PL187094B1 - Izolowana cząsteczka DNA kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, chimerowy gen, sposób wytwarzania roślin oraz sposób zwalczania chwastów - Google Patents

Abstract

1. Izolowana czasteczka DNA (a) kodujaca enzym oksydaze protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierajacy sekwen- cje aminokwasowa okreslona jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodujaca enzym oksydaze protoporfirynogenu (protox) pszenicy, majaca sekwencje nukleotydowa, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej okreslonej jako SEKW. ID NR: 9 w nastepujacych warunkach hybrydyzacji i plukania: i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO 4 pH 7,0, 1 mM EDTA w 50°C; i ii) plukanie w 2 X SSC, 1% SDS w 50°C. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka DNA kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, chimerowy gen, zawierający izolowaną cząsteczkę DNA, sposób wytwarzania roślin, które wykazują cechę tolerancji lub cechę oporności na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, oraz sposób zwalczania chwastów.

Enzym oksydaza protoporfirynogenu, określany zwyczajowo jako „protox”, bierze udział w szlaku biosyntezy chlorofilu/hemu.

Szlaki biosyntezy, które prowadzą do produkcji chlorofilu i hemu mają szereg wspólnych etapów. Chlorofil jest barwnikiem zbierającym światło obecnym we wszystkich zielonych organizmach fotosyntetyzujących. Hem jest kofaktorem hemoglobiny, cytochromu, oksygenaz P450 o mieszanych funkcjach, peroksydaz i katalaz (Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York, (1975)), a zatem, jest niezbędnym składnikiem wszystkich organizmów tlenowych.

187 094

Ostatni wspólny etap w biosyntezie chlorofilu i hemu to utlenianie protoporfirynogenu IX do protoporfiryny IX. Oksydaza protoporfirynogenu (protox) jest; enzymem, który katallzuje ten ostatni etap utleniania (Matringe i wsp., Biochem. J. 260:231, (1989)).

Enzym protox został oczyszczony częściowo lub całkowicie z szeregu organizmów, w tym drożdży Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois i Labbe, w Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.H. Daley, red. McGrawHill, New York str. 235-285, (1990)), z etioplastów jęczmienia (Jacobs i Jacobs, Biochem. J. 244:219, (1987)) i z wątroby myszy (Daley i Karr, Biochem. 26: 2697, (1987)). Geny kodujące protox wyizolowano z dwóch organizmów prokariotycznych, Escherichia coli (Sasarman i wsp., Can. J. Microbiol. 39: 1155, (1993) i Bacillus subtilis (Dailey i wsp., J. Biol. Chem. 269: 813, (1994)). Te wyizolowane geny nie mają podobnych sekwencji; także przewidywane produkty białkowe nie wykazują identyczności sekwencji aminokwasów. Białko E. coli ma masę około 21 kDa i asocjuje z błoną komórkową. Białko B. subtilis ma masę 51 kDa, jest rozpuszczalne i ma aktywność cytoplazmatyczną.

Geny kodujące protox wyizolowano obecnie także z człowieka (Nishimura i wsp., J. Biol. Chem. 270 (14); 8076-8080, (1995) i rośliny (międzynarodowe zgłoszenie nr PCT/IB95/00452, zgłoszone 8 czerwca 1995 r., opublikowane 21 grudnia 1995 r. jako WO 95/34659).

Geny protox są stosowane do wytwarzania roślin opornych lub tolerancyjnych na określone herbicydy.

Stosowanie herbicydów do zwalczania niepożądanej roślinności, takiej jak chwasty lub rośliny niepożądane w plonach, stało się praktyką nieomal uniwersalną. Mimo tego szerokiego stosowania, zwalczanie chwastów pozostaje znacznym i kosztownym problemem dla rolników·'.

Skuteczność herbicydów zależy od właściwego ich stosowania. Przykładowo, uzyskanie dobrej kontroli nad chwastami, za pomocą herbicydów, zależy od czasu, rodzaju i sposobu stosowania herbicydu, oraz od stadium rozwoju chwastu. Ponieważ różne gatunki chwastów są oporne na herbicydy, produkcja skutecznych herbicydów staje się coraz bardziej ważna.

Herbicydy, które wykazują dużą skuteczność i szerokie spektrum działania przeciw chwastom, jak też szybszą degradację w glebie, często wykazują wyższą fitotoksyczność w stosunku do roślin uprawnych. Zaczęto więc wytwarzać rośliny uprawne, które są oporne lub tolerancyjne w stosunku do herbicydów. Hybrydy roślin uprawnych lub odmiany oporne na herbicydy pozwalają na stosowanie herbicydów bez ryzyka zniszczenia plonów. Nadanie roślinie cechy oporności może pozwolić na stosowanie herbicydu w tych uprawach roślin, w których stosowanie herbicydu, ze względu na wrażliwość plonu na herbidyd, było wykluczone lub ograniczone (np. do stosowania przed kiełkowaniem). Przykładowo, opis patentowy US 4 761 373 (Andersona i wsp.) ujawnia rośliny posiadające oporność na herbicydy imidazolinowe lub sulfonamidowe. Oporność jest nadawana przez zmieniony enzym syntazę acetohydroksykwasów (AHAS). Opis US 4 975 374 (Goodmana i wsp.) ujawnia komórki roślinne i rośliny zawierające gen kodujący zmutowaną syntetazę glutaminy (GS), oporne na hamowanie ich rozwoju przez herbicydy, które były znane jako inhibitory GS, np. fosfinotrycyny i sulfoksiminy metioniny. Z opisu US 5 013 659 (Bedbrooka i wsp.) są znane rośliny, które wyrażają zmutowaną syntazę acetomleczanu, która czyni je opornymi na herbicydy sulfonylomocznikowe, zaś z opisu US 5 162 602 (Somersa i wsp.) są znane rośliny tolerancyjne na herbicydy cykloheksanodionowe i herbicydy oparte na kwasie arylofenoksypropanowym. Tolerancję nadaje zmieniona karboksylaza acetylokoenzymu A (ACCaza).

Enzym protox stanowi cel szeregu związków herbicydowych. Herbicydy, które hamują protox obejmują wiele różnych strukturalnych klas cząsteczek (Duke i wsp. Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli i wsp., Pesticide Biochem Physiol. 43: 193 (1992); Matringe i wsp., FEBS Lett. 245: 35 (1989), Yanase i Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Te herbicydy obejmują etery difenylowe (np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy)-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorofen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyloetoksy)fenylo]-5-(1,1-dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo-3,4,5,6-tetrahydroftalamid; chloroftalin, N-(chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2.3,4-trichlorofenylo)-4— nitropirazolilo-5-oksy)propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydynowe (np. LS 82-556) i

187 094 fenopilan i jego analogi O-fenylopirrolidonowe i piperydynokarbaminianowe. Wiele z tych związków kompetycyjnie hamuje normalną reakcję katalizowaną przez enzym, wydają się działać jako analogi substratu. .

Zwykle efekt hamowania protox jest określany przez pomiar fluorescencji w około 622 do 635 nm, po wzbudzeniu w około 395 do 410 nm (Jacobs i Jacobs, Enzyme 28:206, (1992); Sherman i wsp., Plant Physiol. 97:280, (1991)). Oznaczenie to jest oparte na fakcie, że protoporfiryna IX jest barwnikiem fluorescencyjnym, a protoporfirynogen IX nie fluoryzuje.

Przewidywany sposób działania herbicydów hamujących protox obejmuje akumulację protoporfirynogenu IX w chloroplaście. Uważa się, że ta akumulacja doprowadza do wyciekania protoporfirynogenu IX do cytosolu, gdzie jest utleniana przez aktywność peroksydazy do protoporfiryny IX. Po ekspozycji na światło, protoporfiryna IX powoduje wytwarzanie singletowego tlenu w cytosolu. Ten singletowy tlen może z kolei doprowadzić do tworzenia innych czynnych form tlenu, co może powodować peroksydację lipidów i dysrupcję błon komórkowych, oraz doprowadza do szybkiej śmierci komórek (Lee i wsp., Plant Physiol. 102:881,(1993)).

Nie wszystkie enzymy protox są wrażliwe na herbicydy, które hamują roślinne enzymy protox. Oba enzymy protox kodowane przez geny izolowane z Escherichia coli (Sasarman i wsp., Can. J. Microbiol. 39: 1155, (1993) i Bacillus subtilis (Dailey i wsp., J. Biol. Chem. 269: 813, (1994)) są oporne na te inhibitory herbicydowe. Ponadto, opisano mutanty jednokomórkowego glonu Chlamydomonas reinhardtii oporne na herbicyd fenylimidowy S-23142 (Kataoka i wsp., J. Pesticide Sci. 15:449, (1990); Shibata i wsp., w Research in Photosynthesis, tom III, N. Murata, red., Kluwer: Holandia str. 567-570, (1992)). Przynajmniej jeden z tych mutantów wydaje się mieć zmienioną aktywność protox, która jest oporna nie tylko na inhibitor herbicydowy, na którym selekcjonowano mutanta, ale także na inne klasy inhibitorów protox (Oshio i wsp., Z. Naturforsch. 48c:339 (1993); Sato i wsp. w ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, red. ACS Press: Washington, D.C., (1994)). Opisano także zmutowaną linię komórkową tytoniu oporną na inhibitor S-21432 (Che i wsp., Z. Naturforsch. 48c:350, (1993)).

Zgodnie z wynalazkiem izolowana cząsteczka DNA stanowi cząsteczkę DNA (a) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mającą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania:

i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO₄ pH 7,0, 1 mM EDTA w 50° C; i ii) płukanie w 2 X SSC, 1 % SDS w 50°C.

Korzystnie, izolowana cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową określoną jako SEKW. ID NR: 9.

Korzystnie, izolowana cząsteczka DNA koduje enzym protox, który ma wprowadzoną co najmniej jedną modyfikację aminokwasu, nadającą enzymowi cechę oporności na herbicydy hamujące protox.

Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 356 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, walina jest zastąpiona przez leucynę.

Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie seryny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 421 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż seryna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, seryna jest zastąpiona przez prolinę.

Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 502 w SEKW. ED NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie

187 094 modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, walina jest zastąpiona przez alaninę.

Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie alaniny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 211 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż alanina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, alanina jest zastąpiona przez walinę lub treoninę.

Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie glicyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 212 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż glicyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, glicyna jest zastąpiona przez serynę.

Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie izoleucyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 466 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż izoleucyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególno ści, izoleucyna jest zastąpiona przez treoninę.

Każdy powyżej wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.

Według wynalazku chimerowy gen zawiera izolowaną cząsteczkę DNA (a) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mającą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania:

i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPOą pH 7,0, 1 mM EDTA w 50° C; i ii) płukanie w 2 X SSC, 1% SDS w 50°C, operacyjnie połączoną z heterologicznym promotorem aktywnym w roślinie.

Korzystnie, chimerowy gen dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu.

Korzystnie, chimerowy gen dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium.

Sposób wytwarzania roślin, które wykazują cechę tolerancji lub cechę oporności na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

i) transformuje się materiał roślinny powyżej zdefiniowaną izolowaną cząsteczką DNA albo powyżej zdefiniowanym genem chimerowym, ii) selekcjonuje się stransformowany materiał i następnie iii) regeneruje się wyselekcjonowany materiał w morfologicznie normalne, płodne, zdrowe rośliny.

Sposób zwalczania chwastów, według wynalazku charakteryzuje się tym, że rośliny wytworzone powyżej określonym sposobem traktuje się herbicydem hamującym oksydazę protoporfirynogenu, stosowanym w ilości wystarczającej do zwalczania chwastów, zasadniczo bez oddziaływania na rośliny.

Izolowane cząsteczki DNA, kodujące enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny oraz zmodyfikowane formy enzymów oksydazy protoporfirynogenu są oporne na związki, które hamują niezmodyfikowane naturalnie występujące enzymy roślinne protox.

Cząsteczki DNA kodujące takie oporne na inhibitory enzymy roślinne protox są wprowadzane pod kontrolą odpowiedniego promotora, w postaci genów hybrydowych, do roślin. Wprowadzone do genonu rośliny zmodyfikowane geny eksprymują w roślinie oporne na inhibitory roślinne enzymy protox.

187 094

Geny te mogą być stosowane do nadawania oporności na herbicydy hamujące protox w całych roślinach i jako selekcjonowalne markery do transformacji roślin. Rośliny, w tym ich potomstwo, tkanki roślinne i nasiona roślin, zawierające geny wyrażalne w roślinach, kodujące zmodyfikowane enzymy protox, są oporne na inhibitory protox w ilościach, które normalnie są hamujące dla naturalnie występujących w roślinach aktywności protox.

Sposób według wynalazku umożliwia wytwarzanie roślin, w tym materiał roślinny, taki jak na przykład tkanki roślinne, protoplasty, komórki, kalusy, narządy, nasiona roślin, zarodki, pyłek, komórki jajowe, zygoty, wraz z dowolnym innym rozmnażającym się materiałem i częściami roślin, jak na przykład kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie pochodzące z roślin transgenicznych lub ich potomstwa uprzednio transformowanych za pomocą sposobu według wynalazku, które produkują formę roślinnego enzymu protox opornego na inhibitor. Takie rośliny mogą być stabilnie transformowane za pomocą genu struktury kodującego oporny protox, lub mogą być wytwarzane za pomocą bezpośrednich technik selekcji, w których linie opome na herbicyd są izolowane, charakteryzowane i rozwijane, a także przez stosowanie technologii transformacji plastydów, w przypadkach gdy jest korzystne, aby geny protox były wyrażane w chloroplaście rośliny.

Zmodyfikowane geny są stosowane jako sondy do wykrywania obecności genów kodujących opome na inhibitor formy enzymu roślinnego protox i do ilościowego określania poziomów opornych na inhibitor transkryptów protox w tkance roślinnej. Mogą być też stosowane do identyfikowania lub badania przesiewowego roślin lub tkanki roślinnej zawierającej i/lub eksprymującej gen kodujący oporną na inhibitor formę roślinnego enzymu protox.

Sekwencja kodująca DNA dla enzymu oksydazy protoporfirogenu (protox) z dowolnego organizmu eukariotycznego może być uzyskana za pomocą metod standardowych.

Roślinami do których zmodyfikowane enzymy protox mogą być wprowadzane są zwłaszcza rośliny uprawne, takie jak kukurydza, jęczmień, pszenica, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i paszowe, proso, ryż, trzcina cukrowa, soja, bawełna, burak cukrowy, rzepak oleisty i tytoń.

OPIS LISTY SEKWENCJI

SEKW. ID NR: 1: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l Arabidopsis thaliana.

SEKW. ID NR: 2: Sekwencja aminokwasów protox-l Arabidopsis kodowana przez SEKW. ID NR: 1.

SEKW. ID NR: 3: Sekwencja DNA kodująca białko protox-2 Arabidopsis thaliana.

SEKW. ID NR: 4: Sekwencja aminokwasów protox-2 Arabidopsis kodowana przez SEKW. ID NR: 3.

SEKW. ID NR: 5: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l kukurydzy.

SEKW. ID NR: 6: Sekwencja aminokwasów protox-l kukurydzy kodowana przez SEKW. ID NR: 5.

SEKW. ID NR: 7: Sekwencja DNA kodująca białko protox-2 kukurydzy.

SEKW. ID NR: 8: Sekwencja aminokwasów protox-2 kukurydzy kodowana przez SEKW. ID NR: 7.

SEKW. ID NR: 9: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l pszenicy.

SEKW. ID NR: 10: Sekwencja aminokwasów protox-l pszenicy kodowana przez SEKW. ID NR: 9.

SEKW. ID NR: 11: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l soi.

SEKW. ID NR: 12: Sekwencja aminokwasów protox-l soi kodowana przez SEKW. IDNR: 11.

SEKW. ID NR: 13 : Sekwencja promotora genu protox-l Arabidopsis thaliana.

SEKW. IDNR: 14: Sekwencja promotora genu protox-l kukurydzy.

SEKW. ID NR: 15: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l bawełny.

SEKW. ID NR: 16: Sekwencja aminokwasów protox-l bawełny kodowana przez SEKW. IDNR: 15.

SEKW. ID NR: 17: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l buraka cukrowego.

SEKW. ID NR: 18: Sekwencja aminokwasów protox-l buraka cukrowego kodowana przez SEKW. IDNR: 17.

187 094

SEKW. ID NR: 19: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l rzepaku.

SEKW. ID NR: 20: Sekwencja aminokwasów protox-l rzepaku kodowana przez SEKW. IDNR: 19.

SEKW. ID NR: 21: Sekwencja DNA kodująca białko protox-1 ryżu.

SEKW. ID NR: 22: Sekwencja aminokwasów protox-1 ryżu kodowana przez SEKW. ID NR: 21.

SEKW. ID NR: 23: Sekwencja DNA kodująca białko protox-1 sorgo.

SEKW. ID NR: 24: Sekwencja aminokwasów protox-l sorgo kodowana przez SEKW. ID NR: 24.

SEKW. ID NR: 25: Sekwencja intronu protox-l kukurydzy.

SEKW. ID NR: 26: Sekwencja promotora protox-l buraka cukrowego.

SEKW. ID NR: 27: Primer PclpPla dla górnej nici promotora genu plastydowego clpP

SEKW. ID NR: 28: Primer Pclp_P1b dla dolnej nici promotora genu plastydowego clpP

SEKW. ID NR: 29: Primer Pclp_P2b dla górnej nici promotora genu plastydowego clpP

SEKW. ID NR: 30: Primer Trpsl6_Pla dla górnej nici genu plastykowego rps16

SEKW. ID NR: 31: Primer Trpsl6_Pl a dla dolnej nici genu plastydowego rps16

SEKW. ID NR: 32: Primer minpsb_U dla górnej nici genu plastydowego psbA

SEKW. ID NR: 33: Primer minpsbU dla dolnej nici genu plastydowego psbA

SEKW. ID NR: 34: Primer ApRtXP1 a dla górnej nici

SEKW. ID NR: 35: Primer APRTXP1 b dla dolnej nici

DEPOZYTY

Następujące cząsteczki wektorów zdeponowano w Agricultural Research Service, Patent Cuture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois USA, w podanych poniżej datach:

Protox 1a pszenicy w wektorze pBluescript' SK zdeponowano 19 marca 1996 jako pWDC-13 (NRRL#B 21545).

Protox-1 soi w wektorze pBluescript SK zdeponowano 15 grudnia 1995 jako pWDC-12 (NRRL#B-21516).

Protox-1 bawełny w wektorze pBluescript SK zdeponowano 1 lipca 1996 jako pWDC15(NRRL#B-21594).

Protox -1 buraka cukrowego w wektorze pBluescript SK zdeponowano 29 lipca 1996 jako pWDC-16 (NRRL#B-21595N).

Protox-1 rzepaku w wektorze pBluescript SK zdeponowano 23 sierpnia 1996 jako pWDC-17 (NRRUB-21615).

Protox-1 ryżu w wektorze pBluescriptSK zdeponowano 6 grudnial966 jakopWDC18(NRRL#B-21648).

Protox-1 sorgo w wektorze pBluescript SK zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pWDC19 (NRRL#B-21649).

Opornego mutanta pAraC-2Cys w plazmidzie pMut-1 zdeponowano 14 listopada 1994 pod nazwą pWDC-7 w Agricultural Research Culture Collection i uzyskał nazwę depozytową NRRL# 21339N.

AraPT1Pro zawierający promotor Protox-l ArabiZopsis zdeponowano 15 grudnia 1995 jako pWDC-11 (NRRL#B-21515).

Plazmid zawierający promotor Protox-1 kukurydzy w formie fuzji z resztą sekwencji kodującej Protox-l kukurydzy zdeponowano 19 marca 1996 jako pWDC-14 (NRRL#B21546).

Plazmid zawierający promotor Protox-1 buraka cukrowego zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pWDC-20 (NRRL#B-21650).

Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu rrntnx pszenicy są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 9 i 10. Podano również sekwencje kodujące DNA i odpowiednie sekwencje aminokwasów dla innych roślin. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox soi są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 11 i 12. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu rrotox bawełny są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 15 i 16. Sekwencja

187 094 kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox buraka cukrowego są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 17 i 18. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox rzepaku są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 19 i 20. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox ryżu są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 21 i 22. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox sorgo są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 23 i 24.

Sekwencje kodujące DNA i odpowiednie sekwencje aminokwasów dla enzymów protox Arabidopsis thaliana i kukurydzy, które były uprzednio wyizolowane są podane jako SEKW. ID NR: 1-4 {Arabidopsis) oraz SEKW. ID NR: 5-8 (kukurydza).

Wyizolowane cząsteczki DNA kodujące enzym oksydazę protoporfirogenu (protox) rośliny dwuliściennej, charakteryzują się tym, że wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy złożonej z SEKW. ID NR: 12, 16, 18 i 20. Wyizolowane cząsteczki DNA kodujące enzym oksydazę protoporfirogenu (protox) rośliny jednoliściennej, charakterystyzują się tym, że wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy złożonej z SEKW. ID NR: 10, 22 i 24.

Sekwencja kodująca DNA dla enzymu oksydazy protoporfirogenu (protox) z dowolnego organizmu eukariotycznego może być uzyskana stosując metody standardowe.

Izolowane cząsteczki DNA kodujące enzym protox mają odpowiednie sekwencje nukleotydów, które hybrydyzują do sekwencji nukleotydowej SEKW. ID NR: 9, 11, 15, 17, 19, 21 i 23 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania:

i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPC, pH 7,0, 1 mM

EDTA w 50°C; i .

ii) płukanie w 2 X SSC, l % SDS w 50°C.

Izolowane eukariotyczne sekwencje mogą być manipulowane zgodnie ze standardowymi technikami inżynierii genetycznej, aby odpowiadać pożądanemu celowi. Przykładowo, cała sekwencja protox lub jej części mogą być zastosowane jako sondy zdolne do specyficznej hybrydyzacji do sekwencji kodujących protox i mRNA. Aby uzyskać specyficzną hybrydyzację w różnych warunkach, sondy zawierają sekwencje, które są unikalne wśród sekwencji kodujących protox i korzystnie mają przynajmniej 10 nukleotydów długości, a najbardziej korzystnie przy najmniej 20 nukleotydów długości. Takie sondy mogą być zastosowane do amplifikacji i analizy sekwencji kodujących protox z wybranego organizmu za pomocą dobrze znanego procesu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Technika ta może być użyteczna do izolowania dodatkowych sekwencji kodujących protox z pożądanego organizmu lub jako oznaczenie diagnostyczne, aby określić obecność sekwencji kodujących protox u organizmu.

Czynniki, które wpływają na stabilność hybryd, określają ostrość warunków hybrydyzacji. Jednym z czynników jest temperatura topnienia T_m, która może być łatwo obliczona według wzoru podanego w DNA PROBES, George H. Keller i Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd. 1993, Section one: Molecular hybridization Technology, str. 8 i dalsze. Korzystna temperatura hybrydyzacji leży w zakresie około 25°C poniżej wyliczonej temperatury topnienia Tm, korzystnie w zakresie 12-15°C poniżej wyliczonej temperatury topnienia Tm, zaś w przypadku oligonukleotydów w zakresie 5-10°C poniżej temperatury topnienia Tm.

Do modyfikacji mogą być stosowne cząsteczki, które hybrydyzują do cząsteczki DNA kokującej zmodyfikowany enzym protox, korzystnie do sondy oligonukleotydowej otrzymywanej ze zmodyfikowanej cząsteczki DNA, zawierającej ciągły fragment sekwencji wymienionego enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) o długości przynajmniej 10 nukleotydów, w umiarkowanie ostrych warunkach.

Sondy nukleotydowe mogą być stosowane, w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), do specyficznej hybrydyzacji z roślinnym genem protox lub z mRNA o długości przynajmniej 10 nukleotydów.

Sondy zdolne do specyficznej hybrydyzacji do eukariotycznej sekwencji DNA kodującej aktywność oksydazy protoporfirogenu lub odpowiedniego mRNA, mogą być stosowane do wykrywania wymienionych sekwencji DNA w organizmach eukariotycznych.

187 094

Specyficzne sondy hybrydyzacyjne protox mogą też być stosowane do zmapo wania położenia naturalnych eukariotycznych genów (lub genu) protox w genomie wybranego organizmu stosując standardowe techniki oparte na wybiórczej hybrydyzacji sondy do genomowych sekwencji protox. Techniki te obejmują identyfikację polimorfizmów DNA określonych lub zawartych w sekwencji sondy protox, i użycie takich polimorfizmów do śledzenia segregacji genu protox w stosunku do innych markerów o znanej pozycji na mapie w populacji do mapowania pochodzącej z samozapylenia mieszańca z dwóch polimorficznych linii rodzicielskich (Helentjaris i wsp., Plant Mol. Biol. 5:109 (1985); Sommer wsp. Biotechniques 12:1982 (1982); D' Ovidio i wsp., Plant Mol. Biol. 15:169 (1990)). Podczas gdy każda eukariotyczna sekwencja protox jest rozważana jako użyteczna sonda do mapowania genów protox z dowolnego organizmu eukariotycznego, preferowanymi sondami są sekwencje protox z organizmów bardziej blisko spokrewnionych z wybranym organizmem, a najbardziej preferowanymi sondami są sekwencje proton z wybranego organizmu. Mapowanie genów protox w ten sposób jest rozważane jako szczególnie użyteczne w celach hodowli roślin. Przykładowo, poprzez znajomość pozycji na mapie genetycznej zmutowanego genu protox nadającego oporność na herbicyd można identyfikować flankujące markery DNA z referencyjnej mapy genetycznej (Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). Podczas introgresji cechy oporności na herbicydy do nowej linii hodowlanej markery te mogą być następnie wykorzystane do śledzenia zakresu DNA chromosomalnego flankującego protox, który jest jeszcze obecny w rekurencyjnym rodzicu po każdej rundzie krzyżówek wstecznych.

Sondy do hybrydyzacji specyficzne dla protox mogą być też stosowane do określania ilościowo ilości mRNA protox w organizmie stosując standardowe techniki jak analizę typu Northern. Ta technika może być stosowana jako oznaczenie diagnostyczne, aby wykiywać zmienione poziomy ekspresji protox, które mogą być związane z poszczególnymi niesprzyjającymi warunkami, takimi jak autosomalna dominująca choroba u człowieka, związana zarazem z objawami neuropsychiatrycznymi oraz uszkodzeniami skóry, które są związane z obniżonymi poziomami aktywności protox (Brenner i Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765, (1980)).

Cząsteczki DNA zawierające fragment DNA kodujący białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) mogą być wytwarzane, jak też izolowane z dowolnej rośliny, poprzez sposób obejmujący:

a) przygotowanie sondy nukleotydowej zdolnej do specyficznej hybrydyzacji do roślinnego genu protox lub mRNA, charakterystycznej tym, że wymieniona sonda zawiera ciągły fragment sekwencji kodującej białko protox rośliny o długości co najmniej 10 nukleotydów;

b) poszukiwanie innych sekwencji kodujących protox w populacjach sklonowanych fragmentów genomowego DNA lub fragmentów cDNA z wybranego organizmu z zastosowaniem sondy nukleotydowej przygotowanej zgodnie z etapem (a); oraz

c) izolację i namnożenie cząsteczki DNA zawierającej fragment DNA kodujący białko mające aktywność enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Natomiast wytwarzanie zasadniczo czystej sekwencji DNA kodującej białko wykazujące aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox), prowadzi się w sposób następujący:

a) przygotowanie biblioteki genomowej lub cDNA z odpowiedniego organizmu wyjściowego stosując odpowiedni wektor do klonowania;

b) hybrydyzację biblioteki z cząsteczką sondy; oraz

c) określenie pozytywnych hybrydyzacji sondy do klonów DNA z biblioteki to znaczy klonów potencjalnie zawierających sekwencje odpowiadające sekwencji aminokwasów dla oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Ponadto, sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji DNA kodującej białko wykazujące aktywność enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmuje:

a) przygotowanie całkowitego DNA z biblioteki genomowej lub cDNA;

b) zastosowanie DNA z etapu (a) jako matrycy do reakcji PCR z primerami przedstawiającymi części o niskim stopniu degeneracji sekwencji aminokwasów oksydazy protoporfirynogenu (protox).

187 094

Oznaczanie inhibitorów aktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmuje:

a) inkubację pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu;

b) pomiar niezahamowanej reaktywności oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (a);

c) inkubację pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej związek będący inhibitorem;

d) pomiar hamowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (c); i

s) porównanie hamowanej reaktywności do nishamowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Oznaczanie opornych na inhibitory mutantów oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmuje:

a) inkubację pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej inhibitor enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox);

b) pomiar niszmutowanej reaktywności oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (a);

c) inkubację pierwszej próbki zmutowanego enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jsj substratu w obecności drugiej próbki zawierającej związek będący inhibitorem oksydazy protoporfirynogenu (protox);

d) pomiar zmutowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (c); i

e) porównanie zmutowanej reaktywności do niezmutowansj reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox).

Dla wytworzenia enzymu w organizmie gospodarza, przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA, sekwencja kodująca protox możs być wstawiona do kasety ekspresyjnej zaprojektowanej dla wybranego gospodarza, zostać wprowadzona do tego gospodarza i następnie przez gospodarza wyrażana. Wybór specyficznych sekwencji regulatorowych takich jak promotor, sekwencja sygnałowa, sekwencje 5' i 3' nis ulegające translacji i snhancer jest w zakresie umiejętności osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Powstała cząsteczka zawierająca poszczególne elementy połączone w odpowiedniej ramce odczytu możs być wstawiona do wektora, który możs być wtransformowany do komórki gospodarza. Odpowiednie wektory ekspresyjne i sposoby do produkcji zrekombinowanych białek są dobrze znane dla organizmów gospodarzy takich jak E. coli (Studier i Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986); Brosius, DNA : 759 (1989)), drożdży (Schneider i Guarents, Meth. Enzymol 194: 373 (1991)) i komórek owadów (Lucków i Summers, Bio/Tschnol. 6: 47 (1988)). Specyficzne przykłady obejmują plazmidy takie jak pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Havsn, CT), pTrcHis (lnvitrogsn, La Jolla, CA) i bakulowirusowe wektory ekspresyjne, np. pochodzące z genomu wirusa polihedruzy jądrowej Autographica californica (AcMNPV). Korzystnym systemem bakulowirus/owad są komórki pVI 11392/Sf21 (lnvitrogen, La Jolla, CA).

Wytwarzany za pomocą rekombinacji eukariotyczny enzym protox jest pożyteczny dla różnych celów, przykładowo, może być użyty do dostarczania aktywności protox in vitro. Może być też użyty jako oznaczenie in vitro do badań przesiewowych znanych związków herbicydowych, których cel nie jest znany aby sprawdzić czy hamują protox. Takie oznaczenie in vitro może też być stosowane jako bardziej ogólne badanie przesiewowe dla określenia związków chemicznych, które hamują aktywność protox, a zatem mogą być stosowane jako herbicydy. Produkowany za pomocą rekombinacji eukariotyczny enzym protox może też być zastosowany w oznaczeniu do identyfikacji mutantów protox opornych na inhibitory (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/IB95/00452, zgłoszone 8 czerwca 1995 r., opublikowane 21 grudnia 1995 r. jako WO 95/34659).

Alternatywnie, enzym protox wytworzony za pomocą metod rekombinacji może być użyty dla dalszej charakteryzacji jego asocjacji ze znanymi inhibitorami, aby w racjonalny sposób planować nowe hamujące herbicydy jak i tolerujące herbicyd formy enzymu.

187 094

Sekwencje aminokwasów każdej roślinnej oksydazy protoporfirynogenu (protox) mogą być modyfikowane, aby uzyskać oporną na inhibitor formę tego enzymu.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) ma przy najmniej jedną modyfikację aminokwasu, dla nadawania oporności na inhibitor protox. Zmodyfikowane białko toleruje herbicyd w ilościach, które hamują eukariotyczne białko. Określenie „hamują” oznacza obniżenie aktywności enzymatycznej obserwowane w obecności danego herbicydu w porównaniu do poziomu aktywności obserwowanego w nieobecności danego herbicydu, gdzie korzystnie procent obniżenia jest przynajmniej 10%, bardziej korzystnie 50% a najbardziej korzystnie co najmniej 90%.

Cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox) zawierającą eukariotyczny protox (np. enzym protox pszenicy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu i sorgo), ma przynajmniej jedną modyfikację aminokwasu, charakterystyczną tym, że zmodyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.

Jak wyżej podano, wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd, stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że cysteina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 159 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Cysteina jest zastąpiona przez fenyloalaninę lub lizynę, a zwłaszcza przez fenylolaninę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że izoleucyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 419 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Izoleucyna jest zastąpiona przez treoninę, histydynę, glicynę lub asparaginę, a zwłaszcza przez treoninę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że alanina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 164 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Alanina jest zastąpiona zwłaszcza przez treoninę, leucynę lub walinę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że glicyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 165 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Glicyna jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę lub leucynę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 370 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez izoleucynę lub metioninę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że walina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 356 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Walina jest zastąpiona przez leucynę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że seryna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 421 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Seryna jest zastąpiona zwłaszcza przez prolinę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że walina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 502

187 094

SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Walina jest zastąpiona zwłaszcza przez alaninę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że alanina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 211 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Alanina jest zastąpiona zwłaszcza przez walinę lub treoninę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że glicyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 212 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Glicyna jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że izoleucyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 466 SEKW. ID nR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Izoleucyna jest zastąpiona zwłaszcza przez treoninę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że prolina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 369 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Prolina jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę lub histydynę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że alanina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 226 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Alanina jest zastąpiona zwłaszcza przez treoninę lub leucynę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że walina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 517 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Walina jest zastąpiona zwłaszcza przez alaninę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 432 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez leucynę lub izoleucynę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że prolina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 365 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Prolina jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 428 SEKW. ID NR: 16 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez cysteinę lub argininę.

Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 449 SEKW. ID NR: 18 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez cysteinę, leucynę, izoleucynę, walinę lub metioninę.

187 094

Kasety ekspresyjne i wektory zrekombinowane zawierające wymienione kasety ekspresyjne i zawierające zasadniczo promotor, w szczególności promotor, który jest aktywny w roślinie, mogą być czynnie powiązane z cząsteczką DNA kodującą - enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z organizmu eukariotycznego. Kaseta ekspresyjna może dodatkowo zawierać sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z wymienioną cząsteczką DNA, wyróżniającą się tym, że wymieniona sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania wymienionego białka kodowanego przez wymienioną cząsteczkę DNA do chloroplastu lub mitochondriów.

Gen hybrydowy, który zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą zasadniczo promotor, ale w szczególności promotor, który jest aktywny w roślinie, jest funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z organizmu eukariotycznego. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny, przykładowo z Arabidopsis, trzciny cukrowej, soi, jęczmienia, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku oleistego, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, traw darniowych i paszowych, prosa, paszy i ryżu. Gen hybrydowy zawiera zwłaszcza promotor czynny w roślinie połączony funkcjonalnie z heterologiczną. cząsteczką DNA kodującą oksydazę protoporfirynogenu (protox), przykładowo, z protox pszenicy zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 10, protox soi zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 12, protox bawełny zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 16, protox buraka cukrowego zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 18, protox rzepaku zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 20, protox ryżu zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 22 i protox sorgo zawierający sekwencję podaną w SEKW. ED NR: 24.

Stosowane określenie „protox-l” oznacza protox z chloroplastów, zaś „protox-2” oznacza protox z mitochondriów.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z gatunku Arabidopsis mające aktywność protox-l lub protox-2, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 2 lub SEKW. ID NR: 4.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z kukurydzy mające aktywność protox-l lub protox-2, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 6 lub SeKw. iD NR: 8.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z pszenicy mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 10.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z soi mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 12.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z bawełny mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 16.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z buraka cukrowego mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 18.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z rzepaku mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 20.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z ryżu mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 22.

Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z sorgo mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 24.

Gen hybrydowy może być w postaci, która zawiera kasetę ekspresyjną, złożoną zasadniczo z promotora, w szczególności z promotora, który jest czynny w roślinie, funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z orga187 094 nizmu eukariotycznego, oporną na poziomy herbicydów, hamujące niezmodyfikowaną formę enzymu. Cząsteczka DNA może kodować oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny wybranej z grupy złożonej z Arabidopsis, trzciny cukrowej, soi, jęczmienia, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku oleistego, kukurydzy, przenicy, sorgo, żyta, owsa, traw darniowych i paszowych, prosa, paszy i ryżu.

Gen hybrydowy zawierający promotor, który jest aktywny w roślinie, może być funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox), mającego przy najmniej jedną modyfikację aminokwasu, która nadaje oporność na inhibitor protox.

Gen hybrydowy może dodatkowo zawierać sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z wymienioną cząsteczką DNA, charakterystyczną tym, że wymieniona sekwencja sygnałowa jest zdolna do adresowania białka kodowanego przez wymienioną sekwencję DNA do chloroplastu lub do mitochondriów. Ponadto, gen hybrydowy może zawierać jeszcze sekwencję sygnałową, wyróżniającą się tym, że wymieniona sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania wymienionego białka kodowanego przez wymienioną cząsteczkę DNA do mitochondriów.

Zrekombinowane cząsteczki DNA zawierają roślinną oksydazę protoporfirynogenu lub jej funkcjonalnie równoważny odpowiednik. Zrekombinowany wektor DNA zawiera wymienioną zrekombinowaną cząsteczkę DNA.

Zrekombinowany wektor zawierający hybrydowy gen, charakteryzuje się tym, że wymieniony wektor jest zdolny do stabilnej transformacji rośliny, nasion rośliny, tkanki roślinnej lub komórki roślinnej.

Stabilnie transformowana wektorem roślina, nasiona rośliny, tkanka roślinna lub komórka roślinna jest zdolna do ekspresji cząsteczki DNA kodującej oksydazę protoporfirynogenu (protox). Korzystny jest wektor zrekombinowany, charakteryzujący się tym, że roślina, nasiona rośliny, tkanka roślinna lub komórka roślinna stabilnie transformowana wymienionym wektorem jest zdolna do ekspresji cząsteczki DNA kodującej oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny, która jest oporna na herbicydy na poziomie, który hamuje odpowiednią niezmodyfikowaną wersję enzymu.

Zrekombinowany wektor zawierający promotor aktywny w roślinie jest funkcjonalnie powiązany z heterologiczną cząsteczką DNA kodującą oksydazę protoporfirynogenu (protox). Wektor zrekombinowany, charakteryzuje się tym, że roślina, nasiona rośliny, tkanka roślinna lub komórka roślinna, stabilnie transformowana wymienionym wektorem, jest zdolna do ekspresji cząsteczki DNA kodującą oksydazę protoporfirynogenu (protox), przykładowo, protox pszenicy zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 10, protox soi zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 12, protox bawełny zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 16, protox buraka cukrowego zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 18, protox rzepaku zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 20, protox ryżu zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 22 oraz protox sorgo zawierający sekwencję podaną w SEKW. IDNR: 24.

Komórka gospodarza stabilnie transformowana wektorem, charakteryzuje się tym, że wymieniony gospodarz jest zdolny do ekspresji wymienionej cząsteczki DNA. Komórka gospodarza może być wybrana z grupy złożonej z komórki roślinnej, komórki bakterii, komórki drożdży i komórki owadów.

Wytworzone rośliny, ich potomstwo, tkanki roślinne i nasiona roślin, są tolerancyjne w stosunku do herbicydów, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tolerancja na herbicyd jest nadana przez gen eksprymujący zmodyfikowany oporny na inhibitor enzym protox. Roślinami, które są poddawane działaniu herbicydów, są zwłaszcza rośliny o znaczeniu rolniczym, okrytonasienne i nagonasienne, takie jak Arabidopsis, trzcina cukrowa, soja, jęczmień, bawełna, tytoń, burak cukrowy, rzepak oleisty, kukurydza, pszenica, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i paszowe, proso, ryż, itp.

Transgeniczna tkanka roślinna (obejmująca rośliny i ich potomstwo, nasiona, i hodowane tkanki), stabilnie transformowana przynajmniej jednym hybrydowym genem, zwłaszcza genem, który zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą promotor (w szczególności promotor,

187 094 który jest czynny w roślinie, funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox), jest oporna na herbicydy na poziomach, które hamują odpowiednią niezmodyfikowaną wersję enzymu w tkankach roślinnych.

Zrekombinowana cząsteczka DNA według wynalazku może być wprowadzona do komórki roślinnej w szereg sposobów znanych w dziedzinie. Odpowiednie metody transformacji komórek roślinnych obejmują mikroinjekcję (Crossway i wsp., Bio Techniques 4: 320-334 (1986)), elektroporację (Riggs i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986), przenoszenie, w którym pośredniczy Agrobacterium (Hinchee i wsp., Biotechnology 6:915-921 (1988)), bezpośrednie przeniesienie genów (Paszkowski) Paszowski wsp., EMBO J. 3:27172733 (1984)), balistyczne przyspieszenie cząsteczek stosując urządzenia dostepne od Agracetus, Inc. Madison, Wisconsin i Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (np. Sanford i wsp., US 4 945 050; i McCabe i wsp., Biotechnology 6:923-926 (1988)) i metody transformacji/regeneracji protoplastów (opis patentowy US 5 350 689 wydany 27 września 1994 r. dla Ciba-Geigy Copr.). Ponadto, odpowiednie sposoby postępowania są ujawnione w publikacjach Weissinger i wsp., Annual Rev. Genet 22: 421-477 (1988); Sanford i wsp., Particulate Science and Technology 5:27-27 (1987) (cebula); Christou i wsp., Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (soja); McCabe i wsp., Bio/Technology 6:923-926 (1988) (soja); Datta i wsp., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (ryż), Klein i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:43-54309 (kukurydza); Klein i WSP., Bio/Technology 6:559-563 1988) kukurydza); Klein i wsp., Plant Physiol. 91:440-444 (kukurydza); Fromm i wsp., Bio/Technology 8:833-839 (1990); i Gordon-Kamm i wsp., Paint Cell 2: 603-618 (1990) (kukurydza).

