CN1039283C

CN1039283C - 卟啉的应用

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Publication number: CN1039283C
Application number: CN90104921A
Authority: CN
Inventors: 布兰克·菲力普·海林; 德伯拉·安·维特考斯基
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1990-06-11
Publication date: 1998-07-29
Anticipated expiration: 2005-06-11
Also published as: US5407808A; CN1057194A

Abstract

本发明涉及一种化合物在制备光动力治疗或检查肿瘤中使用的药物组合物中的应用，该化合物在所述细胞中能抑制因原还原卟啉的酶催化转化为原卟啉IX而在所述细胞内产生原卟啉IX的积累。

Description

卟啉的应用

本发明涉及一种化合物在制备光动力治疗或检查肿瘤中使用的药物组合物中的应用。

众所周知，将血卟啉衍生物或由其衍生的卟啉混合物(如Photofrin II^)用于哺乳动物肿瘤细胞，然后对这些细胞进行适当波长的光照，使细胞破坏。有一系列论文的主题涉及这种在光中发荧光的治疗方法，这些论文刊于光化学和光生物学(Photochemistry andphotobiogy)第46卷，5期，1987年11月(下文中以“P & P 46-5”表示)的特刊中。在这些论文中认为，这种在光中发荧光的治疗法已用于处理各种癌症(包括支气管、膀胱、食道、肺、皮肤、头和颈、脑、结肠和眼内以及妇科的癌症)。已经表明，这种卟啉光敏作用的生化效应包括膜蛋白的交联、脂类的过氧化作用、某些基本代谢物的输送的抑制作用、溶菌酶和线粒体膜的溶解、几种酶的失活作用，以及增高卟啉的细胞吸收(P&P 46-5第695页)。一般是使用注射引入卟啉物质(如静脉或腹膜内注射)。常用剂量为每公斤体重约2毫克Photofrin II。

也可以将卟啉物质引入脂质体，而注射(例如腹膜内注射)，例如在Spikes等人的“在模型细胞、组织和肿瘤系统中卟啉的在光中发荧光的行为”(在“Photodynamic Therapy of Tumors and other Dis-eases”，由G.Jori和C.A.Perria编辑，45-53页，Libreria Proget-to，Padua(1985))中，而且其中引入了参考文献。

专业文献指出，引入原卟啉于细胞中，如人体红细胞(Dubbel-man等人，Biochimica et Biophysica Acta，511(1978)141-151)或鼠白血病细胞(Kessel，Cancer Research 42，1703-1706，May1982)，可以产生明显的光敏化效应。Kessel的文章指出，原卟啉是所测试的最有效的光敏化剂。但是当Kessel和其他人(如Beren-baum)等人，Br.J.Cancer(1982)45，571-581)将原卟啉注射入动物体中时，发现在肿瘤中没有可检出量的原卟啉，他们认为这样引入原卟啉于体内可能容易在循环系统中损失。

将血卟啉衍生物和类似物质用于肿瘤的检测和定位，如膀胱或肺部癌症(P&P 46-5，759)中，也是熟知的。

本发明的一个目的是提供一种酶抑制剂，它可用来制备光动力治疗或检查肿瘤中使用的药物组合物。

本发明的技术方案涉及一种在这种光中发荧光处理中所用于处理细胞或用于按已知方法检测或定位肿瘤的试剂，这种试剂不是卟啉，或者不单是卟啉。它包括一种酶抑制剂，该抑制剂在所说细胞中抑制原还原卟啉(protoporphyrinogen)的酶催化转化为血红素，从而在所述细胞中产生内生的原卟啉IX的积累。我们已查明，这种试剂，例如某种除草化合物类，它可以在植物细胞中抑制原还原卟啉的酶催化转化为叶绿素，也可以在哺乳动物细胞中抑制还原卟啉的酶催化转化为血红素。我们相信，通过这种试剂的抑制作用，能够影响由酶(原还原卟啉氧化酶，EC1，2，3，4)引起的原还原卟啉的酶转化为原卟啉IX的步骤，这样就能使原还原卟啉不能按正常的酶催化途径转变成原卟啉IX，而是在细胞中(如在血浆中)被氧化，但不按正常酶催化的途径(如在类脂质膜之外)，其结果是在不易获得正常转化成血红素的位置积累了原卟啉IX。因此，当细胞受到光照时，这种积累的原卟啉IX具有上文所述的在光中发荧光处理中所显示的破坏细胞的效应。

本发明的酶抑制剂，在某种意义上来说，是原还原卟啉的酶催化转化为血红素的特异抑制剂，它们不产生通常的酶中毒，例如改性剂或交联剂(如硫氢基试剂)，最好它们不是那些影响氧化条件(如电子受体)的物质。因此本发明优选的试剂的氧化还原电位势要更负于约-500mV，如更负于-8.00mV(例如按传统方法，采用循环伏安测量法或极谱法在试剂的非质子传递溶剂中进行测量)。最好该试剂不是四吡咯，而且对原还原卟啉氧化酶的I₅₀要低于10μm(而pI₅₀大于约5)，更好的是低于约1μm(而pI ₅₀要大于约6)，例如低于约0.3μ m，如I₅₀约为0.1或0.03或0.01 μm或更低。

优选的酶抑制剂具有高的破坏植物质膜的能力，测试该能力的-种方法是流失实验(Efflux Experiment)描述于Halling和Peters的文章(Plant Physiology，84，1114-5(1987))中。在这种测试(详细描述见下文附录A)中，优选的试剂，在处理率为100μm，最好在处理率1μm或更少，如100nM时，其总流失量至少为50％，高的活性物质，如1-(4-氯-2-氟-5-炔丙基氧苯基)-3-甲基-4-二氟甲基-Δ²-1，2，4-三唑啉-5-酮或乳吩(lactophen)(下文有描述)，在100nM浓度下，其总流失百分数超过90％。

另一种测试物质破坏植物质膜能力的方法是光感应变绿抑制试验(Light-Induced Greening Inhibition Test)，它详述于下面附录B中。该测试法是测量抑制暗脱色的马舌蝶衣藻(Chlamydomonas reinbardi)突变株Y-1(一种藻类，在黑暗中生长时不产生叶绿素，所以该藻由于存在新的非绿色细胞而成为脱色，但在光照后，重新产生叶绿素)的光-变绿的能力。许多用于本发明的优选化合物(试剂)，当所用化合物浓度为10^-5M，优选的10^-6M或更低(如10^-7M)时，具有的抑制光-变绿能力至少50％。但是，在水中电离的化合物，如化合物6C(见下文实施例6)，其中运行的离子带负电荷，在本试验中就没有很好反应，显然藻细胞阻止酸性基团进入。另外，有许多优选的化合物，在光-变绿抑制试验中使用所述浓度时，其上清液在约405 nm处的光吸收峰大于叶绿素峰(在约668 nm处)，例如，上清液在405nm处的峰高是668nm峰高度的2，3或4倍。

