された。ｐＳＯＧ
１９及びｐＳＯＧ３５は、アンピシリン耐性のためのｐＵＣ遺伝子を支持し、外
来性配列のクローニングのために利用可能なHindＩＩＩ，ＳphＩ，ＰstＩ及びＥ
coＲＩ部位をもつ。

【０３０３】 ４．例２２： 植物発現カセットの構築 遺伝子導入植物内での発現のために意図された遺伝子配列は、まず第１に、適
切なプロモータの後ろで、適切な転写ターミネータの上流側で集合させられる。
これらの発現カセットはこのとき、例２１にて上述した植物形質転換ベクターへ
と容易に移入され得る。

【０３０４】 Ｉ．プロモータの選択 発現カセット内で使用されるプロモータの選択は、遺伝子導入植物内のトラン
スジーンの空間的及び時間的発現パターンを決定することになる。選択されたプ
ロモータは、特定の細胞タイプ（例えば葉の表皮細胞、葉肉細胞、根の皮膚細胞
）又は特定の組織又は器官（根、葉又は花など）の中でトランスジーンを発現し
、この選択は、トランスジーンの所望の発現場所を反映することになる。代替的
には、選択されたプロモータは、光により誘発された又はその他の時間的に調節
されたプロモータの下で遺伝子の発現を駆動できる。さらにもう１つの代替案は
、選択されたプロモータが化学的に調節されるというものである。こうして、化
学的誘発物質での処置によりひき起こされるか又は望まれる場合にのみトランス
ジーンの発現を誘発する可能性が提供されることになる。

【０３０５】 ＩＩ．転写ターミネータ 発現カセット内で使用するために、さまざまな転写ターミネータが利用可能で
ある。これらは、トランスジーンを超えた転写の終結及びその正しいポリアデニ
ル化を担当する。適切な転写ターミネータは、植物内で機能することがわかって
いるものであり、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータ、tmlターミネータ、ノパリンシ
ンターゼターミネータ、エンドウマメ rbcＳＥ９ターミネータならびに植物プロ
トックス遺伝子と天然に会合されたターミネータ（すわなち「プロトックスター
ミネータ」）がある。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で使用可能で
ある。

【０３０６】 ＩＩＩ．発現の増強又は調節のための配列 転写単位の中からの遺伝子発現を増強するために数多くの配列が発見されてき
ており、これらの配列は、遺伝子導入植物内でのその発現を増大させるために本
発明の遺伝子と合わせて使用することができる。

【０３０７】 さまざまなイントロン配列が、特に単子葉細胞において発現を増強するもので
あることが示されてきた。例えば、トウモロコシＡdhＩ 遺伝子のイントロンは
、トウモロコシ細胞内に導入された時点でその同族プロモータの下で野生型遺伝
子の発現を著しく増強することがわかってきている。イントロン１は、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構成体の中で特に有効
であることが発見され、発現を増強した（Callis et al., Genes Develop. １：
１１８３−１２００（１９８７））。同じ実験システムにおいて、maize bronze
１遺伝子からのイントロンは、発現を増強する上で類似の効果を有していた（Ca
llis et al., 前出）。イントロン配列は、標準的には、未翻訳リーダーの内部
で、植物形質転換ベクター内に所定の手順に従って取込まれてきた。

【０３０８】 ウイルスから誘導されたいくつかの未翻訳リーダー配列も同様に、発現を増強
させることがわかっており、これらは特に双子葉細胞において有効である。特定
的には、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ、「Ｗ−配列」）、トウモロコシ退緑
斑紋ウイルス（ＭＣＭＶ）及びアルファルファモザイクウイルスからのリーダー
配列が、発現を増強させる上で有効であることが示されてきた（例えば、Gallie
et al. Nucl. Acids Res.１５；８６９３−８７１１（１９８７）；Skuzeski e
t al. Plant Molec. Biol.１５；６５−７９（１９９０））。

【０３０９】 ＩＶ．細胞内の遺伝子産物のターゲティング 遺伝子産物をターゲティングするためのさまざまなメカニズムが植物内に存在
することがわかっており、これらのメカニズムの機能を制御する配列が、或る程
度詳しく特徴づけされてきた。例えば、葉緑体に対する遺伝子産物のターゲティ
ングは、さまざまなタンパク質のアミノ末端に発見され葉緑体の移入の間に分割
されて成熟タンパク質を生み出すシグナル配列によって制御される（例えばComa
i et al. J. Biol. Chem. ２６３：１５１０４−１５１０９（１９８８））。こ
れらのシグナル配列は、葉緑体内への異種産物の移入をもたらすべく異種遺伝子
産物に融合され得る（van den Broeck et al. Nature３１３：３５８−３６３（
１９８５））。適切なシグナル配列についてコードするＤＮＡを、ＲＵＢＩＳＣ
Ｏタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２ タンパク
質及び葉緑体局在性であるものとして知られるその他の数多くのタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡの５′末端から分離することができる。

【０３１０】 その他の遺伝子産物が、メチコンドリン及びペロキシソームといったようなそ
の他の細胞小器官に局在化されている（例えば、Unger et al. Plant Molec. Bi
ol. １３：４１１−４１８（１９８９））。これらの産物をコードするｃＤＮＡ
を操作して、これらの細胞小器官に対し異種遺伝子産物をターゲティングするこ
とも可能である。かかる配列の例としては、核コードされたＡＴＰアーゼ及びミ
トコンドリアのための特異的アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼイソ型が
ある細胞タンパク粒に対するターゲティングについては、Rogers et al., Proc.
Natil. Acad. Sci. USA８２．６５１２−６５１６（１９８５））により記述さ
れてきた。

【０３１１】 さらに、その他の細胞区画に対する遺伝子産物のターゲティングをひき起こす
配列が特徴づけされてきた。アミノ末端配列は、アリューロン細胞からのＥＲ、
アポプラスト及び細胞外分泌に対するターゲティングを担当する（Ｋoehler & H
o, Plant Cell２：７６９−７８３（１９９０））。さらにアミノ末端配列はカ
ルボキシ末端配列と合わさって遺伝子産物の空胞ターゲティングを担当している
（Shinshi et al., Plant Molec. Biol.１４：３５７−３６８（１９９０）） 上述の適切なターゲティング配列を問題のトランスジーン配列と融合させるこ
とにより、あらゆる細胞小器官又は細胞区画にトランスジーン産物を導くことが
可能である。例えば葉緑体ターゲティングのためには、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、
ＣＡＢ遺伝子，ＥＰＳＰ遺伝子又はＧＳ２遺伝子からの葉緑体シグナル配列は、
トランスジーンのアミノ末端ＡＴＧに対し枠内で融合される。選択されたシグナ
ル配列は、既知の分割部位を内含すべきであり、構築される融合には、分割のた
めに必要とされる分割部位の後あらゆるアミノ酸が考慮されるべきである。一部
のケースでは、この必要条件は、分割部位とトランスジーンＡＴＧの間に少数の
アミノ酸を付加することによってか又は、代替的にはトランスジーン配列内でい
くつかのアミノ酸を置換することによって満たすことができる。葉緑体移入のた
めに構築された融合は、（Bartlett et al. In:Edelmann et al.(Eds.) Methods
in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. pp.１０８１−１０９１（１９
８２）；Wasmann et al.Mol.Gen.Genet.２０５：４４６−４５３（１９８６）に
より記述された技術を用いて、in vitro転写された構成のin vitro翻訳とそれに
続くin vitro葉緑体摂取により、葉緑体摂取効力についてテストすることができ
る。これらの構築技術は、当該技術分野において周知のものであり、ミトコンド
リア及びペロキシソームにも同等に利用可能である。トランスジーンの発現のた
めに必要とされうるターゲティングの選択は、一定の与えられた経路のための出
発点として必要とされる前駆体の細胞局在性により左右されることになる。これ
は、通常細胞質ゾル又は葉緑体のものとなるが、一部のケースではミトコンドリ
ア又はペロキシソームのものであってよい。トランスジーン発現産物は通常、Ｅ
Ｒ／アポプラストマは空胞に対するターゲティングを必要としない。

【０３１２】 細胞ターゲティングのための上述のメカニズムは、その同族プロモータと合わ
せてのみならず、ターゲティングシグナルを誘導したプロモータのものとは異な
る発現パターンをもつプロモータの転写調節の下で特異的細胞ターゲティング最
終目的をもたらすべく異種プロモータと合わせて利用可能である。

【０３１３】 ５．例２３： 双子葉植物の形質転換 双子葉植物についての形質転換技術は当該技術分野において周知のものであり
、Agrobacterium ベースの技術及びAgrobacterium を必要としない技術を含む。
非Agrobacterium 技術には、原形質体又は細胞による直接的な外因性遺伝子材料
の摂取が関与している。これは、ＰＥＧ又は電気穿孔法を媒介とした摂取、微粒
子ボンバードを媒介とした送達又は微量注入によって達成できる。これらの技術
の例は、Paszkowski et al., EMBO J３：２７１７−２７２２（１９８４），Pot
rykus et al., Mol. Gen. Genet. １９９：１６９−１７７（１９８５），Reich
et al., Biotechnology ４；１００１−１００４（１９８６），及びKlein et
al., Nature３２７：７０−７３（１９８７）によって記述されている。各々の
ケースにおいて、形質転換された細胞は、当該技術分野において既知の技術を用
いて全植物にまで再生される。

【０３１４】 Agrobacterium媒体形質転換は、その形質転換効率が高く数多くの異なる種に
ついて広く有用であることから、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術で
ある。タバコ、トマト、ヒマワリ、綿花、セイヨウアブラナ、ジャガイモ、大豆
、アルファルファ及びハコヤナギ（ＥＰ０３１７５１１（綿花）、ＥＰ０２４９
４３２トマト、Calgene）, ＷＯ８７／０７２９９（アブラナ属 Calgene）、Ｕ
Ｓ４,７９５,８５５（ハコヤナギ））。

【０３１５】 組換え型Agrobacteriumによる標的植物種の形質転換には通常、植物からの外
植体とAgrobacteriumの同時培養が関与し、これは当該技術分野において周知の
プロトコルに従っている。形質転換された組織は、バイナリープラスミドＴ−Ｄ
ＮＡボーダーの間に存在する抗生物質又は除草剤耐性マーカーを支持する選択可
能な培地の中で再生される。

【０３１６】 ６．例２４： 単子葉植物の形質転換 大部分の単子葉植物種の形質転換は現在同様に日常的なものとなっている。好
ましい技術としては、ＰＥＧ又は電気穿孔技術を用いた原形質体内への直接的遺
伝子移入及びカルス組織内への粒子ボンバードが内含される。形質転換は、単一
のＤＮＡ種又は多数のＤＮＡ種（すなわち（同時形質転換）で行なうことができ
、これらの技術は両方共、本発明と共に使用するために適している。同時形質転
換は、複雑なベクター構築を回避し、問題の遺伝子及び選択可能なマーカーのた
めのリンクされていない遺伝子座を伴う遺伝子導入植物を生成し、かくして万一
望ましいとみなされた場合にその後の世代における選択的マーカーの除去を可能
にする、という利点をもつ可能性がある。しかしながら、同時形質転換の使用に
伴う欠点は、別々のＤＮＡ種がゲノム内に組込まれる頻度が１００％未満である
ということにある（Schocher et al. Biotechnology ４：１０９３−１０９６（
１９８６））。

