JP3961570B2 - 植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするdna分子およびその阻害物質耐性突然変異体 - Google Patents
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Description
本発明は一般に、植物酵素プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(「protox」)に関する。本発明は特に、この酵素をコードするDNA分子およびこの酵素の阻害物質耐性修飾体に関する。本発明はさらに、これらの修飾体に基づく組織培養選択法および除草剤適用法に関する。
発明の背景
I.Protox酵素およびそのクロロフィル/ヘム生合成経路への関与
クロロフィルおよびヘムを産生する各生合成経路は、共通する多くの段階を共有している。クロロフィルは、すべての緑色光合成生物の中にある、光を取り入れる色素である。ヘムは、ヘモグロビン、チトクロム、P450混合機能オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼの補助因子であり(例えばLehninger,「Biochemistry」Worth Publishers,ニューヨーク(1975年)参照)、従ってすべての好気性生物にとって必要な成分である。
クロロフィルおよびヘムの生合成の最終共通段階はプロトポルフィリノーゲンIXのプロトポルフィリンIXへの酸化である。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(本明細書では「protox」と呼ぶ)はこの最終の酸化段階を触媒する酵素である(Matringe等,Biochem J.260:231(1989年))。
protox酵素は、酵母サッカロミセス・セレビジエ(E.H.Dailey編「Biosynthesis of Heme and Chlorophyll」マグローヒル:ニューヨーク,235〜285(1990年)に収載のLabbe−BoisおよびLabbeによる章)、大麦エチオプラスト(etioplast)(JacobsおよびJacobs,Biochem J.244:219(1987年))およびマウス肝臓(DaileyおよびKarr,Biochem 26:2697(1987年))を含む多くの生体から部分精製または完全精製された。大腸菌(Sasarman等,Can J.Microbiol.39:1155(1993年))および枯草菌(Dailey等,J.Biol.Chem.269:813(1994年))の2種類の原核生物からprotoxをコードする遺伝子を単離した。これらの遺伝子には配列類似性がなく、その予想される蛋白生成物にもアミノ酸配列同一性が全くない。この大腸菌蛋白はおよそ21kDaであり、細胞膜に付随している。枯草菌蛋白は51kDaであり、可溶な細胞質活性体である。
また、ヒト(Nishimuraら,J.Biol.Chem.270(14))8076〜8080(1995)参照)および植物(1995年12月21日に出願され、1995年6月8日にWO95/34659として公開された国際出願第PCT/IB95/00452号)からもProtoxをコードする遺伝子が単離された。
II.除草剤の標的としてのProtox遺伝子
作物に紛れ込んだ雑草や植物などの望ましくない植生を防除するために除草剤を使用することは、ほとんど普遍的な慣行となっている。関連市場は年間10億ドルを超える。この広範な使用にもかかわらず、雑草防除は農業従事者にとって重大かつ費用がかかる問題のまま残されている。
除草剤を有効に使用するには、しっかりした管理が要求される。例えば、適用の時期および方法と雑草植物発育の段階は、除草剤による十分な雑草防除を行なうには極めて重要である。様々な雑草種が除草剤に耐性であるため、有効な除草剤を作り出すことがますます重要となっている。
残念ながら、土壌中で比較的強い効力と広い雑草スペクトルと速い分解速度を示す除草剤はまた、作物に対しても比較的強い植物毒性を持ち得る。この問題に対処する一解決策は、除草剤に対して耐性または許容性の作物を開発することである。作物を除草剤耐性の雑種または品種にすると、作物損傷の危険を伴わずに除草剤を使用することが可能になる。耐性を高くすると、それまでは作物の除草剤への感受性のため、使用できなかったり使用が制限(例えば雑草発芽前の使用に、など)されていた、除草剤の作物への適用が可能となる。例えば、Anderson他の米国特許第4,761,373号は、種々のイミダゾリノンまたはスルホンアミド除草剤に対して耐性の植物に関するものである。この耐性は、変更アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素によって付与される。Goodman他の米国特許第4,975,374号は、グルタミンシンセターゼ(GS)を阻害することが知られている除草剤、例えばホスフィノトリシン、メチオニンスルホキシイミンなどによる阻害に対して耐性の突然変異体GSをコードする遺伝子を含む植物細胞および植物に関するものである。Bedbrook他の米国特許第5,013,659号は、植物をスルホニル尿素除草剤による阻害に対して耐性にする突然変異体アセト乳酸シンターゼを発現する植物に関するものである。Somers他の米国特許第5,162,602号は、シクロヘキサンジオンおよびアリールオキシフェノキシプロパン酸の各除草剤による阻害に許容性の植物を開示している。この許容性は、変更アセチル補酵素Aカルボキシル化酵素(ACCase)により付与される。
protox酵素は様々な除草化合物の標的の役割を果たす。protoxを阻害する除草剤には、多種多様な構造をもつ分子が含まれる(Duke等,Weed Sci.39:465(1991年);Nandihalli等,Pesticide Biochem.Physiol.43:193(1992年);Matringe等,FEBS Lett.245:35(1989年);YanaseおよびAndoh,Pesticide Biochem.Physiol.35:70(1989年))。このような除草化合物としては、ジフェニルエーテル{(例えばアシフルオルフェン、即ち5−[2−クロロ−4−(トリフルオロメチル)フェノキシ]2−ニトロbezoic acid;そのメチルエステル;あるいはオキシフルオルフェン、即ち2−クロロ−1−(3−エトキシ−4−ニトロフェノキシ)−4−(トリフルオロベンゼン)}、(オキシジアゾール(例えばオキシジアゾン、即ち3−[2,4−ジクロロ−5−(1−メチルエトキシ)フェニル]−5−(1,1−ジメチルエチル)−1、3、4−オキサジアゾール−2−(3H)−オン)、環状イミド(例えばS−23142、即ちN−(4−クロロ−2−フルオロ−5−プロパルギルオキシフェニル)−3,4,5,6−テトラヒドロフタルイミド;クロロフタリム、即ちN−(4−クロロフェニル−3,4,5,6−テトラヒドロフタルイミド)、フェニルピラゾール、(例えばTNPP−エチル、即ちエチル2−[1−(2,3,4−トリクロロフェニル)−4−ニトロピラゾリル−5−オキシ]プロピオネート;M&B39279)、ピリジン誘導体(例えばLS82−556)、フェノピレートとそのO−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体などがある。これらの化合物の多くは、酵素により触媒される通常の反応を競争的に阻害して、見かけ上、基質類似体の役割を果たす。
典型的には、protoxに対する阻害的影響は約395乃至410nMで励起した後に約622乃至635nmで蛍光測定することによって測定される(例えばJacobsおよびJacobs,Enzyme28:206(1982年);Sherman等,Plant Physiol.97:280(1991年)参照)。この測定法は、プロトポルフィリンIXは蛍光色素であるがプロトポルフィリノーゲンIXは蛍光性ではないという事実に基づいている。
予想されるprotox阻害性除草剤の作用機序には、葉緑体中でのプロトポルフィリノーゲンIXの蓄積が関与している。この蓄積は、ペルオキシダーゼ活性によってプロトポルフィリノーゲンIXに酸化されるとプロトポルフィリンIXの細胞質ゾルへの漏出をもたらすと考えられる。プロトポルフィリンIXは、露光すると細胞質ゾル中に一重項酸素を生成し得る。一重項酸素により他の反応性酸素種が生成し、それにより脂質の過酸化と細胞膜の破壊が引き起こされ、迅速な細胞死がもたらされ得る(Lee等,Plant Physiol.102:881(1993年))。
すべてのprotox酵素が植物protox酵素を阻害する除草剤に感受性であるわけではない。大腸菌(Sasarman等,Can.J.Microbiol.39:1155(1993年))および枯草菌(Dailey等,J.Biol.Chem.269:813(1994年))から単離された遺伝子によってコードされるprotox酵素は両方とも、これらの除草効果のある阻害物質に耐性である。さらに、フェニルイミド除草剤S−23142に耐性の単細胞の藻類Chlamydomonas reinhardtiiの突然変異体が報告されている(Kataoka等,J.Pesticide Sci.15:449(1990年);N.Murata編「Research in Photosynthesis」(第III巻),Kluwer:オランダ,567〜570(1992年)収載のShibata他の章)。これらの突然変異体の少なくとも1つは、突然変異体の選択基準とした除草効果のある阻害物質だけでなく、他の種類のprotox阻害物質に対しても耐性の修飾protox活性を持つらしい(Oshio等,Z.Naturforsch.48c:339(1993年);S.Duke編「ACS Symoosium on Porphyric Pesticides」,ACS Press:ワシントン(1994年)収載のSato他の章)。また、阻害物質S21432に耐性の突然変異体タバコ細胞株も報告されている(Che等,Z.Natufforsch.48c:350(1993年))。
発明の概要
本発明は、コムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネおよびモロコシ(sorghum)由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする単離DNA分子およびキメラ遺伝子を提供する。このような単離DNA分子の配列を配列番号:9(コムギ)、11(ダイズ)、15(ワタ)、17(テンサイ)、19(ナタネ)、21(イネ)および23(モロコシ)に示す。
本発明はまた、非修飾天然植物protox酵素を阻害する化合物に耐性の植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素修飾体および、このような阻害物質耐性の植物protox酵素をコードするDNA分子とを提供する。本発明は、植物中に阻害物質耐性の植物protox酵素を発現し得るキメラ遺伝子および天然protox遺伝子変更体を含む。
阻害物質耐性の植物protox酵素をコードする遺伝子は、protox阻害除草剤に対する耐性を植物全体に付与するために使用することができ、また植物細胞形質転換方法の中の選択マーカーとして使用し得る。従って本発明は、これらの修飾protox酵素をコードする、発現可能な遺伝子を含む、植物並びにその子孫、植物組織および植物種子を含む。これらの植物、植物組織および植物種子は、通常は植物中の天然protox活性を阻害する量のprotox阻害物質に対して耐性である。特に本発明に含まれる植物としては、protox阻害性除草剤の潜在的な標的となるもの、具体的にはトウモロコシをはじめ、大麦、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビおよびイネなどの他の穀類作物など、農業経済学上重要な作物がある。また、サトウキビ、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネおよびタバコなどの他の作物も含まれる。
本発明はさらに、本発明の方法によって予め形質転換された遺伝子組み換え植物あるいはそれらの子孫を起源とする、例えば植物組織、プロトプラスト、細胞、カルス、器官、植物種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子などの植物材料、並びに他の繁殖する材料および植物の一部、例えば花、茎、実、葉、根などを含む、本明細書に提供する植物protox酵素の阻害物質耐性体を産生する植物の作出方法に関する。このような植物は、耐性protoxをコードする構造遺伝子により安定して形質転換されるか直接選択技術によって作られ、それによって除草剤耐性株が単離され、特徴が明らかにされ、育成される。さらに、本発明は植物葉緑体内部にprotox遺伝子を発現するための生活組織形成形質転換技術の使用を含む。
本発明はさらに、植物protox酵素の阻害物質耐性体をコードする遺伝子の存在を検出し、植物組織中の阻害物質耐性のprotox複写物量を定量するためのプローブおよび方法に関する。これらの方法は、植物protox酵素の阻害物質耐性体をコードする遺伝子を含み、かつ/または発現する植物または植物組織を識別またはスクリーンするために使用される。
配列表の説明
配列番号:1:アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)protox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:2:配列番号:1によってコードされるアラビドプシスprotox−1アミノ酸配列
配列番号:3:アラビドプシス・タリアナprotox−2蛋白配列をコードするDNA
配列番号:4:配列番号:3によってコードされるアラビドプシスprotox−2アミノ酸配列
配列番号:5:トウモロコシprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:6:配列番号:5によってコードされるトウモロコシprotox−1アミノ酸配列
配列番号:7:トウモロコシprotox−2蛋白配列をコードするDNA
配列番号:8:配列番号:7によってコードされるトウモロコシprotox−2アミノ酸配列
配列番号:9:コムギprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:10:配列番号:9によってコードされるコムギprotox−1アミノ酸配列
配列番号:11:ダイズprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:12:配列番号:11によってコードされるダイズprotox−1蛋白
配列番号:13:アラビドプシス・タリアナprotox−1遺伝子由来のプロモーター配列
配列番号:14:トウモロコシprotox−1遺伝子由来のプロモーター配列
配列番号:15:ワタprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:16:配列番号:15によってコードされるワタprotox−1アミノ酸配列
配列番号:17:テンサイprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:18:配列番号:17によってコードされるテンサイprotox−1アミノ酸配列
配列番号:19:ナタネprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:20:配列番号:19によってコードされるナタネprotox−1アミノ酸配列
配列番号:21:イネprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:22:配列番号:21によってコードされるイネprotox−1アミノ酸配列
配列番号:23:モロコシprotox−1蛋白配列をコードするDNA
配列番号:24:配列番号:23によってコードされるモロコシprotox−1アミノ酸配列
配列番号:25:トウモロコシprotox−1イントロン配列
配列番号:26:テンサイprotox−1遺伝子由来のプロモーター配列
配列番号:27:Pclp_P1a−色素体clpP遺伝子プロモータートップストランドPCRプライマー
配列番号:28:Pclp_P1b−色素体clpP遺伝子プロモーターボトムストランドPCRプライマー
配列番号:29:Pclp_P2b−色素体clpP遺伝子プロモーターボトムストランドPCRプライマー
配列番号:30:Trps16_P1a−色素体rps16遺伝子トップストランドPCRプライマー
配列番号:31:Trps16_p1b−色素体rps16遺伝子ボトムストランドPCRプライマー
配列番号:32:minpsb_U−プラスチックのpsbA遺伝子トップストランドプライマー
配列番号:33:minpsb_L−色素体psbA遺伝子ボトムストランドプライマー
配列番号:34:APRTXP1a−トップストランドPCRプライマー
配列番号:35:APRTXP1b−ボトムストランドPCRプライマー
寄託
下記のベクター分子を以下に示す年月日に米国農業研究部特許培養株保管所北部地域研究センター(NRRL)(米国イリノイ州ピオリア、ノースユニバーシティーストリート1815)に寄託した。
pBluescript SKベクター中のコムギProtox−1aを1996年3月19日にpWDC−13(NRRL#B21545)として寄託した。
pBluescript SKベクター中のダイズProtox(Soybean Protox)−1を1995年12月15日にpWDC−12(NRRL#B21516)として寄託した。
pBluescript SKベクター中のワタProtox(Cotton Protox)−1を1996年7月1日にpWDC15(NRRL#B−21594)として寄託した。
pBluescript SKベクター中のテンサイProtox−1を1996年7月29日にpWDC−16(NRRL#B21595N)として寄託した。
pBluescript SKベクター中のナタネProtox(Rape Protox)−1を1996年8月23日にpWDC−17(NRRL#B−21615)として寄託した。
pBluescript SKベクター中のイネProtox(Rice Protox)−1を1996年12月6日にpWDC−18(NRRL#B−21648)として寄託した。
pBluescript SKベクター中のモロコシProtox(Sorghum Protox)−1を1996年12月6日にpWDC−19(NRRL#B21649)として寄託した。
pMut−1プラスミド中の耐性突然変異体pAraC−2Cysを1994年11月14日にpWDC−7の名称でAgricultural Research Culture Collectionに寄託し、寄託名称NRRL#21339Nが与えられた。
アラビドプシスProtox−1プロモーターを含むAraPTlProを1995年12月15日にpWDC−11(NRRL#B−21515)として寄託した。
トウモロコシProtox−1プロモーターをトウモロコシProtox−1コード配列の残りの部分と融合させたものを含むプラスミドを1996年3月19日にpWDC−14(NRRL#B21546)として寄託した。
テンサイProtox−1プロモーターを含むプラスミドを1996年12月6日にpWDC−20(NRRL#B−21650)として寄託した。
発明の詳細な説明
1.植物Protoxコード配列
一態様では、本発明はプロトポルフィリノーゲンIXのプロトポルフィリンIXへの酸化を触媒する、コムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネおよびモロコシ由来の酵素であるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(本明細書では「protox」と称する)をコードする単離DNA分子に関する。
コムギprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:9および10として提供する。ダイズprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:11および12として提供する。ワタprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:15および16として提供する。テンサイprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:17および18として提供する。ナタネprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:19および20として提供する。イネprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:21および22として提供する。モロコシprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:23および24として提供する。
以前に単離したアラビドプシス・タリアナおよびトウモロコシ由来のprotox酵素のDNAコード配列および相当するアミノ酸配列を本明細書では配列番号:1〜4(アラビドプシス)および配列番号:5〜8(トウモロコシ)として再掲する。
従って、本発明は第1に、コムギprotox酵素、ダイズprotox酵素、ワタprotox酵素、テンサイprotox酵素、ナタネprotox酵素、イネprotox酵素およびモロコシprotox酵素から成る群から選択される真核生物protoxを含むプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子に関する。
本発明の範囲内で好ましいのは、双子葉植物の植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする単離DNA分子、特に配列番号:11、15、17および19に示したものなどの、ダイズ植物、ワタ植物、テンサイ植物およびナタネ植物由来の単離DNA分子である。より好ましいのは、配列番号:11に示したダイズと配列番号:17に示したテンサイ由来のものなどのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする単離DNA分子である。
また、好ましいのは単子葉植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする単離DNA分子、特に配列番号:9、21および23に示したものなどの、コムギ植物、イネ植物およびモロコシ植物由来の単離DNA分子である。より好ましいのは、配列番号:9に示したものなどの、コムギ由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする単離DNA分子である。
別の態様では、本発明は双子葉植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素蛋白質をコードする単離DNA分子であって、前記蛋白が配列番号:12、16、18および20から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離DNA分子に関する。さらに含まれるのは、単子葉植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素蛋白質をコードする単離DNA分子であって、前記蛋白が配列番号:10、22および24から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離DNA分子である。より好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする単離DNA分子であって、前記蛋白が配列番号:10に示したコムギ由来のアミノ酸配列を含む単離されたDNA分子である。より好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする単離DNA分子であって、前記蛋白が配列番号:12に示したダイズおよび配列番号:18に示したテンサイ由来のアミノ酸配列を含む単離DNA分子である。
本発明によって提供される情報を使用すると、標準の方法を使用して、任意の真核生物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素の配列をコードするDNAが得られる。
別の態様では、本発明はコムギprotox酵素をコードし、
(a)7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4pH 7.0、1mM EDTA、50℃でハイブリダイゼーション
(b)2倍濃度SSC、1%SDS、50℃で洗浄
のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号:9のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離DNA分子に関する。
別の態様では、本発明はダイズprotox酵素をコードし、
(a)7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4pH 7.0、1mM EDTA、50℃ででハイブリダイゼーション
(b)2倍濃度SSC、1%SDS、50℃で洗浄
のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号:11のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離DNA分子に関する。
別の態様では、本発明はワタprotox酵素をコードし、
(a)7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4pH 7.0、1mM EDTA、50℃ででハイブリダイゼーション
(b)2倍濃度SSC、1%SDS、50℃で洗浄
のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号:15のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離DNA分子に関する。
別の態様では、テンサイprotox酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号:17のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離DNA分子に本発明に関する:
(a)7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4pH 7.0、1mM EDTA、50℃ででハイブリダイゼーション
(b)2倍濃度SSC、1%SDS、50℃で洗浄
別の態様では、ナタネprotox酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号:19のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離DNA分子に本発明に関する:
(a)7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4pH 7.0、1mM EDTA、50℃ででハイブリダイゼーション
(b)2倍濃度SSC、1%SDS、50℃で洗浄
別の態様では、イネprotox酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号:21のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離DNA分子に本発明に関する:
(a)7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4pH 7.0、1mM EDTA、50℃ででハイブリダイゼーション
(b)2倍濃度SSC、1%SDS、50℃で洗浄
別の態様では、モロコシprotox酵素をコードし、下記のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で配列番号:23のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離DNA分子に本発明に関する:
(a)7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4pH 7.0、1mM EDTA、50℃ででハイブリダイゼーション
(b)2倍濃度SSC、1%SDS、50℃で洗浄
本発明の教示による単離真核生物protox配列は、任意の所望の目的に適する標準の遺伝子工学技術によって操作される。例えば、protox配列全体あるいはその一部は、protoxをコードする配列およびメッセンジャーRNAと特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用する。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するため、このようなプローブには、protoxをコードする配列中で独特であり、好ましくは長さが少なくとも10ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも20のヌクレオチドの配列が含まれる。このようなプローブは、選択した生体由来のprotoxをコードする配列を有名なポリメラーゼチェインリアクション(PCR)法を介して増幅、分析するために使用し得る。この技術は、所望の生体からさらにprotoxコード配列を単離するのに有用であり、あるいは生体中のprotoxをコードする配列の存在を判定する診断分析としても有用であろう。
