PL187545B1 - Izolowana cząsteczka DNA zawierająca region kodujący zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox), sposób wytwarzania roślin, które są tolerancyjne lub oporne na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu oraz sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji - Google Patents

Abstract

Izolowana czasteczka DNA zawierajaca region kodujacy zmodyfikowana oksydaze protoporfirynogenu (protox), sposób wytwarzania roslin, które sa tolerancyjne lub oporne na herbicyd hamujacy oksydaze protoporfirynogenu oraz sposób kontrolowania wzrostu niepozadanej wegetacji PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka DNA zawierająca region kodujący zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox), sposób wytwarzania roślin, które są tolerancyjne lub oporne na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu oraz sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji.

Enzym oksydaza protoporfirynogenu, określany zwyczajowo jako enzym protox bierze udział w szlaku biosyntezy chlorofilu/hemu.

Szlaki biosyntezy, które prowadzą do produkcji chlorofilu i hemu mają szereg wspólnych etapów·'. Chlorofil jest barwnikiem absorbującym światło i jest obecny we wszystkich zielonych organizmach fotosyntetyzujących. Hem jest kofaktorem hemoglobiny, cytochromu, oksygenaz P450 o mieszanych funkcjach, peroksydaz i katalaz (p. np. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York (1975)) i jest niezbędnym składnikiem wszystkich organizmów tlenowych.

Ostatni wspólny etap w biosyntezie chlorofilu i hemu to utlenianie protoporfirynogenu IX do protoporfiryny IX. Oksydaza protoporfirynogenu jest enzymem, który katalizuje ten ostatni etap utleniania (Matringe i wsp., Biochem. J. 260:231(1989)).

Enzym protox został oczyszczony częściowo lub całkowicie z szeregu organizmów, w tym z drożdży Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois i Labbe, w Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.H. Daley, red. McGrawHill¹, New York str. 235-285(1990)), z etioplastów jęczmienia (Jacobs i Jacobs, Biochem. J. 244:219 (1987)) i z wątroby myszy (Daley i Ka.rr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Geny kodujące protox wyizolowano z dwóch organizmów prokariotycznych, Escherichia coli (Sasarman i wsp., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) i Bacillus subtilis (Dailey i wsp., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Geny wyizolowane z obu prokariotów nie mają podobnych sekwencji; także przewidywane produkty białkowe nie wykazują identyczności sekwencji aminokwasów. Białko E. coli ma masę około 21 kDa i asocjuje z błoną komórkową. Białko B. subtilis ma masę 5 l kDa jest rozpuszczalne i ma aktywność cytoplazmatyczną.

Geny kodujące protox zostały wyizolowane z organizmu człowieka (patrz Nishimura i wsp., J. Biol. Chem. 270 (14); 8076-8080 (1995) oraz z niektórych roślin (międzynarodowe zgłoszenie nr PCT/IB95/00452 dokonane 8.06.1995, publikacja WO 95/34659 z 21.12.1995).

Geny Protox są chętnie stosowane do wytwarzania roślin opornych lub tolerancyjnych na określone herbicydy.

Stosowanie herbicydów do kontrolowania niepożądanej roślinności takiej jak chwasty lub rośliny w plonach stał się praktyką nieomal uniwersalną. Odpowiedni rynek przekracza miliard dolarów rocznie. Mimo tego szerokiego stosowania, kontrola chwastów pozostaje znacznym i kosztownym problemem dla rolników.

Skuteczność stosowania herbicydów zależy od właściwego ich stosowania. Przykładowo: uzyskanie przy użyciu herbicydów dobrej kontroli nad chwastami zależy od czasu, rodzą4

187 545 ju i sposobu użycia herbicydu oraz od stadium rozwoju chwastu. Ponieważ niektóre gatunki chwastów są oporne na herbicydy, produkcja skutecznych herbicydów ma stale bardzo duże znaczenie.

Herbicydy, które wykazują dużą skuteczność i szerokie spektrum działania przeciw chwastom oraz szybką degradację w glebie często cechują się wysoką fitotoksycznością w stosunku do roślin uprawnych. Zaczęto więc wytwarzać takie rośliny uprawne, które są oporne lub tolerancyjne w stosunku do herbicydów. Hybrydy roślin uprawnych lub odmiany oporne na herbicydy pozwalają na stosowanie herbicydów bez ryzyka niszczenia plonów. Nadanie roślinie cechy oporności może pozwolić na stosowanie herbicydu w stosunku do roślin uprawnych, do których dotychczas stosowanie tego herbicydu, ze względu np. na wrażliwość plonu na herbicyd, było wykluczone lub ograniczone (np. ograniczone tylko do stosowania przed kiełkowaniem). Przykładowo: opis patentowy USA Nr 4 761 373 (Anderson i wsp.) ujawnia rośliny posiadają-opomość na herbicydy imidazolinowe lub sulfonamidowe. Oporność jest nadawana przez zmieniony enzym syntazę acetohydroksykwasów (AHAS). Opis patentowy USA Nr 4 975 374 (Goodman i wsp.) ujawnia komórki roślinne i rośliny zawierające gen kodujący zmutowaną syntetazę glutaminy (GS), oporne na hamowanie ich rozwoju przez herbicydy, które były znane jako inhibitory GS, np. fosfmotrycyny i sulfoksyminy metioniny. Z opisu patentowego USA Nr 5 013 659 (Bedbrook i wsp.) są znane rośliny, które wyrażają zmutowaną syntazę acetomleczanu, która czyni je opornymi na herbicydy sulfonylomocznikowe, a z opisu patentowego USA Nr 5 162 602 (Somers i wsp.) są znane rośliny tolerancyjne wobec herbicydów cykloheksanodionowych i herbicydów opartych na kwasie arylofenoksypropanowym. Tolerancję nadaje zmieniona karboksylaza acetylokoenzymu A (ACCaza).

Do wytwarzania roślin opornych lub tolerancyjnych na określone herbicydy stosowane są nie tylko geny kodujące protox, ale również bezpośrednio konkretne enzymy protoks.

Enzymy protox stanowią cel szeregu związków herbicydowych. Herbicydy, które hamują protox obejmują wiele różnych strukturalnych klas cząsteczek (Duke i wsp. Weed Sci. 39: 465 (1991; Nandihalli i wsp., Pesticide Biochem Physiol. 43: 193 (1992); Matringe i wsp., FEBS Lett. 245: 35 (1989), Yanase i Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989). Te herbicydy obejmują etery difenylowe (np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluoroetylo)fenoksy)2-nitrobenzoesowy, jego ester metylowy lub oksyfluorofen, 2-chloro-l-(3etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5(l-metyloetoksy)fenylo]-5(l,l-dimetyloetylo)l,3,4-oksadiazol-2(3T/)-on), cykliczne imidy (np. S23142, N-4(chloro-2)fluoro-5-propargiloksyfenylo-3,4,5,6, tetrahydroftalamid), chloroftalin, N(chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-etyl, etylo 2-[l-(2,3,4trichlorofenylo)-4-nitropyrazolylo-5-oksy)propionian; M&B 39279), pochodne pirydynowe np. LS 82-556) oraz fenopilan i jego analogi O-fenylopirolidonowe i piperydynokarbaminianowe. Wiele z tych związków, które kompetycyjnie hamują normalną reakcję katalizowaną przez enzym, wydaje się działać jako analogi substratu.

Efekt hamowania enzymu protox jest określany przez pomiar fluorescencji w około 622 do 635 nm, po wzbudzeniu w około 395 do 410 nm (p. np Jacobs i Jacobs, Enzyme 28:206 (1992); Sherman i wsp., Plant Physiol. 97:280 (1991)). Oznaczenie to jest oparte na fakcie, że protoporfiryna IX jest barwnikiem fluorescencyjnym a protoporfirynogen IX nie fluoryzuje.

Przewidywany sposób działania herbicydów hamujących protox obejmuje akumulację protoporfirynogenu IX w chloroplaście. Uważa się, że ta akumulacja doprowadza do wyciekania protoporfirynogenu L< do cytosolu, gdzie jest utleniana przez aktywność peroksydazy do protoporfiryny IX. Po ekspozycji na światło, protoporfiryna IX powoduje wytwarzanie singletowego tlenu w cytosolu. Ten singletowy tlen może z kolei doprowadzić do tworzenia innych czynnych postaci tlenu, co może powodować peroksydację lipidów i dysrupcję błon komórkowych, co doprowadza do szybkiej śmierci komórek (Lee i wsp., Plant Physiol. 102:881 (1993)).

Nie wszystkie enzymy protox są wrażliwe na herbicydy, które hamują roślinne enzymy protox. Herbicydy, które hamują roślinne enzymy protox nie hamują działania enzymów protox kodowanych przez geny wyizolowane z Escherichia coli (Sasarman i wsp., Can. J. Micro187 545 biol. 39: 1155 (1993)) i Bacillus subtilis (Dailey i wsp., J. Biol. Chem. 269: 813(1994)). Ujawniono też, że mutanty jednokomórkowego glona Chlamydomonas reinhardtii są oporne na herbicyd fenylimidowy S-23142 (Kataoka i wsp., J. Pesticide Sci. 15:449 (1990); Shibata i wsp., w Research in Photosynthesis, tom III, N. Murata, red., Kluwer: Holandia str. 567-570 (1992)). Przynajmniej jeden z tych mutantów wydaje się mieć zmienioną aktywność protox, która nadaje organizmowi nie tylko oporność na inhibitor herbicydowy, na którym selekcjonowano mutanta ale także na inne klasy inhibitorów protox (Oshio i wsp., Z. Naturforsch. 48c:339 (1993); Sato i wsp. w ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, red. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Opisano także zmutowaną linię komórkową tytoniu oporną na inhibitor S-21432 (Che i wsp., Z. Naturforsch. 48c:350 (1993).

Zgodnie z wynalazkiem izolowana cząsteczka DNA zawierająca region kodujący zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox), charakteryzuje się tym, że kodowany przez nią zmodyfikowany protox jest protoxem roślinnym mającym dwa podstawienia aminokwasów, z których pierwsze podstawienie aminokwasu nadaje mu cechę oporności na inhibitor protox, a drugie podstawienie aminokwasu powoduje wzmożenie nadanej oporności.

Protox roślinny, do którego, zgodnie z wynalazkiem, wprowadza się modyfikacje aminokwasów, jest wybrany z grupy enzymów protoks określonych sekwencjami aminokwasów SEKW. ID NR: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22 i 24 i pierwsze podstawienie aminokwasu występuje w nim w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje odpowiadające:

(a) alaninie w aminokwasie 164 SEKW. ID NR:6;

(b) glicynie w aminokwasie 165 SEKW. ID NR:6;

(c) tyrozynie w aminokwasie 370 SEKW. ID NR:6;

(d) cysteinie w aminokwasie 159 SEKW. ID NR:6;

(e) izoleucynie w aminokwasie 419 SEKW. ID NR:6.

(f) walinie w aminokwasie 356 SEKW. ID NR: 10;

(g) serynie w aminokwasie 421 SEKW. ID NR: 10;

(h) walinie w aminokwasie 502 SEKW. ID NR: 10;

(i) alaninie w aminokwasie 211 SEKW. ID NR: 10;

(j) glicynie w aminokwasie 212 SEKW. ID NR: 10;

(k) izoleucynie w aminokwasie 466 SEKW. ID NR: 10 (l) prolinie w aminokwasie 369 SEKW. ID NR:12;

(m) alaninie w aminokwasie 226 SEKW. ID NR: 12;

(n) tyrozynie w aminokwasie 432 SEKW. ID NR: 12;

(o) walinie w aminokwasie 517 SEKW. ID NR: 12;

(p) tyrozynie w aminokwasie 428 SEKW. ID NR: 16 (q) prolinie w aminokwasie 365 SEKW. ID NR: 16; oraz;

(r) tyrozynie w aminokwasie 449 SEKW. ID NR: 18.

a drugie podstawienie występuje w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje odpowiadające:

(i) serynie w aminokwasie 305 SEKW. ID NR:2;

(ii) treoninie w aminokwasie 249 SEKW. ID NR:2;

(iii) prolinie w aminokwasie 118 SEKW. ID NR:2;

(iv) asparaginie w aminokwasie 425 SEKW. ID NR:2; oraz (v) tyrozynie w aminokwasie 498 SEKW. ID NR:2.

Szczególnie korzystne są modyfikacje enzymu, w których pierwsze podstawienie aminokwasu występuje w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycję odpowiadającą:

(a) alaninie w aminokwasie 164 SEKW. Id nR: 6 oraz (b) tyrozynie w aminokwasie 370 SEKW. ID NR:6, a drugie podstawienie aminokwasu występuje w pozycji odpowiadającej serynie w aminokwasie 305 SEKW. ID NR:2, a zwłaszcza korzystną jest modyfikacja, w której pierwsze podstawienie aminokwasu dotyczy tyrozyny, występującej w pozycji odpowiadającej amino6

187 545 kwasowi 370 SEKW. ID NR: 6, a drugie podstawienie aminokwasu dotyczy seryny, występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 305 SEKW. ID NR:2.

W tej ostatniej modyfikacji tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 370 SEKW. ID NR:6 jest korzystnie zastąpina przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej cysteinę, izoleucynę, leucynę, treoninę, walinę i metioninę.

Również korzystne są modyfikacje, w któiych seryna odpowiadająca aminokwasowi 305 w SEKW. ID NR:2 jest zastąpiona przez leucynę, a tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 370 SEKW. ID NR:6. jest zastąpiona przez metioninę.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania roślin, które są tolerancyjne lub oporne na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, polega na tym, że transformuje się materiał roślinny izolowaną cząsteczką DNA według wynalazku i następnie ten stransformowany materiał selekcjonuje się, po czym regeneruje się transformowany materia! w morfologicznie normalne, płodne i zdrowe rośliny.

Zgodnie z wynalazkiem sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji polega na tym, że rośliny wytworzone sposobem według wynalazku traktuje się herbicydem hamującym oksydazę protoporfirynogenu, stosowanym w ilości wystarczającej do kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, zasadniczo bez oddziaływania na rośliny.

Roślinami w stosunku do których stosowanie rozwiązań według wynalazku jest korzystne, są rośliny wybrane z grupy złożonej z kukurydzy, pszenicy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu, sorgo i Arabidopsis, a szczególnie korzystnie rośliny wybrane z grupy złożonej z kukurydzy, pszenicy, soi, buraka cukrowego i Arabidopsis. Sekwencje DNA kodujące protox w tych roślinach i kodowane przez nie enzymy protox są wymienione w opisie listy sekwencji i wyszczególnione w załączonym wykazie sekwencji.

Cząsteczki DNA kodujące enzymy protoks pochodzące z dowolnego organizmu eukariotycznego mogą być otrzymane przez stosowanie znanych, standardowych metod.

Modyfikacje wprowadzone do sekwencji aminokwasowej enzymów oksydazy protoporfirynogenu, powodują, że organizmy zawierające takie zmodyfikowane enzymy są oporne na związki, które hamują niezmodyfikowane, naturalnie występujące enzymy roślinne protox. Cząsteczki DNA kodujące takie oporne na inhibitory enzymy roślinne protox są wprowadzane pod kontrolą odpowiedniego promotora, w postaci genów hybrydowych do określonych roślin. Wprowadzone do genomu rośliny zmodyfikowane geny eksprymująw roślinach oporne na inhibitory roślinne enzymy protox.

Geny te mogą być stosowane do nadawania oporności na herbicydy hamujące protox w całych roślinach i jako selekcj ono walne markery do transformacji roślin.

Wprowadzenie zmodyfikowanego genu powoduje, że rośliny, tkanki roślinne i nasiona roślin są oporne na inhibitory protox stosowane w ilościach, które normalnie hamowałyby naturalnie występującą w roślinach aktywność protox. Rośliny do których szczególnie cenne jest wprowadzanie zmodyfikowanych genów kodujących zmodyfikowane enzymy protox są to przede wszystkim rośliny ważne z punktu widzenia rolnictwa, a więc w szczególności kukurydza oraz zboża, takie jak jęczmień, pszenica, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i paszowe, proso i ryż, a także inne rośliny uprawne, między innymi takie jak trzcina cukrowa, soja, bawełna, burak cukrov/y, rzepak oleisty i tytoń.

Zmodyfikowane geny mogą być wprowadzane do materiału roślinnego, w celu otrzymania roślin opornych na herbicydy, wszelkimi znanymi technikami transformacji, w tym do tkanek roślinnych, protoplastów, komórek, kalusów i innych narządów, do nasion roślin, zarodków, do pyłku roślin oraz do dowolnego, innego materiału roślinnego pochodzącego np. z części roślin, takich jak kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie.

Rośliny oporne na herbicydy hamujące protoks mogą też być otrzymywane przez stosowanie technik selekcyjnych, gdzie linie oporne na herbicyd są izolowane, charakteryzowane i rozwijane, a także przez stosowanie Technologii transformacji plastydów, w przypadkach kiedy korzystne jest, aby geny protox byty wyrażane w chloroplaście rośliny.

Zmodyfikowane geny są stosowane jako sondy do wykrywania obecności genów kodujących oporne na inhibitor postacie roślinnego enzymu protox i do ilościowego określania poziomów opornych na inhibitor transkryptów protox w tkance roślinnej. Mogą być stosowa187 545 ne do identyfikowania lub badania przesiewowego roślin lub tkanki roślinnej zawierającej i/lub eksprymującej gen kodujący oporną na inhibitor formę roślinnego enzymu protox.

Izolowane eukariotyczne sekwencje protox mogą być stosowane do różnych celów i mogą być wprowadzane do roślin zgodnie ze standardowymi technikami inżynierii genetycznej. Na przykład cała sekwencja protox lub jej części mogą być zastosowane jako sondy zdolne do specyficznej hybrydyzacji do sekwencji kodujących protox i mRNA. Aby uzyskać specyficzną hybrydyzację w różnych warunkach takie sondy zawierają sekwencje, które są unikalne wśród sekwencji kodujących protox i korzystnie zawierają co najmniej 10 nukleotydów, a bardziej korzystnie co najmniej 20 nukleotydów. Takie sondy mogą być zastosowane do amplifikacji i analizy sekwencji kodujących protox z wybranego organizmu za pomocą dobrze znanego procesu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Technika ta może być użyteczna do izolowania dodatkowych sekwencji kodujących protox z pożądanego organizmu lub jako oznaczenie diagnostyczne aby określić obecność sekwencji kodujących protox w danym organizmie.

Czynniki, które wpływają na stabilność hybryd określają ostrość warunków hybrydyzacji. Jednym takim czynnikiem jest temperatura topnienia T_m, która może być łatwo obliczona według wzoru podanego w DNA PROBES, George H. Keller i Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd. 1993, Section one: Molecular hybridization Technology, str. 8 i dalsze.Temperatura hybrydyzacji leży w zakresie około 25°C poniżej wyliczonej temperatury topnienia T_m, a korzystnie w zakresie około 12-15°C poniżej wyliczonej temperatury topnienia T_m. W przypadku oligonukleotydów leży w zakresie około 5-10°C poniżej temperatury topnienia T_in.

Do roślin mogą być również korzystnie wprowadzane cząsteczki, które hybrydyzują do izolowanej cząsteczki DNA według wynalazku, przy czym bardziej korzystne jest stosowanie cząsteczek, które hybrydyzują do sondy oligonukleotydowej otrzymywanej z cząsteczki DNA zawierającej ciągły fragment sekwencji zmodyfikowanego enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) o długości przynajmniej 10 nukleotydów, w umiarkowanie ostrych warunkach.

Korzystne jest stosowanie w reakcji łańcuchowej polimeryzacji (PCR) sondy nukleotydowej zdolnej do specyficznej hybrydyzacji do roślinnego genu protox lub mRNA o długości przynajmniej 10 nukleotydów i stosowanie tych sond do wykrywania poszukiwanych sekwencji DNA w organizmach eukariotycznych.

Stosując standardowe techniki oparte na wybiórczej hybrydyzacji sondy do genomowych sekwencji protox można używać specyficznych sond hybrydyzacyjnych protox do mapowania położenia naturalnych eukariotycznych genów (lub genu) protox w genomie wybranego organizmu. Techniki te obejmują ale nie ograniczają się do identyfikacji polimorfizmów DNA określonych lub zawartych w sekwencji sondy protox, i użycia takich polimorfizmów do śledzenia segregacji genu protox w stosunku do innych markerów o znanej pozycji na mapie, w populacji wyznaczonej do mapowania, a pochodzącej z samozapylenia mieszańca z dwóch polimorficznych linii rodzicielskich [przykładowo: Helentjaris i wsp., Plant Mol. Biol. 5:109 (1985); Sommer i wsp. Biotechniques 12:1982 (1982); D' Ovidio i wsp., Plant Mol. Biol. 15:169 (1990)]. Wprawdzie każda eukariotyczna sekwencja protox może być stosowana jako użyteczna sonda do mapowania genów protox z dowolnego organizmu eukariotycznego, ale preferowanymi sondami są takie, które zawierają sekwencje protox pochodzące z organizmów blisko spokrewnionych z wybranym organizmem, a najbardziej preferowanymi sondami są te, które zawierają sekwencje protox pochodzące z badanego organizmu. Mapowanie genów protox jest szczególnie użyteczne w celach hodowli roślin. Na przykład poprzez znajomość pozycji na mapie genetycznej zmutowanego genu protox nadającego oporność na herbicyd można identyfikować flankujące markery DNA z referencyjnej mapy genetycznej (Helentjaris, Trends Genet. 3:217 (1987)). Podczas introgresji cechy oporności na herbicydy do nowej linii hodowlanej markery te mogą być wykorzystane do śledzenia zakresu DNA chromosomalnego flankującego protox, który jest jeszcze obecny w rekurencyjnym rodzicu, po każdej rundzie krzyżówek wstecznych.

187 545

Sondy do hybrydyzacji specyficzne dla Protox mogą być też stosowane do ilościowego określania zawartości mRNA protox w organizmie, przy użyciu takich standardowych technik jak analiza typu Northern. Ta technika może być stosowana dla wykrywania zmienionych poziomów ekspresji protox, w różnych oznaczeniach diagnostycznych, przykładowo w diagnozowaniu autosomalnej, dominującej choroby u ludzi, związanej zarazem z objawami neuropsychiatrycznymi jak i uszkodzeniami skóry, które są wywoływane obniżonymi poziomami aktywności protox (Brenner i Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765(1980)).

Wytwarzanie i izolowanie cząsteczek DNA zawierających fragment DNA kodujący białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) może mieć przebieg następujący:

a) przygotowuje się sondę nukleotydową zdolną do specyficznej hybrydyzacji do roślinnego genu protox lub mRNA, zawierającej ciągły fragment sekwencji kodującej białko protox rośliny o długości co najmniej 10 nukleotydów;

b) poszukuje się innych sekwencji kodujących protox w populacjach sklonowanych fragmentów genomowego DNA lub fragmentów cDNA z wybranego organizmu z zastosowaniem sondy nukleotydowej przygotowanej zgodnie z etapem (a); i

c) izoluje się i namnaża cząsteczki DNA zawierające fragment DNA kodujący białko mające aktywność enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Zasadniczo czyste cząsteczki DNA kodujące białka wykazujące aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) mogą być wytwarzane również inymi sposobami, przykładowo przez:

a) przygotowanie biblioteki genomowej lub cDNA z odpowiedniego organizmu wyjściowego stosując odpowiedni wektor do klonowania,

b) hybrydyzację biblioteki z cząsteczką sondy i następnie

c) określenie pozytywnych hybrydyzacji sondy do klonów DNA z biblioteki to znaczy klonów potencjalnie zawierających sekwencje odpowiadające sekwencji aminokwasów dla oksydazy protoporfirynogenu (protox);

albo też przez przygotowanie całkowitego DNA z biblioteki genomowej lub cDNA i zastosowanie tego DNA jako matrycy w reakcji PCR z primerami przedstawiającymi części o niskim stopniu degeneracji sekwencji aminokwasów oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Cząsteczki DNA zawierające fragment DNA kodujący białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) mogą być stosowane do określania inhibitorów aktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) w następujący sposób:

a) inkubowanie pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu;

b) pomiar niezahamowanej reaktywności oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (a);

c) inkubowanie pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej związek będący inhibitorem;

d) pomiar hamowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (c); i

e) porównanie hamowanej reaktywności do niehamowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Cząsteczki DNA zawierające fragment DNA kodujący białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) mogą być też stosowane do oznaczeń opornych na inhibitory mutantów oksydazy protoporfirynogenu (protox). Te oznaczenia można zrealizować przez:

a) inkubowanie pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej inhibitor enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox);

b) pomiar niezmutowanej reaktywności oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (a);

c) inkubowanie pierwszej próbki zmutowanego enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej związek będący inhibitorem oksydazy protoporfirynogenu (protox);

d) pomiar zmutowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (c); i

187 545

e) porównanie zmutowanej reaktywności do niezmutowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Dla wytworzenia zrekombinowanego enzymu w organizmie gospodarza, przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA, wprowadza się sekwencję kodującą protox do kasety ekspresyjnej zaprojektowanej dla wybranego gospodarza. Kasety ekspresyjne i wektory zrekombinowane do których te kasety się wprowadza zawierają zasadniczo promotor, ale w szczególności jest to promotor, który jest aktywny w roślinie i jest czynnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z organizmu roślinnego stosowanego zgodnie z wynalazkiem. Kaseta ekspresyjna może dodatkowo zawierać sekwencję sygnałową zdolną do kierowania wymienionego białka kodowanego przez wymienioną cząsteczkę DNA do chloroplastu lub mitochondriów, funkcjonalnie połączoną z wymienioną cząsteczką DNA.

Białko pochodzące z chloroplastów jest dalej oznaczane w opisie jako „protoks-1”, natomiast białko pochodzące z mitochondriów jest dalej oznaczane jako „protoks-2”.

Wybór specyficznych sekwencji regulatorowych takich jak promotor, sekwencja sygnałowa, sekwencje 5' i 3' nie ulegające translacji i enhancer jest w zakresie umiejętności osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Powstała cząsteczka zawierająca poszczególne elementy połączone w odpowiedniej ramce odczytu jest wprowadzana do wektora, który może być wtransformowany do komórki gospodarza. Odpowiednie wektory ekspresyjne i sposoby wytwarzania zrekombinowanych białek są dobrze znane dla organizmów gospodarzy takich jak E. coli (p. np. Studier i Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986); Brosius, DNA: 759 (1989)), drożdże (Schneider i Guarente, Meth. Enzymol 194: 373 (1991)), komórki owadów (Lucków i Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)), różne bakterie i komórki roślinne. Specyficzne przykłady obejmują plazmidy takie jak pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) i bakulowirusowe wektory ekspresyjne, np. pochodzące z genomu wirusa polihedruzy jądrowej Autographica califomica (AcMNPV). Korzystnym systemem bakulowirus/owad są komórki pVI11392/Sf21 (Invitrogen, La Jolla, CA).

Wytwarzany technikami rekombinacyjnymi eukariotyczny enzym protox jest pożyteczny dla różnych celów. Na przykład może być użyty do dostarczania aktywności protox in vitro. Może być też użyty do oznaczeń in vitro, w badaniach przesiewowych znanych związków herbicydowych, dla-sprawdzenia czy są one inhibitorami enzymu protox. Takie oznaczenie in vil.ro może też być stosowane, przy bardziej ogólnych badaniach przesiewowych, dla określenia związków chemicznych, które hamują aktywność protox i które są kandydatami na herbicydy. Wytwarzany technikami rekombinacyjnymi eukariotyczny protox może też być zastosowany w oznaczeniu do identyfikacji mutantów protox opornych na inhibitory (PCT/IB95/00452, publikacja WO 95/34659).

Alternatywnie, enzym protox wytwarzany technikami rekombinacyjnymi może być użyty do dalszych doświadczeń, w szczególności do jego asocjacji ze znanymi inhibitorami, aby w przyszłości móc w sposób racjonalny planować wytwarzanie nowych postaci enzymu protoks, hamujących i/lub tolerujących określone herbicydy.

OPIS LISTY SEKWENCJI

SEKW. ID NR:1: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l Arabidopsis thaliana.

SEKW. ID NR:2: Sekwencja aminokwasów protox-l Arabidopsis kodowana przez SEKW.ID NR:1.

SEKW. ID NR:3: Sekwencja DNA kodująca białko protox-2 Arabidopsis thaliana.

SEKW. ID NR:4: Sekwencja aminokwasów protox-2 Arabidopsis kodowana przez SEKW. ID NR:3.

SEKW. ID NR:5: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l kukurydzy.

SEKW. ID NR:6: Sekwencja aminokwasów protox-l kukurydzy kodowana przez SEKW. ID NR:5.

SEKW. ID NR:7: Sekwencja DNA kodująca białko protox-2 kukurydzy.

SEKW. ID NR:8: Sekwencja aminokwasów protox-2 kukurydzy kodowana przez SEKW. ID NR:7.

187 545

SEKW. ID NR:9: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l pszenicy.

SEKW. ID NR: 10: Sekwencja aminokwasów protox-1 pszenicy kodowana przez SEKW. ID NR:9.

SEKW. ID NR: 11: Sekwencja DNA kodująca białko proto\-1 soi.

SEKW. ID NR: 12: Sekwencja aminokwasów protox-1 soi kodowana przez SEKW. IDNR: 11.

SEKW. ID NR: 13: Sekwencja promotora genu protox-1 Arabidopsis thaliana.

SEKW. IDNR: 14: Sekwencja promotora genu protox-1 kukurydzy.

SEKW. ID NR: 15: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l bawełny.

SEKW. ID NR: 16: Sekwencja aminokwasów protox-1 bawełny kodowana przez SEKW. IDNR: 15.

SEKW. ID NR: 17: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l buraka cukrowego.

SEKW. ID NR: 18: Sekwencja aminokwasów protox-1 buraka cukrowego kodowana przez SEKW. ID NR: 17.

SEKW. ID NR: 19: Sekwencja DNA kodująca białko protox-1 rzepaku.

SEKW. ID NR:20: Sekwencja aminokwasów protox-1 rzepaku kodowana przez SEKW. IDNR: 19.

SEKW. ID NR:21: Sekwencja DNA kodująca białko protox-1 ryżu.

SEKW. ID NR:22: Sekwencja aminokwasów protox-1 ryżu kodowana przez SEKW. IDNR:21.

SEKW. ID NR:23: Sekwencja DNA kodująca białko protox-1 sorgo.

SEKW. ID NR:24: Sekwencja aminokwasów protox-1 sorgo kodowana przez SEKW. ID NR:24.

SEKW. ID NR:25: Sekwencja intronu protox-1 kukurydzy.

SEKW. ID NR:26: Sekwencja promotora protox-1 buraka cukrowego.

SEKW. ID NR:27: Primer PclpPla dla górnej nici promotora genu plastydowego clpP

SEKW. ID NR:28: Primer Pclp_Plb dla dolnej nici promotora genu plastydowego clpP

SEKW. ID NR:29: Primer Pclp_P2b dla górnej nici promotora genu plastydowego clpP

SEKW. ID NR:30: Primer Trpsl6_Pl a dla górnej nici genu plastydowego rpsló

SEKW. ID NR:31: Primer Trpsl6_Pla dla dolnej nici genu plastydowego rps 16

SEKW. ID NR:32: Primer minps_U dla górnej nici genu plastydowego psbA

SEKW. ID NR:33: Primer minpsb_U dla dolnej nici genu plastydowego psbA

SEKW. ID NR:34: Primer APRTXP1 a dla górnej nici

DEPOZYTY

Następujące cząsteczki wektorów zdeponowano w Agricultural Research Service, Patent Cuture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois USA, w podanych poniżej datach:

Protox 1a pszenicy w wektorze pBluescript SK zdeponowano 19 marca 1996 jako pWDC-13 (NRRL#B21545).

Protox-l soi w wektorze pBluescript SK zdeponowano 15 grudnia 1995 jako pWDC-12 (NRRL#B-21516).

Protox-l bawełny w wektorze pBluescript SK zdeponowano 1 lipca 1996 jako pWDC15 (NRRL#B-21594).

Protox -1 buraka cukrowego w wektorze pBluescript SK zdeponowano 29 lipca 1996 jako pWDC-16 (NRRL#B-21595N).

Protox-l rzepaku w wektorze pBluescript SK zdeponowano 23 sierpnia 1996 jako pWDC-17 (NRRL#B~21615).

Protox-1 ryżu w wektorze pBluescript SK zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pWDC18(NRRL#B-21648).

Protox-1 sorgo w wektorze pBluescript SK zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pWDC19 (NRRL#B-21649).

Opornego mutanta pAraC-2Cys w plazmidzie pMut-1 zdeponowano 14 listopada 1994 pod nazwą pWDC-7 w Agricultural Research Culture Collection i uzyskał nazwę depozytową

NRRL#21339N.

187 545

AraPTIPro zawierający promotor Protox-1 Arabidopsis zdeponowano 15 grudnia 1995 jako pWDC-11 (NRRL#B-^1515).

Plazmid zawierający promotor Protox-l kukurydzy w formie fuzji z resztą sekwencji kodującej Protox-1 kukurydzy zdeponowano 19 marca 1996 jako pWDC-14 (NRRL#B21546).

Plazmid zawierający promotor Protox-1 buraka cukrowego zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pWDC-20 (NRRL#B-21650).

Izolowana cząsteczka DNA według wynalazku może być wprowadzona do komórki roślinnej różnymi sposobami znanymi w dziedzinie. Wybór metody zależy od typu rośliny, poddawanej transformacji, przy czym metody stosowane w stosunku do roślin jednoliściennych mogą być inne niż stosowane do dwuliściennych.

Metody transformacji komórek roślinnych obejmują mikroinjekcję (Crossway i wsp., Bio Techniąues 4: 320-334 (1986)), elektroporację (Riggs i wsp., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606 (1986), przenoszenie, w którym pośredniczy Agrobacterium (Hinchee i wsp., Biotechnology 6:915-921 (1988), bezpośrednie przeniesienie genów (Paszkowski i wsp., EMBO J. 3:2717-2733 (1984)), balistyczne przyspieszenie cząsteczek stosując urządzenia dostępne od Agracetus, Inc. Madison, Wisconsin i Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (Sanford i wsp., opis patentowy USA 4 945 050 oraz McCabe i wsp., Biotechnology 6:923-926 (1988)) i metody transformacji/regeneracji protoplastów (opis patentowy USA Nr 5 350 689; Weissinger i wsp., Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Sanford i wsp., Particulate Science and Technology 5:27-27 (1987) (cebula); Christou i wsp., Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (soja); McCabe i wsp., Bio/Technology 6:923-926 (1988) (soja); Datta i wsp., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (ryż), Klein i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:43054309 (kukurydza); Klein i wsp., Bio/Technology 6:559-563 (1988) (kukurydza); Klein i wsp., Plant Physiol. 91:440-444 (kukurydza); Fromm i wsp., Bio/Technology 8:833-839 (1990); i Gordon-Kamm i wsp., Plant Celi 2: 603-618 (1990) (kukurydza).

Komórki roślinne lub rośliny transgeniczne stransformowane izolowaną cząsteczką DNA według wynalazku, są oporne albo przynajmniej tolerują herbicyd stosowany w ilościach, w których ten sam herbicyd hamuje naturalnie występującą aktywność protox w roślinie.

Wytworzona roślina transgeniczna może być rośliną dwuliścienną Iub jednoliśeienną. Rośliny jednoliścienne podatne na transformację pochodzą z rodziny Graminaceae i obejmują takie rośliny jak: Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale i Setaria, a w szczególności kukurydzę, pszenicę, owies, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i paszowe, proso i ryż.

Rośliny dwuliścienne poddawane transformacji są to przede wszystkim Arabidopsis, soja, bawełna, burak cukrowy, trzcina cukrowa, rzepak oleisty, tytoń i słonecznik, szczególnie często transformowane są soja, bawełna, tytoń, burak cukrowy i rzepak oleisty.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „potomstwo” dotyczy potomstwa roślin powstałego zarówno w sposób płciowy jak i bezpłciowy. Określenie to obejmuje również wszystkie mutanty i warianty otrzymywane za pomocą znanych procedur, na przykład fuzji komórek Iub selekcji mutantów, a które nadal wykazują charakterystyczne właściwości wyjściowej rośliny transformowanej. Pojęcia „ potomstwo” Iub „rośliny potomne” obejmują również rośliny powstałe w wyniku krzyżowania wstecznego, tak długo, jak długo zachowują cechę oporności na herbicyd.

Właściwości genetyczne wprowadzone do transgenicznych nasion i roślin opisanych powyżej są przekazywane poprzez rozmnażanie płciowe Iub wzrost wegetatywny i w ten sposób mogą być utrzymywane i są propagowane w roślinach potomnych. Utrzymywanie i propagacja korzystnych cech w roślinach potomnych może następować we wszystkich etapach produkcji roślin, jak uprawianie, sianie Iub zbieranie, a także przy stosowaniu takich specjalistycznych sposobów upraw, jak hydroponika Iub technologie szklarniowe, a także sposobów służących ochronie upraw. Sposoby służące ochronie upraw obejmują przykładowo mechaniczne sposoby usuwania chwastów i zakażonych roślin, a także stosowanie agrochemikaliów takich jak herbicydy, fungicydy, środki nicieniobójcze, regulatory wzrostu, środki powodujące dojrzewanie i insektycydy.

187 545

Wykorzystanie korzystnych właściwości genetycznych stransformowanych roślin i nasion może następować w hodowli roślin maj'ącej na celu opracowanie odmian roślin z takimi właściwościami jak: tolerancja szkodników, tolerancja herbicydów lub stresu, lepsza wartość odżywcza, większa wydajność, lub ulepszona struktura roślin powodująca mniejsze straty, wynikające np. z wylęgania lub rozrywania. W zależności od pożądanych właściwości roślin stosowane są oczywiście różne sposoby hodowlane, przy czym odpowiednie techniki są dobrze znane w dziedzinie. Obejmują one między innymi hybrydyzację, chów wsobny, krzyżowanie wsteczne, hodowlę wieloliniową mieszanie odmian, hybrydyzację międzygatunkową, technikę aneuploidów itp. Techniki hybrydyzacji obejmują sterylizację roślin, aby uzyskać rośliny męsko- lub żeńskosterylne, przy pomocy sposobów mechanicznych, chemicznych lub biochemicznych. Zapłodnienie krzyżowe rośliny męskosterylnej pyłkiem innej linii zapewnia, że genom męskosterylnej ale żeńskopłodnej rośliny uzyska jednorodnie właściwości obu linii rodzicielskich. Tak więc transgeniczne nasiona i rośliny mogą być stosowane do hodowli ulepszonych linii roślin, które na przykład zwiększają skuteczność konwencjonalnych metod takich jak stosowanie herbicydów lub pestycydów i lub pozwalają na nie stosowanie wymienionych metod ze względu na zmodyfikowane właściwości genetyczne. Alternatywnie, mogą być otrzymane nowe rośliny uprawne z ulepszoną tolerancją na stres, które, ze względu na zoptymalizowane genetyczne „wyposażenie”, będą stanowić produkt dający lepsze zbiory, niż produkty, które nie były zdolne do tolerancji porównywalnych, niesprzyjających warunków rozwoju.