可用于本发明实施的酶抑制剂中有下列A至G类除草化合物：

A通式为

Ph-NHet的芳基杂环除草剂，其中“Ph”是取代的苯基，优选的为2，4-二取代的苯基，更优选的是2，4，5-三取代的苯基，NHet是-个5或6节杂环，并具有1～4个环氮原子，其通式为

其中Q是杂环的其它部分而R是氢或一取代基，这类化合物包括在Wakabayashi等人的文章(J.Pesticide Sci.11，635-460(1986))中称为”环酰亚胺类除草剂”的那些物质，在其图1中有以下化合物：

化合物I是芳基恶二唑除草剂，即2-叔丁基-4-(2，4-二氯-5-异丙基氧苯基)-Δ²-1，3，4-恶二唑啉-5-酮。其它可用于本发明的2-烷基-4-(2，4，5-三取代苯基)-Δ²-1，3，4-恶二唑啉-5-酮类已公开于，如美国专利3385862；3836539；和3876413中。

化合物II是芳基四氢吲唑除草剂，即3-氯-2-(4-氯-2-氟-5-异丙基氧苯基)-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑。其它可用于本发明的3-取代-2-(2，4，5-三取代苯)四氢吲唑类已公开于，如美国专利4670043中。

化合物III、IV和V是芳基四氢酞亚胺除草剂。其它可用于本发明的芳基四氢酞亚胺类已公开于，如美国专利4431822；4670046；4670042和4439229以及公开的国际申请(PCT)WO 87/07602中。后两篇文献还公开了其它可用于本发明的NHet环，如在US 4439229第4栏第25行至第5栏第20行，以及WO 87/07602中第12至14页中，对这种环进行了说明。

其它合适的PH-NHet型除草剂有：

芳基三唑啉酮类，如在美国专利 4318731；4398943；4404019；4702945；4705557；4702763；4761174；和国际申请(PCT)WO85/01637，WO 85/04307，WO 87/00730，WO 87/03782，WO 86/04481和WO 88/01133中所公开的化合物；

芳基四唑啉酮类，如在美国专利 47734124和国际申请(PCT)WO 85/01939和WO 87/03873中所公开的化合物；

芳基三嗪二酮类，如在美国专利 4755217和4766233以及国际申请(PCT)WO 86/00072中所公开的化合物；

芳基乙内酰脲类，如在美国专利 4427438中所公开的化合物；

芳基咪唑嘧啶类，如在西德专利DT 2604989(德温特文摘登记号 65326X)日本公开特许J 60-158147A(德温特文摘登记号85-240363)和欧洲公开专利申请Ep 230874(德温特文摘登记号87-215141)中所公开的化合物；

芳基吡啶二嗪类，如下面实施例8的化合物8X类型的化合物；

芳基二嗪二酮类如下面实施例8的化合物8e和8v类型的化合物；

芳基匹拉二嗪酮(aryl pyradiazinones)类，如下面实施例8的化合物8f的化合物；

芳基恶二唑啉酮类，如在日本公开特许J59-148769(德温特文摘登记号84-246947)或日本公开特许J62-161772(德温特文摘登记号87-238787)中所公开的化合物；

芳基恶二嗪酮类，如下面实施例8的8 k和8 m的化合物类的化合物；

芳基苯甲酰胺哒唑(aryl benzamidazolos)类，如下面实施例8的8ad化合物类的化合物；

芳基亚氨三唑并哒嗪类，如在美国专利4913723；4906281和4906279中所公开的化合物；

芳基噻唑，如下面实施例8的化合物8L、8r和8ah类的化合物；

芳基吡咯类，如在欧洲公开专利申请EP255601(德温特文摘登记号88-037583)和EP 260288(德温特文摘登记号88-127433)中所公开的化合物；

芳基尿唑类，如在美国专利4452981中所公开的化合物；

芳基六氧哒唑类，如在美国专利4619687中所公开的化合物；

B.芳基杂环尿烷类，如在美国专利4521242中所公开的化合物。

C.芳基杂环脲类，如在日本公开特许J58-225081(德温特文摘登号84-034261)中所公开的化合物。

D.芳基酰胺类，如下面实施例8的化合物8aj和8ak类的化合物。

E.苯醚除草剂类，如具有对一卤素成对一硝基的苯氧基苯结构的那些化合物，如下列可商购的物质：5-(2-氯-4-(三氟甲甲基5-(2，4-二氯苯氧基)苯氧基)-2-硝基-N、基)-2-硝基苯甲酸甲酯-甲磺酰苯甲酰胺(fomagafen) (bifenox)

5-(2-氯-4-(三氟甲 2-氯-1-(3-乙氧基-基)苯氧基)-2-硝基苯甲 4-硝基-苯氧基)-4-三酸钠(acifluorfen) 氟甲苯(oxyfluorfen)

其它合适的可商购的二苯醚除草剂是：

乳吩(lactophen)：1-(乙氧羰基)乙基5-(2-氯-4-三氟甲基苯氧基)-2-硝基苯甲酸酯，

氟糖吩(fluoroglycofen)：(乙氧羰基)甲基5-(2-氯-4-三氟甲基苯氧基)-2-硝基苯甲酸酯，

氯硝吩(chloronitrofen)：2，4，6-三氯-(4-硝基苯氧基)-苯，

氟二吩(fluorodifen)：2-硝基-1-(4-硝基苯氧基)-4-三氟甲基苯，

硝吩(nitrofen)：2.4-二氯-1-(4-硝基苯氧基)苯，

氯甲氧吩(chlomethoxyfen)：4-(2，4-二氯苯氧基)-2-甲氧基-1-硝基苯。

另外合适的二苯醚除草剂还有甲基5-2-氯-4-三氟甲基苯氧基)-2-硝基乙酰苯酮肟-O-乙酸酯。

F.芳基吡唑除草剂类，如在美国专利4563210；4496390和4459150和德国公开专利3520327A1中所公开的化合物。

G.以下通式的化合物：其中X^b是O或S，“Ph”具有上述的含义，如在欧洲公开专利申请EP 273417或德温德文摘登记号87-040749中所公开的化合物。

有些酶抑制除草剂在Matringe等人(FEBS Letters，Vol 245，No 1，2，35～38页(1989))和Yonase等人(Pesticide Biochemistry andPhysiology，Vol 35，70～80页(1989)的文章中已有公开。