ハイブリッドの安定に影響する要因は、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。このような要因の1つは融解温度Tmであり、これはGeorge H.KellerおよびMark M.Manak著「DNA PROBES」Macmillan Publishers社(1993年)の第1章「Molecular Hybridization Technology」8ページ以下に提供される公式によって容易に計算し得る。好ましいハイブリダイゼーション温度は、融解温度の計算値Tmより約25℃下の範囲内であり、好ましくは融解温度の計算値Tmより約12〜15℃下の範囲内であり、オリゴヌクレオチドの場合は融解温度Tmより約5〜10℃下の範囲内である。
本発明に含まれるのは、上文に定義した、本発明によるDNA分子とハイブリダイズするDNA分子であるが、好ましくは穏和なストリンジェント条件下で前記DNA分子から入手できる、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素配列の、長さが少なくとも10ヌクレオチドの近接部分を含むオリゴヌクレオチドプローブである。
本発明はさらに、長さが少なくとも10ヌクレオチドの植物protox遺伝子、あるいはmRNAと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチドプローブの、ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)での使用を実施する。
さらに一実施態様では、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性をコードする真核生物のDNA配列あるいはそれぞれのmRNAと特異的にハイブリダイズし得るプローブと、本発明によるプローブを使用して真核生物の前記DNA配列を検出する方法とを提供する。
また、ゲノムprotox配列の選択的ハイブリダイゼーションに基づいた標準の技術を使用して、選択した生体のゲノム中の天然真核生物protox遺伝子の位置をマッピングするためにprotox特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用してもよい。これらの技術には、protoxプローブ配列内に確認または包含されるDNA多形の確認と、2種類の多形親株雑種の自家受精から得られるprotox遺伝子の、他の既知の遺伝子マッピング集団地図位置マーカーを基準とした分離の追跡への、このような多形の使用が含まれるが、これらに限定されない(例えばHelentjaris等,Plant Mol.Biol.5:109(1985年).Sommer等,Biotechniques 12:82(1992年);D’Ovidio等,Plant Mol.Biol.15:169(1990年)参照)。任意の真核生物由来のprotox遺伝子をマッピングするためのプローブとしていかなる真核生物のprotox配列も有用と考えられる一方で、好ましいプローブは選択した生体とより密接な関係がある生体由来のprotox配列であり、最も好ましいプローブは選択した生体由来のprotox配列である。このような方法のprotox遺伝子のマッピングは植物での育種の目的に特に有用と考えられる。例えば、除草剤耐性を付与する突然変異体protox遺伝子の遺伝地図位置を知ることによって、参照遺伝地図から隣接するDNAマーカーを識別し得る(例えばHelentjaris,Trends Genet3:217(1987年)参照)。新しい育種株の中へ除草剤耐性形質を遺伝子移入する間に、戻し交配の各回後に再生する親の中に依然として存在する、protoxで結合された隣接染色体DNAの程度をモニターするためにこれらのマーカーを使用し得る。
また、ノーザンブロット分析などの標準の技術を用いて生体中のprotox mRNA量を定量するためにProtox特異性のハイブリダイゼーションプローブを使用してもよい。この技術は、神経精神病の徴候および皮膚傷害の両方を特徴とし、protox活性レベル低下と関係のある、ヒト常染色体優性障害などの特定有害状態に関係するprotox発現レベル変化を検出するための診断的測定法として有用であろう(BrennerおよびBloomer(New Engl.J.Med.302:765(1980年))。
本発明のさらなる実施態様は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA部分を含むDNA分子を産生する方法であって、
(a)植物protox遺伝子またはmRNAと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチドプローブを調製する段階であって、前記プローブが長さ少なくとも10ヌクレオチドの植物由来protox蛋白をコードする配列の近接部分を含む段階と、
(b)段階(a)によって調製されたヌクレオチド・プローブを使用して、選択した生体由来のクローン化されたゲノムDNA断片またはゲノムcDNA断片の集団中の他のprotoxコード配列をプローブで探る段階と、
(c)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)の酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA部分を含むDNA分子を単離、増幅する段階とを含む方法である。
本発明のさらなる実施態様は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA部分を含む、任意の植物からDNA分子を単離する方法であって、
(a)植物protox遺伝子またはmRNAと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチドプローブを調製する段階であって、前記プローブが長さ少なくとも10ヌクレオチドの植物由来protox蛋白をコードする配列の近接部分を含む段階と、
(b)段階(a)によって調製されたヌクレオチド・プローブを使用して、選択した生体由来のクローン化されたゲノムDNA断片またはゲノムcDNA断片の集団中の他のprotoxコード配列をプローブで探る段階と、
(c)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)の酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA部分を含むDNA分子を単離、増幅する段階とを含む方法である。
本発明はさらに、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素活性を示す蛋白質をコードする、ほぼ純粋なDNA配列を作成する方法であって、
(a)適切なクローニング・ベクターを使用して適当な原料生体からゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製する段階と、
(b)プローブ分子を備えたライブラリーをハイブリダイズする段階と、
(c)ライブラリーからのDNAクローンに対するプローブのポジティブハイブリダイゼーションを識別する段階であって、クローンがプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列を含む可能性がある段階とを含む方法を含む。
本発明はさらに、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素活性(方法はそれを含む)を示す蛋白質をコードするほぼ純粋なDNA配列を作成する方法であって、
(a)ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーからDNA全体を調製する段階と、
(b)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)のアミノ酸配列の低縮重部分を示すプライマーによるPCR反応のテンプレートとして段階(a)のDNAを使用する段階と
を含む方法を含む。
本発明のさらなる目的は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素活性の阻害物質を識別する測定法であって、
(a)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)およびその基質の最初の試料をインキュベートする段階と、
(b)段階(a)からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)の阻害されていない反応性を測定する段階と、
(c)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)の最初の試料およびその基質を、阻害物質化合物を含む別の試料がある状態でインキュベートする段階と、
(d)段階(c)からのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素の阻害された反応性を測定する段階と、
(e)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素の阻害されていない反応性と阻害された反応性とを比較する段階と、
を含む測定法である。
本発明のさらなる目的は、阻害物質耐性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)突然変異体を識別する測定法であって、
(a)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素の最初の試料およびその基質を、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素阻害物質を含む別の試料がある状態でインキュベートする段階と、
(b)段階(a)由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素の変異させていない反応性を測定する段階と、
(c)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素阻害物質を含む別の試料がある状態で、変異プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素およびその基質の最初の試料をインキュベートする段階と、
(d)段階(c)からの変異プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素の変異反応性を測定する段階と、
(e)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素の変異させていない反応性と変異反応性とを比較する段階とを含む測定法である。
本発明のさらなる目的は、本発明による方法によって得られるprotox酵素阻害物質である。
宿主生体で酵素を組換え産生するには、選択した宿主向けに設計し、組換え産生する宿主に導入する発現カセットにprotoxコード配列を挿入してもよい。プロモーター、シグナル配列、5’非翻訳配列および3’非翻訳配列、エンハンサーなどの特定の調節配列の選択は、当業者の技能水準の範囲内である。得られた分子は適切な読み枠中で連結した個々の要素を含むが、これを宿主細胞で形質転換し得るベクターに挿入する。蛋白質の組換え産生に適した発現ベクターおよび方法は、大腸菌(例えばStudierおよびMoffatt,J.Mol.Biol.189:113(1986年);Brosius,DNA8:759(1989年)参照)、酵母(例えばSchneiderおよびGuarente、Meth.Enzymol.194:373(1991年)参照)および昆虫細胞(例えばLuckowおよびSummers,Bio/Technol.6:47(1988年)参照)などの宿主生体に対するものがよく知られている。具体例としては、pBluescript(Stratagene,カリフォルニア州ラホーヤ)、pFLAG(International Biotechnologies社,コネティカット州ニューヘーヴン)、pTrcHis(Invitrogen,カリフォルニア州ラホーヤ)、バキュロウイルス発現ベクターなどのプラスミドなどで、例えばAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)のゲノム由来のものなどがある。好ましいバキュロウイルス/昆虫系はpVI11392/Sf21細胞(Invitrogen,カリフォルニア州ラホーヤ)である。
組換え産生した真核生物のprotox酵素は、様々な目的に役立つ。例えば、in vitoroでprotoxに酵素の活性を提供するために使用してもよい。また、それを公知の除草薬であって、それらがprotoxを阻害するかどうか判定するためにその標的を識別していないものをスクリーンするin vitoro測定法で使用してもよい。このようなin vitoro測定法はまた、protox活性を阻害し、従って除草剤候補である化学薬品を識別するために、より一般的なスクリーンとして使用してもよい。組換え産生した真核生物のprotox酵素はまた、阻害物質耐性のprotox突然変異体を識別する測定法で使用してもよい(1995年6月8日に出願され、1995年12月21日にWO95/34659として公開された国際出願第PCT/IB95/00452号参照、その全体を参照により本明細書の一部とする)。別法として、酵素の除草剤抵抗体と共に新しい阻害性除草剤も合理的に設計するために、組換え産生したprotox酵素と公知の阻害物質との関連性の特徴をさらに明らかにするのにその酵素を使用してもよい。
II.阻害物質耐性植物Protox酵素
別の態様では、本発明は任意の植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(本明細書では「protox」と呼ぶ)酵素のアミノ酸配列になし得る変更であって、この酵素の阻害物質耐性体を得るための変更を教示する。本発明は、本明細書で教示する変更を有する阻害物質耐性の植物protox酵素と、この修飾酵素をコードするDNA分子と、植物中でこの修飾酵素を発現し得る遺伝子に関する。
従って、本発明は少なくとも1つのアミノ酸変更を有する、修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードする単離DNA分子であって、前記アミノ酸変更がprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有する、即ち前記修飾protoxが真核生物のprotoxを阻害する量の前記除草剤に対して耐性である単離DNA分子に関する。本明細書で使用する「阻害する」とは、対象除草剤存在しない状態で観察される酵素活性レベルと比較したときの、対象除草剤が存在する状態で観察される酵素活性の低下をいい、ここで低下度(%)は好ましくは少なくとも10%であり、より好ましくは少なくとも50%であり、最も好ましくは少なくとも90%である。
好ましいのは、少なくとも1つのアミノ酸変更を有するコムギprotox酵素、ダイズprotox酵素、ワタprotox酵素、テンサイprotox酵素、ナタネprotox酵素、イネprotox酵素およびモロコシprotox酵素から成る群から選択される真核生物のprotoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性であるDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:6のアミノ酸159に相当する位置に生じるシステインが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記システインがフェニルアラニンまたはリジンと置換された前記DNA分子であり、最も好ましいのは、前記システインがフェニルアラニンと置換された前記DNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNAであって、配列番号:6のアミノ酸419に相当する位置に生じるイソロイシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNAである。
特に好ましいのは、前記イソロイシンがトレオニン、ヒスチジン、グリシンあるいはアスパラギンと置換されたDNA分子であり、最も好ましくは前記イソロイシンがトレオニンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:6のアミノ酸164に相当する位置に生じるアラニンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記アラニンがトレオニン、ロイシンまたはバリンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:6のアミノ酸165に相当する位置に生じるグリシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記グリシンがセリンまたはロイシンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:6のアミノ酸370に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがイソロイシンまたはメチオニンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:10のアミノ酸356に相当する位置に生じるバリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記バリンがロイシンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:10のアミノ酸421に相当する位置に生じるセリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記セリンがプロリンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:10のアミノ酸502に相当する位置に生じるバリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記バリンがアラニンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:10のアミノ酸211に相当する位置に生じるアラニンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記アラニンがバリンまたはトレオニンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:10のアミノ酸212に相当する位置に生じるグリシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記グリシンがセリンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNAであって、配列番号:10のアミノ酸466に相当する位置に生じるイソロイシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記イソロイシンがトレオニンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:12のアミノ酸369に相当する位置に生じるプロリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記プロリンがセリンまたはヒスチジンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:12のアミノ酸226に相当する位置に生じるアラニンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記アラニンがトレオニンまたはロイシンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:12のアミノ酸517に相当する位置に生じるバリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記バリンがアラニンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:12のアミノ酸432に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがロイシンまたはイソロイシンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:16のアミノ酸365に相当する位置に生じるプロリンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記プロリンがセリンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、配列番号:16のアミノ酸428に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがシステインまたはアルギニンと置換されたDNA分子である。
また好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNAであって、配列番号:18のアミノ酸449に相当する位置に生じるチロシンが別のアミノ酸と置換され、前記修飾protoxが天然protox活性を阻害する量の除草剤に対して耐性のDNA分子である。特に好ましいのは、前記チロシンがシステイン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはメチオニンと置換されたDNA分子である。
本発明はさらに、第1アミノ酸置換および第2アミノ酸置換を有する植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、前記第1アミノ酸置換がprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第2アミノ酸置換が前記第1アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有するDNA分子に関する。好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、前記植物がトウモロコシ、コムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネ、モロコシおよびアラビドプシスから成る群から選択されるDNA分子である。より好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、前記植物がトウモロコシ、コムギ、ダイズ、テンサイおよびアラビドプシスから成る群から選択されるDNA分子である。
好ましいのは、前記第2アミノ酸置換が
(i)配列番号:2のアミノ酸305のセリンに相当する位置
(ii)配列番号:2のアミノ酸249のトレオニンに相当する位置
(iii)配列番号:2のアミノ酸118のプロリンに相当する位置
(iv)配列番号:2のアミノ酸425のアスパラギンに相当する位置
(v)配列番号:2のアミノ酸498のチロシンに相当する位置から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
また好ましいのは、前記第1アミノ酸置換が
(a)配列番号:6のアミノ酸164のアラニンに相当する位置
(b)配列番号:6のアミノ酸165のグリシンに相当する位置
(c)配列番号:6のアミノ酸370のチロシンに相当する位置
(d)配列番号:6のアミノ酸159のシステインに相当する位置
(e)配列番号:6のアミノ酸419のイソロイシンに相当する位置
(f)配列番号:10のアミノ酸356のバリンに相当する位置
(g)配列番号:10のアミノ酸421のセリンに相当する位置
(h)配列番号:10のアミノ酸502のバリンに相当する位置
(i)配列番号:10のアミノ酸211のアラニンに相当する位置
(k)配列番号:10のアミノ酸212のグリシンに相当する位置
(I)配列番号:10のアミノ酸466のイソロイシンに相当する位置
(m)配列番号:12のアミノ酸369のプロリンに相当する位置
(n)配列番号:12のアミノ酸226のアラニンに相当する位置
(o)配列番号:12のアミノ酸432のチロシンに相当する位置
(p)配列番号:12のアミノ酸517のバリンに相当する位置
(q)配列番号:16のアミノ酸428のチロシンに相当する位置
(r)配列番号:16のアミノ酸365のプロリンに相当する位置
(s)配列番号:18のアミノ酸449のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
特に好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、植物protoxが配列番号:2、4、6、8、10、12、16、18、20および22から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むDNA分子である。最も好ましいのは、植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子であって、植物protoxが配列番号:2、4、6、8、10、12および18から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むDNA分子である。
より好ましいのは、前記第1アミノ酸置換が
(a)配列番号:6のアミノ酸164のアラニンに相当する位置
(b)配列番号:6のアミノ酸165のグリシンに相当する位置
(c)配列番号:6のアミノ酸370のチロシンに相当する位置
(d)配列番号:6のアミノ酸159のシステインに相当する位置
(e)配列番号:6のアミノ酸419のイソロイシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
より好ましいのは、前記第2アミノ酸置換が配列番号:2のアミノ酸305のセリンに相当する位置で起き、前記第1アミノ酸置換が
(a)配列番号:6のアミノ酸164のアラニンに相当する位置
(b)配列番号:6のアミノ酸370のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:2のアミノ酸305に相当する位置に生じる前記セリンがロイシンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、DNA分子であって、前記第2アミノ酸置換が配列番号:2のアミノ酸249のトレオニンに相当する位置で起き、前記第1アミノ酸置換が
(a)配列番号:6のアミノ酸164のアラニンに相当する位置
(b)配列番号:6のアミノ酸370のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:2のアミノ酸249に相当する位置に生じる前記トレオニンがイソロイシンとアラニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNAである。
より好ましいのは、前記第2アミノ酸置換が配列番号:2のアミノ酸118のプロリンに相当する位置で起き、前記第1アミノ酸置換が
(a)配列番号:6のアミノ酸164のアラニンに相当する位置
(b)配列番号:6のアミノ酸370のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:2のアミノ酸118に相当する位置に生じる前記プロリンがロイシンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、前記第2アミノ酸置換が配列番号:2のアミノ酸425のアスパラギンに相当する位置で起き、前記第1アミノ酸置換が
(a)配列番号:6のアミノ酸164のアラニンに相当する位置
(b)配列番号:6のアミノ酸370のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:2のアミノ酸425に相当する位置に生じる前記がアスパラギンセリンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、前記第2アミノ酸置換が配列番号:2のアミノ酸498のチロシンに相当する位置で起き、前記第1アミノ酸置換が
(a)配列番号:6のアミノ酸164のアラニンに相当する位置
(b)配列番号:6のアミノ酸370のチロシンに相当する位置