Rośliny transgeniczne, w szczególności rośliny transgeniczne transformowane za pomocą powyżej wymienionych sposobów i ich bezpłciowe i/lub płciowe potomstwo, są nadal oporne albo przynajmniej tolerują hamowanie przez herbicyd na poziomach, które są normalnie hamujące dla naturalnie występującej aktywności proton w roślinie. Rośliny potomne także obejmują rośliny z innym tłem genetycznym niż roślina rodzicielska, które to rośliny są wynikiem programu krzyżowania wstecznego wstecznego nadal zawierają w swoim genomie cechę oporności. Korzystne są rośliny hybrydowe, które SA oporne lub przynajmniej tolerancyjne na inhibicję przez herbicyd na poziomach, które są normalnie hamujące dla naturalnie występującej aktywności protox w roślinie.

Transgeniczna roślina może być dwuliścienna lub jednoliścienna. Rośliny jednoliścienne z rodziny Graminaceae obejmujące rośliny Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale i Setaria. Wytwarzana jest zwłaszcza transgeniczna kukurydza, pszenica, owies, sorgo, żyto, trawy darniowe i paszowe, proso oraz ryż.

Roślinami dwuliściennymi są Arabidopsis, soja, bawełna, burak cukrowy, trzcina cukrowa, rzepak oleisty, tytoń i słonecznik. Wytwarzana jest zwłaszcza transgeniczna soja, bawełna, tytoń, burak cukrowy i rzepak oleisty.

Określenie „potomstwo” oznacza potomstwo roślin powstałe za równo w sposób „bezpłciowy” i „płciowy”. Ta definicja ma także obejmować wszystkie mutanty i warianty otrzymywane za pomocą znanych procedur jak na przykład fuzji komórek lub selekcji mutantów i które nadal wykazują charakterystyczne właściwości wyjściowej rośliny tranformowanej wraz z produktami krzyżowania i fuzji stransformowanego materiału roślinnego. To także obejmuje rośliny potomne powstałe w wyniku programu krzyżowania wstecznego, tak długo jak wymienione rośliny potomne nadal zawierają cechę oporności na herbicyd.

Materiał proliferacyjny roślin transgenicznych oznacza każdy materiał roślinny, który może być namnażany płciowo lub bezpłciowo in vivo lub in vitro. Szczególnie preferowane są protoplast, komórki, kalusy, tkanki, narządy, nasiona, zarodki, pyłek, komórki jajowe, zygoty wraz z każdym innym materiałem do namnażania uzyskanym z roślin transgenicznych.

Części roślin, takie jak na przykład kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie, pochodzące od roślin transgenicznych lub ich potomstwa uprzednio transformowanych za pomocą sposobu według wynalazku, również zawierają, przynajmniej częściowo, komórki transgeniczne.

Możliwe jest wytworzenie roślin, protoplastów, komórek, kalusów, tkanek, narządów, nasion, zarodków, pyłku, komórek jajowych, zygot wraz z dowolnym innym materiałem do namnażania, części roślin, takie jak na przykład kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie, po187 094 chodzące od roślin transgenicznych lub ich potomstwa uprzednio transformowanych za pomocą sposobu według wynalazku, które więc wytworzyły oporną na inhibitor formę enzymu roślinnego rrntox poprzez transformację rośliny, za pomocą DNA według wynalazku. Korzystny jest sposób produkcji komórki gospodarza zawierającej izolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukarionta mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmujący transformację wymienionego gospodarza za pomocą /.rekombinowanej cząsteczki wektora. Ponadto, korzystna jest metoda wytworzenia komórki roślinnej zawierającej izolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukarionta, mające aktywność oksydazy protoporfiry nogenu (protox) obejmująca transformację wymienionego gospodarza za pomocą zrekombinowanej cząsteczki wektora. Korzystny jest sposób produkujący traosgeniczoe potomstwo traosgenicznej rośliny rodzicielskiej obejmujący wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukarionta mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmujący transformację wymienionej rośliny rodzicielskiej zrekombinowaną cząsteczką wektora i przeniesienie cechy tolerancji na herbicyd na potomstwo wymienionej traosgeniczoej rośliny rodzicielskiej używając znanych technik hodowli roślin.

Sposób wytwarzania roślin, tkanek roślinnych, nasion roślin i części roślin, które produkują oporną na inhibitor formę enzymu roślinnego protox, polega na tym, że rośliny, tkanki roślinne, nasiona roślin i części roślin są stabilnie stransformowane genem struktury kodującym oporny enzym prntnx. Sposób wytwarzania roślin, tkanek roślinnych, nasion roślin i części roślin, polega zwłaszcza na tym, że rośliny, tkanki roślinne, nasiona roślin i części roślin są stablilnie stransformowane DNA. Sposób wytwarzania wymienionych roślin, tkanek roślinnych, nasion roślin i części roślin, które produkują oporną na inhibitor formę enzymu roślinnego protox, polega na tym, że rośliny, tkanki roślinne, nasion roślin i części roślin są przygotowane za pomocą technik bezpośredniej selekcji, dzięki czemu izolowane, scharakteryzowane i rozwijane linie są oporne na herbicydy.

Właściwości genetyczne wprowadzone do transgenicznych nasion i roślin opisanych powyżej są przekazywane poprzez rozmnażanie płciowe lub wzrost wegetatywny i w ten sposób mogą być utrzymywane i propagowane w roślinach potomnych. A zatem, utrzymywanie i propagacja wykorzystują znane metody rolnicze opracowane dla spełnienia specyficznych celów, takich jak uprawianie, sianie lub zbieranie. Wyspecjalizowane procesy, takie jak hyZroponika i technologie szklarniowe, też mogą być stosowane. Z uwagi na fakt, że rosnące rośliny są wrażliwe na atak i zniszczenia powodowane przez owady, na zakażenia, jak i na współzawodnictwo z chwastami, podejmuje się stosowne działania aby kontrolować chwasty, choroby roślin, owady, nicienie i inne niekorzystne warunki, tak aby polepszyć plony. Działania te obejmują mechaniczne sposoby, takie jak uprawianie gleby lub usuwanie chwastów i zakażonych roślin, oraz stosowanie agrochemikaliów takich jak herbicydy, fungicydy, środki nicieniobójcze, regulatory wzrostu, środki powodujące dojrzewanie i insektycydy.

Specyficzne właściwości genetycznych roślin i nasion traosgenicznych mogą być dalej wykorzystywane w hodowli roślin, mającej na celu opracowanie odmian roślin z polepszonymi właściwościami, takimi jak tolerancja na szkodniki, tolerancja na herbicydy, lub tolerancja na stres, lepsza wartość odżywcza, większa wydajność, lub ulepszona struktura powodująca mniejsze straty z wylęgania lub rozrywania. Te różne etapy hodowlane polegają na stosowaniu znanych sposobów, takich jak wybór linii do krzyżowania, kierowanie zapylania linii rodzicielskich, lub wybór odpowiednich roślin potomnych. W zależności od pożądanych właściwości stosowane są różne sposoby hodowlane. Odpowiednie techniki są dobrze znane w ZzieZzioie i obejmują ale nie ograniczają się do hybrydyzacji, chowu wsobnego, krzyżowania wstecznego, hodowania wielnlioiowego, mieszania odmian, hybrydyzacji międzygatunkowej, techniki ara^^idów, itp. Techniki hybrydyzacji także obejmują sterylizację roślin aby uzyskać rośliny męsko- lub żeńskosterylne za pomocą sposobów mechanicznych, chemicznych lub biochemicznych. Zapłodnienie krzyżowe rośliny męskosterylnej pyłkiem innej linii zapewnia, że genom męskosteiylnej ale żeńskopłodnej rośliny uzyska jednorodnie właściwości obu linii rodzicielskich. Zatem, traosgeoiczoe nasiona i rośliny mogą być stosowane do hodowli ulepszonych linii roślin, które na przykład zwiększają skuteczność konwencjonalnych metod takich jak stosowanie herbicydów lub pestycydów i lub pozwalają na nie stosowanie wymienionych metod ze względu na

187 094 zmodyfikowane właściwości genetyczne. Alternatywnie, mogą być otrzymane nowe rośliny uprawne, z ulepszoną tolerancją na stres, które ze względu na zoptymalizowane genetyczne „wyposażenie” dają produkt do zbiorów o lepszej jakości niż produkty, które nie były zdolne do .tolerancji porównywalnych niesprzyjających warunków rozwoju.

W produkcji nasion jakość kiełkowania i jednorodność nasion są najważniejszymi cechami produktu, podczas gdy jakość kiełkowania i jednorodność nasion zbieranych i sprzedawanych przez rolnika nie jest ważna. Jako że jest trudno utrzymać roślinę uprawną wolną od nasion innych roślin uprawnych i chwastów, aby kontrolować choroby przenoszone przez nasiona i aby produkować nasiona o dobrym kiełkowaniu dość ekstensywne i dobrze określone praktyki produkcji nasion zostały opracowane przez producentów nasion, którzy są doświadczeni w dziedzinie hodowli, kondycjonowania i sprzedawania czystych nasion. Tak więc jest częstą praktyką rolnika kupowanie nasion atestowanych spełniających specyficzne standardy jakości, niż stosowanie nasion zebranych z własnych plonów. Materiał do propagacji do stosowania jako nasiona jest zwyczajowo traktowany ochronną wartwą zawierającą herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki bakteriobójcze, środki nicieniobójcze, środki mięczakobójcze lub ich mieszaniny. Zwyczajowo stosowane związki ochronne obejmują związki takie jak kaptan, karboksyn, tiram (TMTD®), metalaksyl (Apron®) i pirimifor-metyl (Actelic®). Jeśli jest to pożądane, te związki są w formule z innymi nośnikami, związkami powierzchniowymi lub adiuwantami sprzyjającymi nakładaniu zwyczajowo stosowanych w formułowaniu, aby dostarczyć ochronę przed zniszczeniem powodowanym przez szkodniki bakteryjne, grzybowe lub zwierzęce. Ochronne powleczenia mogą być nakładane przez impregnowanie materiału do namnażania płynną formułą lub przez powleczenie ich łączoną formułą płynną lub suchą. Inne sposoby nakładania są także możliwe, tak jak procedury ukierunkowane na pąki lub owoce.

Niniejszy wynalazek pozwala na wytwarzanie materiału do propagacji roślin dla roślin hodowlanych, ale szczególnie nasion roślin, które są traktowane przez powleczenie nasion zwyczajowo stosowane w traktowaniu nasion.

Ponadto, niniejszy wynalazek pozwala na prowadzenie nowych metod rolniczych, takich jak metody podane powyżej, które charakteryzują się stosowaniem roślin transgenicznych, materiału z roślin transgenicznych lub nasion transgenicznych. W metodach tych jest stosowana transgeniczna roślina lub jej potomstwo zawierające hybrydowy gen według wynalazku, w ilości wystarczającej, aby wyrażać opome na herbicyd formy docelowych białek herbicydu w roślinie, dla nadania tolerancji na herbicyd.

Aby hodować potomstwo z roślin transformowanych może być stosowany sposób taki jak podano poniżej: rośliny kukurydzy wytworzone tak jak podano w przykładach przedstawionych poniżej są hodowane w doniczkach w szklarni lub glebie jak wiadomo w dziedzinie, i pozwala się im na kwitnięcie. Z dojrzałej kitki uzyskuje się pyłek i stosuje do zapylenia kłosu tej samej rośliny, roślin siostrzanych lub dowolnej pożądanej rośliny kukurydzy. Podobnie, kłosy rozwijające się na stransformowanej roślinie mogą być zapylone przez pyłek uzyskany z tej samej rośliny, rośliny siostrzanej lub dowolnej pożądanej rośliny kukurydzy. Transformowane potomstwo uzyskane za pomocą tej metody może zostać od różnione od nietransformowanego potomstwa przez obecność wprowadzonego genu (genów) i/lub towarzyszącego DNA (genotyp), lub przez uzyskany fenotyp. Stransformowane potomstwo może być krzyżowane ze sobą lub z innymi roślinami, jak normalnie się robi z rośliną niosącą pożądaną cechę. Podobnie tytoń lub inne transformowane rośliny produkowane tą metodą mogą być krzyżowane ze sobą lub krzyżowane jak znane jest w dziedzinie aby uzyskać potomstwo o pożądanych cechach.

Podobnie inne transgeniczne organizmy wytworzone poprzez kombinację metod znanych w dziedzinie i tego wynalazku mogą być hodowane jak znane jest w dziedzinie aby produkować potomstwo o pożądanych cechach.

Zmodyfikowane enzymy protox opome na inhibitory według niniejszego wynalazku posiadają przynajmniej jedno podstawienie aminokwasu, addycję lub delecję w stosunku do naturalnie występującego odpowiednika (tzn. form wrażliwych na inhibitor, które naturalnie występują w nie manipulowanej roślinie, albo bezpośrednio poprzez metodologie zrekombi187 094 nowanego DNA albo pośrednio poprzez hodowlę selekcyjną np. przez człowieka). Pozycje aminokwasów, które mogą być zmodyfikowane aby uzyskać oporną na inhibitor formę enzymu protox lub zwiększyć oporność na inhibitor są podane w sposób wytłuszczony w tabeli 1 dla roślinnych sekwencji protox-l z Arabidopsis, kukurydzy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu, sorgo i pszenicy. Spacjalista doceni, że ekwiwalentne zmiany mogą być wprowadzone do dowolnego genu protox mającego budowę dostatecznie podobną do pokazanych tu sekencji enzymu protox by pozwolić na porównanie i identyfikację tych aminokwasów, które są zmodyfikowane według wynalazku aby dać oporne na inhibitor formy enzymu. Takie dodatkowe geny roślinne protox mogą być uzyskane stosując standardowe techniki jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym Nr PCT/IB95/00452 zgłoszonym 8 czerwca 1995 r., opublikowanym 21 grudnia 1995 r. jako WO 95/34659.

Cząsteczki DNA kodujące sekwencje protox oporne na herbicydy ujawnione w niniejszym wynalazku mogą być poddane inżynierii genetycznej aby uzyskać optymalną ekspresję w roślinie uprawnej. Może to obejmować zmianę sekwencji kodującej genu oporności dla optymalnej ekspresji w interesującej roślinie uprawnej. Sposoby modyfikowania sekwencji kodujących aby uzyskać optymalną ekspresję w danym gatunku uprawnym są dobrze znane (Perlak i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:324(1991); Kozieł i wsp., Bio/technol. 11:194(1993)).

Inżynieria genetyczna sekwencji kodującej protox dla optymalnej ekspresji może także obejmować funkcjonalne powiązanie odpowiednich sekwencji regulatorowych (np. promotor, sekwencje sygnałowe, terminatory transkrypcji). Przykłady promotorów zdolnych do funkcjonowania w roślinach lub częściach roślin (np. zdolnych do sterowania ekspresją połączonych strukturalnych genów, takich jak protox w komórkach roślinnych obejmują promotory wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) 19S lub 35S i podwójne promotory CaMV; promotory syntazy nopaliny, promotory białek związanych z patogenezą (PR), promotory małej podjednostki karboksylazy rybulozobisfosforanu (ssuRUBISCO), promotor białka szoku cieplnego z Brassica z odniesieniem do EPA 0 559 603 (promotor hsp80), promotor aktyny Arabidopsis i promotor SuperMas (WO 95/14098), itp. Korzystnymi promotorami są takie, które nadają wysoki poziom ekspresji konstytutywnej, lub bardziej korzystnie takie, które nadają specyficzny wysoki poziom ekspresji konstytutywnej w tkance wrażliwej na niszczenie przez herbicyd. Korzystnymi promotorami są promotor aktyny ryżu (McElroy i wsp., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991), promotor ubikwityny kukurydzy (eP 0 342 926); Taylor i wsp., Plant Celi Rep., 12: 491 (1993) i promotor PR-1 z tytoniu, Arabidopsis lub kukurydzy (zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numery EP-332 104 oraz 08/181,271, dla Ryals i wsp.). Same promotory mogą być modyfikowane, aby manipulować mocą promotora zwiększyć ekspresję protox zgodnie ze sposobami znanymi w dziedzinie.

Korzystnym promotorem do stosowania z sekwencjami protox opornymi na inhibitor jest promotor związany z naturalnym genem protox (tzn. promotor protox, ujawniony we wspólnie zgłoszonym i wspólnie posiadanym Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym, numer rejestru PH/5-20756/CGC1846, pt. „Promotory genów oksydazy protoporfirynogenu”). Sekwencja promotora z genu protox-l Arabidopsis jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 13, sekwencja promotora genu protox-l kukurydzy jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 14, i sekwencja promotora genu protox-l buraka cukrowego przedstawiona w SEKW. ID NR: 26.

Opisane modyfikacje mogą być przeprowadzone bezpośrednio na naturalnym genie protox obecnym w genomie rośliny bez konieczności konstrukcji genu hybrydowego z heterologicznymi sekwencjami regulatorowymi, ponieważ sam promotor protox jest odpowiedni dla ekspresji sekwencji kodujących protox-l opornych na inhibitor. Takie modyfikacje mogą być przeprowadzone za pomocą technik mutagenezy ukierunkowanej takich jak homologiczna rekombinacja i wybierane na powstałe fenotypy oporności na herbicyd (Paszkowski i wsp., EMBO J. 7:4021-4028(1988) i US 5 487 992, kolumny 18-19 i przykład 8). Dodatkową zaletą tego podejścia jest, że oprócz zawierania naturalnego promotora protox, powstały zmodyfikowany gen będzie też zawierał każdy inny element regulatorowy, taki jak sekwencje kodujące peptyd sygnałowy lub tranzytowy, które są częścią natywnego genu.

187 094

Peptydy sygnałowe lub tranzytowe mogą tworzyć fuzje z sekwencjami kodującymi protox w hybrydowych konstruktaćh DNA, aby kierować transportem wyrażanego enzymu protox do pożądanego miejsca działania. Przykłady peptydów sygnałowych obejmują te naturalnie połączone z białkami związanymi z patogenezę np. PR-1, PR-2, itp. (Payne i wsp., Plant Mol. Biol. 11:89-94 (1988)). Przykłady peptydów tranzytowych obejmują peptydy tranzytowe chloroplastu takie jak opisali Von Heijne i wsp., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991); Mazur i wsp., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst i wsp., Gene 65: 59 (1988) i mitochondrialne peptydy tranzytowe, takie jak opisali Boultry i wsp., Nature 328:340-342 (1987). Uważa się chloroplastowe i mitochondrialne peptydy tranzytowe za szczególnie korzystne w obecnym wynalazku jako że aktywność protox występuje typowo w mitochondriach i chloroplastach. Najbardziej korzystne do stosowania są peptydy tranzytowe chloroplastów jako że hamowanie aktywności protox w chloroplastach jest uważane za pierwszorzędną podstawę działania herbicydów hamujących protox (Witkowski i Haling, Plant Physiol 87: 632(1988); Lehnen i wsp., Pestic. Biochem. Physiol. 37:329 (1990); Duke i wsp., Weed Sei. 39:465 (1991)). Także włączone są sekwencje, które powodują lokalizację kodowanego białka do różnych kompartymentów komórkowych takich jak wakuola (Neuhaus i wsp., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:1036210366 (1991) i Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53 (1991)).

Hybrydowe konstrukt(y) DNA mogą zawierać wielokrotne kopie promotora lub wielokrotne kopie genów struktury protox. Dodatkowo, konstrukt(y) mogą zawierać kodujące sekwencje dla markerów i kodujące sekwencje dla innych peptydów takich jak peptydy sygnałowe lub tranzytowe, każdy we właściwej ramce odczytu w stosunku do innych funkcjonalnych elementów w cząsteczce DNA. Przygotowanie takich konstruktów jest w zakresie normalnego poziomu umiejętności w dziedzinie.

Użyteczne markery obejmują peptydy nadające oporność na herbicydy, antybiotyki lub leki, takie jak na przykład oporność na hygromycynę, kanamycynę, G418, gentamycynę, linkomycynę, metotreksat, glifosat, fosfotricynę lub tym podobne. Te markery mogą być użyte do selekcji komórek transformowanych hybrydowymi konstruktami DNA spośród niestransformowanych komórek. Innymi użytecznymi markerami są peptydowe enzymy, które mogą być łatwo wykryte za pomocą widzialnej reakcji, takiej jak na przykład reakcja barwna, na przykład lucyferaza, β-glukuronidaza lub β-galaktozydaza.

Sposób pozytywnej selekcji komórek stransformowanych genetycznie, do których może być włączona pożądana sekwencja nukleotydów dająca komórkom przewagę selekcyjną, jest podany w WO 94/20627.

Ekspresja piastydowa, w której geny są wprowadzane za pomocą homologicznej rekombinacji do wszystkich kilku tysięcy kopii kolistego genomu chloroplastowego obecnego w każdej komórce roślinnej, wykorzystuje ogromną zaletę liczby kopii ponad genami wyrażanymi w jądrze, aby pozwolić na poziomy ekspresji, które mogą przekroczyć 10% całkowitego rozpuszczalnego białka rośliny. Ponadto, ekspresja w plastydach jest pożądana, ponieważ cechy wyrażane w plastydach nie są przenoszone przez pyłek, tak więc potencjalne niebezpieczeństwo mimowolnej ucieczki transgenu do dzikich krewnych roślin transgenicznych jest wy kluczone. Technologia transformacji plastydów jest szczegółowo ujawniona w opisach w US 5 451 513, 5 545 817 i 5 545 818, w zgłoszeniu PCT o numerze publikacji WO 95/16783, oraz w publikacji McBride i wsp., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305 (1994). Podstawowa technika dla transformacji chloroplastów tytoniu została opracowana i udoskonalona w laboratorium Dr Pal Maliga w Rutgers University (Piscattaway, New Jersey). Technika ta obejmuje bombardowanie cząsteczkami tkanki liści z regionami plastydowego DNA otaczającymi selekcj onowalny marker oporności na antybiotyk. Obszary flankujące 1 do 1,5 kb określone jako sekwencje naprowadzające, ułatwiają rekombinację homologiczną z genomem piastydu i w ten sposób pozwalają na zastępowanie lub modyfikację specyficznych obszarów plastomu 156 kb tytoniu. Początkowo stosowano mutacje punktowe w chloroplastowym 16S rRNA i genach rpsl2 nadające oporność na spektynomycynę i/lub streptomycynę jako markery do selekcji do transformacji (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., i Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Staub, J.M. i Maliga, P. (1992) Plant Celi 4:39-45. To dało stabilne homoplazmatyczne tranformanty z częstością około jednego na 100 bombardowań docelo187 094 wych liści. Obecność miejsc klonowania między tymi markerami pozwoliła na stworzenie plastydowego wektora naprowadzającego dla wprowadzania obcych genów (Staub, J.M. i Maliga, P. EMBO J. 12:601-616 (1993)). Znaczny wzrost w częstości transformacji uzyskano przez zastąpienie recesywnych genów rRNA lub białek r oporności na antybiotyki przez dominujący marker selekcyjny, gen bakteryjny aadA, kodujący detoksykujący enzym adenylotransferazę 3'-aminoglikozydową spektynomycyny (Svab Z. i Maliga P. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:913-917). Uprzednio ten marker stosowano z powodzeniem dla transformacji o wysokiej częstości genomu plastydowego zielonego glonu Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4083-4089).

Gen hybrydowy może zawierać roślinny promotor plastydowy funkcjonalnie połączony z izolowaną cząsteczka DNA, która albo koduje naturalny enzym protox albo zmodyfikowany enzym protox, taką jak cząsteczka DNA, która koduje naturalny lub zmodyfikowany enzym protox pszenicy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu lub sorgo. Gen hybrydowy korzystnie dalej zawiera sekwencję 5' nie ulegającą translacji (5' UTR) z promotora plastydowego i sekwencję 3' nie ulegającą translacji (3' UTR) funkcjonalnie powiązaną z wyizolowaną cząsteczką DNA. Korzystnie 3' UTR jest nie ulegającą translacji 3' sekwencją genu plastydowego rps16.

Wektor do tranformacji piastydów zawierający hybrydowy gen, opisany powyżej bezpośrednio, jak i plastyd roślinny stransformowany takim wektorem do transformacji plastydu, charakteryzuje się tym, że wymieniony zmodyfikowany enzym protox jest wyrażany w wymienionym plastydzie. Roślina lub komórka roślinna, wraz z ich potomstwem, zawierająca ten plastyd roślinny, przy czym zmodyfikowany roślinny enzym protox jest wyrażany w roślinie i nadaje roślinie tolerancję na herbicyd w ilościach, które hamują normalnie występującą aktywność protox.

Gdy oporny na herbicyd allel protox jest uzyskany przez ukierunkowaną mutację natywnego genu w roślinie użytkowej lub hodowli komórek roślinnych, z których może być regenerowana roślina użytkowa, może być przeniesione do handlowych odmian przez stosowanie tradycyjnych technik hodowlanych, aby uzyskać roślinę użytkową tolerującą herbicyd bez potrzeby przeprowadzania inżynierii genetycznej na zmodyfikowanej sekwencji kodującej i transformowaniu jej do rośliny, Alternatywnie, gen oporny na herbicyd może być izolowany, poddany inżynierii genetycznej dla optymalizacji ekspresji i następnie wtransformowany do pożądanej odmiany.

Geny kodujące zmienione protox, oporne na inhibitor protox, mogą też być stosowane jako markery selekcyjne w metodach transformacji komórek roślinnych. Przykładowo, rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transformowane transgenem mogą być także transformowane genem kodującym zmieniony protox, zdolnym do ekspresji w roślinie. Tak stransformowane komórki są przenoszone do pożywki zawierającej inhibitor protox, w którym mogą przeżyć tylko rośliny stransformowane. Inhibitory protox, uważane za szczególnie pożyteczne jako czynniki selekcyjne to: difenyloetery (np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorofen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-trifluorobenzen), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyloetoksy)fenylo]-5-(1,1dimetyloetylo)-1,3,4-oksydiazol-2-(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargliloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-tricWorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy] propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) i fenopilan i jego O-fenylopirrolidono- i piperydynokarbaminianowe analogi i dwucykliczne triazolony, jak podano w WO 92/04827; EP 532146).

Sposób może być stosowany do dowolnej komórki roślinnej zdolnej do bycia transformowaną zmienionym genem protox, i może być stosowany z dowolnym interesującym transgenem. Ekspresja transgenu oraz genu protox może być sterowana przez ten sam promotor funkcjonalny w komórkach roślinnych lub przez oddzielne promotory.

Zmodyfikowane oporne na inhibitory enzymy niniejszego wynalazku są oporne na herbicydy, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Herbicydy, które hamują protox obejmują wiele strukturalnych klas cząsteczek (Duke i wsp., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandi22

187 094 halli i wsp., Pesticide Biochem Physiol. 43: 193 (1992); Matringe i wsp., FEBS Lett. 245: 35 (1989), Yanase i Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989) w tym etery difenylows (np. aćyfluorofsn, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy)-2-nitrobsnzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorofsn, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichłoro-5-(1-mstylostoksy)fenylo]-5-(1,1-dimetylostylo)-1,3,4-okśadiazol-2(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142 N-(4-chloro-2-flu^oi^c^-^5-^p^io^f^ar^tllilok^yicr^ylo)-3,4,5,6-^t^etr^ahyd^roftalimid; chloroftalim, N-(chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydrofftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-styl, 2-[1-(2,3,4--trichlorofenylo)-4-nitropIrazclil-5-cksy)propionIan stylu; M&B 39279), pochodne pirydynowe (np. LS 82-556), fenopilan i jego analogi O-fenylopirrolidonows- i piperydynokarbamimanowe.

Difsnyloeterami o szczególnym znaczeniu są związki o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza -COONa (wzór II), -CONHSO2CH3 (wzór III) lub -COOCH2COOC2H5 (wzór IV, Maigrot i wsp., Brighton Crop Protection Conference - Weeds: 47-51 (1989)).

Difenyloeterami są również związki, w których R jest przedstawione wzorem IVa (wzór IVa, Hayasji i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989)).

Difenyloeterem jest zwłaszcza związek o wzorze IVb (wzór IVb; bifenoks, Dest i wsp., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)).

Dalszym interesującym diferyloeterem jest związek o wzorze lvc (wzór IVc, oksyfluorofen, Yih i Swithenbank, J. Agric. Food Chem, 23:592 (1975)).

Jeszcze innym interesującym difenylceterem jest związek o wzorze IVd (wzór IVd, laktofen, str. 623 „The Pesticide Manual” wydanie 10, red. C. Tomlin, British Crop Protection Council, Surrey, (1994)).

Znaczenie ma też klasa herbicydów znanych jako imidy, o wzorze ogólnym V, gdzie Q jest wyrażone wzorami VI lub VII lub VIII lub IX lub IXa lub IXb (Hemper i wsp. (1995) w „Proceedings of the Eigth International Congress of Pesticide Chemistry”, Ragdale i wsp., Amer. Chem. Soc. Washington, D.C. str. 42-48 (1994); i R1 oznacza H, Cl lub F, R2 oznacza Cl, zaś R3 jest ewentualnie podstawionym eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową. Alternatywnie, R2 i R3 razem mogą tworzyć 5 lub 6 członowy pierścień heterocykliczny. Przykładem szczególnie interesujących imidowych herbicydów są związki o wzorze Vlla (wzór VIla; flutiacetometyl, Miyazawa i wsp., Brighton Crop Protection Ccrfererce-Weeds, str. 23-26 (1993)), o wzorze X (wzór X sulfentrazon, Van Saun i wsp., Brighton Crop Protection Ccrference-Weeds, str. 77-82 (1991)), o wzorze XI oraz wzorze XII (Miura i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str. 35-40 (1993)), o wzorze XIII, wzorze XIV, wzorze XV oraz wzorze XVI.

Aktywność chwastobójcza powyższych związków jest opisana w Procsedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzory X i XVI), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Prote^on Council) (wzory XII i XIII), Patent US Nr 4,746,352 (wzór XI) i Abstracts of the Weed Science Society of America, t. 33, str. 9 (1993) (wzór XIV).

Najbardziej korzystnymi herbicydami są te, które są klasyfikowane jako arylouracyle i mają wzór ogólny XVII, w którym R oznacza grupę (C2-5-alkenyloksy-Cl.4-alkylcwą) jak ujawniono w opisie US 5 183 492.

Także znaczące są herbidycy o wzorze ogólnym XVIII przedstawiającym tiadiazimmę (Weller i wsp., Brighton Crop Protection Conferencs-Weeds, str. 29-34 (1993)), o wzorze XIX przedstawiającym karfentrazon (Van Saun i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str. 19-22 (1993)).

N-podstawione pirazole są zilustrowane wzorem ogólnym XX, w którym

R1 jest C1-C4 alkilem, dowolnie podstawionym przez jeden lub więcej atomów halogenu;

R2 jest wodorem lub C1-C4 alkoksy, każdy z nich jest dowolnie podstawiony przez jeden lub więcej atomów halogenu, lub

R1 i R2 razem z grupy -(CH2)n-X-, gdzie X jest związany w R2,

R 3 jest wodorem lub halogenem,

R4 jest wodorem lub C1-C4 alkilem,

R5 jest wodorem, nitro-, cyjano lub grupą -COORć lub CONR7R6 i

187 094

R jest wodorem, C1-C6 alkilem, C2-C6 alkenylem lub C2-C6 alkinylem; (międzynarodowe publikacje patentowe WO 94/08999, WO 93/10100 i US 5 405 829, Schering):

N-fenylopirazole, jak związek o wzorze XXI, nipyraklofen (str. 621 „The Pesticide Manual” wyd. 9, CR Worthing, red. British Ceop Protection Council, Surrey, (1991)) oraz 3-podstawione-2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazole (Lyga i wsp., Pesticide Sci. 4229-36 (1994)) (wzór XXIa, BAY 1134-0).

Znaczenie majątakże fenylopirazole opisane w WO 96/01254 i WO 97/00246 (wzór XXII).

Poziomy herbicydu, które normalnie są hamujące dla aktywności protox, obejmują dawki aplikacji znanych dziedzinie, i które częściowo zależą od czynników zewnętrznych takich jak środowisko, czas i sposób nanoszenia. Na przykład w przypadku herbidyców imidowych reprezentowanych przez wzory V do IX a bardziej szczególnie reprezentowanych przez wzory X do XVII dawki stosowane wahają się od 0,0001 do 10 kg/ha, korzystnie od 0,005 do 2 kg/ha. Tempo dawkowania lub stężenie herbicydu mogą być inne, w zależności od pożądanego działania i szczególnego związku, który był stosowany, i mogą być określone przez sposoby znane w dziedzinie.

Przykłady

Użyte tutaj standardowe techniki klonowania i rekombinacji DNA są dobrze znane i opisane przez T. Maniatis, E.F.Fritsch i J.Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, NY (1989) i przez T.J.Silhavy, M.L.Berman, i L.W.Enauist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1994).

Dział A: Izolacja i charakteryzacja genów roślinnej oksydazy protoporfirynogenu (Protox)

Przykład 1. Izolacja cDNA Protox-1 z pszenicy na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy.

Całkowite RNA wyizolowane z Triticucum aestivum (cv Kanzler) zostało przekazane firmie Clontech do konstrukcji biblioteki cDNA na wektorze Lambda Uni-Zap. Około 50.333 ffu jeednotki i twozzące tysiaki) cDNA z bibiiotek i zorało wysiane z gęstością około 5.000 pfu na 10 cm szalkę Petriego i w;>4^<^^^n^unł kopię na filtrze nitrocelulozowym. Łysinki były hybrydyzowane z sondą cDNA Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR 5; patrz przykład 2 międzynarodowego zgłoszenia patentowego numer PCT/IB95/00452, złożonego 8 czerwca 1995, opublikowanego 21 grudnia 1995 jako WO 95/34659) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaPOą pH 7,0; 1mM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984). włączony tu w całości w formie odniesienia). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidówpBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy cDNA Protox-1 pszenicy uzyskany w czasie pierwszych prób przeszukiwania banku nazwany „Protox-1 pszenicy” miał długość 1489 bp. Protox-1 pszenicy nie posiada sekwencji kodującej dla peptydu liderowego i około 126 aminokwasów dojrzałej sekwencji kodującej opartej na porównaniu z innymi znanymi roślinnymi sekwencjami białek protox.

W celu uzyskania dłuższego cDNA protox z pszenicy nowa biblioteka cDNA Triticum aestivum (cv Kanzler) została wykonana na miejscu przy użyciu wektora lambda Uni-Zap. Około 200.000 pfu biblioteki cDNA przeszukano jak wyżej oprócz tego, że jako sondy użyto cDNA Protox-1 pszenicy, a hybrydyzację i płukania przeprowadzano w temperaturze 65°C a nie 50°C. Najdłuższy cDNA pszenicy uzyskany z tego przeszukiwania, nazwany „Proto.\-1a pszenicy” miał 1811 bp długości. Sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 9 i 10. W oparciu o porównanie z innymi znanymi sekwencjami białek protox u roślin i odpowiednimi sekwencjami genomowymi, to cDNA jest albo pełnej długości albo brakuje mu jedynie kilku kodonów peptydu liderowego (tabela 1). Ta sekwencja białka pszenicy jest w 91% identyczna (podobna w 95%) do sekwencji białka Protox 1 kukurydzy.

Protox-la pszenicy na wektorze pBluescript SK został zdeponowany 19 marca 1996 roku jako pWDC-13 (NRRL #B21545).

187 094

Przykład 2. Izolacja cDNA Protox-1 z soi na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u Arabidopsis.

W firmie Stratagene zakupiono bibliotekę cDNA soi (v Williams 82, epikotyl) na wektorze Lambda Uni-Zap. Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR 1; patrz przykład 1 międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr PCT/IB95/00452, złożonego 8 czerwca 1995, opublikowanego 21 grudnia 1995 jako WO 95/34659) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaPO₄ pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cDNA soi nazwany „Protox-l soi” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Prot<^ox-1 soi ma 1847 bp długości i koduje białko o wielkości 58,8 kDa. Sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio Nr 11 i 12. Białko soi jest w 78% identyczne (w 87% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis.

Protox-l soi na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 15 grudnia 1995r. jako pWDC-12 (NRRL#B-21516).

Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów odpowiednich białek kodowanych przez sekwencje przedstawione jako SEKW. ID NR: 2, 6, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23 zamieszczono poniżej w tabeli 1. Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów odpowiednich białek kodowanych przez sekwencje przedstawione jako SEKW. ID NR 4 i 8 zamieszczono poniżej w tabeli 2.

Tabela 1

Porównanie sekwencji aminokwasowych białka Protox-1 z Arabidopsis („Arabpt-1”; SEKW. ID NR 2), kukurydzy („Mzpt-1”; SEKW. ID NR: 6), pszenicy („Wtpt-1”; SEKW. ID NR: 10), soi („Soybeanpt-1”; SEKW. ID NR: 12), bawełny „Cottonpt-1”, SEKW. ID NR: 16), buraka cukrowego(„Sugpt-1”, SEKW. ID NR: 18), rzepaku („Rapept-1”, SEKW. ID NR: 20), ryżu („Ricept-1”, SEKW. ID NR: 22), sorgo („sorghumpt-1”; SEKW. ID NR: 24)

Porównanie wykonano przy użyciu programu PileUp (pakiet GCG, Uniwersytet Wisconsin, Madison, WI). Pozycje, które mogą podlegać modyfikacji, zgodnie z zamieszczonymi tutaj założeniami, w celu nadania lub zahamowania oporności na inhibitor zaznaczono grubą czcionką.

187 094

Ręppptl..........

Acatpt-1 ..........

Sorghunpt-1..........

Mpp-1 ..........

Wpptl..........

Ricqpt-1..........

Oottorot-1..........

Soyibeaipptl........MV

Suęg^-1 MKSMA3NCI

	MDSJLR?.. MEHLTRPTT	QEPFL3HFSN? <Q3LLPaE3K>	FPRSRPYKPL NLRLNVYKPL
	.........M	ATAT3AASP	LRRWGRPH
......IMTL		SWEPSIfflH	OHPERFRKPF
£SVFEETF?P	NCTLLRKLH	SPTFFTSPr	RraFERaRENP
FPOICMPLR	S3YRGNCM1		RGYYSHKKRR

Rgppt-1 NLRCSVSGGS Aratpt-1 RLRCSVAGGP

Sorghunpt-1..........

Mpp-1..........

Wpt-1 RURPRCATA

Ri.<cę>t-1..........

Ootcnpt-1 KLRCSLAEGP

Soy:xsant-1 ILRCSAEES Suęgfc-IMEMCSKSG

W2EGIB33

TTMSfSKEGj

SA3EPTAAG nsSaoDcr;

TTSPPKER..

SPK?AVEEGS

CTGTIDCADC

03Γ.	TTTTC
........DC
VPL.	. .SAEC
ESS.	. ADC
DSA	. .JVDC
(G3GA3JL0C

VWGSSίSS_J 'VΓWSASIISL

WSGSSSL

WVSSSVΠL

VIWSSSISSŁ

V][VSSSΰ3SL 'VΓVSSSIISL

100

C3AQALVTKH

CIA&LAIKH

CIQALAIRH

CT^JAIRY oacalatkh

CWAATKH

OAOALCIKH

187 094

101

R^ppt-1 EDA. .AKNVM Aratypt-1 PDA. .APNLI

Sacghumt-1..........

Mpt-1 . .G. .WGMl Wtpt-1 . .G. .VSDLL

Ri<cept-1..........

Cottcnpjt-1 RDV. .ASNVI Soytbeanpt-1 . .A. .NANW S^gps-1 SSSSLSENFI

VIEAKDRM33

VIEAKDRV33

VIEARARPGG

VIEARERPGG

VIEARDRV33

VIEARCRW3G

VIFAKEKV33

151

Rąpep^-1 WDSGLKCDL Araktpt-1 WDSCXKL

Sarghurpt-l AVDSGLKDDL Mzpt-1 AVD3GLKDDL Wpt-1 AVDSC3LKDL

Ricept-1..........

Cottonpt-1 AVDSGLKD3L Sqybeanp:-1 WDSGLKDEL Sugfc-1 AVDSGLKDEL

VL3DPBAKF

VLGDETAPRF

WGDPNAPRF

VP33INAPRF

VBDPNAPRF

VLGDENAPRF

VL3DEEAEF

VL3DENAERF

201

Ręppt-1-AGFAIGIRP Arakpt-1 AGFGALGRP

Sctrghunpt-l AGLGALGRP Mpt-1 TALGALGIRP Wpt-1 AGLGALGRP

Rioept-l ..........

