CZ272698A3 - Molekula DNA kódující rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu a její mutovanou formu rezistentní k inhibitoru - Google Patents

Molekula DNA kódující rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu a její mutovanou formu rezistentní k inhibitoru Download PDF

Info

Publication number
CZ272698A3
CZ272698A3 CZ982726A CZ272698A CZ272698A3 CZ 272698 A3 CZ272698 A3 CZ 272698A3 CZ 982726 A CZ982726 A CZ 982726A CZ 272698 A CZ272698 A CZ 272698A CZ 272698 A3 CZ272698 A3 CZ 272698A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protox
sequence
amino acid
dna molecule
plant
Prior art date
Application number
CZ982726A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297325B6 (cs
Inventor
Sandra L. Volrath
Marie A. Johnson
Sharon L. Potter
Eric R. Ward
Peter B. Heifetz
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ272698A3 publication Critical patent/CZ272698A3/cs
Publication of CZ297325B6 publication Critical patent/CZ297325B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se obecně týká rostlinného enzymu protoporfyrinogenoxidázy („protox). Zvláště se vynález týká molekuly DNA kódující tento enzym a jeho modifikované formy rezistentní k inhibitoru. Vynález se dále týká způsobů selekce tkáňových kultur a aplikace herbicidů, které jsou založeny na těchto modifikovaných formách.
Dosavadní stav techniky
I. Enzym protoporfyrinogenoxidáza (protox) a jeho účast v biosyntéze chlorofylu/hemu
Biosyntetické cesty vedoucí k tvorbě chlorofylu a hernu sdílejí řadu společných kroků. Chlorofyl je světlosběrný. pigment přítomný ve všech zelených fotosyntetických organismech. Hem je kofaktor hemoglobinu, cytochromů, oxygenáz P450 se smíšenou funkcí, peroxidáz a kataláz (viz např. Lehningér, Biochemistry, Worth Publishers, New York, 1975) , a je proto nepostradatelnou složkou všech aerobních organismů.
Poslední společný krok v biosyntéze chlororofylu a hernu je oxidace protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX. Protoporfyrinogenoxidáza (nadále označovaná jako „protox) je enzym, který katalyzuje tento poslední krok (Matringe et al., Biochem J. 260: 231, 1989).
Enzym protoporfyrinogenoxidáza byl purifikován, buďto částečně nebo úplně, z mnoha různých organismů včetně kvasinek Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois a Labbe, Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, ed., McGraw Hill,
• ·
New York, s. 235-285, 1990), etioplastů ječmene (Jacobs a Jacobs, Biochem J. 244: 219, 1987) a myších jater (Dailey a Karr, Bichem. 26: 2697, 1987). Geny kódující protox byly izolovány ze dvou prokaryotických organismů, a sice Escherichia coli (Sasarman et al. , Can. J. Microbiol. 39: 1155, 1993) a Bacillus subtilis (Dailey et al. , J. Biol. Chem. 269: 813, 1994). Tyto geny nemají žádnou podobnost v sekvencích a ani proteinové produkty predikované na jejich základě nesdílejí žádnou identickou sekvenci aminokyselin. Protein z E. Coli je velký asi 21 kDa a je asociován s buněčnou membránou. Protein z B. subtilis je velký asi 51 kDa, je rozpustný a aktivní je v cytoplazmě.
cDNA kódující lidskou protox byla v nedávné době izolována (Nishimura et al. , J. Biol. Chem. 270(14) : 8076-8080, 1995) a také byla izolována rostlinná cDNA (Mezinárodní patentová přihláška PCT/IB95/00452, podaná 8. června 1995, publikovaná 21. prosince 1995 jako WO 95/34659).
II. Gen protox jako cíl herbicidů
Použití herbicidů k omezení nežádoucí vegetace jako jsou plevely nebo jiné nežádoucí rostliny v plodinách se stalo univerzální praxí. Odpovídající trh představuje ročně více než miliardu dolarů. I přes toto extenzivní využívání, kontrola plevelů představuje pro zemědělce významný a často finančně náročný problém.
Efektivní využití herbicidů vyžaduje dobrý management. Např. vhodná doba a způsob aplikace, a také vývojové stadium plevelu, jsou kritické faktory pro účinnou kontrolu plevele užitím herbicidů. Vzhledem k tomu, že některé plevely jsou rezistentní k herbicidům, výroba účinných herbicidů je stále důležitěj ší.
·· ·· < > · · · ·
I · · · 4 ft · · · · · ·
Naneštěstí herbicidy, které mají největší potenciál, širší druhové spektrum a rychlejší degradaci v půdě, mohou být také nejvíce fytotoxické pro plodiny. Jedno řešení tohoto problému bylo vyvinutí plodin rezistentních nebo tolerantních k herbicidům. Hybridi nebo variety plodin rezistentní k herbicidům umožňují použití herbicidů bez rizika poškození plodiny. Vývoj rezistence umožňuje také použití herbicidů i tam, kde to dříve nebylo možné nebo to bylo možné jen omezeně (např. použití před vzcházením) vzhledem k citlivosti plodiny k herbicidu. Např. U.S. patent č. 4 761 373 Andersona et al. popisuje rostliny rezistentní k různým imidazolinonovým nebo sulfonamidovým herbicidům. Rezistence je způsobena změněným enzymem syntézou acetohydroxykyseliny (AHAS) . U.S. patent č. 4 975 374 Goodmana et al. se týká rostlinných buněk a rostlin obsahujících gen kódující mutovanou glutaminsyntetázu (GS) rezistentní k inhibici herbicidy, které jsou známy tím, že inhibují GS, jako je např. fosfinotricin nebo methioninsulfoximin. U.S. patent č. 5 013 659 Bedbrooka et al. se týká- rostlin, které exprimují mutovanou acetolaktátsyntázu, která udílí rostlinám rezistenci k inhibici sulfonylmočovinovými herbicidy.
U.S. patent č. 5 162 602 Somerse et al. popisuje rostliny tolerantní k inhibici herbicidy založenými na cyklohexandionu a kyselině aryloxyfenoxypropanové. Tolerance je udílena změněnou acetylkoenzym-A-karboxylázou (ACCase).
Enzym protox slouží jako cíl mnoha různých herbicidních sloučenin. Herbicidy, které inhibují protox, zahrnují molekuly mnoha různých strukturních tříd (Duke et al., Weed Sci. 39: 465, 1991, Nandihalli et al. , Pesticide Biochem. Physiol.43: 193, 1992, Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35, 1989, Yanase a Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70, 1989). Tyto herbicidní sloučeniny zahrnují difenlyétery • · • · ··· · (např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluorometyl)fenoxy]-2nítrobenzoová kyselina a její metylester, oxyfluorfen, 2chloro-1-(3-etoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)), oxidiazoly (např. Oxidiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyl etoxy) fenyl]-5- (1,1-dime tyle tyl) -1,3,4-oxadiazol-2- (3H) -on) , cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid, chloroftalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylpyrazoly (např. TNPP-etyl, etyl-2-[l-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionát, M&B 39279), pyridinové deriváty (např. LS 82-556), fenopylát a jeho O-fenylpyrollidinové a piperidinokarbamátové analogy. Mnohé z těchto sloučenin kompetitivně inhibují normální reakci katalyzovanou enzymem, působí tedy zjevně jako analogy substrátu.
Inhibiční vliv na protox se typicky určuje měřením fluorescence v oblasti 622 až 635 nm, po excitaci v pásmu 395 až 410 nm (Jacobs a Jacobs, Enzyme 28: 206, 1982, Sherman et al. , Plant Physiol. 97: 280, 1991). Tento test je založen na skutečnosti, že protoporfyrin IX je fluorescenční pigment, zatímco protoporfyrinogen IX není.
Předpokládaný způsob působení herbicidů inhibujících protox zahrnuje akumulaci protoporfyrinogenu IX v chloroplastu. Předpokládá se, že tato akumulace vede k pronikání protoporfyrinogenu IX do cytosolu, kde je oxidován peroxidázovou aktivitou na protoporfyrin IX. Pokud je vystaven světlu, protoporfyrin IX může způsobovat tvorbu singletního kyslíku v cytosolu. Singletní kyslík může zase vést k tvoprbě dalších reaktivních molekul kyslíku, což může způsobovat peroxidaci lipidů a popraskání membrán, vedoucí až k rychlé buněčné smrti (Lee et al. , Plant Physiol. 102: 881, 1993).
• ·
Všechny enzymy protox nejsou citlivé k herbicidům, které inhibuj£ rostlinný enzym protox. Jak protox kódovaná geny izolovanými z Escherichia coli (Sasarman et al. , Can.
J. Microbiol. 39: 1155, 1993) tak i z Bacillus subtilis (Dailey et al. , J. Biol. Chem. 269: 813, 1994) jsou rezistentní k těmto herbicidovým inhibitorům. Kromě toho byly popsány mutanty jednobuněčné řasy Chlamydomonas reinhardtii rezistentní k fenylimidovému herbicidu S-23142 (Kataoka et al. , Pesticide Sci. 15: 449, 1990, Shibata et al. , In: Research in Photosynthesis, Vol. III, Murata, N., ed., Kluwer, Netherlands, s. 567-570, 1992). Přinejmenším jedna z těchto mutant má zřejmě změněnou aktivitu protox, která je rezistentní nejen k herbicidovým inhibitorům, na kterých byly mutanty selektovány, ale také k jiným třídám inhibitorů protox (Oshio et al. , Z. Naturforsch. 48c: 339, 1993, Sáto et al., In: ACS Symposium on Porphyric Pesticides, Duke, S., ed. , ACS Press, Washington, D.C., 1994). Byla popsána také mutovaná buněčná linie tabáku, která je rezistentní k inhibitoru S-21432 (Che et al. , Z. Naturforsch. 48c: 350,
1993).
Podstata vynálezu
Shrnutí vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu DNA a chimérický gen kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z pšenice, sóji, bavlniku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže a ěiroku. Sekvence takových izolovaných molekul DNA jsou zde uvedeny jako sekvence s identifikačním číslem (id. č.) 9 (pšenice), 11 (sója), 15 (bavlník) , 17 (cukrová řepa), 19 (řepka olejka), 21 (rýže) a 23 (čirok).
• · ··· ····
Předkládaný vynález také poskytuje modifikované formy rostlinného enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox), které jsou rezistentní ke sloučeninám, inhibujícím nemodifikovaný přirozeně se vyskytující rostlinný enzym protox, a dále molekuly DNA kódující takové rostlinné enzymy protox rezistentní k inhibitoru. Předkládaný vynález zahrnuje také chimérické geny a modifikované formy přirozeně se vyskytujících genů protox, které mohou v rostlinách exprimovat rostlinné enzymy protox rezistentní k inhibitoru.
Geny kódující rostlinné enzymy protox rezistentní k inhibitoru se mohou použít k tomu, aby poskytly rezistenci k herbicidům inhibujícím protox v celé rostlině a jako selektovatelný markér použitelný v metodách transformace rostlin. Tudíž předkládaný vynález obsahuje také rostliny, včetně jejich potomstva, rostlinné pletivo a rostlinná semena, obsahující geny kódující tyto modifikované formy enzymu protox exprimovatelné v rostlině. Tyto rostliny, rostlinné pletivo a rostlinná semena jsou rezistentní k inhibitorům protox v hladinách, které inhibuji aktivitu přirozeně se vyskytující protox v rostlinách. Rostliny zahrnuté do vynálezu jsou zvláště ty, které by byly potenciálním cílem pro herbicidy inhibující protox, zejména agronomicky důležité plodiny jako je kukuřice a další obiloviny jako např. ječmen, pšenice, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso a rýže. Vynález také zahrnuje další plodiny jako jsou např. cukrová třtina, sója, bavlník, cukrová řepa, řepka olejka a tabák.
Předkládaný vynález se dále týká způsobů přípravy rostlin, včetně rostlinného materiálu jako jsou např. rostlinná pletiva, protoplasty, buňky, kalusy, orgány, semena, embrya, pyl, vaječné buňky, zygoty, společně s jakýmkoliv rozmnožovacím materiálem a částmi rostlin, jako např. květy, stonky, plody, listy, kořeny vznikající na transgenních rostlinách nebo jejich potomstvu, které byly předtím transformované způsobem podle předkládaného vynálezu, který vede k formě rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru. Takové rostliny mohou být trvale transformované strukturním genem kódujícím rezistentní protox, nebo připraveny technikou přímé selekce, kde se linie rezistentní k herbicidu izolují, charakterizují a vyvíjejí. Předkládaný vynález zahrnuje také použití techniky transformace plastidu pro expresi genu protox v chloroplastu.
Předkládaný vynález se dále týká sond a způsobů detekce přítomnosti genů kódujících formy rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, a dále kvantifikace hladiny transkriptů forem protox rezistentních k inhibitoru v rostlinném pletivu. Tyto způsoby je možné použít pro identifikaci nebo screening rostlin nebo rostlinných pletiv obsahujících a/nebo exprimujicích gen kódující formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru.
Popis seznamu sekvencí
Sekvence identifikačního čísla (dále jen id. č.) 1: Sekvence
DNA kódující protein protox-1 z Arabidopsis thaliana.
Sekvence id. č. 2: Aminokyselinová sekvence protox-1 z Arabidopsis kódovaná sekvencí i. č. 1.
Sekvence id. č. 3: Sekvence DNA kódující protein protox-2 z Arabidopsis thaliana.
Sekvence id. č. 4: Aminokyselinová sekvence protox-2 z Arabidopsis kódovaná sekvencí i. č. 3.
Sekvence id. č. 5: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z kukuřice.
Sekvence id. č. 6: Aminokyselinová sekvence protox-1 z kukuřice kódovaná sekvencí i. č. 5.
Sekvence id. č. 7: Sekvence DNA kódující protein protox-2 z kukuřice.
Sekvence id. č. 8: Aminokyselinová sekvence protox-2 z kukuřice kódovaná sekvencí i. č. 7.
Sekvence id. č. 9: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z pšenice.
Sekvence id. č. 10: Aminokyselinová sekvence protox-1 z pšenice kódovaná sekvencí i. č. 9.
Sekvence id. č. 11: Sekvence DNA kódující protein protox-1 ze soj i.
Sekvence id. č. 12: Aminokyselinová sekvence protox-1 ze sóji kódovaná sekvencí i. č. 11.
Sekvence id. č. 13: Sekvence promotoru genu protox-1 z Arabidopsis thaliana.
Sekvence id. č. 14: Sekvence promotoru genu protox-1 z kukuřice.
Sekvence id. č. 15: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z bavlníku.
Sekvence id. č. 16: Aminokyselinová sekvence protox-1 z bavlníku kódovaná sekvencí i. č. 15.
Sekvence id. č. 17: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z řepy cukrovky.
Sekvence id. č. 18: Aminokyselinová sekvence protox-1 z řepy cukrovky kódovaná sekvencí i. č. 17.
Sekvence id. č. 19: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z řepky olejky.
Sekvence id. č. 20: Aminokyselinová sekvence protox-1 z řepky olejky kódovaná sekvencí i. č. 19.
Sekvence id. č. 21: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z rýže.
• ·· ·· · 0 • 0 • · • 0 • •0 0·00 » 000
Sekvence id. č. 22: Aminokyselinová sekvence protox-1 z rýže kódovaná sekvencí i. č. 21.
Sekvence id. č. 23 : Sekvence DNA kódující protein protox-1
z čiroku.
Sekvence id. v* , c. 24 : Aminokyselinová sekvence protox-1 z
čiroku kódovaná sekvencí i. č. 23.
Sekvence id. č. 25 : Sekvence intronu genu protox-1 z kukuři-
ce.
Sekvence id. č. 26 : Sekvence promotoru genu protox-1 z řepy
cukrovky.
Sekvence id. č. 27 : Pclp Pia - PCR primer pro horní řetězec
promotoru plastidového genu clpP.
Sekvence id. č. 28 : Pclp_Plb - PCR primer pro spodní řetězec
promotoru plastidového genu clpP.
Sekvence id. č. 29 : Pclp_P2b - PCR primer pro spodní řetězec
promotoru plastidového genu clpP.
Sekvence id. č. 30: Trpsl6_Pla - PCR primer pro horní řetězec promotoru plastidového genu rpsl6.
Sekvence id. č. 31: Trpsl6_Plb - PCR primer pro spodní řetězec promotoru plastidového genu rpslS.
Sekvence id. č. 32: minpsb_U - PCR primer pro horní řetězec promotoru plastidového genu psbA.
Sekvence id. č. 33: minpsb_L - PCR primer pro spodní řetězec promotoru plastidového genu psbA.
Sekvence id. č. 34: APRTXPla - PCR primer pro horní řetězec. Sekvence id. č. 35: APRTXPlb - PCR primer pro spodní řetězec .
Uložení
Vektorové molekuly uvedené v následujícím seznamu byly uloženy ve sbírce „Patent Culture Collection, NRRL, Agri• · • 9999 ·· 99
9 9 9
9 9
9 9999
9 9 cultural Research Service, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A., a to k uvedenému datu.
Protox-la z pšenice, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 9. března 1996 jako pWDC-13 (NRRL č. B-21545).
Protox-1 ze sóji, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen
15. prosince 1995 jako pWDC-12 (NRRL č. B-21516).
Protox-1 z bavlníku, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 1. července 1996 jako pWDC-15 (NRRL č. B-21594).
Protox-1 z cukrové řepy, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 29. července 1996 jako pWDC-16 (NRRL č. B-21595).
Protox-1 z řepky olejky, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 23. srpna 1996 jako pWDC-17 (NRRL č. B-21615).
Protox-1 z rýže, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen
6. prosince 1996 jako pWDC-18 (NRRL č. B-21648).
Protox-1 z čiroku, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 6. prosince 1996 jako pWDC-19 (NRRL č. B-21549).
Rezistentní mutant pAraC-2Cys, ve vektoru pMut_l, byla uloženal4. listopadu 1996 ve Sbírce kultur zemědělského výzkumu (Agricultural Research Culture Collection) pod depositním číslem NRRL 21339N.
AraPTÍPo obsahující promotor Protox -1 z Arabidopsis byl uložen 15. prosince 1995 jako pWDC-11 (NRRL č. B21515).
Plazmid obsahující promotor protox -1 z kukuřice fúzovaný se zbytkem kódující sekvence Protox-1 kukuřice byl uložen 19. března 1996 jako pWDC-14 (NRRL č. B-21546).
Plazmid obsahující promotor protox-1 z cukrové řepy byl uložen 6. prosince 1996 jako pWDC-20 (NRRL δ. B-21650).
• to *··« • to ·· «
Detailní popis vynálezu
I. Kódující sekvence rostlinné protox
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje protoporfyrinogenoxidázu (dále zde označovánu jako „protox), enzym katalyzující oxidaci protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX, a to z pšenice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže a čiroku. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z pšenice jsou zde uvedeny jako sekvence iden[id. č.) 9 a 10. Kódující sekvence DNA tifikačního čísla a odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id.
enzymu protox ze soj i č. 11 a 12. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z bavlníku jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 15 a 16. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z cukrové řepy jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 17 a 18. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z řepky olejky jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 19 a 20. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z rýže jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 21 a 22. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z čiroku jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 23 a 24.
Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z Arabidopsis thaliana a kukuřice, které byly již dříve izolovány, jsou zde reprodukovány jako sekvence id. č. 1-4 {Arabidopsis} a 5-8 (kukuřice).
Vynález se zejména týká molekuly DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující eukaryotickou protox vybranou ze skupiny protox enzymů z následujících rostlin:
·· « ···· ·· »« • 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99
9 9 9 9 999 9 9
9 9 9 9 9 • 99 99 99 99 pšenice, sója, bavlník, cukrová řepa, řepka olejka, rýže a čirok.
Výhodné provedeni vynálezu jsou izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) ze dvouděložných rostlin, zvláště z rostlin sójí, bavlníku, cukrové řepy a řepky olejky, které jsou uvedeny zde jako sekvence id. č. 11, 15, 17 a 19. Výhodnější jsou izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) ze sóji, jejíž sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 11, nebo z cukrové řepy, jejíž sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 17.
Výhodné jsou také izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z jednoděložných rostlin, zejména však z pšenice, rýže a čiroku, jejichž sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 9, 21 a 23. Výhodnější jsou izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z pšenice, jejíž sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 9.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaných molekul DNA kódujících enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z dvouděložných rostlin, přičemž tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 12, 16, 18 a 20. Předkládaný vynález se také dále týká izolovaných molekul DNA kódujících enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z jednoděložných rostlin, přičemž tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 10, 22 a 24.· Výhodnější je izolovaná molekula DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox), kde tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin z pšenice, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 10. Výhodnější je také izolovaná molekula DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox), kde ·· · • · · · · · · · ··· ···· ··· ·· ·· ·· tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin ze sóji, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 12, anebo cukrové řepy, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 18.
Pomocí informací, které poskytuje předkládaný vynález, lze s využitím standardních metod získat sekvenci DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z libovolného eukaryotického organismu.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z pšenice, a která má nukleotidovou sekvenci, hybridizující s nukleotidovou sekvencí id. č. 9 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox ze sóji a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 11 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z bavlníku, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 15 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z cukrové řepy, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí • 99
9· · · • ·
9 • · • 99 9999 • 9 99
9 9 9 9
9 9 99
9999 9
9 9 9 id. č. 17 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání :
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z řepky olejky, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizujíc£ se sekvencí id. č. 19 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání :
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z rýže, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizujicí se sekvencí id. č. 21 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z čiroku, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizujicí se sekvenci id. č. 23 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Izolované prokyaryotické sekvence protox uvedené v tomto vynálezu je možné měnit (manipulovat) standardními technikami genového inženýrství tak, aby vyhovovaly požadovanému účelu. Tak např. celá sekvence protox nebo její část se může použít jako sonda schopná specificky hybridizovat • 9 • 9999
99 ·9 99
999 9 9 99 9
9 9 9 9 99 • 9 99 99 9 · 9
9 9 9 9 9 *99 99 99 99 s kódující sekvencí protox a příslušnou mRNA („messenger RNA) . Tiby se dosáhlo specifické hybridizace v různých podmínkách, takové sondy obsahují sekvence které jsou jedinečné mezi různými sekvencemi kódující protox a jsou výhodně dlouhé alespoň 10 nukleotidů, výhodněji 20 nukleotidů. Takové sondy se mohou použít pro amplifikaci a analýzu sekvencí kódujících protox z vybraného organismu pomocí dobře známé metody polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato metoda může být užitečná pro izolaci dalších sekvencí kódujících protox z požadovaného organismu nebo jako diagnostický test pro stanovení přítomnosti sekvence kódující protox v daném organismu .
Faktory, které ovlivňují stabilitu hybridů, určuji stringentnost (přísnost) podmínek hybridizace. Jedním z takových faktorů je teplota tání Tm, která se dá snadno vypočítat podle vzorce popsaného v „DNA Probes (Keller, George H. , Manak, Mark M. , MacMillan Publishers Ltd, 1993, kapitola první: Molecular Hybridization Technology, s. 8). Výhodná hybridizační teplota je v rozmezí přibližně 25 °C pod vypočtenou teplotou tání Tm a výhodně v rozmezí přibližně 12 až 15 °C pod vypočtenou teplotou tání Tm, a v případě oligonukleotidů v rozmezí přibližně 5 až 10 °C pod teplotou tání Tm.
Předkládaný vynález se také týká molekul DNA, které hybridizují s molekulou DNA podle předkládaného vynálezu, jak bylo definováno dříve, ale které výhodně hybridizují se sondou, kterou lze získat z uvedené molekuly DNA, obsahující souvislý úsek ze sekvence enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) dlouhý nejméně 10 nukleotidů v průměrně stringentních (přísných) podmínkách.
Vynález se dále týká použití nukleotidové sondy schopné specificky hybridizovat s rostlinným genem protox nebo mRNA • 0 • 0 9« dlouhé nejméně 10 nukleotidů v polymerázové řetězové reakci (PCR).
Další provedeni předkládaného vynálezu poskytuje sondu schopnou specificky hybridizovat s eukaryotickou sekvencí DNA kódující protoporfyrinogenoxidázovou aktivitu nebo s příslušnou mRNA, a dále poskytuje způsob detekce uvedené sekvence DNA v eukaryotíckém organismu použitím sondy podle předkládaného vynálezu.
Hybridizační sondy specifické pro protox se mohou použít také pro mapování polohy nativního eukaryotického genu (připadne genů) protox v genomu vybraného organismu pomocí standardních technik založených na selektivní hybridizaci sondy s genomovou sekvenci protox. Tyto techniky zahrnují (ale tento výčet není omezující) identifikaci polymorfismu DNA pomocí sekvence sondy protox a využiti takového polymorfismu pro sledováni segregace genu protox ve vztahu k dalším markérům se známou polohou v mapě v mapované populaci odvozené samosprášením hybrida ze dvou polymorfnich rodičovských linií (viz např. Helentjaris et al., Plant Mol. Biol.5: 109, 1985, Sommer et al., Biotechniques 12. 82, 1992, D'ovidio et al. , Plant Mol. Biol. 15: 169, 1990). Zatímco lze považovat jakoukoliv eukaryotickou sekvenci protox za vhodnou sondu pro mapováni genů protox z libovolného eukaryotického organismu, výhodné sondy jsou sekvence protox z organismů blížeji příbuzných vybranému organismu a nejvýhodnější sondy jsou sekvence protox přímo z vybraného organismu. Mapování genů protox takovým způsobem v rostlinách se považuje za zvláště užitečné pro šlechtitelské účely. Např. ze znalosti polohy mutovaného genu protox, který poskytuje rezistenci k herbicidu, v genetické mapě, se mohou identifikovat sousední DNA markéry z referenční genetické mapy (viz. např. Helentjaris, Trends Genet. 3: 217, 1987). Při vnášeni znaku rezistence
k herbicidu do nové šlechtitelské linie se mohou použít tyto markéry pro monitorování rozsahu chromozómové DNA obklopující protox která je ještě přítomná v rodičovské linii po každém z opakujících se zpětných křížení.
Hybridizační sonda specifická pro protox se může použít také pro kvantifikaci hladiny mRNA pomocí standardních postupů jako je např. analýza „northern přenosu. Tento postup může být užitečný jako diagnostický test pro stanovení změněné hladiny exprese protox, která může být spojena se zvláště nepříznivými podmínkami jako jsou autozomálně dominantní poruchy u člověka charakterizované neuropsychyatrickými symptomy a kožními lézemi, které jsou spojeny se sníženou hladinou aktivity protox (Brenner a Blommer. New Engl. J. Med 302: 765, 1980).
Další provedení předkládaného vynálezu je způsob přípravy molekuly DNA obsahující úsek DNA kódující protein s enzymovou aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), který obsahuje následující kroky
a) připraví se nukleotidová sonda schopná specificky hybridizovat s rostlinným genem protox nebo příslušnou mRNA, přičemž tato sonda obsahuje souvislý úsek sekvence kódující protein protox z rostliny dlouhý nejméně 10 nukleotidů,
b) nukleotidová sonda připravená podle kroku a) se použije k vyhledání jiných sekvencí kódujících protox v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo fragmentů cDNA z vybraného organismu, a
c) izoluje se a namnoží se molekula DNA obsahující úsek DNA kódující protein, který má enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Další provedení předkládaného vynálezu je způsob izolace molekuly DNA z jakékoliv rostliny obsahující úsek DNA
kódující protein s enzymovou aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), který obsahuje následující kroky
a) připraví se nukleotidová sonda schopná specificky hybridizovat s rostlinným genem protox nebo příslušnou mRNA, přičemž tato sonda obsahuje souvislý úsek sekvence kódující protein protox z rostliny dlouhý nejméně 10 nukleotidů,
b) nukleotidová sonda připravená podle kroku a) se použije k vyhledání jiných sekvencí kódujících protox v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo fragmentů cDNA z vybraného organismu, a
c) izoluje se a namnoží se molekula DNA obsahující úsek DNA kódující protein, který má enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Vynález se dále týká způsobu přípravy v podstatě čisté sekvence DNA kódující protein vykazující enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy/ který obsahuje následující kroky:
a) připraví se genomová knihovna nebo cDNA knihovna z vhodného zdrojového organismu pomocí vhodného klonovacího vektoru,
b) knihovna se hybridizuje s molekulou sondy, a
c) identifikuje se pozitivní hybridizace sondy s DNA klonem, z knihovny, který je klonem potenciálně obsahujícím nukleotidovou sekvenci odpovídající sekvenci aminokyselin protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Vynález se dále týká způsobu přípravy v podstatě čisté sekvence DNA kódující protein vykazující enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy, který obsahuje následující kroky:
a) připraví se celková DNA z genomové nebo cDNA knihovny,
b) použitím DNA z kroku a) jako templátu v PCR reakci s primery představujícími úseky sekvence aminokyselin protoporfyrinogenoxidázy (protox) s nízkou degenerací.
9
9 9 <
• · <1
9 ·9 *
Dalším předmětem vynálezu je test k identifikaci inhibitorů enzymové aktivity protoporfyrinogenoxidázy (protox), který spočívá v tom, že se
a) inkubuje první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát,
b) měří se neinhibovaná reaktivita protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku a),
c) inkubuje se první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje inhibující sloučeninu (inhibitor),
d) měří se inhibovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku c), a
e) porovná se inhibovaná reaktivita s neinhibovanou reaktivitou enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Dalším předmětem vynálezu je test k identifikaci mutantů protoporfyrinogenoxidázy (protox) rezistentních k inhibitoru, který spočívá v tom, že se
a) inkubuje první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje inhibitor enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox),
b) měří se nemutovaná reaktivita protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku a),
c) inkubuje se první vzorek mutované protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje inhibitor protoporfyrinogenoxidázy (protox),
d) měří se mutovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku c), a
e) porovná se mutovaná reaktivita s nemutovanou reaktivitou enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Dalším předmětem vynálezu je inhibitor enzymu protox získaný způsobem podle předkládaného vynálezu.
• · • · ·· · • ·· i · ··
Pro rekombinantní produkci enzymu v hostitelském organismu se může sekvence kódující protox vložit do expresní kazety navržené pro vybraného hostitele a zavést do hostitele, kde je pak enzym rekombinantně produkován. Výběr specifických regulačních sekvencí jako je promotor, signální sekvence, netranslatované sekvence 5'- a 3'-konce nebo zesilující sekvence („enhancer) může provést odborník rutinním způsobem odpovídajícím stavu techniky v oboru. Výsledná molekula obsahující jednotlivé prvky spojené ve vhodném čtecím rámci, může být vložena do vektoru, který je schopen transformovat hostitelskou buňku. Vhodné expresní vektory a metody rekombinantní přípravy proteinů jsou dobře známy pro hostitelské organismy jako jsou např. E. coli (viz. např. Studier a Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113, 1986, Brosius, DNA 8: 759, 1989), kvasinky (viz. např. Schneider a Guarente, Meth. Enzymol. 194: 373, 1991) a hmyzí buňky (viz např. Luckow a Summers, Bio/technol. 6: 47, 1988). K příkladům patří např. plazmidy jako je pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFlag (Intrnational Biotechnologies, lne., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA)a bakulovirové expresní vektory, např. vektory odvozené z genomu viru jaderné polyhedrózy (AcMNPV) Autographica californica. Výhodným systémem bakulovirus/hmyz jsou buňky pVlll392/Sf21 (Invitrogen, La Jolla, CA).
Rekombinantně produkovaný eukaryotický enzym protox je užitečný pro mnoho různých účelů. Např. se může použít pro zabezpečení protox aktivity in vitro. Může se také použít v testu in vitro ke sereeiningu známých chemických látek s herbicidním účinkem, jejichž cíl dosud nebyl identifikován, k určení toho, zda inhibují protox. Takový test in vitro se může také užít pro zcela obecný screening k identifikaci chemických látek, které inhibují aktivitu protox
a které jsou proto kandidáty na herbicid. Rekombinantně produkovaný eukaryotický enzym protox se může také použít v testu pro identifikaci mutantů protox rezistentních k inhibitoru (viz Mezinárodní patentovou přihlášku PCT/IB95/00452 podanou 8. června 1995 a publikovanou 21. prosince 1995 jako WO 95/34659, na jejíž plné znění se zde odkazujeme). Rekombinantně produkovaný enzym protox se může případně také použít pro další charakterizaci jeho spojení se známými inhibitory k tomu, aby se racionalizoval návrh dalších inhibičních herbicidů stejně tak jako formy enzymu rezistentní k inhibitoru.
II. Rostlinný enzym protox rezistentní k inhibitoru
Další aspekt předkládaného vynálezu popisuje modifikace, které je možné učinit v sekvenci aminokyselin libovolné rostlinné protoporfyrinogenoxidázy (zde zkracováno na „protox) s cílem získat formu tohoto enzymu rezistentní k inhibitoru. Předkládaný vynález se týká rostlinného enzymu protox rezistentního k inhibitoru, který má modifikace popsané zde, a dále se týká genů schopných exprimovat tyto modifikované enzymy v rostlinách.
Předkládaný vynález se týká izolované molekuly DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox), která má alespoň jednu aminokyselinovou modifikaci, přičemž tato modifikace má tu vlastnost, že poskytuje rezistenci k inhibitoru protox, což znamená, že uvedená modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje eukaryotickou protox. Termín „inhibuje jak se zde užívá, znamená snižování enzymové aktivity pozorované v přítomnosti předmětného herbicidu ve srovnání s aktivitou pozorovanou bez přítomnosti tohoto herbicidu, přičemž míra redukce je ·· · · • · · • 99
9 9 9 · 9 «♦ · · výhodně alespoň 10%, výhodněji 50% a nejvýhodněji alespoň 90%.
Výhodná je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující eukaryotickou protox vybranou ze skupiny obsahující enzymy protox z pšenice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže a čiroku, které mají alespoň jednu aminokyselinovou modifikaci, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox .
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající
159. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde cystein je nahrazen fenylalaninem nebo lysinem a nejvýhodnější je, je-li cystein nahrazen fenylalaninem.
Výhodná je také DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde isoleucin je nahrazen threoninem, histidinem, glycinem nebo asparaginem a nejvýhodnější je, je-li isoleucin nahrazen threoninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 164. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyse• 9 • 4 • · • · · 9 ♦ linou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde alanin je nahrazen threoninem, leucinem nebo valinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde glycin je nahrazen serinem nebo leucinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen isoleucinem nebo methioninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 356. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde valin je nahrazen leucinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 421. aminokyselině v poloze sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou • · · 0
aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde serin je nahrazen prolinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytujících se v poloze odpovídající 502. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde valin je nahrazen alaninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 211. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde alanin je nahrazen valinem nebo threoninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 212. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde glycin je nahrazen serinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající
466. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde isoleucin je nahrazen threoninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 369. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde prolin je nahrazen serinem nebo histidinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 226. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde alanin je nahrazen threoninem nebo leucinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 517. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde valin je nahrazen alaninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající
432. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou
aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen alaninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 365. aminokyselině sekvence id. č. 16 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde prolin je nahrazen serinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 42 8. aminokyselině sekvence id. č. 16 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen cysteinem nebo argininem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 449. aminokyselině sekvence id. č. 18 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen cysteinem, leucinem, isoleucinem, valinem nebo methioninem.
Předkládaný vynález se dále týká molekuly DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substitu··· ···» «·· ·· ·· «· ci a druhou aminokyselinovou substituci, přičemž první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že poskytuje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci poskytovanou první aminokyselinovou substituci. Výhodná je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olej ku, rýži, čirok a Arabidopsis. Výhodnější je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde rostlina je vybrána z skupiny obsahující kukuřici, pšenici, sóju, cukrovou řepu, a Arabidopsis.
Výhodná je molekula DNA, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující:
i) polohu odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, ii) polohu odpovídající threoninu jako 249. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, iii) polohu odpovídající prolinu jako 118. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, iv) polohu odpovídající asparaginu jako 425. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, a
v) polohu odpovídající tyrosinu jako 498. aminokyselině v sekvenci id. č. 2.
Výhodná je také molekuly DNA, kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující:
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající glycinu jako 165. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, • ··♦»
44 44 ♦· ♦ 4 4 4 ♦ 4 4 ·
4 4 4 4 *4
4 4 · · 4 4 · 4
4 4 4 * » • 44 44 « 4 «·
c) polohu i odpovídající tyrosinu jako 370 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
d) polohu odpovídaj ící cysteinu j ako 159. aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
e) polohu odpovídáj ící isoleucinu j ako 419 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
f) polohu odpovídaj ící valinu jako 356 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 10,
g) polohu odpovídaj ící šeřinu j ako 421. aminokyselině
v sekvenci id. č. 10,
h) polohu odpovídající valinu j ako 502 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 10,
i) polohu odpovídaj ící alaninu j ako 211. aminokyselině
v sekvenci id. č. 10,
k) polohu odpovídaj ící glycinu j ako 212 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 10,
1) polohu odpovídající isoleucinu j ako 466 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 10,
m) polohu odpovídaj ící prolinu j ako 369 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 12,
n) polohu odpovídaj ící alaninu jako 226 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 12,
o) polohu odpovídaj ící tyrosinu j ako 432 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 12,
p) polohu odpovídající valinu jako 517. aminokyselině v sek-
věnci id. č. 12,
q) polohu odpovídaj ící tyrosinu jako 428 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 16,
r) polohu odpovídaj ící prolinu j ako 365 . ami nokys e1i ně
v sekvenci id. č. 16 a
s) polohu odpovídaj ící tyrosinu j ako 449 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 18.
• · ♦ to ♦ 99 99 99 ♦ to t · * · « * toto· # » ·* *♦ ♦ · 999 9 9 • ♦ · »· » «to· ·« to· 9·
Zvláště výhodná je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, přičemž tato rostlinná protox obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. čísel 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20 a 22. Ne j výhodně j ší je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující obsahující rostlinnou protox, přičemž tato rostlinná protox obsahuje aminokyselinovou sekvenci
vybranou z· e skupiny obsahující sekvence id. čísel 2, 4, 6,
8, 10, 12 a 18.
Výhodnější je molekula DNA, kde první aminokyselinová
substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahu-
j ící
a) polohu odpovídající alaninu jako 164 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající glycinu jako 165. aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
c) polohu odpovídající tyrosinu jako 370 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
d) polohu odpovídající cysteinu jako 159. aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
e) polohu odpovídající isoleucinu jako 419 aminokyselině
v sekvenci id. č. 6.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahuj ící
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
«
00 00 09
0 0 0 9 9 0
0 0 0 « 09
9 00 0000 0
0 9 0 0 0
090 00 «· 00
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 305. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen leucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající threoninu jako 249. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny
obsahuj ící
a) polohu odpovídaj ící alaninu jako 164. aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídaj ící tyrosinu j ako 3 7 0. aminokyselině
v sekvenci id. č. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde threonin vyskytující se v poloze odpovídající 249. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující isoleucin a alanin.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající prolinu jako
118. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyse-
linová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny
obsahuj ící
a) polohu odpovídající alaninu j ako 164 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu j ako 370 . aminokyselině
v sekvenci id. č. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 118. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen leucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající asparaginu jako 425. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první amino44 ·4
4 4 4
4 ·4
4 4 4 « 4 **
4444 kyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde asparagin vyskytující se v poloze odpovídající 425. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající tyrosinu jako 498. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahuj ící
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 498. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen cysteinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující cystein, isoleucin, leucin, threonin, valin a methionin.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující cystein, isoleucin, leucin, threonin, a methionin.
Výhodnější je molekula DNA, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 164. aminokyselinovému zbytku sekvence
* 9 9 9«
9 9 99
9999 «
9 9 9
9 99 id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující valin, threonin, leucin, cystein a tyrosin.
Výhodnější je molekula DNA, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující serin a leucin.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající 159. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující fenylalanin a lysin.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající 159. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen fenylalaninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující threonin, histidin, glycin a asparagin.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 356. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen leucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 421. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen prolinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 502. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen alaninem.
44 4 44 4« 44
4 4 444 4 4 44 4
4 44444 44
44 44 44 44 44 4
444 4 4 ·
444 4444 444 44 44 4*
Výhodnější je molekula DNA, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 466. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 212. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 211. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen valinem nebo threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 369. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 12 je nahrazen serinem nebo histidinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 226. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 12 je nahrazen serinem nebo threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 432. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 12 je nahrazen leucinem nebo isoleucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 517. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 12 je nahrazen alaninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 428. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 16 je nahrazen cysteinem nebo argininem.
Výhodnější je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 365. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 16 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 449. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 18 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující leucin, isoleucin, valin a methionin.
9 99
9 9 9
9 9 «9 • 9 • ·9
Předkládaný -vynález se týká expresních kazet a rekombinantních vektorů obsahujících tyto expresní kazety, které obsahují nezbytně promotor, zvláště pak promotor aktivní v rostlině, operativně spojený s molekulou DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z eukaryotického organismu podle předkládaného vynálezu. Expresní kazeta podle předkládaného vynálezu může navíc obsahovat signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna směrování proteinu kódovaného touto molekulou DNA do chloroplastu nebo mitochondrie.
Předkládaný vynález se týká chimérického genu, který obsahuje expresní kazetu skládající se promotoru, zvláště promotoru aktivního v rostlině, operativně spojeného s heterologni molekulou DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z eukaryotického organismu podle předkládaného vynálezu. Výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovou třtinu, sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a rýži. Výhodnější je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny -vybrané ze skupiny obsahující sóju, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy, proso, pícniny a rýži. Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující pšenici, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olejku, rýži a čirok. Nejvýhodnější je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující pšenici, cukrovou řepu a sóju.
· • *9 • 9 99
9 9 9 9
9 9 99
999· ·
9 9 9 • 9 99
Výhodnější je chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, operativně spojený s heterologní molekulou DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny, do které patří protox z pšenice obsahující sekvenci id. č. 10, protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12, protox z bavlniku obsahující sekvenci id. č. 16, protox z cukrové řepy obsahující sekvenci id. č. 18, protox z řepky olejky obsahující sekvenci id. č. 20, protox z rýže obsahující sekvenci id. č. 22 a protox z čiroku obsahující sekvenci id. č. 24. Výhodnější je chimérický gen, kde protoporfyrinogenoxidáza (protox) je vybrána ze skupiny, do které patří protox z pšenice obsahující sekvenci id. ó. 10, protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12 a protox z cukrové řepy obsahující sekvenci id. č. 18.
Název „protox-1 se zde užívá pro označení chloroplastové protox, zatímco „protox-2 označuje mitochondriální protox.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z Arabidopsis sp., který má aktivitu protox-1 nebo protox-2, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z kukuřice, který má aktivitu protox-1 nebo protox-2, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 6 nebo sekvenci id. č. 8.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z pšenice, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 10.
• 99 9 99 99 99
9 9 99 9 9 9 9 9 9
9 9 9 · 9 9 99
99 999999999
9 9 9 9 9 9 9
999 9999 999 99 99 99
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein ze. sóji, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 12.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z bavlníku, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 16.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z cukrové řepy, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 18.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z řepky olejky, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 20.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z rýže, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 22.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z čiroku, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 24.
Provedením předkládaného vynálezu je také chimérický gen, který obsahuje expresní kazetu, která se skládá nezbytně z promotoru, zvláště promotoru aktivního v rostlině, operativně spojeného s molekulou DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z eukaryotického organismu podle předkládaného vynálezu, kterážto protox je rezistentní k herbicidům v hladinách, které inhibují odpovídající nemodifikovanou verzi enzymu. Výhodný je chimérický gen, kde • 9 99 99 • 9 9 9·· • 9 9 « 99
99 999« 9 • 9 9 9 9 • 9 99 ·· molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovou třtinu, sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a rýži.
Výhodnější je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující sóju, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy, proso, pícniny a rýži. Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující Arabidopsis, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok a rýži.