から成る群から選択される位置で起きるDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:2のアミノ酸498に相当する位置に存在する前記チロシンがシステインと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:6のアミノ酸370に相当する位置に存在する前記チロシンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、バリンおよびメチオニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:6のアミノ酸370に相当する位置に存在する前記チロシンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、トレオニンおよびメチオニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:6の残基164に相当する位置に存在する前記アラニンがバリン、トレオニン、ロイシン、システインおよびチロシンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:6の残基165に相当する位置に存在する前記グリシンがセリンとロイシンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:6の残基165に相当する位置に存在する前記グリシンがセリンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:6の残基159に相当する位置に存在する前記システインがフェニルアラニンとリシンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:6の残基159に相当する位置に存在する前記システインがフェニルアラニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:6の残基419に相当する位置に存在する前記イソロイシンがトレオニン、ヒスチジン、グリシンおよびアスパラギンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNA分子である。
特に好ましいのは、配列番号:6の残基419に相当する位置に存在する前記イソロイシンがトレオニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:10の残基356に相当する位置に存在する前記バリンがロイシンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:10の残基421に相当する位置に存在する前記セリンがプロリンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:10の残基502に相当する位置に存在する前記バリンがアラニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:10の残基466に相当する位置に存在する前記イソロイシンがトレオニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:10の残基212に相当する位置に存在する前記グリシンがセリンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:10の残基211に相当する位置に存在する前記アラニンがバリンまたはトレオニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:12の残基369に相当する位置存在する前記プロリンがセリンまたはヒスチジンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:12の残基226に相当する位置に存在する前記アラニンがロイシンまたはトレオニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:12の残基432に相当する位置に存在する前記チロシンがロイシンまたはイソロイシンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:12の残基517に相当する位置に存在する前記バリンがアラニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:16の残基428に相当する位置に存在する前記チロシンがシステインまたはアルギニンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:16の残基365に相当する位置に存在する前記プロリンがセリンと置換されたDNA分子である。
より好ましいのは、配列番号:18の残基449に相当する位置に存在する前記プロリンがロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニンから成る群から選択されるアミノ酸と置換されたDNA分子である。
本発明は、発現カセットおよび組換えベクターであって、前記発現カセットがプロモーターを必ず含むが、特に本発明による真核生物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするDNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含む発現カセットおよび組換えベクターに関する。本発明による発現カセットはさらに、前記DNA分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含んでもよく、前記シグナル配列が前記DNA分子によりコードされる蛋白質を葉緑体またはミトコンドリアにターゲティングし得る。
本発明は、プロモーターを必ず含む発現カセットを含むキメラ遺伝子に関し、特に本発明による真核生物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする異種DNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含む発現カセットを含むキメラ遺伝子に関する。好ましいのは、DNA分子がアラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするキメラ遺伝子である。より好ましいのは、DNA分子がダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生、イネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするキメラ遺伝子である。特に好ましいのは、DNA分子がコムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネおよびモロコシから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするキメラ遺伝子である。最も好ましいのは、DNA分子がダイズ、テンサイおよびコムギから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするキメラ遺伝子である。
より好ましいのは、配列番号:10に示す配列を含むコムギprotox、配列番号:12に示す配列を含むダイズprotox、配列番号:16に示す配列を含むワタprotox:、配列番号:18に示す配列を含むテンサイprotox、配列番号:20に示す配列を含むナタネprotox、配列番号:22に示す配列を含むイネprotox、および配列番号:24に示す配列を含むモロコシprotoxから成る群から選択されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードする異種DNA分子と作用可能な状態で連結した植物の中で活性なプロモーターを含むキメラ遺伝子である。より好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素が配列番号:10に示す配列を含むコムギprotox、配列番号:12に示す配列を含むダイズprotox、および配列番号:18に示す配列を含むテンサイprotoxから成る群から選択されるキメラ遺伝子である。
本明細書に使用する「protox−1」とは、葉緑体protoxをいい、「protox−2」はミトコンドリアprotoxをいう。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性またはprotox−2活性を有するアラビドプシス種由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白質が配列番号:2または配列番号:4に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性またはprotox−2活性を有するトウモロコシ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号:6または配列番号:8に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性を有するコムギ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号:10に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性を有するダイズ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号:12に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性を有するワタ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号:16に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprofox−1活性を有するテンサイ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号:18に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性を有するナタネ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号:20に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性を有するイネ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、好ましくは前記蛋白が配列番号:22に示すアミノ酸配列を含むキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がprotox−1活性を有するモロコシ由来の蛋白質をコードするキメラ遺伝子であり、前記蛋白が配列番号:24に示すアミノ酸配列を好ましくは含むキメラ遺伝子である。
本発明はまた、プロモーターを必ず含む発現カセットを含むキメラ遺伝子を実施するが、特に相当する非修飾版の酵素を阻害する量の除草剤に対して耐性の本発明による真核生物由来プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするDNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含む発現カセットを含むキメラ遺伝子を実施する。
好ましいのは、DNA分子がアラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするキメラ遺伝子である。
より好ましいのは、DNA分子がダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生、またイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするキメラ遺伝子である。
特に好ましいのは、DNA分子がアラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシおよびイネから成る群から選択される植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするキメラ遺伝子である。
本発明に含まれるのは、少なくとも1つのアミノ酸変更を有する真核生物のprotoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子であって、前記アミノ酸変更がprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有するキメラ遺伝子である。
また本発明に含まれるのは、第1アミノ酸置換および第2アミノ酸置換を有する植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子であって、前記第1アミノ酸置換はprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第2アミノ酸置換が前記第1アミノ酸置換によって付与された前記耐性を増強する特性を有するキメラ遺伝子である。好ましいのは、前記DNA分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含む前記キメラ遺伝子であって、前記シグナル配列が前記DNA分子によりコードされる蛋白質を葉緑体またはミトコンドリアにターゲティングし得るキメラ遺伝子である。
本発明によるキメラ遺伝子はさらに、前記DNA分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含んでもよく、前記シグナル配列が前記DNA分子によりコードされる蛋白質を葉緑体にターゲティングし得る。
本発明によるキメラ遺伝子はさらに、前記DNA分子と作用可能な状態で連結したシグナル配列をさらに含んでもよく、前記シグナル配列が前記DNA分子によりコードされる蛋白質をミトコンドリアにターゲティングし得る。
また、本発明に含まれるのは、本明細書で前に述べた、宿主・ゲノムへ安定して組み込まれる任意のDNA配列である。
本発明はさらに、植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)またはその機能的に等価な誘導体を含む組換えDNA分子に関する。
本発明はさらに、前記組換えDNA分子を含む組換えDNAベクターに関する。
本発明のさらなる目的は、本発明によるキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記ベクターが宿主細胞で安定して形質転換可能な組換えベクターである。
本発明のさらなる目的は、本発明によるキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記ベクターが植物、植物種子、植物組織または植物細胞で安定して形質転換可能な組換えベクターである。好ましいのは、本発明によるキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、植物にで安定して形質転換可能な組換えベクターである。このベクターにより安定して形質転換された植物、植物種子、植物組織または植物細胞は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子を発現し得る。好ましいのは、組換えベクターであって、前記ベクターにより安定して形質転換された植物、植物種子、植物組織または植物細胞が、相当する非修飾版の酵素を阻害するレベルで除草剤に対して耐性の植物由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子を発現可能な組換えベクターである。
好ましいのは、配列番号:10に示す配列を含むコムギprotox、配列番号:12に示す配列を含むダイズprotox、配列番号:16に示す配列を含むワタprotox、配列番号:18に示す配列を含むテンサイprotox、配列番号:20に示す配列を含むナタネprotox、配列番号:22に示す配列を含むイネprotoxおよび配列番号:24に示す配列を含むモロコシprotoxから成る群から選択されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードする異種DNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記ベクターが宿主細胞で安定して形質転換し得る組換えベクターである。
また好ましいのは、第1アミノ酸置換および第2アミノ酸置換を有する植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーターを含むキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、前記第1アミノ酸置換がprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第2アミノ酸置換が前記第1アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有し、前記ベクターが植物細胞で安定して形質転換可能な組換えベクターである。
また、本発明に含まれるのは、本発明によるベクターで安定して形質転換された宿主細胞であって、前記宿主細胞が前記DNA分子を発現可能な宿主細胞である。好ましいのは、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞から成る群から選択される宿主細胞である。
本発明はさらに、許容性が本明細書で教示するようにして阻害物質耐性の修飾protox酵素を発現する遺伝子により付与される、植物中の天然protox活性を阻害する除草剤に許容性の植物およびその子孫、植物組織および植物種子に関する。代表的な植物としては、この除草剤をその通常意図される目的のために適用する任意の植物などである。好ましいのは、農業経済学上重要な作物、即ちアラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネ等などの被子植物および裸子植物である。より好ましいのは、農業経済学上重要な作物、即ちアラビドプシス、ワタ、ダイズ、ナタネ、テンサイ、トウモロコシ、イネ、コムギ、大麦、エンバク、ライ麦、モロコシ、キビ、芝生、フォーレージ、芝草などの被子植物および裸子植物である。特に好ましいのは、農業経済学上重要な作物、即ちアラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシおよびイネなどの被子植物および裸子植物である。
好ましいのは、第1アミノ酸置換および第2アミノ酸置換を有する植物protoxを含む修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードするDNA分子を含む植物であって、前記第1アミノ酸置換がprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、前記第2アミノ酸置換が前記第1アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有し、前記DNA分子が前記植物中で発現されて天然protox活性を阻害する量の除草剤に対する植物許容性を前記植物に付与する植物である。好ましいのは、前記DNA分子が相当する天然protoxコード配列と置換した植物である。本発明に含まれるのは、前記キメラ遺伝子が天然protox活性を阻害する量の除草剤に対する前記植物耐性付与する、本発明によるキメラ遺伝子を含む植物およびその子孫である。
本発明に含まれるのは、本発明による少なくとも1つのキメラ遺伝子により安定して形質転換された植物およびその子孫、種子、培養組織を含むトランスジェニック植物組織である。好ましいのは、プロモーターを必ず含むが特に植物組織中で相当する非修飾版の酵素を阻害する量の除草剤に対して耐性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)酵素をコードするDNA分子と作用可能な状態で連結した植物内活性型プロモーター発現カセットを含む、少なくとも1つのキメラ遺伝子により安定して形質転換された植物、種子および培養組織を含むトランスジェニック植物組織である。
本発明の組換えDNA分子は、技術的に認識された多くの方法によって植物細胞に導入し得る。当業者なら、方法の選択が形質転換の標的とする植物の種類、即ち単子葉植物、双子葉植物などに依存し得ることを理解しよう。植物細胞を形質転換する適切な方法としては、マイクロインジェクション(Crossway等,BioTechniques4:320〜334(1986年))、エレクトロポレーション(Riggs等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602〜5606(1986年))、アグロバクテリウムによる形質転換(Hinchee等,Biotechnology 6:915〜921(1988年))、直接遺伝子転移(Paszkowski等,EMBO J:3.2717〜2722(1984年))、Agracetus社(ウィスコンシン州マディソン)およびDuPont社(デラウェア州ウィルミントン)から市販の装置を使用する弾道粒子加速(例えば、Sanford他の米国特許第4,945,050号、McCabe等,Biotechnology 6.923〜926(1988年)参照)、プロトプラスト形質転換/再生法(1994年9月27日にチバ−ガイギー社に対して発行された米国特許第5,350,689号参照)などがある。また、Weissinger等,Annual Rev.Genet.22:421〜477(1988年);Sanford等,Particulate Science and Technology5:27〜37(1987年)(タマネギ);Christou等,Plant Physiol.87:671〜674(1988年)(ダイズ);McCabe等,Bio/Technology6:923〜926(1988年)(ダイズ);Datta等,Bio/Technology8:736〜740(1990年)(イネ);Klein等,Proc Natl.Acad.Sci.USA.85:4305〜4309(1988年)(トウモロコシ);Klein等,Bio/Technology 6:559〜563(1988年)(トウモロコシ);Klein等,Plant Physiol.91:440〜444(1988年)(トウモロコシ);Fromm等,Bio/Technology 8.833〜839(1990年);Gordon−Kamm等,Plant Cell2:603〜618(1990)(トウモロコシ)も参照のこと。
本発明の範囲に含まれるのは、トランスジェニック植物、特に前記の方法によって形質転換したトランスジェニック稔性植物および無性および/または有性の子孫であって、植物中で天然protox活性を通常阻害するレベルで除草剤による阻害に対して耐性または少なくとも許容性のものである。また子孫植物としては、親植物とは異なる遺伝的背景をもつ植物であって、戻し交配プログラムから得られ、そのゲノム中に依然として本発明による除草剤抵抗形質を含む植物などがある。なかでも特に好ましいのは、植物中の天然protox活性を通常阻害する量の除草剤による阻害に対して耐性または少なくとも許容性の雑種植物である。
本発明によるトランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。好ましいのは、ライグラス属(Lolium)、トウモロコシ属(Zea)、コムギ属(Triticum)、ライコムギ属(Triticale)、モロコシ属(Sorghum)、サトウキビ属(Saccarum)、ブロムグラス属(Bronus)、イネ属(Oryzae)、カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Hordeum)、ライ麦属(Secule)、セタリア属(Setaria)の各植物を含むイネ科族の単子葉植物である。より好ましいのは、トランスジェニックトウモロコシ、コムギ、大麦、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビおよびイネである。特に好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生およびイネである。
双子葉植物の中では、本明細書ではアラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、サトウキビ、脂肪種子ナタネ、タバコおよびヒマワリがより好ましい。
特に好ましいのは、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイおよび脂肪種子ナタネである。
「子孫」(又は後代)(progeny)の表現は、「無性的」および「有性的」に産出されたトランスジェニック植物の子孫の両方を含むと理解する。この定義はまた、例えば細胞融合または突然変異体選択などの公知の方法によって入手可能な突然変異体および形質転換体をすべて含むことを意味し、形質転換植物材料のすべての交雑・融合生成物と同様に、依然として最初の形質転換植物特有の特性を示すことを意味する。これはまた、戻し交配プログラムから得られる子孫植物をも含むが、ただし前記子孫植物が依然として本発明による除草剤耐性形質を含む場合に限る。
本発明の別の目的は、トランスジェニック植物の増殖材料に関する。本発明に関しては、トランスジェニック植物の増殖材料を、有性的または無性的にin vivoまたはin vitroで繁殖する任意の植物材料と定義する。本発明の範囲内で特に好ましいのは、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子、並びにトランスジェニック植物から得られた他の繁殖材料である。
植物の一部、例えば本発明の方法によってあらかじめ形質転換され、従って少なくとも部分的にはトランスジェニック細胞から成るトランスジェニック植物またはその子孫を起源とする花、茎、実、葉、根などもまた本発明の目的である。
本発明のさらなる目的は、本発明の方法によって形質転換され、従って本発明によるDNAによって植物または植物の一部を形質転換することにより植物protox酵素の阻害物質耐性体を産生するトランスジェニック植物またはその子孫を起源とする植物、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子、並びに他の繁殖材料、植物の一部、例えば花、茎、実、葉、根などを産生する方法である。好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)活性を有する真核生物由来の蛋白質をコードする単離DNA分子を含む宿主細胞を作成する方法であって、本発明による組換えベクター分子により前記宿主細胞を形質転換する段階を含む方法である。さらに好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)活性を有する真核生物由来の蛋白質をコードする単離DNA分子を含む植物細胞を作成する方法であって、本発明による組換えベクター分子により前記植物細胞を形質転換する段階を含む方法である。好ましいのは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)活性を有する真核生物由来の蛋白質をコードする単離DNA分子を含むトランスジェニック親植物のトランスジェニック子孫を産生する方法であって、公知の植物育種技術を要する、本発明による組換えベクター分子によって前記親植物を形質転換する段階と、除草剤を耐性形質を前記トランスジェニック親植物の子孫に移し入れる段階とを含む方法である。
好ましいのは、植物protox酵素の阻害物質耐性体を産生する植物、植物組織、植物種子および植物の一部を作成する方法であって、植物、植物組織、植物種子および植物の一部が耐性protox酵素をコードする構造遺伝子により安定して形質転換される方法である。特に好ましいのは、植物、植物組織、植物種子および植物の一部を作成する方法であって、植物、植物組織、植物種子および植物の一部が本発明によるDNAにより安定して形質転換される方法である。とりわけ好ましいのは、植物protox酵素の阻害物質耐性体を産生する前記の植物、植物組織、植物種子および植物の一部を作成する方法であって、植物、植物組織、植物種子および植物の一部を直接選択技術により調製し、それによって除草剤耐性株を単離し、特徴を明らかにし、育成する方法である。
上述のトランスジェニック種子およびトランスジェニック植物に導入された遺伝的特性は、有性生殖または栄養生長によって伝えられ、こうして子孫植物に維持、伝達され得る。一般に、前記の維持と伝達は、耕作、播種、収穫などの特定の目的に適するように開発された公知の農業の方法を利用する。また、水耕法または温室技術などの専門の方法も適用し得る。成長中の作物は、昆虫または伝染病が引き起こす攻撃および破損、並びに雑草植物による競争に対して脆弱であるため、雑草、植物病害、昆虫、線虫および他の逆の条件をコントロールして収穫量を改善する手段を講じる。これらには、土壌の耕作または雑草および感染植物の除去などの機械的な手段、並びに除草剤、殺菌剤、花粉発育阻止剤、線虫駆除剤、成長調節剤、成熟剤、殺虫剤などの農薬の使用などが含まれる。
本発明によるトランスジェニック植物およびトランスジェニック種子の有利な遺伝的特性は、害虫許容性、除草剤許容性、ストレス許容性、栄養価の改善、収穫量の増大、あるいは倒伏または破砕によって引き起こされる損害を少なくする構造改善などの改善された特性を備えた植物の開発を目的とした植物育種に利用し得る。様々な育種の段階は、交雑株の選択、親株授粉の支配、適切な子孫植物の選択などの明確な人の介在を特徴とする。所望の特性により、様々な育種法が取られる。適切な技術は当技術分野でよく知られており、ハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交雑、多株育種、品種混合、種間交雑、異数体技術などが含まれるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション技術はまた、機械的、化学的または生化学な手段による雄性または雌性の不稔植物を作成するための植物の不稔化を含む。異なる株の花粉によって雄性の不稔植物を他家受粉すると、雄性は不稔であるが雌性は稔性の植物のゲノムに両親株の特性が一様に得されることが確実になる。従って、本発明によるトランスジェニック種子およびトランスジェニック植物は、例えば除草剤または殺虫剤処理などの従来法の有効性を増大させるか、変更されたその遺伝的特性により前記方法を省くことが可能な、改善された植物株の育種に使用し得る。別法として、それらの最適化された遺伝の「設備」により、匹敵する有害な発育条件に耐えられなかった生産物よりも質のよい収穫生産物をもたらす、改善されたストレス耐性を備えた新しい作物を得ることができる。