【０３１７】 特許出願（ＥＰ０ ２９２ ４３５（Ciba-Geigy）, ＥＰ０３９２２２５（Ciba
-Geigy），ＷＯ９３／０７２７８（Ciba-Geigy） は、トウモロコシの優良自殖
系統からの原形質体及びカルスの調製、ＰＥＧ又は電気穿孔法を用いた原形質体
の形質転換及び形質転換を受けた原形質体からのトウモロコシ植物の再生のため
の技術について記述している。 Gordon-Kamm et al., Plant Cell２：６０３−
６１８（１９９０））及び Fromm et al., Biotechnology ８：８３３−８３９
（１９９０））は、粒子ボンバードを用いたＡ１８８誘導型トウモロコシ系統の
形質転換のための技術を発表している。さらに、出願ＷＯ９３／０７２７８（Ci
ba-Geigy）及びKoziel et al.,Biotechnology １１：１９４−２００（１９８３
））は、粒子ボンバードによるトウモロコシの優良自殖系統の形質転換のための
技術を記述している。この技術は、受粉から１４〜１５日後のトウモロコシの雌
穂から切り出した長さ１.５〜２.５mmの未成熟トウモロコシ胚芽及びボンバード
のためのＰＤＳ−１０００He Biolistics 装置を利用する。

【０３１８】 イネの形質転換は、原形質体又は微粒子ボンバードを利用した直接的遺伝子移
入技術によっても行なうことができる。原形質体を媒体とする形質転換は、ジャ
ポニカ型及びインディカ型について記述されてきた（Zhang et al., Plant Cell
Rep７：３７９−３８４（１９８８）；Shimamoto et al. Nature ３３８：２７
４−２７７（１９８９）；Datta et al. Biotechnology８：７３６−７４０（１
９９０））。両方の型共、同様に微粒子ボンバードを用いて所定の手順に従って
形質転換可能である（Christou et al. Biotechnology ９：９５７−９６２（１
９９１））。

【０３１９】 特許出願ＥＰ０，３３２，５８１（Ciba-Geigy） は、Pooideae原形質体の生
成、形質転換及び再生のための技術について記述している。これらの技術は、Da
ctylis及び小麦の形質転換を可能にする。さらに、小麦の形質転換は、Ｃ型長期
再生可能カルス細胞内への粒子ボンバードを用いて（Vasil et al., Biotechnol
ogy １０：６６７−６７４（１９９２））によって、そして同じく、未成熟胚芽
及び未成熟胚芽由来のカルスの粒子ボンバードを用いてVasil et al., Biotechn
ology １１：１５５３−１５５８（１９９３））及び Weeks et al., Plant Phy
siol.１０２：１０７７−１０８４（１９９３）によって記述された。しかしな
がら、小麦形質転換のための好ましい技術には、未成熟胚芽の粒子ボンバードに
よる小麦形質転換が関与し、遺伝子送達に先立ち高スクロース又は高マルトース
段階のいずれかが内含される。ボンバードに先立ち、暗所で進行させられる体細
胞胚の誘発のため３mg／ｌの２.４−Ｄ及び３％のスクロースを伴うＭＳ培地上
に、任意の数の胚芽（長さ０.７１〜１mm）を平板固定させる（Murashige & Sko
og, Physiologia Plantarum１５：４７３−４９７（１９６２））。選択された
ボンバード日に、胚芽を誘発培地から除去し、浸透圧調節物質（すなわち望まし
い濃度、標準的には１５％でスクロース及びマルトースが添加された誘発培地）
上に置く。胚芽を２〜３時間原形質溶解させ、その後ボンバードに付す。標的平
板一枚につき２０の胚芽が標準的であるが、これはさほど重要なことではない。
標準手順を用いてマイクロメートルサイズの全粒子上に、適切な遺伝子支持プラ
スミド（例えばｐＣＩＢ３０６４又はｐＳＧ３５）を沈殿させる。各々の胚芽平
板を、標準的８０メッシュスクリーンを用いて最高１０００psiのバースト圧力
を用いDuPont Biolistics のヘリウム装置で射撃する。ホンバードの後、胚芽を
、約２４時間（なおも浸透圧調節物質上で）回収するべく、暗所に戻す。２４時
間後、胚芽を浸透圧調節物質から除去し、誘発培地に戻し、これらの胚芽は再生
するまでここに約１カ月間とどまる。約１カ月後、発達中の胚形成カルスを伴う
胚芽外植体を、適切な選択作用物質（ｐＣＩＢ３０６４の場合１０mg／ｌのバス
タ、ｐＳＯＧ３５の場合２mg／ｌのメトトレキセート）をさらに含む再生培地（
ＭＳ＋１mg／リットルのＮアミノ酸，５mg／リットルのＧＡ）に移す。約１カ月
後、発達した苗条を半強度ＭＳ，２％スクロース及び同じ濃度の選択作用物質が
入った、「ＧＡ７ｓ」として知られるより大きい無菌容器に移す。特許出願ＷＯ
９４／１３８２２は、小麦形質転換のための方法を記述しており、本書に参考と
して内含されている。

【０３２０】 例２５： シロイヌナズナプロトックス−１プロモータ配列の分離 シロイヌナズナ（コロンビア、全植物）から調製したLamda-ZapＩＩゲノミッ
クｃＤＮＡライブラリをStratageneから購入した。約１２５０００ファージを、
１５cmのペトリ皿１枚につき約２５０００pfu の密度で平板固定し、重複フィル
タリフトをコロニー／プラークスクリーン膜上に作った（ＮＥＮ Dupont）。プ
ラークリフトを、ランダムプライミング法（Life Technology）により３２Ｐ−
ｄＣＴＰで標識づけされたシロイヌナズナプロトックス−１ｃＤＮＡ（配列番号
１）を用いてプローブ探査した。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、Chur
ch and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Scl. USA８１：１９９１−１９９５（１９
８４）内で記述されている通り６５℃であった。ハイブリッド形成陽性プラーク
を精製し、ｐBluescriptプラスミド内へin vivoで切り出した。ゲノミックＤＮ
Ａインサートからの配列を蛍光染料で標識付けされたジデオキシターミネータを
用いたチェーンターミネーション法によって決定した（Applied Biosystems, In
c)。１つのクローンＡraＰＴ１Ｐroがプロトックス−１タンパク質コーディング
配列の開始メチオニン（ＡＴＧ）から上流側に５８０ｂｐのシロイヌナズナ配列
を含むことを見極めた。このクローンは同様に、プロトックス１ｃＤＮＡ配列の
ｂｐ−１２４１まで広がるイントロン及びコーディング配列をも含んでいる。５
８０−ｂｐの５′非コーディング配列は、推定上のシロイヌナズナプロトックス
１プロモータであり、該配列は配列番号１３に示されている。

【０３２１】 ＡraＰＴ１Ｐroは、１９９５年１２月１５日にＰＷＤＣ−１１（ＮＲＲＬ＃Ｂ
−２１５１５）として寄託された。

【０３２２】 例２６： 未変性シロイヌナズナプロトックス１プロモータの後ろの改変済み
プロトックス−１遺伝子を発現する形質転換ベクターの構築 ＥcoＲＩ−ＸhoＩ部分消化物フラグメントとして、適切な改変済みシロイヌナ
ズナプロトックス１ｃＤＮＡの全長ｃＤＮＡ を分離した（１９９５年１２月２１日にＷ０９５／３４６５９として公示された
１９９５年６月８日付国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００４５２号の例９を参照の
こと）。このプラスミドをＮcoＩ及びBamＨＩで消化させ、完全なプロトックス
−１ｃＤＮＡとAgrobacterium tumefaciens の tml遺伝子の３′未翻訳配列から
の転写ターミネータから成る１つのフラグメントを産生した。上述のＡraＰＴ１
ProプラスミドをＮcol 及び BamＨＩで消化させ、ｐBluescript及び５８０ｂｐ
の推定上のシロイヌナズナプロトックス−１プロモータから成る１つのフラグメ
ントを産生した。これら２つのフラグメントの連結により、未変性プロトックス
プロモータに対する改変プロトックスｃＤＮＡの融合が産生された。プロトック
ス−１プロモータ／プロトックス−１ｃＤＮＡ／ｔｍｌターミネータの融合を含
む発現カセットをＫpnl での消化によって切り出し、バイナリーベクターｐＣＩ
Ｂ２００へとクローニングさせた。バイナリープラスミドを、電気穿孔法により
Agrobacterium へと形質転換し、次に真空浸潤方法を用いて、シロイヌナズナへ
と形質転換した（Bechtold et al., C.R. Acad. Sci. Paris３１６：１１９４−
１１９９（１９９３）。改変プロトックス遺伝子を発現する形質転換体をカナマ
イシン又はさまざまな濃度のプロトックス阻害性除草剤上で選択した。

【０３２３】 例２７： 未変性プロトックス−１プロモータ／改変プロトックス−１融合の
発現による除草剤寛容性植物の産生 上述の手順を用いて、プロトックス−１配列（配列番号１）内のヌクレオチド
１３０６−１３０８においてＴＡＣからＡＴＧ（チロシンからメチオニン）への
変化を含むシロイヌナズナプロトックス−１ｃＤＮＡを、未変性プロトックス−
１プロモータフラグメントに融合した。この改変プロトックス−１酵素（ＡraＣ
−２Ｍet）は、前述した細菌発現系の中でテストしたとき天然に発生する酵素に
比べ１０倍を超えるさまざまなプロトックス阻害性除草剤に対する寛容性をもつ
ことが示されてきた。真空浸潤した植物からの種子を収集し、構造式ＸＶＩＩの
一定範囲（１０.０ｎＭ〜１.０μＭ）のプロトックス阻害型アリルウラシル除草
剤上に平板固定した。野生型シロイヌナズナでの多数の実験により、この化合物
の１０.０ｎＭ濃縮物が、正常な実生発芽を妨げるのに充分なものであることが
示された。未変性プロトックス−１プロモータに融合されたＡraＣ−２Ｍet改変
酵素を発現する遺伝子導入種子が、最高５００ｎＭの除草剤濃度で正常なシロイ
ヌナズナ実生を生産し、野生型シロイヌナズナに比べて少なくとも５０倍高い除
草剤寛容性を示した。従って、このプロモータ／改変プロトックス酵素融合は、
植物形質転換のための有効な選択可能マーカーとして機能する。１００.０ｎＭ
のプロトックス阻害性除草剤上で発芽した植物のいくつかを土壌に移植し、２〜
３週間成長させ、さまざまな濃度のプロトックス阻害性除草剤を用いた噴霧検定
においてテストした。空のベクター対照形質転換体に比べた場合、ＡraＰＴ１ P
ro／ＡraＣ−２Ｍet 遺伝子導入体は、除草剤噴霧に対し１０倍以上の寛容性を
有していた。