Předkládaný vynález se také týká chimérického genu, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, který je operativně spojen s molekulou DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující eukaryotickou protox, která má nejméně jednu modifikaci, kde tato aminokyselinová modifikace má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox.
Předkládaný vynález se také týká chimérického genu, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, který je operativně spojen s molekulou DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, kde první aminokyselinová substituce má to vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udílenou první substitucí. Výhodný je chimérický gen obsahující navíc signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna • ·♦ «· ·· • to · · · · · · • · to · · toto • · ·· ««toto · • to · ··· ·«· ·· ·· ·· nasměrovat protein kódovaný touto molekulou DNA do chloroplastu nebo do mitochondrie.
Chimérický gen podle předkládaného vynálezu může dále obsahovat signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do chloroplastu. Chimérický gen podle předkládaného vynálezu může dále obsahovat signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do mitochondrie.
Předkládaný vynález se také týká dříve zmíněných sekvencí DNA, které jsou trvale vloženy (integrovány) v hostitelském genomu.
Předkládaný vynález se také týká rekombinantní molekuly DNA obsahující rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu (protox) nebo její funkčně shodný derivát.
Předkládaný vynález se také týká rekombinantního vektoru DNA, který obsahuje tuto rekombinantní molekulu.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle vynálezu, přičemž tímto vektorem může být trvale transformována hostitelská buňka.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle vynálezu, přičemž tímto vektorem může být trvale transformována rostlina, rostlinná semena, rostlinné pletivo nebo rostlinná buňka. Výhodný je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle vynálezu, přičemž tímto vektorem může být trvale transformována rostlina. Rostlina, rostlinná semena, rostlinné pletivo nebo rostlinná buňka trvale transformované tímto vektorem jsou schopné exprimovat molekulu DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox). Výhodný je takový rekom• ·· · ·· ·· ·· 00 0 0 00 00 0000
0 00000 00 0 00 00 00 00 00 0 00 000 000 • 00 0000 000 ·· 00 00 binantní vektor, že rostlina, rostlinná semena, rostlinné pletivo nebo rostlinná buňka trvale transformované tímto vektorem jsou schopné exprimovat molekulu DNA kódující rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu (protox), která je rezistentní k herbicidům v hladině, která inhibuje odpovídající nemodifikovanou verzi enzymu.
Výhodný je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, operativně spojený s heterologní molekulou DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny, do které patří protox z pšenice obsahující sekvenci id. č. 10, protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12, protox z bavlníku obsahující sekvenci id. č. 16, protox z cukrové řepy obsahující sekvenci id. č. 18, protox z řepky olejky obsahující sekvenci id. č. 20, protox z rýže obsahující sekvenci id. č. 22 a protox z čiroku obsahující sekvenci id. č. 24, přičemž tento vektor je schopen trvale transformovat hostitelskou buňku.
Výhodný je také chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, který je operativně spojen s molekulou DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, kde první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udílenou první substitucí, přičemž tento vektor je schopen trvale transformovat hostitelskou buňku.
Předkládaný vynález také zahrnuje hostitelskou buňku trvale transformovanou vektorem podle předkládaného vynálezu, kde hostitelská buňka je schopna exprimovat danou molekulu DNA. Výhodná je hostitelská buňka ze skupiny obsahující
99
9 9
9
9 9 ·
··· ·*·· • 99 99 99
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99
9 9 9 999 9 » • 9 · 9 9 9
999 99 99 99 rostlinnou buňku, bakteriální buňku, kvasinkovou buňku a hmyzí buňku.
Předkládaný vynález se také týká rostlin a jejich potomstva, rostlinného pletiva a rostlinných semen tolerantních k herbicidu, který inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox v těchto rostlinách, přičemž tolerance je udílena genem exprimujícím modifikovaný enzym protox rezistentní k inhibitoru ,jak je popsáno v této přihlášce. Mezi reprezentativní rostliny patří jakákoliv rostlina, na kterou lze aplikovat takový herbicid S původně zamýšleným účelem. Výhodné jsou agronomicky důležité plodiny, krytosemenné i nahosemenné, jako je např. Arabidopsis, cukrová třtina (tj . cukrovnik lékařský), sója, ječmen, bavlník, tabák, cukrová řepa, řepka olejka, kukuřice, pšenice, čirok, rýže, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a podobně. Výhodnější jsou agronomicky důležité plodiny, krytosemenné i nahosemenné, jako je např. Arabidopsis, bavlník, sója, řepka olejka, cukrová řepa, kukuřice, rýže, pšenice, ječmen, oves, žito, čirok, proso, trávníkové a pícninové trávy. Zvláště výhodné jsou agronomicky důležité plodiny, krytosemenné i nahosemenné, jako je např. Arabidopsis, sója, bavlník, řepka olejka, kukuřice, pšenice, čirok a rýže.
Výhodná je rostlina, která obsahuje molekulu DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, kde první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udílenou první substitucí, přičemž molekula DNA je exprimována v rostlině a uděluje ji toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox. Výhodná je • 9 9 « · • ·· rostlina, kde tato molekula DNA nahrazuje odpovídající přirozeně se vyskytující sekvenci kódující protox.
Předkládaný vynález se týká také rostliny a jejího potomstva, obsahující chimérický gen podle vynálezu, kde tento chimérický gen uděluje rostlině toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox.
Předkládaný vynález dále zahrnuje transgenní rostlinné pletivo, včetně rostlin a jejich potomstva, semen a kultivovaného pletiva, které jsou trvale transformované alespoň jedním chimérickým genem podle vynálezu. Výhodné je transgenní rostlinné pletivo, včetně rostlin, rostlinných semen a kultivovaného pletiva, které jsou trvale transformované alespoň jedním chimérickým genem, který obsahuje expresní kazetu složenou nezbytně z promotoru, zvláště promotoru aktivního v, rostlině, operativně spojeného s molekulou DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox), která je rezistentní k herbicidům v hladině, která inhibuje odpovídající nemodifikovanou verzi enzymu v rostlinném pletivu.
Rekombinantní molekula DNA podle předkládaného vynálezu může být zavedena do rostlinné buňky různými způsoby, které jsou odborníkovi známy. Odborníkovi je zřejmé, že volba metody závisí na druhu rostliny vybrané pro transformaci, tj . na tom, je-li jednoděložná nebo dvouděložná. Mezi metody vhodné pro transformaci rostlinné buňky patří mikroinjekce (Crossway et al. , Bio Techniques 4: 320-334, 1986, elektroporace (Riggs et al, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 56025606, 1986, transformace zprostředkovaná Agrobacterium (Hinchee et al. , Biotechnology 6: 915-921, 1988), přímý transfer genu (Paszkowski et al. , EMBO J. 3: 2717-2722, 1984), balistické urychlování částic pomocí zařízení od firmy Agracetus, lne., Madison,Wisconsin a Dupont, lne.,
Willmington, Delaware (viz např. Sanford et al. , patent USA č. 4 945 050 a McCabe et al. , Biotechnology 6: 923-926,
1988) a transformace/regenerace protoplastů (viz patent USA č. 5 350 689 udělený Ciba-Geigy Corp. 27. září 1994). Další informace publikovali: Weissinger et al. , Annual. Rev. Genet. 22: 421-447, 1988, Sanford et al. , Particulate Science and Technology 5: 27-37, 1987 (cibule), Christou et al. , Plant Physiol. 87: 671-674, 1988 (sója), McCAbe et al. , Biotechnology 6: 923-926, 1988 (sója), Datta et al. , Biotechnology 8: 736-740, 1990 (rýže), Klein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309, 1988 (kukuřice), Klein et al., Biotechnology 6: 559-563, 1988 (kukuřice), Klein et al. , Plant Physiol. 91: 440-444, 1988 (kukuřice), Fromm et al. , Biotechnology 8: 833-839, 1990 a Gordon-kamm et al. , Plant Cell 32: 603-618, 1990 (kukuřice).
Předmětem předkládaného vynálezu jsou transgenní rostliny, zvláště transgenní fertilní rostliny, transformované popsaným způsobem a jejich pohlavní nebo nepohlavní potomstvo, které je stále ještě rezistentní nebo přinejmenším tolerantní k inhíbici herbicidem v hladinách, které jsou normálně inhibující pro aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox. K potomstvu patří také rostliny s genetickým základem odlišným od rodičovských rostlin, toto potomstvo pochází z programu zpětného křížení a stále ještě obsahuje ve svém genomu znak rezistence k inhibitoru podle předkládaného vynálezu. Velmi výhodné jsou hybridní rostliny, které jsou rezistentní nebo alespoň tolerantní k inhibici herbicidem v hladinách, které jsou normálně inhibující pro aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
Transgenní rostlina podle předkládaného vynálezu může být dvouděložná nebo jednoděložná rostlina. Výhodně je to jednoděložná rostlina z čeledi Graminaceae, včetně rostlin • «· rodu Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryza, Avena, Hordeum, Secale a Setaria. Výhodnější jsou transgenni rostliny jako kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso a rýže.
K výhodným dvouděložným rostlinám patří Arabidopsis, sója, bavlník, cukrová řepa, cukrová třtina, řepka olejka, tabák a slunečnice. Zvláště výhodné jsou sója, bavlník, tabák, cukrová řepa a řepka olejka.
Výraz „potomstvo zde zahrnuje pohlavně, tak i nepohlavně vzniklé potomstvo transgenních rostlin. „Potomstvo zahrnuje také všechny mutanty a varianty, které lze získat pomoci známých způsobů, jako je např. fúze buněk nebo selekce mutantů, a které stále mají charakteristické vlastnosti počátečních transformovaných rostlin, a také zahrnuje všechny výsledky křížení a fúzí transformovaného rostlinného materiálu. To tedy zahrnuje i rostliny potomstva, které pocházejí z programu zpětného křížení, pokud rostliny potomstva ještě obsahují znak rezistence k herbicidu podle vynálezu .
Další předmět předkládaného vynálezu se týká rozmnožovacího materiálu z transgenních rostlin. Rozmnožovací materiál transgenni rostlin je v předkládaném vynálezu definován jako jakýkoliv rostlinný materiál, který může být rozmnožován pohlavně nebo nepohlavně in vivo nebo in vitro. Zvláště výhodné jsou podle předkládaného vynálezu protoplasty, buňky, kalusy, pletiva, orgány, semena, embrya, pyl, vaječné buňky, zygoty a jakýkoliv další rozmnožovací materiál získaný z transgenních rostlin.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou např. také stonky, plody, listy a kořeny pocházející z transgenních rostlin nebo jejich potomstva, které byly původně transformovány ·« ·· ·· • · · · · · « · · · · · • ·· · · · · · • C · · · • · ·· · · pomocí prostředků a způsobů podle předkládaného vynálezu a proto obsahují alespoň částečně transgenní buňky.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy rostlin, protoplastů, buněk, kalusů, pletiv, orgánů, semen, embryí, pylu, vaječných buněk, zygot a jakéhokoliv rozmnožovacího materiálu, částí rostliny jako jsou květy, stonky, plody, listy, kořeny, které pocházejí z transgenních rostlin nebo jejich potomstva, předtím transformovaných pomocí prostředků a způsobů podle předkládaného vynálezu, které proto produkují formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, kterýžto způsob spočívá v tom, že se transformuje rostlina nebo část rostliny DNA podle předkládaného vynálezu. Výhodný je způsob, který poskytuje hostitelskou buňku obsahující izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), kterýžto způsob spočívá v tom, že se transformuje hostitelská buňka rekombinantní vektorovou molekulou podle předkládaného vynálezu. Dále je výhodný způsob, který poskytuje rostlinnou buňku obsahující izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), kterýžto způsob spočívá v tom, že se transformuje rostlinná buňka rekombinantní vektorovou molekulou podle předkládaného vynálezu. Výhodný je způsob, který poskytuje transgenní potomstvo transgenních rodičovských rostlin obsahujících izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), kterýžto způsob spočívá v tom, že se rodičovská rostlina transformuje rekombinantní vektorovou molekulou podle předkládaného vynálezu a znak tolerance k herbicidu se přenese na potomstvo těchto rodičovských transgenních rostlin, přičemž způsob zahrnuje známé způsoby šlechtění rostlin .
e · *· • ·
Výhodný je způsob přípravy rostlin, rostlinného pletiva, rostlinných semen a částí rostlin, které produkují formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, kde rostliny, rostlinná pletiva, rostlinná semena a části rostlin byly trvale transformované strukturním genem kódujícím rezistentní enzym protox. Zvláště výhodný je způsob přípravy rostlin, rostlinného pletiva, rostlinných semen a částí rostlin, kde tyto rostliny, rostlinná pletiva, rostlinná semena a části rostlin byly trvale transformované DNA podle předkládaného vynálezu. Zvláště výhodný je způsob přípravy takových rostlin, rostlinného pletiva, rostlinných semen a částí rostlin, které produkují formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, kde tyto rostliny, rostlinná pletiva, rostlinná semena a části rostlin byly připraveny technikami přímé selekce, kterými se izolují, charakterizují a vyvíjejí linie rezistentní k herbicidu.
Genetické vlastnosti, vnesené do transgenních semen a rostlin metodami genového inženýrství popsanými v předchozím textu, se předávají pohlavním rozmnožováním nebo vegetativním růstem a mohou se tak udržovat a šířit v potomstvu, tj. dceřinných rostlinách. Obecné se pro udržování a propagaci využijí způsoby vyvinuté v zemědělství pro specifické účely jako je orání, setí nebo sklizeň. Specializované způsoby jako je hydroponická nebo skleníková technologie, se mohou také použít. Jelikož rostoucí plodiny jsou náchylné k napadení a poškození hmyzem nebo infekcemi a také kompeticí s plevely, provedou se opatření ke kontrole plevelů, nemocí, hmyzu, červů a další, vedoucí ke zvýšení výnosu. To zahrnuje také taková mechanická opatření jako je orání půdy nebo odstraňování plevelů a infikovaných rostlin, a také aplikaci agrochemikálií jako jsou herbicidy, fungicidy, • ·
• · · · 4 · <
4 4 4 • 4 4 · gametocidy, nematocidy, růstové regulátory, činidla k dozrávání a insekticidy.
Výhodné genetické vlastnosti transgenních rostlin a semen podle vynálezu se mohou využít ve šlechtění rostlin, jehož cílem je vyšlechtit rostliny se zlepšenými vlastnostmi jako je např. tolerance k hmyzu, herbicidům nebo stresu, se zlepšenou nutriční hodnotou, zvýšeným výnosem nebo zlepšenou strukturou, která vede ke snížení ztrát způsobených poléháním nebo polámáním nebo při uskladnění. Jednotlivé šlechtitelské kroky jsou charakterizovány jasně definovanou lidskou činností, jako je např. výběr linií ke křížení, přímé opylování rodičovských linií nebo výběr vhodného potomstva. V závislosti na požadovaných vlastnostech se provádějí různá šlechtitelská opatření. Odpovídající způsoby jsou v oboru dobře známy a zahrnují, kromě jiného, např. hybridizaci, inbreeding, zpětné křížení, víceliniové křížení, směsné odrůdy, mezidruhovou hybridizaci, aneuploidní techniky atd. Hybrídizační techniky zahrnují také sterilizaci rostlin vedoucí k samčím nebo samičím sterilním rostlinám, která se provádí mechanickými, chemickými nebo biochemickými prostředky. Křížové opylení samčí sterilní rostliny pylem různých linií zajistí, že genom rostliny se samčí sterilitou a se zachovanou samičí fertilitou uniformně získá vlastnosti obou rodičovských linií. Tudíž transgenní osivo a rostliny podle vynálezu se mohou užít ve šlechtění linií zlepšených rostlin, což např. může zvýšit účinnost konvenčních metod jako je ošetření herbicidem nebo pesticidem, a nebo se obejdou bez těchto metod vzhledem k jejich změněným genetickým vlastnostem. Případně nové plodiny se zlepšenou tolerancí ke stresu se mohou získat tak, že vzhledem k jejich optimalizovanému genetickému „vybavení je sklízený produkt lepší • · 9 • · · · • · · · · ·
99
9 9 • · ··» ·· kvality než produkty, které nebyly schopny tolerovat srovnatelně nepříznivé vývojové podmínky.
V semenářství jsou kvalita klíčení a uniformita osiva nezbytnými charakteristikami produktu, zatímco kvalita klíčení a uniformita semen sklízených a prodávaných farmáři nejsou tak důležité. Jelikož je obtížné udržovat plodinu v čistém stavu bez příměsí semen jiné plodiny nebo plevelu, kontrolovat nemoci přenášené semeny, a produkovat osivo s dobrou kvalitou klíčení, značně obsáhlé a dobře definované techniky výroby osiva byly vyvinuty producenty osiva, kteří mají zkušenosti s pěstováním, udržováním a prodejem čistého osiva. Je běžnou praxí, že farmář kupuje certifikované osivo odpovídající kvalitativním standardům, místo aby používal osivo z vlastní úrody. Materiál používaný jako osivo je obvykle ošetřen ochrannou vrstvou obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematicidy, moluscicidy nebo jejich různé směsi. Obvykle užívané ochranné vrstvy obsahují sloučeniny jako kaptan, karboxin, thiram (TMTD®), metalaxyl (Apron®) a pirimifosmetyl (Actellic®) . Pokud je to potřeba, tyto sloučeniny tvoří prostředek společně s dalšími pomocnými látkami, nosiči, surfaktanty nebo adjuvans usnadňujícími aplikaci, jak se běžně užívá v oboru prostředků pro ochranu před poškozením bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci. Ochranná vrstva se může aplikovat impregnací osiva tekutým prostředkem nebo kombinovanou aplikací kapalného a suchého prostředku. Jiné způsoby aplikace lze také použít, např. přímé ošetření pupenů nebo plodů.
Další předmět předkládaného vynálezu poskytuje rostlinný rozmnožovací materiál pro pěstování rostlin, zejména rostlinné osivo, které je ošetřeno ochranným potahem, kterého se obvykle využívá pro ošetřování osiva.
• ·· · · • · 0 0 0 0 • · · · · · • · · ·· 0 · · • « 0 0 · • · 0 0 · 0 0
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje nové zemědělské způsoby, jejichž příklady jsou uvedeny v předchozím textu, a které jsou charakterizovány použitím transgenních rostlin, transgenního rostlinného materiálu nebo transgenního osiva podle předkládaného vynálezu. Vynález poskytuje takové zemědělské způsoby, kde se užívá transgenní rostlina nebo její potomstvo, které obsahují chimérický gen podle předkládaného vynálezu v množství dostatečném pro expresi k herbicidu rezistentní formy cílových proteinů herbicidu v rostlině, což jí uděluje toleranci k herbicidu.
Pro vypěstováni/vyšlechtění potomstva rostlin transformovaných způsobem podle vynálezu, lze užít následující postup. Rostliny kukuřice, získané jak je popsáno v dále uvedených příkladech, se pěstují v nádobách ve skleníku nebo v půdě tak, jak je v oboru známo, a ponechají se kvést. Ze zralých samčích vláken se získá pyl a použije se k opylení klasu téže rostliny, sesterské rostliny nebo jakékoliv jiné požadované rostliny kukuřice. Stejně tak klas vyvíjející se na transformované rostlině se může opylit pylem z téže rostliny, sesterské rostliny nebo jakékoliv jiné požadované rostliny kukuřice. Transformované potomstvo získané tímto způsobem se dá odlišit od netransformovaného potomstva tím, že obsahuje vnesený gen (geny) a/nebo srovnáním genomových DNA (genotypů) nebo příslušných fenotypů. Transformované potomstvo může být samosprášeno nebo kříženo s jinými rostlinami, tak jak se to dělá normálně s jakoukoliv rostlinou nesoucí požadovaný znak. Podobně tabák nebo jiná transformovaná rostliny získaná tímto způsobem se může samosprášit nebo křížit způsobem známým v oboru, aby se získalo potomstvo požadovaných vlastností. Podobně také další transgenní organismy získané kombinací způsobů známých v oboru se způ-
• · * soby podle vynálezu se mohou šlechtit způsoby v oboru známými, aby se získalo potomstvo požadovaných vlastností.
Modifikované enzymy protox rezistentní k inhibitoru podle předkládaného vynálezu mají alespoň jednu aminokyselinovou substituci, adici nebo deleci vzhledem k jejich přirozeně se vyskytujícímu protějšku (tj. formě citlivé k inhibitoru vyskytující se v rostlině aniž by byla jakkoliv geneticky ovlivňována člověkem, ať už přímo technikami genového inženýrství nebo nepřímo výběrovým šlechtěním). Polohy aminokyselin, které se mohou modifikovat, aby vznikla forma enzymu protox rezistentní k inhibitoru, nebo aby se zvýšila rezistence k inhibitoru, jsou uvedeny tučně v tab. 1 v souladu se sekvencemi rostlinné protox-1 z Arabidopsis, kukuřice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže, čiroku a pšenice. Odborníkovi je zřejmé, že obdobné změny lze provést v jakémkoliv rostlinném genu protox, který je strukturně dostatečně podobný sekvencím genu protox uvedeným v této přihlášce tak, aby bylo možné porovnání a identifikace těch aminokyselin, které jsou modifikovány podle vynálezu pro vytvoření formy enzymu rezistentní k inhibitoru. Další rostlinné geny protox se dají získat pomocí standardních technik způsobem, který je popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/IB95/00452, podané 8. června 1995, publikované
21. prosince 1995 jako WO 95/34659, jejíž relevantní části jsou zde uvedeny jako odkazy.
Molekuly DNA kódující protox rezistentní k inhibitoru popsané zde se mohou modifikovat metodami genového inženýrství tak, aby se zajistila maximální exprese v plodině. To může zahrnovat změnu kódující sekvence rezistentní alely, aby se zajistila optimální exprese ve vybrané plodině. Způsoby úprav kódujících sekvencí pro dosažení optimální exprese u určitých druhů plodin jsou dobře známy (viz např. Per• 9 ·· • ·· · ·
lak et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324, 1991, Koziel et al., Biotechnology 11: 194, 1993).
Sekvence kódující protox upravená technikami genového inženýrství pro optimální expresi může také obsahovat operativně spojené vhodné regulační sekvence (tj. promotor, signální sekvenci, terminátor transkripce). Mezi příklady promotorů schopných působit v rostlinných buňkách (tj . řídit expresi připojených strukturních genů, jako např. protox, v rostlinných buňkách) patří např. 19S promotor a 35S promotor z viru mozaiky květáku (CaMV) a také dvojitý promotor CaMV, promotory nopalinsyntázy, promotory proteinu (PR) patogeneze („pathogenesis-related) , promotory malé podjednotky ribulózobisfosfátkarboxylázy (ssuRUBISCO), promotory proteinu tepelného šoku hsp80 z Brassica (viz EPA 0 559 603), aktinový promotor z Arabidopsis, SuperMas promotor (viz WO 95/14098) a další. Výhodné promotory jsou takové promotory, které poskytují vysokou konstitutivní expresi, výhodnější jsou takové promotory, které poskytují specificky vysokou hladinu exprese v pletivech náchylných k poškození herbicidem. Mezi výhodné promotory patří aktinový promotor z rýže (McElroy et al., Molekula. Gen. genet 231: 150,
1991), ubichitinový promotor z kukuřice (EP 0 342 926, Taylor et al., Plant cell rep. 12: 491, 1993) a PROTEIN-1 promotor z tabáku, Arabidopsis nebo kukuřice (viz Ryals et al. , patentové přihlášky EP 332 104 a USA č. 08/181271, zahrnuté plně v odkazech). Samotné promotory se mohou způsoby známými v oboru modifikovat tak, aby se ovlivnila síla promotoru a zvýšila exprese protox.
Vynálezci také zjistili, že další výhodný promotor pro použití se sekvencí kódující protox rezistentní k inhibitoru je promotor spojený s nativním genem protox (tj . protox promotor, viz. současně projednávanou Mezinárodní přihlášku • ·· · · • ·· ·* ·♦ ·· · · · · * · • · · · ♦ *· • · · · ··· · ♦ • · * · ♦ · ··· · 4 ·· ·· s registračním číslem PH/5-20756/P1/CGC1846 s názvem „Promotory genů protoporfyrinogenoxidázy, podanou ve stejný den jako předkládaná přihláška, na jejíž plné zněni zde odkazujeme). Promotorová sekvence genu protox-1 z Arabidopsis je zde uvedena jako sekvence id. č. 13, promotorová sekvence genu protox-1 z kukuřice je zde uvedena jako sekvence id. č. 14 a promotorová sekvence genu protox-1 z cukrové řepy je zde uvedena jako sekvence id. č. 26.
Vzhledem k tomu, že protox promotor sám je vhodný pro expresi sekvence kódující protox rezistentní k inhibitoru, modifikace se mohou provést přímo v nativním genu protox přítomném v genomu rostlinné buňky, aniž by bylo třeba vytvářet chimérický gen s heterologní regulační sekvencí. Takové modifikace mohou být uskutečněny technikami cílené mutageneze jako je např. homologní rekombinace a selekce na výsledná fenotyp rezistentní k herbicidu (viz Příklad 10 v Pazkowski et al. , EMBO J. 7: 4021-4026, 1988 a patent USA
č. 5 487 992, zejména sloupce 18-19 a Příklad 8) . Další výhodou takového přístupu je to, že výsledný modifikovaný gen obsahuje, kromě nativního protox promotoru, také jakékoliv další regulační prvky, jako např. sekvence kódující signální nebo tranzitní peptidy, které jsou součástí nativního genu.
Signální nebo tranzitní peptidy se mohou fúzovat se sekvencí kódující protox v chimérických konstruktech DNA podle předkládaného vynálezu, aby se transport exprimovaného enzymu protox nasměroval do požadovaného místa působení. K příkladům signálních peptidů patří ty peptidy, které jsou přirozeně spojeny s rostlinnými proteiny patogeneze PR-1 a PR-2 a podobně (viz např. Payne et al. , Plant Mol. Biol. 11: 89-94, 1988). K příkladům tranzitních peptidů patří chloroplastové peptidy, které popsali VonHeijne et al.
(Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126, 1991), Mazur et al. (Plant Physiol. 85: 1110, 1987) a Vorst et al. (Gene 65: 59, 1988) a mitochondriální tranzitní peptidy, které popsali Boutry et al. (Nátuře 328: 340-342, 1987). Tranzitní peptidy chloroplastů a mitochondrií se považují za zvláště užitečné podle předkládaného vynálezu, neboř enzymatická aktivita protox se typicky vyskytuje v chloroplastu nebo mitochondrii. Nejvýhodnější je použití chloroplastových tranzitních peptidů, neboř se má zato, že enzymatická aktivita protox právě v chloroplastu je prvotním cílem působení herbicidů inhibujících protox (Witkowski a Halling, Plant Physiol. 87: 632, 1988, Lehnen et al., Pestříc. Biochem. physiol. 37: 239, 1990, Duke et al. , Weed Sci. 39: 465, 1091). Také sem patří sekvence, které vedou k umístění kódovaného proteinu do různých buněčných kompartmentů jako např. vakuoly (viz např. Neuhaus et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 103 6210366, 1991, Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53, 1991). Relevantní objevy popsané v těchto publikacích zahrnujeme mezi odkazy.
Chimérické konstrukty podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat více kopií promotoru nebo více kopií strukturních genů protox. Navíc mohou konstrukty obsahovat sekvence kódující markéry a sekvence kódující další peptidy jako jsou signální nebo tranzitní peptidy, z nichž každý je ve vhodném čtecím rámci společně s dalšími funkčními prvky v molekule DNA. Takové konstrukty může připravit průměrný odborník.
Mezi užitečné markéry patří peptidy, které poskytují rezistenci k herbicidům, antibiotikům nebo jiným chemickým látkám, jako je např. rezistence k hygromycinu, kanamycinu, G418, gentamycinu, lincomycinu, metothrexatu, glyphosatu, fosfinotricinu a pod. Tyto markéry se mohou použít pro výběr • 4 ·· • 4 4 ·
4 44
4 4 ·
4 ·
4 4 4 a odlišení buněk transformovaných chimérickými konstrukty DNA podle předkládaného vynálezu od buněk netransformovaných. Dalšími vhodným markéry jsou peptidové enzymy, které se dají snadno detekovat viditelnou reakcí, např. barevnou reakcí, jako je např. luciferáza, β-glukuronidáza nebo βgalaktosidáza.
Způsob pozitivní selekce geneticky tranforomovaných buněk, do kterých se může vložit požadovaná nukleotidová sekvence, která poskytuje transformovaná buňce selektivní výhodu, je popsán ve WO 94/20627, na což se tímto odkazujeme .
Exprese v plastidech, kde jsou geny vloženy homologní rekombinací do všech z několika tisíc kopií cirkulárního plastidového genomu přítomných v každé rostlinné buňce, má výhodu enormního počtu kopií ve srovnání s geny exprimovanými v jádře, což dovoluje úroveň exprese která může přesahovat 10 % celkového rozpustného proteinu v rostlině. Kromě toho je exprese v plastidech žádoucí proto, že znaky kódované plastídem jsou nepřenosné pylem a tudíž je zabráněno potenciálnímu riziku nechtěného úniku transgenu a přenosu na divoké příbuzné transgenních rostlin. Technologie transformace plastidů je podrobně popsána v patentech USA č. 5 451 513, 5 545 817 a 5 545 818, na jejichž plné znění odkazujeme, a v přihlášce PCT č. WO 95/16783, na jejíž plné znění odkazujeme, a dále v článku McBride et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305, 1994, na jehož plné znění odkazujeme. Základní technika pro transformaci chloroplastů tabáku byla vyvinuta a zdokonalena v laboratoři, kterou vede Dr. Pal Maliga na Rutgers University (Piscattaway, New Jersey) , a zahrnuje bombardování pletiva listu mikročásticemi, které obsahují úseky klonované plastidové DNA lemující selektovatelný markér rezistence k antibiotiku. Lemující úseky dlouhé 1 až 1,5 kb, nazývané zaměřovači sekvence, usnadňují homologní rekombinaci v plastidovém genomu a tak umožňují nahradit nebo modifikovat specifický úsek v plastomu tabáku velkém 156 kB. Původně byly využity jako selektovatelný markér pro transformaci bodové mutace v chloroplastových genech pro 16S rRNA a rpsl2 udělujících rezistenci ke spectinomycinu a/nebo streptomycinu (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530, na úpný text tohoto článku odkazujeme, a Staub, J.M. a Maliga, P., 1992, Plant Cell 4, 39-45, na úplný text tohoto článku odkazujeme). To vedlo k stabilní homoplazmové transformaci s frekvenci asi 1 na 100 bombardování cílového listového pletiva. Přítomnost klonovacích míst mezi těmito markéry umožňuje vytvořit vektor cílený do plastidu pro vnášení cizorodých genů (Staub, J.M. a Maliga, P., EMBO J. 12: 601-606, 1993, na úplný text tohoto článku odkazujeme). Bylo dosaženo podstatného zvýšení frekvence transformace tím, že se recesivní geny pro rRNA nebo r-protein rezistence k antibiotiku nahradily dominantně selektovatelným markérem, a sice bakteriálním genem aadA, který kóduje enzym aminoglykosid-3'-adenyltransferázu, který detoxikuje spectinomycin (Svab, Z. a Maliga, P., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 913-917, na úplný text tohoto článku odkazujeme). Předtím byl tento markér úspěšně využit pro transformaci plastidového genomu zelené řasy Chlamydomonas reinhardtii s vysokou frekvencí (Goldschmidt-Clermont, Μ. , 1991, Nucl. Acid Res. 19, 4083-4089, na úplný text tohoto článku odkazujeme).
Předkládaný vynález se proto také týká chimérického genu obsahujícího rostlinný plastidový promotor operativně spojený s izolovanou molekulou DNA, která kóduje buďto nativní rostlinný enzym protox nebo modifikovaný rostlinný enzym protox, jako je např. molekula DNA kódující nativní • to • toto toto ·· to· 9 · · · · · ·· · · to toto ·· ·· ···♦ to to· ··· · ♦ · ··· ···· ··· ·* ·* ·· nebo modifikovaný enzym protox z pšenice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže, nebo čiroku. Zvláště výhodný je rostlinný promotor plastidového genu clpP. Chimérický gen výhodně dále obsahuje 5'-netranslatovanou sekvenci (5UTR) z plastidového promotoru a 3'-netranslatovanou sekvenci (3'UTR) z plastidového genu operativně spojenou s izolovanou molekulou DNA. Výhodně 3'UTR je 3'netranslatovaná sekvence plastidového genu rpsl6.
Předkládaný vynález dále zahrnuje vektor pro transformaci plastidu obsahující chimérický gen popsaný bezprostředně v předchozím textu, a také rostlinný plastid transformovaný tímto vektorem pro transformaci plastidu, přičemž modifikovaný rostlinný enzym protox se exprimuje v rostlinném plastidu. Vynález se také týká rostliny nebo rostlinné buňky, nebo jejich potomstva, které obsahují rostlinný plastid, přičemž modifikovaný rostlinný enzym protox se exprimuje v rostlině a uděluje jí toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox.
Když se alela protox rezistentní k herbicidu získá cílenou mutací nativního genu v plodině (kulturní rostlině) nebo v buněčné kultuře, ze které se může plodina regenerovat, může se přenést do komerčních variet pomocí tradičních způsobů šlechtění , aby se vyšlechtila plodina tolerantní k herbicidu, aniž by se modifikovaná kódující sekvence měnila technikami genového inženýrství a transformací přenesla do rostliny. Alternativně může být gen rezistentní k herbicidu izolován, změněn technikami genového inženýrství pro optimální expresi a pak vnesen transformací do požadované variety.
Geny kódující změněnou protox rezistentní k inhibitorům protox se mohou použít také jako selektovatelné markéry v metodách transformace rostlinných buněk. Např. rostliny, rostlinné pletivo nebo rostlinné buňky mohou být transformovány genem kódujícím změněnou protox, která je schopná exprese v rostlině. Takto transformované buňky jsou pak přeneseny na médium obsahující inhibitor protox, kde přežiji jen transformované buňky. K inhibitorům protox, které mohou být užitečné jako selekční činidla, patří difenlyétery (např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluorometyl)fenoxy]-2nitrobenzoová kyselina a její metylester nebo oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-etoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)), oxidiazoly (např. Oxidiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1metyletoxy) fenyl]-5- (1,1-dimetyletyl) -1,3,4-oxadiazol-2- (3H) on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid, chloroftalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylpyrazoly (např. TNPP-etyl, etyl-2-[l-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionát, M&B 39279), pyridinové deriváty (např. LS 82-556), fenopylát a jeho O-fenylpyrollidinové a piperidinokarbamátové analogy a bicyklické triazolony, což je popsáno v patentových přihláškách WO 92/04827 a EP 532146.
Způsob je použitelný pro jakoukoliv rostlinnou buňku schopnou transformace změněným genem kódujícím protox, a může se použít s jakýmkoliv požadovaným transgenem. Exprese transgenu a genu protox může být řízena stejným promotorem funkčním v rostlinné buňce nebo samostatnými promotory.
Modifikované enzymy protox rezistentní k inhibitoru podle předkládaného vynálezu jsou rezistentní k herbicidům, které inhibují aktivitu přirozeně se vyskytující protox. Herbicidy, které inhibují protox, zahrnují molekuly mnoha různých strukturních tříd (Duke et al. , Weed Sci. 39: 465,
1991, Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol.43: 193,
1992, Matringe et al. , FEBS Lett. 245: 35, 1989, Yanase a ·4 • 4 4 · • · ·· • 4« 4 · »4 · • 4 9 4
Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70, 1989) . Tyto herbicidní sloučeniny zahrnují difenlyétery (např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4- (trifluorometyl) fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina a její metylester, nebo oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-etoxy4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)), oxidi-azoly (např. oxidiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyl-etoxy)fenyl]-5- (1,1dimetyletyl)-1,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)3.4.5.6- tetrahydroftalimid, chloroftalim, N-(4-chlorofenyl)3.4.5.6- tetrahydroftalimid) , fenylpyrazoly (např. TNPP-etyl, etyl-2-[l- (2,3,4-trichlorfenyl) -4-nitro-pyrazolyl-5-oxy]propionát, M&B 39279), pyridinové deriváty (např. LS 82-556), fenopylát a jeho O-fenylpyrollidinové a piperidinokarbamátové analogy.
Zvláště významné difenylétery jsou podle obecného vzorce I,
•CONHSO2CH3 (vzorecll) nebo Brighton Crop Proteckde R je -COONa (vzorec II) ,
COOCH2COOC2H5 (vzorec IV, viz et al tion Conference- Weeds: 47-51, 1989).
Další zajímavé difenylétery jsou takové, kde R se rovná :
NOCH2COOCH3
CCH2OCH3 (IVa) (Viz Hayashi et al., Brighton Crop Protection ConferenceWeeds: 53-58, 1989).
• ·
Další zajímavé difenylétery jsou podle vzorce:
00*00 0 • 0 0 0 0» 00 0 0 00 0 00 0000 0 0 0 0 0 0
00 ·· ··
(IVb) (Bifenox, viz dest et al. , Proč. Northeast Weed Sci. Conf 27: 31, 1973).
Další zajímavé difenylétery mají obecný vzorec IVc:
och2ch3 cf3-o-N02 (IVc)
Cl (Oxyfluorfen, viz Yih a Swithenbank, J. Agric. Food Chem, 23: 592, 1975) .
Další zajímavý difenyléter má vzorec IVd:
CH3
CO2CHCO2CH2CH3 cf3Z Vo.
(ivd) no2
Cl (Laktofen, viz str. 623 v „The Pesticide Manual, lOth ed. , ed. C. Tomlin, British Crop Protéction Councíl, Surrey, 1994) .
Významná je také skupina herbicidů známá jako imidy, které mají obecný vzorec V:
kde Q se rovna nebo
nebo
nebo • 0 ·· ♦· • · · « · ♦ • 0 · 0 ·· • 0· 0000 · (V) (VI) (VII) (VIII)
(ix) • · · ··« · · • 0 »·
nebo (IXa) nebo
(IXb) (Viz Hemper et al., „Proceedings of the Eighth International
Congress of Pesticide Chemistry, Ragdale et al., eds., Amer. Chem. Soc., Washington, D:C:, S. 42-48, 1994), a kde R se rovná H, Cl nebo F, R2 je Cl a R3 je optimálně substituovaná éterová, thioéterová, esterová, aminová nebo alkylová skupina. Alternativně R2 a R3 společně mohou tvořit 5 nebo 6členný heterocyklický kruh.
Zvláště zajímavé příklady imidových herbicidů uvádějí následující vzorce Vila, X, XI, XII, XIII, XIV, XV a XVI.
φ • φφ φφ φφ • φ · · φ φ * φ φφ φ φ φφφ φ φ φ φφφ φφ φφ (Fluthiacetmetyl, viz. Miyazawa et al. , Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 23-28, 1993).
Cl o v N 0¾
(X) (Sulfentrazon, viz Van Saun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 77-82, 1993).
(XI)
(XII) (Viz Miura et Weeds, s. 35-40 al., Brighton Crop Protection Conference1993).
(XIII) (XIV) • · • · · • · ··· ···· · ·· ·· »· • 9 9 9 9 9
9 9 9 99
9 9 999 9 · • · 9 9 9
99 99
(XV) (xvi)
Herbicidní aktivita v předchozím textu uvedených sloučenin je popsána v Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protéction Conference, Weeds, British Crop protection Councel (vzorce X a XVI) , Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds, British Crop Protection Councel (vzorce XII a XIII) , v patentu USA č. 4 746 352 (vzorec XI) a v Abstracts of the Weed Science Society of America 33, s.9, 1993 (vzorec XIV).
Nejvýhodnější imidové herbicidy jsou ty, které patří do třídy aryluracilů a mají obecný vzorec XVII
kde R je (alkenyloxy)karbonylalkylová skupina, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 uhlíkových atomů a alkylová skupina obsahuje 1 až 4 uhlíkových atomů, jak je popsáno v patentu USA č. 5 183 492, na který se tímto odkazujeme.
• · • · · ·
Významné jsou také herbicidy podle následujících vzorců
XVI Ha XIX
(Thiadiazimin, viz. Weler et al. , Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 29-34, 1993).
(XIX) (Carfentrazon, viz. VanSaun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 19-22, 1993), a dále N-substituované pyrazoly podle obecného vzorce XX
(XX) kde Rx je alkylová skupina š 1 až 4 atomy uhlíku, volitelně substituovaná jedním nebo více halogenovými atomy,
R2 je vodík nebo alkyloxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž každá z nich může být substituována jedním nebo více halogenovými atomy, nebo • · · · · · · · · • ·· ········· ·· ··· · · · ··· ···· ··· ·· ·· ··
Rx a R2 společně tvoří skupinu -(CH2)n-X-, kde X je navázáno v R2, a R3 je vodík nebo halogenová skupina,
R4 je vodík nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku,
R5 j vodík, nitroskupina, kyanová skupina nebo skupina -COOR6 nebo CONR7R8, a
Rs je vodík, alkylové skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylová skupina se 2 až 6 atomy uhlíku nebo alkynylová skupina se 2 až 6 atomy uhlíku (viz mezinárodní patentové přihlášky WO 94/08999 a WO 93/10100 a patent USA č. 5 405 829, udělený firmě Shering), a dále N-fenylpyrazoly, jehož příklad ukazuje vzorec
XXI
(XXI) (Nipyraclofen, viz. str. 621 v „Pesticide Manual, 9th ed. , ed. C.R.Worthing, British Crop Protection Councel, Surrey, 1991), a dále 2-aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazoly substituované v poloze 3 (Lyga et al. , Pesticide Sci. 42: 29-36, 1994), jejichž příklad ukazuje vzorec XXIa • ·
N02
Cl
NHC-CH-CH3
O
Cl
Cl
I (XXIa) chf2 (BAY 11340) .
Významné jsou také fenylpyrazoly takového typu, který je popsán v přihláškách WO 96/01254 a WO 97/00246, na které se tímto odkazujeme (vzorec XXII).
Hladiny herbicidů, které normálně inhibují aktivitu protox, odpovídají aplikačním dávkám známým v oboru, a jsou do značné míry závislé na vnějších faktorech jako je prostředí a čas a způsob aplikace. Např. v případě imidových herbicidů představovaných vzorcem V až IX, a zvláště pak vzorcem X až XVII, aplikační dávky jsou v rozmezí od 0,0001 až do 10 kg/ha, výhodně od 0,005 do 2 kg/ha. Dávky nebo koncentrace herbicidu mohou být různé v závislosti na požadovaném účinku a použité sloučenině, a mohou být určeny způsoby v oboru známými.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace, který spočívá v tom, že se aplikuje na populaci rostlin, vybranou ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovou třtinu, sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny, rýži ·· · • · • 4 a další, účinné množství herbicidu inhibujícího protox. Výhodný je způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace, který se skládá z toho, že se aplikuje na populaci rostlin, vybraných ze skupiny obsahující sóju, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy a rýži, účinné množství herbicidu inhibujícího protox. Zvláště výhodný je způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace, který se skládá z toho, že se aplikuje na populaci rostlin, vybraných ze skupiny obsahující Arabidopsis, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok a rýži, účinné množství herbicidu inhibujícího protox.
Vynález je dále popsán následujícími podrobnými příklady. Tyto příklady slouží pouze k ilustraci vynálezu a v žádném případě ho nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Standardní techniky rekombinantní DNA a klonování molekul použité zde jsou v oboru známy a jsou popsány v publikacích: T. Maniatis, E.F.Fritsch a J. Sambrook, Molecular Cloning: A LAboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, a T.J. Šilhavý, M.L. Beraman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1984.
