CZ297325B6 - Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru - Google Patents

Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru Download PDF

Info

Publication number
CZ297325B6
CZ297325B6 CZ0272698A CZ272698A CZ297325B6 CZ 297325 B6 CZ297325 B6 CZ 297325B6 CZ 0272698 A CZ0272698 A CZ 0272698A CZ 272698 A CZ272698 A CZ 272698A CZ 297325 B6 CZ297325 B6 CZ 297325B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protox
amino acid
seq
position corresponding
plant
Prior art date
Application number
CZ0272698A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ272698A3 (cs
Inventor
L. Volrath@Sandra
A. Johnson@Marie
L. Potter@Sharon
R. Ward@Eric
B. Heifetz@Peter
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of CZ272698A3 publication Critical patent/CZ272698A3/cs
Publication of CZ297325B6 publication Critical patent/CZ297325B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Resení poskytuje nové sekvence kódující rostlinnýenzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) ze sóji, psenice, bavlníku, cukrové repy, repky olejky, rýze a ciroku. Krome toho popisuje modifikované formyenzymu protox, které jsou rezistentní k herbicidu. Vynález také poskytuje rostliny, které exprimujímodifikovaný enzym protox a jsou proto rezistentní nebo tolerantní k herbicidu. Rezistence nebo tolerance k inhibitorum protox muze do techto rostlinbýt vnesena bud mutací nativního genu protox na rezistentní formu, nebo mohou být rostliny transformovány genem kódujícím formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru.

Description

(57) Anotace:
Řešení poskytuje nové sekvence kódující rostlinný enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) ze sóji, pšenice, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže a čiroku. Kromě toho popisuje modifikované formy enzymu protox, které jsou rezistentní k herbicidu. Vynález také poskytuje rostliny, které exprimují modifikovaný enzym protox ajsou proto rezistentní nebo tolerantní k herbicidu. Rezistence nebo tolerance k inhibitorům protox může do těchto rostlin být vnesena buď mutací nativního genu protox na rezistentní formu, nebo mohou být rostliny transformovány genem kódujícím formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru.
O) CM
N O
Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru
Oblast techniky
Vynález se obecně týká rostlinného enzymu protoporfyrinogenoxidázy („protox“). Zvláště se vynález týká molekuly DNA kódující tento enzym a jeho modifikované formy rezistentní k inhibitoru. Vynález se dále týká způsobů selekce tkáňových kultur a aplikace herbicidů, které jsou založeny na těchto modifikovaných formách.
Dosavadní stav techniky
I. Enzym protoporfyrinogenoxidáza (protox) a jeho účast v biosyntéze chlorofylu/hemu
Biosyntetické cesty vedoucí k tvorbě chlorofylu a hernu sdílejí řadu společných kroků. Chlorofyl je světlosběmý pigment přítomný ve všech zelených fotosyntetických organismech. Hem je kofaktor hemoglobinu, cytochromů, oxygenáz P450 se smíšenou funkcí, peroxidáz a kataláz (viz např. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York, 1975), a je proto nepostradatelnou složkou všech aerobních organismů.
Poslední společný krok v biosyntéze chlorofylu a hernu je oxidace protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX. Protoporfyrinogenoxidáza (nadále označovaná jako „protox“) je enzym, který katalyzuje tento poslední krok (Matringe et al., Biochem J. 260: 231, 1989).
Enzym protoporfyrinogenoxidáza byl purifikován, buďto částečně nebo úplně, z mnoha různých organismů včetně kvasinek Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois a Labbe, Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, ed., McGraw Hill, New York, s. 235-285, 1990), etioplastů ječmene (Jacobs a Jacobs, Biochem J. 244: 219, 1987) a myších jater (Dailey a Karr, Biochem. 26: 2697, 1987). Geny kódující protox byly izolovány ze dvou prokaryotických organismů, a sice Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155, 1993) a Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813, 1994). Tyto geny nemají žádnou podobnost v sekvencích a ani proteinové produkty predikované na jejich základě nesdílejí žádnou identickou sekvenci aminokyselin. Protein z E. Coli]e velký asi 21 kDa a je asociován s buněčnou membránou. Protein z B. subtilis je velký asi 51 kDa, je rozpustný a aktivní je v cytoplazmě.
cDNA kódující lidskou protox byla v nedávné době izolována (Nishimura et al., J. Biol. Chem. 270(14): 8076-8080, 1995) a také byla izolována rostlinná cDNA (Mezinárodní patentová přihláška PCT/IB95/00452, podaná 8. června 1995, publikovaná 21. prosince 1995 jako WO 95/34659).
II. Gen protox jako cíl herbicidů
Použití herbicidů k omezení nežádoucí vegetace jako jsou plevely nebo jiné nežádoucí rostliny v plodinách se stalo univerzální praxí. Odpovídající trh představuje ročně více než miliardu dolarů. I přes toto extenzivní využívání, kontrola plevelů představuje pro zemědělce významný a často finančně náročný problém.
Efektivní využití herbicidů vyžaduje dobrý management. Např. vhodná doba a způsob aplikace, a také vývojové stadium plevelu, jsou kritické faktory pro účinnou kontrolu plevele užitím herbicidů. Vzhledem k tomu, že některé plevely jsou rezistentní k herbicidům, výroba účinných herbicidů je stále důležitější.
-1 CZ 297325 B6
Naneštěstí herbicidy, které mají největší potenciál, širší druhové spektrum a rychlejší degradaci v půdě, mohou být také nejvíce fytotoxické pro plodiny. Jedno řešení tohoto problému bylo vyvinutí plodin rezistentních nebo tolerantních k herbicidům. Hybridi nebo variety plodin rezistentní k herbicidům umožňují použití herbicidů bez rizika poškození plodiny. Vývoj rezistence umožňuje také použití herbicidů i tam, kde to dříve nebylo možné nebo to bylo možné jen omezeně (např. použití před vzcházením) vzhledem k citlivosti plodiny k herbicidu. Např. US patent 4 761 373 Andersona et al. popisuje rostliny rezistentní k různým imidazolinonovým nebo sulfonamidovým herbicidům. Rezistence je způsobena změněným enzymem syntázou acetohydroxykyseliny (AHAS). US patent 4 975 374 Goodmana et al. se týká rostlinných buněk a rostlin obsahujících gen kódující mutovanou glutaminsyntetázu (GS) rezistentní k inhibicí herbicidy, které jsou známy tím, že inhibují GS, jako je např. fosfinotricin nebo methioninsulfoximin. US patent 5 013 659 Bedbrooka et al. se týká rostlin, které exprimují mutovanou acetolaktátsyntázu, která udílí rostlinám rezistenci k inhibicí sulfonylmočovinovými herbicidy. US patent 5 162 602 Somerse et al. popisuje rostliny tolerantní k inhibicí herbicidy založenými na cyklohexandionu a kyselině aryloxyfenoxypropanové. Tolerance je udílena změněnou acetylkoenzym-A-karboxylázou (ACCase).
Enzym protox slouží jako cíl mnoha různých herbicidních sloučenin. Herbicidy, které inhibují protox, zahrnují molekuly mnoha různých strukturních tříd (Duke et al., Weed Sci. 39: 465, 1991, Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193, 1992, Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35, 1989, Yanase a Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70, 1989). Tyto herbicidní sloučeniny zahrnují difenylétery (např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina a její methylester, oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-etoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifliiorobenzen)), oxidiazoly (např. Oxidiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(l-methyletoxy)fenyl]-5-(l,l-dimethylethyl)-l,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on, cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid, chloroftalim, N-(4-chlorofenyl)3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylpyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl-2-[l-(2,3,4-trichlorfenyl)4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionát, M&B 39279), pyridinové deriváty (např. LS 82-556), fenopylát a jeho O-fenylpyrollidinové a piperidinokarbamátové analogy. Mnohé z těchto sloučenin kompetitivně inhibují normální reakci katalyzovanou enzymem, působí tedy zjevně jako analogy substrátu.
Inhibiční vliv na protox se typicky určuje měřením fluorescence v oblasti 622 až 635 nm, po excitaci v pásmu 395 až 410 nm (Jacobs a Jacobs, Enzyme 28: 206, 1982, Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280, 1991). Tento test je založen na skutečnosti, že protoporfyrin IX je fluorescenční pigment, zatímco protoporfyrinogen IX není.
Předpokládaný způsob působení herbicidů inhibujících protox zahrnuje akumulaci protoporfyrinogenu IX v chloroplastu. Předpokládá se, že tato akumulace vede k pronikání protoporfyrinogenu IX do cytosolu, kde je oxidován peroxidázovou aktivitou na protoporfyrin IX. Pokud je vystaven světlu, protoporfyrin IX může způsobovat tvorbu singletního kyslíku v cytosolu. Singletní kyslík může zase vést k tvorbě dalších reaktivních molekul kyslíku, což může způsobovat peroxidaci lipidů a popraskání membrán, vedoucí až k rychlé buněčné smrti (Lee et al., Plant Physiol. 102: 881, 1993).
Všechny enzymy protox nejsou citlivé k herbicidům, které inhibují rostlinný enzym protox. Jak protox kódovaná geny izolovanými zEscherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155, 1993) tak i z Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813, 1994) jsou rezistentní k těmto herbicidovým inhibitorům. Kromě toho byly popsány mutanty jednobuněčné řasy Chlamydomonas reinhardtii rezistentní k fenylimidovému herbicidu S-23142 (Kataoka et al., Pesticide Sci. 15: 449, 1990, Shibata et al., In: Research in Photosynthesis, Vol. III, Murata, N., ed., Kluwer, Netherlands, s. 567-570, 1992). Přinejmenším jedna z těchto mutant má zřejmě změněnou aktivitu protox, která je rezistentní nejen k herbicidovým inhibitorům, na kterých byly mutanty selektovány, ale také k jiným třídám inhibitorů protox (Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c: 339, 1993, Sáto et al., In: ACS Symposium on Porphyric Pesticides, Duke, S., ed., ACS Press,
-2CZ 297325 B6
Washington, D. C., 1994). Byla popsána také mutovaná buněčná linie tabáku, která je rezistentní k inhibitoru S-21432 (Che et al., Z. Naturforsch. 48c: 350, 1993).
Podstata vynálezu
Shrnutí vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu DNA a chimérický gen kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z pšenice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže a čiroku. Sekvence takových izolovaných molekul DNA jsou zde uvedeny jako sekvence s identifikačním číslem (id. č.) 9 (pšenice), 11 (sója), 15 (bavlník), 17 (cukrová řepa), 19 (řepka olejka), 21 (rýže) a 23 (čirok).
Předkládaný vynález také poskytuje modifikované formy rostlinného enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox), které jsou rezistentní ke sloučeninám, inhibujícím nemodifikovaný přirozeně se vyskytující rostlinný enzym protox, a dále molekul DNA kódující takové rostlinné enzymy protox rezistentní k inhibitoru. Předkládaný vynález zahrnuje také chimérické geny a modifikované formy přirozeně se vyskytujících genů protox, které mohou v rostlinách exprimovat rostlinné enzymy protox rezistentní k inhibitoru.
Geny kódující rostlinné enzymy protox rezistentní k inhibitoru se mohou použít ktomu, aby poskytly rezistenci k herbicidům inhibujícím protox v celé rostlině a jako selektovatelný markér použitelný v metodách transformace rostlin. Tudíž předkládaný vynález obsahuje také rostliny, včetně jejich potomstva, rostlinné pletivo a rostlinná semena, obsahující geny kódující tyto modifikované formy enzymu protox exprimovatelné v rostlině. Tyto rostliny, rostlinné pletivo a rostlinná semena jsou rezistentní k inhibitorům protox v hladinách, které inhibují aktivitu přirozeně se vyskytující protox v rostlinách. Rostliny zahrnuté do vynálezu jsou zvláště ty, které by byly potenciálním cílem pro herbicidy inhibující protox, zejména agronomicky důležité plodiny jako je kukuřice a další obiloviny jako např. ječmen, pšenice, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso a rýže. Vynález také zahrnuje další plodiny jako jsou např. cukrová třtina, sója, bavlník, cukrová řepa, řepka olejka a tabák.
Předkládaný vynález se dále týká způsobů přípravy rostlin, včetně rostlinného materiálu jako jsou např. rostlinná pletiva, protoplasty, buňky, kalusy, orgány, semena, embrya, pyl, vaječné buňky, zygoty, společně s jakýmkoliv rozmnožovacím materiálem a částmi rostlin, jako např. květy, stonky, plody, listy, kořeny vznikající na transgenních rostlinách nebo jejich potomstvu, které byly předtím transformované způsobem podle předkládaného vynálezu, který vede k formě rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru. Takové rostliny mohou být trvale transformované strukturním genem kódujícím rezistentní protox, nebo připraveny technikou přímé selekce, kde se linie rezistentní k herbicidu izolují, charakterizují a vyvíjejí. Předkládaný vynález zahrnuje také použití techniky transformace plastidu pro expresi genu protox v chloroplastu.
Předkládaný vynález se dále týká sond a způsobů detekce přítomnosti genů kódujících formy rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, a dále kvantifikace hladiny transkriptů forem protox rezistentních k inhibitoru v rostlinném pletivu. Tyto způsoby je možné použít pro identifikaci nebo screening rostlin nebo rostlinných pletiv obsahujících a/nebo exprimujících gen kódující formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru.
Popis seznamu sekvencí
Sekvence identifikačního čísla (dále jen id. č.) 1: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z Arabidopsis thaliana.
Sekvence id. č. 2: Aminokyselinová sekvence protox-1 z Arabidopsis kódovaná sekvencí i. č. 1.
-3 CZ 297325 B6
Sekvence id. č. 3: Sekvence DNA kódující protein protox-2 z Arabidopsis thaliana.
Sekvence id. č. 4: Aminokyselinová sekvence protox-2 z Arabidopsis kódovaná sekvencí i. č. 3.
Sekvence id. č. 5: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z kukuřice.
Sekvence id. č. 6: Aminokyselinová sekvence protox-1 z kukuřice kódovaná sekvencí i. č. 5.
Sekvence id. č. 7: Sekvence DNA kódující protein protox-2 z kukuřice.
Sekvence id. č. 8: Aminokyselinová sekvence protox-2 z kukuřice kódovaná sekvencí i. č. 7.
Sekvence id. č. 9: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z pšenice.
Sekvence id. č. 10: Aminokyselinová sekvence protox-1 z pšenice kódovaná sekvencí i. č. 9.
Sekvence id. č. 11: Sekvence DNA kódující protein protox-1 ze sóji.
Sekvence id. č. 12: Aminokyselinová sekvence protox-1 ze sóji kódovaná sekvencí i. č. 11.
Sekvence id. č. 13: Sekvence promotoru genu protox-1 z Arabidopsis thaliana.
Sekvence id. č. 14: Sekvence promotoru genu protox-1 z kukuřice.
Sekvence id. č. 15: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z bavlníku.
Sekvence id. č. 16: Aminokyselinová sekvence protox-1 z bavlníku kódovaná sekvencí i. č. 15.
Sekvence id. č. 17: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z řepy cukrovky.
Sekvence id. č. 18: Aminokyselinová sekvence protox-1 z řepy cukrovky kódovaná sekvencí i. č. 17.
Sekvence id. č. 19: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z řepky olejky.
Sekvence id. č. 20: Aminokyselinová sekvence protox-1 z řepky olejky kódovaná sekvencí i. č. 19.
Sekvence id. č. 21: Sekvence DNA kódující protein protox—1 z rýže.
Sekvence id. č. 22: Aminokyselinová sekvence protox-1 z rýže kódovaná sekvencí i. č. 21.
Sekvence id. č. 23: Sekvence DNA kódující protein protox-1 z čiroku.
Sekvence id. č. 24: Aminokyselinová sekvence protox-1 z čiroku kódovaná sekvencí i. č. 23.
Sekvence id. č. 25: Sekvence intronu genu protox-1 z kukuřice.
Sekvence id. č. 26: Sekvence promotoru genu protox-1 z řepy cukrovky.
Sekvence id. č. 27: Pclp Pla - PCR primer pro horní řetězec promotoru plastidového genu clpP.
Sekvence id. č. 28: Pclp Plb - PCR primer pro spodní řetězec promotoru plastidového genu clpP.
-4CZ 297325 B6
Sekvence id. č. 29: Pclp_P2b - PCR primer pro spodní řetězec promotoru plastidového genu clpP.
Sekvence id. č. 30: Trpsló Pla - PCR primer pro horní řetězec promotoru plastidového genu rpsló.
Sekvence id. č. 31: Trpsló Plb - PCR primer pro spodní řetězec promotoru plastidového genu rpsló.
Sekvence id. č. 32: minpsb_U - PCR primer pro horní řetězec promotoru plastidového genu psbA.
Sekvence id. č. 33: minpsb L - PCR primer pro spodní řetězec promotoru plastidového genu psbA.
Sekvence id. č. 34: APRTXPla - PCR primer pro horní řetězec.
Sekvence id. č. 35: APRTXPlb - PCR primer pro spodní řetězec.
Uložení
Vektorové molekuly uvedené v následujícím seznamu byly uloženy ve sbírce „Patent Culture Collection“, NRRL, Agricultural Research Service, Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A., a to k uvedenému datu.
Protox-la z pšenice, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 9. března 1996 jako pWDC-13 (NRRL č. B-21545).
Protox-1 ze sóji, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 15. prosince 1995 jako pWDC-12 (NRRLČ. B—21516).
Protox-1 zbavlníku, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 1. července 1996 jako pWDC-15 (NRRLČ. B-21594).
Protox-1 z cukrové řepy, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 29. července 1996 jako pWDC-16 (NRRL č. B-21595).
Protox-1 z řepky olejky, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 23. srpna 1996 jako pWDC-17 (NRRLČ. B-21615).
Protox-1 z rýže, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 6. prosince 1996 jako pWDC-18 (NRRLČ. B-21648).
Protox-1 zčiroku, ve vektoru pBluescript SK, byl uložen 6. prosince 1996 jako pWDC-19 (NRRLČ. B-21549).
Rezistentní mutant pAraC-2Cys, ve vektoru pMut_l, byl uložen 14. listopadu 1996 ve Sbírce kultur zemědělského výzkumu (Agricultural Research Culture Collection) pod depositním číslem NRRL21339N.
AraPTÍPo obsahující promotor Protox-1 zArabidopsis byl uložen 15. prosince 1995 jako pWDC-11 (NRRLČ. B-21515).
-5CZ 297325 B6
Plazmid obsahující promotor protox-1 z kukuřice fúzovaný se zbytkem kódující sekvence Protox-1 kukuřice byl uložen 19. března 1996 jako pWDC-14 (NRRL č. B-21546).
Plazmid obsahující promotor protox-1 z cukrové řepy byl uložen 6. prosince 1996 jako pWDC20 (NRRL č. B-21650).
Detailní popis vynálezu
I. Kódující sekvence rostlinné protox
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje protoporfyrinogenoxidázu (dále zde označovanou jako „protox“), enzym katalyzující oxidaci protoporfyrinogenu IX na protoporíyrin IX, a to z pšenice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže a čiroku. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z pšenice jsou zde uvedeny jako sekvence identifikačního čísla (id. č.) 9 a 10. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox ze sóji jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 11 a 12. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z bavlníku jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 15 a 16. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z cukrové řepy jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 17 a 18. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z řepky olejky jsou zde uvedeny jako sekvence id č. 19 a 20. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z rýže jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 21 a 22. Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox z čiroku jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 23 a 24.
Kódující sekvence DNA a odpovídající sekvence aminokyselin enzymu protox zArabidopsis thaliana a kukuřice, které byly již dříve izolovány, jsou zde reprodukovány jako sekvence id. č. 1-4 (Arabidopsis) a 5-8 (kukuřice).
Vynález se zejména týká molekuly DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující eukaryotickou protox vybranou ze skupiny protox enzymů z následujících rostlin: pšenice, sója, bavlník, cukrová řepa, řepka olejka, rýže a čirok.
Výhodné provedení vynálezu jsou izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) ze dvouděložných rostlin, zvláště z rostlin sóji, bavlníku, cukrové řepy a řepky olejky, které jsou uvedeny zde jako sekvence id. č. 11, 15, 17 a 19. Výhodnější jsou izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) ze sóji, jejíž sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 11, nebo z cukrové řepy, jejíž sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 17.
Výhodné jsou také izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z jednoděložných rostlin, zejména však z pšenice, rýže a čiroku, jejichž sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 9, 21 a 23. Výhodnější jsou izolované molekuly DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z pšenice, jejíž sekvence je zde uvedena jako sekvence id. ě. 9.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaných molekul DNA kódujících enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z dvouděložných rostlin, přičemž tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 12, 16, 18 a 20. Předkládaný vynález se také dále týká izolovaných molekul DNA kódujících enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z jednoděložných rostlin, přičemž tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 10, 22 a 24. Výhodnější je izolovaná molekula DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox), kde tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin z pšenice, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 10. Výhodnější je také izolovaná
-6CZ 297325 B6 molekula DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox), kde tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin ze sóji, která je zde uvedena jako sekvence id.č. 12, anebo cukrové řepy, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 18.
Pomocí informací, které poskytuje předkládaný vynález, lze s využitím standardních metod získat sekvenci DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z libovolného eukaryotického organismu.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z pšenice, a která má nukleotidovou sekvenci, hybridizující s nukleotidovou sekvencí id. č. 9 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox ze sóji a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 11 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z bavlníku, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 15 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z cukrové řepy, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 17 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z řepky olejky, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 19 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
-7 CZ 297325 B6
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z rýže, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 21 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1 % SDS při 50 °C.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje enzym protox z čiroku, a která má nukleotidovou sekvenci hybridizující se sekvencí id. č. 23 za následujících podmínek pro hybridizaci a promývání:
a) hybridizace v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, a
b) promytí ve 2x SSC, 1% SDS při 50 °C.
Izolované prokaryotické sekvence protox uvedené v tomto vynálezu je možné měnit (manipulovat) standardními technikami genového inženýrství tak, aby vyhovovaly požadovanému účelu. Tak např. celá sekvence protox nebo její část se může použít jako sonda schopná specificky hybridizovat s kódující sekvencí protox a příslušnou mRNA („messenger“ RNA). Aby se dosáhlo specifické hybridizace v různých podmínkách, takové sondy obsahují sekvence které jsou jedinečné mezi různými sekvencemi kódující protox a jsou výhodně dlouhé alespoň 10 nukleotidů, výhodněji 20 nukleotidů. Takové sondy se mohou použít pro amplifikaci a analýzu sekvencí kódujících protox z vybraného organismu pomocí dobře známé metody polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato metoda může být užitečná pro izolaci dalších sekvencí kódujících protox z požadovaného organismu nebo jako diagnostický test pro stanovení přítomnosti sekvence kódující protox v daném organismu.
Faktory, které ovlivňují stabilitu hybridů, určují stringentnost (přísnost) podmínek hybridizace. Jedním z takových faktorů je teplota tání Tm, která se dá snadno vypočítat podle vzorce popsaného v „DNA Probes“ (Keller, George H„ Manak, Mark M„ MacMillan Publishers Ltd, 1993, kapitola první: „Molecular Hybridization Technology“, s. 8). Výhodná hybridizační teplota je v rozmezí přibližně 25 °C pod vypočtenou teplotou tání Tm a výhodně v rozmezí přibližně 12 až 15 °C pod vypočtenou teplotou tání Tm, a v případě oligonukleotidů v rozmezí přibližně 5 až 10 °C pod teplotou tání Tm.
Předkládaný vynález se také týká molekul DNA, které hybridizují s molekulou DNA podle předkládaného vynálezu, jak bylo definováno dříve, ale které výhodně hybridizují se sondou, kterou lze získat z uvedené molekuly DNA, obsahující souvislý úsek ze sekvence enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) dlouhý nejméně 10 nukleotidů v průměrně stringentních (přísných) podmínkách.
Vynález se dále týká použití nukleotidové sondy schopné specificky hybridizovat s rostlinným genem protox nebo mRNA dlouhé nejméně 10 nukleotidů v polymerázové řetězové reakci (PCR).
Další provedení předkládaného vynálezu poskytuje sondu schopnou specificky hybridizovat s eukaryotickou sekvencí DNA kódující protoporfyrinogenoxidázou aktivitu nebo s příslušnou mRNA, a dále poskytuje způsob detekce uvedené sekvence DNA v eukaryotickém organismu použitím sondy podle předkládaného vynálezu.
Hybridizační sondy specifické pro protox se mohou použít také pro mapování polohy nativního eukaryotického genu (případně genů) protox v genomu vybraného organismu pomocí standard
-8CZ 297325 B6 nich technik založených na selektivní hybridizaci sondy s genomovou sekvencí protox. Tyto techniky zahrnují (ale tento výčet není omezující) identifikaci polymorfismu DNA pomocí sekvence sondy protox a využití takového polymorfismu pro sledování segregace genu protox ve vztahu k dalším markérům se známou polohou v mapě v mapované populaci odvozené samosprášením hybrida ze dvou polymorfních rodičovských linií (viz např. Helentjaris et al., Plant Mol. Biol. 5: 109, 1985, Sommer et al., Biotechniques 12. 82, 1992, D'ovidio et al., Plant Mol. Biol. 15: 169, 1990). Zatímco lze považovat jakoukoliv eukaryotickou sekvenci protox za vhodnou sondu pro mapování genů protox z libovolného eukaryotického organismu, výhodné sondy jsou sekvence protox z organismů blížeji příbuzných vybranému organismu a nej výhodnější sondy jsou sekvence protox přímo z vybraného organismu. Mapování genů protox takovým způsobem v rostlinách se považuje za zvláště užitečné pro šlechtitelské účely. Např. ze znalosti polohy mutovaného genu protox, který poskytuje rezistenci k herbicidu, v genetické mapě, se mohou identifikovat sousední DNA markéry z referenční genetické mapy (viz. např. Helentjaris, Trends Genet. 3: 217, 1987). Při vnášení znaku rezistence k herbicidu do nové šlechtitelské linie se mohou použít tyto markéry pro monitorování rozsahu chromozómové DNA obklopující protox která je ještě přítomná v rodičovské linii po každém z opakujících se zpětných křížení.
Hybridizační sonda specifická pro protox se může použít také pro kvantifikaci hladiny mRNA pomocí standardních postupů jako je např. analýza „northem“ přenosu. Tento postup může být užitečný jako diagnostický test pro stanovení změněné hladiny exprese protox, která může být spojena se zvláště nepříznivými podmínkami jako jsou autozomálně dominantní poruchy u člověka charakterizované neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi, které jsou spojeny se sníženou hladinou aktivity protox (Brenner a Blommer. New Engl. J. Med 302: 765, 1980).