Jakość kiełkowania i jednorodność nasion są najważniejszymi cechami produktu podczas produkcji nasion, ale nie są to najważniejsze cechy podczas zbierania ich i sprzedawania przez rolnika. W trakcie normalnej produkcji rolnej, bardzo jest trudno otrzymać nasiona roślin uprawnych wolne od nasion innych roślin uprawnych i chwastów i wolne od pasożytów i szkodników, przenoszących często choroby. Dlatego też zostały opracowane i dobrze określone ekstensywne metody produkcji nasion, które pozwalają na wytwarzanie nasion atestowanych, dobrze kondycjonowanych, czystych i prawidłowo kiełkujących. Do produkcji roślin są przez producentów roślin kupowane takie właśnie nasiona, spełniające specyficzne standardy jakości, nawet przez rolników posiadających nasiona zebrane z własnych plonów.

Materiał do propagacji znajdujący się w handlu, w tym nasiona, jest zwyczajowo traktowany ochronną wartwą zawierającą herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki bakteriobójcze, środki nicieniobójcze, środki mięczakobójcze lub ich mieszaniny. Zwyczajowo stosowane związki ochronne obejmują związki takie jak kaptan, karboksyn, tiram (TMTD®), metalaksyl (Apron®) i pirimifor-metyl (Actelic®). Jeśli jest to pożądane te związki są połączone w określone kompozycje z nośnikami, związkami powierzchniowymi lub adiuwantami sprzyjającymi nakładaniu warstw ochronnych, stanowiącymi ochronę przed szkodnikami bakteryjnymi, grzybowymi lub zwierzęcymi. Powłoki ochronne są nakładane przez impregnowanie materiału do namnażania płynną kompozycją lub przez powlekanie łącznie kompozycją płynną i suchą. Stosuje się także nakładanie powłok ochronnych na pąki lub owoce.

Poniżej podano przykład hodowli potomstwa z roślin stransformowanych cząsteczką według wynalazku: rośliny kukurydzy hoduje się w doniczkach w szklarni Iub bezpośrednio w glebie i pozwala się im zakwitniąć. Z dojrzałej kitki uzyskuje się pyłek i stosuje się go do zapylenia kłosu tej samej rośliny, roślin siostrzanych lub dowolnej pożądanej rośliny kukurydzy. Podobnie, kłosy rozwijające się na stransformowanej roślinie mogą być zapylone przez pyłek uzyskany z tej samej rośliny, rośliny siostrzanej lub dowolnej pożądanej rośliny kukurydzy. Transformowane potomstwo uzyskane za pomocą tej metody jest odróżniane od niestransformowanego potomstwa przez obecność wprowadzonego genu (genów) i/lub towarzyszącego DNA (genotyp), lub przez uzyskany fenotyp. Stransformowane potomstwo może być krzyżowane ze sobą Iub z innymi roślinami, jak normalnie czyni się z rośliną niosącą pożądaną cechę. W podobny sposób wytwarza się tytoń i inne rośliny.

Zmodyfikowane enzymy protox oporne na inhibitory zawierające cząsteczkę DNA według wynalazku posiadają co najmniej dwa podstawienia aminokwasu, addycję lub delecję, w stosunku do naturalnie występującego odpowiednika (tzn. postaci wrażliwych na inhibitor, które naturalnie występują w nie transformowanej roślinie. Te podstawienia aminokwasów

187 545 wprowadzane są albo bezpośrednio poprzez techniki rekombinacji DNA albo pośrednio poprzez hodowlę selekcyjną. Pozycje aminokwasów, które mogą być zmodyfikowane aby uzyskać oporną na inhibitor postać enzymu protox lub zwiększyć oporność na inhibitor są podane w sposób wytłuszczony w tabeli 1 dla roślinnych sekwencji protox-l z Arabidopsis, kukurydzy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu, sorgo i pszenicy. Ekwiwalentne zmiany mogą być wprowadzone do dowolnego genu protox mającego budowę dostatecznie podobną do pokazanych tu sekwencji enzymu protox, aby możliwe było porównanie i zidentyfikowanie tych aminokwasów, które są zmodyfikowane, dając oporne na inhibitor postacie enzymu. Takie ekwiwalentne roślinne geny protox mogą być uzyskane przy zastosowaniu standardowych technik (PCT/IB95/00452 zgłoszone 8 czerwca 1995, publikacja WO 95/34659 z 21 grudnia 1995).

Cząsteczki DNA kodujące sekwencje protox oporne na herbicydy mogą być poddane inżynierii genetycznej, aby uzyskać optymalną ekspresję w roślinie uprawnej. Może to obejmować zmianę sekwencji kodującej genu oporności dla optymalnej ekspresji w interesującej roślinie uprawnej. Sposoby modyfikowania sekwencji kodujących, aby uzyskać optymalną ekspresję w danym gatunku uprawnym są znane (patrz: Perlak i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:324 (1991); Kozieł i wsp., Bio/technol. 11:194(1993)).

Inżynieria genetyczna sekwencji kodującej protox dla optymalnej ekspresji może obejmować funkcjonalne powiązanie odpowiednich sekwencji regulatorowych (np. promotor, sekwencje sygnałowe, terminatory transkrypcji). Przykłady promotorów zdolnych do funkcjonowania w roślinach lub częściach roślin (np. zdolnych do sterowania ekspresją połączonych strukturalnych genów takich jak protox w komórkach roślinnych obejmują promotory wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) 19S lub 35S i podwójne promotory CaMV; promotory syntazy nopaliny, promotory białek związanych z patogenezą (PR), promotory małej podjednostki karboksylazy rybulozobisfosforanu (ssuRUBISCO), promotor białka szoku cieplnego z Brassica, ujawniony w EP-A 0 559 603 (promotor hsp80), promotor aktyny Arabidopsis i promotor SuperMas (WO/95/140980 i tym podobne. Korzystnymi promotorami są takie, które nadają wysoki poziom ekspresji konstytutywnej, a jeszcze bardziej korzystne takie, które nadają specyficzny wysoki poziom ekspresji konstytutywnej w tkance wrażliwej na niszczenie przez herbicyd. Korzystnymi promotorami są promotor aktyny ryżu (McElroy i wsp., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991), promotor ubikwityny kukurydzy (EP 0 342 926); Taylor i wsp., Plant Celi Rep., 12: 491 (1993) i promotor PR-1 z tytoniu, Arabidopsis lub kukurydzy (zgłoszenie patentowe EP-332 104 i zgłoszenie dokonane w USA nr 08/181,271, Ryals i wsp). Same promotory mogą być modyfikowane, aby manipulować mocą promotora lub zwiększyć ekspresję protox.

Korzystnym promotorem do stosowania z sekwencjami protox opornymi na inhibitor jest promotor związany z naturalnym genem protox. Sekwencja promotora z genu protox-l Arabidopsis jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 13, sekwencja promotora genu protox-l kukurydzy jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 14, i sekwencja promotora genu protox-l buraka cukrowego przedstawiona w SEKW. ID NR:26.

Ponieważ sam promotor protox jest odpowiedni dla ekspresji sekwencji kodujących protox-l opornych na inhibitor, ujawnione modyfikacje mogą być wprowadzone bezpośrednio do naturalnego genu protox, obecnego w genomie rośliny, bez konieczności konstrukcji genu hybrydowego z hetero logicznymi sekwencjami regulatorowymi. Takie modyfikacje mogą być przeprowadzone za pomocą technik mutagenezy ukierunkowanej, takich jak homologiczna rekombinacja i wybieranie powstałych fenotypów oporności na herbicyd (Paszkowski i wsp., EMBO J. 7:4021-4028(1988) oraz opis patentowy USA Nr 5 487 992, w szczególności kolumny 18-19 i przykład 8). Dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że oprócz naturalnego promotora protox, powstały zmodyfikowany gen będzie też zawierał każdy inny element regulatorowy taki jak sekwencje kodujące peptyd sygnałowy lub tranzytowy, które są częścią natywnego genu.

Peptydy sygnałowe lub tranzytowe mogą tworzyć fuzje z sekwencjami kodującymi protox w hybrydowych konstruktach DNA, aby kierować transportem wyrażanego enzymu protox do pożądanego miejsca działania. Przykłady peptydów sygnałowych obejmują peptydy

187 545 naturalnie połączone z białkami związanymi z patogenezą, np. PR-1, PR-2 i tym podobne [Payne i wsp., Plant Mol. Biol. 1189-94 (1988)]. Przykłady peptydów tranzytowych obejmują peptydy tranzytowe występujące w chloroplastach [Von Heijne i wsp., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991); Mazur i wsp., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst i wsp., Gene 65: 59 (1988)] oraz mitochondrialne peptydy tranzytowe [Boultry i wsp., Nature 328:340-342 (1987)]. Chloroplastowe i mitochondrialne peptydy tranzytowe uważa się za szczególnie korzystne, ponieważ naturalna aktywność protox występuje w mitochondriach i chloroplastach. Najkorzystniejsze są peptydy tranzytowe występujące w chloroplastach, ponieważ herbicydy hamujące protox w pierwszym rzędzie hamują aktywności protox właśnie w chloroplastach (Witkowski i Haling, Plant Physiol 87: 632(1988); Lehnen i wsp., Pestic. Biochem. Physiol. 37:329 (1990); Duke i wsp., Weed Sci. 39:465 (1991)). Istotne są też sekwencje, które powodują lokalizację kodowanego białka do różnych kompartymentów komórkowych takich jak wakuola [Neuhaus i wsp., Proc. Natl. Acad Sei. USA 88:10362-10366 (1991)) i Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53 (1991)].

Hybrydowe konstrukt(y) DNA mogą zawierać wielokrotne kopie promotora Iub wielokrotne kopie genów struktury protox. Dodatkowo, konstrukty te mogą zawierać kodujące sekwencje dla markerów i kodujące sekwencje dla innych peptydów takich jak peptydy sygnałowe lub tranzytowe, każdy we właściwej ramce odczytu w stosunku do innych funkcjonalnych elementów w cząsteczce DNA. Przygotowanie takich konstruktów jest w zakresie normalnego poziomu umiejętności w dziedzinie.

Użyteczne markery obejmują peptydy nadające oporność na herbicydy, antybiotyki lub leki, takie jak na przykład oporność na hygromycynę, kanamycynę, G418, gentamycynę, linkomycynę, metotreksat, glifosat, fosfotricynę lub tym podobne. Te markery mogą być użyte do selekcji komórek transformowanych hybrydowymi konstruktami DNA spośród niestransformowanych komórek. Innymi użytecznymi markerami są peptydowe enzymy, które mogą być łatwo wykryte za pomocą widzialnej reakcji, takiej jak na przykład reakcja barwna, na przykład lucyferazą, β-glukuronidaza lub β-galaktozydaza.

Sposób pozytywnej selekcji komórek stransformowanych genetycznie, do których może być włączona pożądana sekwencja nukleotydów dająca komórkom przewagę selekcyjną jest ujawniony w publikacji WO 94/20627.

Ekspresja plastydowa, w której geny są wprowadzane za pomocą homologicznej rekombinacji do kilku tysięcy kopii kolistego genomu chloroplastowego obecnego w każdej· komórce roślinnej ma tę ogromną zaletę w stosunku do wprowadzania genów do jądra komórki, że osiąga się znacznie wyższe poziomy ekspresji, które mogą przekroczyć nawet 10% całkowitego rozpuszczalnego białka rośliny. W dodatku ekspresja w plastydach jest pożądana, ponieważ cechy wyrażane w plastydach nie są przenoszone przez pyłek, a więc potencjalne niebezpieczeństwo mimowolnej ucieczki transgenu do dzikich krewnych roślin transgenicznych jest wykluczone. Technologia transformacji plastydów jest ujawniona w opisach patentowych USA Nr 5 451 513, Nr 5 545 817 i Nr 5 545 818, w publikacji WO 95/16783 i w publikacji McBride i wsp., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305 (1994). Technika transformacji chloroplastów tytoniu została opracowana i udoskonalona w laboratorium Dr Pal Maliga w Rutgers University (Piscattaway, New Jersey) i obejmuje bombardowanie cząsteczkami tkanki liści z regionami plastydowego DNA otaczającymi selekcj onowalny marker oporności na antybiotyk. Obszary flankujące 1 do 1,5 kb określone jako sekwencje naprowadzające, ułatwiają rekombinację homologiczną z genomem plastydu i w ten sposób pozwalają na zastępowanie lub modyfikację specyficznych obszarów plastomu 156 kb tytoniu. Początkowo stosowano mutacje punktowe w chloroplastowym 16S rRNA i genach rpsl2 nadające oporność na spektynomycynę i/lub streptomycynę jako markery do selekcji do transformacji [Svab, Z., Hajdukiewicz, P., i Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Staub, J.M. i Maliga, P (1992) Plant Celi 4:39-45], Otrzymano stabilne homoplazmatyczne transformanty z częstością około jednego na 100 bombardowań docelowych liści. Obecność miejsc klonowania między tymi markerami pozwoliła na stworzenie plastydowego wektora naprowadzającego dla wprowadzania obcych genów (Staub, J.M. i Maliga, P. EMBO J. 12:601-616 (1993)). Znaczny wzrost w częstości transformacji uzyskano przez zastąpienie

187 545 recesywnych genów rRNA lub białek r oporności na antybiotyki przez dominujący marker selekcyjny, gen bakteryjny aadA kodujący detoksykujący enzym adenylotransferazę 3' aminoglikozydową spektynomycyny (Svab Z. i Maliga P. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:913917). Uprzednio ten marker stosowano z powodzeniem dla transformacji o wysokiej częstości genomu plastydowego zielonego glona Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4083-4089)).

Gen hybrydowy zawierający roślinny promotor plastydowy funkcjonalnie połączony z izolowaną cząsteczką DNA, która albo koduje naturalny enzym protox albo zmodyfikowany enzym protox pszenicy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu lub sorgo ma korzystnie sekwencję 5' nie ulegającą translacji (5' UTR) z promotora plastydowego i sekwencję 3' nie ulegającą translacji (3' UTR) funkcjonalnie powiązaną z wyizolowaną cząsteczką DNA. Korzystnie 3' UTR jest nie ulegającą translacji 3' sekwencją genu plastydowego rpsló.

Gdy oporny na herbicyd allel protox jest uzyskany przez ukierunkowaną mutację natywnego genu w roślinie użytkowej lub hodowli komórek roślinnych, z których może być regenerowana roślina użytkowa, może być on przeniesiony do handlowych odmian dla uzyskania rośliny użytkowej, tolerującej herbicyd, przez stosowanie tradycyjnych technik hodowlanych, bez potrzeby stosowania inżynierii genetycznej. Alternatywnie, gen oporny na herbicyd może być izolowany, poddany inżynierii genetycznej dla optymalizacji ekspresji i następnie wtransformowany do pożądanej odmiany.

Geny kodujące zmieniony protox oporny na inhibitor protox mogą być stosowane jako markery selekcyjne w metodach transformacji komórek roślinnych. Na przykład rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transformowane transgenem mogą być także transformowane genem kodującym zmieniony protox zdolnym do ekspresji w roślinie. Te tak stransformowane komórki są przenoszone do pożywki zawierającej inhibitor protox, w której przeżywają tylko rośliny stransformowane.

Za szczególnie pożyteczne, jako czynniki selekcyjne, uważane są difenyloetery (np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorofen, 2-chloro-l-{3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(l-metyloetoksy)fenylo]-5-(l,l-dimetyloetylo)(l,3,4oksydiazol-2-(37/)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-proparglyloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloro ftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-etyl, 2-[l-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolylo-5-oksy] propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) i fenopilan i jego Ofenylopirolidono i piperydynokarbaminianowe analogi oraz dwucykliczne triazolony, ujawnione w publikacjach WO 92/04827 i EP 532 146.

Herbicydy/ które hamują protox obejmują wiele strukturalnych klas cząsteczek opisanych wcześniej, przy czym do herbicydów o szczególnym znaczeniu należą difenyloetery o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza -COONa (wzór II), -CONHSO2CH3 (wzór III) lub COOCH2COOC2H5 (wzór IV), ujawnione w publikacji Maigrot i wsp., Brighton Crop Protection Conference - Weeds: 47-51 (1989); difenyloetery określone wzorem IVa, ujawnione w publikacji Hayasji i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989); difenyloeter o wzorze IVb, o nazwie bifenoks, ujawniony w publikacji Dest i wsp., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973); następnie difenyloeter o wzorze IVc (oksyfluorofen), ujawniony w publikacji Yih i Swithenbank, J. Agric. Food Chem, 23:592 (1975) oraz difenyloeter o wzorze IVd, ujawniony jako laktofen w publikacji „The Pesticide Manual”, British Crop Protection Council, Surrey, (1994), pod red. C. Tomlinp, wydanie 10, str. 623.

Znaczenie ma też klasa herbicydów znanych jako imidy, o wzorze ogólnym V, gdzie Q jest wyrażone wzorami VI lub VII lub VIII lub IX lub IXa lub IXb (Hemper i wsp. (1995) w „Proceedings of the Eigth International Congress of Pesticide Chemistry”, Ragdale i wsp., Amer. Chem. Soc. Washington, D.C. str. 42-48 (1994); R| oznacza H, Cl lub F; R₂ oznacza Cl a R₃ jest optymalnie podstawionym eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową. Alternatywnie, R₂ i R₃ razem mogą tworzyć 5 lub 6 członowy pierścień heterocykliczny. Przykładem szczególnie interesujących imidowych herbicydów są związki o wzorze VIIa [wzór VIIa; flutiacetometyl, p. Miyazawa i wsp., Brighton Crop Protection Conference16

187 545

Weeds, str. 23-26 (1993)], związki o wzorze X (ujawnione jako związki o wzorze X, o nazwie sulfentrazon przez Van Saun i wsp. w Brighton Crop Protection Conference-Weeds, na str. 7782 (1991)), związki o wzorze XI oraz związki o wzorze XII (Miura i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str. 35-40 (1993)), a także związki o wzorach XIII, XIV, XV oraz XVI.

Aktywność chwastobójcza powyższych związków jest ujawniona w Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzory X i XVI), ProJeedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzory XII i XIII), opisie patentowym USA Nr 4 746 352 (Wzór XI) i w Abstracts of the Weed Science Society ofAmerica, t. 33, str. 9 (1993) (wzór XTV).

Szczególnie znaczenie mają też herbicydy, które są klasyfikowane jako arylouracyle i mają wzór ogólny XVII, w którym R oznacza grupę (C2-5-alkenyloksy-Cl-4-alkelową jak ujawniono w opisie patentowym USA nr 5 183 492 oraz ki^dycy o wzorze ogólnym XVIII przedstawiającym tiadiaziminę (Weller i wsp., Brighton Crop Protection Conference Weeds, str. 29-34 (1993)), oraz herbicydy o wzorze XIX przedstawiającym karfentrazon (Van Saun i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str. 19-22 (1993)).

N-podstawione pirazole są ujawnione w międzynarodowych publikacjach patentowych WO 94/08999, WO 93/10100 oraz w opisie patentowym USA nr 5 405 829 i są określone wzorem ogólnym XX, w którym R] jest C1-C4 alkilem, ewentualnie podstawionym przez jeden lub więcej atomów halogenu; R2 jest wodorem lub C1-C4 alkoksy, każdy z nich jest ewentualnie podstawiony przez jeden lub więcej atomów halogenu, lub

R1 i R2 są razem z grupą-(Cl Dn-K-. w której X jest związany przy R2,

R3 jest wodorem lub halogenem.

R4 jest wodorem lub C1-C4 alkilem,

R5 jest wodorem, nitro-, cyjano Iub grupą-COORó lub CONR7R i

R6 jest wodorem, C1-C6 alkilem, C2-C6 alkenylem lub C2-C6 alkinylem.

N-fenylopirazole, w szczególności nipyraklofen o wzorze XXI, są ujawnione w „The Pesticide Manuał” wyd. 9, CR Worthing, red. British Ceop Protection Council, Surmy, (1991)) na str. 621, a 3-podstawione-2-arelo-4.5,6.7-tetrahedroindazole w publikacji Lyga i wsp., „Pesticide Sci”. 4229-36 (1994)) (wzórXXIa, BAY 11340).

Znaczenie mają także fenylopirazole ujawnione w WO 96/01254 i WO 97/00246 (wzór XXII).

Poziomy herbicydu, które normalnie są hamujące dla aktywności protox obejmują dawki aplikacji znanych w dziedzinie i częściowo zależą od czynników zewnętrznych takich jak środowisko, czas i sposób nanoszenia. Na przykład w przypadku herbideJÓw imidowych reprezentowanych przez wzory V do IX a bardziej szczególnie reprezentowanych przez wzory X do XVII dawki stosowane wahają się od 0,0001 do 10 kg/ha, korzystnie od 0,005 do 2 kg/ha. Tempo dawkowania Iub stężenie herbicydu mogą być inne, w zależności od pożądanego działania i szczególnego związku, który był stosowany i mogą być określone w znany sposób.

Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej roślinności według wynalazku obejmuje traktowanie populacji roślin wybranych z grupy złożonej z Arabidopsis, trzciny cukrowej, soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku oleistego, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, traw darniowych i paszowych, prosa, pasz i ryżu i tym podobnych skuteczną ilością herbicydu hamującego protox. Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej roślinności, według wynalazku, jest korzystny zwłaszcza w stosunku do roślin wybranych z grupy złożonej z soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku oleistego, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta owsa, traw darniowych 1 ryżu skutecznej ilości herbicydu hamującego protox, a szczególnie korzystny do kontrolowania wzrostu niepożądanej roślinności w stosunku do roślin wybranych z grupy złożonej z Arabidopsis, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku oleistego, kukurydzy, pszenicy, sorgo i ryżu.

Przykłady

Zastosowane standardowe techniki klonowania i rekombinacji DNA są dobrze znane i opisane przez T. Maniatis, E.F.Fritsch i J.Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory Manual,

187 545

Cold Spring Harbor llaboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) i przez T.J.Silhavy, M.LBerman, i LW.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1994).

Dział A: Izolowanie i charakterystyka genów roślinnej oksydazy protoporfirynogenu (Protox)

Przykład 1. Izolowanie cDNA Protox-1 z pszenicy na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy-.

Całkowite RNA wyizolowane z Triticucum aestivum (cv Kanzler) zostało przekazane firmie Clontech do konstrukcji biblioteki cDNA na wektorze Lambda Uni-Zap. Około 50.000 pfu (jednostki tworzące łysinki) cDNA z biblioteki zostało wysiane z gęstością około 5.000 pfu na 10 cm szalkę Petriego i wykonano kopię na filtrze nitrocelulozowym. Łysinki były hybrydyzowane z sondą cDNA Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR 5; patrz przykład 2 międzynarodowego zgłoszenia patentowego numer PCT/IB95/00452, złożonego 8 czerwca 1995, opublikowanego 21 grudnia 1995 jako WO 95/34659) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1%o SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984),włączony tu w całości w formie odniesienia). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy cDNA Protox-1 pszenicy uzyskany w czasie pierwszych prób przeszukiwania banku nazwany „Protox-1 pszenicy” miał długość 1489bp. Protox-1 pszenicy nie posiada sekwencji kodującej dla peptydu liderowego i około 126 aminokwasów dojrzałej sekwencji kodującej opartej na porównaniu z innymi znanymi roślinnymi sekwencjami białek protox.

W celu uzyskania dłuższego cDNA protox z pszenicy nowa biblioteka cDNA Triticum aestivum (cv Kanzler) została wykonana na miejscu przy użyciu wektora lambda Uni-Zap. Około 200.000 pfu biblioteki cDNA przeszukano jak wyżej oprócz tego, że jako sondy użyto cDNA Protox-l pszenicy, a hybrydyzację i płukania przeprowadzano w temperaturze 65°C a nie 50°C. Najdłuższy cDNA pszenicy uzyskany z tego przeszukiwania, nazwany „Protox-la pszenicy” miał 181 lbp długości. Sekwencja nukleotydową tego cDNA i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 9 i 10. W oparciu o porównanie z innymi znanymi sekwencjami białek protox u roślin i odpowiednimi sekwencjami genomowymi, to cDNA jest albo pełnej długości albo brakuje mu jedynie kilku kodonów peptydu liderowego (tabela 1). Ta sekwencja białka pszenicy jest w 91% identyczna (podobna w 95%) do sekwencji białka Protox 1 kukurydzy.

Protox-la pszenicy na wektorze pBluescript SK został zdeponowany 19 marca 1996 roku jako pWDC-13 (NRRL #B-21545).

Przykład 2. Izolowanie cDNA Protox-l z soi na podstawie homologii do sekwencji kodującej Proto.x-1 u Arabidopsis.

W firmie Stratagene zakupiono bibliotekę cDNA soi (v Williams 82, epikotyl) na wektorze Lambda Uni-Zap. Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szkle Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR 1; patrz przykład 1 międzyn. zgłoszenia patentowego nr PCT/IB95/00452, złożonego 8 czerwca 1995, opublikowanego 21 grudnia 1995 jako WO 95/34659) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cDNA soi nazwany „Protox-l soi” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-1 soi ma 1847 bp długości i koduje białko o wielkości 58,8 kDa. Sekwencja nukleotydową tego cDNA i sekwencja aminokwa18

187 545 sowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio Nr 11 i 12. Białko soi jest w 78% identyczne (w 87% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis.

Protox-1 soi na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 15 grudnia 1995r. jako pWDC-12 (NRRL#B-21516).

Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów odpowiednich białek kodowanych przez sekwencje przedstawione jako SEKW. ID nr: 2, 6, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23 zamieszczono poniżej w tabeli 1. Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów odpowiednich białek kodowanych przez sekwencje przedstawione jako SEKW. ID nr 4 i 8 zamieszczono poniżej w tabeli 2.

Tabela 1

Porównanie sekwencji aminokwasowych białka Protox-1 z Arabidopsis („Arabpt-1”; SEKW. ID nr 2), kukurydzy („Mzpt-1”; SEKW. ID nr 6), pszenicy („Wtpt-1”; SEKW. ID nr 10), soi („Soybeanpt-1”; SEKW. ID nr 12), bawełny („Cottonpt-1”; SEKW. ID nr 16), buraka cukrowego („Sugpt-1”; SEKW. ID nr 18), rzepaku („Rapept-1”; SEKW. ID nr 20), ryżu („Ricept-1”; SEKW. ID nr 22), sorgo („sorghumpt-1”; SEKW. ID nr 24)

Porównanie wykonano przy użyciu programu PileUp (pakiet GCG, Uniwersytet Wisconsin, Madison, WI). Pozycje, które mogą podlegać modyfikacji, zgodnie z zamieszczonymi tutaj założeniami, w celu nadania lub zahamowania oporności na inhibitor zaznaczono grubą czcionką.

Rapept-1 ..........

Arabpt-1 ..........

Sorghurnpt-l..........

Mzpt-1 ..........

wtpt-1 ..........

Ricept-1 ..........

Cottonpt-1 ..........

Soybeanpt-1........MG

Sugpt-1 MK1MALSNCI

	MDLSLLRP.. MElSITRPTr	QPFLSPFSNP QSLLPSFSKP	FPRSRPYKPL NŁKUWYKPL
	.........M	AIATVAAASP	LROWTOIPH
......MIAŁ	IDLSLIRSSP	SVSPFSIPHH	QHPPRFRKPF
SVFNEILFPP	NOILLRPSŁH	SPTSFFTSPT	RKFPRSRENP
ΡζΖΓΟΟΜΡΙΡε	SGHYRGNCIM	LSIPCSLIGR	RGYYSHKKRR

Rapept-1 NLRCSVSGGS Arabpt-1 RIRCSGAGGP

Sorghumpt-1 ..........

WGSSTIEGG	GGGKTVTAEC	VIVGGGISGL	100 CIAQALVIKH
WGSSKIEGG	GGT.TITTCC	VIVGGGISGL	CIAQALAIKH

187 545

Mpt-1....................	........DC	WGGEISGL	CTAQALAIRH
Wtpt-1 RVRFRGAIA3 SAEETPAAPG	GG.. .SAEC	WGASISGL	CTA2ALATRY
Ricept-1.......... ..........
Cottonpt-1 KLRCSLAEGP T1EŚWED.VGI	ESS.. .ADC	VIVGGGISGL	CIA2AIATKH
RoyGbeanGG ILRCSIAEES TAS/P'//:..	DSA.. EVDC	WVGGGVSGL	CIAQAIAIKH
Sugot-1 MSMSCSTSSG SKSATKEAGS	GSOGGLŁDC	WGGGISGL	CEQADCTKH

101	150
Rappt-1 PDA. .AKNVM	VTE2KERVGG	NIIT..REEQ	GELWEGPNS	fQPSDEMLIM
Arabpt-1 PER. .APNLI	VTEAEDRVGG	NIIT..HEN	GFIWEEGENS	rQRDVVIL:ITV
Sorghiupt—l..........		. .STVEREEE	GYUWEGHNS	PDRdDFLMI
Mzpt-1 . .G. .VGVL	VTEARSRPGG
NITTYERPEE	GYLWEEGPNS
Wpt-1 . .G. .VSDLL	VTEARDRPGG	NnTYERPDE	GYDaKEGPNS	EQPSDFVLM
Ricept-1 ..........
O)tto:npt-1 RDV. .ASNVI	VTEARERVGG		GYLWEEGENS	F2fSDPPILM
NITTV3R .D
Vo'yxe!npr-'l· . .A. .NANW Su.<£>t-1 SSSSLSH^T	VTEARDRVGG	NIT MER. .D	GYTWEEGPN.S	PQPSDMLIM FQPSEAVLIM
VTEAKDRVGG	NUWE .AD	GYIWEEGENS
151				200
Rap^E^tt-1 WDSGLKDDL	VLGDPTA?RF	VLWNGKRPV	PSKLIDLPFF’	DIMSIGGKIR
Arabpt-1 WDSGLKDDL	VLGDPEARF	VLWNGLRPV	PSKLTDLPFF	DIMSIGGKIR
Corynum. p-1 ATDSGŁKDDL	VEGDPNARF	REWKRÓRW	PSKEADLHFF	DIMSIPGKLR
Mpt-1 AVDSGLKDDL	VEGDPNARF	VLWEGKLREV	PSKEADLFF	DIMSIBGKER
Wtpt-1 AVDSGLKDDL R.cept--1..........	VEGDENAPF	VUVnERr,RPV	PSKEGDLPEF	SL^IPGKLR
Gattonpt-1 AVDSGLKDDL	VLGDENWF	VLWEGKLRPV	PSKPTDLPFF	DIMSIIGKLR
Soybe=an?t-1 WDSG3KDEL	VDGDPWRF	VMJRKLRPV	PGKLCDLPFF	DIMSIGGKIR
Sucgpt-1 AVDSGtKEEL	VLGDENPRF	VLWNDKRPV	PSSLTDLEFF	DIMTIP0GR
201				250
^¢^-1 AGPSAIGIRP	SPPGREESVE	EEVRBNEGDE	VFERLIEPFC	SGVYA3DPAK
Arabpt-1 AGE33LGIRP Sarghiuipt-1 AGLGAGRP	SPPGREESVE	EiYRRNLGDE	VFFRT .TF.PFC	SGVYAGDPSK
PAPGREESVE	EFVFRNLGAE	VFEKLLEPFG	SGVYAGDPSK

187 545

Mpt-1 AGLGALGIRP	PPPGREESVE	EFYRRNLGAE	VFERIIEPPCO	SGVYAGDPSK
Wpt-1 AGD3YLGRP	PPPGREESYE	PEYRRNlGAP	VFIERLTEPEC.	SGVYAGDPSK
Ricept-1 ..........
Cottonpt-1 AGETYLIRP	PPPGYEESW	EFVRRNLGAE	YFERFIEPFC	SGVYAGDPSK
So^bearpt-1 AGEGAL1IRP	PE^EGHEESYE	PEVRRNLGDP	WERL,IEPEI.	SGVYAGDPSK
Sucpt-1 AALGALGFRP	SPPEHEESWE	HFVRRNLGDE	VFERT .TEPET.	SGVYAA3DPSK
251				300
Ra.jppt-1 LSMKAAEGKV	WKHFNGSI	IGGAFKAIQA	KNKAKTTRD	PRLEKPKGOI
AraŁpt-1 LSMKAFGKV	WLEOSCGSI	I^OGTIKALCE	RKNAPKAERD	PRLEKPQ3QT
Sorghiunpt-1 LMKAAEGKV	WRTJKFAGGST	I^GGnKTI^QE	RGKNEKPPRD	ERLEKEKCCT
Mpt-1 LSMKAAFGKV	WRLEETGG3I	IGGTIKTIęE	RSKNPKPPRD	ARLFKPaGęT
Wpt-1 LSMKA\FGKV	WRIEEIGGSI	IGGTHKAIQD	KGKNPKPPRD	PRLPAEKGOT
Ricept-1 RALKAAEGKV	WRLEDTGGSI	IGGUKUOE	RGKNPKPPRD	PRIPI'PKGQI
(cDttonpt-1 LSMKAAFGRV	WKLEFIGGSI	IGGTEKTIQa	RNKTEKPPRD	ERIPKEKGGT
ooyfx.arnK.t-l· ISMKAA:GKV	WKIΞKXGGl·l·l	I^GGTEKA[QE	RNGAKPERD	PRLPKPKGOT
Su<g?t-1 LSMKAFGKV	WKUEJ3GG5I	TGGTLKAIail·	RGSNPKPERD	ORLEKEKSCT
301				350
ΛΟΧΟ a-l· VGSERRGLTM	LPEAISARLG	DKVKV SWKjS	SUKIASCEY	SLIYETPP3I
ArObpt-1 VGSERKGLFM	LPEAISRDG	SKVKLSWKLS	GniiEs-Ga	NLIYPIEDGL
Sorgbiuript-1 VASFRKGLAM	LPNAZTSSLG	SKVKLWKJL'	SMTKSEGCGY	VLPXEIEPGV
Mpt-1 VASFRKGLTM	LENAETSELG	SKVKLSWKLT	SIKSDDKGY	VLPYPIPEGV
Wtpt-1 VASFRKGLTM	LPNALASRLG	SKVKLSWKLT	SUKALNOGY	VLGYEIPPGL
Ricept-1 YASERKGCM	LPDATSRLG	SKyKLSWEKLT	SHOSENKEY	ALWETPEGY
Cottonpt-1 VGSFRKGLrM	LEEAIANSLG	SNVKLSWKLS	SUKIONGGY	NLIPPIEEGM
Soarac-aaK-l· VGSFRKGLTM	LPDAISARIG	NEWKLWKS	SliKLASGEY	SŁIΎPIEPGV
Srigot-1 VGSERKGLVM	LETAI£ARLG	SEWKLSWZLS	SrKDSJGEY	SLTYDIPDGL
351				400
a'ąpa:L-l· VTVQsKsWM	TVPSHVA3SL	IRPISDSAAE	ALSKLYYPPV	AA^SISYSKE
ArOb?tt-1 VSVQSKSWM	TVPSHVASGL	LRELSEiAAN	ALSKLYYPPV	azAaoiSYFKE
Sorghurpt-1 VLVQSKSVIM	TIISYVASDI	IRELSGDAAD	VLSRFYYPPV	AAVTVSYPKE

187 545

Mzpt-1 LSVQAKSLIM Wpt-l LSVQAKSLIM

Gicept-1 VSVęAKTLLM COttonpt-l VSLQSRSWM Soyfeanpt-l LSLQEKTWL Sucg?t-1 VSLGTKSWM fóępsptArabptSorghuirptM^pl

WtptRiCepttCottonptSoYoeanptSuęgptGapsptArabptSorghumptMptWtptRiceptCottonptSoyybeanp; Si u g p.

401

-1 AlGSżEELIEG

-1 AIGTYRLTDG

-1 AIRKEELIDG

-1 AUKEeLLDG

-1 arkeelidg airkeelidg

-i arkeettpg

-1 airseelldg

-1 airseelng

451

-1 yiggaentgi

-1 YIGGSTNTGI

-1 yiggaentgi

-1 yiggatntgi

-1 yiggstntgi

-i yiggstntgi

-1 ykesyentgi

-1 yiggatntgi

-1 yiggaknpgi

501

Rqpept-1 PQETIGHIDL Arabpt-1 PQFLV<GHFDI

Sorghum^|t-1 EQFLLGHLDL

TIKYVASNI	LRELSSDAAD	ALSGFYYPPV	aaltlsypke
TRRRRYTY	LRELSIDAAD	alskfyyppl	aavtvsypke
TIPSYLASDI	LRELSSDAAD	ALSIEYYPPV	aaltlsypke
TIPSHLASNL	LHELSAAAAD	alsqfyyppl	asltlsyeke
TIPSYLASTL	LRPLSAAAAD	alskfyyppl	aavsisyeke
TLPSYLASGL	LRELSDSAAD	slskfyyppl	aalslsyeke
			450
elkgegolhp	RięKYYTYGT	1YSSELFPNG	apeggllltn
etkgegothp	RTQGVETLGT	lYSSSLFENG	appgbtttln
ELQGEGQLHP	RSQGVETLGT	lYSSSLFHNG	apagrltttn
ELQGEGQLHP	GSQGVETLGT	1YSSSLFTNG	apdggllltn
ELQGEGQLHP	RSQGVETLGT	IYSSSLFENG	apagglllln
ELGGEG2LHP	RSQGVETLGT	lYYSY^HSA	apaggllln
etkgegolhp	RSCGETLGT	lYSSSLFHNG	apsggllltn
elkgegqlhp	RSQGVETLGT	lYSSSLFHSlG	APEGGLTTLN
ELQGFGQLHP	RSQGVETLGT	1YSSSLFPGR	appggil.il s
			500
lsksegelve	aldgdlgkml	1KESSTD)PLV	lglglwlqpq
LSKSEGeLLE	avegdlgkml	ikenstdelk	lglglwpqat
lsktesetle	AVTM3RKML	:NFTALDELV	lglglwfqai
lsktfsfttlf	ayjdlrkml	NRYA/DpL/	lglglw?qal
vsktesdllg	avegdlgkml	1NEGMDELA	lglglweqai
lskteselle	avdrdlrkml	HEGALDELL	lglglwpqae
tsktegetve	avegdlgkml	INPNAKDELV	lglglweka:
lskteselle	tldlrkel	1NHNAQDPFV	lglglwsai
lnfskdelak	wdkdiprml	inpdaklpgv	lglglweqai
			550
vdmkaslss	aghegledgg	nyvagvalgg	eleoayet^i
ldiaksslts	sgyeglftgg	nylaglalgg	elegayeta:
lemksaleq	ggynglelgg	nylaglalgg	eiegayesaa

187 545

Mpt-1 PQFLVGHLDL	LEAAKAALDR	GGYEGIFLGG	NYVAGVALGR	CYEG^YESAS
Wtpt-1 PQFLKH[LDR	LAAAKSALGQ	GGYDGLELGG	KYVAGVALGR	CIEG^iES^^
R.cept-1 PQELIGHLEH	LEAAKSALGK	GGYDGLELGG	NYVAGVALGR	CVLGAYLSAS
Cottonpt-1 PQELVGHLDL	LDSAKMALRD	EGEEGŁEL-GG	NYVSGVALGR	CVEG\YEVAA
ŚYoĄb.eanY.-l PQFLVOLDL	IDYAKASIRN	TGEEGLEDGC	NYVSGALGR	CVLGAYEVAA
Su.^t-1 pqf'3:yhful	EDAAKAALTD	IG^GU/ICG	NYVSGVALGR	CIEGAYESAA
551	563
Ręppt-1 QVNDEMSCYA	YK*
ArrObpt-1 EVNNEMEY	YK*
SorghurpP-1 QIYDELTKYA	YK*
Mzpt-1 QISDFLTKYA	YK*
Wtpt-1 QVSDFLTKYA	YK*
RLcept-1 QRDYYTKYA	YK*
Cottonpt-1 EVKEELSQYA	YK*
soy:earpi--1 EVNDFLTNEV	YK*
SiugP-1 EWDELSQYS	DK*

Tabela 2

Porównanie sekwencji aminokwasowych białek Protox-2 z Arabidopsis i kukurydzy.