Část A: Izolace a charakterizace genů rostlinné protoporfyrinogenoxidázy (protox)
Příklad 1
Izolace Protox-1 cDNA z pšenice založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice • ·» «·· ·« · ·· • β · · • · · · .· · · · • · · · * • · · «α
Celková RNA připravená z Triticum aestivum (cv. Kanzler) byla dodána firmě Clontech, kde byla připravena cDNA knihovna ve vektoru lambda Uni-Zap. Přibližně 50 000 pfu („plaque forming units, jednotek tvořících plaky) z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misky a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5, viz příklad 2 z Mezinárodní patentové přihlášky PCT/IB95/00452, podané 8. června 1995 a publikované 21. prosince 1995 jako WO 95/34659) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984, na plné znění této publikace se zde odkazujeme). Pozitivně hybridizujicí plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší klon protox-1 cDNA pšenice získaný z počátečního screeningu, nazvaný „Protox-1 z pšenice byl dlouhý 1489 bp. Tento Protox-1 z pšenice postrádal kódující sekvenci pro tranzitní peptid a navíc asi 126 aminokyselin kódující sekvence maturovaného peptidu, jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox.
Druhý screening byl proveden, aby se získala delší cDNA protox z pšenice. Pro tento screening byla připravena interní cDNA knihovna z z Triticum aestivum (cv. Kanzler) ve vektoru Lambda Uni-Zap. Přibližně 200 000 pfu z cDNA knihovny bylo testováno stejným způsobem jak je popsáno v předcho<· ♦ ·· ·· ·· • · · · · · · · • * » · to · · · • · · · · · · · · · • · · · to· zim odstavci, až na to, že se jako sonda použila Protox-1 cDNA z pšenice a hybridizace i odmývání proběhly při 65°C místo 50°C. Nej delší cDNA z pšenice získaná v tomto screeningu byla nazvána „Protox-la z pšenice a byla dlouhá 1811 bp. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí kódovaná sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 9 a 10. Ze srovnání s jinými známými sekvencemi rostlinného protox peptidu a s odpovídající genomovou sekvencí vyplývá, že tato cDNA je bud' plné délky nebo postrádá pouze několik kodonů tranzitního peptidu (tab. 1). Tato sekvence z pšenice má 91% identitu (95% podobnost) se sekvencí proteinu Protox-1 z kukuřice, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 6.
Protox-la z pšenice ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 19. března 1996 jako pWDC-13 (NRRL č. B-21545).
Příklad 2
Izolace Protox-1 cDNA ze sóji založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z Arabidopsis
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená ze sóji (cv. Wiliams 82, epikotyl) byla zakoupena od firmy Stratagene. Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misky a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na membránu Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z Arabidopsis (sekvence id. č. 1, viz příklad 1 z mezinárodní patentové přihlášky PCT/IB95/00452, podané 8. června 1995 a publikované 21. prosince 1995 jako WO 95/34659) zriacené P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M
NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující • 9 plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, Inc.). Ne j delší získaný klon cDNA ze sóji nazvaný „Protox-1 ze sóji byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox (tab. 1) . Protox-1 ze sojin je dlouhá 1847 bp a kóduje protein o velikosti 58,8 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 11 a 12. Protein ze sóji má 78% identitu (87% podobnost) s proteinem Protox-1 z Arabidopsis.
Protox-1 ze sóji ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 15. prosince 1995 jako pWDC-12 (NRRL ě. B-21516).
Srovnáni predikovaných sekvencí aminokyselin příslušných proteinů kódovaných sekvencemi id. č. 2, 6, 10, 12, 15, 17, 19, 21 a 23 je uvedeno v následující tabulce 1. Srovnání predikovaných sekvencí aminokyselin příslušných proteinů kódovaných sekvencemi id. č. 4 a 8 je uvedeno v následující tabulce 2.
Tab. 1
Srovnání sekvence aminokyselin Protox-1 z Arabidopsis („Arabpt-1 sekvence id. č. 2), kukuřice („Mzpt-1, sekvence id. č. 6), pšenice („Wtpt-1, sekvence id. č. 10), sóji („Soybeanpt-1, sekvence id. č. 12), bavlníku („Cottonpt-1, sekvence id. č. 16), cukrové řepy („Sugpt-1, sekvence id. č. 18), řepky olejky („Rappt-1, sekvence id. č. 22) a čiroku („Sorghumpt-1, sekvence id. č. 24).
Srovnání bylo provedeno pomocí programu „Pile up (GCG Package, University of Wisconsin, Madison, WI) . Polohy aminokyselin, které mohou být modifikovány podle předkládaného ·
• 0 • 0 »000 «0 ·· • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · 0 0 · » 000« 0 0 0 0 0 0 000 ·· 00 vynálezu, aby se získala nebo zvýšila rezistence k inhibitoru, jsou •vyznačeny tučně.
50
Rapept-1 ....................MDLSLLRP.. QPFLSPFSNP FERSRPYKPL
Arahpt-1 ....................MELSLLRFIT QSLLPSFSKP NLRLNVYKPL
Sorghorpt-1 ..................................................
Mzpt-1 ..................................................
Wtpt-1 .............................M ATATVAAASP LRGRVIGRFH
Ricept-1 ..................................................
Cottonpt-1 ................MCAL IDLSLLRSSP SVSFFSIFHH QHPPRFRKPF
Soýbeanptl ........MV SVFNEILFPP NQTLLRPSLH SPTSFFTSFT RKFPRSRENP
Sugpt-1 MKSMALSNCI PQTQCMPLRS SGHYRGNCIM LSIPCSLIGR RGYYSHKKRR
Rapept-1
Arahpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-1
Soýbeanptl
Sugpt-1
100 NLRCSV5GGS WGSSTIEG3 GGGKTVTADC VIVGGGISGL CIAQALVTKH RLRCSVAGGP TVGSSKH233 GGT.TITTDC VIVGGGISGL CIAQALATKH
RVRPRCATAS SATETPAAFG VRL . . .ADC VWGGGISGL CTAQALATRH . .SAEC VIVGAGISGL CTAQALATRY
KLRCSLAB3P TISSSKIDGG ESS ILRCSIAEES TASPPKTR.. DSA . .IADC VIVGGGISGL CIAQALATKH . .PVDC VWGGGVSGL CIAQALATKH
MSMSCSTSSG SKSAVKEAGS GSGAGGLLDC VIVGGGISGL CIAQALCTKH
Rapept-1
Arahpt-1 jrghunpt-l
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1 :ottonpt-l toybeanptl
Sugpt-1
101 150
PDA. .AKNVM VTEAKDRVGG NIIT. .RESQ GFLWEB3ENS PQPSDEMLTM
PDA.
. .G.
. .G.
AENLI VTEAKDKVGG NIIT. .REEN GFLWESGENS PQPSDEMLIM
.......·;.........STVERPEE GYLWEEGENS PQPSDPVLSM
VGDVL VTEARARPGG NITTVERPEE GYLWEB3ENS FQPSDPVLTM VSDLL VTEARDREOG NITTVERPDE GYLWEEGENS FQPSDPVLTM
RDV.
. .A.
ASNVI VTEARDKVGG NITTVER. .D GYLWEEGENS FQPSDPILTM NANW VTEARDRVGG NITIMER. .D GYLWEEGENS PQPSDFMLIM
SSSSLSENFI VTEAKDKVGG NIVTVE. .AD GYIWEEGENS FQPSDAVLTM • >
Rapept-1
Arahpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept—1
Cottonpt-l
Soybeanptl
Sugpt-1
Rapept-1
Arahpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-l
Soybeanptl
Sugpt-1
Rapept-1
Arahpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-l
Soybeanptl
Sugpt-1 • 0 000 · · 0 0 0 0 0 0 00 0000 0 • 0 000 ··· 000 0000 000 00 ·« 00
151 ' 200
VVDSGLKDDL VLGDPTAPRF VLWMGKLRPV PSKLTDLPFF DLMSIGGKIR WDSGLKDDL VLGDPTAPRF VLWM3KLRP7 PSKLTDLPFF DLMSIGGKIR AVDSGLKDDL VFGDFNAPRF VLWEGKLRPV PSKPADLPFF DLMSIPGKLR AVDSGLKDDL VFGDFNAPRF VLWEGKLRPV PSKPADLPFF DLMSIPGKLR AVDSGLKDDL VFGDFNAPRF VLWEGKLRPV PSKPGDLPFF SIMSIPGKLR
AVDSGLKDDL VLGDFNAPRF VLWEGKLRPV PSKPTDLPFF DLMSIAGKLR WDSGLKDEL VLGDPDAPRF VLWNRKLRPV FGKLTDLPFF DLMSIGGKIR AVDSGLKDEL VLGDFNAPRF VLWNDKLRPV PSSLTDLPFF DLMTIPGKIR .201 250
AGFGAIGIRP SPPGREESVE EFVRRNLGDE VFERLIEPFC SGVYAGDPAK
AGPGALGIRP SPPGREESVE EFVRRNLGDE VFERLIEPPC SGVYAGDPSK
AGLGALGIRP PAPGREESVE EFVRRNLGAE VFERLIEPFC SGVYAGDPSK
AGLGALGIRP PPPGREESVE EFVRRNLGAE VFERLIEPPC SGVYAGDPSK
AGLGALGIRP PPPGREESVE EFVRRNLGAE VFERLIEPFC SGVYAGDPSK
AGPGAIGIRP PPPGYEESVE EFVRRNLGAE VFERFIEPPC SGVYAGDPSK
AGPGALGIRP PPPGHEESVE EFVRRNLGDE VFERLIEPPC SGVYAGDPSK
AALGALGFRP SPPPHEESVE HFVRRNLGDE VFERLIEPFC SGVYAGDPAK
251 300
LSMKAAPGKV WKLEENGGSI IGGAFKAIQA KNKAPKTIRD PRLPKPKGQT LSMKAAPGKV WKLS^ÍGGSI IGGTFKAIQE RKNAPKAERD PRLPKPQGQT LSMKAAPGKV WRLEEAGGSI IGGnKTIQE RGKNPKPPRD PRLPKFKGQT LSMKAAPGKV WRLEET3GSI IGGTIKTIQE RSKNPKPPRD ARLPKPKGQT LSMKAAPGKV WRLEEEG3SI IGGTIKAIQD KGKNPKPPRD PRLPAPKGQT RALKAAFGKV WRLEDIGGSI IGGnKTIQE RGKNPKPPRD PRLPTPKGQT LSMKAAFGRV WKLEEIGGSI IGGTFKTIQE RNKTPKPPRD PRLPKPKGQT LSMKAAPGKV WKLEKNGGSI IGGTFKAIQE RNGASKPPRD PRLPKPKGQT LSMKAAPGKV WKLSQKGGSI IGGTLKAIQE RGSNPKPPRD QRLPKPKGQT
Rapept-1 301 VGSFRKGLIM LPEAISARLG
Aratpt-1 VGSFRKGLRM LPEAISARLG
Sorghunpt-1 VASFRKGLAM LFNAITSSLG
Mzpt-1 VASFRKGLAM LFNAITSSLG
Wtpt-1 VASFRKGLAM LLNAIASRLG
Ricept-1 VASFRKGLIM LPDAITSRLG
Cottonpt-1 VGSFRKGLIM LPEAIANSLG
Soybeanptl VGSFRKGLIM LPEAISARLG
Sugpt-1 VGSFRKGLVM LFTAISARLG
350
DKVKVSWKLS SITKLASGEY SLTYFTPEEI
SKVKLSWKLS GITKLSSGSY NLTYFTPDGL
SKVKLSWKLT SMIKSDGKGY VLEYFTPECV SKVKLSWKLT SIIKSDDKGY VLEYFTPEGV SKVKLSWKLT SITKAENQGY VLGYETPEEL SKVKLSWKLT SIIKSENKGY ALVYFTPBGV SNVKLSWKLS STIKLGM3GY NLTFETPEGM
NKVKLSWKLS SISKLDSGEY SLTYFTPBGV
SRVKLSWTLS SIVKSINSEY SLTYDTPDGL
Rapept-1
Arahpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-1
Soybeanptl
Sugpt-1
351 400 VTVQSKSWM TVPSHVASSL LRPLSDSAAE ALSKLYYPFV AAVSISYAKE VSVQSKSWM TVPSHVASSL LRPLSESAAN ALSKLYYPFV AAVSISYPKE VLVQAKSVIM TIPSYVASDI LRPLSGDAAD VLSRFYYPPV AAVTVSYPKE VSVQAKSVIM TIPSYVASNI LRPLSSDAAD ALSRFYYPPV AAVTVSYPKE VSVQAKSVIM TIPSYVASDI LRPLSIDAAD ALSKFYYPPV AAVTVSYPKE VSVQAKTWM TIPSYVASDI LRPLSSDAAD ALSIFYYPPV AAVTVSYPKE VSLQSRSWM TIPSHVASNL LHPLSAAAAD ALSQFYYPPV ASVTVSYPKE VSLQCKTWL TIPSYVASTL LRPLSAAAAD ALSKFYYPPV AAVSISYPKE VSVR1KSWM TVPSYVASRL LRPLSDSAAD SLSKFYYPPV AAVSLSYPKE
Rapept-1
Arahpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-1
Soybeanptl
Sugpt-1
401
AIRSECLIDG
AIRTDCLIDG
AIRKECLIDG
AIRKECLIDG
AIRKECLIDG
AIRKECLIDG
AIRKECLIDG
AIRSECLIDG
AIRSECLING
ELKGEGQLHP RTQKVFTLGT ELKGFGQLHP RTQGVFTLGT ELQGFGQLHP RSQGVETLGT ELQGFGQLHP RSQGVETLGT ELQGFGQLHP RSQGVETLGT ELQGFGQLHP RSQGVETLGT ELKGFGQLHP RSQGIFTLGT ELKGFGQLHP RSQGVETLGT ELQGFGQLHP RSQGVETLGT
450
IYSSSLFPNR APPGRVLLLN IYSSSLFPNR APPGRILLLN
IYSSSLFPNR APAGRVLLLN
IYSSSLFPNR APDGRVLLLN
IYSSSLFPNR APAGRVLLLN
IYSSSLFPNR APAGRVLLLN
IYSSSLFPNR APSGRVLLLN
IYSSSLFPNR APPGRVLLLN
IYSSSLFPSR APPGRILILS • » *
• · · ··
Rapept-1
Arahpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-1
Soybeanptl
Sugpt-1
Rapept-1
Araipt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-1
Soybeanptl
Sugpt-1
451
YIGGAINIGI
YIGGSINIGI
YIGGMNTGI
YIGGAINIGI
YIGGSTOTCI
YIGGSINIGI
YIGGAINIGI
YIGGAINIGI
YIGGAKNPGI
501
PQFLIGHTDL
PQFLVGHFDI
PQFLVGHLDL
PQFLVGHLDL
PQFLIGHLDR
PQFLIGHLDH
PQFLVGHLDL
PQFLVGHLDL
PQFSIGHFDL
LSKSEGELVE
LSKSEGELVE
VSKTESELVE
VSKTESELVE
VSKTESDLVG
VSKTESELVE
LSKTEGELVE
LSKTDSELVE
I23KSKDELAK
VDAAKASLSS
LDIAKSSLTS
LEAAKSALDQ
LEAAKAALDR
LAAAKSALGQ
LEAAKSALGK
LDSAKMALRD
LD7AKASIRN
LDAAKAALTD
IKPSSTDPLV
IKENSTDPLK
INPTAVDPLV
IMSTAVDPLV
INPRAADPLA
INPRAVDPLV
INPNAKDPLV
INPNAQDPFV
INFDAKLPR.V
NYVAGVALGR
NYVAGVALGR
NYVAGVALGR
NYVAGVALGR
KYVAGVALGR
NYVAGVALGR
NYVSGVALGR
NYVSGVALGR
NYVSGVALGR
AVDRDLRKML
AVDRDLRKML
AVDRDLRKML
AVDRDLRKML
AVDRDLRKML
AVDRDLRKML
AVDRDLRKML
TVDRDLRKIL
TVDKDLRRML
SGHEGLFLGG
SGYEGLFLGG
GGYN3LFIGG
GGYDGLFLGG
GGYDGLFLGG
GGYDGLFLGG
SGFHGLFLGG
IGFEGLFLSG
IGVKGLFLGG
500
LGVKLWPQAI
LGVRVWPQAI
LGVRVWPQAI
LGVRVWPQAI
LGVRVWPQAI
LGVRVWPQAI
LGVRVWPKAI
VGVRLWPQAI
LGVRVWPQAI
550
CVBGAYETAT
CVEGAYETAI
CIEGAYESAA
CVEGAYESAS
CIEGAYESAS
CVEEAYESAS
CVEGAYEVAA
CVEGAYEVAA
CIEGAYESAA
551 563
Rapept-1 QVNDPMSRYA YK* Arahpt-1 EVNNFMSRYA YK*
Sorghuirpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottonpt-1
Soybeanptl
Sugpt-1
QIYDFLTKYA YK* QISDFLTKYA YK* QVSDFLTKYA YK* QISDYLTKYA YK* EVKEFLSQYA YK* EVNDFLINRV YK* EWDFLSQYS DK* «9 9 * 99 9 9 9 · 9 · • · 9 9···*·
9 9 9* 9 9 99· · ·
9-9 999 999
999 9999 999 «9 ·· «·
Tab. 2
Srovnání sekvencí aminokyselin Protox-2 z Arabidopsis (sekvence id. č. 4) a z kukuřice (sekvence id. č. 8).
Shodné aminokyselinové zbytky jsou označeny svislou čárkou mezi sekvencemi. Srovnání je provedeno programem „GAP, který popsali Deveraux et al. (Nucl. Acíd Res. 12: 387-395, 1984).
Procenta podobnosti: 75,889
Procenta identity: 57,905
Srovnávané sekvence: Protox-2.Pep x Mzprotox-2.Pep
............................MASGAVAD. HQIEAVSGKRVAV 21 •1 ΙΦ |..::.111
MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 50
VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71 f ί 111111111 i: I -- · I: I Η 1111 ·: I · 11 ί: I- :·1·:ΙΙ11ΙΙΙ
VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 100
MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121 UM I · : · I : 1 ! 11 I . : 11 l· I I I . I 1 1 I I : : 1 . 1 . : : I . : I I . 1 : .
101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150
122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167
111111-11 = - = = = 1111 = 1-1 -1 = 111 = · -111 = -1 =1111-1 151 SEVLSTKSKIALEFEPFLYKKAKTENSGFFFSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200 ·
9 9 · · · * · ·
9 » · < · * ·· · · ·
9 9 9 · · · · ·· «··· ··· «· ·· 9·
168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217
II 11==11 i l· I i í I -11 -1 i I - -1 - II -111 - b:·=ΙΙ=ΙΙΙΙΙ -1 = 1
201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250
218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267 |||:. = · ..|.|.::..|.||||.HU | :.| | .
251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300
268 VLSLS. .YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ. . .NPHYDAVIMTAPLCNVK 312 lili· =·ΙΙ=Ι· |. =··=== I- dli 111111=11=
01 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350
313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362
II· ΙΙΙ·|. I = 111 · = = I = 111 = = = I · I · I = · 11 = 1111 i 11111 I
351 RMKFTKGGAPWLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400
363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411
I 1111=111111111111111-1-1 · 11111 = 111 · I · = 11 Ι·Ι· I
401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450
412 KQWTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461
11:11111 -2111111:1 - |.| II -II lil· · I · 11:111:111 ·:
451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN 500
462 LPGFFYAGNHRGGLSVGXSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509 lllllllll : = 11-11· II 11 = 11111-111111 ......:
501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*. . . 545 • 4 • 44 ♦ 4 4 4
9
9
4
444 44 4 4
Příklad 3
Izolace Protox-1 cDNA z bavlníku založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená z Gossypium hirsutum L. (děložní lístky pěstované 72 hodin ve tmě) byla získána od Dr. Dicka Trelease, Dept. of Botany, Arizona State University (Ni, W. a Trelease, R.N., Arch. Biochem. Biophys. 289: 237-243, 1991) . Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misky a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na membránu Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies) . Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984).
Pozitivně hybridizuj£c£ plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA z bavlníku nazvaný „Protox-1 z bavlníku byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidů protox (tab. 1) . Protox-1 z bavlníku je dlouhá 1826 bp a kóduje protein o velikosti 58,2 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 13 a 14. Protein z bavlníku má 77% identitu (86% podobnost) s proteinem Protox-1 z kukuřice
Protox-1 z bavlníku ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 1. července 1996 jako pWDC-15 (NRRL č. B-21594).
• Φ φφ φ φ φ φ φ φ φφ φ φ · φφφφ φφφφ φ φφ φφφ φφφ φφφ φφφφ φφφ φφ ·< φ*
Příklad 4
Izolace Protox-1 cDNA z cukrové řepy založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z Arabidopsis
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená z Beta vulgarís byla získána od Dr. Philip Rea, Dept. of Botany, Plant Science Insitute, Philadelphia, PA (Yongcheol Kim, Eugene J. Kim a Philip A. Rea, Plant Physiol. 106: 375-382, 1994). Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5) značené
2
P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M
NaP04 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acaa. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.) . Nej delší získaný klon cDNA z cukrové řepy nazvaný „Protox-1 z cukrové řepy byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox (tab. 1). Protox-1 z cukrové řepy je dlouhá 1910 bp a kóduje protein o velikosti 60 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 15 a 16. Protein z cukrové řepy má 73% identitu (82% podobnost) s proteinem Protox-1 z Arabidopsis.
Protox-1 z cukrové řepy ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 29. července 1996 jako pWDC-16 (NRRL č. B-21595).
44 ·· ·· • 44 4 4 44 4
4 4 4 4 44
4 4 4 444 4 4
4 4 4 4 4
444 4· 4« 44
Příklad 5
Izolace Protox-1 cDNA z řepky olejky založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z Arabidopsis
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená z Brassica napus (3 až 4 týdny staré dospělé zelené listy) byla získána od Dr. Guenthera Ochse, Instutut fuer allgemeine Botanik, Johannes Guttenberg-Universitaet Mainz, Deutschland (Guenther Ochs, Gerald Schock a Aloysius Wild, Plant Physiol. 103: 303-304, 1993). Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z Arabidopsis (sekvence id. č. 1) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS) , 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 5 0 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA z řepky olejky označený „Protox-1 z řepky olejky byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox (tab. 1) . Protox-1 z řepky olejky je dlouhá 1784 bp a kóduje protein o velikosti 57,3 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 17 a 18. Protein z řepky olejky má 87% identitu (92% podobnost) s proteinem Protox-1 z Arabidopsis.
• 00 00 0 0 • »
000 0000
0- 00 00 0 0
0 0
0 0
0 0
000 *»
00 ♦ 0 0 Φ • 0 00
0 0 0 0
0 · • · 0 0
Protox-1 z řepky olejky ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 23. srpna 1996 jako pWDC-17 (NRRL č. B-21615).
Příklad 6
Izolace Protox-1 cDNA z rýže založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice
Knihovna cDNA v Lambda gtll připravená z Oryza sativa (etiolované výhonky staré 5 dnu) byla zakoupena od firmy Clontech. Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuzřice (sekvence id. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M
NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odrnývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a lambda DNA byla získána pomocí soupravy „Wizard Lambda-Prep (Promega). Inzerty cDNA byly subklonovány jako EcoRI fragmenty do vektoru pBluescript standardní technikou. Sekvence inzertů cDNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.) . Nej delší získaný klon cDNA z rýže nazvaný „Protox-1 z rýže byl klon dlouhý 1224 bp. Tento Protox-1 z rýže postrádal kódující sekvenci pro tranzitní peptid a navíc asi 172 aminokyselin kódující sekvence maturovaného peptidů, jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidů protox. Nukleotidová sekvence této neúplné cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 19 a 20 .
• to • to to •
to ··♦· • to • to ·* ·* ♦ · * · tototo· ·♦* · <
• · · ·♦ ··
Protox-1 z rýže ve vektoru pBlueScript SK byla uložena
6. prosince 1996 jako pWDC-18 (NRRL č. B-21648).
Příklad 7
Izolace Protox-1 cDNA z čiroku založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice
Knihovna cDNA v Lambda-Zap II připravená ze Sorghum bicolor(zelené semenáčky staré 3 až 6 dnů) byla získána od Dr. Klause Pfizenmeyera, Intitute of Cell biology and Immunology, University of Stuttgart, Germany (Harald Wajant, Karl-Wolfgang Mundry a Klaus Pfinzenmaier, Plant Mol. Biol. 26: 735-746, 1994). Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuzřice (sekvence id. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies) . Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS) , 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS pří 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Scí. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmídy pBluescript. Sekvence inzertů cDNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Ne j delší získaný klon cDNA z čiroku označený „Protox-1 z čiroku byl klon dlouhý 1590 bp. Tento Protox-1 z čiroku postrádal kódující sekvenci pro tranzitní peptid a navíc asi 44 aminokyselin kódující sekvence maturovaného peptidu, jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox. Nukleotidová sekvence této neúplné cDNA a • 00 ·· »0 0 0 0 • »
0 0
0
000 0000 0
00 0 0 0 0 ·
0 0 00
0000 0 0 0 0 · • 0 0 0 jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 21 a 22.
Protox-1 z čiroku ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 6. prosince 1996 jako pWDC-19 (NRRL č. B-21649).
Příklad 8
Demonstrace citivosti klonu rostlinné protox k herbicidům inhibujícím protox v bakteriálním systému.
Tekuté kultury Protox-1/SASX38, Protox-2/SASX38 a pBluescript/XLl-Blue byly pěstovány v médiu L amp100. ΙΟΟμΙ alikvoty z každé kultury byly vysety na médium L amp100 obsahuící různé koncentrace (Ι,ΟηΜ až lOmM) aryluracilového herbicidu inhibujícího protox podle vzorce XVII. Sady misek ve dvou opakováních byly inkubovány 18 hodin při 37 °C.
Kmen XLl-Blue protox+ E. coli nejevil citlivost k herbicidu při žádné koncentraci, což je v souladu s popisovanou rezistencí nativního bakteriálního enzymu k podobným herbicidům. Protox-1/SASX38 byl jasně citlivý, neboť, bakteriální trávník byl téměř úplně eliminován již při lOnM koncentraci. Protox-2/SASX38 byl také citlivý, ale jen při vyšších koncntracích (10 μΜ) herbicidu. Herbicid byl účinný i když byly misky udržovány téměř úplně ve tmě. Toxicita herbicidu byla úplně eliminována přidáním 20 pg/ml hematinu na misky.
Rozdíl v toleranci k herbicidu mezi dvěma rostlinnými kmeny protox je pravděpodobně důsledkem různé exprese ze dvou použitých plazmidů než vrozený rozdíl citlivosti enzymu. Protox-1/SASX38 rostly mnohem pomaleji než Protox2/SASX38 v jakémkoliv médiu neobsahujícícm hem. navíc kmen MzProtox-2/SASX38 s růstovou rychlostí srovnatelnou s ArabProtox-1/SASX38 je také velmi citlivý k herbicidu při nižších (10 až lOOnM) koncentracích.
• 9
99 • 9 9 9 ·
9 9 ·9 · 99 · 9 ·
9 9 ·
99 • ♦♦
Část Β: Identifikace a charakterizace rostlinných genů protox rezistentních k herbicidům inhibujícím protox
Příklad 9
Selekce rostlinných genů protox rezistentních k herbicidům inhibujícícm protox v expresním systému E. coli
Knihovna cDNA z Arabidopsis thaliana (Landsberg)v plazmidovém vektoru pFK61 (minet etal., Plant J. 2: 417-422,
1992) byla získána a amplif ikována. Mutanata E. coli hemG SASX38 (Sasarman et al. , J. Gen. Microbiol. 113: 297, 1979) byla získána a udržována v L médiu obsahujícím 20 .Pg/ml hematinu (United States Biochemicals). Plazmidová knihovna byla tranformována do bakterií SASX38 elektroporací pomocí zařízení „Βίο-Rad Gene Pulser za podmínek doporučených výrobcem. Buňky po elektroporací byly vysety na L agar obsahující 100 Pg/ml ampcilinu v hustotě přibližně 500 000 transformant/lOCM miska. Buňky pak byly inkubovány 40 hodin při 3 7 °C v nízkém světle a selektovány na schopnost růstu bez .přídavku exogenníhi hernu. Buňky prototrofní na hem byly získány s frekvencí 400/107 z knihovny pFL61. Analýza sekvencí 22 komplemetuj ících klonů ukázala, že 9 z nich bylo typu označeného „Protox-1, tj . protox gen který by měl exprimovat chloroplastový enzym protox.
Knihovna pFL61 je kvasinková expresní knihovna, kde jsou cDNA z Arabidopsis vloženy obousměrně. Tyto cDNA mohou být exprimovány také v bakteriích. Protox cDNA zjevně začíná ATG ve čtecím rámci na 3''-konci kvasinkové sekvence PGK přibližně 10 aminokyselin 5'-směrem ke klonovacímu místu Notl ve vektoru a je exprimována buď z promotoru lacZ vzdáleného 300 bp „upstream (proti směru transkripce) nebo z nedefinovaného kryptického bakteriálního promotoru. Protože Protox-1 cDNA obsahující značný úsek chloroplastové tran·· ·· • · · * • · · · ·· · · · ·· · · · · · · ··· ···· ··· ** ·· ·· žitní sekvence inhibuje růst kmene E. coli SASX38, pro selekční pokusy s mutagenezí a selekcí s herbicidy byl vybrán klon s nejmenším úsekem připojené chloroplastové tranzitní sekvence. Tento klon, pSLV19, obsahuje pouze 17 aminokyselin z předpokládaného chloroplastového tranzitního peptidu, jehož sekvence začíná v poloze odpovídající 151. bp sekvence cDNA Protox-1 z Arabidopsis (sekvence id. č. 1).
Plazmid pSLV19 byl transformován do náhodně mutagenního kmene XLl-Red (Statagene, La Jolla, CA) . Transformanty byly vysety na L médium obsahující 50 pg/ml ampicilinu a inkubovány 48 hodin při 37°C. Trávníky transformovaných buněk byly seškrábnuty z misek a plazmidová DNA byla připravena pomocí soupravy „Wizard Megaprep (Promega, Madison, WI). Plazmidová DNA izolovaná z tohoto mutátorového kmene by měla obsahovat přibližně 1 náhodnou změnu baze na 2000 nukleotidů (viz Greener et al., Strategies 7(2): 32-34, 1994).
Mutovaná plazmidová DNA byla transformována do mutanty hemG SASX38 (Sasarman et al. , J. gen Microbiol 113: 297,
1979) a vyseta na L médium obsahující různé koncentrace herbicidu inhibujicícho protox. Misky byly inkubovány 2 dny při 37 °C. Plazmidová DNA byla izolována ze všech kolonií, které rostly v přítomnosti herbicidu v koncentracích, které účinně zabíjejí kmen divokého typu. Izolovaná DNA pak byla transformována do SASX38 a vyseta opět na půdu s herbicidem, aby se zajistilo, že pozorovaná rezistence je opravdu nesena plazmidem. Sekvence kódující protox, která prošla tímto výběrem, byla vystřižena pomocí Notl a znovu klonována do nemutujícího vektoru a testována znovu, aby se ověřilo, že má schopnost udílet toleranci k herbicidu. Sekvence cDNA protox, které nesly rezistenci k herbicidu, byla určena a mutace byly identifikovány srovnáním se sekvencí divokého typu Protox-1 z Arabidopsis (sekvence id. č. 1).
• ··
9
9
A
9999
A 9 9 9 • 9 9 9 9 • 9 · 99
9999 9
9 9 9
Jediná mutanta kódující sekvence byla získána z první pokusné mutageneze. Tato mutace vedla ke zvýšené „rezistenci k herbicidu pouze tím, že zvýšila růstovou rychlost. Obsahuje mutaci A za C v poloze odpovídající 197. nukleotidu v sekvenci id. č. 1 ve zkrácené chloroplastové tranzitní sekvenci v pSLV19, která mění kodon ACG pro threonin na AAG pro lysin v poloze 56. aminokyseliny v sekvenci id. č. 2. a vede k lepší komplementaci bakteriálního mutanta. Plazmid obsahuje také umlčenou mutaci v kódující sekvenci v 1059. nukleotidu, kde se AGT (Ser) mění na AGC (Ser) . Plazmid byl označen pMut-1.
Plazmid pMut-1 byl poté transformován do mutátorového kmene XLl-Red jak bylo popsáno v předchozím textu a mutovaná DNA byla izolována a přenesena na koncentraci herbicidu, která je letální pro nemutovaný protox gen v pMut-1. Kolonie tolerantní k herbicidu byly izolovány po dvou dnech v 3 7°C a byly analyzovány postupem, který byly popsán v předchozím textu. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala, že rezistentní geny spadají do dvou tříd. Jedna rezistentní mutace byla identifikovány jako změna C na T v poloze odpovídající 689. nukleotidu v sekvenci Protox-1 z Arabidopsis uvedené zde jako sekvence id. č. 1. Tato výměna způsobuje změnu kodonu GCT pro alanin v poloze odpovídající 220. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 na kodon GTT pro valin, a byla označena pAraC-lVal.
Druhá třída mutantů rezistentní k herbicidu obsahuje změnu A na G v 1307. nukleotidové poloze sekvence Protox-1 z Arabidopsis. Tato záměna způsobuje změnu kodonu TAC pro tyrosin v poloze odpovídající 426 aminokyselině na kodon TGC pro cystein, a byla označena pAraC-2Cys.
0 0 · 0 0 0 · ♦ 0 0 · • 0 0 0 9 0 0 00
0· · 0 00 00 00 0 00 000 000
000 000» 009 09 »0 0«
Třetí rezistentní mutant má záměnu A za G v 691. nukleotidové poloze sekvence Protox-1 z Arabidopsis. Tato záměna způsobuje změnu kodonu GGT pro glycin v poloze odpovídající 221. aminokyselině na kodon AGT pro serin v poloze sousedící s mutací v pAraC-1. Tento plazmid byl označen pAraC-3Ser.
Rezistentní mutant pAraC-2Cys v plazmidu pMut-1 byl uložen 14. listopadu 1994 pod označením pWDC-7 ve sbírce Agricultural Research Culture Collection a dostal depozitní č. NRRL 21339N.
Příklad 10
Další substituce v kodonech rezistentních k herbicidu v polohách identifikovaných v náhodném screeningu
Aminokyseliny identifikované jako místa rezistence k herbicidu při náhodném screeningu se nahradí jinými aminokyselinami a pak se testuje funkčnost a tolerance k herbicidu v bakteriálním systému.
Oligonukleotidy cílená mutageneze sekvence Protox-1 z Arabidopsis byla provedena pomocí soupravy „Transformer Site-directed Mutagenesis (Clontech, Palo Alto, CA) . Poté, co se potvrdily změny aminokyselin sekvenační analýzou, jsou mutované plazmidy vneseny transformací do SASX38 a vysety na L-amp100 médium, aby se testovala funkce na různých koncentracích herbicidu inhibujícího protox pro ověření tolerance.
Tento postup byl použit pro alaninový kodon zahrnující polohy 688 a 690 a pro tyrosinový kodon zahrnující nukleotidy 1306-1308 v sekvenci Protox-1 z Arabidopsis (sekvence id. č. 1.). Výsledek ukazuje, že alaninový kodon zahrnující nukleotidy 688 až 690 může být změněn na kodon pro valin, threonin, leucin, cystein nebo isoleucin, aby vznikl enzym protox rezistentní k herbicidu, který si zachovává svou funkci. Výsledky dále ukazují, že tyrosinový kodon zahrnují9· 99 99
9 9 9 9 9
9 9 9 9 ·
99 ··9 · » « 9 9 9 9
9 *9 99 cí nukleotidy 1306 až 1308 může být změněn na kodon pro cystein, isoleucin, leucin, threonin, methionin, valin nebo alanin, aby vznikl enzym protox rezistentní k herbicidu, který si zachovává svou funkci.
Příklad 11
Izolace dalších mutací, které zvyšují enzymovou funkci a/nebo toleranci k herbicidu u dříve identifikovaných rezistentních mutantů
Plazmidy obsahující geny protox rezistentní k herbicidu se transformují do mutátorového kmene XLl-Red a mutovaná DNA je izolována jak bylo popsáno dříve. Mutované plazmidy jsou transformovány do SASX38 a transformanty jsou podrobeny screeningu na koncentraci herbicidu dostatečné k inhibici růstu původních „rezistentních mutantů. Tolerantní kolonie jsou izolovány a u fenotypů s vyšší tolerancí se ověřuje závislost na kódující sekvenci jak bylo popsáno v předchozím textu. Stanoví se sekvence těchto mutantů a mutace se identifikují srovnáním s původní sekvencí předchůdce.
Tento postup byl užit pro mutanta pAraC-lVal, jak je popsáno v předchozím textu. Výsledky ukazují, že serinový kodon odpovídající poloze 305. aminokyseliny (sekvence id. č. 2) může být změněn na kodon pro leucin, což vede k enzymu s vyšší tolerancí k herbicidům inhibujícím protox než jakou má mutant pAraC-lVAl. Mutace ve druhém místě byla nazvána AraC305Leu. Stejné výsledky jsou ukázány pro threoninový kodon v poloze odpovídajíc 249. aminokyselině, kde změna na isoleucin nebo alanin vede k enzymu s vyšší tolerancí. Tyto změny byly označeny AraC249Ile a AraC249Ala.
Tento postup byl užit pro mutanta pAraC-2Cys, jak je popsáno v předchozím textu. Výsledky ukazují, že prolinový kodon odpovídající poloze 118. aminokyseliny (sekvence id.
to« • ·· to· ·· ·· · · · · · · • · · · · ·· • to ·· ··· · « • · · · · · ··· ·· toto ··
č. 2) může být změněn na kodon pro leucin, což vede k enzymu s vyšší tolerancí k herbicidům inhibujícím protox než jakou má mutant pAraC-ICys. Tato mutace byla nazvána AraC118Leu.
Stejné výsledky jsou ukázány pro serinový kodon v poloze odpovídajíc 305. aminokyselině, kde změna na isoleucin nebo alanin vede k enzymu pAraC-2Cys s vyšší tolerancí. Tato změna byla izolována také na mutantovi pAraC-lVal popsaném v předchozím textu a mutant byl nazván AraC305Leu. Další mutace zvyšující rezistenci k herbicidu mutanta pAraC-2Cys zahrnují změnu asparaginu na serin v poloze odpovídající 425. aminokyselině, nazvanou AraC425Ser, a změnu tyrosinu na cystein v poloze odpovídající 498. aminokyselině, nazvanou AraC4 98Cys.
Tyto změny jsou nazvány mutacemi „druhého místa, protože samy nejsou dostatečné k udělení tolerance k herbicidu, ale spíše zvyšují funkci a/nebo toleranci k herbicidu již mutovaného enzymu. To předem nevylučuje možnost, že jiné substituce aminokyselin v těchto místech budou stačit ke vzniku enzymu tolerantního k herbicidu, neboť, nebyl proveden vyčerpávající screening všech možných náhrad.
Příklad 12
Kombinace identifikovaných mutací rezistence s identifikovanými mutacemi druhého místa vedoucí k vytvoření vysoce funkčního/vysoce tolerantního enzymu protox
Bylo zjištěno, že mutace AraC305Leu popsaná v předchozím příkladu zvyšuje funkci/rezistenci k herbicidu obou mutovaných plazmidů AraC-lVal a AraC-2Cys. Ve snaze otestovat obecnou užitečnost této mutace druhého místa, byla kombinována s mutacemi AraC-2Leu, AraC-2Val a AraC-2Ile a pak bylo provedeno testování tolerance k herbicidu. V každém případě změna AraC305Leu zvýšila významně růstovou rychlost • ··
9 · • · • 9 9 • · ··· 9999 • ·· 99 ·· ·· · · 9 9 9 9 • 9 · 9 9 99 • · · · ··· · 9
9 9 9 9 9
999 99 99 99 rezistentního mutanta protox na herbicidu inhibujícím protox. Kombinace rezistentního mutanta AraC-2Ile s mutací druhého místa buď AraC249Ile nebo AraC118Leu také vedla ke vzniku mutovaného enzymu protox s vyšší tolerancí. Mutace AraC249Ile ukazuje, že mutace druhého místa, která zvyšuje toleranci mutanta AraC-1 může také zvýšit rezistenci mutanta AraC-2. Plazmid se třemi mutacemi obsahující AraC-2Ile, AraC3051eu a ARaC249Ile také produkoval vysoce funkční enzym protox-1 s vysokou tolerancí k herbicidu.
Přiklad 13
Identifikace míst v genu Protox-1 z kukuřice, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Plazmid pMut-1 obsahující protox-1 z Arabidopsis popsaný v předchozím textu je velmi účinný v experimentech mutageneze/screening, kde poskytuje pravé mutanty s mutací v kódující sekvenci na rozdíl od mutant s mutací před promotorem, které vznikají často při použití jiných plazmidů. Ve snaze vytvořit účinný systém pro screening plazmidů s Protox-1 z kukuřice byla cDNA z kukuřice vložena do vektoru pMut-1 přibližně ve stejném sekvenčním kontextu jako cDNA z Arabidopsis. Pomocí standardní techniky PCR s překrývající fúzí byl fúzován 5'-konec klonu pMut-1 Arabidopsis (včetně 17 aminokyselin chloroplastového tranzitního peptidů s jednou mutací měnící smysl popsanou v předchozím textu) s cDNA sekvencí Protox-1 z kukuřice, která začíná aminokyselinou v poloze 14 (sekvence id. č. 6) sekvence z kukuřice. 3'-konec sekvence cDNA z kukuřice zůstal nezměněn. Na oba konce fúzního genu byla vnesena restrikční místa Notl a chimérický gen byl klonován do plazmidové páteře pFL61 vektoru pMut-1. Analýza sekvence ukázala jednonukleotidovou umlčenou mutaci způsobenou PCR, která mění kodon ACG zahrnující nukleotidy • ·
745 až 747 (sekvence id. č. 5) na kodon ACT, přičemž oba tyto kodony kódují threonin. Plazmid obsahující chimérický gen Protox-1 Arab-kukuřice byl označen pMut3.
Plazmid pMut-3 byl poté transformován do mutátorového kmene XLl-Red jak bylo popsáno v předchozím textu a mutovaná DNA byla izolována a přenesena na koncentraci herbicidu, která je letální pro nemutovaný protox gen v pMut-3. Kolonie tolerantní k herbicidu byly izolovány po dvou dnech v 37°C a byly analyzovány postupem, který byly popsán v předchozím textu. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala pět záměn jednotlivých bázi, které individuálně vedly k enzymu Protoxl z kukuřice tolerantnímu k herbicidu. Tři z těchto mutaci odpovídají změnám aminokyselin, u kterých se dříve ukázalo, že vedou k toleranci v homologní poloze v genu Protox-1 z Arabidopsis. Dvě z nich jsou pMzClVal a pMzC-IThr, které mění alanin (GCT) odpovídající 164. aminokyselině (sekvence id. č. 6) buď na valin (GAT) nebo threonin (ACT). tato poloha odpovídá mutacím v pAraC-1 popsaným již v předchozím textu. Třetí analogická záměna mění glycin (GGT) odpovídající 165. aminokyselině na serin (AGT) odpovídámutaci AraC-3Ser popsané již v předchozím textu, tyto výsledky slouží k ověření toho, co jsme očekávali, a sice že mutace tolerantní k herbicidu identifikované v jednom rostlinném genu protox mohou poskytovat toleranci k herbicidu v odpovídajícím rostlinné genu protox z jiného druhu.
Dvě z mutací izolovaných z Protox-1 z kukuřice vedly ke změnám aminokyselinových zbytků, které nebyly dříve identifikovány jako místa rezistence k herbicidu. Jedna změna vedla změně cysteinu (TGC) na fenylalanin (TTC) v poloze 159. aminokyseliny Protox-1 kukuřice (sekvence i.č. 6).
e ·
Druhá změna mění isoleucin (ATA) na threonin (ACA) v poloze 419. aminokyseliny.
Další substituce aminokyselin byly vytvořeny a testovány ve třech z mutantních míst kukuřice. Byla prokázána tolerance, když glycin 165 byl změněn na leucin nebo když cystein 159 byl změněn bud' na leucin nebo lysin. Tolerantní enzymy byly také vytvořeny změnou isoleucinu 419 na histidin, glycin nebo asparagin.