【０３２４】 例２８： シロイヌナズナ発芽検定におけるさまざまなプロトックス阻害性化
合物に対する耐性突然変異の交差寛容性の実証 上述の手順を用いて、プロトックス−１配列（配列番号１）中のヌクレオチド
１３０６−１３０８におけるＴＡＣからＡＴＣ（チロシンからイソロイシン）へ
の変化、及びヌクレオチド９４５〜９４７におけるＴＣＡからＴＴＡ（セリンか
らロイシン）への変化を含むシロイヌナズナプロトックス−１ｃＤＮＡを、未変
性プロトックス−１プロモータフラグメントに融合させ、シロイヌナズナへと形
質転換させた。この改変プロトックス−１酵素（ＡraＣ−２Ｉle＋Ａra（３０５
Ｌeu）は、細菌系（例９−１３参照）内でテストしたとき天然に発生する酵素に
比べ１０倍を超える寛容性をもつことが示されてきた。この融合を含む同型接合
性シロイヌナズナ系統を、上述のような実生発芽検定においてプロトックス阻害
性除草剤に対する高い寛容性を示す形質転換体から生成した。野生型シロイヌナ
ズナの発芽を阻害することが示された複数の濃度の化合物に対する発芽検定をく
り返すことによって、１つの系統からの種子を、さまざまなプロトックス阻害性
化合物に対する交差寛容性についてテストした。これらの実験からの結果は、表
４に示されている。

【０３２５】 ７．トウモロコシプロトックス１プロモータ配列の分離 Lambda ＦＩＸ ＩＩベクター内のZea Mays（Missouri １７自殖系統黄化実生
）ゲノミックＤＮＡライブラリをStratageneから購入した。ライブラリの約２５
０,０００pfu を１５cmのペトリ皿１枚につき約５０,０００ファージの密度で平
板固定し、重複フィルタリフトをコロニー／プラークスクリーン膜上に作った（
ＮＥＮ Dupont）。

【０３２６】 プラークリフトを、ランダムプライミング法（Life Technology）により３２
Ｐ−ｄＣＴＰで標識付けされたトウモロコシプロトックス１ｃＤＮＡ（配列番号
５）を用いてプローブ探査した。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、Chur
ch and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA８１：１９９１−１９９５（１９
８４）内で記述されている通り６５℃であった。Wizard Lambda Preps ＤＮＡ精
製システム（Promega）を用いて３つのハイブリッド形成陽性ファージからLambd
aファージＤＮＡを分離した。制限消化物、除草剤Ｎパターンによる分析及びＤ
ＮＡ配列分析は、ｃＤＮＡクローンとして以前に分離したトウモロコシプロトッ
クス１コーディング配列まで５′のところにある約３.５ｋｂのトウモロコシゲ
ノミックＤＮＡを含むラムダクローンを同定した。このフラグメントは、トウモ
ロコシプロトックス１プロモータを内含する。このフラグメントの配列は、配列
番号１４に示されている。ヌクレオチド３５３３から３８４８まで、この配列は
トウモロコシプロトックス１タンパク質の５′末端をコードする。

【０３２７】 トウモロコシプロトックス１コーディング配列の残りの部分に融合された配列
番号１４を含むプラスミドが、１９９６年３月１９日、ｐＷＤＣ−１４（ＮＲＲ
Ｌ＃Ｂ−２１５４６）とし寄託された。

【０３２８】 例３０： 未変性トウモロコシプロトックス１プロモータの後ろでの、改変プ
ロトックス−１遺伝子を発現する植物形質転換ベクターの構築 ３８４８ｂｐのトウモロコシゲノミックフラグメント（配列番号１４）を、Ｓ
alＩ−ＫpnＩ部分消化物産物として分離ラムダファージクローンから切り出し、
アミノ酸１６４（配列番号６）にアラニンからロイシンの変化を含む改変トウモ
ロコシプロトックス−１ｃＤＮＡから誘導されたＫpnＩ−ＮotＩ フラグメント
に連結させた。こうして、細菌系統内で除草剤寛容性を付与することが示された
全長ｃＤＮＡに対する未変性トウモロコシプロトックス１プロモータの融合を作
り出した（例９−１４）。この融合を、ＣａＭＶ３５Ｓ ターミネータ配列を含
有するｐＵＣ１８由来のベクターにクローニングさせた。このカセットを含有す
るプラスミドをｐＷＣｏ−１と呼称した。

【０３２９】 トウモロコシゲノミッククローンからＣＤ５内に見い出された第１のイントロ
ンをトウモロコシｃＤＮＡ内へと工学処理で戻すことにより、トウモロコシ形質
転換のための第２の構成体を作り出した。標準的なオーバラップＰＣＲ融合技術
を用いて挿入を行なった。イントロン（配列番号２５）は長さ９３ｂｐであり、
例２９に記述されているラムダクローン内で天然の状況下で現われるのと全く同
じように、配列番号６のヌクレオチド２０３と２０４の間に挿入された。発現カ
セットのこのイントロン含有バージョンをｐＷＣｏ−２と呼称した。

【０３３０】 ８．例３１： 遺伝子導入トウモロコシ植物におけるトウモロコシプロトック
ス−１プロモータ活性の実証 トウモロコシプロトックスプロモータ／改変プロトックス融合を用いて形質転
換されたトウモロコシ植物を、トランスジーンに特異的なプライマーを用いたＰ
ＣＲ分析により同定した。全ＲＮＡを、ＰＣＲ陽性植物から調製し、推奨された
条件下で、Superscript Ｍ−ＭＬＶ（Life Technologies)を用いて逆転写した。
改変プロトックス配列に特異的なものとなるように設計されたＰＣＲ反応の中で
、逆転写反応物を２マイクロリットル使用した。形質転換を受けていない対照は
、この反応においていかなる産物を与えないが、ｐＷＣｏ−１で形質転換された
約８５％の植物は陽性結果を与え、トランスジーンから誘導されたｍＲＮＡの存
在を示していた。このことは、トウモロコシプロトックスプロモータについての
一定レベルの活性を実証している。遺伝子導入トウモロコシ植物からのＲＮＡを
同様に、配列番号６からの放射性標識づけされたトウモロコシプロトックスｃＤ
ＮＡフラグメントをプローブとして用いた標準的ノーザンブロット分析に付した
。形質転換を受けていない対照のものよりもはるかに高いプロトックス−１ ｍ
ＲＮＡレベルが、遺伝子導入トウモロコシ植物の一部の中に検出された。この高
いｍＲＮＡレベルは、クローニングされたトウモロコシプロトックスプロモータ
からの改変プロトックス−１ｍＲＮＡの発現に起因するものと推測されている。

【０３３１】 ９．例３２： テンサイプロトックス−１プロモータ配列の分離 Lambda FixＩＩベクタ内で、Stratageneによりゲノミックテンサイライブラリ
が調製された。例２９においてトウモロコシについて記述したとおり、ライブラ
リの約３００,０００pfuを平板固定し、テンサイプロトックス−１ｃＤＮＡ配列
（配列番号１７）でプローブ探査した。制限消化物、ハイブリダイゼーションパ
ターンによる分析及びＤＮＡ配列分析は、ｃＤＮＡクローンとして以前に分離さ
れたテンサイコーディング配列まで５′のところにある約７ｋｂのテンサイゲノ
ミックＤＮＡを含むラムダクローンを同定した。２６０６ｂｐのＰstＩ−ＳalＩ
フラグメントをラムダクローンからｐBluescriptベクターへとサブクローニング
させた。このフラグメントは、２０６８ｂｐの５′非コーディング配列を含有し
、テンサイプロトックス−１プロモータ配列を内含する。これには同様に、コー
ディング配列内に含有された８５ｂｐの第１のイントロン配列及び第１の４５３
ｂｐのプロトックス−１コーディング配列も内含されている。このフラグメント
の配列は、配列番号２６に示されている。

【０３３２】 配列番号２６の配列を含有するプラスミドが、１９９６年１２月６日にｐＷＤ
Ｃ−２０（ＮＲＲＬ＃Ｂ−２１６５０）として寄託された。

【０３３３】 例３３： 未変性テンサイプロトックス−１プロモータの後ろでの、改変テン
サイプロトックス−１遺伝子を発現する植物形質転換ベクターの構築 ２０６８ｂｐの５′非コーディング配列及び第１の３００ｂｐのテンサイプロ
トックス−１コーディング配列を内含するＳacＩ−ＢsrＧＩフラグメントとして
、例３２に記述されているゲノミックサブクローンから、テンサイゲノミックフ
ラグメント（配列番号２６）を切り出した。このフラグメントを、アミノ酸４４
９（配列番号１８）においてチロシンからメチオニンへの変化を含む改変テンサ
イプロトックス−１ｃＤＮＡから誘導されたＢsrＧＩ−ＮotＩフラグメントに連
結させた。こうして、細菌系内で除草剤寛容性を付与することが示された全長ｃ
ＤＮＡ（例９−１４）に対する未変性テンサイプロトックス−１プロモータの融
合が作り出された。この融合を、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータ配列を含むＰＵＣ
１８由来のベクター内にクローニングさせ、プロトックスプロモータ／改変プロ
トックスｃＤＮＡ／ターミネータカセットを作り上げた。このカセットを含有す
るプラスミドは、ｐＷＣｏ−３と呼称された。

【０３３４】 例３４： 未変性テンサイプロトックス−１プロモータ／改変テンサイプロト
ックス−１融合の発現による除草剤寛容性植物の産生ｐＷＣｏ−３からの発現カ
セットを、Agrobacterium、 原形質体及び微粒子銃形質転換技術を含む、双子葉
植物に適用可能な形質転換技術のいずれかを用いてテンサイ内に形質転換させる
。改変プロトックス−１酵素を発現する遺伝子導入テンサイをＲＮＡ−ＰＣＲに
よって同定し、未形質転換テンサイにとって致死的である濃度でプロトックス阻
害性除草剤に対する寛容性についてテストした。

【０３３５】 第Ｄ節： 植物色素体内のプロトックス遺伝子の発現 例３５： 色素体形質転換ベクター内での色素体 rps１６ 遺伝子３′未翻訳配
列及び ＧＵＳリポータ遺伝子に融合された未変性ｃｌｐＰ５′未翻訳配列及びタバコ色
素体ｃｌｐＰ 遺伝子プロモータを含むキメラ遺伝子の調製 Ｉ．タバコ色素体ｃｌｐＰ 遺伝子プロモータ及び完全５′未翻訳ＲＮＡ（５
′ＵＴＲ）の増幅 構成的に発現された色素体ｃｌＰ遺伝子のＡＴＧ開始コドンとの関係において
−１９７の位置にある導入されたＥcoＲＩ制限部位を含む左から右への「トップ
ストランド」プライマー（プライマーＰclp＿Ｐ１ａ：５′−ＧＣＧＧＡＡＴＴ
ＣＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧ−３′（配列番号２７）；Ｅ
coＲＩ制限部位に下線）及び翻訳開始地点に導入されたNcol制限部位を内含する
clpＰプロモータのＡＴＧ開始コドンとの関係において−２１〜−１の領域と相
同な右から左への「ボトムストランド」プライマー（プライマーＰclp＿Ｐ２ｂ
：５′−ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡ−３
′（（配列番号２８）：Ncol制限部位に下線）を用いたＰＣＲのための鋳型とし
て、N.tabacum C.V.「Xanthi ＮＣ」からの全ＤＮＡを使用した。このＰＣＲ反
応は、９５℃で７分間の後に、次に９５℃で１分間／４３℃で２分間／７２℃で
１分間というサイクルを４回、次に９５℃で１分間／５５℃で２分間／７２℃で
１分間というサイクルを２５回、といったように、メーカーの推奨事項（Perkin
Elmer/Roche, Branchburg, NJ）に従ってPerkin Elmer サーマルサイクラー４
８０の中で Pfu熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla CA）を用
いて行なった。プロモータ及び、左端部にはＥcoＲＩ部位を、右端部にはNcol部
位を含みN.tabacum 色素体ＤＮＡ配列のヌクレオチド７４７００〜７４５０５（
Shinozaki et al., EMBO J. ５：２０４３−２０４９（１９８６））に対応する
clpＰ 遺伝子の５′未翻訳領域を含んで成る２１３ｂｐの増幅産物を、標準的手
順を用いてゲル精製し、ＥcoＲＩ及びＮcoＩで消化させた（全ての制限酵素はNe
w England Biolabs, Beverly, MAから購入した。