Takie same reszty są oznaczone przez pionową linię między dwoma sekwencjami. Porównanie wykonano używając programu GAP opisanego przez Devaraux i wsp., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984).

Procent podobieństwa: 75,889 Procent identyczności: 57,905

Protox-2.Pep x Mzprotox-2.Pep

1............................MASGAYAD . HQIEAVSGKRVAV 21

MLA1TASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAYLAMAGSDDPRAAPARSYAY 50

VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNYTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71

187 545

VGAGVSGLAAAYRLRQSGVWTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 100

MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121 111:1 1.:.1:11111.:111:1 | | | | | | | | | | | | | .

101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150

122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK. . . .KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167 llllll. II:· :::1111:11 ·|:|Ι|:. -111:-1 dl I I-I

151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200

168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217

I I I I : : I I I I : I I I I : I I : I I I : : I . I I : I I I : I:. : I I : I I I I I - I : I

201 WDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250

218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267

III:· :- ..1.1.::..1.1111.1111 | :.| . . : : . I : : . I : . .

251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300

268 VLSLS. .YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ. . . NPHYDAVIMTAPLCNVK 312 llll. :::.. :.||:|. Η : I I I I I I I I I : I I :

301 VLSLACTFDGVPALGRWSISVD.SKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPL.SWR 350

313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362

II. Ill.l. IHI 1.::1 :111:::1.1.1:.1 HI II II lilii I

351 RMKFTKGGAPWLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400

363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411

I IIII: IIII111IIIIIIII. I. I .11111:111:1.:11 HI. I

401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450

412 KQWTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461

11:11111.:111111:1. I-I II .11111: .1.11:111:11!.:

451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN 500

462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509

501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH* . . .

545

187 545

Przykład 3: Izolowanie cDNA Protox-1 z bawełny na podstawie homologii do sekwencji kodującej Proto.x-1 u kukurydzy.

Bibliotekę cDNA na wektorze Lambda Uni-Zap utworzona z Gossypium hirsutum L. (72 godz. liścienie hodowane w ciemności) otrzymano od dr Dicka Trełease, Dept. Of Botany, Arizona State University (Ni W. I Trelease R.N., Arch. Biochem. Biophys. 289: 237-243 (1991)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szkle Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-l kukurydzy (SEKW. ID nr 5) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1°% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjne (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cDNA bawełny nazwany „Protox-1 bawełny” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-l bawełny ma 1826 bp długości i koduje białko o wielkości 58,2 kDa. Sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID nr 13 i 14. Białko bawełny jest w 77% identyczne (w 86% podobne) do białka Protox-1 kukurydzy.

Protox-1 bawełny na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 1 lipca 1996 r. jako pWDC-15 (NRRL#B-21595).

Przykład 4. Izolowanie cDNA Protox-1 z buraka cukrowego na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u Arabidopsis.

Bibliotekę cDNA Beta vulgaris na wektorze Lambda Uni-Zap otrzymano od dr Philipa Rea, Dept. of Botany, Plant Science Institute, Philadelphia, PA (Yongcheol Kim, Eugene J. Kim i Philip A. Rea, Plant Physiol. 106: 375-382 (1994)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szkle Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 Arabidopsis (Sekw. ID nr:l) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SdS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjne (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cDNA buraka cukrowego nazwany „Protox-1 buraka cukrowego” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-l buraka cukrowego ma 1910 bp długości i koduje białko o wielkości 60 kDa. Sekwencja nukleotydową tego cDNA i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 15 i 16. Białko buraka cukrowego jest w 73% identyczne (w 82% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis.

Prottox^1 buraka cukrowego na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 29 lipca 1996r. jako pWDC-16 (NRRL#B-21595N).

Przykład 5. Izolowanie cDNA Protox-1 rzepaku na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-l u Arabidopsis.

Bibliotekę cDNA Brassica napus (3-4 wk. dojrzałe zielone liście) na wektorze Lambda Uni-Zap II otrzymano od dr Guenthera Ochs, Institut Fuer Allemeine Botanik, Johannes Gutenberg-Universitaet Mainz, Germany (Gunter Ochs, Gerald Schock i Aloysiius Wild, Plant Physiol. 103: 303-304 (1993)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szkle Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID nr 1) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS' temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustało187 545 ne metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjne (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cDNA rzepaku nazwany „Protox-l rzepaku” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-l rzepaku ma 1784 bp długości i koduje białko o wielkości 57,3 kDa. Sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 17 i 18. Białko rzepaku jest w 87% identyczne (w 92% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis.

Protox-1 rzepaku na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 23 sierpnia 1996 r. jako pWDC-17 (NRRL#B-21615).

Przykład 6. Izolowanie cDNA Protox-1 ryżu na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy.

Bibliotekę cDNA Oryza sativa (5 dni etiolowane pędy) na wektorze Lambda gt11 zakupiono w firmie Clontech. Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szkle Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID nr 5) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies).

Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaPO4 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1%o SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i DNA lambda zostało obrobione przy użyciu Wizard Lambda-Prep kit (Promega). Wstawka cDNA została zsubklonowana na wektorze pBluescript przy użyciu standardowych technik. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). W najdłuższym otrzymanym cDNA ryżu nazwanym „Protox-1 ryżu” brakuje peptydu i około 172 aminokwasów dojrzałej sekwencji kodującej na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1). Niepełna sekwencja nukleotydową tego cDNA i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 19 i 20.

Protox-1 ryżu na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 6 grudnia 1996 r. jako pWDC-18 (NRRL#B-21648).

Przykład 7. Izolowanie cDNA Protox-1 sorgo na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy.

Bibliotekę cDNA Sorghum bicolor (3-6 dni zielone sadzonki) na wekterze Lambda UniZap II otrzymano od dr Klaus Pfizenmaier Institute of Cell Biology and Immunology, University of Stuttgart, Germany (Harald Wajant, Karl-Wolfgang Mundry i Klaus Pfizenmaiet, Plant Mol. Biol. 26: 735-746 (1994)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szkle Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID nr 5) znakowaną 32p.-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). W najdłuższym otrzymanym cDNA sorgo nazwanym „Protox-l sorgo” brakuje peptydu liderowego i około 44 aminokwasów pełnej sekwencji kodującej na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1). Niepełna sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 21 i 22.

Protox-1 sorgo na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 6 grudnia 1996 r. jako pWDC-19 (NRRL#B-21649).

Przykład 8. Wykazanie wrażliwości klonów protox z roślin na herbicydy hamujące białka protox w układzie bakteryjnym.

Płynne hodowle Protox- 1/SASX3 8, Protox-2/SASX38 i pBluescript/XI.-lBhie prowadzono w pożywce L amp^u’°. Sto mikrolitrów każdej hodowli wysiewano na podłoża L amp¹⁰

187 545 zawierające różne stężenia (1,0nM-10mM) aryluracylowego herbicydu formuły XVII hamującego protox. Podwójne zestawy szalek inkubowano przez 18 godzin w 37°C

Szczep E.coli XL1-Blue protox+ nie wykazał wrażliwości na herbicyd w żadnym stężeniu zgodnie ze znaną naturalną opornością enzymów własnych bakterii na podobne herbicydy. Protox-l/SASX38 był wyraźnie wrażliwy z murawą bakterii prawie całkowicie usuniętą przy stężeniu inhibitora wynoszącym jedynie 10nM. Protox-2/SASX38 był również wrażliwy ale tylko w wyższych stężeniach herbicydu (10nM). Herbicyd działał nawet wtedy gdy szalki trzymano w prawie całkowitej ciemności. Efekt toksyczny herbicydu można było prawie całkowicie wyeliminować przez dodanie hematyny do pożywki w stężeniu 20pg/ml.

Różnice w tolerancji na herbicyd między dwoma szczepami zawierającymi roślinne białko protox są raczej wynikiem różnej ekspresji z tych dwóch plazmidów niż jakiejś właściwej różnicy we wrażliwości enzymów. Protox-1/SASX38 na wszystkich pożywkach nie zawierających hemu rośnie znacznie wolniej niż Protox-2/SASX38. Poza tym, szczep MzProtox-2/SASX38, którego szybkość wzrostu jest bardzo podobna do szczepu ArabProtox-1/SASX38 jest także bardzo wrażliwy na herbicyd w niższych (10-100nM) stężeniach.

Dział B: Identyfikacja i charakterystyka roślinnych genów protox wrażliwych na herbicydy hamujące protox.

Przykład 9. Selekcja genów protox wrażliwych na herbicydy hamujące protox w systemie ekspresyjnym E. coli.

Biblioteka cDNA Arabidopsis taliana (Landsberg) na wektorze plazmidowym pFL61 (Minet i wsp., Plant J. 2: 417-422 (1992) została namnożona. Mutant E. coli hemG SASX38 (Sasarman i wsp., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)) był hodowany na pożywce zawierającej hematynę (United States Biochemicals) w stężeniu 20ng/ml. Bibliotekę stransformowano SASX38 techniką elektroporacji używając Bio-Rad Gene Pulser w warunkach zalecanych przez producenta. Stransformowane komórki o gęstości około 500.000 transformantów/10 cm szalkę wysiano na pożywkę L zawierającą ampicylinę w stężeniu 100pg/ml. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 40 godzin przy ograniczonym dostępie światła i następnie poddano selekcji na zdolność wzrostu bez uzupełnienia pożywki hemem. Prototrofy hemowe były uzyskiwane z biblioteki pFL61 z częstością 400/10⁷' Analiza sekwencji 21 komplementujących klonów wykazała, ze 9 z nich należy do typu „Protox-1”, a więc genów protox, wynikiem ekspresji których są enzymy protox chloroplastów.

Biblioteka pFL61 jest biblioteką ekspresyjną w drożdżach z cDNA Arabidopsis wstawionym w obu kierunkach. Te cDNA mogą również być eksprymowane w bakteriach. CDNA protox zaczyna się kodonem ATG w ramce na końcu 3' drożdżowej sekwencji PGK około 10 aminokwasów od miejsca cięcia dla enzymu Notl (miejsce wklonowania wstawki) na wektorze i może ulegać ekspresji spod promotora LacZ znajdującego się 300bp przed ramką odczytu, lub też z nieustalonego kryptycznego promotora bakteryjnego. Ponieważ cDNA Protox-l zawierające sekwencje kierujące do chloroplastów hamowały wzrost szczepu E. coli SASX38, do eksperymentów z mutagenezą i selekcją szczepów opornych na herbicydy wybrano klon z najkrótszą chloroplastową sekwencją liderową. Klon ten, pSLV 19, zawiera tylko 17 aminokwasów domniemanego chloroplastowego peptydu liderowego z sekwencją DNA zaczynającą się od nukleotydu 151 cDNAProtox-l Arabidopsis (SEKW. ID nr 1)

Plazmidem pSLV19 transformowano szczep podlegający losowej mutagenezie XL1-Red (Stratagene, La Jolla, CA). Transformanty wysiewano na podłoże L zawierające ampicylinę w stężeniu 50 ug/ml i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Murawę transformantów zdrapano z szalki i wyizolowano plazmidowe DNA przy użyciu Wizard Megaprep kit (Promega, Madison, Wl). Plazmidowe DNA wyizolowane ze szczepu mutatorowego powinno zawierać około jednej przypadkowej zmiany zasady na 2000 nukleotydów (patrz Greenner i wsp., Strategies 7(2): 32-34(1994))

Zmutowanym plazmidowym DNA stransformowano mutanta hemG SASX38 (Sasarman i wsp., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) i wysiano na pożywkę L zawierającą różne stężenia herbicydu hamującego protox. Szalki były inkubowane przez 2 dni w temperaturze

37°C. DNA plazmidowy został wyizolowany ze wszystkich kolonii, które rosły w obecności takiego stężenia herbicydu, które zabijało szczep dziki. Wyizolowane DNA był następnie uży187 545 ty do transformacji szczepu SASX38 i ponownie wysiany na pożywkę z herbicydem w celu upewnienia się, że zaobserwowana oporność jest zależna od plazmidu. Sekwencja kodująca protox z plazmidów, która przeszła selekcję była wycinana enzymem NotI, wklonowana w niezmutowany wektor i ponownie testowana na zdolność do nadania szczepowi tolerancji na herbicyd. Sekwencję cDNA protox, która miała zdolność nadawania szczepowi oporności na herbicyd została następnie ustalona. Poprzez porównanie z dziką sekwencją Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID nr 1) ustalono miejsca mutacji.

Z pierwszego eksperymentu z mutagenezą otrzymano pojedynczego mutanta posiadającego mutację w sekwencji kodującej. Ten mutant powoduje wzmocnioną „oporność” na herbicyd tylko poprzez podwyższenie tempa wzrostu. Zawiera mutację C w A w nukleotydzie 197 (SEKW. ID nr 1) w skróconej chloroplastowej sekwencji liderowej w plazmidzie pSLV19, zmieniając kodon ACG dla treoniny w kodon AAG dla lizyny w pozycji 56 białka (SEKW. ID nr 2) i powoduje lepszą komplementację mutanta bakteryjnego. Plazmid zawiera także mutację milczącą w sekwencji kodującej w nukleotydzie 1059 powodującą zmianę kodonu AGT (Ser) w AGC (Ser). Plazmid ten został nazwany pMut-1.

Plazmid pMut-1 użyto następnie do transformacji szczepu mutatorowego XL1-Red jak opisano powyżej i zmutowane DNA było izolowane i wysiewane na pożywki zawierające stężenia letalne dla niezmutowanego genu protox pMut-1. Kolonie oporne na herbicyd były izolowane po dwóch dniach w 37°C i analizowane jak opisano powyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna pokazała, że geny oporne tworzą dwie klasy. Jedna mutacja powodująca oporność została zidentyfikowana jako zmiana C w T w nukleotydzie 689 sekwencji Ptotox-1 Arabidopsis zamieszczonej poniżej jako SEKW. ID nr 1. Mutacja ta zmienia kodon GCT dla alaniny aminokwasie 220 sekwencji SEKW. ID nr 2 w kodon GTT dla waliny i została nazwana pAraC-1 Val.

Mutant drugiej klasy zawiera zmianę A w G w nukleotydzie 1307 sekwencji Protox-1 Arabidopsis, powoduje to zmianę kodonu TAC dla tyrozyny w aminokwasie 426 w kodon TGC dla cysteiny i została nazwana pAraC-2Cys.

Trzeci mutant zawiera zmianę G w A w nukleotydzie 691 sekwencji Protox-1 Arabidopsis, powoduje to zmianę kodonu GGT dla glicyny w aminokwasie 221 w kodon AGT dla seryny. Plazmid został nazwany pAraC-3Ser.

Oporny mutant pAraC-2Cys w plazmidzie pMut-1 został zdeponowany 14 listopada 1994 pod nazwą pWDC-7 w Agricultural Research Culture Collection i nadano mu numer depozytu NRRL#21339N.

Przykład 10. Dodatkowe herbicydoopome podstawienia kodonów w pozycjach zidentyfikowanych w czasie losowego przeszukiwania.

Aminokwasy zidentyfikowane jako miejsca oporności przy losowym przeszukiwaniu są podstawiane przez inne aminokwasy i testowane na funkcję i tolerancję na herbicyd w układzie bakteryjnym. Mutageneza sterowana przez oligonukleotydy sekwencji Protox-1 Arabidopsis jest przeprowadzana przy użyciu Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech, Pało Alto, CA). Po potwierdzeniu zmian aminokwasów przez analizę sekwencyjny zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i wysiewane na pożywkę L amp w celu sprawdzenia funkcji i na różne stężenia herbicydu hamującego protox w celu sprawdzenia tolerancji.

Ta procedura jest stosowana dla kodonu alanino wego tworzonego przez nukleotydy 688-690 i kodonu tyrozynowego tworzonego przez nukleotydy 1306-1308 sekwencji Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID nr 1). Rezultaty pokazują że kodon alaninowy (nukleotydy 688-690) może zostać zamieniony na kodon dla waliny, treoniny, leucyny, cysteiny lub izoleucyny by spowodować, że herbicydoopomy enzym protox pozostał przy swej funkcji. Później, rezultaty pokazują że kodon tyrozynowy (nukleotydy 1306-1308) może być zmieniony na kodon dla cysteiny, izoleucyny, leucyny treoniny, metioniny, waliny lub alaniny, by spowodować, że herbicydoopomy enzym protox pozostał przy swej funkcji.

Przykład 11. Izolowanie dodatkowych mutacji, które zwiększają funkcję enzymatyczną i/lub tolerancję na herbicyd pierwotnie zidentyfikowanych mutantów opornych

187 545

Plazmidy zawierające oporny na herbicyd gen protox są transformowane do szczepu mutatorowego XL1-Red i zmutowany DNA jest izolowany jak opisano wyżej. Zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38i transformanty są przeszukiwane na stężeniach herbicydu wystarczających by zahamować wzrost oryginalnego „opornego” mutanta. Kolonie wykazujące tolerancję są izolowane i fenotyp silnej tolerancji jest weryfikowany jakby był zależny od sekwencji jak opisano wężej. Ustala się sekwencję tych mutantów i identyfikuje mutacje przez porównanie z sekwencją wyjściową.

Ta procedura miała zastosowanie przy opisanym wyżej mutancie pAraC-lVal. Wyniki pokazują, że kodon serynowy aminokwasu 305 (SEKW. ID NR 2) może być zamieniony na kodon dla l^cyny by uzyskać enzym z wyższą, niż pojedynczy mutant pAraC-Val tolerancją na herbicydy hamujące protox. To drugie miejsce jest nazwane AraC305Leu. Te same wyniki pokazują dla kodonu treoninowego w aminokwasie 249 zmianę na izoleucynę lub alaninę prowadzącą do enzymu ze zwiększoną tolerancją. Te zmiany są nazwane odpowiednio AraC24911e i AraC249Ala.

Ta procedura miała także zastosowanie przy opisanym wyżej mutancie pAraC-2Cys. Wyniki pokazują, że kodon prolinowy aminokwasu 118 (SEKW. ID nr2) może być zamieniony na kodon dla leucyny by uzyskać enzym z wyższą, niż pojedynczy mutant pAraC-2Cys tolerancją na herbicydy hamujące protox. To drugie miejsce jest nazwane AraC118Leu. Te same wyniki pokazują dla kodonu serynowego w aminokwasie zmianę na leucynę prowadzącą do enzymu pAraC-2Cys ze zwiększoną tolerancją. Ta zmiana została także wyizolowana z mutantem pAraC-lVal jak opisano powyżej i została nazwana AraC305Leu. Dodatkowe mutacje zwiększające oporność na herbicyd mutanta pAraC-2Cys zawierały zmianę asparaginy w serynę w aminokwasie 425, nazwaną AraC425Ser i tyrozyny w cysteinę w aminokwasie 498 nazwaną AraC498Cys.

Te zmiany są określane jako mutacje „drugiej pozycji” ponieważ nie są one wystarczające do nadania tolerancji na herbicyd, ale raczej wzmacniają funkcję i/lub tolerancję na herbicyd już zmutowanego enzymu. To nie przekreśla możliwości, że inne podstawienia aminokwasów w tych pozycjach mogłyby wystarczyć do wyprodukowania enzymu posiadającego tolerancję na herbicyd dopóki wszystkie możliwe podstawienia nie zostaną gruntownie przetestowane.

Przykład 12. Łączenie zidentyfikowanych mutacji oporności ze zidentyfikowanymi mutacjami drugiej pozycji w celu stworzenia wysoce funkcjonalnech/wesoce tolerancyjnych enzymów protox

Opisana wyżej mutacja AraC305Leu wzmacnia funkcję/oporność na herbicyd zarówno zmutowanego plazmidu AraC-1 Val jak i AraC-2Cys. W drodze do przetestowania użyteczności tej mutacji drugiej pozycji, została ona połączona z mutacjami AraC-2Leu, AraC-2Vak i AraC-2Ile i testowana na tolerancję na herbicyd. W każdym z przypadków zmiana AraC305Leu znacząco zwiększyła tempo wzrostu opornego mutanta protox na herbicyd hamujący protox. Połączenia mutanta opornego AraC-2lle zarówno z mutantem drugiej pozycji AraC249lle jak i AraCl 18Leu także doprowadziło do powstania zmutowanych enzymów protox o wyższej tolerancji. Mutacja AraC24911e pokazuje, że mutacje drugiego miejsca zidentyfikowane jako wzmacniające mutanty AraC-1 mogą także zwiększać oporność mutantów AraC-2. Wykazano, że plazmid z trzema mutacjami zawierającymi AraC-2Ile, AraC305Leu i AraC24911e produkuje wysoce funkjjonalny. wysoce tolerancyjny na herbicyd enzym protox-l.

Przykład 13. Identyfikacja miejsc w genie Protox-1 kukurydzy, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Opisany powyżej plazmid pMut-1 Arabidopsis Protox-1 jest bardzo wydajny w eksperymentach z mutagenezą i przeszukiwaniem, w których daje wysoką częstość prawdziwych mutantów sekwencji kodującej, w opozycji do częstych mutantów zwiększających siłę promotora, które są izolowane przy użyciu innych plazmidów. W celu stworzenia wydajnego systemu przeszukiwania opartego o plazmid dla Protox-1 kukurydzy, cDNA kukurydzy został włączony do wektora pMut-1 w możliwie takim samym kontekście sekwencyjnym jak cDNA Arabidopsis. Używając standardowych metod łączenia zachodzących na siebie produktów PCR, koniec 5' klonu pMut-1 Arabidopsis (zawierający 17 aminokwasów chloroplastowego

187 545 peptydu liderowego z mutacją typu „zmiany sensu” opisaną powyżej) został połączony do cDNA Protox-1 kukurydzy zaczynającego się od aminokwasu numer 14 (SEKW'. ID nr 6) sekwencji kukurydzy. Koniec 3' cDNA kukurydzy nie był zmieniony. Miejsca cięcia dla enzymu Notl zostały umieszczone na obu końcach utworzonej fuzji, i gen hybrydowy został wklonowany do plazmidu pFL61 będącego protoplastą pMut-1. Analiza sekwencyjna wykazała jedno nukleotydową milczącą mutację wprowadzoną przez PCR, która zmienia kodon ACG (nukleotydy 745-747) (SEKW. ID nr 5) w kodon ACT, oba kodujące treoninę.

Ten hybrydowy plazmid Protox-1 Arab-kukurydza został nazwany pMut-3.

Plazmid pMut-3 użyto do transformacji szczepu mutatorowego XL1-Red jak opisano powyżej i zmutowane DNA było izolowane i wysiewane na pożywki zawierające stężenia letalne dla niezmutowanego genu protox pMut-1. Kolonie oporne na herbicyd były izolowane po dwóch dniach w 37°C i analizowane jak opisano powyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 5 pojedynczych zmian zasad, które prowadzą do enzymu Protox-1 kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Trzy z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-1 Arabidopsis powodowały tolerancję. Dwie z trzech to pMzC-1 Val i pMzC-IThr, zmieniające alaninę (GCT) w aminokwasie 164 (SEKW. ID nr 6) w walinę (GAT) Iub treoninę (ACT). Ta pozycja odpowiada opisanym wyżej mutacjom pAraC-1. Trzecia analogiczna zmiana wymienia glicynę (GGT) w pozycji 165 w serynę (AGT) co odpowiada opisanej wyżej mutacji AraC-3Ser. Te wyniki służą potwierdzeniu oczekiwania, że mutacje herbicydooporne zidentyfikowane w jednym roślinnym genie protox mogą również nadawać oporność na herbicyd odpowiadającym roślinnym genom protox z innych gatunków.

Dwie z mutacji wyizolowanych z przeszukiwania Protox-1 kukurydzy doprowadziły do zmian aminokwasów w zasadach wcześniej niezidentyfikowanych jako miejsca oporności. Jedna zmiana powoduje wymianę cysteiny (TGC) w fenyloalaninę (TTC) w aminokwasie 159 sekwencji Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID nr 6). Druga zamienia izoleucynę (ATA) na treoninę (ACA) w aminokwasie 419.

Dodatkowe podstawienia aminokwasów zostały zrobione i przetestowane dla trzech miejsc mutacji u kukurydzy. Wykazano tolerancję kiedy glicyna 165 była zamieniona na leucynę Iub kiedy cysteina 159 była zamieniona na leucynę Iub lizynę. Enzymy wykazujące tolerancję zostały także stworzone przez zamianę izoleucyny 419 w histydynę, glicynę Iub asparaginę.

Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-1 Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-1 kukurydzy przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej.Testy w bakteriach wykazały, że zmiana alaniny (GCT) w aminokwasie 164 (SEKW. ID nr 6) w leucynę (CTT) prowadziła do utworzenia enzymu wykazującego silną tolerancję. Nie wyizolowano dla kukurydzy mutacji analogicznej do mutacji AraC-2 u Arabidopsis. Jednakże, zmiana tego miejsca, tyrozyny 370 w enzymie kukurydzy (SEKW. ID nr 6) w izoleucynę Iub metioninę prowadziła do powstania enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd.

Przykład 14. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l pszenicy, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l pszenicy, cDNA pszenicy zostało wprowadzone do wektora pMut-1 jak to opisano powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-pszenica został nazwany pMut-4. DNA pMut-4 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 7 pojedynczych zmian zasad, które samodzielnie powodują utworzenie enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Cztery z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsżs/kukurydzy powodowały tolerancję. Dwie zmieniają alaninę (GCT) w aminokwasie 211 (SEKW. ID nr 10) w walinę (GAT) Iub treoninę (ACT). Ta pozycja odpowiada opisanym wyżej mutacjom pAraC-1. Trzecia analogiczna mutacja zmienia glicynę (GGT) w ami30

187 545 nokwasie 212 w serynę (AGT) odpowiadając opisanej powyżej mutacji AraC-3Ser. Czwarta zmienia izoleucynę (ATA) na treoninę (ACA) w aminokwasie 466 odpowiadając mutantowi Mz419Thr.

Trzy z wyizolowanych mutacji z przeszukiwania Protox-l pszenicy doprowadziło do znalezienia zmian aminokwasów wcześniej nie zidentyfikowanych. Jedna mutacja zmienia walinę (GTT) w leucynę (CTT) w aminokwasie 356 sekwencji Protox-l pszenicy (SEKW. ID nr 10). Druga zmienia serynę (TCT) w prolinę w aminokwasie 421. Trzecia zmienia walinę (GTT) w alaninę (GCT) w aminokwasie 502.

Przykład 15. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l soi, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l pszenicy, cDNA soi zostało wprowadzone do wektora pMut-1 jak to opisano powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-soja został nazwany pMut-5. DNa pMut-5 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 4 pojedyncze zmiany zasad, które samodzielnie powodują utworzenie enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Dwa z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsishpszemcy powodowały tolerancję. Jedna zmienia alaninę (GCA) w aminokwasie 226 (SEKW. ID nr 12) treoninę (ACA). Ta pozycja odpowiada opisanej wyżej mutacji pAraC-IThu^. Druga analogiczna mutacja zmienia walinę (GTT) w aminokwasie 517 w alaninę (GCTlodpowiadając opisanej powyżej mutacji Wht502Val u pszenicy.

Dwie z wyizolowanych w czasie przeszukiwania Protox-l pszenicy mutacji powodowały wcześniej nie zidentyfikowane zmiany aminokwasów. Jedna mutacja zmienia prolinę (CCT) w serynę (TCT) w aminokwasie 369 sekwencji Protox-l soi (SEKW. ID nrl2). Druga zmienia tę samą prolinę 369 w histydynę (CAT).

Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-l Arabidopsis były wprowadzone do genu Proto.K-l soi przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana alaniny (GCT) w aminokwasie 226 (SEKW. ID nr 12) w leucynę prowadziła do utworzenia enzymu wykazującego silną tolerancję. Zmiana tyrozyny (TAC) w aminokwasie 432 (SEKW. ID nr 12) w leucynę lub izoleucynę prowadziła do powstania enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd.

Przykład 16. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l buraka cukrowego, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l buraka cukrowego, cDNA buraka cukrowego zostało wprowadzone do wektora pMut-1 jak to opisano powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-burak cukrowy został nazwany pMut-6. DNA pMut-6 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała pojedynczą zmianę zasady, która powoduje powstanie enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Ta mutacja zmienia tyrozynę (TAC) w aminokwasie 449 w cysteinę (TGC) i odpowiada opisanej wyżej mutacji AraC-2 u Arabidopsis.

Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-l Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-l soi przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana tyrozyny (TAC) w aminokwasie 449 w leucynę, izoleucynę, walinę lub metioninę prowadziła do utworzenia enzymu buraka cukrowego wykazującego silną tolerancję na herbicyd.

Przykład 17. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l bawełny, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l bawełny, cDNA bawełny zostało wprowadzone do wektora pMut-1 jak to opisano powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid został nazwany pMut-7. DNa pMut-7 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów za187 545 wierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 3 pojedyncze zmiany zasad, które samodzielnie powodują powstanie enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Dwa mutanty zmieniają tyrozynę (TAC) w aminokwasie 428 (SEKW. ID nr 16) odpowiednio w cysteinę (TGC) i argininę (CGC). Arginina jest nowym podstawieniem dającym tolerancję na herbicyd w tej wcześniej zidentyfikowanej pozycji AraC-2. Trzecia mutacja zmienia prolinę (CCC) w serynę (TCC) w aminokwasie 365. Ta zmiana odpowiada mutantowi Soy369Sersoi.

Przykład 18. Wykazanie krzyżowej tolerancji mutacji oporności na różne czynniki hamujące protox

Zmutowane oporne plazmidy oryginalnie zidentyfikowane w oparciu o oporność na jeden herbicyd hamujący protox były testowane wieloma innymi czynnikami hamującymi protox. Do tego testu szczep SASX38 zawierający dziki plazmid jest wysiewany na szeregu rozcieńczeń każdego czynnika aby ustalić letalne stężenie dla każdego z nich. Zmutowane plazmidy oporne w SASX38 są wysiewane i zliczane na zdolność przetrwania na stężeniu każdego czynnika przynajmniej 10 razy większym niż stężenie, które jest śmiertelne dla szczepu SASX38 zawierającego dziki plazmid.

Wyniki bakteryjnego testu krzyżowego, pokazane w tabelach 3A i 3B poniżej, wskazują, że każda ze zidentyfikowanych mutacji niesie tolerancję na wiele czynników hamujących protox.

Tabela 3A

Tolerancja krzyżowa roślinnych mutantów protoK na różne inhibitory protox

Wzór	AraC-1 Val	AraC-2-Cys	AraC-1Thr	AraC-3Thr	MzC-1 Val
XVII	+	+	+	+	+
XVIIa	4-	+	+	-	+
IV	++	-	++	++	-
XV	+	+	+	+	+
XI	-	+	·+	++	+
XVI	. -	-	-	-	+
XII	+	-	++	++	++
XIV	+	-	+	+	+
*x

+ = tolerancja 10x wyższa niz szczepu dzikiego ++ = tolerancja 10x wyzsza niż szczepu dzikiego

- = bbak tolerancji kryzowej * = ten czynnik był testowany lecz nie uzyskano żadnych informacji

Tabela 3B

Tolerancja krzyżowa roślinnych mutantów sretex na różne inhibitory protox

	AraC ILeu	AraC- -2Ile	AraC-1Lru+ AraC+2Met	AraC-HLeu +AraC-	AraC-2Ile +AraC3- -GóLeu	AraC-2- -Cys+AraC- -42Ser	AraC-2- -Leu+Ar- -C-42 -5 Ser	AraC-2- Met+Ara- -C42- 5 Ser
1	2	3	4	5	6	7	8	9
XVII	+	+	+	+	+	+	+	+
XVIIa	++	++	++	+—+	++	++	++	++
IV	++	-	+	++	+	-	+	+

187 545

c.d. tabeli 3B

1	2	3	4	5	6	7	8	9
XV	++	+++	+++	+++	+++	++	+4-+	++
XI	++	++	++	++	++	++	++	-H-
XVI	+++	+++	+++	+++	+++	+	++	++
XII
XIV	++	++	++	++	++	-	++	++

Dział C: Ekspresja herbicydoopornych genów protox w roślinach transgenicznych

Przykład 19. Tworzenie roślin opornych na herbicydy hamujące protox metodą rekombinacji homologicznej lub konwersji genów.

Ponieważ opisane mutanty sekwencji kodującej wydajnie nadają tolerancję na herbicyd gdy ulegają ekspresji spod naturalnego promotora protox, ukierunkowane zmiany sekwencji kodującej protox w jej naturalnej lokalizacji chromosomowej stanowią alternatywę dla stworzenia opornych na herbicyd roślin i komórek roślinnych. Fragment DNA protox zawierający żądane mutacje, lecz nie posiadający własnych sygnałów ekspresji (promotora lub regionu 3' nie podlegającego translacji) może zostać wprowadzony jedną z kilku dobrze znanych metod (na przykład transformacja Agrobacterium, bezpośredni transfer genów do protoplastów, bombardowanie mikropociskami) i można selekcjonować transformanty wykazujące tolerancję na herbicyd. Wprowadzane fragmenty DNA zawierają także diagnostyczne miejsce restrykcyjne lub inny polimorfizm sekwencyjny, który jest wprowadzany przez ukierunkowaną mutagenezę in vitro bez zmieniania kodowanej sekwencji aminokwasowej (na przykład mutacja milcząca). Z wcześniejszych doniesień dla wielu markerów selekcyjnych i genów oporności na herbicydy (patrz na przykład Paszkowski i wsp., EMBO J. 7: 4021-4026 (1988); Lee i wsp., Plant Cell 2: 415-425 (1990); Risseeuw i wsp., Plant J. 7: 109-119 (1995)) wynika, że niektóre znalezione transformanty są wynikiem integracji homologicznej zmutowanego DNA w locus chromosomalne protox, lub konwersji naturalnej sekwencji chromosomalnej protox we wprowadzaną sekwencję mutanta. Te transformanty są rozpoznawane dzięki kombinacji fenotypu tolerancji na herbicyd i obecności diagnostycznego miejsca restrykcyjnego w ich chromosomalnym locus protox.

Przykład 20. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin

Liczne wektory do transformacji są osiągalne do transformacji roślin i geny mogą być używane w połączeniu z każdym z takich wektorów. Selekcja używanego wektora będzie zależała od preferowanej techniki transformacji i gatunku biorcy. Dla różnych biorców mają zastosowanie różne antybiotykowe lub herbicydowe markery selekcyjne. Markery selekcyjne rutynowo stosowane w transformacji to: gen nptll, który nadaje odporność na kanamycynę i podobne antybiotyki (Messing i Vierra, Gene 19: 259-268 (1982)), gen bar nadający oporność na herbicyd fosfinotrycynę (White i wsp., Nuci Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer i wsp., Theor Appl Genet 79: 625-631 (1990), gen hph nadający oporność na antybiotyk hygromycynę (Blochinger i Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931 (1983)) i gen dhfr, który niesie oporność na metotreksat (Bourouis i wsp., EMBO J. 2(7): 10991104(1983)).

I. Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji Agrobacterium

Istnieje wiele wektorów odpowiednich do transformacji przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Mają one przeważnie przynajmniej jedną sekwencję graniczną T-DNA i zawierają wektory takie jak pBIN19 (Bevan, Nuci. Acids Res. (1984)) i pXYZ. Konstrukcja dwóch typowych wektorów jest opisana poniżej.

Konstrukcja pCIB200 i pCIB2001: Wektory bifunkcjonalne pCIB200 i pCIB2001 są używane do konstrukcji zrekombinowanych wektorów do użytku z Agrobacterium i zostały skonstruowane w następujący sposób. pTJS75kan został stworzony przez strawienie enzymem Narl pTJS75 (Schmidhauser i Helinski, J Bacteriol 164:446-455 (1985)) co pozwoliło na wy187 545 cięcie genu oporności na tetracyklinę, następnie wstawiono fragment Accl z pUC4K niosący NPTII (Messing i Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan i wsp., Nature 304: 184-187 (1983); McBride i wsp., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Doligowano adaptery Xhol do fragmentu EcoRVpCIB7, który zawierał lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, roślinny hybrydowy gen selekcyjny nos/nptll i polilinker pUC (Rothstein i wsp., Gene 53: 153-161 (1987)) i fragment strawiony enzymem Xhol został wklonowany w strawiony enzymem Sali pTJS75kan by utworzyć tCIB200 (patrz także EP 0 332 104, przykład 19). pCIB200 zawiera następujące pojedyncze miejsca trawienia w polilinkerze: EcoRI, Sstl, KpnI, Bgll, Xbal i Sali pCIB2001 pochodzi od pCIB200 i stworzony został przez wstawienie do polilinkera dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Pojedynczymi miejscami trawienia w poliEnkerze pCIB2001 są EcoRI, Sstl, Kpnl, Bgll, Xbal Sali, MU, Bell, Avril, Apal, Hpal, i Stul. Oprócz posiadania dodatkowych pojedynczych miejsc trawienia pCIB2001 posiada bakteryjną i roślinną selekcję na kanamycynę, prawą i lewą sekwencję graniczną T-DNA do transformacji przy użyciu Agrobacterium, Funkcję trfA pochodzącą z RK2 umożliwiającą przemieszczanie się między E. coli i innymi gospodarzami oraz OriT i OriV także z RK2. Polilinker pCIB2001jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających własne sygnały regulacyjne.

Konstrukcja pCIB10 i jego pochodnych z selekcją na hygromycynę: Bifunkcjonalny wektor pCIBlO zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę do selekcji w roślinach, lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA i posiada sekwencje z plazmidu pRK252 zdolnego do działania w wielu gospodarzach umożliwiające replikację zarówno w E. coli jak i Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana przez Rothstein i wsp., Gene 53:153-161 (1987). Liczne pochodne zawierające gen fosfotransferazy hygromycyny B pCIBlO zostały stworzone i opisane przez Gritz i wsp., Gene 25:179-188 (1983). Te pochodne umożliwiają selekcję transgenicznych komórek roślinnych na hygromycynie (pCIB743) Iub hygromycynie i kanamycynie (pCIB715, pCIB717).

II. Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji bez użycia Agrobacteriimn,

Transformacja bez użycia Agrobacterium tumefaciens pozwala na obejście konieczności posiadania przez wybrany wektor sekwencji T-DNA i konsekwentnie wektory nie posiadające tych sekwencji mogą być używane równocześnie z wektorami takimi jak opisane wyżej zawierającymi sekwencje T-DNA. Technikami transformacji, które nie opierają się na Agrobacterium są: transformacja przez bombardowanie cząsteczkami, pobieranie przez protoplasty (na przykład PEG i elektroporacja) i mikroinjekcja. Wybór wektorów w dużym stopniu zależy od preferowanego rodzaju selekcji dla transformowanego gatunku. Poniżej opisano konstrukcję kilku typowych wektorów.