用本发明试剂的处理，可以通过静脉或腹膜内注射来实施。该试剂可以用作消毒组合物，包括溶解或分散在药物上允许的载体，如水相的等渗压溶液，如盐水(如0.9％NaCl)或Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，(如浓度约为2.5 mg ml^-1)中的试剂，或者包括在脂质体(liposomal)系统中的试剂，如按照Remington′s Pharmaceutical Sciences，1985(17版)1659-1660页(Mack PublishingCompany出版)中所述方法，以磷脂质泡(vesicle)制备的。例如，与Jori等人(Br.J.Cancer(1983).48，307页)所述制剂相类似的方法，将51.4 mg二棕榈酰基二磷脂酰基胆碱溶于10 ml 1mM试剂的氯仿-甲醇(9∶1 v/v)的溶液中，完全混合后，在30℃真空下除去溶剂，得到一种固体，可以将固体重新悬浮在10 ml PH 7.4，含有150 mM NaCl的0.01 M磷酸盐缓冲液中，然后在50℃对混浊的溶液进行声波处理(sonicate)30分钟。

可用于本发明实施的酶抑制剂可以相互结合或使用现有技术的连接子技术结合到适当的肿瘤特异单克隆抗体(MABs)上，以便引导酶抑制剂到具体的肿瘤位置。

用于本发明的酶抑制剂也可以通过简单的口服引入而使用，最好是用药物上允许的载体稀释后的形式，如下文实施例6所述的，将它们加到食物中。

尤其对于口服，要求所使用的酶抑制剂最好是水溶性盐或是酸性的并形成水溶性钠或钾盐，如国际专利申请(PCT)WO 87/03782(如下文实施例6的试剂6c)或WO 85/001939和WO 87/037873中所述的酸性磺胺类或其水溶性盐，或者羧酸或其水溶性盐，如称为酸氟吩(acifluorfen)的钠盐。

本发明所使用的酶抑制剂可以加入到常用的药物制剂中，如片剂(如，可用糖膏和/或糖浆包衣的压片)、栓剂、胶囊(如硬明胶胶囊)、悬浮液、溶液、粉末或安瓿。在这些制剂中，试剂可以是和药物上允许的固体和/或液体载体混合的形式，如果需要，这些载体可以是营养素，例如它可以是如玉米淀粉的固体或是液体稀释剂，如水或食用油或矿物油或如二甲基亚砜的溶剂。也可以使用酶抑制剂的混合物，例如，下面实施例6的试剂6c和酸氟吩，如按约等比例的混合物，所用剂量可以按现有技术中熟知的常规实验测定，如对Photofrin II类的试验，描述于Dougherty的“Photody-namic Theropy(PDT)of Malignant Tumors”(CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology vol 2，issue2(1984)83～116页)的文章中。

试剂可以和一些已知能够提高抗癌药物的抗癌细胞敏感性的药物(如戊脉安、环孢菌素、或奎宁)相结合而施用。

列出下面实施例以进一步说明本发明。

实施例1

将在对数生长期(在1升Falcon组织培养瓶中，在37℃保温5天)的海拉(Hela)细胞(一种常用于肿瘤研究的人类肿瘤细胞系，并从美国典型培养物保藏中心得到)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。加入0.25％胰蛋白酶的PBS溶液2 ml，几分钟后，轻轻地将细胞从瓶中移出，并放入110ml在最小基本培养基(MEM)中的25 mM Hepes的溶液中，该最小基本培养基中添加有10％v/v的非活性小牛血清、1.1ml 200 mM谷酰胺的0.85％盐水溶液，以及11000单位青霉素/11000mcg链霉素。

将所得的再悬浮的细胞培养物的5ml等分溶液分别装入50mlFalcon组织培养瓶中，并且(除了用于对照外)与处理剂混合。然后将等分液在黑暗中，37℃下保温三天。随后将细胞移出，并按下述方法在绿光下进行萃取：

通过加入0.8ml 0.25％胰蛋白酶的PBS溶液，将细胞从瓶底移出。在黑暗中培养1小时后，将细胞和介质从瓶中移出，装入园底离心管，然后经过两次冷冻-解冻循环条件，以破裂细胞并进行萃取。

在这破裂操作以后，检测细胞悬浮液，没有发现有完整的细胞。然后在各试管中分别加入10ml碱性丙酮(90％丙酮：10％1N NH₄OH)，离心试管以除去蛋白质和细胞碎片。在上清液中加入0.5ml饱和NaCl水溶液后，再加入5ml水。然后滴加2MKH₂PO₄以将PH值调到6.8。将含水丙酮提取物装到C8 Baker Prep柱。在柱流干后用2ml水洗涤。用2×1.5ml体积的CH₃OH/H₂O(90/10)洗脱四吡咯。用分光荧光计定量测定提取物。

在本实验中所用的处理剂是：

A.5-氨基乙酰丙酸，已知它是四吡咯的前体。

B.具有以下结构式的酸氟吩-甲基

C.具有以下结构式的除草剂：

D.具有以下结构式的除草剂：

E.具有以下结构式的除草剂：

将试剂A配制成250mM.P且6.5的菌过滤水溶液。将试剂B、C、D和E配制成50mM的丙酮溶液。在对照例中也加入丙酮，使其浓度为0.2％v/v。加到细胞培养物中的试剂量按表1所列的浓度。所产生的四吡咯原卟啉IX(“Proto IX”)的量示于表1。

表 1

在处理过的海拉细胞中的四吡咯积累试剂试剂浓度荧光发射 Proto IX含量

(μ m) CPS 400/630 (Pmoles)A 5000 41842 4.2B 100 12921 1.3C 100 33477 3.5D 100 10551 1.1E 100 8967 0.9对照 - 2795 0.3

实施例2

将在对数生长期(在六个1升Falcon组织培养瓶中，在37℃保温6天)的海拉细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。加入0.25％胰蛋白酶的PBS溶液，几分钟后，慢慢地将细胞移出，并装入110ml在最小基本培养基(MEM)中的25mM Hepes溶液中，该最小基本培养基中添加有10％v/v非活性小牛血清、1.1ml 200mM谷酰胺的0.85％盐水溶液，11000单位青霉素/11000mcg链霉素。

将再悬浮的细胞培养物的等分液(每个5ml)分别装入50mlFalcon组织培养瓶中，瓶中加入或不加入除草剂，并在黑暗中，37℃时，培养4天，除草剂按实施例1中的丙酮稀释溶液形式加入。在对照例中也加入丙酮，使其丙酮浓度为0.2％v/v。除草剂加入量按下面表2所指定的浓度。处理剂是：B.如例1C.如例1F.结构式如下的除草剂：

萃取：将各瓶中的培养基装入玻璃圆底管中，通过加入0.5ml0.25％胰蛋白酶的PBS溶液，将粘附在瓶底的细胞打松，然后在37℃保持几分钟后，将其从瓶中洗下并与其培养基合并。然后从各细胞悬浮液中取出100μl等分液以测定细胞密度。接着对剩下的5.4ml细胞悬浮液进行声波处理以破裂细胞。