【０３３６】 ＩＩ． タバコ色素体 rps１６ 遺伝子３′未翻訳ＲＮＡ配列（３′ＵＴＲ）
の増幅 リボソームタンパク質Ｓ１６をコードする色素体rps１６遺伝子のＴＡＡ停止
コドンのすぐ後に続く導入されたＸbaＩ制限部位を含む左から右への「トップス
トランド」プライマー（プライマー rps１６Ｐ＿１ａ（５′−ＧＣＧＴＣＴＡＧ Ａ ＴＣＡＡＣＣＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＡＡＧＧ−３′（配列番号３０）：Ｘba
Ｉ制限部位に下線）及び、rps１６ ３′ＵＴＲの３′末端において導入されたHi
ndＩＩＩ制限部位を取込んだ、rps１６のＴＡＡ停止コドンとの関係において＋
１３４〜＋１５１の領域と相同な右から左への「ボトムストランド」プライマー
（プライマー１６Ｐ＿１ｂ（５′−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＡ
ＡＴＧＡＴＡＡ−３′（配列番号３１）：Hindlll 制限部位に下線）を用いた上
述のとおりのＰＣＲのための鋳型としてN.tabacum C.V.「Xanthi NC」からの全
ＤＮＡを使用した。N.tabacum 色素体ＤＮＡ配列のヌクレオチド４９４３〜５０
９３に対応する領域（Shinozaki et al.１９８６）を含有し左端部にはＸbal部
位を又右端部にはHindＩＩＩ部位を含有するbps１６遺伝子の３′未翻訳領域を
含んで成る１６９ｂｐの増幅産物をゲル精製し、Ｘbal 及びHindＩＩＩで消化さ
せた。

【０３３７】 ＩＩＩ．ｃｌｐＰ 遺伝子プロモータ及び５′及び３′ＵＴＲに対するＧＵＳ
遺伝子フラグメントの連結 ＡＴＧ開始コドンにNcol制限部位をそして未変性３′ＵＴＲの後にＸbaＩ部位
を含有するプラスミドｐＲＡＪ２７５（Clontech）から誘導された１８６４ｂｐ
のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポータ遺伝子フラグメントを、Ncol及びXb
alでの消化によって産生した。このフラグメントを、４方向反応において２０１
ｂｐのＥcoＲＩ／Ncol clpＰプロモータフラグメント，１５７ｂｐのＸbal/Ｈin
d ＩＩＩrps １６ ３′ＵＴＲフラグメント及びクローニングベクターＰＧＥＭ
３zf（−）（Promega, Madison ＷＩ）からの３１４８ｂｐのＥcoＲＩ／Ｈind
ＩＩＩフラグメントに連結させ、プラスミドｐＰＨ１３８を構築した。ＥcoＲＩ
及びＨind ＩＩＩでプラスミドｐＰＲＶｌｌｌａ（Zoubenko et al, １９９４）
を消化させ、結果として得た７２８７ｂｐのフラグメントをｐＰＨ１３８の２２
２２ｂｐのＥcoＲＩ／Ｈind ＩＩＩフラグメントに連結させることによって、色
素体形質転換ベクターｐＰＨ１４０を構築した。

【０３３８】 例３６： 色素体形質転換ベクター内での色素体 rps１６遺伝子３′未翻訳配
列及びＧＵＳリポータ遺伝子に融合されたタバコ色素体 psbＡ遺伝子最小Ｐ５′
未翻訳配列を伴ってタバコ色素体clpＰ遺伝子プロモータを含むキメラ遺伝子の
調製 タバコ色素体clpＰ遺伝子プロモータ及び切形５′未翻訳ＲＮＡ（５′ＵＴＲ
）の増幅： 左から右への「トップストランド」プライマーＰclp＿Ｐ１ａ（配列
番号２７）及び位置−１１でclpＰ５′ＵＴＲ内に導入されたＸba１制限部位を
取込んだclpＰ プロモータのＡＴＧ開始コドンとの関係において−３４〜−１１
の領域を相同な右から左への「ボトムストランド」プライマー（プライマーＰcl
p Ｐｌｂ：５′−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＡＴＴ
ＴＣＡＣ−３′（配列番号２９）；Ｘbal 制限部位に下線）を用いた上述のとお
りのＰＣＲのための鋳型としてN. tabacum c.v. 「Xanthi NC」からの全ＤＮＡ
を使用した。プロモータ及び、左端部にはＥcoＲＩ部位を、右端部にはＸbal 部
位を含有するclpＰ 遺伝子の切形５′ＵＴＲを含んで成る２０２−ｂｐの増幅産
物をゲル精製し、Ｘbalで消化した。Ｘbal部位をその後クレノウＤＮＡポリメラ
ーゼ（New England Biolabs)で充てんし、フラグメントをＥcoＲＩで消化させた
。合成オリゴヌクレオチドminpsb＿Ｕ（トップストランド：５′−ＧＧＧＡＧＴ
ＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＣ−３′（配列
番号３２））及びminpsb＿Ｌ（ボトムストランド）５′−ＣＡＴＧＧＴＡＡＡＡ
ＴＣＴＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＣＣＣ−３′（配列
番号３３）；Ncol制限部位に下線）をアニールすることによって作り出された（
ＡＴＧ開始コドン内に導入されたNcol制限部位懸垂を伴う）タバコ色素体psbＡ
遺伝子５′ＵＴＲのＡＴＧ開始コドン及び最後の３８個のヌクレオチドに対応す
る２本鎖ＤＮＡフラグメント，上述のNcol／Xbal ＧＵＳリポータ遺伝子フラグ
メント，上述のXbal／Hind ＩＩＩrps１６ ３′ＵＴＲフラグメント及び上述の
ＥcoＲＩ／HindＩＩＩｐＧＥＭ３ｚｆ（−）フラグメントに対して、これを５方
向反応で連結し、プラスミドｐＰＨ１３９を構築した。ＥcoＲＩ及びHindＩＩＩ
でプラスミドｐＰＲＶ１１１ａ（Zoubenko, et al., Nucleic Acids Res ２２：
３８１９−３８２４（１９９４））を消化し、結果として得られた７２８７ｂｐ
フラグメントをｐＰＨ１３９の２２５１−ｂｐのＥcoＲＩ／HindＩＩＩフラグメ
ントに連結させることによって、色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４４を構築し
た。

【０３３９】 例３７： タバコ色素体形質転換のためのベクター内での、色素体rps１６ 遺
伝子３′未翻訳配列及びシロイヌナズナプロトックス−１コーディング配列に融
合された完全５′未翻訳配列そしてタバコ色素体clpＰ遺伝子プロモータを含有
するキメラ遺伝子の調製 成熟プロトックスタンパク質コーディング配列の演繹された出発点において新
しいＡＴＧ開始コドン及び導入されたＮcoＩ制限部位を含む（全長前駆体タンパ
ク質のＡＴＧ開始コドンとの関係において＋１７２〜＋１９４のヌクレオチドと
相同性をもつ）左から右への「トップストランド」プライマー（プライマーＡＰ
ＲＴＸＰ１ａ：５′−ＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＧ
ＣＧＧＡＧＧ−３′（配列番号３４）；Ncol制限部位に下線）及びプロトックス
前駆体タンパク質の未変性ＡＴＧ開始コドンとの関係において＋９１７〜＋９４
０のヌクレオチドと相同性をもつ右から左への「ボトムストランド」プライマー
（プライマーＡＰＲＴＸＰ１ｂ：５′−ＣＴＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＡＧ
ＴＧＡＴＡＣ−３′（配列番号３５）を用いた上述のとおりのＰＣＲのための鋳
型として、アミノ末端色素体輸送ペプチドの一部分、全長ｃＤＮＡ及び３′未翻
訳領域の一部分をコードするプロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ（「プ
ロトックス」）からのｃＤＮＡ配列を内含するシロイヌナズナ Notlインサート
を支持するプラスミドＡraＣ−２ＭetからのミニプレップＤＮＡを使用した。７
７８ｂｐの産物をＮcoＩ及びＳfuＩで消化させ、結果として得られた６８２ｂｐ
のフラグメントを、プロトックスコーディング配列の３′部分を含むＡraＣ−２
Ｍetの８４４−ｂｐのＳful／ＮotＩ ＤＮＡフラグメント及びクローニングベク
ターＰＧＥＭ５Ｚｆ（＋）の２９７８−ｂｐＮcoＩ／ＮotＩフラグメント（Prom
ega, MadisonＷＩ）に連結させてプラスミドｐＰＨ１４１を構築した。ｐＰＨ１
４１をＮcoＩ及びＳspＩで消化させ、完全プロトックスコーディング配列を含有
する１４９１ｂｐのフラグメントを分離し、HindＩＩＩで上述のrps１６Ｐ＿ｌ
ａ及びrps１６Ｐ＿ｌｂ ＰＣＲ産物を消化し、ｐＰＨ１４０の７４３６−ｂｐの
ＮcoＩ／HindＩＩＩフラグメントにこれらを連結させることによって、rps１６
３′ＵＴＲで構造式ＸＶＩＩ耐性ＡraＣ−２Ｍet プロトックス 遺伝子を駆動す
るclpＰ プロモータを含有する色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４３を構築した
。

【０３４０】 例３８： タバコ色素体形質転換のためのベクター内での、色素体rps１６ 遺
伝子３′未翻訳配列及びシロイヌナズナプロトックス−１コーディング配列に融
合されたタバコ色素体psbＡ 遺伝子最小５′未翻訳配列に伴ってタバコ色素体cl
pＰ遺伝子プロモータを含有するキメラ遺伝子の調製 ｐＰＨ１４１をＮco１及びＳspＩで消化させ、完全プロトックスコーディング
配列を含有する１４９１ｂｐのフラグメントを分離し、HindＩＩＩで上述のrps
１６Ｐ＿ｌａ及びrps１６Ｐ＿ｌｂ ＰＣＲ産物を消化し、ｐＰＨ１４４の７４６
５−ｂｐのＮcoＩ／HindＩＩＩフラグメントにこれらを連結させることによって
、rps１６ ３′ＵＴＲで構造式ＸＶＩＩ耐性ＡraＣ−２Ｍet プロトックス 遺伝
子を駆動するclpＰ プロモータ／psbＡ′ＵＴＲを含有する色素体形質転換ベク
ターｐＰＨ１４５を構築した。