Konstrukcja pCIB3064: pCIB3064 jest wektorem pochodzącym od wektora pUC odpowiednim do technik bezpośredniego transferu genów w kombinacji z selekcją na herbicyd basta (Iub fosfinotrycynę). Plazmid pCIB246 obejmuje promotor CaMV 35S w funkcjonalnej fuzji z genem GUS E. coli i terminator transkrypcji CaMV 35S i jest ujawniony w WO 93/072778. Promotor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje ATG w kierunku 5' od startu. Te pozycje zostały zmutowane przy użyciu standardowych metod PCR w taki sposób by usunąć oba ATG i wprowadzić miejsce trawienia dla enzymu Sspl i Pvull. Nowe miejsca restrykcyjne były położone 96 i 37 bp od pojedynczego miejsca trawienia Sali i 101 i 42 bp od rzeczywistego miejsca startu. Uzyskany plazmid wywodzący się z pCIB246 został nazwany pCIB3025. Następnie gen GUS został wycięty z pCIB3025 przez trawienie enzymami Sali i Sacl, końce zostały strawione „na tępo” i ponownie zligowane by utworzyć plazmid pCIB3060. Plazmid pJIT82 otrzymano z John Innes Centre, Norwich i fragment Smal o wielkości 400 bp zawierający gen bar ze Streptomyces viridochromogenes został z niego wycięty i wstawiony w miejsce Hpal plazmidu pCIB3060 (Thompson i wsp. EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Tak utworzony pCIB3064, który zawiera gen selekcji na herbicyd bar pod kontrolą promotora i terminatora CaMV 35S, gen oporności na ampicylinę (do selekcji w E. coli) i polilinker z pojedynczymi miejscami trawienia dla enzymów Sphl, Pstl, Hindlll i BamHI. Ten wektor jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulatorowe.

187 545

Konstrukcja pSOGE) i pSOG35: pSOG35 jest wektorem do transformacji, który używa gen reduktazy dihydrofolanowej (DHFR) E. coli jako markera selekcyjnego nadającego oporność na methotrexate. Użyto PCR do namnożenia promotora 35S (~800bp), 6 intronu genu Adhl kukurydzy (~550bp) i 18 bp nie podlegającej' translacji sekwencji liderowej GUS z pSOGlO. Fragment o długości 250 bp kodujący gen reduktazy dihydrofolanowej typu drugiego E. coli został również namnożony techniką PCR i te dwa fragmenty zostały połączone fragmentem Sacl-Pstl z pBI221 (Clontech), który zawiera szkielet wektora pUC19 i terminator syntazy nopalinowej. Połączenie tych fragmentów utworzyło pSOG19, który zawiera promotor 35S w fuzji z sekwencją intronu 6, lider GUS, gen DHFR i terminator syntazy nopalinowej. Zastąpienie lidera GUS w pSOG19 liderem sekwencji z Wirusem Chlorotycznej Plamistości Kukurydzy (MCMV) utworzyło wektor pSOG35. PSOG19 i pSOG35 niosą gen oporności na ampicylinę z pUC i mają miejsca trawienia dla HindUl, SphI, Pstl, i EcoRI, które można zastosować do klonowania obcych sekwencji.

Przykład 21. Konstrukcja roślinnych kaset ekspresyjnych

Sekwencje genów, przeznaczone do ekspresji w roślinach transgenicznych są wpierw włączane do kaset ekspresyjnych za odpowiednim promotorem i przed odpowiednim terminatorem transkrypcji. Takie kasety ekspresyjne mogą być łatwo przenoszone do roślinnych wektorów do transformacji opisanych wyżej w przykładzie 20.

I. Wybór promotora

Wybór promotora użytego w kasetach ekspresyjnych będzie miał wpływ na przestrzenny i czasowy wzór ekspresji transgenu w roślinie transgenicznej. Wybrane promotory będą eksprymować transgeny w specyficznych typach komórek (jak komórki epidermy liści, komórki mezofilu, komórki kory korzenia) Iub w specyficznych narządach Iub tkankach (na przykład korzeń, liście Iub kwiaty) i ten wybór będzie odbiciem żądanej lokalizacji ekspresji transgenu. Wybrany promotor może również powodować ekspresję genu spod słabo indukowalnego Iub podlegającego regulacji czasowej promotora. Późniejszą alternatywą jest wybór promotora regulowanego chemicznie. To umożliwi ekspresję transgenu tylko na żądanie, wtedy gdy zostanie potraktowany induktorem chemicznym.

II Terminatory transkrypcji

Jest wiele terminatorów transkrypcji dostępnych do użycia w kasetach ekspresyjnych. Są one .odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie są takie terminatory transkrypcji, o których wiadomo, że działają w roślinach i zawierają terminator 35S CaMV, terminator tml, terminator syntazy nopalinowej, terminator rbcS E9 grochu jak również terminatory naturalnie związane z roślinnymi genami protox (na przykład „terminatory protox”). Mogą być one używane zarówno w roślinach jedno- jak i dwuliściennych.

EL Sekwencje wzmacniające Iub regulujące ekspresję

Znaleziono sekwencje wzmacniające ekspresję genów wewnątrz jednostki transkrypcyjnej i sekwencje te mogą być użyte w połączeniu z genami do zwiększenia ich ekspresji w roślinach transgenicznych.

Wykazano, że różne sekwencje intronów wzmacniają ekspresję, szczególnie w komórkach roślin jednoliściennych. Na przykład introny genu Adhl kukurydzy znacząco wzmacniają ekspresję dzikiego genu pod jego własnym promotorem gdy zostanie wprowadzony do komórek kukurydzy. Stwierdzono, że intron 1 jest szczególnie wydajny i wzmacnia ekspresję w konstrukcje będącym fuzją z genem acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis i wsp. Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)). W tym samym systemie eksperymentalnym, intron genu bronzel miał podobny efekt wzmacniający ekspresję (Callis i wsp., to samo). Sekwencje intronów były rutynowo włączane do wektorów służących do transformacji roślin, przeważnie wewnątrz nie ulegającego translacji lidera.

Znanych jest również wiele nie ulegających translacji sekwencji liderowych pochodzących z wirusów, które wzmacniają ekspresję i są one szczególnie wydajne w komórkach roślin dwuliściennych. Wykazano, że szczególnie sekwencje liderowe Wirusa Mozaiki Tytoniowej (TMV, „sekwencja-W”), Wirusa Chlorotycznej Plamistości Kukurydzy (MCMV), Wirus Mo187 545 zaiki Lucerny (AMV) są wydajne we wzmacnianiu ekspresji (na przykład Gallie i wsp. Nuci. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski i wsp. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

IV. Kierowanie produktu genu w obrębie komórki

Znane są różne mechanizmy kierowania produktów genów u roślin i sekwencje kontrolujące funkcjonowanie tych mechanizmów zostały dość szczegółowo scharakteryzowane. Na przykład kierowanie produktów genów do chloroplastów jest kontrolowane przez sekwencję sygnałową, która jest spotykana na N-końcu różnych białek i która jest odszczepiana podczas importu do chloroplastów dając dojrzałe białko (np. Comal i wsp., J. Biol. Chem. 263: 1510415109 (1988)). Te sekwencje sygnałowe mogą być połączone z heterologiJznemi produktami genów aby przeprowadzić importowanie heterologiJzneJh produktów do chloroplastu (van den Broeck i wsp. Nature 313:358-363). DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnałowe może być izolowany z 5' końca cD-NA kodujących białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazę EPSP, białko GS2 i wiele innych białek, o których wiadomo, że są zlokalizowane w chloroplaście.

Inne produkty genów są zlokalizowane w innych organellach takich jak mitochondrium i peroksysom (np. Unger i wsp. Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)). cDNA kodujący te produkty może też być manipulowany aby uzyskać efekt kierowania heterologiczneJh produków genów do tych organelli. Przykładami takich sekwencji są kodowane w jądrze ATPazy i specyficzne dla mitochondriów aminotransferazy asparaginianowe. Kierowanie do organelli komórkowych opisali Rogers i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516(1985)).

Dodatkowo scharakteryzowano sekwencje, które powodują kierowanie produktów genów do innych kompartymentów komórki. N-końcowe sekwencje są odpowiedzialne za kierowanie do ER, apoplastu, i zewnątrzkomórkowego wydzielania z komórek aleuronu (Koehler & Ho, Plant Celi 2: 769-783 (1990)). Dodatkowo, N-końcowe sekwencje w połączeniu z C-końcowymi sekwencjami są odpowiedzialne za kierowanie produktów genu do wakuoli (Shinsi i wsp., Plant Molec. Biol. 14:357-368 (1990)).

Przez fuzję odpowiednich sekwencji kierujących opisanych powyżej z sekwencjami interesującego transgenu jest możliwe kierowanie produktu transgenu do dowolnej organelli lub kompartymentu komórki. Dla kierowania do chloroplastów, na przykład, sekwencja sygnałowa z genu RUBISCO, genu CAB, genu syntazy EPSP lub genu GS2 jest połączona w ramce odczytu z N-końcowym ATG transgenu. Wybrana sekwencja sygnałowa powinna obejmować znane miejsce cięcia i skonstruowanafuzja powinna uwzględniać dowolne aminokwasy po miejscu cięcia, które są wymagane do cięcia. W niektórych przypadkach to wymaganie może być spełnione przez dodanie niewielkiej ilości aminokwasów między miejscem cięcia i ATG transgenu lub alternatywnie zastąpienie niektórych aminokwasów sekwencją transgenu. Fuzje skonstruowane dla importu do chloroplastów mogą być testowane pod kątem skuteczności pobierania do chloroplastów przez translację in vitro konstruktów frachtowanych in vivo a następnie przez pobieranie in vitro do chloroplastów stosując techniki molekularne opisane przez (Bartlett i wsp. W: Edelmann i wsp. (red.) Methods in chloroplast molecular biology, Elsevier str. 1081-1091 (1982); Wasmann i wsp. Mol. Gen. Genet, 205: 446-453 (1986)). Te techniki konstrukcji są dobrze znane w dziedzinie i są w tym samym stopniu stosowalne do mitochondriów i peroksysomów. Wybór kierowania, które może być wymagane dla ekspresji transgenów będzie zależał od komórkowej lokalizacji prekursora wymaganego jako punktu wyjścia dla danego szlaku. Będzie ona na ogół Jetosollczna Iub chloroplastowa, choć może w niektórych przypadkach być mitochondrialna lub peroksysomalną. Produkty ekspresji transgenu nie będą normalnie wymagały kierowania do ER, apoplastu lub wodniczki.

Powyżej opisane mechanizmy nakierowewania w komórce mogą być wykorzystane nie tylko w połączeniu ze swymi odpowiednimi promotorami ale także w połączeniu z heterologicznymi promotorami tak by osiąnąć specyficzny cel kierowania pod regulacją transkrepcerną promotora inną niż ten, z którego pochodzi sygnał kierowania.

Przykład 22. Transformacja dwuliściennych

Techniki transformacji dla dwuliściennych są dobrze znane w dziedzinie i obejmują techniki oparte o Agrobacterium i techniki, które nie wymagają Agrobacterium. Techniki nie wymagające Agrobacterium obejmują pobranie egzogennego materiału bezpośrednio przez

187 545 protoplasty lub komórki. Może to być uzyskane przez pobieranie, w którym pośredniczy PEG lub elektroporacja, bombardowanie cząsteczkami lub mikroinjekcję. Przykłady tych technik opisali Paszkowski i wsp., EMBO J. 3:2717-2722 (1984), Potrykus i wsp., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich i wsp., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986) i Klein i wsp., Nature 327, 70-73 (1987). W każdym przypadku transformowane komórki są regenerowane do całych roślin stosując standardowe techniki znane w dziedzinie.

Transformacja, w której pośredniczy Agrobacterium jest preferowaną techniką transformacji dwuliściennych ze względu na swoją wysoką wydajność transformacji i szeroką stosowalność do wielu różnych gatunków. Wiele gatunków roślin uprawnych, które można rutynowo transformować Agrobacterium obejmuje tytoń, pomidory, słonecznik, bawełnę, rzepak oleisty, ziemniak, soję, lucernę i topolę (EP 0 317 511 (bawełna), EP 0 249 432 (pomidor, dla Calgene), WO 87/07299 (Brassica, dla Calgene), US 4,795,855 (topola).

Transformacja docelowego gatunku roślin przez zrekombinowany Agrobacterium na ogół obejmuje kokultywację Agrobacterium z eksplantami z rośliny i zachodzi według protokołów dobrze znanych w dziedzinie. Tkanka stransformowana jest regenerowana na pożywce selekcyj-nej zawierającej marker oporności na antybiotyk lub herbicyd obecny między granicami dwuskładnikowego plazmidu T.

Przykład 23. Transformacja jednoliściennych

Transformacja większości gatunków jednoliściennych jest obecnie rutynowa. Preferowane techniki obejmują bezpośredni transfer genów do protoplastów z zastosowaniem PEG lub technik elektroporacji, i bombardowanie cząsteczkami tkanki kalusa. Transformacje mogą być przeprowadzane pojedynczym rodzajem DNA lub wieloma rodzajami DNA (np. kotransformacja) i obie te techniki są odpowiednie do stosowania z niniejszym wynalazkiem. Kotransformacja może mieć zaletę unikania konstrukcji złożonych wektorów i generowania roślin transgenicznych z niesprzężonymi loci dla interesującego genu i markera selekcyjnego pozwalając na usunięcie markera w kolejnych pokoleniach, o ile to jest uważane za pożądane. Jednak wadą stosowania kotransformacji jest mniejsza niż 100% częstość, z którą oddzielne rodzaje DNA są wintegrowywane do genomu (Schocher i wsp., Biotechnology 4: 1093-1096 (1986).

Zgłoszenia patentowe EP 0 292 435 (dla Ciba Geigy) oraz EP 0 392 225 (dla Ciba Geigy) i WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisują techniki przygotowania kalusów i protoplastów z elitarnej linii wsobnej kukurydzy, transformację protoplastów z zastosowaniem PEG lub elektroporacji i regenerację roślin kukurydzy ze stransformowanych protoplastów. GordonKamm i wsp., Plant Cell 2: 603-618 (1990)) i Fromm i wsp., Biotechnology 8:833-839 (1990) opublikowali techniki transformacji linii kukurydzy pochodzącej od Al88 stosując bombardowanie cząsteczkami. Dodatkowo, publikacja WO 93/07278 (dla Ciba-Geigy) i Kozieł i wsp., Biotechnology 11: 194-200 (1993) opisują techniki dla transformacji elitarnych wsobnych linii kukurydzy za pomocą bombardowania cząsteczkami. Technika ta stosuje niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5-2 mm wycięte z kłosa kukurydzy 14-15 dni po zapyleniu i urządzenie biolistyczne PDS-lOOOHe do bombardowania.

Transformacja ryżu może też być przeprowadzona za pomocą technik bezpośredniego przenoszenia genów stosując protoplasty lub bombardowanie cząsteczkami. Transformacja w której pośredniczą protoplasty była opisana dla typów Japonica i typów Indica (Zhang i wsp., Plant Cell Rep. 7:379-384 (1988); Shimamoto i wsp., Nature 336:274-277 (1989); Datta i wsp., Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Oba typy także mogą być rutynowo transformowane stosując bombardowanie cząsteczkami (Christou i wsp., Biotechnology 9:957-962 (1991).

Zgłoszenie patentowe EP 0 332 581 (dla Ciba-Geigy) opisuje techniki dla generacji, transformacji i regeneracji protoplastów Pooideae. Techniki te pozwalają na transformację Dactylis i pszenicy. Dodatkowo, transformacja pszenicy, którą opisali Vasil i wsp., Biotechnology 10:667-674(1992)) stosując bombardowanie cząsteczkami kalusa długoterminowego typu C, a także Vasil i wsp., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)) i Weeks i wsp., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) stosując bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków i kalusa pochodzącego od niedojrzałych zarodków. Korzystna technika transformacji pszenicy

187 545 obejmuje jednak transformację pszenicy przez bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków i obejmuje etap albo z wysoką sukrozą albo wysoką maltozą przed podaniem genu. Przed bombardowaniem dowolna ilość zarodków (0,75 - 1 mm długości) jest wysiewana na pożywkę MS z 3% sukrozą (Murashige i Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)) i 3 mg/ml 2,4-D dla indukcji somatycznych zarodków, która zachodzi w ciemności. W wybranym dniu bombardowania zarodki są usuwane z pożywki indukcyjnej i umieszczane w osmoticum (tzn. pożywce indukcyjnej z dodaną sukrozą lub maltozą w pożądanym stężeniu, typowo 15%). Następnie pozwala się na zajście plazmolizy u zarodków przez 2-3 godziny i poddaje się je bombardowaniu. Dwadzieścia zarodków na płytce jest typowe, choć nie jest krytyczne. Odpowiedni plazmid niosący gen (taki jak pCIB3064 lub pSG35) jest strącany na cząsteczki złota o wielkości mikrometra stosując standardowe procedury. Do każdej płytki z zarodkami strzela się z urządzenia DuPont Biolistics- hel stosując ciśnienie strzału ok. 1000 psi i standardowy ekran o sieci 80. Po bombardowaniu zarodki umieszcza się ponownie w ciemności by doszły do siebie przez około 24 godz (nadal na osmoticum). Po 24 godz. zarodki usuwane są z osmoticum i umieszczane ponownie na pożywce indukcyjnej, na której pozostają przez miesiąc przed regeneracją. Około jeden miesiąc później eksplanty zarodków z rozwijającym się embriogennym kalusem są przenoszone na pożywkę regeneracyjną (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA) dodatkowo zawierającą odpowiedni czynnik selekcyjny (10 mg/1 basta dla pCIB3064v i 2 mg/1 metotreksatu dla pSOG35). Po około miesiącu rozwinięte pędy przenosi się do większych sterylnych pojemników znanych jako „GA7” które zawierają MS o połowie stężenia, 2% sukrozę i to samo stężenie czynnika selekcyjnego. Zgłoszenie patentowe WO 94/13822 opisuje sposoby transformacji pszenicy i jest tu włączone w formie odniesienia.

Przykład 24. Izolowanie sekwencji promotora protox-l Arabidopsis thaliana

Bibliotekę genomową z Arabidopsis thaliana (Columbia, cala roślina) w lambda Zap II nabyto od Stratagene. Około 125000 fagów wysiano z gęstością 25000 pfu na 15 cm szalkę Petriego i sporządzono duplikaty na membrany Colony/Plaąue Screen (NEN Dupont). Odbicia płytek na filtrach sondowano cDNA Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR:1 wyznakowana za pomocą 32-P dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji i płukania były w 65°C jak opisali Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA S1:1991 -1995 (1984). Dodatnie hybrydyzujące łysinki oczyszczano i in vivo wycinano do plazmidów pBluescript. Sekwencje z wstawek genomowego DNA określano za pomocą metody terminacji łańcucha stosując terminatory dideoksy wyznaczone stosując barwniki fluoryzujące (Applied Biosystems, Inc.). Stwierdzono, że jeden klon, AraPTIPro, zawiera 580 bp sekwencji Arabidopsis przed inicjującą metioniną (ATG) sekwencji kodującej białka Protox-1. Klon ten także zawiera sekwencje kodujące i introny które sięgają do 1241 bp sekwencji cDNA Protox-1. 580 bp 5' nie kodującego fragmentu stanowi przypuszczalny promotor Protox-1 Arabidopsis, i sekwencja jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 13.

AraPTIPro zdeponowano 15 grudnia, 1995 jako pWDC-11 (NRRL #B-21515).

Przykład 25. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmieniony gen Protox-1 za naturalnym promotorem Protox-1.

cDNA pełnej długości odpowiedniego zmienionego cDNA Protox-1 Arabidopsis wyizolowano jako częściowy produkt trawienia EcoRI-Xhol i sklonowano w roślinnym wektorze ekspresyjnym pCGN1761ENX (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe Nr PCT/TB95/00452, opublikowane jako WO 95/34659, przykład 9). Plazmid ten strawiono Ncol i BamHI aby wyprodukować fragment złożony z całkowitego cDNA Protox-1 plus terminator transkrypcji z nie ulegającej translacji 3' sekwencji genu tml Agrobacterium tumefaciens. Plazmid AraPTIPro opisany powyżej został strawiony Ncol i BamHI aby wyprodukować fragment złożony z pBluescript i 580 bp przypuszczalnego promotora Protox-1 Arabidopsis. Ligacja tych dwóch fragmentów wytworzyła fiizję zmienionego cDNA protox do naturalnego promotora protox. Kaseta ekspresyjna zawierająca fuzję promotor Protox-l/cDNA Protox-1/ terminator tml została wycięta za pomocą trawienia KpnI i sklonowana w wektorze dwuskładnikowym pCIB200. Plazmidem dwuskładnikowym transformowano przez elektroporację do Agrobacterium i następnie do Arabidopsis stosując technikę nasączania w próżni (Bechtold i wsp., C.R.

187 545

Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199 (1993). Transformanty wyrażające zmienione geny protox wybierano na kanamycynie Iub na różnych stężeniach herbicydu hamującego protox.

Przykład 26. Produkcja roślin tolerancyjnych w stosunku do herbicydu przez ekspresję fuzji naturalny promotor fotoK-l/zmieniony protox-l.

Stosując procedurę opisaną powyżej, cDNA Protox-l Arabidopsis zawierający zmianę TAC na ATG (tyrozyna na metioninę) w nukleotydach 1306-1308 w sekwencji Protox-l (SEKW. ID NR:1) połączono z fragmentem naturalnego Protox-l i wtransformowano do Arabidopsis thaliana. Wykazano, że ten zmieniony enzym Protox-l (AraC-2Met) jest >10 razy bardziej tolerancyjny na różne herbicydy hamujące protox niż naturalnie występujący enzym gdy jest testowany w uprzednio opisanym bakteryjnym systemie ekspresji. Nasiona z naczyń nasączonych pod próżnią zbierano i wysiewano na zakresie (10,0 nm-1,0 uM) hamującego protox herbicydu arylouracylowego o wzorze XVII. Wielokrotne doświadczenia z dzikim Aradidopsis wykazały, że 10,0 nM stężenie tego związku wystarcza by zapobiec normalnemu kiełkowaniu siewek. Transgeniczne nasiona wyrażające zmieniony enzym AraC-2Met w formie fuzji z naturalnym promotorem Protox-l produkowały normalne siewki Arabidopsis przy stężeniach herbicydu do 500 nM, wykazując przynajmniej 50-krotnie większą oporność na herbicyd w porównaniu z dzikim Arabi-dopsis. Ta fuzja promotor/zmieniony enzym protox działa więc jako skuteczny selekcyjny marker do transformacji roślin. Kilka z roślin, które wykiełkowały ma 100,0 nM herbicydzie hamującym protox transplantowano do gleby, hodowano 2-3 tygodnie i testowano w oznaczeniu sprajowym z różnymi stężeniami herbicydu hamującego protox. Gdy porównano z transformacją kontrolami złożonymi z samego wektora, transgemki AraPTPro/AraC-2Met były 10 razy bardziej tolerancyjne na spray herbicydu.

Przykład 27. Wykazanie tolerancji krzyżowej mutacji opornych na różne związki hamujące protox w oznaczeniu kiełkowania Arabidopsis.

Stosując procedurę opisaną powyżej cDNA protox-1 Arabidopsis zawierający zarówno zmianę TAC na ATC (tyrozyna na izoleucynę) w nukleotydach 1306-1398 i zmianę TCA na TTA (seryna na leucynę) w nukleotydach 945-947 w sekwencji Protox-1 (SEKW. ID NR:1) został podłączony do naturalnego fragmentu promotora Protox-1 i wtransformowany do Arabidopsis thaliana. Stwierdzono, że ten zmieniony enzym Protox-l (AraC-211e + AraC305Leu) jest >10 razy bardziej tolerancyjny na hamujący protox herbicyd arylouraculowy o wzorze XVII niż naturalny enzym badany w systemie bakteryjnym (p. przykłady 8-12). Homozygotyczne linie Arabidopsis zawierające tę fuzję generowano z transformantów, które wykazywały wysoką tolerancję na herbicyd hamujący protox w oznaczeniu kiełkowania siewek jak opisano powyżej. Nasiona z jednej linii przetestowano na oporność krzyżową na różne związki hamujące protox przez powtórzenie testu kiełkowania na stężeniach związków, dla których pokazano, że hamują kiełkowanie w dzikim Arabidopsis. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4.

Tolerancja krzyżowa na różne inhibitory prolox w teście kiełkowania nasion.

Wzór	Nazwa zwyczajowa	Tolerancja
1	2
II	acifluorofen	+
III	fomasafen	+
IV	tluoroglykofen	±
IVb	bifenoks	+
IVc	oksyfluorofen	+
IVd	laktofen	±
VIIa	flutiacet-metyl

187 545

c.d. tabeli 4

1	2	3
X	sulfentrazone	+
XI	flupropazyl	++
XIV	ftumiklorak	+
XVI	flumioksazyn	+++
XVII
XXIa	BAY11340	+
XXII		++

± < 10 x bardziej tolerancyjny niż dziki + < 10 x bardziej tolerancyjny niż dziki ++ > 100 x bardziej tolerancyjny niż dziki +++ > 100 x bardziej tolerancyjny niz dziki

Przykład 28. Izolowanie sekwencji promotora Protox-1 kukurydzy

Bibliotekę genomowąDNA z Zea mays (Missouri 17, linia wsobna, etiolowane siewki) w lambda FIX II nabyto od Stratagene. Około 250000 pfu biblioteki wysiano w gęstości 50000 fagów na 15 cm szalkę Petriego i sprządzono duplikaty na membrany Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Odbicia płytek na filtrach sondowano cDNA Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR:5) wyznakowanej za pomocą 32-P dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji i płukania były w 65°C jak opisali Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984). DNA fagów lambda izolowano z trzech dodatnio hybrydyzujących fagów stosując Wizard Lambda Preps Purification System (Promega). Analiza za pomocą trawienia restrykcyjnego, wzorów hybrydyzacji i analizy sekwencji DNA pozwoliły na identyfikację klonu lambda zawierającego około 3,5 kb genomowego DNA kukurydzy położonego 5' przed sekwencją kodującą Protox-1 kukurydzy uprzednio wyizolowaną jako klon cDNA. Fragment ten także zawiera promotor Protox-1 kukurydzy. Sekwencja tego fragmentu jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 14. Od nukleotydu 1 do 3532 sekwencja ta składa się z sekwencji 5' nie kodującej. Od nukleotydu 3533 do 3848 sekwencja ta koduje 5' koniec białka Protox-1 kukurydzy.

Plazmid zawierający sekwencję SEKW. ID NR: 14 w postaci fuzji z resztą sekwencji kodującej Protox-1 kukurydzy zdeponowano 19 marca, 1996 jako pWDC-14 (NRRL#B21546).

Przykład 29. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmienione geny Protox-1 za naturalnym promotorem Protox-1 kukurydzy.

Fragment genomowy kukurydzy o długości 3848 bp (SEKW. ID NR: 14) wycięto z wyizolowanego klonu bakteriofaga lambda jako częściowy produkt trawienia Sall-Kpnl i zligowano z fagmentem Kpnl-Notl pochodzącym ze zmienionego cDNA Protox-1 kukurydzy, który zawierał zmianę alaniny na leucynę w aminokwasie 164 (SEKW. ID NR:6). Dało to fuzję naturalnego promotora Protox-1 kukurydzy z cDNA pełnej długości, który, jak wykazano, nadawał tolerancję na herbicyd w układzie bakteryjnym (przykłady 8-13). Fuzję tę wklonowano do wektora pochodzącego od pUC18 zawierającego sekwencję terminatora CaMV 35S aby stworzyć kasetę promotor protox/zmieniony cDNA protox/terminator. Plazmid zawierający tę kasetę określono jako pWcó-1.

Drugi konstrukt do transformacji kukurydzy stworzono przez wprowadzenie pierwszego intronu obecnego w sekwencji kodującej genomowego klonu kukurydzy z powrotem do cDNA kukurydzy. Insercję wprowadzono stosując standardowe techniki fuzji zachodzących na siebie fragmentów PCR. Intron (SEKW. ID NR:25) miał 93 bp długości i został wprowadzony między nukleotydami 203 i 204 SEKW. ID NR:6, dokładnie tak jak występuje w naturalnym

187 545 klonie lambda opisanym w przykładzie 26. Ta zawierająca intron wersja kasety ekspresyjnej została nazwana pWCo-2.

Przykład 30. Wykazanie aktywności promotora Protox-1 kukurydzy w roślinach transgenicznych.

Rośliny kukurydzy transformowane fuzjami promotor protox kukurydzy/zmieniony protox identyfikowano stosując analizę za pomocą PCR z primerami specyficznymi dla transgenu. Całkowity RNA izolowano z roślin dodatnich w teście PCR i przeprowadzano odwrotną transkrypcję stosując Superscript M-MLV (Life Technologies) w zalecanych warunkach. Dwa mikrolitry odwrotnej transkryptazy stosowano w reakcji PCR zaplanowanej aby była specyficzna w stosunku do zmienionej sekwencji protox. Podczas gdy nietransformowane kontrole nie dawały produktu w tej reakcji, około 85% roślin transformowanych pWCo-1 dawało dodatni wynik, wskazując na obecność mRNA pochodzącego z transgenu. Wykazuje to pewien poziom aktywności promotora protox kukurydzy. RNA z transgenicznych roślin kukurydzy także poddawano standardowej analizie typu Northern stosując radioaktywnie wyznakowany fragment cDNA protox kukurydzy z SEKW. ID NR:6 jako sondę. Poziomy mRNA Protox-1 znacząco wyższe od nietransformowanych kontroli wykryto w niektórych roślinach transgenicznych. Przypuszcza się, że ten podwyższony poziom mRNA może być wynikiem ekspresji zmienionego protox-l mRNA ze sklonowanego promotora kukurydzy.

Przykład 31. Izolowanie sekwencji promotora Protox-1 buraka cukrowego

Bibliotekę genomową buraka cukrowego przygotował Stratagene w wektorze Lambda FIX II. Około 300000 pfu biblioteki wysiano i sondowano cDNA Protox-1 buraka cukrowego (SEKW. ID NR: 17) jak opisano dla kukurydzy w przykładzie 28. Analiza za pomocą trawienia restrykcyjnego, wzorów hybrydyzacji i analizy sekwencji DNA pozwoliły na identyfikację klonu lambda zawierającego około 7 kb genomowego DNA buraka cukrowego położonego 5' przed sekwencją kodującą Pro tox-l buraka cukrowego uprzednio wyizolowaną jako klon cDNA. Fragment Pstl-Sall o wielkości 2606 kb subklonowano z klonu lambda do wektora pBluescript. Fragment ten zawiera 2068 bp sekwencji nie kodującej 5' i zawiera sekwencję promotora protox-l buraka cukrowego. Zawiera też pierwsze 453 bp sekwencji kodującej protox-l i pierwszy intron 85 bp zawarty w sekwencji kodującej. Sekwencja tego fragmentu jest przedstawiona w SEKW. ID NR:26.

Plazmid zawierający sekwencję SEKW. ID NR:26 zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pWDC-20 (NRRL#B-21650).

Przykład 32. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmienione geny Protox-1 buraka cukrowego za naturalnym promotorem Protox-1 buraka cukrowego.

Fragment genomowy buraka cukrowego (SEKW. ID NR:26) wycięto z genomowego subklonu opisanego w przykładzie 31 jako fragment Sacl-BsrGl, który zawiera 2068 bp sekwencji 5' nie kodującej i pierwsze 300 bp sekwencji kodującej Protox-1 buraka cukrowego. Fragment ten zligowano z fagmentem BsrGI-Notl pochodzącym ze zmienionego cDNA Protox-l buraka cukrowego, który zawierał zmianę tyrozyny na metioninę w aminokwasie 449 (SEKW. ID NR: 18). Dało to fuzję naturalnego promotora Protox-1 buraka cukrowego z cDNA pełnej długości, który, jak wykazano, nadawał tolerancję herbicydu w układzie bakteryjnym (przykłady 8-13). Fuzję tę wklonowano do wektora pochodzącego od pUC18 zawierającego sekwencję terminatora CaMV 35S aby stworzyć kasetę promotor protox/zmieniony cDNA protox/terminator. Plazmid zawierający tę kasetę określono jako pWco-3.

Przykład 33. Produkcja roślin tolerancyjnych dla herbicydu przez ekspresję fuzji naturalny promotor Protox-1 buraka cukrowego/zmieniony protox-l buraka cukrowego

Kasetę ekspresyjną z pWCo-3 wtransformowano do buraka cukrowego stosując dowolną z metod transformacji używanych do roślin dwuliściennych, w tym techniki z Agrobacterium, protoplastami i biolistyczne. Transgeniczne rośliny wyrażające zmieniony enzym protox identyfikowano stosując analizę za pomocą RNA-PCR i badano u nich tolerancję dla herbicydów hamujących protox w stężeniach zabójczych dla nietransformowanych buraków cukrowych.

187 545

Dział D : Ekspresja genów protox w plastydach roślin

Przykład 34. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego clpP i naturalną sekwencję 5' nie ulegającą translacji clpP w formie fuzji z genem reporterowym GUS i 3' nieulegające translacji sekwencje genu plastydowego rpsló w wektorze do transformacji plastydu.

I. Amplifikacja produktu promotora genu plastydu tytoniu clpP i całej 5' nie ulegającej translacji (5' UTR) części RNA

Całkowity DNA z N. tabacum c.v. „Xanthi NC” stosowano jako matrycę dla PCR z primerem „nici górnej” od lewej do prawej zawierającym wprowadzone miejsce restrykcyjne EcoRI w pozycji -197 w stosunku do kodonu start ATG konstytutywnie wyrażanego genu plastydowego clpP (primer PclpPla: 5''-gcggaąttęatatacttatttatcattagaaag-3' (SEKW. ID NR:27); miejsce restrykcyjne EcoRI podkreślone), i primer „nici dolnej” prawa do lewej homologiczny do regionu -21 do -1 względem kodonu start ATG promotora clpP który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne na starcie translacji (primer Pclp_P2b: 5''-gcgccatggtaaatgaaagaaagaactaaa-3 (SEKW. ID NR:28); miejsce restrykcyjne Ncol podkreślone). Tę reakcję PCR przeprowadzono za pomocą termostabilnej polimerazy DNA Pfu (Stratagene, La Jolla CA) w Perkin Elmer Thermal Cycler 480 zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) w sposób następujący: 7 min 95°C, a następnie 4 cykle 1 min 95°C/ 2 min 43°C/1 min 72°C, potem 25 cykli 1 min 95°C/ 2 min 55°C/1 min 72°C. Produkt amplifikacji 213 bp zawierający promotor i obszar 5' nie ulegający translacji genu clpP zawierający miejsce EcoRI na lewym końcu i miejsce Ncol na ich prawym końcu i odpowiadający sekwencji nukleotydów 74700 do 74505 sekwencji plastydowego DNAN.tabacum (Shinozaki i wsp., EMBO J. 5:2043-2049 (1986)) oczyszczano na żelu stosując standardowe procedury i strawiono EcoRI i Ncol (wszystkie enzymy restrykcyjne nabyto od New England Biolabs, Beverly, MA).

II. Amplifikacja 3' nie ulegającej translacji sekwencji RNA (3'UTR) genu rpsló z plastydu tytoniu

Całkowity DNA z N. tabacum c.v. „Xanthi NC” stosowano jako matrycę dla PCR z jak opisano powyżej z primerem „nici górnej” od lewej do prawej zawierającym wprowadzone miejsce restrykcyjne Xbal zaraz za kodonem stop TAA genu plastydowego rps16 kodującego białko rybosomalne S16 (primer rps16P1a (5-GCGTCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG-3' (SEKW. ID NR:30); miejsce restrykcyjne Xbal podkreślone), i primer „nici dolnej” prawa do lewej homologiczny do regionu +134 do +151 względem kodonu stop TAA rps16, który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne Hindlll na 3' końcu UTR rpsló (primer rps16P1b (5 '-CGCAAGCTTCAATGGAAGCAATGATAA-3 ' (SEKW. ID NR:31);

miejsce restrykcyjne Hindlll podkreślone). Produkt amplifikacji 169 bp zawierający obszar 3' nie ulegający translacji genu rpsló zawierający miejsce Xbal na lewym końcu i miejsce Hindlll na prawym końcu i odpowiadający sekwencji nukleotydów 4943 do 5093 sekwencji DNA pla-stydu N. tabacum (Shinozaki i wsp., (1986)) oczyszczano na żelu stosując standardowe procedury i strawiono Xbal i Hindlll.

III. Ligacja fragmentu genu reporterowego GUS do promotora genu clpP i 5' i 3' UTR

Za pomocą trawienia Ncol i Xbal uzyskano fragment 1864 bp genu reporterowego (3galakturorndazy (GUS) pochodzący z pRAJ275 (Clontech) zawierający miejsce restrykcyjne Ncol w kodonie start ATG i miejsce Xbal za naturalnym 3' UTR. Ten fragment ligowano w czteroskladnikowej reakcji z fragmentem 201 bp EcoRI/Ncol promotora clpP, fragmentem 157 bp Xbal/HindIII rps16 3' UTR i fragmentem 3148 bp EcoRI/Hindlll z wektora do klonowania pGEM3Zf(-) (Promega, Madison, WI) aby skonstruować plazmid pPH138. Wektor do transformacji plastydów pPH140 skonstruowano przez strawienie plazmidu pPRVllla (Zoubenko i wsp., 1994) EcoRI i Hindlll i ligację powstałego fragmentu 7287 bp z fragmentem 2222 bp EcoRI/Hindlll pPH138.

187 545

Przykład 35. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego tytoniu clpP plus minimalną sekwencję 5' nie ulegającą translacji genu psbA z plastydu tytoniu w formie ruzji z genem reporterowym GUS i 3' nie ulegającą translacji sekwencją genu plastydowego rpsló w wektorze do transformacji plastydu.