Cbttonpt-1 AGF3AL3IRP Scybeaipt-1 AGF3ALGRP SUpt-1 AAŁGAGFRP

SĘĘGREEffVE

REES

PAPREESVE

PPP3EESVE

FPP3raEESVE

PPPGffiE£VE

PPIGHEESVE

SP!iHEESVE

NIIT. .REB2 NIIT. .REEN . .SVERPEE

NTTIVERPEE

NITTVERPDE

NITIVER. .D

NTTMM, .D

NIWE. .AD

VLWł3KLRV

VLWN3KREV

VLWEEKLRV

VLWEGKLREV

VLWEJ3KLREV

YLWEGKLRPT·

VLWNRKLRPV

VLWN3KJBEV

EFVRRNLGDI

EFVRRNJLD3

EFVRRRDL3A3

EFVRRNLGAE

EFVRRNLCRE

EEVRRNLGAE

EFVRRNLGDE

HFVRRNLGDE

GFLWEE3SN3

GFI WeeGeNS

GYLWEEGENS

GYLWEEGENS

GYLWEGPNS

GYLWEEGPNS

GYLWEEGPNS

GYIEEGGPN3

PSKLTDILEFF

PSKLTDLEFF

PSKPADLPFF

PSKEADLPFF

PSKPGDLPFF

PSKPULPFF

PGKLHDLPFF

PSSLTDLPFF

VFEERIEPFC

VFERLIEEFC

VEERL,TEPCG

VFERTLTHPFC

WFET.LIEPFC

VEERIFIE¢EC:

VFERLEKPFC

WERT.IEPFC

150

FSPSDEMLIM

FQPSDEMLIM

EQPSDPVLSM

ECPSDPTLIM

FQPSDPVLTM

FQP3DPIKM

PQPSDEMLIM

FQPSDAVLIM

200

DLMSIGKIR

LMEICGKIR

EUM3IPGKLR

DLM3IPGKLR

SLMSI^^ZKLR

DIMSIAGKLR

ELM3IGGKER

DLMTIPGKIR

250

SGVYA3DEAK

SGTYAGPSK

SGVYA3P^

SGVYADPSK

SGVYAG3PSK

SGVYAG)ESK

SGWYAGDPSK

SGVYAGDPSK

187 094

251	300
R=ępę£-1 LSWAAPGKl	WKLEEN3G3I	IGAFKAIOA	KNKAPKIKD	ERLPKPKGOI
Aratpt-1 I£MKAAF3KV	WKLEONGSI	IGGTKKAOE	RKNAPKAERD	PRLPKP2G2T
Sorghimpt-1 USMAAPEKl	WLEEA3G3I	IGGTKTIQE	RGKNPKPPRD	PRLPKPKGT
Męt-1 I£MKAAF3KV	WRLEET3G3I	IGGTDKITQE	RSKNKPPRD	ARLPKPKQT
Wpt-1 LSMKAAFGK/	WRKKTGET	ICGITKAICD	KGKNPKFRD	ERL·PAPKCOT
Ricqąt-1 RALKAAFeKU	WRLEDGGSI	IGGIIKTięE	RGKNPKPPRD	PRLPTPK3GI
Cbttcnpt-l LSM®AFGRV	WKLEETGGSI	IGGUFKIOE	RNKIPKPPRD	ERLPKPKGT
Soyaeapt-1 LMSKAAGK/	WKLEKNG3SI	IGGTFKAQE	RNGASKPPRD	PRLPKPKGT
Sugpt-1 ISMAAFEKl	wkueckggsi	IGGILKAIQE	RGSNPKPERD	QRLPKPKGQT
301				350
Rępęt -1 U3SHRK3L1M	LPEAIiAKLG	ekukuwkls	SITKLASGEY	SLTYETPEGI
ArrOtpt-1 VGSERKGLKM	LPEAISARLG	SKlKLSWKLS	GTIKLESQ3f	NLTYETEDGL
Sorghunpt -1 VASFRKELAM	LPSAITSSLG	SKUKLSWKLT	SMKSDGKGY	ULEYEIPEGl
Męt-1 WASFRKGIMI	LPNAnSSLG	SKKLSWKIT	SITKSEDKGY	ULEYETPEGl
Wt±-1 VASFRK3CIM	LFNAIASKLG	skuklswkkt	SITKAZNQGY	ULGYEIPEEL
Rz^pt-l lASERKGLTM	LEDATISRLG	skuklswklt	SITKSENKGY	ALVYEIPEGl
GDttanpt-1 HEFRKGLiIM	LPFAIANSLG	snuklswkls	STKLGNGGY	NLTFETPEGM
Scoyx£apt-1 U3SFRK3JIM	LPDMSARLG	NKZKL3WKLS	SISKLASGEY	SLTYETPEGI
Siupt -1 V33EFKGLVM	LPIAIiARLG	SRlKLSWILS	sukslnee	SETYDIFDGL
351				400
Rąppt-1 lUSKAUM	TlPSHlASSL	LRPLSSAAE	alsklyyppv	AAUISYAKE
Aratpt-l SlOSKSUW	TUSHlAGL	LRPLSESAAN	ALSKLYYPPl	AAUISYPKE
Sorghurpt-l ILUSKSUM	TTPSYUA3DI	LRPLSGDAAD	ULSRFYYPPl	AAUISYPKE
Mzpt-1 UU2AKSUM	TIlSYlZASNI	LRPILSAAD	ALSRFYYPFl	AAUISYPKE
Wpt-1 ISloASSUM	TTPSYUASDI	LRELSIDAAD	ALSKFYYPPl	AAlIlSYPKE
Ri.cept-1 USUAKWM	TTPSY1A3DI	LRPLSSDAAD	ALSIEYYPPl	AAUISYPKE
Cot tcnpt -1 ISLGSFSllM	ttpshuasnl	LHPLSAAAAD	ALSCFYYPPl	ASUSYPKE
Scyb^npt-1 USLOCKIllL	tpsyhasil	LRPLSAAAAD	ALSKFYYPPl	AAUISYPKE

187 094

StKpt-1 ν5νΚΊΚ3ΡΜ	TVPtYVAtRL	LRELSDtAAD	SLSKFYYPEV
401
Rąr^r;-1 AIRSBGLIDG	ELKGFGQTHP	RIQKVEΓLGΓ	lYSStLFTNR
Aratpt-1 AtRIEDLIDG	ELNCBCOLH?	RΓQGFGΠTHP	lYSSSTFENR
S^rghL^tt^-1 AIRKEmCG	ETQGBG2LHP	R^QGVEΓLGΓ	IYSSSLFPNR
Mpt-1 AIRKEDLDG	ETGGFGOLHP	RSQGVETLGT	IYSSSLFPNR
Wpt-1 ATRKEDLEG	ELQGFG2THP	RSQGVΈΓLGT	IYSSSLFPNR
Ricptt-1 ATRKEDTTG	EL3GFG2LHP	RtQGVΈLΓGΓ	IYSSSLFPNR
DntnCΏpt -1ATRKEC.TTG	ELKGFGQLHP	RtOdETLCT	IYSSSLFPNR
Scyte-au-pt-l airsect idg	ELKGFG2LHP	RSQGVETLGΓ	IYSSSLFPNR
&upt-1 AIRSEDLTNG	ELQGFG2THP	RSQGVΈΓLGΓ	IYSSSLFP3R

451

Rwr=pt-1 YIGGAnNIGI	L^<SEGELV^	AWRDRKML	HKPSSIDDPLV
Aratpt-1 YIGGSENIGI	LSKSEEELVE	AVDRDτRSML	IKPNtΓDPLS
Storgjhumpt-1 YIGGATNIGI	VSKTESELVE	A^RDTRKML	INPEAVDPLV
Mpt-1 YIGGATNGI	VSKIESELVE	AVDRDTRML	INETAVDPTV
Wjfc-1 YIGGSINIGI	VSKHE£DLVG	AVDRDLRK4L	INPRAVDPLV
RŁc^-1 YIGGSINIGI	VSKTESELVE	AVDR:LRSML	INPRAVDPLV
D^^tcnpt-1 YIGGATNOGI	LSKn'GE VE	AWRDTRKML	INPRAVDPLV
Soybeanpt-1 YIGGATNIGI	L-KTOSEL^	TVDRDLRKIL	HNPNA0DPFV
SUg±-1 YIGGATNPGI	INKSKDELAK	ΓVDSΠLSRMτ	INΈDASLFRV

501

R¾rąrt-- P0FLGHIDL	VDAASAtLtS	AGHEGLFLGG	NYVAGVALGR
Aratpt-1 PQFLIGHFDI	LDTASSSLΓS	SGYEGLLGG	NYVAGVALGR
Sórghunpt-l PQFLVGHLDL	LE/ASALCC	GGYNGLFTGG	NYVAGVATGR
Mpt-1 P2FLVGHLDL	LEAAKAATDR	GGYDGjFTGG	NYVAGVALGR
Wpt-1 PQFLIGHTDR	LAAASSALGQ	GGYNGL1GG	KYtZAG^MGR
RLt3e^tt-1 P2FLGHLDH	TEAASSATGS	GGYDGLFLGG	NYVAGVATGR
Cnttcnpt -1PQFLVGHLDT	LDeAKMATRD	SGFHGLFGG	NYVSGVALGR

AAVSTSYPKE

450

APPGRVLLTN

APPGRVLLLN

APAGRVLLLN

APGRVLLTN

APAGRVTLIN

APAGRVLLLN

APSGRVLLLN

APPGRVTLIN

APPGRILTTfi

500

LGVSLWPΪAI igvrvwpqa:

IGVRVWP2Ai l3vrvwpqa;

LGVRVWPQAI

IGVRVWPQA ]GV/RVWPSAI

VGVRLWPQAI

IGWWWPQAI

550

ΟνΈΕ^ΥΞΈΑΓ

C^JGAYEDAI

DIEGAYESAA

DVEGAYESA3

DVEGAYESAS

DVEGAYESAS

DVEGAYEVAA

187 094

Soyfcearpt-l P2FLU3ŁDL	LDWASIKN IGFBSLFLGG NYVSGVALGR CVB3\YEVAA
Sugpt-1 PQFSIGHFDL	LCAAKAAUID IGTKGLFIGG NYVSGVAU3ł CIB3\YESAA
551	563
Rapept-l QVNDFMSRYA	YK*
Arafcpt-1 EtMSlFMSRYA	YK*
Sorghurrpt-1 QIYDELTKYA	YK*
Mzpt-1 QISDFL!KYA	YK*
Wtpt-1 QVSDELIKYA	YK*
Rioept-l QISDYLIKYA	YK*
Cbttcnpt-1 EVKEFL£QYA	YK*
Scybearpt-1 EVNDFLBsKV	YK*
Sugpt-1 EWDELSQYS	EK*

Tabela 2

Porównanie sekwencji aminokwasowych białek Protex-2 z Arabidopsis i kukurydzy.

Takie same reszty są oznaczone przez pionową linię między dwoma sekwencjami. Porównanie wykonano używając programu GAP opisanego przez Devaraux i wsp., Nucleic Acids Res. 12; 387-395 (1984).

Procent podobieństwa: 75,889 Procent identyczności: 57,905 Protox-2. Pep x Mzprotox-2.Pep

1............................MASGAVAD.HQIEAVSGKRVAV 21 .1 1:1: .: 1..::.111

MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 50

VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71 111111111111:1: -1:1111111. :1.111:1. :.1::1111111

VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 100

MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121

111:1 I . : . I : I I I I I . : I H : I I I . I I I I I : : I . I . : : I . : I I . I : .

101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150

122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK. . . . KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167 llllll.II:-:::1111:11 .l:|||:. -111:-1 :||||.|

151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200

168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217

I I I I : : I I I I : I I I I : I I : I I I : : I . I I : I I I : I : . : I I : I I I I I -1 = 1

201 WDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250

218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267

251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300

187 094

268 VLSLS . . YNSGSRQENWSLSCVSH^'^I^]R(2. . . NPHYDAVIMTAPLCNVK 312

1111. :.11:1. I- :I I I I I I I I I : I I :

301 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350

313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362

II. Ill.l. 1:111.::1:111:::1. I . I : . I I : I I I I I I I I I I I

351 RMKFTKGGAPWLOFLPiKUDYIuPLSUMrrAFlKKmyKKPLEGFGyLIPYK 400

363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411

I 1111 = 111111111111111.l.l .11111:111:1.:11 l.l. I

401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450

412 KQV^S'DL^RLGVE^(^^V'^:VNHrYW^]KAU^l^I^YD^£^£^lD^SVMEAIDKMEND 461

11:11111.:111111:1. l.l II .11111: .1.11:111:111.:

451 KQDVTSDLKKLDGVEGQPΊ^,FVKHVYWGNAFPDYGH:SYSSVDEAIEKMEKN 500

462 DPGFFYAGNHRGGDSVGKSIASGCKAADDVISYDESCSNSKKI^,NDSL* 509

501 LPGFFYAGNSKDGDAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH» ... 545

Przykład 3: Izolacja cDNA Protox-1 z bawełny na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-l u kukurydzy.

Bibliotekę cDNA na wektorze Lambda Uni-Zap utworzona z Gossypium hirsutum L. (72 godz. liścienie hodowane w ciemności) otrzymano od dr Dicka Trelease, Dept. Of Botany, Arizona State University (Ni W. i Trelease R.N., Arch. Biochem. Biophys. 289: 237-243 (1991)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 kukurydzy (SeKw. ID NR:5) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x sSc, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Bio-systems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cDNA bawełny nazwany .,Protox-1 bawełny” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-l bawełny ma 1826 bp długości i koduje białko o wielkości 58,2 kDa. Sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID NR: 13 i 14. Białko bawełny jest w 77% identyczne (w 86% podobne) do białka Protox-l kukurydzy.

Protox-l bawełny na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 1 lipca 1996 r. jako pWDC-15 (NRRL#B-21595).

Przykład 4. Izolacja cDNA Protox-1 z buraka cukrowego na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u Arabidopsis.

Bibliotekę cDNA Beta vulgaris na wektorze Lambda Uni-Zap otrzymano od dr Philipa Rea, Dept. of Botany, Plant Science Institute, Philadelphia, PA (Yongcheol Kim, Eugene J. Kim i Philip A. Rea, Plant Physiol. 106: 375-382 (1994)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaąue Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-l Arabidopsis (Sekw. ID NR: 1) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzyma187 094 ny cDNA buraka cukrowego nazwany „Protox-1 buraka cukrowego” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-1 buraka cukrowego ma 1910 bp długości i koduje białko o wielkości 60 kDa. Sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 15 i 16. Białko buraka cukrowego jest w 73% identyczne (w 82% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis.

Protox-1 buraka cukrowego na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 29 lipca 1996r. jako pWDC-16 (NRRL#B-21595N).

Przykład 5. Izolacja cDNA Protox-1 rzepaku na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u Arabidopsis.

Bibliotekę cDNA Brassica napus (3-4 wk. dojrzałe zielone liście) na wektorze Lambda Uni-Zap II otrzymano od dr Guenthera Ochs, Institut Fuer Allemeine Botanik, Johannes Gutenberg-Universitaet Mainz, Germany (Gunter Ochs, Gerald Schock i Aloysiius Wild, Plant Physiol. 103: 303-304 (1993)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-l Arabidopsis (SEKW. ID NR: 1) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cDNA rzepaku nazwany „Protox-1 rzepaku” jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-1 rzepaku ma 1784 bp długości i koduje białko o wielkości 57,3 kDa. Sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 17 i 18. Białko rzepaku jest w 87% identyczne (w 92% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis.

Protox-1 rzepaku na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 23 sierpnia 1996 r. jako pWDC-17 (NRRL#B-21615).

Przykład 6. Izolacja cDNA Protox-l ryżu na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy.

Bibliotekę cDNA Oryza sativa (5 dni etiolowane pędy) na wektorze Lambda gtl 1 zakupiono w firmie Clontech. Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gąstości około 5.000 pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR:5) znakowaną 32PdCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i DNA lambda zostało obrobione przy użyciu Wizard Lambda-Prep kit (Promega). Wstawka cDNA została zsubklonowana na wektorze pBlu-escript przy użyciu standardowych technik. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). w najdłuższym otrzymanym cDNA ryżu nazwanym „Protox-1 ryżu” brakuje peptydu i około 172 aminokwasów dojrzałej sekwencji kodującej na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1). Niepełna sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 19 i 20.

Protox-1 ryżu na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 6 grudnia 1996 r. jako pWDC-18 (NRRL#B-21648).

Przykład 7. Izolacja cDNA Protox-l sorgo na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy.

Bibliotekę cDNA Sorghum bicolor (3-6 dni zielone sadzonki) na wektorze Lambda UniZap II otrzymano od dr Klaus Pfizenmaier Institute of Cell Biology and Immunology, University of Stuttgart, Germany (Harald Wajant, Karl-Wolfgang Mundry i Klaus Pfizenmaiet, Plant Mol. Biol. 26: 735-746 (1994)). Około 50.000 pfu biblioteki wysiano w gęstości około 5.000 pfu

187 094 na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cDNA Protox-l kukurydzy (SEKW. ID NR:5) znakowaną 32p.-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 pH 7,0; ImM EDTA; temperatura 50°C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50°C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pBluescript. Sekwencje wstawek cDNA zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). w najdłuższym otrzymanym cDNA sorgo nazwanym „Protox-l sorgo” brakuje peptydu liderowego i około 44 aminokwasów pełnej sekwencji kodującej na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1). Niepełna sekwencja nukleotydowa tego cDNA i sekwencja aminokwasowa przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio NR 21 i 22.

Protox-l sorgo na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 6 grudnia 1996 r. jako pWDC-19 (NRRL#B-21649).

Przykład 8. Wykazanie wrażliwości klonów protox z roślin na herbicydy hamujące białka protox w układzie bakteryjnym.

Płynne hodowle Protox-1/SASX3 8, Protox-2/SASX38 i pBlu-escript/XL-1Blue prowa·

100 dzono w pożywce L amp¹⁰⁰ Sto mikrolitrów każdej hodowli wysiewano na podłoża L amp zawierające różne stężenia (l,0nM-10mM) aryluracylowego herbicydu formuły XVII hamującego protox. Podwójne zestawy szalek inkubowano przez 18 godzin w 37°C.

Szczep E. coli XL1-Blue protox+ nie wykazał wrażliwości na herbicyd w żadnym stężeniu zgodnie ze znaną naturalną opornością enzymów własnych bakterii na podobne herbicydy. Protox-l/SASX38 był wyraźnie wrażliwy z murawą bakterii prawie całkowicie usuniętą przy stężeniu inhibitora wynoszącym jedynie 10nM. Protox-2/SASX38 był również wrażliwy ale tylko w wyższych stężeniach herbicydu (10pM). Herbicyd działał nawet wtedy gdy szalki trzymano w prawie całkowitej ciemności. Efekt toksyczny herbicydu można było prawie całkowicie wyeliminować przez dodanie hematyny do pożywki w stężeniu 20pg/ml.

Różnice w tolerancji na herbicyd między dwoma szczepami zawierającymi roślinne białko protox są raczej wynikiem różnej ekspresji z tych dwóch plazmidów niż jakiejś właściwej różnicy we wrażliwości enzymów.

Protox-1 /SASX38 rośnie znacznie wolniej niż Protox-2/SASX38 na wszystkich pożywkach nie zawierających hemu. Poza tym, szczep MzProtox-2/SASX38, którego szybkość wzrostu jest bardzo podobna do szczepu ArabProtox-1/SASX38 jest także bardzo wrażliwy na herbicyd w niższych (10-100nM) stężeniach.

Dział B: Identyfikacja i charakteryzacja roślinnych genów protox wrażliwych na herbicydy hamujące protox.

Przykład 9. Selekcja genów protox wrażliwych na herbicydy hamujące protox w systemie ekspresyjnym E. Coli.

Biblioteka cDNA Arabidopsis taliana (Landsberg) na wektorze plazmidowym pFL61 (Minetⁱ wsp., Plant J. 2: 417-422 (19992) została namnoż ona. Mutant E. coli hemG SASX38 (Sasarman i wsp., J. Gen. Microbiol. 113: 2*97 (1979)) by^ż hodowany na pożywce zawierającej hensatynę (United States Bmchemicals) w stężeniu 20 fgńnl. Bib Hoteką stransformrawano SASX38 techniką elektrcpcracji używając Bio-Rad Gene Pulser w warunkach zalecanych przez producenta. Stransfcemoware komórk i o gęstoś ci około 500.000 10 cm szalkę wysiano na pożywkę L zawi erającą ampicylinę w s^żenki ⁰⁰⁰ ągybsd. iKomOTki inkuIwwo w 37°C przez 40 godzin przy ograniczonym dostępie światła i następni padano _sel_ekcji n_{a z}dol_ność wzrostu bez uzupełnienia pożywki hemem. Prototrofy heimowe p^y _uzy _ski_wan_{e z} biblioteki pFL61 z częstością 400409 AMliz a snkwencji 21 komplementujący^ klonów wykazała, że 9 z ni ch należy do typu „Protox-1” a wiec genów prc^, o/yrikiem ekspresji których są enzymy eroiox chloroplastów.

Biblioteka pFLS1 jest Wbli oteką ekspcec^pjną wdrożdżach z cDNA Arabidopsis wstawionym w obu kierunkach. Te cDNA mogą również być eksprym owane w bakterioch. CDNA proKw _zaczyna _się kodo^m ATG w ramce na końcu 3' drożdżowej sekwencji PGK około 10 amiroawat0w od κiejt/a cięcia dla enzymu Not! (miejscs wklonowania wstawki) na wekto187 094 rze i może ulegać ekspresji spod promotora LacZ znajdującego się 300 bp przed ramką odczytu, lub też z nieustalonego kryptycznego promotora bakteryjnego. Ponieważ cDNA Protox-1 zawierające sekwencje kierujące do chloroplastów hamowały wzrost szczepu E. coli SASX38, do eksperymentów z mutagenezą i selekcją szczepów opornych na herbicydy wybrano klon z najkrótszą chloroplastową sekwencją liderową. Klon ten, pSLV19, zawiera tylko 17 aminokwasów domniemanego chloroplastowego peptydu liderowego z sekwencją DNA zaczynającą się od nukleotydu 151 cDNA Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR: 1)

Plazmidem pSLV19 transformowano szczep podlegający losowej mutagenezie XL1Red (Stratagene, La Jolla, CA). Transformanty wysiewano na podłoże L zawierające ampicylinę w stężeniu 50 iig/ml i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Murawę transformantów zdrapano z szalki i wyizolowano plazmidowe DNA przy użyciu Wizard Megaprep kit (Promega, Madison, WI). Plazmidowe DNA wyizolowane ze szczepu mutatorowego powinno zawierać około jednej przypadkowej zmiany zasady na 2000 nukleotydów (patrz Greenner i wsp., Strategies 7(2): 32-34 (1994))

Zmutowanym plazmidowym DNA stransformowano mutanta hemG SASX38 (Sasarman i wsp., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) i wysiano na pożywkę L zawierającą różne stężenia herbicydu hamującego protox. Szalki były inkubowane przez 2 dni w temperaturze 37°C. DNA plazmidowy został wyizolowany ze wszystkich kolonii, które rosły w obecności takiego stężenia herbicydu, które zabijało szczep dziki. Wyizolowane DNA był następnie użyty do transformacji szczepu SASX38 i ponownie wysiany na pożywkę z herbicydem w celu upewnienia się, że zaobserwowana oporność jest zależna od plazmidu. Sekwencja kodująca protox z plazmidów, która przeszła selekcję była wycinana enzymem Notl, wklonowana w niezmutowany wektor i ponownie testowana na zdolność do nadania szczepowi tolerancji na herbicyd. Sekwencję cDNA protox, która miała zdolność nadawania szczepowi oporności na herbicyd została następnie ustalona. Poprzez porównanie z dziką sekwencją Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR:1) ustalono miejsca mutacji.

Z pierwszego eksperymentu z mutagenezą otrzymano pojedynczego mutanta posiadającego mutację w sekwencji kodującej. Ten mutant powoduje wzmocnioną „oporność” na herbicyd tylko poprzez podwyższenie tempa wzrostu. Zawiera mutację C w a w nukleotydzie 197 (SEKW. ID NR:1) w skróconej chloroplastowej sekwencji liderowej w plazmidzie pSLV19, zmieniając kodon ACG dla treoniny w kodon AAG dla lizyny w pozycji 56 białka (SEKW. ID NR:2) i powoduje lepszą komplementację mutanta bakteryjnego. Plazmid zawiera także mutację milczącą w sekwencji kodującej w nukleotydzie 1059 powodującą zmianę kodonu AGT (Ser) w AGC (Ser). Plazmid ten został nazwany pMut-1.

Plazmid pMut-1 użyto następnie do transformacji szczepu mutatorowego XL1-Red jak opisano powyżej i zmutowane DNA było izolowane i wysiewane na pożywki zawierające stężenia letalne dla niezmutowanego genu protox pMut-1. Kolonie oporne na herbicyd były izolowane po dwóch dniach w 37°C i analizowane jak opisano powyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna pokazała, że geny oporne tworzą dwie klasy. Jedna mutacja powodująca oporność została zidentyfikowana jako zmiana C wT w nukleotydzie 689 sekwencji Ptotox-1 Arabidopsis zamieszczonej poniżej jako SEKW. ID NR:1. Mutacja ta zmienia kodon GCT dla alaniny aminokwasie 220 sekwencji SEKW. ID NR:2 w kodon GTT dla waliny i została nazwana pAraC-1 Val.

Mutant drugiej klasy zawiera zmianę a wG w nukleotydzie 1307 sekwencji Protox-1 Arabidopsis, powoduje to zmianę kodonu TAC dla tyrozyny w aminokwasie 426 w kodon TGC dla cysteiny i została nazwana pAraC-2Cys.

Trzeci mutant zawiera zmianę G w a w nukleotydzie 691 sekwencji Protox-l Arabidopsis, powoduje to zmianę kodonu GGT dla glicyny w aminokwasie 221 w kodon AGT dla seryny. Plazmid został nazwany pAraC-3Ser.

Oporny mutant pAraC-2Cys w plazmidzie pMut-1 został zdeponowany 14 listopada 1994 pod nazwą pWDC-7 w Agricultural Research Culture Collection i nadano mu numer depozytu NRRL#21339N.

Przykład 10. Dodatkowe herbicydoopome podstawienia kodonów w pozycjach zidentyfikowanych w czasie losowego przeszukiwania.

187 094

Aminokwasy zidentyfikowane jako miejsca oporności przy losowym przeszukiwaniu są podstawiane przez inne aminokwasy i testowane na funkcję i tolerancję na herbicyd w układzie bakteryjnym. Mutageneza sterowana przez oligonukleotydy sekwencji Protox-1 Arabidopsis jest przeprowadzana przy użyciu Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA). Po potwierdzeniu zmian aminokwasów przez analizę sekwencyjną, zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i wysiewane na pożywkę L amp¹⁽ⁱ⁽⁾ w celu sprawdzenia funkcji i na różne stężenia herbicydu hamującego protox w celu sprawdzenia tolerancji.

Ta procedura jest stosowana dla kodonu alaninowego tworzonego przez nukleotydy 688-690 i kodonu tyrozynowego tworzonego przez nukleotydy 1306-1308 sekwencji Protox-l Arabidopsis (SEKW. ID NR:1). Rezultaty pokazują, że kodon alaninowy (nukleotydy 688-690) może zostać zamieniony na kodon dla waliny, treoniny, leucyny, cysteiny lub izoleucyny by spowodować, że herbicydoopomy enzym protox pozostał przy swej funkcji. Później, rezultaty pokazują, że kodon tyrozynowy (nukleotydy 1306-1308) może być zmieniony na kodon dla cysteiny, izoleucyny, leucyny treoniny, metioniny, waliny lub alaniny, by spowodować, że herbicydoopomy enzym protox pozostał przy swej funkcji.

Przykład 11. Izolacja dodatkowych mutacji, które zwiększają funkcję enzymatyczną i/lub tolerancję na herbicyd . pierwotnie zidentyfikowanych mutantów opornych

Plazmidy zawierające oporny na herbicyd gen protox są transformowane do szczepu mutatorowego XL1-Red i zmutowany DNA jest izolowany jak opisano wyżej. Zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i transformanty są przeszukiwane na stężeniach herbicydu wystarczających by zahamować wzrost oryginalnego „opornego” mutanta. Kolonie wykazujące tolerancję są izolowane i fenotyp silnej tolerancji jest weryfikowany jakby był zależny od sekwencji jak opisano wyżej. Ustala się sekwencję tych mutantów i identyfikuje mutacje przez porównanie z sekwencją wyjściową.

Ta procedura miała zastosowanie przy opisanym wyżej mutancie pAraC-lVal. Wyniki pokazują, że kodon serynowy aminokwasu 305 (SEKW. ID NR:2) może być zamieniony na kodon dla leucyny by uzyskać enzym z wyższą niż pojedynczy mutant pAraC-lVal tolerancją na herbicydy hamujące protox. To drugie miejsce jest nazwane AraC305Leu. Te same wyniki pokazują dla kodonu treoninowego w aminokwasie 249 zmianę na izoleucynę lub alaninę prowadzącą do enzymu ze zwiększoną tolerancją. Te zmiany są nazwane odpowiednio AraC24911e i AraC249Ala.

Ta procedura miała także zastosowanie przy opisanym wyżej mutancie pAraC-2Cys. Wyniki pokazują, że kodon prolinowy aminokwasu 118 (SEKW. ID NR:2) może być zamieniony na kodon dla leucyny by uzyskać enzym z wyższą, niż pojedynczy mutant pAraC-2Cys tolerancją na herbicydy hamujące protox. To drugie miejsce jest nazwane AraC118Leu. Te same wyniki pokazują dla kodonu serynowego w aminokwasie zmianę na leucynę prowadzącą do enzymu pAraC-2Cys ze zwiększoną tolerancją. Ta zmiana została także wyizolowana z mutantem pAraC-1 Val jak opisano powyżej i została nazwana AraC305Leu. Dodatkowe mutacje zwiększające oporność na herbicyd mutanta pAraC-2Cys zawierały zmianę asparaginy aminokwasie serynę w aminokwasie 425, nazwaną AraC425Ser i tyrozyny w cysteinę cysternę aminokwasie 498 nazwaną AraC498Cys.

Te zmiany są określane jako mutacje „drugiej pozycji” ponieważ nie są one wystarczające do nadania tolerancji na herbicyd, ale raczej wzmacniają funkcję i/lub tolerancję na herbicyd już zmutowanego enzymu. To nie przekreśla możliwości, że inne podstawienia aminokwasów w tych pozycjach mogłyby wystarczyć do wyprodukowania enzymu posiadającego tolerancję na herbicyd dopóki wszystkie możliwe podstawienia nie zostaną gruntownie przetestowane.

Przykład 12. Łączenie zidentyfikowanych mutacji oporności ze zidentyfikowanymi mutacjami drugiej pozycji w celu stworzenia wysoce funkcjonalnych/wysoce tolerancyjnych enzymów protox

Opisana wyżej mutacja AraC305Leu wzmacnia funkcję/oporność na herbicyd zarówno zmutowanego plazmidu AraC-lVal jak i AraC-2Cys. W drodze do przetestowania użyteczności tej mutacji drugiej pozycji, została ona połączona z mutacjami AraC-2Leu, AraC-2Val, i AraC-2Ile

187 094 i testowana na tolerancję na herbicyd. W każdym z przypadków zmiana AraC30SLeu znacząco zwiększyła tempo wzrostu opornego mutanta protox na herbicyd hamujący protox. Połączenia mutanta opornego AraC-2Ile zarówno z mutantem drugiej pozycji AraC249fie jak i AraCl 18Leu także doprowadziło do powstania zmutowanych enzymów protox o wyższej tolerancji. Mutacja AraC249Ile pokazuje, że mutacje drugiego miejsca zidentyfikowane jako wzmacniające mutanty AraC-1 mogą także zwiększać oporność mutantów AraC-2. Wykazano, że plazmid z trzema mutacjami zawierającymi AraC-2Ile, AraC305Leu i AraC249Ile produkuje wysoce funkcjonalny, wysoce tolerancyjny na herbicyd enzym protox-l.

Przykład 13. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l kukurydzy, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Opisany powyżej plazmid pMut-1 Arabidopsis Protox-l jest bardzo wydajny w eksperymentach z mutagenezą i przeszukiwaniem, w których daje wysoką częstość prawdziwych mutantów sekwencji kodującej, w opozycji do częstych mutantów zwiększających siłę promotora, które są izolowane przy użyciu innych plazmidów, w celu stworzenia wydajnego systemu przeszukiwania opartego o plazmid dla Protox-l kukurydzy, cDNA kukurydzy został włączony do wektora pMut-1 w możliwie takim samym kontekście sekwencyjnym jak cDNA Arabidopsis. Używając standardowych metod łączenia zachodzących na siebie produktów PCR, koniec 5' klonu pMut-1 Arabidopsis (zawierający 17 aminokwasów chloroplastowego peptydu liderowego z mutacją typu „zmiany sensu” opisaną powyżej) został połączony do cDNA Protox-l kukurydzy zaczynającego się od aminokwasu numer 14 (SEKW. ID NR:6) sekwencji kukurydzy. Koniec 3' cDnA kukurydzy nie był zmieniony. Miejsca cięcia dla enzymu Notl zostały umieszczone na obu końcach utworzonej fuzji, i gen hybrydowy został wklonowany do plazmidu pFL61 będącego protoplastą pMut-1. Analiza sekwencyjna wykazała jedno nukleotydową milczącą mutację wprowadzoną przez PCR, która zmienia kodon ACG (nukleotydy 745-747) (SEKW. ID NR:5) w kodon aCt, oba kodujące treoninę. Ten hybrydowy plazmid Protox-l Arab-kukurydza został nazwany pMut-3.

Plazmid pMut-3 użyto do transformacji szczepu mutatorowego XL1-Red jak opisano powyżej i zmutowane DNA było izolowane i wysiewane na pożywki zawierające stężenia łetalne dla niezmutowanego genu protox pMut-1. Kolonie oporne na herbicyd były izolowane po dwóch dniach w 37°C i analizowane jak opisano powyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 5 pojedynczych zmian zasad, które prowadzą do enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Trzy z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsis powodowały tolerancję. Dwie z trzech to pMzC-lVal i pMzC-IThr, zmieniające alaninę (GCT) w aminokwasie 164 (SEKW. ID NR:6) w walinę (GAT) lub treoninę (ACT). Ta pozycja odpowiada opisanym wyżej mutacjom pAraC-1. Trzecia analogiczna zmiana wymienia glicynę (GGT) w pozycji 165 w serynę (AGT) co odpowiada opisanej wyżej mutacji AraC-3Ser. Te wyniki służą potwierdzeniu oczekiwania, że mutacje herbicydoopome zidentyfikowane w jednym roślinnym genie protox mogą również nadawać oporność na herbicyd odpowiadającym roślinnym genom protox z innych gatunków.

Dwie z mutacji wyizolowanych z przeszukiwania Protox-l kukurydzy doprowadziły do zmian aminokwasów w zasadach wcześniej niezidentyfikowanych jako miejsca oporności. Jedna zmiana powoduje wymianę cysteiny (TGC) w fenyloalaninę (TTC) w aminokwasie 159 sekwencji Protox-l kukurydzy (SEKW. ID NR:6). Druga zamienia izoleucynę (ATA) na treoninę (ACA) w aminokwasie 419.

Dodatkowe podstawienia aminokwasów zostały zrobione i przetestowane dla trzech miejsc mutacji u kukurydzy. Wykazano tolerancję kiedy glicyna 165 była zamieniona na leucynę lub kiedy cysteina 159 była zamieniona na leucynę lub lizynę. Enzymy wykazujące tolerancję zostały także stworzone przez zamianą izoleucyny 419 whistydynę, glicynę lub asparaginę.

Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-l Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-l kukurydzy przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana alaniny (GCT) w aminokwasie 164 (SEKW. ID NR:6) w leucynę (CTT) prowadziła do utworzenia

187 094 enzymu wykazującego silną tolerancję. Nie wyizolowano dla kukurydzy mutacji analogicznej do mutacji AraC-2 u Arabidopsis. Jednakże, zmiana tego miejsca, tyrozyny 370 w enzymie kukurydzy (SEKW. ID NR:6) w izoleucynę lub metioninę prowadziła do powstania enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd.

Przykład 14. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l pszenicy, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l pszenicy, cDNA pszenicy zostało wprowadzone do wektora pMut-1 jak to opisano powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-pszenica został nazwany pMut-4. DNA pMut-4 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 7 pojedynczych zmian zasad, które samodzielnie powodują utworzenie enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Cztery z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsis/kkrydzy powodowały tolerancję. Dwie zmieniają alaninę (GCT) w aminokwasie 211 (SEKW. ID ŃR: 10) w walinę (GAT) lub treoninę (ACT). Ta pozycja odpowiada opisanym wyżej mutacjom pAraC-1. Trzecia analogiczna mutacja zmienia glicynę (GGT) w aminokwasie 212 wserynę (AGT) odpowiadając opisanej powyżej mutacji AraC-3Ser. Czwarta zmienia izoleucynę (ATA) na treoninę (AcA) w aminokwasie 466 odpowiadając mutantowi Mz419Thr.

Trzy z wyizolowanych mutacji z przeszukiwania Protox-l pszenicy doprowadziło do znalezienia zmian aminokwasów wcześniej nie zidentyfikowanych. Jedna mutacja zmienia walinę (GTT) w leucynę (CTT) w aminokwasie 356 sekwencji Protox-l pszenicy (SEKW. ID NR: 10). Druga zmienia serynę (TCT) w prolinę aminokwasie aminokwasie 421. Trzecia zmienia walinę (GTT) w alaninę (GCT) w aminokwasie 502.

Przykład 15. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l soi, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l pszenicy, cDNA soi zostało wprowadzone do wektora pMut-1 jak to opisano powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-soja został nazwany pMut-5. DNA pMut-5 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 4 pojedyncze zmiany zasad, które samodzielnie powodują utworzenie enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Dwa z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsis/pszenicy powodowały tolerancję. Jedna zmienia alaninę (GCA) w aminokwasie 226 (SEKW. ID NR: 12) treoninę (ACA). Ta pozycja odpowiada opisanej wyżej mutacji pAraC-IThr. Druga analogiczna mutacja zmienia walinę (GTT) w aminokwasie 517 w alaninę (GCT) odpowiadając opisanej powyżej mutacji Wht502Val u pszenicy.

Dwie z wyizolowanych w czasie przeszukiwania Protox-l pszenicy mutacji powodowały wcześniej nie zidentyfikowane zmiany aminokwasów. Jedna mutacja zmienia prolinę (CCT) w serynę (TCT) w aminokwasie 369 sekwencji Protox-l soi (SEKW. ID NR: 12). Druga zmienia tę samą prolinę 369 w histydynę (CAT).

Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-l Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-l soi przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana alaniny (gCt) w aminokwasie 226 (SEKW. ID NR: 12) w leucynę prowadziła do utworzenia enzymu wykazującego silną tolerancję. Zmiana tyrozyny (TAC) w aminokwasie 432 (SEKW. ID NR: 12) w leucynę lub izoleucynę prowadziła do powstania enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd.

Przykład 16. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l buraka cukrowego, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l buraka cukrowego, cDNA buraka cukrowego zostało wprowadzone do wektora pMlut-1 jak to opisano

187 094 powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-burak cukrowy został nazwany pMut-6. DNA pMut-6 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała pojedynczą zmianę zasady, która powoduje powstanie enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Ta mutacja zmienia tyrozynę (TAC) w aminokwasie 449 w cysteinę (TGC) i odpowiada opisanej wyżej mutacji AraC-2 u Arabidopsis.

Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-1 Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-l soi przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana tyrozyny (TAC) w aminokwasie 449 w leucynę, izoleucynę, walinę lub metioninę prowadziła do utworzenie enzymu buraka cukrowego wykazującego silną tolerancję na herbicyd.

Przykład 17. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l bawełny, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd.

Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l bawełny, cDNA bawełny zostało wprowadzone do wektora pMut-1 jak to opisano powyżej dla cDNA kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid został nazwany pMut-7. DNA pMut-7 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 3 pojedyncze zmiany zasad, które samodzielnie powodują powstanie enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Dwa mutanty zmieniają tyrozynę (TAC) w aminokwasie 428 (SEKW. ID NR: 16) odpowiednio w cysteinę (TGC) i argininę (CGC). Arginina jest nowym podstawieniem dającym tolerancję na herbicyd w tej wcześniej zidentyfikowanej pozycji AraC-2. Trzecia mutacja zmienia prolinę (CCC) w serynę (TCC) w aminokwasie 365. Ta zmiana odpowiada mutantowi Soy369Ser soi.

Przykład 18. Wykazanie krzyżowej tolerancji mutacji oporności na różne czynniki hamujące protox

Zmutowane oporne plazmidy oryginalnie zidentyfikowane w oparciu o oporność na jeden herbicyd hamujący protox były testowane wieloma innymi czynnikami hamującymi protox. Do tego testu szczep SASX38 zawierający dziki plazmid jest wysiewany na szeregu rozcieńczeń każdego czynnika aby ustalić letalne stężenie dla każdego z nich. Zmutowane plazmidy oporne w SASX38 są wysiewane i zliczane na zdolność przetrwania na stężeniu każdego czynnika przynajmniej 10 razy większym niż stężenie, które jest śmiertelne dla szczepu SASX38 zawierającego dziki plazmid.

Wyniki bakteryjnego testu krzyżowego, pokazane w tabelach 3A i 3B poniżej, wskazują, ze każda ze zidentyfikowanych mutacji niesie tolerancję na wiele czynników hamujących protox.