【０３４１】 例３９： タバコ色素体形質転換のためのベクター内での、色素体rps１６ 遺
伝子３′未翻訳配列及びＥＰＳＰシンターゼコーディング配列に融合された５′
未翻訳配列そしてタバコ色素体clpＰ遺伝子プロモータを含有するキメラ遺伝子
の調製 ５−エノールピルビル−３−ホスフォシキメートシンターゼ（ＥＰＳＰシンタ
ーゼ）遺伝子について、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする（全て本書に
参考として内含されている米国特許第５,３１０,６６７号、５,３１２,９１０号
及び５,６３３,４３５号）。全長ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子ｃＤＮＡを含有する
プラスミドクローンを、分子クローニングの標準技術により分離する。ＰＣＲプ
ライマーは、演繹された成熟タンパク質の出発点からアミノ酸−１のところに挿
入されこの位置でＡＴＧ開始コドンを作り出すＮcol制限部位を含有する５′延
長をもつトップストランドプライマー、及び増幅されたＰＣＲ産物内のＥＰＳＰ
成熟コーディング配列の停止コドンの下流側にＸbaＩ制限部位を含有する５′延
長をもつボトムストランドプライマーを用いて、このプラスミドから成熟サイズ
のＥＰＳＰシンターゼコーディング配列で増幅するように設計されている。ＰＣ
Ｒ増幅は、標準的プロトコルに従い指定のプライマー及びプラスミドＤＮＡ鋳型
を用いて行なわれる。増幅した産物をクローニングし配列決定し、完全成熟ＥＰ
ＳＰシンターゼコーディング配列を含有するＮcoＩ−ＸbaＩＤＮＡフラグメント
を、Ｎcol及びＸbalでの制限消化物、０.８％のＴＡＥアガロースゲル上での電
気泳動、及び切り出されたバンドのフェノール抽出によって分離する。Ｎcol及
びＸbalでｐＰＨ１４０を消化させ、ベクターバックボーン、５′及び３′色素
体組込みターゲティング配列、aadＡ選択可能マーカーカセット及びclpＰプロモ
ータ／rps １６ ３′ＵＴＲ発現配列を含有するフラグメントを精製することに
より、rps１６３′ＵＴＲを伴う成熟サイズのＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の転写
を導くclpＰプロモータを含有する色素体形質転換ベクターを構築する。この産
物を、上述のとおりに分離された成熟サイズのＥＰＳＰシンターゼコーディング
配列を含有するＮcol−Ｘbal ＤＮＡフラグメントと２方向反応において連結さ
せる。

【０３４２】 例４０： タバコ色素体形質転換のためのベクター内での、色素体rps１６ 遺
伝子３′未翻訳配列及びＡＬＳコーディング配列に融合された５′未翻訳配列そ
してタバコ色素体clpＰ遺伝子プロモータを含有するキメラ遺伝子の調製 アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子について、ｃＤＮＡライブラリ
をスクリーニングする（米国特許第５,０１３,６５９号）。全長ＡＬＳ遺伝子ｃ
ＤＮＡを含有するプラスミドクローンを、分子クローニングの標準技術により分
離する。ＰＣＲプライマーは、演繹された成熟タンパク質の出発点からアミノ酸
−１のところに挿入されこの位置でＡＴＧ開始コドンを作り出すＮcol制限部位
を含有する５′延長をもつトップストランドプライマー、及び増幅されたＰＣＲ
産物内のＡＬＳ成熟コーディング配列の停止コドンの下流側にＸbaＩ制限部位を
含有する５′延長をもつボトムストランドプライマーを用いて、このプラスミド
から成熟サイズのＡＬＳコーディング配列で増幅するように設計されている。Ｐ
ＣＲ増幅は、標準的プロトコルに従い指定のプライマー及びプラスミドＤＮＡ鋳
型を用いて行なわれる。増幅した産物をクローニングし配列決定し、完全成熟Ａ
ＬＳコーディング配列を含有するＮcoＩ−ＸbaＩＤＮＡフラグメントを、Ｎcol
及びＸbalでの制限消化物、０.８％のＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動、及
び切り出されたバンドのフェノール抽出によって分離する。 Ｎcol及びＸbalでｐＰＨ１４０を消化させ、ベクターバックボーン、５′及び３
′色素体組込みターゲティング配列、aadＡ選択可能マーカーカセット及びclpＰ
プロモータ／rps １６３′ＵＴＲ発現配列を含有するフラグメントを精製するこ
とにより、rps１６３′ＵＴＲを伴う成熟サイズのＡＬＳ遺伝子を駆動するclpＰ
プロモータを含有する色素体形質転換ベクターを構築する。この産物を、上述の
とおりに分離された成熟サイズのＡＬＳコーディング配列を含有するＮcol−Ｘb
al ＤＮＡフラグメントと２方向反応において連結させる。

【０３４３】 例４１： タバコ色素体形質転換のためのベクター内での、色素体rps１６ 遺
伝子３′未翻訳配列及びＡＨＡＳコーディング配列に融合された５′未翻訳配列
そしてタバコ色素体clpＰ遺伝子プロモータを含有するキメラ遺伝子の調製 アセトヒドリキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子について、ｃＤＮＡライブ
ラリをスクリーニングする（米国特許第４,７６１,３７３号）。全長ＡＨＡＳ遺
伝子ｃＤＮＡを含有するプラスミドクローンを、分子クローニングの標準技術に
より分離する。ＰＣＲプライマーは、演繹された成熟タンパク質の出発点からア
ミノ酸−１のところに挿入されこの位置でＡＴＧ開始コドンを作り出すＮcol制
限部位を含有する５′延長をもつトップストランドプライマー、及び増幅された
ＰＣＲ産物内のＡＨＡＳ成熟コーディング配列の停止コドンの下流側にＸbaＩ制
限部位を含有する５′延長をもつボトムストランドプライマーを用いて、このプ
ラスミドから成熟サイズのＡＨＡＳコーディング配列で増幅するように設計され
ている。ＰＣＲ増幅は、標準的プロトコルに従い指定のプライマー及びプラスミ
ドＤＮＡ鋳型を用いて行なわれる。増幅した産物をクローニングし配列決定し、
完全成熟ＡＨＡＳコーディング配列を含有するＮcoＩ−ＸbaＩ ＤＮＡフラグメ
ントを、Ｎcol及びＸbalでの制限消化物、０.８％のＴＡＥアガロースゲル上で
の電気泳動、及び切り出されたバンドのフェノール抽出によって分離する。 Ｎcol及びＸbalでｐＰＨ１４０を消化させ、ベクターバックボーン、５′及び３
′色素体組込みターゲティング配列、aadＡ選択可能マーカーカセット及びclpＰ
プロモータ／rps １６３′ＵＴＲ発現配列を含有するフラグメントを精製するこ
とにより、rps１６３′ＵＴＲを伴う成熟サイズのＡＨＡＳ遺伝子を駆動するclp
Ｐプロモータを含有する色素体形質転換ベクターを構築する。この産物を、上述
のとおりに分離された成熟サイズのＡＨＡＳシンターゼコーディング配列を含有
するＮcol−Ｘbal ＤＮＡフラグメントと２方向反応において連結させる。

【０３４４】 例４２： タバコ色素体形質転換のためのベクター内での、色素体rps１６ 遺
伝子３′未翻訳配列及びＡＣＣアーゼコーディング配列に融合された５′未翻訳
配列そしてタバコ色素体clpＰ遺伝子プロモータを含有するキメラ遺伝子の調製 アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子について、ｃＤＮ
Ａライブラリをスクリーニングする（米国特許第５,１６２,６０２号）。全長Ａ
ＣＣアーゼ遺伝子ｃＤＮＡを含有するプラスミドクローンを、分子クローニング
の標準技術により分離する。ＰＣＲプライマーは、演繹された成熟タンパク質の
出発点からアミノ酸−１のところに挿入されこの位置でＡＴＧ開始コドンを作り
出すＮcol制限部位を含有する５′延長をもつトップストランドプライマー、及
び増幅されたＰＣＲ産物内のＡＣＣアーゼ成熟コーディング配列の停止コドンの
下流側にＸbaＩ制限部位を含有する５′延長をもつボトムストランドプライマー
を用いて、このプラスミドから成熟サイズのＡＣＣアーゼコーディング配列で増
幅するように設計されている。ＰＣＲ増幅は、標準的プロトコルに従い指定のプ
ライマー及びプラスミドＤＮＡ鋳型を用いて行なわれる。増幅した産物をクロー
ニングし配列決定し、完全成熟ＡＣＣアーゼコーディング配列を含有するＮcoＩ
−ＸbaＩＤＮＡフラグメントを、Ｎcol及びＸbalでの制限消化物、０.８％のＴ
ＡＥアガロースゲル上での電気泳動、及び切り出されたバンドのフェノール抽出
によって分離する。 Ｎcol及びＸbalでｐＰＨ１４０を消化させ、ベクターバックボーン、５′及び３
′色素体組込みターゲティング配列、aadＡ選択可能マーカーカセット及びclpＰ
プロモータ／rps １６３′ＵＴＲ発現配列を含有するフラグメントを精製するこ
とにより、rps１６３′ＵＴＲを伴う成熟サイズのＡＣＣアーゼ遺伝子を駆動す
るclpＰプロモータを含有する色素体形質転換ベクターを構築する。この産物を
、上述のとおりに分離された成熟サイズのＡＣＣアーゼコーディング配列を含有
するＮcol−Ｘbal ＤＮＡフラグメントと２方向反応において連結させる。 ＜ここまで＞ 例４３： タバコ色素体ゲノムの微粒子銃形質転換 Nicotiana tabacum c.v.「
Xanthi nc」の種子を、Ｔ寒天培地上で１″の円形アレイの形で平板１枚あたり
７個の割合で発芽させ、播種から１２〜１４日後に、基本的にＳvab, Z. 及びMa
liga, Ｐ.(１９９３)ＰＮＡＳ９０，９１３〜９１７で記述されている通りにプ
ラスミドｐＰＨ１４３及びｐＰＨ１４５からのＤＮＡでコーティングされた１μ
ｍのタングステン粒子（Ｍ１０，Biorad, Hercules, CA）でボンバードした。ボ
ンバードした実生を２日間Ｔ培地上でインキュベートし、その後葉を切り出し、
５００μｇ／mlのスペクチノマイシンジヒドロクロリド（Sigma, St. Louis, Mo
）を含むプロモータＯＰ培地（Svab, Z., Hajdukiewicz, P.及びMaliga, P.（１
９９０）ＰＮＡ８７，８５２６−８５３０）の平板上で明るい光（３５０〜５０
０μmol 光子／ｍ²／ｓ）の中に背軸側を上にして置いた。ボンバードから３〜
８週間後に漂白した葉の下側に現われた耐性苗条を、同じ選択培地上にサブクロ
ーニングさせ、カルスを形成させ、２次苗条を分離しサブクローニングさせた。
独立したサブクローン内の形質転換された色素体ゲノムコピー（同種細胞質）の
完全な分離を、標準サザンブロット技術によって査定した（Sambrook et al.,（
１９８９）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor)。ＢamＨＩ／ＥcoＲＩで消化された全細胞ＤＮＡ
（Mettler, I.J.（１９８７）Plant Mol Biol Reporter ５，３４６−３４９）
を１％のトリス−ホウ酸塩（ＴＢＥ）アガロースゲル上で分離させ、ナイロン膜
（Amersham) に移し、rps ７／１２ 色素体ターゲティング配列の一部分を含む
ｐＣ８からの０.７ｋｂのBam ＨＩ/Hind ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントに対応する ³² Ｐで標識づけされたランダムプライミングを受けたＤＮＡ配列でプローブ探査
した。同種細胞質性苗条を、スペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地（McBrid
e, K.E. et al.（１９９４）ＰＮＡＳ９１，７３０１−７３０５）上で、無菌状
態で発根させ、温室に移す。