然后在各管中分别加入10ml碱性丙酮(90％丙酮：10％1N NH₄OH)，离心试管以除去蛋白质和细胞碎片。在上清液中加入0.5ml饱和NaCl水溶液后，再加入5ml水。滴加2MKH₂PO₄，使PH调到6.8。将含水丙酮提取物加在C8Backer Prep柱上。柱流干后，用2ml水淋洗。用3ml90/10的CH₃OH/H₂O洗脱四吡咯。和实施例1相同，所有这些提取步骤基本上完全在非原卟啉IX激活的光(如绿光)下或在黑暗(如在不透光的有盖容器中)条件下进行。在SPEX分光荧光计上测定提取物的荧光。使用预定的消光系数定量原卟啉IX(“Proto IX”)的累积量。结果示于表2。

表 2

平均生长抑制和Proto IX的积累试剂试剂浓度生长抑制 Proto IX量 Proto IX量

(μm) (％) (Pmoles)^** 相对％^***B 100 99 5.20 2364F 100 106 2.71 1232C 100 52 4.41 2005C 10 -15^* 0.57 259C 1 -26^* 0.19 86

^*“生长抑制”为负值是指发生生长。^** 每10⁶细胞的平均量。^*** 对照的百分数。

本发明的另一方面涉及原卟啉IX(“Proto IX”)的制备。在这方面，在含有上述试剂(该试剂能抑制原还原卟啉酶催化转化为原卟啉IX)的介质中，在黑暗(或在非原卟啉IX激发的光下)中，将真核生物微藻异养地培养。然后处理介质或藻或介质和藻，以萃取原卟啉IX，并从叶绿素、类胡萝卜素和细胞碎片等中分离。分离可以按任何常用的方法，如采用液相色谱法、包括反相液相色谱法，或溶剂萃取，或通过与金属如Fe、Zn或Mg的螯合作用而沉淀原卟啉IX，移出所产生的螯合物，如果需要，按已知的用稀酸处理螯合物的方法再生原卟啉IX。

分离步骤是在非原卟啉IX激发的光(如附录A、标题“黑暗”下所述的绿光)下或黑暗中进行。铁的螯合物的光敏性较差，因此在处理这种物质时，更可以光照。

优选的微藻最好以细胞悬浮液，在15～30℃的温度范围内培养。抑制剂的浓度，例如可以是约10^-5～10^-7M。所用的微藻实例是栅列藻属种(Scenedesmus sp)、马舌蝶衣藻(Chlamydomonas reinhardi)、裸藻属种(Euglenasp)和线形Bumilleriopsis(Bumilleriopsisfiliformis)。

实施例3

将马舌蝶衣藻(野生类)的对数期培养物，使用下述培养基，在一个不锈钢桶内(如300升)进行再培养。加入1-(乙酯基)-乙基-5-(2-氯-4-三氟甲基苯氧基)-2-硝基苯甲酸酯(乳吩，一种商购的苯醚除草剂)的丙酮溶液，其浓度为10^-5M，丙酮最终浓度为0.1％。使该混合物在黑暗中25℃下，在轻轻搅动和/或通风条件下培养4～7天。在保持黑暗时，过滤桶内所含物并处理其滤液以回收其中的原卟啉IX。

回收原卟啉IX的一种处理方法是过滤反应桶内的所含物(要保持黑暗)并在滤液中加入丙酮。用石油醚萃取混合物。然后用乙醚萃取含水丙酮混合物，通过蒸发除去乙醚，留下残余物。将该残余物溶于甲醇并进行反相色谱以得到原卟啉IX。在实施例1和2中所述的回收方法也可以使用。培养基的组成：

ml

原储

盐摩尔浓度原储液液/L柠檬酸钠·6H₂O 1.7×10^-3M 10％ 5微量金属如下如下 10FeCl₃·6H₂O 0.37×10^-3M 1％ 1CaCl₂·2H₂O 0.36×10^-3M 5.3％ 1MgSO₄·7H₂O 1.2×10^-3M 10％ 3NH₄NO₃ 3.7×10^-3M 10％ 3KH₂PO₄ 2.2×10^-3M 10％ 3K₂HPO₄ 1.7×10^-3M 10％ 3CH₃CO₂Na 7.5×10^-3M 10％ 10

微量金属混合物的原储液

H₃BO₃ 100mg/L

ZnSO₄·7H₂O 100mg/L

MnSO₄·4H₂O 40mg/L

COCl₂·6H₂O 20mg/L

NaMoO₄·2H₂O 20mg/L

CuSO₄ 4mg/L

不用马舌蝶衣藻而使用栅列藻种，在上述培养基上进行培养，但用葡萄糖代替乙酸钠。

实施例4

除了用除草化合物1-(4-氯-2-氟-5-炔丙基氧苯基)-3-甲基-4-二氟甲基-Δ²-1，2，4-三唑啉-5-酮代替乳吩之外，本实施例与实施例3相同。

实施例5

I₅₀的测定

(a)在完整的叶绿体中使用酶：

原还原卟啉1X(“Protogen 1X”)，原卟啉1X是由Porphgrin Products，Logan，UT购得并按T.P.Fuesler等人(Plant Physiol，67，246～249(1981))所述方法纯化。按N.J.Jacobs和J.M.Jacobs(Enzyme，28，206～219(1982))所述方法，用Na/Hg汞齐还原原卟啉1X而新鲜制备原还原卟啉1X，所用的纯化原卟啉1X浓度为300μM。

植物物质，在黑暗培养室中，在蛭石上，用市售(9-45-15)化肥灌溉而培养黄瓜(′Wisconsin SMR18′品种的黄瓜(Cucumis sativus L))。秧苗在25℃、相对湿度80～90％的条件下生长。用光密度为25μE/m^-2sec^-1(PAR)的光每60分钟的周期照射1分钟，间歇照射，光源是由电子计时器控制的通用电器“亮棒”(General Electric“BrightStick”)所提供。这样能使组织加速叶绿素合成，同时使淀粉储存和最初的叶绿素含量降至最小。

叶绿体分离按T.P.Fuesler等人(Plant Physiol75，662～664(1984))所述方法分离所生成的叶绿体，除了在最终纯化步骤之外，质体是通过40％而不是45％(v/v)的Percoll缓冲垫层(Percoll cushion )而离心的。将叶绿体重新悬浮在一种检定缓冲液中，至其最终浓度为2ng蛋白质/ml，该缓冲液含有0.5M甘露糖醇、20mM TES、10mMHEPES、PH7.7、1mM EDTA、1mM MgCl₂、1％(w/v)小牛血清清蛋白和1mM二硫赤藓糖醇。