Jednotlivé záměny aminokyselin, které u Arabidopsis vedly ke vzniku enzymu Protox-1 s vysokou tolerancí, byly vneseny do genu Protox-1 z kukuřice místně cílenou mutagenezí, jak bylo popsáno v předchozím textu. Test v bakteriálním systému ukázal, že změna alaninu (GCT( v poloze odpovídající 164. aminokyselině (sekvence id. č. 6) na leucin (CTT) vedla ke vzniku vysoce tolerantního enzymu z kukuřice. Žádný mutant analogický místu AraC-2 v Arabidopsis nebyl izolován v náhodném screeningu kukuřice. Avšak změna tohoto místa, kdy se tyrosin v poloze 370 enzymu z kukuřice (sekvence id. č. 6) mění buď na isoleucin nebo methionin, vedla k enzymu tolerantnímu k herbicidu.
Příklad 14
Identifikace míst v genu Protox-1 z pšenice, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Aby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 z pšenice byla cDNA z pšenice vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici, chimérický plazmid Arab-pšenice protox byl označen pMut-4. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala 7 záměn jednotlivých baží, které individuálně vedly k enzymu Protoxl z kukuřice tolerantnímu k herbicidu. Čtyři z těchto mutací • · odpovídají změnám aminokyselin u kterých se dříve ukázalo, že vedou k toleranci v homologní poloze v genu Protox-1 z Arabidopsis nebo kukuřice. Dvě z nich mění alanin (GCT) v poloze 211. aminokyseliny (sekvence id. č. 10) buď na valin (GAT) nebo threonin (ACT). Tato poloha odpovídá mutacím v pAraC-1 popsaným již v předchozím textu. Třetí analogická záměna mění glycin (GGT) odpovídající 212. aminokyselině na serin (AGT) odpovídá mutaci AraC-3Ser popsané již v předchozím textu. Čtvrtá mění isoleucin (ATA) ne threonin (ACA) v poloze 466. aminokyseliny, což odpovídá mutantovi Mz419Thr z kukuřice. Tři z mutací izolovaných z Protox-1 z pšenice vedly ke změnám aminokyselinových zbytků, které nebyly dříve identifikovány jako místa rezistence k herbicidu. Jedna změna vedla ke změně valinu (GTT) na leucin (CTT) v poloze odpovídající 356. aminokyselině sekvence Protox-1 pšenice (sekvence id. č. 10). Druhá mění serin (TCT) na prolin (CCT) v poloze 421. aminokyseliny. Třetí mění valin (GTT) na alanin (GCT) v poloze 502. aminokyseliny.
Příklad 15
Identifikace míst v genu Protox-1 ze sóji, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Aby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 ze sóji byla cDNA z pšenice vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici. Chimérický plazmid Arab-sója protox byl označen pMut-5. DNA pMut-5 byla mutovány a podrobena screeningu na toleranci k herbicidu stejně jak bylo již v předchozím textu popsáno. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala 4 záměny jednotlivých baží, které individuálně vedly k enzymu Protox-1 ze sóji tolerantnímu k herbicidu. Dvě z těchto mutací odpovídají
• ♦ • · ··· změnám aminokyselin u kterých se dříve ukázalo, že vedou k toleranci v homologní poloze v genu Protox-1 z Arabidopsis a/nebo pšenice. Jedna z nich mění alanin (GCA) v poloze 226. aminokyseliny (sekvence id. S. 12) na threonin (ACA) . Tato poloha odpovídá mutaci pAraC-1 popsanou již v předchozím textu. Druhá analogická záměna mění valin (GTT) odpovídající 517. aminokyselině na alanin (GCT) což odpovídá mutantovi Wht502val z pšenice. Dvě z mutací izolovaných z Protox-1 ze sóji vedly ke změnám aminokyselinových zbytků, které nebyly dříve identifikovány jako místa rezistence k herbicidu. Jedna změna vedla ke změně prolinu (CCT) na serin (TCT) v poloze odpovídající 369. aminokyselině sekvence Protox-1 sóji (sekvence id. č. 12) . Druhá mění tentýž prolin (CCT) v poloze 369. aminokyseliny na histidin (CAT).
Jednotlivé záměny aminokyselin, které u Arabidopsis vedly ke vzniku enzymu Protox-1 s vysokou tolerancí, byly vneseny do genu Protox-1 ze sóji místně cílenou mutagenezí, jak bylo popsáno v předchozím textu. Test v bakteriálním systému ukázal, že změna alaninu (GCA) v poloze odpovídající 226. aminokyselině (sekvence id. č. 12) na leucin (CTT) vedla ke vzniku vysoce tolerantního enzymu ze sóji. Změna tyrosinu (TAC) v poloze 432. aminokyseliny (sekvence id. č. 12) buď na leucin nebo na isoleucin také vedla k enzymu tolerantnímu k herbicidu.
Příklad 16
Identifikace míst v genu Protox-1 z cukrové řepy, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Tiby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 z cukrové řepy byla cDNA z cukrové řepy vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici. Chimérický plazmid Arab-řepa protox byl označen pMut-6. DNA » · ·
I · « ··· · pMut-6 byla mutovány a podrobena screeningu na toleranci k herbicidu stejně jak bylo již v předchozím textu popsáno. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala jedinou změnu baze, která vedla k enzymu Protox-1 z cukrové řepy tolerantnímu k herbicidu. Tato záměna mění tyrosin (TAC) odpovídající 449. aminokyselině na cystein (TGC), což odpovídá mutantovi AraC-2 Arabidopsis.
Jednotlivé záměny aminokyselin, které u Arabidopsis vedly ke vzniku enzymu Protox-1 s vysokou tolerancí, byly vneseny do genu Protox-1 ze sóji místně cílenou mutagenezí, jak bylo popsáno v předchozím textu. Test v bakteriálním systému ukázal že změna tyrosinu (TAC) v poloze odpovídající 449. aminokyselině na leucin, isoleucin, valin nebo methionin vedla k enzymu z cukrové řepy tolerantnímu k herbicidu.
Příklad 17
Identifikace míst v genu Protox-1 z bavlniku, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Aby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 z bavlniku byla cDNA z bavlniku vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici. Chimérický plazmid Arab-bavlník protox byl označen pMut-7. DNA pMut-7 byla mutována a podrobena screeningu na toleranci k herbicidu stejně jak bylo již v předchozím textu popsáno. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala 3 záměny jednotlivých aminokyselin, které individuálně vedly k enzymu Protox-1 z bavlniku tolerantnímu k herbicidu. Ve dvou mutantech byla záměna tyrosinu (TAC) v poloze 428. aminokyseliny (sekvence id. č. 16) za cystein (TGC) za arginin (CGC) . Arginin je nová substituce udělující toleranci v tomto již • · · · dříve identifikovaném místě AraC-2. Třetí záměna mění prolin (CCC) za serin (TCC) v poloze 365. aminokyseliny. Tato záměna odpovídá mutantovi sóji Soy369Ser.
Příklad 18
Demonstrace křížové tolerance rezistentních mutací k různým sloučeninám inhibujícím protox
Plazmid rezistentních mutantů jejichž původní identifikace byla založena na rezistenci k jedinému herbicidu inhibují čímu protox, byly testovány na rezistenci ke spektru dalších sloučenin inhibujících protox. Pro tento test byl kmen SASX38 obsahujících plazmid divokého typu vyset na různé koncentrace každé z testovaných látek, aby se pro každou z nich stanovila letální koncentrace. Rezistentní mutované plazmid SASX38 pak byly vysety a vyhodnocován podle schopnosti přežít na koncentraci každé ze sloučenin alespoň lOx vyšší než je koncentrace letální pro kmen SASX38 obsahující plazmid divokého typu.
Výsledky z bakteriálních křížových testů tolerance ilustrují následující tabulky (tab. 3A a 3B) , které ukazují, že každá z identifikovaných mutací uděluje toleranci k několika různým sloučeninám inhibujícím protox.
• · · • ·· • 0 · · · • · *
0·
Tab. 3A
Křížová tolerance mutantů rostlinné protox k různým inhibitorům protox
Vzorec AraC-lVal AraC-2Cys AraC-IThr AraC-3Thr MzC-lVal
XVII + + + + +
Vila + + + - +
IV + + - ++ ++ -
XV + + + + +
XI - + + + + +
XVI - - - - +
XII + - ++ + + ++
XIV + - + + +
X*
+ = tolerance nejméně lOx vyšší než divoký typ ++ = tolerance nejméně lOOx vyšší než divoký typ
- = žádná křížová tolerance * = tato sloučenina byla testována, ale neposkytla žádné informace • to ·· to ·
Tab. 3B
Křížová tolerance mutantů rostlinné protox k různým inhibitorům protox
AraC- ILeu AraC- 2Leu AraC- ILeu + AraC- 2Met AraC- lLeu + AraC- 2 Leu AraC- 2Ile + AraC 305Leu AraC- 2Cys + AraC 425Ser AraC- 2Leu + AraC 425Ser AraC- 2Met + AraC 425Ser
XVII + + + + + + + +
Vila ++ + + ++ + + + + ++ ++ ++
IV + + - + + + + - + +
XV + + + + + +++ + + + + + + ++ +++ ++
XI + + + + ++ + + + + ++ ++ ++
XVI + + + +++ +++ + + + + + + + ++ ++
XII
XIV ++ + + ++ + + + + - ++ ++
• · • ··
Část C: Exprese genů protox rezistentních k herbicidu v transgenních rostlinách
Příklad 19
Příprava rostlin tolerantních k herbicidům inhibujícím protox homologní rekombinací nebo genovou konverzí
Vzhledem k tomu, že popsané mutanty s mutacemi cv kódující sekvenci účinně poskytuji toleranci k herbicidu jsou-li exprimovány pod kontrolou nativního promotoru protox, alternativním prostředkem, jak vytvořit rostliny a rostlinné buňky tolerantní k herbicidu, jsou cílené změny sekvence kódující protox v její přirozené poloze v chromozómu. Fragment protox DNA obsahující požadované mutace, ale postrádající vlastní expresní signály (tj . buď promotor nebo netranslatovaný úsek 3'konce) může být zaveden kteroukoliv z metod známou v oboru (např. transformací prostřednictvím Agrobacterium, přímým transferem genů do protoplastů, bombardováním mikročásticemi) a pak se mohou selektovat transformanty tolerantní k herbicidu. Vložený fragment DNA obsahuje také diagnostické místo pro restrikční enzym nebo jiný sekvenční polymorfismus, který je vložen místně cílenou mutagenezí in vitro, aniž by se změnila kódovaná sekvence aminokyselin (tj . umlčená mutace) . Pro různé selektovatelné markéry a geny tolerance k herbicidu bylo již dříve publikováno (viz např. Paszkowski et al. , EMBO J: 7: 4021-4026,
1988, Lee et al. , Plant Cell 2: 415-425, 1990, Risseeuw et al. , Plant J. 7: 109-119, 1995), že některé transformanty vznikají homologní integrací mutantní DNA do chromozómového lokusu protox, nebo vznikají konverzí nativní chromozomové sekvence protox na vloženou mutovanou sekvenci. Takové transformanty se rozpoznají kombinací jejich fenotypu tole• 9 ♦· ·♦ • 99·· • · · 9 9 9 • » · 999 9 9 • 9 9·9 •9 99 9· rantniho k herbicidu s přítomností diagnostického místa pro restrikční enzym v jejich chromozómovém lokusu protox.
Příklad 20
Konstrukce vektorů pro transformaci rostlin
Jsou dostupné mnohé vektory, které jsou vhodné pro transformaci rostlin, přičemž geny podle předkládaného vynálezu se mohou použít ve spojení s jakýmkoliv z těchto vektorů. Výběr vektoru je závislý na zvolené technice transformace a na cílovém rostlinném druhu, který má být transformován. Pro některé cílové druhy mohou být výhodná různá antibiotika nebo herbicidy jako selekční markéry. Selekční markéry rutinně využívané v transformaci obsahují gen nptll, který je nositelem rezistence ke kanamycinu a příbuzným antibiotikům (Messing a Vierra, Gene 19: 259-268, 1982, Bevan et al., Nátuře 304: 184-187, 1983), gen bar, udílející rezistenci k herbicidu fosfinotricinu (White et al. , Nucl. Acids Res. 18: 1062, 1990, Spencer et al. , Theor. Appl. Genet. 79: 625-631, 1990), gen hph udílející rezistenci k antibiotiku hygromycin (Blochinger a Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931) a gen dhfr, poskytující rezistenci k metotrexátu (Bououis et al. , EMBO J. 2(7): 1099-1104.
1983) .
I. Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens
Existuje mnoho dostupných vektorů pro transformaci pomocí Agrobacterium tumefaciens. Tyto vektory typicky nesou alespoň jednu hraniční sekvenci z T-DNA a příkladem takových vektorů jsou např. pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 1984) a ρΧΥΖ. V následujícím odstavci je popsána konstrukce dvou typických vektorů.
♦ ··
Konstrukce vektorů pCIB200 a pCIB2001: Binární vektory pCIB200 a pCIB2001 byly užity pro konstrukci rekombinantních vektorů vhodných pro transformaci pomocí Agrobacterium a byly připraveny jak je dále popsáno. pTJS75kan byl vytvořen naštěpením pTJS75 Narl (Schmidhauser a Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455, 1985), čímž se vyštěpil gen tetracyklinové rezistence, a pak se vložil AccI fragment z pUC4K nesoucí NPTII (Messing a Vierra, Gene 19: 259-268,
1982, Bevan et al., Nátuře 304: 184-187, 1983, McBride et al. , Plant Molecular Biology 14: 266-276, 1990). Linkery (spojky) Xhol byly ligovány k EcoRV fragmentu z pCIB7, který obsahuje levou i pravou hranici z T-DNA, rostlinný selektovatelný chimérický gen nos/nptll a polylinker pUC (Rothstein et al. , Gene 53: 153-161, 1987), a fragment naštěpený Xhol byl klonován do pTJS75kan naštěpeného Sáli, čímž vznikl pCIB200 (viz také EP 0 332 104, příklad 19(1338)) . pCIB200 obsahuje následující jedinečná restrikční místa v polylinkeru (vícečetném klonovacím místě): EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal a Sáli. pCIB2001 je derivát pCIB200, který byl vytvořen vložením dalších restrikčních míst do polylinkeru. Jedinečná restrikční místa v polylinkeru pCIB2001 jsou EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal a Sáli, Mlul, Bell, AvrlI, Apal, Hpal a Stul. pCIB2001, kromě těchto dodatečných restrikčních míst, obsahuje geny pro kanamycinovou selekci v bakteriích a rostlinách, levou a pravou hranici z T-DNA pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium, funkci trfA odvozenou z RK2 pro mobilizaci mezi E. coli a jinými hostiteli, a také funkce OriT a OriV z RK2. Polylinker pCIB2001 je vhodný pro klonování rostlinných expresních kazet obsahujících vlastní regulační signály.
Konstrukce plazmidů pCIBlO a jeho derivátů pro selekci hygromycinem: binární vektor pCIBlO obsahuje gen kódující • ···· ·* ·· »· • · · · · · « · · · ·· • · · «··· · • · · · » • · · · · ·
100 kanamycinovou rezistenci pro selekci v rostlinách, sekvence levé a pravé hranice z T-DNA a sekvence z plazmidu pRK252 s širokým spektrem hostitelů, což mu dovoluje replikovat se jak v E. coli tak v Agrobacterium tumefaciens. Jeho konstrukci popsal Rothstein et al.(Gene 53: 153-161, 1987). Byly konstruovány různé deriváty pCIBlO, které obsahují gen pro hygromycin-B-fosfotransferázu, jak popsali Gritz et al. (Gene 25: 179-188, 1983). Tyto deriváty umožňují selekci transgenních rostlinných buněk pouze na hygromycinu (pCIB743) nebo na hygromycinu a kanamycinu (pCIB715 a pCIB717) .
II. Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci bez Agrobacterium
Transformace bez použití Agrobacterium tumefaciens obchází požadavek na přítomnost sekvencí T-DNA ve vybraném transformačním vektoru a tudíž vektory postarádající tyto sekvence se dají použít kromě vektorů obsahuj cích T-DNA popsaných výše. Techniky transformace, které nespoléhají na Agrobacterium, zahrnují takové techniky transformace jako je bombardování mikročásticemi, příjem protoplasty (pomocí PEG nebo elektroporací) nebo mikroinjekce. Výběr vektorů závisí hlavně na způsobu selekce vybraného druhu, který má být transformován. V následujícím odstavcích se popisuje konstrukce několika typických vektorů.
Konstrukce pCIB3064: pCIB3064 je vektor odvozený od pUC a je vhodný pro techniky přímého přenosu genů v kombinaci se selekcí pomocí herbicidu basta (fosfinotricinu). Plazmid pCIB246 obsahuje CaMV 35S promotor operativně spojený s genem GUS z E. coli a CaMV 3 5S transkripčním terminátorem jak je popsáno v Mezinárodní patentové přihlášce WO 93/07278. 35S promotor tohoto vektoru obsahuje dvě ATG se« ···!
• ·0 ·« ·· • 0 · · 0 0 0 0
0 0 0 0 00
0 · 000· ·
0 0 0 0 0 000 00 ·* ··
101 kvence na 5'-konci od startovacího místa. Tyto sekvence byly mutovány pomocí standardní PCR techniky tak, že oba kodony ATG byly odstraněny a vznikla tak restrikční místa pro SspI a PvuII. Nová restrikční místa jsou vzdálena 96 bp a 37 bp od jedinečného místa Sáli a 101 bp a 42 bp od skutečného startovacího místa. Výsledný derivát plazmidu pCIB246 byl nazván pCIB3025. Gen GUS byl pak vystřižen z pCIB3025 štěpením Sáli a Sací, konce byly zatupeny a byl znovu spojen, čímž vznikl plazmid pCIB3060. Plazmid pJIT82 byl získán z John Innes Centre, Norwich, a byl z něho vyštěpen Smál fragment velikosti 400 bp obsahující gen bar ze Streptomyces viridochromogenes, a vložen do Hpal místa pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-2523, 1989). Tak vznikl pCIB3064, který obsahuje gen bar pod kontrolou CaMV 3 5S promotoru a terminátoru pro selekci herbicidem, gen pro ampicilinovou rezistenci (pro selekci v E. coli) a polylinker s jedinečnými místy Sphl, Pstl, HindlII a BamHI. Vektor je vhodný pro klonování rostlinných expresních kazet obsahujících vlastní regulační signály.
Konstrukce pSOG19 a pSOG35: pSOG35 je transformační vektor, který využívá gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) z E.coli poskytující rezistenci k metotrexátu jako selektovatelný markér. PCR byla užita pro amplifikaci 35S promotoru (asi 800 bp) , intronu 6 z genu Adhl kukuřice (asi 550 bp) a 18 bp úseku netranslatované vedoucí sekvence GUS z plazmidu pSOGlO. Fragment dlouhý 250 bp kódující dihydrofolátreduktázu typu II z E. coli byl amplifikován také pomocí PCR a tyto dva fragmenty byly spojeny prostřednictvím Scal-Pstl fragmentu z pBI221 (Clontech), který obsahuje kostru vektoru pUC a terminátor nopalinsyntázového genu. Spojením fragmentů vznikl plazmid pSOG19, který obsahuje 35S promotor spojený se sekvencí intronu 6, GUS vedoucí sekven4* 44 • · · · · ·· * 444 4 4 • 4 4 ·· ··
102 cí, genem DHFR a terminátorem nopalinsyntázy. Náhradou GUS vedoucí sekvence v pSOG19 vedoucí sekvencí z viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) vznikl vektor pSOG35. Vektory pSOG19 a pSOG35 nesou gen pro ampicilinovou rezistenci z pUC a mají místa HindlII, Sphl, Pstl a EcoRI dostupná pro klonování cizích sekvencí.
Příklad 21
Konstrukce rostlinných expresních kazet
Kódující sekvence zamýšlené pro expresi v transgenních rostlinách se vloží do expresní kazety za vhodný protox promotorem a před vhodný transkripční terminátor. Takové expresní kazety pak mohou být snadno přeneseny do některého z rostlinných transformačních vektorů popsaných v příkladu
20.
I. Výběr promotoru
Výběr promotoru použitého v expresních kazetách bude určující pro prostorový a časový vzorec exprese transgenu v transgenní rostlině, vybrané promotory exprimuji transgeny ve specifických typech buněk (jako např. v buňkách epidermis listu, mezofylových buňkách, v buňkách kůry kořene) nebo ve specifických pletivech či orgánech (např. kořenech, listech nebo květech) a výběr je tedy odrazem požadované lokalizace exprese transgenu. Alternativně může vybraný promotor řídit expresi genu, který je řízen světlem indukovaným promotorem nebo jiným dočasně regulovaným promotorem. Další možnost je, že vybraný promotor je chemicky regulovatelný. To by poskytlo možnost indukovat expresi transgenu jen když je to žádoucí, a sice působením chemického induktoru.
II. Transkripční terminátory ··· ♦ • · k dispozici pro použití zodpovídáj í za ukončení správnou polyadenylaci.
103
Mnoho různých terminátorů je v expresních kazetách. Terminátory transkripce za transgenem a jeho
Vhodné terminátory transkripce jsou takové, o kterých je známo, že fungují v rostlinách, a patří mezi ně např. CaMV 35S terminátor, tmi terminátor, terminátor nopalinsyntázy, terminátor E9 genu rbcS z hrachu a také terminátory přirozeně se vyskytující ve spojení s protox genem (tj . protox terminátory) . Ty se mohou použít jak v jednoděložných tak i ve dvouděložných rostlinách.
III. Sekvence vhodné pro zvýšení nebo regulaci exprese
Byly nalezeny mnohé sekvence zvyšující genovou expresi transkripční jednotky a tyto sekvence se mohou užít ve spojení s geny podle předkládaného vynálezu pro zvýšení jejich exprese v transgenních rostlinách.
Bylo ukázáno, že různé sekvence intronů zvyšují expresi, zvláště v buňkách jednoděložných rostlin. Např. introny genu Adhl z kukuřice významně zvyšují expresi divokého typu genu s příbuzným promotorem, pokud jsou vloženy do buněk kukuřice. Zejména intron 1 se ukázal zvláště účinný a zvyšoval expresi v konstruktech s genem chloramfennikolacetyltransferázy (Callis et al. , Genes Develop. 1: 1183-1200,
1987) . V témže pokusném systému intron z genu bronzel kukuřice měl podobný účinek na zvýšení exprese (Callis et al. , viz výše). Intronové sekvence se rutinně vkládají do vektorů pro transformaci rostlin, většinou s netranslatovanou vedoucí sekvencí.
Také mnohé netranslatované vedoucí sekvence odvozené z virů zvyšují expresi, a jsou zvláště účinné ve dvouděložných rostlinách. Vedoucí sekvence viru mozaiky tabáku (TMV, „W-sekvence), viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) • ···· ·« 0* • 0 · 0 0 0 00 0 0 ·· • 0 0 0000 0 0 0 0 0 0 00 00 0·
104 a viru mozaiky vojtěšky (AMV) jsou účinné ve zvýšení exprese
(např. Gallie et al. , Nucl Acids Res. 15 : 8696-8711, 1987,
Skuzeski et al ., Plant Mol. Biol. 15 : 65 -79, 1990).
IV. Směrování genového produktu v buňce
V rostlinách existují různé mechanismy směrování („targeting) genových produktů a některé sekvence kontrolující fungování těchto mechanismů byly do jisté míry popsány. Např. cílení genových produktů do chloroplastu je řízeno signální sekvencí nalezenou na N-konci proteinu, která je odštěpena během importu do chloroplastu, čímž vniká maturovaný protein (např. Comai et al. , J. Biol. Chem. 263: 1510415109, 1988). Takové signální sekvence se mohou spojit s heterologními genovými produkty a import heterologních produktů se tak nasměruje do chloroplastů (van den Broeck et al. , Nátuře 313: 358-363, 1985) . DNA kódující vhodné signální sekvence může být izolována z 5''-konců cDNA kódujících proteiny RUBISCO, CAB, EPSP syntázu, GS2 a mnoho dalších proteinů o kterých je známo, že jsou lokalizovány v chloroplastu.
Jiné genové produkty jsou lokalizovány v jiných orgánelách jako např. mitochondriích a peroxisomech (např. Unger et al., Plant Mol. Biol 13: 411-418, 1989). cDNA kódující tyto produkty může být také změněna tak, že se ovlivní cílení heterologních produktů do těchto organel. Příklady takových sekvencí jsou jádrem kódované ATPázy a pro mitochondrie specifické isoformy aspartátaminotransferázy. Cílení do buněčných proteinových tělísek bylo popsáno Rogersem et al.(Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516, 1985).
Kromě toho byly charakterizovány sekvence, které způsobuj i směrování genových produktů do j iných buněčných kompartmentů. Sekvence aminového konce jsou zodpovědné za cíle105 n£ do ER, apoplastu, a extracelulární sekreci z aleuronových buněk, jak popsali Koehler a Ho (Plant Cell 2: 769-783, 1990). Navíc, sekvence aminového konce, společně se sekvencemi karboxylového konce, jsou zodpovědné za směrování genových produktů do vakuoly (Shishi et al. , Plant Mol. Biol. 14: 357-368, 1990).
Spojením vhodné cílové sekvence popsané výše se sekvencí požadovaného transgenu je možné nasměrovat produkt transgenu do jakékoliv organely nebo buněčného kompartmentu. Pro směrování do chloroplastu se např. chloroplastová signální sekvence z genu RUBÍ SCO, CAB, EPSP syntázy nebo GS2, spojí do čtecího rámce s aminokoncovou ATG transgenu. Vybraná signální sekvence by měla obsahovat známá štěpná místa a konstruovaný fúzovaný gen musí zahrnovat všechny aminokyseliny, následující po štěpném místě, které je vyžadováno pro štěpeni. V některých případech tomuto požadavku lze vyhovět tím, že se přidá malý počet aminokyselin mezi štěpné místo a ATG transgenu nebo se nahradí některé aminokyseliny v sekvenci transgenu. Konstrukty pro import do chloroplastu se mohou testovat na účinnost příjmu chloroplasty pomoci in vitro translace in vitro transkribovaného konstruktu následované in vitro příjmem do chloroplastu metodou popsanou Bartelettem et al. (In: Edelman et al. (eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, s. 1081-1091, 1982) a Wasmann et al. (Mol. Gen. Genet. 205: 446-453, 1986). Tyto konstrukční techniky jsou v oboru dobře známy a dají se shodně použit pro mitochondrie i peroxisomy. Výběr toho, jak směrovat expresi transgenu závisí na buněčné lokalizaci prekurzoru, který je nutný jako výchozí bod příslušné metabolické dráhy. Směrování bude obvykle do cytosolu nebo chloroplastu, ačkoliv v určitých případech může být do mitochod«94
I l
I <
9
106 rie nebo peroxisomu. Produkt transgenní exprese normálně nevyžaduje žádné směrování do ER, apoplastu nebo vakuoly.
Výše popsané mechanismy směrování v buňce se mohou užít nejen ve spojení s promotory téhož původu, ale i ve spojení s heterologními promotory tak, aby se ovlivnilo specifické směrování genu, jehož transkripce je řízena promotorem, u kterého je vzorec exprese odlišný od promotoru, ze kterého byl odvozen směrovací signál.
Příklad 22
Transformace dvoudšložných rostlin
Techniky transformace dvouděložných rostlin jsou v oboru dobře známy a patří k nim techniky založené na Agrobacterium tumefaciens i techniky, které Agrobacterium nevyžadují. K technikám bez Agrobacterium patří příjem exogenniho genetického materiálu přímo protoplasty nebo buňkami. Toho lze dosáhnout pomocí PEG nebo elektroporací zprostředkovaného příjmu, bombardováním mikročásticemi nebo mikroinjekcemi. Příklady těchto technik popsali Paszkowski et al. (EMBO J. 3: 2717-2711, 1984), Potrykus et al. (Mol. Gen. Genet. 199: 169-177, 1985), Reich et al. (Biotechnology 4: 1001-1004, 1986) a Klein et al. (Nátuře 327: 70-73, 1987). V každém takovém případě byly celé rostliny regenerovány z transformovaných buněk užitím standardních technik známých v oboru.
Transformace zprostředkovaná pomocí Agrobacterium je výhodná technika transformace dvouděložných rostlin vzhledem k vysoké účinnosti transformace a možnosti využít ji pro široké spektrum různých druhů. Mezi mnohé druhy rutinně transformovatelné Agrobacterium patří tabák, rajče, slunečnice, bavlník, řepka, brambor, sója, vojtěška a topol ( EP 0 317 511 (bavlník), EP 0 249 432 (rajče, patent udělen Calge• ··
9 9 • · · • · 9 4
9·· • 99 99
99
9 9
99
999 9 4 • 9 9 • 9 99
107 ne), WO 87/07299 ( Brassica, patent udělen Calgene) , US 4 795 855 (topol)).
Transformace cílového rostlinného druhu rekombinantním Agrobacterium většinou zahrnuje ko-kultivaci Agrobacterium s explantáty z rostlin podle protokolů, které jsou v oboru dobře známy. Transformované pletivo, nesoucí markér rezistence k antibiotiku nebo herbicidu mezi hranicemi T-DNA binárního vektoru, se pak regeneruje na selekčním médiu.
Příklad 23
Transformace jednoděložných rostlin
Transformace většiny druhů jednoděložných rostlin se dnes stala také rutinní technikou. Výhodná technika zahrnuje přímý transfer genů do protoplastů užitím PEG nebo elektroporační techniky, nebo bombardování kalusového pletiva mikročásticemi. Transformace se může provést s jedním druhem DNA nebo více druhy DNA (tj . ko-transformace) a oba způsoby jsou vhodné pro použití v tomto vynálezu. Ko-transformace může být výhodná v tom, že není třeba konstruovat komplexní vektor, a že vznikají transgenní rostliny, kde lokusy transgenu a selektovatelného markerového genu nejsou ve vazbě, což umožňuje v další generaci odstranit selektovatelný markér, pokud je to žádoucí. Avšak nevýhodou ko-transformace je frekvence menší než 100% se kterou se jednotlivé druhy DNA integrují do genomu (Schocher et al., Biotechnology 4: 10931096).
Patentové přihlášky EP 0 292 435 (Ciba-Geigy),
EP 0 392 225 (Ciba-Geigy) , WO 93/07278 (Ciba-Geigy) popisují způsoby přípravy kalusu a protoplastů z elitní inbrední linie kukuřice, transformaci protoplastů pomocí PEG nebo elektroporací a regeneraci rostlin kukuřice z transformovaných protoplastů. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603-618) • · · * · · • · · · · · · ♦ · t · • ·· *··»····· • · ··· ··· ··· ···· ··· ·· ·· ··
108 a Fromm et al.(Biotechnology 8: 833-839, 1990) popsali techniky transformace linie kukuřice odvozené z A188 metodou bombardováni mikročásticemi. Také Mezinárodní patentová přihláška WO 93/07278 (Ciba-Geigy) a Koziel et al. (Biotechnology 11: 194-200, 1993) popisují transformaci elitní linie kukuřice bombardováním mikročásticemi. Při tomto způsobu transformace se užívají nezralá embrya kukuřice o délce 1,5 až 2,5 mm vyříznutá z kukuřičného klasu 14 až 15 dní po opylení a pro vlastní bombardování se užívá zařízení PDS-lOOOHe Biolistics.
Transformace rýže se může provést také technikou přímého přenosu genů s využitím protoplastů nebo bombardování mikročásticemi. Transformace prostřednictvím protoplastů byla popsána jak pro rýži typu Japonica tak i typu Indica (Zhang et al. , Plant Cell REp. 7: 379-384, 1988, Shimamoto et al., Nátuře 338: 274-277, 1989, Datta et al., Bitechnology 8: 736-740, 1990). Oba typy jsou také rutinně transformovatelné metodou bombardování mikročásticemi (Christou et al., Biotechnology 9: 957-962, 1991).
Patentová přihláška EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) popisuje způsob vytvoření, transformaci a regeneraci protoplastů z travin skupiny Pooideae. Tento způsob umožňuje transformovat pšenici a travinu Dactylis sp. Kromě toho byla popsána transformace pšenice metodou bombardování mikročásticemi buněk dlouhodobě regenerovatelného kalusu typu C (Vasil et al., Biotechnology 10: 667-674, 1992) a nebo metodou bombardování mikročásticemi nezralých embryí a kalusu odvozeného z nezralých embryí (Vasil et al., Biotechnology 11: 15531558, 1993, Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084,
1993) . Výhodný způsob transformace pšenice však zahrnuje transformaci pšenice bombardováním nezralých embryí mikročásticemi a také zahrnuje krok s použitím vysoké koncentrace
109 sacharózy nebo maltózy před vlastním přenosem genů. Před bombardování mikročásticemi se libovolný počet embryí (délky 0,75 až 1,00 mm) vyseje na misku s MS médiem obsahujícím 3% sacharózu (Murashige a Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473497, 1962) a 3 mg/1 2,4-D pro indukci somatických embryí, a ponechají se ve tmě. V den kdy má dojít k bombardování mikročásticemi se embrya odstraní z indukčního média a umístí se na osmotikum (tj. indukční médium se zvýšenou koncentrací sacharózy nebo maltózy, typicky až na 15 %). Ponechá se proběhnout plazmolýza embryí po dobu 2 až 3 hodin a pak se embrya podrobí bombardování mikročásticemi. Typické je 20 embryí na jedné cílové destičce, ale tato hodnota není kritická. Vhodný plazmid nesoucí požadovaný gen (např. pCIB3064 nebo pSG35) se nechá precipitovat na zlatých mikročásticích velikosti řádově mikrometru standardním postupem. Každá cílová destička s embryi je odtsřelována pomocí zařízení Biolistics firmy DuPont použitím tlaku přibližně 1000 psi a standardní siřky kalibru 80. Po bombardování se umístí embrya na 24 hodin do tmy (stále na osmotiku) , aby se vzpamatovala. Po 24 hodinách se embrya přemístí zpět na indukční médium, kde zůstanou asi měsíc než začne regenerace. Přibližně po měsíci se explantáty embryí s vyvíjejícím se embryonálním kalusem přemístí na regenerační médium (MS + 1 mg/1 NAA, 5 mg/1 GA) navíc obsahující selekční agens (10 mg/1 basta v případě plazmidu pCIB3064 a 2 mg/1 metotrexátu v případě pSOG35). Přibližně po dalším měsíci se vyvíjející výhonky prýtu přemístí do větších sterilních nádob známých jako „GA7 obsahujících MS poloviční koncentrace, 2% sacharózu a stejnou koncentraci selekčního agens. Mezinárodní patentová přihláška WO 94/138 22 popisuje způsob transformace pšenice a tímto se zde na ni odkazujeme.
• to • ·· «to······· • · <·· * · · ··· ···· ··· ·· ·· ··
110
Příklad 24
Izolace promotorové sekvence Protox-1 z Arabidopsis thaliana Genomová knihovna Lambda Zap II z Arabidopsis thaliana (Columbia, celá rostlina) byla zakoupena od firmy Stratagene. Přibližně 125 000 fágů bylo vyseto v hustotě 25 000 pfu („plaque forming units, jednotek tvořících plaky) na 15cm Petriho misku a duplikáty byly otisknuty na membránu Colony/Plaque Screen (NEN DuPont). Duplikáty plaků pak byly testovány pomocí sondy Protox-1 cDNA z Arabidopsis (sekvence
i. č. 1) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies) . Hybridizace a odmývání proběhly při 65 °C za podmínek popsaných v Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984. Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmídy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Jeden klon, a sice AraPTlpro, byl identifikován jako klon obsahující 580 bp dlouhý úsek sekvence z Arabidopsis, orientovaný proti směru transkripce od iniciačníhio methioninu (ATG) proteinu Protox-1 z Arabidopsis. Tento klon obsahuje také kódující sekvenci a introny zasahující až k 1241 bp sekvence Protox-1 cDNA. 5'-koncový nekódující fragment o délce 580 bp je domnělý Protox-1 promotor z Arabidopsis a jeho sekvence je zde uvedena jako sekvence id.č. 13.
Plazmid AraPTIPro byl uložen 15. prosince 1995 jako pWDC-11 (NRRL č. B-21515).
Příklad 25
Konstrukce rostlinných transformačních vektorů exprimujících změněný gen Protox-1 za nativním promotorem Protox-1 z Arabidopsis
111 cDNA plné délky příslušné změněné protox-1 cDNA byla izolována jako fragment po částečném štěpení EcoRI-Xhol a klonována do rostlinného expresního vektoru pCGN1761ENX (viz Příklad 9 Mezinárodní patentové přihlášky PCT/IB95/00452, podané 8. 6. 1995, publikované 21. 12. 1995 jako WO 95/34659). Plazmid byl štěpen Ncol a BamHI, čímž vznikl fragment obsahující úplnou protox-1 cDNA a terminátor transkripce ze 3'-koncové netranslatované sekvence genu tmi z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid AraPTIPro popsaný výše se štěpil Ncol a BamHI aby se získal fragment obsahující pBluescript a fragment o délce 580 bp obsahující domnělý Protox-1 promotor. Ligací (spojením) těchto dvou fragmentů vznikla fúzovaná molekula, kde změněná protox cDNA je připojena za nativní protox promotor. Expresní kazeta, obsahující „Protox-1 promotor/Protox-1 cDNA/tmi terminátor, je vytřižena pomocí KpnI a klonována do binárního vektoru pCIB200. Binární plazmid je transformován elektroporací do Agrobacterium a pak do Arabidopsis použitím vakuové inflitrační metody (Bechtold et al. , C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199, 1993). Transformanty exprimující změněné geny protox se selektují na kanamycinu nebo na různých koncentracích herbicidu inhibujícícho protox.
Příklad 26
Příprava rostlin tolerantních k herbicidu exprimujících fúzovaný gen „nativní Protox-1 promotor/změněná Protox-1
Užitím postupů uvedených v předchozím textu byla Protox- 1 cDNA z Arabidopsis obsahující změnu TAC na ATG (tyrosin na methionin) v nukleotidech 1306 až 1308 sekvence Protox-1 (sekvence id.ě. 1) spojena s nativním Protox-1 promotorovým fragmentem a transformována do Arabidopsis thaliana. Testy v bakteriálním expresní systému popsaném • 4 • · · · · ·
4 4 · · · · · • 4 · · · « · · · 4 · • 4 4 4 4 ··· ··· 4444 444 ·· ·· ··
112 v předchozím textu bylo ukázáno, že změněný Protox-1 enzym (AraC-2Met) je více než lOx více tolerantní k různým Protox1 inhibujícícm herbicidům než přirozeně se vyskytující enzym. Semena z vakuově infiltrovaných rostlin byla sebrána a vyseta v prostředí s protox inhibujícícm aryluracilovým herbicidem (v rozmezí ΙΟ,ΟηΜ až Ι,ΟμΜ) podle vzorce XVII. Opakované pokusy s divokým typem Arabidopsis ukázaly, že koncentrace 10 nM této sloučeniny je dostatečná k tomu, aby zabránila normálnímu klíčení semenáčků. Transgenní semena exprimující změněný enzym AraC-2Met spojený s nativním Protox-1 promotorem vyklíčila v normální semenáčky při koncentraci herbicidu až 500nM, což dokazuje alespoň 50x vyšší toleranci k herbicidu ve srovnání s Arabidopsis divokého typu. Tento fúzovaný gen „promotor/změněný protox enzym působí také jako účinný selektovatelný markér pro rostlinnou transformaci. Několik rostlin, které vyklíčily na koncentraci 100 nM protox inhibujícího herbicidu bylo přesazeno do půdy, pěstovnáno 2 až 3 týdny a zkoušeno postřikovým testem s různými koncentracemi protox inhibujícícho herbicidu.
Pokud se srovnaly s kontrolními rostlinami transformovanými prázdným vektorem, transgenní rostliny AraPTlPro/AraC-2Met měly toleranci k herbicidovému postřiku více než lOx vyšší.
Příklad 27
Demonstrace křížové tolerance rezistentních mutací k různým sloučeninám inhibujícím protox v testu klíčení Arabidopsis
Užitím postupů uvedených v předchozím textu byla Protox- 1 cDNA z Arabidopsis obsahující změnu TAC na ATG (tyrosin na methionin) v nukleotidech 1306 až 1308 sekvence Protox-1 (sekvence id.č. 1) spojena s nativním Protox-1 promotorovým fragmentem a transformována do Arabidopsis • · ·· · · 4 • · 4 • · β ·
113 thaliana. Testy v bakteriálním systému bylo ukázáno, že tento změněný enzym Protox-1 (AraC-2Ile+AraC305Leu)je více než lOx tolerantnější k acyluracilovému herbicidu podle vzorce XVII inhibujíčímu protox než přirozeně se vyskytující enzym (viz příklady 8 až 12) . Homozygotní linie Arabidopsis obsahující tento fúzovaný gen vznikly z transformant, které vykazovaly vysokou toleranci k herbicidu inhibujícímu protox v testu klíčení semenáčků popsaném výše. Semena z jedné linie byla testována na křížovou toleranci k různým sloučeninám inhibujícícm protox tím, že se opakoval test klíčení s různými koncentarcenmi sloučenin, u kterých bylo ukázáno, že inhibují klíčení Arabidopsis divokého typu. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 4.
114
Tab. 4
Křížová tolerance k různým inhibitorům protox v testu klíčení semenáčků
vzorec obecný název tolerance
II acifluorofen +
III fomasafen +
IV fluorodlykofen + /-
IVb bifenox +
IVc oxyfluorofen +
IVd laktofe +/-
Vila fluthiacetmetyl ++
X sulfentrazon +
XI flupropazil ++
XIV flumiklorak +
XVI flumioxazin +++
XVII ++
XXI a BAY 11340 +
XXII ++
+/- = < lOx vyšší tolerance než divoký typ + = > lOx vyšší tolerance než divoký typ ++ = > lOx vyšší tolerance než divoký typ +++ = > lOx vyšší tolerance než divoký typ
Příklad 28
Izolace promotorové sekvence Protox-1 z kukuřice
Genomová knihovna kukuřice (Zea mays, inbrední linie
Missouri 17, etiolované semenáčky) ve vektoru Lambda FIX II
0 <0 • 0 0 • 0 »00 0000
115 byla zakoupena od firmy Stratagene. Přibližně 250 000 fágú bylo vyseto v hustotě 50 000 pfu („plaque forming units, jednotek tvořících plaky) na 15cm Petriho misku a duplikáty byly otisknuty na membránu Colony/Plaque Screen (NEN DuPont) . Duplikáty plaků pak byly testovány pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence i. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace a odmývání proběhly oři 65 °C za podmínek popsaných v Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984. Ze tří pozitivně hybridizujících plaků byl izolován fág Lambda pomocí soupravy pro izolaci Wizard Lambda Preps DNA Purification System (Promega). Analýza užitím restrikčního štěpení, hybridizace a sekvenční analýzy DNA vedla k identifikaci klonu obsahujícícho asi 3,5 kB genomové DNA z kukuřice lokalizované na 5'-konci Protox-1 kódující sekvence již dříve izolované jako klon cDNA. Má se za to, že tento fragment obsahuje Protox-1 promotor kukuřice. Sekvence tohoto fragmentu je zde uvedena jako sekevnce id.č. 14. Tato sekvence je od nukleotidu 1 k nukleotidu 3532 nekódující sekvencí. Nukleotidy 3533 až 3848 této sekvence kódují 5' konec proteinu Protox-1 z kukuřice.
Plazmid obsahující sekvenci id.č. 14 spojenou se zbytkem kódující sekvence Protox-1 z kukuřice byl uložen 19. března 1996 jako pWDC-14 (NRRL č. B-21546).