Tabela 3A

Tolerancja krzyżowa roślinnych mutantów protox na różne inhibitory proton

Wzór	AraC-1	AraC-2 Cys	AraC-1 Thr	AraC-3Thr	MzC-1 Val
XVII	+	+	+	+	+
VIIa	+	+	+	-	+
IV	++	-	++	++	-
XV	+	+	+	+	+
XI	-	+	+	++	+
XVI	-	-	-	-	+
XII	+	-	++	++	++
XIV	+	-	+	+	+

*X + = tolerancja 10x wyższa niż szczepu dzikiego ++ = tolerancja 10x wyższa niz szczepu dzikiego

- = brak tolerancji krzyżowej * = ten czynnik był testowany lecz nie uzyskano żadnych informacji

187 094

Tabela 3B

Tolerancja krzyżowa roślinnych mutantów eroiżx na różne inhibitory proton

	AraC- lLeu	AraC-2Ilh	AraC- lLhu+ AraC- 3Mhi	AraC- lLeu+ AraC- 2Uh5	AraC- 2Ilh+ AraC3- 05Leu	AraC- 3Cyt+Ara C42 5 Ser	AraC- 3Ueu+ AraC42 5 Ser	AraC- 3Wei+ AraC42 5 Ser
XVII	+	+	+	+	+	+	+	+
Vila	++	++	++	++	++	++	++	++
IV	++	-	+	++	+	-	+	+
XV	++	+++	+++	+++	+++	++	+++	++
XI	++	++	++	++	++	++	++	++
XVI	+++	+++	+++	+++	+++	+	++	++
XII
XIV	4=	++	++	++	++	-	++	++

Dział C: Ekspresja herbicydoopżκycS genów prżiżx w roślinach iransgenicznych

Przykład 19. Tworzenie roślin opornych na herbicydy Saκujące prżiżx metodą rekombinacji SoκologiczreC lub konwersji genów.

Ponieważ żpisare mutanty sekwencji kodującej wydajnie nadają tolerancje na herbicyd gdy ulegają ekspresji spod naturalnego prżKżtżra protżx, ukierunkowane zmiany sekwencji kodującej eroiox w jej naturalnej lokalizacji cSrżKżsomżwej stanowią alternatywę dla stworzenia opornych na herbicyd roślin i komórek roślinnych. Fragment DNA prżtox zawierający żądane kuI-cCs, lecz nie posiadający własnych sygnałów ekspresji (eroκżtżra lub regionu 3' nie podlegającego translacji) może zostać wprowadzony jedną z kilku dobrze znanych metod (na przykład trarsfżrκacja Agrżbacihriuκ, bezpośredni transfer genów do protoplastów, bombardowanie mikropżcisaami) i można selekcjonować irantforκanty wykazujące tolerancje na herbicyd. Wprowadzane fragmenty DNA zawierają także diagnostyczne miejsce restrykcyjne lub inny polimorfizm sekwencyjny, który jest wprowadzany przez ukierunkowaną mutagenezę in vitro bez zmieniania kodowanej sekwencji ammokwasowej (na przykład mutacja milcząca), z wcześniejszych dżrihtihń dla wielu markerów selekcyjnych i genów oporności na herbicydy (patrz na przykład Paszkowski iwsp., EMBO J. 7: 4021-4026 (1988); Lee i wsp., Plant Celi 2: 415-425 (1990); Risseeuw iwsp., Plant J. 7: 1109-119 (1995)) wynika, żh niektóre znalezione trarsforκariy są wynikiem integracji homologicznej zmutowanego DNA w locus cSromżsomalre protox, lub konwersji naturalnej sekwencji cSromżsoκalnej prżtox we wprowadzaną sekwencję mutanta.. Te irarsfżrmanty są rozpoznawane dzięki kombinacji fenotypu tolerancji na herbicyd i obecności diagnostycznego miejsca restrykcyjnego w ich cSroκżSżmalnym locus protox.

Przykład 20. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin

Liczne wektory do transformacji są osiągalne do transformacji roślin i geny mogą być używane w połączeniu z każdym z takich wektorów. Selekcja używanego wektora będzie zależała od preferowanej techniki transformacji i gatunku biorcy. Dla różnych biorców mają zastosowanie różne antybiotykowe lub herbicydowe markery selekcyjne. Markery selekcyjne rutynowo stosowane w transformacji to: gen nptll, który nadaje odporność na kanaκycyrę i podobne antybiotyki (.Mhssing i Vierra, Gene 19: 259-268 (1982)), gen bar nadający oporność na herbicyd fżsfmoIrycyrę (Whith i wsp., Nuci Acids Res 18: 10Ć2 (1990), Spencer i wsp., Theor Appl Genet 79: 625-631 (1990), gen hph nadający oporność na antybiotyk Sygrżmycynę

187 094 i Diggelmann, Mol Celi Biol 4:2929-2931 (1983)) i gen dhfr, który niesie oporność na metotreksat (Bourouis i wsp., EMBO J. 2(7): 10991104 (1983)).

I. Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji Agrobacterium

Istnieje wiele wektorów odpowiednich do transformacji przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Mają one przeważnie przynajmniej jedną sekwencję graniczną T-DNA i zawierają wektory takie jak pBIN19 (Bevan, Nuci. Acids Res. (1984)) i pXYZ. Konstrukcja dwóch typowych wektorów jest opisana poniżej.

Konstrukcja pCIB200 ipCIB2001: Wektory bifunkcjonalne pCIB200 ipCIB2001 są używane do konstrukcji zrekombinowanych wektorów do użytku z Agrobacterium i zostały skonstruowane w następujący sposób. pTJS75kan został stworzony przez strawienie enzymem Narl pTJS75 (Schmidhauser i Helinskl, J Bacteriol 164:446-455 (1985)) co pozwoliło na wycięcie genu oporności na tetracyklinę, następnie wstawiono fragment AccI z pUC4K niosący NPTII (Messing iVierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan i wsp., Nature 304: 184-187 (1983); McBride i wsp., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Doligowano adaptory Xhol do fragmentu EcoRV pCIB7, który zawierał lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, roślinny hybrydowy gen selekcyjny nos/nptll i polilinker pUC (Rothstein i wsp., Gene 53: 153-161 (1987)) i fragment strawiony enzymem Xhol został wklonowany w strawiony enzymem Sa/7 pTJS75kan by utworzyć pCIB200 (patrz także EP 0332 104, przykład 19). pCIB200 zawiera następujące pojedyncze miejsca trawienia w polilinkerze: EcoRI, Sstl, KpnI, Bgll, Xbal i Sali. pCIB2001 pochodzi od pCIB200 i stworzony został przez wstawienie do polilinkera dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Pojedynczymi miejscami trawienia w polilinkerze pCIB2001 są EcoRI, Sstl, KpnI, Bgll, XbalSali, Mlul, Bell, Avrll, Apal, Hpal, i Stul. Oprócz posiadania dodatkowych pojedynczych miejsc trawienia pCIB2001 posiada bakteryjną i roślinną selekcję na kanamycynę, prawą i lewą sekwencję graniczną T-DNA do transformacji przy użyciu Agrobacterium, Funkcję trfA pochodzącą z RK2 umożliwiającą przemieszczanie się między E. coli i innymi gospodarzami oraz OriT i OriV także z RK2. Polilinker pCIB2001 jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających własne sygnały regulacyjne.

Konstrukcja pCIBlO i jego pochodnych z selekcją na hygromycynę: Bifunkcjonalny wektor pCIB10 zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę do selekcji w roślinach, lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA i posiada sekwencje z plazmidu pRK252 zdolnego do działania w wielu gospodarzach umożliwiające replikację zarówno w E. coli jak i Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana przez Rothstein i wsp., Gene 53:153-161 (1987). Liczne pochodne zawierające gen fosfotransferazy hygromhchny B pCIBlO zostały stworzone i opisane przez Gritz i wsp., Gene 25:179-188 (1983). Te pochodne umożliwiają selekcję transgenicznych komórek roślinnych na hygromhcynie (pCIB743) lub hygromycynie i kanamycynie (pCIB715, pCIB717).

II. Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji bez użycia Agrobacterium.

Transformacja bez użycia Agrobacterium tumefaciens pozwala na obejście konieczności posiadania przez wybrany wektor sekwencji T-DNA i konsekwentnie wektory nie posiadające tych sekwencji mogą być używane równocześnie z wektorami takimi jak opisane wyżej zawierającymi sekwencje T-DNA. Technikami transformacji, które nie opierają się na Agrobacterium są: transformacja przez bombardowanie cząsteczkami, pobieranie przez protoplasty (na przykład PEG i elektroporacja) i mikroinjekcja. Wybór wektorów w dużym stopniu zależy od preferowanego rodzaju selekcji dla transformowanego gatunku. Poniżej opisano konstrukcję kilku typowych wektorów

Konstrukcja pCIB3064: pCIB3064 jest wektorem pochodzącym od wektora pUC odpowiednim do technik bezpośredniego transferu genów w kombinacji z selekcją na herbicyd basta (lub fosfinotrycynę). Plazmid pCIB246 obejmuje promotor CaMV 35S w funkcjonalnej fuzji z genem GUS E. coli i terminator transkrypcji CaMV 35S i jest opisany w opublikowanym przez PCT zgłoszeniu patentowym WO 93/072778. Promotor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje ATG w kierunku 5' od startu. Te pozycje zostały zmutowane przy użyciu standardowych metod PCR w taki sposób by usunąć oba ATG i wprowadzić miejsce trawienia dla enzymu Sspl i PvuII. Nowe miejsca restrykcyjne były położone 96 i 37 od pojedynczego

187 094 jedynczego miejsca trawienia Sali i 101 i 42 bp od rzeczywistego miejsca startu. Uzyskany plazmid wywodzący się z pCIB246 został nazwany pCIB3025. Następnie gen GUS został wycięty z pCIB3025 przez trawienie enzymami Sall i Sacl, końce zostały strawione „na tępo” i ponownie zligowane by utworzyć plazmid pCIB3060. Plazmid pJIT82 otrzymano z John Innes Centre, Norwich i fragment Smal o wielkości 400 bp zawierający gen bar ze Streptomyces viridochromogenes został z niego wycięty i wstawiony w miejsce Hpal plazmidu pCIB3060 (Thompson i wsp. EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Tak utworzony pClB3064, który zawiera gen selekcji na herbicyd bar pod kontrolą promotora i terminatora CaMV 35S, gen oporności na ampicylinę (do selekcji w E. coli) i polilinker z pojedynczymi miejscami trawienia dla enzymów SphI, Pstl, HindII i BamHI. Ten wektor jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulatorowe.

Konstrukcja pSOG19 i pSOG35: pSOG35 jest wektorem do transformacji, który używa gen reduktazy dihydrofolanowej (DHFR) E. coli jako markera selekcyjnego nadającego oporność na methotrexate. Użyto PCR do namnożenia promotora 35S (~800bp), 6 intronu genu Adhl kukurydzy (~550bp) i 18 bp nie podlegającej translacji sekwencji liderowej GUS zpSOG10. Fragment o długości 250bp kodujący gen reduktazy dihydrololanowej typu drugiego E. coli został również namnożony techniką PCR i te dwa fragmenty zostały połączone fragmentem Sacl-Pstl zpB'1221 (Clontech), który zawiera szkielet wektora pUC19 i terminator syntazy nopalinowej. Połączenie tych fragmentów utworzyło pSOG19, który zawiera promotor 35S w fuzji z sekwencją intronu 6, lider GUS, gen DHFR i terminator syntazy nopalinowej. Zastąpienie lidera GUS wpSOG19 liderem sekwencji z Wirusem Chlorotycznej Plamistości Kukurydzy (MCMV) utworzyło wektor pSOG35. PSOG19 ipSOG35 niosą gen oporności na ampicylinę z pUC i mają miejsca trawienia dla Hindlll, SphI, Pstl, i EcoRI, które można zastosować do klonowania obcych sekwencji.

Przykład 21: Konstrukcja roślinnych kaset ekspresyjnych

Sekwencje genów, przeznaczone do ekspresji w roślinach transgenicznych są wpierw włączane do kaset ekspresyjnych za odpowiednim promotorem i przed odpowiednim terminatorem transkrypcji. Takie kasety ekspresyjne mogą być łatwo przenoszone do roślinnych wektorów do transformacji opisanych wyżej w przykładzie 20.

I Wybór promotora

Wybór promotora użytego w kasetach ekspresyjnych będzie miał wpływ na przestrzenny i czasowy wzór ekspresji transgenu w roślinie transgenicznej. Wybrane promotory będą eksprymować transgeny w specyficznych typach komórek (jak komórki epidermy liści, komórki mezofilu, komórki kory korzenia) lub w specyficznych narządach lub tkankach (na przykład korzeń, liście lub kwiaty) i ten wybór będzie odbiciem żądanej lokalizacji ekspresji transgenu. Wybrany promotor może również powodować ekspresję genu spod słabo indukowalnego lub podlegającego regulacji czasowej promotora. Późniejszą alternatywą jest wybór promotora regulowanego chemicznie. To umożliwi ekspresję transgenu tylko na żądanie, wtedy gdy zostanie potraktowany induktorem chemicznym.

II Terminatory transkrypcji

Jest wiele terminatorów transkrypcji dostępnych do użycia w kasetach ekspresyjnych. Są one odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie są takie terminatory transkrypcji, o których wiadomo, że działają w roślinach i zawierają terminator 35s CaMV, terminator tml, terminator syntazy nopalinowej, terminator rbcS E9 grochu jak również terminatory naturalnie związane z roślinnymi genami protox (na przykład „terminatory protox”). Mogą być one używane zarówno w roślinach jedno -jak i dwuliściennych.

III. Sekwencje wzmacniające lub regulujące ekspresję

Znaleziono liczne sekwencje wzmacniające ekspresję genów wewnątrz jednostki transkrypcyjnej i te sekwencje mogą być użyte w połączeniu z genami do zwiększenia ich ekspresji w roślinach transgenicznych.

Wykazano, że różne sekwencje intronów wzmacniają ekspresję, szczególnie w komórkach roślin jednoliściennych. Na przykład introny genu Adhl kukurydzy znacząco wzmacniają ekspresję dzikiego genu pod jego własnym promotorem, gdy zostanie wprowadzony do komórek kukurydzy. Stwierdzono, że intron 1 jest szczególnie wydajny i wzmacnia ekspresję

187 094 w konstrukcji będącym fuzją z genem acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis i wsp. Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)). W tym samym systemie eksperymentalnym, intron genu bronzel miał podobny efekt wzmacniający ekspresję (Callis i wsp., to samo). Sekwencje intronów były rutynowo włączane do wektorów służących do transformacji roślin, przeważnie wewnątrz nie ulegającego translacji lidera.

Znanych jest również wiele nie ulegających translacji sekwencji liderowych pochodzących z wirusów, które wzmacniają ekspresję i są one szczególnie wydajne w komórkach roślin dwuliściennych. Wykazano, że szczególnie sekwencje liderowe Wirusa Mozaiki Tytoniowej (TMV, „sekwencja-W”), Wirusa Chlorotycznej Plamistości Kukurydzy (MCMV), Wirus Mozaiki Lucerny (AMV) są wydajne we wzmacnianiu ekspresji (na przykład Gallie i wsp. Nuci. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski i wsp. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

IV. Kierowanie produktu genu w obrębie komórki

Znane są różne mechanizmy kierowania produktów genów u roślin i sekwencje kontrolujące funkcjonowanie tych mechanizmów zostały dość szczegółowo scharakteryzowane. Na przykład kierowanie produktów genów do chloroplastów jest kontrolowane przez sekwencję sygnałową, która jest spotykana na N-końcu różnych białek i która jest odszczepiana podczas importu do chloroplastów dając dojrzałe białko (np. Comal i wsp., J. Biol. Chem. 263: 1510415109 (1988)). Te sekwencje sygnałowe mogą być połączone z heterologicznymi produktami genów aby przeprowadzić importowanie heterologicznych produktów do chloroplastu (van den Broeck i wsp. Nature 313:358-363). DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnałowe może być izolowany z 5' końca cDNA kodujących białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazę EPSP, białko GS2 i wiele innych białek, o których wiadomo, że są zlokalizowane w chloroplaście.

Inne produkty genów są zlokalizowane w innych organellach takich jak mitochondrium i peroksysom (np. Unger i wsp. Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)). cDNA kodujący te produkty może też być manipulowany aby uzyskać efekt kierowania heterologicznych produków genów do tych organelli. Przykładami takich sekwencji są kodowane w jądrze ATPazy i specyficzne dla mitochondriów aminotransferazy asparaginianowe. Kierowanie do organelli komórkowych opisali Rogers i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)).

Dodatkowo scharakteryzowano sekwencje, które powodują kierowanie produktów genów do innych kompartymentów komórki. N-końcowe sekwencje są odpowiedzialne za kierowanie do ER, apoplastu, i zewnątrzkomórkowego wydzielania z komórek aleuronu (Koehler & Ho, Plant Celi 2: 769-783 (1990)). Dodatkowo, N-końcowe sekwencje w połączeniu z C-końcowymi sekwencjami są odpowiedzialne za kierowanie produktów genu do wakuoli (Shinsi i wsp., Plant Molec. Biol. 14:357-368 (1990)).

Przez fuzję odpowiednich sekwencji kierujących opisanych powyżej z sekwencjami interesującego transgenu jest możliwe kierowanie produktu transgenu do dowolnej organelli lub kompartymentu komórki. Dla kierowania do chloroplastów, na przykład, sekwencja sygnałowa z genu RUBISCO, genu CAB, genu syntazy EPSP lub genu GS2 jest połączona w ramce odczytu z N-końcowym ATG transgenu. Wybrana sekwencja sygnałowa powinna obejmować znane miejsce cięcia i skonstruowana fuzja powinna uwzględniać dowolne aminokwasy po miejscu cięcia, które są wymagane do cięcia, w niektórych przypadkach to wymaganie może być spełnione przez dodanie niewielkiej ilości aminokwasów między miejscem cięcia i ATG transgenu lub alternatywnie zastąpienie niektórych aminokwasów sekwencją transgenu. Fuzje skonstruowane dla importu do chloroplastów mogą być testowane pod kątem skuteczności pobierania do chloroplastów przez translację in vitro konstruktów transkrybowanych in vivo a następnie przez pobieranie in vitro do chloroplastów stosując techniki molekularne opisane przez (Bartlett i wsp. W: Edelmann i wsp. (red.) Methods in chloroplast molecular biology, Elsevier str. 1081-1091 (1982); Wasmann i wsp. Mol. Gen. Genet., 205: 446-453 (1986)). Te techniki konstrukcji są dobrze znane w dziedzinie i są w tym samym stopniu stosowalne do mitochondriów i peroksysomów. Wybór kierowania, które może być wymagane dla ekspresji transgenów będzie zależał od komórkowej lokalizacji prekursora wymaganego jako punktu wyjścia dla danego szlaku. Będzie ona na ogół cytosoliczna lub chloroplastowa, choć może

187 094 w niektórych przypadkach być mitochondrialna lub peroksysomalna. Produkty ekspresji transgenu nie będą normalnie wymagały kierowania do ER, apoplastu lub wodniczki.

Powyżej opisane mechanizmy nakierowywania w komórce mogą być wykorzystane nie tylko w połączeniu ze swymi odpowiednimi promotorami ale także w połączeniu z heterologicznymi promotorami tak by osiąnąć specyficzny cel kierowania pod regulacją transkrypcyjną promotora inną niż ten, z którego pochodzi sygnał kierowania.

Przykład 22. Transformacja dwuliściennych

Techniki transformacji dla dwuliściennych są dobrze znane w dziedzinie i obejmują techniki oparte o Agrobacterium i techniki, które nie wymagają Agrobacterium. Techniki nie wymagające Agrobacterium obejmują pobranie egzogennego materiału bezpośrednio przez protoplasty lub komórki. Może to być uzyskane przez pobieranie, w którym pośredniczy PEG lub elektroporacja, bombardowanie cząsteczkami lub mikroiniekcję. Przykłady tych technik opisali Paszkowski i wsp., EMBO J. 3:2717-2722 (1984), Potrykus i wsp., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich i wsp., Bictechnclogy 4: 1001-1004 (1986) i Klein i wsp., Naturę 327, 70-73 (1987). w każdym przypadku transformowane komórki są regenerowane do całych roślin stosując standardowe techniki znane w dziedzinie.

Transformacja, w której pośredniczy Agrobacterium jest preferowaną techniką transformacji dwuliściennych ze względu na swoją wysoką wydajność transformacji i szeroką stosowalność do wielu różnych gatunków. Wiele gatunków roślin uprawnych, które można rutynowo transformować Agrobacterium obejmuje tytoń, pomidory, słonecznik, bawełnę, rzepak oleisty, ziemniak, soję, lucernę i topolę (EP 0 317 511 (bawełna), EP 0 249 432 (pomidor, dla Calgene), WO 87/07299 (Brassica, dla Calgene), US 4,795,855 (topola).

Transformacja docelowego gatunku roślin przez zrekombinowany Agrobacterium na ogół obejmuje kokultywację Agrobacterium z eksplantami z rośliny i zachodzi według protokołów dobrze znanych w dziedzinie. Tkanka stransformowana jest regenerowana na pożywce selekcyjnej zawierającej marker oporności na antybiotyk lub herbicyd obecny między granicami dwuskładnikowego plazmidu T.

Przykład 23. Transformacja jednoliściennych

Transformacja większości gatunków jednoliściennych jest obecnie rutynowa. Preferowane techniki obejmują bezpośredni transfer genów do protoplastów z zastosowaniem PEG lub technik elektroporacji, i bombardowanie cząsteczkami tkanki kalusa. Transformacje mogą być przeprowadzane pojedynczym rodzajem DNA lub wieloma rodzajami DNA (np. kotransformacja) i obie te techniki są odpowiednie do stosowania z niniejszym wynalazkiem. Kotransformacja może mieć zaletę unikania konstrukcji złożonych wektorów i generowania roślin transgenicznych z niesprzężonymi loci dla interesującego genu i markera selekcyjnego pozwalając na usunięcie markera w kolejnych pokoleniach, o ile to jest uważane za pożądane. Jednak wadą stosowania kotransformacji jest mniejsza niż 100% częstość, z którą oddzielne rodzaje DNA są wintegrowywane do genomu (Schocher i wsp., Biotechnology 4: 1093-1096 (1986).

Zgłoszenia patentowe EP 0 292 435 (dla Ciba Geigy), EP 0 392 225 (dla Ciba Geigy) i WO 93/07278 (dla Ciba-Geigy) opisują techniki przygotowania kalusów i protoplastów z elitarnej linii wsobnej kukurydzy, transformację protoplastów z zastosowaniem PEG lub elektroporacji i regenerację roślin kukurydzy ze stransformowanych protoplastów. GordonKamm i wsp., Plant Celi 2: 603-618 (1990)) i Fromm i wsp., Biotechnology 8:833-839 (1990) opublikowali techniki transformacji linii kukurydzy pochodzącej od A188 stosując bombardowanie cząsteczkami. Dodatkowo, zgłoszenie WO 93/07278 (dla Ciba-Geigy) i Kozieł i wsp., Bictechnolcgy 11: 194-200 (1993) opisują techniki dla transformacji elitarnych wsobnych linii kukurydzy za pomocą bombardowania cząsteczkami. Technika ta stosuje niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5-2 mm wycięte z kłosa kukurydzy 14-15 dni po zapyleniu i urządzenie biolistyczne PDS-lOOOHe do bombardowania.

Transformacja ryżu może też być przeprowadzona za pomocą technik bezpośredniego przenoszenia genów stosując protoplasty lub bombardowanie cząsteczkami. Transformacja w której pośredniczą protoplasty była opisany dla typów Japonica i typów Indica (Zhang i wsp., Plant Celi Rep. 7: 379-384 (1988); Shimamoto i wsp., Nature 336:274-277 (1989); Datta i wsp.,

187 094

Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Oba typy także mogą być rutynowo transformowane stosując bombardowanie cząsteczkami (Christou i wsp., Biotechnology 9:957-962 (1991).

Zgłoszenie patentowe EP 0 332 581 (dla Ciba-Geigy) opisuje techniki dla generacji, transformacji i regeneracji protoplastów Pooideae. Techniki te pozwalają na transformację Dactylis i pszenicy. Dodatkowo, transformacja pszenicy, którą opisali Vasil i wsp., Biotechnology 10:667674 (1992)) stosując bombardowanie cząsteczkami kalusa długoterminowego typu C, a także Vasil i wsp., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)) i Weeks i wsp., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) stosując bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków i kalusa pochodzącego od niedojrzałych zarodków. Korzystna technika transformacji pszenicy obejmuje jednak transformację pszenicy przez bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków i obejmuje etap albo z wysoką sukrozą albo wysoką maltozą przed podaniem genu. Przed bombardowaniem dowolna ilość zarodków (0,75 - 1 mm długości) jest wysiewana na pożywkę MS z 3% sukrozą (Murashige i Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)) i 3 mg/ml 2,4-D dla indukcji somatycznych zarodków, która zachodzi w ciemności, w wybranym dniu bombardowania zarodki są usuwane z pożywki indukcyjnej i umieszczane w osmoticum (tzn. pożywce indukcyjnej z dodaną sukrozą lub maltozą w pożądanym stężeniu, typowo 15%). Następnie pozwala się na zajście plazmolizy u zarodków przez 2-3 godziny i poddaje się je bombardowaniu. Dwadzieścia zarodków na płytce jest typowe, choć nie jest krytyczne. Odpowiedni plazmid niosący gen (taki jak pCIB3064 lub pSG35) jest strącany na cząsteczki złota o wielkości mikrometra stosując standardowe procedury. Do każdej płytki z zarodkami strzela się z urządzenia DuPont Biolistics- hel stosując ciśnienie strzału ok. 1000 psi i standardowy ekran o sieci 80. Po bombardowaniu zarodki umieszcza się ponownie w ciemności by doszły do siebie przez około 24 godz (nadal na osmoticum). Po 24 godz. zarodki usuwane są z osmoticum i umieszczane ponownie na pożywce indukcyjnej, na której pozostają przez miesiąc przed regeneracją. Około jeden miesiąc później eksplanty zarodków z rozwijającym się embriogennym kalusem są przenoszone na pożywkę regeneracyjną (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA) dodatkowo zawierającą odpowiedni czynnik selekcyjny (10 mg/l basta dla pCIB3064v i 2 mg/l metotreksatu dla pSOG35). Po około miesiącu rozwinięte pędy przenosi się do większych sterylnych pojemników znanych jako „GA7” które zawierają MS protoplastów połowie stężenia, 2% sukrozę i to samo stężenie czynnika selekcyjnego. Zgłoszenie patentowe WO 94/13822 opisuje sposoby transformacji pszenicy i jest tu włączone w formie odniesienia.

Przykład 24. Izolacja sekwencji promotora protox-1 Arabidopsis thaliana

Bibliotekę genomową z Arabidopsis thaliana (Columbia, cała roślina) w lambda Zap II nabyto od Stratagene. Około 125000 fagów wysiano z gęstością 25000 pfu na 15 cm szalkę Petriego i sporządzono duplikaty na membrany Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Odbicia płytek na filtrach sondowano cDNA Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR:1 wyznakowana za pomocą 32-P dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji i płukania były w 65°C jak opisali Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984). Dodatnie hybrydyzujące łysinki oczyszczano i in vivo wycinano do plazmidów pBluescript. Sekwencje z wstawek genomowego DNA określano za pomocą metody terminacji łańcucha stosując terminatory dideoksy wyznaczone stosując barwniki fluoryzujące (Applied Biosystems, Inc.). Stwierdzono, że jeden klon, AraPTIPro, zawiera 580 bp sekwencji Arabidopsis przed inicjującą metioniną (ATG) sekwencji kodującej białka Protox-l. Klon ten także zawiera sekwencje kodujące i introny które sięgają do 1241 bp sekwencji cDNA Protox-1. 580 bp 5' nie kodującego fragmentu stanowi przypuszczalny promotor Protox-l Arabidopsis, i sekwencja jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 13.

AraPTIPro zdeponowano 15 grudnia, 1995 jako pWDC-11 (NRRL #B-21515).

Przykład 25. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmieniony gen Protox-1 za naturalnym promotorem Protox-1.

cDNA pełnej długości odpowiedniego zmienionego cDNA Protox-1 Arabidopsis wyizolowano jako częściowy produkt trawienia EcoRI-XhoI i sklonowano w roślinnym wektorze ekspresyjnym pCGN1761ENX (patrz Przykład 9 międzyn. zgłoszenia patentowego Nr PCT/IB95/00452 zgłoszonego 8 czerwca, 1995 i opublikowanego 21 grudnia, 1995 jako WO 95/34659). Plazmid ten strawiono Ncol i BamHI aby wyprodukować fragment złożony

187 094 z całkowitego cDNA Protox-l plus terminator transkrypcji z nie ulegającej translacji 3' sekwencji genu tmI Agrobacterium tumefaciens. Plazmid AraPTIPro opisany powyżej został strawiony Ncol i BamHI aby wyprodukować fragment złożony z pBluescript i 580 bp przypuszczalnego promotora Protox-1 Arabidopsis. Ligacja tych dwóch fragmentów wytworzyła fuzję zmienionego cDNA protox do naturalnego promotora protox. Kaseta ekspresyjna zawierająca fuzję promotor Protox-1/cDNA Protox-1/ terminator tml została wycięta za pomocą trawienia KpnI i sklonowana w wektorze dwuskładnikowym pCIB200. Plazmidem dwuskładnikowym transformowano przez elektroporację do Agrobacterium i następnie do Arabidopsis stosując technikę nasączania w próżni (Bechtold i wsp., C.R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199 (1993). Transformanty wyrażające zmienione geny protox wybierano na kanamycynie lub na różnych stężeniach herbicydu hamującego protox.

Przykład 26. Produkcja roślin tolerancyjnych w stosunku do herbicydu przez ekspresję fuzji naturalny promotor protox-1/zmieniony protox-1.

Stosując procedurę opisaną powyżej, cDNA Protox-l Arabidopsis zawierający zmianę TAC na ATG (tyrozyna na metioninę) w nukleotydach 1306-1308 w sekwencji Protox-1 (SEKW. ID NR:1) połączono z fragmentem naturalnego Protox-1 i wtransformowano do Arabidopsis thaliana. Wykazano, że ten zmieniony enzym Protox-1 (AraC-2Met) jest >10 razy bardziej tolerancyjny na różne herbicydy hamujące protox niż naturalnie występujący enzym gdy jest testowany w uprzednio opisanym bakteryjnym systemie ekspresji. Nasiona z naczyń nasączonych pod próżnią zbierano i wysiewano na zakresie (10,0 nm-1.0 uM) hamującego protox herbicydu arylouracylowego o wzorze XVII. Wielokrotne doświadczenia z dzikim Aradbidopsis wykazały, że 10,0 nM stężenie tego związku wystarcza by zapobiec normalnemu kiełkowaniu siewek. Transgeniczne nasiona wyrażające zmieniony enzym AraC2Met w formie fuzji z naturalnym promotorem Protox-l produkowały normalne siewki Arabidopsis przy stężeniach herbicydu do 500 nM, wykazując przynajmniej 50-krotnie większą oporność na herbicyd w porównaniu z dzikim Arabidopsis. Ta fuzja promotor/zmieniony enzym protox działa więc jako skuteczny seklekcyjny marker do transformacji roślin. Kilka z roślin, które wykiełkowały ma 100,0 nM herbicydzie hamującym protox transplantowano do gleby, hodowano 2-3 tygodnie i testowano w oznaczeniu sprajowym z różnymi stężeniami herbicydu hamującego protox. Gdy porównano z transformacją kontrolami złożonymi z samego wektora, transgeniki AraPTPro/AraC-2Met były 10 razy bardziej tolerancyjne na spray herbicydu.

Przykład 27. Wykazanie tolerancji krzyżowej mutacji opornych na różne związki hamujące protox w oznaczeniu kiełkowania Arabidopsis.

Stosując procedurę opisaną powyżej cDNA protox-l Arabidopsis zawierający zarówno zmianę TAC na ATC (tyrozyna na izoleucynę) w nukleotydach 1306-1398 i zmianę TCA na TTA (seryna na leucynę) w nukleotydach 945-947 w sekwencji Protox-1 (SEKW. Id NR:1) został podłączony do naturalnego fragmentu promotora Protox-1 i wtransformowany do Arabidopsis thaliana. Stwierdzono, że ten zmieniony enzym Protox-1 (AraC-2Ile + AraC305Leu) jest >10 razy bardziej tolerancyjny na hamujący protox herbicyd arylouraculowy o wzorze XVII niż naturalny enzym badany w systemie bakteryjnym (p. Przykłady 8-12). Homozygotyczne linie Arabidopsis zawierające tę fuzję generowano z transformantów, które wykazywały wysoką tolerancję na herbicyd hamujący protox w oznaczeniu kiełkowania siewek jak opisano powyżej. Nasiona z jednej linii przetestowano na oporność krzyżową na różne związki hamujące protox przez powtórzenie testu kiełkowania na stężeniach związków, dla których pokazano, że hamują kiełkowanie w dzikim Arabidopsis. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w Tabeli 4.

Tabela 4

Tolerancja krzyżowa na różne inhibitory protox w teście kiełkowania nasion.

wzór	nazwa zwyczajowa	tolerancja
1	2	3
11	acifluorofen	+

187 094

Ciąg dalszy tabeli

1	2	3
III	fomasafen	+
IV	fluoroglykofen	±
IVb	bifenoks	+
IVc	oksyfluorofen	+
IVd	laktofen	±
Vila	flutiacet-metyl	++
X	sulfentrazone	+
XI	flupropazyl	++
XIV	ftumiklorak	+
XVI	flumioksazyn	+++
XVII		++
XXIa	BAY11340	+
XXII		++

± <10 x bardziej tolerancyjny niż dziki + >10 x bardziej tolerancyjny niż dziki ++ > 100 x bardziej tolerancyjny niż dziki +++ > 100 x bardziej tolerancyjny niż dziki

Przykład 28. Izolacja sekwencji promotora Protox-1 kukurydzy

Bibliotekę genomową DNA z Zea mays (Missouri 17, linia wsobna, etiolowane siewki) w lambda FIX II nabyto od Stratagene. Około 250000 pfu biblioteki wysiano w gęstości 50000 fagów na 15 cm szalkę Petriego i sprządzono duplikaty na membrany Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Odbicia płytek na filtrach sondowano cDNA Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR:5) wyznakowanej za pomocą 32-P dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji i płukania były w 65°C jak opisali Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984). dNA fagów lambda izolowano z trzech dodatnio hybrydyzująch fagów stosując Wizard Lambda Preps Purification System (Promega). Analiza za pomocą trawienia restryjcyjnego, wzorów hybrydyzacji i analizy sekwencji DNA pozwoliły na identyfikację klonu lambda zawierającego około 3,5 kb genomowego DNA kukurydzy położonego 5' przed sekwencją kodującą Protox-1 kukurydzy uprzednio wyizolowaną jako klon cDNA. Fragment ten także zawiera promotor Prctcx-l kukurydzy. Sekwencja tego fragmentu jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 14. Od nukleotydu 1 do 3532 sekwencja ta składa się z sekwencji 5 nie kodującej. Od nukleotydu 3533 do 3848 sekwencja ta koduje 5' koniec białka Protox-l kukurydzy.

Plazmid zawierający sekwencję SEKW. ID NR: 14 w postaci fuzji z resztą sekwencji kodującej Protox-l kukurydzy zdeponowano 19 marca, 1996 jako pWDC-14 (NRRL #6-21546).

Przykład 29. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmienione geny Protox-1 za naturalnym promotorem Protox-1 kukurydzy.

Fragment genomowy kukurydzy o długości 3848 bp (SEKW. ID NR: 14) wycięto z wyizolowanego klonu bakteriofaga lambda jako częściowy produkt trawienia Sall-KpnI i zligowano z fagmentem KpnI-Notl pochodzącym ze zmienionego cDNA Protox-1 kukurydzy, który zawierał zmianę alaniny na leucynę w aminokwasie 164 (SEKW. ID NR:6). Dało to fuzję naturalnego promotora Protox-l kukurydzy z cDNA pełnej długości, który, jak wykazano,

187 094 nadawał tolerancję na herbicyd w układzie bakteryjnym (Przykłady 8-13). Fuzję tę wklonowano do wektora pochodzącego od pUC18 zawierającego sekwencję terminatora DaMV 35S, aby stworzyć kasetę promotor protoX/zmieninoy cDNA protnx/terminctor. Plazmid zawierający tę kasetę określono jako pWco-1.

Drugi konstrukt do transformacji kukurydzy stworzono przez wprowadzenie pierwszego intronu obecnego w sekwencji kodującej genomowego klonu kukurydzy z powrotem do cDNA kukurydzy. Insercję wprowadzono stosując standardowe techniki fuzji zachodzących na siebie fragmentów PGR. Intron (SEKW. ED NR:25) miał 93 bp długości i został wprowadzony między ouklentydcmi 203 i 204 SEKW. ID NR:6, dokładnie tak jak występuje w naturalnym klonie lambda opisanym w przykładzie 26. Ta zawierająca intron wersja kasety ekspresyjnej została nazwana pWCo-2.

Przykład 30. Wykazanie aktywności promotora Protox-1 kukurydzy w roślinach transgeniczoych.

Rośliny kukurydzy transformowane fuzjami promotor protox kukurydzy/zmieniony protox identyfikowano stosując analizę za pomocą PCR z primerami specyficznymi dla transgenu. Całkowity RNA izolowano z roślin dodatnich w teście PCR i przeprowadzano nZwrntoą transkrypcję stosując Superscript M-MLV (Life Technologies) w zalecanych warunkach. Dwa mikrolitry odwrotnej traoskryptazy stosowano w reakcji PCR zaplanowanej aby była specyficzna w stosunku do zmienionej sekwencji protox. Podczas gdy nietransformowane kontrole nie dawały produktu w tej reakcji, około 85% roślin transformowanych pWDo-1 dawało dodatni wynik, wskazując na obecność mRNA pochodzącego z transgenu. Wykazuje to pewien poziom aktywności promotora protox kukurydzy. RNA z trcosgeoicznych roślin kukurydzy także poddawano standardowej analizie typu Northern stosując radioaktywnie wyznakowany fragment cDNA protox kukurydzy z SEKW. ID NR:6 jako sondę. Poziomy mRNA Protox-l znacząco wyższe od nietransformowanych kontroli wykryto w niektórych roślinach transgenicznych. Przypuszcza się, że ten podwyższony poziom mRNA może być wynikiem ekspresji zmienionego pr^^o^-1 mRNA ze sklonowanego promotora kukurydzy.

Przykład 31. Izolacja sekwencji promotora Protox-1 buraka cukrowego

Biblioteką genomową buraka cukrowego przygotował Stratagene w wektorze Lambda FIX II. Około 300000 pfu biblioteki wysiano i sondowano cDNA Protox-1 buraka cukrowego (SEKW. ID NR: 17) jak opisano dla kukurydzy w Przykładzie 28. Analiza za pomocą trawienia restrykcyjnego, wzorów hybrydyzacji i analizy sekwencji DNA pozwoliły na identyfikację klonu lambda zawierającego około 7 kb genomowego DNA buraka cukrowego położonego 5' przed sekwencją kodującą Protox-1 buraka cukrowego uprzednio wyizolowaną jako klon cDNA. Fragment Pstl-Sall o wielkości 2606 kb subklonowano z klonu lambda do wektora pBlu-escript. Fragment ten zawiera 2068 bp sekwencji nie kodującej 5' i zawiera sekwencję promotora protox-l buraka cukrowego. Zawiera też pierwsze 453 bp sekwencji kodującej protox-l i pierwszy intron 85 bp zawarty w sekwencji kodującej. Sekwencja tego fragmentu jest przedstawiona w SEKW. iD NR:26.

Plazmid zawierający sekwencję SEKW. ID NR:26 zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pWDC-20 (NRRL #6-21650).

Przykład 32. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmienione geny Prntnx-1 buraka cukrowego za naturalnym promotorem Protox-1 buraka cukrowego.

Fragment genomowy buraka cukrowego (SEKW. ID NR:26) wycięto z genomowego subklonu opisanego w Przykładzie 31 jako fragment Sacl-BsrGl, który zawiera 2068 bp sekwencji 5' nie kodującej i pierwsze 300 bp sekwencji kodującej Protox-1 buraka cukrowego. Fragment ten /lignwaoo z fagmentem BsrGI-Notl pochodzącym ze zmienionego cDNA Protox-l buraka cukrowego, który zawierał zmianę tyrozyny na metioninę w aminokwasie 449 (SEKW. ID NR: 18). Dało to fuzję naturalnego promotora Protox-l buraka cukrowego z cDNA pełnej długości, który, jak wyka/aoo, nadawał tolerancję herbicydu w układzie bakteryjnym (Przykłady 8-13). Fuzję tę wkłooowaon do wektora pochodzącego od pUD18 zawierającego sekwencję terminatora CaMV 35S aby stworzyć kasetę promotor rrotox//mieoinny cDNA prntnx/termioator. Plazmid zawierający tę kasetę określono jako pWco-3.

187 094

Przykład 33. Produkcja roślin tolerancyjnych dla herbicydu przez ekspresję fuzji naturalny promotor Protox-1 buraka cukrowego/zmieniony protox-1 buraka cukrowego

Kasetę ekspresyjną z pWCo-3 wtransformowano do buraka cukrowego stosując dowolną z metod transformacji używanych do roślin dwuliściennych, w tym techniki z Agrobacterium, protoplastami i biolistyczne. Transgeniczne rośliny wyrażające zmieniony enzym protox identyfikowano stosując analizę za pomocą RNA-PCR i badano u nich tolerancję dla herbicydów hamujących protox w stężeniach zabójczych dla nietnansfonnowanych buraków cukrowych.

Część D : Ekspresja genów protox w piastydach roślin

Przykład 34. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu piastydowego cIpP i naturalną sekwencję 5' nie ulegającą translacji cIpP w formie fuzji z genem reporterowym GUS i 3' nieulegające translacji sekwencje genu plastydowego rps 16 w wektorze do transformacji piastydu.