原还原卟啉氧化酶的检测.按J.M.Jacobs和N.J.Jacobs(Arch.Biochem.Biophys.，229，312～319(1984))所述方法进行检测。用各种浓度的酸氟吩-甲基(acifluorfen-mefhyl)(“AFM”)或0.2％(v/v)丙酮(作为对照)，在黑暗中对0.2ml叶绿体悬浮液样品进行予培养15分钟。然后，将50μl新配制的原还原卟啉1X(约15nM)加入到悬浮液以开始反应。通过加入2.75ml N.J.Jacobs和J.M.Jacobs的荧光介质(Enzyme，28，209～219(1982))中止分析，该介质含有1％(v/v)吐温20(聚氧乙烯山梨醇酐-月桂酸酯)、50mM PH 8.5的Tris-HCl、1mM EDTA；以1mM二硫赤藓糖醇(“DTE”)代替5mM谷胱甘肽。在配备有用于混浊生物样品的正面荧光选择的SPEX Fluorolog-2型分光荧光计上对悬浮液直接读数，由在荧光介质中的纯化原卟啉1X所得的标准曲线(在400nm激发，在630nm的发射量对应原卟啉1X的量)中定量所产生的原卟啉1X的量。

为在上述检测中测定非酶催化氧化成的原卟啉1X的量，可以进行同样的分析，但除了采用在85℃加热15分钟已失活的叶绿体悬浮液代替活性叶绿体悬浮液以外。在有活性叶绿体时所生成的原卟啉IX量中减去这样生成的原卟啉IX量就得到酶催化所形成的原卟啉IX的量。结果以图示于图1(按照惯例，其中LSD表示最小有效偏差)。图1表明，I₅₀值(有50％抑制的浓度)低于0.1μM，即Q约0.03μM。

在叶绿体悬浮液中(在有ATP存在下)10μM AFM对原卟啉IX酶催化转化成原卟啉IX镁的作用的分析表明，AFM对这种转化没有抑制作用。

(b)使用分离的酶

植物物质和均化作用：将豌豆(碗豆变种(Pism sativumvar.)Little Marvel)在20℃黑暗培养室中发芽10天。光照植物每天1小时，使叶子明显展开同时叶绿素合成降至最小。叶子呈淡黄绿。

然后把叶子放入500ml研磨用介质中进行均化，该介质含有0.5M甘露糖醇、10mM HEPES、20mM TES、1mMEDTA、1mM MgCl₂、5mM半胱氨酸和0.2BSA、PH7.7。然后将该浆体通过4层粗平布，再通过43-微米的尼龙筛。然后将匀浆在4000g下离心3分钟。所得沉淀用于质体分离。

白色质体的分离和纯化：将沉淀(质体部分)重新悬浮在40ml测试介质(研磨用介质减去半胱氨酸但含有1mM DTE和1％ESA)中，并在150g下进行离心，以除去细胞碎片。所得上清液在4000g离心，并将重新悬浮的沉淀加在40％Percoll上。在6500g离心3分钟，整体白色质体在管底沉积。

用BioRad方法测定蛋白质含量。

酶增溶作用，按照Jacobs和Jacobs的方法增溶酶。质体沉淀并再悬浮在2.5ml缓冲液中，该缓冲液含有20mM Tris-MCl，30％甘油和1mM DTE PH7.6。在用60mHz的声波处理后，加入洗涤萃取介质，10％Triton 100 X、8％KCl和10mM PMSF，使最终得到：洗涤剂：蛋白为0.7(w/w)在48℃保温3小时后，在Beckman L2-65 B中，100000g下将膜制剂进行超速离心。

凝胶过滤，然后将含有增溶酶的上清液在一个Pharmacia PD-10G-25M Sephad ex柱上进行脱盐。将柱用25ml洗脱缓冲液(20mM Bistris-HCl、20％甘油、0.1％Triton，PH 6.8)洗涤。将试样加在柱上并用3.5ml缓冲液洗脱。弃去第1ml的馏份而收集剩下的2.5ml。然后，在-77℃、N₂条件下冷冻这些馏份。

用DEAE色谱法纯化，将0.75ml体积的质体-增溶的-酶制剂加到一个Waters Protein-Pak DEAE-5pw柱(8mm×7.5cm)上，该柱已用洗脱缓冲液平衡过。用洗脱缓冲液洗涤(1ml/分)60分钟后，用线性0.1M NaCl梯度液在100分钟内洗脱酶。在30分钟内梯度液由0.1M NaCl变到0.8M NaCl。收集4ml馏份，并分析其活性。用Water494紫外检测器(UV detector)在260nm处，灵敏度：1AU时，检测其峰值。

原还原卟啉氧化酶活性：按本实施例5(a)中所述的方法，检测原还原卟啉IX向原卟啉IX的酶催化转化作用。

在该试验中，化合物6c(实施例6中的)的I₅₀值为0.8～0.3μM(相当于pI₅₀ 6.1～6.5，其中pI₅₀为I₅₀摩尔浓度的负对数)；AFM的I₅₀值为0.08μM(pI₅₀为7.1)，化合物8v(实施例8中)的I₅₀值为0.08～0.03μM(pI₅₀ 7.1～7.5)。

实施例6

在本实施例中，将酶抑制剂加入到患有肿瘤的小鼠饲料中；将一些小鼠用作对照，其饲料中不添加抑制剂。然后将小鼠杀死，取出其肾、肠、肾上腺淋巴结、肝和肿瘤并分析它们的原卟啉IX的含量。使用了下列酶抑制剂：

更具体地说，小鼠是DBA/2 Ha小鼠，当天(0天)在右肩给小鼠注射SMT-F皮下肿瘤。分室放置的小鼠，第一天喂以未处理的Purina Rodent Chow 5001混合饲料，随后在第2至10天，小鼠喂以用2000ppm抑制剂处理的同样混合饲料(或者，对对照鼠则喂以同样的未处理混合饲料)。将混合饲料与少量要测试的试剂的丙酮溶液混洽而进行混合饲料的处理。然后在第10天将小鼠杀死，除了用试剂6j处理的小鼠以外，该小鼠在第7天就已杀死。将组织在4℃冷藏过夜，然后吸干，并记录每个组织试样的鲜重。将组织在5ml(对于肠和肝则为10ml)丙酮-0.1 NNH₄OH(9∶1，v/v)中均化。将均浆在1500g离心，并在SPEX FA 112型分光荧光计上分析其上清液，对原卟啉1X，选择400nm波长激发，630nm波长发射。测量原卟啉1X的积累，以每克组织的CPS(每秒钟所发射的荧光计数)表示。结果列于下表(对每个处理的结果都是两只小鼠的平均值，除了用试剂6f、6h、6i和6j处理的之外，用它们仅仅处理了一只小鼠)。