種子作出では種子の発芽の質と均質性が最も重要な産物特性であるのに対し、農業従事者によって収穫・販売される種子の発芽の質と均質性は重要ではない。作物を他の作物および雑草の種子が無い状態に保ち、種子伝染性の病害を防除し、よい発芽を備えた種子を生産することは困難なので、純粋な種子の育成、調質およびマーケティングの技術に熟達した種子産生者がかなり広範で明確な種子生産実践規範を開発している。従って、農業従事者が自分の作物から収穫された種子を使用する代わりに特定の品質基準に合った保証された種子を買うことが一般的慣行である。種子として使用される繁殖材料は通例、除草剤、殺虫剤、殺かび剤、殺菌剤、線虫駆除剤、軟体動物駆除剤、あるいはそれらの混合物を含む保護剤コーティングで処理する。通例使用される保護剤コーティングとしては、キャプタン、カルボキシン、サイラム(TMTD)、メタラキシル(Apron)およびピリミホスメチル(Actellic)などの化合物などがある。望むなら、細菌、かびまたは動物の悪疫によって引き起こされる損害からの保護を提供するために、製剤化技術で通例使用されるさらなる担体、界面活性剤または適用促進アジュバントと共にこれらの化合物を製剤化する。保護剤コーティングは、繁殖材料に液体製剤をしみ込ませることによって、あるいは複合の湿性または乾性の製剤でコーティングすることによって適用してもよい。他の適用方法としてはまた、芽または実向けの処理なども可能である。
従って栽培植物用の植物繁殖材料、特に、通例種子処理に使用される種子保護剤でコーティング処理される植物種子を提供することは本発明のさらなる目的である。
本発明によるトランスジェニック植物、トランスジェニック植物材料またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする、上で例証された方法などの新しい農業の方法を提供することは本発明のさらなる態様である。本発明に含まれるのは、除草剤に対する耐性を付与する植物中で除草剤標的蛋白の除草剤抵抗体を発現するのに十分な量の本発明によるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物またはその子孫を使用する農業の方法である。
本発明の方法によって形質転換した植物から子孫を育種するために、次のような方法を使用し得る。以下の実施例に示すようにして作成したトウモロコシ植物を当技術分野で知られている温室内の植木鉢、あるいは土壌中で育成し、開花させる。成熟した雄穂から花粉を得て、同一植物、同胞植物または任意の望ましいトウモロコシ植物の雌穂への授粉に使用する。同様に、同一植物、同胞植物または任意の望ましいトウモロコシ植物から得られた花粉を、形質転換された植物に生じる雌穂に授粉してもよい。この方法によって得られた形質転換子孫は、導入遺伝子の存在および/または付随するDNA(遺伝子型)、あるいは付与された表現型によって、非形質転換子孫と識別される。望ましい形質をもつ任意の植物について通常行なわれているのと同様に、形質転換子孫を自家受粉するか、他の植物と交雑してもよい。同様に、この方法によって作出したタバコまたは他の形質転換植物を、所望の特徴を持つ子孫を産むためのものとして当技術分野で知られている方法で自家受粉するか、交雑してもよい。同様に、当技術分野で知られている方法と本発明の方法との組合せにより作出した他のトランスジェニック生物を、所望の特徴を持つ子孫を産むためのものとして当技術分野で知られている方法で育種してもよい。
本発明の阻害物質耐性の修飾protox酵素は、その天然相当物(即ち、直接的な組換えDNA法あるいは間接的な選択育種などを介した人間による操作を受けることなく、植物に天然に生じる阻害物質感受性体)と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の置換、追加または欠失を有する。protox酵素の阻害物質耐性体の産生または阻害物質耐性の増強のために変更し得るアミノ酸位置を、表1のアラビドプシス、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネ、モロコシおよびコムギ由来の植物protox−1配列中に太字で示す。当業者なら、本発明による変更アミノ酸の配列および識別を可能にするために本明細書に示したprotox酵素配列に十分に類似した構造を有する任意の植物protox遺伝子に対して同等の変更を行なって酵素の阻害物質耐性体を生成させ得ることを理解するであろう。このような追加の植物protox遺伝子は、1995年6月8日に出願され、WO95/34659として1995年12月21日に公開された国際出願PCT/IB95/00452に記載された標準的技術を使用して得てもよく、その関連部分を参照により本明細書の一部とする。
本明細書で教示した除草剤耐性protoxコード配列をコードするDNA分子は、作物中で最適に発現するように遺伝子組換えしてもよい。これには、対象作物品種で最適に発現させるための抵抗対立遺伝子のコード配列変更が含まれる。特定の作物品種で最適の発現を達成するためにコード配列を変更する方法は、よく知られている(例えば、Perlak等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324(1991年);Koziel等,Bio/technol11:194(1993年)参照)。
最適な発現のためのprotoxコード配列の遺伝子組換えにはまた、適切な調節配列(即ち、プロモーター、シグナル配列、転写ターミネーターなど)と作用可能な状態で連結することも含まれる。植物または植物細胞中で機能し得るプロモーター(即ち、植物細胞中のprotoxなどの関連構造遺伝子の発現を制御し得るもの)としては、例えばカリフラワー・モザイク・ウイルス(CaMV)19Sプロモーターまたは35SプロモーターおよびCaMV二重プロモーター;ノパリンシンターゼプロモーター;病因関連(PR)蛋白プロモーター;リブロースビスリン酸カルボキシル化酵素(ssuRUBISCO)プロモーターの小サブユニット、EPA0559603参照のBrassica由来の熱衝撃蛋白プロモーター(hsp80プロモーター)、WO95/14098参照のアラビドプシスアクチンプロモーターおよびSuperMasプロモーター等がある。好ましいプロモーターは高レベルの構成的発現を付与するもの、あるいはより好ましくは、除草剤による損傷に感受性の組織内高レベル特異的発現を付与するものであろう。好ましいプロモーターは、イネ・アクチン・プロモーター(McElroy等,Mol Gen.Genet231:150(1991年))、トウモロコシ・ユビキチン・プロモーター(EP0342926;Taylor等,Plant Cell Rep.12:491(1993年))、タバコ、アラビドプシスまたはトウモロコシ由来のPR−1プロモーター(Ryals他の米国特許出願第EP−332 104および08/181,271を参照、その全体を参照により本明細書の一部とする)などである。当技術分野で認められた方法に従って、プロモーターの強度を操作してprotox発現を増大させるためにプロモーター自体を変更してもよい。
発明者はまた、阻害物質耐性のprotoxコード配列として使用するための別の好ましいプロモーターが天然protox遺伝子に付随するプロモーター(即ち、protoxプロモーター;共同所有された本願と同時係属であり本願と同日出願の「Promoters from Oxidase Genes(プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーター)」という名称の国際出願________(整理番号PH/5−20756/P1/CGC1846)参照、その全体を参照により本明細書の一部とする)であることを発見した。アラビドプシスprotox−1遺伝子由来のプロモーター配列を配列番号:13に、トウモロコシprotox−1遺伝子由来のプロモーター配列を配列番号:14に、テンサイprotox−1遺伝子を由来のプロモーター配列を配列番号:26に示す。
protoxプロモーター自体が阻害物質耐性protoxコード配列の発現に適しているため、本明細書で教示した変更は、異種調節配列を備えたキメラ遺伝子を構築する必要のない植物細胞ゲノム中にある天然の38protox遺伝子に対して直接行なってもよい。このような変更は、同種組換えなどの定方向突然変異誘発技術によって行ない、得られた除草剤抵抗表現型に基づいて選択し得る(例えば、実施例10,Pazkowski等,EMBO J.7:4021〜4026(1988年)、および米国特許第5,487,992号、特に18〜19段および実施例8参照)。この方法の利点はさらに、天然protoxプロモーターを含むことに加え、得られた変更遺伝子が天然遺伝子の一部であるシグナルペプチドまたは輸送ペプチドのコード配列などの他の任意の調節要素をも含むことである。
シグナルペプチドまたは輸送ペプチドは、本発明のキメラDNA構築物中のprotoxコード配列と融合させて、所望の活性部位に発現されるprotox酵素の輸送するようにさせてもよい。シグナルペプチドとしては、例えば植物病因関連蛋白と天然に連結したもの、例えばPR−1、PR−2等がある。例えば、Payne等,Plant Mol.Biol.11:89〜94(1988年)参照のこと。輸送ペプチドとしては、例えばVon Heijne等,Plant Mol.Biol.Rep.9.104〜126(1991年)、Mazur等,Plant Physiol.85:1110(1987年)、Vorst等,Gene 65:59(1988年)に記載されたものなどの葉緑体輸送ペプチド、Boutry等,Nature328:340〜342(1987年)に記載されたものなどのミトコンドリア輸送ペプチドなどがある。葉緑体とミトコンドリア輸送ペプチドは、ミトコンドリアおよび葉緑体内で典型的に生じるprotox酵素活性として本発明で特に有用であると考えられる。葉緑体でのprotox酵素活性阻害がprotox阻害性除草剤の作用の主要な根拠と考えられるため、使用に最も好ましいのは葉緑体輸送ペプチドである(WitkowskiおよびHalling,Plant Physiol.87:632(1988年)、Lehnen等,Pestic.Biochem. Physiol.37:239(1990年)、Duke等,Weed Sci.39:465(1991年))。また、コードされる蛋白質の液胞などの様々な細胞区画への局在化をもたらす配列も含まれる。例えば、Neuhaus等,Proc.Natl.Acad Sci.USA88:10362〜10366(1991年)およびChrispeels、Ann.Rev.Plant Physiol.(Plant Mol.Biol.42:21〜53(1991年)を参照する。これらの出版物の適切な開示は、その全体を参照により本明細書の一部とする。
本発明のキメラDNA構築物は、多数のprotox構造遺伝子複製物または多数のプロモーター複製物を含み得る。さらに、この構築物は、マーカーのコード配列とシグナルまたは輸送ペプチドなどの他のペプチドのコード配列とを各々DNA分子中の他の機能エレメントを備えた適正な読み枠中に含み得る。このような構築物の調製は、通常レベルの当業者の技能の範囲内である。
有用なマーカーとしては、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、G418、ゲンタマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、グリホサート、ホスフィノトリシンなどに対する耐性などの、除草剤耐性、抗生物質耐性または薬物耐性を提供するペプチドなどがある。これらのマーカーは、本発明のキメラDNA構築物で形質転換細胞を非形質転換細胞から選択するのに使用し得る。他の有用なマーカーは、可視の反応、例えば発色反応などによって容易に検出し得るペプチド酵素、例えばルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどである。
形質転換細胞に選択有利性を与えることにより所望のヌクレオチド配列の組込みが可能な遺伝形質転換細胞のポジティブ選択を、参照によりWO94/20627として本明細書の一部とする。
各植物細胞中にある数千コピーの環状色素体ゲノムすべてに同種組換えにより遺伝子を挿入する色素体発現によると、核で発現した遺伝子に対する卓越したコピー数の優位を利用して総可溶植物蛋白の10%をこえる発現レベルが可能となる。また、色素体によりコードされる形質が花粉伝達性でないため、色素体発現が望ましく、こうすればトランスジェニック植物の野生同系種への偶発的な導入遺伝子逸出の危険の可能性が回避される。色素体形質転換技術は、米国特許第5,451,513号、第5,545,817号および第5,545,818号(これら全ての全体を参照により本明細書の一部とする);PCT出願WO95/16783(その全体を参照により本明細書の一部とする);McBride等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301〜7305(1994年)(これも全体を参照により本明細書の一部とする)などに詳細にわたって記載されている。タバコ葉緑体形質転換の基礎技術は、ラトガーズ大学(ニュージャージー州Piscattaway)のPal Maliga博士の研究所の中で開発、改善されており、選択可能な抗生物質抵抗マーカーと隣接するクローン化色素体DNA領域による葉組織の粒子ボンバードを伴う。ターゲティング配列と呼ばれる1〜1.5kbのブランキング領域は、色素体ゲノムによる同種組換えを促進し、それによってタバコプラストームの156kbの特定領域の置換または変更が可能になる。最初、スペクチノマイシンおよび/またはストレプトマイシンに対する耐性を付与する、葉緑体16SリボソームRNAおよびrps12遺伝子での点突然変異が形質転換の選択マーカーとして利用された(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.およびMaliga,P.(1990年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,8526〜8530、参照により本明細書の一部とする;Staub,J.MおよびMaliga,P.(1992年)Plant Cell4,39〜45、参照により本明細書の一部とする)。これにより、標的葉のボンバード100回につきおよそ1回の頻度で安定したhomoplasmic形質転換体が得られた。これらのマーカー間にクローン化部位が存在すると、外来遺伝子の導入のための色素体ターゲティングベクターの創製が可能となる(Staub,J.M.およびMaliga,P.,EMBO J.12:601〜606(1993年)、参照により本明細書の一部とする)。劣性リボソームRNAまたはr−蛋白抗生物質耐性遺伝子の優性選択マーカー、即ちスペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−3’−アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌aadA遺伝子との置換によって形質転換頻度のかなりの上昇が得られた(Svab,Z.およびMaliga,P.(1993年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,913〜917、参照により本明細書の一部とする)。かつてこのマーカーは、緑藻クラミドモナスreinhardtiiの色素体ゲノムの高頻度形質転換に成功裡に使用された(Goldschmidt−Clermont,M.(1991年)Nucl.Acids Res.19,4083〜4089、参照により本明細書の一部とする)。
従って、本発明にはさらに、天然の、あるいは改変されたコムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、イネまたはモロコシのprotox酵素をコードするDNA分子などの、天然植物protox酵素または修飾植物protox酵素のいずれかをコードする単離DNA分子と作用可能な状態で連結した植物色素体プロモーターを含むキメラ遺伝子が含まれる。特に好ましい植物色素体プロモーターはclpP遺伝子プロモーターである。
キメラ遺伝子は、好ましくは単離DNA分子と作用可能な状態で連結された、色素体プロモーター由来の5’非翻訳配列(5’UTR)および色素体遺伝子’3非翻訳配列(3’UTR)をさらに含む。好ましくは、3’UTRは色素体rps16遺伝子3’非翻訳配列である。
本発明はまた、直ちに上記のキメラ遺伝子並びにこのような色素体形質転換ベクターで形質転換された植物色素体を含む色素体形質転換ベクターであって、前記修飾植物protox酵素が前記植物色素体中で発現される色素体形質転換ベクターをも含む。本発明はまた、修飾植物protox酵素が植物中で発現され、この植物に天然protox活性を阻害する量の除草剤に対する耐性を付与する、この植物色素体を包む植物または植物細胞およびそれらの子孫を含む。
作物を再生成し得る天然遺伝子の作物または植物培養細胞中での定方向突然変異を介して除草剤耐性protox対立遺伝子が得られる場合、除草剤許容性作物を開発するための従来の育種技術を使用して、変更コード配列の遺伝子組換えと植物での形質転換を必要とせずに、それを商用品種へ移行し得る。
別法として、除草剤耐性遺伝子を単離し、最適に発現するように遺伝子組換えを行なった後に所望の品種へ形質転換してもよい。
protox阻害物質に耐性の修飾protoxをコードする遺伝子も植物細胞形質転換法の中で選択マーカーとして使用し得る。例えば、導入遺伝子で形質転換された植物、植物組織または植物細胞も、植物によって発現し得る、修飾protoxをコードする遺伝子によって形質転換し得る。こうして形質転換された細胞を形質転換細胞だけが生存するprotox阻害物質含有培地に移す。選択剤として特に有用と考えられるProtox阻害物質は、ジフェニルエーテル{例えば、アシフルオルフェン、即ち5−[2−クロロ−4−(トリフルオロメチル)フェノキシ]−2−nitrobezoic acid;そのメチルエステル;またはオキシフルオルフェン、即ち2−クロロ−1−(3−エトキシ−4−ニトロフェノキシ)−4−(トリフルオロベンゼン)}、オキシジアゾール、(例えばオキシジアゾン、3−[2,4−ジクロロ−5−(1−メチルエトキシ)フェニル]−5−(1,1−ジメチルエチル)−1,3,4−オキサジアゾール−2−(3H)−オン)、環状イミド(例えばS−23142、即ちN−(4−クロロ−2−フルオロ−5−プロパルギルオキシフェニル)−3,4,5,6−テトラヒドロフタルイミド;クロロphthalim、即ちN−(4−クロロフェニル−3,4,5,6−テトラヒドロフタルイミド)、フェニルピラゾール、(例えばTNPPエチル、エチル2−[1−(2,3,4−トリクロロフェニル)−4−ニトロピラゾリル−5−オキシ]プロピオネート;M&B 39279)、ピリジン誘導体(例えばLS 82−556)、phenopylateとそのO−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体、および国際特許出願WO92/04827に開示される2環式Triazolones;EP532146)などである。
この方法は、修飾protoxコード遺伝子で形質転換し得る、任意の植物細胞に適用可能であり、任意の対象導入遺伝子で使用し得る。導入遺伝子およびprotox遺伝子の発現は、植物細胞上で機能する同一プロモーター、あるいは個別のプロモーターによって制御し得る。
本発明の阻害物質耐性の修飾protox酵素は、天然protox活性を阻害する除草剤に対して耐性である。protoxを阻害する除草剤としては、多種多様の構造をもつ分子、即ち(Duke等,Weed Sci.39:465(1991年);Nandihalli等,Pesticide Biochem.Physiol.43:193(1992年);Matringe等,FEBS Lett.245:35(1989年);YanaseおよびAndoh,Pesticide Biochem.Physiol.35:70(1989年))、ジフェニルエーテル{(例えばacifluorifen、即ち5−[2−クロロ−4−(トリフルオロメチル)フェノキシ]2−ニトロbezoic acid;そのメチルエステル;あるいはオキシフルオルフェン、即ち 2−クロロ−1−(3−エトキシ−4−ニトロフェノキシ)−4−(トリフルオロベンゼン)}、オキシジアゾール(例えばoxidiazon、3−[2,4−ジクロロ−5−(1−メチルエトキシ)フェニル]−5−(1,1−ジメチルエチル)−1,3,4−オキサジアゾール−2−(3H)−オン)、環状イミド(例えばS−23142、即ちN−(4−クロロ−2−フルオロ−5−プロパルギルオキシフェニル)−3,4,5,6−テトラヒドロフタルイミド;クロロphthalim、即ちN−(4−クロロフェニル−3,4,5,6−テトラヒドロフタルイミド)、フェニルピラゾール、(例えばTNPPエチル、エチル2−[1−(2,3,4−トリクロロフェニル)−4−ニトロピラゾリル−5−オキシ]プロピオネート;M&B 39279)、ピリジン誘導体(例えばLS 82−556)、phenopylateとそのO−フェニルピロリジノ−およびピペリジノカルバメート類似体などがある。
特に重要なジフェニルエーテルは一般式:
[式中、Rは−COONa(式II)、−CONHSO2CH3(式III)または−COOCH2COOC2H5(式IV;Maigrot等,Brighton Crop Protection Conference−Weeds:47〜51(1989年)参照)と等しい]を有するものである。
さらに対象のジフェニルエーテルは、Rが
(式IVa;Hayashi等,Brighton Crop Protection Conference−Weeds:53〜58(1989年)参照)と等しいものである。
さらに対象のジフェニルエーテルは、式:
(式IVb;ビフェノックス、Dest等,Proc.Northeast Weed Sci.Conf.27:31(1973年)参照)を有するものである。
さらなる対象のジフェニルエーテルは、式:
(式IVc;オキシフルオルフェン;YihおよびSwithenbank,J.Agric.Food Chem.23:592(1975年)参照)を有するものである。
また別の対象のジフェニルエーテルは、式:
(式IVd;ラクトフェン著,C.Tomlin編「The Pesticide Manual」第10版,British Crop Protection Council,英国サリー州(1994年)の623頁参照)を有するものである。
また、重要なものとしては、一般式:
[式中、Qは
(Ragdale他編「Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry(第8回国際殺虫剤化学会議紀要)」、Amer.Chem.Soc,ワシントン,42〜48(1994年)収載のHemper等(1995年)参照)と等しく、R1はH、ClまたはFと等しく、R2はClと等しく、R3は最適に置換されたエーテル、チオエーテル、エステル、アミノまたはアルキル基である]を有するイミドとして知られている除草剤の品種がある。別法として、R2とR3が合わさって5員環または6員環の複素環を形成してもよい。特に関心の対象のイミド除草剤の例は、
(式VIIa;フルチアセット−メチル、Miyazawa等,Brighton Crop Protection Conference−Weeds23〜28(1993年)参照)
(式X:sulfentrazone、Van Saun等,Brighton Crop Protection Conference−Weeds77〜82(1991年)参照)
(Miura等,righton Crop Protection Conference−Weeds:35−40(1993年)参照)
などである。
上記の化合物の除草活性は、Proceedings of the 1991Brighton Crop Protection Conference,Weeds(British Crop Protection Council)(式Xおよび式XVI)、Proceedings of the 1993Brighton Crop Protection Conference,Weeds(British Crop Protection Council)(式XIIおよび式XIII)、米国特許第4,746,352号(式XI)およびAbstracts of the Weed Science Society of America第33巻9頁(1993年)(式XIV)に記載されている。
最も好ましいイミド除草剤はアリールウラシルに分類され、一般式:
[式中、Rは参照により本明細書の一部とする米国特許第5,183,492号に開示される基(C2-6−アルケニロキシ)カルボニル−C1-4−アルキルを示す]を有するものである。
また、重要なものとしては、一般式:
(WeilerらおよびBrighton Crop Protection Conference−Weeds29〜34(1993年)参照)
(Van Saun等,Brighton Crop Protection Conference−Weeds:19〜22(1993年)参照)を有する除草剤、
一般式:
[式中、R1は自由選択で1個以上のハロゲン原子と置換されたC1〜C4のアルキルであり、R2は水素、あるいは各々自由選択で1個以上のハロゲン原子と置換されたC1〜C4のアルコキシであり、
R1およびR2は合わさって基−(CH2)n−X−(XはR2で結合する)を形成し、
R3は水素またはハロゲンであり、
R4は水素またはC1〜C4のアルキルであり、
R5は水素、ニトロ、シアノ、あるいは基−COOR6または−CONR7R8であり、
R6は水素、C1〜C6のアルキル、C2〜C6のアルケニルまたはC2〜C6のアルキニルである]のN置換ピラゾール、
(Scheringの国際特許公開WO94/08999、WO93/10100および米国特許第5,405,829号参照)、
(C.R.Worthing編「Pesticide Manual」第9版,British Crop Protection Council,Surrey(1991年)の621ページを参照。)などのN−フェニルピラゾール、
および3−置換−2−アリール−4,5,6,7−tetrahydroindazoles(Lyga等,Pesticide Sci.42.29〜36(1994年))などがある。
また、重要なものとしては、WO96/01254およびWO97/00246(それらの両方を参照により本明細書の一部とする)に記載された種類のフェニルピラゾールがある。(式XXII)。
通常、protoxの活性を阻害する除草剤の量としては、当技術分野で知られている適用率などがあり、それは部分的に適用の環境、時間および方法などの外部要因に依存する。例えば、式V乃至式IXによって表わされるイミド除草剤、より詳しくは式X乃至式XVIIによって表わされるイミド除草剤の場合、適用率は、0.0001〜10kg/haの範囲であり、好ましくは0.005〜2kg/haの範囲である。除草剤のこの適用量または濃度は所望の作用および使用される特定の化合物によって異なり、当技術分野で知られている方法によって決定し得る。
本発明のさらなる目的は、アラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、大麦、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、芝生および飼草、キビ、フォーレージおよびイネ等から成る群から選択される植物の集団に有効量のprotox阻害性除草剤を適用する段階を含む、好ましくない植生を調節する方法である。好ましいのは、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライ麦、エンバク、飼草およびイネから成る群から選択される植物の集団に有効量のprotox阻害性除草剤を適用する段階を含む、好ましくない植生を調節する方法である。特に好ましいのは、アラビドプシス、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシおよびイネから成る群から選択される植物の集団に適用する段階を含む、好ましくない植生を調節する方法である。
本発明をさらに、以下の詳細な実施例を参照することによって記載する。これらの実施例は説明のみの目的で提供するものであり、特に指示がない限り、限定しようとするものではない。
実施例
本明細書で使用する標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当技術分野でよく知られており、T.Maniatis,E.F.FritschおよびJ.Sambrook著「Molecular Cloning:A Laboratory manual(分子クローニング:実験室マニュアル)」Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク市コールドスプリング港(1989年)と、T.J.Silhavy,M.L.BermanおよびL.W.Enquist著「Experiments with Gene Fusions(遺伝子融合による実験)」Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク市コールドスプリング港(1984年)に記載されている。