I. Amplifikacja produktu promotora genu plastydu tytoniu cIpP i całej 5' nie ulegającej translacji (5'UTR) części RNA

Całkowity DNA zN. tabacum c.v. „Xanthi NC” stosowano jako matrycę dla PGR z primerem „nici górnej” od lewej do prawej zawierającym wprowadzone miejsce restrykcyjne EcoRI w pozycji -197 w stosunku do kodonu start ATG konstytutywnie wyrażanego genu plastydowego cIpP (primer Pclp_Pla: 5-gcggaattcatatacttatttatcattagaaag-3' (SEKW. ID NR:27); miejsce restrykcyjne EcoRI podkreślone), i primer „nici dolnej” prawa do lewej homologiczny do regionu -21 do -1 względem kodonu start ATG promotora cIpP, który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne na starcie translacji (primer PcIp_P2b: 5”-gcgccatggtaaatgaaagaaagaactaaa-3 (SEKW. ID NR:28); miejsce restrykcyjne Ncol podkreślone). Tą reakcję PCR przeprowadzono za pomocą termostabilnej polimerazy DNA Pfu (Stratagene, La Jolla CA) w Perkin Elmer Thermal Cycler 480 zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) w sposób następujący: 7 min 95°C, a następnie 4 cykle 1 min 95°C/2 min 43°C/1 min 72°C, potem 25 cykli 1 min 95°C/2 min 55°C/1 min 72°C. Produkt amplifikacji 213 bp zawierający promotor i obszar 5' nie ulegający translacji genu cIpP zawierający miejsce EcoRI na lewym końcu i miejsce Ncol na ich prawym końcu i odpowiadający sekwencji nukleotydów 74700 do 74505 sekwencji plastydowego DNA N.tabacum (Shinozaki iwsp., EMBO J. 5:2043-2049 (1986)) oczyszczano na żelu stosując standardowe procedury i strawiono EcoRI i Ncol (wszystkie enzymy restrykcyjne nabyto od New England Biolabs, Beverly, MA).

II. Amplifikacja 3' nie ulegającej translacji sekwencji RNA (3'UTR) genu rps 16 z plastydu tytoniu

Całkowity DNA zN. tabacum c.v. „Xanthi NC stosowano jako matrycę dla PCR z jak opisano powyżej z primerem „nici górnej” od lewej do prawej zawierającym wprowadzone miejsce restrykcyjne Xbal zaraz za kodonem stop TAA genu plastydowego rps 16 kodującego białko rybosomalne S16 (primer rps16P la (5”-GCGTCTAGATCAACCGAAATrCAATTAAGG-3' (SEKW. ID NR:30);

miejsce restrykcyjne Xbal podkreślone), i primer „nici dolnej” prawa do lewej homologiczny do regionu +134 do +151 względem kodonu stop TAA rps 16, który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne Hindlll na 3' końcu UTR rps 16 (primer rps16P_lb (5'-CGCAAGCTTCAATGGAAGC AATGATAA-3' (SEKW. ID NR:31);

miejsce restrykcyjne Hindlll podkreślone). Produkt amplifikacji 169 bp zawierający obszar 3' nie ulegający translacji genu rpsl<5 zawierający miejsce Xbal na lewym końcu i miejsce Hindlll na prawym końcu i odpowiadający sekwencji nukleotydów 4943 do 5093 sekwencji DNA plastydu N. tabacum (Shinozaki i wsp., (1986)) oczyszczano na żelu stosując standardowe procedury i strawiono Xbal i Hindlll.

III. Ligacja fragmentu genu reporterowego GUS do promotora genu cIpP i 5' i 3' UTR

Za pomocą trawienia Ncol i Xbal uzyskano fragment 1864 bp genu reporterowego βgalakturonidazy (GUS) pochodzący z pRAJ275 (Clontech) zawierający miejsce restrykcyjne Ncol wkodonie start ATG i miejsce Xbal za naturalnym 3' UTR. Ten fragment ligowano

187 094 w czteroskładnikowej reakcji z fragmentem 201 bp EcoRI/Ncol promotora cIpP, fragmentem 157 bp XbaI/HindIII rps 16 3'UTR i fragmentem 3148 bp EcoRI/HindIII z wektora do klonowania pGEM3Zf(-) (Promega, Madison, WI), aby skonstruować plazmid pPH138. Wektor do transformacji plastydów pPH140 skonstruowano przez strawienie plazmidu pPRV111a (Zoubenko i wsp., 1994) EcoRI i HindIII i ligację powstałego fragmentu 7287 bp z fragmentem 2222 bp EcoRI/HindIII pPH138.

Przykład 35. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu piastydowego tytoniu cIpP plus minimalną sekwencję 5' nie ulegającą translacji genu psbA z plastydu tytoniu w formie fuzji z genem reporterowym GUS i 3' nie ulegają translacji sekwencją genu plastydowego rps 16 w wektorze do transformacji plastydu.

Amplifikacja produktu promotora genu plastydu tytoniu clpP i całkowitej 5' sekwencji nie ulegającej translacji (5'UTR). Całkowity DNA zN.tabacum c.v. „Xanthi NC” stosowano jako matrycę dla PCR z primerem „nici górnej” od lewej do prawej PcIpPla (SEKW. ID NR:27) i primerem „nici dolnej” prawa do lewej homologicznym do regionu -34 do -11 względem kodonu start ATC promotora clpP, który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne Xbal w 5' UTR clpP w pozycji -11 (primer PcIp_Plb: 5'-gcgtctagaaagaactaaatactactatatttcac-3' (SEKW. ID nr:29); miejsce restrykcyjne Xnal podkreślone). Produkt amplifikacji 202 bp zawierający promotor i ucięty 5' UTR genu clpP zawierający miejsce EcoRI na lewym końcu i miejsce Xbal na prawym końcu oczyszczano na żelu i strawiono Xbal. Miejsce Xbal następnie wypełniono polimerazą DNA Klenowa (New Engleand Biolabs) i stawiono fragment EcoRI. Następnie fragment ten wligowano w reakcji 5-składnikowej do dwuniciowego fragmentu DNA odpowiadającego ostatnim 38 nukleotydom i kodonowi strat ATG 5' UTR genu plastydowego psbA tytoniu (z jednoniciowym miejscem restrykcyjnym Ncol („overhang”) wprowadzonym do kodonu start ATG), który został stworzony przez hybrydyzację syntetycznego oligonukleotydu minpsb_U (górna nić:

5”-gggagtccctgatgattaaataaaccaagattttac-3' (SEKW. ID NR:32)) oraz minpsbL (dolna nić:

5”-ąatggtaaaatcttggtttatttaatąatcagggactącc-3' (SEKW. ID NR:33);

podkreślone jednoniciowe miejsce 5' Ncol), fragmentu genu reporterowego GUS NcoI/Xbal opisanego powyżej, fragmentu XbaI/HindIII rps)6 3'UTR opisanego powyżej i fragmentu EcoRI/Hindlll pGEMZf(-) opisanego powyżej aby skonstruować plazmid pPH139. Wektor do transformacji plastydów pPH144 skonstruowano przez trawienie plazmidu pRVllla (Zoubenko i wsp., Nuci Acids Res. 22:3619-3824 (1994) EcoRI i HindIII i ligację powstałego fragmentu 7827 bp do fragmentu 2251 EcoRI/HindIII pPH139.

Przykład 36. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego tytoniu i całkowitą nie ulegającą translacji sekwencję 5' w formie fuzji z sekwencją kodującą Protox-1 Arabidopsis i 3' nie ulegającą translacji sekwencją genu plastydowego rps 16 w wektorze do transformacji plastydów tytoniu.

Minipreparat DNA z plazmidu AraC-2Met zawierającego wstawkę Notl, która zawiera sekwencję cDNA z genu oksydazy protoporfirogenu IX („PROTOX”) kodującej fragment Nkońcowego plastydowego peptydu sygnałowego, cDNA pełnej długości i część nie ulegającej translacji obszaru 3' zastosowano jako matrycę do PCR jak opisano powyżej stosując primer „nici górnej” od lewej do prawej (z homologią do nukleotydów +172 do +194 wzglądem kodonu start ATG białka prekursora o pełnej długości) zawierający wprowadzone miejsce restrykcyjne Ncol i nowy kodon start ATG na wydedukowanym miejscu startu dojrzałego białka PROTOX (primer APRTXP1 a:

5'-GGGACCATGGATTGTGTGATTGTCGGCGGAGG-3' (SEKW. ID NR:34); miejsce restrykcyjne Ncol podkreślone), i primer „nici dolnej” prawa do lewej homologiczny do regionu +917 do +940 wzglądem naturalnego kodonu start ATG białka prekursorowego PROTOX (primer APRTXP1b:

5'-CTCCGCTCTCCAGCTTAGTGATAC-3' (SEKW. ID NR:35)). Produkt amplifikacji 778 bp trawiono Ncol i SfuI i powstały fragment 682 bp ligowano do fragmentu 844 bp SfuI/Notl z AraC-2Met zawierającym 3' część sekwencji kodującej PROTOX i fragment 2978 bp Ncol/Notl wektora do klonowania pGEMZf(+) (Promega, Madison, WI), aby skonstruować

187 094 plazmid pPH141. Wektor do transformacji plastydów pPH143 zawierający promotor cIpP sterujący genem oporności na 276'854 SVl-Met PROTOX z 3' UTR rps 16 skonstruowano przez trawienie pPH141 Ncol i Sspl i izolację fragmentu 1491 bp zawierającego pełną sekwencję kodującą PROTOX, trawienie produktów PGR rpsl1P_la i rpsl6P_1b opisanych powyżej HindIII i ligację z fragmentem 7436 bp Ncol/HindIII pPH140.

Przykład 37. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego cIpP tytoniu plus minimalną nie ulegającą translacji 5' sekwencję genu psbA w formie fuzji z sekwencją kodującą Protox-1 Arabidopsis thaliana i 3' nie ulegającą translacji sekwencją genu piastydowego rps 16 w wektorze do transformacji plastydów tytoniu

Wektor do transformacji plastydów pPH145 zawierający fuzję promotor cIpP/5'UTR psbA sterujący genem oporności na 276'854 PROTOX SVl-Met z 3'UTR rps 16 skonstruowano przez strawienie pPH141 Ncol i Sspl i izolację fragmentu 1491 bp zawierającego kompletną sekwencję kodującą PROTOX, strawienie produktów PCR rpsl6P_la i rpslóP 1b opisanych powyżej HindIII i ligację ich do fragmentu EcoRI/HindIII 7465 bp pPH144.

Przykład 38: Biolistyczna transformacja genomu: plastydowego tytoniu

Nasiona Nicotiana tabacum c.v. „Xanthi nc” kiełkowano siedem na płytkę w 1 calowym kolistym ustawieniu na pożywce T z agarem i bombardowano 12-14 dni po zasianiu 1 mm wolframowymi cząsteczkami (M10, Biorad, Hercules, CA) powleczonymi DNA z plazmidów pPH143 i pPH145 zasadniczo jak opisano (Svab, ziMaliga, P. ('1993) PNAS 90. 913-917). Bombardowane siewki inkubowano na pożywce T przez dwa dni, po czym liście odcinano i umieszczaną stroną odosiową w górę w jasnym świetle (350-500 mmol fotonów/m²/sek) na płytkach z pożywką RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. i Maliga, P. (1990) PNAS 87:8526-8530) zawierającym 500 mg/ml chlorowodorku spektynomycyny (Sigma, St. Louis, Mo.). Oporne pędy pojawiające się poniżej wyblakłych liści trzy do ośmiu tygodni po bombardowaniu subklonowano na tę samą pożywkę selekcyjną, pozwalano im wytworzyć kalus, i izolowano i subklonowano pędy drugorzędowe. Całkowitą segregację kopii stransformowanych genomow plastydowych (homoplazmatyczność) w niezależnych subklonach oceniano standardowymi technikami Southerna (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Trawiony BamHI/EcoRI całkowity DNA komórkowy (Mettler I. K. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5:346-349) oddzielano na 1% żelach agarozowych w 1% Tris-boranie (TBE), przenoszono na nylonowe membrany (Amersham) i sondowano znakowaną metodą losowych primerów ³²P sekwencją DNA odpowiadającą fragmentowi 0.7 kb BamHI/HindIII z pC8 zawierającym część sekwencji kierującej do plastydu rps7/12. Homoplazmatyczne siewki ukorzeniano aseptycznie na pożywce MS/IBA zawierającej spektynomycynę (McBride K.E. i wsp. (1994) PNAS 91, 7301-7305) i przenoszono do szklarni.

Różne modyfikacje stosowanych tu metod będą ewidentne dla osoby specjalisty. Takie modyfikacje leżą w zakresie załączonych zastrzeżeń.

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Sandra Volrath

Marie Johnson

Sharon Potter

Eric Ward

Peter Heifetz (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Cząsteczki DNA kodujące roślinną oksydazę protoporfirynogenu i jej oporne na inhibitory mutanty (iii) LICZBA SEKWENCJI: 35 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT: Novartis Corporation (B) ULICA: 520 White Plains Road, P.O. Box 2005 (C) MIASTO: Tarrytown (D) STAN: NY (E) PAŃSTWO: USA

187 094 (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 10591 -9005 (V) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (vi) OBOWIĄZUJĄCE DANE ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/012,705 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-LUT-1996 (vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/013,612 (B) DATA ZGŁOSZEŃ 1 A: 28-LUT-1996 (vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/020,003 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-LIP-1996 (viii) INFORMACJE DOT. AGENTA/PEŁNOMOCNIKA:

(A) NAZWISKO: Timothy J. Meigs (B) NR REJ.: 38,241 (C) REFERENCJE/NUMER: CGC 1847 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: (919) 541-8587 (B) TELEFAX: (919) 541-8689 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1719 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(a) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-2 (NRRL B-21238) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS

POZYCJA: 31.. 1644 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „Protox-1 arabidopsis” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR:1:

187 094

ACG ACT CAA TCG (CTT

CCTT Leu

CCG TCG ΤΓΓ TCG (AAG CCC (AAT CTC

CGA Arg

TTA Leu

102

Thr Thr Gln 10

Ser Leu

Pro 15

Ser

Phe

Ser

Lys

Pro 22

Asn

Leu

AAT

GTT

TAT

AAG

CCT

CTT

A<GA

CTC

CGT

TCT

TCCA

GTG

GCC

(TCT

GGA

CCA

150

Asn

Val

Tyr

Lys

Pro

(Leu

Arg

Leu

Arg

cys

Ser

Val

Ala

Gly

Gly

Pro

25

30

30

40

ACC

GTC

GGA

TCT

TCCA

CAAA

ATC

GGAA

GGC

(GGA

(GGA

(TCC

ACC

ACC

ATC

ACG

158

Thr

Val

Gly

Ser

Ser

Lys

Ile

Glu

Gly

Gly

Gly

Gly

Thr

Thr

Ile

Thr

45

50

55

ACG

GAT

TGT

GTG

ATT

GTC

6G5C

(GGA

(TCT

ATT

AGT

(GGT

(CTT

TCC

ATC

(GCT

246

Thr

Asp

Cys

Val

Ile

Val

Gly

Gly

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

60

66

70

CAG

GCG

CTT

GCT

ACT

(AAG

(CAT

CCT

GAT

(GCT

GCT

CCC3

(AAT

TTA

ATT

GTG

254

Gln

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Pro

Asp

Ala

Ala

Pro

(Am

Leu

Ile

Val

75

88

85

ACC

GAG

GCT

TAAG

(GAT

CGT

GTT

(TCA

(TCC

(AAC

ATT

ATC

ACT

CGT

GAA

GAG

042

Thr

Glu

Ala

Lys

Asp

(Arg

Val

Gly

Gly

Asn

Ile

Ile

Thr

Arg

Glu

Glu

90

95

110

AAT

GGT

TTT

CTC

TCTC

(GAA

GAA

(TCT

CCC

(AAT

AGT

ΊΤΓ

(GAA

CCG

TCT

GAT

050

Asn

Gly

Phe

Leu.

Τηο

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

105

110

111

120

CCT

ATG

CTC

ACT

ATG

GTG

GTA

GAT

AGT

(TCT

TTC

(AAG

(GAT

GAT

TTG

GTG

408

Pro

Met

Leu

Thr

Met

Val

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

(A»p

Asp

Leu

Val

125

110)

135

TTG

GGA

GAT

CCT

ACT

(TCG

CCA

AGG

ΤΓΓ

GTC

TTG

(KG3

(AAT

(GTC

AAA

TTG

486

Leu

Gly

Asp

P27O

Thr

Ala

Pro

(Arg

Phe

Val

Leu

Ttt

Asn

Gly

Lys

Leu

140

114

110

AGG

CCG

GTT

CCCA

TCG

AAG

CTA

ACA

GAC

TTA

CCG

(TC

ΊΤΓΓ

GAT

TTG

ATG

504

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Pito

PPe

Phe

Asp

Leu

Met

155

116

116

AGT

ATT

GGT

CGG3

(AAG

ATT

A(GA

(GCT

(TCT

ίγγ

(TCT

GCCA

CTT

(TCC

ATT

CGA

582

Ser

Ile

Gly Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

Gly

PPe

Gly

Ala

Leu

Gl y

Ile

Arg

170

115

118

CCG

TCA

CCT

CCCA

(TCT

CGT

G(AA

G(AA

TCT

GTG

GAG

(GAG

(ΓΓΓ

GTA

CGG

CGT

600

Pro

Ser

Pro

Pro

Gly

(Arg

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

185

199

H5

200

AAC

CTC

GGT

TGAT

(GAG

GTT

ΊΓΓ

(GAG

CGC

CTC

ATT

(GAA

CCG

(ΓΓΓ

TGT

TC(A

678

Asn

Leu

Gly

(Asp

Glu

Val

Phe

Glu

(Arg

Llu

Ile

du

Pro

Phe

(ys

Ser

205

221

215

GGT

GTT

TAT

GCT

(TCT

GAT

CCT

TTCA

(AAA

CTC

AGC

(^A^ł3

(AAA

GCA

GCG

ΤΓΤ

726

Gly

Val

Tyr

TAla.

Gly

Asp

Pro

Sse

Lys

Llu

SS2T

MMt

Lys

Ala

Ala

Phe

220

225

230

187 094

GGG AAG Gly Lys

GTT Val 235

TGG AAA CTA

GAG CAA AAT GGT GGA AGC ATA ATA GGT GGT

774

Trp

Lys

Leu

Glu Gln 240

Asn

Gly

Gly

Ser

Ile 245

Ile

Gly

Gly

ACT

TTT

AAG

GCA

ATT

CAG

GAG

AGG

AAA

AAC

GCT

CCC

AAG

GCA

GAA

CGA

822

Thr

Phe

Lys

Ala

Ile

Gln

Glu

Arg

Lys

Asn

Ala

Pro

Lys

Ala

Glu

Arg

250

255

260

GAC

CCG

CGC

CTG

CCA

AAA

CCA

CAG

GGC

CAA

ACA

GTT

GGT

TCT

TTC

AGG

870

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Gln

Gly

Gln

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Arg

265

270

275

280

AAG

GGA

CTT

CGA

ATG

TTG

CCA

GAA

GCA

ATA

TCT

GCA

AGA

TTA

GGT

AGC

918

Lys

Gly

Leu

Arg

Met

Leu

Pro

Glu

Ala

Ile

Ser

Ala

Arg

Leu

Gly

Ser

285

290

295

AAA

GTT

AAG

TTG

TCT

TGG

AAG

CTC

TCA

GGT

ATC

ACT

AAG

CTG

GAG

AGC

966

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser

Gly

Ile

Thr

Lys

Leu

Glu

Ser

300

305

310

GGA

GGA

TAC

AAC

TTA

ACA

TAT

GAG

ACT

CCA

GAT

GGT

TTA

GTT

TCC

GTG

1014

Gly

Gly

Tyr

Asn

Leu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Pro

Asp

Gly

Leu

Val

Ser

Val

315

320

325

CAG

AGC

AAA

AGT

GTT

GTA

ATG

ACG

GTG

CCA

TCT

CAT

GTT

GCA

AGT

GGT

1062

Gln

Ser

Lys

Ser

Val

Val

Met

Thr

Val

Pro

Ser

His

Val

Ala

Ser

Gly

330

335

340

CTC

TTG

CGC

CCT

CTT

TCT

GAA

TCT

GCT

GCA

AAT

GCA

CTC

TCA

AAA

CTA

1110

Leu

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Glu

Ser

Ala

Ala

Asn

Ala

Leu

Ser

Lys

Leu

345

350

355

360

TAT

TAC

CCA

CCA

GTT

GCA

GCA

GTA

TCT

ATC

TCG

TAC

CCG

AAA

GAA

GCA

1158

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Ser

Ile

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

365

370

375

ATC

CGA

ACA

GAA

TGT

TTG

ATA

GAT

GGT

GAA

CTA

AAG

GGT

TTT

GGG

CAA

1206

Ile

Arg

Thr

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe

Gly

Gln

380

385

390

TTG

CAT

CCA

CGC

ACG

CAA

GGA

GTT

GAA

ACA

TTA

GGA

ACT

ATC

TAC

AGC

1254

Leu

His

Pro

Arg

Thr

Gln

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

395

400

405

TCC

TCA

CTC

TTT

CCA

AAT

CGC

GCA

CCG

CCC

GGA

AGA

ATT

TTG

CTG

TTG

1302

Ser

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

Pro

Pro

Gly

Arg

Ile

Leu

Leu

Leu

410

415

420

AAC

TAC

ATT

GGC

GGG

TCT

ACA

AAC

ACC

GGA

ATT

CTG

TCC

AAG

TCT

GAA

1350

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

425

430

435

440

GGT

GAG

TTA

GTG

GAA

GCA

GTT

GAC

AGA

GAT

TTG

AGG

AAA

ATG

CTA

ATT

1398

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

445

450

455

187 094

AAG CCT AAT TCG

ACC Thr

GAT Asp

CCA CC AAA CA GGA GC AGG GTA TGG

CCT Pro

1446

Lys

Pro AAn Ser 460

Pro

Leu

Lys 465

Leu

Gly Val

Arg

Val 470

Tir?

CAA

GCC

ATT

CCT

CAG

TTT

CTA

GTT

(G3T

CAC

TTT

(GAT

ATC

CTT

GAC

ACG

1494

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu

Val

Gly

His

Phe

Asp

lle

Leu

Asp

Thr

475

480

485

GCT

AAA

TCA

TCT

CTA

A<TC

TCT

TCG

GGC

TAC

GAA

cm

CTA

TTT

TTC

GGT

1542

Ala

Lys

See

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

Gly

Tyr

Glu

C-ly

Leu

Phe

Leu

Gly

490

495

500

GGC

AAT

TTA

GTC

GCT

GGT

GTA

GCC

ΤΓΑ

GGC

CGG

TCT

GTA

GAA

GGC

GCCk

1590

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

ALa

Leu

Gly

Arg

Cct

Val

Glu

Gly

Ala

505

510

515

520

TAT

GAA

AAC

SCO

ATT

GAG

GTC

AAC

AAC

TTC

ATG

TCCr

CGG

TAC

GCT

TAC

1638

Tyr

Glu

TTh

Sla

lle

Glu

Val

Asn

Asn

Phe

Met

SSe

Arg

Tyr

Ala

Tyr

525

530

535

AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT 1691

Lys

TTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA 1719 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 537 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 1:

Met 1

Glu

Leu

Ser

Leu 5

Leu

Arg

Pro

Thr

Thr 10

Gln

Ser

Leu

Leu

Pro 11

Ser

Phe

Ser

Lys

Pro 20

Asn

LeU

Arg

Leu

Asn 25

Val

Tyr

Lys

Pro

Leu 30

Arg

Leu

Arg

Cys

Ser 35

Val

Ala

Gly

Gly

Pro 40

Thr

Val

Gly

Ser

Ser 45

Lys

lle

Glu

Gly

Gly 50

Gly

Gly

Thr

Thr

Ile 55

Thr

Thr

Asp

Cys

Val 60

lle

Val

Gly

Gly

Gly 65

lle

Ser

Gly

Leu

Cys 70

lle

Ala

Gln

Ala

Leu 75

Ala

Thr

Lys

His

Pro 80

Asp

Ala

Ala

Pro

Asn 85

Leu

Ile

Val

Thr

Glu 90

Ala

Lys

Asp

Arg

Val 95

Gly

Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly 100 105 110

187 094

Pro Asn Ser Phe

Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val

Val

Asp

115

110

125

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp

Leu

Val

Leu

Gly

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro

Arg

130

135

110

Phe

Val

Leu

Tip>

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Lru

Thr

145

110

115

160

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

Ser

Ile

Gly

Gly

Lys

lie

Arg

Ala

165

110

175

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

Pro

Ser

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

180

115

110

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

A3n

Leu

Gly

Asp

Glu

Val

Phe

Glu

195

220

205

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

<tys

Ser

Gly

Val

Trr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

210

215

220

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Lys

Val

Trp

Lys

Leu

Glu

Gln

225

220

235

240

Asn

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Phe

Lys

Ala

Ile

Gln

Glu

Arg

245

250

255

Lys

Asn

Ala

P ro

Lys

Ala

Glu

Arg

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Gln

260

265

220

Gly

Gln

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

Arg

Met

Llu

Pro

Glu

275

280

285

Ala

lle

Ser

Ala

Arg

Leu

Gly

Ser

Lys

Val

Lye

Leu

Ser

Trp

Lys

LeU

290

295

300

Ser

Gly

Ile

Tir

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Gly

Tyr

Asn

Leu

Thr

Tyr

Glu

305

31^0

315

320

Thr

Pro

Asp

Gly

Leu

Val

Ser

Val

Gln

Ser

Lys

Ser

Val

Val

Mrt

Thr

325

330

335

Val

Pro

Ser

His

Val

ALa

Ser

Gly

Leu

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Glu

Ser

340

345

335

Ala

Ala

Asn.

Ala

Leu

Ser

Lys

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ala

Val

355

360

365

Ser

lie

Ser

Trr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Tire

Glu

Cys

Leu

lir

Asp

370

375

380

Gly

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

Hse

Pro

Arg

Thr

Gln

Gly

Val

385

390

395

400

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

405

410

415

187 094

Pro Pro Gly Arg 420

Ile Leu Leu

Leu

Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn

425

430

Thr

Gly

Ile

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

435

440

445

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

Lys

Pro

Asn

Ser

Thr

Asp

Pro

Leu

450

455

460

Lys

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Trp

Pro

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu

Val

465

470

475

480

Gly

His

Phe

Asp

Ile

Leu

Asp

Thr

Ala

Lys

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

485

490

495

Gly

Tyr

Glu

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

500

505

510

Leu

Gly

Arg

Cys

Val

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu

Thr

Ala

Ile

Glu

Val

Asn

515

520

525

Asn

Phe

Met

Ser

Arg

Tyr

Ala

Tyr

Lys

530

535

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1738 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-2 (NRRL B-21237) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 70..1596 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „Protox-1 arabidopsis”

187 094 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3:

TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG 60

CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108

Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ala

1

5

10

GTT

TCA

GGA

AAA

AGA

GTC

GCA

GTC

GTA

GGT

GCA

(TCT

GTA

AAG

CGA

CTT?

156

Val

Ser

Gly

Lys

AAg

Val

Ala

Val

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

15

20

25

GCG

GCG

GCG?

TAC

AAA

TTC

CAA

TCG

A(G3

GGT

TTG

CAT

GTC

ACT

GTG

TCT?

200

Ala

Ala

Ala

TTS

Lyy

Veu

Lys

Ser

Arg

Gly

Leu

Asn

Val

TThr

Val

Phh

30

35

40

05

GAA

GCT

GAT?

CGA

CGA

GTA

©3T

©TC

CAG

TTG

ACA

AGT

GTT

ATG

CCA

CAT

252

Glu

Ala

Asp

Gly

Arg

Val

Gly

Gly

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Met

Gln

Asn

50

55

66

GGT

TTG

ΑΊΤ

TTG!

CAT

CGA

CGA

GCA

CAC

ACC

ATC

ACT

GAG

GCT

CTAC

CCA

300

Gly

Leu

Ile

Trp

(Ap

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Ala

Glu

Pro

65

77

77

GAA

GTT

GCG

AGT

CTA

CTT

GAT

CAT

CTT

GGG

CCT

CGT

CGG

CAA

CCA

GCA

308

Glu

Val

Gly

Ser

(LSU

Leu

Asp

(Asp

Llu

Gly

Leu

Arg

Glu

Lys

Gln

Gln

80

80

99

TTT

CCA

ATT

TCA

CAG

CAA

CAG

CGG

TAT

ATT

GTG

CGG

CAT

©3T

GTA

CCT

396

Phe

Pro

Ile

Ser

Gln

Lys

Lys

Arg

'tyyr

Ile

Val

Arg

Asn

Gly

Val

Pro

95

100

H5

GTG

ATG

CTA

CCT

ACC

CAT

CCC

ATA

CAG

CTG

GTC

ACA.

AGT

AGT

GTG

CTC

000

Val

Met

Leu

Pro

Thr

CAsn

Pro

He

Glu

Leu

Val

Thr

Ser

Ser

Val

Leu

110

115

120

125

TCT

ACC

CTA

TCT

CAG

TTTC

GA

ATC

CTG

CTC

GAA

CCA

TTC

TTA

T(TC

CAG

092

Ser

Thr

Gln

Ser

Lys

Phe

Gln

He

Llu

Leu

Glu

Pro

Phe

Leu

Trp

Lys

130

113

110

AAA

AAG

TCC

TCA

CAA

GTC

TCA

GAT

GCA

TCT

GCT

GGA

GJA

AGT

GTA

AGCC

500

Lys

Lys

Ser

Ssr

Lys

Val

Ser

Asp

CAa

Ser

CALa

Glu

Glu

Ser

Val

Ser

145

115

115

GAG

TTC

TTT?

CCA.

CGC

CAT

ΤΠ’

CGA

CCA

GAG

GTT

GTT

CAC

TAT

CTC

ATC

588

Glu

Phe

Phe:

Gln

Arg

His

Phe

Gly

Gln

Glu

Val

Val

Asp

Tyr

Leu

Ile

160

1165

110

GAC

CCT

ΤΤΤΓ

GTT

<GT

(GA

ACA

AGT

GCT

gcg

CAC

CCT

CG^CT

TCC

CCCT

TCA

636

Asp

Pro

PhP

Val

Gly

Gly

Thr

Ser

CAa

Ala

Asp

Pro

(Asp

Ser

Leu

Ser

175

110

185

ATG

AAG

CAT

TCT

TTTC

CCA

GAT

CTC

(ϋ

AAT

GTA

GAG

AA

AGT

cttc

CG^CC

680

Met

Lys

His

Ser

Pile

Pro

Asp

Leu

Tip

Asn

Val

Glu

LyC

Ser

Phe

Gly

190

119

200

205

187 094

TCT Ser

ATT ATA

GTC GGT

GCA ATC AGA ACA AAG TTT GCT GCT

AAA Lys

GGT Gly 220

GGT Gly

732

Ile

Ile

Val

Gly 210

Ala

Ile Arg

Thr Lys 215

Phe

Ala

Ala

AAA

AGT

AGA

GAC

ACA

AAG

AGT

TCT

CCT

GGC

ACA

AAA

AAG

GGT

TCG

CGT

780

Lys

Ser

Arg

Asp

Thr

Lys

Ser

Ser

Pro

Gly

Thr

Lys

Lys

Gly

Ser

Arg

225

230

235

GGG

TCA

TTC

TCT

TTT

AAG

GGG

GGA

ATG

CAG

ATT

CTT

CCT

GAT

ACG

TTG

828

Gly

Ser

Phe

Ser

Phe

Lys

Gly

Gly

Met

Gln

Ile

Leu

Pro

Asp

Thr

Leu

240

245

250

TGC

AAA

AGT

CTC

TCA

CAT

GAT

GAG

ATC

AAT

TTA

GAC

TCC

AAG

GTA

CTC

876

Cys

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Asp

Glu

Ile

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Val

Leu

255

260

265

TCT

TTG

TCT

TAC

AAT

TCT

GGA

TCA

AGA

CAG

GAG

AAC

TGG

TCA

TTA

TCT

924

Ser

Leu

Ser

Tyr

Asn

Ser

Gly

Ser

Arg

Gln

Glu

Asn

Trp

Ser

Leu

Ser

270

275

280

285

TGT

GTT

TCG

CAT

AAT

GAA

ACG

CAG

AGA

CAA

AAC

CCC

CAT

TAT

GAT

GCT

972

Cys

Val

Ser

His

Asn

Glu

Thr

Gln

Arg

Gln

Asn

Pro

His

Tyr

Asp

Ala

290

295

300

GTA

ATT

ATG

ACG

GCT

CCT

CTG

TGC

AAT

GTG

AAG

GAG

ATG

AAG

GTT

ATG

1020

Val

Ile

Met

Thr

Ala

Pro

Leu

Cys

Asn

Val

Lys

Glu

Met

Lys

Val

Met

305

310

315

AAA

GGA

GGA

CAA

CCC

TTT

CAG

CTA

AAC

TTT

CTC

CCC

GAG

ATT

AAT

TAC

1068

Lys

Gly

Gly

Gln

Pro

Phe

Gln

Leu

Asn

Phe

Leu

Pro

Glu

Ile

Asn

Tyr

320

325

330

ATG

CCC

CTC

TCG

GTT

TTA

ATC

ACC

ACA

TTC

ACA

AAG

GAG

AAA

GTA

AAG

1116

Met

Pro

Leu

Ser

Val

Leu

Ile

Thr

Thr

Phe

Thr

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

335

340

345

AGA

CCT

CTT

GAA

GGC

TTT

GGG

GTA

CTC

ATT

CCA

TCT

AAG

GAG

CAA

AAG

1164

Arg

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ile

Pro

Ser

Lys

Glu

Gln

Lys

350

355

360

365

CAT

GGT

TTC

AAA

ACT

CTA

GGT

ACA

CTT

TTT

TCA

TCA

ATG

ATG

TTT

CCA

1212

His

Gly

Phe

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

Met

Met

Phe

Pro

370

375

380

GAT

CGT

TCC

CCT

AGT

GAC

GTT

CAT

CTA

TAT

ACA

ACT

TTT

ATT

GGT

GGG

1260

Asp

Arg

Ser

Pro

Ser

Asp

Val

His

Leu

Tyr

Thr

Thr

Phe

Ile

Gly

Gly

385

390

395

AGT

AGG

AAC

CAG

GAA

CTA

GCC

AAA

GCT

TCC

ACT

GAC

GAA

TTA

AAA

CAA

1308

Ser

Arg

Asn

Gln

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ser

Thr

Asp

Glu

Leu

Lys

Gln

400

405

410

GTT

GTG

ACT

TCT

GAC

CTT

CAG

CGA

CTG

TTG

GGG

GTT

GAA

GGT

GAA

CCC

1356

Val

Val

Thr

Ser

Asp

Leu

Gln

Arg

Leu

Leu

Gly

Val

Glu

Gly

Glu

Pro

415

420

425

187 094

GTG Val 430

TCT GTC AAC CAT

TAC TAT Tyr Tyr 435

TGG AGG AAA GCA TTC CCG TTG TAT GAC

1404

Ser Val Asn

His

Trp

Arg

Lys

Ala 440

Phe

Pro

Leu

Tyr

Asp 445

AGC

AGC

TAT

GAC

TCA

GTC

ATG

GAA

GCA

ATT

GAC

AAG

ATG

GAG

AAT

GAT

1452

Ser

Ser

Tyr

Asp

Ser

Val

Met

Glu

Ala

Ile

Asp

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

450

455

460

CTA

CCT

GGG

TTC

TTC

TAT

GCA

GGT

AAT

CAT

CGA

GGG

GGG

CTC

TCT

GTT

1500

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

His

Arg

Gly

Gly

Leu

Ser

Val

465

470

475

GGG

AAA

TCA

ATA

GCA

TCA

GGT

TGC

AAA

GCA

GCT

GAC

CTT

GTG

ATC

TCA

1548

Gly

Lys

Ser

Ile

Ala

Ser

Gly

Cys

Lys

Ala

Ala

Asp

Leu

Val

Ile

Ser

480

485

490

TAC

CTG

GAG

TCT

TGC

TCA

AAT

GAC

AAG

AAA

CCA

AAT

GAC

AGC

TTA

TAACATTGTC

1603

Tyr

Leu

Glu

Ser

Cys

Ser

Asn

Asp

Lys

Lys

Pro

Asn

Asp

Ser

Leu

495 500 505

AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663

CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1723

ACTATTTATG TAAAA 1738 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 508 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 4:

Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ala Val Ser Gly

1

5

10

15

Lys

Arg

Val

Ala 20

Val

Val

Gly

Ala

Gly 25

Val

Ser

Gly

Leu

Ala 30

Ala

Ala

Tyr

Lys

Leu 35

Lys

Ser

Arg

Gly

Leu 40

Asn

Val

Thr

Val

Phe 45

Glu

Ala

Asp

Gly

Arg 50

Val

Gly

Gly

Lys

Leu 55

Arg

Ser

Val

Met

Gln 60

Asn

Gly

Leu

Ile

Trp 65

Asp

Glu

Gly

Ala

Asn 70

Thr

Met

Thr

Glu

Ala 75

Glu

Pro

Glu

Val

Gly 80

Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln Phe Pro Ile 85 90 95

187 094

Ser Gln Lys Lys

Arg Tyr Ile Val Arg Asn Gly Val 100

Pro

Val 110

Met

Leu

100

Pro

Thr

Asn

Pro

Ile

Glu

Leu

Val

Thr

Ser

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Gln

115

110

112

Ser

Lys

Phe

Gln

11 e

Leu

Leu

Glu

Pro

r^h^e

Leu

Trp>

Lys

Lys

Lys

Ser

130

115

110

Ser

Lys

Val

Ser

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Glu

Ser

Val

Ser

Glu

Phe

Phe

145

150

115

110

Gln

Arg

His

Plee

Gly

Gln

Glu

Val

Val

Asp

Tyr

Leu

Ile

Asp

Pro

Phe

165

117

175

Val

Gly

Gly

TTr

Aer

Ala

Ala

Asp

Pro

Asp

Ser

Leu

Ser

Met

Lys

His

180

110

110

Ser

Phe

Pro

Aas

Aeu

Τη?

AAn

Val

Glu

Lys

Ser

Phie

Gly

Ser

Ile

Ile

195

220

225

Val

Gly

Ala

lie

Arg

Thr

Lys

Phe

AUa

AUa

Lys

Gly

GIjs

Lys

Ser

Arg

210

215

222

Asp

Thr

Lys

Ser

Ser

Pro

Gly

Thr

Lys

Lys

Gly

Ser

Arg

Gly

Ser

Phe

225

230

225

240

Ser

Phe

Lys

Gly

Gly

Met

Gln

Ile

Leu

Pro

Asp

Tho

Leu

cys

Lys

Ser

245

220

255

Leu

Ser

His:

Aas

Alu

Ile

AAsn

Leu

Asp

Seo

Lys

Val

Leu

Ser

Leu

Ser

260

225

220

Tyr

Asn

Ser

Gly

A er

AArg

Gln

Glu

Asn

Top

Ser

Leu

Ser

cys

Val

Ser

275

220

220

His

Asn

Glu

Thr

Gln

Arg

Gln

Asn

Pro

His

iyr

TAs

AAl.