每克的原卟啉1X的平均cps×10^3*

切除肿瘤试剂肿瘤肝肾肾上腺肠的重量(mg)6a 1203 4291 10817 6572 5870^** 1436b 1520 1261 2441 2529 5577^** 906c 14336 2739 16186 13790 9937^** 1576d 2006 1581 12865 443 5565^** 2946e 837 876 915 1331 2069^** 1656f 449 1170 661 5611 1157 696g 166 803 606 1984 466 2506h 298 914 585 2259 584 1926i 932 1510 4014 36940 3454 206j 1251 538 315 491 572 11对照 239 536 494 1504 233 200

424^**

*表中数值等于原数据×10^-3。

**测试是在用3份碱性丙酮稀释的试样上进行的。

这些数据相当于在各自组织中的以下原卟啉1X的浓度，它是以每克组织的原卟啉ng量来表示：试剂肿瘤肝肾肾上腺肠6a 11 39 99 60 546b 14 12 22 23 516c 131 25 148 126 916d 18 14 117 4 516e 8 8 8 12 196f 4 11 6 51 116g 2 7 6 18 46h 3 8 5 21 56i 9 14 37 337 326j 11 5 3 4 5对照 2 5 5 14 2

4

在上面引用的Dougherty文章中，给同样类型(DBA/2Ha)小鼠注射10mg/kg的血卟啉衍生物后，在同样类型(SMT-F)肿瘤中得出的卟啉浓度为3.6μg/g。在其它专业文献(Moan等人，P&P46-5，713～721页；在716页的图2注解)中提出，在给DBA/H₂小鼠腹膜内注射25mg/kg Photofrin II(在光中发荧光的处理和瘤症检测中广泛使用的敏化剂)后，在肿瘤(C₃H/Tif哺乳动物癌)中的原卟啉浓度达到约12μg/g。

小鼠消耗的含试剂饲料的总重量如下：6a，22和35g；6b，37和35g；6c，25和22g；6d，41和32g；6e，40和44g；6f，27g；6g，33和40g；6h，36g；6i，10g；6j，20g 。

在本实施例6所述实验的准备中，要进行下列常规步骤，使用在该实施例6c指出的试剂(除非另有注明)，并用非患肿瘤的动物：

(a)对鼠的LD₅₀超过2600mg/kg(即试剂mg/体重k9)(一次口服含15％试剂的玉米油的剂量后，在14天期间内测试)和对小鼠LD₅₀超过700mg/kg(一次口服含5％试剂和玉米油的剂量后，在14天期间内测试)的试剂进行测定。

(b)在腹膜内注射的赋形剂试验中，没有试剂，测试后得知，小鼠能够忍受注射0.5ml剂量的等量DMSO(二甲基亚砜)和水的混合物。

(c)在腹膜内注射的试剂试验中，试剂是在60％玉米油和40％DMSO的混合物中，测得结果表明，小鼠可以忍受100mg/kg剂量。

(d)用小鼠进行下列试验：

(i)每天管饲口服50mg/kg(用1％试剂的丙酮溶液)8天，

(ii)每天腹膜内注射50mg/kg(用1％试剂的矿物油分散液，将试剂溶于1滴DMSO中并与矿物油混合而制成)共8天；

(iii)每天在皮肤上使用50mg/kg(用1％的DMSO溶液)，共8天；

(iv)喂以8天，掺有2000ppm试剂(基于饲料重量)的标准饲料；

(v)每天静脉注射50mg/kg(用2％DMSO溶液)，共四天。

然后将这些用于试验的小鼠杀死，并测定其组织的原卟啉IX的积累。

在另一个试验中，用含5000ppm试剂6c的饲料喂养雄性Fisher 344大鼠27天，然后杀死，该鼠的组织表明，与对照相比，在肾，肠，胃和脑中所增高的原卟啉量增高明显，而在肌肉组织内只有很少增加。

在上面的大鼠和小鼠试验中，动物是保持在标准的12小时黑暗--12小时明亮的循环中。

实施例7

和实施例1和2的系列一起的一系列实验中，将海拉细胞培养物在有100μM的下列各种处理剂存在下进行培养。几乎每个处理剂给出的百分数都表示，在有处理剂存在下所产生的原卟啉IX量，与相同实验的对照例所产生的量相比，是有增加的。

实施例6所用的试剂：6a，337％；6b，366％；6c，297％；6d，1200％；6e，1210％；6f，280％6g，326％；6h，431％；6i，544％；6j，469％。其它试剂：

与实施例1和2中一样，本实施例7的数据是基于荧光法测量(例如按每秒计数“cps”)。但是在本例中只对细胞提取物进行测量(与实施例1和2不同，在实施例1和2中，破碎的细胞和培养基是一起被提取的)，荧光基质是在实施例5中所描述的那种(含有1％吐温-20，50 mM Tris-Hcl，1mM EDTA和1mM二硫赤藓糖醇，PH 8.5)，而且荧光基质本身也进行了cps测量。在计标本例前面数据时，可用下面的公式计算百分增长数：

[\frac{Ca - Cm}{Cc - Cm} \times 100] - 100

其中Ca是用试剂处理后所得样品的每秒计数，Cc是对照样品的每秒计数，Cm是荧光基质本身的每秒计数(即本底荧光)。从这些数据可以看出，这套实验中Cc-Cm值与Cm值相比相当小；例如对Cc的单独测量值为49025和52069，而对Cm为4295。所以使用上面的公式不能很好地说明化合物的效用。因此，使用下面的公式重新计算数据：

\frac{Ca}{Cc} \times 100 %

结果如下：6a 336％；6b 148％；6c 154％；6d 510％；6e 320％；6f 280％；6g 329％；6h 178％；6i 171％；6j 185％；7a 118％；7b 142％；7c 103％；7d 128％；7e 173％；7f 118％；7g 155％；7h 118％。

实施例8

在本实施例中，分另对处理过的海拉细胞及其培养基的原卟啉1X含量进行分析，证明在处理过程中细胞中所生成的大量原卟啉1X是分泌于培养基中。

按实施例1和2的同样方法，将海拉细胞培养物在有100μM的下面所列各种处理剂存在的条件下进行培养，将处理剂加入到二甲基亚砜(DMSO)的稀释溶液中，而对照例中只含有0.2％DMSOv/v。这样培养后，将培养基倒出以从细胞中分出，通过加入0.25％w/v胰蛋白在37℃浸渍细胞20分钟，使细胞从瓶中松开后，在瓶中再加入荧光介质。荧光介质与实施例7中所述相同，除了其PH值是6.5。此介质也可用作萃取剂，对所得萃取物进行原卟啉1X含量分析。对分离出的培养基也进行原卟啉1X含量的荧光分析。几乎每种处理剂所给出的百分数对，都说明，有处理剂存在下所产生的原卟啉1X量对应于在同样实验中的对照例中所产生的原卟啉1X量；每对数据的第一个值是培养基中原卟啉1X的浓度而第二个值是在细胞中的浓度。