AmpliflkaJja produktu promotora genu plastydu tytoniu clpP i całkowitej 5' sekwencji nie ulegającej translacji (5' UTR). Całkowity DNA z N. tabacum c.v. „Xanthi NC” stosowano jako matrycę dla PCR z primerem „nici górnej” od lewej do prawej Pclp_Pla (SEKW. ID NR:27) i primerem „nici dolnej” prawa do lewej homologicznym do regionu -34 do -11 względem kodonu start ATG promotora clpP który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne Xbal w 5' UTR clpP w pozycji -11 (primer Pclp-Płb: 5' - gcgtctagaaagaaJtaaatactatatttcac3' (SEKW. ID NR:29); miejsce restrykcyjne Xbal podkreślone). Produkt amplifikacji 202 bp zawierający promotor i ucięty 5' UTR genu clpP zawierający miejsce EcoRI na lewym końcu i miejsce Xbal na prawym końcu oczyszczano na żelu i strawiono Xbal. Miejsce Xbal następnie wypełniono polimerazą DNA Klenowa (New England Biolabs) i strawiono fragment EcoRI. Następnie fragment ten wligowano w reakcji 5-składnikowej do dwuniciowego fragmentu DNA odpowiadającego ostatnim 38 nukleotydom i kodonowi start ATG 5' UTR genu plastydowego psbA tytoniu (z Jednoniciowem miejscem restrykcyjnym Ncol („overhang”) wprowadzonym do kodonu start ATG) który został stworzony przez hybrydyzację syntetycznego oligonukleotydu imiⁿpsb_U (górna nić: 5-gggagtJcctgatgattaaataaaccaagattttaJ-3' (SEKW. ID NR:32)) oraz minpsb_i (dolna nić: 5-JatggtaaaatcttggtttatttaatcatJagggactcJc-3' (SEKW ED NO:33); podkreślone jednoniciowe miejsce 5' Ncol), fragmentu genu reportero-wego GUS Ncol/Xbal opisanego powyżej, fragmentu Xbal/HindIII rpsló 3'UTR opisanego powyżej i fragmentu EcoRI/Hindlll pGEMZf(-) opisanego powyżej aby skonstruować plazmid pPH139. Wektor do transformacji plastydów pPH144 skonstruowano przez trawienie plazmidu pRVllla (Zoubenko i wsp., Nuci Acids Res. 22:3619-3824 (1994) EcoRI i Hind III i ligac^ powstałego fragmentu 7827 bp do fragmentu 2251 EcoRI/Hindlll pPH139.

Przykład 36. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego tytoniu i całkowitą nie ulegającą translacji sekwencję 5' w formie fuzji z sekwencją kodującą Protox-1 Arabidopsis i 3' nie ulegającą translacji sekwencją genu plastydowego rpsl 6 w wektorze do transformacji plastydów tytoniu

Minipreparat DNA z plazmidu AraC-2Met zawierającego wstawkę Notl, która zawiera sekwencję cDNA z genu oksydazy protoporfirogenu IX („PROTOX”) kodującej fragment Nkońcowego plastydowego peptydu sygnałowego, cDNA pełnej długości i część nie ulegającej translacji obszaru 3' zastosowano jako matrycę do PCR jak opisano powyżej stosując primer „nici górnej” od lewej do prawej (z homologiądo nukleotydów +172 do +194 względem kodonu start ATG białka prekursora o pełnej długości) zawierający wprowadzone miejsce restrykcyjne Ncol i nowy kodon start ATG na wydedukowanym miejscu startu dojrzałego białka PROTOX (primer APR! XP1a: ,

5'- GGGACCATGGATTGTGTGATTGTCGGCGGAGG-3 - (SEKW. ID NR:34); miejsce restrykcyjne Ncol podkreślone), i primer „nici dolnej” prawa do lewej homologiczny do regionu +917 do +940 względem naturalnego kodonu start ATG białka prekursorowego PROTOX (primer APRTXPlb: 5'-CTCCGCTCTCCAGCTTAGTGATAC-3' (SEKW. ID NR:35)). Produkt amplifikacji 778 bp trawiono Ncol i Sful i powstały fragment 682 bp ligowano do fragmentu 844 bp Sful/Notl z AraC-2Met zawierającym 3' część sekwencji kodującej PROTOX i fragment 2978 bp Ncol/Notl wektora do klonowania pGEMZf(+) (Promega, Madison, WI) aby skonstruować plazmid pPH141. Wektor do transformacji plastydów pPH143 zawierający promotor clpP sterujący genem oporności na 276'854 SVl-Met PROTOX z 3' UTR rpsló skonstruowano przez trawienie pPH141 Ncol i Sspl i izolację fragmentu 1491 bp zawierającego pełną sekwencję kodującą PROTOX, trawienie produktów PCR rpsl6P_la i r^^l6P_l b opisanych powyżej Hindlll i ligację z fragmentem 7436 bp ^01^^111 pPH140.

Przykład 37. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego clpP tytoniu plus minimalną nie ulegającą translacji 5' sekwencję genu psbA w formie fuzji z sekwencją kodującą Protox-1 Arabidopsis thaliana i 3' nie ulegającą translacji sekwencją genu plastydowego rps16 w wektorze do transformacji plastydów tytoniu

187 545

Wektor do transformacji plastydów pPH145 zawierający fuzję promotor clpP/5'UTR psbA sterujący genem oporności na 276'854 PROTOX SVl-Met z 3' UTR rpsló skonstruowano przez strawienie pPH141 Ncol i Sspl i izolację fragmentu 1491 bp zawierającego kompletną sekwencję kodującą PROTOX, strawienie produktów PCR r3sl6P_la i rpslóP_lb opisanych powyżej Hindlll i ligację ich do fragmentu EcoRI/Hindlll 7465 bp pPH 144.

Przykład 38: Biolistyczna transformacja genomu plastydowego tytoniu

Nasiona Nicotiana tabacum c.v. „Xanthi nc” kiełkowano siedem na płytkę w 1 calowym kolistym ustawieniu na pożywce T z agarem i bombardowano 12-14 dni po zasianiu 1 mm wolframowymi cząsteczkami (M 10, Biorad, Hercules, CA) powleczonymi DNA z plazmidów pPH143 i pPH145 zasadniczo jak opisano (Svab, Z i Maliga, P (1993) PNAS 90. 913-917). Bombardowane siewki inkubowano na pożywce T przez dwa dni po czym liście odcinano i umieszczaną stroną. odosiową w górę w jasnym świetle (350-500 mmol fotonów/m²/sek) na płytkach z pożywką RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. i Maliga, P. (1990) PNAS 87:85268530) zawierającym 500 mg/ml chlorowodorku spektynomycyny (Sigma, St. Louis, Mo.). Oporne pędy pojawiające się poniżej wyblakłych liści trzy do ośmiu tygodni po bombardowaniu subklonowano na tę samą pożywkę selekcyjną, pozwalano im wytworzyć kalus, i izolowano i subklonowano pędy drugorzędowe. Całkowitą segregację kopii stransformowanych genomów plastydowych (homoplazmatyczność) w niezależnych subklonach oceniano standardowymi technikami Southerna (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: a Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Trawiony BamHl/EcoRl całkowity DNA komórkowy (Mettler 1. K. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5:346-349) oddzielano na 1%o żelach agarozowych w 1% Tris-boranie (TBE), przenoszono na nylonowe membrany (Amersham) i sondowano znakowaną metodą losowych primerów ³²P sekwencją DNA odpowiadającą fragmentowi 0.7 kb BamHI/Hindlll z pC8 zawierającym część sekwencji kierującej do plastydu rps7/12. Homoplazmatyczne siewki ukorzeniano aseptycznie na pożywce MS/IBA zawierającej spektynomycynę (McBride K. E. i wsp. (1994) pNaS 91, 7301-7305) i przenoszono do szklarni.

187 545

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Sandra Volrath

Marie Johnson Sharon Potter Eric Ward Peter Heifetz (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Cząsteczki DNA kodujące roślinną oksydazą protoporfirynogenu i jej oporne na inhibitory mutanty (iii) LICZBA SEKWENCJI: 35 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT: Novartis Corporation (B) ULICA: 520 White Plains Road, P.O. Box 2005 (c) MIASTO: Tarrytown (D) STAN: NY (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 10591-9005 (v) - SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentiń Release #1.0, Version #1.30 (vi) OBOWIĄZUJĄCE DANE ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/012,705 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-LUT-1996

187 545 (vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/013,612 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-LUT-1996 (vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/020,003 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-LIP-1996 (viii) INFORMACJE DOT. AGENTA/PEŁNOMOCNIKA:

(A) NAZWISKO: Timothy J. Meigs (B) NR REJ.: 38,241 (C) REFERENCJE\NUMER: CGC 1847 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: (919) 541-8587 (B) TELEFAX: (919) 541-8689 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1719 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-2 (NRRL B-21238) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 31..1644 (A) INNE INFORMACJE:/produktd „Protox-1 xrabidapsis” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 1:

TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG 54 Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro

5

187 545

ACG ACT CAA TCG

CTT Leu

CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA

102

Thr Thr

Gln

Ser

Leu

Pro 15

Ser

Phe

Ser

Lys

Pro 20

Asn

Leu

Arg

Leu

10

AAT

GTT

TAT

AAG

CCT

CTT

AGA

CTC

CGT

TGT

TCA

GTG

GCC

GGT

GGA

CCA

150

Asn

Val

Tyr

Lys

Pro

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

Ser

Val

Ala

Gly

Gly

Pro

25

30

35

40

ACC

GTC

GGA

TCT

TCA

AAA

ATC

GAA

GGC

GGA

GGA

GGC

ACC

ACC

ATC

ACG

198

Thr

Val

Gly

Ser

Ser

Lys

Ile

Glu

Gly

Gly

Gly

Gly

Thr

Thr

Ile

Thr

45

50

55

ACG

GAT

TGT

GTG

ATT

GTC

GGC

GGA

GGT

ATT

AGT

GGT

CTT

TGC

ATC

GCT

246

Thr

Asp

Cys

Val

Ile

Val

Gly

Gly

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

60

65

70

CAG

GCG

CTT

GCT

ACT

AAG

CAT

CCT

GAT

GCT

GCT

CCG

AAT

TTA

ATT

GTG

294

Gln

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Pro

Asp

Ala

Ala

Pro

Asn

Leu

Ile

Val

75

80

85

ACC

GAG

GCT

AAG

GAT

CGT

GTT

GGA

GGC

AAC

ATT

ATC

ACT

CGT

GAA

GAG

342

Thr

Glu

Ala

Lys

Asp

Arg

Val

Gly

Gly

Asn

Ile

Ile

Thr

Arg

Glu

Glu

90

95

100

AAT

GGT

TTT

CTC

TGG

GAA

GAA

GGT

CCC

AAT

AGT

TTT

CAA

CCG

TCT

GAT

390

Asn

Gly

Phe

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

105

110

115

120

CCT

ATG

CTC

ACT

ATG

GTG

GTA

GAT

AGT

GGT

TTG

AAG

GAT

GAT

TTG

GTG

4 38

Pro

Met

Leu

Thr

Met

Val

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp

Leu

Val

125

130

135

TTG

GGA

GAT

CCT

ACT

GCG

CCA

AGG

TTT

GTG

TTG

TGG

AAT

GGG

AAA

TTG

486

Leu

Gly

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Gly

Lys

Leu

140

145

150

AGG

CCG

GTT

CCA

TCG

AAG

CTA

ACA

GAC

TTA

CCG

TTC

TTT

GAT

TTG

ATG

534

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

155

160

165

AGT

ATT

GGT

GGG

AAG

ATT

AGA

GCT

GGT

TTT

GGT

GCA

CTT

GGC

ATT

CGA

582

Ser

Ile

Gly

Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

170

175

180

CCG

TCA

CCT

CCA

GGT

CGT

GAA

GAA

TCT

GTG

GAG

GAG

TTT

GTA

CGG

CGT

630

Pro

Ser

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

185

190

195

200

AAC

CTC

GGT

GAT

GAG

GTT

TTT

GAG

CGC

CTG

ATT

GAA

CCG

TTT

TGT

TCA

678

Asn

Leu

Gly

Asp

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

205

210

215

GGT

GTT

TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCA

AAA

CTG

AGC

ATG

AAA

GCA

GCG

TTT

726

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

220

225

230

187 545

GGG	AAG	CTT	TGG3	/AA	CTA
Gly	Lys	Val 205	Τη?	Lys	Leu

GAG	CAC ACT GGT GGA /GGG
Glu	Gln 220	Asn	Gly	Gly	Ser

ΑΤΑ ΑΤΑ GGT GGT 774

Ile Ile Gly Gly

245

ACT TTT AAG GCA ATT CAG Thr Phe Lys Ala Ile Gln

250

GAG	Am	ACA	AAC	G(CT	CCC
Glu	Arg	Lys	Asn	Ala	Pro
255					260

AAG GCA GAA CGA 322

Lys Ala Glu Arg

GAC CCG

CGC Arg

CTG Leu

CCA Pro

AAC Lys 200

CCA Pro

CTAG Gln

GGC Giy

atc Gln

ACA Thr 205

GTTT Val

GGT Gly

TCT Ser

TTC Phe

AGG Arg 280

Asp 265

Pro

AAG

GGA

CTT

CGA

ATG

HG

CCA

GAC

GCA

ATA

TTC

GCA

AGA

HA

GGT

AGC

Lys

Gly

Leu

Arg

Met

Leu

Pro

Glu

AA a

Hu

Sse

LTu

A^rg

Llu

Gly

Ser

285

2 90

205

AAA

GTT

AAG

TTG

TCT

TGG

ACG

CGTT

TCC.

ggt

AATA

ICC

ACG

icg

GAG

AGC

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Llu

Sse

du

Ile

ITh

Lyy

Llu

Glu

Ssr

000

305

310

GGA

GGA

TAC

AAC

TTA

AAT

TAT

GAG

ACT

car

GAT

GGT

HA

GTT

TCG

GTG

Gly

Gly

Tyr

Asn

Leu

Thh

Tyr

Glu

Tiar

Pro

Asp

Gly

Leu

Val

Ser

Val

015

320

325

CAG

AGC

AAA

AGT

GTT

GTA

ATG

ACG

GTG

CCA

TCT

CAT

GTT

GCA

AGT

GGT

Gln

Ser

Lys

Ser

Val

Val

Met

Thr

Val

Pro

Ser

His

Val

Ala

Ser

Gly

000

335

340

CTC

TTG

CGC

CCT

CTT

TCT

GAC

TCC?

GCT

GCTA

ACT

GCA

CTC

TCA

AAAT

CTA

Leu

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Glu

Ser

Ala

Ala

AAn

Ala

Leu

Ser

Lys

Leu

005

350

355

360

TAT

TAC

CCA

CCA

GTT

GCA

GCA

GTA

TCT

ATC

TCG

TAC

CCC

ACTT

GATT

GCA

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Ser

Ili

Ssr

lyr

Ppo

Lyy

Glu

Ala

065

370

305

ATC

CGA

ACA

GAA

TGT

TTG

AiTi

GAT

GGT

GGC

CCT

ACG

GGT

LTTT

GGG

CAC

Ile

Arg

Thr

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

dy

Glu

Llu

Lyy

Gly

PPh

Gly

Gln

080

308

300

TTG

CAT

CCA

CGC

ACG

CAC.

CGA

GIT

GAC

ACA

ITT

aga

ACT

ATC

TAC

AGC

Leu

His

Pro

Arg

Thr

Gln

Gly

Val

du

Thh

Llu

HU

Thr

Ali

T^r

Ser

095

400

405

0

911

65

1014

1062

1110

115 8

06

51

TGC	TCA	GTC	TTT	CGA	ACT	CGC	GCA	CTG
Ser	Ser 010	Leu	Phe	Pro	Asn	AAg 405	Ala	Ppo
^Τ	TAG	ATT	GGC	GGG	TCTA	ACTA	ACC	ACC
Asn	Tyr	lle	Gly	GUy	Ser-	Thr	Asn	Thr

125 410

GGT	GAG	TTA	GTG	GAA	GCA	CTT	GAC	AGA
GUy	GUu	Leu	Val	GUu 005	Ala	Val	Asp	.'->9

CCC IGA AAA Ppo Hu AAO 420	ATT I1u	HG Llu	CTG Leu	HG Leu	50 02
IGA	ATT	ATT	TCC	ACG	TCT	GAC	10 50
Glu	Ilu	Llu	Ssr	Ly^	Ser	Glu
	435					400
GAT	ATT	AAG	ACA	ATG	CTA	ATT	5 0 9 8
AAp	Llu	AAO	Lyy	Met	Leu	Ile
450					4 55

187 545

AAG CCT AAT

T<C3 Ser 460

ACC GAT CCA CTT

AAA Lys 465

ΆΓΑ GGA

GTT AGG GTA TGG

CCT Pro

14 4 6

Lys

Pro

Asn

Thr Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Val

Arg

Val 470

Τη?

CAA

GCC

AAT

CCC?

CAG

4^

CTA

GCT?

GGT

CCAC

ΆΙΆ

GAT

ATC

CTT

GAC

ACG

1G44

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Llu

Val

Gly

His

Phe

Asp

Ile

Leu

Asp

Thr

475

480

485

GCT

AAA

TTA

TCT

CTA

At^G

TCT

TCG

GGC

TAC

σ.?''

GGG

CTA

'ΓΤΓ

GGT

154 2

Ala

Lys

See

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

Gly

Tyr

Glu

Gly

Leu

Phe

Llu

Gly

490

495

500

GGC

AAT

TAA

GTC

GCT

GGT

GGA

GCC

TTA

GGC

CCG3

TGT

GTA

caa

GGC

GCA

1590 0

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

Gly

GArg

cys

Val

Glu

Gil

AAa

505

510

515

520

TAT

GAA

AAC

GCG

AAT?

GAG

GGT

AAA

.GAC

GTC

ATG

TTCA

CGG

TAC

GCT

TTA

1(33 8

Tyr

Glu

Thr

Ala

1ll

Glu

Val

AAr^

GAs

Ghr

Get

Ser

Tao

“Tr

AAl

TTy

525 530 535

AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT 1691

Lys

TTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA 1719 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 2:

(i) CHE^REKTFRYSTYKE SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 537 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 2:

Met 1

Glu

Leu

Ser Leu 5

Leu

Arg

Ppo

Thr

Thr 10

Cln

Ser

Llu

Leu

Ppo 11

GSr

Phe

Ser

Lys

Pro

Asn

Leu

Arg

Llu

Asn

Val

ITr

Lys

Ppo

Lru

Α'ο

Llu

20

22

33

Arg

Cys

Ser

aal

Ala

Gly

Gly

Pro

Thr

aal

Gly

Ser

Sur

Lys

lir

Glu

35

40

45

Gly

Gly

G ly

Gly

Thr

Thr

Ile

Thr

Thr

Asp

Cys

Val

lle

Val

Gly

Gly

50

55

6(0

Gly

111

e er

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

G1g

Ala

Leu

Ala

Thr

LyT

His

Pro

65

70

7 5

80

Asp

Ala

Ala

Pro

Asn

Leu

lle

Val

Thr

Glu

Ala

Lys

Asp

Arg

Val

dy

85

90

935

Gly

Asn

lle

lle

Thr

Arg

Glu

Glu

Asn

Gly

Phe

Leu

Trp

Glu

Glu

dy

100

105

111

187 545

Pro Asn Ser Phe Gln 115	i Pro Ser Asp Pro Met 120	Leu Thr Met 125	Vai	Vai	Asp
Ser Gly Leu Lys Asp	Asp Leu Val Leu Gly	Asp Pro Thr	Ala	Pro	Arg
130	135	140
Phe Val Leu Trp Asn	Gly Lys Leu Arg Pro	VaI Pro Ser	Lys	Leu	Tho
145	150	155			160
Asp Leu Pro Phe Phe	Asp Leu Met Ser lle	Gly Gly Lys	Ile	Arg	Ala
165	170			175
Gly PPe Gly Ala Leu	Gly Ile Arg Plo eer	Ppo Pro Gly	Grg	(Ols	Glu
180	185		190
Ser Wl Glu Glu Phe	Va 1 Aręj Arg Ain geu	GAs Gsp Glu	Gal	Phe	Glu
195	00 s	205
Arg Leu lle Glu Pro	Phe Cys Ser Gly VaI	Tyo Aia Gly	Asp	Pro	Ser
210	215	220
Lys Leu Ser Met Lys	Sil Ala Phe Giy Lys	VaI Trp Lys	Leu	du	dn
225	230	235			224
Asn Gly Gly Ser Ile	Ile Gly Gly Thr Phe	Lys Ala Ile	Gin	du	Sao
245	220			255
Lys Asn Ala Pro Lys	Ala Glu Arg Asp Pro	Arg Leu Pro	Lys	Pro	Gin
260	266		2-70
Gly Gln Thr Val Gly	Ser PhG Arg Lys Gly	Leu SOrg Met	Leu	Pro	Glu
275	20G	225>
Ala lle Ser Ala Arg	Leu Gly Ser Lys Val	Lys Leu Ser	Top	Lys	Leu
290	2 25	300
Ser Gly lle Thr Lys	Leu Glu Ser Gly Gly	Tyr Asn Leu	Thr	Tys	GGn
305	310	315			332
Thr Pro Asp Gly Leu	VaI Ser VaI Gin Ssu	LLS Ssu Val	Val	Mee	GTh
325	330			333
Val Ppo Ser His Val	ASn Ser Gly Leu Leu	Aog Poo Lm	Ssu	dn	Ser
340	3453		330
Ala Ala Asn Ala Leu	Ser Lys Leu Tyr Tyr	Pro Pro \Μ1	Ala	ASn	Val
355	360	335
Ser Ile Ser tys Pro	Lys Glu Ala Iie Aog	Thr Glu cys	Leu	Iie;	Asp
370	337	380
Gly Glu Leu Lys Gly	Phe Gly Gln Leu HHl	Ppo Sao Thr	dn	dy	Gv1
385	390	395			440
Glu Thr Leu Gly Thr	Ile Tyr Ser Ser Ssr	Llu PPe Ppo	Asn	aao	GSn
405	441			411

187 545

Pro Pro Gly Arg

Leu Leu Leu Asn Tyr lie Gly lly Ser Thr

Asn

420

442

400

Thr lly

lie

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

lly Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

435

440

445

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Me t

Le u

Ile

Lys

PLy

Asn

ros

Tne

rTh

Pro

Leu

450

455

460

Lys

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Tpp

ros

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu

W1

465

470

475

480

lly

His

Phe

Asp

Ile

Leu

App

Thr

Ala

Lys

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

485

490

495

lly

Tyr

Gll

Gly

Llu

Phe

Leu

Gly

All

Asn

Tyr

wa

Ala

Gly

Val

A!a

500

550

510

Leu

lly

Arg

cys

Val

Glu

Gly

All

syr

llu

Thr

AAa

Ile

Glu

Val

Asn

515

522

555

Asn

Phe

Met

Ser

Arg

Tyr

Ala

Tyr

Lys

530

535

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1738 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-2 (NRRL B-21237) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 70..1596 (a) INNE INFORMACJE: /produkt= „Protox-1 arabidopsis”

187 545

108 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3:

TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG

CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ala

10

GTT Val

TCA GGA AAA Ser Gly Lys 15

AGA Arg

GTC GCA GTC GTA GGT GCA GGT GTA AGT GGA CTT

115

Val

Ala 20

Val

Val

Gly

Ala

Gly 25

Val

ser

Gly

Leu

GCG

GCG GGT TAC

AAG

TTG

aaa

TCG

ATC

GGT

TTG

AAT

GTG

ACT

GTC

TCC

004

Ala

Ala Ala Tyr

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

Gly

Leu

Asn

Val

Thr

Vel

Phe

30

355

40

40

GAA

GCT GAT GGA

AGA

GTA

GGT

CGG

ATAG

TCT5

AGA

AGT

GCT

ATG

CCTA

AAT

A02

Glu

Ala Asp Gly

Arg

Val

Gil'

Gil'

Lys

Leu

Arg

Ser

val

Met

Gln

Asn

50

55

66

GGT

TTG ATT TTC

GAT

GAT

CHA

GCA

ATT

ACC

ATG

ACT

GAG

GG^CS

CCA

A00

Gly

Leu Ile Trp

Asp

Glu

Gly

Alni

Am

Thr

Met

Thr

Glu

Ala

Glu

P^o

65

77

7 55

GAA

GTT GGG

TTA

CTT

GAT

GAT

CCT

GGG

CTT

CGT

GAG

ATTA

CCA

CCTA

3A 8

Glu

Val Gly Sear

Leu

Leu

Aip

Aip

Lee

dy

Alg

nr

du

Lls

dn

dn

80

85

90

TTT

CCA ATT TCA

CAG

TAH

AAT

ATC

ATT

ATC·

ATC

CTC

AAT

AGT

ATA

ACC

356

Phe

Pro Ile Seer

Gln

Lys

Lls

Tao

ATS

Ul

Av1

Aao

Atp

dy

Aa i

Apo

95

110

110

GTG

ATG CTA CCCT

ACC

AAAT

CCC

AAA

AGA

ACT

ATC

ATC

ACT

ATG

CTC

ACC

44 4

Val

Met Leu Pro

Thr

Asn

Ppo

Hu

dn

AeG

Aa i

Th

se

se

Aa i

Alg

110

115

120

120

TCT

ACC CAT TCT

AAG

ITT?

CCA

ATC

ATC

ATC

AGA

ACC

Att

ATT

TC

AAT

0 53

Ser

Thr Gln Ssr

Lys

Płie

dl

Hu

Alg

AeG

ATC

Apo

Alih

AeG

Acr

ls

130

115

110

AAA

TAG TCC TCA

ATAT

GTC

TCC

AGT

AGC

ATC

TCC

AGA

AGA

ACT

CTT

ATG

540

Lys

Lys Ser Ssr

Lls

Vv1

Tsg

Aip

Alu

se

Ala

dn

du

se

Av1

Sse

145

HO

115>

GAG

TTC TTT· CCA

CGC

CCT

TTT

TGG

ACA

AGA

Arc

ACT

AGA

ATT

ACC

TTC

588

Glu

Phe Php Gln

Arg

HHi

Thh

dy

ATC

Aa i

Aa i

Aip

Acr

AeG

Ilu

160

165

110

GAC

CCT TTT GGT

TCT

GGA

AAC

ACT

ACT

AGC

AGA

ACC

ωτ

CC

ACT

CC

636

Asp

Pro Php Val

Gly

Gly

TCh

Sse

ATC

Ala

Aip

Pr

Aip

se

AeG

se

175

118

188

ATG

HG CAT TCT

TTC

CCA

GGT

CTC

ATG

AAT

STC

AGA

ATA

ACT

ATT

AGC

6 84

Met

Lys His Sse

Phh

Pro

Aip

Aee

Acp

Atp

Aa i

da

Als

se

APh

Aly

190

115

200

205

187 545

TCT Ser

ATT ATA GTC GGT GCA ATC AGA ACA AAG TTT GCT GCT AAA GGT GGT

732

Ile

Ile

Val

Gly 210

Ala

Ile

Arg

Thr

Lys 215

Phe

Ala

Ala

Lys

Gly 220

Gly

AAA

AGT

AGA

GAC

ACA

AAG

AGT

TCT

CCT

GGC

ACA

AAA

AAG

GGT

TCG

CGT

780

Lys

Ser

Arg

Asp

Thr

Lys

Ser

Ser

Pro

Gly

Thr

Lys

Lys

Gly

Ser

Arg

225

230

235

GGG

TCA

TTC

TCT

TTT

AAG

GGG

GGA

ATG

CAG

ATT

CTT

CCT

GAT

ACG

TTG

828

Gly

Ser

Phe

Ser

Phe

Lys

Gly

Gly

Met

Gln

Ile

Leu

Pro

Asp

Thr

Leu

240

245

250

TGC

AAA

AGT

CTC

TCA

CAT

GAT

GAG

ATC

AAT

TTA

GAC

TCC

AAG

GTA

CTC

876

Cys

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Asp

Glu

Ile

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Val

Leu

255

260

265

TCT

TTG

TCT

TAC

AAT

TCT

GGA

TCA

AGA

CAG

GAG

AAC

TGG

TCA

TTA

TCT

924

Ser

Leu

Ser

Tyr

Asn

Ser

Gly

Ser

Arg

Gln

Glu

Asn

Trp

Ser

Leu

Ser

270

275

280

285

TGT

GTT

TCG

CAT

AAT

GAA

ACG

CAG

AGA

CAA

AAC

CCC

CAT

TAT

GAT

GCT

972

Cys

Val

Ser

His

Asn

Glu

Thr

Gln

Arg

Gln

Asn

Pro

His

Tyr

Asp

Ala

290

295

300

GTA

ATT

ATG

ACG

GCT

CCT

CTG

TGC

AAT

GTG

AAG

GAG

ATG

AAG

GTT

ATG

1020

Val

Ile

Met

Thr

Ala

Pro

Leu

Cys

Asn

Val

Lys

Glu

Met

Lys

Val

Met

305

310

315

AAA

GGA

GGA

CAA

CCC

TTT

CAG

CTA

AAC

TTT

CTC

CCC

GAG

ATT

AAT

TAC

1068

Lys

Gly

Gly

Gln

Pro

Phe

Gln

Leu

Asn

Phe

Leu

Pro

Glu

Ile

Asn

Tyr

320

325

330

ATG

CCC

CTC

TCG

GTT

TTA

ATC

ACC

ACA

TTC

ACA

AAG

GAG

AAA

GTA

AAG

1116

Met

Pro

Leu

Ser

Val

Leu

Ile

Thr

Thr

Phe

Thr

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

335

340

345

AGA

CCT

CTT

GAA

GGC

TTT

GGG

GTA

CTC

ATT

CCA

TCT

AAG

GAG

CAA

AAG

1164

Arg

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ile

Pro

Ser

Lys

Glu

Gln

Lys

350

355

360

365

CAT

GGT

TTC

AAA

ACT

CTA

GGT

ACA

CTT

TTT

TCA

TCA

ATG

ATG

TTT

CCA

1212

His

Gly

Phe

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

Met

Met

Phe

Pro

370

375

380

GAT

CGT

TCC

CCT

AGT

GAC

GTT

CAT

CTA

TAT

ACA

ACT

TTT

ATT

GGT

GGG

1260

Asp

Arg

Ser

Pro

Ser

Asp

Val

His

Leu

Tyr

Thr

Thr

Phe

Ile

Gly

Gly

385

390

395

AGT

AGG

AAC

CAG

GAA

CTA

GCC

AAA

GCT

TCC

ACT

GAC

GAA

TTA

AAA

CAA

1308

Ser

Arg

Asn

Gln

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ser

Thr

Asp

Glu

Leu

Lys

Gln

400

405

410

GTT

GTG

ACT

TCT

GAC

CTT

CAG

CGA

CTG

TTG

GGG

GTT

GAA

GGT

GPA

CCC

13 5 6

Val

Val

Thr

Ser

Asp

Leu

Gln

Arg

Leu

Leu

Gly

Val

Glu

Gly

Glu

Pro

415

420

425

187 545

GTG Val 430

TCT Ser

GTC Val

CAA A sn

CAT CTA

TTA CTG Tyr Trp

CAG Arg

TAA L ys

GCA Ala 440

TTC Phe

CCG Pro

TTG Leu

TAT

GAC Asp 445

no 0

H is

Tyr 435

AGC

AGC

TAT

GAC

TCA

GTC

AAT

GAA

GCA

AAT

GG^C

AAAG

ATG

GAG

CAAT

GAT

115 5

Ser

Ser

Tyr

Asp

C er

Val

Met

Glu

Ala

I le

Asp

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

450

455

460

CTA

CCT

GGG

TTC

TTC

TAT

GCA

GGT

AAT

CAT

CGA

CUG

GGG

CCO

tct

GTT

115 0

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe

Tyr

Ala.

Gly

Asn

H is

JArg

Gly

Gly

Clu

See

Val

465

470

475

GGG

GTT

TCA

ATA

GCA

TGA

GGT

tgc

AAA

GCA

GCT

GAAC

CCT

CTT

CTC

TCA

1154

Gly

Lys

Ser

I le;

A la

S er

Ctys

Lys

A la

Ala

Asp

Llu

Cva

Cle

Ser

480

485

490

TAC

CTG

GAG

TCT

TGC

TCA

AAC

GAC

AAG

ATT

CCA

AAT

GAC

AGC

TTA

TAACATTGTC

1603

Tyr

Leu

Glu

Ser

cyss

Ser

Asn

Asp

Lys

Lys

Pro

Asn

Asp

Ser

Leu

495 500 505

AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAAfrTrTGTA AAAATGC.AACA AGCCGCCGTG 166 3

CGATTAGCCA ACAACTCAGC TAAAACCCAGA TTCTCTCTAG GCG CACTATAT TCCAGAAT/CA 172 3

ACTATTTATG TGAAT 17 CC (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 508 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR : 4:

Met 1

Ala Ssu Gly

Ala 5

Val Ala

Asp His Gln llu du 10

Ala

Val

Ser 15

Gly

Lys

Arg

Val

Ala

Val

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

20

25

30

Tyr

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

Gly

Leu

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Asp

35

40

45

Gly

Arg

Val

Gly

Gly

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Met

Gln

Asn

Gly

Leu

Ile

50

55

60

Trp

Asp

dl

Gly

Ala

Asn

Tiar

Met

Thr

Glu

Ala

Glu

Pro

Glu

VaC

Gly

65

70

7C

80

Ser

Leu

Leu

Asp

Asp

Leu

Gly

Leu

Arg

Glu

Lys

Gln

Gln

Phe

Pro

lle

85

90

95

187 545

Ser

Gln Lys

Lys Arg 100

Tyr

Ile

Val

Arg 105

Asn

Gly

Val

Pro

Val 110

Met

Leu

Pro

Thr

Asn

Pro

Ile

Glu

Leu

Val

Thr

Ser

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Gln

115

120

125

Ser

Lys

Phe

Gln

Ile

Leu

Leu

Glu

Pro

Phe

Leu

Trp

Lys

Lys

Lys

Ser

130

135

14 0

Ser

Lys

Val

Ser

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Glu

Ser

Val

Ser

Glu

Phe

Phe

145

150

155

160

Gln

Arg

His

Phe

Gly

Gln

Glu

Val

Val

Asp

Tyr

Leu

Ile

Asp

Pro

Phe

165

170

175

Val

Gly

Gly

Thr

Ser

Ala

Ala

Asp

Pro

Asp

Ser

Leu

Ser

Met

Lys

His

180

185

190

Ser

Phe

Pro

Asp

Leu

Trp

Asn

Val

Glu

Lys

Ser

Phe

Gly

Ser

Ile

Ile

195

200

205

Val

Gly

Ala

Ile

Arg

Thr

Lys

Phe

Ala

Ala

Lys

Gly

Gly

Lys

Ser

Arg

210

215

220

Asp

Thr

Lys

Ser

Ser

Pro

Gly

Thr

Lys

Lys

Gly

Ser

Arg

Gly

Ser

Phe

225

230

235

240

Ser

Phe

Lys

Gly

Gly

Met

Gln

Ile

Leu

Pro

Asp

Thr

Leu

Cys

Lys

Ser

245

250

255

Leu

Ser

His

Asp

Glu

Ile

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Val

Leu

Ser

Leu

Ser

260

265

270

Tyr

Asn

Ser

Gly

Ser

Arg

Gln

Glu

Asn

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ser

275

280

285

His

Asn

Glu

Thr

Gln

Arg

Gln

Asn

Pro

His

Tyr

Asp

Ala

Val

Ile

Met

290

295

300

Thr

Ala

Pro

Leu

Cys

Asn

Val

Lys

Glu

Met

Lys

Val

Met

Lys

Gly

Gly

305

310

315

320

Gin

Pro

Phe

Gln

Leu

Asn

Phe

Leu

Pro

Glu

Ile

Asn

Tyr

Met

Pro

Leu

325

330

335

Ser

Val

Leu

Ile

Thr

Thr

Phe

Thr

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

Arg

Pro

Leu

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ile

Pro

Ser

Lys

Glu

Gln

Lys

His

Gly

Phe

355

360

365

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

Met

Met

Phe

Pro

Asp

Arg

Ser

370

375

380

Pro

Ser

Asp

Val

His

Leu

Tyr

Thr

Thr

Phe

Ile

Gly

Gly

Ser

Arg

Asn

385

390

395

400

187 545

Gln Glu

Leu

Ala

Lsg Ala Ser Tho Asp Glu

Leu

Lys

Gln

VlG

Val 415

Thr

405

410

Ser

Asp

Leu

Gln

AOrg

Leu

Leu

Gly

Val

Glu

Gly

Glu

Pro

VaG

Ser

V^1

420

22 4

443

Asn

His

Tyr

Tipj

AOrg

Lys

Ala

Phe

Pro

Lru

Tyr

Asp

Ser

Suo

TTs

435

440

444

Asp

Ser

Val

Met

Glu

Ala

Ile

Asp

Lys

Met

Glu

Asn

Ass

Llu

Pro

450

445

4100

Phe

Phr

Tyr

Ala

Gly

Asn

His

AOrg

Gly

Gly

Llu

Ser

VaG

Gly

Lys

Ser

465

470

47^

430

lir

Ala

Ser

Gly

CC'3

Lys

Ala

Ala

Asp

Leu

Val

lir

Ser

ly/r

Leu

Glu

485

490

495

Suo

Cys

SSe

Asn

Asp

Lys

Lys

Pro

Aas

Gasi

GSr

Glu

500

555

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1691 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Zea mays (maize) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-4 (NRRL B-21260) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1..1443 (A) INNE INFORMACJE: /produkt^ maize cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5:

GCG GTC

TTC AGT

CTG aal 5

GTG Val

GGC

GGA Gly

GGG Gly

ATC 1ll 10

ACT GGG

CTC Glu

TGC ACC

GCG Ala

Ala 1

Asp

Ccs

Gaa

Ter

GCs

Tho 15

CAG

GCG

CCT

GGC

'CG

CGG

CC^C

GGC

GTC

(MG

GAC

CTra

CTT

GTC

ACG

GAG

Gin

Ala

Llu

AAl

Tho

Arg

Hii

Gly

Val

Gly

Asp

V^1

Leu

Val

Tho

Glu

20

25

30

187 545

GCC CGC GCC CGC CCC GGC GGC AAC ATT ACC ACC GTC GAG

CGC CCC GAG

14 4

Ala Arg Ala

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn 40

Ile

Thr

Thr

Val

Glu 45

Arg

Pro

Glu

35

GAA

GGG

TAC

CTC

TGG

GAG

GAG

GGT

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

CCC

TCC

GAC

192

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

50

55

60

CCC

GTT

CTC

ACC

ATG

GCC

GTG

GAC

AGC

GGA

CTG

AAG

GAT

GAC

TTG

GTT

240

Pro

Val

Leu

Thr

Met

Ala

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp

Leu

Val

65

70

75

80

TTT

GGG

GAC

CCA

AAC

GCG

CCG

CGT

TTC

GTG

CTG

TGG

GAG

GGG

AAG

CTG

288

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

Gly

Lys

Leu

85

90

95

AGG

CCC

GTG

CCA

TCC

AAG

CCC

GCC

GAC

CTC

CCG

TTC

TTC

GAT

CTC

ATG

336

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

100

105

110

AGC

ATC

CCA

GGG

AAG

CTC

AGG

GCC

GGT

CTA

GGC

GCG

CTT

GGC

ATC

CGC

384

Ser

Ile

Pro

Gly

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

115

120

125

CCG

CCT

CCT

CCA

GGC

CGC

GAA

GAG

TCA

GTG

GAG

GAG

TTC

GTG

CGC

CGC

432

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

130

135

140

AAC

CTC

GGT

GCT

GAG

GTC

TTT

GAG

CGC

CTC

ATT

GAG

CCT

TTC

TGC

TCA

480

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

145

150

155

160

GGT

GTC

TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCT

AAG

CTC

AGC

ATG

AAG

GCT

GCA

TTT

528

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

165

170

175

GGG

AAG

GTT

TGG

CGG

TTG

GAA

GAA

ACT

GGA

GGT

AGT

ATT

ATT

GGT

GGA

576

Gly

Lys

Val

Trp

Arg

Leu

Glu

Glu

Thr

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

180

185

190

ACC

ATC

AAG

ACA

ATT

CAG

GAG

AGG

AGC

AAG

AAT

CCA

AAA

CGA

CCG

AGG

624

Thr

Ile

Lys

Thr

Ile

Gln

Glu

Arg

Ser

Lys

Asn

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg

195

200

205

GAT

GCC

CGC

CTT

CCG

AAG

CCA

AAA

GGG

CAG

ACA

GTT

GCA

TCT

TTC

AGG

672

Asp

Ala

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Ala

Ser

Phe

Arg

210

215

220

AAG

GGT

CTT

GCC

ATG

CTT

CCA

AAT

GCC

ATT

ACA

TCC

AGC

TTG

GGT

AGT

720

Lys

Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser

225

230

235

240

AAA

GTC

AAA

CTA

TCA

TGG

AAA

CTC

ACG

AGC

ATT

ACA

AAA

TCA

GAT

GAC

7 o 5

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys

Ser

Asp

Asp

245

250

255

187 545

AAG GGA ΤΑΤ GIT? CTG GAG TAT GAA ACG CCA GAA GGG GTT GTT? TCG GTG 516

Lys Giy Tyr Val Leu Glu Tyo Glu Tho Poo GIu Giy Vai Val Ssr Val

260 265 270

CAG GCT ATS eAσT GCT? ATC ATG ACT ATT CCA TCA TAT GTT GCT AGC ACCC 3 6 A

Gin Aia

LyL 275

Ser Val

IIu

Mut Thr 250

Ile

Pro Ser Tyr

VaI 255

ASn

. Seu

Asn

ATT

TTG

CGT

TCC

. CCT?