Další provedení předkládaného vynálezu je způsob přípravy molekuly DNA obsahující úsek DNA kódující protein s enzymovou aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), který obsahuje následující kroky
a) připraví se nukleotidová sonda schopná specificky hybridizovat s rostlinným genem protox nebo příslušnou mRNA, přičemž tato sonda obsahuje souvislý úsek sekvence kódující protein protox z rostliny dlouhý nejméně 10 nukleotidů,
b) nukleotidová sonda připravená podle kroku a) se použije k vyhledání jiných sekvencí kódujících protox v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo fragmentů cDNA z vybraného organismu, a
c) izoluje se a namnoží se molekula DNA obsahující úsek DNA kódující protein, který má enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Další provedení předkládaného vynálezu je způsob izolace molekuly DNA z jakékoliv rostliny obsahující úsek DNA kódující protein s enzymovou aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), který obsahuje následující kroky
a) připraví se nukleotidová sonda schopná specificky hybridizovat s rostlinným genem protox nebo příslušnou mRNA, přičemž tato sonda obsahuje souvislý úsek sekvence kódující protein protox z rostliny dlouhý nejméně 10 nukleotidů,
b) nukleotidová sonda připravená podle kroku a) se použije k vyhledání jiných sekvencí kódujících protox v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo fragmentů cDNA z vybraného organismu, a
c) izoluje se a namnoží se molekula DNA obsahující úsek DNA kódující protein, ktefy má enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
-9CZ 297325 B6
Vynález se dále týká způsobu přípravy v podstatě čisté sekvence DNA kódující protein vykazující enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy, který obsahuje následující kroky:
a) připraví se genomová knihovna nebo cDNA knihovna z vhodného zdrojového organismu pomocí vhodného klonovacího vektoru,
b) knihovna se hybridizuje s molekulou sondy, a
c) identifikuje se pozitivní hybridizace sondy s DNA klonem, z knihovny, který je klonem potenciálně obsahujícím nukleotidovou sekvenci odpovídající sekvenci aminokyselin protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Vynález se dále týká způsobu přípravy v podstatě čisté sekvence DNA kódující protein vykazující enzymovou aktivitu protoporfyrinogenoxidázy, který obsahuje následující kroky:
a) připraví se celková DNA z genomové nebo cDNA knihovny,
b) použitím DNA z kroku a) jako templátu v PCR reakci s primery představujícími úseky sekvence aminokyselin protoporfyrinogenoxidázy (protox) s nízkou degenerací.
Dalším předmětem vynálezu je test k identifikaci inhibitorů enzymové aktivity protoporfyrinogenoxidázy (protox), který spočívá v tom, že se
a) inkubuje první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát,
b) měří se neinhibovaná reaktivita protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku a),
c) inkubuje se první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje inhibující sloučeninu (inhibitor),
d) měří se inhibovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku c), a
e) porovná se inhibovaná reaktivita s neinhibovanou reaktivitou enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Dalším předmětem vynálezu je test k identifikaci mutantů protoporfyrinogenoxidázy (protox) rezistentních k inhibitoru, který spočívá v tom, že se
a) inkubuje první vzorek protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje inhibitor enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox),
b) měří se nemutovaná reaktivita protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku a),
c) inkubuje se první vzorek mutované protoporfyrinogenoxidázy (protox) a její substrát v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje inhibitor protoporfyrinogenoxidázy (protox),
d) měří se mutovaná reaktivita enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox) z kroku c), a
e) porovná se mutovaná reaktivita s nemutovanou reaktivitou enzymu protoporfyrinogenoxidázy (protox).
Dalším předmětem vynálezu je inhibitor enzymu protox získaný způsobem podle předkládaného vynálezu.
- 10CZ 297325 B6
Pro rekombinantní produkci enzymu v hostitelském organismu se může sekvence kódující protox vložit do expresní kazety navržené pro vybraného hostitele a zavést do hostitele, kde je pak enzym rekombinantně produkován. Výběr specifických regulačních sekvencí jako je promotor, signální sekvence, netranslatované sekvence 5'- a 3'-konce nebo zesilující sekvence („enhancer“) může provést odborník rutinním způsobem odpovídajícím stavu techniky v oboru. Výsledná molekula obsahující jednotlivé prvky spojené ve vhodném čtecím rámci, může být vložena do vektoru, který je schopen transformovat hostitelskou buňku. Vhodné expresní vektory a metody rekombinantní přípravy proteinů jsou dobře známy pro hostitelské organismy jako jsou např. E. coli (viz. např. Studier a Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113, 1986, Brosius, DNA 8: 759, 1989), kvasinky (viz. např. Schneider a Guarente, Meth. Enzymol. 194: 373, 1991) a hmyzí buňky (viz např. Luckow a Summers. Bio/technol. 6: 47, 1988). K příkladům patří např. plazmidy jako je pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFlag (International Biotechnologies, lne., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) a bakulovirové expresní vektory, např. vektory odvozené z genomu viru jaderné polyhedrózy (AcMNPV) Autographica californica. Výhodným systémem bakulovirus/hmyz jsou buňky pVll 1392/SF21 (Invitrogen, La Jolla, CA).
Rekombinantně produkovaný eukaryotický enzym protox je užitečný pro mnoho různých účelů. Např. se může použít pro zabezpečení protox aktivity in vitro. Může se také použít v testu in vitro ke screeningu známých chemických látek s herbicidním účinkem, jejichž cíl dosud nebyl identifikován, k určení toho, zda inhibují protox. Takový test in vitro se může také užít pro zcela obecný screening k identifikaci chemických látek, které inhibují aktivitu protox a které jsou proto kandidáty na herbicid. Rekombinantně produkovaný eukaryotický enzym protox se může také použít v testu pro identifikaci mutantů protox rezistentních k inhibitoru (viz Mezinárodní patentovou přihlášku PCT/IB95/00452 podanou 8. června 1995 a publikovanou 21. prosince 1995 jako WO 95/34659, na jejíž plné znění se zde odkazujeme). Rekombinantně produkovaný enzym protox se může případně také použít pro další charakterizaci jeho spojení se známými inhibitory k tomu, aby se racionalizoval návrh dalších inhibičních herbicidů stejně tak jako formy enzymu rezistentní k inhibitoru.
II. Rostlinný enzym protox rezistentní k inhibitoru
Další aspekt předkládaného vynálezu popisuje modifikace, které je možné učinit v sekvenci aminokyselin libovolné rostlinné protoporíyrinogenoxidázy (zde zkracováno na „protox“) s cílem získat formu tohoto enzymu rezistentní k inhibitoru. Předkládaný vynález se týká rostlinného enzymu protox rezistentního k inhibitoru, který má modifikace popsané zde, a dále se týká genů schopných exprimovat tyto modifikované enzymy v rostlinách.
Předkládaný vynález se týká izolované molekuly DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox), která má alespoň jednu aminokyselinovou modifikaci, přičemž tato modifikace má tu vlastnost, že poskytuje rezistenci k inhibitoru protox, což znamená, že uvedená modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje eukaryotickou protox. Termín „inhibuje“ jak se zde užívá, znamená snižování enzymové aktivity pozorované v přítomnosti předmětného herbicidu ve srovnání s aktivitou pozorovanou bez přítomnosti tohoto herbicidu, přičemž míra redukce je výhodně alespoň 10%, výhodněji 50% a nejvýhodněji alespoň 90%.
Výhodná je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující eukaryotickou protox vybranou ze skupiny obsahující enzymy protox z pšenice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže a čiroku, které mají alespoň jednu aminokyselinovou modifikaci, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající 159. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná
-11 CZ 297325 B6 je molekula DNA, kde cystein je nahrazen fenylalaninem nebo lysinem a nejvýhodnější je, je-li cystein nahrazen fenylalaninem.
Výhodná je také DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde isoleucin je nahrazen threoninem, histidinem, glycinem nebo asparaginem a nejvýhodnější je, je-li isoleucin nahrazen threoninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 164. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde alanin je nahrazen threoninem, leucinem nebo valinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde glycin je nahrazen serinem nebo leucinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen isoleucinem nebo methioninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 356. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde valin je nahrazen leucinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 421. aminokyselině sekvence v poloze id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde serin je nahrazen prolinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 502. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde valin je nahrazen alaninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 211. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde alanin je nahrazen valinem nebo threoninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 212. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní
- 12CZ 297325 B6 k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde glycin je nahrazen serinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 466. aminokyselině sekvence id. č. 10 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde isoleucin je nahrazen threoninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 369. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde prolin je nahrazen serinem nebo histidinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 226. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde alanin je nahrazen threoninem nebo leucinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 517. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde valin je nahrazen alaninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 432. aminokyselině sekvence id. č. 12 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen alaninem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 365. aminokyselině sekvence id. č. 16 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde prolin je nahrazen serinem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 428. aminokyselině sekvence id. č. 16 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen cysteinem nebo argininem.
Výhodná je také molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 449. aminokyselině sekvence id. č. 18 je nahrazen jinou aminokyselinou, přičemž modifikovaná protox je tolerantní k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox. Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin je nahrazen cysteinem, leucinem, isoleucinem, valinem nebo methioninem.
Předkládaný vynález se dále týká molekuly DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, přičemž první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že
- 13CZ 297325 B6 poskytuje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci poskytovanou první aminokyselinovou substitucí. Výhodná je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olejku, rýži, čirok a Arabidopsis. Výhodnější je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, sóju, cukrovou řepu, a Arabidopsis.
Výhodná je molekula DNA, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující:
i) polohu odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, ii) polohu odpovídající threoninu jako 249. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, iii) polohu odpovídající prolinu jako 118. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, iv) polohu odpovídající asparaginu jako 425. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, a
v) polohu odpovídající tyrosinu jako 498. aminokyselině v sekvenci id. č. 2.
Výhodná je také molekula DNA, kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující:
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající glycinu jako 165. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
c) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
d) polohu odpovídající cysteinu jako 159. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
e) polohu odpovídající isoleucinu jako 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
f) polohu odpovídající valinu jako 356. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
g) polohu odpovídající šeřinu jako 421. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
h) polohu odpovídající valinu jako 502. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
i) polohu odpovídající alaninu jako 211. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
k) polohu odpovídající glycinu jako 212. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
l) polohu odpovídající isoleucinu jako 466. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
m) polohu odpovídající prolinu jako 369. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
n) polohu odpovídající alaninu jako 226. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
o) polohu odpovídající tyrosinu jako 432. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
p) polohu odpovídající valinu jako 517. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
q) polohu odpovídající tyrosinu jako 428. aminokyselině v sekvenci id. č. 16,
- 14CZ 297325 B6
r) polohu odpovídající prolinu jako 365. aminokyselině v sekvenci id. č. 16, a
s) polohu odpovídající tyrosinu jako 449. aminokyselině v sekvenci id. č. 18.
Zvláště výhodná je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, přičemž tato rostlinná protox obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. čísel 2,4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20 a 22. Nejvýhodnější je molekula DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, přičemž tato rostlinná protox obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. čísel 2, 4, 6, 8, 10, 12 a 18.
Výhodnější je molekula DNA, kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající glycinu jako 165. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
c) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
d) polohu odpovídající cysteinu jako 159. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
e) polohu odpovídající isoleucinu jako 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde serin vyskytující se v poloze odpovídající 305. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen leucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající threoninu jako 249. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde threonin vyskytující se v poloze odpovídající 249. aminokyselinově sekvence id. č. 2 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující isoleucin a alanin.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající prolinu jako 118. aminokyselině sekvence id č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
-15CZ 297325 B6
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 118. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen leucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající asparaginu jako 425. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. ě. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. ě. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde asparagin vyskytující se v poloze odpovídající 425. aminokyselině sekvence id. č. 2 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde druhá aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající tyrosinu jako 498. aminokyselině sekvence id. č. 2 a kde první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. ě. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 498. aminokyselině sekvence id. ě. 2 je nahrazen cysteinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině sekvence id. ě. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující cystein, isoleucin, leucin, threonin, valin a methionin.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se poloze odpovídající 370. aminokyselině sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující cystein, isoleucin, leucin, threonin, a methionin.
Výhodnější je molekula DNA, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 164. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující valin, threonin, leucin, cystein a tyrosin.
Výhodnější je molekula DNA, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 165. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující serin a leucin.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde glycin vyskytující se poloze odpovídající 165. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde cystein vyskytující se v poloze odpovídající 159. aminokyselinovému zbytku sekvence id. ě. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující fenylalanin a lysin.
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde cystein vyskytující se poloze odpovídající 159. aminokyselinovému zbytku sekvence id. ě. 6 je nahrazen fenylalaninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde isoleucin vyskytující se v poloze odpovídající 419. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující threonin, histidin, glycin a asparagin.
-16CZ 297325 B6
Zvláště výhodná je molekula DNA, kde isoleucin vyskytující se poloze odpovídající 419. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 6 je nahrazen threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 356. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen leucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde serin vyskytující se poloze odpovídající 421. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen prolinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 502. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen alaninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde isoleucin vyskytující se poloze odpovídající 466. aminokyselinovému zbytku sekvence id. ě. 10 je nahrazen threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde glycin vyskytující se v poloze odpovídající 212. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 10 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde alanin vyskytující se poloze odpovídající 211. aminokyselinovému zbytku sekvence id. ě. 10 je nahrazen valinem nebo threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 369. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 12 je nahrazen serinem nebo histidinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde alanin vyskytující se v poloze odpovídající 226. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 12 je nahrazen serinem nebo threoninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 432. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 12 je nahrazen leucinem nebo isoleucinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde valin vyskytující se v poloze odpovídající 517. aminokyselinovému zbytku sekvence id. ě. 12 je nahrazen alaninem.
Výhodnější je molekula DNA, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 428. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 16 je nahrazen cysteinem nebo argininem.
Výhodnější je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 365. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 16 je nahrazen serinem.
Výhodnější je molekula DNA, kde prolin vyskytující se v poloze odpovídající 449. aminokyselinovému zbytku sekvence id. č. 18 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující leucin, isoleucin, valin a methionin.
Předkládaný vynález se týká expresních kazet a rekombinantních vektorů obsahujících tyto expresní kazety, které obsahují nezbytně promotor, zvláště pak promotor aktivní v rostlině, operativně spojený s molekulou DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z eukaryotického organismu podle předkládaného vynálezu. Expresní kazeta podle předkládaného vynálezu může navíc obsahovat signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna směrování proteinu kódovaného touto molekulou DNA do chloroplastu nebo mitochondrie.
Předkládaný vynález se týká chimérického genu, který obsahuje expresní kazetu skládající se promotoru, zvláště promotoru aktivního v rostlině, operativně spojeného s heterologní molekulou DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z eukaryotického organismu podle
- 17CZ 297325 B6 předkládaného vynálezu. Výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovou třtinu, sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a rýži. Výhodnější je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfýrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující sóju, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy, proso, pícniny a rýži. Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující pšenici, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olejku, rýži a čirok. Nej výhodnější je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující pšenici, cukrovou řepu a sóju.
Výhodnější je chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, operativně spojený s heterologní molekulou DNA kódující protoporfýrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny, do které patří protox z pšenice obsahující sekvenci id. č. 10, protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12, protox zbavlníku obsahující sekvenci id. č. 16, protox z cukrové řepy obsahující sekvenci id. č. 18, protox z řepky olejky obsahující sekvenci id. č. 20, protox z rýže obsahující sekvenci id. č. 22 a protox z čiroku obsahující sekvenci id. č. 24. Výhodnější je chimérický gen, kde protoporfyrinogenoxidáza (protox) je vybrána ze skupiny, do které patří protox z pšenice obsahující sekvenci id č. 10, protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12 a protox z cukrové řepy obsahující sekvenci id. č. 18.
Název „protox-1“ se zde užívá pro označení chloroplastové protox, zatímco „protox-2“ označuje mitochondriální protox.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z. Arabidopsis sp., který má aktivitu protox-1 nebo protox-2, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z kukuřice, který má aktivitu protox-1 nebo protox-2, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 6 nebo sekvenci id. č. 8.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z pšenice, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 10.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein ze sóji, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 12.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z bavlníku, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 16.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z cukrové řepy, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 18.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z řepky olejky, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 20.
-18CZ 297325 B6
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z rýže, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 22.
Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protein z čiroku, který má aktivitu protox-1, a kde výhodně tento protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 24.
Provedením předkládaného vynálezu je také chimérický gen, který obsahuje expresní kazetu, která se skládá nezbytně z promotoru, zvláště promotoru aktivního v rostlině, operativně spojeného s molekulou DNA kódující enzym protoporfýrinogenoxidázu (protox) z eukaryotického organismu podle předkládaného vynálezu, kterážto protox je rezistentní k herbicidům v hladinách, které inhibují odpovídající nemodifikovanou verzi enzymu. Výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfýrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovou třtinu, sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a rýži.
Výhodnější je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje protoporfýrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující sóju, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy, proso, pícniny a rýži. Zvláště výhodný je chimérický gen, kde molekula DNA kóduje enzym protoporfýrinogenoxidázu (protox) z rostliny vybrané ze skupiny obsahující Arabidopsis, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok a rýži.
Předkládaný vynález se také týká chimérického genu, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, který je operativně spojen s molekulou DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující eukaryotickou protox, která má nejméně jednu modifikaci, kde tato aminokyselinová modifikace má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox.
Předkládaný vynález se také týká chimérického genu, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, který je operativně spojen s molekulou DNA kódující modifikovanou protoporfýrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, kde první aminokyselinová substituce má to vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udílenou první substitucí. Výhodný je chimérický gen obsahující navíc signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný touto molekulou DNA do chloroplastu nebo do mitochondrie.
Chimérický gen podle předkládaného vynálezu může dále obsahovat signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do chloroplastu. Chimérický gen podle předkládaného vynálezu může dále obsahovat signální sekvenci operativně spojenou s molekulou DNA, kde signální sekvence je schopna nasměrovat protein kódovaný molekulou DNA do mitochondrie.
Předkládaný vynález se také týká dříve zmíněných sekvencí DNA, které jsou trvale vloženy (integrovány) v hostitelském genomu.
Předkládaný vynález se také týká rekombinantní molekuly DNA obsahující rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu (protox) nebo její funkčně shodný derivát.
Předkládaný vynález se také týká rekombinantního vektoru DNA, který obsahuje tuto rekombinantní molekulu.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle vynálezu, přičemž tímto vektorem může být trvale transformována hostitelská buňka.
-19CZ 297325 B6
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle vynálezu, přičemž tímto vektorem může být trvale transformována rostlina, rostlinná semena, rostlinné pletivo nebo rostlinná buňka. Výhodný je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle vynálezu, přičemž tímto vektorem může být trvale transformována rostlina. Rostlina, rostlinná semena, rostlinné pletivo nebo rostlinná buňka trvale transformované tímto vektorem jsou schopné exprimovat molekulu DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox). Výhodný je takový rekombinantní vektor, že rostlina, rostlinná semena, rostlinné pletivo nebo rostlinná buňka trvale transformované tímto vektorem jsou schopné exprimovat molekulu DNA kódující rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu (protox), která je rezistentní k herbicidům v hladině, která inhibuje odpovídající nemodifikovanou verzi enzymu.
Výhodný je rekombinantní vektor obsahující chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, operativně spojený s heterologní molekulou DNA kódující protoporfyrinogenoxidázu (protox) vybranou ze skupiny, do které patří protox z pšenice obsahující sekvenci id. č. 10, protox ze sóji obsahující sekvenci id. č. 12, protox zbavlníku obsahující sekvenci id. č. 16, protox z cukrové řepy obsahující sekvenci id. č. 18, protox z řepky olejky obsahující sekvenci id. č. 20, protox z rýže obsahující sekvenci id. č. 22 a protox zčiroku obsahující sekvenci id. č. 24, přičemž tento vektor je schopen trvale transformovat hostitelskou buňku.
Výhodný je také chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině, který je operativně spojen s molekulou DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox) obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, kde první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udílenou první substitucí, přičemž tento vektor je schopen trvale transformovat hostitelskou buňku.
Předkládaný vynález také zahrnuje hostitelskou buňku trvale transformovanou vektorem podle předkládaného vynálezu, kde hostitelská buňka je schopna exprimovat danou molekulu DNA. Výhodná je hostitelská buňka ze skupiny obsahující rostlinnou buňku, bakteriální buňku, kvasinkovou buňku a hmyzí buňku.
Předkládaný vynález se také týká rostlin a jejich potomstva, rostlinného pletiva a rostlinných semen tolerantních k herbicidu, který inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox v těchto rostlinách, přičemž tolerance je udílena genem exprimujícím modifikovaný enzym protox rezistentní k inhibitoru, jak je popsáno v této přihlášce. Mezi reprezentativní rostliny patří jakákoliv rostlina, na kterou lze aplikovat takový herbicid s původně zamýšleným účelem. Výhodné jsou agronomicky důležité plodiny, krytosemenné i nahosemenné, jako je např. Arabidopsis, cukrová třtina (tj. cukrovník lékařský), sója, ječmen, bavlník, tabák, cukrová řepa, řepka olejka, kukuřice, pšenice, čirok, rýže, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny a podobně. Výhodnější jsou agronomicky důležité plodiny, kiytosemenné i nahosemenné, jako je např. Arabidopsis, bavlník, sója, řepka olejka, cukrová řepa, kukuřice, rýže, pšenice, ječmen, oves, žito, čirok, proso, trávníkové a pícninové trávy. Zvláště výhodné jsou agronomicky důležité plodiny, krytosemenné i nahosemenné, jako je např. Arabidopsis, sója, bavlník, řepka olejka, kukuřice, pšenice, čirok a rýže.
Výhodná je rostlina, která obsahuje molekulu DNA kódující modifikovanou protoporfyrinogenoxidázu (protox), obsahující rostlinnou protox, která má první aminokyselinovou substituci a druhou aminokyselinovou substituci, kde první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udílenou první substitucí, přičemž molekula DNA je exprimována v rostlině a uděluje jí toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox. Výhodná je rostlina, kde tato molekula DNA nahrazuje odpovídající přirozeně se vyskytující sekvenci kódující protox.
-20CZ 297325 B6
Předkládaný vynález se týká také rostliny a jejího potomstva, obsahující chimérický gen podle vynálezu, kde tento chimérický gen uděluje rostlině toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující protox.
Předkládaný vynález dále zahrnuje transgenní rostlinné pletivo, včetně rostlin a jejich potomstva, semen a kultivovaného pletiva, které jsou trvale transformované alespoň jedním chimérickým genem podle vynálezu. Výhodné je transgenní rostlinné pletivo, včetně rostlin, rostlinných semen a kultivovaného pletiva, které jsou trvale transformované alespoň jedním chimérickým genem, který obsahuje expresní kazetu složenou nezbytně z promotoru, zvláště promotoru aktivního 10 v rostlině, operativně spojeného s molekulou DNA kódující enzym protoporfyrinogenoxidázu (protox), která je rezistentní k herbicidům v hladině, která inhibuje odpovídající nemodifikovanou verzi enzymu v rostlinném pletivu.
Rekombinantní molekula DNA podle předkládaného vynálezu může být zavedena do rostlinné 15 buňky různými způsoby, které jsou odborníkovi známy. Odborníkovi je zřejmé, že volba metody závisí na druhu rostliny vybrané pro transformaci, tj. na tom, je-li jednoděložná nebo dvouděložná. Mezi metody vhodné pro transformaci rostlinné buňky patří mikroinjekce (Crossway et al., Bio Techniques 4: 320-334, 1986, elektroporace (Riggs et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606, 1986, transformace zprostředkovaná Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 20 6: 9 1 5-921, 1988), přímý transfer genu (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722, 1984), balistické urychlování částic pomocí zařízení od firmy Agracetus, tne., Madison, Wisconsin a Dupont, fnc., Willmington, Delaware (viz např. Sanford et al., patent USA 4 945 050 a McCabe et al., Biotechnology 6: 923-926, 1988) a transformace/regenerace protoplastů (viz patent USA 5 350 689 udělený Ciba-Geigy Corp. 27. září 1994). Další informace publikovali: Weissinger et 25 al., Annual. Rev. Genet. 22: 421^447, 1988, Sanford et al., Particulate Science and Technology
5: 27-37, 1987 (cibule), Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674, 1988 (sója), McCabe et al., Biotechnology 6: 923-926, 1990 (rýže), Klein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309, 1988 (kukuřice), Klein et al., Biotechnology 6: 559-563, 1988 (kukuřice), Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444, 1988 (kukuřice), Fromm et al., Biotechnology 8: 833-839, 1990 a Gor30 don-kamm et al., Plant Cell 32: 603-618, 1990 (kukuřice).
Předmětem předkládaného vynálezu jsou transgenní rostliny, zvláště transgenní fertilní rostliny, transformované popsaným způsobem a jejich pohlavní nebo nepohlavní potomstvo, které je stále ještě rezistentní nebo přinejmenším tolerantní k inhibici herbicidem v hladinách, které jsou nor35 málně inhibující pro aktivitu přirozeně se vyskytující rostlinné protox. K potomstvu patří také rostliny s genetickým základem odlišným od rodičovských rostlin, toto potomstvo pochází z programu zpětného křížení a stále ještě obsahuje ve svém genomu znak rezistence k inhibitoru podle předkládaného vynálezu. Velmi výhodné jsou hybridní rostliny, které jsou rezistentní nebo alespoň tolerantní k inhibici herbicidem v hladinách, které jsou normálně inhibující pro aktivitu 40 přirozeně se vyskytující rostlinné protox.
Transgenní rostlina podle předkládaného vynálezu může být dvouděložná nebo jednoděložná rostlina. Výhodně je to jednoděložná rostlina z čeledi Graminaceae, včetně rostlin rodu Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryza, Avena, Hordeum, Secale 45 a Setaria. Výhodnější jsou transgenní rostliny jako kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso a rýže.
K výhodným dvouděložným rostlinám patří Arabidopsis, sója, bavlník, cukrová řepa, cukrová třtina, řepka olejka, tabák a slunečnice. Zvláště výhodné jsou sója, bavlník, tabák, cukrová řepa 50 a řepka olejka.