8a.107％，98％ 8f.207％，108％

8g.149％，105％ 8h.776％，252％

8i.101％，99％ 8j.153％，105％

8h.124％，102％ 8l.129％，100％

8m.289％，134％ 8n.297％，135％

8o.112％，103％ 8p.110％，96％

8g.120％，101％ 8r.140％，102％

8g.115％，106％ 8t.150％，105％

8u.122％，100％ 8v.172％，111％

8w.121％，102 8x.192％，118％

8g.126％，101％ 8x.183％，112％

8aa.101％，100％ 8ab.122％，101％ 8ac.123％，101％ 8ac.123％，101％

8ae.126％，101％ 8af.115％，97％

8ag.110％，99％ 8ah.109％，97％ 8ai.200％，118％ 8aj.104％，100％

8ak.10％，98％ 8al.102％，98％

8am.434％，191％ 8an.712％，291％

8ao.587％，214％ 8ap.304％，185％

8ag. 210％，126％ 8ar.122％，106％ 6b.271％，142％ 6c.772％，280％ 6e. 690％，256％

对于化合物8t-8ar，与对照例比较，对细胞生长的粗略观察表明，某些试剂对细胞生长有如下的抑制作用：

8aj，ag ar：25％抑制

t，ac，ai，ak，an，ap：50％抑制

u：60％抑制

v：90％抑制

ab，ad，ae，af，ah：致死的

实施例9

在本实施例中，用实施例6的酶抑制剂6c喂大鼠，将肿瘤植入大鼠中，对有肿瘤的区域进行光照，使肿瘤消退。

特别是，对3只平均体重120克的Spraque-Dawley大鼠喂以含2000ppm试剂的食物共6天。在第三天，通过注射0.3ml肿瘤细胞的悬浮液(约一百万个肿瘤细胞)将软骨肉瘤植入每只大鼠的右后肢。在第6天，将每只大鼠的左后肢剃刮并去毛，测量每个肿瘤的大小，使用不致热剂量的630nm的光对肿瘤区域及其周围皮肤进行总量为270J/cm²的光照。第二天发现两只大鼠已明显没有肿瘤(即没有可触及的肿瘤块)，第三只大鼠的胞瘤几乎完全消退，周围的皮肤和肌肉组织稍有变白而且有些肿胀，但是与用Photofrin II间接的光中发生荧光的治疗相比，肿胀明显要小。

在另一套实验中，给20只大鼠在光照处理前10天，任意地喂以上述相同的食物(即含2000ppm试剂的饲料)，并在动物喂食7天后，注入肿瘤细胞悬浮液。这样注射在1-2天内会引起生成具有充分确定血管网的肿癌。在用光处理时，肿瘤直径为5～8mm，并且没有明显的坏死。在光处理的下一天，观察到75％受处理的肿瘤有明显消退，这种消退是明显的因没有可触及肿瘤块而且在肿瘤形成处有一些暗黑。但是，在时间过去时，有95％肿瘤重新生长，说明这种特定光处理还留下了一些存活的肿瘤细胞，通过下面一种或多种方法以改变这种处理是合乎需要的：较长的光处理、一种或多种另外的光处理、较高的试剂剂量、使肿瘤细胞进行比3天更长时间的酶抑制剂处理、改变用药方式，例如注射。

所用光处理不会对处理区域引起明显的血流堵塞，这已由在光照后，立即注射Sodium fluoroscin而证实。

重复大鼠的予备实验，使用口服相同剂量的化合物8c(在实施例8的试验中比化合物6c的活性低得多的一种试剂)进行处理，没有产生任何肿瘤消退。

通过化合物对在海拉细胞培养物中所产生的原卟啉IX的作用的测试(如上述实施例1、2、7和8)可以方便地筛选酶抑制剂(例如已知的“过氧化的除草剂”)。可以用其它细胞系代替海拉细胞，例如未分化的哺乳动物细胞，如淋巴细胞、小鼠白血病细胞、人胎儿肺纤维细胞、中国大田鼠卵巢细胞或任何其它可再生或产生血红素的哺乳动物细胞系。

附录A

流失百分数的测试

使用从黄化黄瓜秧收集的子叶进行流失百分数的试验。最初的步骤是用含放射性标记的糖的缓冲水溶液在黑暗中处理子叶片。然后测量被子叶吸收的糖量(按下述方法计数)。然后将子叶片分成两部分，一部分子叶在黑暗中用含有要测试化合物的缓冲水溶液进行处理，而另一部分则在黑暗中用不含要测化合物的另外相同的溶液以相同方法进行处理，作为对照。与水溶液接触的子叶光照16小时后，从水溶液中分出，然后进行测量(通过计数)水溶液以测定其放射性标记物质的含量。结果以流失百分数表示，它可以用下述方法计标，其中S是初始处理时子叶所吸收的放射性标记物质的计数(每个子叶)，S_T是光照后含要测试化合物的水溶液中放射性标记物质的计数(每个子叶)，Sc是光照后对照水溶液中放射性标记物质的计数(每个子叶)：

更具体的是，下述物质和条件是在流失百分数试验中所使用的。

植物物质：在蛭石中用市售(9-45-15)化肥浇灌黄瓜子(“Wisconsin SMR 18″品种的黄瓜)而使之发芽和生长。在黑暗的培养室中使秧苗在25℃和80～90RH中生长。由种植后5天的黄化秧苗中收集子叶并用1.0mM CaCl₂冲洗，所有操作都是在绿光下进行。

缓冲溶液：1mM KCl、1mM CaCl₂和2.0mM磷酸钾，PH值调至6.5(如用NaOH)。

放射性标记的糖：比放为10.9GBq/mmol的3-0-甲基-3-〔u-14c〕葡萄糖(Amersham Corp.，Arlington Heights IL)。

初始处理：将洗好的子叶(180～230)加到含50ml缓冲溶液的250ml广口泡沫塞好(foam-stoppered)的Erlenmeyer瓶中，并加入放射性标记的糖，使其在溶液中的浓度为600nM。在暗处，在转动摇床上将瓶以125rpm的转速振摇24小时。然后将子叶盖在尼龙筛上并用20ml体积的1mMCaCl₂冲洗3次。通过在NCS组织增溶剂(Amersham Corp)中消化三份5个子叶的样品而测量所摄取的放射性标记的糖量，并在液体闪烁谱仪中对所得浸渍物计数。(已发现由这些消化液中得出的结果与通过在自氧化器中燃烧样品子叶向所得的同样测定的结果相同。)