? TAC

AGC

GAT

GCT

GCCC

. GAT

GCT

CTA

TTC

. AAC

TAT

912

Iie

Leu

Ars

Ppo

Glu

Ssu

Ser

Asp

Ala

Aia

Asp

Ala

Leu

Seu

Aso

PPh

290

295

300

TAT

TAT

CCA

CCG

GCT

GCT

GCT

GTA

ACT

GTT

TCG

TAT

CCC

AAC

GACC

GCA

960

Tyo

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Aia

Vai

Thr

VaI

Ser

Tyr

Poo

lys

Glu

Ala

305

310

315

320

ATT

AGA

AŁAAS

GAAS

ATCC

CTA

ATT

GAT

GGG

GACA

CTC

CAG

GGC

TTT

GGC

CAG

1108

Ile

Aog

Lys

Glu

cys

Leu

IIu

Asp

Gly

GIu

Leu

Gln

Giy

Phe

Gips

Gln

325

306

335

TTG

CAT

CCA

GCG

AGT

CAC

GGA

GAT

GAG

ACC

TTC

GGA

CCA

ATA

ACG

CGT

1686

Leu

Hls

Ppo

Aso

Suo

Gin

Giy

VaI

Glu

Thr

leu

Gly

Thr

Iie

Los

Ser

340

345

350

TCC

TCA

CCT

ATT

CCA

ASAT

CGT

GCT

CCT

GCC

GCT

AGG

CTG

ATA

CTT

CTA

1LH4

Ser

Ser

Leu

Ahe

Pro

Asn

ASrg

Aia

Pro

Csp

Giy

ASrg

VaI

Leu

Les

Leu

355

360

355

AAC

TAC

ATA

GGA

GGT

GCT

ACA

AAC

ACA

GCC

ATT

GCT

TCC

ACC

ACT

GAA

12.

Asn

Tyo

Ile

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

Giy

IIu

Val

Sur

Lys

Thr

Glu

370

356

330

AGT

GAG

CTG

GTC

GAAS

GCCC

GTT

GAC

CGT

GCC

CTC

CGA

AAC

ATC

CTT-

ATA

12 0 0

Sur

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

AArg

Csp

Luu

ASrg

Lys

Met

Leu

I le

355

390

395

4 00

AAT

TCT

ACA

GCA

GTTC

GAC

CCT

TTA

GTC

ACTA

GGT

GCT

CCC

CTT

TGG

CCA

12 A 5

Asn

Suo

Thr

A la

iJ;il

Asp

Pro

Leu

Vv1

Leu

Giy

Val

Aog

Vai

TrpA

Pro

405

410

4 T. 5>

CAA

GCC

ATA

CCT

CAG

CTC

CTG

GTA

CGA

CAT

CTT

GAT

CTT

CTC

GAAA

GCC

12 96

Gln

Aia

Ile;

P ro

Gln

Phe

Leu

VaI

Gly

Hls

Leu

Asj)

Luu

leu

Glu

Ala

420

442

430

GCA

AAA

GCT?

GCC

CTG

GAC

CGA

AGAT

GGC

TAC

GAT

GGG

CTC

TTC

CTA

GGA

1344

Ala

Lys

Ala

Alei

Leu

Asp

AArg

Giy

Gly

syo

Asp

Gips

Luu

Phe

Leu

Gly

435

440

445

GGG

AAC

TAT

GAG?

GCA

GGG.

GAT?

CCC

CCT

ACCC

AGA

TGC

GTT

GAG

GGCA

GCG

13 92

Giy

Asn

Tyr

V al

Ala

Gips

Val

Ala .

Leu

Giy

ASrg

CCy

ViI

Glu

Gly

Ala

450

455

466

TAT

GAA

AGT

GCC

TCG

CCAC

ATA

TCT

GAC

CTC

TTG

ACC

assg

TAT

GCC

TAC

1440

Tyo

Glu

Ser

Alei

Se i?

Gln

Ile

Ser

Aes

Phe

Luu

Thr

Lys

Tyr

Ala

Tyr

465 470 475 480 aag tcatcaaacc actccagcgc yACτylτyee tcctttctct tgcatagctg 119 3

Lys

187 545

AGGTGCCTCC	GGGGAAAAAA	AAGCTTGAAT AGTATTTTTT	ATTCTTATTT	TGTAAATTGC	1553
ATTTCTGTTC	TTTTITCTAT	CAGTAATTAG	TTATATTTTA	GTTCTGTAGG	AGATTGTTCT	1613
GTTCACTGCC	CTTCAAAAGA	ΑΑΤΤΤΤΑΤΊΤ	TTCATTCTTT	TATGAGAGCT	GTGCTACTTA	1675
AAAAAAAAAA	AAAAAAAA					1691

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 481 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6:

Ala 1

Asp

Cys

Val

Val 5

Val

Gly

Gly

Gly

Ile 10

Ser

Gly

Leu

Cys

Thr 15

Ala

Gln

Ala

Leu

Ala 20

Thr

Arg

His

Gly

Val 25

Gly

Asp

Val

Leu

Val 30

Thr

Glu

Ala

Arg

Ala 35

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn 40

Ile

Thr

Thr

Val

Glu 45

Arg

Pro

Glu

Glu

Gly 50

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu 55

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe 60

Gln

Pro

Ser

Asp

Pro 65

Val

Leu

Thr

Met

Ala 70

Val

Asp

Ser

Gly

Leu 75

Lys

Asp

Asp

Leu

Val 80

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn 85

Ala

Pro

Arg

Phe

Val 90

Leu

Trp

Glu

Gly

Lys 95

Leu

Arg

Pro

Val

Pro 100

Ser

Lys

Pro

Ala

Asp 105

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp 110

Leu

Met

Ser

Ile

Pro 115

Gly

Lys

Leu

Arg

Ala 120

Gly

Leu

Gly

Ala

Leu 125

Gly

Ile

Arg

Pro

Pro 130

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu 135

Glu

Ser

Val

Glu

Glu 140

Phe

Val

Arg

Arg

Asn 145

Leu

Gly

Ala

Glu

Val 150

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile 155

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser 160

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly 180 135 190

165 170 175

187 545

Thr Ile

Lys 195

Thr Ile Gln Glu Arg Ser Lys Asn Pro 200

Lys 205

Pro

Pro Aog

Asp

Ala

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Lys

Gly

Gln

TPo

Val

Ala

Ser

Phe

Aog

210

121 5

220

Lys

Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser

225

230

235

224

Lys

Val

Lys

Lee

Ser

Τηρ

Lys

Leu

Thr

Uo a

Ile

TPo

Lys

Ser

Asp

AAP

245

250

255

Lys

Gly

Tyr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

Vv1

Ser

Val

260

226

220

Gln

Ala

Lys

Ser

Val

Ile

Met

Thr

IIl

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Asn

275

280

285

Ile

Leu

Ar—

Pro

Leu

Ser

eo e

Pp a

Ala

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Arg

PPe

290

0 9 e

300

Tyr

Tyr

Pro

Ppo

Val

AA.l

Ala

Val

Tho

VaI

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

AAl

305

311

315

322

Ile

Arg

Lys

Glu

Cys

Lee

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly

dl

325

330

335

Leu

His;

Pro

Arg

Seo

Gln

Gly

Val

Glu

Tho

Leu

Gly

The

I le

Tyr

Ssu

340

335

350

Ser

Ssu

Leu

Phe

Pup

Am

Arg

Ala

Ppo

Asp

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

355

330

3 36

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

dl

Ile

Val

Ser

Lys

Thr

dl

370

355

380

Ser

Glu

Leu

Val

Glu

AAl

Val

AAP

Arg

Asp

Leu

Arg

Lyr

Met

Leu

I le

385

330

330

400

Asn

Ser

Thr

Ala

Val

AAp

ero

Leu

aal

Leu

Gly

Val

5A-g

Val

Trp

Pro

405

441

4 41

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln

PPlp

Leu

Val

dl

iis

Leu

Asp

Leu

Leu

Glu

A^

420

445

440

Ala

Lls

Ala

Ala

lay

AAp

Arg

Gly

dl

Tyr

Asp

Hy

Lee

PPp

Leu

Gly

435

444

44^

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

dl

AArg

cys

Val

Glu

Gly

A^

450

455

460

Tyr

Glu

Ser

Ala

Ser

dl

IIl

Ssr

Asp

Phe

Lee

Thr

Lys

iyr

Ala

Tyr

465

447

447

4 8 0

Lys

187 545 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 7:

(i) CHAFA\KTERYSnKAO SEKWENCJk (A) DŁUGOŚĆ: 2061 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Zea mays (maize) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-3 (NRRL B-21259) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 64..1698 (A) INNE INFORMACJE : prrodukr: „Protox-2 maize (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 7:

CycyCATACC yCCTCATACT TCTdTTTGC CTCTTCACCT yCCACTACAA CAACCyCACy 64

CAA ATC Met

CTC Leu

GCr' TTG ACT

GCC AA a

Td Gd TCA TCC GCT TCG

TCC Ser

CAT Hi s

CCC Ppo 15

108

AA a

Leu Thr 5

Ser AAl

Ser

Ser 10

Ala

Ser

1

TAT

CGC

CC'

GGC

TCC

GCG

CGA

ACT

CCT

CGC

CCC

CGC

CTA

CGT

GCG

CTT

114

Tyr

Aog

Hii·

AAl

Ter

Ala

Hii

Thr

Ar/

Arg

Pro

(Arg

Leu

Arg

Ala

Val

20

25

30

CTC

GCG

ATC

Ad

GGC

TC^CC

GAC

GAC

CCC

CGT

GCA

GCG

CCC

GCC

AGA

TTC

204

Lru

Ala

Met

GAl

Gly

Ser

Aas

Aas

Ppo

(Arg

Ala

Ala

Pro

Ala

Arg

Set

35

40

45

CTC

GCC

GTC

GTC

GGC

GCCC

GGG

GTC

AGC

GGG

ctc

GCG

GCG

GCG

TAC

Ad

24 2

aal

Ala

Val

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

TSr

A'O

50

55

60

CTC

Ο

CC.'

Ad

GGC

GTG

(0

GTA

Ad

GTG

TTC

GAA

GCG

GCC

GAC

Ad

34 0

Leu

Aog

dl

Ter

Gly

Val

Asn

Val

TTh

Val

Phe

Glu

Ala

Ala

Asp

A'/

65

70

75

GCG

HA

Gd

GAG

ATA

CGG

ACC

iAT

TTC

GAG

GGC

GGG

TTT

GTC

TGG

GG^T

344

Ala

Gly

dy

Gys

Ile

Arg

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly

Gly

Phe

Val

Trp

Aas

80

85

90

95

187 545

GAA GGA GGT AAC ACG ATG Ad GGAa GGT GAA TGG GAG GCC AGT AGA CTG

56<

Glu Gly All

Asn Thr Met 100

Thr du Gly Glu 105

Τηρ

Glu

Ala

Ser

Arg 110

Leu

ATT

GAT

GAT

CTT

AGT

CTA

CTA

GG.A

IAGA

dG

dG

TAG

CCT

AGA

TTC

dA

44 4

Ile

Asp

Asp

Lee

dy

Leu

dn

AAp

Lys

Gln

Gln

Tta

Ppo

AAn

Ssu

dn

115

110

125

TAT

AAG

TGT

TAT

ATT

GTT

AAA

GAT

GGA

Gd

CCA

GCA

CTG

ATT

CCT

TCG

450

iis

Lys

Aog

Tyo

Ile

Val

Lyn

Asp

G ly

A la

5 ro

Ala

A eu

5 le

A ro

Seo

130

113

110

GAT

TTT

ATT

TTl

TTA

ATG

AAA

AGC

AGT

GTT

CTT

TCG

ACA

A-GA

TCA

-GAG

5-41

Asp

Pro

Ile

Seo

Leu

Met

Lys

Ser

S er

-I al

L eu

S er

Thr

L y s

S er

Lys

145

150

155

ATT

Td

TTA

TTT

TTT

GAA

dl

τίτ

CTC

TAC

AAG

A-GA

GCT

AAC

ACA

AGA

558

lie

Ala

Lua

Phe

Phe

Glu

Poo

Php

Leu

Tyr

Lys

L ys

Ala

Asn

Thr

Arg

160

166

170

117

AAT

TTT

GGA

AAA

GTG

TTT

GAG

GAG

dC

TTG

AGT

GAG

GGT

GTT

GGG

AGC

636

Asn

Ser

dy

Lys

Val

Seo

Glu

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

180

185

1100

TTT

TGT

GAA

TlT

TAT

TTT

GGA

AGA

AAA

GTG·

GIG·

GAC

TATA

TAT

GTT

GAT

68 8

Phe

Tys

Glu

Arg

His

PPe

Gly

ArA

g Ig

Sel

Val

Asa;

Tyh

GAp

Uel

Alp

105

220

220

TTA

TTT

GTA

TCT

TTA

Ad

AGT

GCG.

dl

AAT

hCA

GAG

TCA

ATT

AA·

ΑΪΤ-

77 5

Pro

Phe

Val

Ala

Tly

TPr

Ser

Al A

g Ig

Aia

A AO

G Ig

S IS

O ee

S is

Ο le

210

221

222

TGT

TAT

Gd

TTT

dl

Gd

TTG

TGT

gag

TAT

GAG.

GGA

AA A!

TATA

TAG

Td

770

Aog

iis

Ala

Phe

Poo

Ala

Leu

Tr;

Aia

L ee

A Ig

ArA

g eu

Pyh

g Ig

Aeu

225

223

225

TTT

ATT

GUT

<T5T

GCC

ATC

TTG

TCT

IAAG

CTA

Gd

GCT

-AAA

GGT

GAT

CTT.

882

lal

lie

Val

Gly

Ala

Ile

Leu

Ser

Lyr

Leu

Ala

Ala

Lys

Gly

Asp

Ppo

240

224

2 25»

225

GTA

AAG

AGA

AGA

CAT

GAT

Td

Td

GGG

IAGa

AGA

AGG

AAT

AGA

CGA

GGT

887

Vil

Lyn

Thr

-Ag

His

Asp

Ser

Ser

Gly

Lyr

Alg

IA:g

Asn

Arg

Arg

Val

260

226

220

TTG

TTT

TCA

ATTT

(TAT

(TlT

GGA

ATG

CAG

Td

CTA

ATA

AAT

GCA

crr

CAA

90 2

Ser

Phe

Ser

PPp

His

Gly

Gly

Met

Gln

Ser

Leu

Ile

Asn

Ala

Leu

Hii

275

280

228

AAT

GAA

TTT

GGA

GAT

GAT

AAT

GTG

GAA

GAT

TAT

TCG

GAG

GAG

TAT

GCT

907

Asn

Glu

Val

Gly

Asp

Asp

Asn

Val

l a u

P IL

A Ig

AAt

GIg

Sel

l eu

Seu

200

225

330

TTT

GTA

TGT!

Ad

TTT

G-AT

GGA

GGhT

CCT

GCA

CTT

GGC

AGG

TGG

TCA

ATT

112 2

Leu

Ala

Cys;

Tha-

Phe

Asp

Gly

Val

Ppo

Ala

Leu

Gly

Arg

Tl—p

Ser

Ili

305

331

3 15

187 545

TCT Ser 320

GTT Val

GAT Asp

TCG S en

AG Lys

GAT Asp 325

AGC Ser

CTT Gly

GAC Asp

AG Lys

GAC Asp 330

CTT Leu

GCT Ala

AGT Ser

AAC Asn

CA Gln 335

:106 3

ACC

’’’

GAT

GCT

GTT

CTT

ATG

CCA

GCT

CCC

TTG

TCA

GTT

GTC

CGG

ACT

1116

Thr

Phe

Asp

Ala

Val

llu

Met

Thr

Ala

Pro

Ltu

Str

Asn

Val

Arg

Arg

340

345

350

ATG

GAG

TTC

ACC

CCA

GGT

GGA

GCT

CCC

CTT

GTT’

CCT

GAAC

’rrr

CCTT

CCT

0130

Met

Lys

PhP

TTr

Cus

Gly

GGy

ATa

Peo

Val

Val

Llu

Asp

Phe

Leu

Pro

355

36 ’

365

TAG

ATG

GAT

TTT

CTA

CCC

CCT

CCT

CCC

CTT

CTG

CCT

GCT

ITT

CAG

CAG

1212

Lys

Met

Asa

Τγγ

Clu

Ceo

Clu

Cet

Clu

Cet

Cal

CTh

ATl

PPh

Lys

Lys

370

375

330

GCT

GAT

GTC

AG

AGATA

CCT

CTG

GAA

GGA

TTr

GGG

GTC

TTC

ATA

CCT

TTC

12 6 0

Asp

Asp

Val

Lys

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ile

Pro

Tyr

385

390

395

ATG

GTA

CTG

CAC

GCC

CCT

CTT

CTC

TCC

ACC

CTT

GCT

CCT

CTC

CTT

CGC

113 0

Lys

Glu

Gln

Gln

Lys

His

Gly

Luu

Lys

Thr

Ltu

Gly

Thr

Leu

PPh

Cet

400

405

410

415

TCC

ATG

ATG

TTC

CCA

GAT

CGA

GCT

CCT

GAT

GAC

CCCT

TAT

TTA

TAT

ACA

13 5 6

Ser

Met

Met

P lie

Pro

Asp

CTrg

Ala

Pro

Asp

Asp

Gln

^r

Leu

Tyr

Thr

420

442

430

ACA

TTT

GIT

GCT

CTT

AGC

CCACC

CAT

AGAT

GAT

CCT’

GCT

GGA

GCT

CCA

ACG

14 0 4

Thr

Phe

Val

Gly

Gly

Ser

His

Asn

CTrg

Asp

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Thr

4 3 5

44 0

44 4

TCT

ATT

CTG

AAA

CCCA

CCT

GTG

ACC

TCT

GAC

CCT

CTA.

CTA.

CTC

TTG

GGC

14 52

Sur

Ile

Leu

Lys

Gln

Leu

Val

Thr

S^r

Asp

Leu

Lys

Lys

Leu

Leu

Gly

450

445

440

GTC

GAG

GGC·

CA

CCC.

ACT

TTT

GTC

AAG

CAT

GTA

TAC

TCT

GGA

AAT

GCT

15 0 0

Val

Alu

Gly

Gln

Ppo

Thr

PPh

Val

Lys

HHi

Val

iyr

Trp

Gly

Asn

Ala

465

447

447

TTT

CCT

TTG

TAT

CTC

CAT

GAT

TAT

AGT

TCT

GTA

TTG

GAA.

GCT

ATA

GATT

055 8

Phe

Pro

Leui

Tyr

Gly

HHi

Ατρ

iyr

Ser

Ssu

Val

Luu

du

Ala

Ile

du

480

448

449

495

GAG

TTG

GAG

GCA

AAC

CCT

CCA

GGG

'ITC

TTC

TAC

GCA

CTA

CAT

AGC

AG

1596

Lys

Met

Glu

Lus

Asn

Luu

Ppo

Gly

PPh

PPh

ITr

Ala

Gly

Asn

Ser

Lys

500

550

550

GCT

GGG

CTT

GCT

GTT

CTA

AGAT

GTT

.HTA

GCT

ΤΆ

CTA

AGC

CAG

GCT

GCT

030 4

Asp

Gly

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Val

Ile

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys

Ala

Ala

515

520

525

GCC

CTT

GCGC

ATC

TCCA

TAT

CTT

GACA

TCT

CAC

ACC

AG

CjTT

AT

aTAT

TCA

16 92

Asp

Leu

Ala

1 le

Ser

iyr

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Lys

His

Asn

Asn

Ser

530

555

540

187 545 cat tiaaaititc ttacctatcc tctatcaitt ttciacaaat τycyccAlτy 174 5

Hi s

545

CATlTACAlT	AlAAACClAT	lClTTlCAlT	TTCAlAACAT	CTTCACTTCT	TCAlATATTA	1805
acccttcitt	lAACATCCAC	CACAlAGAlA	ATCACATGTG	TiAA3TGGGlA\	AATIATGTTA	1136 5
AAAACTATTA	TIICTTCCIA	AAAGTTCCTT	TTTGTTTTCC	TCACCA.GTGG	CCTAClACAC	195 5
TTlATlTTll	aaatacattt	AATTTTTTTs	ATTTTTTlAT	GlACACATGC	GTGACGTGTA	198 5
atattticct	αττττιατττ	AlCAlTAlTT	TTTlCCAAAT	ITATGCCTTA	CGCCTTTAAA	5 04 5
AAAAAAAAAA	AAAAAA					2061

(2) INFORMMAJE DLA SSKW. I D NN: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 544 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 8:

Met 1

Leu

Ala

Leu

Thr 5

Ala

Ser Ala

Ser

Ser 11

Ala

Ser

Ser

His

Pro 125

Tyr

Arg

His

Ala

Sut

Al a

His

Thr

Arg

Arg

Pro

Arg

Leu

Arg

Al^a

Val

Leu

20

225

30

Ala

Met

Ala

Gly

Ser

Asp

Asp

Prs

Arg

Ala

Aa a

Pro

Ala

Aat

Se:r

Val

35

44

44

Ala

Val

Val

Gly

lya

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Al a

Ala

Ala

TyT

Arg

Leu

50

S 55

60

Arg

Gln

S ee

Tly

Val

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Ala

Asp

Arg

Ala

65

77

77

80

lly

lly

Lys

elu

Arg

Thr

Asn

Ser

llu

Gly

Gly

Phe

vva

Trp

Asp

llu

85

99

99

lly

Ala

Asn

Thr

Mec

Thr

Glu

Gly

Glu

Trp

Glu

Ala

Ser

Aat

Leu

Ilr

100

115

111

Asp

Asp

Leu

Gly

Leu

Gln

Asp

Lys

Gln

lin

Trr

Pro

Asn

Ser

Gln

His

115

112

112

Lys

Aat

Tyr

Ile

VeT

Lys

Asp

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

He

Pro

Ser

Asp

130

135

140

Pro

Ile

S ee

Leu

Met

Lys

eer

Ses

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

Sut

Lys

Ile

145

110

115

160

187 545

Ala

Leu

Phe

Phe

Glu 165

Pro

Phe

Leu Tyr Lys 170

Lys

Ala Asn Thr

Arg 175

Asn

Ser

Gly

Lys

Val

Ser

Glu

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

Phe

180

185

190

Cys

Glu

Arg

His

Phe

Gly

Arg

Glu

Val

Val

Asp

Tyr

Phe

Val

Asp

Pro

195

200

205

Phe

Val

Ala

Gly

Thr

Ser

Ala

Gly

Asp

Pro

Glu

Ser

Leu

Ser

Ile

Arg

210

215

220

His

Ala

Phe

Pro

Ala

Leu

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Lys

Tyr

Gly

Ser

Val

225

230

235

240

Ile

Val

Gly

Ala

lle

Leu

Ser

Lys

Leu

Ala

Ala

Lys

Gly

Asp

Pro

Val

245

250

255

Lys

Thr

Arg

His

Asp

Ser

Ser

Gly

Lys

Arg

Arg

Asn

Arg

Arg

Val

Ser

260

265

270

Phe

Ser

Phe

His

Gly

Gly

Met

Gln

Ser

Leu

Ile

Asn

Ala

Leu

His

Asn

275

280

285

Glu

Val

Gly

Asp

Asp

Asn

Val

Lys

Leu

Gly

Thr

Glu

Val

Leu

Ser

Leu

290

295

300

Ala

Cys

Thr

Phe

Asp

Gly

Val

Pro

Ala

Leu

Gly

Arg

Trp

Ser

Ile

Ser

305

310

315

320

Val

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Gly

Asp

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Asn

Gln

Thr

325

330

335

Phe

Asp

Ala

Val

Ile

Met

Thr

Ala

Pro

Leu

Ser

Asn

Val

Arg

Arg

Met

340

345

350

Lys

Phe

Thr

Lys

Gly

Gly

Ala

Pro

Val

Val

Leu

Asp

Phe

Leu

Pro

Lys

355

360

365

Met

Asp

Tyr

Leu

Pro

Leu

Ser

Leu

Met

Val

Thr

Ala

Phe

Lys

Lys

Asp

370

375

380

Asp

Val

Lys

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ile

Pro

Tyr

Lys

385

390

395

400

Glu

Gln

Gln

Lys

His

Gly

Leu

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

405

410

415

Met

Met

Phe

Pro

Asp

Arg

Ala

Pro

Asp

Asp

Gln

Tyr

Leu

Tyr

Thr

Thr

420

425

430

Phe

Val

Gly

Gly

Ser

His

Asn

Arg

Asp

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Thr

Ser

435 440 445

Ile Leu Lys Gln Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly Val 450 455 460

187 545

Glu 465

Gly

Gln

Pro

Thr

Phe 470

Val

Lys

His

Val

Tyr 475

Trp

Gly

Asn

Ala

Phe 480

Pro

Leu

Tyr

Gly

His 485

Asp

Tyr

Ser

Ser

Val 490

Leu

Glu

Ala

Ile

Glu 495

Lys

Met

Glu

Lys

Asn 500

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe 505

Tyr

Ala

Gly

Asn

Ser 510

Lys

Asp

Gly

Leu

Ala 515

Val

Gly

Ser

Val

Ile 520

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys 525

Ala

Ala

Asp

Leu

Ala 530

Ile

Ser

Tyr

Leu

Glu 535

Ser

His

Thr

Lys

His 540

Asn

Asn

Ser

His

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR; 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1811 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Triticum aestivum (wheat) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-13 (NRRL B-21545) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 3..1589 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „Protox-1 wheat” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 9:

GC

GCA Ala 1

ACA ATG

GCC ACC GCC ACC GTC GCG GCC GCG TCG

CCG Pro

CTC Leu

CGC Arg 15

Thr

Met

Ala

Thr Ala Thr 5

Val

Ala Ala 10

Ala

Ser

GGC

AGG

GTC

ACC

GGG

CGC

CCA

CAC

CGC

GTC

CGC

CCG

CGT

TGC

GCT

ACC

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Arg

Pro

His

Arg

Val

Arg

Pro

Arg

Cys

Ala

Thr

20

25

30

GCG

AGC

AGC

GCG

ACC

GAG

ACT

CCG

GCG

GCG

CCC

GGC

GTG

CGG

CTG

TCC

Ala

Ser

Ser

Ala'

Thr

Glu

Thr

Pro

Ala

Ala

Pro

Gly

Val

Arg

Leu

Ser

35

40

45

GCG

GAA

TGC

GTC

ATT

GTG

GGC

GCC

GGC

ATC

AGC

GGC

CTC

TGC

ACC

GCG

Ala

Glu

Cys

Val

Ile

Val

Gly

Ala

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

Cys

Thr

Ala

50

55

60

3

191

187 545

CAG Gln

GCG Ala 65

CTG Leu

GCC Ala

ATC TCh

ACT Aro

CAC Tyr 70

GGC Gly

TTC Val

AGC seo

GAC Asp

CTG Leu 75

CCC Leu

GTC Val

ACG Thr

GAG Glu

339

GCC

CGC

GAC

CGC

CCG

GGG

GGC

AAC

ATC

ACC

ACC

GTC

GAG

CGT

CCC

GAC

I87

Ala

Arg

Asp

Aog

Pro

Gly

Gly

Asn

lle

Thr

Thr

Val

Glu

Arg

Pro

Asp

80

85

90

55

GAG

GTC

CAC

CTG

TTC

GAG

<^J^G

GGA

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

CCC

TCC

GAC

I55

Glu

Gly

Tyr

Leu

Τη?

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

100

105

110

CCG

GTC

CTC

ACC

ATG

GCC

GTG

GAC

AGC

(GGG

CTC

TAG

GAT

GAC

ATT

GTG

I33

Pro

ViI

Leu

Thr

Met

A la

Val

Asp

Ser

Gly

Llg

Tyr

Aip

Aip

Aet

AiI

115

120

125

CTC

GGG

GAC

CCC

AAC

GCG

CCC

CGG

TTC

AGCG

CTT

ACG

AGA

AGG

AAA

TCC

0 3 1

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

A la

Ppo

Arg

Phe

Val

Llg

Acp

AGn

AGy

Ays

Set

130

115

1^0

ATT

CCG

GCG

CCG

TCG

AAG

CCCT

TCC

GAC

CCC

CCC

ATC

ATC

AAG

ACC

AAC

009

Arg

Pro

Val

Pro

Ses

Oye

Pro

TAsp

Leu

Pro

SPh

SPh

Ast

Alg

Aet

10 5

115

115

AGT

TTC

CCT

GTC

AAG

CTC

AGG

GCC

GGC

cctt

GGG

TGC

TCC

AGG

ATT

ACG

527

ser

lle

Pro

Gly

Lys

L eu

AArg

Ala

Gly

Leu

Gly

Alu

Aet

AGy

Alu

SAO

160

115

170

115,

CCA

CCT

CCC

CCA

GTC

CGC

GGG

GAG

TCG

GTG

GGA

TGA

ATT

TGC

ATC

ATC

5 0 5

Pro

Poo

Pro

Poo

Gly

Sirg

Gln

Glu

Ser

Val

Gln

Ala

SPh

AiI

Aio

Air

180

115

115

TAC

CTC

TCT

GCC

GAG

GAG·

ctt

GGM3

CGC

CTC

AAC

TGA

TCC

ATC

ACG

TCC

60 3

Asn

Leu

Gly

Ala

Gln

Va1

uhh

Alu

TAog

Leu

Ilu

TGn

Aro

SPh

Ays

Sst

155

200

2 05

TCT

GTA

TAC

TCT

TCT

CAG?

CCC·

TCG

TAG

ict·

ATT

AAT

AAA

AGC

TGC

ATT

601

Gly

lal

Tyo

Ala

Gil

Saa

pro

Ser

Lys

Leu

Sse

Aet

Tyr

Alu

Ala

Shh

010

201

200»

GGG

AAG

GTC

CTC

AGA

TAC

GGA

TAG

Aid

GGA

GTG

AAG

ATT

ATT

TGG

TGT

019

Gly

Lys

ViU

Top

Ar(

gse

Vln

Alu

Ile;

Gly'

Gly

Ast

Alu

Alu

AGy

AGy

005

233

235

ACC

TTC

TAG

GCG

ATT

CAC

GGA

TAA

TTG

TAGG

AAA

ACC

AAA

ATC

ACC

AAG

0 60

Thr

lle

Lys

Ala

Ile

G ln

Aip

Lys

Gly

Ays

Am

Aro

Ayr

Aro

Aro

Air

000

200

200

20 5

GAT

CCC

CGA

CTT

CCG

GCA

CCC

TAG

GGTt

ACG

AAC

AGT

TGC

ACC

ATC

AAG

815

Asp

Pro

Arg

Leu

PrP

AS i

aro

Lys

Gly'

Gln

TTr

AiI

Alu

Sse

APh

Aio

060

206

200

TAG

TCC

CTA

GCC

ATU

GAC

CCG

TAT

GCC

ATC

GGC

TCC

AAG

TCC

AGG

TAG

8 63

Lys

Gly

Leu

Ala

Met

Lee

Aro

Asn

Ala

Ile;

Alu

Sse

Aio

Alg

AGy

Sst

075

208

285

187 545

AAA GTC AAG CTG TCA TGG AAG CTT ACG AGC ATT ACA AAG GCG GAC AAC

Lys

Val

Lys 290

Leu

Ser Trp

Lys

Leu Thr Ser Ile 295

Thr

Lys 300

Ala

Asp

Asn

CAA

GGA

TAT

GTA

TTA

GGT

TAT

GAA

ACA

CCA

. GAA

GGA

CTT

GTT

TCA

GTG

959

Gln

Gly

Tyr

Val

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Leu

Val

Ser

Val

305

310

315

CAG

GCT

AAA

AGT

GTT

ATC

ATG

ACC

ATC

CCG

TCA

TAT

GTT

GCT

AGT

GAT

1007

Gln

Ala

Lys

Ser

Val

Ile

Met

Thr

Ile

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Asp

320

325

330

335

ATC

TTG

CGC

CCA

CTT

TCA

ATT

GAT

GCA

GCA

GAT

GCA

CTC

TCA

AAA

TTC

1055

Ile

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Ile

Asp

Ala

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Lys

Phe

340

345

350

TAT

TAT

CCG

CCA

GTT

GCT

GCT

GTA

ACT

GTT

TCA

TAT

CCA

AAA

GAA

GCT

1103

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Thr

Val

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

355

360

365

ATT

AGA

AAA

GAA

TGC

TTA

ATT

GAT

GGG

GAG

CTC

CAG

GGT

TTC

GGC

CAG

1151

Ile

Arg

Lys

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln

370

375

380

TTG

CAT

CCA

CGT

AGC

CAA

GGA

GTC

GAG

ACT

TTA

GGG

ACA

ATA

TAT

AGC

1199

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

385

390

395

TCT

TCT

CTC

TTT

CCT

AAT

CGT

GCT

CCT

GCT

GGA

AGA

GTG

TTA

CTT

CTG

1247

Ser

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

Pro

Ala

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

400

405

410

415

AAC

TAT

ATC

GGG

GGT

TCT

ACA

AAT

ACA

GGG

ATC

GTC

TCC

AAG

ACT

GAG

1295

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Val

Ser

Lys

Thr

Glu

420

425

430

AGT

GAC

TTA

GTA

GGA

GCC

GTT

GAC

CGT

GAC

CTC

AGA

AAA

ATG

TTG

ATA

134 3

Ser

Asp

Leu

Val

Gly

Ala

Val

Asp

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

435

440

445

AAC

CCT

AGA

GCA

GCA

GAC

CCT

TTA

GCA

TTA

GGG

GTT

CGA

GTG

TGG

CCA

1391

Asn

Pro

Arg

Ala

Ala

Asp

Pro

Leu

Ala

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Trp

Pro

450

455

460

CAA

GCA

ATA

CCA

CAG

TTT

TTG

ATT

GGG

CAC

CTT

GAT

CGC

CTT

GCT

GCT

1439

Gin

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu

Ile

Gly

His

Leu

Asp

Arg

Leu

Ala

Ala

465

470

475

GCA

AAA

TCT

GCA

CTG

GGC

CAA

GGC

GGC

TAC

GAC

GGG

TTG

TTC

CTA

GGA

1487

A.La

Lys

Ser

Ala

Leu

Gly

Gln

Gly

Gly

Tyr

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

480

485

490

4 95

GGA

AAC

TAC

GTC

GCA

GGA

GTT

GCC

TTG

GGC

CGA

TGC

ATC

GAG

GGT

GCG

1535

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

Gly

Arg

Cys

Ile

Glu

Gly

Ala

500

505

510

187 545

TAC GAG AGT GCC TCA CAA GTA TCT GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC 1583

Tyr Glu Ser Ala Ser Gln Val Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr

515 520 525

AAG TGA TGGAAGTAGT GCATCTCTTC ATTTTGTTGC ATATACGAGG TGAGGCTAGG 1639 Lys

ATCGGTAAAA	CATCATGAGA	TTCTGTAGTG	TTTCTTTAAT	TGAAAAAACA	AATTTTAGTG	1699
ATGCAATATG	TGCTCTTTCC	TGTAGTTCGA	GCATGTACAT	CGGTATGGGA	TAAAGTAGAA	1759
TAAGCTATTC	TGCAAAAGCA	GTGATTTTTT	TTGAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AA	1311

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 528 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 10:

Ala 1

Thr

Met

Ala

Thr 5

Ala

Thr

Val

Ala

Ala 10

Ala

Ser

Pro

Leu

Arg 15

Gly

Arg

Val

Thr

Gly 20

Arg

Pro

His

Arg

Val 25

Arg

Pro

Arg

Cys

Ala 30

Thr

Ala

Ser

Ser

Ala 35

Thr

Glu

Thr

Pro

Ala 40

Ala

Pro

Gly

Val·

Arg 45

Leu

Ser

Ala

Glu

Cys 50

Val

Ile

Val

Gly

Ala 55

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu 60

Cys

Thr

Ala

Gln

Ala 65

Leu

Ala

Thr

Arg

Tyr 70

Gly

Val

Ser

Asp

Leu 75

Leu

Val

Thr

Glu

Ala 80

Arg

Asp

Arg

Pro

Gly 85

Gly

Asn

Ile

Thr

Thr 90

Val

Glu

Arg

Pro

Asp 95

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp 100

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn 105

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser 110

Asp

Pro

Val

Leu

Thr 115

Met

Ala

Val

Asp

Ser 120

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp 125

Leu

Val

Phe

Gly

Asp 130

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg 135

Phe

Val

Leu

Trp

Glu 140

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Pro

Gly

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Ser

Leu

Met

Ser

145 150 155 160

187 545

Ile

Pro

Gly Lys

Leu 165

Arg Ala Gly Leu

Gly Ala 170

Leu

Gly

Ile

Arg 175

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

180

185

190

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

195

200

205

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

210

215

220

Lys

Val

Trp

Arg

Leu

Glu

Glu

Ile

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

225

230

235

240

Ile

Lys

Ala

Ile

Gln

Asp

Lys

Gly

Lys

Asn

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg

Asp

245

250

255

Pro

Arg

Leu

Pro

Ala

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Ala

Ser

Phe

Arg

Lys

260

265

270

Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

Ile

Ala

Ser

Arg

Leu

Gly

Ser

Lys

275

280

285

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys

Ala

Asp

Asn

Gln

290

295

300

Gly

Tyr

Val

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Leu

Val

Ser

Val

Gln

305

310

315

320

Ala

Lys

Ser

Val

Ile

Met

Thr

Ile

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Asp

Ile

325

330

335

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Ile

Asp

Ala

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Lys

Phe

Tyr

340

345

350

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Thr

_Val

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

355

360

365

Arg

Lys

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

370

375

380

His

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser

385

390

395

400

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

Pro

Ala

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

405

410

415

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Val

Ser

Lys

Thr

Glu

Ser

420

425

430

Asp

Leu

Val

Gly

Ala

Val

Asp

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

Asn

Pro Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln 450 455 460

435 440 445

187 545

Ala 465

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu 470

Ile

Gly

His

Leu

Asp 475

Arg

Leu

Ala

Ala

Ala 480

Lys

Ser

Ala

Leu

Gly 485

Gln

Gly

Gly

Tyr

Asp 490

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly 495

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala 500

Gly

Val

Ala

Leu

Gly 505

Arg

Cys

Ile

Glu

Gly 510

Ala

Tyr

Glu

Ser

Ala 515

Ser

Gln

Val

Ser

Asp 520

Phe

Leu

Thr

Lys

Tyr 525

Ala

Tyr

Lys

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1847 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: soybean (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-12 (NRRL B-21516) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 55..1683 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „protox-1 soybean” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 11:

CTTTAGCACA GTGTTGAAGA TAACGAACGA ATAGTGCCAT TACTGTAACC AACC ATG 5 7

Met

GTT Val

TCC GTC TTC

AAC Asn

GAG Glu

ATC Ile

CTA TTC CCG

CCG AAC CAA ACC

CTT Leu

CTT Leu

105

Ser Val

Phe 5

Leu

Phe 10

Pro

Pro

Asn

Gln

Thr 15

CGC

CCC

TCC

CTC

CAT

TCC

CCA

ACC

TCT

TTC

TTC

ACC

TCT

CCC

ACT

CGA

153

Arg

Pro

Ser

Leu

His

Ser

Pro

Thr

Ser

Phe

Phe

Thr

Ser

Pro

Thr

Arg

20

25

30

AAA

TTC

CCT

CGC

TCT

CGC

CCT

AAC

CCT

ATT

CTA

CGC

TGC

TCC

ATT

GCG

201

Lys

Phe

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Asn

Pro

He

Leu

Arg

Cys

Ser

Ile

Ala

35

40

45

187 545

GAG GAA TCC ACC GCG TCT CCG CCC AAA ACC AGA GAC TCC GCC CCC GTG

24 9

Glu 50

Glu

Ser

Thr Ala

Ser 55

Pro

Pro

Lys

Thr Arg Asp 60

Ser

Ala

Pro

Val 65

GAC

TGC

GTC

GTC

GTC

GGC

GGA

GGC

GTC

AGC

GGC

CTC

TGC

ATC

GCC

CAG

297

Asp

Cys

Val

Val

Val

Gly

Gly

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

Gln

70

75

80

GCC

CTC

GCC

ACC

AAA

CAC

GCC

AAT

GCC

AAC

GTC

GTC

GTC

ACG

GAG

GCC

345

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Ala

Asn

Ala

Asn

Val

Val

Val

Thr

Glu

Ala

85

90

95

CGA

GAC

CGC

GTC

GGC

GGC

AAC

ATC

ACC

ACG

ATG

GAG

AGG

GAC

GGA

TAC

393

Arg

Asp

Arg

Val

Gly

Gly

Asn

Ile

Thr

Thr

Met

Glu

Arg

Asp

Gly

Tyr

100

105

110

CTC

TGG

GAA

GAA

GGC

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

CCT

TCT

GAT

CCA

ATG

CTC

44 1

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

Pro

Met

Leu

115

120

125

ACC

ATG

GTG

GTG

GAC

AGT

GGT

TTA

AAG

GAT

GAG

CTT

GTT

TTG

GGG

GAT

489

Thr

Met

Val

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Asp

130

135

140

145

CCT

GAT

GCA

CCT

CGG

TTT

GTG

TTG

TGG

AAC

AGG

AAG

TTG

AGG

CCG

GTG

537

Pro

Asp

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Arg

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

150

155

160

CCC

GGG

AAG

CTG

ACT

GAT

TTG

CCT

TTC

TTT

GAC

TTG

ATG

AGC

ATT

GGT

585

Pro

Gly

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

Ser

Ile

Gly

165

170

175

GGC

AAA

ATC

AGG

GCT

GGC-

TTT

GGT

GCG

CTT

GGA

ATT

CGG

CCT

CCT

CCT

633

Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

Pro

Pro

Pro

180

185

190

CCA

GGT

CAT

GAG

GAA

TCG

GTT

GAA

GAG

TTT

GTT

CGT

CGG

AAC

CTT

GGT

681

Pro

Gly

His

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

195

200

205

GAT

GAG

GTT

TTT

GAA

CGG

TTG

ATA

GAG

CCT

TTT

TGT

TCA

GGG

GTC

TAT

729

Asp

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

210

215

220

225

GCA

GGC

GAT

CCT

TCA

AAA

TTA

AGT

ATG

AAA

GCA

GCA

TTC

GGG

AAA

GTT

777

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Lys

Val

230

235

240

TGG

AAG

CTG

GAA

AAA

AAT

GGT

GGT

AGC

ATT

ATT

GGT

GGA

ACT

TTC

AAA

825

Trp

Lys

Leu

Glu

Lys

Asn

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Phe

Lys

245

250

255

GCA

ATA

CAA

GAG

AGA

AAT

GGA

GCT

TCA

AAA

CCA

CCT

CGA

GAT

CCG

CGT

673

Ala

Ile

Gln

Glu

Arg

Asn

Gly

Ala

Ser

Lys

Pro

Pro

Arg

Asp

Pro

Arg

260

265

270

187 545

CTG CCA AAA CCA AAA GGT CAG ACT GTT GGA TCT TTC CGG AAG GGA CTT

921

Leu

Pro 275

Lys

Pro

Lys

Gly

Gln Thr Val 280

Gly

Ser

Phe 285

Arg

Lys

Gly

Leu

ACC

ATG

TTG

CCT

GAT

GCA

ATT TCT GCC

AGA

CTA

GGC

AAC

AAA

GTA

AAG

969

Thr

Met

Leu

Pro

Asp

Ala

Ile Ser Ala

Arg

Leu

Gly

Asn

Lys

Val

Lys

290

295

300

305

TTA

TCT

TGG

AAG

CTT

TCA

AGT ATT AGT

AAA

CTG

GAT

AGT

GGA

GAG

TAC

1017

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser

Ser Ile Ser

Lys

Leu

Asp

Ser

Gly

Glu

Tyr

310

315

320

AGT

TTG

ACA

TAT

GAA

ACA

CCA GAA GGA

GTG

GTT

TCT

TTG

CAG

TGC

AAA

1065

Ser

Leu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Pro Glu Gly

Val

Val

Ser

Leu

Gln

Cys

Lys

325

330

335

ACT

GTT

GTC

CTG

ACC

ATT

CCT TCC TAT

GTT

GCT

AGT

ACA

TTG

CTG

CGT

1113

Thr

Val

Val

Leu

Thr

Ile

Pro Ser Tyr

Val

Ala

Ser

Thr

Leu

Leu

Arg

340

345

350

CCT

CTG

TCT

GCT

GCT

GCT

GCA GAT GCA

CTT

TCA

AAG

TTT

TAT

TAC

CCT

1161

Pro

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

Ala Asp Ala

Leu

Ser

Lys

Phe

Tyr

Tyr

Pro

355

360

365

CCA

GTT

GCT

GCA

GTT

TCC

ATA TCC TAT

CCA

AAA

GAA

GCT

ATT

AGA

TCA

1209

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Ser

Ile Ser Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Ser

370

375

380

385

GAA

TGC

TTG

ATA

GAT

GGT

GAG TTG AAG

GGG

TTT

GGT

CAA

TTG

CAT

CCA

1257

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu Leu Lys

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

Pro

390

395

400

CGT

AGC

CAA

GGA

GTG

GAA

ACA TTA GGA

ACT

ATA

TAC

AGC

TCA

TCA

CTA

1305

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

Thr Leu Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser

Leu

405

410

415

TTC

CCC

AAC

CGA

GCA

CCA

CCT GGA AGG

GTT

CTA

CTC

TTG

AAT

TAC

ATT

1353

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

Pro

Pro Gly Arg

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

Tyr

Ile

420

425

430

GGA

GGA

GCA

ACT

AAT

ACT

GGA ATT TTA

TCG

AAG

ACG

GAC

AGT

GAA

CTT

1401

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

Gly Ile Leu

Ser

Lys

Thr

Asp

Ser

Glu

Leu

435

440

445

GTG

GAA

ACA

GTT

GAT

CGA

GAT TTG AGG

AAA

ATC

CTT

ATA

AAC

CCA

AAT

1449

Val

Glu

Thr

Val

Asp

Arg

Asp Leu Arg

Lys

Ile [

Leu

Ile

Asn

Pro

Asn

450

455

460

465

GCC

CAG

GAT

CCA

TTT

GTA

GTG GGG GTG

AGA

CTG

TGG

CCT

CAA

GCT

ATT

1497

Ala

Gln

Asp

Pro

Phe

Val

Val Gly Val

Arg

Leu

Trp

Pro

Gln

Ala

Ile

470

475

480

CCA

CAG

TTC

TTA

GTT

GGC

CAT CTT GAT

CTT

CTA

GAT

GTT

GCT

AAA

GCT

154 5

Pro

Gln

Phe

Leu

Val

Gly

His Leu Asp

Leu

Leu

Asp

Val

Ala

Lys

Ala

485

490

495

187 545

TCT ATC

AGA AAT Arg Asn 500

ACT GGG TTT GAA GGG

CTC Leu

TTC Phe

CTT Leu

GGG Gly 510

GGT Gly

AAT Asn

TAT Tyr

1593

Ser

Ile

Thr

Gly Phe

Glu 505

Gly

GTG

TCT

GGT GTT

GCC

TTG GGA

CGA

TGC

GTT

GAG

GGA

GCC

TAT

GAG

GTA

164 1

Val

Ser

Gly Val

Ala

Leu Gly

Arg

Cys

Val

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu

Val

515

520

525

GCA

GCT

GAA GTA

AAC

GAT TTT

CTC

ACA

AAT

AGA

GTG

TAC

AAA

1683

Ala

Ala

Glu Val

Asn

Asp Phe

Leu

Thr

Asn

Arg

Val

Tyr

Lys

530 535 540

TAGTAGCAGT	TTTTGTTTTT	GTGGTGGAAT	GGGTGATGGG	ACTCTCGTGT	TCCATTGAAT	1743
TATAATAATG	TGAAAGTTTC	TCAAATTCGT	TCGATAGGTT	TTTGGCGGCT	TCTATTGCTG	1803
ATAATGTAAA	ATCCTCTTTA	AGTTTGAAAA	AAAAAAAAAA	AAAA		1847

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 543 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 12:

Met 1

Val

Ser

Val

Phe 5

Asn

Glu

Ile

Leu

Phe Pro 10

Pro

Asn Gln Thr 15

Leu

Leu

Arg

Pro

Ser

Leu

His

Ser

Pro

Thr

Ser

Phe

Phe

Thr

Ser

Pro

Thr

20

25

30

Arg

Lys

Phe

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Asn

Pro

Ile

Leu

Arg

Cys

Ser

Ile

35

40

45

Ala

Glu

Glu

Ser

Thr

Ala

Ser

Pro

Pro

Lys

Thr

Arg

Asp

Ser

Ala

Pro

50

55

60

Val

Asp

Cys

Val

Val

Val

Gly

Gly

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

65

70

75

80

Gln

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Ala

Asn

Ala

Asn

Val

Val

Val

Thr

Glu

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Arg

Val

Gly

Gly

Asn

Ile

Thr

Thr

Met

Glu

Arg

Asp

Gly

100

105

110

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

Pro

Met

115 120 125

Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly 130 135 140

187 S45

Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val 145 150

Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu 165

Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe 180

Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val 195 200

Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu 210 215

Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu 225 230

Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly 245

Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly 260

Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln 275 280

Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile 290 295

Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser 305 310

Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro 325

Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro 340

Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala 355 360

Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile 370 375

Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu 385 390

Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr 405

Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro 420

Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly 435 440

Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro 155 160

Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile 170 175

Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro 185 190

Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu 205

Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val 220

Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys 235 240

Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe 250 255

Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro 265 270

Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly 285

Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val 300

Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu 315 320

Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys 330 335

Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu 345 350

Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr 365

Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg 380

Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His 395 400

Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser 410 415

Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr 425 430

Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu

445

187 545

Leu

Val 450

Glu

Thr Va5

Asp

Aog 455

Asp

Leu

.Arg

Lys

Ile 460

Leu

lUI

°oo

Asn 465

Ala

Gln

Asp Pro

PPp 447

Val

Val

Gly

Val

Arg 475

Leu

Top

Pro

Gln

Ala 4 80

Ile

Poo

Gln

Phe Leu 485

VvG

Gly

His

Leu

Asp 400

Leu

Leu

Asp

Val

Ala 435

Lys

Ala

Seo

Ile

Arg Ann 500

Thr

Gly

Phe

Glu 505

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly 510

Gly

AAn

Tyr

Val

Ser 515

Gly Val

Ala

Leu

Gly 550

Arg

(?as

Val

Glu

Gly 5535,

Ala

T^r

Glu

Val

Ala

Ala

Glu Val

Asn

Asp

PPP

Leu

Tho

Asn

lorg

Val

Tyr

Lys

530 535 540 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 583 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotor (B) POZYCJA: 1..583 (A) INNEINFONMARJE: /funkcjun „promptor protox-1 arab idopsis (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 13:

GAATTCTGAT	CGAATTATAT	AATTGTTATG	AGTTTGGATG	ΑGCA·GTTGC	CTT'··.'··..	60
AGATTTTTAA	TGGATTTTGG	TAATGATTGA	CTTTTΑCTTC	ΑAACTTTATT	C·CA·G·ΑΑh	120
TAATTAATAT	TTACATCΑΑA	ΑTTTTG·CAT	TAATATTATT	AAATTAATAT	ATTAAAATGT	180
TAATTCTCAA	ATAAAACΑC·	AATTCCAAAT	ΑΑAGGGTCA·	TATTATAAAT	ATTTATTGAA	240
CT·'.·...!	CΑAATCAAΑA	ATGATGGGTT	TTAAGGTTTG	GGTTATATAT	GATAAAAAAG	300
AAAAAATTTT	TGTTTATGTA	TCTATTGGGC	C·A·AATCΑT	GTTA·ACΑAA	·TTGTGCT·A	530
ACTAG·..·..	TAAΑA·AΑAC	GTΑATGGTTC	TTTTTATATT	TGTGTCΑΑΑT	TTΑAC·CTA.A	550
ATTTAAACTA	AATAAGAGGT	GTGTGGTATG	TTATATAGAC	TTATTTTGTG	TGTGATTGTG	430
GGTGGATGTT	TCTTGTTGTC	TTTTTCTTTT	TTTTGAAGAA	GATTACTCAA	TTTGAAAAAA	540

ATTAATAATT TTAT·....·· CCTΑATTCTC TTCTATTTTC ATT

583

187 545 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3848 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotor (B) POZYCJA: 1..3848 (A) INNE INFORMACJE: /funkcja= „promotor protox-1 maize (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 14:

TACGTC'TTTA	TGCGATTGTA	CAAGGGTCTT	CCTAATGGGC	CCCTGGCGCC	TCTGCCCCTT	60
CTACAΓTTTC	CAATCGGACG	CC'TTTCATTT	TGCCCCGAGG	ACTGTGAGGT	ATAATGTGAC	1120
ATCTCGCGCT	CGArTACTTT	TTACTAGATT	TGAGTGGAGT	TATTCACTGA	CCTGACGTGC	180
ATAGCGTCTG	TTATT’CATAA	CGGCCCCCTG		AG7GA’CTGTA	ATCCTATTCC	240
ATTAΓTTCTA	CGGGGTCTCT	AACCTTTCGT	GTACTCATCC	ATCATCTGJGG	GCAGCATCTC	300
AGCGG,ΓΓTCT	TTGCGCTTAA	TCGACGGATG	TTGTCCTGTA	GCTCATGGAG	G7G.GTGACTT	360
CGTAGTCCAA	TAGGTCGCGG	TCTCGTTTCC	<AGCCGTA(TTC	GCTTTTGCCA	TCAGGΓCGCAGG	420
CGGCATTACT	GAGTGTCAAT	CGACGTATTA	TTCGTGATCT	TTTGCGCAGT	GCCGGAGCGC	480
ATCGCATCTC	GAACGCTTAC	TTTCGAGCAA	ΊTGGJA\GCTA	GC7GGC(AGGCA	ΤοτσΟΤΓΑΑΑ	54 0
ATTATCCAGA	CGACTCATAC	TAAATGTCAC	.^GG;TGCGGίίAG	GACCGAC^!?	GGCCCAGAGT	600
ACCCGATCAA	GTCGATGACT	GCTTATACGT	GAGAA(AGGTσ	TTGACCCCAT	AGACGGCGAG	660
GCTTCATTAC	TGCATAGTAG	CGAACTCATT	TC3C3C^G?^^^(C7^C3	TGCCCATCAT	AAATGGGGAG	720
ATCGCCTCTA	TTCTGTTATC	CTcCAAATCC		AGCTCTTCTG	^AGAi^^A	780
GCAGTAGTAG	GGGCTGGACG	CATCAT^ATT	GAGGGTATCA	TACCATCCAT	CATCGCTGTGG	840
TGGGACTTAT	TCGACAGTAT	AAATCTTTTT	GGGCAATCGA	TCTTGTTCAT	CA^ΓGGG\CAGGG	900
GTCGACAAAT	TATTAGCTTC	ATTACTACGT	CA*rΓ(ArrτGG	AGATCAGCCA	GTCσCAGAAT	960
CTTATACTTA	TTTATTTTTG	ATTCTTCGTC	GATGCGCTCC			1120
AGACTACTCA	TCTTCCGCTC	TAGCGCTCCT	GGCATdCCTC	ΊTCTGGCATC	GAGCCTCTCC	1180

AAGAGAAAGA GTTTCTTGAT TTGGGTCCAG CGGCTGCAGT GCAGTTGTCC 1110

187 545

AGCTTTCTTC GGTGGCATGA CAAAGGTCAG TGCTTGCCGA AGGTGGTCGA AAAGGGTTCA 1200 CTAGAGGTGG GAGCCAATGT TGGGGACTTC TCAAGTGCTA TGAGTTAAGA ACAAGGCAAC 1260

ACAAAATGTT AAATATTAAT AGCTTTCATC TTTCGAAGCA TTATTTCCCT TTGGGTATAA 1320

TGATCTTCAG	ACGAAAGAGT	CCTTCATCAT	TGCGATATAT	GTTAATAGAA	GGAGGAGCAT	1380
ATGAAATGTA	AGAGACAACA	TGAACAATCG	TGTAGCATTG	TTAATTCATC	ATCATTTTAT	1440
TATTATGGAA	AAATAGAAAC	AATATTGAAT	TACAAATGTA	CCTTTGGCTT	GACAGAAGAT	1500
AAAAGTACAA	GCTTGACGCA	CGAGCAAGTA	CAAGTCAGTG	TGAACAGTAC	GGGGGTACTG	1560
TTCATCTATT	TATAGGCACA	GGACACAGCC	TGTGAGAAAT	TACAGTCATG	CCCTTTACAT	1620
TTACTATTGA	CTTATAGAAA	AATCTATGAG	GACTGGATAG	CCTTTTCCCC	TTTAAGTCGG	1680
TGCCTTTTTC	CGCGATTAAG	CCGAATCTCC	CTTGCGCATA	GCTTCGGAGC	ATCGGCAACC	1740
TTCGTCACGA	TCATGCCCTT	CTCATTGTGT	ATGCTTTTAA	TCCTGAATTC	GAAGGTACCT	1800
GTCCATAAAC	CATACTTGGA	AGACATTGTT	AAATTATGTT	TTTGAGGACC	TTCGGAGGAC	1860
GAAGGCCCCC	AACAGTCGTG	TTTTTGAGGA	CCTTCGGAAG	ATGAAGGCCC	GCAACAAGAC	1 92C
CTATCCATAA	AACCAACCTA	TCCACAAAAC	CGACCCCATT	CACCCTTCAT	TTGCCTCACC	1980
AACAACCCTA	ATTAGGTTGT	TGGTTTAAAT	TTTTTAGGGT	CAATTTGGTC	ATCACCATCC	2040
ACTGTCACTC	CACAAACTCA	ATATCAATAA	ACAGACTCAA	TCACCCAAAC	TGACCATACC	2100
CATAAAACCG	CCCCACCCTT	CTAGCGCCTC	GCCAGAAACC	AGAAACCCTG	ATTCAGAGTT	2160
CAAACTTAAA	ACGACCATAA	CTTTCACCTT	GGAACTCGAA	TCAGGTCCAT	TTTTTTCCAA	2220
ATCACACAAA	ATTAAATTTC	GCATCCGATA	ATCAAGCCAT	CTCTTCACTA	TGGTTTTAAG	2230
TGTTGCTCAC	ACTAGTGTAT	TTATGGACTA	ATCACCTGTG	TATCTCATAC	AATAACATAT	2340
CAGTACATCT	AAGTTGTTAC	TCAATTACCA	AAACCGAATT	ATAGCCTTCG	AAAAAGGTTA	2400
TCGACTAGTC	ACTCAATTAC	CAAAACTAAA	CTTTAGACTT	TCATGTATGA	CATCCAACA7	2460
GACACTGTAC	TGGACTAAAC	CACCTTTCAA	GCTACACAAG	GAGCAAAAAT	AACTAATT7T	2520
CGTAGTTGTA	GGAGCTAAAG	TATATGTCCA	CAACAATAGT	TAAGGGAAGC	CCCCAAGGAC	2580
TTAAAAGTCC	TTTTACCTCT	TGAAACTTTT	GTCGTGGTCT	ACTTTTTCAC	TTTAAACTTC	2640
AAAATTTGAC	ATTTTATCAC	CCCTTAACTC	TTAAAACCAT	TTAAATTACA	TTCTTACTAG	2700
ATTATAGATG	ATTTTGTTGT	GAAAAGTTTT	TAAGACATGT	TTACACATTG	ATTAAAATCA	2760
TTTGTTCAAT	TTCCTAGAGT	TAAATCTAAT	CTTATTAAAA	CTATTAGAGA	TACTTTCACG	2820

AGCTCTAAAT ΑΤΤΤΤΤΑΊΤΤ TTTCATTATG GAATTTTGTT AGAATTCTTA TAGACCTTTT 2880

187 545

	AAAAGCCTTC	CCATGTTTTT	AACAAGTTTT	TTTTCTATTT	TTTCAAATTT	294 0
TCΊTCGAAAC	CACTTCTAAC	CCCCTACAAC	ATΊTATΊTTC	CTACACTTAT	ATCTACAACA	3000
AAATCAACTT	ATCAAATTCT	CTTCCAAACT	acctctaacc	CCCTACAATC	AATΊTCAATC	3060
AAAATTAAAC	CAACTTACCG	AATCGCCCAA		TT'AACTCC'	TA^GATO'	3120
TATCAACAAC	CCCTACACAT	AATCTAAATG	CΊTTCACAAT	TCACCGTΊAT	TTTTTCAACT	3180
TTCATCCCAA	GATAdACCA	TAACCCTACT	TCACAGAGAT	AAAAGG^TTA	TTTTITTCAG	3240
	CCTCCAATTC	ATCCTCTCCC	TCAAATTCAG	CCTGCAACCA		3300
CTACACCCAA	CAdGCCCAC	GTCACCCGTC	CCCCCTCACC	CCAACCACCT	CTTCTCCACA	3360
CΊTTCAC'CC	CATTCCATAT	CA^CGGA-ACC	AATCACGCAC		TTCCCAGCCC	3420
ACCTCTAACC	TTCCACTCCC	CCATCCTTAA	CTCCAAGCCC	AACGGCCCTA	CCCCATCTCU	3480
TCCTCTCATC	CACTCCCCCC	CACA^CGO!1	CACCTCCCCA		AAATCCTCCC	3540
C^CACOGO		dOCTOrcC	ATCCCCCCTA	CTCAACCCCA	CCCGACTACC	3600
TCCCCCCCTC	TOCCATCGO	CACTCACCCT	CCCCTCCCCT	CCTCTCCCCC	CCCCCCCCCC	3660
	CCATCCACCC	CCCCCCGCCT	CTCCCCCCAC	TCCCTTCTCC	TCCCCCCACC	3720
CATCACTCCC	CTCTCCACCC	CCCAGcCCCT		CACCCCCTCC	CCCACCTCCT	3780
TCTC'CCCA.C	CCCCCCCCCC		CAACATTACC			3840

AG^TACC 3 8 4 8 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1826 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Gossypium hirsutum (bawełna) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-15 (NRRL B-21594) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature

187 545 (B) POZYCJA: 31..1647 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „obszar kodujący protox-1 bawełny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 15:

GGTCTGCGTc	GCCTCCCCCC	ACCACCAATC	ATCACdCCrC	TTsATCGACCT	,IT^A:AΓ?(Aτ:τAτy(	60
CCTTCCTCCC	CCTCCCTTTC	CCCACTCTGCC	atia2C(Gca^(ggg	ACCAGlASTCC	GCCCCGCATT	112
GCTACACCTT	TCAeGCTGCC	ATCCCrCCCTC	GCCGAGGGTC	CCACGATTTC	CTTCATCTTec,	115
ATGGACGCCG	GACACTCATC	CATGCCGCAT	TGGCTCeTGG	TTGGeGGTGG	TATCAGTGG.l	200
CTTTCCATTC	CTCCACCTCT	CGCCeCGACG	ccgcgtgccc	TCCCTTCCAC	TGTGiCCTGTG	A00
ACCCCCCCCC	GCGeGCCTGT	TCCTCCCCCC	CTGeCTAGGG	TTCCGCGAGC	TGGATATCTG	600
TGCGCAGCAG	GGGCCACGAC	TTTTCCGGGG	TGGGCTGGTe	TTGTCAGGCT	GGCCGTGGAT	6 20
ACTCCCTTCC	CGGeGCCTTT	GGTTTTACCT	GCGGGTAeTG	CCGGCGGCTT	TGTACTATGG	A 80
CACCGCCCAG	TCCCGCCTGT	CGGGTGGAeG	GCAAGCGCGT	tcggcttttt	TGATSTTGATG	500
AGCCTTGCTG	CCASCCTTCC	CCCTCCCTTC	CCCCCTCTTC	CAATTGGCGC	TCCCCCTCCG	6 00
CGTTCTCAAC	CCTCGCTGCC	GCAGTTTCTC	CCCCCTCATC	TTCGTGCTCC	GGTCTTTrGACs	6 60
CCCTTTATTG	AeCCCTTTTC	TTCCCCTGTT	TATCCCCCCC	ctagttcacc	ATTTTGCATG	720
AACCCAGCAT	TTCCCCCCCT	CTGCCAGCTA	GCACAGATTC	CTGGCCCCCT	CACATTGGGC	7 30
ACTTyCesCA	CACTCCCGGe	GCCCCCTCCC	AGCGGTACCC	CCGGGACCGC	ccacgCtctg	540
gcaaccgcgc	AGCCCCCACC	CGTTCGATGT	TTTCGCCCGC	ceATτeAAeτ	GCCCTCACTC	900
CGACTTGCTC	CAACTTTCCC	TCGCCCTGTA	cecTTCTCTT	CCACGCTTTC	CACACTTACA	96 0
ACATTCCCCC	CTCCCCCCTC	TTTSCSAAGACA	TTTrGicecAsc	CAAGAAGGAAT	GGTATCTCTT	10 2 0
GACAGTAGCe	CTGTTCTCAT	GACCATTCCGg	TCCTACTGTTAG	CCAGTAACTT	GTTAGCATCCT	10 50
CTATCCCCTC	CTCCTCCCGC	TGACACATCC	(ΑΑΑΤΤΤΓΑΤΓ	ATCCTCCAGT	TGCTSTCAGTC	114 0
ACCCTCTCCT	CTCCACACCC	AGCCAASACACl	saaacasstcita	TGATTGATGG	TGCeSCATCASG	12 00
ccgtttggcg	CGTTGCeGGC	ACGCAGCCAA	ggcacttgcsci	CTTTAGGGAC	GATATACAGT	12 £60
TGATCCCTTT	TAGCCeCTCC	AGCTCGATGT	GCCAeGGTGT	TGCTCTTGAA	CTACATAGGA	13 20
CCAGCTACCA	ACCCTCCACT	nTTTCCGGG	ACTGlASCCG	ACSCTTGTAGA	AGCAGTTTGAT	13 S0
GGTGCTTTGA	CAAACeTCCT	TATSTCCTCCT	AeeTCCesGG	ATCCTCTTGT	TTTGGGTGTA	14 4 0
CCCCTCTCCC	GCACeCGGCT	TCCACSGGSTC	GTTGCTGGTC	ATTTGGATCT	CCTTGATAGT	152 2

cG.CSACCT’CC CTCTCACCCC TTCTGGGTGTA CCSTGGACTGT TTCTTGGGGG CAACTATGTA 156 0

187 545

TCTGGTGTGG CATTAGGACG GTGTGTGGAA GGTGCTTACG	AGGTTGCAGC TGAAGTGAAG	1620
GAATTCCTGT CACAATATGC ATACAAATAA TATTGAAATT	CTTGTCAGGC TGCAAATGTA	1680
GAAGTCAGTT ATTGGATAGT ATCTCTTTAG CTAAAAAATT	GGGTAGGGTT TTTTTTGTTA	1740
GTTCCTTGAC CACTTTTTGG GGTTTTCATT AGAACTTCAT	ATTTGTATAT CATGTTGCAA	1800
TATCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA		1826

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 539 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 16:

Met 1

Thr

Ala

Leu

Ile 5

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu 10

Arg

Ser

Ser

Pro

Ser 15

Val

Ser

Pro

Phe

Ser 20

Ile

Pro

His

His

Gln 25

His

Pro

Pro

Arg

Phe 30

Arg

Lys

Pro

Phe

Lys 35

Leu

Arg

Cys

Ser

Leu 40

Ala

Glu

Gly

Pro

Thr 45

Ile

Ser

Ser

Ser

Lys 50

Ile

Asp

Gly

Gly

Glu 55

Ser

Ser

Ile

Ala

Asp 60

Cys

Val

Ile

Val

Gly 65

Gly

Gly

Ile

Ser

Gly 70

Leu

Cys

Ile

Ala

Gln 75

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys 80

His

Arg

Asp

Val

Ala 85

Ser

Asn

Val

Ile

Val 90

Thr

Glu

Ala

Arg

Asp 95

Arg

Val

Gly

Gly

Asn 100

Ile

Thr

Thr

Val

Glu 105

Arg

Asp

Gly

Tyr

Leu 110

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro 115

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro 120

Ser

Asp

Pro

Ile

Leu 125

Thr

Met

Ala

Val

Asp 130

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp 135

Asp

Leu

Val·

Leu

Gly 140

Asp

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

145 150 155 160

Pro Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Ala Gly Lys Leu 165 170 175

187 545

Arg

Ala

Gly

Phe 180

Gly Ala

Ile Gly Ile 185

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro 190

Gly

Tyr

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

195

200

205

Phe

Glu

Arg

Phe

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

210

215

220

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Arg

Val

Trp

Lys

Leu

225

230

235

240

Glu

Glu

Ile

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Phe

Lys

Thr

Ile

Gln

245

250

255

Glu

Arg

Asn

Lys

Thr

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

260

265

270

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

Thr

Met

Leu

275

280

285

Pro

Glu

Ala

Ile

Ala

Asn

Ser

Leu

Gly

Ser

Asn

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

290

295

300

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

Thr

Lys

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Tyr

Asn

Leu

Thr

305

310

315

320

Phe

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Met

Val

Ser

Leu

Gln

Ser

Arg

Ser

Val

Val

325 330 335

Met Thr Ile Pro Ser His Val Ala Ser Asn Leu Leu His Pro Leu Ser 340 345 350

Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Gln Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala 355 360 365

Ser Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Lys Glu Cys Leu 370 375 380

Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln

385 390 395 400

Gly Ile Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn

405 410 415

Arg Ala Pro Ser Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala 420 425 430

Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala 435 440 445

Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Asn Ala Lys Asp 450 455 460

Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Lys Ala Ile Pro Gln Phe 465 470 475 480

187 545

Lru

aal

Gly

His

Lru

Asp

Lru

Lru

Asp

Ser

Ala

Lys

Mrt

'11

Lru

Arg

485

490

495

Asp

Ser

Gly

Phe

Hi.

Gly

Leu

Phe

Lru

Gly

Gly

Asn

TyO

Val

suo

Gly

500

505

510

aal

Ali

Leu

Gly

Arg

cys

Va 1

Glu

Gly

AGe

TAr

Glu

VtS

^a

A1'

A 4e

515

55 2

525

aal

Lys

&u

PPh

Leu

Ser

G^ln

ITr

Ala

pyr

Lys

530

535

(2) INFORR^MAJJ DLL SEEW. . D NR; 1 1;

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1910 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYEEREOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (burak cukrowy) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWLC-16 (NRRL B-21595N) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..1680 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „obszar kodujący protox-1 buraka cukrowego” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 17:

ATGAAATCAA	TGGCGTTATC	AAACTGCATT	CCACAGACAC	AGTGCATGCC	ATTGCGCAGC	60
AGCGGGCATT	ACAGGGGTAA	TTGTATCATG	TTGTCAATTC	CATGTAGTTT	AATTGGAAGA	120
CGAOGTTTATT	ATTCACATAA	GAAGAGGAGG	ATGAGCATGA	GTTGCAGCAC	AAGCTCAGGC	180
TCAAAGTCAG	CGGTTAAAGA	AGCAGGATCA	GGATCAGGTG	CAGGAGGATT	GCTAGACTGC	240
GTAATCGTTG	GAGGTGGAAT	TAGCGGGCTT	TGCATCGCGC	AGGCTCTTTG	TACAAAACAC	300
TCCTCTTCCT	CTTTATCCCC	AAATTTTATA	GTTACAGAGG	CCAAAGACAG	AGTTGGCGGC	360
AACATCGTCA	CTGTGGAGGC	CGATGGCTAT	ATCTGGGAGG	AGGGACCCAA	TAGCTTCCAG	420
CCTTCCGACG	CGGTGCTCAC	CATGGCGGTC	GACAGTGGCT	TGAAAGATGA	GTTGGTGCTC	480

187 545

GGAGATCCCA	. ATGCTCCTCG	CTTTGTGCTA	. TGGAATGACA	AATTAAGGCC	CGTACCTTCC	54 0
AGTCTCACCG	ACCTCCCTTT	CTTCGACCTC	ATGACCATTC	CGGGCAAGAT	TAGGGCTGCT	600
CTTGGTGCTC	TCGGATTTCG	CCCTTCTCCT	CCACCTCATG	AGGAATCTGT	TGAACACTTT	660
GTGCGTCGTA	ATCTCGGAGA	TGAGGTCTTT	GAACGCTTGA	TTGAACCCTT	TTGTTCAGGT	720
GTGTATGCCG	GTGATCCTGC	CAAGCTGAGT	ATGAAAGCTG	CTTTTGGGAA	GGTCTGGAAG	780
TTGGAGCAAA	AGGGTGGCAG	CATAATTGGT	GGCACTCTCA	AAGCTATACA	GGAAAGAGGG	840
AGTAATCCTA	AGCCGCCCCG	TGACCAGCGC	CTCCCTAAAC	CAAAGGGTCA	GACTGTTGGA	900
TCCTTTAGAA	AGGGACTCGT	TATGTTGCCT	ACCGCCATTT	CTGCTCGACT	TGGCAGTAGA	960
GTGAAACTAT	CTTGGACCCT	TTCTAGTATC	GTAAAGTCAC	TCAATGGAGA	ATATAGTCTG	1020
ACTTATGATA	CCCCAGATGG	CTTGGTTTCT	GTAAGAACCA	AAAGTGTTGT	GATGACTGTT	1080
CCATCATATG	TTGCAAGTAG	GCTTCTTCGT	CCACTTTCAG	ACTCTGCTGC	AGATTCTCTT	1140
TCAAAATTTT	ACTATCCACC	AGTTGCAGCA	GTGTCACTTT	CCTATCCTAA	AGAAGCGATC	1200
AGATCAGAAT	GCTTGATTAA	TGGTGAACTT	CAAGGTTTCG	GGCAACTACA	TCCCCGCAGT	1260
CAGGGTGTGG	AAACCTTGGG	AACAATTTAT	AGTTCGTCTC	TTTTCCCTGG	TCGAGCACCA	1320
CCTGGTAGGA	TCTTGATCTT	GAGCTACATC	GGAGGTGCTA	AAAATCCTGG	CATATTAAAC	1380
AAGTCGAAAG	ATGAACTTGC	CAAGACAGTT	GACAAGGACC	TGAGAAGAAT	GCTTATAAAT	144 0
CCTGATGCAA	AACTTCCTCG	TGTACTGGGT	GTGAGAGTAT	GGCCTCAAGC	AATACCCCAG	1500
TTTTCTATTG	GGCACTTTGA	TCTGCTCGAT	GCTGCAAAAG	CTGCTCTGAC	AGATACAGGG	1560
GTCAAAGGAC	TGTTTCTTGG	TGGCAACTAT	GTTTCAGGTG	TTGCCTTGGG	GCGGTGTATA	1620
GAGGGTGCTT	ATGAGTCTGC	AGCTGAGGTA	GTAGATTTCC	TCTCACAGTA	CTCAGACAAA	1630
TAGAGCTTCA	GCATCCTGTG	TAATTCAACA	CAGGCCTTTT	TGTATCTGTT	GTGCGCGCAT	1740
GTAGTCTGGT	CGTGGTGCTA	GGATTGATTA	GTTGCTCTGC	TGTGTGATCC	ACAAGAATTT	1800
TGATGGAATT	TTTCCAGATG	TGGGCATTAT	ATGTTGCTGT	CTTATAAATC	CTTAATTTGT	18 50
ACGTTTAGTG	AATTACACCG	CATTTGATGA	CTAAAAAAAA	AAAAAAAAAA		1910

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 560 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany

187 545 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 18:

Met 1

Lys

Ser

Met

Ala 5

Leu Ser Asn Cys

Ile 10

Pro

Gln Thr Gln

Cys 15

Met

Pro

Leu

Arg

Ser

Ser

Gly

His

Tyr

Arg

Gly

Asn

Cys

Ile

Met

Leu

Ser

20

25

30

Ile

Pro

Cys

Ser

Leu

Ile

Gly

Arg

Arg

Gly

Tyr

Tyr

Ser

His

Lys

Lys

35

40

45

Arg

Arg

Met

Ser

Met

Ser

Cys

Ser

Thr

Ser

Ser

Gly

Ser

Lys

Ser

Ala

50

55

60

Val

Lys

Glu

Ala

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Ala

Gly

Gly

Leu

Leu

Asp

Cys

65

70

75

80

Val

Ile

Val

Gly

Gly

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

Gln

Ala

Leu

85

90

95

Cys

Thr

Lys

His

Ser

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

Pro

Asn

Phe

Ile

Val

Thr

100

105

110

Glu

Ala

Lys

Asp

Arg

Val

Gly

Gly

Asn

Ile

Val

Thr

Val

Glu

Ala

Asp

115

120

125

Gly

Tyr

Ile

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

Ala

130

135

140

Val

Leu

Thr

Met

Ala

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Val

Leu

145

150

155

160

Gly

Asp

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Asp

Lys

Leu

Arg

165

170

175

Pro

Val

Pro

Ser

Ser

Leu

Thr

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

Thr

180

185

190

Ile

Pro

Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

Ala

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly

Phe

Arg

Pro

195

200

205

Ser

Pro

Pro

Pro

His

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

His

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

210

215

220

Leu

Gly

Asp

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

225

230

235

240

val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ala

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

245

250

255

Lys

Val

Trp

Lys

Leu

Glu

Gln

Lys

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Leu Lys Ala Ile Gln Glu Arg Gly Ser Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp 275 280 285