Výraz „potomstvo“ zde zahrnuje pohlavně, tak i nepohlavně vzniklé potomstvo transgenních rostlin. „Potomstvo“ zahrnuje také všechny mutanty a varianty, které lze získat pomocí známých způsobů, jako je např. fúze buněk nebo selekce mutantů, a které stále mají charakteristické vlast55 nosti počátečních transformovaných rostlin, a také zahrnuje všechny výsledky křížení a fúzí
-21 CZ 297325 B6 transformovaného rostlinného materiálu. To tedy zahrnuje i rostliny potomstva, které pocházejí z programu zpětného křížení, pokud rostliny potomstva ještě obsahují znak rezistence k herbicidu podle vynálezu.
Další předmět předkládaného vynálezu se týká rozmnožovacího materiálu z transgenních rostlin. Rozmnožovací materiál transgenních rostlin je v předkládaném vynálezu definován jako jakýkoliv rostlinný materiál, který může být rozmnožován pohlavně nebo nepohlavně in vivo nebo in vitro. Zvláště výhodné jsou podle předkládaného vynálezu protoplasty, buňky, kalusy, pletiva, orgány, semena, embiya, pyl, vaječné buňky, zygoty a jakýkoliv další rozmnožovací materiál získaný z transgenních rostlin.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou např. také stonky, plody, listy a kořeny pocházející z transgenních rostlin nebo jejich potomstva, které byly původně transformovány pomocí prostředků a způsob podle předkládaného vynálezu a proto obsahují alespoň částečně transgenní buňky.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy rostlin, protoplastů, buněk, kalusů, pletiv, orgánů, semen, embryí, pylu, vaječných buněk, zygot a jakéhokoliv rozmnožovacího materiálu, částí rostliny jako jsou květy, stonky, plody, listy, kořeny, které pocházejí z transgenních rostlin nebo jejich potomstva, předtím transformovaných pomocí prostředků a způsobů podle předkládaného vynálezu, které proto produkují formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, kterýžto způsob spočívá v tom, že se transformuje rostlina nebo část rostliny DNA podle předkládaného vynálezu. Výhodný je způsob, který poskytuje hostitelskou buňku obsahující izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), kterýžto způsob spočívá v tom, že se transformuje hostitelská buňka rekombinantní vektorovou molekulou podle předkládaného vynálezu. Dále je výhodný způsob, který poskytuje rostlinnou buňku obsahující izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), kterýžto způsob spočívá v tom, že se transformuje rostlinná buňka rekombinantní vektorovou molekulou podle předkládaného vynálezu. Výhodný je způsob, který poskytuje transgenní potomstvo transgenních rodičovských rostlin obsahujících izolovanou molekulu DNA kódující eukaryotický protein s aktivitou protoporfyrinogenoxidázy (protox), kterýžto způsob spočívá v tom, že se rodičovská rostlina transformuje rekombinantní vektorovou molekulou podle předkládaného vynálezu a znak tolerance k herbicidu se přenese na potomstvo těchto rodičovských transgenních rostlin, přičemž způsob zahrnuje známé způsoby šlechtění rostlin.
Výhodný je způsob přípravy rostlin, rostlinného pletiva, rostlinných semen a částí rostlin, které produkují formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, kde rostliny, rostlinná pletiva, rostlinná semena a části rostlin byly trvale transformované strukturním genem kódujícím rezistentní enzym protox. Zvláště výhodný je způsob přípravy rostlin, rostlinného pletiva, rostlinných semen a částí rostlin, kde tyto rostliny, rostlinná pletiva, rostlinná semena a části rostlin byly trvale transformované DNA podle předkládaného vynálezu. Zvláště výhodný je způsob přípravy takových rostlin, rostlinného pletiva, rostlinných semen a částí rostlin, které produkují formu rostlinného enzymu protox rezistentní k inhibitoru, kde tyto rostliny, rostlinná pletiva, rostlinná semena a části rostlin byly připraveny technikami přímé selekce, kterými se izolují, charakterizují a vyvíjejí linie rezistentní k herbicidu.
Genetické vlastnosti, vnesené do transgenních semen a rostlin metodami genového inženýrství popsanými v předchozím textu, se předávají pohlavním rozmnožováním nebo vegetativním růstem a mohou se tak udržovat a šířit v potomstvu, tj. dceřinných rostlinách. Obecně se pro udržování a propagaci využijí způsoby vyvinuté v zemědělství pro specifické účely jako je orání, setí nebo sklizeň. Specializované způsoby jako je hydroponická nebo skleníková technologie, se mohou také použít. Jelikož rostoucí plodiny jsou náchylné k napadení a poškození hmyzem nebo infekcemi a také kompeticí s plevely, provedou se opatření ke kontrole plevelů, nemocí, hmyzu, červů a další, vedoucí ke zvýšení výnosu. To zahrnuje také taková mechanická opatření jako je
-22CZ 297325 B6 orání půdy nebo odstraňování plevelů a infikovaných rostlin, a také aplikaci agrochemikálií jako jsou herbicidy, fungicidy, gametocidy, nematocidy, růstové regulátory, činidla k dozrávání a insekticidy.
Výhodné genetické vlastnosti transgenních rostlin a semen podle vynálezu se mohou využít ve šlechtění rostlin, jehož cílem je vyšlechtit rostliny se zlepšenými vlastnostmi jako je např. tolerance k hmyzu, herbicidům nebo stresu, se zlepšenou nutriční hodnotou, zvýšeným výnosem nebo zlepšenou strukturou, která vede ke snížení ztrát způsobených poléháním nebo polámáním nebo při uskladnění. Jednotlivé šlechtitelské kroky jsou charakterizovány jasně definovanou lidskou činností, jako je např. výběr linií ke křížení, přímé opylování rodičovských linií nebo výběr vhodného potomstva. V závislosti na požadovaných vlastnostech se provádějí různá šlechtitelská opatření. Odpovídající způsoby jsou v oboru dobře známy a zahrnují, kromě jiného, např. hybridizaci, inbreeding, zpětné křížení, víceliniové křížení, směsné odrůdy, mezidruhovou hybridizací, aneuploidní techniky atd. Hybridizační techniky zahrnují také sterilizaci rostlin vedoucí k samčím nebo samičím sterilním rostlinám, která se provádí mechanickými, chemickými nebo biochemickými prostředky. Křížové opylení samčí sterilní rostliny pylem různých linií zajistí, že genom rostliny se samčí sterilitou a se zachovanou samičí fertilitou uniformě získá vlastnosti obou rodičovských linií. Tudíž transgenní osivo a rostliny podle vynálezu se mohou užít ve šlechtění linií zlepšených rostlin, což např. může zvýšit účinnost konvenčních metod jako je ošetření herbicidem nebo pesticidem, a nebo se obejdou bez těchto metod vzhledem k jejich změněným genetickým vlastnostem. Případně nové plodiny se zlepšenou tolerancí ke stresu se mohou získat tak, že vzhledem k jejich optimalizovanému genetickému „vybavení“ je sklízený produkt lepší kvality než produkty, které nebyly schopny tolerovat srovnatelně nepříznivě vývojové podmínky.
V semenářství jsou kvalita klíčení a uniformita osiva nezbytnými charakteristikami produktu, zatímco kvalita klíčení a uniformita semen sklízených a prodávaných farmáři nejsou tak důležité. Jelikož je obtížné udržovat plodinu v čistém stavu bez příměsi semen jiné plodiny nebo plevelu, kontrolovat nemoci přenášené semeny, a produkovat osivo s dobrou kvalitou klíčení, značně obsáhlé a dobře definované techniky výroby osiva byly vyvinuty producenty osiva, kteří mají zkušenosti s pěstováním, udržováním a prodejem čistého osiva. Je běžnou praxí, že farmář kupuje certifikované osivo odpovídající kvalitativním standardům, místo aby používal osivo z vlastní úrody. Materiál používaný jako osivo je obvykle ošetřen ochrannou vrstvou obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematicidy, moluscicidy nebo jejich různé směsi. Obvykle užívané ochranné vrstvy obsahují sloučeniny jako kaptan, karboxin, thiram (TMTD®), metalaxyl (Apron®) a pirimifosmetyl (Actellic®). Pokud je to potřeba, tyto sloučeniny tvoří prostředek společně s dalšími pomocnými látkami, nosiči, surfaktanty nebo adjuvans usnadňujícími aplikaci, jak se běžně užívá v oboru prostředků pro ochranu před poškozením bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci. Ochranná vrstva se může aplikovat impregnací osiva tekutým prostředkem nebo kombinovanou aplikací kapalného a suchého prostředku. Jiné způsoby aplikace lze také použít, např. přímé ošetření pupenů nebo plodů.
Další předmět předkládaného vynálezu poskytuje rostlinný rozmnožovací materiál pro pěstování rostlin, zejména rostlinné osivo, které je ošetřeno ochranným potahem, kterého se obvykle využívá pro ošetřování osiva.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje nové zemědělské způsoby, jejichž příklady jsou uvedeny v předchozím textu, a které jsou charakterizovány použitím transgenních rostlin, transgenního rostlinného materiálu nebo transgenního osiva podle předkládaného vynálezu. Vynález poskytuje takové zemědělské způsoby, kde se užívá transgenní rostlina nebo její potomstvo, které obsahují chimérický gen podle předkládaného vynálezu v množství dostatečném pro expresi k herbicidu rezistentní formy cílových proteinů herbicidu v rostlině, což jí uděluje toleranci k herbicidu.
Pro vypěstování/vyšlechtění potomstva rostlin transformovaných způsobem podle vynálezu, lze užít následující postup. Rostliny kukuřice, získané jak je popsáno v dále uvedených příkladech,
-23CZ 297325 B6 se pěstují v nádobách ve skleníku nebo v půdě tak, jak je v oboru známo, a ponechají se kvést. Ze zralých samčích vláken se získá pyl a použije se k opylení klasu téže rostliny, sesterské rostliny nebo jakékoliv jiné požadované rostliny kukuřice. Stejně tak klas vyvíjející se na transformované rostlině se může opylit pylem z téže rostliny, sesterské rostliny nebo jakékoliv jiné požadované rostliny kukuřice. Transformované potomstvo získané tímto způsobem se dá odlišit od netransformovaného potomstva tím, že obsahuje vnesený gen (geny) a/nebo srovnáním genomových DNA (genotypů) nebo příslušných fenotypů. Transformované potomstvo může být samosprášeno nebo kříženo s jinými rostlinami, tak jak se to dělá normálně s jakoukoliv rostlinnou nesoucí požadovaný znak. Podobně tabák nebo jiná transformovaná rostlina získaná tímto způsobem se může samosprášit nebo křížit způsobem známým v oboru, aby se získalo potomstvo požadovaných vlastností. Podobně také další transgenní organismy získané kombinací způsobů známých v oboru se způsoby podle vynálezu se mohou šlechtit způsoby v oboru známými, aby se získalo potomstvo požadovaných vlastností.
Modifikované enzymy protox rezistentní k inhibitoru podle předkládaného vynálezu mají alespoň jednu aminokyselinovou substituci, adici nebo deleci vzhledem k jejich přirozeně se vyskytujícímu protějšku (tj. formě citlivé k inhibitoru vyskytující se v rostlině aniž by byla jakkoliv geneticky ovlivňována člověkem, ať už přímo technikami genového inženýrství nebo nepřímo výběrovým šlechtěním). Polohy aminokyselin, které se mohou modifikovat, aby vznikla forma enzymu protox rezistentní k inhibitoru, nebo aby se zvýšila rezistence k inhibitoru, jsou uvedeny tučně vtab. 1 v souladu se sekvencemi rostlinné protox-1 zArabidopsis, kukuřice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže, čiroku a pšenice. Odborníkovi je zřejmé, že obdobné změny lze provést v jakémkoliv rostlinném genu protox, kterýje strukturně dostatečně podobný sekvencím genu protox uvedeným v této přihlášce tak, aby bylo možné porovnání a identifikace těch aminokyselin, které jsou modifikovány podle vynálezu pro vytvoření formy enzymu rezistentní k inhibitoru. Další rostlinné geny protox se dají získat pomocí standardních technik způsobem, kterýje popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/1B95/00452, podané 8. června 1995, publikované 21. prosince 1995 jako WO 95/34659, jejíž relevantní části jsou zde uvedeny jako odkazy.
Molekuly DNA kódující protox rezistentní k inhibitoru popsané zde se mohou modifikovat metodami genového inženýrství tak, aby se zajistila maximální exprese v plodině. To může zahrnovat změnu kódující sekvence rezistentní alely, aby se zajistila optimální exprese ve vybrané plodině. Způsoby úprav kódujících sekvencí pro dosažení optimální exprese u určitých druhů plodin jsou dobře známy (viz např. Perlak et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324, 1991, Koziel et al., Biotechnology 11: 194, 1993).
Sekvence kódující protox upravená technikami genového inženýrství pro optimální expresi může také obsahovat operativně spojené vhodné regulační sekvence (tj. promotor, signální sekvenci, terminátor transkripce). Mezi příklady promotorů schopných působit v rostlinných buňkách (tj. řídit expresi připojených strukturních genů, jako např. protox, v rostlinných buňkách) patří např. 19S promotor a 35S promotor z viru mozaiky květáku (CaMV) a také dvojitý promotor CaMV, promotory nopalinsyntázy, promotory proteinu (PR) patogeneze („pathogenesis-related“), promotory malé podjednotky ribulózbisfosfátkarboxylázy (ssuRUBISCO), promotory proteinu tepelného šoku hsp80 z Brassica (viz EPA 0 559 603), aktivovaný promotor z Arabidopsis, SuperMas promotor (viz WO 95/14098) a další. Výhodné promotory jsou takové promotory, které poskytují vysokou konstitutivní expresi, výhodnější jsou takové promotory, které poskytují specificky vysokou hladinu exprese v pletivech náchylných k poškození herbicidem. Mezi výhodné promotory patří aktinový promotor z rýže (McElroy et al., Molekula. Gen. genet 231: 150, 1991), ubichitinový promotor z kukuřice (EP 0 342 925, Taylor et al., Plant cell rep. 12: 491, 1993) a PROTEIN-1 promotor z tabáku, Arabidopsis nebo kukuřice (viz Ryals et al., patentové přihlášky EP 332 104 a USA 08/181271, zahrnuté plně v odkazech). Samotné promotory se mohou způsoby známými v oboru modifikovat tak, aby se ovlivnila síla promotoru a zvýšila exprese protox.
-24CZ 297325 B6
Vynálezci také zjistili, že další výhodný promotor pro použití se sekvencí kódující protox rezistentní k inhibitoru je promotor spojený s nativním genem protox (tj. protox promotor, viz. současně projednávanou Mezinárodní přihlášku s registračním číslem PH/5-20756/P1/CGC1846 s názvem „Promotory genů protoporfyrinogenoxidázy“, podanou ve stejný den jako předkládaná přihláška, na jejíž plné znění zde odkazujeme). Promotorová sekvence genu protox-1 zArabidopsisje zde uvedena jako sekvence id. č. 13, promotorová sekvence genu protox-1 z kukuřice je zde uvedena jako sekvence id. č. 14 a promotorová sekvence genu protox-1 z cukrové řepy je zde uvedena jako sekvence id. č. 26.
Vzhledem k tomu, že protox promotor sám je vhodný pro expresi sekvence kódující protox rezistentní k inhibitoru, modifikace se mohou provést přímo v nativním genu protox přítomném v genomu rostlinné buňky, aniž by bylo třeba vytvářet chimérický gen s heterologní regulační sekvencí. Takové modifikace mohou být uskutečněny technikami cílené mutageneze jako je např. homologní rekombinace a selekce na výsledný fenotyp rezistentní k herbicidu (viz Příklad 10 vPazkowski et al„ EMBO J. 7: 4021-4026, 1988 a patent USA 5 487 992, zejména sloupce 18-19 a Příklad 8). Další výhodou takového přistupuje to, že výsledný modifikovaný gen obsahuje, kromě nativního protox promotoru, také jakékoliv další regulační prvky, jako např. sekvence kódující signální nebo tranzitní peptidy, které jsou součástí nativního genu.
Signální nebo tranzitní peptidy se mohou fúzovat se sekvencí kódující protox v chimérických konstruktech DNA podle předkládaného vynálezu, aby se transport exprimovaného enzymu protox nasměroval do požadovaného místa působení. K příkladům signálních peptidů patří ty peptidy, které jsou přirozeně spojeny s rostlinnými proteiny patogeneze PR-1 a PR-2 a podobně (viz např. Payne et al„ Plant Mol. Biol. 11: 89-94, 1988). K příkladům tranzitních peptidů patří chloroplastové peptidy, které popsali VonHeijne et al. (Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126, 1991), Mazur et al. (Plant Physiol. 85: 1110, 1987) a Vorst et al. (Gene 65: 59, 1988) a mitochondriální tranzitní peptidy, které popsali Boutry et al. (Nátuře 328: 340-342, 1987). Tranzitní peptidy chloroplastů a mitochondrií se považují za zvláště užitečné podle předkládaného vynálezu, neboť enzymatická aktivita protox se typicky vyskytuje v chloroplastu nebo mitochondrii. Nejvýhodnější je použití chloroplastových tranzitních peptidů, neboť se má zato, že enzymatická aktivita protox právě v chloroplastu je prvotním cílem působení herbicidů inhibujících protox (Witkowski a Halling, Plant Physiol. 87: 632, 1988, Lehnen et al., Pestric. Biochem. Physiol. 37: 239, 1990, Duke et al., Weed Sci. 39: 465, 1091). Také sem patří sekvence, které vedou k umístění kódovaného proteinu do různých buněčných kompartmentů jako např. vakuoly (viz např. Neuhaus et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 10362-10366, 1991, Chrispeels, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53, 1991). Relevantní objevy popsané v těchto publikacích zahrnujeme mezi odkazy.
Chimérické konstrukty podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat více kopií promotoru nebo více kopií strukturních genů protox. Navíc mohou konstrukty obsahovat sekvence kódující markéry a sekvence kódující další peptidy jako jsou signální nebo tranzitní peptidy, z nichž každý je ve vhodném čtecím rámci společně s dalšími funkčními prvky v molekule DNA. Takové konstrukty může připravit průměrný odborník.
Mezi užitečné markéry patří peptidy, které poskytují rezistenci k herbicidům, antibiotikům nebo jiným chemickým látkám, jako je např. rezistence k hygromycinu, kanamycinu, G418, gentamycinu, lincomycinu, metothrexatu, glyphosatu, fosfinotricinu a pod. Tyto markéry se mohou použít pro výběr a odlišení buněk transformovaných chimérickými konstrukty DNA podle předkládaného vynálezu od buněk netransformovaných. Dalšími vhodnými markéry jsou peptidové enzymy, které se dají snadno detekovat viditelnou reakcí, např. barevnou reakcí, jako je např. luciferáza, β-glukuronidáza nebo β-galaktosidáza.
Způsob pozitivní selekce geneticky transformovaných buněk, do kterých se může vložit požadovaná nukleotidová sekvence, která poskytuje transformovaná buňce selektivní výhodu, je popsán ve WO 94/20627, na což se tímto odkazujeme.
-25CZ 297325 B6
Exprese v plastidech, kde jsou geny vloženy homologní rekombinací do všech z několika tisíc kopií cirkulámího plastidového genomu přítomných v každé rostlinné buňce, má výhodu enormního počtu kopií ve srovnání s geny exprimovanými v jádře, což dovoluje úroveň exprese která 5 může přesahovat 10 % celkového rozpustného proteinu v rostlině. Kromě toho je exprese v plastidech žádoucí proto, že znaky kódované plastidem jsou nepřenosné pylem a tudíž je zabráněno potenciálnímu riziku nechtěného úniku transgenu a přenosu na divoké příbuzné transgenních rostlin. Technologie transformace plastidů je podrobně popsána v patentech USA 5 451 513, 5 545 817 a 5 545 818, na jejichž plné znění odkazujeme, a v přihlášce PCT WO 95/16783, na io jejíž plné znění odkazujeme, a dále v článku McBride et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:
7301-7305, 1994, na jehož plné znění odkazujeme. Základní technika pro transformaci chloroplastů tabáku byla vyvinuta a zdokonalena v laboratoři, kterou vede Dr. Pal Maliga na Rutgers University (Piscattaway, New Jersey), a zahrnuje bombardování pletiva listu mikročásticemi, které obsahují úseky klonované plastidové DNA lemující selektovatelný markér rezistence k anti15 biotiku. Lemující úseky dlouhé 1 až 1,5 kb, nazývané zaměřovači sekvence, usnadňují homologní rekombinací v plastidovém genomu a tak umožňují nahradit nebo modifikovat specifický úsek v plastomu tabáku velkém 156 kB. Původně byly využity jako selektovatelný markér pro transformaci bodové mutace v chloroplastových genech pro 16S rRNA a rpsl2 udělujících rezistenci ke spectinomycinu a/nebo streptomycinu (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P., 1990, Proč. 20 Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530, na úplný text tohoto článku odkazujeme, a Staub, J. M.
a Maliga, P., 1992, Plant Cell 4, 39—45, na úplný text tohoto článku odkazujeme). To vedlo k stabilní homoplazmové transformaci s frekvencí asi 1 na 100 bombardování cílového listového pletiva. Přítomnost klonovacích míst mezi těmito markéry umožňuje vytvořit vektor cílený do plastidu pro vnášení cizorodých genů (Staub, J. M. a Maliga, P., EMBO J. 12: 601-606, 1993, na 25 úplný text tohoto článku odkazujeme). Bylo dosaženo podstatného zvýšení frekvence transformace tím, že se recesivní geny pro rRNA nebo r-protein rezistence k antibiotiku nahradily dominantně selektovatelným markérem, a sice bakteriálním genem aadA, který kóduje enzym aminoglykosid-3'-adenyltransferázu, který detoxikuje spectinomycin (Svab, Z. a Maliga, P., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 913-917, na úplný text tohoto článku odkazujeme). Předtím byl 30 tento markér úspěšně využit pro transformaci plastidového genomu zelené řasy Chlamydomonas reinhardtii s vysokou frekvencí (Goldschmidt-Clermont, M., 1991, Nucl. Acid. Res. 19, 40834089, na úplný text tohoto článku odkazujeme).
Předkládaný vynález se proto také týká chimérického genu obsahujícího rostlinný plastidový pro35 motor operativně spojený s izolovanou molekulou DNA, která kóduje buďto nativní rostlinný enzym protox nebo modifikovaný rostlinný enzym protox, jako je např. molekula DNA kódující nativní nebo modifikovaný enzym protox z pšenice, sóji, bavlníku, cukrové řepy, řepky olejky, rýže, nebo čiroku. Zvláště výhodný je rostlinný promotor plastidového genu clpP. Chimérický gen výhodně dále obsahuje 5'-netranslatovanou sekvenci (5'UTR) z plastidového promotoru 40 a 3'-netranslatovanou sekvenci (3'UTR) z plastidového genu operativně spojenou s izolovanou molekulou DNA. Výhodně 3'UTR je 3'-netranslatovaná sekvence plastidového genu rpsl6.
Předkládaný vynález dále zahrnuje vektor pro transformaci piastidu obsahující chimérický gen popsaný bezprostředně v předchozím textu, a také rostlinný plastid transformovaný tímto vekto45 rem pro transformaci plastidů, přičemž modifikovaný rostlinný enzym protox se exprimuje v rostlinném piastidu. Vynález se také týká rostliny nebo rostlinné buňky, nebo jejich potomstva, které obsahují rostlinný plastid, přičemž modifikovaný rostlinný enzym protox se exprimuje v rostlině a uděluje jí toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu protox.
Když se alela protox rezistentní k herbicidu získá cílenou mutací nativního genu v plodině (kulturní rostlině) nebo v buněčné kultuře, ze které se může plodina regenerovat, může se přenést do komerčních variet pomocí tradičních způsobů šlechtění, aby se vyšlechtila plodina tolerantní k herbicidu, aniž by se modifikovaná kódující sekvence měnila technikami genového inženýrství 55 a transformací přenesla do rostliny. Alternativně může být gen rezistentní k herbicidu izolován,
-26CZ 297325 B6 změněn technikami genového inženýrství pro optimální expresi a pak vnesen transformací do požadované variety.
Geny kódující změněnou protox rezistentní k inhibitorům protox se mohou použít také jako selektovatelné markéry v metodách transformace rostlinných buněk. Např. rostliny, rostlinné pletivo nebo rostlinné buňky mohou být transformovány genem kódujícím změněnou protox, která je schopná exprese v rostlině. Takto transformované buňky jsou pak přeneseny na médium obsahující inhibitor protox, kde přežijí jen transformované buňky. K inhibitorům protox, které mohou být užitečné jako selekční činidla, patří difenylétery (např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4(trifluormethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina a její methylester nebo oxyfluorfen, 2-chlorol-(3-etoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)), oxidiazoly, (např. Oxidiazon, 3-[2,4-dichloro5-(l-methyletoxy)fenyl]-5-(l,l-dimethylethyl)-l,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid, chloroftalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofitalimid), fenylpyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl-2-[l-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionát, M&B 39279), pyridinové deriváty (např. LS 82-556), fenopylát a jeho O-fenylpyrollidinové a piperidinokarbamátové analogy a bicyklické triazolony, což je popsáno v patentových přihláškách WO 92/04827 aEP 532146.
Způsob je použitelný pro jakoukoliv rostlinnou buňku schopnou transformace změněným genem kódujícím protox, a může se použít s jakýmkoliv požadovaným transgenem. Exprese transgenu a genu protox může být řízena stejným promotorem funkčním v rostlinné buňce nebo samostatnými promotory.
Modifikované enzymy protox rezistentní k inhibitoru podle předkládaného vynálezu jsou rezistentní k herbicidům, které inhibují aktivitu přirozeně se vyskytující protox. Herbicidy, které inhibují protox, zahrnují molekuly mnoha různých strukturních tříd (Duke et al., Weed Sci. 39: 465, 1991, Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193, 1992, Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35, 1989, Yanase a Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70, 1989). Tyto herbicidní sloučeniny zahrnují difenylétery (např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2nitrobenzoová kyselina a její methylester, nebo oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-etoxy-^l-nitrofenoxyj-4-ftrifluorobenzen), oxidi-azoly (např. oxidiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(l-methyl-etoxy)fenyl]-5-(l,l-dimethylethyl)-l,3,4-oxadiazol-2-(3H-on), cyklické imidy (např. S-23142, N(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid, chloroftalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylpyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl-2-[l-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitro-pyrazolyl-5-oxy]propionát, M&B 39279), pyridinové deriváty (např. LS 82-556), fenopylát a jeho O-fenylpyrrolidinové a piperidinokarbamátové analogy.