セクションA 植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(Protox)遺伝子の単離および特性決定
実施例1.トウモロコシProtox−1コード配列との配列相同性に基づくコムギProtox−1cDNAの単離
特別注文でλUni−Zapベクター中でcDNAライブラリーを構築するため、Triticum aestivum(栽培品種:Kanzler)から調製したRNA全体をClontechに提出した。およそ50,000pfuのcDNAライブラリーをペトリ皿10cm当たりおよそ5,000pfuの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した(SchleicherおよびSchuell)。このプラークリフトをランダムプライミング法(Life Technologies)により32P−dCTPで標識し、トウモロコシProtox−1cDNA(配列番号:5;1995年6月8日に出願され、1995年12月21日にWO95/34659として公開された国際出願PCT/IB95/00452の実施例2参照)で探査した。ハイブリダイゼーション条件は7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA、50℃であった。洗浄条件は、2倍濃度SSC、1%SDS、50℃とした(Churchおよびギルバート,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1991〜1995.(1984年)、その全体を参照により本明細書の一部とする)とした。ポジティブにハイブリダイズしたプラークを精製し、in vivoで切り出してpBluescriptプラスミドに挿入した。cDNAインサートの配列を蛍光性色素(Applied Biosystems社)で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。最初のスクリーン作業から得られた「コムギProtox−1」と称する最長のコムギProtox−1cDNAは、長さが1489塩基対であった。既知の他の植物protoxペプチド配列との比較によると、コムギProtox−1は、輸送ペプチドのコード配列と成熟コード配列のおよそ126個のアミノ酸が欠失している。
より長いコムギprotox cDNAを得るために2回目のスクリーンを実施した。このスクリーンでは、λUni−Zapベクターを使用して、生体内でTriticum aestivum(栽培品種:Kanzler)cDNAライブラリーを調製した。プローブおよびハイブリダイゼーションとしてコムギProtox−1cDNAを使用し、洗浄条件を50℃の代わりに65℃とした以外は上記と同様にして、およそ200,000pfuのDNAライブラリーをスクリーンした。このスクリーン作業から得られた「コムギProtoxla」と称する最長のコムギcDNAは、長さ1811塩基対であった。このcDNAのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:9および10に示す。他の公知の植物protoxペプチド配列および相当するゲノム配列と比較すると、このcDNAは完全長であるか、ほんの少数の輸送ペプチド・コドンが欠失している(表1)。このコムギ蛋白配列は、配列番号:6に示すトウモロコシProtox−1蛋白配列と91%相同(95%類似)である。
pBluescript SKベクター中のコムギProtox−1aを1996年3月19日にpWDC−13(NRRL#B21545)として寄託した。
実施例2.アラビドプシスProtox−1コード配列との配列相同性に基づくダイズProtox−1cDNAの単離
ダイズ(v Williams82、上胚軸)から調製されたLambda Uni−Zap cDNAライブラリーをStratageneから購入した。およそ50,000pfuのライブラリーをペトリ皿10cm当たりおよそ5,000pfuの密度でプレーティングし、コロニー/プラーク・スクリーン膜(NEN Dupont)上に複製フィルター・リフトを作製した。このプラークリフトをランダムプライミング法(Life Technologies)により32P−dCTPで標識し、アラビドプシスProtox−1cDNA(配列番号:1;1995年6月8日に出願され、1995年12月21日にWO95/34659として公開された国際出願PCT/IB95/00452の実施例1参照)で探査した。ハイブリダイゼーション条件は7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA、50℃とした。洗浄条件は、2倍濃度SSC、1%SDS、50℃であった(Churchおよびギルバート(1984年)とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、in vivoで切り出してpBluescriptプラスミドに挿入した。cDNAインサートの配列を蛍光性色素(Applied Biosystems社)で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「ダイズProtox−1」と称する、得られた最長のダイズcDNAは、既知の他の植物protoxペプチド配列との比較によると完全長である(表1)。ダイズProtox−1は長さが1847塩基対であり、58.8kDaの蛋白質をコードする。このcDNAのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:に11および12示す。このダイズ蛋白はアラビドプシスProtox−1蛋白と78%相同(87%類似)である。
pBluescript SKベクター中のダイズProtox−1を1995年12月15日にpWDC−12(NRRL#B21516)として寄託した。
配列番号:2、6、10、12、15、17、19、21、23に示す配列によりコードされる、それぞれの蛋白質の予想アミノ酸配列のアライメントを表1に示す。配列番号:4と8に示す配列によりコードされる、それぞれの蛋白質の予想アミノ酸配列を表2に示す。
実施例3.トウモロコシProtox−1コード配列との配列相同性に基づくワタProtox−1cDNAの単離
Gossypium hirsutum L.(72時間暗生長子葉)から調製されたλUni−Zap cDNAライブラリーをアリゾナ州立大学植物学教室のDick Trelease博士から入手した(Ni W.およびTrelease R.N,Arch.Biochem.Biophys.289:237〜243(1991年))。およそ50,000pfuのライブラリーをペトリ皿10cm当たりおよそ5,000pfuの密度でプレーティングし、コロニー/プラーク・スクリーン膜(NEN Dupont)上に複製フィルター・リフトを作製した。このプラークリフトをランダムプライミング法(Life Technologies)により32P−dCTPで標識し、トウモロコシProtox−1cDNA(配列番号:5)で探査した。ハイブリダイゼーション条件は7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA、50℃とした。洗浄条件は、2倍濃度SSC、1%SDS、50℃であった(Churchおよびギルバート(1984年)とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、in vivoで切り出してpBluescriptプラスミドに挿入した。cDNAインサートの配列を蛍光性色素(Applied Biosystems社)で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「ワタProtox−1」と称する、得られた最長のワタcDNAは、既知の他の植物protoxペプチド配列との比較によると完全長である(表1)。ワタProtox−1は長さが1826塩基対であり、58.2kDaの蛋白質をコードする。このcDNAのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:に13および14示す。このワタ蛋白はアラビドプシスProtox−1蛋白と77%相同(86%類似)である。
pBluescript SKベクター中のワタProtox−1を1996年7月1日にpWDC−15(NRRL#B−21594)として寄託した。
実施例4.アラビドプシスProtox−1コード配列との配列相同性に基づくテンサイProtox−1cDNAの単離
β vulgarisから調製されたλ−Zap cDNAライブラリーをPlant Science Institute(ペンシルヴェニア州フィラデルフィア)植物学部門のPhilip Rea博士から入手した(Yongcheol Kim、Eugene J.KimおよびPhilip A.Rea,Plant Physiol.106:375〜382(1994年))。およそ50,000pfuのcDNAライブラリーをペトリ皿10cm当たりおよそ5,000pfuの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した(SchleicherおよびSchuell)。このプラークリフトをランダムプライミング法(Life Technologies)により32P−dCTPで標識し、アラビドプシスProtox−1cDNA(配列番号:1)で探査した。ハイブリダイゼーション条件は7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA、50℃とした。洗浄条件は、2倍濃度SSC、1%SDS、50℃であった(Churchおよびギルバート(1984年)とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、in vivoで切り出してpBluescriptプラスミドに挿入した。cDNAインサートの配列を蛍光性色素(Applied Biosystems社)で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「テンサイProtox−1」と称する、得られた最長のテンサイProtox−1cDNAは、既知の他の植物protoxペプチド配列との比較によると完全長である(表1)。テンサイProtox−1は長さが1910塩基対であり、60kDaの蛋白質をコードする。このcDNAのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:に15および16示す。このテンサイ蛋白はアラビドプシスProtox−1蛋白と73%相同(82%類似)である。
pBluescript SKベクター中のテンサイProtox−1を1996年7月29日にpWDC−16(NRRL#B−21595N)として寄託した。
実施例5.アラビドプシスProtox−1コード配列との配列相同性に基づくナタネProtox−1cDNAの単離
Brassica napus(3〜4週、成熟緑葉)から調製されたλUni−ZapIIcDNAライブラリーをヨハネス・グーテンベルク大学マインツ校Institut Fuer Allgemeine Botanik(ドイツ)のGuenther Ochs博士から入手した(Guenther Ochs、Gerald SchockおよびAloysius Wild,Plant Physiol.103:303〜304(1993年))。およそ50,000pfuのcDNAライブラリーをペトリ皿10cm当たりおよそ5,000pfuの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した(SchleicherおよびSchuell)。このプラークリフトをランダムプライミング法(Life Technoiogies)により32P−dCTPで標識し、アラビドプシスProtox−1cDNA(配列番号:1)で探査した。ハイブリダイゼーション条件は7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA、50℃とした。洗浄条件は、2倍濃度SSC、1%SDS、50℃であった(Churchおよびギルバート(1984年)とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、in vivoで切り出してpBluescriptプラスミドに挿入した。cDNAインサートの配列を蛍光性色素(Applied Biosystems社)で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「ナタネProtox−1」と称する、得られた最長のナタネProtox−1cDNAは、既知の他の植物protoxペプチド配列との比較によると完全長である(表1)。ナタネProtox−1は長さが1784塩基対であり、57.3kDの蛋白質をコードする。このcDNAのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:に17および18示す。このナタネ蛋白はアラビドプシスProtox−1蛋白と87%相同(92%類似)である。
pBluescript SKベクター中のナタネProtox−1を1996年8月23日にpWDC−17(NRRL#B−21615)として寄託した。
実施例6.トウモロコシProtox−1コード配列との配列相同性に基づくイネProtox−1cDNAの単離
Oryza sativa(5日間黄化した苗条)から調製されたλgtll cDNAライブラリーをClontechから購入した。およそ50,000pfuのcDNAライブラリーをペトリ皿10cm当たりおよそ5,000pfuの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した(SchleicherおよびSchuell)。このプラークリフトをランダムプライミング法(Life Technologies)により32P−dCTPで標識し、トウモロコシProtox−1cDNA(配列番号:5)で探査した。ハイブリダイゼーション条件は7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA、50℃とした。洗浄条件は、2倍濃度SSC、1%SDS、50℃であった(Churchおよびギルバート(1984年)とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、Wizard λ−Prepキット(Promega)を使用して、λDNAを調製した。標準の技術を使用して、このcDNAインサートをpBluescript SKベクターにEcoRI断片としてサブクローン化した。cDNAインサートの配列を蛍光性色素(Applied Biosystems社)で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「イネProtox−1」と称する、得られた最長のイネProtox−1cDNAは、長さが1224塩基対であった。既知の他の植物protoxペプチド配列との比較によると、成熟コード配列のおよそ172個のアミノ酸と輸送ペプチドコード配列が欠失している(表1)。この部分cDNAのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:に19および20示す。
pBluescript SKベクター中のイネProtox−1を1996年12月6日にpWDC−18(NRRL#B−21648)として寄託した。
実施例7.トウモロコシProtox−1コード配列との配列相同性に基づいたモロコシProtox−1cDNAの単離
Sorghum bicolor(3〜6日の緑色実生苗)から調製されたλ−ZapII cDNAライブラリーをシュツットガルト大学細胞生物免疫研究所(ドイツ)のKlaus Pfizenmaier博士から入手した(Herald Wajant、Karl−Wolfgang MundryおよびKlaus Pfizenmaier,Plant Mol.Biol.26:735〜746(1994年)。およそ50,000pfuのcDNAライブラリーをペトリ皿10cm当たりおよそ5,000pfuの密度でプレーティングし、ニトロセルロース膜上に複製フィルター・リフトを作製した(SchleicherおよびSchuell)。このプラークリフトをランダムプライミング法(Life Technologies)により32P−dCTPで標識し、トウモロコシProtox−1cDNA(配列番号:5)で探査した。ハイブリダイゼーション条件は7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA、50℃とした。洗浄条件は、2倍濃度SSC、1%SDS、50℃であった(Churchおよびギルバート(1984年)とした。ハイブリダイズ陽性のプラークを精製し、in vivoで切り出してpBluescriptプラスミドに挿入した。cDNAインサートの配列を蛍光性色素(Applied Biosystems社)で標識したジデオキシターミネーターを使用する連鎖停止法によって決定した。「モロコシProtox−1」と称する、得られた最長のモロコシProtox−1cDNAは、長さが1590塩基対であった。既知の他の植物protoxペプチド配列との比較によると、成熟コード配列のおよそ44個のアミノ酸と輸送ペプチドコード配列が欠失している(表1)。この部分cDNAのヌクレオチド配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:に21および22示す。
pBluescript SKベクター中のモロコシProtox−1を1996年12月6日にpWDC−19(NRRL#B21649)として寄託した。
実施例8.細菌系でのProtox阻害性除草剤に対する植物Protoxクローンの感受性実験
Protox−1/SASX38、Protox−2/SASX38およびpBluescript/XL1−Blueの液体培養物をL amp100中で培養した。様々な濃度(1.0nM〜10mM)の式XVIIのprotox阻害性アリールウラシル除草剤を含む各培養物の100μlアリコートをL amp100培地上にプレーティングした。各平板の2組ずつを37℃で18時間インキュベートした。
protox+大腸菌株XL1−Blueは、いかなる濃度でも除草剤に感受性を示さず、報告されている類似除草剤に対する天然細菌酵素の耐性と一致した。Protox−1/SASX38は明らかに感受性であり、10nMという低濃度の阻害物質によって細菌層がほぼ完全に除去された。より高い濃度(10uM)の除草剤だけではProtox2/SASX38も感受性であった。除草剤は、ほぼ完全な暗中に維持した平板上でさえ有効であった。平板に20ug/mlのヘマチンを添加したところ、除草剤毒性が完全に除去された。
2つの植物Protox株間での異なる除草剤許容性は、酵素感受性のなんらかの固有差ではなく、これら2つのプラスミドからの示差的発現の結果であると思われる。Protox−1/SASX38は、任意のヘム欠乏培地中でProtox−2/SASX38よりもずっとゆっくり成長する。成長速度がアラビドプシスProtox−1/SASX38に匹敵するMzProtox−2/SASX38株も、より低濃度(10〜100nM)の除草剤に対して非常に感受性である。
セクションB Protox阻害性除草剤耐性植物Protox遺伝子
実施例9.大腸菌発現系でのProtox阻害性除草剤耐性植物Protox遺伝子の選択
プラスミド・ベクターpFL61中のアラビドプシス・タリアナ(Landsberg)cDNAライブラリー(Mines等,Plant J.2:417〜422(1992年))を入手し、増幅した。大腸菌hemG突然変異体SASX38(Sasarman等,J.、Gen.Microbiol.113:297(1979年))を入手し、20ug/mlヘマチンを含むL培地(United States Biochemicals)上で維持した。Bio−Rad Gene Pulserおよび製造者の条件を用いたエレクトロポレーションにより、このプラスミドライブラリーをSASX38に形質転換した。エレクトロポレーションを行なった細胞をおよそ500,000形質転換体/10cm平板の密度で100μg/mlアンピシリンを含むL寒天上にプレーティングした。次いで、細胞を微光中で37℃40時間インキュベートし、外因性ヘム添加のない状態で成長する能力によって選択した。pFL61ライブラリーからヘム原栄養体が400/107の頻度で回収された。22個の相補性クローンの塩基配列分析から、9個が葉緑体protox酵素を発現すると期待される「Protox−1」と称するタイプのprotox遺伝子であることが示された。
pFL61ライブラリーは、アラビドプシスcDNAが二方向性で挿入された酵母発現ライブラリーである。これらのcDNAは細菌の中でも発現し得る。protox cDNAは明らかに、ベクターの中のNotIクローニング部位方向へおよそ10アミノ酸5’の酵母PGK3’配列の中の読み枠内ATGから開始し、一方のlacZプロモーターからさらに300塩基対上流または不確定の潜在細菌プロモーターから発現する。葉緑体通過配列の重要部分を含んでいたProtox−1 cDNAが、大腸菌SASX38株の成長を阻害したため、突然変異誘発/除草剤選択実験用として最小量の葉緑体通過配列が結合したクローンを選択した。このクローン、即ちpSLV19は、DNA配列がアラビドプシスProtox−1cDNA(配列番号:1)の塩基対151から開始する、17アミノ酸だけの推定葉緑体輸送ペプチドを含む。
プラスミドpSLV19で無作為突然変異誘発株XL1−Red(Stratagene、カリフォルニア州ラ ホーヤ)を形質転換した。50ug/mlアンピシリンを含むL培地上に形質転換株をプレーティングし、37℃で48時間インキュベートした。形質転換細胞層を平板からはがし、Wizard Megaprepキット(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を使用してプラスミドDNAを調製した。この突然変異誘発株から単離されたプラスミドDNAは、2000ヌクレオチド当たりおよそ1つの無作為塩基変異を含むことが予想される(Greener等,Strategies7(2):32〜34(1994年)参照)。
この突然変異プラスミドDNAでhemG突然変異体SASX38を形質転換し(Sasarman等,J.Gen.Miclobiol.113:297(1979年)、様々な濃度のprotox阻害性除草剤を含むL培地上にプレーティングした。平板を37℃で2日間インキュベートした。野生株を効果的に殺滅する除草剤濃度で成長した全てのコロニーからプラスミドDNAを単離した。次いで単離DNAでSASX38を形質転換し、観察された耐性が確実にプラスミドで運搬されるように除草剤上に再びプレーティングした。このスクリーンを通過したプラスミド由来のprotoxコード配列をNotI消化により切り出し、突然変異を起こさせていないベクターに再度クローン化し、除草剤耐性を付与する能力に関して再び試験した。次いで、除草剤耐性を付与したprotox cDNAのDNA配列を決定し、野生アラビドプシスProtox−1配列(配列番号:1)と比較することによって突然変異を確認した。
1回目の突然変異誘発実験から単一のコード配列突然変異体が回収された。この突然変異体は、成長速度を上昇させることによってのみ除草剤「耐性」が増強される。それには、配列番号:2のアミノ酸56でトレオニンのACGコドンがリシンのAAGコドンに変換され、細菌の突然変異体の相補性が改善される、pSLV19の切断型葉緑体輸送配列内の配列番号:1のヌクレオチド197でのCからAへの変異が含まれる。このプラスミドには、AGC(Ser)がAGT(Ser)に変わる、ヌクレオチド1059での無形質コード配列の変異も含まれる。このプラスミドをpMut−1と命名した。
次いで、上記と同様にしてpMut−1プラスミドで突然変異誘発体XL1−Red株を形質転換し、変異したDNAを単離し、突然変異を起こさせていないpMut−1 protox遺伝子にとって致死濃度の除草剤上にプレーティングした。37℃2日間培養後に除草剤耐性のコロニーを単離し、上記と同様にして分析した。多数のプラスミドが除草剤耐性のprotoxコード配列を含むことが明らかにされた。塩基配列分析によると、耐性遺伝子が2種類に分類されることが示唆された。確認された1つの耐性変異は配列番号:1に示すアラビドプシスProtox−1配列のヌクレオチド689でのCからTへの変異であった。この変異は、配列番号:2のアミノ酸220でアラニンのGCTコドンをバリンのGTTコドンへ変換し、これをpAraC−1Valと命名した。
2つ目の種類の除草剤耐性の突然変異体は、アラビドプシスProtox−1配列のヌクレオチド1307AからGへの変異を含む。この変異は、アミノ酸426でチロシンのTACコドンをシステインのTGCコドンに変換し、これをpAraC−2Cysと命名した。
3つ目の耐性突然変異体はアラビドプシスProtox−1配列のヌクレオチド691でのGからAへの変異を有する。この変異は、アミノ酸221のグリシンのGGTコドンをpAraC−1中の変異に隣接するコドン位置のセリンのAGTコドンに変換する。このプラスミドをpAraC−3Serと命名した。
pMut−1プラスミド中の耐性の突然変異体pAraC−2Cysを1994年11月14日にpWDC−7の名称でAgricultural Research Culture Collectionに寄託し、寄託名NRRL#21339Nが与えられた。
実施例10.無作為スクリーンで確認された位置での別の除草剤耐性コドン置換
無作為スクリーンで除草剤抵抗部位であることが確認されたアミノ酸を他のアミノ酸と置換し、細菌系での機能および除草剤耐性に関して試験した。
トランスフォーマ部位特異的突然変異誘発キット(Clontech、カリフォルニア州パロアルト)を使用して、アラビドプシスProtox−1配列のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を実施する。塩基配列分析によってアミノ酸変更を確認した後、変異プラスミドでSASX38を形質転換し、L−amp100培地上にプレーティングして機能に関して試験し、また様々な濃度のprotox阻害性除草剤上にプレーティングして耐性に関して試験する。
この方法をアラビドプシスProtox−1配列(配列番号:1)のヌクレオチド688〜690のアラニン・コドンおよびヌクレオチド1306〜1308のチロシン・コドンに適用する。その結果、ヌクレオチド688〜690のアラニン・コドンがバリン、トレオニン、ロイシン、システインまたはイソロイシンのコドンに変異され機能が保持された除草剤耐性protox酵素を産生し得ることが立証された。この結果からさらに、ヌクレオチド1306〜1308のチロシン・コドンがシステイン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、バリンまたはアラニンのコドンに変異され機能が保持された除草剤耐性protox酵素を産生し得ることが立証された。
実施例11.あらかじめ確認された耐性突然変異体の酵素機能および/または除草剤許容性を増強する別の突然変異体の単離
除草剤耐性protox遺伝子を含むプラスミドで突然変異誘発株XL1−Redを形質転換し、変異DNAを上記と同様にして単離する。変異プラスミドをSASX38に形質転換し、元の「耐性」突然変異体の成長を阻害するのに十分な除草剤濃度で形質転換体をスクリーンする。耐性のコロニーを単離し、比較的耐性の高い表現型がコード配列に依存することを上記と同様にして確認する。これらの突然変異体の配列を決定し、祖先配列と比較して変異を確認する。
この方法を上記のpAraC−1Val突然変異体に適用した。その結果、アミノ酸305(配列番号:2)のセリン・コドンがロイシンのコドンに変異されpAraC−1Val突然変異体単独よりもprotox阻害性除草剤に対する耐性が高い酵素を産生し得ることが立証された。この第2部位変異体をAraC305Leuと称する。アミノ酸249のトレオニン・コドンでも同じ結果を示し、イソロイシンへの変異でもアラニンへの変異でもより許容性の高い酵素が得られる。これらの変異体をそれぞれAraC249IIeおよびAraC249Alaと称する。
この方法をさらに上記のpAraC−2Cys突然変異体に適用した。その結果、アミノ酸118(配列番号:2)のプロリン・コドンがロイシンのコドンに変異されpAraC−1Cys突然変異体単独よりもprotox阻害性除草剤に対する耐性が高い酵素を産生し得ることが立証された。この変異をAraC118Leuと称する。アミノ酸305のセリンコドンでも同じ結果を示し、ロイシンに変異させると、より許容性の高いpAraC−2Cys酵素が得られる。この変異体もpAraC−1Val突然変異体で上記と同様にして単離され、これをAraC305Leuと称する。pAraC−2Cys突然変異体の除草剤耐性を増強する、別の変異としては、AraC425Serと称するアミノ酸425でのアスパラギンからセリンへの変異、AraC498Cysと称するアミノ酸498でのチロシンからシステインへ変異などがある。
これらの変異は、除草剤耐性を単独で付与するのには十分ではなく、既に突然変異体である酵素の機能および/または除草剤耐性を増強するため、「第2部位」変異と呼ぶ。あらゆる可能な置換に関する徹底的な試験を実施していないので、このことは、これらの部位での他のアミノ酸置換が除草剤耐性の酵素を産生するのに十分である可能性を排除していない。