Příklad 29
Konstrukce rostlinných transformačních vektorů exprimujících změněný Protox-1 gen za nativním Protox-1 promotorem z kukuřice
Fragment genomové DNA z kukuřice o délce 3848 bp (sekvence id. č. 14) se vyjme z izolovaného klonu fága lambda pomocí částečného štěpení Sall-KpnI a liguje se s KpnI• a · 4 44 94 ·4
944 · 949 4 · 44 • 4 4 4 4 4 4 44 • 44 9444 444 4
9 4 9 4 4 4 «494999 444 44 44 44
116
Notl fragmentem odvozeným ze změněné Protox-1 cDNA z kukuřice, který obsahuje záměnu alaninu za leucin v aminokyselině 164 (sekvence id. č. 6) . Tak se vytvoří spojení nativního Protox-1 promotoru z kukuřice s cDNA plné délky, která poskytuje, jak bylo ukázáno, toleranci k herbicidu v bakteriálním systému (viz příklady 8 až 13) . Tento fúzovaný produkt je klonován do vektoru odvozeného z plazmidů pUC18 obsahujícího CaMV 35S terminátorovou sekevenci, čímž se vytvoří kazeta „protox promotor/změněná protox cDNA/terminátor. Plazmid obsahující tuto kazetu byl nazván pWCo-1.
Druhý konstrukt pro transformaci kukuřice je vytvořen vložením prvního intronu nalezeného v kódující sekvenci v kukuřičném genomovém klonu zpět do cDNA kukuřice. Vložení je provedeno standardním způsobem pomocí PCR fúze s přesahy. Intron (sekvence id. č. 25) je dlouhý 93 bp a je vložen mezi nukleotidy 203 a 204 sekvence id. č. 5, zcela shodně s tím, jak je v přirozeneém kontextu v klonu lambda popsaném v příkladu 28. Tato verze expresní kazety obsahující intron byla nazvána pWCo-2.
Příklad 30
Demonstrace aktivity Protox-1 promotoru kukuřice v transgenních rostlinách kukuřice
Rostliny kukuřice transformované kazetou „protox promotor kukuřice/změněný protox byly identifikovány analýzou PCR s primery specifickými pro transgen. Celková RNA byla připravena z rostlin pozitivnívh v PCR a byla reverzně transkribována pomocí soupravy „Superscript M-MLV (Life Technologies) za doporučených podmínek. 2 μΐ reakční směsi z reverzní transkripce byly použity pro reakci PCR specifickou pro změněnou protox sekvenci. Zatímco netransformované kontroly neposkytly v této reakci žádný produkt, přibliž• ·
• · · · · · ♦ • · · ♦♦·*··· « · · · ·
44« ···· ··· ·· ·*
117 ně 85 % rostlin transformovaných pWCo-1 poskytlo pozitivní výsledky, což ukazuje na přítomnost mRNA pocházející z transgenu. To demonstruje jistou úroveň aktivity protox promotoru kukuřice. RNA z transgenních rostlin kukuřice se také analyzovala standardním northernovým přenosem s radioaktivně značenou sondou, což byl fragment protox cDNA kukuřice (sekvence id. č. 6). V některých transgenních rostlinách byla zjištěna vyšší hladina Protox-1 mRNA než v netransformovaných kontrolách. Lze se domnívat, že tato zvýšená hladina mRNA je důsledkem exprese změněné protox-1 mRNA z klonovaného protox promotoru kukuřice.
Příklad 31
Izolace Protox-1 promotorové sekvence z cukrové řepy
Genomová knihovna ve vektoru Lambda Fix II z cukrové řepy byla připravena firmou Stratagene. Přibližně 300 000 pfu bylo vyseto a testováno pomocí sondy Protox-1 cDNA z řepy cukrovky (sekvence id. č. 17) stejně jak je popsáno v příkladu 28. Pomocí restrikčního štěpení, hybridizace a analýzy sekvence DNA byl identifikován lambda klon obsahující 7kb úsek genomické DNA cukrové řepy lokalizovaný od 5'-konce kódující sekvence již dříve izolované jako cDNA klon. Pstl-SAlI fragment dlouhý 2606 bp byl subklonován z lambda klonu do vektoru pBluescript. Tento fragment obsahuje 2068 bp dlouhý úsek 5'-nekódující sekvence a obsahuje také protox-1 promotorovou sekvenci. Obsahuje také prvních 453 bp z protox-1 kódující sekvence a 85 bp z intronu obsaženého v kódující sekvenci. Sekvence tohoto fragmentu je zde uvedena jako sekvence id. č. 26.
Plazmid obsahující sekvenci id. č. 26 byl uložen 6. prosince 1996 jako pWDC-20 (NRRL č. B-21650).
• ·« · ·· ·* · ♦ ··· · · · · · * · · * « · ««· ·*·· • · « · · · ♦ ·♦ · · · • « · · · · · · ««· ···· ··♦ ·· ·♦ ··
118
Příklad 32
Konstrukce rostlinného transformačního vektoru, který exprimuje změněný Protox-1 gen z cukrové řepy ležící za nativním promotorem Protox-1 z cukrové řepy
Fragment genomové DNA řepy cukrovky (sekvence id. č. 26) byl vyjmut z genomového subklonu popsaného v příkladu 31 jako SacI-BsrGI fragment obsahující 2068 bp z 5'-nekódující sekvence a prvních 300 bp Protox-1 kódující sekvence z řepy curovky. Tento fragment byl ligován s BsrGI-Notl fragmentem pocházejícícm ze změněné Protox-1 cDNA, která obsahuje záměnu tyrosinu za methionin v aminokyselině 449 (sekvence i.č. 18) . Tím je vytvořena fúze nativního protox-1 promotoru řepy cukrovky s cDNA plné délky, která poskytuje toleranci k herbicidu v bakteriálním systému (viz příklady 8 až 13). Tento fúzovaný produkt byl klonován do vektoru odvozeného z pUC18 obsahujícího CaMV 35S terminátorovou sekvenci, a tím se vytvořila kazeta „protox promotor/změněná protox cDNA/terminátor. Plazmid obsahující tuto kazetu byl nazván pWCo-3.
Příklad 33
Příprava k herbicidu tolerantních rostlin exprimujících fúzovaný gen „nativní Protox-1 promotor z cukrové řepy /změněný Protox-1 z cukrové řepy
Expresní kazeta z pWCo-3 se transformuje do rostlin řepy cukrovky kterýmkoliv způsobem transformace vhodným pro dvouděložná rostliny, včeteně použití Agrobacterium, proťoplastů nebo bombardování mikročásticemi. Transgenní rostliny exprimující změněný protox-1 enzym se identifikují pomocí RNA-PCR a testují se na toleranci k protox-inhibujícím herbicidům v koncentracích, keré jsou letální pro netransformované rostliny cukrové řepy.
119
Část D: Exprese genu protox v rostlinných plastidech
Příklad 34
Příprava chimérického genu, který obsahuje promotor pláštidového genu clpP z tabáku a nativní clpP 5'-netranslatovanou sekvenci fúzované s repotérovým genem GUS a 3'-netranslatovanou sekvencí plastidového genu rpsl6 v plastidovém transformačním vektoru
I. Amplifikace promotoru plastidového genu clpP z tabáku a úplné 5'-netranslatované clpP RNA (5'UTR)
Celková DNA z N. tabaccum cv. Xanthi NC byla použita jako templát v PCR s „levopravým primerem pro horní řetězec obsahujícím vložené restrikční místo EcoRI v poloze 197 vzhledem k počátečnímu kodonu ATG konstitutivně exprimovaného plastidového genu clpP (primer pclp_Pla: 5'gcggaattcatacttatttatcattagaaag-3'. sekvence id. č. 27, podtrženo je restrikční místo pro EcoRI) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec homologním k úseku v poloze -21 až -1 od počátečního kodonu ATG promotoru clpP obsahujícím vložené restrikční místo Ncol na začátku translačního primeru (primer Pclp_P2b: 5'-gcgccatggaaatgaaagaaagaactaaa-3', sekvence id. č. 28, podtrženo je restrikční místo Ncol). Tato PCR reakce byla provedena s termostabilní polymerázou Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) v termocykleru „Perkin Elmer Thermal Cycler 480 podle doporučení výrobce (Perkin Élmer/Roche, Branchburg, NJ) v následujících cyklech: 7 minut 95°C, pak 4 cykly 1 minuta 95°C/2 min 43°C/lmin 72°C, pak 25 cyklů 1 min 95°C/2min 55°C/lmin 72°C. Amplifikační produkt velikosti 213 bp obsahoval promotor a 5'-netranslatovaný • · •· ·« ·9 · * ·· 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 »·
99 9999 999 · * • « ··· 9 9·
999 9999 999 99 99 ··
120 úsek genu clpP s restrikčním místem EcoRI na levém konci a Ncol místem na pravém konci a obsahoval úsek odpovídající nukleotidům 74700 až 74505 sekvence plastidové DNA N. tabaccum (Shinozaki et al. , EMBO J. 5: 2043-2049, 1986). Tento amplifikační produkt byl izolován z gelu standardním způsobem a pak naštěpen EcoRI a Ncol (všechny restrikční enzymy byly zakoupeny od New England Biolabs, Beverly, MA).
II. Amplifikace 3'-netranslatované sekvence (3'UTR) RNA plastidového genu rpsl6 z tabáku
Celková DNA z N. tabaccum cv. Xanthi NC byla použita jako templát v PCR s „levopravým primerem pro horní řetězec obsahujícím vložené restrikční místo Xbal v poloze bezprostředně následující za stop kodonem TAA plastidového genu rpsl6 kódujícího ribozomální protein S16 (primer rpsl6P_la: 5'-GCGTCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG -3', sekvence id. č. 30, podtrženo je restrikční místo pro Xbal) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec homologním k úseku v poloze +134 až +151 od stop kodonu TAA genu rpsl6 obsahujícím vložené restrikční místo HindiII na 3'-konci 3'UTR genu rpsl6 (primerrpsl6_lb: 5 ' -CGCAAGCTTCTkATGGAAGCTkATGATAA-3 ' , sekvence id. č. 31, podtrženo je restrikční místo HindlII). Amplifikační produkt velikosti 169 bp obsahující 3'-netranslatovaný úsek genu rpsl6 s restrikčním místem Xbal na levém konci a HindlII místem na pravém konci a obsahující úsek odpovídající nukleotidům 4943 až 5093 sekvence plastidové DNA N. tabaccum (Shinozaki et al. , EMBO J. 5: 2043-2049, 1986) byl izolován z gelu standardním způsobem a pak naštěpen Xbal a HindlII.
* · » » · · · «·♦· · • · *·* «« » ·«····· ··· »· ·· ··
121
III. Ligace fragmentu reportérového genu GUS s promotorem a netranslatovanými úseky 5'UTR a 3'UTR genu clpP.
Fragment reportérového genu β-galakturonidázy (GUS) o velikosti 1864 bp odvozený z plazmidu pRAJ275 (Clontech) obsahující restrikční místo Ncol v místě start-kodonu ATG a restrikční místo Xbal následující nativní 3'UTR byl získán vyštěpením pomocí enzymů Ncol a Xbal. Tento fragment byl spojen ve čtyřcestné ligační reakci s promotorovým fragmentem EcoRl/NcoI promotoru clpP velikosti 201 bp, s fragmentem Xbal/HindlII z 3'UTR genu rpsl6 velikosti 157 bp a fragmentem EcoRI/HindlII z klonovacího vektoru pGEM3Zf(-)(Promega, Madison, WI) , a byl tak vytvořen plazmid pPH138. Plastidový transformační vektor byl vytvořen tak, že se plazmid pPRVllla (Zoubenko et al. , 1994) naštěpil EcoRI a HindlII a výsledný fragment velikosti 7287 bp se ligoval s fragmentem EcoRI/HindlII z pPH138 o velikosti 2222 bp.
Příklad 35
Příprava chimérického genu, který obsahuje promotor plastidového genu clpP z tabáku a minimální 5'-netranslatovaný úsek plastidového genu psbA z tabáku, spojené s reportérovým genem GUS a 3'-netranslatovaným úsekem plastidového genu rpsl6 v plastidovém transformačním vektoru
Amplifikace promotoru plastidového genu clpP z tabáku a zkráceného 5'-netranslatovaného úseku RNA (5'UTR): Celková DNA z N. tabaccum cv. Xanthi NC byla použita jako templát v PCR popsané podrobněji v předchozím textu s „levopravým primerem pro horní řetězec Pclp_Pla (sekvence id. č. 27) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec homologním k úseku v poloze -34 až -11 od start-kodonu ATG promotoru clpP obsahujícím vložené restrikční místo Xbal v poloze -11 v 5'UTR • Φ· φ ·· φφφ · φφφ • φ · · • · ♦ φ * φ φ φ φ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ *· φφ ·· φ φ φ · • · ·φ • φφφ · φ φ φ ·· · φ
122 clpP (primer Pclp_Plb: 5'-gcgtctagaaagaactaaatactatatttcac 2', sekvence id. č. 29, podtrženo je restrikční místo Xbal). Amplifikační produkt velikosti 202 bp obsahující promotor a zkrácený 5'-netranslatovaný úsek genu clpP restrikčním místem EcoRI na levém konci a Xbal místem na pravém byl izolován z gelu standardním způsobem a pak naštěpen Xbal. místo Xbal bylo následně doplněno pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerázy (New England Biolabs) a fragment byl štěpen EcoRI. Pak byl fragment v pěticestné ligační reakci spojen s dvouřetězcovým fragmentem DNA, který odpovídal posledním 38 nukleotidům a start-kodonu ATG v 5'UTR plastidového genu psbA z tabáku (s přesahujícím restrikčním místem Ncol zavedeným do start-kodonu ATG) a byl vytvořen spojením syntetických oligonukleotidů minpsb_U (horní řetězec: 5'gggagtccctgatgattaaataaaccaagattttac-3', sekvence id. č. 32) a minpsb_L (dolní řetězec: 5'-catggbaaaatcttggtttatttaatcatcagggactccc-3', sekvence id. č. 33, podtržen je 5'-přesah místa Ncol), fragmentem reportérového genu GUS popsaným v předchozím textu, fragmentem Xbal/HindlII z 3'UTR genu rpsl6 popsaným v předchozím textu, a fragmentem . EcoRl/HindlII pGEM3Zf(-) popsaným v předchozím textu, a pPH144 byl vytvořen tak, že se plazmid pPRVllla (Zoubenko et al. , Nucl. Acid Res. 22: 3819-3824, 1994) naštěpil EcoRI a HindiII a výsledný fragment velikosti 7287 bp se ligoval s EcoRI/HindlII fragmentem z pPH139 velikosti 2251 bp.
Příklad 36
Příprava chimérické genu, který obsahuje promotor plastidového genu clpP z tabáku a úplný 5'-netranslatovaný úsek, fúzované s kódující sekvencí Protox-1 z Arabidopsis thaliana • ··♦· • *9
99 • 9 · 9 · • · 9 99
9 9999 9
9 9 9
9·
123 a 3'-netranslatovaným úsekem plastidového genu rpsl6 ve vektoru pro transformaci plastidů tabáku
DNA získaná minipreparací z plazmidu AraC-2Met obsahujícího inzert Notl z Arabidopsis thaliana, který obsahuje sekvenci cDNA genu protoporfyrinogen-IX-oxidázy (PROTOX) kódující aminokoncovou část plastidového tranzitního peptidu, úplnou cDNA a část 3'-netranslatovaného úseku, byla použita jako templát pro PCR reakci podrobně popsanou v předchozím textu s „levopravým primerem pro horní řetězec (s homologií k nukleotidům v poloze +1172 až +1194 od startkodonu prekurzorového proteinu plné délky) obsahujícím vložené restrikční místo Ncol v novém start-kodonu v dedukovaném místě počátku sekvence maturovaného proteinu PROTOX (primer APRTXPla: 5'-GGACCATGGATTGTGTGATTGTCGGCGGAGG-3', sekvence id. č. 34, podtrženo je restrikční místo Ncol) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec homologním k úseku v poloze +917 až +940 od nativního start-kodonu ATG prekurzorového proteinu PROTOX (primer APRTXPlb: 5'CTCCGCTCTCCAGCTTAGTGATAC-3“, sekvence id. č. 35). Amplifikační produkt velikosti 778 byl naštěpen Ncol a Sful a výsledný fragment velikosti 682 bp byl ligován s DNA fragmentem Sful/Notl z AraC-2Met velikosti 844 bp obsahujícím 3'úsek kódující sekvence PROTOX a fragmentem Ncol/Notl z klonovacího vektoru pGEM5Zf(+)(Promega, Madison, WI) velikosti 2978 bp, a byl tak vytvořen plazmid pPH141. Plastidový transformační vektor pPH143 obsahující promotor clpP řídící gen rezistence 276'854 SVl-Met PROTOX s 3'UTR rpsl6 byl vytvořen tak, že pPH141 se naštěpil Ncol a SspI a izoloval se fragment velikosti 1491 bp obsahující úplnou kódující sekvenci PROTOX, produkty z PCR s rpsl6P__la a rpsl6P_lb popsaný v předchozím textu se naštěpil HindlII, a tyto frag• 0
• · • 0 • · ·
0 · 00
0 0 ·
0 00
0 0 ·
0 0
00
124 menty se ligovaly s fragmentem Ncol/HindlII z pPH140 o velikosti 7436 bp.
Příklad 37
Příprava chimérického genu, který obsahuje promotor plastidového genu clpP z tabáku a minimální 5'-netranslatovaný úsek plastidového genu psbA, fúzované s kódující sekvencí Protox-1 z Arabidopsis thaliana a 3'-netranslatováným úsekem plastidového genu rpsl6 ve vektoru pro transformaci plastidů tabáku
Plastidový transformační vektor pPH145 obsahující fúzovanou sekvenci „promotor clp/5'UTR psbA, která řídí gen rezistence 276'854 SVl-Met PROTOX s 3'UTR rpsl6, byl připraven tak, ze se naštěpil plazmid pPH141 enzymy Ncol a SspI, izoloval se fragment o velikosti 1491 bp obsahující úplnou kódující sekvenci PROTOX, produkty z PCR s rpsl6P_la a rpsl6P_lb popsaný v předchozím textu se naštěpil HindlII, a tyto fragmenty se ligovaly s fragmentem Ncol/HindlII z pPH144 o velikosti 7465 bp.
Příklad 38
Transformace plastidového genomu tabáku metodou bombardování mikročásticemi
Semena Nicotiana tabacum cv. Xanthi NC byla náklíčena po 7 na 1 kruhové misce velikosti 2,5 cm na T-agarovém médiu a 12 až 14 dní po vysetí byly semenáčky bombardovány lgm wolframovými částicemi (M10, Biorad, Hercules, CA) pokrytými DNA plazmidů pPH143 a pPH145 v podstatě způsobem, který popsali Svab, Z. a Maliga, P. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 913-917, 1993). Bombardované semenáčky byly po 2 dny inkubovány v T-médiu a pak byly listy odříznuty a umístěny • 9 9* 99 99 9999 • 9 99999 99
9 9 9 9 9 9 999 9 9
9 9 · 999
999 9999 999 99 99 99
125 abaxiální stranou nahoru na misky s médiem RMOP (Svab, Z. Hajdukiewicz, P., Maliga, P., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530, 1990) obsahujícím 500 μυ/ιτιΐ dihydrochloridu spectinomycinu (Sigma, St. Louis, MO) a umístěny pod silným světlem (350 až 500 μπιοί foton/m2/s). Rezistentní výhonky, které se objevovaly na spodku vybledlých listů tři až osm týdnů po bombardování byly subklonovány na stejné selektivní médium, ponechány až do vytvoření kalusu a pak byly izolovány a subklonovány druhotné výhonky. Úplná segregace kopií transformovaného plastidového genomu (homoplasmicita) v nezávislých subklonech byla hodnocena standardní technikou Southernova přenosu (Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Celková buněčná DNA naštěpená BamHl/EcoRI (Mettler, I.J., 1987, Plant Mol. Biol. Reportér 5, 346-349) byla rozdělena v 1% Tris-borátovém (TBE) agarózovém gelu, přenesena na nylonovou membránu (Amersham) a hybridizována s DNA sondou značenou náhodně 32P odpovídající DNA fragmentu BamHl/HindlII velikosti 0,7 kb z pC8 obsahující část plastidové směrovací sekvence rps7/l2. Homoplasmické výhonky byly asepticky zakořeněny na médiu MS/IBA obsahujícím spectinomycin (McBride, K.E. et al. , 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305) a pak přeneseny do skleníku .
Odborníkovi jsou zřejmé další modifikace předkládaného vynálezu popsaného zde a následující nároky zahrnují i tyto modifikace.
• toto • · · · • · · · ··· · to to · · ·
126
SEZNAM SEKVENCI (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1719 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (víi) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-2 (NRRL B-21238) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 31..1644 (C) DALŠÍ INFORMACE:/produkt = „Arabidopsis protox-1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG * Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro
5 • *·
44 • 4 · 4 * • · 4 »4
4444 4
4 4 4
44
127
ACG Thr ACT CAA TCG CTT Thr Gin Ser Leu 10 CTT Leu CCG Pro 15 TCG Ser TTT Phe TCG' AAG CCC AAT CTC CGA TTA 102
Ser Lys Pro . 20 Asn Leu Arg Leu
AAT GTT TAT AAG CCT CTT AGA CTC CGT TGT TCA GTG GCC GGT GGA CCA 150
Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro
25 30 35 40
ACC GTC GGA TCT TCA AAA ATC GAA GGC GGA GGA GGC ACC ACC ATC ACG 198
Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr
45 50 55
ACG GAT TGT GTG ATT GTC GGC GGA GGT ATT AGT GGT CTT TGC ATC GCT 246
Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala
60 65 70
CAG GCG CTT GCT ACT AAG CAT CCT GAT GCT GCT CCG AAT TTA ATT GTG 294
Gin Ala Leu Ala Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val
75 80 85
ACC GAG Thr Glu 90 GCT AAG GAT Ala Lys Asp CGT GTT GGA GGC AAC ATT ATC ACT CGT GAA GAG 342
Arg Val 95 Gly.Gly Asn Ile Ile 100 Thr Arg Glu Glu
AAT GGT TTT CTC TGG GAA GAA GGT CCC AAT AGT TTT CAA CCG TCT GAT 390
Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp
105 110 115 120
CCT ATG CTC ACT ATG GTG GTA GAT AGT GGT TTG AAG GAT GAT TTG GTG 438
Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
125 130 135
TTG GGA GAT CCT ACT GCG CCA AGG TTT GTG TTG TGG AAT GGG AAA TTG 486
Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu
140 145 150
AGG CCG GTT CCA TCG AAG CTA ACA GAC TTA CCG TTC TTT GAT TTG ATG 534
Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met
155 160 165
AGT ATT GGT GGG AAG ATT AGA GCT GGT TTT GGT GCA CTT GGC ATT CGA 582
Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg
170 175 180
CCG TCA CCT CCA GGT CGT GAA GAA TCT GTG GAG GAG TTT GTA CGG CGT 630
• 9 99
9 9 9 • 9 99
9999 9
9 9
99 *9
128
Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg
185 190 195 200
AAC CTC GGT GAT GAG GTT TTT GAG CGC CTG ATT GAA CCG TTT TGT TCA 678
Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
205 210 215
GGT GTT Gly Val TAT Tyr GCT GGT GAT Ala Gly Asp 220 CCT Pro TCA Ser AAA Lys 225 CTG Leu AGC Ser ATG Met AAA Lys GCA Ala 230 GCG Ala TTT Phe 726
GGG AAG GTT TGG AAA CTA GAG CAA AAT GGT GGA AGC ATA ATA GGT GGT 774
Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gin Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly
235 240 245
ACT TTT AAG GCA ATT CAG GAG AGG AAA AAC GCT CCC AAG GCA GAA CGA 822
Thr Phe Lys Ala Ile Gin Glu Arg Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg
250 255 260
GAC CCG CGC CTG CCA AAA CCA CAG GGC CAA ACA GTT GGT TCT TTC AGG 870
Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gin Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg
265 270 275 280
AAG GGA CTT CGA ATG TTG CCA GAA GCA ATA TCT GCA AGA TTA GGT AGC 918
Lys Gly Leu Arg Met 285 Leu Pro Glu Ala Ile 290 Ser Ala Arg Leu Gly 295 Ser
AAA GTT AAG TTG TCT TGG AAG CTC TCA GGT ATC ACT AAG CTG GAG AGC 966
Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser
300 305 310
GGA GGA TAC AAC TTA ACA TAT GAG ACT CCA GAT GGT TTA GTT TCC GTG 1014
Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val
315 320 325
CAG AGC AAA AGT GTT GTA ATG ACG GTG CCA TCT CAT GTT GCA AGT GGT 1062
Gin Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly
330 335 340
CTC TTG CGC CCT CTT TCT GAA TCT GCT GCA AAT GCA CTC TCA AAA CTA 1110
Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu
345 350 355 360
TAT TAC CCA CCA GTT GCA GCA GTA TCT ATC TCG TAC CCG AAA GAA GCA 1158
Tyr Tyr Pro Pro ' Val . Ala , Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala
365 370 375 « ···· » 0· »· • · · · · • · 0 ·· • · ··· · · • · · · | ·· ·♦
129
ATC CGA ACA GAA TGT TTG Leu ATA GAT GGT GAA CTA AAG GGT TTT GGG CAA 1206
Ile Arg Thr Glu Cys Ile Asp Gly 385 Glu Leu Lys Gly Phe 390 Gly Gin
380
TTG CAT CCA CGC ACG CAA GGA GTT GAA ACA TTA GGA ACT ATC TAC AGC 1254
Leu His Pro Arg Thr Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser
395 400 405
TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGC GCA CCG CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG 1302
Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu
410 415 420
AAC TAC ATT GGC GGG TCT ACA AAC ACC GGA ATT CTG TCC AAG TCT GAA 1350
Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu
425 430 435 440
GGT GAG TTA GTG GAA GCA GTT GAC AGA GAT TTG AGG AAA ATG CTA ATT 1398
Gly Glu Leu Val Glu 445 Ala Val Asp Arg Asp Leu 450 Arg Lys Met Leu 455 Ile
AAG CCT AAT TCG ACC GAT CCA CTT AAA TTA GGA GTT AGG GTA TGG CCT 1446
Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro
460 465 470
CAA GCC ATT CCT CAG TTT CTA GTT GGT CAC TTT GAT ATC CTT GAC ACG 1494
Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr
475 480 485
GCT AAA TCA TCT CTA ACG TCT TCG GGC TAC GAA GGG CTA TTT TTG GGT 1542
Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly
490 495 500
GGC AAT TAC GTC GCT GGT GTA GCC TTA GGC CGG TGT GTA GAA GGC GCA 1590
Gly A.sn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala
505 510 515 520
TAT GAA ACC GCG ATT GAG GTC AAC AAC TTC ATG TCA CGG TAC GCT TAC 1638
Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr
525 530 535
AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT Lys
1691 • · » · ··· ·
TTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA 1719
130 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 537 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
Met 1 Glu Leu Ser Leu 5 Leu Arg Pro , Thr Thr 10 1 Gin Ser Leu Leu Pro 15 Ser
Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu
20 25 30
Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly
50 55 60
Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu Ala Thr Lys His Pro
65 70 75 80
Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly
85 90 95
Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly
100 105 110
Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp
115 120 125
Ser Gly Leu Lys Asp . Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro . Arg
130 135 140
Phe ' Val : Leu Trp . Asn < Gly Lys Leu , Arg Pro ' Val Pro Ser Lys Leu 1 Thr
145 150 155 160 • *
131
Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly 165 170
Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro 180 185
Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp 195 200
Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala 210 215 220
Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp
225 230 235 240
Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gin Glu Arg 245 250 255
Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gin 260 265 270
Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu 275 280 285
Lys Ile Arg Ala
175
Gly Arg Glu Glu 190
Glu Val Phe Glu 205
Gly Asp Pro Ser
Lys Leu Glu Gin
Ala Ile 290 Ser Ala Arg Leu Gly 295 Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp 300 Lys Leu
Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu
305 310 315 320
Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Gin Ser Lys Ser Val Val Met Thr
325 330 335
Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser
340 345 350
Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val
355 360 365
Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Thr Glu Cys Leu Ile Asp
370 375 380
Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin ' Leu His Pro Arg Thr Gin Gly Val
385 390 395 400
• · • · • · · « »···
132 • · · · · · • ·· ·· · · · • » · · · • ·· ·· ··
Glu Thr Leu Gly Thr 405 Ile Tyr Ser Ser Ser 410 Leu Phe Pro Asn Arg 415 Ala
Pro Pro Gly Arg 420 Ile Leu Leu Leu Asn 425 Tyr Ile Gly Gly Ser 430 Thr Asn
Thr Gly Ile Leu 435 Ser Lys Ser Glu 440 Gly Glu Leu Val Glu 445 Ala Val Asp
Arg Asp 450 Leu Arg Lys Met Leu 455 Ile Lys Pro Asn Ser 460 Thr Asp Pro Leu
Lys 465 Leu Gly Val Arg Val 470 Trp Pro Gin Ala Ile 475 Pro Gin Phe Leu Val 480
Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser
485 490 495
Gly Tyr Glu Gly 500 Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala
505 510
Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn
515 520 525
Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys
530 535 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1738 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana • · • · · · · · · · · • to to to · · ·· • · « · · · · totototo to ·· tototo ··· ··· ···· ··· ·· ·· ··
133 (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-1 (NRRL B-21237) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 70..1596 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-2 Arabidopsis (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG 60
CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA .GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108
Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gin Ile Glu Ala
10
GTT Val TCA GGA Ser Gly 15 AAA AGA GTC GCA GTC GTA GGT GCA GGT GTA AGT GGA CTT 156
Lys Arg Val Ala Val 20 Val Gly Ala Gly Val 25 Ser Gly Leu
GCG GCG GCT TAC AAG TTG AAA TCG AGG GGT TTG AAT GTG ACT GTG TTT 204
Ala Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe
30 35 40 45
GAA GCT GAT GGA AGA GTA GGT GGG AAG TTG AGA AGT GTT ATG CAA AAT 252
Glu Ala Asp Gly Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gin Asn
50 55 60
GGT TTG ATT TGG GAT GAA GGA GCA AAC ACC ATG ACT GAG GCT GAG CCA 300
Gly Leu Ile Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ala Glu Pro
65 70 75
GAA GTT GGG AGT TTA CTT GAT GAT CTT GGG CTT CGT GAG AAA CAA CAA 348
Glu Val Gly Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gin Gin
85 90
TTT CCA ATT TCA CAG AAA AAG CGG TAT ATT GTG CGG AAT GGT GTA CCT 396
Phe Pro Ile Ser Gin Lys Lys Arg Tyr Ile Val Arg Asn Gly Val Pro
95 100 105
GTG ATG CTA CCT ACC AAT CCC ATA GAG CTG GTC ACA AGT AGT GTG CTC 444
Val Met Leu Pro Thr Asn Pro Ile -Glu Leu Val Thr Ser Ser Val Leu
110 115 120 125 • ·
492
134 ·· • · • · · · • · · · · • · · • · ·· · ·· β · · · • · · · · • · · • · · ·
TCT Ser ACC Thr CAA Gin TCT Ser AAG Lys 130 TTT Phe CAA ATC Gin Ile TTG Leu TTG GAA CCA TTT TTA TGG AAG Lys
Leu 135 Glu Pro Phe Leu Trp 140
AAA AAG TCC TCA AAA GTC TCA GAT GCA TCT GCT GAA GAA AGT GTA AGC
' Lys Lys Ser Ser Lys Val Ser Asp Ala Ser Ala Glu Glu Ser Val Ser
145 150 155
GAG TTC TTT CAA CGC CAT TTT GGA CAA GAG GTT GTT GAC TAT CTC ATC
Glu Phe Phe Gin Arg His Phe Gly Gin Glu Val Val Asp Tyr Leu Ile
160 165 170
GAC CCT TTT GTT GGT GGA ACA AGT GCT GCG GAC CCT GAT TCC CTT TCA
Asp Pro Phe Val Gly Gly Thr Ser Ala Ala Asp Pro Asp Ser Leu Ser
175 180 185
540
588
6
ATG Met 190 AAG Lys CAT His TCT Ser TTC Phe CCA GAT Pro Asp 195 CTC Leu TGG AAT GTA Trp Asn Val 200 GAG Glu AAA Lys AGT Ser TTT Phe GGC Gly 205
TCT ATT ATA GTC GGT GCA ATC AGA ACA AAG TTT GCT GCT AAA GGT GGT
Ser Ile Ile Val Gly Ala Ile Arg Thr Lys Phe Ala Ala Lys Gly Gly
210 215 220
AAA AGT AGA GAC ACA AAG AGT φ0Τ CCT GGC ACA AAA AAG GGT TCG CGT
Lys Ser Arg Asp Thr Lys Ser Ser Pro Gly Thr Lys Lys Gly Ser Arg
225 230 235
GGG TCA TTC TCT TTT AAG GGG GGA ATG CAG ATT CTT CCT GAT ACG TTG
Gly Ser Phe Ser Phe Lys Gly Gly Met Gin Ile Leu Pro Asp Thr Leu
240 245 . 250
684
732
780
828
TGC AAA AGT CTC TCA CAT GAT GAG ATC AAT TTA GAC TCC AAG GTA CTC
Cys Lys Ser Leu Ser His Asp Glu Ile Asn Leu Asp Ser Lys Val Leu
255 260 265
TCT TTG TCT TAC AAT TCT GGA TCA AGA CAG GAG AAC TGG TCA TTA TCT
Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Gly Ser Arg Gin Glu Asn Trp Ser Leu Ser
270 275 280 285
TGT GTT TCG CAT AAT GAA ACG CAG AGA CAA AAC CCC CAT TAT GAT GCT
Cys Val Ser His Asn Glu Thr Gin Arg Gin Asn Pro His Tyr Asp Ala
290 . 295 300
876
924
972
GTA ATT ATG ACG GCT CCT CTG TGC AAT GTG AAG GAG ATG AAG GTT ATG
1020
135
Val Ile Met Thr 305 Ala Pro Leu Cys Asn 310 Val Lys Glu Met Lys 315 Val Met
AAA GGA GGA CAA CCC TTT CAG CTA AAC TTT CTC CCC GAG ATT AAT TAC 1068
Lys Gly Gly Gin Pro Phe Gin Leu Asn Phe Leu Pro Glu Ile Asn Tyr
320 325 330
ATG CCC CTC TCG GTT TTA ATC ACC ACA TTC ACA AAG GAG AAA GTA AAG 1116
Met Pro Leu Ser Val Leu Ile Thr Thr Phe Thr Lys Glu Lys Val Lys
335 340 345
AGA CCT CTT GAA GGC TTT GGG GTA CTC ATT CCA TCT AAG GAG CAA AAG 1164
Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Ser Lys Glu Gin Lys
350 355 360 365
CAT GGT TTC AAA ACT CTA GGT ACA CTT TTT TCA TCA ATG ATG TTT CCA 1212
His Gly Phe Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro
370 375 380
GAT CGT TCC CCT AGT GAC GTT CAT CTA TAT ACA ACT TTT ATT GGT GGG 1260
Asp Arg Ser Pro Ser Asp Val His Leu Tyr Thr Thr Phe Ile Gly Gly
385 390 395
AGT AGG AAC CAG GAA CTA GCC AAA GCT TCC ACT GAC GAA TTA AAA CAA 1308
Ser Arg Asn Gin Glu Leu Ala Lys Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gin
400 405 410
GTT GTG ACT TCT GAC CTT CAG CGA CTG TTG GGG GTT GAA GGT GAA CCC 13 56
Val Val Thr Ser Asp Leu Gin Arg Leu Leu Gly Val Glu Gly Glu Pro
415 420 425
GTG TCT GTC AAC CAT TAC TAT TGG AGG AAA GCA TTC CCG TTG TAT GAC Asp 445 1404
Val 430 Ser Val Asn His Tyr 435 Tyr Trp Arg Lys Ala 440 Phe Pro Leu Tyr
AGC AGC TAT GAC TCA GTC ATG GAA GCA ATT GAC AAG ATG GAG AAT GAT 1452
Ser Ser Tyr Asp Ser Val Met Glu Ala Ile Asp Lys Met Glu Asn Asp
450 455 460
CTA CCT GGG TTC TTC TAT GCA GGT AAT CAT CGA GGG GGG CTC TCT GTT 1500
Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val
465 470 475
GGG AAA TCA ATA GCA TCA GGT TGC AAA GCA GCT GAC CTT GTG ATC TCA · 1548
Gly Lys Ser Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser
136
480 485 490
TAC CTG GAG TCT TGC TCA AAT GAC AAG AAA CCA AAT GAC AGC TTA TAACATTGTC
1603
Tyr Leu Glu Ser Cys Ser Asn Asp Lys Lys Pro Asn Asp Ser Leu
495 500 505
AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663
CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA . 1723
ACTATTTATG TAAAA 1738
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 508 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gin Ile Glu Ala Val Ser Gly
1 5 10 15
Lys Arg Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Tyr Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Asp
35 40 45
Gly Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gin Asn Gly Leu Ile
55 60
Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Gly
65 70 75 80
Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gin Gin Phe Pro Ile
90 95
Ser Gin Lys Lys Arg Tyr Ile Val Arg Asn Gly Val Pro Val Met Leu 100 105 110
• »
137
Pro Thr Asn Pro Ile Glu Leu Val Thr Ser Ser Val Leu Ser Thr Gin a iis
Ser Lys 130 Phe Gin Ile Leu Leu 135 Glu Pro Phe Leu Trp 140 Lys Lys Lys Ser
Ser Lys Val Ser Asp Ala Ser Ala Glu Glu Ser Val Ser Glu Phe Phe
145 150 155 160
Gin Arg His Phe Gly Gin Glu Val Val Asp Tyr Leu Ile Asp Pro Phe
165 170 175
Val Gly Gly Thr Ser Ala Ala Asp Pro Asp Ser Leu Ser Met Lys His
180 185 190
Ser Phe Pro Asp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Phe Gly Ser Ile Ile
195 200 205
Val Gly Ala Ile Arg Thr Lys Phe Ala Ala Lys Gly Gly Lys Ser Arg
210 215 220
Asp Thr Lys Ser Ser Pro Gly Thr Lys Lys Gly Ser Arg Gly Ser Phe
225 230 235 240
Ser Phe Lys Gly Gly Met Gin Ile Leu Pro Asp Thr Leu Cys Lys Ser
245 250 255
Leu Ser His Asp Glu Ile Asn Leu Asp Ser Lys Val Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Tyr Asn , Ser Gly Ser Arg i Gin i Glu Asn Trp Ser : Leu Ser Cys ' Val Ser
275 280 285
His Asn Glu Thr Gin Arg Gin Asn Pro His Tyr Asp Ala Val Ile Met 290 295 300
Thr Ala Pro Leu Cys Asn Val Lys Glu Met Lys Val Met Lys Gly Gly
305 310 315 320
Gin Pro Phe Gin Leu Asn Phe Leu Pro Glu Ile Asn Tyr Met Pro Leu
325 330 335
Ser Val Leu Ile Thr Thr Phe Thr Lys Glu Lys Val Lys Arg Pro Leu 340 345 350 • 99 ·
138
Glu Gly Phe 355 Gly Val Leu Ile Pro Ser Lys Glu Gin 360 Lys 365 His Gly Phe
Lys Thr Leu Gly • Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ser
370 375 380
Pro Ser Asp Val His Leu Tyr Thr Thr Phe Ile Gly Gly Ser Arg Asn
385 390 395 400
Gin Glu Leu Ala Lys Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gin Val Val Thr
405 410 415
Ser Asp Leu Gin Arg Leu Leu Gly Val Glu Gly Glu Pro Val Ser Val
420 425 430
Asn His Tyr Tyr Trp Arg Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Asp Ser Ser Tyr
435 440 445
Asp Ser Val Met Glu Ala Ile Asp Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gly
450 455 460
Phe Phe Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ser
465 470 475 480
Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala . Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Glu
485 490 495
Ser Cys Ser Asn Asp Lys ' Lys Pro Asn , Asp Ser Leu
500 505 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1691 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne • · • · ♦······ • · · ······♦·♦ • · · · ♦ ··· ··· ···· ··· ·· ·♦ ··
139 (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Zea mays (kukuřice) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..1443 (C) DALŠÍ INFORMACE:/produkt = „cDNA protox-1 kukuřice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GCG Ala 1 GAC TGC GTC GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC TGC ACC GCG 48
Asp Cys Val Val Val 5 Gly Gly Gly Ile 10 Ser Gly Leu Cys Thr 15 Ala
CAG GCG CTG GCC ACG CGG CAC GGC GTC GGG GAC GTG CTT GTC ACG GAG 96
Gin Ala Leu Ala Thr Arg His Gly Val Gly Asp Val Leu Val Thr Glu
20 25 3 0
GCC CGC GCC CGC CCC GGC GGC AAC ATT ACC ACC GTC GAG CGC CCC GAG 144
Ala Arg Ala Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Glu
35 40 45
GAA GGG TAC CTC TGG GAG GAG GGT CCC AAC AGC TTC CAG CCC TCC GAC 192
Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp
50 55 60
CCC GTT CTC ACC ATG GCC GTG GAC AGC GGA CTG AAG GAT GAC TTG GTT 240
Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
70 75 80
TTT GGG GAC CCA AAC GCG CCG CGT TTC GTG CTG TGG GAG GGG AAG CTG 288
Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys 95 Leu
85 90
AGG CCC GTG CCA TCC AAG CCC GCC GAC CTC CCG TTC TTC GAT CTC ATG 336
Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Ala Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met
100 105 110
AGC ATC CCA GGG AAG CTC AGG GCC GGT CTA GGC GCG CTT GGC ATC CGC 384
• · · · · ·♦ « · · · ··· · · ♦ 9 * 9 9·
999 99 99 99 • · 999 9999
140
Ser Ile Pro 115 Gly Lys Leu Arg Ala Gly 120 Leu Gly Ala
CCG CCT CCT CCA GGC CGC GAA GAG TCA GTG GAG GAG
Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu
130 135 140
Leu Gly Ile Arg
125
TTC GTG CGC CGC 432
Phe Val Arg Arg
AAC CTC GGT GCT GAG GTC TTT Phe GAG Glu CGC CTC ATT GAG CCT TTC TGC TCA 480
Asn Leu 145 Gly Ala Glu Val 150 Arg Leu Ile 155 Glu Pro Phe Cys Ser 160
.GGT GTC TAT GCT GGT GAT CCT TCT AAG CTC AGC ATG AAG GCT GCA TTT 528
Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe
165 170 175
GGG AAG GTT TGG CGG TTG GAA GAA ACT GGA GGT AGT ATT ATT GGT GGA 576
Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly
180 185 190