Zvláště významné difenylétery jsou podle obecného vzorce I,
Cl kde Rje -COONa (vzorec II), -CONHSO2CH3 (vzorec II) nebo COOCH2COOC2H5 (vzorec IV, viz et al., Brighton Crop Protection Conference- Weeds: 47-51, 1989).
Další zajímavé difenylétery jsou takové, kde R se rovná:
I4OCH2COOCH3
CCH2OCH3 (Viz Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58, 1989).
-27CZ 297325 B6
Další zajímavé difenylétery jsou podle vzorce:
(IVb) (Bifenox, viz dest et al., Proč. Northeast Weed Sci. Conf. 27: 31, 1973).
Další zajímavé difenylétery mají obecný vzorec IVc:
OCH2CH3
(Oxyfluorfen, viz Yih a Swithenbank, J. Agric. Food Chem. 23: 592, 1975).
Další zajímavý difenyléter má vzorec IVd:
(IVd)
(Laktofen, viz str. 623 v „The Pesticide Manual“, 10th ed., ed. C. Tomlin, British Crop Protection Council, Surrey, 1994).
Významná je také skupina herbicidů známá jako imidy, které mají obecný vzorec V:
(V) kde Q se rovná
-28CZ 297325 B6 nebo nebo nebo nebo nebo
O
N—
(VI) (VII) (VIII) (IX) (IXa) (IXb) (Viz Hemper et al., „Proceedings of the Eighth Intemational Congress of Pesticide Chemistry, Ragdale et al., eds., Amer. Chem. Soc., Washington, D:C:, S. 42^18, 1994), a kde R se rovná H, Cl nebo F, R2 je Cl a R3 je optimálně substituovaná éterová, thioéterová, esterová, aminová nebo alkylová skupina. Alternativně R2 a R3 společně mohou tvořit 5 nebo óčlenný heterocyklický kruh.
-29CZ 297325 B6
Zvláště zajímavé příklady imidových herbicidů uvádějí následující vzorce Vila, X, XI, XII, XIII, XIV, XV a XVI.
(Vila) (Fluthiacetmetyl, viz. Miyazawa et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 23-28, 1993).
(X)
CHjSOzNH (Sulfentrazon, viz Van Saun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 77-82, 1993).
(XI) (XII) (Viz Miura et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 35-40, 1993).
-30CZ 297325 B6 (XIII)
(XIV)
(XV) (XVI)
Herbicidní aktivita v předchozím textu uvedených sloučenin je popsána v Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds, British Crop protection Councel (vzorce X 5 a XVI), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds, British Crop
Protection Councel (vzorce XII a XIII) v patentu (JSA 4 746 352 (vzorec XI) a v Abstracts of the Weed Science Society of America 33, s. 9, 1993 (vzorec XIV).
Nejvýhodnější imidové herbicidy jsou ty, které patří do třídy aryluracilů a mají obecný vzo10 rec XVII
(XVII) kde R je (alkenyloxy)karbonylalkylová skupina, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 uhlíkových atomů a alkylová skupina obsahuje 1 až 4 uhlíkových atomů, jak je popsáno v patentu USA 5 183 492, na který se tímto odkazujeme.
-31 CZ 297325 B6 (XVIII)
Významné jsou také herbicidy podle následujících vzorců XVIIIa XIX
(Thiadiazimin, viz. Weler et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 29-34, 1993).
CH3CH2O
N-CHF2 (XIX) ch3 (Carfentrazon, viz. VanSaun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, s. 19-22, 1993), a dále N-substituované pyrazoly podle obecného vzorce XX
(XX) kde Ri je alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, volitelně substituovaná jedním nebo více halogenovými atomy,
R2 je vodík nebo alkyloxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž každá z nich může být substituována jedním nebo více halogenovými atomy, nebo
Ri a R2 společně tvoří skupinu -(CH2)n-X-, kde X je navázáno v R2, a R3 je vodík nebo halogenová skupina,
R4 je vodík nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku,
R5 je vodík, nitroskupina, kyanová skupina nebo skupina -COOR6 nebo CONR7R8, a
Re je vodík, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylová skupina se 2 až 6 atomy uhlíku nebo alkynylová skupina se 2 až 6 atomy uhlíku (viz mezinárodní patentové přihlášky WO 94/08999 a WO 93/10100 a patent US 5 405 829, udělený firmě Shering),
-32CZ 297325 B6 a dále N-fenylpyrazoly, jehož příklad ukazuje vzorec XXI
(XXI) (Nipyraclofen, viz. str. 621 v „Pesticide Manual“, 9th ed., ed. C. R. Worthing, British Crop Protection Councel, Surrey, 1991), a dále 2-aryM,5,6,7-tetrahydroindazoly substituované v poloze 3 (Lyga et al., Pesticide Sci. 42: 29-36, 1994), jejichž příklad ukazuje vzorec XXIa
(XXIa) (BAY 11340).
Významné jsou také fenylpyrazoly takového typu, který je popsán v přihláškách WO 96/01254 a WO 97/00246, na které se tímto odkazujeme (vzorec XXII).
Hladiny herbicidů, které normálně inhibují aktivitu protox, odpovídají aplikačním dávkám známým v oboru, a jsou do značné míry závislé na vnějších faktorech jako je prostředí a čas a způsob aplikace. Např. v případě imidových herbicidů představovaných vzorcem V až IX, a zvláště pak vzorcem X až XVII, aplikační dávky jsou v rozmezí od 0,0001 až do 10 kg/ha, výhodně od 0,005 do 2 kg/ha. Dávky nebo koncentrace herbicidu mohou být různé v závislosti na požadovaném účinku a použité sloučenině, a mohou být určeny způsoby v oboru známými.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace, který spočívá v tom, že se aplikuje na populaci rostlin, vybranou ze skupiny obsahující Arabidopsis, cukrovou třtinu, sóju, ječmen, bavlník, tabák, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové a pícninové trávy, proso, pícniny, rýži a další, účinné množství herbicidu inhibujícího protox. Výhodný je způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace, který se skládá z toho, že se aplikuje na populaci rostlin, vybraných ze skupiny obsahující sóju, bavlník, tabák,
-33CZ 297325 B6 cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, trávníkové trávy a rýži, účinné množství herbicidu inhibujícího protox. Zvláště výhodný je způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace, který se skládá z toho, že se aplikuje na populaci rostlin, vybraných ze skupiny obsahující Arabidopsis, sóju, bavlník, cukrovou řepu, řepku olejku, kukuřici, pšenici, čirok a rýži, účinné množství herbicidu inhibujícího protox.
Vynález je dále popsán následujícími podrobnými příklady. Tyto příklady slouží pouze k ilustraci vynálezu a v žádném případě ho nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Standardní techniky rekombinantní DNA a klonování molekul použité zde jsou v oboru známy a jsou popsány v publikacích: T. Maniatis, E. F. Fritsch a J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, a T. J. Šilhavý, M. L. Beraman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1984.
Část A: Izolace a charakterizace genů rostlinné protoporfyrinogenoxidázy (protox)
Příklad 1
Izolace Protox-1 cDNA z pšenice založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice
Celková RNA připravená z Triticum aestivum (cv. Kanzler) byla dodána firmě Clontech, kde byla připravena cDNA knihovna ve vektoru lambda Uni-Zap. Přibližně 50 000 pfu („plaque forming units“, jednotek tvořících plaky) z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5000 pfu na lOcm Petriho misky a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5, viz příklad 2 z Mezinárodní patentové přihlášky PCT/IB95/00452, podané 8. června 1995 a publikované 21. prosince 1995 jako WO 95/34659) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984, na plné znění této publikace se zde odkazujeme). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, Inc.). Nejdelší klon protox—1 cDNA pšenice získaný z počátečního screeningu, nazvaný „Protox-1 z pšenice“ byl dlouhý 1489 bp. Tento Protox-1 z pšenice postrádal kódující sekvenci pro tranzitní peptid a navíc asi 126 aminokyselin kódující sekvence maturovaného peptidu, jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox.
Druhý screening byl proveden, aby se získala delší cDNA protox z pšenice. Pro tento screening byla připravena interní cDNA knihovna z Triticum aestivum (cv. Kanzler) ve vektoru Lambda Uni-Zap. Přibližně 200 000 pfu z cDNA knihovny bylo testováno stejným způsobem jak je popsáno v předchozím odstavci, až na to, že se jako sonda použila Protox-1 cDNA z pšenice a hybridizace i odmývání proběhly při 65 °C místo 50 °C. Nejdelší cDNA z pšenice získaná v tomto screeningu byla nazvána „Protox-1 a z pšenice“ a byla dlouhá 1811 bp. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí kódovaná sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 9 a 10. Ze srovnání s jinými známými sekvencemi rostlinného protox peptidu a s odpovídající genomovou sekvencí vyplývá, že tato cDNA je buď plné délky nebo postrádá pouze několik kodonů tranzitního peptidu (tab. 1). Tato sekvence z pšenice má 91% identitu (95% podobnost) se sekvencí proteinu Protox-1 z kukuřice, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 6.
-34CZ 297325 B6
Protox-1 a z pšenice ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 19. března 1996 jako pWDC-13 (NRRL č. B-21545).
Příklad 2
Izolace Protox-1 cDNA ze sóji založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z Arabidopsis
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená ze sóji (cv. Williams 82, epikotyl) byla zakoupena od firmy Stratagene. Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5000 pfu na 1 Ocm Petriho misky a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na membránu Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z Arabidopsis (sekvence id. č. 1, viz příklad 1 z mezinárodní patentové přihlášky PCT/IB95/00452, podané 8. červena 1995 a publikované 21. prosince 1995 jako WO 95/34659) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA ze sóji nazvaný „Protox-1 ze sóji“ byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox (tab. 1). Protox-1 ze sóji je dlouhá 1847 bp a kóduje protein o velikosti 58,8 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 11 a 12. Protein ze sóji má 78% identitu (87 % podobnost) s proteinem Protox-1 z Arabidopsis.
Protox-1 ze sóji ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 15. prosince 1995 jako pWDC-12 (NRRLč. B—21516).
Srovnání predikovaných sekvencí aminokyselin příslušných proteinů kódovaných sekvencemi id. č. 2, 6, 10, 12, 15, 17, 19, 21 a 23 je uvedeno v následující tabulce 1. Srovnání predikovaných sekvencí aminokyselin příslušných proteinů kódovaných sekvencemi id. č. 4 a 8 je uvedeno v následující tabulce 2.
Tabulka 1
Srovnání sekvence aminokyselin Protox—1 z Arabidopsis („Arabpt—1“ sekvence id. č. 2), kukuřice („Mzpt-1“, sekvence id. č. 6), pšenice („Wtpt-1“, sekvence id. č. 10), sóji („Soybeanpt-l“, sekvence id. č. 12), bavlníku („Cottonpt-1“, sekvence id. č. 16), cukrové řepy („Sugpt-1“, sekvence id. č. 18), řepky olejky („Rappt-l“, sekvence id. č. 22) a čiroku („Sorghumpt-1, sekvence id. č. 24).
Srovnání bylo provedeno pomocí programu „Pile up“ „GCG Package, University of Wisconsin, Madison, WI). Polohy aminokyselin, které mohou být modifikovány podle předkládaného vynálezu, aby se získala nebo zvýšila rezistence k inhibitoru, jsou vyznačeny tučně.
-35 CZ 297325 B6
Rapept-1
MDLSLLRP.. QPFLSPFSNP FPRSRPYKPL
Arafcpt-1
MELSLuRPIT QSLLPSFSKP NLRLNVYKPL·
Sorghurrpt-1
Mzct-1
Wtpt-1
M ATATVAAASP LRGRVTGRPH
Ricept-1
Cottonpt-1
MTAL IDLSIZRSSP
SVSPFSIPHH
QHPPRFRKPF
Soybeairotl
MV SVFNEZLFPP NQTLLRPSIH
SPTSFFTSPT
RKFPRSRFNP
Sugpt-1
MKSMALSNCI
SGHYRGN2IM
LSIPCSLIGR
RGYYSHKKRR
100
Rapept-1
NLRCSVSGGS
WGSSTI33G
GGGKTVTADZ VTV333ISGL
CIAQALVTKH
Aratpt-1
RLRCSVAGG?
TVGSSKEEGG
G3T. TITTOC VTVGGGISGL
CIAQALATKH
Sorghunpt-1
ADC VWGGGISGL CTAQALATRH
Wtpt-1
RVRPRCKTAS SATETPAAPG VRL.. .SABC VIVGAGISGL CTAQALATRY
Ricept-1
Cottonpt-1
KLRCSLAEGP
Soybeanptl
ILRCSIAEHS
TASPPKIR.. DSA.. . FVDC
VWGGGVSGL
CIAQAIATKH
Sugpt-1
MSMSCSTSSG
SKSAVKEAGS GSGASGLLDC
VTVGGGISGL
CIAQALCTKH
101
150
Rapept-1
PDA.
AKNVM VTEAKDRVGG NIIT. -REEQ
GFLWEEEENS
FQPSDEMLTM
Aratpt-1 pm.
Sorghurrpt-1
Mzpt-1
GYUWEEGPNS
FQPSDWLSM
GYIWEBGHCS
FQPSDPVLIM
Wtpt-1
VSDLL. VTSARDRPGG NITTVERPDE
GYLWEEGPNS
FQPSDPVLIM
Ricept-1
Cottorrot-1
REV.
ASNVI VTEARERVGG NIITVFR. .D GYLWEESRSIS
FQPSDPILTM
Soybeanptl
NANW VTSARCRVGG KTTOÍER. .D GYLWSSGFNS
FQPSDRCU4
Sugpt-1
SSSSLSFNFI VTEAKERVGG NIVTVE. .AD GYIWEEEPNS
FQPSDAVLTM
-36CZ 297325 B6
151
Rapept-1 VVDSGLKDDL VLGDPTAPRF
Arakpt-1 WDSGLKDDL VLGDFTAPRF
Sorghunpt-l AVDSGLKDDL VFGDrNAPRF
Mzpt-1 AVDSGLKDDL VFGDFNAPRF
Wtpt-1 AVDSGLKDDL VFGDR4APRF
Riceot-1
Cottonpt-l AVDSGLKDDL VLGOEKAPRF
Soybeanptl WDSGLKDEL VLGDPDAPRF
Sugpt-1 AVDSGLKDEL VLGDINAPRF
200 VLXtfXIKLRPV PSKLTDLPFF DLMSIGGKIR VLříEKLREV PSKLTDLPFF DLMSIGGKIR VLI*SGKLRPV PSKPADLPFF DLMSIPGKLR VDWB3KLRIV PSKPADLPFF DLMSIPGKLR VLWEGKLRPV PSKPGDLPFF SLMSIPGKLR
VLÍiEGKLRPV PSKPTDLPFF DLMSIAGKLR
VUÍNRKLRPV PSKLTDLPFF DLMSIGGKIR
VnčEKLPPV PSSLTDLPFF DLMTIPGKIR
Rapept-1 Aratpt-1 201 AGFGAIGIRP SPPGREESVE AGFGALGIRP SPPGREESVE
Sorghunpt-1 AGLGALGIRP PAPGREESVE
Mzpt-1 AGLGALGIRP PPPGREESVE
Wtpt-1 AGLGALGIRP PPPGREESVE
Riceot-1
Cottonpt-l AGFGAIGIR? PPPGYEESVE
Soybeanptl AGFGALGIRP PPPGHEESVE
Suopt-1 AALGAIGFR? SPPPHEESVE
250 EFVRRNIGDS VFERLIEPFC SGVYAGDPAK EFVRRNLGCE VFERLIEPFC SGVYAGDPSK EFVRRNLGAE VFERLIEPFC SGVYAGDPSK EFVRRNLGAE VFERLIEPFC SGWAGDPSK EFVRRNLGAE VFERLIEPFC SGVYAGDPSK
EFVRRNLGAE VFERFIEPFC SGVYAGDPSK
EFVRRNLGDE VFERLIEPFC SGVYAGDPSK
EFVRRNLGDE VFERLIEPFC SGVYAGDPAK
251
300
Rapept-1 LSMKAAFGKV WKT.EENSGSI IGGAFXAIQA KNKAPKTTRD PRLPKPKGQT
Aratpt-1 LSMKAAFGKV WKLEQNGGSI IGGTFKAIQE RKNAPKAERD PRLPKPQGQT
Sorghwpt-1 LSMKAAFGKV WRLSEAGGSI IGGTIKTIQE RGKNPKPPRD PRLPKPKGQT
Mzpt-1 LSMKAAFGKV WRLESIGGSI IGGTIKTIQE RSKNPKPPRD ARLPKPKGQT
Wtpt-1 LSMKAAFGKV WRLEEIGGSI IGGTIKAIQD RGKNPKPPRD PRLPAPKGQT
Ricept-1 RALKAAFGKV VRLEDIGGSI IGGTIKTIQE RGKNPKPPRD PRLPTPKGQT
Cottonpt-l LSMKAAPGRV KKLEEIGGSI IGGTFKTIQE RNKTPKPPRD PRLPKPKGQT
Soybeanptl LSMKAAFGKV WKLEKNGGSI IGGTFKAIQE PNGASKPPRD PRLPKPKGQT
Sugpt-1 LSMKAAFGKV WKLE^KGGSI IG3TLKAIQE RGSNFKPPRD QRLPKPKGQT
-37CZ 297325 B6
301
Rapept-1 VGSFRKGLTM LPEAISARLG
Arabpt-1 VGSFRKGLRM LPEAISARLG
Sorghurrot-1 VASFRKGLAM LFNATPSSLG
Mzpt-1 VASFRKGLAM LFNAITSSLG
Wtpt-1 VASFRKGLAM LPNAIASRLG
Ricept-1 VASFRKGLTM LPDATTSRLG
Cottonpt-1 VGSFRKGLTM LPEAIANSIG
Sovbeanptl VGSERKGLTM LFDAISARLG
Sugpt-1 VGSFRKGLVM LFTAISARLG
350 DKVKVSÍ€KLS SITKLASGEY SLTYETPSGI SKVKLSWKLS GITKLESGGY NLTYETPDGL SKVKLSWKLT SMIKSDGKGY VLEYETPEGV SKVKLSWKLT SITKS3XKGY VLEYETPECV SKVKLSWKLT SITKAEN2GY VLGYETPBGL SKVKLSWKLT SITKSLMKGY ALVYETPEGV SNVKLSWKLS STTKUaJGGY NLTFETPBSI NKVKLSNKLS SISKLDSGEY SLTYETPEGV SRVKLSWILS SrVKSLNGEY SLTYDTPDGL
351
400
Rapept-1
VTVQSKSVVM
LRPLSDSAAE ALSKLYYPPV AAVSISYAKE
Arátpt-l
VSVQSKSWM
LRPLSESAAN ALSKLYYPPV AAVSISYPKS
Sorghurrpt-1
VLVQAKSVIM
TIPSYVASDI
LRPLSGDAAD VLSRFYYPPV AAVTVSYPKE
Mzpt-1
VSVQAKSVIM PIPSYVASvI
LRPLSSEAAD ALSRFYYPPV AAVTVSYPKE
Wtpt-1
VSVQAKSVIM TIPSYVASDI
LRPLSUAAD ALSKFYYPPV AAVTVSYPKE
Rioept-1
VSVQřCTVVM TIPSYVASDI
LRPLSSDAAD ALSIFYYPPV AAVTVSYPKS
Cottonpt-1
Scrybearptl
LHPLSAAAAD ALSQFYYPPV ASVTVSYPKE
LRPLSAAAAD ALSKFYYPPV AAVSISYPKE
Sugpt-1
VSVRIKSWM TvPSYVASRL LRPLSDSAAD
SLSKFYYPPV AAVSLSYPKE
401
450
Rapept-1 AIRSECLIEG FLKGFGQLHP RIQKVSIUJT IYSSSLFPNR APKRVLLLN
Aratpt-1 AIRTECLIDG ELKGFGQLHP RTQGVETLCT IYSSSLFPNR APPGRILLLN
Sorghurtpt-1 AXRKKZLLDS ELQGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APAGRVLLLN
Mzpt-1 AIRK3CLIDG FLQGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APCGRVLLLN
Wtpt-1 AIRKECLIEG FLQGFGQLHP RSQGVETlGT IYSSSLFPNR APAGRVLLLN
Ricept-1 AIRKECLIDG ELQGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APAGRVLLLN Cottonpt-1 AIRKECLIDG ELKGFGQÍHP RSQGIEILGT IYSSSLFPNR APSGRVLLLN Soybeanptl AIRSSCLIDS FLKGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APPGRVLLLN Sugpt-1 AIRSECLING ELQGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPGR APPGRILILS
-38CZ 297325 B6
451
500
Rapept-1
YIGGATNTGI LSKSEGELVE
AVDRDLRKML
IKPSSTOPLV LGVKLWPQAI
Arahpt-1
AVERDLRKML
IKHtfSTDPLK LGVRVWPQAI
Sorghurrpt-1
HGGMNIGI
VSKTESELVE
AVERDLRKML
INPTAVDPLV LGVRVWPQAI
Mzpt-1
YIGGAINIGI
VSKTESELVE AVERDLRKML
INSTAVDPLV LGVRVWPQAI
Wtpt-1
YIGGSINIGI
VSKTESDLVG AVDRDLRKML
INPRAADPLA LGVRVWPQAI
Ricept-1
YIGGSINIGI
VSKTESELVE AVERDLRKML
INPRAVDPLV LGVRVWPQAI
Cottonpt-1
YIGGMNIGI
LSKTEGELVS AVDRDLRKML
INPNAKDPLV LGVRVWEKAI
Soybeanptl
YIGGAINIGI
LSKTDSELVE TvDRDIRKIL
INPNAQDPFV VGVRLWPQAI
Sugpt-1
YIGGAKNPGI
LNKSKDSLAK TVEKDLRRML
INPDAKLPRV LGVRVWPQAI
Rapept-1
Aratpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottorpt-1
Soybeanptl
Sugpt-1
Rapept-1
Aratpt-1
Sorghunpt-1
Mzpt-1
Wtpt-1
Ricept-1
Cottorpt-1
Soybeanptl
Sugpt-1
501
550
PQFLIGHIDL VEAAKASLSS
SGHE3LFLGG NYVAGVALGR
SGYEGLRLGG NYVAGVALGR
CVEGAYETAT
CVEGAYEEAI
PQFLVGHLDL LEAAKSALEQ
PQFLVGHLDL LEAAKAALDR
GGYNGLFLGG NYVAGVALGR
PQFLIGHLDR LAAAKSALGQ GGYEGLFLGG
KYVAGVALGR
CIEGAYESAA
CVEGAYESAS
CIEGAYESAS
PQFLIGHLDH
LEAAKSALGK
NYVAGVALGR
CVEGAYESAS
PQFLVGHLDL
LDSAKMAIRD
SGFHGLFLGG
NYVSGVALGR
CVEGAYEVAA
PQFLVGHLDL
LDvAKASIRN
NYVSGVALGR
CVEGAYEVAA
PQFSIGHFDL
LDAAKAALTD
TGVKGLFLGG NYVSGVALGR
CIEGAYESAA
551
563
QVNDFMSRYA. YK*
EVNNFMSRYA YK*
QIYDFLTKYA YK*
QISDELTKYA YK*
QVSDFLTKYA YK*
QISDYLTKYA YK*
EVKEFLSQYA YK*
EVNDFLINRV YK*
EWDFLSQYS EK*
-39CZ 297325 B6
Tabulka 2
Srovnání sekvencí aminokyselin Protox-2 z Arabidopsis (sekvence id. č. 4) a z kukuřice (sekvence id. č. 8).
Shodné aminokyselinové zbytky jsou označeny svislou čárkou mezi sekvencemi. Srovnání je provedeno programem „GAP“, který popsali Deveraux et al. (Nucl. Acid Res. 12: 387-395, 1984).
io Procenta podobnosti: 75,889
Procenta identity: 57,905
Srovnávané sekvence: Protox-2.Pep x Mzprotox-2.Pep
............................MASGAVAD.HQIEAVSGKRVAV 21
MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 50
VGAGVSGLAAAYKLKSRC-LNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71
I! 11 i 111111! ·· I = · l· iH! 111 · = Μ 11 = I · -1--11(1111
VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDSGANT 100
MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPZSQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121
1((:( (--(:(1111-:(1(:( I ! - Μ I I I : : I · I - - I - = I I - I 101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150
122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167
I I I lil - I I - : : = I I I I : I! .|:|||- -lll-l :(11(-(
151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200
-40CZ 297325 B6
168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217
I li |: : I I I l: I I i I d I : I ! I ’= = 1 - II - 1 I I : 1 -· - d l· IIIII dd
201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250
218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267
251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300
268 VLSLS. .YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ. . .NPHYDAVIMTAPLCNVK 312 lili- = : = -- = dld- 1-=··=== I- =111111111=11=
01 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350
313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 3 62
II- II1-1- Id11·:d= 111 ··· d-1-1 = 11d IIII11III I
351 RMKFTKGGAPWLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400
363 E.QKHGFKTLGTLFSSIíMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411
I 1111 d 11111111111111 -1 -1 dlllldlld-dl Id- I
401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450
412 KQWTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461
II d JI 11 - d 11111 d - Id II -lilií: -1 -11 d 11 d 11 - =
451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN 500
462 LPGFFYAGNHRGGLSVGXSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509
501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*... 545
Příklad 3
Izolace Protox-1 cDNA zbavlníku založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená z Gossypium hirsutum L. (děložní lístky pěstované 72 hodin ve tmě) byla získána od Dr. Dicka Trelease, Dept. of Botany, Arizona Statě 10 University (Ni, W. a Trelease, R. N., Arch. Biochem. Biophys. 289: 237-243, 1991). Přibližně
000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5 000 pfu na lOcm Petriho misky a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na membránu Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% 15 dodecylsuifátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:
-41 CZ 297325 B6
1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA z bavlníku nazvaný „Protox-1 z bavlníku“ byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidů protox (tab. 1). Protox-1 z bavlníku je dlouhá 1826 bp a kóduje protein o velikosti 58,2 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 13 a 14. Protein z bavlníku má 77% identitu (86% podobnost) s proteinem Protox-1 z kukuřice.
Protox-1 z bavlníku ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 1. července 1996 jako pWDC-15 (NRRLč. B-21594).