実施例12.確認された耐性変異と確認された第2部位変異の組合せによる高機能/高許容性Protox酵素の創製
上記のAraC305Leu変異は、AraC−1ValとAraC−2Cysの両方の突然変異体プラスミドの機能/除草剤耐性を増強することが分かった。この第2部位変異の一般的な有用性を調べるため、これをAraC−2Leu、AraC−2ValおよびAraC−2IIe変異と組合せ、除草剤許容性に関して試験した。各場合では、AraC305Leuの変異によって、protox阻害性除草剤に関して耐性のprotox突然変異体の成長速度が著しく速くなった。AraC−2IIe耐性突然変異体をAraC249IIeまたはAraC118Leuのいずれかの第2部位突然変異体と組み合わせることによっても、より許容性の高い突然変異体protox酵素が産生された。AraC249IIe変異によると、AraC−1突然変異体を増強することが確認された第2部位変異もAraC−2突然変異体の耐性を増大させることが立証される。AraC2IIe、AraC305LeuおよびAraC249lleを含む3つの変異プラスミドも、高機能、高除草剤許容性のprotox−1酵素を産生することを示した。
実施例13.変異させると除草剤許容性が得られるトウモロコシProtox−1遺伝子中の部位の確認
他のプラスミドを使用した場合上流プロモーター突然変異体が高頻度で単離されるのに対して、上記のpMut−1アラビドプシスProtox−1プラスミドは、突然変異誘発/スクリーニング実験で使用すると、真正のコード配列突然変異体が高頻度で得られる点で非常に有効である。トウモロコシProtox−1の効率的なプラスミドスクリーニング系を作成するため、アラビドプシスcDNAとほぼ同じ配列中のpMut−1ベクターにトウモロコシcDNAを組み込んだ。標準的方法の重複PCR融合を使用して、pMut−1 アラビドプシスクローンの5’末端(上記のようなセンス混合変異が1つある17アミノ酸の葉緑体輸送ペプチドを含む)をトウモロコシ配列のアミノ酸14(配列番号:6)から開始するトウモロコシProtox−1cDNA配列と融合した。トウモロコシcDNAの3’末端は変異していなかった。この融合の両端にNotI制限部位を設け、pMut−1由来のpFL61プラスミドバックボーンにキメラ遺伝子をクローン化した。塩基配列分析から、ヌクレオチド745〜747(配列番号:5)のACGコドンがACTコドンに変換される、PCRによる単一ヌクレオチドの無形質変異が明らかになったが、ACGコドンとACTコドンは両方ともトレオニンをコードする。このキメラアラビドプシス−トウモロコシProtox−1プラスミドをpMut−3と称する。
上記と同様にしてpMut−3プラスミドで突然変異誘発XL1−Red株を形質転換し、変異DNAを単離し、突然変異が起きていないpMut−3トウモロコシprotox遺伝子にとり致死濃度の除草剤上にプレーティングした。37℃で2日間培養後に除草剤許容性コロニーを単離し、上記と同様にして分析した。この分析から、除草剤耐性protoxのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のトウモロコシProtox−1酵素をもたらす5つの単一塩基の変異が明らかになった。これらの変異のうちの3つは、かつてアラビドプシスProtox−1遺伝子中の相同の位置で耐性を付与することが明らかにされたアミノ酸変異に相当する。3つのうちの2つはアミノ酸164(配列番号:6)のアラニン(GCT)をバリン(GAT)またはトレオニン(ACT)のいずれかに変換するpMzC−1ValおよびpMzC−1Thrである。この位置は上記のpAraC−1変異に相当する。第3の相同性変異はアミノ酸165のグリシン(GGT)をSerine(AGT)に変換し、上記のAraC−3Ser変異に相当する。これらの結果は、1つの植物protox遺伝子で確認された除草剤耐性の変異が別の品種由来の同等の植物protox遺伝子にも除草剤耐性を付与するだろうという予想を確認するのに役立つ。
トウモロコシProtox−1スクリーンから単離された変異のうち2つは、以前には除草剤抵抗部位として確認されていない残基でのアミノ酸変異をもたらす。1つの変異は、トウモロコシProtox−1配列(配列番号:6)のアミノ酸159のシステイン(TGC)をフェニルアラニン(TTC)に変換する。第2の変異はアミノ酸419のイソロイシン(ATA)をトレオニン(ACA)に変換する。
トウモロコシ突然変異体部位のうち3つでさらにアミノ酸を置換して試験した。グリシン165がロイシンに変異した時、あるいはシステイン159がロイシンまたはリシンのいずれかに変異した時に許容性を示した。また、ヒスチジン、グリシンまたはアスパラギンにイソロイシン419を変異することによっても許容性酵素が創製された。
許容性の高いアラビドプシスProtox−1酵素を産生した個々のアミノ酸変異を上記と同様にして部位特異的突然変異誘発によってトウモロコシProtox−1遺伝子に組み込んだ。細菌試験から、アミノ酸164(配列番号:6)のアラニン(GCT)をロイシン(CTT)に変異すると許容性の高いトウモロコシ酵素が産生されることが立証された。トウモロコシでの無作為スクリーンでは、アラビドプシス中のAraC−2部位と相同の変異は単離されなかった。しかしながら、この部位、即ちトウモロコシ酵素(配列番号:6)中のチロシン370をイソロイシンまたはメチオニンのいずれに変異すると、除草剤許容性酵素が産生された。
実施例14.変異させると除草剤許容性が得られるコムギProtox−1遺伝子中の部位の確認
効率のよいコムギProtox−1用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシcDNAについての上の記載と同様にしてコムギcDNAをpMut−1ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−コムギProtox−1キメラプラスミドをpMut−4と称する。pMut−4DNAを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性protoxのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のコムギProtox−1酵素をもたらす7つの単一塩基の変異が明らかになった。これらの変異のうちの4つは、かつてアラビドプシスおよび/またはトウモロコシProtox−1遺伝子中の相同の位置で耐性を付与することが明らかにされたアミノ酸変異に相当する。2つの変異がアミノ酸211(配列番号:10)のアラニン(GCT)をバリン(GAT)またはトレオニン(ACT)のいずれかに変換する。この位置は上記のpAraC−1変異に相当する。第3の相同性変異はアミノ酸212のグリシン(GGT)をSerine(AGT)に変換し、上記のAraC−3Ser変異に相当する。第4の変異は、アミノ酸466のイソロイシン(ATA)をトレオニン(ACA)に変換し、これはトウモロコシ由来のMz419Thr突然変異体に相当する。コムギProtox−1スクリーンから単離された変異のうち3つは、以前には除草剤抵抗部位として確認されていない残基でのアミノ酸変異をもたらす。1つの変異は、コムギProtox−1配列(配列番号:10)のアミノ酸356のバリン(GTT)をロイシン(CTT)に変換する。第2の変異はアミノ酸421のセリン(TCT)をプロリン(CCT)に変換する。第3の変異はアミノ酸502のバリン(GTT)をアラニン(GCT)に変換する。
実施例15.変異させると除草剤許容性が得られるダイズProtox−1遺伝子中の部位の確認
効率のよいダイズProtox−1用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシcDNAについての上の記載と同様にしてダイズcDNAをpMut−1ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−ダイズProtox−1キメラプラスミドをpMut−5と称する。pMut−5DNAを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性protoxのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のダイズProtox−1酵素をもたらす4つの単一塩基の変異が明らかになった。これらの変異のうちの2つは、かつてアラビドプシスおよび/またはコムギProtox−1遺伝子中の相同の位置で耐性を付与することが明らかにされたアミノ酸変異に相当する。1つの変異がアミノ酸266(配列番号:12)のアラニン(GCA)をトレオニン(ACA)に変換する。この位置は上記のpAraC−1Thr変異に相当する。第2の相同性変異はアミノ酸517のバリン(GTT)をアラニン(GCT)に変換し、コムギ由来のWht502Val変異に相当する。
ダイズProtox−1スクリーンから単離された変異のうち2つは、以前には除草剤抵抗部位として確認されていない残基でのアミノ酸変異をもたらす。1つの変異は、ダイズProtox−1配列(配列番号:12)のアミノ酸369のプロリン(CCT)をセリン(TCT)に変換する。第2の変異はこの同じプロリン369をヒスチジン(CAT)に変換する。
許容性の高いアラビドプシスProtox−1酵素を産生した個々のアミノ酸変異を上記と同様にして部位特異的突然変異誘発によってダイズProtox−1遺伝子に組み込んだ。細菌試験から、アミノ酸226(配列番号:12)のアラニン(GCA)をロイシンに変異すると許容性のダイズ酵素が産生されることが立証された。アミノ酸432(配列番号:12)のチロシン(TAC)をロイシンまたはイソロイシンのいずれかに変異しても除草剤許容性酵素が産生された。
実施例16.変異させると除草剤許容性が得られるテンサイProtox−1遺伝子中の部位の確認
効率のよいテンサイProtox−1用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシcDNAについての上の記載と同様にしてテンサイcDNAをpMut−1ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−テンサイProtox−1キメラプラスミドをpMut−6と称する。pMUt−6DNAを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性protoxのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、除草剤許容性のテンサイProtox−1酵素をもたらす1つの単一塩基の変異が明らかになった。この変異はアミノ酸449のチロシン(TAC)をシステイン(TGC)に変換し、アラビドプシス中のAraC−2変異と相同である。
許容性の高いアラビドプシスProtox−1酵素を産生した個々のアミノ酸変異を上記と同様にして部位特異的突然変異誘発によってテンサイProtox−1遺伝子に組み込んだ。細菌試験から、アミノ酸449のチロシン(TAC)をロイシン、イソロイシン、バリンまたはメチオニンのいずれかに変異したところ、除草剤許容性酵素が産生された。
実施例17.変異させると除草剤許容性が得られるワタProtox−1遺伝子中の部位の確認
効率のよいワタProtox−1用プラスミドのスクリーニング系を作成するため、トウモロコシcDNAについての上の記載と同様にしてワタcDNAをpMut−1ベクターに組み込んだ。このアラビドプシス−ワタProtox−1キメラプラスミドをpMut−7と称する。pMut−7DNAを変異させ、上記と同様にして除草剤耐性に関してスクリーンした。この分析から、除草剤耐性protoxのコード配列を含む多数のプラスミドが明らかになった。塩基配列分析から、それぞれ除草剤許容性のワタProtox−1酵素をもたらす3つの単一塩基の変異が明らかになった。2つの突然変異体が、アミノ酸428(配列番号:16)のチロシン(TAC)をそれぞれシステイン(TGC)およびアルギニン(CGC)に変異する。アルギニンは、以前に確認されたこのAraC−2部位で耐性を与える新規の置換である。第3の変異はアミノ酸365のプロリン(CCC)をセリン(TCC)に変換する。この変異はダイズ突然変異体Soy369Serに相当する。
実施例18.種々のProtox阻害性化合物に対する耐性変異の交差許容性実験
元々単一のprotox阻害性除草剤に対する耐性に基づいて識別された耐性の突然変異体プラスミドを、他の様々なprotox阻害性化合物について試験した。この試験については、各致死濃度を決定するため、野生型プラスミドを含むSASX38株を一連の濃度の各化合物上にプレーティングする。SASX38中の耐性の突然変異体プラスミドをプレーティングし、野生型のプラスミドを含むSASX38に致死の濃度より少なくとも10倍高い各化合物濃度で残存する能力を評価する。
下記表3Aおよび表3Bに示した細菌の交差耐性試験の結果から、確認された各変異によって様々なprotox阻害化合物に対する耐性が付与されることが明らかである。
セクションC トランスジェニック植物での除草剤耐性Protox遺伝子の発現
実施例19.同種組換えまたは遺伝子転換によるprotox阻害性除草剤許容性植物の遺伝子組換え
天然protoxプロモーターの調節下で発現すると、記載された突然変異体コード配列は有効に除草剤許容性を付与するので、protoxコード配列の天然染色体の位置を標的とした変異は、除草剤耐性の植物および植物細胞を作成する代替手段であることを意味する。所望の変異を含むがそれ自体の発現シグナル(プロモーターまたは3’非翻訳領域のいずれか)が欠失しているprotoxDNA断片は、当技術分野で認められた任意の方法(例えばアグロバクテリウム形質転換、プロトプラストへの直接遺伝子転移、微量噴出性ボンバードなど)により導入し、除草剤許容性の形質転換体を選択し得る。導入されたDNA断片はまた、コードされるアミノ酸配列(即ち、無形質変異)を変異させずに、in vitroの部位特異的突然変異誘発により導入される診断用制限酵素部位または他の配列多形を含む。かつて様々な選択マーカーおよび除草剤許容性遺伝子について報告されたように(例えば、Paszkowski等,EMBO J.7:4021〜4026(1988年)、Lee等,Plant Cell2:415〜425(1990年)、Risseeuw等,Plant J.7:109〜119(1995年)参照)、ある形質転換体は、突然変異体DNAのprotox染色体座中への相同的組込みにより、あるいは天然protox染色体配列の導入された突然変異体配列への転換により得られることが分かっている。これらの形質転換体は、その除草剤許容性表現型の組合せと、そのprotox染色体座中の診断用制限酵素部位の存在によって認められる。
実施例20.植物形質転換ベクターの構築
多くの形質転換ベクターが植物形質転換に利用可能であり、本発明の遺伝子はこのような任意のベクターと共に使用し得る。使用するベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の標的種に依存する。ある標的種に対して異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましいことがある。形質転換に通常使用される選択マーカーとしては、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するnptII遺伝子(MessingおよびVierra,Gene19:259〜268(1982年);Bevan等,Nature304.184〜187(1983年))、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するbar遺伝子(White等,Nucl Acids Res 18:1062(1990年)、スペンサー等,Theor Appl Genet 79:625〜631(1990年))、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子(BlochingerおよびDiggelmann,Mol Cell Biol4:2929〜2931)、およびメトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子、(Bourouis等,EMBO J.2(7)1099〜1104(1983年))などがある。
I.アグロバクテリウムの形質転換に適したベクターの構築
アグロバクテリウム−ツメファシエンスを使用する多くのベクターが形質転換に利用可能である。通常これらは少なくとも1つのT−DNA境界配列をもち、pBIN19(Bevan,Nucl.Asids Res.(1984年))およびpXYZなどのベクターを含む。2種類の代表的なベクターの構築を以下に記載する。
pCIB200およびpCIB2001の構築:アグロバクテリウムに使用する組換えベクター構築用のバイナリーベクター、pCIB200およびpCIB2001を使用して、次のようにして構築した。pTJS75のNarl消化によりpTJS75kanを作成して(SchmidhauserおよびHelinski,J Bactenol.164:446〜455(1985年))テトラサイクリン抵抗遺伝子の切り出しを可能にした後、NPTIIをもつpUC4K由来のAccl断片を挿入した(MessingおよびVierra,Gene19:259〜268(1982年);Bevan等,Nature304:184〜187(1983年);McBride等,Plant Molecular Biology14:266〜276(1990年))。左右のT−DNA境界、植物選択可能なnos/nptIIキメラ遺伝子およびpUCポリリンカーを含むpCIB7のEcoRV断片にXhoIリンカーをライゲートし(Rothstein等,Gene53:153〜161(1987年))、XhoI消化断片をSaII消化pTJS75kanにクローン化してpCIB200を作成した(EP0332104、実施例19も参照)。pCIB200は、EcoRI、SstI、KpnI、BgIII、XbaIおよびSaIIの特有のポリリンカー制限部位を含む。pClB2001は、ポリリンカーに追加制限部位を挿入することによって作成されるpCIB200の誘導体である。pCIB2001のポリリンカー中の特有の制限部位はEcoRI、SstI、KpnI、BgIII、XbaI、SaII、MluI、BcII、AvrII、ApaI、HpaIおよびStuIである。これらの特有の制限部位を含むことに加え、pCIB2001はまた、植物および細菌のカナマイシン選択、アグロバクテリウムによる形質転換用の左右のT−DNA境界、大腸菌と他の宿主との間で動員するためのRK2由来のtrfA機能およびこれもRK2由来のOriTとOriV機能を有する。pCIB2001ポリリンカーは、それ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適する。
pCIB10およびそのハイグロマイシン選択誘導体の構築:バイナリーベクターpCIB10は、植物での選択のためのカナマイシン耐性をコードする遺伝子、T−DNAの右境界配列および左境界配列を含む上、広範囲の宿主のプラスミドpRK252由来の配列を組み込んでおり、それによって、大腸菌とアグロバクテリウムの両方で複製が可能である。その構築については、Rothstein等,Gene53:153〜161(1987年)に記載されている。Gritz等,Gene25:179〜188(1983年)に記載された、ハイグロマイシンBホスフォトランスフェラーゼの遺伝子を組み込んだ、pCIB10の様々な誘導体が構築された。これらの誘導体によると、ハイグロマイシンのみ(pCIB743)またはハイグロマイシンおよびカナマイシン(pCIB715、pCIB717)に関するトランスジェニック植物細胞の選択が可能になる。
II.非アグロバクテリウム形質転換に適したベクターの構築
アグロバクテリウム−ツメファシエンスを使用しない形質転換によると、選択される形質転換ベクター中のT−DNA配列に対する要求が回避され、従って、T−DNA配列を含む上記などのベクターに加え、これらの配列が欠失しているベクターを利用し得る。アグロバクテリウムに依存しない形質転換技術としては、粒子ボンバード、プロトプラスト取込み(例えばPEGおよびエレクトロポレーション)、マイクロインジェクションを介する形質転換などがある。ベクターの選択は主として、形質転換する種にとって好ましい選択に依存する。以下にいくつかの代表的なベクターの構築について記載する。
pCIB3064の構築:pCIB3064は除草剤basta(またはホスフィノトリシン)による選択と組み合せた直接遺伝子転移技術に適するpUC由来のベクターである。プラスミドpCIB246は、CaMV35Sプロモーターおよび作用状態で大腸菌GUS遺伝子と融合したCaMV35S転写ターミネーターを含み、PCT公開出願WO93/07278に記載されている。このベクターの35Sプロモーターは、開始部位の2つのATG配列5’を含む。標準のPCR技術を使用して、ATGが除去され、制限部位SspIおよびPvuIIが生じるようにこれらの部位を変異させた。新しい制限部位は、特有のSaII部位から96塩基対および37塩基対離れ、実際の開始部位から101塩基対および42塩基対離れていた。得られたpCIB246の誘導体をpCIB3025と命名した。次いで、SaIIとSacIによる消化によってpCIB3025からGUS遺伝子を切り出し、末端を平滑末端化し、再度ライゲーションを行なってプラスミドpCIB3060を生成させた。John Innes Centre(ノリッジ)からプラスミドpJIT82を入手し、Streptomyces viridochromogenes由来のbar遺伝子を含む400塩基対のSmaI断片を切り出し、pCIB3060のHpaI部位に挿入した(Thompson等,EMBO J 6:2519〜2523(1987年))。これによって、CaMV35Sプロモーターと草剤選択用のターミネーター、即ちアンピシリン耐性の遺伝子(大腸菌での選択用)および特有の部位SphI、PstI、HindIIIおよびBamHIを備えたポリリンカーの調節を受けるbar遺伝子を含むpCIB3064が生成した。このベクターは、それ自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適する。
pSOG19およびpSOG35の構築:pSOG35は、選択マーカーとして大腸菌遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を利用し、メトトレキサートに対する耐性を付与する形質転換ベクターである。PCRを使用して35Sプロモーター(約800塩基対)、トウモロコシAdh1遺伝子由来のイントロン6(約550塩基対)およびpSOG10由来の18塩基対のGUS非翻訳リーダー配列を増幅した。大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼII型遺伝子をコードする250塩基対の断片もPCRによって増幅し、これらの2個のPCR断片をpUC19ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むpBI221(Clontech)由来のSacI−Pst1断片と組み合わせた。これらの断片を組み合わせたところ、イントロン6配列、GUSリーダー、DHFR遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターと融合した35Sプロモーターを含むpSOG19が生成した。pSOG19中のGUSリーダーをトウモロコシChlorotic Mottle Virus(MCMV)由来のリーダー配列と置換したところ、ベクターpSOG35が生成した。pSOG19とpSOG35は、アンピシリン耐性のpUC遺伝子を保有し、外来配列のクローニングに利用可能なHindIII、SphI、PstIおよびEcoRI部位を有する。
実施例21.植物発現カセットの構築
トランスジェニック植物での発現を目的とした遺伝子配列はまず、発現カセットの中の適切なプロモーターの後ろで適切な転写ターミネーターの上流に組み立てる。次いで、これらの発現カセットは上記の実施例20に記載した植物形質転換ベクターに容易に転移し得る。
I.プロモーターの選択
発現カセットの中で使用するプロモーターの選択により、トランスジェニック植物中の導入遺伝子の空間的、時間的な発現パターンが決定される。選択されたプロモーターは、特定の細胞型(葉の表皮細胞、葉肉細胞、根の皮質細胞など)または特定の組織または器官(例えば根、葉または花など)の中で導入遺伝子を発現し、この選択は、導入遺伝子の発現の所望の位置を反映している。別法として、プロモーターを光誘発型、または他の一時的に調節して選択されたプロモーターが遺伝子の発現を制御するようにしてもよい。さらなる別法は、選択されたプロモーターを化学的に調節するということである。これによると、望むときに化学的誘導物質処理によって引き起こす時だけに導入遺伝子の発現を誘起する可能性が提供されるであろう。
II.転写ターミネーター
様々な転写ターミネーターが発現カセットでの使用に利用できる。これらは、導入遺伝子およびその正確なポリアデニル化を超える転写を終了させる役割を果たす。適切な転写ターミネーターは植物中で機能することが知られており、CaMV 35Sターミネーター、tmIターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウrbcSE9ターミネーター、並びに植物protox遺伝子に天然で付随するターミネーター(即ち、「protoxターミネーター」)などが含まれる。これらは、単子葉植物と双子葉植物の両方で使用し得る。
III.発現の強化または調節のための配列
多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を増強し、これらの配列を本発明の遺伝子と共に使用してトランスジェニック植物中でのそれらの発現を増大させ得ることが分かっている。
様々なイントロン配列が、特に単子葉の細胞中で発現を増強することが分かっている。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞へ導入されると、その同種のプロモーター下での野生型遺伝子の発現を著しく増強することが分かった。イントロン1は、特に有効であることが分かり、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子による融合構築物中での発現を増強した(Callis等,Genes Develop.1:1183〜1200(1987年))。同じ実験系で、トウモロコシbronzel遺伝子由来のイントロンに発現増強で類似の効果があった(Callis等,前出)。イントロン配列は常法により植物形質転換ベクター、典型的には非翻訳リーダー内に組み入れた。
ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列も発現を増強することが知られており、これらは双子葉植物細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイルス(TMV、「W配列」)、Maize Chlorotic Mottle Virus(MCMV)およびアルファルファモザイクウイルス(AMV)由来のリーダー配列は、発現増強に有効なことが示された(例えば、Gallie等,Nucl.Acids Res.15:8693〜8711(1987年);Skuzeski等,Plant Molec.Biol.15:65〜79(1990年)など)。
IV.植物内遺伝子産物のターゲティング
植物には遺伝生産物ターゲティングの様々なメカニズムが存在することが知られており、これらのメカニズムの機能を調節する配列の特徴をかなり詳細に調べた。例えば、葉緑体への遺伝生産物のターゲティングは、様々な蛋白質のアミノ末端に見られ、葉緑体移入中に切断されて成熟した蛋白質を産生するシグナル配列によって調節される(例えば、Comai等,J.Biol.Chem.263:15104〜15109(1988年)など)。これらのシグナル配列は、異種遺伝生産物と融合させて異種生産物の葉緑体への移入を達成させ得る(van den Broeck等,Nature313:358〜363(1985年))。RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSPシンターゼ酵素、GS2蛋白および葉緑体に局在していることが知られている他の多くの蛋白質をコードするcDNAの5’末端から、適切なシグナル配列をコードするDNAを単離し得る。
他の遺伝生産物がミトコンドリアやペルオキシゾームなどの他の細胞器官に局在する(例えば、Unger等,Plant Molec.Biol.13:411〜418(1989年))。また、これらの生産物をコードするcDNAもこれらの細胞器官への異種遺伝生産物のターゲティングを達成するために操作し得る。このような配列の例は、核コード化ATPアーゼおよびミトコンドリアの特異的アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソフォームである。細胞蛋白体へのターゲティングについてはRogers等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6512〜6516(1985年)に記載されている。