ACC ATC AAG ACA ATT CAG GAG AGG AGC AAG AAT CCA AAA CCA CCG AGG 624
Thr Ile Lys Thr Ile Gin Glu Arg Ser Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg
195 200- 205
GAT GCC CGC CTT CCG AAG CCA AAA GGG CAG ACA GTT GCA TCT TTC AGG 672
Asp Ala Arg 210 Leu Pro Lys Pro Lys 215 Gly Gin Thr Val 220 Ala Ser Phe Arg
AAG GGT CTT GCC ATG CTT CCA AAT GCC ATT ACA TCC AGC TTG GGT AGT 720
Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ser
225 230 235 240
AAA GTC AAA CTA TCA TGG AAA CTC ACG AGC ATT ACA AAA TCA GAT GAC 768
Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asp
245 250 255
AAG GGA TAT GTT TTG GAG TAT GAA ACG CCA GAA GGG GTT GTT TCG GTG 816
Lys Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Val
260 265 270
CAG GCT AAA AGT GTT ATC ATG ACT ATT CCA TCA TAT GTT GCT AGC AAC 864
Gin Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asn
275 280 285
ATT TTG CGT CCA CTT TCA AGC GAT GCT GCA GAT GCT CTA TCA AGA TTC 912
Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala . Ala Asp Ala Leu Ser Arg Phe
960
141
4 4
4 4 ·
4
4
4
444 4444 » ·· ·· ♦· ♦ ♦ · · ♦ · ♦ · * · · · » ·♦ • · ·· ··«· ♦ • · · ♦ · · ·*» ·« ·· ··
290 295 300
TAT TAT CCA CCG GTT GCT GCT GTA ACT GTT TCG TAT CCA AAG GAA GCA
Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala
305 310 315 320
ATT AGA AAA GAA TGC TTA ATT GAT GGG GAA CTC CAG GGC TTT GGC CAG
Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin
325 330 335
1008
TTG CAT CCA CGT AGT CAA .GGA GTT GAG ACA TTA GGA ACA ATA TAC AGT
Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser
340 345 350
TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGT GCT CCT GAC GGT AGG GTG TTA CTT CTA
Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Asp Gly Arg Val Leu Leu Leu
355 360 365
AAC TAC ATA GGA GGT GCT ACA AAC ACA GGA ATT GTT TCC AAG ACT GAA
Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu
370 375 380
AGT GAG CTG GTC GAA GCA GTT GAC CGT GAC CTC CGA AAA ATG CTT ATA
Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile
385 390 395 400
1056
1104
1152
1200
AAT TCT ACA GCA GTG GAC CCT TTA GTC CTT GGT GTT CGA GTT TGG CCA
Asn Ser Thr Ala Val 405 Asp Pro Leu Val Leu 410 Gly Val Arg Val Trp 415 Pro
CAA GCC ATA CCT CAG TTC CTG GTA GGA CAT CTT GAT CTT CTG GAA GCC
Gin Ala Ile Pro 420 Gin Phe Leu Val Gly 425 His Leu Asp Leu Leu 430 Glu Ala
GCA AAA GCT GCC CTG GAC CGA GGT GGC TAC GAT GGG CTG TTC CTA GGA
Ala Lys Ala 435 Ala Leu Asp Arg Gly 440 Gly Tyr Asp Gly Leu 445 Phe Leu Gly
GGG AAC TAT GTT GCA GGA GTT GCC CTG GGC AGA TGC GTT GAG GGC GCG
Gly Asn 450 Tyr Val Ala Gly Val 455 Ala Leu Gly Arg Cys 460 Val Glu Gly Ala
TAT GAA AGT GCC TCG CAA ATA TCT 'GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC
Tyr 465 Glu Ser Ala Ser Gin 470 Ile Ser Asp Phe Leu 475 Thr Lys Tyr Ala Tyr 480
1248
1296
1344
1392
1440 *·* · • ·
142
AAG TGATGAAAGA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT TGCATAGATG 1493
Lys
AGGTGCCTCC GGGGAAAAAA AAGCTTGAAT AGTATTTTTT ATTCTTATTT TGTAAATTGC 1553
ATTTCTGTTC TTTTTTCTAT CAGTAATTAG TTATATTTTA GTTCTGTAGG AGATTGTTCT 1613
GTTCACTGCC CTTCAAAAGA AATTTTATTT TTCATTCTTT TATGAGAGCT GTGCTACTTA 1673
AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1691
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 481 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
Ala 1 Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala
5 10 15
Gin Ala Leu Ala Thr Arg His Gly Val Gly Asp Val Leu Val Thr Glu
20 25 30
Ala Arg Ala Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Glu
35 40 45
Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp
50 55 60
Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
65 70 75 80
Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu
90 95
Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Ala Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met 100 105 110 ·· 44 ·· • · 4 4 4 ·
4 · *4
4 4 ··· · 4
4 4 · 4 • 4 4 4 ·4
143
Ser Ile Pro Gly Lys 115 Leu Arg Ala 120 Gly Leu Gly Ala Leu 125 Gly Ile Arg
Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg
130 135 140
Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
145 150 155 160
Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe
165 170 175
Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly
ISO 185 190
Thr Ile Lys Thr Ile Gin Glu Arg Ser Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg
195 200 205
Asp Ala Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gin Thr Val Ala Ser Phe Arg
210 215 220
Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ser
225 230 235 240
Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asp
245 250 255
Lys Gly Tyr Val 260 Leu Glu Tyr Glu Thr 265 Pro Glu Gly Val Val 270 Ser Val
Gin Ala Lys 275 Ser Val Ile Met Thr 280 Ile Pro Ser Tyr Val 285 Ala Ser Asn
Ile Leu 290 Arg Pro Leu Ser Ser 295 Asp Ala Ala Asp Ala 300 Leu Ser Arg Phe
Tyr 305 Tyr Pro Pro Val Ala 310 Ala Val Thr Val Ser 315 Tyr Pro Lys Glu Ala 320
Ile Arg Lys Glu Cys 325 Leu Ile Asp Gly Glu 330 Leu Gin Gly Phe Gly 335 Gin
Leu His Pro Arg 340 Ser Gin Gly Val Glu 345 Thr Leu Gly Thr Ile 350 Tyr Ser
0 ·0 0» • 00 00 00 0*00 0
000 000
000 0000 000 00 00 ··
144
Ser Ser Leu 355 Phe Pro Asn Arg Ala 360 Pro Asp Gly Arg Val 365 Leu Leu Leu
Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu
370 375 380
Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile
385 390 395 400
Asn Ser Thr Ala Val Asp Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro
405 410 415
Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly
435 440 445
Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala' Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala
450 455 460
Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser . Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr
465 470 475 480
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2061 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Zea mays (kukuřice) to ·· ·· toto ··· a · ·· · toto * · · · · • to ·· ···· · • to to · · · ··· ·« >· ··
145 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-3 (NRRL B-21259) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 64..1698 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-2 kukuřice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60
CAA ATG Met 1 CTC GCT TTG ACT GCC TCA GCC TCA TCC GCT TCG TCC CAT CCT 108
Leu Ala Leu Thr Ala 5 Ser Ala Ser Ser 10 Ala Ser Ser His Pro 15
TAT CGC CAC GCC TCC GCG CAC ACT CGT CGC CCC CGC CTA CGT GCG GTC 156
Tyr Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val
20 25 30
CTC GCG ATG GCG GGC TCC GAC GAC CCC CGT GCA GCG CCC GCC AGA TCG 204
Leu Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser
35 40 45
GTC GCC GTC GTC GGC GCC GGG GTC AGC GGG CTC GCG GCG GCG TAC AGG 252
Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg
50 55 60
CTC AGA CAG AGC GGC GTG AAC GTA ACG GTG TTC GAA GCG GCC GAC AGG 300
Leu Arg Gin Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg
65 70 75
GCG GGA GGA AAG ATA CGG ACC AAT TCC GAG GGC GGG TTT GTC TGG GAT 348
Ala Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp
85 90 95
GAA GGA GCT AAC ACC ATG ACA GAA GGT GAA TGG GAG GCC AGT AGA CTG 396
Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu
100 105 110
ATT GAT GAT CTT GGT CTA CAA GAC AAA CAG CAG TAT CCT AAC TCC CAA 444
Ile Asp Asp Leu Gly Leu Gin Asp·Lys Gin Gin Tyr Pro Asn Ser Gin
115 120 125 • 0 · 0
0 • 0 « • · * • · 0 0 • 0
0 0000
146
CAC AAG CGT TAC ATT GTC AAA GAT GGA GCA Ala CCA GCA CTG Leu 140 ATT Ile CCT Pro TCG Ser 492
His Lys Arg Tyr 130 Ile Val Lys Asp 135 Gly Pro Ala
GAT CCC ATT TCG CTA ATG AAA AGC AGT GTT CTT TCG ACA AAA TCA AAG 540
Asp Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys
145 150 155
ATT Ile 160 GCG Ala TTA Leu TTT Phe TTT GAA CCA TTT CTC TAC Tyr AAG Lys 170 AAA GCT Lys Ala AAC Asn ACA Thr AGA Arg 175 588
Phe Glu 165 Pro Phe Leu
AAC TCT GGA AAA GTG TCT GAG GAG CAC TTG AGT GAG AGT GTT GGG AGC 636
Asn Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser
180 185 190
TTC TGT GAA CGC CAC TTT GGA AGA GAA GTT GTT GAC TAT TTT GTT GAT 684
Phe Cys Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp
195 200 205
CCA TTT GTA GCT GGA ACA AGT GCA GGA GAT CCA GAG TCA CTA TCT ATT 732
Pro Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile
210 215 220
CGT CAT GCA TTC CCA GCA TTG TGG AAT TTG GAA AGA AAG TAT GGT TCA 780
Arg His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser
225 230 235
GTT . ATT GTT ' GGT GCC ATC TTG TCT AAG CTA GCA GCT AAA GGT GAT CCA 828
Val Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro
240 245 250 255
GTA AAG ACA AGA CAT GAT TCA TCA GGG AAA AGA AGG AAT AGA CGA GTG 876
Val Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val
260 265 270
TCG TTT TCA TTT CAT GGT GGA ATG CAG TCA CTA ATA AAT GCA CTT CAC 924
Ser Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gin Ser Leu Ile Asn Ala Leu His
275 280 285
AAT GAA GTT GGA GAT GAT AAT GTG AAG CTT GGT ACA GAA GTG TTG TCA 972
Asn Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser
290 295 300
TTG GCA TGT ACA TTT GAT GGA GTT CCT GCA CTA GGC AGG TGG TCA ATT
1020 • to toto·· ·· toto toto
I · totototo > to to · toto » toto ·· · · to » · · · · • to ·· ·*
147
Leu Ala Cys 305 Thr Phe Asp Gly 310 Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser 315 Ile
TCT GTT GAT TCG AAG GAT AGC GGT GAC AAG GAC CTT GCT AGT AAC CAA 1068
Ser Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gin
320 325 330 335
ACC TTT GAT GCT GTT ATA ATG ACA GCT CCA TTG TCA AAT GTC CGG AGG 1116
Thr Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg
340 345 350
ATG AAG TTC ACC AAA GGT GGA GCT CCG GTT GTT CTT GAC TTT CTT CCT 1164
Met Lys Phe Thr Lys 355 Gly Gly Ala Pro Val 360 Val Leu Asp Phe Leu Pro 365
AAG ATG GAT TAT CTA CCA CTA TCT CTC ATG GTG ACT GCT TTT AAG AAG 1212
Lys Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys
370 375 380
GAT GAT GTC AAG AAA CCT CTG GAA GGA TTT GGG GTC TTA ATA CCT TAC 1260
Asp Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr
385 390 395
AAG GAA CAG CAA AAA CAT GGT CTG AAA ACC CTT GGG ACT CTC TTT TCC 1308
Lys Glu Gin Gin Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser
400 405 410 415
. TCA ATG ATG TTC CCA GAT CGA GCT CCT GAT GAC CAA TAT TTA TAT ACA 1356
Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp Asp Gin Tyr Leu Tyr Thr
420 425 430
ACA TTT GTT GGG GGT AGC CAC AAT AGA GAT CTT GCT GGA GCT CCA ACG 1404
Thr Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr
435 440 445
TCT ATT CTG AAA CAA CTT GTG ACC TCT GAC CTT AAA AAA CTC TTG GGC 1452
Ser Ile Leu Lys Gin Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly
450 455 460
GTA GAG GGG CAA CCA ACT TTT GTC AAG CAT GTA TAC TGG GGA AAT GCT 1500
Val Glu Gly Gin Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala
465 470 475
TTT CCT TTG TAT ' GGC CAT GAT TAT , AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA 1548
Phe Pro Leu Tyr i Gly His . Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu
• ·· * ·· · · ·· • · · • · · · • · · ··· ···· J»·· ·· ·· ·· · · · · · • · · · ·· • · · ··· · · • · · · · ·· ·· ··
148
480 ·— fc. » 485 490 495
AAG ATG GAG AAA AAC CTT CCA GGG TTC TTC TAC GCA GGA AAT AGC AAG 1596
Lys Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys
500 505 510
GAT GGG CTT GCT GTT GGA AGT GTT ATA GCT TCA GGA AGC AAG GCT GCT 1644
Asp Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala
515 520 525
GAC CTT GCA ATC TCA TAT CTT GAA TCT CAC ACC AAG CAT AAT AAT TCA 1692
Asp Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser
530 535 540
CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 1745
His
545
CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA 1805
ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA 1865
AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC 1925
TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGTA 1985
ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA 2045
AAAAAAAAAA AAAAAA 2061
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 544 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
Met Leu Ala
Leu Thr Ala Ser Ala -Ser Ser Ala Ser Ser His Pro Tyr • · • · · · · • · ··· · ·
149
Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val Leu 20 25 30
Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser Val 35 40 ’ 45
Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu 50 55 60
Arg Gin Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg Ala
70 75 80
Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu
90 95
Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu Ile 100 105 110
Asp Asp Leu Gly Leu Gin Asp Lys Gin Gin Tyr Pro Asn Ser Gin His 115 120 125
Lys Arg Tyr Ile Val Lys Asp Gly. Ala Pro Ala Leu Ile Prc Ser Asp 130 135 140
Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ile
145 150 155 160
Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg Asn
165 170 175
Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser Phe 180 185 190
Cys Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp Pro 195 200 205
Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg 210 215 220
His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser Val
225 230 235 240
Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys -Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro Val
245 250 255
150 • • · · • ···· • • · • · »· ·
• ··
Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val Ser
260 265 270
Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gin Ser Leu Ile Asn Ala Leu His Asn
275 280 285
Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser Leu
290 295 300
Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile Ser
305 310 315 320
Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gin Thr
325 330 335
Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg Met
340
345
350
Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe 365 Leu Pro Lys
355 360
Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys Asp
370 375 380
Asp Val Lys 385 Lys Pro Leu Glu 390 Gly Phe Gly Val Leu 395 Ile Pro Tyr Lys 400
Glu Gin Gin Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser
405 410 415
Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp Asp Gin Tyr Leu Tyr Thr Thr
420 425 430
Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr Ser
435 440 445
Ile Leu Lys Gin Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly Val
450 455 460
Glu Gly Gin Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala Phe
465 470 475 480
Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser ’ Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu Lys
485 490 495 • φ • φ · ·
151 φ·Φ φφφφ • · · · · Φ ·
Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys Asp
500 505 510
Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala Asp
515 520 525
Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser His
530 535 540 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1811 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Triticum aestivum (pšenice) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-13 (NRRL B-21545) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 3..1589 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-1 pšenice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
GC GCA ACA ATG GCC ACC GCC ACC GTC GCG GCC GCG TCG CCG CTC CGC 47
Ala Thr Met Ala Thr Ala Thr Val Ala Ala Ala Ser Pro Leu Arg
10 15
GGC AGG GTC ACC GGG CGC CCA CAC CGC GTC CGC CCG CGT TGC GCT ACC 95
Gly Arg Val Thr Gly Arg Pro His-Arg Val Arg Pro Arg Cys Ala Thr
25 30 • · · · • · ·· ··
• · · · · · ·
152
GCG AGC AGC GCG ACC GAG ACT CCG GCG GCG CCC GGC GTG CGG CTG TCC 143
Ala Ser Ser Ala Thr Glu Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Arg Leu Ser
40 45
GCG GAA TGC GTC ATT GTG GGC GCC GGC ATC AGC GGC CTC TGC ACC GCG 191
Ala Glu Cys Val Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala
55 60
CAG GCG CTG GCC ACC CGA TAC GGC GTC AGC GAC CTG CTC GTC ACG GAG 239
Gin Ala Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Ser Asp Leu Leu Val Thr Glu
65 70 75
GCC CGC GAC CGC CCG GGC GGC AAC ATC ACC ACC GTC GAG CGT CCC GAC 287
Ala Arg Asp Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Asp
80 85 90 95
GAG GGG TAC CTG TGG GAG GAG GGA CCC AAC AGC TTC CAG CCC TCC GAC 335
Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp
100 105 110
CCG GTC CTC ACC ATG GCC GTG GAC AGC GGG CTC AAG GAT GAC TTG GTG 3 83
Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp' Leu val
115 120 125
TTC GGG GAC CCC AAC GCG CCC CGG TTC GTG CTG TGG GAG GGG AAG CTG 431
Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu
130 135 140
AGG CCG GTG CCG TCG AAG CCA GGC GAC CTG CCT TTC TTC AGC CTC ATG 479
Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp Leu Pro Phe Phe Ser Leu Met
145 150 155
AGT ATC CCT GGG AAG CTC AGG GCC GGC CTT GGC GCG CTC GGC ATT CGC 527
Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg
160 165 170 175
CCA CCT CCT CCA GGG CGC GAG GAG TCG GTG GAG GAG TTT GTG CGC CGC 575
Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg
180 185 190
AAC CTC GGT GCC GAG GTC TTT GAG CGC CTC ATC GAG CCT TTC TGC TCA 623
Asn Leu Gly Ala 195 Glu Val Phe Glu Arg •200 Leu Ile Glu Pro Phe 205 Cys Ser
GGT GTA TAT GCT GGT GAT CCT TCG AAG CTT AGT ATG AAG GCT GCA TTT 671
• · ·
Ser Met Lys Ala Ala Phe
220
719
153
Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu
210 215
GGG AAG GTC TGG AGG TTG GAG GAG ATT GGA
Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Ile Gly
225 230
GGT AGT ATT ATT GGT GGA
Gly Ser Ile Ile Gly Gly
235
ACC ATC AAG GCG ATT CAG GAT AAA GGG AAG AAC CCC AAA CCG CCA AGG 767
Thr 240 Ile Lys Ala Ile Gin 245 Asp Lys Gly Lys Asn 250 Pro Lys Pro Pro Arg 255
GAT CCC CGA CTT CCG GCA 'cca AAG GGA CAG ACG GTG GCA TCT TTC AGG 815
Asp Pro Arg Leu Pro Ala Pro Lys Gly Gin Thr Val Ala Ser Phe Arg
260 265 270
AAG GGT CTA GCC ATG CTC CCG AAT GCC ATC GCA TCT AGG CTG GGT AGT 863
Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Ala Ser Arg Leu Gly Ser
275 280 285
AAA GTC AAG CTG TCA TGG AAG CTT ACG AGC ATT ACA AAG GCG GAC AAC 911
Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ala Asp Asn
290 295 300
CAA GGA TAT GTA TTA GGT TAT GAA ACA CCA GAA GGA CTT GTT TCA GTG 959
Gin Gly Tyr Val 305 Leu Gly Tyr 310 Glu Thr Pro Glu Gly 315 Leu Val Ser Val
CAG GCT AAA AGT GTT ATC ATG ACC ATC CCG TCA TAT GTT GCT AGT GAT 1007
Gin Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp
320 325 330 335
ATC TTG CGC CCA CTT TCA ATT GAT GCA GCA GAT GCA CTC TCA AAA TTC 1055
Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ile Asp Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe
340 345 350
TAT TAT CCG CCA GTT GCT GCT GTA ACT GTT TCA TAT CCA AAA GAA GCT 1103
Tyr iyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala
355 360 365
ATT AGA AAA GAA TGC TTA ATT GAT GGG GAG CTC CAG GGT TTC GGC CAG 1151
Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin
370 375 380
TTG CAT CCA CGT . AGC CAA GGA GTC GAG ACT TTA GGG ACA ATA TAT AGC 1199
Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser
• ·
·· · ·· ··
154
385 390 395
TCT Ser 400 TCT CTC TTT CCT AAT CGT GCT CCT GCT GGA AGA GTG TTA CTT CTG Leu 415 1247
Ser Leu Phe Pro Asn Arg 405 Ala Pro Ala Gly Arg Val 410 Leu Leu
AAC TAT ATC GGG GGT TCT ACA AAT ACA GGG ATC GTC TCC AAG ACT GAG 1295
Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu
420 425 430
AGT GAC TTA GTA GGA GCC GTT GAC CGT GAC CTC AGA AAA ATG TTG ATA 1343
Ser Asp Leu Val Gly Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile
435 440 445
AAC CCT AGA GCA GCA GAC CCT TTA GCA TTA GGG GTT CGA GTG TGG CCA 1391
Asn Pro Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Leu Gly Val Arg Val Trp Pro
450 455 460
CAA Gin GCA Ala 465 ATA CCA CAG Gin TTT TTG Phe Leu 470 ATT GGG CAC CTT GAT CGC CTT GCT GCT 1439
Ile Pro Ile Gly His Leu Asp 475 Arg Leu Ala Ala
GCA AAA TCT GCA CTG GGC CAA GGC GGC TAC GAC GGG TTG TTC CTA GGA 1487
Ala Lys Ser Ala Leu Gly Gin Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly
480 485 490 495
GGA AAC TAC GTC GCA GGA GTT GCC TTG GGC CGA TGC ATC GAG GGT GCG 1535
Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Ile Glu Gly Ala
500 505 510
TAC GAG AGT GCC TCA CAA GTA TCT GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC 1583
Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Val Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr
515 520 525
AAG TGA TGGAAGTAGT GCATCTCTTC ATTTTGTTGC ATATACGAGG TGAGGCTAGG 1639
Lys
ATCGGTAAAA
ATGCAATATG
CATCATGAGA
TGCTCTTTCC
TTCTGTAGTG
TGTAGTTCGA
TTTCTTTAAT
GCATGTACAT
TGAAAAAACA
CGGTATGGGA
AATTTTAGTG
TAAAGTAGAA
1699
1759
TAAGCTATTC TGCAAAAGCA GTGATTTTTT TTGAAAAAAA AAAAAAAAAA AA
1811 • 9
• 9 99 9
155 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 528 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10
Ala 1 Thr Met Ala Thr 5 Ala ‘Thr Val Ala Ala 10 Ala Ser Pro Leu Arg 15 Gly
Arg Val Thr Gly 20 Arg Pro His Arg Val 25 Arg Pro Arg Cys Ala 30 Thr Ala
Ser Ser Ala 35 Thr Glu Thr Pro Ala 40 Ala Pro Gly Val Arg 45 Leu Ser Ala
Glu Cys 50 Val Ile Val Gly Ala 55 Gly Ile Ser Gly Leu 60 Cys Thr Ala Gin
Ala 65 Leu Ala Thr Arg Tyr 70 Gly Val Ser Asp Leu 75 Leu Val Thr Glu Ala 80
Arg Asp Arg Pro Gly 85 Gly Asn Ile Thr Thr 90 Val Glu Arg Pro Asp 95 Glu
Gly Tyr Leu Trp 100 Glu Glu Gly Pro Asn 105 Ser Phe Gin Pro Ser 110 Asp Pro
Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe
115 120 125
Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe 135 Val Leu Trp Glu Gly Lys 140 Leu Arg
130
Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp Leu Pro Phe Phe Ser Leu Met Ser
145 150 155 160
Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro
165 170 175
Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn ;· ··· ···· , « . . . . ···· · « · ··· ··· ······· ··· ·· ·· ··
156
180 185 190
Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly 195 200 205
Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly 210 215 220
Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr 225 230 235 240
Ile Lys Ala Ile Gin Asp Lys Gly Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp
245 250 255
Pro Arg Leu Pro Ala Pro Lys Gly Gin Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys
260 265 270
Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Ala Ser Arg Leu cly Šer Lys
275 280 285
Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ala Asp Asn Gin
290 295 300
Gly Tyr Val Leu Gly Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Leu Val Ser Val Gin
305 310 315 320
Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ue Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp Ile
325 330 335
Leu Arg Pro Leu 340 Ser Ile Asp Ala Ala 345 Asp Ala Leu Ser Lys 350 Phe Tyr
Tyr Pro Pro 355 Val Ala Ala Val Thr 360 Val Ser Tyr Pro Lys 365 Glu Ala Ile
Arg Lys 370 Glu Cys Leu Ile Asp 375 Gly Glu Leu Gin Gly 380 Phe Gly Gin Leu
His 385 Pro Arg Ser Gin Gly 390 Val Glu Thr Leu Gly 395 Thr Ile Tyr Ser Ser 400
Ser Leu Phe Pro Asn 405 Arg Ala Pro Ala Gly 410 Arg Val Leu Leu Leu 415 Asn
Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser ·· · ·
• 157 • • · · · · • · · • · · ·· • · · ·· ··
420 425 430
Asp Leu Val Gly Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn
435 440 445
Pro Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin
450 455 460
Ala Ile Pro Gin Phe Leu Ile Gly His Leu Asp Arg Leu Ala Ala Ala
465 470 475 480
Lys Ser Ala Leu Gly Gin Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly Gly
485 490 495
Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Ile Glu Gly Ala Tyr
500 505 510
Glu Ser Ala Ser Gin Val Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys
515 520 525
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11 :
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1847 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: sója (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-12 (NRRL B-21516) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 55..1683 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-1 sóji ··· · • · ··· ·*·· ··· ·* ·· ··
158 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
CTTTAGCACA GTGTTGAAGA TAACGAACGA ATAGTGCCAT TACTGTAACC AACC ATG 57
Met
GTT TCC GTC TTC AAC GAG ATC CTA TTC CCG CCG AAC CAA ACC CTT CTT 105
Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gin Thr Leu Leu
10 15
.. CGC CCC TCC CTC CAT TCC ..CCA ACC TCT TTC TTC ACC TCT CCC ACT CGA 153
Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr Arg
25 30
AAA TTC CCT CGC TCT CGC CCT AAC CCT ATT CTA CGC TGC TCC ATT GCG 201
Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile Ala
40 45
GAG GAA TCC ACC GCG TCT CCG CCC AAA ACC AGA GAC TCC GCC CCC GTG 249
Glu 50 Glu Ser Thr Ala Ser 55 Pro Pro Lys Thr Arg 60 Asp Ser Ala Pro Val 65
GAC TGC GTC GTC GTC GGC GGA GGC GTC AGC GGC CTC TGC ATC GCC CAG 297
Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin
70 75 80
GCC CTC GCC ACC AAA CAC GCC AAT GCC AAC GTC GTC GTC ACG GAG GCC 345
Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu Ala
85 90 95
CGA GAC CGC GTC GGC GGC AAC ATC ACC ACG ATG GAG AGG GAC GGA TAC 393
Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly Tyr
100 105 110
CTC TGG GAA GAA GGC CCC AAC AGC TTC CAG CCT TCT GAT CCA ATG CTC 441
Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Met Leu
115 120 125
ACC ATG GTG GTG GAC AGT GGT TTA AAG GAT GAG CTT GTT TTG GGG GAT 489
Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly Asp
130 135 140 145
CCT GAT GCA CCT CGG TTT GTG TTG TGG AAC AGG AAG TTG AGG CCG GTG 537
Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro Val
150 155 160 • · ·· * · « « • · ·· ··· · • · · ·· ··
585 ·· ·
159
ccc GGG AAG CTG ACT GAT TTG CCT TTC TTT GAC TTG ATG AGC ATT GGT
Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly
165 170 175
GGC AAA ATC AGG GCT GGC TTT GGT GCG CTT GGA ATT CGG CCT CCT CCT Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Pro
180 185 190
CCA GGT CAT GAG GAA TCG GTT GAA GAG TTT GTT CGT CGG AAC CTT GGT
Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly
195 200 205
GAT GAG GTT TTT GAA CGG TTG ATA GAG CCT TTT TGT TCA GGG GTC TAT
Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr
210 215 220 225
GCA GGC GAT CCT TCA AAA TTA AGT ATG AAA GCA GCA TTC GGG AAA GTT
633
681
729
777
Ala Gly Asp Pro Ser Lys 230 Leu Ser Met Lys 235 Ala Ala Phe Gly Lys Val 240
TGG AAG CTG GAA AAA AAT GGT GGT AGC ATT ATT GGT GGA ACT TTC AAA
Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys
245 250 255
GCA ATA CAA GAG AGA AAT GGA GCT TCA AAA CCA CCT CGA GAT CCG CGT
Ala Ile Gin Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg
260 265 270
CTG CCA AAA CCA AAA GGT CAG ACT GTT GGA TCT TTC CGG AAG GGA CTT
Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu
275 280 285
ACC ATG TTG CCT GAT GCA ATT TCT GCC AGA CTA GGC AAC AAA GTA AAG
Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val Lys
290 295 300 305
825
873
921
969
TTA TCT TGG AAG CTT TCA AGT ATT AGT AAA CTG GAT AGT GGA GAG TAC
Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu Tyr
310 315 320
1017
AGT TTG ACA TAT GAA ACA CCA GAA GGA GTG GTT TCT TTG CAG TGC AAA
Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu •Gly Val Val Ser Leu Gin Cys Lys
325 330 335
1065 ··
9 9 9
9 9«
999 9 9
9 « • 9 49 *· • 9 9 9
9 » 9 9
9
999 9999 * 99
9 9
9«
9 9 9
9 9
9 94
160
ACT GTT GTC CTG ACC ATT CCT TCC TAT GTT GCT AGT ACA TTG CTG CGT 1113
Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu Arg
340 345 350
CCT CTG TCT GCT GCT GCT GCA GAT GCA CTT TCA.AAG TTT TAT TAC CCT 1161
Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro
355 360 365
CCA GTT GCT GCA GTT TCC ATA TCC TAT CCA AAA GAA GCT ATT AGA TCA 1209
Pro Val Ala Ala Val 370 Ser Ile 375 Ser Tyr Pro Lys 380 Glu Ala Ile Arg Ser 385
GAA TGC TTG ATA GAT GGT GAG TTG AAG GGG TTT GGT CAA TTG CAT CCA 1257
Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin Leu His Pro
390 395 400
CGT AGC CAA GGA GTG GAA ACA TTA GGA ACT ATA TAC AGC TCA TCA CTA 1305
Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser. Leu
405 410 415
TTC CCC AAC CGA GCA CCA CCT GGA AGG GTT CTA CTC TTG AAT TAC ATT 1353
Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile
420 425 430
GGA GGA t GCA ACT AAT ACT GGA ATT TTA TCG AAG ACG GAC AGT GAA CTT 1401
Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu Leu
435 440 445
GTG GAA ACA GTT GAT CGA GAT TTG AGG AAA ATC CTT ATA AAC CCA AAT 1449
Val Glu Thr Val Asp . Arg . Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro Asn
450 455 460 465
GCC CAG GAT CCA TTT GTA GTG GGG GTG AGA CTG TGG CCT CAA GCT ATT 1497
Ala Gin Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gin Ala Ile
470 475 480
CCA CAG TTC TTA GTT GGC CAT CTT GAT CTT CTA GAT GTT GCT AAA GCT 1545
Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys Ala
485 490 495
TCT ATC AGA AAT ACT GGG TTT GAA GGG CTC TTC CTT GGG GGT AAT TAT 1593
Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr
500 505- 510
GTG TCT GGT GTT GCC TTG GGA CGA TGC GTT GAG GGA GCC TAT GAG GTA 1641 • ·
161 ······· ··· ·· ··
Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr
515 520 525
GCA GCT GAA GTA AAC GAT TTT CTC ACA AAT AGA GTG TAC AAA
Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys
530 535 540
TAGTAGCAGT TTTTGTTTTT GTGGTGGAAT GGGTGATGGG ACTCTCGTGT TCCATTGAAT
TATAATAATG TGAAAGTTTC TCAAATTCGT TCGATAGGTT TTTGGCGGCT TCTATTGCTG
ATAATGTAAA ATCCTCTTTA AGTTTGAAAA AAAAAAAAAA AAAA
1683
1743
1803
1847 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 543 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM :
Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gin Thr Leu
1 5 10 15
Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr
20 25 30
Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile
35 40 45
Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala
65 70 75 80
Gin Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu
90 95
Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly 100 105 110
162
Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Met 115 120 125
Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly 130 135 140
Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro
145 150 155 160
Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile
165 ’ 170 175
Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro 180 185 190
Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu 195 200 205
Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val 210 215 220
Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys
225 230 235 240
Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe
245 250 255
Lys Ala Ile Gin Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro
260 265 270
Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly
275 280 285
Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val
290 295 300
Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gin Cys
325 330 335
Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu 340 345 350
• ·
163
Arg Pro Leu 355 Ser Ala Ala Ala Ala Asp 360 Ala Leu Ser Lys 365 Phe Tyr Tyr
Pro Pro 370 Val Ala Ala Val Ser 375 Ile Ser Tyr Pro Lys 380 Glu Ala Ile Arg
Ser 385 Glu Cys Leu Ile Asp 390 Gly Glu Leu Lys Gly 395 Phe Gly Gin Leu His 400
Pro Arg Ser Gin Gly 405 Val Glu Thr Leu Gly 410 Thr Ile Tyr Ser Ser 415 Ser
Leu Phe Pro Asn 42 0 Arg Ala Pro Pro Gly 425 Arg Val Leu Leu Leu 430 Asn Tyr
Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu
435 440 445
Leu Val 450 Glu Thr Val Asp Arg 455 Asp Leu Arg Lys Ile 460 Leu Ile Asn Pro
Asn 465 Ala Gin Asp Pro Phe 470 Val Val Gly Val Arg 475 Leu Trp Pro Gin Ala 480
Ile Pro Gin Phe Leu 485 Val Gly His Leu Asp 490 Leu Leu Asp Val Ala 495 Lys
Ala Ser Ile Arg 500 Asn Thr Gly Phe Glu 505 Gly Leu Phe Leu Gly 510 Gly Asn
Tyr Val Ser 515 Gly Val Ala Leu Gly 520 Arg Cys Val Glu Gly 525 Ala Tyr Glu
Val Ala 530 Ala Glu Val Asn Asp 535 Phe Leu Thr Asn Arg 540 Val Tyr Lys
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 583 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • ·
9 9
164 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1..583 (C) DALŠÍ INFORMACE: /funkce = „promotor protox-1 Arabidopsis (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
GAATTCCGAT CGAATTATAT AATTATCATA AATTTGAATA AGCATGTTGC CTTTTATTAA 60
AGAGGTTTAA TAAAGTTTGG TAATAATGGA CTTTGACTTC AAACTCGATT CTCATGTAAT 120
TAATTAATAT TTACATCAAA ATTTGGTCAC TAATATTACC AAATTAATAT ACTAAAATGT 180
TAATTCGCAA ATAAAACACT AATTCCAAAT AAAGGGTCAT TATGATAAAC ACGTATTGAA 240
CTTGATAAAG CAAAGCAAAA ATAATGGGTT TCAAGGTTTG GGTTATATAT GACAAAAAAA 300
AAAAAAGGTT TGGTTATATA TCTATTGGGC CTATAACCAT GTTATACAAA TTTGGGCCTA 360
ACTAAAATAA TAAAATAAAC GTAATGGTCC TTTTTATATT TGGGTCAAAC CCAACTCTAA 420
ACCCAAACCA AAGAAAAAGT ATACGGTACG GTACACAGAC TTATGGTGTG TGTGATTGCA 480
GGTGAATATT TCTCGTCGTC TTCTCCTTTC TTCTGAAGAA GATTACCCAA TCTGAAAAAA 540
ACCAAGAAGC TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG 583
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3848 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne • · • ·
165 (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1..3848 (C) DALŠÍ INFORMACE: /funkce = „promotor protox-1 kukuřice,, (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
TCGATCTTTC TAGGCTGATC CCCAAATCTT CCTCCGAAGC CCCTGGCGCC TCTGCCCCTT 60
GGAGCTGGTG GCCTGAAAGA GCTTTGCTGT TGCCCCGAAG ATTGTGAGGT ATATTGTGAC 120
CTCTGAGACT GACTTCCTTT GTCGTCACTT TGAGTGGAGT TATGGATTGA CCTGACGTGC 180
CTCAGATGGA TTCTTCCTCC GAAGCCCCTG GTCATTTCGG AGAATCTGTA ATCTTATTCC 240
CTTCTTTGGC GAAAATCTGT CAGCTTGGAT GTACTCATCC atcttctgaa GCAGCTTCTC 300
CAGAGTTTGT GGAGGCTTCC TGGCGAAATA TTGGGCTGTA GGTCCTGGAC GAAGACCCTT 360
GATCATGGCC TCAATGACAA TCTCATTGGG CACCGTAGGC GCTTGTGCCC TCAATCGCAA 420
GAACCTTCGT ACATATGCCT GAAGGTATTC TTCGTGATCT TGTGTGCATT GGAACAGAGC 480
CTGAGCTGTG ACCGACTTCG TTTGAAAC-CC TTGGAAGCTA GTAACCAACA TGTGCTTAAG 540
CTTCTGCCAC GACGTGATAG TCCCTGGCCG AAGAGAAGAA TACCATGTTT GGGCTACATT 600
CCGGACTGCC ATGACGAAGG ACTTCGCCAT GACTACAGTG TTGACCCCAT ACGAAGATAT 660
AGTTGCTTCG TAGCTCATCA GAAACTGCTT TGGATCTGAG TGCCCATCAT ACATGGGGAG 720
CTGAGGTGGC TTGTATGATG GGGGCCATGG GGTAGCCTGC AGTTCTGCTG CCAAGGGAGA 780
AGCATCATCA AAAGTAAAGG CATCATGATT AAAATCATCA TACCATCCAT CCTCGTTGAA 840
TAAGCCTTCT TGACGAAGCT CCCTGTGTTG GGGCCTTCGA TCTTGTTCAT CTTGAACAAG 900
ATGACGCACT TCTTCAGTGG CTTCGTCGAT CTTTCTTTGG AGATCAGCCA GTCGCACCAT 960
CTTCTCCTTC TTTCTTTGTA CTTGTTGATG GATGATCTCC ATGTCCCTGA TCTCTTGGTC 1020
CAACTCCTCC TCTTGGAGTG TCAGACTGGT GGCTTTCCTC TTCTGGCTTC GAGCCTCTCG
1080 • ·· · ·· ·· ·· • · · · ··· ♦ · ·· · • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · ·· ··· ··· ··· ···· ··· ·· ·· ··
166
AAGAGAAAGA GTTTCTTGAT TTGGGTCCAG CGGCTGCAGT GCAGTGGTCC CTGGTGCTGA 1140
AGCTTTCTTC GGTGGCATGA CAAAGGTCAG TGCTTGCCGA AGGTGGTCGA AAAGGGTTCA 1200
CTAGAGGTGG GAGCCAATGT TGGGGACTTC TCAAGTGCTA TGAGTTAAGA ACAAGGCAAC 1260
ACAAAATGTT AAATATTAAT AGCTTTCATC TTTCGAAGCA TTATTTCCCT TTGGGTATAA 1320
TGATCTTCAG ACGAAAGAGT CCTTCATCAT TGCGATATAT GTTAATAGAA GGAGGAGCAT 1380
ATGAAATGTA AGAGACAACA TGAACAATCG TGTAGCATTG TTAATTCATC ATCATTTTAT 1440
TATTATGGAA AAATAGAAAC AATATTGAAT TACAAATGTA CCTTTGGCTT GACAGAAGAT 1500
AAAAGTACAA GCTTGACGCA CGAGCAAGTA CAAGTCAGTG TGAACAGTAC GGGGGTACTG 1560
TTCATCTATT TATAGGCACA GGACACAGCC TGTGAGAAAT TACAGTCATG CCCTTTACAT 1620
TTACTATTGA CTTATAGAAA AATCTATGAG GACTGGATAG CCTTTTCCCC TTTAAGTCGG 1680
TGCCTTTTTC CGCGATTAAG CCGAATCTCC CTTGCGCATA GCTTCGGAGC ATCGGCAACC 1740
TTCGTCACGA TCATGCCCTT CTCATTGTGT ATGCTTTTAA TCCTGAATTC GAAGGTACCT 1800
GTCCATAAAC CATACTTGGA AGACATTGTT AAATTATGTT TTTGAGGACC TTCGGAGGAC 1860
GAAGGCCCCC AACAGTCGTG TTTTTGAGGA CCTTCGGAAG ATGAAGGCCC CCAACAAGAC 1920
CTATCCATAA AACCAACCTA TCCACAAAAC CGACCCCATT CACCCTTCAT TTGCCTCACC 1980
AACAACCCTA ATTAGGTTGT TGGTTTAAAT TTTTTAGGGT CAATTTGGTC ATCACCATCC 2040
ACTGTCACTC CACAAACTCA ATATCAATAA ACAGACTCAA TCACCCAAAC TGACCATACC 2100
CATAAAACCG CCCCACCCTT CTAGCGCCTC GCCAGAAACC AGAAACCCTG ATTCAGAGTT 2160
CAAACTTAAA ACGACCATAA CTTTCACCTT GGAACTCGAA TCAGGTCCAT TTTTTTCCAA 2220
ATCACACAAA ATTAAATTTC GCATCCGATA ATCAAGCCAT CTCTTCACTA TGGTTTTAAG 2280
TGTTGCTCAC ACTAGTGTAT TTATGGACTA ATCACCTGTG TATCTCATAC AATAACATAT 2340
CAGTACATCT AAGTTGTTAC TCAATTACCA AAACCGAATT ATAGCCTTCG AAAAAGGTTA 2400
TCGACTAGTC ACTCAATTAC CAAAACTAAA CTTTAGACTT TCATGTATGA CATCCAACAT 2460 • · 9
167
GACACTGTAC TGGACTAAAC CACCTTTCAA GCTACACAAG GAGCAAAAAT AACTAATTTT
CGTAGTTGTA GGAGCTAAAG TATATGTCCA CAACAATAGT TAAGGGAAGC CCCCAAGGAC