用要测试化合物处理(和对照处理)：

在一个直径35mm有盖的塑料佩替氏培养皿中，将5个子叶离轴向上地悬浮在3ml缓冲液上，然后加入要测试的化合物(以其丙酮溶液形式)，使要测试的化合物在缓冲溶液中达到予定浓度(下面将讨论)，与含测试化合物的溶液一样，在对照例中，丙酮在缓冲溶液中的浓度为0.1％(v/v)。在转动摇床面上，以90rpm转速振摇培养皿使悬浮的子叶旋动16小时。

光照：在形态的光合活性区(PAR)用四只GE F20T1-CW荧光灯以150μE m^-2 sec^-1的测量强度对盛有悬浮于溶液上子叶的培养皿进行光照16小时(在子叶的表面测量)，同时振摇培养皿。

液体中放射性标记物质含量的测定：从子叶中分离全部液体，然后在液体闪烁谱仪中计数。

黑暗：在照明步骤前的全部处理都是在黑暗中或在绿色荧光下进行(即通过一个能使450～600nm的光通过的绿色可塑阈滤光片(plastic cut-off filter)过滤的光)。

附录B

培养基：培养基M

盐摩尔浓度原储液 ml原

储液/L柠檬酸钠·6 H₂O 1.7×10^-3M 10％ 5微量金属如下如下 10FeCl₃·6H₂O 0.37×10^-3M 1％ 1CaCl₂·2H₂O 0.36×10^-3M 5.3％ 1MgSO₄·7H₂O 1.2×10^-3M 10％ 3NH₄NO₃ 3.7×10^-3M 10％ 3KH₂PO₄ 2.2×10^-3M 10％ 3K₂HPO₄ 1.7×10^-3M 10％ 3

微量金属混合物的原储液

H₃BO₃ 100mg/L

ZnSO₄·7H₂O 100mg/L

MnSO₄·4H₂O 40mg/L

COCl₂·6H₂O 20mg/IL

NaMoO₄·2H₂O 20mg/L

CuSO₄ 4mg/L

培养基A是由在培养基M中加入10ml/l 10％乙酸钠水溶液(7.5×10^-3M)而制备的。

按上面所列顺序将各成份加到蒸馏水中，并以15psi(磅/时²)的压力，高压蒸煮15分钟。

在光照下储备培养物的培养：

在25℃，在用聚尿烷塞子塞好的Erlenmeyer瓶中，在14/10小时光照/黑暗的循环过程中使Y-1细胞的储备培养物无污染地保持在液体培养基A或M中，最好在培养基M中。储备培养物在125 rpm转速的转动摇床上，在没有补充通气的条件下进行培养。培养物面上的光照强度是120 μE·m^-2·sec^-1(PAR)。在这些条件下培养物处于半同步生长模式，直至它们达到2-4×10⁶细胞/ml的稳定期。

无光照下培养物的培养(黑暗培养的培养物)

将由光照下培养的稳定期储备培养物的细胞(7.5ml)转入Erlenm8yer瓶中的750ml培养基A中。通过一个水下充气管充气，将细胞在黑暗中，25℃培养3-4天。在此期间，Y-1细胞培养物将进行7-8次细胞分裂，失去所有可见的叶绿素，而浓度为2-3×10⁶细胞/ml。

用于测试的细胞制备：

在约20℃低速离心(即约2000rpm)约5分钟，从新鲜制备的黑暗生长的培养物(750ml)中收集细胞。将细胞轻轻地重新悬浮在50ml培养基A中。测定这悬浮样品(约0.25ml)的活动性，并用1％戊二醛水溶液固定后，进行细胞计数以测定细胞/ml值。正常的细胞计数是约5×10⁷细胞/ml。将1ml等分样品(10⁷细胞/ml)加到测试容器(例如，Falcon^24-孔组织培养皿)中。此时细胞非常活动并且呈黄色。

将测试化合物溶于溶剂(丙酮、乙醇、二甲基亚砜或水，优选的是丙酮)中，使其浓度为最终浓度的1000倍。用5或10μl微型注射器将1μl该测试液加到每两个孔中。

按上述方式，在每个组织培养血中制备四个没有测试化合物的对照照孔。将组织培养皿用透明塑料盖盖上，并放入25℃、备有70～90μE·m^-2·sec^-1的光强度的培养箱中保持13～16小时。如果测试孔中的内含物呈现黄色，则按下面结果鉴定一节中所述方法萃取。如果测试孔中的内含物呈现透明或淡绿色，则应在萃取前将其置于125rpm转速的转动床上，并以约600μE·m^-2··sec^-1的光强度照射2小时。

结果鉴定

将10％十二烷基硫酸钠的水溶液(250μl)和甲醇(1ml)加至每个测试孔中，并彻底混合。将混合物在黑暗中放置3-4小时。将组织培养皿在室温低速(约2000rpm)离心5分钟。移出上清液，并在Beckman 35型分光光度计上，在350nm和500nm波长之间进行原吓啉IX存在的分析，在668nm处是该溶剂系统的叶绿素吸收峰，在720nm处是用于混浊度本底的读数。

数据分析

对每个孔，从668nm读数中减去720读数就得到绿色值。这些值是每个要测试化合物浓度和对照例的平均值。百分抑制率是：

Claims

1.一种化合物在制备光动力治疗或检查肿瘤中使用的药物组合物中的应用，其特征在于，该化合物是原还原卟啉通过还原卟啉氧化酶而酶催化转化为原卟啉IX的特异性抑制剂，所述化合物对原还原卟啉氧化酶的I₅₀小于1μM。

2.一种化合物在制备光动力治疗或检查肿瘤中使用的药物组合物中的应用，其特征在于，该化合物是原原还原卟啉通过还原卟啉氧化酶而酶催化转化为原卟啉IX的特异性抑制剂，所述化合物不是四吡咯，所述化合物的氧化还原电位势更负于一500mv。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述的化合物是1-(4-氯-2-氟-5-炔丙基氧苯基)-3-甲基-4-二氟甲基-△²-1，2，4，-三唑啉-5-酮。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述的化合物是芳基三唑啉酮、芳基四唑啉酮、芳基三嗪二酮、芳基噁二唑、芳基四氢吲唑、芳基四氢酞亚胺、芳基乙内酰脲、芳基尿唑、芳基六氢哒嗪、芳基杂环尿烷、苯氧基苯基化合物、芳基吡唑或下式化合物

其中X^b是O或S，“Ph”是取代的苯基。

5.根据权利要求4所述的应用，其中芳基具有酸性磺酰氮基或它的水溶性盐的取代基。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述的化合物是芳基三唑啉酮。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述的化合物具有下式：