260 265 270

187 545

Gln

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Arg

Lys

290

295

300

Gly

Leu

Val

Met

Leu

Pro

Thr

Ala

Ile

Ser

Ala

Arg

Leu

Gly

Ser

Arg

305

310

315

320

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Ser

Ser

Ile

Val

Lys

Ser

Leu

Asn

Gly

325

330

335

Glu

Tyr

Ser

Leu

Thr

Tyr

Asp

Thr

Pro

Asp

Gly

Leu

Val

Ser

Val

Arg

340

345

350

Thr

Lys

Ser

Val

Val

Met

Thr

Val

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Arg

Leu

355

360

365

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Asp

Ser

Ala

Ala

Asp

Ser

Leu

Ser

Lys

Phe

Tyr

370

375

380

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Ser

Leu

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

385

390

395

400

Arg

Ser

Glu

Cys

Leu

Ile

Asn

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

405

410

415

His

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser

420

425

430

Ser

Leu

Phe

Pro

Gly

Arg

Ala

Pro

Pro

Gly

Arg

Ile

Leu

Ile

Leu

Ser

435

440

445

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ala

Lys

Asn

Pro

Gly

Ile

Leu

Asn

Lys

Ser

Lys

Asp

450

455

460

Glu

Leu

Ala

Lys

Thr

Val

Asp

Lys

Asp

Leu

Arg

Arg

Met

Leu

Ile

Asn

465

470

475

480

Pro

Asp

Ala

Lys

Leu

Pro

Arg

Val

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Trp

Pro

Gln

485

490

495

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Ser

Ile

Gly

His

Phe

Asp

Leu

Leu

Asp

Ala

Ala

500

505

510

Lys

Ala

Ala

Leu

Thr

Asp

Thr

Gly

Val

Lys

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Gly

515

520

525

Asn

Tyr

Val

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

Gly

Arg

Cys

Ile

Glu

Gly

Ala

Tyr

530

535

540

Glu

Ser

Ala

Ala

Glu

Val

Val

Asp

Phe

Leu

Ser

Gln

Tyr

Ser

Asp

Lys

545

550

555

560

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1784 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy

187 545 (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Brasica napus (rzepak) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-17 (NRRL B-21615) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 47..1654 (a) INNE INFORMACJE: /produkt= „obszar kodujący protox-1 rzepaku” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 19:

CCGAAAACAA	CGGAGTTCGT	CATrcTAATT	ATCTATTTAC	GTACAAGTCT	ArTrATCTCT	60
TATCACTACC	CGCCAGTTAA	TATC^CATT	CTAGGATAAG	TTTAAT'ACCT	ACAC'ΓAAATG	120
AGAGCCTCTC	AGCCTACCTT	CCTCCCTGTA	CCτTTC.GrAA	TTACTACCAT	ArτcrGAAGr	180
ACGGCCACTG	CCGCTGTCTG	GGGACCTAAC	CGATTACTTA	CTCGTACTAC	CACGATCGGr	240
AGCACCCCTT	TCAGTTTACC		CAATGGTAGA	AAGCACTCTG	AGAATGGrcr	300
CGTGCTTGCT	TGCGACGACC	GACCTTTCGC	ACCGGGTGTA	ATAGATCCGC	GCTATAGACC	360
CTTTATGTTC	CGGTGGTGTC	AAGGTGGCTT	TCGTCATTCT	TGTCCTGTCA	rcGATGTccr	420
TCTGGGTGTT	TTΓrrTCGGGC	GTTGTATGTT	CTTTCCGTGT	CCTGCTCCTC	ACGGG'rτ'rcr	480
CTTCTTTGGT	TCTGACCTTG	CTAACGTTAA	T,ΓCCAGCATG	GCTCGATTCA	Aττr’Ar'ττcG	540
ATTCGTCGCT	GTTTCGCCGG	GCGTTGTACA	τccτττ'rτττ	CAAGTTCCTG	TTACGCCTTA	600
GACTAATCTT	ACTCGCTGGT	AGCTCGGACA	CTTTCTGATC	cσrGGTATτc	TTCGrCGCCT	660
TTT'^TGCCTC	TTCATTCGAA	CCTTT‘ΓCATC	GCGTG'r'TTAr	CCCCCATGTA	Cr'CACGGGAr	720
CGTTGTTGGG	TCGTCTTTTC	TTGGGG'rτrT	CGATATGGGT	TGCGGTCCTC	CCGCAGTAGT	780
TCTTCCTTAT	TTTGGTGCGG	TTAGGCATGA	GGGTGGGTAT	AAAGGCGAGA	AAACGCGTAA	840
CACTATCCCA	AGCACGGGCT	CCAGGGCTCT	T^TTCnTC	ACCGGACCGC	TAGAGATCAT	900
CAAGCGTTAG	GTCTAACCAG	CCTTCCTTTG	CGGCTTTGGA	TTTTATTTCA	GCATArAGGC	960

TGTA'GATGGC ATTTAAATAC TGCGGTATAC CTTGACTTGC CGGGATACTC GCCCTGTGCT 102 0

187 545

	τcτGτττcyc	ττcACτycτc		TTyCTΑCCΑT	CATCTCTTTT
CCCTCCATAC	TTACTy'ATTC	CTCCACTTCT	CCTCAC\GGGτ	CATATTATAT	CCTTTCAACC
	TTTTTTATCC	CCTATCTTCC	ττycccττcτ	CTTTCCTATT	ττcAyccτcG
ACATTTTCCC		TCCTTCCTCC		CAGCATTTAT	yACcττcτAy
	τcccAcyττc	TCTTCTCTCT			yτyACττcyG
TTTCCCTCCT	CTATTTTATT	TACCCTATTA	τyτcττcτcc	CTTCCTCTCA	yτcτccττcτ
ACATCTTTCT	CTCTACTCCT	τcτyccτcττ		TCCTCCCTAT	cττyAcyττy
yccτcτAτττ	yATACcτcyc		TTCCTAATAC	GTTCCTCTTT	yACAyAACcy
ACTCCTGCCC		ycττcATTττ	ACCATTACTC	CGTTATTACA	ycccτccGττ
yΑTτcyΑCTτ	CCTCTTCCTT	TCCCTCCCTC	TCyGCTTCCA	CCTATTCTTT	CTCCTTCCTA
ACACAττcτy	yAcττcτcττ	CCTTTCTAAT	TGCCATTyCT	TTCCCTCCTT	ccττyACτyG
TATTCTTCTT	CTyAAACCTC	yAAACTTyAA	ττcττττcyτ	yCTAACTCTT	AAGyACAτcy
CACACTAACT	CTATTAATTA	CAτyAτyATT	AATTTTTAAT	GATT

80

114 0

00

1260

20

80

4 0

00

1560

152 0

80

174 0

8 4 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 536 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (d) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 20:

Mrt 1

Ass

Leu

Sru

Leu 5

Leu Arg

Pro dn P'O The Oeu 10

See

Pro

pe. 15

Ser

Asn

Ppo

Phe

Pro

Arg

Se r

TA-g

Pro

eyr

Las

Gro

Oeu

Asn

Leu

Asy

Cys

20

25

30

Ser

Val

Ser

Gty

Gly

Se r

Val

Val

dy

Sei

Ter

Alu

He

Glu

OPy

GSo

35

40

45

Gly

dy

Gly

Lys

Thr

Va 1

Thr

Ala

Ar p

CTr

Aal

ll u

yss

Gly

dy

GVa

50

5T

60

Ile

Ser

Gly

y eu

Gys

IG e

Ala

Gln

rl t

Lee

Val

ouu

Lys

Gis

Pro

Asp

65

70

7T

80

Ala

Ala

Lye

Am

Gal

Mg t

Val

Thr

Glu

AGe

Lys

lay

Ary

Gal

GPy

GGp

85

90

95

187 545

Asn Ile

Ile

Thr 100

Arg Glu Glu Gln Gly Phe Leu Trp Glu Glu

Gly

Pro

105

110

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

Pro

Met

Leu

Thr

Met

Val

Val

Asp

Ser

115

120

125

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp

Leu

Val

Leu

Gly

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro

Arg

Phe

130

135

140

Val

Leu

Trp

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr

Asp

145

150

155

160

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

Ser

Ile

Gly

Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

Gly

165

170

175

Phe

Gly

Ala

Ile

Gly

Ile

Arg

Pro

Ser

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

180

185

190

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Asp

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

195

200

205

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ala

Lys

210

215

220

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Lys

Val

Trp

Lys

Leu

Glu

Glu

Asn

225

230

235

240

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Ala

Phe

Lys

Ala

Ile

Gln

Ala

Lys

Asn

245

250

255

Lys

Ala

Pro

Lys

Thr

Thr

Arg

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Lys

Gly

260

265

270

Gln

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

Thr

Met

Leu

Pro

Glu

Ala

275

280

285

Ile

Ser

Ala

Arg

Leu

Gly

Asp

Lys

Val

Lys

Val

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser

290

295

300

Ser

Ile

Thr

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Glu

Tyr

Ser

Leu

Thr

Tyr

Glu

Thr

305

310

315

320

Pro

Glu

Gly

Ile

Val

Thr

Val

Gln

Ser

Lys

Ser

Val

Val

Met

Thr

Val

325

330

335

Pro

Ser

His

Val

Ala

Ser

Ser

Leu

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Asp

Ser

Ala

340

345

350

Ala

Glu

Ala

Leu

Ser

Lys

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Ser

355

360

365

Ile

Ser

Tyr

Ala

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Ser

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

370

375

380

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

Pro

Arg

Thr

Gln

Lys

Val

Glu

385

390

395

400

187 545

Thr	Leu	Gly	Thr	Ile 405	?Lor	Ser	Ser Ser Leu Phe 410	Pro Asn	TAO	Aap 441	Poo
Pro	Giy	TSrg	VaI	Leu	Leu	Leu	Asn Tyr Ile Gly	Giy Ala	TTh	As^n	Tho
			420				425		430
CPy	Ile	Leu	Ser	Lys	Ser	Glu	Giy Glu Leu Va6	Glu Ala	Val	Asp	Arg
		435					440	44 5
Asp	Leu	Aog	Lys	Met	Leu	Ile	Lys Pro Suo Ser	Thr Asp	Pro	Leu	Val
	450					455		440
Leu	CPy	VaP	Lys	Leu	Τη?	Pro	Gin Ala Ile Ppo	Gin Phs	L eu	I Ie	Gly
660					440		447				440
Hls	Ilu	Asp	Leu	Val	Asp	Ala	Aia Lys Ala Ser	Luu Ser	Ser	Ser	Gly
				455			440			449
Hls	Glu	Gly	Leu	Phu	Leu	Giy	Giy Asn Syso AU	Aia GPy	Vv1	ASn	Se^u
			500				550		551
Giy	Aog	(Cys	Val	Glu	Gly	Ala	Tyr Glu Thr Aia	Thir Gln.	Vv^1	Asn	Ass
		515					550	552
Phe	Met	Ser	AArg	iyr	ASn	syr	Les

530 553 (2) INFORMACJE DLA SEfKW ID NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJL (A) DŁUGOŚĆ: 1224 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Oryza sative (ryż) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-18 (NRRL B-21648) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (b) POZYCJA: 1..936 (A) INNE INFORMACJE i /produkt= „cząść obszaru kodującego protox-1 ryżu”

187 545 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 21:

CGGGCTTTGA	AGGCTGCATT	TGGGAAGGTG	TGGAGGCTGG	AGGATACTGG	AGGTAGCATT	60
ATTGGTGGAA	CCATCAAGAC	AATCCAGGAG	AGGGGGAAAA	ACCCCAAACC	GCCGAGGGAT	120
CCCCGCCTTC	CAACGCCAAA	GGGGCAGACA	GTTGCATCTT	TCAGGAAGGG	TCTGACTATG	180
CTCCCGGATG	CTATTACATC	TAGGTTGGGT	AGCAAAGTCA	AACTTTCATG	GAAGTTGACA	240
AGCATTACAA	AGTCAGACAA	CAAAGGATAT	GCATTAGTGT	ATGAAACACC	AGAAGGGGTG	300
GTCTCGGTGC	AAGCTAAAAC	TGTTGTCATG	ACCATCCCAT	CATATGTTGC	TAGTGATATC	360
TTGCGGCCAC	TTTCAAGTGA	TGCAGCAGAT	gctctgtcaa	TATTCTATTA	TCCACCAGTT	420
gctgctgtaa	CTGTTTCATA	TCCAAAAGAA	GCAATTAGAA	AAGAATGCTT	AATTGACGGA	480
GAGCTCCAGG	GTTTCGGCCA	GCTGCATCCG	CGTAGTCAGG	GAGTTGAGAC	TTTAGGAACA	540
ATATATAGCT	CATCACTCTT	TCCAAATCGT	GCTCCAGCTG	GAAG3GTGTT	ACTTCTGAAC	600
TACATAGGAG	gttctacaaa	TACAGGGATT	GTTTCCAAGA	CTGAAAGTGA	GCTGGTAGAA	660
GCAGTTGACC	GTGACCTCAG	GAAGATGCTG	ATAAATCCTA	GAGCAGTGGA	CCCTTTGGTC	720
CTTGGCGTCC	GGGTATGGCC	ACAAGCCATA	CCACAGTTCC	TCATTGGCCA	TCTTGATCAT	780
CTTGAGGCTG	CAAAATCTGC	CCTGGGCAAA	GGTGGGTATG	ATGGATTGTT	CCTCGGAGGG	840
AACTATGTTG	GAGGAGTTGC	CCTGGGCCGA	TGCGTTGAAG	GTGCATATGA	GAGTGCCTCA	900
CAAaATATCTG	ACTACTTGAC	CAAGTACGCC	tacaagtgaT	CAAAGTTGGC	CTGCTCCTTT	960
TGGCACATAG	ATGTGAGGCT	TCTAGCAGCA	AAAATTTCAT	GGGCATCTTT	TTATCCTGAT	1020
TCTAATTAGT	TAGAATTTAG	AATTGTAGAG	GAATGTTCCA	TTTGCAGTTC	ATAATAGTTG	1080
TTCAGATTTC	AGCCATTCAA	TTTGTGCAGC	CATTTACTAT	ATGTAGTATG	atcttgtaag	11-10
TACTACTAAG	aacajaatcaa	TTATATTTTC	CTGCAAGTGA	catcttaatc	GTCAGCAAAT	1200
CCAGTTACTA	GTAAAAAAAA	AAAA				1224

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 312 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (c) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko

187 545 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 22:

Arg Ala Leu Lys Ala Ala Phe AUy Lys Val Trp Trg Leu Glu Asp Thr 15 10 55

Gly

Gly

ser

lle

lle

Gly

• Gly

• Thr

• Ile

Lys

Tho

He

Gln

Glu

Arg

dy

20

25

30

Lys

Asn

Pro

Lys

Pro

Pro

Trg

Asp

Poo

Arg

Lru

Pro

Thr

Pro

Lys

Gly

05

40

45

Gln

Thr

Val

AUi

ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

Thr

eet

Leu

Pro

Csp

Cla

50

55

66

ser

llu

Thr

Lys

Ser

Asp

Asn

Lys

Gly

Tyr

Ala

Leu

Val

Tyr

Glu

TTir

65

70

Ύ5

80

ser

lle

Thr

Lys

Ser

Asp

Asn

Lys

Gly

Tyr

TU^a

Lru

Val

Tyr

Glu

TTir

85

00

05

Pro

Glu

Gly

Val

Val

sro

Val

Gln

Ala

Lys

Tho

VuI

\Xć^l

Met

Thr

Ile;

100

105

110

Pro

ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Asp

Ile

Leu

Arg

Pro

Leu

srr

ser

Csp

Ala

115

120

125

Ala

Asp

Ala

Leu

ser

ile

Phe

Tyr

Tyo

Pri

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Thr

100

135

140

Val

srr

Tyr

Pro

Lyi

Glu

Ala

Ile

Arg

Lyi

Glu

cys

Leu

Ile

Asp

G(.y

105

150

155

116

Glu

Lru

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

165

110

175

Thr

Lru

Gly

Thr

lir

Tyo

sro

sro

srr

Lru

Phr

Pro

Asn

Arg

Ala

Ppo

180

185

110

Ala

Gly

Arg

Val

Lru

Leu

Leu

Asn

Tyo

Ile

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Tlir

105

220

205

dy

lle

Val

Ssr

Lys

Thr

GGu

Ssr

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

ato

210

225

220

Asp

Leu

Aro

Lys

Met

Leu

Ile

Asn

Pro

Arg

Ala

Val

Asp

Pro

Leu

Vv1

225

230

205

220

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Trp

Pro

Gln

Ala

Ile

Pro

dn

Phe

Leu

I le

GGu

205

225

2 55

His

Leu

Asp

His

Leu

Glu

Ala

Ala

Lys

Ser

Ala

Leu

Gly

Lyy

Gly

GGu

260

265

220

Tyr

Asp

Gly

Llu

Phe

Leu

Gly

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Giy

Val

Ala

Llu

205

288

285

187 545

Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gln Ile Ser Asp ²⁹° 295 300

Tyr Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys 305 310 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1590 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Sorghum bicolor (sorgo) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-19 (NRRL B-21649) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..1320 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „część obszaru kodującego protox-1 sorgo” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 23:

TCCACCGTCG AGCGCCCCGA G3AAGGGTAC CTCTGGGAGG AGGGTCCCAA CAGCTTCCAG 60

CCATCCGACC CCGTTCTCTC CATGGCCGTG GACAGCGGGC TGAAGGATGA CCTGGTTTTT 120

GGGGACCCCA ACGCGCCACG GTTCGTGCTG TGGGAGGGGA AGCTGAGGCC CGTGCCATCC 180

AAGCCCGCCG ACCTCCCGTT CTTCGATCTC ATGAGCATCC CTGGCAAGCT CAGGGCCGGT 240

CTCGGCGCGC TTGGCATCCG CCCGCCTGCT CCAGGCCGCG AGGAGTCAGT GGAGGAGTTT 300

GTGCGCCGCA ACCTCGGTGC TGAGGTCTTT GAGCGCCTAA TTGAGCCTTT CTGCTCAGGT 360

GTCTATGCTG GCGATCCTTC CAAGCTCAGT ATGAAGGCTG CATTTGGGAA GGTGTGGCGG 420

TT AG AAG AAG CTGGAGGTAG TATTATTGGT GGAACCATCA AGACGATTCA GGAGAGGGGC 4 30

AAGAATCCAA AACCACCGAG GGATCCCCGC CTTCCGAAGC CAAAAGGGCA GACAGTTGCA 540

TCTTTCAGGA AGGGTCTTGC CATGCTTCCA AATGCCATCA CATCCAGCTT GGGTAGTAAA 600

GTCAAACTAT CATGGAAACT CACGAGCATG ACAAAATCAG ATGGCAAGGG GTATGTTTTG 660

187 545

GAGCATGAAA	CAGCAGAAGT	GGTrGGTTTTG	GTGCAGGCTA	IGAlGTGTCAT	CATGACCATT
^ΑΤ^ΤΑΤη	TTGCTAGCGA	CATTCCGCGT	CCCGCTITCCiG	GTGATGCTGC	AGATGTTCTi
	ATTATGGACC	AGGTGGCGGC	GTTACCGGTT	CGTATCCCAA1	GGAAGCAATT
AGAAAAGAAT	GCTTAATTTA	TC-G-G-GGAACT	CAGGGGCTTT	GCCCAGTTGCCl	TCGACGTAGT
CAAGTAGTTG	AGACATTAGG	AAACATTAAC	AGCTCAACAA	TCCTTCCCTAG	TCGTGCTTTT
GGTGGTAGGG	TGTTACCTCT	ATACCACATA	GGAGGTGCTA	CAAACACAGT	11111111^
AAGACTGAAA	GTGAGCCGGT	AGAAGCAGTT	GACCGTGACC	Τ^ΙΤΙΑΤΑΙ	GCTTATAAAT
GCTACAGCAG	TGGACCCTTT	AGTGTCTGTT	GTCCGAGTTT	GGCCACAAGC	CATAGTTCAG
1^^11111	GACATCTTGA	TCTTCrGTAG	GCCGCAAAAT	CTGCCCTGGA	CCAA11T11C
TATAATGGTG	TGTTCCTATG	AGGGAATTAT	GTTGCAGGAG	TTGCCG1GGG
GAGGGCGCAT	ATGAGAGTGC	CGCGCAAATA	TATGACTTCT	TGAGCAAGTA	CGCGTAGAAG
TGATGGAAGA	AGTGTAGGGC	TGCTTGCTTA	TTGTTACGTT	GCATAGATGA	TGTTATACCA
GGAGTAGTAA	AAGTCGTGAG	GAGTACTTTT	CATTCTTATT	TTGTAAATTG	CAGTTGTGTT
TTTTTTTCGT	GTCAGTAATT	AGTTAGATTT	TAGTTATGTA	GGAGATTTTT	111^^1^1
TTCTACAAAA	GAATTTTTAT	TTTGCACTCG	TTTACGAGAG	CTGTGGAGAT	11111111^
TTTTACTGTA	ATTATCTACA	ATATCTATTA

I0O

I0O

0I0

I00

9I0

O035

0555

110 0

00

6 0

3 3 5

80

0 0

150 0

156 0

50 (2) INFORMAAJE DLASSKW. I D NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 440 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 24:

ser

TCh

Val

Glu

.Arg

Pro

Glu

Alu

Ols

Tnn

Leu

Tup

Glu

GUv

Gly

Pro

1

5

10

15

Asn

Ssu

Phe

Ghn

Pro

Se r

Asp

Pro

Go A

Lir

Ser

ool

a- lu

VgP

Asp

Ser

00

05

30

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp

Le u

Val

Phe

Gl A

Aii

Pro

hUG

A Ir

Poo

Arg

Phe

lal Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Aro Val Aro Ser oya Pro Ais As 50 5I 60

40 55

187 545

Leu 65

Pro

Phe

Phe Asp Leu 70

Met

Ser

Ile

Pro Gly Lys 75

Leu

Arg

Ala

Gly 80

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

Pro

Pro

Ala

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

85

90

95

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

100

105

110

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

115

120

125

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Lys

Val

Trp

Arg

Leu

Glu

Glu

Ala

130

135

140

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Ile

Lys

Thr

Ile

Gln

Glu

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Lys

Gly

165

170

175

Gln

Thr

Val

Ala

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

180

185

190

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Thr

195

200

205

Ser

Met

Thr

Lys

Ser

Asp

Gly

Lys

Gly

Tyr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

Thr

210

215

220

Pro

Glu

Gly

Val

Val

Leu

Val

Gln

Ala

Lys

Ser

Val

Ile

Met

Thr

Ile

225

230

235

240

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Asp

Ile

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Gly

Asp

Ala

245

250

255

Ala

Asp

Val

Leu

Ser

Arg

Phe

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Thr

260

265

270

Val

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Lys

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

275

280

285

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

290

295

300

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

Pro

305

310

315

320

Ala

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

325

330

335

Gly

Ile

Val

Ser

Lys

Thr

Glu

Ser

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

Arg

Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Thr Ala Val Asp Pro Leu Val 355 360 365

340 345 350

187 545

Leu Gly Val 370

Arg

Val

Trp

Pro Gln Ala Ile 375

Pro

Gln 380

Phe

Leu

Val

Gly

His 385

Leu

Asp

Leu

Leu

Glu 390

Ala

Ala

Lys

Ser

Ala 395

Leu

Asp

Gln

Gly

Gly 400

Tyr

Asn

Gly

Leu

Phe 405

Leu

Gly

Gly

Asn

Tyr 410

Val

Ala

Gly

Val

Ala 415

Leu

Gly

Arg

Cys

Ile 420

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu 425

Ser

Ala

Ala

Gln

Ile 430

Tyr

Asp

Phe

Leu

Thr 435

Lys

Tyr

Ala

Tyr

Lys 440

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 93 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /deso = „sekwencja intronu protox-1 kukurydzy” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 25:

GTACGCTCCT CGCTGGCGCC GCAGCGTCTT CTTCTCAGAC TCATGCGCAG CCATGGAATT 60

GAGATGCTGA ATGGATTTTA TACGCGCGCG CAG 93 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2606 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (burak cukrowy) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-20 (NRRL B-21650)

187 545 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..6 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla Sali” (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: komplementarna (1..538) (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „część cDNA protox-1 buraka cukrowego w kierunku 3’-5’” (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 539..2606 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „obszar promotora protox-1 buraka cukrowego przedstawiony w kierunku 3-5’ (częściowa sekwencja fragmentu 3 kb Pstl-Sa1l subklonowanego z pWDC-20)” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 26:

GCClAACTCC	lAAAACGAAA	ACCCAAAAAT	CAAAAGCTAT	GAATCGCCTC	GAACCGAACC	6 0
ACGACTACGA	ATAACTCAGA	TACATAATTA	CAlCAACTTC	GATCCACGCT	TCllAAGlCC	120
GGACGATATr	lGGCACATCC	TCAAATATCC	AGCACCCTGA	CTCCACCTTG	AClACGCClA	180
AlAAAACCAC	lTACTrTTCA	TCTTTAACCA	CCAACTTCGT	TTATACCTAT	lCATlTTTCl	24 0
TAAAACTATA	CTlAGAGATG	AAACGAAATA	CAACCACACC	TACACCGATC	AClCCGCCCG	3 00
GCCACCATCC	CTCTCATTCT	ACTTCCAATG	ACAACGATCA	CCTCCAATAT	TACTCTGAGC	360
ACTAlCTTTT	lATGACAATC	ATTATAATAA	CAATATCATC	ACGClAATAA	TACCCCCGCA	420
TTCCACTTAA	AATAACCTTA	ATCTCAACAT	CTATAAAATC	GCAACCTTCA	ClACCGATlC	4 80
ClClCAACGG	ACCGACCTGT	TTATGTTTAA	CGACGTTTGC	TGAClACATC	lACTCCACAC	54 0
ACACCCCGAC	ATACCTAAAT	ACTCCTAATA	CCTACCCCCT	TCCClATTGC	CAlTlAATCA	600
TGCCTAACAT	TCTATCCCAC	TGCAAAAAAC	lTTTCTAGTC	ACACCTTCCT	TTATAGCTTG	660
TACTACAAAC	CGCCGATTCC	CTGTCTACTA	CAAACATCCT	TGTCCTTCGT	AlGTlGCGAl	72 0
CAΑΑΑ1GTAC	CTrACCTCTG	CCCCTAAAAT	ACACAACTAC	τrcτlAτrcA	GGACAAGGAC	7 80
TCTTTTAACA	CATACTTACT	TGCCCTACTC	AGCTGTACTG	CATACAATAC	GΑCTCClCCT	84 0
CTCCGlTCAT	ACACTCCATC		CGAGCTTTAT	ACTTCCGATC	AAAATGCATT	900
TGAAlGGGTr	CATTATTAAT	CAACTATATA	ATrCAATGAG	GATTTCCTCG	ACTCGCAClC	96 0

ACGAGCGClA CAATTAATCC CCCACTTATA CCGCTCACGT AATCCTTTTC lCCAAAAlTG 102 0

187 545

AAAAGTACTT	’ GGAAAAATGA	. TTAAGCGACT	' ΤΑΑΤΊΤΤΓΤΤ	' TATTTGTTTG	AAAGTTGCCT	1080
TTTCTTGGCT	ATCTTAACAT	GTATTTATCA	. AACACCTTTT	TTAATTACAT	GGAAATCGAA	1140
AAGTTTGAAA	AAAAAAAATC	ATACTCACTA	ACCGCCTTAA	AATATAAGCT	GAAGATGTCT	1200
CACTAACAGA	GTGCATGTGA	AGCACCCCCA	AAGCAATTAT	AACACAACAT	CTCCGCCTCT	1260
TCAAAATTCC	TACAAATACA	TCTAATAAAC	TTGTTGAAAC	AATCAAAGTA	ACATGGTGTG	1320
TCAATTGCGG	ATGCTTCTCA	TTCCAGACTT	TATATAGTGA	TTTTGTTTAA	TCCATAGTCA	1380
ACAACTCACA	TAATGGTACC	CAAAGAATAC	CCAAATTTTT	TGGTCAAAAT	CCCTAAACAT	14 4 0
TGTAGCTGTG	TAAGTTTGAC	TAACATGTTT	CAGCATGCTT	GCCATGGGTA	AATAAGACTT	1500
AGGGGCAAAT	CTCGAATCCA	CAAACTCATC	ATTGGTTTTA	GTTTGTCTCC	AACGTAAAAC	1560
AATGATGTGA	AATACACCAC	AAAATTCATA	CAATCTCGTT	ATCTTGGAAG	CTTGAAAGCC	1620
ATAATCTTGT	TTGTACTTTC	ACTACGTCGA	GAAGACAAAA	TTACAACTAA	GAAGAGGTCA	1680
TTGCTCAGTG	TCGTGTAĆTA	CTTATCTTTC	AACTCATAGA	AACAAGCAAA	CCAATTGTCA	1740
CCTATATACT	GTACTTCTCC	ATCATATACT	TCCAACTTGC	CTTAAACTCA	ATACTATCAT	1800
AAAAACCACA	AAGACATTTC	ATAAAAGCAT	AATAAAAATG	TGTCATCACT	CTTCAAAGTT	1860
CCAAAGTGAT	TCTAACTACA	TTCTAATGAA	AATGACATTG	GTGTAAACCT	AATCCTTGTG	1920
TTATAAAACA	CCTACATACC	ACGATTATGT	TAGAAATATA	TTTATGAATG	CAGTACCTAC	1980
ATAAAGCCAT	TAAATAACCA	GTTTTATGTT	ATTTCGTGAC	CAACATAGTT	CCTAAAGATT	2040
ACGAAGTAAT	TTATAGTCAT	TTTGTGGCCA	CTTAATTCAT	TTAATACCCA	GTATATTTAT	2100
AAGTTACCAG	CTTAAGTAGT	TTTGTGACCA	TCTCTACATA	CTTCCTCCGG	TCCATAATAA	2160
GGGGGCGTTT	GGTTGCAACG	GGGTAAAGGG	AATGGAATCA	AGAAAGGGAG	AGGAGAGGAA	2220
AGGAAAAGAA	AACCCTTAGA	TTTAGAGTGG	TGTTTGGTTA	AGATAATGTT	AATTCTCTTT	2280
CTTCCTCTTT	CTTACCCTTC	TTCCACCCTA	GCACCACCAC	TCCTCCCTCT	GTTACTATTC	2 3 40
TCCACGCCGC	CTCTCCCTAC	CCCAGTAACA	CCACCTTGTC	GGCCCCCCGG	TCTTCCCCTT	2400
CCCGCGACGG	TTCCCCCCTC	CCCTGCGCCG	TCACGTCGTC	CCCCTCACCT	CCCTGCACCG	2460
TCGAGTTATC	CCCCTCCCCT	GCGCGTCGCG	TTCTCCCCTC	CCTCACCATC	GCGTTCTCCC	2520
CTCCCTCACC	GTCGCGTTCT	CCCCTCCCTC	ACCGTCGCGG	TCTCCCCTCC	CTCACCGTCG	2580

CGGTCTCTCT TTCCCTCCCC CTGCAG

2606

187 545 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „Pc1p_P1a primer do PCR dla górnej nici promotora genu plastydowego clpP (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla EcoRI” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 27:

CGCCAATTGC TAcTTCTTTC TCCTTCGAAe C 31 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „Pc1p_P1b primer do PCR dla dolnej nici promotora genu plastydowego clpP (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (a) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla Xbal” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 28:

CGCTGTAGAC CGACGTAACT CGTATCTTTC CG

187 545 (2) INFORMACJE DLA SEłKW. IID NR: 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Cdesc = „Pc1p_P2b primer do PCR dla dolnej nici promotora genu plastydowego clpP (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: Cuwaga= „miejsce dla Ncol” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 29:

GCGTTATGG· AAATGAAAGA ΑATΑACTΑΑA 30 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Cdesc = „Trps16_P1a pumer do PCR dla górnej nici obszaru 3' nie ulegającego translacji Xbal/Hindlll genu plastydowego rps16 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (a) INNE INFORMACJE: Cuwaga= „miejsce dla Xbal”

100

187 545 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 30:

lClTCTAlAT caacctaaat tcaattaatt

3C (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „Trps16_P1b primer do PCR dla dolnej nici obszaru 3' nie ulegającego translacji Xbal/Hindlll genu plastydowego rps16 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla Hindlll” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 31:

ClCAAlCTTC AATllAAlCA ATlATAA 21 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „minpsb_U primer dla górnej nici obszaru 38 nt (tępe/Ncol) obejmującego ATG z 5' nie ulegającej translacji części genu plastydowego psbA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 32:

GGGACTCCCT GATGATTAAA TAAACCAAGA TTTTAC

187 545

101 (2) INFORMACJE DLA SEKW. IID NR: 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Cdesc = „minpsb_L primerdla górnej nici obszaru 38 nt (tępe/Ncol) obejmującego ATG z 5' nie ulegającej translacji części genu plastydowego psbA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 33:

TATTG·.... TTTTTGTTTA TTTAATTATT AGGGACTCCC 4I (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Cdesc = „APRTXP1a primer do PCR dla górnej nici do amplifikacji części 5' zmutowanego genu χratox Arabidopsis (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 5..10 (A) INNE INFORMACJE: Cuwaga= „miejsce dla NcalCkadon inicjacyjny ATG (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 34:

GGGATCATGG ATTGTGTTAT ·GTCGGTGGA GG 32 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad

187 545 (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „APRTXP1b primer do PCR dla dolnej nici do amplifikacji części 5' zmutowanego genu protox Arabidopsis (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 34:

CTGGCGTCTC GAGGTTCGTC ATCC 24

187 545

NOs

NOCH₂COOCH₃

CCH₂OCH₃

Wzór IVa

COOCH3

CF-

Cl

Wzór IVc cf₃-

Cl

Wzór IVd

Wzór V

187 545

Ο

Ο ο

Ν—

Wzór VI

Wzór VII

Wzór VIIa

Wzór VIII

CHj

HFjC * ? _:'^NY

Wzór IX

CI

CI· //

Ή ^N c

CH3SO₂NH

CHj

Wzór X

187 545

Wzór XI

V?~^a \a-fecoocBj

Wzór XIII

Wzór XIV

Wzór XVI

Wzór XVIII

Wzór XVII

187 545

Wzór XX

Wzór XXI

Wzór XXIa

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowana cząsteczka DNA zawierająca region kodujący zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox), przy czym niezmodyfikowany protox jest protoxem roślinnym zawierającym sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEKW. ID NR: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22 i 24, a modyfikacja obejmuje pierwsze podstawienie aminokwasu występujące w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje odpowiadające:

   (a) alaninie w aminokwasie 164 SEKW. ID Nr:6;

   (b) glicynie w aminokwasie 165 SEKW. ID NR:6;

   (c) tyrozynie w aminokwasie 370 SEKW. ED NR:6;

   (d) cysteinie w aminokwasie 159 SEKW. ID NR:6;

   (e) izoleucynie w aminokwasie 419 SEKW. ID NR:6;

   (f) walinie w aminokwasie 356 SEKW. ID NR: 10;

   (g) serynie w aminokwasie 421 SEKW. ID NR: 10;

   (h) walinie w aminokwasie 502 SEKW. ID NR: 10;

   (i) alaninie w aminokwasie 211 SEKW ID NR: 10;

   (j) glicynie w aminokwasie 212 SEKW. ID NR: 10;

   (k) izoleucynie w aminokwasie 466 SEKW. ID NR: 10;

   (l) prolinie w aminokwasie 369 SEKW. ID NR: 12;

   (m) alaninie w aminokwasie 226 SEKW. ID NR: 12;

   (n) tyrozynie w aminokwasie 432 SEKW. ID NR: 12;

   (o) walinie w aminokwasie 517 SEKW. ID NR: 12;

   (p) tyrozynie w aminokwasie 428 SEKW. ID NR: 16;

   (q) prolinie w aminokwasie 365 SEKW. ID NR: 16; oraz (r) tyrozynie w aminokwasie 449 SEKW. ID NR: 18 i drugie podstawienie aminokwasu występujące w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje odpowiadające (i) serynie w aminokwasie 305 SEKW. ID NR:2;

   (ii) treoninie w aminokwasie 249 SEKW. ID NR:2;

   (iii) prolinie w aminokwasie 118 SEKW. ID NR:2;

   (iv) asparaginie w aminokwasie 425 SEKW. ID NR:2; oraz (v) tyrozynie w aminokwasie 498 SEKW. ID NR:2, przy czym pierwsze podstawienie aminokwasu nadaje mu cechę oporności na inhibitor protox, a drugie podstawienie aminokwasu powoduje wzmożenie nadanej oporności.
2. 2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że pierwsze podstawienie aminokwasu występuje w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje odpowiadające (a) alaninie w aminokwasie 164 SEKW. Id NR:6 oraz (b) tyrozynie w aminokwasie 370 SEKW. ID NR:6, a drugie podstawienie aminokwasu występuje w pozycji odpowiadającej serynie w aminokwasie 305 SEKW. ID NR:2.
3. 3. Cząsteczka DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że pierwsze podstawienie aminokwasu dotyczy tyrozyny, występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 370 SEKW. ID NR:6, a drugie podstawienie aminokwasu dotyczy seryny, występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 305 SEKW. ID NR:2.
4. 4. Cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 370 SEKW. ID NR:6 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej cysteinę, izoleucynę, leucynę, treoninę, walinę i metioninę.

   187 545
5. 5. Cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że seryna odpowiadająca aminokwasowi 305 w SEKW. ID NR:2 jest zastąpiona przez leucynę, a tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 370 SEKW. ID NR:6 jest zastąpiona przez metioninę.
6. 6. Sposób wytwarzania roślin, które są tolerancyjne lub oporne na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, znamienny tym, że

   i) transformuje się materiał roślinny izolowana cząsteczką DNA, jak określono w zastrz 1-5, ii) selekcjonuje się transformowany materiał i iii) regeneruje się ten transformowany materiał w morfologicznie normalne, płodne, zdrowe rośliny.
7. 7. Sposób zwalczania wzrostu niepożądanej wegetacji, znamienny tym, że rośliny wytworzone sposobem określonym w zastrz. 6 oraz roślinność niepożądaną traktuje się herbicydem hamującym oksydazę protoporfirynogenu, stosowanym w ilości wystarczającej do zwalczania wzrostu niepożądanej roślinności, zasadniczo bez oddziaływania na rośliny.