TTAAAAGTCC TTTTACCTCT TGAAACTTTT GTCGTGGTCT ACTTTTTCAC TTTAAACTTC
AAAATTTGAC ATTTTATCAC CCCTTAACTC TTAAAACCAT TTAAATTACA TTCTTACTAG
ATTATAGATG ATTTTGTTGT GAAAAGTTTT TAAGACATGT TTACACATTG ATTAAAATCA
TTTGTTCAAT TTCCTAGAGT TAAATCTAAT CTTATTAAAA CTATTAGAGA TACTTTCACG
AGCTCTAAAT ATTTTTATTT TTTCATTATG GAATTTTGTT AGAATTCTTA TAGACCTTTT
TTTGTGGTTT AAAAGCCTTG CCATGTTTTT AACAAGTTTT TTTTCTATTT TTTGAAATTT
TCTTGGAAAC CACTTCTAAC CCGGTAGAAG ATTTATTTTG CTACACTTAT ATCTACAACA
AAATCAACTT ATGAAATTGT CTTGGAAACT ACCTCTAACC CGGTAGAATG AATTTGAATG
AAAATTAAAC CAACTTACGG AATCGCCCAA CATATGTCGA TTAAAGTGGA TATGGATACA
TATGAAGAAG CCCTAGAGAT AATCTAAATG GTTTCAGAAT TGAGGGTTAT TTTTTGAAGT
TTGATGGGAA GATAAGACCA TAACGGTAGT TCACAGAGAT AAAAGGGTTA TTTTTTTCAG
AAATATTTGT gctgcaattg atcctgtgcc tcaaattcag cctgcaacca aggccaggtt
CTAGAGCGAA CAAGGCCCAC GTCACCCGTG GCCCGTCAGG CGAAGCAGGT CTTGTGCAGA
CTTTGAGAGG GATTGGATAT CAACGGAACC AATCACGCAC GGCAATGCGA TTCCCAGCCC
ACCTGTAACG TTCCAGTGGG CCATCCTTAA CTCCAAGCCC AACGGCCCTA CCCCATCTCG
TCGTGTCATC CACTCCGCCG CACAGGCGCT CAGCTCCGCA ACGCCGCCGG AAATGGTCGC
CGCCACAGCC ACCGCCATGG CCACCGCTGC ATCGCCGCTA CTCAACGGGA CCCGAATACC
TGCGCGGCTC CGCCATCGAG GACTCAGCGT GCGCTGCGCT GCTGTGGCGG GCGGCGCGGC
CGAGGCACCG GCATCCACCG GCGCGCGGCT GTCCGCGGAC TGCGTTGTGG TGGGCGGAGG
CATCAGTGGC CTCTGCACCG CGCAGGCGCT GGCCACGCGG CACGGCGTCG GGGACGTGCT
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
168 • ·« 9 99 99 99
9 9 99 9 · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 99 9999 9
9* 9 9 9 9 9 9
999 9999 ··· ·· 99 ··
TGTCACGGAG GCCCGCGCCC GCCCCGGCGG CAACATTACC ACCGTCGAGC GCCCCGAGGA 3840
AGGGTACC 3848 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1826 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Gossypium hirsutum (bavlník) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
KLON: pWDC-15 (NRRL B-21594) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 31..1674 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „kódující oblast protox-1 bavlníku (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
CCTCTCGCTC GCCTGGCCCC ACCACCAATC ATGACGGCTC TAATCGACCT TTCTCTTCTC 60
CGTTCCTCGC CCTCCGTTTC CCCTTTCTCC ATACCCCACC ACCAGCATCC GCCCCGCTTT 120
CGTAAACCTT TCAAGCTCCG ATGCTCCCTC GCCGAGGGTC CCACGATTTC CTCATCTAAA 180
ATCGACGGGG GAGAATCATC CATCGCGGAT TGCGTCATCG TTGGAGGTGG TATCAGTGGA 240
CTTTGCATTG CTCAAGCTCT CGCCACCAAG· CACCGTGACG TCGCTTCCAA TGTGATTGTG 300
ACGGAGGCCA GAGACCGTGT TGGTGGCAAC ATCACTACCG TTGAGAGAGA TGGATATCTG 360
169 to • •to · to • to to· ► 1 • ·
TGGGAAGAAG GCCCCAACAG TTTTCAGCCC TCCGATCCTA TTCTAACCAT GGCCGTGGAT 420
AGTGGATTGA AGGACGATTT GGTTTTAGGT GACCCTAATG CACCGCGATT TGTACTATGG 480
GAGGGAAAAC TAAGGCCTGT GCCCTCCAAG CCAACCGACT TGCCGTTTTT TGATTTGATG 540
AGCATTGCTG GAAAACTTAG GGCTGGGTTC GGGGCTATTG GCATTCGGCC TCCCCCTCCG 600
GGTTATGAAG AATCGGTGGA GGAGTTTGTG CGCCGTAATC TTGGTGCTGA GGTTTTTGAA 660
CGCTTTATTG AACCATTTTG TTCAGGTGTT TATGCAGGGG ATCCTTCAAA ATTAAGCATG 720
AAAGCAGCAT TTGGAAGAGT ATGGAAGCTA GAAGAGATTG GTGGCAGCAT CATTGGTGGC 780
ACTTTCAAGA CAATCCAGGA GAGAAATAAG ACACCTAAGC CACCCAGAGA CCCGCGTCTG 840
CCAAAACCGA AGGGCCAAAC AGTTGGATCT TTTAGGAAGG GACTTACCAT GCTGCCTGAG 900
GCAATTGCTA ACAGTTTGGG TAGCAATGTA AAATTATCTT GGAAGCTTTC CAGTATTACC 960
AAATTGGGCA ATGGAGGGTA TAACTTGACA TTTGAAACAC CTGAAGGAAT GGTATCTCTT 1020
CAGAGTAGAA GTGTTGTAAT GACCATTCCA TCCCATGTTG CCAGTAACTT GTTGCATCCT 1080
CTCTCGGCTG CTGCTGCAGA TGCATTATCC CAATTTTATT ATCCTCCAGT TGCATCAGTC 1140
ACAGTCTCCT ATCCAAAAGA AGCCATTCGA AAAGAATGTT TGATTGATGG TGAACTTAAG 1200
GGGTTTGGCC AGTTGCACCC ACGCAGCCAA GGAATTGAAA CTTTAGGGAC GATATACAGT 1260
TCATCACTTT TCCCCAATCG AGCTCCATCT GGCAGGGTGT TGCTCTTGAA CTACATAGGA 1320
GGAGCTACCA ACACTGGAAT TTTGTCCAAG ACTGAAGGGG AACTTGTAGA AGCAGTTGAT 1380
CGTGATTTGA GAAAAATGCT TATAAATCCT AATGCAAAGG ATCCTCTTGT TTTGGGTGTA 1440
AGAGTATGGC CAAAAGCCAT TCCACAGTTC TTGGTTGGTC ATTTGGATCT CCTTGATAGT 1500
GCAAAAATGG CTCTCAGGGA TTCTGGGTTT CATGGACTGT TTCTTGGGGG CAACTATGTA 1560
TCTGGTGTGG CATTAGGACG GTGTGTGGAA GGTGCTTACG AGGTTGCAGC TGAAGTGAAG 1620
GAATTCCTGT CACAATATGC ATACAAATAA TATTGAAATT CTTGTCAGGC TGCAAATGTA 1680 • 99 9 99 99
9 9 99 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9999 ·
9 9 9 9 9 9 9
999 9999 999 99 99 99
170
GAAGTCAGTT ATTGGATAGT ATCTCTTTAG CTAAAAAATT GGGTAGGGTT TTTTTTGTTA 1740
GTTCCTTGAC CACTTTTTGG GGTTTTCATT AGAACTTCAT ATTTGTATAT.CATGTTGCAA 1800
TATCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1826 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 539 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
Met 1 Thr Ala Leu Ile 5 Asp Leu Ser Leu Leu 10 Arg Ser Ser Pro Ser 15 Val
Ser Pro Phe Ser 20 Ile Pro His His Gin 25 His Pro Pro Arg Phe 30 Arg Lys
Pro Phe Lys 35 Leu Arg Cys Ser Leu 40 Ala Glu Gly Pro Thr 45 Ile Ser Ser
Ser Lys 50 Ile Asp Gly Gly Glu 55 Ser Ser Ile Ala Asp 60 Cys Val Ile Val
Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu Ala Thr Lys
70 75 80
His Arg Asp Val Ala 85 Ser Asn Val Ile Val 90 Thr Glu Ala Arg Asp 95 Arg
Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Asp Gly Tyr Leu Trp Glu
100 105 110
Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin- Pro Ser Asp Pro Ile Leu Thr Met Ala 115 120 125 • 99 9 9
9· 9
171
Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly 140 Asp Pro Asn Ala
130 135
Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys
145 150 155 160
Pro Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Ala Gly Lys Leu
165 170 175
Arg Ala Gly Phe Gly Ala Ile Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro Gly Tyr 180 185 190
Glu Glu Ser 195 Val Glu Glu Phe Val 200 Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val 205
Phe Glu Arg Phe Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp
210 215 220
Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Arg Val Trp Lys Leu
225 230 235 240
Glu Glu Ile Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Thr Ile Gin
245 250 255
Glu Arg Asn Lys Thr Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu
275 280 285
Pro Glu Ala Ile Ala Asn Ser Leu Gly Ser Asn Val Lys Leu Ser Trp
290 295 300
Lys Leu Ser Ser Ile Thr Lys Leu Gly Asn Gly Gly Tyr Asn Leu Thr
305 310 315 320
Phe Glu Thr Pro Glu Gly Met Val Ser Leu Gin Ser Arg Ser Val Val 325 330 335
Met Thr Ile Pro Ser His Val Ala Ser Asn Leu Leu His Pro Leu Ser 340 ' 345 350
Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu· Ser Gin Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala 355 360 365 • 0 • 9 9
172 • · ·»· 0000 • • • 0· 0 0 0 0 0
Ser Val 370 Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu 375 Ala Ile Arg 380 Lys Glu Cys Leu
Ile Asp 385 Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly 390 Gin Leu His 395 Pro Arg Ser Gin 400
Gly Ile Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn
405 410 415
Arg Ala Pro Ser Gly 420 Arg Val Leu Leu Leu Asn 425 Tyr Ile Gly 430 Gly Ala
Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala
435 440 445
Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Asn Ala Lys Asp
450 455 460
Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Lys Ala Ile Pro Gin Phe
465 470 475 480
Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Ser Ala Lys Met Ala Leu Arg
485 490 495
Asp Ser Gly Phe His Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly
500 505 510
Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Val Ala Ala Glu
515 520 525
Val Lys Glu Phe Leu Ser Gin Tyr Ala Tyr Lys 530 535 ' (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1910 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
173 • ·« ·♦ · 9 • · 9 9 • · •99 9999
99 99 99
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99
9 9 9 99 9 9 9
9 9 9 9 9
999 99 99 99 (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris (cukrová řepa) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-16 (NRRL B-21595N) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..1680 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „kódující oblast protox-1 z cukrové řepy (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
ATGAAATCAA TGGCGTTATC AAACTGCATT CCACAGACAC AGTGCATGCC ATTGCGCAGC 60
AGCGGGCATT ACAGGGGTAA TTGTATCATG TTGTCAATTC CATGTAGTTT AATTGGAAGA 120
CGAGGTTATT ATTCACATAA GAAGAGGAGG ATGAGCATGA GTTGCAGCAC AAGCTCAGGC 180
TCAAAGTCAG CGGTTAAAGA AGCAGGATCA GGATCAGGTG CAGGAGGATT GCTAGACTGC 240
GTAATCGTTG GAGGTGGAAT TAGCGGGCTT TGCATCGCGC AGGCTCTTTG TACAAAACAC 300
TCCTCTTCCT CTTTATCCCC AAATTTTATA GTTACAGAGG CCAAAGACAG AGTTGGCGGC 360
AACATCGTCA CTGTGGAGGC CGATC-GCTAT ATCTGGGAGG AGGGACCCAA TAGCTTCCAG 420
CCTTCCGACG CGGTGCTCAC CATGGCGGTC GACAGTGGCT TGAAAGATGA GTTGGTGCTC 480
GGAGATCCCA atgctcctcg CTTTGTGCTA TGGAATGACA AATTAAGGCC CGTACCTTCC 540
AGTCTCACCG ACCTCCCTTT CTTCGACCTC ATGACCATTC CGGGCAAGAT TAGGGCTGCT 600
CTTGGTGCTC TCGGATTTCG CCCTTCTCCT CCACCTCATG AGGAATCTGT TGAACACTTT 660
GTGCGTCGTA ATCTCGGAGA TGAGGTCTTT GAACGCTTGA TTGAACCCTT TTGTTCAGGT 720
GTGTATGCCG GTGATCCTGC CAAGCTGAGT ATGAAAGCTG CTTTTGGGAA GGTCTGGAAG 780
TTGGAGCAAA AGGGTGGCAG CATAATTGGT GGCACTCTCA AAGCTATACA GGAAAGAGGG 840
·
4
4
444 444
174
44 4444 4
4 4 4 4
44*4
AGTAATCCTA AGCCGCCCCG TGACCAGCGC CTCCCTAAAC CAAAGGGTCA GACTGTTGGA 900
TCCTTTAGAA AGGGACTCGT TATGTTGCCT ACCGCCATTT CTGCTCGACT TGGCAGTAGA 960
GTGAAACTAT .CTTGGACCCT TTCTAGTATC GTAAAGTCAC TCAATGGAGA ATATAGTCTG 1020
ACTTATGATA CCCCAGATGG CTTGGTTTCT GTAAGAACCA AAAGTGTTGT GATGACTGTT 1080
CCATCATATG TTGCAAGTAG GCTTCTTCGT CCACTTTCAG ACTCTGCTGC AGATTCTCTT 1140
TCAAAATTTT ACTATCCACC AGT.TGCAGCA GTGTCACTTT CCTATCCTAA AGAAGCGATC 1200
AGATCAGAAT GCTTGATTAA TGGTGAACTT CAAGGTTTCG GGCAACTACA TCCCCGCAGT 1260
CAGGGTGTGG AAACCTTGGG AACAATTTAT AGTTCGTCTC TTTTCCCTGG TCGAGCACCA 1320
CCTGGTAGGA TCTTGATCTT GAGCTACATC GGAGGTGCTA AAAATCCTGG CATATTAAAC 1380
AAGTCGAAAG ATGAACTTGC CAAGACAGTT GACAAGGACC TGAGAAGAAT GCTTATAAAT 1440
CCTGATGCAA AACTTCCTCG TGTACTGGGT GTGAGAGTAT GGCCTCAAGC AATACCCCAG 1500
TTTTCTATTG GGCACTTTGA TCTGCTCGAT GCTGCAAAAG CTGCTCTGAC AGATACAGGG 1560
GTCAAAGGAC TGTTTCTTGG TGGCAACTAT GTTTCAGGTG TTGCCTTGGG GCGGTGTATA 1620
GAGGGTGCTT ATGAGTCTGC AGCTGAGGTA GTAGATTTCC TCTCACAGTA CTCAGACAAA 1680
TAGAGCTTCA GCATCCTGTG TAATTCAACA CAGGCCTTTT TGTATCTGTT GTGCGCGCAT 1740
GTAGTCTGGT CGTGGTGCTA GGATTGATTA GTTGCTCTGC TGTGTGATCC ACAAGAATTT 1800
TGATGGAATT TTTCCAGATG TGGGCATTAT ATGTTGCTGT CTTATAAATC CTTAATTTGT 1860
ACGTTTAGTG AATTACACCG CATTTGATGA CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1910
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 560 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní φφφ
175 φ φ φ
Φ· φ · φ • ·· φ « • φ • · φ φ « • Φ φφ (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18
Met Lys Ser Met Ala Leu Ser Asn Cys Ile Pro Gin Thr Gin Cys Met 15 10 15
Pro Leu Arg Ser Ser Gly His Tyr Arg Gly Asn Cys Ile Met Leu Ser 20 25 30
Ile Pro Cys Ser Leu Ile Gly Arg Arg Gly Tyr Tyr Ser His Lys Lys 35 40 45
Arg Arg Met Ser Met Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Ser Lys Ser Ala 50 55 60
Val Lys Glu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gly Gly Leu Leu Asp Cys
70 75 80
Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu
90 95
Cys Thr Lys His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Pro Asn Phe Ile Val Thr 100 105 110
Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Val Thr Val Glu Ala Asp 115 120 125
Gly Tyr Ile Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Ala 130 135 140
Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu
145 150 155 160
Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Asp Lys Leu Arg
165 170 175
Pro Val Pro Ser Ser Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Thr 180 185 190
Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala· Ala Leu Gly Ala Leu Gly Phe Arg Pro 195 200 205 ··
9 · • · • · · • 9
A99 9999 * 99 99 99
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99
9 9 9 9<9 · ·
9 9 9 9 9
999 99 99 9«
176
Ser Pro Pro Pro His Glu Glu Ser Val Glu His Phe Val Arg Arg Asn 210 215 220
Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly
225 230 235 240
Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ala Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly
245 250 255
Lys Val Trp Lys Leu Glu Gin Lys Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr 260 ... 265 270
Leu Lys Ala Ile Gin Glu Arg Gly Ser Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp 275 280 285
Gin Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys 290 295 300
Gly Leu Val Met Leu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Arg 305 310 315 . 320
Val Lys Leu Ser Trp Thr Leu Ser Ser Ile Val Lys Ser Leu Asn Gly 325 330 335
Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Asp Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Arg 340 345 350
Thr Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser Tyr Val Ala Ser Arg Leu 355 360 365
Leu Arg Pro Leu Ser Asp Ser Ala Ala Asp Ser Leu Ser Lys Phe Tyr 370 375 380
Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Leu Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile
385 390 395 400
Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asn Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin Leu
405 410 415
His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser 420 425 430 '
Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala· Pro Pro Gly Arg Ile Leu Ile Leu Ser 435 440 445 • ···· • ·
177
Tyr Ile 450 Gly Gly Ala Lys Asn 455 Pro Gly Ile Leu Asn 460 Lys Ser Lys Asp
Glu 465 Leu Ala Lys Thr Val 470 Asp Lys Asp Leu Arg 475 Arg Met Leu Ile Asn 480
Pro Asp Ala Lys Leu 485 Pro Arg Val Leu Gly 490 Val Arg Val Trp Pro 495 Gin
Ala Ile Pro Gin 500 Phe Ser Ile Gly His 505 Phe Asp Leu Leu Asp 510 Ala Ala
Lys Ala Ala 515 Leu Thr Asp Thr Gly 520 Val Lys Gly Leu Phe 525 Leu Gly Gly
Asn Tyr 530 Val Ser Gly Val Ala 535 Leu Gly Arg Cys Ile 540 Glu Gly Ala Tyr
Glu Ser Ala Ala Glu Val Val Asp Phe Leu Ser Gin Tyr Ser Asp Lys
545 550 555 560 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1784 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Brassica napus (řepka olejka) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-17 (NRRL B-21615) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 47..1654 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „kódující oblast protox-1 řepky olejky • ·
178 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
CTCGCGGGCG ATCGCCATGG ATTTATCTCT
CTCAAATCCA TTTCCTCGGT CGCGTCCCTA
CGGTGGATCC GTCGTCGGCT CTTCTACAAT
GGCGGACTGC GTGATCGTCG GCGGAGGAAT
GACGAAGCAC CCAGACGCTG CAAAGAATGT
AGGGAATATC ATCACGCGAG AGGAGCAAGG
TCAGCCGTCT GATCCTATGC TCACTATGGT
CTTGGGAGAT CCTACTGCTC CGAGGTTTGT
GTCGAAGCTA ACTGACTTGC CTTTCTTTGA
TGGGTTTGGT GCCATTGGTA TTCGACCTTC
GTTTGTAAGG CGTAATCTTG GTGATGAGGT
AGGTGTTTAT GCGGGAGATC CTGCGAAACT
GAAGCTAGAG GAGAATGGTG GGAGCATCAT
AAATAAAGCT CCCAAGACAA CCCGAGATCC
TGGTTCTTTC AGGAAAGGAC TCACAATGCT
CAAGGTGAAA GTTTCTTGGA AGCTCTCAAG
CTTAACTTAC GAAACTCCGG AGGGTATAGT
TGTGCCATCT CATGTTGCTA GTAGTCTCTT
GCTCTCAAAA CTCTACTATC CGCCAGTTGC
AATCCGAAGC GAATGCTTAA TAGATGGTGA
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
GGGCCCCCCC CAAAATTGAG GATTCTCCTT
TCTCCGTCCG CAGCCATTCC TATCGCCATT
CAAGCCTCTC AACCTCCGTT GCTCCGTATC
CGAAGGCGGA GGAGGAGGTA AAACCGTCAC
CAGCGGCCTG TGCATTGCGC AAGCGCTCGT
GATGGTGACG GAGGCGAAGG ACCGTGTGGG
GTTTCTATGG GAAGAAGGTC CCAATAGCTT
GGTAGATAGT GGTTTGAAAG ATGATCTAGT
GTTGTGGAAT GGGAAGCTGA GGCCGGTTCC
CTTGATGAGT ATTGGAGGGA AGATTAGAGC
ACCTCCGGGT CGTGAGGAAT CAGTGGAAGA
TTTTGAGCGC TTGATTGAAC CCTTTTGCTC
GAGTATGAAA GCAGCTTTTG GGAAGGTTTG
TGGTGGTGCT TTTAAGGCAA TTCAAGCGAA
GCGTCTGCCA AAGCCAAAGG GCCAAACTGT
GCCAGAGGCA ATCTCCGCAA GGTTGGGTGA
TATCACTAAG CTGGCCAGCG GAGAATATAG
CACTGTACAG AGCAAAAGTG TAGTGATGAC
GCGCCCTCTC TCTGATTCTG CAGCTGAAGC
AGCCGTATCC ATCTCATACG CGAAAGAAGC • ·
179
ACTAAAAGGG TTCGGCCAGT TGCATCCACG CACGCAAAAA GTGGAAACTC TTGGAACAAT 1260
ATACAGTTCA TCGCTCTTTC CCAACCGAGC ACCGCCTGGA AGAGTATTGC TATTGAACTA 1320
CATCGGTGGA GCTACCAACA CTGGGATCTT ATCAAAGTCG GAAGGTGAGT TAGTGGAAGC 1380
AGTAGATAGA GACTTGAGGA AGATGCTGAT AAAGCCAAGC TCGACCGATC CACTTGTACT 1440
TGGAGTAAAA TTATGGCCTC AAGCCATTCC TCAGTTTCTG ATAGGTCACA TTGATTTGGT 1500
AGACGCAGCG AAAGCATCGC TCŤCGTCATC TGGTCATGAG GGCTTATTCT TGGGTGGAAA 1560
TTACGTTGCC GGTGTAGCAT TGGGTCGGTG TGTGGAAGGT GCTTATGAAA CTGCAACCCA 1620
AGTGAATGAT TTCATGTCAA GGTATGCTTA CAAGTAATGT AACGCAGCAA CGATTTGATA 1680
CTAAGTAGTA GATTTTGCAG TTTTGACTTT AAGAACACTC TGTTTGTGAA AAATTCAAGT 1740
CTGTGATTGA GTAAATTTAT GTATTATTAC TAAAAAAAAA AAAA 1784 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 536 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
Met Asp Leu Ser Leu Leu Arg Pro Gin Pro Phe Leu Ser Pro Phe Ser
1 5 10 15
Asn Pro Phe Pro Arg Ser Arg Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Leu Arg Cys
20 25 30
Ser Val Ser Gly Gly Ser Val. Val Gly Ser Ser Thr Ile Glu Gly Gly
35 40 45
• 0 0 0 00 0 0 0 · 0 * • 0 000 00 00 « 0 0 00 ·0 0000 0 • 0 0Φ0 000
000 0000 000 0· ·· ··
180
Gly Gly Gly Lys Thr Val Thr 55 Ala Asp Cys Val Ile Val Gly 60 Gly Gly
50
Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu Val Thr Lys' His Pro Asp
65 70 75 80
Ala Ala Lys Asn Val Met Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly 85 90 95
Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Gin Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro 100 ... 105 110
Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser 115 120 125
Gly Leu Lys 130 Asp Asp Leu Val 135 Leu Gly Asp Pro Thr 140 Ala Pro Arg Phe
Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp
145 150 155 160
Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly
165 170 175
Phe Gly Ala Ile Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser
180 185 190
Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ala Lys
210 215 220
Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Glu Asn
225 230 235 240
Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly . Ala Phe Lys Ala Ile Gin Ala Lys Asn
245 250 255
Lys Ala Pro Lys Thr Thr Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly
260 265 270
Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Glu Ala
275 280 285
· • · • · · · · ···· • · · ·· ·· · · · · · • · · · · · · · ··· ···· ··· ·· ·· ··
181
Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asp Lys Val Lys Val Ser Trp Lys Leu Ser 290 295 300
Ser Ile Thr Lys Leu Ala Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr
305 310 315 320
Pro Glu Gly Ile Val Thr Val Gin Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val
325 330 335
Pro Ser His Val Ala Ser Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser Asp Ser Ala 340 345 350
Ala Glu Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser 355 360 365
Ile Ser Tyr Ala Lys Glu Ala Ile Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly 370 375 380
Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin Leu His Pro Arg Thr Gin Lys Val Glu
385 390 395 400
Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn A.rg Ala Pro
405 410 415
Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr 420 425 430
Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg 435 440 445
Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Ser Ser Thr Asp Pro Leu Val 450 455 460
Leu Gly Val Lys Leu Trp Pro Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Ile Gly
465 470 475 480
His Ile Asp Leu Val Asp Ala Ala Lys Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly
485 490 495
His Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu 500 505 510
Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala. Tyr Glu Thr Ala Thr Gin Val Asn Asp 515 520 525 • · • · · · ··· · · ·· · • · · · · ···· • · · · · · · ··♦ · * • · · · · ··· ··· ···· ··· ·· ·· ··
182
Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys 530 535 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1224 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Oryza sativa (rýže) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-18 (NRRL B-21648) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..936 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „částečný kódující úsek protox-1 rýže (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
CGGGCTTTGA AGGCTGCATT TGGGAAGGTG TGGAGGCTGG AGGATACTGG AGGTAGCATT 60
ATTGGTGGAA CCATCAAGAC AATCCAGGAG AGGGGGAAAA ACCCCAAACC GCCGAGGGAT 120
CCCCGCCTTC CAACGCCAAA GGGGCAGACA GTTGCATCTT TCAGGAAGGG TCTGACTATG 180
CTCCCGGATG CTATTACATC TAGGTTGGGT AGCAAAGTCA AACTTTCATG GAAGTTGACA 240
AGCATTACAA AGTCAGACAA CAAAGGATAT GCATTAGTGT ATGAAACACC AGAAGGGGTG 300
GTCTCGGTGC AAGCTAAAAC TGTTGTCATG- ACCATCCCAT CATATGTTGC TAGTGATATC 360
TTGCGGCCAC TTTCAAGTGA TGCAGCAGAT GCTCTGTCAA TATTCTATTA TCCACCAGTT 420
• 4»
183
GCTGCTGTAA CTGTTTCATA TCCAAAAGAA GCAATTAGAA AAGAATGCTT AATTGACGGA 480
GAGCTCCAGG GTTTCGGCCA GCTGCATCCG CGTAGTCAGG GAGTTGAGAC TTTAGGAACA 540
ATATATAGCT CATCACTCTT TCCAAATCGT GCTCCAGCTG GAAGGGTGTT ACTTCTGAAC 600
TACATAGGAG GTTCTACAAA TACAGGGATT GTTTCCAAGA CTGAAAGTGA GCTGGTAGAA 660
GCAGTTGACC GTGACCTCAG GAAGATGCTG ATAAATCCTA GAGCAGTGGA CCCTTTGGTC 720
CTTGGCGTCC GGGTATGGCC ACAAGCCATA CCACAGTTCC TCATTGGCCA TCTTGATCAT 780
CTTGAGGCTG CAAAATCTGC CCTGGGCAAA GGTGGGTATG ATGGATTGTT CCTCGGAGGG 840
AACTATGTTG CAGGAGTTGC CCTGGGCCGA TGCGTTGAAG GTGCATATGA GAGTGCCTCA 900
CAAATATCTG ACTACTTGAC CAAGTACGCC TACAAGTGAT CAAAGTTGGC CTGCTCCTTT 960
TGGCACATAG ATGTGAGGCT TCTAGCAGCA AAAATTTCAT GGGCATCTTT TTATCCTGAT 1020
TCTAATTAGT TAGAATTTAG AATTGTAGAG GAATGTTCCA TTTGCAGTTC ATAATAGTTG 1080
TTCAGATTTC AGCCATTCAA TTTGTGCAGC CATTTACTAT ATGTAGTATG ATCTTGTAAG 1140
TACTACTAAG AACAAATCAA TTATATTTTC CTGCAAGTGA CATCTTAATC GTCAGCAAAT 1200
CCAGTTACTA GTAAAAAAAA AAAA 1224 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 312 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
Arg Ala Leu Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Asp Thr
• 9 9 • 9 9 99 9 » 9 9 99 9 9 • · 9 9 9 · 9 9
9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 φ ·
• 9 9 9999 99 9 »9 99 • 9
184
1' 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Ile Lys Thr Ile Gin Glu Arg Gly
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Thr Pro Lys Gly
35 40 45
Gin Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala
50 55 60
Ile Thr Ser Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr
65 70 75 80
Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asn Lys Gly Tyr Ala Leu Val Tyr Glu Thr
85 90 95
Pro Glu Gly Val Val Ser Val Gin Ala Lys Thr Val Val Met Thr Ile
100 105 110
Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala
115 - 120 125
Ala Asp Ala Leu Ser Ile Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr
130 135 140
Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly
145 150 155 160
Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu
165 170 · 175
Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro 180 185 190
Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr 195 200 205
Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg 210 215 220
Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Arg Ala Val Asp Pro Leu Val 225 230 · 235 240
Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Ile Gly
185 • • to to · ···· • · • · · • • · « • · • · toto
245 250 255
His Leu Asp His 260 Leu Glu Ala Ala Lys 265 Ser Ala Leu Gly Lys 270 Gly Gly
Tyr Asp Gly 275 Leu Phe Leu Gly Gly 280 Asn Tyr Val Ala Gly 285 Val Ala Leu
Gly Arg 290 Cys Val Glu Gly Ala 295 Tyr Glu Ser Ala Ser 300 Gin Ile Ser Asp
Tyr Leu Thr Lys Tyr’ Ala Tyr Lys
305
310 (2)
INFORMACE PRO SEKVENCI
S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1590 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Sorghum bicolor (čirok) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-19 (NRRL B-21649) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..1320 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „částečný kódující úsek protox-1 čiroku (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23
TCCACCGTCG AGCGCCCCGA GGAAGGGTAC CTCTGGGAGG AGGGTCCCAA CAGCTTCCAG • · • · ► 0 « • •0 0
186
CCATCCGACC CCGTTCTCTC CATGGCCGTG GACAGCGGGC TGAAGGATGA CCTGGTTTTT 120
GGGGACCCCA ACGCGCCACG GTTCGTGCTG TGGGAGGGGA AGCTGAGGCC CGTGCCATCC 180
AAGCCCGCCG ACCTCCCGTT CTTCGATCTC ATGAGCATCC CTGGCAAGCT CAGGGCCGGT 240
CTCGGCGCGC TTGGCATCCG CCCGCCTGCT CCAGGCCGCG AGGAGTCAGT GGAGGAGTTT 300
GTGCGCCGCA ACCTCGGTGC TGAGGTCTTT GAGCGCCTAA TTGAGCCTTT CTGCTCAGGT 360
GTCTATGCTG GCGATCCTTC CAAGCTCAGT ATGAAGGCTG CATTTGGGAA GGTGTGGCGG 420
TTAGAAGAAG CTGGAGGTAG TATTATTGGT GGAACCATCA AGACGATTCA GGAGAGGGGC 480
AAGAATCCAA AACCACCGAG GGATCCCCGC CTTCCGAAGC CAAAAGGGCA GACAGTTGCA 540
TCTTTCAGGA AGGGTCTTGC CATGCTTCCA AATGCCATCA CATCCAGCTT GGGTAGTAAA 600
GTCAAACTAT CATGGAAACT CACGAGCATG ACAAAATCAG ATGGCAAGGG GTATGTTTTG 660
GAGTATGAAA CACCAGAAGG GGTTGTTTTG GTGCAGGCTA AAAGTGTTAT CATGACCATT 720
CCATCATATG TTGCTAGCGA CATTTTGCGT CCACTTTCAG GTGATGCTGC AGATGTTCTA 780
TCAAGATTCT ATTATCCACC AGTTGCTGCT GTAACGGTTT CGTATCCAAA GGAAGCAATT 840
J
AGAAAAGAAT GCTTAATTGA TGGGGAACTC CAGGGTTTTG GCCAGTTGCA TCCACGTAGT 900
CAAGGAGTTG AGACATTAGG AACAATATAC AGCTCATCAC TCTTTCCAAA TCGTGCTCCT 960
GCTGGTAGGG TGTTACTTCT AAACTACATA GGAGGTGCTA CAAACACAGG AATTGTTTCC 1020
AAGACTGAAA GTGAGCTGGT AGAAGCAGTT GACCGTGACC TCCGAAAAAT GCTTATAAAT 1080
CCTACAGCAG TGGACCCTTT AGTCCTTGGT GTCCGAGTTT GGCCACAAGC CATACCTCAG 1140
TTCCTGGTAG GACATCTTGA TCTTCTGGAG GCCGCAAAAT CTGCCCTGGA CCAAGGTGGC 1200
TATAATGGGC TGTTCCTAGG AGGGAACTAT GTTGCAGGAG TTGCCCTGGG CAGATGCATT 1260
GAGGGCGCAT ATGAGAGTGC CGCGCAAATA TATGACTTCT TGACCAAGTA CGCCTACAAG 1320
TGATGGAAGA AGTGGAGCGC TGCTTGTTAA TTGTTATGTT GCATAGATGA GGTGAGACCA 1380
GGAGTAGTAA AAGGCGTCAC GAGTATTTTT CATTCTTATT TTGTAAATTG CACTTCTGTT 1440 > 9 9 » · «
999 9 9 9
187
TTTTTTTCCT GTCAGTAATT AGTTAGATTT TAGTTATGTA GGAGATTGTT GTGTTCACTG 1500
CCCTACAAAA GAATTTTTAT TTTGCATTCG TTTATGAGAG CTGTGCAGAC TTATGTAACG 1560
TTTTACTGTA AGTATCAACA AAATCAAATA 1590
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 440 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
Ser 1 Thr Val Glu Arg 5 Pro Glu Glu Gly Tyr 10 Leu Trp Glu Glu Gly 15 Pro
Asn Ser Phe Gin 20 Pro Ser Asp Pro Val Leu 25 Ser Met Ala Val 30 Asp Ser
Gly Leu Lys 35 Asp Asp Leu Val Phe 40 Gly Asp Pro Asn Ala 45 Pro Arg Phe
Val Leu 50 Trp Glu Gly Lys Leu 55 Arg Pro Val Pro Ser 60 Lys Pro Ala Asp
Leu 65 Pro Phe Phe Asp Leu 70 Met Ser Ile Pro Gly 75 Lys Leu Arg Ala Gly 80
Leu Gly Ala Leu Gly 85 Ile Arg Pro Pro Ala 90 Pro Gly Arg Glu Glu 95 Ser
Val Glu Glu Phe 100 Val Arg Arg Asn Leu Gly 105 Ala Glu Val Phe 110 Glu Arg
Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys 115 120 125 • · · ········* • · ·»» · · * ······· ·»· ·· ·· ··
188
Leu Ser 130 Met Lys Ala Ala Phe 135 Gly Lys Val Trp Arg 140 Leu Glu Glu Ala
Gly 145 Gly Ser Ile Ile Gly 150 Gly Thr Ile Lys Thr 155 Ile Gin Glu Arg Gly 160
Lys Asn Pro Lys Pro 165 Pro Arg Asp Pro Arg 170 Leu Pro Lys Pro Lys 175 Gly
Gin Thr Val Ala 180 Ser Phe Arg Lys Gly 185 Leu Ala Met Leu Pro 190 Asn Ala
Ile Thr Ser 195 Ser Leu Gly Ser Lys 200 Val Lys Leu Ser Trp 205 Lys Leu Thr
Ser Met 210 Thr Lys Ser Asp Gly 215 Lys Gly Tyr Val Leu 220 Glu Tyr Glu Thr
Pro Glu Gly Val Val Leu Val Gin Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile
225 230 235 240
Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp Ile Leu Arg Pro Leu Ser Gly Asp Ala 245 250 255
Ala Asp Val Leu Ser Arg Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr 260 265 270
Val Ser Tyr Pro Lys 275 Glu Ala Ile Arg 280 Lys Glu Cys Leu Ile 285 Asp Gly
Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu
290 295 300
Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro
305 310 315 320
Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr
325 330 335
Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg
340 345 350
Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Thr Ala Val Asp Pro Leu Val
355 360 365
• 9 <
99
9
189
Leu Gly 370 Val Arg Val Trp Pro 375 Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu 380 Val Gly
His Leu Asp Leu Leu Glu Ala Ala Lys Ser Ala Leu Asp Gin Gly Gly
385 390 395 400
Tyr Asn Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu
405 410 415
Gly Arg Cys Ile Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ala Gin Ile Tyr Asp
420 425 430
Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys
435 440 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „sekvence intronu protox-1 kukuřice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25
GTACGCTCCT CGCTGGCGCC GCAGCGTCTT CTTCTCAGAC TCATGCGCAG CCATGGAATT 60
GAGATGCTGA ATGGATTTTA TACGCGCGCG CAG 93 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2606 párů baží • · ·· 9 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris (cukrová řepa) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-20 (NRRL B-21650) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..6 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Sáli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: komplement (1..538) (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „částečná cDNA protox-1 cukrové řepy ve směru 3'-5' (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 539..2606 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „oblast promotoru protox-1 cukrové řepy uvedená ve směru 3'-5' (částečná sekvence fragmentu Pstl-Sall o velikosti ~ 3 kb subklonovaná z pWDC-20) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
GTCGACCTAC GCACATGCGA CATTCCACAT TCCACGTTAG GAATTGAATT GAATTGAATT 60
ATGATTATGA ATAATGAAGA GACAGAATTA CCGCCATGGT GAGCACCGCG TCGGAAGGCT 120
GGAAGCTATT GGGTCCCTCC TCCCAGATAT AGCCATCGGC CTCCACAGTG ACGATGTTGC 180
CGCCAACTCT GTCTTTGGCC TCTGTCACTA TAAAATTTGG GGATAAAGAG GACTGTTTTG 240
TACAAAGAGC CTGCGCGATG CAAAGCCCGC· TAATTCCACC TCCAACGATT ACGCAGTCTA 300
GCAATCCTCC TGCTCCTGAT CCTGATCCTG ATCCTGCTTC TTTAACCGCT GACTTTGAGC 360 ·· · • · · to · *· • · to · to · • · ··
191
CTGAGCTTGT GCTGCAACTC ATGCTCATCC TCCTCTTCTT ATGTGAATAA TAACCTCGTC 420
TTCCAATTAA ACTACATGGA ATTGACAACA TGATACAATT GCCCCTGTAA TGCCCGCTGC 480
TGTGCAATGG CATGCACTGT GTCTGTGGAA TGCAGTTTGA TAACGCCATT GATTTCATCT 540
CTCTCTCGCT CTCTCGCCCT CCTTATCCTC TATATCCCCT TCTTGCTTGC TCGGGAATTC 600
TAATTAACCT TATATCAAAA TGAAACAACT GTTTCTAGTT AAAAAGTTTT TTATAAATAG 660
TACTCTAAAT AAACGATTAC ATGTATCTTC TAACCATACT TGTTTGGTGG AGGTGGTGCG 720
TAACCGGTAA CTTACCTTTG TAACTCACCT CAATACCTAC TTATGCTTAA GGATACGGAT 780
TCTTTTAAAC TCTCAGGCAT TGACCTATGT AGCTGGACTG ACTAACATCT GAATTTGTTT 840
CTCTGGTTAT ATATGCAATT TTAACTGAAT CGAAATTTCT CTGGATGCTA AAAATGTCTT 900
TAACGGGGTT TATGAGGACT AAATTATCTC CTTCAATGAG GAGGTTCTTG ATTTGCATGT 960
ATGAGCGTGA AAATGCATTC TTAACGGCTA TAGATTCAGT AATAAGTGGT GTTAAAAGTA 1020
AAAAGTACTT GGAAAAATGA TTAAGCGACT TAATTTTTTT TATTTGTTTG AAAGTTGCCT 1080
TTTCTTGGCT ATCTTAACAT GTATTTATCA AACACCTTTT TTAATTACAT GGAAATCGAA 1140
AAGTTTGAAA AAAAAAAATC ATACTCACTA ACCGCCTTAA AATATAAGCT GAAGATGTCT 1200
CACTAACAGA GTGCATGTGA AGCACCCCCA AAGCAATTAT AACACAACAT CTCCGCCTCT 1260
TCAAAATTCC TACAAATACA TCTAATAAAC TTGTTGAAAC AATCAAAGTA ACATGGTGTG 1320
TCAATTGCGG ATGCTTCTCA TTCCAGACTT TATATAGTGA TTTTGTTTAA TCCATAGTCA ' 1380
ACAACTCACA TAATGGTACC CAAAGAATAC CCAAATTTTT TGCTCAAAAT CCCTAAACAT 1440
TGTAGCTGTG TAAGTTTGAC TAACATGTTT CAGCATGCTT GCCATGGGTA AATAAGACTT 1500
AGGGGCAAAT CTCGAATCCA CAAACTCATC ATTGGTTTTA GTTTGTCTCC AACGTAAAAC 1560
AATGATGTGA AATACACCAC AAAATTCATA CAATCTCGTT ATCTTGGAAG CTTGAAAGCC 1620
ATAATCTTGT TTGTACTTTC ACTACGTCGA GAAGACAAAA TTACAACTAA GAAGAGGTCA 1680 ·· ·
9 9 9
999 9999 *99 99
192
TTGCTCAGTG TCGTGTACTA CTTATCTTTC AACTCATAGA AACAAGCAAA CCAATTGTCA 1740
CCTATATACT GTACTTCTCC ATCATATACT TCCAACTTGC CTTAAACTCA ATACTATCAT 1800
AAAAACCACA AAGACATTTC ATAAAAGCAT AATAAAAATG TGTCATCACT CTTCAAAGTT 1860
CCAAAGTGAT TCTAACTACA TTCTAATGAA AATGACATTG GTGTAAACCT AATCCTTGTG 1920
TTATAAAACA CCTACATACC ACGATTATGT TAGAAATATA TTTATGAATG CAGTACCTAC 1980
ATAAAGCCAT 1 TAAATAACCA GTTTTATGTT ATTTCGTGAC CAACATAGTT CCTAAAGATT 2040
ACGAAGTAAT TTATAGTCAT TTTGTGGCCA CTTAATTCAT TTAATACCCA GTATATTTAT 2100
AAGTTACCAG CTTAAGTAGT TTTGTGACCA TCTCTACATA CTTCCTCCGG TCCATAATAA 2160
GGGGGCGTTT GGTTGCAACG GGGTAAAGGG AATGGAATCA AGAAAGGGAG AGGAGAGGAA 2220
AGGAAAAGAA AACCCTTAGA TTTAGAGTGG TGTTTGGTTA AGATAATGTT AATTCTCTTT 2280
CTTCCTCTTT CTTACCCTTC TTCCACCCTA GCACCACCAC TCCTCCCTCT GTTACTATTC 2340
TCCACGCCGC CTCTCCCTAC CCCAGTAACA CCACCTTGTC GGCCCCCCGG TCTTCCCCTT 2400
CCCGCGACGG TTCCCCCCTC CCCTGCGCCG TCACGTCGTC CCCCTCACCT CCCTGCACCG 2460
TCGAGTTATC CCCCTCCCCT GCGCGTCGCG TTCTCCCCTC CCTCACCATC GCGTTCTCCC 2520
CTCCCTCACC GTCGCGTTCT CCCCTCCCTC . ACCGTCGCGG TCTCCCCTCC CTCACCGTCG 2580
CGGTCTCTCT TTCCCTCCCC CTGCAG 2606
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární « ·
193 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PclP_Pla - PCR primer pro horní řetězec plastidového genu clpP (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místoEcoRI (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
GCGGAATTCA TACTTATTTA TCATTAGAAA G (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PclP_Plb - PCR primer pro dolní řetězec plastidového genu clpP (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Xbal (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
GCGTCTAGAA AGAACTAAAT ACTATATTTC AC
194 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PclP_P2b - PCR primer pro dolní řetězec plastidového genu clpP (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Ncol (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
GCGCCATGGT AAATGAAAGA AAGAACTAAA 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „Trpsl6_Pla - PCR primer pro horní řetězec 3'netranslatovaného úseku Xbal/HindlII (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Xbal • · • » • · · · · • · · * • · > ···· • · · · • ·· · ·
195 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
GCGTCTAGAT CAACCGAAAT TCAATTAAGG 30' (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „Trpsl6_Plb - PCR primer pro dolní řetězec 3netranslatovaného úseku Xbal/HindlII (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo HindlII (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
CGCAAGCTTC AATGGAAGCA ATGATAA 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
196 ·· · ·· ·* ·· ·· · · · · 4 4 4 4 • 4 4 4 4 · 44
4 44 44 4444 4
4 4 4 4 4 ·
44444 444 44 4· 4 4 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PCR primer minpsbJJ 5'netranslatovaný úsek plastidového genu psbA dlouhý 38 nt (tupý konec/NcoI) včetně start-kodonu ATG (primer pro horní řetězec) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
GGGAGTCCCT GATGATTAAA TAAACCAAGA TTTTAC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PCR primer minpsb_L 5'netranslatovaný úsek plastidového genu psbA dlouhý 38 nt (tupý konec/NcoI) včetně start-kodonu ATG (primer pro dolní řetězec) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
CATGGTAAAA TCTTGGTTTA TTTAATCATC AGGGACTCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
· 9 · 9
9 9 · 9 9
• 9 9
197 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „APRTXPla - PCR primer pro horní řetězec pro amplifikaci 5' úseku mutantního genu protox z Arabidopsis (iii) HYPOTETICKÁ: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:různé (B) POZICE: 5..10 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Ncol/start kodon ATG (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
GGGACCATGG ATTGTGTGAT TGTCGGCGGA GG 32 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24párú baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „APRTXPlb - PCR primer pro horní řetězec pro amplifikaci 5' úseku mutantního genu protox z Arabidopsis (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
CTCCGCTCTC CAGCTTAGTG ATAC

Claims (167)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    198
    1. Izolovaná molekula DNA kódující rostlinný enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny obsahující enzym protox z pšenice, enzym protox ze sóji, enzym protox z bavlníku, enzym protox z cukrové řepy, enzym protox z řepky olejky, enzym protox z rýže a enzym protox z čiroku.
  2. 2. Izolovaná molekula DNA kódující rostlinný enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny obsahující enzym protox ze sóji a enzym protox z pšenice.
  3. 3. Izolovaná molekula DNA podle nároku 1 kódující enzym protox z pšenice, která obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 10.
  4. 4. Izolovaná molekula DNA podle nároku 3, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 9.