また、他の細胞区画への遺伝生産物のターゲティングを引き起こす配列の特徴が明らかにされた。アミノ末端配列は、ER、アポプラストおよびアリューロン細胞からの細胞外分泌物へのターゲティングの役割を果す(KoehlerおよびHo、Plant Cell2:769〜783(1990年))。さらに、カルボキシ末端配列と組み合わせたアミノ末端配列は、遺伝生産物の空胞へのターゲティングの役割を果す(Shinshi等,Plant Molec Biol.14:357〜368(1990年))。
上記の適切なターゲティング配列の対象導入遺伝子配列との融合によって、導入遺伝子生産物を任意の細胞器官または細胞区画に指向させることが可能である。例えば葉緑体ターゲティングのためには、RUBISCO遺伝子、CAB遺伝子、EPSPシンターゼ遺伝子またはGS2遺伝子由来の葉緑体シグナル配列を導入遺伝子のアミノ末端ATGと読み枠内で融合する。選択されたシグナル配列には、既知の切断部位を含むようにし、構築する融合には、切断に必要な切断部位の後に任意のアミノ酸を考慮に入れるべきである。ある場合には、この要求は切断部位と導入遺伝子ATGとの間に少数のアミノ酸を挿入することによって、あるいは別法として導入遺伝子配列内のいくつかのアミノ酸の置換によって満たしてもよい。葉緑体移入のために構築した融合体は、(Edelmann他編「Methods in Chloroplast Molecular Biology」Elsevier,1081〜1091(1982年)収載のBarlett等の章;Wasmann等,Mol.Gen.Genet.205:446〜453(1986年))に記載された技術を使用してin vitroで転写した構築物をin vitroで翻訳した後にin vitroで葉緑体取込みを行なうことによって、葉緑体取込み効果を試験し得る。これらの構築技術は当技術分野でよく知られており、ミトコンドリアとペルオキシゾームと等しく適用可能である。導入遺伝子の発現に必要なターゲティングの選択は、所与の経路の開始点として必要な前駆体が細胞内のどこに局在するかに依存する。通常これはサイトゾルまたは葉緑体であるが、ミトコンドリアまたはペルオキシゾームの場合もある。導入遺伝子発現生成物には通常、ER、アポプラストまたは液胞へのターゲティングは要求されない。
上記の細胞ターゲティングメカニズムは、ターゲティングシグナルが由来するプロモーターのものとは異なった発現パターンを有するプロモーターの転写調節下で特定細胞のターゲティングを行なうという目標を達成するために、それらと同種のプロモーターだけでなく異種プロモーターとも併用し得る。
実施例22.双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技術は当技術分野でよく知られており、アグロバクテリウムを核とした技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術としては、直接プロトプラストまたは細胞による外因性遺伝材料の取込みなどがある。これはPEGまたはエレクトロポレーションによる取込み、粒子ボンバードによる送達、またはマイクロインジェクションによって達成し得る。これらの技術の例については、Paszkowski等,EMBO J 3:2717〜2722(1984年)、Potrykus等,Mol.Gen.Genet.199:169〜177(1985年)、Reich等,Biotechnology 4:1001〜1004(1986年)、Klein等,Nature327:70〜73(1987年)などに記載されている。各場合とも、形質転換細胞は当技術分野で知られている標準の技術を使用して植物全体に再生されている。
アグロバクテリウムによる形質転換は、形質転換効率が高く、かつ多種多様な種を幅広く利用できるため、好ましい双子葉植物形質転換技術である。アグロバクテリウムにより通常、形質転換し得る多くの作物種としては、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、脂肪種子ナタネ、じゃがいも、ダイズ、アルファルファ、ポプラなどがある(EP0317511(ワタ)、EP0249432(トマト、Calgene社)、WO87/07299(アブラナ、Calgene社)、米国特許第4,795,855号(ポプラ))。
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換には通常、アグロバクテリウムと植物由来の外植片との同時培養が含まれ、当技術分野でよく知られている手順に従う。形質転換した組織は、バイナリープラスミドT−DNA境界間に存在する抗生物質耐性マーカーまたは除草剤耐性マーカーを保有した状態で、選択培地上で再生する。
実施例23.単子葉植物の形質転換
今やほとんどの単子葉植物種の形質転換もルーチンとなった。好ましい技術としては、PEGまたはエレクトロポレーションの技術を使用する、プロトプラストへの直接遺伝子転移や、カルス組織中への粒子ボンバードなどがある。形質転換は単一のDNA種または多数のDNA種(即ち同時形質転換)で行なうことができ、これらの技術は両方とも本発明での使用に適する。同時形質転換は、複合ベクター構築が回避でき、対象遺伝子および選択マーカーのための非連結遺伝子座を備えたトランスジェニック植物が作成できるという利点を有し、望ましいと見なす場合には、後代で選択マーカーを除去することが可能になる。一方、同時形質転換を使用する場合の欠点は、分離DNA種のゲノムへの組み込み頻度が100%未満だということである(Schocher等,Biotechnology4:1093〜1096(1986年))。
特許出願EP0292435(チバ−ガイギー)、EP0392225(チバ−ガイギー)およびWO93/07278(チバ−ガイギー)は、トウモロコシ優良同系繁殖株由来のカルスおよびプロトプラストの調製、PEGまたはエレクトロポレーションを使用したプロトプラストの形質転換、形質転換プロトプラストからのトウモロコシ植物の再生の各技術について記載している。Gordon−Kamm等,Plant Cell 2:603〜618(1990年)およびフロム等,Biotechnology8:833〜839(1990年)は、粒子ボンバードを使用したA188由来トウモロコシ株の形質転換技術を発表した。さらに、出願WO93/07278(チバ−ガイギー)およびKoziel等,Biotechnology11:194〜200(1993年)は、粒子ボンバードによるトウモロコシ優良同系繁殖株の形質転換技術について記載している。この技術は、授粉14〜15日後にトウモロコシ雌穂から切り出された1.5〜2.5mmの長さの未熟トウモロコシ胚芽と、ボンバード用のPDS−1000He Biolistics(微粒子銃)装置を利用している。
イネの形質転換もプロトプラストまたは粒子ボンバードを利用した直接遺伝子転移技術によって行なうことができる。プロトプラストによる形質転換は、ジャポニカ型およびインディカ型について記載されている(Zhang等,Plant Cell Rep7:379〜384(1988年);Shimamoto等,Nature338:274〜277(1989年);Datta等,Biotechnology8:736〜740(1990年))。両方の型とも通例、粒子ボンバードを使用して形質転換される(Christou等,Biotechnology9:957〜962(1991年))。
特許出願EP0332581(チバ−ガイギー)は、Pooideaeプロトプラストの生成、形質転換および再生の技術について記載している。これらの技術によると、オーチャードグラスとコムギの形質転換も可能である。さらに、コムギ形質転換は、長期再生可能なカルスのタイプC細胞への粒子ボンバードを使用するものがVasil等,Biotechnology 10:667〜674(1992年)に、また未熟胚芽および未熟胚芽由来のカルスの粒子ボンバードを使用するものがVasil等,Biotechnology11:15531558(1993年)、Weeks等,Plant Physiol.102:1077〜1084の(1993)に記載されている。しかしながら、コムギ形質転換の好ましい技術としては、遺伝子送達前に高蔗糖または高麦芽糖のいずれかの段階を含む、未熟胚芽の粒子ボンバードによるコムギの形質転換などがある。ボンバードに先立ち、任意の数の胚芽(長さ0.75〜1mm)を体細胞不定胚誘導用の3%蔗糖(Murashige&Skoog、Physiologia Planterum15:473〜497(1962年))および3mg/lの2,4Dを含むMS培地上にプレーティングし、暗中で生育させる。ボンバードに選択した日に誘導培地から胚芽を取り除き、osmoticum(即ち、蔗糖またはマルトースを所望の濃度、典型的には15%加えた誘導培地)の上に置く。胚芽を、2〜3時間原形質単離させた後、ボンバードする。標的平板当たり胚芽20個が決定的ではないが典型的である。標準の方法を使用して、ミクロン大の金粒子上に適切な遺伝子保有プラスミド(pCIB3064またはpSG35など)を付着させる。各胚芽平板を、80メッシュの標準スクリーンを使用して−1000psiの爆圧を使用するDuPont Biolisticsのヘリウム装置によって撃つ。ボンバード後、胚芽を暗中に戻し、約24時間(osmoticum上)で回復させる。24時間後、osmoticumから胚芽を取り出して誘導培地上に戻し、再生まで約1月間静置する。およそ1か月後、成育中の胚性カルス付きの胚芽外植片を、適切な選択剤(pCIB3064の場合10mg/lのbasta、pSOG35の場合2mg/lのメトトレキサート)をさらに含む、再生培地(MS+1mg/lのNAA、5mg/lのGA)に移す。およそ1か月後、生育した苗条を、半濃度のMS、2%蔗糖および同濃度の選択剤を含む、「GA7s」として知られている、より大きい滅菌容器に移す。特許出願WO94/13822にはコムギ形質転換法が記載されており、これを参照により本明細書の一部とする。
例24.アラビドプシス・タリアナProtox−1プロモーター配列の単離
アラビドプシス・タリアナ(コロンビア、全植物)から調製されたLambda ZapIIゲノムDNAライブラリーをStratagene社から購入した。およそ125,000個のファージを15cmのペトリ皿当たり25,000pfuの密度でプレーティングし、複製リフトをColony/Plaque Screen膜(NEN Dupont)上に作成した。このプラークリフトを、ランダムプライミング法(Life Technologies)により32P−dCTP標識したアラビドプシスProtox−1cDNA(配列番号:1)で探査した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、ChurchおよびGilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1991〜1995(1984年)に記載されているように65℃とした。ポジティブにハイブリダイズするクローンを精製し、in vivoで切り出してpBluescriptに導入した。ゲノムDNAインサート由来の配列を蛍光色素で標識したジデオキシターミネーター(Applied Biosystems社)を用いた連鎖停止法によって決定した。1つのクローン、即ちAraPTlProが、Protox−1蛋白コード配列の開始メチオニン(ATG)の上流に580塩基対のアラビドプシス配列を含むことが決定された。このクローンはまた、Protox−1cDNA配列の塩基1241に向かって伸長するコード配列およびイントロンをも含む。580塩基対の5’非コード断片は推定アラビドプシスProtox−1プロモーターであり、配列番号:13に配列を示す。
AraPTlProは、1995年12月15日にpWDC−11(NRRL#B−21515)として寄託した。
実施例25.天然アラビドプシスProtox−1の後ろに変更Protox−1遺伝子を発現する植物形質転換ベクターの構築
適当な変異アラビドプシスProtox−1cDNAの完全長cDNAをEcoRI−XhoI部分消化断片として単離し、植物発現ベクターpCGN1761ENXでクローン化した(1995年6月8日に出願され、1995年12月21日にWO95/34659として公開された国際出願PCT/IB95/00452の実施例9参照)。このプラスミドをNcoIとBamHIで消化してアグロバクテリウム−ツメファシエンスのtmI遺伝子の完全なProtox−1cDNAと3’非翻訳配列由来の転写ターミネーターとで構成された断片を作成した。上記のAraPTlProプラスミドをNcoIおよびBamHIで消化してpBluescriptおよび580塩基対の推定アラビドプシスProtox1プロモーターを含む断片を作成した。これらの2個の断片をライゲートしたところ、変異protox cDNAが天然protoxプロモーターへ融合された。Protox−1プロモーター/Protox−1 cDNA/tmIターミネーター融合体を含む発現カセットをKpnIによる消化によって切り出し、バイナリーベクターpCIB200でクローン化した。エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムをこのバイナリープラスミドで形質転換した後、真空浸潤法(Bechtold等,C.R Acad.Sci.Paris316:1194〜1199(1993年))を使用してAmbidopsisを形質転換した。変更Protox遺伝子を発現する形質転換体をカナマイシンまたは種々の濃度のProtox阻害性除草剤について選択した。
実施例26.天然Protox−1プロモーター/変更天然Protox−1融合体の発現による除草剤許容性植物の作成
上記の方法を使用して、Protox−1配列(配列番号:1)のヌクレオチド1306〜1308にTACからATG(チロシンからメチオニン)への変異を含むアラビドプシスProtox−1cDNAを天然Protox−1プロモーター断片と融合し、アラビドプシス・タリアナを形質転換した。この改変Protox−1酵素(AraC−2Met)は、前記の細菌発現系で試験するとき、様々なprotox阻害性除草剤に対して天然酵素よりも10倍を超える高い許容性を示した。真空浸潤させた植物由来の種子を集め、一連の濃度(10.0nM〜1.0uM)の式XVIIのprotox阻害性アリールウラシル除草剤上にプレーティングした。野野生型アラビドプシスでの多数の実験から、濃度10.0nMのこの化合物が正常な実生苗の発芽を防ぐのに十分であることが示された。天然Protox−1プロモーターと融合したAraC−2Met修飾酵素を発現するトランスジェニック種子は、500nMまでの除草剤濃度で正常なアラビドプシス実生苗を産生し、野生型アラビドプシスと比較して少なくとも50倍高い除草剤許容性を示した。従って、このプロモーター/修飾protox酵素融合体は、植物形質転換の有効な選択マーカーとして機能する。100.0nMのprotox阻害性除草剤上で発芽した植物のいくつかを土壌に移植し、2〜3週間成長させ、様々な濃度のprotox阻害性除草剤による噴霧測定法で試験した。空ベクター対照形質転換体と比較したところ、AraPTlPro/AraC−2Metトランスジェニック植物は、除草剤スプレーに対する許容性が10倍を超えていた。
実施例27.アラビドプシス発芽測定法での様々なprotox阻害性化合物に対する耐性変異体の交差許容性実験
上記の方法を使用して、Protox−1配列(配列番号:1)中のヌクレオチド1306〜1308のTACからATC(チロシンからイソロイシン)への変異およびヌクレオチド945〜947のTCAからTTA(セリンからロイシン)への変異を両方とも含むアラビドプシスProtox−1cDNAを天然Protox−1プロモーター断片と融合し、アラビドプシス・タリアナを形質転換した。この修飾Protox−1酵素(AraC−2IIe+AraC305Leu)は細菌系で試験したとき、式XVIIのprotox阻害性アリールウラシル除草剤に対する許容性が天然酵素の10倍を超えていることを示した(実施例8〜12参照)。上記と同様にして、実生苗発芽測定法でprotoxを阻害する除草剤に対して高い許容性を示した形質転換体から、この融合体を含む同型接合アフビドプシス株を作成した。野生型アラビドプシスの発芽阻害を示した化合物濃度について発芽測定法を繰り返すことより、1株由来の種子につき、様々なprotox阻害化合物に対する交差許容性を試験した。これらの実験の結果を表4に示す。
実施例28.トウモロコシProtox−1プロモーター配列の単離
StratageneからλFIXIIベクターに挿入したトウモロコシ(ミズーリ17同系交配黄化実生)ゲノムDNAライブラリーを購入した。このライブラリーおよそ250,000pfuを15cm平板当たり50,000個ファージの密度でプレーティングし、Colony/Plaqueスクリーン膜(NEN Dupont)上に複製リフトを作成した。このプラークリフトを、ランダムプライミング法(ライフ・テクノロジーズ)により32P−dCTPで標識したトウモロコシProtox−1cDNA(配列番号:5)で探査した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、Churchおよびギルバート,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1991〜1995(1984年)の記載と同様に65℃とした。Wizard Lambda Preps DNA Purification System(Promega)を使用して、ポジティブにハイブリダイズする3個のファージからλファージDNAを単離した。制限消化、ハイブリダイゼーションパターンおよびDNA配列分析による解析から、以前cDNAクローンとして単離されたトウモロコシProtox−1コード配列の5’に位置するおよそ3.5kbのトウモロコシゲノムDNAを含むλクローンが確認された。この断片はトウモロコシProtox−1プロモーターを含む。この断片の配列を配列番号:14に示す。ヌクレオチド1〜3532から、この配列は5’非コード配列から成る。ヌクレオチド3533〜3848から、この配列は、トウモロコシProtox−1蛋白の5’末端をコードする。
トウモロコシProtox−1コード配列の残部と融合させた配列番号:14の配列を含むプラスミドを、1996年3月19日にpWDC−14(NRRL#B−21546)として寄託した。
実施例29.天然トウモロコシProtox−1プロモーターの後ろに改変Protox−1遺伝子を発現する植物形質転換ベクター
単離したλファージクローンから3848塩基対のゲノム断片(配列番号:14)をSalI−KpnI部分消化生成物として切り出し、アミノ酸164(配列番号:6)にアラニンからロイシンへの変異を含む改変トウモロコシProtox−1cDNA由来のKpnI−Not1断片とライゲートした。これにより、細菌系中で除草剤許容性を付与することを示す(実施例8〜13)、天然トウモロコシProtox−1プロモーターの完全長cDNAとの融合体が作成された。この融合体をCaMV35Sターミネーター配列を含むpUC18由来ベクターでクローン化してprotoxプロモーター/改変protox cDNA/ターミネーターカセットを作成した。このカセットを含むプラスミドをpWCo−1と命名した。
トウモロコシゲノムクローン由来のコード配列中に見出した第1イントロンを元のトウモロコシcDNAに組み込むことによってトウモロコシ形質転換のための第2の構築物を作成した。この挿入は標準のオーバーラップPCR融合技術を使用して行なった。イントロン(配列番号:25)は長さ93塩基対であり、実施例28に記載したλクローンの天然配列に示されるように、正確に配列番号:6のヌクレオチド203とヌクレオチド204の間に挿入された。この発現カセットのイントロン含有版をpWCo−2と命名した。
実施例30.トランスジェニックトウモロコシ植物中のトウモロコシProtox−1プロモーター活性の実験
トウモロコシprotoxプロモーター/改変protox融合体で形質転換されたトウモロコシ植物は導入遺伝子に特異的なプライマーによるPCR分析を使用して確認した。PCRポジティブの植物からRNA全体を調製し、Superscript M−MLV(Life Technologies)を使用して推奨条件下でRNAを逆転写した。改変protox配列に特異的となるように設計したPCR反応中で逆転写反応物2μlを使用した。この反応では、非形質転換対照からは生成物が生じなかったが、一方pWCo−1で形質転換した植物のおよそ85%からは肯定的な結果が得られ、導入遺伝子由来のmRNAの存在が示された。これは、あるレベルのトウモロコシprotoxプロモーター活性を示す。また、このトランスジェニックトウモロコシ植物由来のRNAも、配列番号:6由来の放射性同位体標識トウモロコシprotox cDNA断片をプローブとして使用する標準のノーザンブロット分析に供した。トランスジェニックトウモロコシ植物のうちのいくつかに非形質転換対照のものをかなり上回るProtox−1 mRNAレベルが検出された。この高いmRNAレベルは、クローン化トウモロコシprotoxプロモーター由来の改変protox−1 mRNAの発現によると推定される。
実施例31.テンサイProtox−1プロモーター配列の単離
ゲノムテンサイライブラリーはStratageneによりλFixIIベクター中に調製された。トウモロコシについて実施例28に記載されているようにして、およそ300,000pfuのライブラリーをテンサイprotox−1cDNA配列(配列番号:17)上にプレーティングして探査した。制限消化、ハイブリダイゼーションパターンおよびDNA配列分析による解析から、以前cDNAクローンとして単離されたテンサイコード配列の5’に位置するおよそ7kbのテンサイゲノムDNAを含むλクローンが確認された。λクローンから2606bbのPstI−Sall断片をpBluescriptベクターにサブクローン化した。この断片は2068塩基対の5’非コード配列を含み、テンサイProtox−1プロモーターを含む。それはまた、protox−1コード配列の最初の453塩基対およびコード配列に含まれる85塩基対の第1イントロンをも含む。この断片の配列を配列番号:26に示す。
配列番号:26の配列を含むプラスミドを1996年12月6日にpWDC−20(NRRL#B−21650)として寄託した。
実施例32.天然テンサイProtox−1プロモーターの後ろに改変Protox−1遺伝子を発現する植物形質転換ベクターの構築
実施例31に記載したゲノムサブクローンからテンサイゲノム断片(配列番号:26)を、2068塩基対の5’非コード配列とテンサイProtox−1コード配列の最初の300塩基対とを含むSacI−BsrGI断片として切り出した。この断片を、アミノ酸449(配列番号:18)にチロシンからメチオニンへの変異を含む改変テンサイProtox−1cDNA由来のBsrGI−NotI断片とライゲートした。これにより、細菌系で除草剤許容性を付与することを示す(実施例8〜13)、天然テンサイProtox−1プロモーターの完全長のcDNAへの融合体が作成された。この融合体をCaMV35Sターミネーター配列を含むpUC18由来ベクターでクローン化してProtoxプロモーター/改変protox cDNA/ターミネーターカセットを作成した。このカセットを含むプラスミドをpWCo−3と命名した。
実施例33.天然テンサイProtox−1プロモーター/改変テンサイProtox−1融合体の発現による除草剤許容性植物の作成
アグロバクテリウム、プロトプラストおよび微粒子銃形質転換技術を含む、双子葉植物植物に適用可能な任意の形質転換方法を使用して、pWCo−3由来の発現カセットをテンサイに形質転換する。RNA−PCRによって改変protox−1酵素を発現するトランスジェニックテンサイを確認し、非形質転換テンサイにとり致死濃度のprotox阻害性除草剤に対する許容性について試験する。
セクションD 植物色素体中のProtox遺伝子発現
実施例34.色素体形質転換ベクター中のGUSレポーター遺伝子および色素体rps16遺伝子3’非翻訳配列と融合したタバコ色素体clpP遺伝子プロモーターおよび天然clpP 5’非翻訳配列を含むキメラ遺伝子の調製
I.タバコ色素体clpP遺伝子プロモーターおよび完全5’非翻訳RNA(5’UTR)の増幅
N.tabacum栽培品種「Xanthi NC」由来のDNA全体を、構成的に発現した色素体clpP遺伝子のATG開始コドンを基準として−197の位置に導入EcoRI制限部位を含む左から右への「トップストランド」プライマー(プライマーPclp_P1a:5’−gcggaattcatacttatttatcattagaaag−3’(配列番号:27);下線部はEco−RI制限部位)と、翻訳開始点に導入NcoI制限部位を組み込むclpPプロモーターのATG開始コドンを基準として−21から−1までの領域と相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー(プライマーPclp_P2b:5’−gcgccatggtaaatgaaagaaagaactaaa−3’(配列番号:28);下線部はNcoI制限部位)とによるPCRのテンプレートとして使用した。このPCR反応は、以下の製造者(パーキン・エルマー/Roche、ニュージャージー州ブランチバーグ)の推奨によりPfu熱安定DNAポリメラーゼ(Stratagene(カリフォルニア州ラ ホーヤ))を用いてパーキン・エルマーThermal Cycler 480中で行なった。95℃7分間後に95℃1分間/43℃2分間/72℃1分間を4サイクル、次いで95℃1分間/55℃2分間/72℃2分間を25サイクル。このプロモーターと、左末端のEcoRI部位および右末端のNcoI部位を含みN.tabacum色素体DNA配列のヌクレオチド74700〜74505に相当するclpP遺伝子の5’非翻訳領域を含む213塩基対の増幅産物(Shinozaki等,EMBO J.5:2043〜2049(1986年))を標準法を用いてゲル精製し、EcoRIおよびNcoIで消化した(制限酵素は全てNew Ingland Biolabs(マサチューセッツ州ベヴァリー)から購入した)。
II.タバコ色素体rps16遺伝子3’非翻訳RNA配列(3’UTR)の増幅
上記と同様に、N.tabacum栽培品種「Xanthi NC」由来のDNA全体を、リボソーム蛋白S16をコードする色素体rps16遺伝子のTAA停止コドン直後に導入XbaI制限部位を含む左から右へのトップストランドプライマー(プライマーrps16P_1a(5’GCGTCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG−3’(配列番号:30);下線部はXbaI制限部位)と、rps16 3’UTRの3’末端に導入HindIII制限部位を組み込むrps16のTAA停止コドンを基準として+134から+151までの領域と相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー(プライマーrps16P_1b(5’CGCAAGCTTCAATGGAAGCAATGATAA−3’(配列番号:31);下線部はHindIII制限部位)とによるPCRのテンプレートとして使用した。左末端のXbaI部位と右末端のHindIII部位を含みN.tabacum色素体DNA配列のヌクレオチド4943〜5093に相当する領域を含むrps16遺伝子の3’非翻訳領域を含む169塩基対の増幅産物(Shinozaki等、1986年)をゲル精製し、XbaIおよびHindIIIで消化した。
III.GUSリポーター遺伝子断片のclpP遺伝子プロモーターと5’および3’UTRとのライゲーション
ATG開始コドンのNcoI制限部位および天然3’UTRの後のXbaI部位を含む、プラスミドpRAJ275(Clontech)由来の1864塩基対のb−ガラクツロニダーゼ(GUS)リポーター遺伝子断片をNcoIおよびXbaIによる消化によって作成した。この断片を201塩基対のEcoRI/NcoI clpPプロモーター断片、157塩基対のXbaI/HindIII rps16 3’UTR断片およびクローニングベクターpGEM3Zf(−)(Promega、ウィスコンシン州マディソン)由来の3148塩基対のEcoRI/HindIII断片に4通りの反応でライゲートしてプラスミドpPH138を構築した。EcoRIとHindIIIでプラスミドpPRV111a(Zoubenko等、1994年)を消化し、得られた7287塩基対断片をpPH138の2222塩基対のEcoRI/HindIII断片にライゲートすることによって色素体形質転換ベクターpPH140を構築した。
実施例35.色素体形質転換ベクター中のレポーター遺伝子および色素体rps16遺伝子3’非翻訳配列と融合したタバコ色素体clpP遺伝子プロモーターとタバコ色素体psbA遺伝子最小5’GUS非翻訳配列のキメラ遺伝子の調製