Val

Ile

Met

290

225

330

Thr

Ala

Pro

Leu

cys

JAsn

Val

Lys

Glu

Met

Lls

Val

Met

Lys

Gly

Gly

305

33.1

311

330

Gln

Pro

Phe

Gln

Leu

Asn

Phe

Leu

Pro

Glu

lie

Asn

Tyo

Met

Poo

Leu

325

330

335

Ser

Val

Lyu

Ile

Thr

Thr

Phe

Thr

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

Arg

Pro

Leu

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ile

Pro

Ser

Lys

Glu

Gln

Lys

His

Gly

Phe

355

360

365

Lys

Thr

Lyu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

Met

Met

Phe

Pro

Asp

Arg

Ser

370

375

380

Pro

Ser

Asp

Val

His

Leu

Tyr

inr

Tho

Phe

lie

Gly

Gly

Ser

Arg

Asn

385

3 90

355

400

187 094

Gln

Glu

Leu

Ala

Lys

ALa

Ser

Thr

Asp

Glu

Leu

Lys

GIn

Val

Val

Thg

405

44^0

441

Ser

Asp

Leu

Gln

Arg

Leu

Leu

Gly

Val

Glu

Gly

Glu

Pro

Val

S€^sr

VaI

420

425

443

Asn

His

TTsr

Ty^r

Trp

Arg

Lys

Ala

Phe

Pro

Leu

Tyr

Asp

Siiir

Ser

Tyr

435

440

445

Asp

Ser

Val

Met

Glu

ALa

Ile

Asp

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

Llu

Pro

Gly

450

455

460

Phe

Phe

TTsr

ALa

Gly

Asn

His

Arg

Gly

Gly

Leu

Ser

Val

GIy

Lys

Ser

465

477

447

480

Ile

Ala

Ser

Gly

Cys

Lys

AIi

Ala

Asp

Leu

Val

Ilr

Ser

Tyg

Leu

GIu

485

490

440

Ser

Cys

SeS

Asn

Asp

Lys

Lys

Pro

Asn

Asp

Ser

Leu

500

505

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 5:

(i) charakterystyk sekwencji:

(A) DŁUGOŚĆ: 1691 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Zea mays (maize) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-4 (NRRL B-21260) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1..1443 (A) IN^N^E INFORMACJE : /produkt= „Protox1 1 maize cDNA” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5:

GCG

GAC

TGC

GTC

GTG

GTG

GGC

GGA

GGC

ATC

AGT

GGC

CTC

TGC

ACC

GCG

48

Ali

Asp

Cys

Val

Val

Vil

Gly

Gly

Gly

Ilr

Srg

Gly

Leu

Cys

Thr

Ali

1

5

10

15

CAG GCG CTG GCC ACG CGG CAC GGC GTC GGG GAC GTG CTT GGC ACG C-AG

Gln Ala Leu Ala Thr Arg His Gly Vh1 Gly Asp Val Leu Vv1 Thr Glu

22 30

187 094

GCC CGC GCC CGC CCC GGC GGC AAC ATT ACC ACC GTC GAG CGC CCC GAG

144

Ala

Arg

Ala 35

Arg Pro Gly Gly

Asn Ile Thr 40

Thr

Val

Glu 45

Arg

Pro

Glu

GAA

GGG

TAC

CTC

TGG

GAG

GAG

GGT

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

CCC

TCC

GAC

192

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

50

55

60

CCC

GTT

CTC

ACC

ATG

GCC

GTG

GAC

AGC

GGA

CTG

AAG

GAT

GAC

TTG

GTT

240

Pro

Val

Leu

Thr

Met

Ala

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp

Leu

Val

65

70

75

80

TTT

GGG

GAC

CCA

AAC

GCG

CCG

CGT

TTC

GTG

CTG

TGG

GAG

GGG

AAG

CTG

288

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

Gly

Lys

Leu

85

90

95

AGG

CCC

GTG

CCA

TCC

AAG

CCC

GCC

GAC

CTC

CCG

TTC

TTC

GAT

CTC

ATG

336

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

100

105

110

AGC

ATC

CCA

GGG

AAG

CTC

AGG

GCC

GGT

CTA

GGC

GCG

CTT

GGC

ATC

CGC

384

Ser

Ile

Pro

Gly

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

115

120

125

CCG

CCT

CCT

CCA

GGC

CGC

GAA

GAG

TCA

GTG

GAG

GAG

TTC

GTG

CGC

CGC

432

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

130

135

140

AAC

CTC

GGT

GCT

GAG

GTC

TTT

GAG

CGC

CTC

ATT

GAG

CCT

TTC

TGC

TCA

480

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

145

150

155

160

GGT

GTC

TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCT

AAG

CTC

AGC

ATG

AAG

GCT

GCA

TTT

528

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

165

170

175

GGG

AAG

GTT

TGG

CGG

TTG

GAA

GAA

ACT

GGA

GGT

AGT

ATT

ATT

GGT

GGA

576

Gly

Lys

Val

Trp

Arg

Leu

Glu

Glu

Thr

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

180

185

190

ACC

ATC

AAG

ACA

ATT

CAG

GAG

AGG

AGC

AAG

AAT

CCA

AAA

CCA

CCG

AGG

624

Thr

Ile

Lys

Thr

Ile

Gln

Glu

Arg

Ser

Lys

Asn

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg

195

200

205

GAT

GCC

CGC

CTT

CCG

AAG

CCA

AAA

GGG

CAG

ACA

GTT

GCA

TCT

TTC

AGG

672

Asp

Ala

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Ala

Ser

Phe

Arg

210

215

220

AAG

GGT

CTT

GCC

ATG

CTT

CCA

AAT

GCC

ATT

ACA

TCC

AGC

TTG

GGT

AGT

720

Lys

Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser

225

230

235

240

AAA

GTC

AAA

CTA

TCA

TGG

AAA

CTC

ACG

AGC

ATT

ACA

AAA

TCA

GAT

GAC

768

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys

Ser

Asp

Asp

245

250

255

187 094

AAG GGA Lys Gly

TAT Tyr

AGT ttg

GAG Glu

TAT GAA ACG CCA GAA OG3 GTT GTT TCG GTC

816

Gal 260

Leu

ITr

Glu

TTrr Pro Glu 22 6

Gly

Val

Val 270

Ser

Val

CAG

GCT

AAA

GGT

GTT

ATC

ΑΊΌ

ACT

AAC

CCA

TCA

TAT

GTT

GCT

AGC

AAAC

864

Gln

Ala

Lyy

Gsr

Val

lie

Met

Thr

Ili

Pro

Ser

1^

Val

Ala

Ser

Asn

275

280

285

ATT

TTG

CGT

GCG

CTT

TCA

AGG

GAT

GGC

GCA

GAT

GCC

CTA

TCA

AGA

GCC

912

lle

Leu

AAr

Giro

Leu

Ser

Ssu

AAsp

Ala

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Arg

Phe

290

229

330

TAT

TAT

CCC

GCG

τyy

GCT

GCT

GTA

ACC

ττy

TCG

TAT

CCA

AAG

GGAr

GCG

960

Tyr

Tyr

Prr

Pro

Val

Ala

AALa

Val

Thr

Val

Ser

ITr

Pro

Lys

Glu

AALa

305

310

315

330

ATT

AGA

AAA

AJG

TGC

TTA

ΑΊΤ

AGT

GGG

GAA

CTC

CAA

AGCC

ITT

CGGC

CGG

1008

lle

Arg

Lyy

Glu

Cys

Leu

Ili

Asp

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln

325

330

333

TTG

CAT

CCC

CGT

AGT

CAA

«Γ.

GIT

GAG

ACA

TTA

G(G

ACA

ATA

TAC

AGT?

1056

Leu

His

Prr

Arg

Ser

Gin

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

lie

^yr

Ser

340

334

350

TCC

TCA

CCT

ΤΊΤ

CCA

AAT

CGT

GCC

CCT

GAC

GTy

ACG3

GTG

TTA

(CT

CTA

1104

Ser

Ser

Leu

Ahe

Pro

Asn

Arg

AALa

Pro

Asp

Gly

TArg

Val

Leu

Leu

Leu

355

330

365

AAC

TAC

AAT

AGA

GGT

GCT

ACA

AAC

AGA

GGA

ATT

GIC

TCC

AAG

ACC

GGAr

1152

Asn

Tyr

Ili

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

Gly

lie

Val

Ser

Lys

Thr

Glu

370

337

330

AGT

GAG

CCT

GTC

GAA

GCA

GIT

GGC

CGT

GAC

CTC

CCG

AAAA

ATG

CCCT

ATA

1200

Ser

Glu

Llu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

AArg

Aksp

Leu

Arg

Lys

eet

Leu

Ile

385

390

395

440

AAT

TCT

AAC

GCCk

GTG

GAC

CCC

GCA

GTTC

CTT

ττy

GTC

CGA

GTT

TGG

CCA

1248

Asn

Ser

TTr

AALa

Val

Asp

Pro

Leu

Val

Leu

Gly

Val

AArg

Val

Τη?

Pro

405

410

4]_5

CAA

GCC

AAT

ACT

CAG

TTC

CCO

GTA

CGG

CAT

CTT

GAT

cyy

CTG

(GA.

GCC

1296

Gin

Ala

Ili

Aro

Gin

rre

Leu

Val

Gly

His

Leu

TA»p

Leu

Leu

Glu

Ala

420

445

430

GCA

AAA

GCT

gcc

CCG

GAC

CCG.

CGC

CGiC

TAC

GAT

cxm

CTG

TTC

CCA

GGA

1344

Ala

Lys

AAa

Ala

Leu

Asp

AArg

Gly

Gly

Tyr

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

435

440

445

GGG

AAC

TGA

gtt

GCA

GGA

GIT

GCC

ACG

GGC

AGA

TGC

GTT

GAG

CG3C

GCG

1392

Gly

Asn

TTy

Val

Ala

Gly

Val

AALa

Leu

Gly

Arg

CCt

Val

Glu

Gly

Ala

450

445

440

TAT

GAA

AAG

GCC

TCG

CAA

ATA

TCC

GAC

TTC

TTG

ACC

CGG

TAT

GCC

TAC

1440

Tyr

Glu

Ssu

AALa

Ser

Gin

Ile

Ser

Asp

rre

Leu

Thr

Lys

Tyr

Ala

Άτ

465

470

475

4180

1493

AAG TGATGAAAGA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT TGCATAGATG Lys

187 094

AGGTGCCTCC	GGGGAAAAAA	AAGCTTGAAT	AGTATTTTTT	attcttattt	TGTAAATTGC	1553
ATTTCTGTTC	TTTTTTCTAT	CAGTAATTAG	ΤΤΑΤΑΊΤΤΤΑ	GTTCTGTAGG	AGATTGTTCT	1613
GTTCACTGCC	CTTCAAAAGA	ΑΑΤΤΤΤΑΊΤΤ	TTCATTCTTT	TATGAGAGCT	GTGCTACTTA	1673
AAAAAAAAAA	AAAAAAAA					1691

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 481 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6:

Ala 1

Asp

Cys

Val

Val 5

Val

Gly Gly Gly

Ile 10

Ser

Gly

Leu

Cys

Thr 15

Ala

Gln

Ala

Leu

Ala 20

Thr

Arg

His

Gly

Val 25

Gly

Asp

Val

Leu

Val 30

Thr

Glu

Ala

Arg

Ala 35

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn 40

Ile

Thr

Thr

Val

Glu 45

Arg

Pro

Glu

Glu

Gly 50

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu 55

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe 60

Gln

Pro

Ser

Asp

Pro 65

Val

Leu

Thr

Met

Ala 70

Val

Asp

Ser

Gly

Leu 75

Lys

Asp

Asp

Leu

Val 80

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn 85

Ala

Pro

Arg

Phe

Val 90

Leu

Trp

Glu

Gly

Lys 95

Leu

Arg

Pro

Val

Pro 100

Ser

Lys

Pro

Ala

Asp 105

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp 110

Leu

Met

Ser

Ile

Pro 115

Gly

Lys

Leu

Arg

Ala 120

Gly

Leu

Gly

Ala

Leu 125

Gly

Ile

Arg

Pro

Pro 130

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu 135

Glu

Ser

Val

Glu

Glu 140

Phe

Val

Arg

Arg

Asn 145

Leu

Gly

Ala

Glu

Val 150

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile 155

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser 160

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly 165

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu 170

Ser

Met

Lys

Ala

Ala 175

Phe

Gly

Lys

Val

Trp 180

Arg

Leu

Glu

Glu

Thr 185

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile 190

Gly

Gly

187 094

Thr

Ile

Lys 155

Thr

Ile

Gln

Glu

(Arg 200

Ser

Lys

Asn

Pro

Lys 225

Pro

Pro

(Arg

Asp

Ala 210

Arg

Llu

Pro

Lys

Pro 221

Lys

Gly

Gln

Thr

Val 222

Ala

Ser

Phe

(Arg

Lys 225

Gly

Leu

A Al

Met

Leu 230)

Pro

(Asn

Ala

Ile

Thr 220

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser 240

Lys

Val

Lys

Lsu

( er 245

Τη?

Lys

Leu

Thr

Ser 220

Ile

Thr

Lys

Ser

Asp 225

(A;p

Lys

Gly

iyr

Val 260

Leu

Glu

Tyr

Glu

Thr 226

Pro

Glu

Gly

Val

Val 270

Ser

Val

Gln

Ala

Lys 275

Ser

Val

Ile

Met

Thr 220

Ile

Pro

Ser

łyr

Val 225

Ala

Ser

Asn

lie

Leu 250

Arg

Ppr

(eu

Se r

Ser 295

Asp

dc

da

(Asp

da 300

Leu

Ser

Arg

Phe

Tyr 005

Tyr

Pro

Ppo

Val

Ala 310

(ALa

Val

Thr

Val

Ser 30.1

(tyr

Pro

Lys

Glu

da 300

lie

Arg

Lys

dl

(ys 025

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu 330

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly 335

Gln

Leu

His

Pro

AOrg 040

Ser

Gln

Gly

Val

Glu 345

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile 350

Tyr

Ser

Ser

Ser

Leu 055

Phe

Pro

Asn

AOrg

Ala 360

Pro

Asp

Gly

Arg

Val 365

Leu

Leu

Leu

Asn

ryr 070

liii

dy

dy

Al a

Thr 375

Asn

Thr

(le

Val 380

Ser

Lys

Thr

Glu

Ser 085

Glu

Leu

vaa

Glu

Ala 390

Val

Asp

Arg

Asp

Leu 305

(Arg

LyS

Met

Leu

Ile 400

Asn

Ser

Thr

AAl

Val 405

Asp

Pro

Leu

Val

Leu 410

Gly

Val

(Arg

Val

Trp 415

Pro

Gln

Ala

Ile

Pro 420

Gln

Phe

Leu

Val

Gly 425

His

Leu

Asp

Leu

Leu 430

Glu

Ala

Ala

Lys

Ala 405

Ala

Leu

(Asp

(Arg

Gly 440

Gly

Tyr

(sp

d(

Leu 445

(hę

lys

uPh

Gly

Asn 450

Ty:r

Vv1

(la

Gly

Val 45 5

Ala

Leu

dy

(Arg

Cys 4(50

Val

Glu

Gly

Ala

Tyr 465

Glu

Ser

A Al

Ser

Gln 470

Ile

Seo

Asp

Phe

Leu 475

Thr

Lys

Tyr

Ala

Tyr 480

Lys

187 094 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2061 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Zea mays (maize) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-3 (NRRL B-21259) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 64..1698 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „Protox-2 maize” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 7:

CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60

CAA ATG

CTC GCT

TTG ACT GCC TCA GCC TCA TCC GCT TCG TCC

CAT His

CCT Pro 15

108

Met 1

Leu

Ala

Leu Thr 5

Ala

Ser

Ala Ser

Ser 10

Ala

Ser

Ser

TAT

CGC

CAC

GCC

TCC

GCG

CAC

ACT

CGT

CGC

ccc

CGC

CTA

CGT

GCG

GTC

156

Tyr

Arg

His

Ala

Ser

Ala

His

Thr

Arg

Arg

Pro

Arg

Leu

Arg

Ala

Val

20

25

30

CTC

GCG

ATG

GCG

GGC

TCC

GAC

GAC

CCC

CGT

GCA

GCG

CCC

GCC

AGA

TCG

204

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Ser

Asp

Asp

Pro

Arg

Ala

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

35

40

45

GTC

GCC

GTC

GTC

GGC

GCC

GGG

GTC

AGC

GGG

CTC

GCG

GCG

GCG

TAC

AGG

252

Val

Ala

Val

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

Tyr

Arg

50

55

60

CTC

AGA

GAG

AGC

GGC

GTG

AAC

GTA

ACG

GTG

TTC

GAA

GCG

GCC

GAC

AGG

300

Leu

Arg

Gln

Ser

Gly

Val

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Ala

Asp

Arg

65

70

75

GCG

GGA

GGA

AAG

ATA

CGG

ACC

AAT

TCC

GAG

GGC

GGG

TTT

GTC

TGG

GAT

348

Ala

Gly

Gly

Lys

Ile

Arg

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly

Gly

Phe

Val

Trp

Asp

80

85

90

95

187 094

GAA GGA Glu Gly

GCT AAC Ala Asn

ACC ATG ACA GAA GGT GAA TGG GAG GCC AGT AGA CTG

396

Thr 100

Met

Thr

Glu

Gly

Glu 105

Trp

Glu

Ala

Ser Arg 110

Leu

ATT

GAT

GAT

CTT

GGT

CTA

CAA

GAC

AAA

CAG

CAG

TAT

CCT

AAC

TCC

CAA

444

Ile

Asp

Asp

Leu

Gly

Leu

Gln

Asp

Lys

Gln

Gln

Tyr

Pro

Asn

Ser

Gln

115

120

125

CAC

AAG

CGT

TAC

ATT

GTC

AAA

GAT

GGA

GCA

CCA

GCA

CTG

ATT

CCT

TCG

492

His

Lys

Arg

Tyr

Ile

Val

Lys

Asp

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

Ile

Pro

Ser

130

135

140

GAT

CCC

ATT

TCG

CTA

ATG

AAA

AGC

AGT

GTT

CTT

TCG

ACA

AAA

TCA

AAG

540

Asp

Pro

Ile

Ser

Leu

Met

Lys

Ser

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

Ser

Lys

145

150

155

ATT

GCG

TTA

TTT

TTT

GAA

CCA

TTT

CTC

TAC

AAG

AAA

GCT

AAC

ACA

AGA

588

Ile

Ala

Leu

Phe

Phe

Glu

Pro

Phe

Leu

Tyr

Lys

Lys

Ala

Asn

Thr

Arg

160

165

170

175

AAC

TCT

GGA

AAA

GTG

TCT

GAG

GAG

CAC

TTG

AGT

GAG

AGT

GTT

GGG

AGC

636

Asn

Ser

Gly

Lys

Val

Ser

Glu

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

180

185

190

TTC

TGT

GAA

CGC

CAC

TTT

GGA

AGA

GAA

GTT

GTT

GAC

TAT

TTT

GTT

GAT

684

Phe

Cys

Glu

Arg

His

Phe

Gly

Arg

Glu

Val

Val

Asp

Tyr

Phe

Val

Asp

195

200

205

CCA

TTT

GTA

GCT

GGA

ACA

AGT

GCA

GGA

GAT

CCA

GAG

TCA

CTA

TCT

ATT

732

Pro

Phe

Val

Ala

Gly

Thr

Ser

Ala

Gly

Asp

Pro

Glu

Ser

Leu

Ser

Ile

210

215

220

CGT

CAT

GCA

TTC

CCA

GCA

TTG

TGG

AAT

TTG

GAA

AGA

AAG

TAT

GGT

TCA

780

Arg

His

Ala

Phe

Pro

Ala

Leu

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Lys

Tyr

Gly

Ser

225

230

235

GTT

ATT

GTT

GGT

GCC

ATC

TTG

TCT

AAG

CTA

GCA

GCT

AAA

GGT

GAT

CCA

828

Val

Ile

Val

Gly

Ala

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Ala

Ala

Lys

Gly

Asp

Pro

240

245

250

255

GTA

AAG

ACA

AGA

CAT

GAT

TCA

TCA

GGG

AAA

AGA

AGG

AAT

AGA

CGA

GTG

876

Val

Lys

Thr

Arg

His

Asp

Ser

Ser

Gly

Lys

Arg

Arg

Asn

Arg

Arg

Val

260

265

270

TCG

TTT

TCA

TTT

CAT

GGT

GGA

ATG

CAG

TCA

CTA

ATA

AAT

GCA

CTT

CAC

924

Ser

Phe

Ser

Phe

His

Gly

Gly

Met

Gln

Ser

Leu

Ile

Asn

Ala

Leu

His

275

280

285

AAT

GAA

GTT

GGA

GAT

GAT

AAT

GTG

AAG

CTT

GGT

ACA

GAA

GTG

TTG

TCA

972

Asn

Glu

Val

Gly

Asp

Asp

Asn

Val

Lys

Leu

Gly

Thr

Glu

Val

Leu

Ser

290

295

300

TTG

GCA

TGT

ACA

TTT

GAT

GGA

GTT

CCT

GCA

CTA

GGC

AGG

TGG

TCA

ATT

1020

Leu

Ala

Cys

Thr

Phe

Asp

Gly

Val

Pro

Ala

Leu

Gly

Arg

Trp

Ser

Ile

305

310

315

187 094

TCT GTT Ser Val 320

GAT Asp

TCG AAG

GAT AGC GGT GAC AAG GAC CCT GCT AGT AAAC

ACAA Gln 335

1050

Ser

Lys

Asp 325

Ser Gly

.AAsp

Lys Asp Leu 330

Ala

Ser

Asn

ACC

TTT

GAT

(GCT

GTT

ATA

ATC

AGA

GCT

CCCA

TTC

TTCA

AAAT

GTC

CCG

ACG

1115

Tho

Phe

Asp

Ala

Val

Ile

Met

Thr

AALa

Pro

Leu

Ser

AAsn

Val

AAog

AAog

340

335

330

ATG

AAG

TTC

ACC

AAA

CGT

CHA

GCT

CCTG

GTT

GGT

CCT

GAC

ACtc

CTT

CCCT

1154

Met

Lys

Phe

Thr

Lys

Gly

Gly

AALa

Pro

Val

Val

Leu

Asp

Phe

Leu

Pro

355

330

335

AAG

ATG

GAT

TAT

CTA

CCA

CTA

TCT

CC?C

ATC

GTG

ACT

AKT

ITT?

.AAG

AAAG

1212

Lys

Met

Asp

Tyr

Leu

Pro

Leu

Ser

Leu

Met

Val

TTro

AALa

Phe

Lys

Lys

370

335

330

GAT

GAT

GTC

AAG

AAAA

CCC?

CCT5

CGAA

AGA

ATT

AGG

GTC

ATFTA

ATA

CCCT

TAC

1250

Asp

Asp

Val

Lys

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ilu

Pro

Tyr

305

330

335

AAG

GAA

CAG

(CAA

AAAA

CCAT

AGT

ACTC

AAAA

ACC

CCT

AGG

ACT

CTC

ATTT

TCC

0308

Lys

Glu

Gln

Gln

LyS

His

Gly

Leu

Lys

ATro

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

400

405

44ΰ

445

TCA

ATG

ATG

TTC

CCA

AGAT

CCGA

GCT

CCCT

AGAT

AGC

ACAA

TAT

ATA

TTAT

A(CA

1353

Ser

Met

Met

Phe

Pro

AAsp

AArg

AALa

Pro

Asp

AAp

Gln

ATyo

Leu

Aiyr

Thr

420

442

440

ACA

TTT

GIT

TGH

GGT

AGC

CCAC

AAAT

AGA

AGAT

CTT

GCT

GGA

GCT

CCCA

ACG

1000

Thr

Phe

Val

Gly

Gly

Ser

His

AAjn

Arg

AAsp

Leu

Ala

Gly

AALa

Pro

Thr

435

440

444

TCT

ATT

CTC

GAAA

GAA

CCCT

GTC

ACCC

TCT

GAC

ACT

AAAA

AAAA

CTC

TTG

AGC

0403

Ser

lie

Leu

Lys

Gln

Leu

Val

Thr

SSr

AAsp

Llu

Lyy

Lyy

Llu

Leu

Gly

450

445

445

GTA

GAG

GCG

CCAA

C(CA

AAC?

ΊΓΤ

GTC

AAAG

AAT

GTA

TTA

ATG

AGA

AAAT

GCT

1500

Val

Glu

Gly

Gln

Pro

Thr

Pił

Val

Lys

Aii

Vv1

ACr

Tcp

Gly

Asn

Ala

455

447

447

TTT

CCT

TTG

TAT

AGC

CCAT

GAT

TAT

AGT

TTT

AGA

ATT

AGAA

ACT

ATA

GGAA

1008

Phe

Poo

Leu

Gtyr

Gly

His

CAs

ATso

Ser

Aer

AVl

Llu

du

Ala

Ali

Glu

400

440

440

445

AAG

ATG

GAG

AAA

AAC

ACT

CCCA

GGG

TTC

ATC

AAA

GGCA

gga

AAAT

AGC

AAAG

0053

Lys

Met

Glu

Lys

AAsn

Leu

Pro

Gly

PIir

AP.r

ATr

AAu

dy

Asn

Aer

Lys

500

550

550

GAT

gg

CTT

GCT

GGTT

AHA

AGT

GGT

ATA

ACT

TTCA

AGA

AAG

AAAG

GCT

GCT

1544

Asp

Gly

Leu

ALa

Val

Gly

Ser

AVl

Ili

AA a

Ae:e

Gly

Aee

Lys

Ala

Ala

515

552

552

GAC

CTT

GOC

ATC

T<CA

TAT

CCT

GAA

TTC?

CCAC

AAC

AAG

CAA

AAAT

AAAT

TTCA

0353

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

<Tso

Llu

Glu

SSr

Aii

ATr

Lyy

Hii

Asn

Asn

Ser

530

553

554

187 094

CAT CGΑΑΑ1CGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGΑCTTAT TTCTCCAGTT 1745

His

545

AACGCAAAGT	AGAAACAGAC	GCGITGCAGT	TCCAGAASAS	STTGACTTCT	CCAlACACCA	1105
ACCCTCAGCC	GAACATCAAC	CA¢TGATAGΓA	GTCAAATCGT	TAACTUAA	AATGAGGTTA	1185
TAAAACACCA	CGGCGGCAGA	aatgttcctt	TCCTTCTTCC	S(ASCAAAGTGG	ACCAAGACAC	11973
CCGΑCGTCGG	AAACACACCIC		AATCCTCTTA	GAAACACCATGC	GTGACGTGTA	1198
ACACCTGACT	ATTGTGATTT	TAGCAGTAGT	CΊ’TCGlCAGA	'CCATClA'ΠCΓA	AGCCTCTTAA	2005
AASAAAAASA	AAAAAA					2061

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 544 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 8:

Met 1

Leu

Ala

Leu

Thr 5

Ala

Ser

AH^a

Ser

Ser 10

AALa

Ser

Ser

His

Pito 11

Tyr

Arg

His

Ala

Ser 20

Ala

His

Thr

Arg

Arrg 22

Pro

TArg

Leu

AArg

Ala 30

Val

Leu

Ala

Met

Ala 35

Gly

Ser

Asp

Asp

Pro 40

Arg

Ala

Ala

Pro

Ala 4)5

Arg

Ser

Val

Ala

Val 50

Val

Gly

Ala

Gly

Val 55

Ser

Gly

Leu

Ala

Ala 60

Ala

Tyr

Arg

Leu

Arg 65

Gln

S ee

Gly

Val

.Asn 70

Val

Thr

Vsl

Phe

Glu 77

Al a

APa

Asp

Ars

AAa 80

Gly

Gly

Lys

lle

Arg 85

Thr

SAsn

Ser

Glu

Gly 90

Gly

Phe

Val

Trp

Ass 99

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr 100

Met

Thr

Glu

Gly

Glu 115

Trp

Glu

Ala

Ser

AArg m

Leu

lle

Asp

Asp

Leu 115

Gly

Leu

Gln

Asp

Lys 120

Gln

Gln

Tyr

Pro

Asn 125

Ser

Gln

His

Lys

Arg 130

Tyr

lle

Val

Lys

Asp 113

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu 140

lle

Pro

Ser

Asp

Pro 145

11l

S Sr

Leu

Met

Lys 150

SSr

Ser

VaS

Leu

Ser 1175

Thr

Lys

Ser

Lys

lle 160

187 094

AIi

Ueu

Phr

Phe

llu 165

Pro

Phe

Lru

Tyr

Lys 110

Lys

AIi

Asn

Thr

Arg 175

Asn

Srg

Gly

Lys

Val 180

Ser

Glu

Glu

Hie

Leu 115

Ser

Glu

Ser

Val

Gly 190

Ser

Phe

Cys

Glu

Arg 105

Hie

Phe

Gly

Arg

Glu 200

VaI

Val

Asp

Tyr

Phe 205

Val

Asp

Pro

Phr

Vil 210

Ala

Gly

Thr

Ser

Ala 215

Gly

Asp

Pro

Glu

Ser 220

Leu

Ser

Ile

Mg

His 225

AIi

Phe

Pro

Ala

Leu 230

Tgp

.Asn

Leu

Glu

Arg 223

Uys

Tyg

Gly

Ser

Val 240

Iie

Vil

Gly

Ma

Ile 245

Leu

Ser

Lys

Leu

ALa 220

ALa

Uys

Gly

Asp

Pro 255

Val

Uys

Thr

Arg

His 260

A3p

Ser

Ser

Gly

Lys 265

Arg

Mg

Asn

Mg

Mg 270

Val

Ser

Phe

Ser

Phe 275

His

Gly

Gly

Met

Gln 280

Ser

Leu

Ili

Asn

Ala 285

Leu

His

Asn

Glu

VaI 200

Gly

Asp

Asp

Asn

Val 2 95

Lys

Leu

CGI^y

Thr

llu 330

Val

Leu

Ser

Leu

Ali 305

Cys

nur

Phe

Asp

Gly 310

Vil

Pro

ALa

Leu

Gly 331

Arg

Τηο

Ser

Ile

Ser 320

Val

Asp

Ser

Lys

Asp 325

Ser

Gly

Asp

Lys

Asp 333

Llu

Ala

Ser

Asn

GIn 335

Thr

Phr

Asp

Ala

Val 340

Ile

Met

Tłrr

Ala

Pro 334

Lru

Ser

Asn

Val

Mg 350

Mg

Met

Lys

Phr

Thr 355

Lys

Gly

Gly

Ala

Pro 330

VaI

Val

Leu

Asp

Phe 336

Leu

Pro

Lys

Met

Asp 370

7yr

Leu

Pro

Leu

Ser 33i^

Leu

Met

Val

Thr

Ala 338

Phe

Lys

Lys

Asp

Asp 385

Vil

Lys

Lys

PrO

Leu 330

llu

Gly

Phe

Gly

Vai 330

Ueu

Ile

Pro

Tyr

Lys 400

GIu

GIn

Gln

Lys

His 405

Gly

Leu

Lys

Tłrr

Leu 441

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser 415

Ser

Met

Met

Phe

Pro 420

Asp

ATg

Ala

Pro

AAs 442

Asp

Gln

Tyr

Leu

Tg 440

Thr

Thr

Phr

Vil

Gly 435

Gly

Ser

His

Asn

Mg 440

Asp

Lru

Ma

GIy

Ma 445

Pro

Thr

Ser

lie

Lru 450

Lys

lln

Lru

Vil

Thg 455

Ser

Asp

Lru

Uys

Lys 460

Ueu

Ueu

Gly

Vil

187 094

Glu 465

Gly

Gln

Pro

Thr

Phe 470

Val

Lys

His

Val

Tyr 475

Trp

Gly

Asn

Ala

Phe 480

Pro

Leu

Tyr

Gly

His 485

Asp

Tyr

Ser

Ser

Val 490

Leu

Glu

Ala

Ile

Glu 495

Lys

Met

Glu

Lys

Asn 500

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe 505

Tyr

Ala

Gly

Asn

Ser 510

Lys

Asp

Gly

Leu

Ala 515

Val

Gly

Ser

Val

Ile 520

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys 525

Ala

Ala

Asp

Leu

Ala 530

Ile

Ser

Tyr

Leu

Glu 535

Ser

His

Thr

Lys

His 540

Asn

Asn

Ser

His

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1811 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Triticum aestivum (wheat) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-13 (NRRL B-21545) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 3..1589 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „Protox-1 wheat” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 9:

GC

GCA

ACA

ATG

GCC

ACC

GCC

ACC

GTC

GCG

GCC

GCG

TCG

CCG

CTC

CGC

Ala 1

Thr

Met

Ala

Thr 5

Ala

Thr

Val

Ala

Ala 10

Ala

Ser

Pro

Leu

Arg 15

GGC

AGG

GTC

ACC

GGG

CGC

CCA

CAC

CGC

GTC

CGC

CCG

CGT

TGC

GCT

ACC

Gly

Arg

Val

Thr

Gly 20

Arg

Pro

His

Arg

Val 25

Arg

Pro

Arg

Cys

Ala 30

Thr

GCG

AGC

AGC

GCG

ACC

GAG

ACT

CCG

GCG

GCG

CCC

GGC

GTG

CGG

CTG

TCC

Ala

Ser

Ser

Ala 35

Thr

Glu

Thr

Pro

Ala 40

Ala

Pro

Gly

Val

Arg 45

Leu

Ser

GCG

GAA

TGC

GTC

ATT

GTG

GGC

GCC

GGC

ATC

AGC

GGC

CTC

TGC

ACC

GCG

Ala

Glu

Cys 50

Val

Ile

Val

Gly

Ala 55

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu 60

Cys

Thr

Ala

143

191

187 094

CAG GCG CTG GCC ACC

CGA TAC GGC GTC AGC GAC CTG CTC GTC

ACG GAG Thr Glu

239

Gln Ala Leu 65

Ala

Thr

Arg

Tyr Gly 70

Val

Ser Asp Leu 75

Leu

Val

GCC

CGC

GAC

CGC

CCG

GGC

GGC

AAC

ATC

ACC

ACC

GTC

GAG

CGT

CCC

GAC

287

Ala

Arg

Asp

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn

Ile

Thr

Thr

Val

Glu

Arg

Pro

Asp

80

85

90

95

GAG

GGG

TAC

CTG

TGG

GAG

GAG

GGA

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

CCC

TCC

GAC

335

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

100

105

110

CCG

GTC

CTC

ACC

ATG

GCC

GTG

GAC

AGC

GGG

CTC

AAG

GAT

GAC

TTG

GTG

383

Pro

Val

Leu

Thr

Met

Ala

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp

Leu

Val

115

120

125

TTC

GGG

GAC

CCC

AAC

GCG

CCC

CGG

TTC

GTG

CTG

TGG

GAG

GGG

AAG

CTG

431

Phe

Gly Asp

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

Gly

Lys

Leu

130

135

140

AGG

CCG

GTG

CCG

TCG

AAG

CCA

GGC

GAC

CTG

CCT

TTC

TTC

AGC

CTC

ATG

479

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Pro

Gly Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Ser

Leu

Met

145

150

155

AGT

ATC

CCT

GGG

AAG

CTC

AGG

GCC

GGC

CTT

GGC

GCG

CTC

GGC

ATT

CGC

527

Ser

Ile

Pro

Gly

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

160

165

170

175

CCA

CCT

CCT

CCA

GGG

CGC

GAG

GAG

TCG

GTG

GAG

GAG

TTT

GTG

CGC

CGC

575

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly

Arg

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

180

185

190

AAC

CTC

GGT

GCC

GAG

GTC

TTT

GAG

CGC

CTC

ATC

GAG

CCT

TTC

TGC

TCA

623

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

195

200

205

GGT

GTA

TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCG

AAG

CTT

AGT

ATG

AAG

GCT

GCA

TTT

671

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

210

215

220

GGG

AAG

GTC

TGG

AGG

TTG

GAG

GAG

ATT

GGA

GGT

AGT

ATT

ATT

GGT

GGA

719

Gly

Lys

Val

Trp

Arg

Leu

Glu

Glu

Ile

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

225

230

235

ACC

ATC

AAG

GCG

ATT

CAG

GAT

AAA

GGG

AAG

AAC

CCC

AAA

CCG

CCA

AGG

767

Thr

Ile

Lys

Ala

Ile

Gln

Asp

Lys

Gly

Lys

Asn

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg

240

245

250

255

GAT

CCC

CGA

CTT

CCG

GCA

CCA

AAG

GGA

CAG

ACG

GTG

GCA

TCT

TTC

AGG

815

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Ala

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Ala

Ser

Phe

Arg

260

265

270

AAG

GGT

CTA

GCC

ATG

CTC

CCG

AAT

GCC

ATC

GCA

TCT

AGG

CTG

GGT

AGT

863

Lys

Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

Ile

Ala

Ser

Arg

Leu

Gly

Ser

275

280

285

187 094

AAA GTC

AAG CTC TG

TłTC (AA CCTł ACTC AGC AATł

ACCA (ACG TTr (ys 300

GCG GAC (AA

511

Lys

aal

Lys 250

Lsu

(Sr

Ττρ Lls

Leu 225

Thr

Ser

Ile

Ala

Asp

Asn

CAA

GGA

TATA

GTA

TTA

(TCT

TAT

(GAA

AG

CG

(GAC

(TCA

CCTT

GGTł

TCCA

GTG

555

Gin

Gly

Tyr

Vv1

Llu

Gly

irc

Glu

Thr

Ppo

Glu

GGl

Leu

Val

Ser

Val

005

3H

3H

CAG

GCT

A(AC

AGT

(GT

ATC

ATG

ACC

ATC

CCC

TG

(AT

GGTT

GCT

AGT

GAT

1007

Gin

Ala

Lys

Ser

Val

Ili;

Me^t

Thr

Ι’ε

Ppo

(Sr

(.r

Val

(ALa

Ser

Asp

020

302

300

300

ATC

TTG

CGC

CCC.

CTT

TCCA

AAT1

GT

GCA

GG

GAT

GG

CTC

TG

(AAA

TTC

1055

lie

Leu

Arg

Ppo

(su

(Sr

Ilie

Asp

Ala

(P’

As(

AA’

(Le

(Sr

Lys

PPh

040

304

300

TAT

TAT

CCG

CCCC

ggt

GCT

GCT

GTA

ACT

GGT’

TG

(TCT

CCCC

(AAC

GGAA

GCT

1100

Tyr

Tyr

Pro

Ppo

Val

Ala

Ala

Val

Thr

Val

(Sr

(yr

Pro

Lys

Glu

Ala

055

300

306

ATT

AGA

AAA

G(AC

TCC

TTA

ACTC

GT

(GTC

GG

CTC

GA

(TCT

(TTC

(TCC

GG

1151

lie

Arg

Lys

Glu

(ys

Leu

Ili:

Asp

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly

Phh

Gly

Gln

070

307

308

TTG

CAT

CCCC

(TCT

AGC

(CAC

(GGA

GTC

GG

ACT

ΤΓΑ

«TC

AG.

ATA

TAT

AGC

1155

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

ili

Tyr

SSr

085

300

305

TCT

TCT

CTC

CTTC

CCT

(AAT

CGT

GCT

CCT

GCT

GG

AGA

GGT3

TTA

(CTT

CTG

1247

Suo

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg

(ALa

Pro

Ala

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

400

4 05

441

445

AAC

TAT

ATC

CGTC

<TCT

TCT

AG

(ACT

AG

(GTC

ATC

GTC

TCC

(ACG

ACT

GAG

1255

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Thr

GG.’

Ι’ε

Val

SSr

Lys

Thr

Glu

420

442

440

AGT

GAC

TTA

GTA

(TCA

GC^CC

GTTT

GAC

CGT

GAC

CTC

AGA

(AAC

ATC

(T^G

ATA

1141

Suo

Asp

Leu

Val

Gly

Ala

Val

(Ap

(Arg

(Au

Leu

(Arg

Lys

Met

Leu

Ili

405

440

444

AAC

CCT

AGA

GG

(GCC

GC

CCT

(ΤΓΑ

GCCA

TTA

(GTC

GGTT

CGA

GTC

TCTC

CCCA

1101

Asn

Pro

Arg

ALa

Ala

(Asp

Pro

Leu

Ala

Llu

Gly

Val

(Arg

Val

Tło?

Pro

450

445

440

CAA

GCA

ATA

CCCA

(CAG

TTT

(TG

AATł

(GTC

CAC

(CTT

GAT

CGC

(CTT

GCT

GCT

1405

Gin

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

LeU

Ι’ε

Gly

Hii

Leu

(Asp

Arg

Leu

Ala

Ala

465

477

447

GCA

AAA

tct

GCCA

CTG

(GTC

(CAA

(TCC

(TCC

TTC

GAC

(GTC

TTG

TTC

CTA

(GGA

1487

Ala

Lys

Ser

ALa

Leu

Gly

Gln

Gly

Gly

(Tso

(Asp

Gly

Leu

Phe

LeU

Gly

480

485

440

445

GGA

AAC

TAC

GTC

GGA

GGA

GTTT

GCC

(TTG

(TCC

CGA

TGC

ATC

GAG

(TCT

GCG

1505

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

Gly

Arg

Cys

Ile

Glu

Gly

Ala

500

5d0

510

187 094

TAC GAG AGT GCC TCA CAA GTA TCT GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC 1583

Tyr Glu Ser ALi Ser Gln ViI Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr

515 520 525

ASl TGA TCGAAGTAGT GCATCTCTTC ATTTClTClA ATATACGAGG TCAGGCTAGG 116 3

Lys

ATClGTAAAA	AATCATGAGA	TTCTCTAGTC	CTTCTTTAAC	TGAAAAAACA	AATTCCAlTl	1699
ATCCAATATC	TCCTCTTTCC	TTCAGC'CClA	lCACGCAAAC	CGGTATGGGA	CAAAlCAGSA	1759
CAAlACACCC	CGAAAAAlCA	GCGACCTCCC	TTGAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AA	1811

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 528 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 10:

Ala 1

Thr

Mee

Ala

Tho 5

Ala

Thr

Val

AALa

AAl 10

Ala

Ser

Pro

Leu

ATg 11

Gly

Arg

Val

TTh

Gly 20

Aog

Pro

His

Arg

Val 25

AArg

Pro

AArg

Ccs

SAla 30

Thr

Ala

Ser

Ser

AAl. 35

Shr

Glu

Tho

Pro

Ala 40

AAl

Pro

Gly

Val

SArg 45

Leu

SSe

SALa

Glu

Cys 50

Val

lle

Val

Gly

Ala 55

Gly

lle

Ser

Gly

Leu 60

Ays

Thr

Ala

Gln

Ala 65

Leu

Ala

Thr

AArg

STt 77

Gly

Val

SSr

Asp

Leu 75

Leu

VaS

Thr

Glu

Ala 88

Arg

Asp

Arg

Pro

Gly 85

Sly

AAsn.