【０３４５】 例４４： Ｎｔ−ｐＰＨ１４３及びＮｔ−ｐＰＨ１４５色素体形質転換体系統
における除草剤寛容性の査定 例４３で記述されている通りに得たｐＰＨ１４３（Ｎｔ−ｐＰＨ１４３系統）
又はｐＰＨ１４５（Ｎｔ−ｐＰＨ１４５系統）で形質転換された一次同種細胞質
性形質転換体系統を、温室内で成熟するまで成長させた。花を（ａ）自家受粉さ
せるか、又は（ｂ）野生型タバコ（c.v. Xanthi nc）で受粉させるか又は（ｃ）
野生型Xanthi植物の除雄された花を受精させるため花粉供与体として使用した。
リンクされたスペクチノマイシン耐性マーカーの色素体分離を、自殖又は戻し交
雑きょう膜から誘導された選択プール１つあたり最低５０個の種子を用いて、各
々の形質転換体の中のスペクチノマイシン耐性表現型の片親雌遺伝により確認し
た。付加的な自殖又は野生型戻し交雑（Xanthi花粉親） 種子を土壌中で発芽さ
せた。各系統（１４３ １Ｂ−１，１４３ １Ｂ−４，１４３ ４Ａ−２，１４３
４Ａ−５，１４５ ７Ａ−５，１４５ ７Ａ−６，１４５ ８Ａ−３）の３６の植
物と同質遺伝型対照としての３６の野生型 Xanthi 植物を、制御された環境キュ
ービクルの中で別々の６″の埴土鉢内で成長させた。プロトックス阻害物質構造
式ＸＶＩＩに対する寛容性を査定するために、Xanthi及び７つの形質転換系統の
植物を、８つの同一の１６鉢フラット（１フラットあたり各タイプ２本の植物）
へと分配した。１リットルあたり構造式ＸＶＩＩを０，０.５，２.５，５，１０
，２５，５０，又は１００mgのいずれかの濃度で流出に至るまでフラットに噴霧
した。ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した構造式ＸＶＩＩの４ｇ
／リットル又は４０ｇ／リットルの原液を用いて、水中で溶液を作り、調製後直
ちに使用した。加湿薬Silwett ２０ミリリットルを、最終濃度０.０１％となる
ように、２００ml体積の除草剤溶液の各々に添加した。フラットは午後遅くに噴
霧し、成長キュービクルへの移送の前に一晩乾燥させた。散布から０，１８，４
８時間及び６日後に、形質転換を受けていないXanthi対照と葉の損傷及びしおれ
を比較することによって、寛容性を査定した。０.５mg／ｌ以上の全ての濃度でX
anthi 植物上に重大な損傷が見られ、２.５mg／ｌ以上で完全なしおれ／焼け枯
れが起こった。Ｎｔ−ｐＰＨ１４３植物については最高濃度（１００mg／リット
ル）でさえわずかな損傷しか発生せず、植物は、直ちに、漂白斑点を外殖した（
０.５mg／リットルでのXantihi の外観は、１００mg／リットルでのＮｔ−Ｐ Ｐ
Ｈ１４３ １Ｂ−１にほぼ等しく、約２００倍の寛容性を示した）。

【０３４６】 例４５： トウモロコシの色素体形質転換 特許遺伝子型キメラ遺伝子００５２６及びキメラ遺伝子００７１４のＩ型胚形
成カルス培養（Green et al.（１９８３）in A.Fazelahmad, K. Downey, J.Schu
ltz, R.W. Voellmy, eds. Advances in Gene Technology: Molecular Genetics
of Plants and Animals. Miami Winter Symposium Series, Vol.２０. Academic
Press, N.Y.）を、温室で成長させた材料からの長さ１.５〜２.５mmの未成熟胚
芽から開始させる。胚芽は、受粉から約１４日後に表面を殺菌した雄穂から、無
菌状態で切り出しする。キメラ遺伝子００５２６の胚芽を、２％のスクロース及
び５mg／Ｌのクロランベンを伴うＤカルス開始培地上に置き（Duncan et al.(１
９８５)Planta １６５：３２２−３３２），一方キメラ遺伝子００７１４の胚芽
は、３％のスクロース及び０.７５mg／Ｌの２.４ｄを伴うＫＭカルス開始培地上
に置く（Kao and Michayluk(１９７５)Planta １２６，１０５−１１０）。その
後、胚芽及び胚形成培養を暗所で培養させる。最大１４日後に胚形成応答を外植
体からとり除く。キメラ遺伝子００５２６応答は、２％のスクロースと０.５mg
／Ｌの２.４−ｄを伴うＤカルス維持培地上に置き、一方、キメラ遺伝子００７
１４の応答は、２％のスクロース及び５mg／ＬのDicamba を伴うＫＭカルス維持
培地上に置く。新鮮な維持培地に対し３〜８週間毎週選択的継代培養を行なった
後、高品質で密な胚形成培養を確立する。遺伝子送達のための標的組織として、
活発に成長している胚形成カルス片を選択する。カルス片を、遺伝子送達の約４
時間前に１２％のスクロースを伴う維持培地を含む標的平板上に固定する。カル
ス片は、標的平板の中心から８mm及び１０mmの半径で、円形に配置させる。DuPo
nt Biolistics マニュアルに記述されているように、プラスミドＤＮＡを金の微
小担体上に沈殿させる。各々の６ショット式マイクロキャリア調製において各プ
ラスミドを２〜３μｇずつ使用する。ＰＤＳ−１０００Ｈe Biolistics装置を用
いて、標的組織細胞に、遺伝子を送達する。Biolistics装置の設定値は以下の通
りである：ラプチャーディスクとマクロキャリアの間８mm、マクロキャリアとス
トッピングスクリーンの間１０mm，停止スクリーンと標的の間７cm。各々の標的
平板は、６５０psi のラプチャーディスクを用いて２度射撃される。停止スクリ
ーンと標的組織の間には、２００×２００のステンレス鋼メッシュ（McMaster-C
arr, New Brunswick, NJ）が設置される。

【０３４７】 ５日後、２％のスクロース及び０.５mg／Ｌの２.４−ｄを伴うもののアミノ酸
を含まず、７５０又は１０００ｎＭの構造式ＸＶＩＩを含有する維持培地に、ボ
ンバードを受けたカルス片を移す。移送から４〜５時間後又は翌日、ライトシェ
ルフ上に１時間カルス片を置き、５〜６週間２７℃で暗所に保管する５〜６週間
の一次選択段階の後、黄色乃至は白色の組織を、５００又は７５０ｎＭの構造式
ＸＶＩＩを補充した。同じ培地の入った新鮮な平板に移す。移送から４〜５時間
後、又は翌日、組織をライトシェルフ上に１時間置き、３〜４週間２７℃で暗所
に保管する。３〜４週間の選択段階後、組織を、５００ｎＭの構造式ＸＶＩＩで
補充された同じ培地の入った平板に移す。健康な成長しつつある組織を１時間ラ
イトシェルフ上に置き、２７℃で暗所に保管する。コロニーが再生に充分なほど
大きくなるまで、２週間おきにそれを継代培養させる。その時点でコロニーを、
選択作用物質を全く含まず３％のスクロース（ＭＳ３Ｓ）を含む修正ＭＳ培地（
Murashige and Skoog(１９６２)Physiol. Plant１５：４７３−４９７）に移し
、光の下に置く。キメラ遺伝子００５２６については、胚芽の発芽を誘発するた
めこの培地に０.２５mg／Ｌのアンシミドールと０.５mg／Ｌのキネチンを添加し
、一方キメラ遺伝子００７１４については、２mg／Ｌのベンジルアデニンを添加
する。再生しつつあるコロニーを、２週間後にキメラ遺伝子００５２６又はキメ
ラ遺伝子００７１４のそれぞれについてアンシミドール及びキネチン又はベンジ
ルアデニンを含まないＭＳ３Ｓ培地に移す。根を伴う又は伴わない再生しつつあ
る苗条を、ＭＳ３Ｓ培地を含む箱に移し、場合によって根を伴う小さな植物を回
収し、温室内で土壌に移す。

【０３４８】 表１Ａ シロイヌナズナ（「Arabpt-1」；配列番号２），トウモロコシ（「Mzpt-1」；
配列番号６），小麦（「Wtpt-1」；配列番号１０），大豆（「Soybeanpt-1」；
配列番号１２），綿花（「Cottonpt-1」；配列番号１６），テンサイ（「Sugpt-
1」；配列番号１８），セイヨウアブラナ（「Rapept-1」；配列番号２０），イ
ネ（「Ricept-1」；配列番号２２），ソルガム（「Sorghumpt-1」；配列番号２
４），及びサトウキビ（「Scpt-1」；配列番号３７）からの全長及び部分的プロ
トックス１ アミノ酸配列の整列。整列は、PileUpプログラム（ＧＣＧパッケー
ジ University of Wisconsin, Madison, WI)を用いて実施した。阻害物質耐性を
付与又は増強するために本書の教示に従って修飾されうる位置は太字で示されて
いる。

【０３４９】

【表１】

【０３５０】

【表２】

【０３５１】

【表３】

【０３５２】

【表４】

【０３５３】

【表５】

【０３５４】

【表６】

【０３５５】

【表７】

【０３５６】

【表８】

【０３５７】

【表９】

【０３５８】

【表１０】

【０３５９】

【表１１】

【０３６０】

【表１２】

【０３６１】

【表１３】

【０３６２】

【表１４】

【０３６３】

【表１５】

【０３６４】

【表１６】

【０３６５】

【表１７】

【０３６６】

【表１８】

【０３６７】 本書に記述されている本発明のさまざまな修正が当業者には明白になることだ
ろう。かかる修正は、添付のクレームの範囲内に入るものと意図されている。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月１日（２００１．１０．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボルラス，サンドラ リン アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27707，ダーハム，ピン オーク ドライ ブ 4225 (72)発明者 へイフェッツ，ピーター バーナード アメリカ合衆国，カリフォルニア 92121 −1125，サンディエゴ，メリーフィールド ロー 3115，トーレイ メサ リサーチ インスティテュート インコーポレイテ ィド (72)発明者 ロー，マーカス ディクソン アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27516，チャペル ヒル，リトル クリー ク ファーム ロード 8718 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA08 CA04 CA06 DA01 DA05 EA04 EA10 GA11 HA01 4B050 CC04 DD13 LL10 4B065 AA11X AA88Y AA99Y AB01 AC20 BA02 CA53