Příklad 4
Izolace Protox-1 cDNA z cukrové řepy založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z Arabidopsis
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená z Beta vulgaris byla získána od Dr. Philip Rea, Dept. of Botany, Plant Science Institute, Philadelphia, PA (Yongcheol Kim, Eugene J. Kim a Philip A. Rea, Plant Physiol. 106: 375-382, 1994). Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBlueScript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA z cukrové řepy nazvaný „Protox-1 z cukrové řepy“ byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidů protox (tab. 1). Protox-1 z cukrové řepy je dlouhá 1910 bp a kóduje protein o velikosti 60 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 15 a 16. protein z cukrové řepy má 73% identitu (82% podobnost) s proteinem Protox-1 z Arabidopsis.
Protox-1 z cukrové řepy ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 29. července 1996 jako pWDC-16 (NRRL č. B-21595).
Příklad 5
Izolace Protox-1 cDNA z řepky olejky založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z Arabidopsis
Knihovna cDNA v Lambda Uni-Zap připravená z Brassicae napus (3 až 4 týdny staré dospělé zelené listy) byla získána od Dr. Guenthera Ochse, Institute fuer allgemeine Botanik, Johannes Guttenbeg-Universitaet Mainz, Deutschland (Guenther Ochs, Gerald Schock a Aloysius Wild, Plant Physiol 103: 303-304, 1993). Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA ϊ Arabidopsis (sekvence id. č. 1) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizují plaky byly pře
-42CZ 297325 B6 čištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBlueScript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA z řepky olejky označený „Protox-1 z řepky olejky“ byl klon plné délky jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidů protox (tab. 1). Protox-1 z řepky olejky je dlouhá 1784 bp a kóduje protein o velikosti 57,3 kDa. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 17 a 18. Protein z řepky olejky má 87% identitu (92% podobnost) s proteinem Protox-1 z Arabidopsis.
Protox-1 z řepky olejky ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 23. srpna 1996 jako pWDC-17 (NRRLč. B-21615).
Příklad 6
Izolace Protox-1 cDNA z rýže založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice
Knihovna cDNA v Lambda gtl 1 připravená z Oryza sativa (etiolované výhonky staré 5 dnů) byla zakoupena od firmy Clontech. Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizují plaky byly přečištěny a lambda DNA byla získána pomocí soupravy „Wizard Lambda-Prep“ (Promega). Inzerty cDNA byly subklonovány jako EcoRI fragmenty do vektoru pBlueScript standardní technikou. Sekvence inzertů cDNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA z rýže nazvaný „Protox-1 z rýže“ byl klon dlouhý 1224 bp. Tento Protox-1 z rýže postrádal kódující sekvenci pro tranzitní peptid a navíc asi 172 aminokyselin kódující sekvence maturovaného peptidů, jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidů protox. Nukleotidová sekvence této cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 19 a 20.
Protox-1 z rýže ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 6. prosince 1996 jako pWDC-18 (NRRLč. B-21648).
Příklad 7
Izolace Protox-1 cDNA z čiroku založená na sekvenční homologii se sekvencí kódující Protox-1 z kukuřice
Knihovna cDNA v Lambda-Zap II připravená ze Sorghum bicolor (zelené semenáčky staré 3 až 6 dnů) byla získána od Dr. Klause Pfízenmeyera, Institute of Cell biology and Immunology, University of Stuttgart, Germany (Herald Wajant, Karl-Wolfgang Mundry a Klaus Pfínzenmaier, Plant. Mol. Biol. 26: 735-746, 1994). Přibližně 50 000 pfu z cDNA knihovny bylo vyseto v hustotě 5000 pfu na lOcm Petriho misku a byly vytvořeny otisky (duplikáty) na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell). Byl proveden screening duplikátů plaků pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence id. č. 5) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace proběhla v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA při 50 °C. Podmínky pro odmývání byly 2xSSC, 1% SDS při 50 °C (Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984). Pozitivně hybridizující plaky byly
-43CZ 297325 B6 přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů cDNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Nejdelší získaný klon cDNA z čiroku označený „Protox-1 z čiroku“ byl klon dlouhý 1590 bp. Tento Protox-1 z čiroku postrádal kódující sekvenci pro tranzitní peptid a navíc asi 44 aminokyselin kódující sekvence maturovaného peptidu, jak vyplývá ze srovnání s dalšími známými sekvencemi rostlinného peptidu protox. Nukleotidová sekvence této neúplné cDNA a jí odpovídající sekvence aminokyselin jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 21 a 22.
Protox-1 z čiroku ve vektoru pBlueScript SK byla uložena 6. prosince 1996 jako pWDC-19 (NRRL č. B-21649).
Příklad 8
Demonstrace citlivosti klonu rostlinné protox k herbicidům inhibujícím protox v bakteriálním systému.
Tekuté kultury Protox-1/SASX38, Protox-2/SASX38 a pBlueScript/XLI-Blue byly pěstovány v médiu L amp100. 100μ1 alikvoty z každé kultury byly vysety na médium L amp100 obsahující různé koncentrace (Ι,ΟηΜ až lOmM) aryluracilového herbicidu inhibujícího protox podle vzorce XVII. Sady misek ve dvou opakováních byly inkubovány 18 hodin při 37 °C.
Kmen XLl-Blue protox+ E. coli nejevil citlivost k herbicidu při žádné koncentraci, což je v souladu s popisovanou rezistencí nativního bakteriálního enzymu k podobným herbicidům. Protox-1/SASX38 byl jasně citlivý, neboť bakteriální trávník byl téměř úplně eliminován již při lOnM koncentraci. Protox-2/SASX38 byl také citlivý, ale jen při vyšších koncentracích (10 μΜ) herbicidu). Herbicid byl účinný i když byly misky udržovány téměř úplně ve tmě. Toxicita herbicidu byla úplně eliminována přidáním 20 pg/ml hematinu na misky.
Rozdíl v toleranci k herbicidu mezi dvěma rostlinnými kmeny protox je pravděpodobně důsledkem různé exprese ze dvou použitých plazmidů než vrozený rozdíl citlivosti enzymu. Protox1/SASX38 rostly mnohem pomaleji než Protox-2/SASX38 vjakémkoliv médiu neobsahujícím hem. navíc kmen MzProtox-2/SASX38 s růstovou rychlostí srovnatelnou s ArabProtox1/SASX38 je také velmi citlivý k herbicidu při nižších (10 až lOOnM) koncentracích.
Část B: Identifikace a charakterizace rostlinných genů protox rezistentních k herbicidům inhibujícím protox
Příklad 9
Selekce rostlinných genů protox rezistentních k herbicidům inhibujících protox v expresním systému E. coli
Knihovna cDNA z Arabidopsis thaliana (Landsberg) v plazmidovém vektoru pFK61 (minet etal., Plant J. 2: 417-422, 1992) byla získána a amplifíkována. Mutanata E. coli hemG SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297, 1979) byla získána a udržována v L médiu obsahujícím 20 pg/ml hematinu (United States Biochemicals). Plazmidová knihovna byla transformována do bakterií SASX38 elektroporací pomocí zařízení „Bio-Rad Gene Pulser“ za podmínek doporučených výrobcem. Buňky pro elektroporací byly vysety na L agar obsahující 100 pg/ml ampicilinu v hustotě přibližně 500 000 transformant/lOCM miska. Buňky pak byly inkubovány 40 hodin při 37 °C v nízkém světle a selektovány na schopnost růstu bez přídavku exogenního hernu. Buňky prototrofní na hem byly získány s frekvencí 400/107 z knihovny pFL61. Analýza sekvencí 22 komplementujících klonů ukázala, že 9 z nich bylo typu označeného „Protox-1“, tj. protox gen který by měl exprimovat chloroplastový enzym protox.
-44CZ 297325 B6
Knihovna pFL61 je kvasinková expresní knihovna, kde jsou cDNA zArabidopsis vloženy obousměrně. Tyto cDNA mohou být exprimovány také v bakteriích. Protox cDNA zjevně začíná ATG ve čtecím rámci na 3'-konci kvasinkové sekvence PGK přibližně 10 aminokyselin 5'-směrem ke klonovacímu místu Notl ve vektoru a je exprimována buď z promotoru lacZ vzdáleného 300 bp „upstream“ (proti směru transkripce) nebo z nedefinovaného kryptického bakteriálního promotoru. Protože Protox-1 cDNA obsahující značný úsek chloroplastové tranzitní sekvence inhibuje růst kmene E. coli SASX38, pro selekční pokusy s mutagenezí a selekcí s herbicidy byl vybrán klon s nejmenším úsekem připojené chloroplastové tranzitní sekvence. Tento klon, pSLV19, obsahuje pouze 17 aminokyselin z předpokládaného chloroplastového tranzitního peptidu, jehož sekvence začíná v poloze odpovídající 151. bp sekvence cDNA Protox-1 zArabidopsis (sekvence id. č. 1).
Plazmid pSLV19 byl transformován do náhodně mutagenního kmene XL-Red (Stratagene, La Jolla, CA). Transformanty byly vysety na L médium obsahující 50 pg/ml ampicilinu a inkubovány 48 hodin při 37 °C. Trávníky transformovaných buněk byly seškrábnuty z misek a plazmidová DNA byla připravena pomocí soupravy „Wizard Megaprep“ (Promega, Madison, Wl). Plazmidová DNA izolovaná z tohoto mutátorového kmene by měla obsahovat přibližně 1 náhodnou změnu báze na 2000 nukleotidů (viz Greener et al., Stratagene 7(2): 32-34, 1994).
Mutovaná plazmidová DNA byla transformována do mutanty hemG SASX38 (Sasarman et al., J. gen Microbiol 113: 297, 1979) a vyseta na L médium obsahující různé koncentrace herbicidu inhibujícího protox. Misky byly inkubovány 2 dny při 37 °C. Plazmidová DNA byla izolována ze všech kolonií, které rostly v přítomnosti herbicidu v koncentracích, které účinně zabíjejí kmen divokého typu. Izolovaná DNA pak byla transformována do SASX38 a vyseta opět na půdu s herbicidem, aby se zajistilo, že pozorovaná rezistence je opravdu nesena plazmidem. Sekvence kódující protox, která prošla tímto výběrem, byla vystřižena pomocí Notl a znovu klonována do nemutujícího vektoru a testována znovu, aby se ověřilo, že má schopnost udílet toleranci k herbicidu. Sekvence cDNA protox, které nesly rezistenci k herbicidu, byla určena a mutace byly identifikovány srovnáním se sekvencí divokého typu Protox-1 zArabidopsis (sekvence id. č. 1).
Jediná mutanta kódující sekvence byla získána z první pokusné mutageneze. Tato mutace vedla ke zvýšené „rezistenci“ k herbicidu pouze tím, že zvýšila růstovou rychlost. Obsahuje mutaci A za C v poloze odpovídající 197. nukleotidu v sekvenci id. č. 1 ve zkrácené chloroplastové tranzitní sekvenci v pSLV19, která mění kodon ACG pro threonin na AAG pro lysin v poloze 56. aminokyseliny v sekvenci id. č. 2. a vede k lepší komplementaci bakteriálního mutanta. Plazmid obsahuje také umlčenou mutaci v kódující sekvenci v 1059. nukleotidu, kde se AGT (Ser) mění na AGC (Ser). Plazmid byl označen pMut-1.
Plazmid pMut—1 byl poté transformován do mutátorového kmene XL1—Red jak bylo popsáno v předchozím textu a mutovaná DNA byla izolována a přenesena na koncentraci herbicidu, která je letální pro nemutovaný protox gen v pMut-Ι. Kolonie tolerantní k herbicidu byly izolovány po dvou dnech v 37 °C a byly analyzovány postupem, který byl popsán v předchozím textu. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala, že rezistentní geny spadají do dvou tříd. Jedna rezistentní mutace byla identifikována jako změna C na T v poloze odpovídající 689. nukleotidu v sekvenci Protox-1 zArabidopsis uvedené zde jako sekvence id. č. 1. Tato výměna způsobuje změnu kodonu GCT pro alanin v poloze odpovídající 220. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 na kodon GTT pro valin, a byla označena pAraC-1 Val.
Druhá třída mutantů rezistentní k herbicidu obsahuje změnu A na G v 1307. nukleotidové poloze sekvence Protox-1 zArabidopsis. Tato záměna způsobuje změnu kodonu TAC pro tyrosin v poloze odpovídající 426 aminokyselině na kodon TGC pro cystein, a byla označena pAraC2Cys.
-45CZ 297325 B6
Třetí rezistentní mutant má záměnu A za G v 691. nukleotidové poloze sekvence Protox-1 zArabidopsis. Tato záměna způsobuje změnu kodonu GGT pro glycin v poloze odpovídající 221. aminokyselině na kodon AGT pro serin v poloze sousedící s mutací v pAraC-1. Tento plazmid byl označen pAraC-3Ser.
Rezistentní mutant pAraC-2Cys v plazmidů pMut-1 byl uložen 14. listopadu 1994 pod označením pWDC-7 ve sbírce Agricultural Research Culture Collection a dostal depozitní č. NRRL 21339N.
Příklad 10
Další substituce v kodonech rezistentních k herbicidu v polohách identifikovaných v náhodném screeningu
Aminokyseliny identifikované jako místa rezistence k herbicidu při náhodném screeningu se nahradí jinými aminokyselinami a pak se testuje funkčnost a tolerance k herbicidu v bakteriálním systému.
Oligonukleotidy cílená mutageneze sekvence Protox-1 zArabidopsis byla provedena pomocí soupravy „Transformer Site-directed Mutagenesis“ (Clontech, Palo Alto, CA). Poté, co se potvrdily změny aminokyselin sekvenční analýzou, jsou mutované plazmidy vneseny transformací do SASX38 a vysety na L-amp100 médium, aby se testovala funkce na různých koncentracích herbicidu inhibujícího protox pro ověření tolerance.
Tento postup byl použit pro alaninový kodon zahrnující polohy 668 a 690 a pro tyrosinový kodon zahrnující nukleotidy 1306-13088 v sekvenci Protox-1 z Arabidopsis (sekvence id. č. 1). Výsledek ukazuje, že alaninový kodon zahrnující nukleotidy 688 až 690 může být změněn na kodon pro valin, threonin, leucin, cystein nebo isoleucin, aby vznikl enzym protox rezistentní k herbicidu, který si zachovává svou funkci. Výsledky dále ukazují, že tyrosinový kodon zahrnující nukleotidy 1306 až 1308 může být změněn na kodon pro cystein, isoleucin, leucin, threonin, methionin, valin nebo alanin, aby vznikl enzym protox rezistentní k herbicidu, který si zachovává svou funkci.
Příklad 11
Izolace dalších mutací, které zvyšují enzymovou funkci a/nebo toleranci k herbicidu u dříve identifikovaných rezistentních mutantů
Plazmidy obsahující geny protox rezistentní k herbicidu se transformují do mutátorového kmene XLl-Red a mutovaná DNA je izolována jak bylo popsáno dříve. Mutované plazmidy jsou transformovány do SASX38 a transformanty jsou podrobeny screeningu na koncentraci herbicidu dostatečné k inhibici růstu původních „rezistentních“ mutantů. Tolerantní kolonie jsou izolovány a u fenotypů s vyšší tolerancí se ověřuje závislost na kódující sekvenci jak bylo popsáno v předchozím textu. Stanoví se sekvence těchto mutantů a mutace se identifikují srovnáním s původní sekvencí předchůdce.
Tento postup byl užit pro mutanta pAraC-lVal, jak je popsáno v předchozím textu. Výsledky ukazují, že serinový kodon odpovídající poloze 305. aminokyseliny (sekvence id. č. 2) může být změněn na kodon pro leucin, což vede k enzymu s vyšší tolerancí k herbicidům inhibujícím protox než jakou má mutant pAraC-lVAl. Mutace ve druhém místě byla nazvána AraC305Leu. Stejné výsledky jsou ukázány pro threoninový kodon v poloze odpovídající 249. aminokyselině, kde změna na isoleucin nebo alanin vede k enzymu s vyšší tolerancí. Tyto změny byly označeny AraC249Ile a AraC249Ala.
-46CZ 297325 B6
Tento postup byl užit pro mutanta pAraC-2Cys, jak je popsáno v předchozím textu. Výsledky ukazují, že prolinový kodon odpovídající poloze 118. aminokyseliny (sekvence id. č. 2) může být změněn na kodon pro leucin, což vede k enzymu s vyšší tolerancí k herbicidům inhibujícím protox než jakou má mutant pAraC-ICys. Tato mutace byla nazvána AraCl 18Leu.
Stejné výsledky jsou ukázány pro serinový kodon v poloze odpovídající 305. aminokyselině, kde změna na isoleucin nebo alanin vede k enzymu pAraC-2Cys s vyšší tolerancí. Tato změna byla izolována také na mutantovi pAraC-lVal popsaném v předchozím textu a mutant byl nazván AraC305Leu. Další mutace zvyšující rezistenci k herbicidu mutanta pAraC-2Cys zahrnují změnu asparaginu na serin v poloze odpovídající 425. aminokyselině, nazvanou AraC425Ser, a změnu tyrosinu na cystein v poloze odpovídající 498. aminokyselině, nazvanou AraC498Cys.
Tyto změny jsou nazvány mutacemi „druhého místa“, protože samy nejsou dostatečné k udělení tolerance k herbicidu, ale spíše zvyšují funkci a/nebo toleranci k herbicidu již mutovaného enzymu. To předem nevylučuje možnost, že jiné substituce aminokyselin v těchto místech budou stačit ke vzniku enzymu tolerantního k herbicidu, neboť nebyl proveden vyčerpávající screening všech možných náhrad.
Příklad 12
Kombinace identifikovaných mutací rezistence s identifikovanými mutacemi druhého místa vedoucí k vytvoření vysoce funkčního/vysoce tolerantního enzymu protox
Bylo zjištěno, že mutace AraC305Leu popsaná v předchozím příkladu zvyšuje funkci/rezistenci k herbicidu obou mutovaných plazmidů AraC-lVal a AraC-2Cys. Ve snaze otestovat obecnou užitečnost této mutace druhého místa, byla kombinována s mutacemi AraC-2Leu, AraC-2Val a AraC-2Ile a pak bylo provedeno testování tolerance k herbicidu. V každém případě změna AraC305Leu zvýšila významně růstovou rychlost rezistentního mutanta protox na herbicidu inhibujícím protox. Kombinace rezistentního mutanta AraC-2Ile s mutací druhého místa buď AraC249Ile nebo AraCl 18Leu také vedla ke vzniku mutovaného enzymu protox s vyšší tolerancí. Mutace AraC249Ile ukazuje, že mutace druhého místa, která zvyšuje toleranci mutanta AraC-1 může také zvýšit rezistenci mutanta AraC-2. Plazmid se třemi mutacemi obsahující AraC-2Ile, AraC3051eu a AraC249Ile také produkoval vysoce funkční enzym protox-1 s vysokou tolerancí k herbicidu.
Příklad 13
Identifikace míst v genu Protox-1 z kukuřice, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Plazmid pMut-1 obsahující protox-1 z. Arabidopsis popsaný v předchozím textuje velmi účinný v experimentech mutageneze/screening, kde poskytuje pravé mutanty s mutací v kódující sekvenci na rozdíl od mutant s mutací před promotorem, které vznikají často při použití jiných plazmidů. Ve snaze vytvořit účinný systém pro screening plazmidů s Protox-1 z kukuřice byla cDNA z kukuřice vložena do vektoru pMut-1 přibližně ve stejném sekvenčním kontextu jako cDNA z Arabidopsis. Pomocí standardní techniky PCR s překrývající fúzí byl fúzován 5'-konec klonu pMut-1 Arabidopsis (včetně 17 aminokyselin chloroplastového tranzitního peptidu s jednou mutací měnící smysl popsanou v předchozím textu) s cDNA sekvencí Protox-1 z kukuřice, která začíná aminokyselinou v poloze 14 (sekvence id. č. 6) sekvence z kukuřice. 3'-konec sekvence cDNA z kukuřice zůstal nezměněn. Na oba konce fúzního genu byla vnesena restrikční místa Notl a chimérický gen byl klonován do plazmidového páteře pFLól vektoru pMut-1. Analýza sekvence ukázala jednonukleotidovou umlčenou mutaci způsobenou PCR, která mění kodon
-47CZ 297325 B6
ACG zahrnující nukleotidy 745 až 747 (sekvence id. č. 5) na kodon ACT, přičemž oba tyto kodony kódují threonin. Plazmid obsahující chimérický gen Protox-1 Arab-kukuřice byl označen pMut3.
Plazmid pMut-3 byl poté transformován do mutátorového kmene XLl-Red jak bylo popsáno v předchozím textu a mutovaná DNA byla izolována a přenesena na koncentraci herbicidu, která je letální pro nemutovaný protox gen v pMut-3. Kolonie tolerantní k herbicidu byly izolovány po dvou dnech v 37 °C a byly analyzovány postupem, který byl popsán v předchozím textu. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala pět záměn jednotlivých bází, které individuálně vedly k enzymu Protox-1 z kukuřice tolerantnímu k herbicidu. Tři z těchto mutací odpovídají změnám aminokyselin, u kterých se dříve ukázalo, že vedou k toleranci vhomologní poloze v genu Protox-1 z Arabidopsis. Dvě z nich jsou pMzC-1 Val a pMzC-IThr, které mění alanin (GCT) odpovídající 164. aminokyselině (sekvence id. č. 6) buď na valin (GAT) nebo threonin (ACT). Tato poloha odpovídá mutacím v pAraC-1 popsaným již v předchozím textu. Třetí analogická záměna mění glycin (GGT) odpovídající 165. aminokyselině na serin (AGT) odpovídá mutaci AraC-3Ser popsané již v předchozím textu. Tyto výsledky slouží k ověření toho, co jsme očekávali, a sice že mutace tolerantní k herbicidu identifikované v jednom rostlinném genu protox mohou poskytovat toleranci k herbicidu v odpovídajícím rostlinném genu protox z jiného druhu.
Dvě z mutací izolovaných z Protox-1 z kukuřice vedly ke změnám aminokyselinových zbytků, které nebyly dříve identifikovány jako místa rezistence k herbicidu. Jedna změna vedla ke změně cysteinu (TGC) na fenylalanin (TTC) v poloze 159. aminokyseliny Protox-1 kukuřice (sekvence i.č. 6). Druhá změna mění isoleucin (ATA) na threonin (ACA) v poloze 419. aminokyseliny.
Další substituce aminokyselin byly vytvořeny a testovány ve třech z mutantních míst kukuřice. Byla prokázána tolerance, když glycin 165 byl změněn na leucin nebo když cystein 159 byl změně buď na leucin nebo lysin. Tolerantní enzymy byly také vytvořeny změnou isoleucinu 419 na histidin, glycin nebo asparagin.
Jednotlivé záměny aminokyselin, které u Arabidopsis vedly ke vzniku enzymu Protox-1 s vysokou tolerancí, byly vneseny do genu Protox-1 z kukuřice místně cílenou mutagenezí, jak bylo popsáno v předchozím textu. Test v bakteriálním systému ukázal, že změna alaninu (GTC) v poloze odpovídající 164. aminokyselině (sekvence id. č. 6) na leucin (CTT) vedla ke vzniku vysoce tolerantního enzymu z kukuřice. Žádný mutant analogický místu AraC-2 v Arabidopsis nebyl izolován v náhodném screeningu kukuřice. Avšak změna tohoto místa, kdy se tyrosin v poloze 370 enzymu z kukuřice (sekvence id. č. 6) mění buď na isoleucin nebo methionin, vedla k enzymu tolerantnímu k herbicidu.
Příklad 14
Identifikace míst v genu Protox-1 z pšenice, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Aby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 z pšenice byla cDNA z pšenice vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici. Chimérický plazmid Arabpšenice protox byl označen pMut-4. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala 7 záměn jednotlivých bází, které individuálně vedly k enzymu Protox-1 z kukuřice tolerantnímu k herbicidu. Čtyři z těchto mutací odpovídají změnám aminokyselin, u kterých se dříve ukázalo, že vedou k toleranci v homologní poloze v genu Protox-1 z Arabidopsis nebo kukuřice. Dvě z nich mění alanin (GCT) v poloze 211. aminokyseliny (sekvence id. č. 10) buď na valin (GAT) nebo threonin (ACT). Tato poloha odpovídá mutacím v pAraC-1 popsaným již v předchozím textu. Třetí analogická záměna mění glycin (GGT) odpovídající 212. aminokyselině na serin (AGT) odpovídá mutaci AraC-3Ser
-48CZ 297325 B6 popsané již v předchozím textu. Čtvrtá mění isoleucin (ATA) na threonin (ACA) v poloze 466. aminokyseliny, což odpovídá mutantovi Mz419Thr z kukuřice. Tři z mutací izolovaných z Protox-1 z pšenice vedly ke změnám aminokyselinových zbytků, které nebyly dříve identifikovány jako místa rezistence k herbicidu. Jedna změna vedla ke změně valinu (GTT) na leucin (CTT) v poloze odpovídající 356. aminokyselině sekvence Protox-1 pšenice (sekvence id. č. 10). Druhá mění serin (TCT) na prolin (CCT) v poloze 421. aminokyseliny. Třetí mění valin (GTT) na alanin (CCT) v poloze 502. aminokyseliny.
Příklad 15
Identifikace míst v genu Protox-1 ze sóji, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Aby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 ze sóji byla cDNA z pšenice vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici. Chimérický plazmid Arabsója protox byl označen pMut-5. DNA pMut-5 byla mutována a podrobena screeningu na toleranci k herbicidu stejně jak bylo již v předchozím textu popsáno. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala 4 záměny jednotlivých bází, které individuálně vedly k enzymu Protox-1 ze sóji tolerantnímu k herbicidu. Dvě z těchto mutací odpovídají změnám aminokyselin u kterých se dříve ukázalo, že vedou k toleranci v homologní poloze v genu Protox-1 z Arabidopsis a/nebo pšenice. Jedna z nich mění alanin (GCA) v poloze 226. aminokyseliny (sekvence id. č. 12) na threonin (ACA). Tato poloha odpovídá mutaci pAracC-1 popsanou již v předchozím textu. Druhá analogická záměna mění valin (GTT) odpovídající 517. aminokyselině na alanin (GCT) což odpovídá mutantovi Wht502val z pšenice. Dvě z mutací izolovaných z Protox-1 ze sóji vedly ke změnám aminokyselinových zbytků, které nebyly dříve identifikovány jako místa rezistence k herbicidu. Jedna změna vedla ke změně prolinu (CCT) na serin (TCT) v poloze odpovídající 369. aminokyselině sekvence Protox-1 sóji (sekvence id. č. 12). Druhá mění tentýž prolin (CCT) v poloze 369. aminokyseliny na histidin (CAT).