  5. 5. Izolovaná molekula DNA podle nároku 1 kódující enzym protox ze sóji, která obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 12.
  6. 6. Izolovaná molekula DNA podle nároku 5, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 11.
  7. 7. Izolovaná molekula DNA podle nároku 1 kódující enzym protox z bavlníku, která obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 16.
    199
  8. 8. Izolovaná molekula DNA podle nároku 7, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 15.
  9. 9. Izolovaná molekula DNA podle nároku 1 kódující enzym protox z cukrové řepy, která obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 18.
  10. 10. Izolovaná molekula DNA podle nároku 9, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 17.
  11. 11. Izolovaná molekula DNA podle nároku 1 kódující enzym protox z řepky olejky, která obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 20.
  12. 12. Izolovaná molekula DNA podle nároku 11, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 19.
  13. 13. Izolovaná molekula DNA podle nároku 1 kódující enzym protox z rýže, která obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 22.
  14. 14. Izolovaná molekula DNA podle nároku 13, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 21.
  15. 15. Izolovaná molekula DNA podle nároku 1 kódující enzym protox z čiroku, která obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 24.
  16. 16. Izolovaná molekula DNA podle nároku 15, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 23.
    • · · · » · · < I · · · • « · · I • · <
    • · * · ··* ···· ··· ··
    200
  17. 17. Izolovaná molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox), která obsahuje eukaryotickou protox mající alespoň jednu aminokyselinovou modifikaci, přičemž tato aminokyselinová modifikace má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox.
  18. 18. Molekula DNA podle nároku 17, kde eukaryotická protox je vybrána ze skupiny obsahující enzym protox z pšenice, enzym protox ze sóji, enzym protox z bavlníku, enzym protox z cukrové řepy, enzym protox z řepky olejky, enzym protox z rýže a enzym protox z čiroku.
  19. 19. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající 159. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje rostlinnou protox.
  20. 20. Molekula DNA podle nároku 19, kde cystein je nahrazen fenylalaninem nebo lysinem.
  21. 21. Molekula DNA podle nároku 19, kde cystein je nahrazen fenylalaninem.
  22. 22. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množ• · • 9 9 99 9 9 I • · · · 4 • ·· · · ·»
    201 ství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  23. 23. Molekula DNA podle nároku 22, kde isoleucin je nahrazen threoninem, histidinem, glycinem nebo asparaginem.
  24. 24. Molekula DNA podle nároku 22, kde isoleucin je nahrazen threoninem, histidinem, glycinem nebo asparaginem.
  25. 25. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  26. 26. Molekula DNA podle nároku 25, kde alanin je nahrazen threoninem, leucinem nebo valinem.
  27. 27. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  28. 28. Molekula DNA podle nároku 27, kde glycin je nahrazen serinem nebo leucinem.
    • · ·· ·· ·· 9 9 99 9 9 * 9 · · • » ····♦·· • · 9 9 9 9 9 ···· ·
    9 9 9 · · 9 9 9
    999 9999 ··· *9 ·· 99
    202
  29. 29. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  30. 30. Molekula DNA podle nároku 29, kde tyrosin je nahrazen isoleucinem nebo methioninem.
  31. 31. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 356. aminokyselině v sekvenci id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  32. 32. Molekula DNA podle nároku 31, kde valin je nahrazen leucinem.
  33. 33. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 421. aminokyselině v sekvenci id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
    • · • · • · • · ······· • · · 9 · · · ··· 9 9 9 9 9 · · · 9 9
    999 ···· ··· ·· ·* <·
    203
  34. 34. Molekula DNA podle nároku 33, kde serin je nahrazen prolinem.
  35. 35. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 502. aminokyselině v sekvenci id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  36. 36. Molekula DNA podle nároku 35, kde valin je nahrazen alaninem.
  37. 37. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 211. aminokyselině v sekvenci id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  38. 38. Molekula DNA podle nároku 37, kde alanin je nahrazen valinem nebo threoninem.
  39. 39. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 212. aminokyselině v sekvenci id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množ99 9 9 99 9 9 ♦ · * · • · 9 · · 9 · 99
    9 9 9 9 9 9 9 999 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9
    999 9999 999 99 99 99
    204 ství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  40. 40. Molekula DNA podle nároku 39, kde glycin je nahrazen serinem.
  41. 41. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 466. aminokyselině v sekvenci id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  42. 42. Molekula DNA podle nároku 41, kde isoleucin je nahrazen threoninem.
  43. 43. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 369. aminokyselině v sekvenci id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  44. 44. Molekula DNA podle nároku 43, kde prolin je nahrazen serinem nebo histidinem.
  45. 45. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 226. aminokyselině • ·
    205 v sekvenci id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  46. 46. Molekula DNA podle nároku 45, kde threoninem nebo leucinem.
    alanin je nahrazen
  47. 47. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 517. aminokyselině v sekvenci id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  48. 48. Molekula DNA podle nároku 47, kde valin je nahrazen alaninem.
  49. 49. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 432. aminokyselině v sekvenci id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  50. 50. Molekula DNA podle nároku 49, kde tyrosin je nahrazen leucinem nebo isoleucinem.
    0 0
    0 9
    206
  51. 51. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 365. aminokyselině v sekvenci id. č. 16 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  52. 52. Molekula DNA podle nároku 51, kde prolin je nahrazen serinem.
  53. 53. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 428. aminokyselině v sekvenci id. č. 16 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
  54. 54. Molekula DNA podle nároku 53, kde tyrosin je nahrazen cysteinem nebo argininem.
  55. 55. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 449. aminokyselině v sekvenci id. č. 18 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
    « » · · ♦« · ♦ * · « ♦ « · · · · · ♦ «· • ♦ * · · · * «·♦< * • « · · · * · *
    999 «··· «·· ♦· ·*
    207
  56. 56. Molekula DNA podle nároku 55, kde tyrosin je nahrazen cysteinem, leucinem, isoleucinem, valinem nebo methioninem.
  57. 57. Molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, kde první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a kde druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udělovanou první aminokyselinovou substitucí .
  58. 58. Molekula DNA podle nároku 57, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
    I) polohu odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2,
    II) polohu odpovídající threoninu jako 249. aminokyselině v sekvenci id. č. 2,
    III) polohu odpovídající prolinu jako 118. aminokyselině v sekvenci id. č. 2,
    IV) polohu odpovídající asparaginu jako 425. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, a
    V) polohu odpovídající tyrosinu jako 498. aminokyselině v sekvenci id. č. 2.
  59. 59. Molekula DNA podle nároku 58, kde se první aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující í _ ...
    • ·
    208
    a) polohu odpovídaj ící alaninu j ako 164 . aminokyselině v sekvenci id. č. 6, b) polohu odpovídaj ící glycinu j ako 165. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, O polohu odpovídaj ící tyrosinu j ako 370 . ami nokys elíně v sekvenci id. č. 6, d) polohu odpovídaj ící cysteinu j ako 159. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, e) polohu odpovídaj ící isoleucinu j ako 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 ,
    f) polohu odpovídající valinu jako 356. aminokyselině v sek- věnci id. č. 10, g) polohu odpovídající šeřinu jako 421. věnci id. č. 10, aminokyselině v sek- h) polohu odpovídající valinu jako 502. věnci id. č. 10, aminokyselině v sek- i) polohu odpovídající alaninu jako v sekvenci id. č. 10, 211. aminokyselině k) polohu odpovídající glycinu jako v sekvenci id. č. 10, 212. aminokyselině 1) polohu odpovídající isoleucinu jako v sekvenci id. č. 10, 466. aminokyselině m) polohu odpovídající prolinu jako v sekvenci id. č. 12, 369. aminokyselině n) polohu odpovídající alaninu jako v sekvenci id. č. 12, 226. aminokyselině o) polohu odpovídající tyrosinu jako v sekvenci id. č. 12, 432. aminokyselině p) polohu odpovídající valinu jako v sekvenci id. č. 12, 517. aminokyselině
    • 99 * • 9 9· 99 9 · 9 9 9 9 9 • 9 9 999 9999 99 99 99 99 9 9 9 9 9 9 99 9 9 99 • 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 «9 99 209 q) polohu odpovídající tyrosinu j ako 428. aminokyselině v sekvenci id. č. 16, r) polohu odpovídající prolinu jako 365. aminokyselině v sekvenci id. č. 16, a s) polohu odpovídající tyrosinu j ako 449. ami noky s e 1 i ně v sekvenci id. č. 18. 60. Molekula DNA podle nároku 58, kde se první aminokyseli- nová substituce vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsa- huj ící a) polohu odpovídající alaninu j ako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, b) polohu odpovídající glycinu j ako 165. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, c) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, d) polohu odpovídající cysteinu jako 159. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, e) polohu odpovídající isoleucinu jako 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
  60. 61. Molekula DNA podle nároku 58, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2a první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahuj icí
    a) polohu odpovídající alaninu jako 164. v sekvenci id. č. 6,
    b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370 v sekvenci id. č. 6.
    aminokyselině aminokyselině • ·
    9 99
    99 9 ·
    9 9
    9 9 9
    9 9
    999 9999
    9 9 9 9 * • * 9 99
    9 9 *9-9 9 · • 9 9 9 «9 9 9
    210
  61. 62. Molekula DNA podle nároku 61, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 je nahrazen leucinem.
  62. 63. Molekula DNA podle nároku 58, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze odpovídající threoninu jako 249. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 a první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
    a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
    b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
  63. 64. Molekula DNA podle nároku 63, kde threonin vyskytující se v poloze odpovídající 249. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující isoleucin a alanin.
  64. 65. Molekula DNA podle nároku 58, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze odpovídající prolinu jako 118. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 a první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahuj ící
    a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
    b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
    • to • to •toto ««toto • to to· «to • toto • · ··
    211
  65. 66. Molekula DNA podle nároku 65, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 118. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 je nahrazen leucinem.
  66. 67. Molekula DNA podle nároku 58, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze odpovídající asparaginu jako 425. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 a první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahuj ící
    a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6, a
    b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
  67. 68. Molekula DNA podle nároku 67, kde asparagin vyskytující se v poloze odpovídající 425. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 je nahrazen serinem.
  68. 69. Molekula DNA podle nároku 58, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze odpovídající tyrosinu jako 498. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 a první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahuj ící
    a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. ě. 6, a
    b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
  69. 70. Molekula DNA podle nároku 69, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 498. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 je nahrazen cysteinem.
    • ··
    9· »9
    9 9 9 9 9 • 9 9··
    9 · 99 9 9 9 • 9 9 9 ·· ·9
    212
  70. 71. Molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 61 až 70, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující cystein, isoleucin, leucin, threonin, valin a methionin.
  71. 72. Molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 61 až 70, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující cystein, isoleucin, leucin, threonin a methionin.
  72. 73. Molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 61 až 70, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 164. aminokyselinovému zbytku v sekvenci id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující valin, threonin, leucin, cystein a tyrosin.
  73. 74. Molekula DNA podle nároku 60, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. zbytku v sekvenci id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující serin a leucin.
  74. 75. Molekula DNA podle nároku 60, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. zbytku v sekvenci id. č. 6 je nahrazen serinem.
  75. 76. Molekula DNA podle nároku 60, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající 159. zbytku v sekvenci id. č. 6 je skupiny obsahující feφφ φφ • φ φ φ φ φ φφ φφφφ φ φ · · φ · φ φ
    213 nahrazen aminokyselinou vybranou ze nylalanin a lysin.
  76. 77. Molekula DNA podle nároku 60, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající 159. zbytku v sekvenci id. č. 6 je nahrazen fenylalaninem.
  77. 78. Molekula DNA podle nároku 60, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. zbytku v sekvenci id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující threonin, histidin, glycin a asparagin.
  78. 79. Molekula DNA podle nároku 60, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. zbytku v sekvenci id. č. 6 je nahrazen threoninem.
  79. 80. Molekula DNA podle nároku 59, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 356. zbytku v sekvenci id. č. 10 je nahrazen leucinem.
  80. 81. Molekula DNA podle nároku 59, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 421. zbytku v sekvenci id. č. 10 je nahrazen prolinem.
  81. 82. Molekula DNA podle nároku 59, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 502. zbytku v sekvenci id. č. 10 je nahrazen alaninem.
  82. 83. Molekula DNA podle nároku 59, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 466. zbytku v sekvenci id. č. 10 je nahrazen threoninem.
    9 * • 9 9 9
    9 9
    214
  83. 84. Molekula DNA podle nároku 59, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 212. zbytku v sekvenci id. č. 10 je nahrazen serinem.
  84. 85. Molekula DNA podle nároku 59, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 211. zbytku v sekvenci id. č. 10 je nahrazen valinem nebo threoninem.
  85. 86. Molekula DNA podle nároku 59, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 369. zbytku v sekvenci id. č. 12 je nahrazen serinem nebo histidinem.
  86. 87. Molekula DNA podle nároku 59, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 226. zbytku v sekvenci id. č. 12 je nahrazen leucinem nebo threoninem.
  87. 88. Molekula DNA podle nároku 59, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 432. zbytku v sekvenci id. č. 12 je nahrazen leucinem nebo isoleucinem.
  88. 89. Molekula DNA podle nároku 59, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 517. zbytku v sekvenci id. č. 12 je nahrazen alaninem.
  89. 90. Molekula DNA podle nároku 59, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 428. zbytku v sekvenci id. č. 16 je nahrazen cysteinem nebo argininem.
    • · ·» 9 9
    9 9 9 9
    9 9 99 • 9 9 9 9
    9 9 9
    99 99
    215
  90. 91. Molekula DNA podle nároku 59, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 365. zbytku v sekvenci id. č. 16 je nahrazen serinem.
  91. 92. Molekula DNA podle nároku 59, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 449. zbytku v sekvenci id. č. 18 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující leucin, isoleucin, valin a methionin.
  92. 93. Molekula DNA podle nároku 57, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olej ku, rýži, čirok a Arabidopsis.
  93. 94. Molekula DNA podle nároku 57, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, sóju a Arabidopsis.
  94. 95. Molekula DNA podle nároku 57, kde rostlinná protox obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22 a 24.
  95. 96. Molekula DNA podle nároku 57, kde rostlinná protox obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 2, 4, 6, 8, 10, 12 a 18.
  96. 97. Chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině operativně spojený s heterologní molekulou DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny obsahující protox z pšenice, protox ze sóji, protox z bavlníku, protox z cukrové řepy, protox z řepky olejky, protox z rýže a protox z čiroku.
    ««« 9 00 *· ··
    0··· 00 00 0000 0 9 00000 00 « »0 00 00 00 00 0 00 000 000
    000 0000 »·0 ·· ··
    216
  97. 98. Chimérický gen podle nároku 97, kde heterologní molekula DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) je vybrána ze skupiny obsahující protox ze sóji a protox z pšenice.
  98. 99. Chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině operativně spojený s heterologní molekulou DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny obsahující protox z pšenice obsahující sekvenci id. č. 10, protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12, protox z bavlníku obsahující sekvenci id. č. 16, protox z cukrové řepy obsahující sekvenci id. č. 18, protox z řepky olejky obsahující sekvenci id. č. 20, protox z rýže obsahující sekvenci id. č. 22 a protox z čiroku obsahující sekvenci id. č. 24.
  99. 100. Chimérický gen podle nároku 99, kde protoporfyrinogenoxidáza (protox) je vybrána ze skupiny obsahující protox z pšenice obsahující sekvenci id. č. 10 a protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12.
  100. 101. Chimérický gen podle nároku 99 nebo 100, který navíc obsahuje signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, přičemž signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do chloroplastu.
  101. 102. Chimérický gen podle nároku 99 nebo 100, který navíc obsahuje signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, přičemž signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do mitochondrie.
    • 99 · 99 ·· ··
    99 9 9 99 · 9 9999
    9 9 99999 99 • 99 99 99 99 99 9
    99 999 999
    999 9999 999 99 99 99
    217
  102. 103. Chimérický gen obsahující promotor aktivní v rostlině operativně spojený s molekulou DNA podle kteréhokoliv z nároků 17 až 96.
  103. 104. Chimérický gen podle nároku 103, který navíc obsahuje signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, přičemž signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do chloroplastu nebo mitochondrie.
  104. 105. Chimérický gen obsahující promotor aktivní v rostlině operativně spojený s molekulou DNA podle nároku 57.
  105. 106. Chimérický gen podle nároku 105, který navíc obsahuje signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, přičemž signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do chloroplastu.
  106. 107. Chimérický gen podle nároku 105, který navíc obsahuje signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, přičemž signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do mitochondrie.
  107. 108. Rekombinantní vektor, který obsahuje chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 97 až 107, přičemž tento vektor je schopen být trvale vložen (transformován) do hostitelské buňky.
  108. 109. Rekombinantní vektor, který obsahuje chimérický gen podle nároku 105, přičemž tento vektor je schopen být trvale vložen (transformován) do hostitelské buňky.
    ·· 99 ·· • 9 9 9 9 9
    9 · 9 * 99
    9 99 9999 *
    9 * 9 9 9 *9 9* 9*
    218
  109. 110. Hostitelská buňka trvale transformovaná vektorem podle kteréhokoliv z nároků 108 nebo 109, přičemž tato hostitelská buňka je schopna exprimovat uvedenou molekulu DNA.
  110. 111. Hostitelská buňka podle nároku 110, která je vybrána ze skupiny obsahující rostlinnou buňku, bakteriální buňku, kvasinkovou buňku a hmyzí buňku.
  111. 112. Rostlina nebo rostlinná buňka včetně jejich potomstva, obsahující molekulu DNA podle nároku 17 nebo 57, přičemž tato molekula DNA je exprimována v rostlině a uděluje jí toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox.
  112. 113. Rostlina obsahující molekulu DNA podle nároku 17 nebo 57, přičemž tato molekula DNA je exprimována v rostlině a uděluje ji toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox.
  113. 114. Rostlina nebo rostlinná buňka včetně jejich potomstva podle nároku 112, kde molekula DNA nahrazuje odpovídající přirozeně se vyskytující sekvenci kódující protox.
  114. 115. Rostlina podle nároku 112, kde molekula DNA nahrazuje odpovídající přirozeně se vyskytující sekvenci kódující protox.
  115. 116. Rostlina nebo rostlinná buňka včetně jejich potomstva, obsahující chimérický gen podle nároku 103 nebo 105, přičemž tento chimérický gen uděluje toleranci k herbicidu v množ• ·· ·· · · • · • · · • · ··· ···· • ·· ·· ·· ·· · · · · · · • · · · · ·· • · · 9 ··· · · • · · · · · ··· ·♦ ·· ··
    219 ství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox.
  116. 117. Rostlina obsahující chimérický gen podle nároku 103 nebo 105, přičemž tento chimérický gen uděluje toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox.
  117. 118. Rostlina podle nároku 112 nebo 113 která je vybrána ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovník lékařský (tj. cukrovou třtinu), sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a rýži.
  118. 119. Rostlina podle nároku 112 nebo 113 která je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy, rýži, sóju, bavlník, tabák, cukrovou řepu a řepku olejku.
  119. 120. Způsob omezení růstu nežádoucí vegetace, vyznačující se tím, že se na populaci rostlin podle kteréhokoliv z nároků 112 až 119 aplikuje účinné množství herbicidu inhibujícího protox.
  120. 121. Způsob podle nároku 120, vyznačující se tím, že rostlina je vybrána ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovník lékařský (tj . cukrovou třtinu), sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a rýži.
    220
  121. 122. Způsob podle nároku 120, vyznačující se tím, že rostlina je vybrána ze skupiny obsahující sóju, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olej ku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy, Arabidopsis a rýži.
  122. 123. Způsob podle nároku 121 nebo 122 vyznačující se tím, že herbicid inhibující protox se vybere ze skupiny obsahující aryluracil, difenyléter, oxidiazol, imid, fenylpyrazol, derivát pyridinu,
    2-aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazol substituovaný v poloze 3, fenopylát a jeho O-fenylpyrrolidinové a piperidinokarbamátové analogy.
  123. 124. Způsob podle nároku 123, v y z n tím, že herbicid inhibující protox je ačující se imid podle obecného vzorce V (V) kde Q je jedna ze skupin podle následujících vzorců (VI) (VII)
    221 (VIII) (IX) (IXa) (IXb) a kde R2 je H, Cl nebo F, R2 je Cl a R3 je optimálně substituovaný éter, thioéter, ester, aminová skupina nebo alkylová skupina, přičemž R2 a R3 dohromady mohou tvořit pěti- nebo šestičlenný heterocyklický kruh, nebo skupina podle následujícího vzorce Vila E
    222
  124. 125. Způsob podle nároku 124, vyznačující se tím, že imid se vybere ze skupiny obsahující
    Cl c|-y
    CWjSC^NH //
    N 'n (X) (XI) (XII) (XIII) (xiv) (XV)
    223 (XVI) (XVII) a kde R je (alkenyloxy)karbonylalkylová skupina, přičemž alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku a alkylová skupina obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku.
  125. 126. Způsob podle nároku 120, vyznačující se tím, že se užije herbicid inhibující protox, který má vzorec vybraný ze skupiny obsahující (XVIII)
    O (xix) (XX)
    224 (XXI) cf3 ,no2 (XXIa) a vzorec XXII.
  126. 127. Způsob přípravy rostlin, rostlinných pletiv a semen rostlin, vyznačující se tím, že rostliny, rostlinná pletiva a semena produkují formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru.
    225
  127. 128. Způsob přípravy hostitelské buňky obsahující izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) aktivitou, vyznačuj ící se t i m, že hostitelská buňka se transformuje molekulou rekombinantního vektoru podle nároku 108 nebo 109.
  128. 129. Způsob přípravy rostlinné buňky obsahující izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) aktivitou, vyznačuj ící se tím, že rostlinná buňka se transformuje molekulou rekombinantního vektoru podle nároku 108 nebo 109.
  129. 130. Způsob přípravy transgenního potomstva transgenních rodičovských rostlin, obsahujícího izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) aktivitou, vyznačující se tím, že rodičovská rostlina se transformuje molekulou rekombinantního vektoru podle nároku 105 nebo 106 a přenos znaku tolerance k herbicidu na potomstvo této transgenní rodičovské rostliny zahrnuje známé způsoby šlechtění rostlin.
  130. 131. Způsob přípravy molekuly DNA obsahující úsek DNA kódující protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) aktivitou, vyznačující se tím, že se
    a) připraví nukleotidová sonda schopná specifické hybridizace s rostlinným protox genem nebo mRNA, přičemž tato sonda obsahuje souvislý úsek sekvence kódující rostlinný protox protein dlouhý alespoň 10 nukleotidů,
    b) vyhledává další protox kódující sekvence v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo fragmentů cDNA z vybraného organismu pomocí nukleotidové sondy podle kroku a),
    226
    c) izoluje a namnoží molekula DNA obsahující úsek DNA kódující protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) aktivitou.
  131. 132. Způsob izolace molekuly DNA z kterékoliv rostliny obsahující úsek DNA kódující protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) aktivitou, vyznačující se tím, že se
    a) připraví nukleotidová sonda schopná specifické hybridizace s rostlinným protox genem nebo mRNA, přičemž tato sonda obsahuje souvislý úsek sekvence kódující rostlinný protox protein dlouhý alespoň 10 nukleotidů,
    b) vyhledává další protox kódující sekvence v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo fragmentů cDNA z vybraného organismu pomocí nukleotidové sondy podle kroku a) ,
    c) izoluje molekula DNA obsahující úsek DNA kódující protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) aktivitou.
  132. 133. Zemědělský způsob, vyznačující se tím, že se užije transgenní rostlina nebo její potomstvo obsahující chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 96 až 104 v množství, které je dostatečné k tomu, aby se exprimovala k herbicidu rezistentní forma cílového proteinu herbicidu v rostlině a tím rostlina získala toleranci k herbicidu.
  133. 134. Způsob přípravy rostlin, rostlinných pletiv, semen rostlin a částí rostlin, produkujících formu rostlinného protox enzymu rezistentní k inhibitoru, vyznačující se tím, že rostliny, rostlinná pletiva, semena rostlin a části rostlin byly trvale trans• · • ·
    227 formovány strukturním genem kódujícím rezistentní enzym protox.
  134. 135. Způsob přípravy rostlin, rostlinných pletiv, semen rostlin a částí rostlin podle nároku 134 vyznačující se tím, že rostliny, rostlinná pletiva, semena rostlin a části rostlin byly trvale transformovány DNA podle kteréhokoliv z nároků 57 až 96.
  135. 136. Způsob přípravy rostlin, rostlinných pletiv, semen rostlin a částí rostlin, produkujících formu rostlinného protox enzymu rezistentní k inhibitoru, vyznačující se tím, že rostliny, rostlinná pletiva, semena rostlin a části rostlin byly připraveny způsoby přímé selekce, při nichž se k herbicidu rezistentní linie izolují, charakterizují a vyvíjejí.
  136. 137. Použití sekvence kódující protox jako sondy, přičemž tato sekvence sdílí dostatečnou homologii k tomu, aby hybridi zovala se sekvencí kódující protox spojenou s vybraným promotorem.
  137. 138. Použití nukleotidové sondy schopné specificky hybridizovat s rostlinným genem protox nebo mRNA v polymerázové řetězové reakci (PCR), přičemž tato sonda je dlouhá alespoň 10 nukleotidů.
  138. 139. Způsob přípravy v podstatě čisté sekvence DNA kódující protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) enzymovou aktivitou, vyznačující se tím, že se • ··
    228
    a) připraví genomová nebo cDNA knihovna z vhodného zdrojového organismu pomocí vhodného vektoru,
    b) knihovna hybridizuje s molekulou sondy,
    c) identifikují pozitivní hybridizace sondy s DNA klony z knihovny, tj. s klony potenciálně obsahujícími nukleotidovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci protoporfyrinogenoxidázy (protox).
  139. 140. Způsob přípravy v podstatě čisté sekvence DNA kódující protein s protoporfyrinogenoxidázovou (protox) enzymovou aktivitou, vyznačující se tím, že se
    a) připraví celková DNA z genomové nebo cDNA knihovny
    b) DNA z kroku a) použije jako templát v PCR reakci s příměry představujícími úseky aminokyselinové sekvence protoporfyrinogenoxidázy (protox) s nízkou degenerací.
  140. 141. Způsob testování pro identifikaci inhibitorů protoporfyrinogenoxidázové (protox) enzymové aktivity, vyznačující se tím, že se
    a) inkubuje první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát,
    b) měří neinhibovaná reaktivita protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku a),
    c) inkubuje první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát v přítomnosti druhého vzorku obsahujícího inhibující sloučeninu,
    d) měří neinhibovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku c),
    e) porovná inhibovaná a neinhibovaná reaktivita protoporfyrinogenoxidázy (protox).
    • ····
    99 ·· Μ • · · 9 9 ·
    99 9 9 99 • 9 9 999 9 9
    9 9 9 9 ·
    99 ·· ··
    229
  141. 142. Způsob testování pro identifikaci mutantů protoporfyrinogenoxidázy (protox) rezistentních k inhibitoru, vyznačujícíse tím, že se
    a) inkubuje první vzorek enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) a jeho substrát v přítomnosti druhého vzorku obsahujícího inhibitor enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox),
    b) měří nemutovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku a) ,
    c) inkubuje první vzorek mutovaného enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) a jeho substrát v přítomnosti druhého vzorku obsahujícího inhibitor enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox),
    d) měří mutovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku c),
    e) porovná mutovaná a nemutovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
  142. 143. Inhibitor enzymu protox, který byl získán způsobem podle nároku 141 nebo 142.
  143. 144. Rostlina nebo rostlinná buňka včetně jejich potomstva, které obsahují DNA molekuly podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 .
  144. 145. Izolovaná molekula DNA kódující enzym protox z pšenice, přičemž tato molekula DNA má nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí id. č. 9 za následujících hybridizačních a promývacích podmínek:
    a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
    b) promývání ve 2xSSC, 1% SDS při 50 °C.
    • 99 • 9 9 99 99 9999 9 • 9 9·· 999
    999 9999 999 99 99 99
    230
  145. 146. Izolovaná molekula DNA kódující enzym protox ze sóji, přičemž tato molekula DNA má nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí id. č. 11 za následujících hybridizačnich a promývacích podmínek:
    a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
    b) promývání ve 2xSSC, 1% SDS při 50 °C.
  146. 147. Izolovaná molekula DNA kódující enzym protox z bavlníku, přičemž tato molekula DNA má nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí id. č. 15 za následujících hybridizačnich a promývacích podmínek:
    a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a 7b) promývání ve 2xSSC, 1% SDS při 50 °C.
  147. 148. Izolovaná molekula DNA kódující enzym protox z cukrové řepy, přičemž tato molekula DNA má nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí id. č. 17 za následujících hybridizačnich a promývacích podmínek:
    a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
    b) promývání ve 2xSSC, 1% SDS při 50 °C.
  148. 149. Izolovaná molekula DNA kódující enzym protox z řepky olejky, přičemž tato molekula DNA má nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí id. č. 19 za nás*£ ledujících hybridizačnich a promývacích podmínek:
    a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a » ·« 9 99 *9 99 «·· 9 999 9 9 99 9
    Z · 9 9 9 9 9 ·· » · * »«······· • 9 *99 .999
    999 ···· ··· ·♦ ·· ··
    231
    b) promývání ve 2xSSC, 1% SDS při 50 °C.
  149. 150. Izolovaná molekula DNA kódující enzym protox z rýže, přičemž tato molekula DNA má nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí id. č. 21 za následujících hybridizačních a promývacích podmínek:
    a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
    b) promývání ve 2xSSC, 1% SDS při 50 °C.
  150. 151. Izolovaná molekula DNA kódující enzym protox z čiroku, přičemž tato molekula DNA má nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí id. č. 23 za následujících hybridizačních a promývacích podmínek:
    a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
    b) promývání ve 2xSSC, 1% SDS při 50 °C.
  151. 152. Chimérický gen obsahující promotor aktivní v rostlině operativně spojený s izolovanou molekulou DNA podle kteréhokoliv z nároků 145 až 151.
  152. 153. Rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle nároku 152, přičemž tento vektor je schopen být trvale transformován (vložen) do hostitelské buňky.
  153. 154. Hostitel trvale transformovaný rekombinantním vektorem podle nároku 153, přičemž tento hostitel je schopen exprimovat enzym protox.
    232
    9« · 9« ·· ··
    9 99 99 9999
    9 9 9 9 9 9 *«
    9 9 *9 *9 9999 «
    9 9 9 9 9 9 «
    999 99 999 99 99
  154. 155. Hostitel podle nároku 155, kterým je rostlina nebo rostlinná buňka včetně jejich potomstva.
  155. 156. Chimérický gen obsahující rostlinný plastidový promotor operativně spojený s izolovanou molekulou DNA podle nároku
    1.
  156. 157. Chimérický gen podle nároku 156, kde rostlinný plastidový promotor je promotor genu clpP.
  157. 158. Chimérický gen podle nároku 156, který dále obsahuje 5'-netranslatovanou sekvenci (5'UTR) z plastidového promotoru a 3'-netranslatovanou sekvenci (3'UTR)) plastidového genu operativně spojené s izolovanou molekulou DNA.
  158. 159. Chimérický gen podle nároku 158, kde rostlinný plastidový promotor je promotor genu clpP a kde 3UTR je 3'netranslatováný úsek plastidového genu rpsl6.
  159. 160. Plastidový transformační vektor obsahující chimérický gen podle nároku 156 nebo 158.
  160. 161. Rostlinný plastíd transformovaný plastidovým transformačním vektorem podle nároku 160, přičemž rostlinný enzym protox je exprimován v rostlinném plastidu.
  161. 162. Chimérický gen, který obsahuje promotor rostlinného plastidu operativně spojený s izolovanou molekulou DNA podle nároku 17 nebo 57.
    233 « 4 4 4 4 4 4 44
    4 « 4 4 4 4 4 444 4 4
    44 444 444
    444 4444 444 »4 44 44
  162. 163. Chimérický gen podle nároku 162, kde rostlinný plastidový promotor je promotor genu clpP.
  163. 164. Chimérický gen podle nároku 162, který dále obsahuje 5'-netranslatovanou sekvenci (5'UTR) z plastidového promotoru a 3'-netranslatovanou sekvenci (3'UTR)) plastidového genu operativně spojené s izolovanou molekulou DNA.
  164. 165. Chimérický gen podle nároku 164, kde rostlinný plastidový promotor je promotor genu clpP a kde 3'UTR je 3'-netranslatovaný úsek plastidového genu rpsl6.
  165. 166. Plastidový transformační vektor obsahující chimérický gen podle nároku 162 nebo 164.
  166. 167. Rostlinný plastid transformovaný piastidovým transformačním vektorem podle nároku 166, přičemž modifikovaný rostlinný enzym protox je exprimován v rostlinném plastidu.
  167. 168. Rostlina nebo rostlinná buňka včetně jejich potomstva obsahující rostlinný plastid podle nároku 167, kde modifikovaný rostlinný enzym protox je exprimován v této rostlině a uděluje jí toleranci k herbicidu v množstvích, která inhibu jí aktivitu přirozeně se vyskytující protox.
CZ0272698A 1996-02-28 1997-02-27 Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru CZ297325B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1270596P 1996-02-28 1996-02-28
US1361296P 1996-02-28 1996-02-28
US2000396P 1996-06-21 1996-06-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ272698A3 true CZ272698A3 (cs) 1998-12-16
CZ297325B6 CZ297325B6 (cs) 2006-11-15

Family

ID=27359690

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0272698A CZ297325B6 (cs) 1996-02-28 1997-02-27 Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru
CZ982727A CZ272798A3 (cs) 1996-02-28 1997-02-27 Promotory rostlinných protoporfyrinogenoxidázových genů

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ982727A CZ272798A3 (cs) 1996-02-28 1997-02-27 Promotory rostlinných protoporfyrinogenoxidázových genů

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6018105A (cs)
EP (2) EP0883682A1 (cs)
JP (2) JP2000506011A (cs)
KR (2) KR100493500B1 (cs)
CN (2) CN1175107C (cs)
AU (2) AU724838B2 (cs)
BR (2) BR9707769A (cs)
CA (2) CA2247797A1 (cs)
CZ (2) CZ297325B6 (cs)
HU (2) HUP9901044A3 (cs)
PL (3) PL187094B1 (cs)
UA (1) UA70912C2 (cs)
WO (2) WO1997032011A1 (cs)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
WO1997004088A1 (en) 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene
WO1998029554A1 (en) * 1996-12-27 1998-07-09 Sumitomo Chemical Co., Ltd. Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation
ZA98371B (en) * 1997-01-31 1999-07-16 Du Pont Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides.
AU741013B2 (en) * 1997-09-11 2001-11-22 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to light-requiring herbicides
US6362398B1 (en) 1998-03-11 2002-03-26 Syngenta Participations Ag ClpP plastid promoter sequence
JP2002505883A (ja) * 1998-03-11 2002-02-26 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 新規植物色素体プロモーター配列
AU769868B2 (en) 1998-04-10 2004-02-05 Sumitomo Chemical Company, Limited A method for evaluating the ability of a compound to inhibit the protoporphyrinogen oxidase activity
US6906245B1 (en) 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
JP4788011B2 (ja) * 1998-04-30 2011-10-05 住友化学株式会社 雑草防除剤耐性の付与方法
AU753020B2 (en) * 1998-04-30 2002-10-03 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for giving resistance to weed control compounds to plants
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US6492578B1 (en) * 1998-07-10 2002-12-10 Calgene Llc Expression of herbicide tolerance genes in plant plastids
ATE354660T1 (de) * 1998-07-10 2007-03-15 Calgene Llc Expression von herbizidtoleranzgenen in pflanzenplastiden
KR20010086009A (ko) * 1998-11-10 2001-09-07 릴리 엠 씨즐러 스피허, 아네뜨 워너 제초제 조성물
RU2240001C2 (ru) * 1998-11-10 2004-11-20 Зингента Партисипейшнс Аг Гербицидная композиция и способ борьбы с нежелательной растительностью в посевах культурных растений с использованием этой композиции
GB9828201D0 (en) * 1998-12-21 1999-02-17 Zenco No 4 Ltd Genetic modification of compositae
AU6277600A (en) * 1999-07-27 2001-02-13 Syngenta Participations Ag Novel chimeric genes
CA2381927A1 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 Syngenta Participations Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase
US6617498B1 (en) * 1999-09-03 2003-09-09 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Inducible promoters
CA2382658A1 (en) * 1999-10-11 2001-04-19 Sung-Beom Lee Process for increasing crop yield or biomass using protoporphyrinogen oxidase gene
JP4821036B2 (ja) * 1999-10-29 2011-11-24 住友化学株式会社 除草剤耐性植物
AU2156901A (en) * 1999-11-16 2001-05-30 Basf Plant Science Gmbh Production of plants which are resistant against peroxidising inhibitors of protoporphyrinogen ix oxidase
CN100425701C (zh) 1999-12-16 2008-10-15 孟山都技术有限公司 新型植物表达构建物
AU2001260114A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-24 Syngenta Participations Ag Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US6713259B2 (en) * 2000-09-13 2004-03-30 Monsanto Technology Llc Corn event MON810 and compositions and methods for detection thereof
AR037413A1 (es) * 2001-11-27 2004-11-10 Valent Biosciences Corp Composicion herbicida intensificada
EP2078753A3 (en) 2002-12-26 2010-12-15 Syngenta Participations AG Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
ATE495264T1 (de) 2003-10-06 2011-01-15 Syngenta Participations Ag In pflanzenplastiden funktionsfähiger promotor
BRPI0508518A (pt) 2004-03-08 2007-08-14 Syngenta Participations Ag proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina
JP4720223B2 (ja) * 2004-05-18 2011-07-13 住友化学株式会社 除草活性化合物耐性植物
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
US9347046B2 (en) 2009-01-22 2016-05-24 Syngenta Participations Ag Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
AU2010206619A1 (en) 2009-01-22 2011-07-28 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
MX2011007889A (es) 2009-02-06 2011-08-15 Syngenta Participations Ag Modificacion de enzima multidominio para la expresion en plantas.
UA112969C2 (uk) * 2010-08-03 2016-11-25 Сібас Юс Ллс Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх)
JP2012056817A (ja) * 2010-09-10 2012-03-22 Kochi Univ Of Technology 単細胞藻類の細胞破砕液を利用したアミノ酸含有有機液肥
WO2012080975A1 (en) * 2010-12-16 2012-06-21 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
CN104107437B (zh) * 2013-06-09 2015-08-26 厦门成坤生物技术有限公司 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法
US10087460B2 (en) 2013-08-12 2018-10-02 BASF Agro B.V. Transgenic or non-transgenic plants with mutated protoporphyrinogen oxidase having increased tolerance to herbicides
AU2014307664A1 (en) * 2013-08-12 2016-02-18 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides (PPO)
AU2016280215B2 (en) 2015-06-17 2022-07-28 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
CN111423990B (zh) * 2020-04-10 2021-08-27 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法
IL302776A (en) 2020-11-24 2023-07-01 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CN118956784A (zh) * 2021-04-02 2024-11-15 青岛清原种子科学有限公司 对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽及应用
CN115247157A (zh) * 2021-04-02 2022-10-28 青岛清原化合物有限公司 对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽及应用
JP2024514827A (ja) 2021-04-07 2024-04-03 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 除草化合物
CN115340987B (zh) * 2021-05-12 2023-12-01 北京大北农生物技术有限公司 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
US20250212879A1 (en) 2022-03-11 2025-07-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2023185306A1 (zh) * 2022-03-29 2023-10-05 青岛清原化合物有限公司 对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo2多肽及应用
IL292199B2 (en) 2022-04-12 2024-02-01 Plantarc Bio Ltd Method for optimizing gene expression levels in plants
CN119233967A (zh) 2022-05-20 2024-12-31 先正达农作物保护股份公司 除草化合物
AR129821A1 (es) 2022-07-13 2024-10-02 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
AU2024225839A1 (en) 2023-02-24 2025-08-07 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
CN120676860A (zh) 2023-02-24 2025-09-19 先正达农作物保护股份公司 除草组合物
CN120752221A (zh) 2023-03-17 2025-10-03 先正达农作物保护股份公司 除草三嗪衍生物
WO2025016884A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2025016885A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
CN120230766B (zh) * 2025-05-29 2025-08-26 隆平生物技术(海南)有限公司 耐除草剂基因ppo的变体及其编码蛋白和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0360750A3 (en) * 1988-09-22 1991-01-02 Ciba-Geigy Ag Novel herbicide tolerant plants
CN1039283C (zh) * 1988-12-12 1998-07-29 Fmc公司 卟啉的应用
NZ231658A (en) * 1988-12-12 1992-05-26 Fmc Corp Inhibitors of protoporphyrinogen oxidase and compositions for killing tumour cells
US5086169A (en) * 1989-04-20 1992-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Isolated pollen-specific promoter of corn
US5451513A (en) * 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
ES2149758T3 (es) * 1990-05-18 2000-11-16 Mycogen Plant Science Inc Promotor recombinante para la expresion de genes en monocotiledoneas.
IL98405A0 (en) * 1990-06-11 1992-07-15 Fmc Corp Pharmaceutical compositions containing enzyme inhibiting agents
US5290926A (en) * 1990-09-14 1994-03-01 Ciba-Geigy Corporation Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase
ES2123269T5 (es) * 1994-06-14 2002-11-01 Neurocrine Biosciences Inc Receptores del factor 2 de liberacion de corticotropina.
US5767373A (en) * 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
WO1997004088A1 (en) * 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene
NZ315226A (en) * 1995-08-10 1999-04-29 Univ Rutgers Nuclear-encoded transcription system in plastids of higher plants

Also Published As

Publication number Publication date
BR9707769A (pt) 1999-07-27
EP0883682A1 (en) 1998-12-16
HUP9901044A3 (en) 2001-11-28
CN1212725A (zh) 1999-03-31
BR9707783A (pt) 1999-07-27
PL328617A1 (en) 1999-02-01
PL187094B1 (pl) 2004-05-31
KR19990087454A (ko) 1999-12-27
PL187545B1 (pl) 2004-07-30
CA2247074A1 (en) 1997-09-04
CZ272798A3 (cs) 1998-11-11
US6018105A (en) 2000-01-25
CN1175107C (zh) 2004-11-10
HUP9901044A2 (hu) 1999-07-28
AU2065497A (en) 1997-09-16
HUP9900623A2 (hu) 1999-06-28
CZ297325B6 (cs) 2006-11-15
HUP9900623A3 (en) 2001-11-28
KR19990087356A (ko) 1999-12-27
KR100493500B1 (ko) 2006-09-20
AU724893B2 (en) 2000-10-05
JP2000506011A (ja) 2000-05-23
JP3961570B2 (ja) 2007-08-22
PL328651A1 (en) 1999-02-15
WO1997032011A1 (en) 1997-09-04
AU1984697A (en) 1997-09-16
UA70912C2 (uk) 2004-11-15
AU724838B2 (en) 2000-09-28
EP0885305A1 (en) 1998-12-23
WO1997032028A1 (en) 1997-09-04
CN1212724A (zh) 1999-03-31
CA2247797A1 (en) 1997-09-04
JP2000506724A (ja) 2000-06-06
HU9901044D0 (en) 1999-06-28
CA2247074C (en) 2008-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU724893B2 (en) DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US6308458B1 (en) Herbicide-tolerant plants and methods of controlling the growth of undesired vegetation
US6808904B2 (en) Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling
US5939602A (en) DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US20020073443A1 (en) Herbicide tolerance achieved through plastid transformation
US6288306B1 (en) Methods of selecting plants, plant tissue or plant cells resistant to a protoporphyrinogen oxidase inhibitor
CA2381927A1 (en) Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase
WO2001068826A2 (en) Protoporphyrinogen oxidase (&#39;protox&#39;) genes
US6023012A (en) DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20100227