Ile

Thr

STor 90

Sv1

Glu

Arg

Pro

Asp 99

Glu

Gly

Tyr

Leu

TOp 100

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn 10S

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser 110

Asp

Pro

Val

Leu

Thr 115

Met

Ala

Val

Asp

Ser 10S

Gly

Leu

Lys

Asp

AAsp 115

Leu

Val

Phe

Gly

Asp 130

Pro

Asn

AALa

Pro

AOrg 13 S

Phe

Val

Leu

Trp

Glu 140

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro

ViI

Pro

Ser

Lys

Pro

Gly

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Ser

Leu

Met

Ser

145 15S 1^^5 160

187 094

Ile

Pro

Gly

Lys

Leu 165

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly 170

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg 175

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly 180

Arg

Glu

Glu

Ser

Val 185

Glu

Glu

Phe

Val

Arg 190

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala 195

Glu

Val

Phe

Glu

Arg 200

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe 205

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr 210

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser 215

Lys

Leu

Ser

Met

Lys 220

Ala

Ala

Phe

Gly

Lys 225

Val

Trp

Arg

Leu

Glu 230

Glu

Ile

Gly

Gly

Ser 235

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr 240

Ile

Lys

Ala

Ile

Gln 245

Asp

Lys

Gly

Lys

Asn 250

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg 255

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro 260

Ala

Pro

Lys

Gly

Gln 265

Thr

Val

Ala

Ser

Phe 270

Arg

Lys

Gly

Leu

Ala 275

Met

Leu

Pro

Asn

Ala 280

Ile

Ala

Ser

Arg

Leu 285

Gly

Ser

Lys

Val

Lys 290

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu 295

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys 300

Ala

Asp

Asn

Gln

Gly 305

Tyr

Val

Leu

Gly

Tyr 310

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly 315

Leu

Val

Ser

Val

Gln 320

Ala

Lys

Ser

Val

Ile 325

Met

Thr

Ile

Pro

Ser 330

Tyr

Val

Ala

Ser

Asp 335

Ile

Leu

Arg

Pro

Leu 340

Ser

Ile

Asp

Ala

Ala 345

Asp

Ala

Leu

Ser

Lys 350

Phe

Tyr

Tyr

Pro

Pro 355

Val

Ala

Ala

Val

Thr 360

Val

Ser

Tyr

Pro

Lys 365

Glu

Ala

Ile

Arg

Lys 370

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp 375

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly 380

Phe

Gly

Gln

Leu

His 385

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly 390

Val

Glu

Thr

Leu

Gly 395

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser 400

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn 405

Arg

Ala

Pro

Ala

Gly 410

Arg

Val

Leu

Leu

Leu 415

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly 420

Ser

Thr

Asn

Thr

Gly 425

Ile

Val

Ser

Lys

Thr 430

Glu

Ser

Asp

Leu

Val 435

Gly

Ala

Val

Asp

Arg 440

Asp

Leu

Arg

Lys

Met 445

Leu

Ile

Asn

Pro

Arg 450

Ala

Ala

Asp

Pro

Leu 455

Ala

Leu

Gly

Val

Arg 460

Val

Trp

Pro

Gln

187 094

Ala 465

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu 470

Ile

Gly

His

Leu

Asp 475

Arg

Leu

Ala

Ala

Ala 480

Lys

Ser

Ala

Leu

Gly 485

Gln

Gly

Gly

Tyr

Asp 490

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly 495

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala 500

Gly

Val

Ala

Leu

Gly 505

Arg

Cys

Ile

Glu

Gly 510

Ala

Tyr

Glu

Ser

Ala 515

Ser

Gln

Val

Ser

Asp 520

Phe

Leu

Thr

Lys

Tyr 525

Ala

Tyr

Lys

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1847 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: soybean (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-12 (NRRL B-21516) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 55..1683 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „protox-1 soybean” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 11:

CTTTAGCACA GTGTTGAAGA TAACGAACGA ATAGTGCCAT TACTGTAACC AACC ATG 57

Met

GTT TCC

GTC TTC

AAC GAG ATC CTA TTC

CCG CCG AAC

CAA ACC

CTT Leu

CTT Leu

105

Val

Ser

Val

Phe 5

Asn Glu

Ile

Leu Phe 10

Pro Pro

Asn

Gln

Thr 15

CGC

CCC

TCC

CTC

CAT

TCC

CCA

ACC

TCT

TTC

TTC

ACC

TCT

CCC

ACT

CGA

153

Arg

Pro

Ser

Leu

His

Ser

Pro

Thr

Ser

Phe

Phe

Thr

Ser

Pro

Thr

Arg

20

25

30

AAA

TTC

CCT

CGC

TCT

CGC

CCT

AAC

CCT

ATT

CTA

CGC

TGC

TCC

ATT

GCG

201

Lys

Phe

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Asn

Pro

Ile

Leu

Arg

Cys

Ser

Ile

Ala

35

40

45

187 094

GAG Glu 50

GAA TCC

ACC GCG TCT Thr Ala Ser 55

CCG Pro

CCC AAA ACC AGA GAC

TCC GCC

CCC Pro

GTG Val 65

249

Glu

Ser

Pro

Lys Thr

Arg 60

Asp

Ser

Ala

GAC

TGC

GTC

GTC

GTC

GGC

GGA

GGC

GTC

AGC

GGC

CTC

TGC

ATC

GCC

CAG

'2 97

Asp

Cys

Val

Val

Val

Gly

Gly

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

Gln

70

75

80

GCC

CTC

GCC

ACC

AAA

CAC

GCC

AAT

GCC

AAC

GTC

GTC

GTC

ACG

GAG

GCC

345

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Ala

Asn

Ala

Asn

Val

Val

Val

Thr

Glu

Ala

85

90

95

CGA

GAC

CGC

GTC

GGC

GGC

AAC

ATC

ACC

ACG

ATG

GAG

AGG

GAC

GGA

TAC

393

Arg

Asp

Arg

Val

Gly

Gly

Asn

Ile

Thr

Thr

Met

Glu

Arg

Asp

Gly

Tyr

100

105

110

CTC

TGG

GAA

GAA

GGC

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

CCT

TCT

GAT

CCA

ATG

CTC

441

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser

Asp

Pro

Met

Leu

115

120

125

ACC

ATG

GTG

GTG

GAC

AGT

GGT

TTA

AAG

GAT

GAG

CTT

GTT

TTG

GGG

GAT

489

Thr

Met

Val

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Asp

130

135

140

145

CCT

GAT

GCA

CCT

CGG

TTT

GTG

TTG

TGG

AAC

AGG

AAG

TTG

AGG

CCG

GTG

537

Pro

Asp

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Arg

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

150

155

160

CCC

GGG

AAG

CTG

ACT

GAT

TTG

CCT

TTC

TTT

GAC

TTG

ATG

AGC

ATT

GGT

585

Pro

Gly

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

Ser

Ile

Gly

165

170

175

GGC

AAA

ATC

AGG

GCT

GGC

TTT

GGT

GCG

CTT

GGA

ATT

CGG

CCT

CCT

CCT

633

Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

Pro

Pro

Pro

180

185

190

CCA

GGT

CAT

GAG

GAA

TCG

GTT

GAA

GAG

TTT

GTT

CGT

CGG

AAC

CTT

GGT

681

Pro

Gly

His

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

195

200

205

GAT

GAG

GTT

TTT

GAA

CGG

TTG

ATA

GAG

CCT

TTT

TGT

TCA

GGG

GTC

TAT

729

Asp

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

210

215

220

225

GCA

GGC

GAT

CCT

TCA

AAA

TTA

AGT

ATG

AAA

GCA

GCA

TTC

GGG

AAA

GTT

777

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Lys

Val

230

235

240

TGG

AAG

CTG

GAA

AAA

AAT

GGT

GGT

AGC

ATT

ATT

GGT

GGA

ACT

TTC

AAA

825

Trp

Lys

Leu

Glu

Lys

Asn

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Phe

Lys

245

250

255

GCA

ATA

CAA

GAG

AGA

AAT

GGA

GCT

TCA

AAA

CCA

CCT

CGA

GAT

CCG

CGT

873

Ala

Ile

Gln

Glu

Arg

Asn

Gly

Ala

Ser

Lys

Pro

Pro

Arg

Asp

Pro

Arg

260

265

270

187 094

CTG Leu

CCA Pro 275

AAA Lys

CCA AAA Pro Lys

GGT Gly

CAG ACT GTT GGA TCT TTC CGG AAG GGA

CTT Leu

921

Gln Thr 280

Val

Gly

Ser

Phe 285

Arg

Lys

Gly

ACC

ATG

TTG

CCT

GAT

GCA

ATT

TCT

GCC

AGA

CTA

GGC

AAC

AAA

GTA

AAG

969

Thr

Met

Leu

Pro

Asp

Ala

Ile

Ser

Ala

Arg

Leu

Gly

Asn

Lys

Val

Lys

290

295

300

305

TTA

TCT

TGG

AAG

CTT

TCA

AGT

ATT

AGT

AAA

CTG

GAT

AGT

GGA

GAG

TAC

1017

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

Ser

Lys

Leu

Asp

Ser

Gly

Glu

Tyr

310

315

320

AGT

TTG

ACA

TAT

GAA

ACA

CCA

GAA

GGA

GTG

GTT

TCT

TTG

CAG

TGC

AAA

1065

Ser

Leu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

Val

Ser

Leu

Gln

Cys

Lys

325

330

335

ACT

GTT

GTC

CTG

ACC

ATT

CCT

TCC

TAT

GTT

GCT

AGT

ACA

TTG

CTG

CGT

1113

Thr

Val

Val

Leu

Thr

Ile

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Thr

Leu

Leu

Arg

340

345

350

CCT

CTG

TCT

GCT

GCT

GCT

GCA

GAT

GCA

CTT

TCA

AAG

TTT

TAT

TAC

CCT

1161

Pro

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Lys

Phe

Tyr

Tyr

Pro

355

360

365

CCA

GTT

GCT

GCA

GTT

TCC

ATA

TCC

TAT

CCA

AAA

GAA

GCT

ATT

AGA

TCA

1209

Pro

Val

Ala

Ala

Val

Ser

Ile

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Ser

370

375

380

385

GAA

TGC

TTG

ATA

GAT

GGT

GAG

TTG

AAG

GGG

TTT

GGT

CAA

TTG

CAT

CCA

1257

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

Pro

390

395

400

CGT

AGC

CAA

GGA

GTG

GAA

ACA

TTA

GGA

ACT

ATA

TAC

AGC

TCA

TCA

CTA

1305

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser

Leu

405

410

415

TTC

CCC

AAC

CGA

GCA

CCA

CCT

GGA

AGG

GTT

CTA

CTC

TTG

AAT

TAC

ATT

1353

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

Pro

Pro

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

Tyr

Ile

420

425

430

GGA

GGA

GCA

ACT

AAT

ACT

GGA

ATT

TTA

TCG

AAG

ACG

GAC

AGT

GAA

CTT

1401

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Leu

Ser

Lys

Thr

Asp

Ser

Glu

Leu

435

440

445

GTG

GAA

ACA

GTT

GAT

CGA

GAT

TTG

AGG

AAA

ATC

CTT

ATA

AAC

CCA

AAT

1449

Val

Glu

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Ile

Leu

Ile

Asn

Pro

Asn

450

455

460

465

GCC

CAG

GAT

CCA

TTT

GTA

GTG

GGG

GTG

AGA

CTG

TGG

CCT

CAA

GCT

ATT

1497

Ala

Gln

Asp

Pro

Phe

Val

Val

Gly

Val

Arg

Leu

Trp

Pro

Gln

Ala

Ile

470

475

480

CCA

CAG

TTC

TTA

GTT

GGC

CAT

CTT

GAT

CTT

CTA

GAT

GTT

GCT

AAA

GCT

1545

Pro

Gln

Phe

Leu

Val

Gly

His

Leu

Asp

Leu

Leu

Asp

Val

Ala

Lys

Ala

485

490

495

187 094

TCA Suo

ATC AGA AAT Ile Ar. Ατη 500

AGG GGG GTTC Ghr Gly Phe

GAA Glu 505

CGG CTC GTCC CAT

CGG CGT GATT TAT

1153

Gly Lm

Phe

Leu

Gly Gly 510

Asn

iyr

GTG

TCT

GGT

AGA

GCC

GTTC

CGA

CCGG

TCGC

GGT?

CGTG

GGA

GCC

TAT

CGTG

GTA

1141

Val

Ser

G1g

Vv1

Ala

Leu

Gly

AArg

Cct

Vv1

Glu

Gly

Ala

CAyr

Glu

Val

515

520

525

GCA

TCT

TAA

TTA

AAC

TAT

TTT

CTC

ACA

AAT

AGA

GTG

TAC

AAA

1683

Ala

Ala

Glu

Val

Asn

Asp

Phe

Leu

Thr

Asn

Arg

Val

Tyr

Lys

530 535 540 tattagcatt τyτττyyyyy gttgttgaat ττGyτATτττ AcycycGyτy tccattgaat 1743

TATTATAATT TTAAAGyTTC TCAAATACGT TCTATATGAA TTTGGCGGCT TCTATTTCTG 1803

ATAATGTAAA ATCCACTTAA AGTTTTAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1847 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 543 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 12:

eet 1

Val

Ser

Val

Phe 5

Ατη

Glu

Ile

Leu

PLe 11

łh^o

Pro

oas

Gln

Thr 11

Leu

Leu

Arg

Pro

Ser 20

Leu

Hi i

Ser

Pro

Thr 22

Ssu

Phu

Phe

Thr

Ser 33

Ppo

TTh

Arg

Lys

Phe 35

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro 40

Asn

Pro

Ilu

Luu

Arg 44

Cys

Ser

Ile

Ala

Glu 50

Glu

Ser

Thr

Ala

Ser 55

Pro

Pro

Lys

Thr

Arg 60

Asp

Ser

Ala

Poo

Val 65

Asp

Cys

VaL

Val

Val 70

Gly

Gly Gly

VaL

Sur 75

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala 80

Gln

Ala

Leu

Ala

Thr 85

Lys

His

TUa

Asn

Ma 99

Asn

Val

Val

Val

Tłhr 99

GGu

Ala

Arg

Asp

Arg 100

Val

GGy

ciy

Asn

11 e 110

Thr

Thr

hot

GGu

AArg 110

Asp

Gly

Tyr

Leu

Trp 115

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn 120

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser 115

Asp

Poo

eet

Leu

Thr 130

eet

VaL

Val

Asp

Ser 135

Gly

Leu

Lys

Asp

Glu 140

Leu

Val

Leu

TLy

187 094

Asp 145

Pro

Mp Ala

Pro Arg Phr Val Leu Τη? 150

Mn Mg Lys 115

Leu

Mg

Pito 160

Vil

Pro

Gly

Lys

Leu

Tłrr

Asp

Leu

Pro

3^!^e

Phe

Mp

Iuuu

Met

Ser

11 e

165

117

115

Gly

GIy

Lys

IUe

Arg

Ma

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Mg

Pro

Pro

180

115

110

Pro

Pro

Gly

His

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Mg

Mg

Asn

Leu

105

200

225

GIy

Asp

Glu

VaI

Phe

Glu

Mg

Leu

lle

Glu

Pro

Phe

(Cs

Ser

Gly

Val

210

225

222

Tyg

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ma

Phe

Gly

Lys

225

230

223

240

Vil

Tgp

Lys

Leu

Glu

Lys

Asn

Gly

Gly

Ser

Ile

lle

Gly

Gly

Thr

Phe

245

220

255

Uys

Ala

Ile

Gln

Glu

Mg

Mn

Gly

Ma

Ser

Lys

Pro

Pro

Mg

Asp

Pro

260

226

220

Arg

Uru

Pro

Lys

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Mg

Lys

Gly

275

280

22^

Ueu

Thg

Met

Leu

Pro

Mp

Ma

11 e

Ser

Ma

Mg

Leu

Gly

Asn

Lys

Val

200

225

3(30

Lys

Uru

Ser

Trp

Lys

Leu

Sur

Ser

Ile

Ser

Lys

Ueu

Mp

Ser

Gly

Glu

305

310

331

320

Tyr

Ser

Leu

Thr

Tyg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

VaI

Ser

Leu

Gln

Cys

325

333

335

Uys

Thr

Val

VaI

Leu

TM

Ile

Pro

Ser

Tyg

Val

Ma

Ser

Thr

LeU

Leu

340

334

330

Arg

Pro

Leu

Srr

Ma

Ma

Ma

Ma

Mp

Ma

Ueu

Ser

Lys

Phe

TTg

Tyr

355

336

336

Pro

Pro

Val

Ma

Ma

Val

Ser

11

Srr

Tyge

Pro

Lys

Glu

Ala

11 Ii

Mg

370

337

338

Ser

Glu

(C<s

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

385

330

330

400

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly

Val

GIu

TM

Leu

Gly

TM

llu

Tyg

Ser

Ser

Ser

405

441

415

Leu

Phr

Pro

Asn

Mg

Ala

Pro

Pro

Gly

Mg

Val

Leu

Leu

Leu

Mn

erg

420

442

440

Ilr

Gly

Gly

AIi

Thr

Asn

Thg

GIy

1lr

Leu

Ser

Lys

Thr

Asp

Srr

Glu

435

440

445

187 094

Leu

Val 450

Glu

Tłrr

Val

Asp

AOg 455

Assp

Leu

AOg

Lys

Ile 460

Leu

Ile

Asn

Pro

Asn 060

Ala

Gln

Asp

Pro

Phe 470

Val

Val

Gly

Val

AOg 475

Leu

Trp

Pro

Gln

Ala 4S0

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu 405

Val

Gly

His

Leu

Asp 400

Leu

Leu

Asp

Val

Ma 405

Lys

Ala

Seo

Ile

Arg 500

Asn

Thr

Gly

Phe

Glu 505

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly 510

Gly

Asn

Tyr

Val

Ser 515

Gly

Val

Ala

Leu

Gly 520

AOg

Cys

Val

Glu

Gly 525

Ala

Tyr

Glu

VaL

All 530

Ala

Glu

Val

Asn

Asp 535

Phe

Leu

Tłoo

Asn

TAg 550

Val

Tyr

Lys

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 13:

(i) CHAFAKTTERYSTKA SEIW/ENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 583 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotor (B) POZYCJA: 1..583 (A) INNEINFORMARJE: /Cnkcjun „promotor protop-1 arab idopsis” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 13:

lAACTCAlAT	AlAATTATAC	AACTATCACA	AATTTGAATA	AlAATlCCΌA	CTTTTATTAA	50
AGAHTTTAA	TAAAlCTTll	TAATAATG!A	CTTCGACTTC	AAAACClATT	CCAAClTAAC	120
CAACCAATAT	TTAAACAAAA	ACTCHTCAC	CAATATTAAC	AAATTAATAT	ACTAAAAClT	100
TAATCClAAA	ATAAAAAACT	AATTCC:AAAC	AAAGGlTCAT	TACGATAAAC	ACGTATTlAA	240
CTTlACAAAl	AAAAlAAAAA	ATAATmTT	TAAAGlTTTΊ	HTTATACAT	lAAAAAAAAA	300
AAAAAAGlCT	TUCTATATA	TCTACTlGlC	CTATAACCAT	GTTATAAAAA	TTTGUCCTA	350
ACCAAAACAA	TAAAATAAAC	lTAAClGCAC	TTTTTATATT	TmTCAAAC	AAAACCCTAA	420
ACCCAAACCA	AAGAAAAAGC	ATACHTAd	GCACACAGAC	TTATGlTlCG	CGTlATTlCA	4θ0
lGClAATACT	TACAGCClCA	TTCCCCTCTC	TCAClAAlAA	lATTAACAAA	CCTGAAAAAA	540

AAAAAGAAlA CGACAAAATT CClAATTATA ClClATCCAC ATG

503

187 094 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3848 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotor (B) POZYCJA: 1..3848 (A) INNE INFORMACJE:/funkcja= „promotor protox-1 maize (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 14:

TCGATCTTTC	TAGGCTGATC	CCCAAATCTT	CCTCCGAAGC	CCCTGGCGCC	TCTGCCCCTT	60
GGAGCTGGTG	GCCTGAAAGA	GCTTTGCTGT	TGCCCCGAAG	ATTGTGAGGT	ATATTGTGAC	120
CTCTGAGACT	GACTTCCTTT	GTCGTCACTT	TGAGTGGAGT	TATGGATTGA	CCTGACGTGC	180
CTCAGATGGA	TTCTTCCTCC	GAAGCCCCTG	GTCATTTCGG	AGAATCTGTA	ATCTTATTCC	240
CTTCTTTGGC	GAAAATCTGT	CAGCTTGGAT	GTACTCATCC	ATCTTCTGAA	GCAGCTTCTC	300
CAGAGTTTGT	GGAGGCTTCC	TGGCGAAATA	TTGGGCTGTA	GGTCCTGGAC	GAAGACCCTT	360
GATCATGGCC	TCAATGACAA	TCTCATTGGG	CACCGTAGGC	GCTTGTGCCC	TCAATCGCAA	420
GAACCTTCGT	ACATATGCCT	GAAGGTATTC	TTCGTGATCT	TGTGTGCATT	GGAACAGAGC	480
CTGAGCTGTG	ACCGACTTCG	TTTGAAAGCC	TTGGAAGCTA	GTAACCAACA	TGTGCTTAAG	540
CTTCTGCCAC	GACGTGATAG	TCCCTGGCCG	AAGAGAAGAA	TACCATGTTT	GGGCTACATT	600
CCGGACTGCC	ATGACGAAGG	ACTTCGCCAT	GACTACAGTG	TTGACCCCAT	ACGAAGATAT	660
AGTTGCTTCG	TAGCTCATCA	GAAACTGCTT	TGGATCTGAG	TGCCCATCAT	ACATGGGGAG	720
CTGAGGTGGC	TTGTATGATG	GGGGCCATGG	GGTAGCCTGC	AGTTCTGCTG	CCAAGGGAGA	780
AGCATCATCA	AAAGTAAAGG	CATCATGATT	AAAATCATCA	TACCATCCAT	CCTCGTTGAA	840
TAAGCCTTCT	TGACGAAGCT	CCCTGTGTTG	GGGCCTTCGA	TCTTGTTCAT	CTTGAACAAG	900
ATGACGCACT	TCTTCAGTGG	CTTCGTCGAT	CTTTCTTTGG	AGATCAGCCA	GTCGCACCAT	960
CTTCTCCTTC	TTTCTTTGTA	CTTGTTGATG	GATGATCTCC	ATGTCCCTGA	TCTCTTGGTC	1020
CAACTCCTCC	TCTTGGAGTG	TCAGACTGGT	GGCTTTCCTC	TTCTGGCTTC	GAGCCTCTCG	1080

AAGAGAAAGA GTTTCTTGAT TTGGGTCCAG CGGCTGCAGT GCAGTGGTCC CTGGTGCTGA 1140

187 094

AGCTTTCTTC GGTGGCATGA CAAAGGTCAG TGCTTGCCGA AGGTGGTCGA AAAGGGTTCA 1200
CTAGAGGTGG	GAGCCAATGT	TGGGGACTTC	TCAAGTGCTA	TGAGTTAAGA	ACAAGGCAAC	1260
ACAAAATGTT	AAATATTAAT	agctttcatc	TTTCGAAGCA	TTATTTCCCT	TTGGGTATAA	1320
tgatcttcag	ACGAAAGAGT	CCTTCATCAT	TGCGATATAT	GTTAATAGAA	GGAGGAGCAT	1380
ATGAAATGTA	AGAGACAACA	TGAACAATCG	TGTAGCATTG	TTAATTCATC	ATCATTTTAT	1440
TATTATGGAA	AAATAGAAAC	AATATTGAAT	TACAAATGTA	CCTTTGGCTT	GACAGAAGAT	1500
AAAAGTACAA	GCTTGACGCA	CGAGCAAGTA	CAAGTCAGTG	TGAACAGTAC	GGGGGTACTG	1560
TTCATCTATT	TATAGGCACA	GGACACAGCC	TGTGAGAAAT	TACAGTCATG	CCCTTTACAT	1620
TTACTATTGA	CTTATAGAAA	AATCTATGAG	GACTGGATAG	CCTTTTCCCC	TTTAAGTCGG	1680
TGCCTTTTTC	CGCGATTAAG	CCGAATCTCC	CTTGCGCATA	GCTTCGGAGC	ATCGGCAACC	1740
TTCGTCACGA	TCATGCCCTT	CTCATTGTGT	ATGCTTTTAA	TCCTGAATTC	GAAGGTACCT	1800
GTCCATAAAC	CATACTTGGA	AGACATTGTT	AAATTATGTT	TTTGAGGACC	TTCGGAGGAC	1860
GAAGGCCCCC	AACAGTCGTG	TTTTTGAGGA	CCTTCGGAAG	ATGAAGGCCC	CCAACAAGAC	1920
CTATCCATAA	AACCAACCTA	TCCACAAAAC	CGACCCCATT	CACCCTTCAT	TTGCCTCACC	1980
AACAACCCTA	ATTAGGTTGT	TGGTTTAAAT	TTTTTAGGGT	CAATTTGGTC	ATCACCATCC	2040
ACTGTCACTC	CACAAACTCA	ATATCAATAA	ACAGACTCAA	TCACCCAAAC	TGACCATACC	2100
CATAAAACCG	CCCCACCCTT	CTAGCGCCTC	GCCAGAAACC	AGAAACCCTG	ATTCAGAGTT	2160
CAAACTTAAA	ACGACCATAA	CTTTCACCTT	GGAACTCGAA	TCAGGTCCAT	TTTTTTCCAA	2220
ATCACACAAA	ATTAAATTTC	GCATCCGATA	ATCAAGCCAT	CTCTTCACTA	TGGTTTTAAG	2280
TGTTGCTCAC	ACTAGTGTAT	TTATGGACTA	ATCACCTGTG	TATCTCATAC	AATAACATAT	2340
CAGTACATCT	AAGTTGTTAC	TCAATTACCA	AAACCGAATT	ATAGCCTTCG	AAAAAGGTTA	2400
TCGACTAGTC	ACTCAATTAC	CAAAACTAAA	CTTTAGACTT	TCATGTATGA	CATCCAACAT	2460
GACACTGTAC	TGGACTAAAC	CACCTTTCAA	GCTACACAAG	GAGCAAAAAT	AACTAATTTT	2520
CGTAGTTGTA	GGAGCTAAAG	TATATGTCCA	CAACAATAGT	TAAGGGAAGC	CCCCAAGGAC	2580
TTAAAAGTCC	TTTTACCTCT	TGAAACTTTT	GTCGTGGTCT	actttttcac	TTTAAACTTC	2640
AAAATTTGAC	attttatcac	CCCTTAACTC	TTAAAACCAT	TTAAATTACA	TTCTTACTAG	2700
ATTATAGATG	ATTTTGTTGT	GAAAAGTTTT	TAAGACATGT	TTACACATTG	ATTAAAATCA	2760
TTTGTTCAAT	TTCCTAGAGT	TAAATCTAAT	CTTATTAAAA	CTATTAGAGA	TACTTTCACG	2820

AGCTCTAAAT ATTTTTATTT TTTCATTATG GAATTTTGTT AGAATTCTTA TAGACCTTTT 2880

187 094

TTTGTGGTTT	ATAAGCCTAT	CCTTGTTTTT	AACTTTTTTA	TTTTCTTTTT	TTTTAAATTT	2940
TCTTGGAAAC	GACTTCTATC	CCTGTAGAAT	TTTAATTTTG	CTACACTTTT	TTCTTCTACA	3000
ATATCAACTA	TTGATATTGT	CTTTGTTTCT	ACCTCTTTCC	CGGTTTTTTG	attattattg	3060
TTTATTAAAC	GAACTTTCGT	AATCTCCCAT	CATTTGTCTA	TTATTGTTGT	TTTTGATTCA	3120
TATGAATAAT	CCCATTAGTT	AATCATATTG	GTTTCAGTTT	TTATGTTTTT	TTTTATAAGT	3180
TTTATGGGAA	GTTATGACCA	TTTCTGTAGT	TCACAGAGTT	AAAATGGTTT	TTTTTTTCTT	3240
aaatattttt	GCTTCATTTT	ATCCTGTGCC	TCTATTTCTG	CCTGCAACCA	TGTCCTTGTT	3300
CAATATCGAA	CATGGCCCTC	TTCACCCGTG	GCCCTTCTTG	CGAAGCATTT	CTTGTTCATT	3360
CTTTGAGATG	TTTTTGTTTT	CTTCTTTTCC	AATCTCTCTC	TGCTTTGCGT	TTCCCTTCCC	3420
ACCTTTTTCT	TACCTTTTGG	CCTTCCTTTT	CTCCTAGCCC	TTCTGCCCTA	CCCCTTCTCT	3480
TCGTGTCATC	GACACCGCCT	CACATGCGCA	CAGCTCCGCA	ACTCCGCCGG	TATTGTTCGC	3540
CTCCACAGCC	TCCGCCTTTG	CCACCGCTGC	TTCGCCGCTA	CTCAACTTTT	CCCGAATACC	3600
TTCTCGGCTC	CGCCTTCTAT	TTCACAGCGT	TCTCTGCGCT	GCTGTTTCGT	TCGTCGCTTC	7000
CGATGCTCCG	GCTTCCTCCT	TCGCTCTGCA	GTCCGCGGTC	TGCTTTTTTT	TTTTCGTAGT	3720
CATCTTTTGC	CTCTTCTCCG	CGCATTCTCT	GGCCTCGCGG	CACTGCTTCG	TTTTCGTGCT	3780
TGTCACTGAG	GCCCGCGCCC	TCCCCGGCGG	CTTCTTTTCC	ACCGTCGATC	GCCCCGAGGT	3840
ATGTTTCC						3848

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1826 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Gossypium hirsutum (bawełna) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-15 (NRRL B-21594) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature

187 094 (B) POZYCJA: 31..1647 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „obszar kodujący protox-1 bawełny” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 15:

CCTCTCGCTC	GCCTGGCCCC	ACCACCAATC	ATGACGGCTC	TAATCGACCT	TTCTCTTCTC	60
CGTTCCTCGC	CCTCCGTTTC	CCCTTTCTCC	ATACCCCACC	ACCAGCATCC	GCCCCGCTTT	120
CGTAAACCTT	TCAAGCTCCG	ATGCTCCCTC	GCCGAGGGTC	CCACGATTTC	CTCATCTAAA	180
ATCGACGGGG	GAGAATCATC	CATCGCGGAT	TGCGTCATCG	TTGGAGGTGG	TATCAGTGGA	240
CTTTGCATTG	CTCAAGCTCT	CGCCACCAAG	CACCGTGACG	TCGCTTCCAA	TGTGATTGTG	300
ACGGAGGCCA	GAGACCGTGT	TGGTGGCAAC	ATCACTACCG	TTGAGAGAGA	TGGATATCTG	360
TGGGAAGAAG	GCCCCAACAG	TTTTCAGCCC	TCCGATCCTA	TTCTAACCAT	GGCCGTGGAT	420
AGTGGATTGA	AGGACGATTT	GGTTTTAGGT	GACCCTAATG	CACCGCGATT	TGTACTATGG	480
GAGGGAAAAC	TAAGGCCTGT	GCCCTCCAAG	CCAACCGACT	TGCCGTTTTT	TGATTTGATG	540
AGCATTGCTG	GAAAACTTAG	GGCTGGGTTC	GGGGCTATTG	GCATTCGGCC	TCCCCCTCCG	600
GGTTATGAAG	AATCGGTGGA	GGAGTTTGTG	CGCCGTAATC	TTGGTGCTGA	ggtttttgaa	660
CGCTTTATTG	AACCATTTTG	TTCAGGTGTT	TATGCAGGGG	ATCCTTCAAA	ATTAAGCATG	720
AAAGCAGCAT	TTGGAAGAGT	ATGGAAGCTA	GAAGAGATTG	GTGGCAGCAT	CATTGGTGGC	780
ACTTTCAAGA	CAATCCAGGA	GAGAAATAAG	ACACCTAAGC	CACCCAGAGA	CCCGCGTCTG	840
CCAAAACCGA	AGGGCCAAAC	AGTTGGATCT	TTTAGGAAGG	GACTTACCAT	GCTGCCTGAG	900
GCAATTGCTA	ACAGTTTGGG	TAGCAATGTA	AAATTATCTT	GGAAGCTTTC	CAGTATTACC	960
AAATTGGGCA	ATGGAGGGTA	TAACTTGACA	TTTGAAACAC	CTGAAGGAAT	GGTATCTCTT	1020
CAGAGTAGAA	GTGTTGTAAT	GACCATTCCA	TCCCATGTTG	CCAGTAACTT	GTTGCATCCT	1080
CTCTCGGCTG	CTGCTGCAGA	TGCATTATCC	CAATTTTATT	ATCCTCCAGT	TGCATCAGTC	1140
ACAGTCTCCT	ATCCAAAAGA	AGCCATTCGA	AAAGAATGTT	TGATTGATGG	TGAACTTAAG	1200
GGGTTTGGCC	AGTTGCACCC	ACGCAGCCAA	GGAATTGAAA	CTTTAGGGAC	GATATACAGT	1260
TCATCACTTT	TCCCCAATCG	AGCTCCATCT	GGCAGGGTGT	TGCTCTTGAA	CTACATAGGA	1320
GGAGCTACCA	ACACTGGAAT	TTTGTCCAAG	ACTGAAGGGG	AACTTGTAGA	AGCAGTTGAT	1380
CGTGATTTGA	GAAAAATGCT	TATAAATCCT	AATGCAAAGG	ATCCTCTTGT	TTTGGGTGTA	1440
AGAGTATGGC	CAAAAGCCAT	TCCACAGTTC	TTGGTTGGTC	ATTTGGATCT	CCTTGATAGT	1500

GCAAAAATGG CTCTCAGGGA TTCTGGGTTT CATGGACTGT TTCTTGGGGG CAACTATGTA 1560

187 094

TCTGGTGTGG CATTAGGACG GTGTGTGGAA GGTGCTTACG AGGTTGCAGC TGAAGTGAAG

GAATTCCTGT CACAATATGC ATACAAATAA TATTGAAATT CTTGTCAGGC TGCAAATGTA

GAAGTCAGTT ATTGGATAGT ATCTCTTTAG CTAAAAAATT GGGTAGGGTT TTTTTTGTTA

GTTCCTTGAC CACTTTTTGG GGTTTTCATT AGAACTTCAT ATTTGTATAT CATGTTGCAA

TATCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 539 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany

1620

1680

1740

1800

1826 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 16:

Met 1

Thr

Ala

Leu

Ile 5

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu 10

Arg

Ser

Ser

Pro

Ser 15

Val

Ser

Pro

Phe

Ser 20

Ile

Pro

His

His

Gln 25

His

Pro

Pro

Arg

Phe 30

Arg

Lys

Pro

Phe

Lys 35

Leu

Arg

Cys

Ser

Leu 40

Ala

Glu

Gly

Pro

Thr 45

Ile

Ser

Ser

Ser

Lys 50

Ile

Asp

Gly

Gly

Glu 55

Ser

Ser

Ile

Ala

Asp 60

Cys

Val

Ile

Val

Gly 65

Gly

Gly

Ile

Ser

Gly 70

Leu

Cys

Ile

Ala

Gln 75

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys 80

His

Arg

Asp

Val

Ala 85

Ser

Asn

Val

Ile

Val 90

Thr

Glu

Ala

Arg

Asp 95

Arg

Val

Gly

Gly

Asn 100

Ile

Thr

Thr

Val

Glu 105

Arg

Asp

Gly

Tyr

Leu 110

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro 115

Asn

Ser

Phe

Gln

Pro 120

Ser

Asp

Pro

Ile

Leu 125

Thr

Met

Ala

Val

Asp 130

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp 135

Asp

Leu

Val

Leu

Gly 140

Asp

Pro

Asn

Ala

Pro 145

Arg

Phe

Val

Leu

Trp 150

Glu

Gly

Lys

Leu

Arg 155

Pro

Val

Pro

Ser

Lys 160

Pro

Thr

Asp

Leu

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu

Met

Ser

Ile

Ala

Gly

Lys

Leu

165 170 175

187 094

Arg Ala Gly Phe

Gly

Ala Ile Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro

Gly Tyr

180

185

190

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Phe

Val

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

195

200

205

Phe

Glu

Arg

Phe

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

210

215

220

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Arg

Val

Trp

Lys

Leu

225

230

235

240

Glu

Glu

Ile

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Phe

Lys

Thr

Ile

Gln

245

250

255

Glu

Arg

Asn

Lys

Thr

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

260

265

270

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

Thr

Met

Leu

275

280

285

Pro

Glu

Ala

Ile

Ala

Asn

Ser

Leu

Gly

Ser

Asn

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

290

295

300

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

Thr

Lys

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Tyr

Asn

Leu

Thr

305

310

315

320

Phe

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Met

Val

Ser

Leu

Gln

Ser

Arg

Ser

Val

Val

325

330

335

Met

Thr

Ile

Pro

Ser

His

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Leu

His

Pro

Leu

Ser

340

345

350

Ala

Ala

Ala

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Gln

Phe

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

355

360

365

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Lys

Glu

Cys

Leu

370

375

380

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Gln

385

390

395

400

Gly

Ile

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

405

410

415

Arg

Ala

Pro

Ser

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ala

420

425

430

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Leu

Ser

Lys

Thr

Glu

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

435

440

445

Val

Asp

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

Asn

Pro

Asn

Ala

Lys

Asp

450

455

460

Pro

Leu

Val

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Trp

Pro

Lys

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

465

470

475

480

187 094

Leu

Val

Gly

His

Leu 485

Asp

Leu

Leu

Asp

Ser Ala 490

Lys

Met

Ala

Leu 495

Arg

Asp

Ser

Gly

Phe 500

His

Gly

Leu

Phe

Leu 505

Gly Gly

Asn

Tyr

Val 510

Ser

Gly

Val

Ala

Leu 515

Gly

Arg

Cys

Val

Glu 520

Gly Ala Tyr

Glu

Val 525

Ala

Ala

Glu

Val

Lys 530

Glu

Phe

Leu

Ser

Gln 535

Tyr

Ala

Tyr Lys

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1910 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE <vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (burak cukrowy) <vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-16 (NRRL B-21595N) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..1680 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „obszar kodujący protox-1 buraka cukrowego” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 17:

ATGAAATCAA	TGGCGTTATC	AAACTGCATT	CCACAGACAC	AGTGCATGCC	ATTGCGCAGC	60
AGCGGGCATT	ACAGGGGTAA	TTGTATCATG	TTGTCAATTC	CATGTAGTTT	AATTGGAAGA	120
CGAGGTTATT	ATTCACATAA	GAAGAGGAGG	ATGAGCATGA	GTTGCAGCAC	AAGCTCAGGC	180
TCAAAGTCAG	CGGTTAAAGA	AGCAGGATCA	GGATCAGGTG	CAGGAGGATT	GCTAGACTGC	240
GTAATCGTTG	GAGGTGGAAT	TAGCGGGCTT	TGCATCGCGC	AGGCTCTTTG	TACAAAACAC	300
TCCTCTTCCT	CTTTATCCCC	AAATTTTATA	GTTACAGAGG	CCAAAGACAG	AGTTGGCGGC	360
AACATCGTCA	CTGTGGAGGC	CGATGGCTAT	ATCTGGGAGG	AGGGACCCAA	TAGCTTCCAG	420
CCTTCCGACG	CGGTGCTCAC	CATGGCGGTC	GACAGTGGCT	TGAAAGATGA	GTTGGTGCTC	480

187 094

GGAGATCCCA	ATGCTCCTCG	CTTTGTGCTA	TGGAATGACA	AATTAAGGCC	CGTACCTTCC	540
AGTCTCACCG	ACCTCCCTTT	CTTCGACCTC	ATGACCATTC	CGGGCAAGAT	TAGGGCTGCT	600
CTTGGTGCTC	TCGGATTTCG	CCCTTCTCCT	CCACCTCATG	AGGAATCTGT	TGAACACTTT	660
GTGCGTCGTA	ATCTCGGAGA	TGAGGTCTTT	GAACGCTTGA	TTGAACCCTT	TTGTTCAGGT	720
GTGTATGCCG	GTGATCCTGC	CAAGCTGAGT	ATGAAAGCTG	CTTTTGGGAA	GGTCTGGAAG	780
TTGGAGCAAA	AGGGTGGCAG	CATAATTGGT	GGCACTCTCA	AAGCTATACA	GGAAAGAGGG	840
AGTAATCCTA	AGCCGCCCCG	TGACCAGCGC	CTCCCTAAAC	CAAAGGGTCA	GACTGTTGGA	900
TCCTTTAGAA	AGGGACTCGT	TATGTTGCCT	ACCGCCATTT	CTGCTCGACT	TGGCAGTAGA	960
GTGAAACTAT	CTTGGACCCT	TTCTAGTATC	GTAAAGTCAC	TCAATGGAGA	ATATAGTCTG	1020
ACTTATGATA	CCCCAGATGG	CTTGGTTTCT	GTAAGAACCA	AAAGTGTTGT	GATGACTGTT	1080
CCATCATATG	TTGCAAGTAG	GCTTCTTCGT	CCACTTTCAG	ACTCTGCTGC	AGATTCTCTT	1140
TCAAAATTTT	ACTATCCACC	AGTTGCAGCA	GTGTCACTTT	CCTATCCTAA	AGAAGCGATC	1200
AGATCAGAAT	GCTTGATTAA	TGGTGAACTT	CAAGGTTTCG	GGCAACTACA	TCCCCGCAGT	1260
CAGGGTGTGG	AAACCTTGGG	AACAATTTAT	AGTTCGTCTC	TTTTCCCTGG	TCGAGCACCA	1320
CCTGGTAGGA	TCTTGATCTT	GAGCTACATC	GGAGGTGCTA	AAAATCCTGG	CATATTAAAC	1380
AAGTCGAAAG	ATGAACTTGC	CAAGACAGTT	GACAAGGACC	TGAGAAGAAT	GCTTATAAAT	1440
CCTGATGCAA	AACTTCCTCG	TGTACTGGGT	GTGAGAGTAT	GGCCTCAAGC	AATACCCCAG	1500
TTTTCTATTG	GGCACTTTGA	TCTGCTCGAT	GCTGCAAAAG	CTGCTCTGAC	AGATACAGGG	1560
GTCAAAGGAC	TGTTTCTTGG	TGGCAACTAT	GTTTCAGGTG	TTGCCTTGGG	GCGGTGTATA	1620
GAGGGTGCTT	ATGAGTCTGC	AGCTGAGGTA	GTAGATTTCC	TCTCACAGTA	CTCAGACAAA	1680
TAGAGCTTCA	GCATCCTGTG	TAATTCAACA	CAGGCCTTTT	TGTATCTGTT	GTGCGCGCAT	1740
GTAGTCTGGT	CGTGGTGCTA	GGATTGATTA	GTTGCTCTGC	TGTGTGATCC	ACAAGAATTT	1800
TGATGGAATT	TTTCCAGATG	TGGGCATTAT	ATGTTGCTGT	CTTATAAATC	CTTAATTTGT	1860
ACGTTTAGTG	AATTACACCG	CATTTGATGA	CTAAAAAAAA	AAAAAAAAAA		1910