Jednotlivé záměny aminokyselin, které u Arabidopsis vedly ke vzniku enzymu Protox-1 s vysokou tolerancí, byly vneseny do genu Protox-1 ze sóji místně cílenou mutagenezí, jak bylo popsáno v předchozím textu. Test v bakteriálním systému ukázal, že změna alaninu (GCA) v poloze odpovídající 226. aminokyselině (sekvence id. č. 12) na leucin (CTT) vedla ke vzniku vysoce tolerantního enzymu ze sóji. Změna tyrosinu (TAC) v poloze 432. aminokyseliny (sekvence id. č. 12) buď na leucin nebo na isoleucin také vedla k enzymu tolerantnímu k herbicidu.
Příklad 16
Identifikace míst v genu Protox-1 z cukrové řepy, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Aby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 z cukrové řepy byla cDNA z cukrové řepy vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici. Chimérický plazmid Arab-řepa protox byl označen pMut-6. DNA pMut-6 byla mutována a podrobena screeningu na toleranci k herbicidu stejně jak bylo již v předchozím textu popsáno. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala jedinou změnu báze, které vedla k enzymu Protox-1 z cukrové řepy tolerantnímu k herbicidu. Tato záměna mění tyrosin (TAC) odpovídající 449. aminokyselině na cystein (TGC), což odpovídá mutantovi AraC-2 Arabidopsis.
Jednotlivé záměny aminokyselin, které u Arabidopsis vedly ke vzniku enzymu Protox-1 s vysokou tolerancí, byly vneseny do genu Protox-1 ze sóji místně cílenou mutagenezí, jak bylo popsá
-49CZ 297325 B6 no v předchozím textu. Test v bakteriálním systému ukázal, že změna tyrosinu (TAC) v poloze odpovídající 449. aminokyselině na leucin, isoleucin, valin nebo methionin vedla k enzymu z cukrové řepy tolerantnímu k herbicidu.
Příklad 17
Identifikace míst v genu Protox-1 z bavlníku, která mohou být mutována, aby vznikla tolerance k herbicidu
Aby se vytvořil účinný systém pro screening Protox-1 z bavlníku byla cDNA z bavlníku vložena do vektoru pMut-1 stejným způsobem jak bylo popsáno pro kukuřici. Chimérický plazmid Arabbavlník protox byl označen pMut-7. DNA pMut-7 byla mutována a podrobena screeningu na toleranci k herbicidu stejně jak bylo již v předchozím textu popsáno. Ukázalo se, že více plazmidů obsahovalo sekvence kódující protox rezistentní k herbicidu. Analýza sekvencí ukázala 3 záměny jednotlivých aminokyselin, které individuálně vedly k enzymu Protox-1 z bavlníku tolerantnímu k herbicidu. Ve dvou mutantech byla záměna tyrosinu (TAC) v poloze 428. aminokyseliny (sekvence id. č. 16) za cystein (TGC) za arginin (CGC). Arginin je nová substituce udělující toleranci v tomto již dříve identifikovaném místě AraC-2. Třetí záměna mění prolin (CCC)) za serin (TCC) v poloze 365. aminokyseliny. Tato záměna odpovídá mutantovi sóji Soy369Ser.
Příklad 18
Demonstrace křížové tolerance rezistentních mutací k různým sloučeninám inhibujícím protox
Plazmid rezistentních mutantů jejichž původní identifikace byla založena na rezistenci k jedinému herbicidu inhibujícímu protox, byly testovány na rezistenci ke spektru dalších sloučenin inhibujících protox. Pro tento test byl kmen SASX38 obsahujících plazmid divokého typu vyset na různé koncentrace každé z testovaných látek, aby se pro každou z nich stanovila letální koncentrace. Rezistentní mutované plazmid SASX38 pak byly vysety a vyhodnocován podle schopnosti přežít na koncentraci každé ze sloučenin alespoň 1 Ox vyšší než je koncentrace letální pro kmen SASX38 obsahující plazmid divokého typu.
Výsledky z bakteriálních křížových testů tolerance ilustrují následující tabulky (tab. 3A a 3B), které ukazují, že každá z identifikovaných mutací uděluje toleranci k několika různým sloučeninám inhibujícím protox.
-50CZ 297325 B6
Tabulka 3A
Křížová tolerance mutantů rostlinné protox k různým inhibitorům protox
Vzorec AraC-lVal AraC-2Cys AraC-IThr AraC-3Thr MzC-lVal
XVII + 4- 4- + +
Vila 4- 4- + - 4-
IV + 4- - 4-4- 4-4- -
XV + + + 4- 4-
XI - u. 4- + + 4-
XVI - - - - +
XII 4- - + + + + 4-4-
XIV 4- - 4- 4- 4-
X*
+ = tolerance nejméně 1 Ox vyšší než divoký typ ++ = tolerance nejméně 1 OOx vyšší než divoký typ
- = žádná křížová tolerance * = tato sloučenina byla testována, ale neposkytla žádné informace
-51 CZ 297325 B6
Tabulka 3B
Křížová tolerance mutantů rostlinné protox k různým inhibitorům protox
Část C: Exprese genů protox rezistentních k herbicidu v transgenních rostlinách
Příklad 19
Příprava rostlin tolerantních k herbicidům inhibujícím protox homologní rekombinací nebo genovou konverzí
Vzhledem k tomu, že popsané mutanty s mutacemi cv kódující sekvenci účinně poskytují toleranci k herbicidu jsou-li exprimovány pod kontrolou nativního promotoru protox, alternativním prostředkem, jak vytvořit rostliny a rostlinné buňky tolerantní k herbicidu, jsou cílené změny sekvence kódující protox v její přirozené poloze v chromozóm. Fragment protox DNA obsahující požadované mutace, ale postrádající vlastní expresní signály (tj. buď promotor nebo netranslatovaný úsek 3'konce) může být zaveden kteroukoliv z metod známou v oboru (např. transformací prostřednictvím Agrobacterium, přímým transferem genů do protoplastů, bombardováním mikročásticemi) a pak se mohou selektovat transformanty tolerantní k herbicidu. Vložený fragment DNA obsahuje také diagnostické místo pro restrikční enzym nebo jiný sekvenční polymorfismus, který je vložen místně cílenou mutagenezí in vitro, aniž by se změnila kódovaná sekvence aminokyselin (tj. umlčená mutace). Pro různé selektovatelné markéry a geny tolerance k herbicidu bylo již dříve publikováno (viz např. Paszkowski et al., EMBO J: 7: 4021—4026, 1988, Lee et al., Plant Cell 2: 415^125, 1990, Risseeuw et al., Plant J. 7: 109-119, 1995), že některé transformanty vznikají homologní integrací mutantní DNA do chromozómového lokusu protox, nebo vznikají konverzí nativní chromozómové sekvence protox na vloženou mutovanou sekvenci. Takové transformanty se rozpoznají kombinací jejich fenotypu tolerantního k herbicidu s přítomností diagnostického místa pro restrikční enzym v jejich chromozómovém lokusu protox.
-52CZ 297325 B6
Příklad 20
Konstrukce vektorů pro transformaci rostlin
Jsou dostupné mnohé vektory, které jsou vhodné pro transformaci rostlin, přičemž geny podle předkládaného vynálezu se mohou použít ve spojení s jakýmkoliv z těchto vektorů. Výběr vektoru je závislý na zvolené technice transformace a na cílovém rostlinném druhu, který má být transformován. Pro některé cílové druhy mohou být výhodná různá antibiotika nebo herbicidy jako selekční markéry. Selekční markéry rutinně využívané v transformaci obsahují gen nptll, který je nositelem rezistence ke kanamycinu a příbuzným antibiotikům (Messing a Vierra, Gene 19: 259268, 1982, Bevan et al., Nátuře 304: 184-187, 1983), gen bar, udílející rezistenci k herbicidu fosfinotricinu (White et al., Nucl. Acids. Res. 18: 1062, 1990, Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631, 1990), gen hph udílející rezistenci k antibiotiku hygromycin (Blochinger a Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931) a gen dhfr, poskytující rezistenci k mototrexátu (Bououis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104. 1983).
I. Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens
Existuje mnoho dostupných vektorů pro transformaci pomocí Agrobacterium tumefaciens. Tyto vektory typicky nesou alespoň jednu hraniční sekvenci z T-DNA a příkladem takových vektorů jsou např. pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 1984) a ρΧΥΖ. V následujícím odstavci je popsána konstrukce dvou typických vektorů.
Konstrukce vektorů pCIB200 a pCIB2001: Binární vektory pCIB200 a pCIB2001 byly užity pro konstrukci rekombinantních vektorů vhodných pro transformaci pomocí Agrobacterium a byly připraveny jak je dále popsáno. pTJS75kan byl vytvořen naštěpením pTJS75 Narl (Schmidhauser a Helinski, J. Bacteriol. 164: 446^455, 1985), čímž se vyštěpil gen tetracyklinové rezistence, a pak se vložil Accl fragment zpUC4K nesoucí ΝΡΤΠ (Messing a Vierra, Gene 19: 259-268, 1982, Bevan et al., Nátuře 304: 184-187, 1983, McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276, 1990). Linkery (spojky) Xhol byly ligovány k EcoRV fragmentu zpCIB7, který obsahuje levou i pravou hranici z T-DNA, rostlinný selektovatelný chimérický gen nos/nptll apolylinker pUC (Rothstein et al., Gene 53: 153-161, 1987), a fragment naštěpený Xhol byl klonován do pTJS75kan naštěpeného Sáli, čímž vznikl pCIB200 (viz také EP 0 332 104, příklad 19(1338)). pCIB200 obsahuje následující jedinečná restrikční místa v polylinkeru (vícečetném klonovacím místě): EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal a Sáli, pCIB2001 je derivát pClB200, který byl vytvořen vložením dalších restrikčních míst do polylinkeru. Jedinečná restrikční místa v polylinkeru pCIB2001 jsou EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal a Sáli, Mlul, Bell, AvrlI, Apal, Hpal a Stul. pCIB2001, kromě těchto dodatečných restrikčních míst, obsahuje geny pro kanamycinovou selekci v bakteriích a rostlinách, levou a pravou hranici z T-DNA pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium, funkci trfA odvozenou z RK2 pro mobilizaci mezi E. coli ajinými hostiteli, a také funkce OriT a OriV2 RK2. Polylinker pCIB2001 je vhodný pro klonování rostlinných expresních kazet obsahujících vlastní regulační signály.
Konstrukce plazmidu pCIBlO ajeho derivátů pro selekci hygromycinem: binární vektor pCIBlO obsahuje gen kódující kanamycinovou rezistenci pro selekci v rostlinách, sekvence levé a pravé hranice z T-DNA a sekvence z plazmidu pRK252 s širokým spektrem hostitelů, což mu dovoluje replikovat se jak v E. coli tak v Agrobacterium tumefaciens. Jeho konstrukci popsal Rothstein et al. (Gene 53: 153-161, 1987). Byly konstruovány různé deriváty pCIBlO, které obsahují gen pro hygromycin-B-fosfotransferázu, jak popsali Gritz et al. (Gene 25: 179-188, 1983). Tyto deriváty umožňují selekci transgenních rostlinných buněk pouze na hygromycinu (pCIB743) nebo na hygromycinu a kanamycinu (pCIB715 a pCIB717).
-53 CZ 297325 B6
II. Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci bez Agrobacterium
Transformace bez použití Agrobacterium tumefaciens obchází požadavek na přítomnost sekvencí T-DNA ve vybraném transformačním vektoru a tudíž vektory postrádající tyto sekvence se dají použít kromě vektorů obsahujících T-DNA popsaných výše. Techniky transformace, které nespoléhají na Agrobacterium, zahrnují takové techniky transformace jako je bombardování mikročásticemi, příjem protoplasty (pomocí PEG nebo elektroporací) nebo mikroinjekce. Výběr vektorů závisí hlavně na způsobu selekce vybraného druhu, který má být transformován. V následujícím odstavcích se popisuje konstrukce několika typických vektorů.
Konstrukce pCIB3064: pCIB3064 je vektor odvozený od pUC a je vhodný pro techniky přímého přenosu genů v kombinaci se selekcí pomocí herbicidu basta (fosfinotricinu). Plazmid pCIB246 obsahuje CaMV 35S promotor operativně spojený s genem GUS z£. coli a CaMV 35S transkripčním terminátorem jak je popsáno v Mezinárodní patentové přihlášce WO 93/07278. 35S promotor tohoto vektoru obsahuje dvě ATG sekvence na 5'-konci od startovacího místa. Tyto sekvence byly mutovány pomocí standardní PCR techniky tak, že oba kodony ATG byly odstraněny a vznikla tak restrikční místa pro SspI a PvuIL Nová restrikční místa jsou vzdálena 96 bp a 37 bp od jedinečného místa Sáli a 101 bp a 42 bp od skutečného startovacího místa. Výsledný derivát plazmidu pCIB246 byl nazván pCIB3025. Gen GUS byl pak vystřižen zpCIB3025 štěpením Sáli a Sací, konce byly zatupeny a byl znovu spojen, čímž vznikl plazmid pCIB3060. Plazmid pJIT82 byl získán z John Innes Centre, Norwich, a byl z něho vyštěpen Smál fragment velikosti 400 bp obsahující gen bar ze Streptomyces viridochromogenes, a vložen do Hpal místa pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-2523, 1989). Tak vznikl pCIB3064, který obsahuje gen bar pod kontrolou CaMV 35S promotoru a terminátoru pro selekci herbicidem, gen pro ampicilinovou rezistenci (pro selekci v E. coli) a polylinker s jedinečnými místy Sphl, Pstl, HindlII a BamHI. Vektor je vhodný pro klonování rostlinných expresních kazet obsahujících vlastní regulační signály.
Konstrukce pSOG19 a pSOG35: pSOG35 je transformační vektor, který využívá gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) zE. coli poskytující rezistenci k metotrexátu jako selektovatelný markér. PCR byla užita pro amplifíkaci 35S promotoru (asi 800 bp), intronu 6 z genu Adhl kukuřice (asi 550 bp) a 18 bp úseku netranslatované vedoucí sekvence GUS z plazmidu pSOGÍO. Fragment dlouhý 250 bp kódující dihydrofolátreduktázu typu II z E. coli byl amplifikován také pomocí PCR a tyto dva fragmenty byly spojeny prostřednictvím Scal-Pstl fragmentu zpBI221 (Clontech), který obsahuje kostru vektoru pUC a terminátor nopalinsyntázového genu. Spojením fragmentů vznikl plazmid pSOG19, který obsahuje 35S promotor spojený se sekvencí intronu 6, GUS vedoucí sekvencí, genem DHFR a terminátorem nopalinsyntázy. Náhradou GUS vedoucí sekvence vpSOG19 vedoucí sekvencí z viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) vznikl vektor pSOG35. Vektory pSOG19 a pSOG35 nesou gen pro ampicilinovou rezistenci zpUC a mají místa HindlII, Sphl, Pstl a EcoRI dostupná pro klonování cizích sekvencí.
Příklad 21
Konstrukce rostlinných expresních kazet
Kódující sekvence zamýšlené pro expresi v transgenních rostlinách se vloží do expresní kazety za vhodný protox promotorem a před vhodný transkripční terminátor. Takové expresní kazety pak mohou být snadno přeneseny do některého z rostlinných transformačních vektorů popsaných v příkladu 20.
I. Výběr promotoru
Výběr promotoru použitého v expresních kazetách bude určující pro prostorový a časový vzorec exprese transgenu v transgenní rostlině. Vybrané promotory exprimují transgeny ve specifických
-54CZ 297325 B6 typech buněk (jako např. v buňkách epidermis listu, mezofylových buňkách, v buňkách kůry kořene) nebo ve specifických pletivech či orgánech (např. kořenech, listech nebo květech) a výběr je tedy odrazem požadované lokalizace exprese transgenu. Alternativně může vybraný promotor řídit expresi genu, který je řízen světlem indukovaným promotorem nebo jiným dočasně regulovaným promotorem. Další možnost je, že vybraný promotor je chemicky regulovatelný. To by poskytlo možnost indukovat expresi transgenu jen když je to žádoucí, a sice působením chemického induktoru.
II. Transkripční terminátory
Mnoho různých terminátorů je k dispozici pro použití v expresních kazetách. Terminátory zodpovídají za ukončení transkripce za transgenem a jeho správnou polyadenylaci. Vhodné terminátory transkripce jsou takové, o kterých je známo, že fungují v rostlinách, a patří mezi ně např. CaMV 35S terminátor, tmi terminátor, terminátor nopalinsyntázy, terminátor E9 genu rbcS z hrachu a také terminátory přirozeně se vyskytující ve spojení s protox genem (tj. protox terminátory). Ty se mohou použít jak v jednoděložných tak i ve dvouděložných rostlinách.
III. Sekvence vhodné pro zvýšení nebo regulační exprese
Byly nalezeny mnohé sekvence zvyšující genovou expresi transkripční jednotky a tyto sekvence se mohou užít ve spojení s geny podle předkládaného vynálezu pro zvýšení jejich exprese v transgenních rostlinách.
Bylo ukázáno, že různé sekvence intronů zvyšují expresi, zvláště v buňkách jednoděložných rostlin. Např. introny genu Adhl z kukuřice významně zvyšují expresi divokého typu genu s příbuzným promotorem, pokud jsou vloženy do buněk kukuřice. Zejména intron 1 se ukázal zvláště účinný a zvyšoval expresi v konstruktech s genem chloramfennikolacetyltransferázy (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200, 1987). V témže pokusném systému intron z genu bronzel kukuřice měl podobný účinek na zvýšení exprese (Callis et al., viz výše). Intronové sekvence se rutinně vkládají do vektorů pro transformaci rostlin, většinou s netranslatovanou vedoucí sekvencí.
Také mnohé netranslatované vedoucí sekvence odvozené z virů zvyšují expresi, a jsou zvláště účinné ve dvouděložných rostlinách. Vedoucí sekvence viru mozaiky tabáku (TMV, „Wsekvence“), viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) a viru mozaiky vojtěšky (AMV) jsou účinné ve zvýšení exprese (např. Gallie et al., Nucl Acids Res. 15: 8696-8711, 1987, Skuzeski et al., Plant Mol. Biol. 15: 65-79, 1990).
IV. Směrování genového produktu v buňce
V rostlinách existují různé mechanismy směrování („targeting“) genových produktů a některé sekvence kontrolující fungování těchto mechanismů byly do jisté míry popsány. Např. cílení genových produktů do chloroplastu je řízeno signální sekvencí nalezenou na N-konci proteinu, která je odštěpena během importu do chloroplastu, čímž vzniká maturovaný protein (např. Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109, 1988). Takové signální sekvence se mohou spojit s heterologními genovými produkty a import heterologních produktů se tak nasměruje do chloroplastů (van den Broeck et al., Nátuře 313: 358-363, 1985). DNA kódující vhodné signální sekvence může být izolována z 5'-konců cDNA kódujících proteiny RUBISCO, CAB, EPSP syntázu, GS2 a mnoho dalších proteinů o kterých je známo, že jsou lokalizovány v chloroplastu.
Jiné genové produkty jsou lokalizovány v jiných organelách jako např. mitochondriích aperoxisomech (např. Unger et al., Plant. Mol. Biol 13: 411-418, 1989). cDNA kódující tyto produkty může být také změněna tak, že se ovlivní cílení heterologních produktů do těchto organel. Příklady takových sekvencí jsou jádrem kódované ATPázy a pro mitochondrie specifické isoformy
-55CZ 297325 B6 aspartátaminotransferázy. Cílení do buněčných proteinových tělísek bylo popsáno Rogersem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516, 1985).
Kromě toho byly charakterizovány sekvence, které způsobují směrování genových produktů do jiných buněčných kompartmentů. Sekvence aminového konce jsou zodpovědné za cílení do ER, apoplastu, a extracelulámí sekreci z aleuronových buněk, jak popsali Koehler a Ho (Plant Cell 2: 769-783, 1990). Navíc, sekvence aminového konce, společně se sekvencemi karboxylového konce, jsou zodpovědné za směrování genových produktů do vakuoly (Shishi et al., Plant Mol. Biol. 14: 357-368, 1990).
Spojením vhodné cílové sekvence popsané výše se sekvencí požadovaného transgenu je možné nasměrovat produkt transgenu do jakékoliv organely nebo buněčného kompartmentů. Pro směrování do chloroplastu se např. chloroplastová signální sekvence z genu RUBISCO, CAB, EPSP syntázy nebo GS2, spojí do čtecího rámce s aminokoncovou ATG transgenu. Vybraná signální sekvence by měla obsahovat známá štěpná místa a konstruovaný fúzovaný gen musí zahrnovat všechny aminokyseliny, následující po štěpném místě, které je vyžadováno pro štěpení. V některých případech tomuto požadavku lze vyhovět tím, že se přidá malý počet aminokyselin mezi štěpné místo a ATG transgenu nebo se nahradí některé aminokyseliny v sekvenci transgenu. Konstrukty pro import do chloroplastu se mohou testovat na účinnost příjmu chloroplasty pomocí in vitro translace in vitro transkribovaného konstruktu následované in vitro příjmem do chloroplastu metodou popsanou Bartelettem et al. (In: Edelman et al. (eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, s. 1081-1091, 1982) a Wasmann et al. (Mol. Gen. Genet. 205: 446453, 1986). Tyto konstrukční techniky jsou v oboru dobře známy a dají se shodně použít pro mitochondrie i peroxisomy. Výběr toho, jak směrovat expresi transgenu závisí na buněčné lokalizaci prekurzorů, který je nutný jako výchozí bod příslušné metabolické dráhy. Směrování bude obvykle do cytosolu nebo chloroplastu, ačkoliv v určitých případech může být do mitochodrie nebo peroxisomu. Produkt transgenní exprese normálně nevyžaduje žádné směrování do ER, apoplastu nebo vakuoly.
Výše popsané mechanismy směrování v buňce se mohou užít nejen ve spojení s promotory téhož původu, ale i ve spojení s heterologními promotory tak, aby se ovlivnilo specifické směrování genu, jehož transkripce je řízena promotorem, u kterého je vzorec exprese odlišný od promotoru, ze kterého byl odvozen směrovací signál.
Příklad 22
Transformace dvouděložných rostlin
Techniky transformace dvouděložných rostlin jsou v oboru dobře známy a patří k nim techniky založené na Agrobacterium tumefaciens i techniky, které Agrobacterium nevyžadují. K technikám bez Agrobacterium patří příjem exogenního genetického materiálu přímo protoplasty nebo buňkami. Toho lze dosáhnout pomocí PEG nebo elektroporací zprostředkovaného příjmu, bombardování mikročásticemi nebo mikroinjekcemi. Příklady těchto technik popsali Paszkowski et al. (EMBO J. 3: 2717-2711, 1984), Potrykus et al. (Mol. Gen. Genet. 199: 169-177, 1985), Reich et al. (Biotechnology 4: 1001-1004, 1986) a Klein et al. (Nátuře 327: 70-73, 1987). V každém takovém případě byly celé rostliny regenerovány z transformovaných buněk užitím standardních technik známých v oboru.
Transformace zprostředkovaná pomocí Agrobacterium je výhodná technika transformace dvouděložných rostlin vzhledem k vysoké účinnosti transformace a možnosti využít ji pro široké spektrum různých druhů. Mezi mnohé druhy rutinně transformovatelné Agrobacterium patří tabák, rajče, slunečnice, bavlník, řepka, brambor, sója, vojtěška a topol (EP 0 317 511 (bavlník), EP 0 249 432 (rajče, patent udělen Calgene), WO 87/07299 (Brassica, patent udělen Calgene), US 4 795 855 (topol)).
-56CZ 297325 B6
Transformace cílového rostlinného druhu rekombinantním Agrobacterium většinou zahrnuje kokultivaci Agrobacterium s explantáty z rostlin podle protokolů, které jsou v oboru dobře známy. Transformované pletivo, nesoucí markér rezistence k antibiotiku nebo herbicidu mezi hranicemi T-DNA binárního vektoru, se pak regeneruje na selekčním médiu.
Příklad 23
Transformace jednoděložných rostlin
Transformace většiny druhů jednoděložných rostlin se dnes stala také rutinní technikou. Výhodná technika zahrnuje přímý transfer genů do protoplastů užitím PEG nebo elektroporaění techniky, nebo bombardování kalusového pletiva mikročásticemi. Transformace se může provést s jedním druhem DNA nebo více druhy DNA (tj. ko-transformace) a oba způsoby jsou vhodné pro použití v tomto vynálezu. Ko-transformace může být výhodná v tom, že není třeba konstruovat komplexní vektor, a že vznikají transgenní rostliny, kde lokusy transgenu a selektovatelného markerového genu nejsou ve vazbě, což umožňuje v další generaci odstranit selektovatelný markér, pokud je to žádoucí. Avšak nevýhodou ko-transformace je frekvence menší než 100% se kterou se jednotlivé druhy DNA integrují do genomu (Schocher et al., Biotechnology 4: 1093-1096).
Patentové přihlášky EP 0 292 435 (Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (Ciba-Geigy), WO 93/07278 (Ciba-Geigy) popisují způsoby přípravy kalusu a protoplastů z elitní inbrední linie kukuřice, transformaci protoplastů pomocí PEG nebo elektroporací a regeneraci rostlin kukuřice z transformovaných protoplastů. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603-618) a Fromm et al. (Biotechnology 8: 833-839, 1989) popsali techniky transformace linie kukuřice odvozené z A188 metodou bombardování mikročásticemi. Také Mezinárodní patentová přihláška WO 93/07278 (CibaGeigy) a Koziel et al. (Biotechnology 11: 194-200, 1993) popisují transformaci elitní linie kukuřice bombardováním mikročásticemi. Při tomto způsobu transformace se užívají nezralá embrya kukuřice o délce 1,5 až 2,5 mm vyříznutá z kukuřičného klasu 14 až 15 dní po opylení a pro vlastní bombardování se užívá zařízení PDS-lOOOHe Biolistics.
Transformace rýže se může provést také technikou přímého přenosu genů s využitím protoplastů nebo bombardování mikročásticemi. Transformace prostřednictvím protoplastů byla popsána jak pro rýži typu Japonica tak i typu Indica (Zhang et al., Plant Cell REp. 7: 379-384, 1988, Shimamoto et al., Nátuře 338: 274-277, 1989, Datta et al., Bitechnology 8: 736-740, 1990). Oba typy jsou také rutinně transformovatelné metodou bombardování mikročásticemi (Christou et al., Biotechnology 9: 957-962, 1991).