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活
   性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子において
   、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵素の阻害物質に対して耐性を
   もち、前記修飾された酵素が： （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｃ） Δ₁をアルギニン以外のアミノ酸とする、ＡＰΔ₁Ｆ、 （ｄ） Δ₂をロイシンとする、ＦΔ₂Ｓ、 （ｅ） Δ₃をイソロイシンとする、ＹΔ₃Ｇ、 （ｆ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 （ｇ） Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするＴΔ₁₆Ｇ及び、Δ₁₇をアラニン以
   外のアミノ酸とするＹＶΔ₁₇Ｇ、 というアミノ酸部分配列のうちの少なくとも１つのを含んで成り、天然に発生す
   る形態の前記酵素をコードするヌクレオチド配列が１つの植物から誘導されてい
   る、核酸分子。
2. 【請求項２】 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活
   性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の
   ヌクレオチド酸分子において、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵
   素の阻害物質に対して耐性をもち、前記修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｃ） Δ₁をアルギニン以外のアミノ酸とする、ＡＰΔ₁Ｆ、 （ｄ） Δ₂をロイシンとする、ＦΔ₂Ｓ、 （ｅ） Δ₃をイソロイシンとする、ＹΔ₃Ｇ、 （ｆ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 （ｇ） Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするＴΔ₁₆Ｇ及び、Δ₁₇をアラニン以
   外のアミノ酸とするＹＶΔ₁₇Ｇ から成るグループの中から選択された少なくとも１つのアミノ酸部分配列を含ん
   で成り、前記修飾された酵素をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１
   、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列
   番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号３６において記されている
   ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対し、 （ｉ） ７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭのＮａＰＯ₄、ｐＨ
   ７.０、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でのハイブリダイゼーション；及び、 （ｉｉ） ２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中５０℃での洗浄、 という条件下でハイブリッド形成する、ヌクレオチド酸分子。
3. 【請求項３】 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活
   性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子において
   、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵素の阻害物質に対して耐性を
   もち、前記修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｃ） Δ₁をアルギニン以外のアミノ酸とする、ＡＰΔ₁Ｆ （ｄ） Δ₇をヒスチジン又はアラニンとするΔ₇ＩＧ、 というアミノ酸部分配列のうちの少なくとも１つを含んで成り、天然に発生する
   形態の前記酵素をコードするヌクレオチド配列が１つの植物から誘導されている
   、 請求項１又は２のいずれか１項に記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 前記修飾された酵素がアミノ酸部分配列 ＫＡΔ₁₈Ｆを含み
   、ここでΔ₁₈はアラニン以外のアミノ酸、好ましくはトレオニン又はバリンであ
   る（但し特にバリン）である、請求項１に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 前記修飾された酵素がアミノ酸部分配列 ＱΔ₁₉Ｈを含み、
   ここでΔ₁₉は、ロイシン以外のアミノ酸、好ましくはセリンである、請求項１に
   記載の核酸分子。
6. 【請求項６】 前記修飾された酵素がアミノ酸部分配列 ＡＰΔ₁Ｆを含み、
   ここでΔ₁はロイシン又はシステインである、請求項１に記載の核酸分子。
7. 【請求項７】 前記修飾された酵素がアミノ酸部分配列 Δ₇ＩＧを含んで成
   り、ここでΔ₇はヒスチジン又はアラニン、好ましくはヒスチジンである、請求
   項１に記載の核酸分子。
8. 【請求項８】 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活
   性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子において
   、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵素の阻害物質に対して耐性を
   もち、前記修飾された酵素が、第１のアミノ酸部分配列そしてさらに （ａ） Δ₁₁をプロリン以外のアミノ酸とするＱΔ₁₁Ｓ、 （ｂ） Δ₁₂をトレオニン以外のアミノ酸とするＩＧＧΔ₁₂、 （ｃ） Δ₁₃をセリン以外のアミノ酸とするＳＷＸＬΔ₁₃、 （ｄ） Δ₁₄をアスパラギン以外のアミノ酸とするＬΔ₁₄Ｙ、 （ｅ） Δ₁₅をチロシン以外のアミノ酸とするＧΔ₁₅ＸＧＬ、 から成るグループの中から選択された少なくとも１つの付加的アミノ酸部分配列
   を含んで成る、核酸分子。
9. 【請求項９】 前記第１の部分配列が、請求項１〜７のいずれか１項に記載
   の配列である、請求項８に記載の核酸分子。
10. 【請求項１０】 前記付加的な部分配列がＱΔ₁₁Ｓであり、ここでΔ₁₁がプ
    ロリン以外のアミノ酸、好ましくはロイシンである、請求項８及び９のいずれか
    １項に記載の核酸分子。
11. 【請求項１１】 前記付加的な部分配列がＩＧＧΔ₁₂であり、ここでΔ₁₂は
    トレオニン以外のアミノ酸、好ましくはイソロイシン又はアラニンである、請求
    項８及び９のいずれか１項に記載の核酸分子。
12. 【請求項１２】 前記付加的な部分配列がＳＷＸＬΔ₁₃であり、ここでΔ₁₃ はセリン以外のアミノ酸、好ましくはロイシンである、請求項８及び９のいずれ
    か１項に記載の核酸分子。
13. 【請求項１３】 前記付加的な部分配列がＬΔ₁₄Ｙであり、ここでΔ₁₄はア
    スパラギン以外のアミノ酸、好ましくはセリンである、請求項８及び９のいずれ
    か１項に記載の核酸分子。
14. 【請求項１４】 前記付加的な部分配列がＧΔ₁₅ＸＧＬであり、Δ₁₅がチロ
    シン以外のアミノ酸、好ましくはシステインである、請求項８及び９のいずれか
    １項に記載の核酸分子。
15. 【請求項１５】 修飾された酵素が、Δ₇をチロシン以外のアミノ酸好まし
    くはイソロイシンとするアミノ酸部分配列Δ₇ＩＧ、Δ₁₂をトレオニン以外のア
    ミノ酸好ましくはイソロイシンとするアミノ酸部分配列ＩＧＧΔ₁₂、及びΔ₁₃を
    セリン以外のアミノ酸好ましくはロイシンとするアミノ酸部分配列ＳＷＸＬΔ₁₃ を含んで成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子。
16. 【請求項１６】 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）
    活性をもつ修飾された酵素をコードする植物から分離されたヌクレオチド配列を
    含み、該修飾された酵素が天然に発生するプロトックス酵素の阻害物質に対する
    耐性をもち、ヌクレオチド配列はさらに、 （ａ） 核酸配列が、Δ₁をロイシンとするアミノ酸部分配列ＡＰΔ₁Ｆをコード
    する配列を有する； （ｂ） 核酸配列が、Δ₂をロイシンするアミノ酸部分配列ＦΔ₂Ｓをコードする
    配列を有する； （ｃ） 核酸配列が、Δ₃をイソロイシンとするアミノ酸部分配列ＹΔ₃Ｇをコー
    ドする配列を有する； （ｄ） 核酸配列が、Δ₇をアラニン又はヒスチジンとするアミノ酸部分配列
    Δ₇ＩＧをコードする配列を有する； （ｅ） 核酸配列が、Δ₃アラニン以外但し好ましくはシステイン又はイソロイ
    シン、より好ましくはイソロイシンとするアミノ酸部分配列ＹΔ₃Ｇをコードす
    る配列を有し、核酸配列が同様に： （１） Δ₁₁をプロリン以外のアミノ酸とする、部分配列ＱΔ₁₁Ｓ、 （２） Δ₁₂をトレオニン以外のアミノ酸とする、部分配列ＩＧＧΔ₁₂、 （３） Δ₁₃をセリン以外のアミノ酸とする、部分配列ＳＷＸＬΔ₁₃、 （４） Δ₁₄をアスパラギン以外のアミノ酸とする部分配列ＬΔ₁₄Ｙ、 （５） Δ₁₅をチロシン以外のアミノ酸とする、部分配列ＧΔ₁₅ＸＧＬ から成るグループのうちの１つをコードする配列を有する； （ｆ） 核酸配列が、Δ₇をチロシン以外但し好ましくはトレオニン、アラニン
    又はヒスチジン、より好ましくはアラニン又はヒスチジンそして最も好ましくは
    ヒスチジンとするアミノ酸部分配列 Δ₇ＩＧをコードする配列を有し、核酸配列
    が同様に： （１） Δ₁₁をプロリン以外のアミノ酸とする、部分配列ＱΔ₁₁Ｓ； （２） Δ₁₂をトレオニン以外のアミノ酸とする、部分配列ＩＧＧΔ₁₂； （３） Δ₁₃をセリン以外のアミノ酸とする、部分配列 ＳＷＸＬΔ₁₃； （４） Δ₁₄をアスパラギン以外のアミノ酸とする部分配列ＬΔ₁₄Ｙ； （５） Δ₁₅をチロシン以外のアミノ酸とする、部分配列 ＧΔ₁₅ＸＧＬ； から成るグループのうちの１つをコードする配列を有する； （ｇ） 核が、Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸とするアミノ酸部分配列ＴΔ₁₆Ｇ
    をコードする配列を有し、核酸配列が同様にΔ₁₇をアラニン以外のアミノ酸とす
    るアミノ酸部分配列ＹＶΔ₁₇Ｇをコードする配列を有する； （ｈ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とするＫＡΔ₁₈Ｆ； （ｉ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とするＱΔ₁₉Ｈ、 という条件のうちの少なくとも１つが満たされていることを特徴としている請求
    項１及び８〜９のいずれか１項に記載の核酸分子。
17. 【請求項１７】 前記部分配列が、Δ₁₆をロイシン以外のアミノ酸好ましく
    はセリンとするアミノ酸部分配列ＴΔ₁₆Ｇをコードし、前記核酸配列が同様に、
    Δ₁₇をアラニン以外のアミノ酸好ましくはトレオニンとするアミノ酸部分配列Ｙ
    ＶΔ₁₇Ｇをコードする配列を有する、請求項１６に記載の核酸分子。
18. 【請求項１８】 配列番号６のアミノ酸８８に対応する位置で発生するアル
    ギニンが、もう１つのアミノ酸好ましくはロイシンで置換されている植物プロト
    ックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス
    ）をコードし、修飾されたプロトックスが、天然に発生するプロトックス活性を
    阻害する量で除草剤に対する寛容性をもつ、請求項１に記載の核酸分子。
19. 【請求項１９】 配列番号６のアミノ酸１５９に対応する位置において発生
    するシステインがロイシンで置換されている植物プロトックスを含む修飾された
    プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードする、請求項
    １に記載の核酸分子。
20. 【請求項２０】 配列番号６のアミノ酸１７５に対応する位置で発生するア
    ラニンがもう１つのアミノ酸好ましくはバリン又はトレオニンで置換されている
    植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プ
    ロトックス）をコードし、修飾されたプロトックスが、天然に発生するプロトッ
    クス活性を阻害する量で除草剤に対する寛容性をもつ、請求項１に記載の核酸分
    子。
21. 【請求項２１】 配列番号６のアミノ酸３３７に対応する位置で発生するロ
    イシンがもう１つのアミノ酸好ましくはセリンで置換されている植物プロトック
    スを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）を
    コードし、修飾されたプロトックスが、天然に発生するプロトックス活性を阻害
    する量で除草剤に対する寛容性をもつ、請求項１に記載の核酸分子。
22. 【請求項２２】 配列番号１６のアミノ酸４２８に対応する位置において発
    生するチロシンがヒスチジン又はアラニン、好ましくはヒスチジンで置換されて
    いる植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
    （プロトックス）をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
23. 【請求項２３】 配列番号２のアミノ酸２２０に対応する位置において発生
    するアラニンがイソロイシン又はチロシンで置換されている植物プロトックスを
    含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコー
    ドする、請求項１に記載の核酸分子。
24. 【請求項２４】 配列番号２のアミノ酸４２６に対応する位置において発生
    するチロシンがアラニンで置換されている植物プロトックスを含む修飾されたプ
    ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードする、請求項１
    に記載の核酸分子。
25. 【請求項２５】 第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換をもつ植物プ
    ロトックスを含む修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトッ
    クス）をコードし、該第１のアミノ酸置換がプロトックス阻害物質に対する耐性
    を付与する物性をもち、第２のアミノ酸置換が第１のアミノ酸置換により付与さ
    れた耐性を増強する特性をもつ、請求項１及び８〜９のいずれか１項に記載の核
    酸分子、ただし特に、該植物がトウモロコシ、小麦、大豆、綿花、テンサイ、セ
    イヨウアブラナ、イネ、ソルガム、サトウキビ、及びシロイヌナズナから成るグ
    ループの中から選択されている植物プロトックスを含む修飾されたプロトポルフ
    ィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）をコードするＤＮＡ分子。
26. 【請求項２６】 第１のアミノ酸置換が： （ａ） 配列番号６のアミノ酸８８におけるアルギニンに対応する位置； （ｂ） 配列番号６のアミノ酸１７５におけるアラニンに対応する位置；及び （ｃ） 配列番号６のアミノ酸３３７におけるロイシンに対応する位置、 からなるグループの中から選択された位置で起こる、請求項２５に記載の核酸分
    子。
27. 【請求項２７】 特に好ましいのは、第１のアミノ酸置換が： （ａ） 配列番号６のアミノ酸８８におけるアルギニンに対応する位置； （ｂ） 配列番号６のアミノ酸１６４におけるアラニンに対応する位置； （ｃ） 配列番号６のアミノ酸１６５におけるグリシンに対応する位置； （ｄ） 配列番号６のアミノ酸３７０におけるチロシンに対応する位置； （ｅ） 配列番号６のアミノ酸１５９におけるシステインに対応する位置； （ｆ） 配列番号６のアミノ酸４１９におけるイソロイシンに対応する位置； （ｇ） 配列番号１０のアミノ酸３５６におけるバリンに対応する位置； （ｈ） 配列番号１０のアミノ酸４２１におけるセリンに対応する位置； （ｉ） 配列番号１０のアミノ酸５０２におけるバリンに対応する位置； （ｊ） 配列番号１０のアミノ酸２１１におけるアラニンに対応する位置； （ｋ） 配列番号１０のアミノ酸２１２におけるグリシンに対応する位置； （ｌ） 配列番号１０のアミノ酸４６６におけるイソロイシンに対応する位置；
    （ｍ） 配列番号１２のアミノ酸３６９におけるプロリンに対応する位置； （ｎ） 配列番号１２のアミノ酸２２６におけるアラニンに対応する位置； （ｏ） 配列番号１２のアミノ酸４３２におけるチロシンに対応する位置； （ｐ） 配列番号１２のアミノ酸５１７におけるバリンに対応する位置； （ｑ） 配列番号１６のアミノ酸４２８におけるチロシンに対応する位置； （ｒ） 配列番号１６のアミノ酸３６５におけるプロリンに対応する位置； （ｓ） 配列番号１８のアミノ酸４４９におけるチロシンに対応する位置； （ｔ） 配列番号６のアミノ酸１７５におけるアラニンに対応する位置；及び （ｕ） 配列番号６のアミノ酸３３７におけるロイシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こり、かつ 第２のアミノ酸置換が： （ａ） 配列番号２のアミノ酸３０５におけるセリンに対応する位置； （ｂ） 配列番号２のアミノ酸２４９におけるトレオニンに対応する位置； （ｃ） 配列番号２のアミノ酸１１８におけるプロリンに対応する位置； （ｄ） 配列番号２のアミノ酸４２５におけるアスパラギンに対応する位置；及
    び （ｅ） 配列番号２のアミノ酸４９８におけるチロシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こる、ＤＮＡ分子である。
28. 【請求項２８】 第１のアミノ酸置換が： （ａ） 配列番号６のアミノ酸８８におけるアルギニンに対応する位置； （ｂ） 配列番号６のアミノ酸１７５におけるアラニンに対応する位置；及び （ｃ） 配列番号６のアミノ酸３３７におけるロイシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こり、かつ第２のアミノ酸置換が
    ： （ａ） 配列番号２のアミノ酸３０５におけるセリンに対応する位置； （ｂ） 配列番号２のアミノ酸２４９におけるトレオニンに対応する位置； （ｃ） 配列番号２のアミノ酸１１８におけるプロリンに対応する位置； （ｄ） 配列番号２のアミノ酸４２５におけるアスパラギンに対応する位置；及
    び （ｅ） 配列番号２のアミノ酸４９８におけるチロシンに対応する位置、 から成るグループの中から選択された位置で起こる、請求項２７に記載の核酸分
    子。
29. 【請求項２９】 ２重アミノ酸置換を有し、１つのアミノ酸置換が、配列番
    号６のアミノ酸３４７においてロイシンに対応する位置で起こり、第２のアミノ
    酸置換が、配列番号６のアミノ酸４５３においてアラニンに対応する位置で起こ
    る、請求項１に記載の核酸分子。
30. 【請求項３０】 配列番号６のアミノ酸３４７に対応する位置で発生するロ
    イシンがセリンにより置換され、配列番号６のアミノ酸４５３に対応する位置で
    発生するアラニンがトレオニンで置換される、２重アミノ酸置換を有する、請求
    項２９に記載の核酸分子。
31. 【請求項３１】 前記植物が、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、トウモロ
    コシ、小麦、大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、イネ、ソルガム、及び
    サトウキビ、好ましくはトウモロコシ又は綿花から成るグループの中から選択さ
    れる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
32. 【請求項３２】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列
    によってコードされる、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス
    ）活性を有する修飾された酵素。
33. 【請求項３３】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子に操作可
    能な形でリンクされた植物中で活性であるプロモータを含むキメラ遺伝子。
34. 【請求項３４】 請求項３３に記載のキメラ遺伝子を含んで成る組換え型ベ
    クター。
35. 【請求項３５】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含んで
    成る植物細胞。
36. 【請求項３６】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、
    その後代を含めた植物、植物組織、植物細胞又は植物種子において、前記核酸分
    子がその中で発現されるか又はその後代が天然に発生するプロトックス活性の阻
    害物質に対する寛容性をそれに付与する、植物、植物組織、植物細胞又は植物種
    子。
37. 【請求項３７】 シロイヌナズナ、サトウキビ、大豆、大麦、綿花、タバコ
    、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、ライ麦、オー
    ト麦、芝草及び飼料牧草、アワ、青刈飼料及びイネから成るグループの中から選
    択される、請求項３６に記載のその後代を含めた、植物、植物組織、植物細胞、
    又は植物種子。
38. 【請求項３８】 シロイヌナズナ、大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラ
    ナ、トウモロコシ、小麦、ソルガム、イネ、及びサトウキビから成るグループの
    中から選択される、請求項３６に記載のその後代を含めた植物、植物組織、植物
    細胞、又は植物種子。
39. 【請求項３９】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、
    シロイヌナズナ、大豆、綿花、テンサイ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、小
    麦、ソルガム、イネ及びサウトキビから成るグループの中から選択される、その
    後代を含めた、植物、植物組織、植物細胞、又は植物種子。
40. 【請求項４０】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子に操作可
    能な形でリンクされた植物色素体内で機能的なプロモータを含んで成る、請求項
    ３３に記載のキラメ遺伝子。
41. 【請求項４１】 植物色素体中で機能的な前記プロモータがc/ｐP遺伝子プ
    ロモータである、請求項４０に記載のキメラ遺伝子。
42. 【請求項４２】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む色
    素体形質転換ベクター。
43. 【請求項４３】 請求項４２に記載の色素体形質転換ベクターを含む植物色
    素体。
44. 【請求項４４】 請求項４３に記載の植物色素体を含む、その後代を含めた
    植物、植物組織、植物細胞又は植物種子において、前記修飾された植物プロトッ
    クス酵素がその中で発現され、それに対して、天然に発生するプロトックス活性
    の阻害物質に対する寛容性を付与する、植物、植物組織、植物細胞又は植物種子
    。
45. 【請求項４５】 請求項３５〜３９及び４４のいずれか１項に記載の植物細
    胞を含む植物の個体群に対して、有効量のプロトックス阻害性除草剤を適用する
    段階を含んで成る、望ましくない植生の成長を制御する方法。
46. 【請求項４６】 請求項４３に記載の植物色素体を含む植物の個体群に対し
    て、有効量のプロトックス阻害性除草剤を適用する段階を含んで成る、望ましく
    ない植生の成長を制御する方法。
47. 【請求項４７】 前記プロトックス阻害性除草剤が、アリルウラシル、ジフ
    ェニルエーテル、オキシジアゾール、イミド、フェニルピラゾール、ピリジン誘
    導体、３置換−２−アリル−４，５，６，７−テトラヒドロインダゾール、フェ
    ノピレート及び前記フェノピレートのｏ−フェニルピロリジノ及びピペリジノカ
    ルバメート類似体から成るグループの中から選択されている、請求項４５及び４
    ６のいずれか１項に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記プロトックス阻害性除草剤が、構造式Ｖ、ＶＩ、ＶＩ
    Ｉ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＸａ又はＩＸｂのイミドである、請求項４７
    に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記プロトックス阻害性除草剤が、構造式ＸＸＩＩＩａ又
    はＸＸＩＩＩｂのピリジルピラゾールである、請求項４７に記載の方法。
50. 【請求項５０】 前記プロトックス阻害性除草剤が、構造式ＸＸＩＶのフェ
    ニルピラゾールである、請求項４７に記載の方法。
51. 【請求項５１】 植付けされた作物種子又は1植物群の作物を内含する畑の
    中の雑草の成長を選択的に抑制するための方法において、 （ａ） 請求項３５〜３９及び４４のいずれか１項に記載の植物細胞、又は請求
    項４３に記載の植物色素体を含む、除草剤寛容性作物又は作物種子を植付けする
    段階、及び （ｂ） 天然に発生するプロトックス活性を阻害する量で、畑の中の作物又は作
    物種子及び雑草に対しプロトックス阻害性除草剤を適用する段階、 を含んで成り、除草剤が作物の成長を著しく抑制することなく雑草の成長を抑制
    する、方法。
52. 【請求項５２】 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）
    活性をもつ修飾された酵素をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド酸
    分子において、前記修飾された酵素が天然に発生する形態の該酵素の阻害物質に
    対して耐性をもち、前記修飾された酵素が、 （ａ） Δ₁₈をアラニン以外のアミノ酸とする、ＫＡΔ₁₈Ｆ、 （ｂ） Δ₁₉をロイシン以外のアミノ酸とする、ＱΔ₁₉Ｈ、 （ｃ） Δ₁をロイシン、ＡＰΔ₁Ｆ、 （ｄ） Δ₇をヒスチジンとするΔ₇ＩＧ、 から成るグループの中から選択された少なくとも１つのアミノ酸部分配列を含ん
    で成り、前記修飾された酵素をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１
    、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列
    番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号３６において記されている
    ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対し、 （ｉ） ７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５ＭのＮａＰＯ₄、ｐＨ
    ７.０、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でのハイブリダイゼーション；及び、 （ｉｉ） ２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中５０℃での洗浄、という条件下でハイブ
    リッド形成する、ヌクレオチド酸分子。
53. 【請求項５３】 天然に発生する形態の前記酵素をコードするヌクレオチド
    配列が１つの植物から誘導されている、請求項５２に記載の核酸分子。
54. 【請求項５４】 請求項５２に記載のヌクレオチド配列によってコードされ
    る、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性をもつ修飾さ
    れた酵素。