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 560 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany

187 094 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 18:

Met 1

Lys

Ser

Met

Ala 5

Leu

Ser

Asn

Cys

Ile 10

Pro

Gln

Thr

Gln

Cys 15

Met

Pro

Leu

Arg

Ser 20

Ser

Gly

His

Tyr

Arg 25

Gly

Asn

Cys

Ile

Met 30

Leu

Ser

Ile

Pro

Cys 35

Ser

Leu

Ile

Gly

Arg 40

Arg

Gly

Tyr

Tyr

Ser 45

His

Lys

Lys

Arg

Arg 50

Met

Ser

Met

Ser

Cys 55

Ser

Thr

Ser

Ser

Gly 60

Ser

Lys

Ser

Ala

Val 65

Lys

Glu

Ala

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Ala

Gly 75

Gly

Leu

Leu

Asp

Cys 80

Val

Ile

Val

Gly

Gly 85

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu 90

Cys

Ile

Ala

Gln

Ala 95

Leu

Cys

Thr

Lys

His 100

Ser

Ser

Ser

Ser

Leu 105

Ser

Pro

Asn

Phe

Ile 110

Val

Thr

Glu

Ala

Lys 115

Asp

Arg

Val

Gly Gly 120

Asn

Ile

Val

Thr

Val 125

Glu

Ala

Asp

Gly

Tyr 130

Ile

Trp

Glu

Glu

Gly 135

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln 140

Pro

Ser

Asp

Ala

Val 145

Leu

Thr

Met

Ala

Val 150

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys 155

Asp

Glu

Leu

Val

Leu 160

Gly

Asp

Pro

Asn

Ala 165

Pro

Arg

Phe

Val

Leu 170

Trp

Asn

Asp

Lys

Leu 175

Arg

Pro

Val

Pro

Ser 180

Ser

Leu

Thr

Asp

Leu 185

Pro

Phe

Phe

Asp

Leu 190

Met

Thr

Ile

Pro

Gly 195

Lys

Ile

Arg

Ala

Ala 200

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly 205

Phe

Arg

Pro

Ser

Pro 210

Pro

Pro

His

Glu

Glu 215

Ser

Val

Glu

His

Phe 220

Val

Arg

Arg

Asn

Leu 225

Gly

Asp

Glu

Val

Phe 230

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu 235

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly 240

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp 245

Pro

Ala

Lys

Leu

Ser 250

Met

Lys

Ala

Ala

Phe 255

Gly

Lys

Val

Trp

Lys 260

Leu

Glu

Gln

Lys

Gly 265

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly 270

Gly

Thr

Leu Lys Ala Ile Gln Glu Arg Gly Ser Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp 275 280 285

187 094

Gln

Arg 290

Leu

Pro

Lys

Pro

Lys 295

Gly

Gln

Thr

Val

Gly 300

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly 305

Leu

Val

Met

Leu

Pro 310

Thr

Ala

Ile

Ser

Ala 315

Arg

Leu

Gly

Ser

Arg 320

Val

Lys

Leu

Ser

Trp 325

Thr

Leu

Ser

Ser

Ile 330

Val

Lys

Ser

Leu

Asn 335

Gly

Glu

Tyr

Ser

Leu 340

Thr

Tyr

Asp

Thr

Pro 345

Asp

Gly

Leu

Val

Ser 350

Val

Arg

Thr

Lys

Ser 355

Val

Val

Met

Thr

Val 360

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala 365

Ser

Arg

Leu

Leu

Arg 370

Pro

Leu

Ser

Asp

Ser 375

Ala

Ala

Asp

Ser

Leu 380

Ser

Lys

Phe

Tyr

Tyr 385

Pro

Pro

Val

Ala

Ala 390

Val

Ser

Leu

Ser

Tyr 395

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile 400

Arg

Ser

Glu

Cys

Leu 405

Ile

Asn

Gly

Glu

Leu 410

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln 415

Leu

His

Pro

Arg

Ser 420

Gln

Gly

Val

Glu

Thr 425

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr 430

Ser

Ser

Ser

Leu

Phe 435

Pro

Gly

Arg

Ala

Pro 440

Pro

Gly

Arg

Ile

Leu 445

Ile

Leu

Ser

Tyr

Ile 450

Gly

Gly

Ala

Lys

Asn 455

Pro

Gly

Ile

Leu

Asn 460

Lys

Ser

Lys

Asp

Glu 465

Leu

Ala

Lys

Thr

Val 470

Asp

Lys

Asp

Leu

Arg 475

Arg

Met

Leu

Ile

Asn 480

Pro

Asp

Ala

Lys

Leu 485

Pro

Arg

Val

Leu

Gly 490

Val

Arg

Val

Trp

Pro 495

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln 500

Phe

Ser

Ile

Gly

His 505

Phe

Asp

Leu

Leu

Asp 510

Ala

Ala

Lys

Ala

Ala 515

Leu

Thr

Asp

Thr

Gly 520

Val

Lys

Gly

Leu

Phe 525

Leu

Gly

Gly

Asn

Tyr 530

Val

Ser

Gly

Val

Ala 535

Leu

Gly

Arg

Cys

Ile 540

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu

Ser

Ala

Ala

Glu

Val

Val

Asp

Phe

Leu

Ser

Gln

Tyr

Ser

Asp

Lys

545 550 555 560 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1784 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy

187 094 (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Brasica napus (rzepak) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-17 (NRRL B-21615) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 47..1654 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „obszar kodujący protox-1 rzepaku” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 19:

GGGCCCCCCC	CAAAATTGAG	GATTCTCCTT	CTCGCGGGCG	ATCGCCATGG	ATTTATCTCT	60
TCTCCGTCCG	CAGCCATTCC	TATCGCCATT	CTCAAATCCA	TTTCCTCGGT	CGCGTCCCTA	120
CAAGCCTCTC	AACCTCCGTT	GCTCCGTATC	CGGTGGATCC	GTCGTCGGCT	CTTCTACAAT	180
CGAAGGCGGA	GGAGGAGGTA	AAACCGTCAC	GGCGGACTGC	GTGATCGTCG	GCGGAGGAAT	240
CAGCGGCCTG	TGCATTGCGC	AAGCGCTCGT	GACGAAGCAC	CCAGACGCTG	CAAAGAATGT	300
GATGGTGACG	GAGGCGAAGG	ACCGTGTGGG	AGGGAATATC	ATCACGCGAG	AGGAGCAAGG	360
GTTTCTATGG	GAAGAAGGTC	CCAATAGCTT	TCAGCCGTCT	GATCCTATGC	TCACTATGGT	420
GGTAGATAGT	GGTTTGAAAG	ATGATCTAGT	CTTGGGAGAT	CCTACTGCTC	CGAGGTTTGT	480
GTTGTGGAAT	GGGAAGCTGA	GGCCGGTTCC	GTCGAAGCTA	ACTGACTTGC	CTTTCTTTGA	540
CTTGATGAGT	ATTGGAGGGA	AGATTAGAGC	TGGGTTTGGT	GCCATTGGTA	TTCGACCTTC	600
ACCTCCGGGT	CGTGAGGAAT	CAGTGGAAGA	GTTTGTAAGG	CGTAATCTTG	GTGATGAGGT	660
TTTTGAGCGC	TTGATTGAAC	CCTTTTGCTC	AGGTGTTTAT	GCGGGAGATC	CTGCGAAACT	720
GAGTATGAAA	GCAGCTTTTG	GGAAGGTTTG	GAAGCTAGAG	GAGAATGGTG	GGAGCATCAT	780
TGGTGGTGCT	TTTAAGGCAA	TTCAAGCGAA	AAATAAAGCT	CCCAAGACAA	CCCGAGATCC	840
GCGTCTGCCA	AAGCCAAAGG	GCCAAACTGT	TGGTTCTTTC	AGGAAAGGAC	TCACAATGCT	900
GCCAGAGGCA	ATCTCCGCAA	GGTTGGGTGA	CAAGGTGAAA	GTTTCTTGGA	agctctcaag	960

TATCACTAAG CTGGCCAGCG GAGAATATAG CTTAACTTAC GAAACTCCGG AGGGTATAGT 1020

187 094

CACTGTACAG	AGCAAAAGTG	TAGTGATGAC	TGTGCCATCT	CATGTTGCTA	GTAGTCTCTT	1080
GCGCCCTCTC	TCTGATTCTG	CAGCTGAAGC	GCTCTCAAAA	CTCTACTATC	CGCCAGTTGC	1140
AGCCGTATCC	ATCTCATACG	CGAAAGAAGC	AATCCGAAGC	GAATGCTTAA	TAGATGGTGA	1200
ACTAAAAGGG	TTCGGCCAGT	TGCATCCACG	CACGCAAAAA	GTGGAAACTC	TTGGAACAAT	1260
ATACAGTTCA	TCGCTCTTTC	CCAACCGAGC	ACCGCCTGGA	AGAGTATTGC	TATTGAACTA	1320
CATCGGTGGA	GCTACCAACA	CTGGGATCTT	ATCAAAGTCG	GAAGGTGAGT	TAGTGGAAGC	1380
AGTAGATAGA	GACTTGAGGA	AGATGCTGAT	AAAGCCAAGC	TCGACCGATC	CACTTGTACT	1440
TGGAGTAAAA	TTATGGCCTC	AAGCCATTCC	TCAGTTTCTG	ATAGGTCACA	TTGATTTGGT	1500
AGACGCAGCG	AAAGCATCGC	TCTCGTCATC	TGGTCATGAG	GGCTTATTCT	TGGGTGGAAA	1560
TTACGTTGCC	GGTGTAGCAT	TGGGTCGGTG	TGTGGAAGGT	GCTTATGAAA	CTGCAACCCA	1620
AGTGAATGAT	TTCATGTCAA	GGTATGCTTA	CAAGTAATGT	AACGCAGCAA	CGATTTGATA	1680
CTAAGTAGTA	GATTTTGCAG	TTTTGACTTT	AAGAACACTC	TGTTTGTGAA	AAATTCAAGT	1740
CTGTGATTGA	GTAAATTTAT	GTATTATTAC	TAAAAAAAAA	AAAA		1784

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 536 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 20:

Met 1

Asp

Leu

Ser

Leu 5

Leu

Arg

Pro

Gln

Pro 10

Phe

Leu

Ser

Pro

Phe 15

Ser

Asn

Pro

Phe

Pro 20

Arg

Ser

Arg

Pro

Tyr 25

Lys

Pro

Leu

Asn

Leu 30

Arg

Cys

Ser

Val

Ser 35

Gly

Gly

Ser

Val

Val 40

Gly

Ser

Ser

Thr

Ile 45

Glu

Gly

Gly

Gly

Gly 50

Gly

Lys

Thr

Val

Thr 55

Ala

Asp

Cys

Val

Ile 60

Val

Gly

Gly

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

Gln

Ala

Leu

Val

Thr

Lys

His

Pro

Asp

70 75 80

Ala Ala Lys Asn Val Met Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95

187 094

Asn Ile Ile

Asn Ser Phe 115

Gly Leu Lys 130

Val Leu Trp 145

Leu Pro Phe

Phe Gly Ala

Val Glu Glu 195

Leu Ile Glu 210

Leu Ser Met 225

Gly Gly Ser

Lys Ala Pro

Gln Thr Val 275

Ile Ser Ala 290

Ser Ile Thr 305

Pro Glu Gly

Pro Ser His

Ala Glu Ala 355

Ile Ser Tyr 370

Glu Leu Lys 385

Thr Arg Glu Glu Gln Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro 100 105 HO

Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser 120 125

Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe 135 140

Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp 150 155 160

Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly 165 170 175

Ile Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser 180 185 190

Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg 200 205

Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ala Lys 215 220

Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Glu Asn 230 235 240

Ile Ile Gly Gly Ala Phe Lys Ala Ile Gln Ala Lys Asn 245 250 255

Lys Thr Thr Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly 260 265 270

Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Glu Ala 280 285

Arg Leu Gly Asp Lys Val Lys Val Ser Trp Lys Leu Ser 295 300

Lys Leu Ala Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr 310 315 320

Ile Val Thr Val Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val 325 330 335

Val Ala Ser Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser Asp Ser Ala 340 345 350

Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser 360 365

Ala Lys Glu Ala Ile Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly 375 380

Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Lys Val Glu 390 395 400

187 094

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro

405

410

415

Pro

Gly

Arg

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

420

425

430

Gly

Ile

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

Arg

435

440

445

Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

Lys

Pro

Ser

Ser

Thr

Asp

Pro

Leu

Val

450

455

460

Leu

Gly

Val

Lys

Leu

Trp

Pro

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Leu

Ile

Gly

465

470

475

480

His

Ile

Asp

Leu

Val

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

Ser

Leu

Ser

Ser

Ser

Gly

485

490

495

His

Glu

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

500

505

510

Gly Arg

Cys

Val

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu

Thr

Ala

Thr

Gln

Val

Asn

Asp

515

520

525

Phe

Met

Ser

Arg

Tyr

Ala

Tyr

Lys

530

535

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1224 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Oryza sative (ryż) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-18 (NRRL B-21648) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..936 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „część obszaru kodującego protox-1 ryżu”

187 094 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 21:

CGGGCTTTGA	AGGCTGCATT	TGGGAAGGTG	TGGAGGCTGG	AGGATACTGG	AGGTAGCATT	60
ATTGGTGGAA	CCATCAAGAC	AATCCAGGAG	AGGGGGAAAA	ACCCCAAACC	GCCGAGGGAT	120
CCCCGCCTTC	CAACGCCAAA	GGGGCAGACA	GTTGCATCTT	TCAGGAAGGG	TCTGACTATG	180
CTCCCGGATG	CTATTACATC	TAGGTTGGGT	AGCAAAGTCA	AACTTTCATG	GAAGTTGACA	240
AGCATTACAA	AGTCAGACAA	CAAAGGATAT	GCATTAGTGT	ATGAAACACC	AGAAGGGGTG	300
GTCTCGGTGC	AAGCTAAAAC	TGTTGTCATG	ACCATCCCAT	CATATGTTGC	TAGTGATATC	360
TTGCGGCCAC	TTTCAAGTGA	TGCAGCAGAT	GCTCTGTCAA	TATTCTATTA	TCCACCAGTT	420
GCTGCTGTAA	CTGTTTCATA	TCCAAAAGAA	GCAATTAGAA	AAGAATGCTT	AATTGACGGA	480
GAGCTCCAGG	GTTTCGGCCA	GCTGCATCCG	CGTAGTCAGG	GAGTTGAGAC	TTTAGGAACA	540
ATATATAGCT	CATCACTCTT	TCCAAATCGT	GCTCCAGCTG	GAAGGGTGTT	ACTTCTGAAC	600
TACATAGGAG	GTTCTACAAA	TACAGGGATT	GTTTCCAAGA	CTGAAAGTGA	GCTGGTAGAA	660
GCAGTTGACC	GTGACCTCAG	GAAGATGCTG	ATAAATCCTA	GAGCAGTGGA	CCCTTTGGTC	720
CTTGGCGTCC	GGGTATGGCC	ACAAGCCATA	CCACAGTTCC	TCATTGGCCA	TCTTGATCAT	780
CTTGAGGCTG	CAAAATCTGC	CCTGGGCAAA	GGTGGGTATG	ATGGATTGTT	CCTCGGAGGG	840
AACTATGTTG	CAGGAGTTGC	CCTGGGCCGA	TGCGTTGAAG	GTGCATATGA	GAGTGCCTCA	900
CAAATATCTG	ACTACTTGAC	CAAGTACGCC	TACAAGTGAT	CAAAGTTGGC	CTGCTCCTTT	960
TGGCACATAG	ATGTGAGGCT	TCTAGCAGCA	AAAATTTCAT	GGGCATCTTT	TTATCCTGAT	1020
TCTAATTAGT	TAGAATTTAG	AATTGTAGAG	GAATGTTCCA	TTTGCAGTTC	ATAATAGTTG	1080
TTCAGATTTC	AGCCATTCAA	TTTGTGCAGC	CATTTACTAT	ATGTAGTATG	ATCTTGTAAG	1140
TACTACTAAG	AACAAATCAA	TTATATTTTC	CTGCAAGTGA	CATCTTAATC	GTCAGCAAAT	1200
CCAGTTACTA	GTAAAAAAAA	AAAA				1224

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 312 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko

187 094 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 22:

Arg 1

Ala

Leu

Lys

Ala 5

Ala

Phe

Gly

Lys

Val 10

Trp

Arg

Leu

Glu

Asp 15

Thr

Gly

Gly

Ser

Ile 20

He

Gly

Gly

Thr

Ile 25

Lys

Thr

Ile

Gln

Glu 30

Arg

Gly

Lys

Asn

Pro 35

Lys

Pro

Pro

Arg

Asp 40

Pro

Arg

Leu

Pro

Thr 45

Pro

Lys

Gly

Gln

Thr 50

Val

Ala

Ser

Phe

Arg 55

Lys

Gly

Leu

Thr

Met 60

Leu

Pro

Asp

Ala

Ser 65

Ile

Thr

Lys

Ser

Asp 70

Asn

Lys

Gly

Tyr

Ala 75

Leu

Val

Tyr

Glu

Thr 80

Ser

Ile

Thr

Lys

Ser 85

Asp

Asn

Lys

Gly

Tyr 90

Ala

Leu

Val

Tyr

Glu 95

Thr

Pro

Glu

Gly

Val 100

Val

Ser

Val

Gln

Ala 105

Lys

Thr

Val

Val

Met 110

Thr

Ile

Pro

Ser

Tyr 115

Val

Ala

Ser

Asp

Ile 120

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser 125

Ser

Asp

Ala

Ala

Asp 130

Ala

Leu

Ser

Ile

Phe 135

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val 140

Ala

Ala

Val

Thr

Val 145

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu 150

Ala

Ile

Arg

Lys

Glu 155

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly 160

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe 165

Gly

Gln

Leu

His

Pro 170

Arg

Ser

Gln

Gly

Val 175

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr 180

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser 185

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg 190

Ala

Pro

Ala

Gly

Arg 195

Val

Leu

Leu

Leu

Asn 200

Tyr

Ile

Gly

Gly

Ser 205

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile 210

Val

Ser

Lys

Thr

Glu 215

Ser

Glu

Leu

Val

Glu 220

Ala

Val

Asp

Arg

Asp 225

Leu

Arg

Lys

Met

Leu 230

Ile

Asn

Pro

Arg

Ala 235

Val

Asp

Pro

Leu

Val 240

Leu

Gly

Val

Arg

Val 245

Trp

Pro

Gln

Ala

Ile 250

Pro

Gln

Phe

Leu

Ile 255

Gly

His

Leu

Asp

His 260

Leu

Glu

Ala

Ala

Lys 265

Ser

Ala

Leu

Gly

Lys 270

Gly

Gly

Tyr

Asp

Gly 275

Leu

Phe

Leu

Gly

Gly 280

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly 285

Val

Ala

Leu

187 094

Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gln Ile Ser Asp 290 295 300

Tyr Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys

305 310 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1590 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Sorghum bicolor (sorgo) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-19 (NRRL B-21649) (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..1320 (A) INNE INFORMACJE: /produkt= „część obszaru kodującego protox-1 sorgo” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 23:

TCCACCGTCG AGCGCCCCGA GGAAGGGTAC CTCTGGGAGG AGGGTCCCAA CAGCTTCCAG 60

CCATCCGACC CCGTTCTCTC CATGGCCGTG GACAGCGGGC TGAAGGATGA CCTGGTTTTT 120

GGGGACCCCA ACGCGCCACG GTTCGTGCTG TGGGAGGGGA AGCTGAGGCC CGTGCCATCC 180

AAGCCCGCCG ACCTCCCGTT CTTCGATCTC ATGAGCATCC CTGGCAAGCT CAGGGCCGGT 240

CTCGGCGCGC TTGGCATCCG CCCGCCTGCT CCAGGCCGCG AGGAGTCAGT GGAGGAGTTT 300

GTGCGCCGCA ACCTCGGTGC TGAGGTCTTT GAGCGCCTAA TTGAGCCTTT CTGCTCAGGT 360

GTCTATGCTG GCGATCCTTC CAAGCTCAGT ATGAAGGCTG CATTTGGGAA GGTGTGGCGG 420

TTAGAAGAAG CTGGAGGTAG TATTATTGGT GGAACCATCA AGACGATTCA GGAGAGGGGC 4 80

AAGAATCCAA AACCACCGAG GGATCCCCGC CTTCCGAAGC CAAAAGGGCA GACAGTTGCA 540

TCTTTCAGGA AGGGTCTTGC CATGCTTCCA AATGCCATCA CATCCAGCTT GGGTAGTAAA 600

GTCAAACTAT CATGGAAACT CACGAGCATG ACAAAATCAG ATGGCAAGGG GTATGTTTTG 660

187 094

TCTTCTTAAA	CCCCΑTAΑGT	GTTTTTTTTT	TTTCCGTCTC	CAATTTTTAT	CATGACCATT	720
CCATCATATG	TTTCTCGCGC	CCTTTTGCTT	CCCCTTTCCT	TTTCTTCTTC	AGCTGTTCTC	780
TCAATATTCT	ATTATCCACC	ATTTTCTTCT	TTACCTTTTT	CTTCTCCACC	GTAATCACTT	800
CTACACTAAT	TCTTAATTTC	TGTTTAACTC		GCCCGTTTCC	TCCCCGTCTT	900
CAATGATTTT	CGCCATTCTT	AACCATCTCC	CTCTCΑTCΑC	TCTTTCCACC	TCCTGCTCCT	960
GCTCTTCGTT		AAACTACATA	GTCGTTTCTC	CACCCCCCGT	AATTGTTTCC	1020
ΑΑTACTTΑCΑ	TTTCTCTGTT	AGAAGCCTTT	GCCCGTTCCC	TCCGAAAAAT	GCTTCTACCT	1080
CCTACATCCT	TGTCCCCTTT	ATTCCTTGTT		GTCCACACGC	CCTCCCTCCT	1100
TTCCTGTTAT	TCCATCTTTC	TCTTCTGTCT	TCCTCAAACT	CTTCCCTTTC	CCAATTTTTC	1200
TCTACTTTTC	TTTTCCTCTT	CTTTCACTCT	TTTTCCGTΑT	TTTCCCTTTT	CAGATGCATT	1260
TATTTCGCCT	CTTATCGTTC	CTCGCAACTA	TCTTCCTTCT	TTACCCATTA	CGCCTACAAG	1320
TGATTTACGC	CTTTTCTCTC	TGCT,TTTTAA	TTTTTCTTTT	GCATCTATTC	GTTGAGCCCC	1380
GTCGTAGTAA	AATTiCGTCAC	τcττAτrτ,ττ	CATTCTTATT	TTTTCAATTG	CACTTCTCTT	1000
TTTTTTTCCT	TTCCTTACTT	CTTTAGCTTT	TCTTTCTGTC	GTCGCTTTTT	GTTTTCACTT	1500
CCCTACAAAA	GAATTTTTAT	CTTGCATTCG	TTTCTTCTCT	CTTTGCCTCC	TTATGTAACG	1560
TTTTACTTTC	CTTCTCACCC	CACTCAAATC				1590

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 440 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (d) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 24:

Ser 1

Thr

Val

Glu

Arg 5

Pro

Glu

Glu

Gly

Tyr 10

Leu

Τηρ

Glu

Glu

GGl 15

Pro

Asn

Srr

Phe

Gln 20

Pro

Ser

Asp

Pro

Val 25

Leu

Sec

Met

Ma

VaC 30

AAf)

Ser

Gly

Leu

Lys

AAp

Asp

Leu

Val

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

Ala

Pro

(Ag

Phe

00 45

Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro AAa As 50 55 60

187 094

Leu Pro 65

Phe

Phe

Asp Leu 70

Met Ser Ile

Pro Gly Lys 75

Leu Aog AAla

Gly 80

Leu

Gly

AAa

Leu

Gly

lle

AOrg

Pro

Pro

AAla

Pro

Gly

AArg

Glu

Glu

Ser

85

0S

95

Val

Glu

Glu

PhS

Val

Arg

Arg

Ann

Leu

Gly

ALla

Glu

VaS

Phe

Glu

Arg

100

105

HO

Leu

lle

Glu

Pro

Phe

(Ays

Ser

Gly

Vi1

Tor

AUa

Gly

AAsp

Pro

Ser

Lys

115

120

115

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala

Phe

Gly

Lys

Val

Tp

AOrg

Leu

Glu

Glu

Ala

130

135

110

Gly

Gly

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr

Ile

Lys

Thr

Ile

Gln

Glu

AArg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Pro

Lys

Pro

Poo

AOrg

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Poo

Lys

Gly

165

17S

1715

Gln

Thr

Val

Ala

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

AUa

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

180

185

150

lle

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser

Lys

Vi1

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Thr

195

200

2075

Ser

Met

Thr

Lys

Ser

Asp

Gly

Lys

Gly

TAOS

Val

Leu

Glu

•Tsr

Glu

Thr

210

215

220

Pro

Glu

Gly

Val

Val

Leu

Val

Gln

SAla

Lys

Seo

Val

Ile

Met

Thr

11 e

225

230

235

240

Pro

Ser

Tyr

Val

Ala

Ser

Asp

Ile

Leu

SArg

roo

Leu

Ser

Gly

Asp

AAla

245

250

255

Ala

Asp

Val

Leu

Ser

Arg

Phe

Tyo

Ίπ

Pro

Pro

Val

A^a

AAla

Val

Thr

260

265

270

Val

Ser

Tyt

Pro

Lys

Glu

SAla

Ile

SArg

Lys

Glu

cys

Leu

Ile

Asp

Gly

275

22ΰ

228

Glu

Leu

Gln

Gly

Phe

Gly

Gln

Leu

His

Pro

AOrg

Ser

Gln

Gly

Val

Glu

290

225

3<)0

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyo

Ser

Ser

Ser

Lee

Phe

Pro

Asn

SAog

Ala

Pro

305

310

315

320

Ala

Gly

Ar Ar

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

rT^r

Ile:

Gly

Gly

SALa

Thr

Asn

Thr

325

330

335

Gly

lle

Val

Ser

Lys

Thr

Glu

Ser

Glu

Leu

Val

Glu

AUa

Val

Asp

AArg

340

334

3350

Asp

Leu

TArg

Lys

Met

Leu

Ile

SA3n

Pro

Thr

Ala

Val

AAsp

Pro

Leu

Val

355

330

3375

100

187 094

Leu

Gly 070

aal

Aog

Val

Top

Poo 075

Gln

Ala

Ile

Poo

Gln 080

Phe

Leu

Vil

Gly

His 085

Leu

Asp

Leu

Leu

Glu 050

Ala

Ali

Lys

Seo

Ala 055

Leu

Asp

Gln

Gly

Gly 400

Tyr

Asn

Gly

Leu

Phe 405

Leu

Gly

Gly

Asn

Tyo 410

Vae

Ali

Gly

Vle

Ali 415

Leu

Gly

Aog

Cys

Ile 420

Glu

Gly

Ala

Tyo

Glu 425

Ser

Ala

Ali

Gln

Ile 400

Tyo

Asp

Phe

Leu

Tho

Lys

Tyo

Ala

Tyo

Lys

405 440 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 93 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: innn kwas nukleincow (A) OPIS: /desc = „sekwencja intronu protox-1 kukurydzy” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 25:

ΊΓACΊCΓCCT CGCΓGΊCΊCC ΊCAΊCΊΓCTT CΓΓCΓCAΊAC TCATGCGCAG CCATGGAATT

GAGATGCTGA ATOGATTTTA TACGCGCGCG CAG (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2606 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (burak cukrowy) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) KLON: pWDC-20 (NRRL B-21650)

101

187 094 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..6 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla Sali (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: komplementarna (1..538) (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „część cDNA protox-1 buraka cukrowego w kierunku 3’-5’” (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 539..2606 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „obszar promotora protox-1 buraka cukrowego przedstawiony w kierunku 3-5’ (częściowa sekwencja fragmentu 3 kb Pstl-Sa1l subklonowanego z pWDC-20)” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 26:

GTCGACCTAC	GCACATGCCA	CATTCCACAT	TCCACGTTAG	GAATTGAATT	GAATTGAATT	60
ATGATTATGA	ATAATGAAGA	GACAGAATTA	CCGCCATGGT	GAGCACCGCG	TCGGAAGGCT	120
GGAAGCTATT	GGGTCCCTCC	TCCCAGATAT	AGCCATCGGC	CTCCACAGTG	ACGATGTTGC	180
CGCCAACTCT	gtctttggcc	TCTGTCACTA	TAAAATTTGG	GGATAAAGAG	GACTGTTTTG	240
TACAAAGAGC	CTGCGCGATG	CAAAGCCCGC	TAATTCCACC	TCCAACGATT	ACGCAGTCTA	300
GCAATCCTCC	TGCTCCTGAT	CCTGATCCTG	ATCCTGCTTC	TTTAACCGCT	GACTTTGAGC	360
CTGAGCTTGT	GCTGCAACTC	ATGCTCATCC	TCCTCTTCTT	ATGTGAATAA	TAACCTCGTC	420
TTCCAATTAA	ACTACATGGA	ATTGACAACA	TGATACAATT	GCCCCTGTAA	TGCCCGCTGC	480
TGTGCAATGG	CATGCACTGT	GTCTGTGGAA	TGCAGTTTGA	TAACGCCATT	GATTTCATCT	540
CTCTCTCGCT	CTCTCGCCCT	CCTTATCCTC	TATATCCCCT	TCTTGCTTGC	TCGGGAATTC	600
TAATTAACCT	TATATCAAAA	TGAAACAACT	GTTTCTAGTT	AAAAAGTTTT	TTATAAATAG	660
TACTCTAAAT	AAACGATTAC	ATGTATCTTC	TAACCATACT	TGTTTGGTGG	AGGTGGTGCG	720
TAACCGGTAA	CTTACCTTTG	TAACTCACCT	CAATACCTAC	TTATGCTTAA	GGATACGGAT	780
TCTTTTAAAC	TCTCAGGCAT	TGACCTATGT	AGCTGGACTG	ACTAACATCT	GAATTTGTTT	840
CTCTGGTTAT	ATATGCAATT	TTAACTGAAT	CGAAATTTCT	CTGGATGCTA	AAAATGTCTT	900
TAACGGGGTT	TATGAGGACT	aaattatctc	CTTCAATGAG	GAGGTTCTTG	ATTTGCATGT	960

ATGAGCGTGA AAATGCATTC TTAACGGCTA TAGATTCAGT AATAAGTGGT GTTAAAAGTA 1020

102

187 094

AAAAGTACTT	GGGAGGGTGG	TTCAGCGACT	GTAATTTTTT	GAATTCimCl	SAAlGTTGCCT	1088
TTTCTTGGCT	ATCTTAACAT	CTCATCTAT^	SAAACCCTTT	STCAlTTACCA	GGGGAATCGGGa	1114
GGGTTTGGGG	GAAGAAGGTC	ATAACTCACT	ACCGGCGTCA	ggatatcgagct	GlAAjATGTCT	11C^^
CACTAACAGA	GTGCATGTGA	AAGGACCGCC	SSAGTCAATAT	sagcgcagcat	gtccgcctct	1126
TCAAlATTCC	TACAAATACA	tcctagtaac	STTGTCGAAA	SGGTCCGAAjTA	ACACGGCTGTG	13^0
TCAATTGCGG	ATGCTTCTCA	KCCCAGACT	TATATAGGGA	GTTTTGCCTAa	TCCCATAGTCGl	1138
GCGGCTCGCG	TAATGGTACC	CCAAAGATAC	CCCGAGTCCT	TGCTłCAAAlIT	CCCTłAGAClT	1140
TGTAGCTGTG	TAAGTTTGAC	TTACAATGTT	GCGGAGCGGT	GCCClTCGGTA	AATGAGACCT	1500
AGGGGCAAAT	CTCGAATCCA	CCGGGCTCATC	AATCTGGTTTA	GlTTTTCTCC	SAACGTłAAALC	1156
AATGATGTGA	AATACACCAC	MAKAT TCAT	scagcccgit	ATCCTTGGGG	ccttgagagc	1160
ATAATCTTGT	TTGTACTTTC	AAGACGGTGG	GAAGGAGGGAl	STACCAACTCGl	GlAGAGGTCA	1680
TTGCTCAGTG	TCGTGTACTA	CCTATTCTTC	ggactcgaga	SAACCAIGCCGAa	CCCAlATGTTCl	1140
CCTATATACT	GTACTTCTCC	ATCCAATAAC	TCCCACGTGC	SGTłAAlCTCA	ATACTATCAT	1180
AGGGGCCGCA	AAGACATTTC	ATCAAAAlCGT	SGGrTGGAGGTl	TGTłClTCCAT	CTTCCAGAGTT	1186
CCAAAGTGAT	TCTAACTACA	TTCTCAACGAa	SAATGACAlCTi	GTGTłAAACCT	SAlTCCTTGTG	1100
TTGTGGAGCG	CCTACATACC	AACGATTAATT	TAGGAATATA	STTATGGGlTG	CAGTACCTAC	1180
ATGGGGCCAT	TAAATAACCA	GGTTrAATGTł	aattcgtgac	CCAAACATAGlTł	CCTCAAGAATC	2200
ACGAAGTAAT	TTATAGTCAT	ITTGTTGGCA	(ΆΓΤΑΑΤΤΆΤ	STCAATACCCA	gtataacctat	2210
AAGTTACCAG	CTTAAGTAGT	TTTTGTGC(C\	TCTTTACATA	CTTCCTCCGG	TCCATCATCAl	2260
GGGTGCGTTT	GGTTGCAACG	CGGTCAAAGG	GAATCGGGlTCGa	AGAAAGGGAG	GGGGGAGGAA	2220
AGGAAlAGAA	AACCCTTAGA	ITTAGAGGTG	ST3GTTCGGTA	AGATCAATGTT	AGCTrCCrCTCrr	2280
CTTCCTCTTT	CTTACCCTTC	TTCCACCCATC	cgaccaccac	TCCTCCCTCCC	GlTACTATTC	2230
TCCACGCCGC	CTCTCCCTAC	CCCCAGCAAC	CCACCCTGTC	SGlCCCCCCCG!	tctcccccct	22()0
CCCGCGACGG	TTCCCCCCTC	CCCTGCGCCG	TCClCGTCGTC	CCCCTTClCCT	CCCTGCACCG	2460
TCGAGTTATC	CCCCTCCCCT	GGGCGGCGCG	STCGCCCCGC	CCTACCAGC	GCGCTCCCCCCC	2520
CTCCCTCACC	GTCGCGTTCT	CCCCCTCCCCTC	SlCC^CG£(C(j(CCGj	TCTCCCCTCC	CTCACCCGTCG	2580

CGGTCTCTCT TTCCCTCCCC ctgcag

2606

187 094

103 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „Pc1p_Pla primer do PCR dla górnej nici promotora genu plastydowego cIpP (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (a) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla EcoRI” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 27:

GCTTAATTCA TCCTTCTTTC TCCTTATACA G 31 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „Pc1p_P1b primer do PCR dla dolnej nici promotora genu plastydowego cIpP (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla Xbal” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 28:

TCTTCTATCA ATACCTACAT ACTATATTTC AC

104

187 094 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „Pc1 p_P2b primer do PCR dla dolnej nici promotora genu plastydowego cIpP (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla Ncol” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 29:

GCGCCATGGT AAATGAAAGA AAGAACTAAA 00 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „Trps16_P1a primer do PCR dla górnej nici obszaru 3' nie ulegającego translacji Xbal/HindIII genu plastydowego rps16 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: miscfeature (B) POZYCJA: 4..9 (a) INNE INFORMACJE: /uwaga= „mi^esce dla Xbal”

187 094

105 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 30:

GCGTCTAGAT CAACCGAAAT TCAATTAAGG 30 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /deso = „Trps16_P1b primer do PCR dla dolnej nici obszaru 3’ nie ulegającego translacji Xbal/Hindlil genu plastydowego rps16 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla HindllΓ (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 31:

CGCAAGCTTC AATGGAAGCA ATGATAA 27 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „minpsbJJ primer dla górnej nici obszaru 38 nt (tępe/Ncol) obejmującego ATG z 5’ nie ulegającej translacji części genu plastydowego psbA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 32:

GGGAGTCCCT GATGATTAAA TAAACCAAGA TTTTAC

106

187 094 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = ,,minpsb_L primer dla górnej nici obszaru 38 nt (tępe/Ncol) obejmującego ATG z 5' nie ulegającej translacji części genu plastydowego psbA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 33:

CATGGTAAAA TCTTGGTTTA TTTAATCATC AGGGACTCCC 40 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „APRTXP1a primer do PCR dla górnej nici do amplifikacji części 5' zmutowanego genu protox Arabidopsis (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 5..10 (a) INNE INFORMACJE: /uwaga= „miejsce dla Ncol/kodon inicjacyjny ATG (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 34:

GGGACCATGG ATTGTGTGAT TGTCGGCGGA GG 32 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad

187 094

107 (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = ,APRTXP1b primer do PCR dla dolnej nici do amplifikacji części 5' zmutowanego genu protox Arabidopsis (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 34:

CTCCGCTCTC CCTCTTCTTT ATAC 20

187 054

187 094

Pa

NOCH2COOCH3

CCH₂OCH₃

Wzór IVa

Cl

Wzór IVb

Ri

Rz· >_/^Q cf₃·

Z Vo

Cl

COOCH3

NO2 ch₃

CO2CHC02CH2CH3 no₂

Wzór IVd

Wzór V

187 094

Ο

Ο

Ο

Ν—

Wzór VI

Wzór VII

ch, χχ o

Wzór VIII

N—

Hiyc n o

Wzór IX

CHjSO₂NH

Wzór X

187 094

CFh,

CHj

-^COOCHCCHb

O Ul,

Cl

Wzór XI

Wzór XVII

187 094

N^N—CHF₂ Ν=^

CH₃

Wzór XIX

Wzór XX

Wzór XXI

Wzór XXIa

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (20)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowana cząsteczka DNA (a) kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mająca sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania:

   i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPOą pH 7,0, 1 mM EDTA w 50°C; i ii) płukanie w 2 x SSC, 1% SDS w 50°C.
2. 2. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową określoną jako SEKW. ID NR: 9.
3. 3. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje enzym protox, który ma wprowadzoną co najmniej jedną modyfikację aminokwasu, nadającą enzymowi cechę oporności na herbicydy hamujące protox.
4. 4. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 356 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.
5. 5. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 4, znamienna tym, że walina jest zastąpiona przez leucynę.
6. 6. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie seryny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 421 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż seryna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.
7. 7. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 6, znamienna tym, że seryna jest zastąpiona przez prolinę.
8. 8. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 502 w SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.
9. 9. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 8, znamienna tym, że walina jest zastąpiona przez alaninę.
10. 10. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie alaniny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 211 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż alanina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.
11. 11. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 10, znamienna tym, że alanina jest zastąpiona przez walinę lub treoninę.
12. 12. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie glicyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 212 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż glicyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje

    187 094 enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.
13. 13. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 10, znamienna tym, że glicyna jest zastąpiona przez serynę.
14. 14. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie izoleucyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 466 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż izoleucyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox.
15. 15. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że izoleucyna jest zastąpiona przez treoninę.
16. 16. Chimerowy gen zawierający izolowaną cząsteczkę DNA (a) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, zawierający sekwencję aminokwasową określonąjako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mającą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania:

    i) hybiydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaP0₄ pH 7,0, 1 mM EDTAw50°C;i ii) płukanie w 2 x SSC, 1% SDS w 50°C, operacyjnie połączoną z heterologicznym promotorem aktywnym w roślinie.
17. 17. Chimerowy gen według zastrz. 16, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu.
18. 18. Chimerowy gen według zastrz. 16, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium.
19. 19. Sposób wytwarzania roślin, które wykazują cechę tolerancji lub cechę oporności na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, znamienny tym, że:

    i) transformuje się materiał roślinny izolowaną cząsteczką DNA określoną w zastrz. 1-15 albo genem chimerowym określonym w zastrz. 16-18, ii) selekcjonuje się stransformowany materiał, a następnie iii) regeneruje się wyselekcjonowany materiał w morfologicznie normalne, płodne, zdrowe rośliny.
20. 20. Sposób zwalczania chwastów, znamienny tym, że rośliny wytworzone sposobem określonym w zastrz. 19 traktuje się herbicydem hamującym oksydazę protoporfirynogenu, stosowanym w ilości wystarczającej do zwalczania chwastów, zasadniczo bez oddziaływania na rośliny.