Patentová přihláška EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) popisuje způsob vytvoření, transformaci a regeneraci protoplastů z travin skupiny Pooideae. Tento způsob umožňuje transformovat pšenici a travinu Dactylis sp. Kromě toho byla popsána transformace pšenice metodou bombardování mikročásticemi buněk dlouhodobě regenerovatelného kalusu typu C (Vasil et al., Biotechnology 10: 667-674, 1992) a nebo metodou bombardování mikročásticemi nezralých embryí a kalusu odvozeného z nezralých embryí (Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558, 1993, Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084, 1993). Výhodný způsob transformace pšenice však zahrnuje transformaci pšenice bombardováním nezralých embryí mikročásticemi a také zahrnuje krok s použitím vysoké koncentrace sacharózy nebo maltózy před vlastním přenosem genů. Před bombardováním mikročásticemi se libovolný počet embryí (délky 0,75 až 1,00 mm) vyseje na misku s MS médiem obsahujícím 3% sacharózu (Murashige a Skoog, Physiologa Plantarum 15: 473^197, 1962) a 3 mg/l 2,4-D pro indukci somatických embryí, a ponechají se ve tmě. V den kdy má dojít k bombardování mikročásticemi se embrya odstraní z indukčního média a umístí se na osmotikum (tj. indukční médium se zvýšenou koncentrací sacharózy nebo maltózy, typicky až na 15 %). Ponechá se proběhnout plazmolýza embryí po dobu 2 až 3 hodin a pak se embrya podrobí bombardování mikročásticemi. Typické je 20 embryí na jedné cílové destičce, ale tato
-57CZ 297325 B6 hodnota není kritická. Vhodný plazmid nesoucí požadovaný gen (např. pCIB3064 nebo pSG35) se nechá precipitovat na zlatých mikročásticích velikosti řádově mikrometru standardním postupem. Každá cílová destička s embryi je odstřelována pomocí zařízení Biolistics firmy DuPont použitím tlaku přibližně 1000 psi a standardními síťky kalibru 80. Po bombardování se umístí embrya na 24 hodin do tmy (stále na osmotiku), aby se vzpamatovala. Po 24 hodinách se embrya přemístí zpět na indukční médium, kde zůstanou asi měsíc než začne regenerace. Přibližně po měsíci se explantáty embryí s vyvíjejícím se embryonálním kalusem přemístí na regenerační médium (MS + 1 mg/1 NAA, 5 mg/1 GA) navíc obsahující selekční agens (10 mg/1 basta v případě plazmidu pCIB3064 a 2 mg/1 metotrexátu v případě pSOG35). Přibližně po dalším měsíci se vyvíjející výhonky prýtu přemístí do větších sterilních nádob známých jako „GA7“ obsahujících MS poloviční koncentrace, 2% sacharózu a stejnou koncentraci selekčního agens. Mezinárodní patentová přihláška WO 94/138 22 popisuje způsob transformace pšenice a tímto se zde na ni odkazujeme.
Příklad 24
Izolace promotorové sekvence Protox-1 z Arabidopsis thaliana
Genomová knihovna Lambda Zap II z Arabidopsis thaliana (Columbia, celá rostlina) byla zakoupena od firmy Stratagene. Přibližně 125 000 fágů bylo vyseto v hustotě 25 000 pfu („plaque forming units“, jednotek tvořících plaky) na 15cm Petriho misku a duplikáty byly otisknuty na membránu Colony/Plaque Screen (NEN DuPont). Duplikáty plaků pak byly testovány pomocí sondy Protox-1 cDNA z Arabidopsis (sekvence i. č. 1) značené 32P-dCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace a odmývání proběhly při 65 °C za podmínek popsaných v Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984. Pozitivně hybridizující plaky byly přečištěny a byly z nich vystřiženy plazmidy pBluescript. Sekvence inzertů genomové DNA byly stanoveny řetězovou terminační reakcí pomocí dideoxyterminátorů značených fluorescenční barvou (Applied Biosystems, lne.). Jeden klon, a sice AraPTlpro, byl identifikován jako klon obsahující 580 bp dlouhý úsek sekvence z Arabidopsis, orientovaný proti směru transkripce od iniciačního methioninu (ATG) proteinu Protox-1 z Arabidopsis. Tento klon obsahuje také kódující sekvenci a introny zasahující až k 1241 bp sekvence Protox-1 cDNA. 5'-koncový nekódující fragment o délce 580 bp je domnělý Protox-1 promotor z Arabidops is a jeho sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 13.
Plazmid AraPTIPro byl uložen 15. prosince 1995 jako pWDC-11 (NRRL č. B-21515).
Příklad 25
Konstrukce rostlinných transformačních vektorů exprimujících změněný gen Protox-1 za nativním promotorem Protox—1 z Arabidopsis cDNA plné délky příslušné změněné protox-1 cDNA byla izolována jako fragment po částečném štěpení EcoRI-Xhol a klonována do rostlinného expresního vektoru pCGN1761ENX (viz Příklad 9 Mezinárodní patentové přihlášky PCT/IB95/00452, podané 8. 6. 1995, publikované 21. 12. 1995 jako WO 95/34659). Plazmid byl štěpen Ncol a BamHI, čímž vznikl fragment obsahující úplnou protox-1 cDNA a terminátor transkripce ze 3'-koncové netranslatované sekvence genu tmi z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid AraPTIPro popsaný výše se štěpil Ncol a BamHI aby se získal fragment obsahující pBluescript a fragment o délce 580 bp obsahující domnělý Protox1 promotor. Ligací (spojením) těchto dvou fragmentů vznikla fúzovaná molekula, kde změněná protox cDNA je připojena za nativní protox promotor. Expresní kazeta, obsahující „Protox-1 promotor/Protox-1 cDNA/řw/ terminátor“, je vystřižena pomocí KpnI a klonována do binárního vektoru pCIB200. Binární plazmid je transformován elektroporací do Agrobacterium a pak do Arabidopsis použitím vakuové infiltrační metody (Bechtold et al., C. R. Acad. Sci. Paris 316:
-58CZ 297325 B6
1194-1199, 1993). Transformanty exprimující změněné geny protox se selektují na kanamycinu nebo na různých koncentracích herbicidu inhibujícího protox.
Příklad 26
Příprava rostlin tolerantních k herbicidu exprimujících fúzovaný gen „nativní Protox-1 promotor/změněná Protox-1“
Užitím postupů uvedených v předchozím textu byla Protox-1 cDNA z Arabidopsis obsahující změnu TAC na ATG (tyrosin na methionin) v nukleotidech 1306 až 1308 sekvence Protox-1 (sekvence id. č. 1) spojena s nativním Protox-1 promotorovým fragmentem a transformována do Arabidopsis thaliana. Testy v bakteriálním expresním systému popsaném v předchozím textu bylo ukázáno, že změněný Protox-1 enzym (AraC-2Met) je více než lOx více tolerantní k různým Protox-1 inhibujícím herbicidům než přirozeně se vyskytující enzym. Semena z vakuově infiltrovaných rostlin byla sebrána a vyseta v prostředí s protox inhibujícím aryluracilovým herbicidem (v rozmezí 10,0nM až Ι,ΟμΜ) podle vzorce XVII. Opakované pokusy s divokým typem Arabidopsis ukázaly, že koncentrace 10 nM této sloučeniny je dostatečná ktomu, aby zabránila normálnímu klíčení semenáčků. Transgenní semena exprimující změněný enzym AraC-2Met spojený s nativním Protox-1 promotorem vyklíčila v normální semenáčky při koncentraci herbicidu až 500nM, což dokazuje alespoň 50x vyšší toleranci k herbicidu ve srovnání s Arabidopsis divokého typu. Tento fúzovaný gen „promotor/změněný protox enzym“ působí také jako účinný selektovatelný markér pro rostlinnou transformaci. Několik rostlin, které vyklíčily na koncentraci 100 nM protox inhibujícího herbicidu bylo přesazeno do půdy, pěstováno 2 až 3 týdny a zkoušeno postřikovým testem s různými koncentracemi protox inhibujícího herbicidu. Pokud se srovnaly s kontrolními rostlinami transformovanými prázdným vektorem, transgenní rostliny AraPTlPro//AraC-2Met měly toleranci k herbicidovému postřiku více než lOx vyšší.
Příklad 27
Demonstrace křížové tolerance rezistentních mutací k různým sloučeninám inhibujícím protox v testu klíčení Arabidopsis
Užitím postupů uvedených v předchozím textu byla Protox-1 cDNA z Arabidopsis obsahující změnu TAC na ATG (tyrosin na methionin) v nukleotidech 1306 až 1308 sekvence Protox-1 (sekvence id. č. 1) spojena s nativním Protox-1 promotorovým fragmentem a transformována do Arabidopsis thaliana. Testy v bakteriálním systému bylo ukázáno, že tento změněný enzym Protox-1 (AraC-2Ile+AraC305Leu) je více než lOx tolerantnější k acyluracilovému herbicidu podle vzorce XVII inhibujícímu protox než přirozeně se vyskytující enzym (viz příklady 8 až 12). Homozygotní linie Arabidopsis obsahující tento fúzovaný gen vznikly z transformant, které vykazovaly vysokou toleranci k herbicidu inhibujícímu protox v testu klíčení semenáčků popsaném výše. Semena z jedné linie byla testována na křížovou toleranci k různým sloučeninám inhibujícím protox tím, že se opakoval test klíčení s různými koncentracemi sloučenin, u kterých bylo ukázáno, že inhibují klíčení Arabidopsis divokého typu. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 4.
-59CZ 297325 B6
Tabulka 4
Křížová tolerance k různým inhibitorům protox v testu klíčení semenáčků
vzorec obecný název tolerance
II acifluorofen +
III fomasafen
IV fluorodlykofen +/-
IVb bifenox 4-
IVc oxyfluorofen +
IVd laktofe +/-
Vila fluthiacetmetyl ++
X sulfentrazon +
XI flupropazil ++
XIV flumiklorak 4-
XVI flumioxazin + + +
XVII 4-4-
XXI a BAY 11340 +
XXII 4-4-
+/- = < 1 Ox vyšší tolerance než divoký typ + = > 1 Ox vyšší tolerance než divoký typ ++ = > 1 Ox vyšší tolerance než divoký typ +++ - > lOx vyšší tolerance než divoký typ
Příklad 28
Izolace promotorové sekvence Protox-1 z kukuřice
Genomová knihovna kukuřice (Zea mays, inbrední linie Missouri 17, etiolované semenáčky) ve vektoru Lambda FIX II byla zakoupena od firmy Stratagene. Přibližně 250 000 fágů bylo vyseto v hustotě 50 000 pfu („plaque forming units“, jednotek tvořících plaky) na 15cm Petriho misku a duplikáty byly otisknuty na membránu Colony/Plaque Screen (NEN DuPont). Duplikáty plaků pak byly testovány pomocí sondy Protox-1 cDNA z kukuřice (sekvence i. č. 5) značené 32PdCTP metodou náhodných primerů (Life Technologies). Hybridizace a odmývání proběhly při 65 °C za podmínek popsaných v Church a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, 1984. Ze tří pozitivně hybridizujících plaků byl izolován fág Lambda pomocí soupravy pro izolaci Wizard Lambda Preps DNA Purification Systém (Promega). Analýza užitím restrikčního štěpení, hybridizace a sekvenční analýzy DNA vedla k identifikaci klonu obsahujícího asi 3,5 kB genomové DNA z kukuřice lokalizované na 5'-konci Protox-1 kódující sekvence již dříve izolované jako klon cDNA. Má se za to, že tento fragment obsahuje Protox-1 promotor kukuřice. Sekvence tohoto fragmentu je zde uvedena jako sekvence id. č. 14. Tato sekvence je od nukleoti
-60CZ 297325 B6 du 1 k nukleotidu 3532 nekódující sekvencí. Nukleotidy 3533 až 3848 této sekvence kódují 5' konec proteinu Protox-1 z kukuřice.
Plazmid obsahující sekvenci id. č. 14 spojenou se zbytkem kódující sekvence Protox-1 z kukuřice byl uložen 19. března 1996 jako pWDC-14 (NRRL č. B-21546).
Příklad 29
Konstrukce rostlinných transformačních vektorů exprimujících změněný Protox-1 gen za nativních Protox-1 promotorem z kukuřice
Fragment genomové DNA z kukuřice o délce 3848 bp (sekvence id. č. 14) se vyjme z izolovaného klonu fágu lambda pomocí částečného štěpení Sall-KpnI a liguje se s KpnI-Notl fragmentem odvozeným ze změněné Protox-1 cDNA z kukuřice, který obsahuje záměnu alaninu za leucin v aminokyselině 164 (sekvence id. č. 6). Tak se vytvoří spojení nativního Protox-1 promotoru z kukuřice s cDNA plné délky, která poskytuje, jak bylo ukázáno, toleranci k herbicidu v bakteriálním systému (viz příklady 8 až 13). Tento fúzovaný produkt je klonován do vektoru odvozeného z plazmidu pUC18 obsahujícího CaMV 35S terminátorovou sekvenci, čímž se vytvoří kazeta „protox promotor/změněná protox cDNA/terminátor“. Plazmid obsahující tuto kazetu byl nazván pWCo-1.
Druhý konstrukt pro transformaci kukuřice je vytvořen vložením prvního intronu nalezeného v kódující sekvenci v kukuřičném genomovém klonu zpět do cDNA kukuřice. Vložení je provedeno standardním způsobem pomocí PCR fúze s přesahy. Intron (sekvence id. č. 25) je dlouhý 93 bp a je vložen mezi nukleotidy 203 a 204 sekvence id. č. 5, zcela shodně s tím, jak je v přirozeném kontextu v klonu lambda popsaném v příkladu 28. Tato verze expresní kazety obsahující intron byla nazvána pWCo-2.
Příklad 30
Demonstrace aktivity Protox-1 promotoru kukuřice v transgenních rostlinách kukuřice
Rostliny kukuřice transformované kazetou „protox promotor kukuřice/změněný protox“ byly identifikovány analýzou PCR s primery specifickými pro transgen. Celková RNA byla připravena z rostlin pozitivních v PCR a byla reverzně transkribována pomocí soupravy „Superscript MMLV“ (Life Technologies) za doporučených podmínek. 2 μΐ reakční směsi z reverzní transkripce byly použity pro reakci PCR specifickou pro změněnou protox sekvenci. Zatímco netransformované kontroly neposkytly v této reakci žádný produkt, přibližně 85 % rostlin transformovaných pWCo-1 poskytlo pozitivní výsledky, což ukazuje na přítomnost mRNA pocházející z transgenu. To demonstruje jistou úroveň aktivity protox promotoru kukuřice. RNA z transgenních rostlin kukuřice se také analyzovala standardním northemovým přenosem s radioaktivně značenou sondou, což byl fragment protox cDNA kukuřice (sekvence id. č. 6). V některých transgenních rostlinách byla zjištěna vyšší hladina Protox-1 mRNA než v netransformovaných kontrolách. Lze se domnívat, že tato zvýšená hladina mRNA je důsledkem exprese změněné protox-1 mRNA z klonovaného protox promotoru kukuřice.
Příklad 31
Izolace Protox-1 promotorové sekvence z cukrové řepy
Genomová knihovna ve vektoru Lambda Fix II z cukrové řepy byla připravena firmou Stratagene. Přibližně 300 000 pfu bylo vyseto a testováno pomocí sondy Protox-1 cDNA z řepy cuk
-61 CZ 297325 B6 rovky (sekvence id. č. 17) stejně jak je popsáno v příkladu 28. Pomocí restrikčního štěpení, hybridizace a analýzy sekvence DNA byl identifikován lambda klon obsahující 7kb úsek genomické DNA cukrové řepy lokalizovaný od 5'-konce kódující sekvence již dříve izolované jako cDNA klon. Pstl-SAII fragment dlouhý 2606 bp byl subklonován z lambda klonu do vektoru pBluescript. Tento fragment obsahuje 2068 bp dlouhý úsek 5'-nekódující sekvence a obsahuje také protox-1 promotorovou sekvenci. Obsahuje také prvních 453 bp z protox-1 kódující sekvence a 85 bp z intronu obsaženého v kódující sekvenci. Sekvence tohoto fragmentu je zde uvedena jako sekvence id. č. 26.
Plazmid obsahující sekvenci id. č. 26 byl uložen 6. prosince 1996 jako pWDC-20 (NRRL č. B21650).
Příklad 32
Konstrukce rostlinného transformačního vektoru, který exprimuje změněný Protox-1 gen z cukrové řepy ležící za nativním promotorem Protox-1 z cukrové řepy
Fragment genomové DNA řepy cukrovky (sekvence id. č. 26) byl vyjmut z genomového subklonu popsaného v příkladu 31 jako SacI-BsrGI fragment obsahující 2068 bp z 5'-nekódující sekvence a prvních 300 bp Protox-1 kódující sekvence z řepy cukrovky. Tento fragment byl ligován s BsrGI-Notl fragmentem pocházejícím ze změněné Protox-1 cDNA, která obsahuje záměnu tyrosinu za methionin v aminokyselině 449 (sekvence i.č. 18). Tím je vytvořena fúze nativního protox-1 promotoru řepy cukrovky s cDNA plné délky, která poskytuje toleranci k herbicidu v bakteriálním systému (viz příklady 8 až 13). Tento fúzovaný produkt byl klonován do vektoru odvozeného z pUC18 obsahujícího CaMV 35S terminátorovou sekvenci, a tím se vytvořila kazeta „protox promotor/změněná protox cDNA/terminátor“. Plazmid obsahující tuto kazetu byl nazván pWCo-3.
Příklad 33
Příprava k herbicidu tolerantních rostlin exprimujících fúzovaný gen „nativní Protox-1 promotor z cukrové řepy/změněný Protox-1 z cukrové řepy“
Expresní kazeta z pWCo-3 se transformuje do rostlin řepy cukrovky kterýmkoliv způsobem transformace vhodným pro dvouděložné rostliny, včetně použití Agrobacterium, protoplastů nebo bombardování mikročásticemi. Transgenní rostliny exprimující změněný protox-1 enzym se identifikují pomocí RNA-PCR a testují se na toleranci k protox-inhibujícím herbicidům v koncentracích, které jsou letální pro netransformované rostliny cukrové řepy.
Část D: Exprese genu protox v rostlinných plastidech
-62CZ 297325 B6
Příklad 34
Příprava chimérického genu, který obsahuje promotor plastidového genu clpP z tabáku a nativní clpP 5'-netranslatovanou sekvencí fúzované s reportérovým genem GUS a 3'-netranslatovanou sekvencí plastidového genu rpsl 6 v plastidovém transformačním vektoru
I. Amplifikace promotoru plastidového genu clpP z tabáku a úplné 5'-netranslatované clpP RNA (5'UTR)
Celková DNA z N. tabaccum cv. Xanthi NC byla použita jako templát v PCR s „levopravým primerem pro horní řetězec“ obsahujícím vložené restrikční místo EcoRI v poloze 197 vzhledem k počátečnímu kodonu ATG konstitutivně exprimovaného plastidového genu clpP (primer pclp_Pla: 5'-gcggaattcatacttatttatcattagaaag-3', sekvence id. č. 27, podtrženo je restrikční místo pro EcoRI) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec“ homologním k úseku v poloze -21 až -1 do počátečního kodonu ATG promotoru clpP obsahujícím vložené restrikční místo Ncol na začátku translačního primeru (primer Pclp_P2b: 5'-gcgccatggaaatgaaagaaagaactaaa-3', sekvence id. č. 28, podtrženo je restrikční místo Ncol). Tato PCR reakce byla provedena s termostabilní polymerázou Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) v termocykleru „Perkin Elmer Thermal Cycler 480“ podle doporučení výrobce (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) v následujících cyklech: 7 minut 95 °C, pak 4 cykly 1 minuta 95 °C/2 min 43 °C/lmin 72 °C, pak 25 cyklů 1 min 95 °C/2 min 55 °C/1 min 72 °C. Amplifikační produkt velikosti 213 bp obsahoval promotor a 5'-netranslatovaný úsek genu clpP s restrikčním místem EcoRI na levém konci a Ncol místem na pravém konci a obsahoval úsek odpovídající nukleotidům 74700 až 74505 sekvence plastidové DNA N. tabaccum (Shinozaki et al., EMBO J. 5: 2043-2049, 1986). Tento amplifikační produkt byl izolován z gelu standardním způsobem a pak naštěpen EcoRI a Ncol (všechny restrikční enzymy byly zakoupeny od New England Biolabs, Beverly, MA).
II. Amplifikace 3'-netranslatované sekvence (3'UTR) RNA plastidového genu rpsl6 z tabáku
Celková DNA z N. tabaccum cv. Xanthi NC byla použita jako templát v PCR s „levopravým primerem pro horní řetězec“ obsahujícím vložené restrikční místo Xbal v poloze bezprostředně následující za stop kodonem TAA plastidového genu rpsl6 kódujícího ribozomální protein TAA plastidového genu rpsl6 kódujícího ribozomální protein S16 (primer rpsl6P_la: 5-GCGTCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG-3', sekvence id. č. 30, podtrženo je restrikční místo pro Xbal) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec“ homologním k úseku v poloze +134 až +151 od stop kodonu TAA genu rpsl6 obsahujícím vložené restrikční místo HindlII na 3'-konci 3'UTR genu rpsl6 (primerrpsl6_lb: 5'-CGCAAGCTTCAATGGAAGCAATGATAA-3', sekvence id. č. 31, podtrženo je restrikční místo HindlII). Amplifikační produkt velikosti 169 bp obsahující 3'-netranslatovaný úsek genu rpsl6 s restrikčním místem Xbal na levém konci a HindlII místem na pravém konci a obsahující úsek odpovídající nukleotidům 4942 až 5093 sekvence plastidové DNA N. tabaccum (Shinozaki et al., EMBO J. 5: 2043-2049, 1986) byl izolován z gelu standardním způsobem a pak naštěpen Xbal a HindlII.
III. Ligace fragmentu reportérového genu GUS s promotorem a netranslatovanými úseky 5'UTR a 3'UTR genu clpP.
Fragment reportérového genu β-galakturonidázy (GUS) o velikosti 1864 bp odvozený z plazmidu pRAJ275 (Clontech) obsahující restrikční místo Ncol v místě start-kodonu ATG a restrikční místo Xbal následující nativní 3-UTR byl získán vyštěpením pomocí enzymů Ncol a Xbal. Tento fragment byl spojen ve čtyřcestné ligační reakci s promotorovým fragmentem EcoRI/NcoI promotoru clpP velikosti 201 bp, s fragmentem Xbal/HindlII z 3'UTR genu rpsl6 velikosti 157 bp a fragmentem EcoRI/HindlII zklonovacího vektoru pGEM3Zf(-) (Promega, Madison, WI), a byl tak vytvořen plazmid pPH138. Plastidový transformační vektor byl vytvořen
-63 CZ 297325 B6 tak, že se plazmid pPRVllla (Zoubenko et al., 1994) naštěpil EcoRI a HindlII a výsledný fragment velikosti 7287 bp se ligoval s fragmentem EcoRI/HindlII z pPH138 o velikosti 2222 bp.
Příklad 35
Příprava chimérického genu, který obsahuje promotor plastidového genu clpP z tabáku a minimální 5'-netranslatovaný úsek plastidového genu psbA z tabáku, spojené s reportérovým genem GUS a 3'-netranslatovaným úsekem plastidového genu rpsló vplastidovém transformačním vektoru
Amplifikace promotoru plastidového genu clpP z tabáku a zkráceného 5'-netranslatovaného úseku RNA (5'UTR): Celková DNA z N. tabaccum cv. Xanthi NC byla použita jako templát v PCR popsané podrobněji v předchozím textu s „levopravým primerem pro horní řetězec“ Pclp Pla (sekvence id. č. 27) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec“ homologním k úseku v poloze 34 až -11 od start-kodonu ATG promotoru clpP obsahujícím vložené restrikční místo Xbal v poloze -11 v 5'UTR clpP (primer PclpJPlb: 5'-gcgtctagaaagaactaaatactatatttcac-3', sekvence id. č. 29, podtrženo je restrikční místo Xbal). Amplifikační produkt velikosti 202 bp obsahující promotor a zkrácený 5'-netranslatovaný úsek genu clpP restrikčním místem EcoRI na levém konci a Xbal místem na pravém byl izolován z gelu standardním způsobem a pak naštěpen Xbal. Místo Xbal bylo následně doplněno pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerázy (New England Biolabs) a fragment byl štěpen EcoRI. Pak byl fragment v pěticestné ligační reakci spojen s dvouřetězcovým fragmentem DNA, který odpovídal posledním 38 nukleotidům a startkodonu ATG v 5'UTR plastidového genu psbA z tabáku (s přesahujícím restrikčním místem Ncol zavedeným do start-kodonu ATG) a byl vytvořen spojením syntetických oligonukleotidů minpsb_U (horní řetězec: 5'-gggagtccctgatgattaaataaaccaagattttac-3', sekvence id. č. 32) aminpsb L (dolní řetězec: 5'-catggtaaaatcttggtttatttaatcatcagggactccc-3'. sekvence id. č. 33, podtržen je 5'-přesah místa Ncol), fragmentem reportérového genu GUS popsaným v předchozím textu, fragmentem Xbal/HindlII z 3'UTR genu rpsló popsaným v předchozím textu, a fragmentem Eco-RI/HindlII pGEM3Zf(-) popsaným v předchozím textu, a pPH144 byl vytvořen tak, že se plazmid pPRVl 1 la (Zoubenko et al., Nucl. Acad. Res. 22: 3819-3824, 1994) naštěpil EcoRI a HindlII a výsledný fragment velikosti 7287 bp se ligoval s EcoRI/HindlII fragmentem z pPH139 velikosti 2251 bp.