タバコ色素体clpP遺伝子プロモーターおよび切断型5’非翻訳RNA(5’UTR)の増幅:上記と同様にしてN.tabacum栽培品種「Xanthi NC」由来のDNA全体を、左から右への「トップストランド」プライマーPclp_P1a(配列番号:27)と、ClpP5’UTRの位置−11に導入XbaI制限部位を組み込むclpPプロモーターのATG開始コドンを基準として−34から−11までの領域と相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー(プライマーPclP_Plb:5’−gcgtctagaaagaactaaatactatatttcac−3’(配列番号:29);下線部はXbaI制限部位)とによるPCRのテンプレートとして使用した。左末端のEcoRI部位と右末端のXbaI部位を含み、プロモーターおよびclpP遺伝子の切断型5’UTRを含む202塩基対の増幅産物をゲル精製し、XbaI消化した。このXbaI部位を、クレノウDNAポリメラーゼ(New Ingland Biolabs)でほぼ満たし、断片をEcoRI消化した。これを、タバコ色素体psbA遺伝子の5’UTRの最終の38ヌクレオチドおよびATG開始コドン(NcoI制限部位オーバーハング開始コドンをATGに導入)に相当する2本鎖DNA断片に5通りの反応でライゲートしてプラスミドpPH139を構築したが、この2本鎖DNA断片は、合成オリゴヌクレオチドminpsb_U(トップストランド:5’−gggagtccctgatgattaaataaaccaagattttac−3’(配列番号:32))およびminpsb_L(ボトムストランド:5’−catggtaaaatcttggtttatttaatcatcagggactccc−3’(配列番号:33)下線部はNcoI制限部位5’オーバーハング))、上記のNcoI/Xbal GUSリポーター遺伝子断片、上記のXbaI/HindIII rps16 3’UTR断片、および上記のEcoRI/HindIII pGEM3Zf(−)断片をアニーリングすることによって作成した。プラスミドpPRV111a(Zoubenko等,Nucleic Acids Res22:3819〜3824(1994年))をEcoRIおよびHindIIIで消化し、得られた生じる7287塩基対断片をpPH139の2251塩基対EcoRI/HindIII断片にライゲートすることによって色素体形質転換ベクターpPH144を構築した。
実施例36.タバコ色素体形質転換用のベクター中でアラビドプシス・タリアナProtox−1コード配列および色素体rps16遺伝子3’非翻訳配列と融合したタバコ色素体clpP遺伝子プロモーターおよび完全5’非翻訳配列を含むキメラ遺伝子の調製
アミノ末端の色素体輸送ペプチド、完全長のcDNAおよび3’非翻訳領域の一部をコードするプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ(「PROTOX」)遺伝子由来のcDNA配列を含むアラビドプシス・タリアナNotIインサートを保有するプラスミドAraC−2Met由来のMiniprepDNAを、成熟PROTOX蛋白コード配列の推定された開始点に導入されたNcoI制限部位および新しい開始コドンATG(プライマーAPRTXP1a:5’−GGGACCATGGATTGTGTGATTGTCGGCGGAGG−3’(配列番号:34);下線部はNcoI制限部位)を含む左から右への「トップストランド」プライマー(完全長の前駆体蛋白のATG開始コドンを基準として+172から+194のヌクレオチドと相同)とPROTOX前駆体蛋白の天然ATG開始コドンを基準として+917から+940のヌクレオチドに相同の右から左への「ボトムストランド」プライマー(プライマーAPRTXP1b:5’−CTCCGCTCTCCAGCTTAGTGATAC−3’(配列番号:35))とを使用する上記のPCRのテンプレートとして使用した。778塩基対の生成物をNcoIおよびSfuIで消化し、得られた682塩基対の断片をPROTOXコード配列の3’部分を含むAraC−2Metを含む844塩基対のSfuI/NotlDNA断片と、クローニングベクターpGEM5Zf(+)(Promega、ウィスコンシン州マディソン)の2978塩基対のNcoI/Notl断片にライゲートしてプラスミドpPH141を構築した。pPH141をNcoIおよびSspIにより消化し、完全なPROTOXコード配列を含む1491塩基対の断片を単離し、上記のrps16P_1aおよびrps16P_1bの各PCR産物をHindIIIで消化し、これらをpPH140の7436塩基対のNcoI/HindIII断片にライゲートすることによって、rps16 3’UTRにより276’854−耐性SV1−Met PROTOX遺伝子を制御するclpPプロモーターを含む色素体形質転換ベクターpPH143を構築した。
実施例37.タバコ色素体形質転換用のベクター中でアラビドプシス・タリアナProtox−1コード配列および色素体rps16遺伝子3’非翻訳配列と融合したタバコ色素体clpP遺伝子プロモーターおよびpsbA遺伝子最小5’非翻訳配列を含むキメラ遺伝子の調製
pPH141をNcoIおよびSspIにより消化し、完全なPROTOXコード配列を含む1491塩基対の断片を単離し、上記のrps16P_1aおよびrps16P_1bの各PCR産物をHindIIIで消化し、これらをpPH144の7465塩基対のNcoI/HindIII断片にライゲートすることによって、rps16 3’UTRにより276’854−耐性SV1−Met PROTOX遺伝子を制御するclpPプロモーター/psbA 5’のUTR融合体を含む色素体形質転換ベクターpPH145を構築した。
実施例38.タバコ色素体ゲノムのBiolistic形質転換
基本的に記載(Svab、Z.およびMaliga、P.(1993)PNAS 90、91〜917)の通り、Nicotiana tabacum栽培品種「Xanthi nc」の種子をT寒天培地の上に円形に配列し平板1枚当たり7個発芽させ、播種から12〜14日後にプラスミドpPH143およびpPH145由来のDNAで被覆した1μmのタングステン粒子(M10、Biorad、カリフォルニア州ヘラクレス)でボンバードした。ボンバードした実生をT培地上で2日間インキュベートした後、葉を切り出して背軸面を明光(350〜500μmol光子/m2/s)側にして500μg/mlスペクチノマイシンジヒドロクロリド(シグマ、ミズーリ州セントルイス)を含むRMOP培地(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.およびMaliga,P.(1990年)PNAS87,8526〜8530)の平板上に置いた。ボンバードから3〜8週間後に白くなった葉の真下に現われた耐性苗条を、同じ選択培地上にサブクローン化してカルスを形成させ、二次苗条を単離、サブクローン化した。標準的技術のサザンブロット法(Sambrook等,(1989年)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリング港)により、独立したサブクローン中の形質転換色素体ゲノムコピーの完全な分離(ホモプラスミシティー:homoplasmicity)を評価した。BamHI/EcoRI消化した全細胞DNA(Mettler,I.J.(1987年)Plsnt Mol Biol Reporter5,346〜349)を、1%トリス−ホウ酸塩(TBE)アガロースゲル上で単離し、ナイロン膜(Amersham)に移し、rps7/12色素体ターゲティング配列の一部を含むpC8由来の0.7kbのBamHI/HindIII DNA断片に相当するDNA配列を32P−標識した無作為プライミングDNA配列で探査した。ホモプラスミック(Homoplasmic)な苗条を、スペクチノマイシンを含むMS/IBA培地(McBride,K.E.等(1994年)PNAS91,7301〜7305)上で無菌的に根付かせ、温室へ移した。
本明細書に記載した発明の様々な修正は当業者には明白であろう。このような修正は添付した請求の範囲の中に含まれるものとする。
配列表
(1)一般情報:
(ii)発明の名称:植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするDNA分子およびその阻害物質耐性突然変異体
(iii)配列の数:35
(vii)前の出願のデーター:
(A)出願番号:US 60/012,705
(B)出願日:1996年2月28日
(vii)前の出願のデーター:
(A)出願番号:US 60/013,612
(B)出願日:1996年2月28日
(vii)前の出願のデーター:
(A)出願番号:US 60/020,003
(B)出願日:1996年6月21日
(2)配列番号:1:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1719塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Arabidopsis thaliana
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-2(NRRL B-21238)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)位置:31..1644
(D)他の情報:/product=”Arabidopsis protox-1”
(xi)配列の記載:配列番号:1:
(2)配列番号:2:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:537アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列数:2:
(2)配列番号:3
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1738塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイホセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Arabidopsis thaliana
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-1(NRRL B-21237)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)位置:70..1596
(D)他の情報:/product=”Arabidopsis protox-2”
(xi)配列の記載:配列番号:3:
(2)配列番号:4:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:508アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:4:
(2)配列番号:5:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1691塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Zea mays(maize)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-4(NRRL B-21260)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)位置:1..1443
(D)他の情報:/product=”Maize protox-1 cDNA”
(xi)配列の記載:配列番号:5:
(2)配列番号:6:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:481アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列数:6:
(2)配列番号:7:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2061塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Zea mays(maize)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-3(NRRL B-21259)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)位置:64..1698
(D)他の情報:/product=”Maize protox-2”
(xi)配列の記載:配列番号:7:
(2)配列番号:8:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:544アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:8:
(2)配列番号:9:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1811塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(vi)由来:
(A)生物:Triticum aestivum(wheat)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-13(NRRL B-21545)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)位置:3..1589
(D)他の情報:/product=”wheat protox-1”
(xi)配列の記載:配列番号:9:
(2)配列番号:10:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:528アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:10:
(2)配列番号:11:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1847塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(vi)由来:
(A)生物:大豆
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-12(NRRL B-21516)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)位置:55..1683
(D)他の情報:/product=”soybean protox-1”
(xi)配列の記載:配列番号:11:
(2)配列番号:12:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:543アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:12:
(2)配列番号:13:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:583塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:promoter
(B)位置:1..583
(D)他の情報:/function=”arabidopsis protox-1 promoter”
(xi)配列の記載:配列番号:13:
(2)配列番号:14:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:3848塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:promoter
(B)位置:1..3848
(D)他の情報:/function=”maize protox-1 promoter”
(xi)配列の記載:配列番号:14:
(2)配列番号:15:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1826塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Gossypium hirsutum(ワタ)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-15(NRRL B-21594)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:31..1647
(D)他の情報:/product=”Cotton protox-1 coding region”
(xi)配列の記載:配列番号:15:
(2)配列番号:16:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:539アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:無関係
(D)トポロジー:無関係
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:16:
(2)配列番号:17:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1910塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Beta vulgaris(Sugar Beet)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-16(NRRL B-21595N)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:1..1680
(D)他の情報:/product=”Sugar Beet Protox-1 coding region”
(xi)配列の記載:配列番号:17:
(2)配列番号:18:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:560アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:無関係
(D)トポロジー:無関係
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:18:
(2)配列番号:19:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1784塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Brassica napus(rape)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-17(NRRL B-21615)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:47..1654
(D)他の情報:/product=”Rape Protox-1 coding region”
(xi)配列の記載:配列番号:19:
(2)配列番号:20:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:536アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:無関係
(D)トポロジー:無関係
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:20:
(2)配列番号:21:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1224塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Oryza sative(イネ)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-18(NRRL B-21648)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:1..936
(D)他の情報:/product=”Rice Protox-1 partial coding region”
(xi)配列の記載:配列番号:21:
(2)配列番号:22:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:312アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:無関係
(D)トポロジー:無関係
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:22:
(2)配列番号:23:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1590塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Sorghum bicolor(モロコシ)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-19(NRRL B-21649)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:1..1320
(D)他の情報:/product=”Sorghum Protox-1 partial coding region”
(xi)配列の記載:配列番号:23:
(2)配列番号:24:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:440アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:無関係
(D)トポロジー:無関係
(ii)分子型:蛋白質
(xi)配列の記載:配列番号:24:
(2)配列番号:25:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”maize protox-1 intron sequence”
(xi)配列の記載:配列番号:25:
(2)配列番号:26:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2606塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)由来:
(A)生物:Beta vulgaris(テンサイ)
(vii)直接の由来:
(B)クローン:pWDC-20(NRRL B-21650)
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:1..6
(D)他の情報:/note=”SalI site”
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:complement(1..538)
(D)他の情報:/note=”3'-5'方向のテンサイprotox-1の部分cDNA”
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:539..2606
(D)他の情報:/note=”3'-5'方向のテンサイprotox-1のプロモーター領域(pWDC-20からサブクローニングされた〜3kb PstI-SalI断片の部分配列)”
(xi)配列の記載:配列番号:26:
(2)配列番号:27:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:31塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”PclP_P1a-プラスミドclpP遺伝子プロモータートップストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:4..9
(D)他の情報:/note=”EcoRI restriction site”
(xi)配列の記載:配列番号:27:
(2)配列番号:28:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”Pclp_P1b-プラスミドclpP遺伝子プロモーターボトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:4..9
(D)他の情報:/note=”XbaI restriction site”
(xi)配列の記載:配列番号:28:
(2)配列番号:29:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:30塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”Pclp_P2b-プラスミドclpP遺伝子プロモーターボトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:4..9
(D)他の情報:/note=”NcoI restriction site”
(xi)配列の記載:配列番号:29:
(2)配列番号:30:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:30塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”Trps16_P1a-プラスミドrps16遺伝子3'非翻訳領域XbaI/HindIIIトップストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:4..9
(D)他の情報:/note=”XbaI restriction site”
(xi)配列の記載:配列番号:30:
(2)配列番号:31:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:27塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”Trps16_p1b-プラスミドrps16遺伝子3'非翻訳領域XbaI/HindIIIボトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:4..9
(D)他の情報:/note=”HindIII restriction site”
(xi)配列の記載:配列番号:31:
(2)配列番号:32:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”minpsb_U-プラスミドpsbA遺伝子5'非翻訳領域38nt(blunt/NcoI)ATG開始コドン、トップストランドプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列の記載:配列番号:32:
(2)配列番号:33:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:40塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”minpsb_L-プラスミドpsbA遺伝子5'非翻訳領域38nt(blunt/NcoI)ATG開始コドン含有(ボトムストランドプライマー)”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列の記載:配列番号:33:
(2)配列番号:34:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”APRTXPla-変異Arabidopsis protox遺伝子の5'-部分を増幅するためのトップストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(ix)特徴:
(A)NAME/KEY:misc_feature
(B)位置:5..10
(D)他の情報:/note=”NcoI restriction site/ATG start codon”
(xi)配列の記載:配列番号:34:
(2)配列番号:35:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)DESCRIPTION:/desc=”APRTXP1b-変異Arabidopsis protox遺伝子の5'部分を増幅するためのドトムストランドPCRプライマー”
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列の記載:配列番号:35:
Claims (3)
- 修飾されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(protox)をコードする領域を含むDNA分子であって、未修飾のprotoxは配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する植物protoxであり、当該修飾は第1アミノ酸置換および第2アミノ酸置換からなり、
前記第1アミノ酸置換がprotox阻害物質に対する耐性を付与する特性を有し、
前記第2アミノ酸置換が前記第1アミノ酸置換により付与された前記耐性を増強する特性を有し、
前記第1アミノ酸置換が、配列番号:2のアミノ酸位置426位に対応する位置に存在するチロシンのメチオニンによる置換であり、そして
前記第2アミノ酸置換が、配列番号:2のアミノ酸位置305位に存在するセリンのロイシンによる置換である、
ことを特徴とするDNA分子。 - プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤に対して寛容であるか又は耐性である植物の製造方法において、
i.請求項1に記載のDNAにより植物材料を形質転換し、
ii.前記形質転換された植物材料を選択し、そして
iii.前記形質転換された植物材料を、形態的に正常な、繁殖可能な、全体植物体に再生する、
ことを含んで成る方法。 - 望ましくない植生の成長を抑制する方法であって、請求項2に記載の方法により得られた植物及び望ましくない植生に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害性除草剤を、前記不所望の植生の成長を抑制するのに適当な量で適用することを含んで成る方法。
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