Příklad 36
Příprava chimérického genu, který obsahuje promotor plastidového genu clpP z tabáku a úplný 5'-netranslatovaný úsek, fúzované škodující sekvencí Protox-1 zArabidopsis thaliana a 3'netranslatovaným úsekem plastidového genu rpsló ve vektoru pro transformaci plastidů tabáku
DNA získaná minipreparací z plazmidu AraC-2Met obsahujícího inzert Notl z Arabidopsis thaliana, který obsahuje sekvenci cDNA genu protoporfyrinogen-IX-oxidázy (PROTOX) kódující aminokoncovou část plastidového tranzitního peptidu, úplnou cDNA a část 3'-netranslatovaného úseku, byla použita jako templát pro PCR reakci podrobně popsanou v předchozím textu s „levopravým primerem pro horní řetězec“ (s homologií k nukleotidům v poloze +1172 až +1194 od start-kodonu prekurzorováného proteinu plné délky) obsahujícím vložené restrikční místo Ncol v novém start-kodonu v dedukovaném místě počátku sekvence maturovaného proteinu PROTOX (primer APRTXPla: 5'-GGACCATGGATTGTGTGATTGTCGGCGGAGG-3 sekvence id. č. 34, podtrženo je restrikční místo Ncol) a „pravolevým primerem pro dolní řetězec“ homologním k úseku v poloze -917 až +940 od nativního start-kodonu ATG prekurzorového proteinu PROTOX (primer APRTXPlb: 5'-CTCCGCTCTCCAGCTTAGTGATAC-3', sekvence id. č. 35). Amplifikační produkt velikosti 778 byl naštěpen Ncol a Sful a výsledný fragment velikost 682 bp byl ligován s DNA fragmentem Sful/Notl z AraC-2Met velikosti 844
-64CZ 297325 B6 bp obsahujícím 3'-úsek kódující sekvence PROTOX a fragmentem Ncol/Notl zklonovacího vektoru pGEM5Zf(+) (Promega, Madison, WI) velikosti 2978 bp, a byl tak vytvořen plazmid pPH141. Plastidový transformační vektor pPH143 obsahující promotor clpP řídící gen rezistence 276'854 SVl-Met PROTOX s 3'UTR rspló byl vytvořen tak, že pPH141 se naštěpil Ncol a SspI a izoloval se fragment velikosti 1491 bp obsahující úplnou kódující sekvenci PROTOX, produkty z PCR srpsl6P_la a rpsl6P_lb popsaný v předchozím textu se naštěpil HindlII, a tyto fragmenty se ligovaly s fragmentem NcoI/HindlII z pPH140 o velikosti 7436 bp.
Příklad 37
Příprava chimérického genu, který obsahuje promotor plastidového genu clpP z tabáku a minimální 5'-netranslatovaný úsek plastidového genu psbA, fúzované s kódující sekvencí Protox-1 z Arabidopsis thaliana a 3'-netranslatovaným úsekem plastidového genu rpsl6 ve vektoru pro transformaci plastidů tabáku
Plastidový transformační vektor pPH145 obsahující fúzovanou sekvenci „promotor clp/5'UTR psbA“, která řídí gen rezistence 276'854 SVl-Met PROTOX s 3'UTR rpsl6, byl připraven tak, že se naštěpil plazmid pPH141 enzymy Ncol a SspI, izoloval se fragment o velikosti 1491 bp obsahující úplnou kódující sekvenci PROTOX, produkty zPCR srpsl6P_la a rpsl6P_lb popsaný v předchozím textu se naštěpil HindlII, a tyto fragmenty se ligovaly s fragmentem NcoI/HindlII z pPH144 o velikosti 7465 bp.
Příklad 38
Transformace plastidového genomu tabáku metodou bombardování mikročásticemi
Semena Nicotiana tabacum cv. Xanthi NC byla naklíčena po 7 na 1 kruhové misce velikosti 2,5 cm na T-agarovém médiu a 12 až 14 dní po vysetí byly semenáčky bombardovány Ipm wolframovými částicemi (M10, Biorad, Hercules, CA) pokrytými DNA plazmidů pPH143 a pPH145 v podstatě způsobem, který popsali Svab, Z. a Maliga, P. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 913-917, 1993). Bombardované semenáčky byly po 2 dny inkubovány v T-médiu a pak byly listy odříznuty a umístěny abaxiální stranou nahoru na misky s médiem RMOP (Svab, Z. Hajdukiewicz, P., Maliga, P., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530, 1990) obsahujícím 500 pg/ml dihydrochloridu spectinomycinu (Sigma, St. Louis, MO) a umístěny pod silným světlem (350 až 500 pmol foton/m2/s). Rezistentní výhonky, které se objevovaly na spodku vybledlých listů tři až osm týdnů po bombardování byly subklonovány na stejné selektivní médium, ponechány až do vytvoření kalusu a pak byly izolovány a subklonovány druhotné výhonky. Úplná segregace kopií transformovaného plastidového genomu (homoplasmicita) v nezávislých subklonech byla hodnocena standardní technikou Southemova přenosu (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Celková buněčná DNA naštěpená BamHI/EcoRI (Mettler, I. J., 1987, Plant Mol. Biol. Reportér 5, 346-349) byla rozdělena v 1% Tris-borátovém (TBE) agarózovém gelu, přenesena na nylonovou membránu (Amersham) a hybridizována s DNA sondou značenou náhodně 32P odpovídající DNA fragmentu BamHI/HindlII velikosti 0,7 kb z pC8 obsahující část plastidové směrovací sekvence rps7/12. Homoplasmické výhonky byly asepticky zakořeněny na médiu MS/IBA obsahujícím spectinomycin (McBride, K. E. et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305) a pak přeneseny do skleníku.
Odborníkovi jsou zřejmé další modifikace předkládaného vynálezu popsaného zde a následující nároky zahrnují i tyto modifikace.
-65CZ 297325 B6
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1719 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-2 (NRRL B-21238) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 31..1644 (C) DALŠÍ INFORMACE:/produkt = .Arabidopsis protox-1“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
TGACAAAATT CCGAATTC7C TGCGATTTCC ATG GAG ΊΤΑ TCT CTT CTC CGT CCG Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro 1 5
-66CZ 297325 B6
ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA 102
Thr Gin Ser Leu Leu Pro Ser Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu
10 15 20
AAT GTT TAT AAG CCT CTT AGA CTC CGT TGT TCA GTG GCC GGT GGA CCA 150
?lsn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro
25 30 35 40
ACC GTC GGA TCT TCA AAA ATC GAA GGC GGA GGA GGC ACC ACC ATC ACG 198
Thr Val Gly Ser Ser Lys Cle Glu Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr
45 50 55
ACG GAT TGT GTG ATT GTC GGC GGA GGT ATT AGT GGT CTT TGC ATC GCT 246
Thr Asp Cys Val Zle Val Gly Gly Gly Cle Ser Gly Leu Cys Cle Ala
60 65 70
CAG GCG CTT GCT ACT AAG CAT CCT GAT GCT GCT CCG AAT TTA ATT GTG 294
Gin Ala Leu Ala Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val
75 εο 85
ACC GAG GCT AAG GAT CGT GTT GGA GGC AAC ATT ATC ACT CGT GAA GAG 342
Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly C-ly Asn Cle ile Thr Arg Glu Glu
50 55 100
AAT GGT TTT CTC TGG GAA GAA GGT CCC AAT Asn Glv Phe Leu Trp Glu Glu Glv pro Asn 105 110 AGT Ser 115 TTT CAA CCG TCT GAT 390
Phe Gin Pro Ser Asp 120
CCT ATG CTC ACT ATG GTG GTA GAT AGT GGT TTG AAG GAT GAT TTG GTG 438
Pro Me: Leu Thr Meu Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
125 130 135
TTG GGA GAT CCT ACT GCG CCA AGG TTT GTG TTG TGG AAT GGG AAA TTG 486
Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu
140 145 150
AGG CCG GTT CCA TCG AAG CTA ACA GAC TTA CCG TTC TTT GAT TTG ATG 534
Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met
155 160 165
AGT ATT GGT GGG AAG ATT AGA GCT GGT TTT GGT GCA CTT GGC ATT CGA 582
Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg
170 175 180
CCG TCA CCT CCA GGT CGT GAA GAA TCT GTG GAG GAG TTT GTA CGG CGT 630
-67CZ 297325 B6
Pro Ser Prc i Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg
185 190 195 200
AAC CTC GGT ' GAT GAG GTT TTT GAG CGC CTG ATT GAA CCG TTT TGT TCA 678
Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
205 210 215
GGT GTT TAT GCT GGT GAT CCT TCA AAA CTG AGC ATG AAA GCA GCG TTT 726
Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe
220 225 230
GGG AAG GTT TGG AAA CTA GAG CAA AAT GGT GGA AGC ATA ATA GGT GGT 774
Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gin Asn Gly Gly Ser Ile Tle Gly Gly
235 240 245
ACT TTT AAG GCA ATT CAG GAG AGG AAA AAC GCT CCC AAG GCA GAA CGA 822
Thr Phe Lys Ala Ile Gin Glu Arg Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg
250 255 260
GAC CCG CGC CTG CCA AAA CCA CAG GGC CAA ACA GTT GGT TCT TTC AGG 870
Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gin Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg
265 270 275 280
AAG GGA CTT CGA ATG TTG CCA GAA GCA ATA TCT GCA AGA TTA GGT AGC 918
Lys Gly Leu Arg' Met Leu Pro Glu Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser
285 290 295
AAA i GTT . AAG TTG TCT TGG . AAG CTC TCA GGT ATC ACT AAG CTG GAG AGC 966
Lys Val Lys Leu Ser Trp : Lys Leu Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser
300 305 310
GGA GGA TAC AAC TTA ACA TAT GAG ACT CCA GAT GGT TTA GTT TCC GTG 1014
Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val
315 320 325
CAG AGC AAA AGT GTT GTA ATG ACG GTG CCA TCT CAT GTT GCA AGT GGT 1062
Gin Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly
330 335 340
CTC TTG CGC CCT CTT TCT GAA TCT GCT GCA AAT GCA CTC TCA AAA CTA 1110
Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu
345 350 355 36D
TAT TAC CCA CCA GTT GCA GCA GTA TCT ATC TCG TAC CCG AAA GAA GCA 1158
Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala
-68CZ 297325 B6
365 370 375
ATC Ile CGA Arg ACA Thr GAA TGT TTG ATA GAT Asp GGT GAA CTA AAG GGT TTT GGG Gly CAA Gin
Glu Cys 380 Leu Ile Gly 385 Glu Leu Lys Gly Phe 390
TTG CAT CCA CGC ACG CAA GGA GTT GAA ACA TTA GGA ACT ATC TAC AGC
Leu His Pro Arg Thr Gin Gly Val G1U Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser
395 400 405
TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGC GCA CCG CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG
Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu
410 415 420
AAC TAC ATT GGC GGG TCT ACA AAC ACC GGA ATT CTG TCC AAG TCT GAA
Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu
425 430 435 440
1206
1254
1302
1350
GGT GAG TTA GTG GAA GCA GTT GAC AGA GAT TTG AGG AAA ATG CTA ATT
Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile
445 450 455
AAG CCT AAT TCG ACC GAT CCA CTT AAA TTA GGA GTT AGG GTA TGG CCT
Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro
450 465 470
CAA GCC ATT CCT CAG TTT CTA GTT GGT CAC TTT GAT ATC CTT GAC ACG
Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr
475 480 485
GCT AAA TCA TCT CTA ACG TCT TCG GGC TAC GAA GGG CTA TTT TTG GGT
Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly
490 495 500
GGC AAT TAC GTC GCT GGT GTA GCC TTA GGC CGG TGT GTA GAA GGC GCA
Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala
505 510 515 520
TAT GAA ACC GCG ATT GAG GTC AAC AAC TTC ATG TCA CGG TAC GCT TAC
Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr
525 530 535
1395
1446
1494
1542
1590
1638
AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT Lys
1691
-69CZ 297325 B6
TTGAGATATC CAAAAAAAAA ΑΑΆΑΑΑΑΑ 1719 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 537 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gin Ser Leu Leu Pro Ser
1 5 10 15
Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu
20 25 30
Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly
50 55 60
Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu Ala Thr Lys His Pro
65 70 75 80
Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly
85 90 95
Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly
100 105 110
Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp
115 120 125
Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg
130 135 140
Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr
145 150 155 160
70CZ 297325 B6
Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala
165 170 175
Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu
180 185 190
Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu
195 200 205
Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser
210 215 220
Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gin
225 230 235 240
Asn Gly Gly Ser Zle Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gin Glu Arg
245 250 255
Lys Asp. Ala Pro Lys Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys ?XO Gin
260 265 270
Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu
275 280 285
Ala Zle Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu
290 295 300
Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu
305 310 315 320
Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Gin Ser Lys Ser Val Val Met Thr
325 330 335
Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser
340 345 350
Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val
3 55 360 365
Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Thr Glu Cys Leu Ile Asp
370 375 380
Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin Leu His Pro Arg Thr Gin Gly Val
385 390 395 400
-71 CZ 297325 B6
Glu Thr Leu . Gly Thr Ile i Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn . Arg Ala
405 410 415
Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn
420 425 430
Thr Gly He Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp
435 440 445
Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu
450 455 460
Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val
465 470 475 480
Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser
485 490 495
Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala
500 505 510
Leu Gly Arg Cys ' Val Glu Gly Ala Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn
515 520 525
Asn Phe : Met Ser ; h rg ' Tyr Ala Tyr Lys
530 535
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 1738 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: cDNA
(iii) HYPOTETICKÁ: ne
(iv) ANTI-SENSE: ne
(vi) PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS: Arabidcpsis thaliana
-72CZ 297325 B6 (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-1 (NRRL B-21237) (ϊχ) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 70.-1596 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-2 Arabidopsis (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG 60
CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA .GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108
Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gin Ile Glu Ala
1 5 10
GTT TCA GGA AAA AGA . GTC L GCA GTC GTA . GGT 1 GCA . GGT GTA . AGT ' GGA CTT 156
Val Ser Gly Lys Arg Val Ala Val Val Gly 1 Ala Gly Val Ser Gly Leu
15 20 25
GCG GCG GCT TAC AAG TTG AAA TCG AGG GGT TTG AAT GTG ACT GTG TTT 204
Ala Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe
30 35 40 45
GAA GCT GAT GGA AGA GTA GGT GGG AAG TTG AGA AGT GTT ATG CAA AAT 252
Glu Ala Asp Gly Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gin Asn
50 55 60
GGT TTG ATT TGG GAT GAA GGA GCA AAC ACC ATG ACT GAG GCT GAG CCA 300
Gly Leu Ile Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ala Glu Pro
65 70 75
GAA GTT GGG AGT TTA CTT GAT GAT CTT GGG CTT CGT GAG AAA CAA CAA 348
Glu Val Gly Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gin Gin
80 85 90
TTT CCA ATT TCA CAG AAA AAG CGG TAT ATT GTG CGG AAT GGT GTA CCT 396
Phe Pro Ile Ser Gin Lys Lys Arg Tyr Ile Val Arg Asn Gly Val Pro
95 100 105
GTG . ATG i CTA CCT ACC AAT CCC ATA GAG CTG GTC . ACA . AGT AGT GTG CTC 444
Val Met : Leu Pro ' Thr . Asn Pro Ile -Glu Leu Val Thr Ser Ser Val Leu
110 115 120 125
TCT AC-C CAA TCT AAG TTT CAA ATC TTG TTG GAA CCA TTT TTA TGG AAG 492
Ser Thr Gin Ser Lys Phe Gin Ile Leu Leu Glu Pro Phe Leu Trp Lys
13 0 135 140
AAA AAG TCC TCA AAA GTC TCA GAT GCA TCT GCT GAA GAA AGT GTA AGC 540
Lys Lys Ser Ser Lys Val Ser A.sp Ala Ser A.la Glu Glu Ser Val Ser
145 150 155
GAG TTC TTT CAA CGC CAT TTT GGA CAA GAG GTT GTT GAC TAT CTC ATC 588
Glu Phe Phe Gin Arg His Phe Gly Glr. Glu Val Val Asp Tyr Leu Ile
160 165 170
GAC CCT TTT GTT GGT GGA ACA AGT GCT GCG GAC CCT GAT TCC CTT TCA 636
Asp Pro Phe Val Gly Gly Thr Ser Ala Ala Asp Pro Asp Ser Leu Ser
175 1S0 185
ATG AAG CAT TCT TTC CCA GAT CTC TGG AAT GTA GAG AAA AGT TTT GGC 684
Me t Lys His Ser Phe Pro A.sp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Phe Gly
190 195 200 205
TCT ATT ATA GTC GGT GCA ATC AGA ACA AAG TTT GCT GCT AAA GGT GGT 732
Ser Ile Ile Val Gly Ala Ile Arg Thr Lys Phe Ala Ala Lys Gly Gly
210 215 220
AAA AGT AGA GAC ACA AAG AGT TCT CCT GGC ACA AAA AAG GGT TCG CGT 780
Lys Ser Arg Asp Thr Lys Ser Ser Pro Gly Thr Lys Lys Gly Ser Arg
225 230 235
GGG TCA TTC TCT TTT AAG GGG GGA ATG CAG ATT CTT CCT GAT ACG TTG 828
Gly Ser Phe Ser Phe Lys Gly Gly Met Gin Ile Leu Pro Asp Thr Leu
240 245 250
TGC AAA AGT CTC TCA CAT GAT GAG ATC AAT TTA GAC TCC AAG GTA CTC 876
Cys Lys Ser Leu Ser His Asp Glu Ile Asn Leu Asp Ser Lys Val Leu
255 260 265
TCT TTG TCT TAC AAT TCT GGA TCA AGA CAG GAG AAC TGG TCA TTA TCT 924
Ser Leu Ser Tyr Asn Ser G2y Ser Arg Gin Glu Asn Trp Ser Leu Ser
270 275 280 285
TGT Cys GTT Val TCG Ser CAT AAT GAA Glu ACG Thr CAG AGA CAA AAC CCC CAT TAT GAT GCT 972
His Asn 290 Gin Arg Gin 295 A.sn Pro His Tyr Asp 300 Ala
GTA ATT ATG ACG GCT CCT CTG TGC AAT GTG AAG GAG ATG AAG GTT ATG 1020
-74CZ 297325 B6
Val Tle Met Thr Ala 305 Pro Leu Cys Asn Val 310 Lys Glu Met Lys 315 Val Met
AAA GGA GGA CAA CCC TTT CAG CTA AAC TTT CTC CCC GAG ATT AAT TAC 1068
Lys Gly Gly Gin Pro Phe Gin Leu Asn Phe Leu Pro Glu Ile Asn Tyr
320 325 330
ATG CCC CTC TCG GTT TTA ATC ACC ACA TTC ACA AAG GAG AAA GTA AAG 1116
Met Pro Leu Ser Val Leu Zle Thr Thr Phe Thr Lys Glu Lys Val Lys
335 340 345
AGA CCT CTT GAA GGC TTT GGG GTA CTC ATT CCA TCT AAG GAG CAA AAG 1164
Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Ser Lys Glu Gin Lys
350 355 360 365
CAT GGT TTC AAA ACT CTA GGT ACA CTT TTT TCA TCA ATG ATG TTT CCA 1212
His Gly Phe Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro
370 375 380
GAT CGT TCC CCT AGT GAC GTT CAT CTA TAT ACA ACT TTT ATT GGT GGG 1260
Asp Arg Ser Pro Ser Asp Val His Leu Tyr Thr Thr Phe Ile Gly Gly
385 390 395
AGT AGG AAC CAG GAA CTA GCC AAA GCT TCC ACT GAC GAA TTA AAA CAA 1308
Ser Arg Asn Gin Glu Leu Ala Lys Ala Ser Thr Asp G1U Leu Lys Gin
400 405 410
GTT GTG ACT TCT GAC CTT CAG CGA CTG TTG GGG GTT GAA GGT GAA CCC 1356
Val Vál Thr Ser Asp Leu Gin Arg Leu Leu Gly Val Glu Gly Glu Pro
415 420 425
GTG TCT GTC AAC CAT TAC TAT TGG AGG AAA GCA TTC CCG TTG TAT GAC
Val Ser Val Asn His Tyr Tyr Trp Arg Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Asp
430 435 440 445
1404
AGC AGC TAT GAC TCA GTC ATG GAA GCA ATT GAC AAG ATG GAG AAT GAT
Ser Ser Tyr Asp Ser Val Met Glu Ala Ile Asp Lys Met Glu Asn Asp
450 455 460
1452
CTA CCT GGG TTC TTC Phe TAT GCA GGT Gly AAT CAT CGA GGG GGG CTC Ser GTT Val
Leu Pro Gly Phe 465 Tyr Ala Asn 470 His Arg Gly Gly Leu 475
GGG AAA TCA ΆΤΑ GCA TCA GGT TGC AAA GCA GCT GAC CTT GTG ATC TCA
Gly Lys Ser Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser
1500
1548
-75CZ 297325 B6
480 485 490
TAC CTG GAG TCT TGC TCA AAT GAC AAG AAA CCA AAT GAC AGC ΤΤΆ TAACATTGTC
1603
Tyr Leu Glu Ser Cys Ser Asn Asp Lys Lys Pro Asn Asp Ser Leu
495 500 505
AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663
CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1723
ACTATTTATG TAAAA 1738
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 508 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
Met 1 Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His 5 Gin Ile Glu Ala 10 Val Ser 15 Gly
Lys Arg Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Tyr Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Asp
35 40 45
Gly Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gin Asn Gly Leu Ile
50 55 60
Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Gly
65 70 75 80
Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gin Gin Phe Pro Ile
85 90 95
Ser ' Gin Lys Lys Arg Tyr Ile Val Arg . Asn Gly Val Pro Val Met Leu
100 105 HO
-76CZ 297325 B6
Pro Thr Asn Pro Ile Glu Leu Val Thr Ser Ser Val Leu Ser Thr Gin
115 120 125
Ser Lys Phe Gin Ile Leu Leu Glu Pro Phe Leu Trp Lys Lys Lys Ser
130 135 140
Ser Lys Val Ser Asp Ala Ser Ala Glu Glu Ser Val Ser' Glu Phe Phe
145 150 155 160
Gin Arg His Phe Gly Gin Glu Val Val Asp Tyr Leu Ile Asp Pro Phe
165 170 175
Val Gly Gly Ser Ala Ala Asp Pro Asp Ser Leu Ser Met Lys His
180 185 190
Ser Phe Pro Asp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Phe Gly Ser Ile Ile
195 200 205
Val Gly Ala Ile λΧΌ Thr Lys Phe Ala Ala Lys Gly Gly Lys Ser Arg
210 215 220
Asp Thr Lys Ser Ser Pro Gly Thr Lys Lys Gly Ser Arg Gly Ser Phe
225 230 235 240
Ser Phe Lys Gly cly Met Gin Ile Leu Pro Asp Thr Leu Cys Lys Ser
245 250 255
Leu Ser His Asp 260 Glu Ile Asn Leu Asp 265 Ser Lys Val Leu Ser 270 Leu Ser
Tyr Asn Ser Gly Ser Arg Gin Glu Asn Trp Ser Leu Ser Cys Val Ser
275 280 285
His Asn Glu Thr Gin Arg Gin Asn Pro His Tyr Asp Ala Val Ile Met
290 295 300
Thr Ala Pro Leu Cys Asn Val Lys Glu Met Lys Val Met Lys Gly Gly
305 310 315 320
Gin Pro Phe Gin Leu Asn Phe Leu Pro Glu Ile Asn Tyr Met Pro Leu
325 330 335
Ser Val Leu Ile Thr Thr Phe Thr Lys Glu Lys Val Lys Arg Pro Leu
340 345 350
-77CZ 297325 B6
Glu Gly Phe : Gly Val Leu Ile Pro ' Ser Lys Glu Gin Lys His Gly • Phe
355 360 365
Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ser
370 375 380
Pro Ser Asp Val His Leu Tyr Thr Thr Phe Ile Gly Gly Ser Arg Asn
385 390 395 400
Gin Glu Leu Ala Lys Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gin Val Val Thr
405 410 415
Ser Asp Leu Gin Arg Leu Leu Gly Val Glu Gly Glu Pro Val Ser Val
420 425 430
Asn His Tyr Tyr Trp Arg Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Asp Ser Ser Tyr
435 440 445
Asp Ser Val Met Glu Ala Ile Asp Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gly
450 455 460
Phe Phe Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ser
465 470 475 480
Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser ‘ Tyr Leu Glu
485 490 495
Ser cys Ser . Asn Asp Lys Lys Pro . Asn . Asp Ser : Leu
500 505
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1691 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne
-78CZ 297325 B6 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Zea ma.ys (kukuřice) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..1443 (C) DALŠÍ INFORMACE:/produkt = „cDNA protox-1 kukuřice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GCG GAC TGC GTG GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC TGC ACC GCG 48
Ala Asp Cys ; Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala
1 5 10 15
CAG GCG CTG GCC ACG CGG CAG GGC GTC GGG GAC GTG CTT ’ GTC ACG GAG 96
G-ín A..a Lgu Ala Thr Arg His Gly Val Gly Asp Val Leu Val Thr Glu
20 25 30
GCC CGC GCC CGC CCC GGC GGC AAC ATT ACC ACC GTC GAG CGC CCC GAG 144
Ala Arg Ala Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Glu
35 40 45
GAA GGG TAC CTC TGG GAG GAG GGT CCC AAC AGC TTC CAG CCC TCC GAC 192
Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser ASp
50 55 60
CCC GTT CTC ACC ATG GCC GTG GAC AGC GGA CTG AAG GAT GAC TTG GTT 240
Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
65 70 75 80
TTT GGG GAC CCA AAC GCG CCG CGT TTC GTG CTG TGG GAG GGG AAG CTG 288
Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu
35 90 95
AGG CCC GTG CCA TCC AAG CCC GCC GAC CTC CCG TTC TTC GAT CTC ATG 336
Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Ala Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met
100 -105 110
AGC ATC CCA < GGG AAG * CTC AGG GCC GGT CTA GGC i GCG ' CTT GGC . ATC i CGC 384
-79CZ 297325 B6
Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg
115 120 125
CCG CCT CCT CCA GGC CGC GAA GAG TCA GTG GAG GAG TTC GTG CGC CGC 432
Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg
130 135 140
AAC CTC GGT GCT GAG GTC TTT GAG CGC CTC ATT GAG CCT TTC TGC TCA 480
Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
145 150 155 160
GGT GTC TAT GCT GGT GAT CCT TCT AAG CTC AGC ATG AAG GCT GCA TTT 528
Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys .Ala Ala Phe
165 170 175
GGG AAG GTT TGG CGG TTG C-AA GAA ACT GGA GGT AGT ATT A.TT GGT GGA 576
Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly
180 185 190
ACC ATC AAG ACA ATT CAG GAG AGG AGC AAG AAT CCA AAA CCA CCG AGG 624
Thr Ile Lys Thr Ile Gin Glu Arg Ser Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg
195 200 205
GAT Asp 1 GCC Ala 210 CGC A.rc CTT CCG AAG CCA AAA GGG C.AG ACA GTT GCA TCT TTC AGG 672
Leu Pro Lys Pro Lys 215 Gly Gin Thr Val 220 Ala Ser Phe Arg
AAG GGT CTT GCC ATG CTT CCA AAT GCC ATT ACA TCC AGC TTG GGT AGT 720
Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn A.1 a Tle Thr Ser Ser Leu Gly Ser
225 230 235 240
AAA GTC AAA CTA TCA TGG AAA CTC ACG AGC ATT ACA AAA TCA GAT GAC 768
Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asp
245 250 255
AAG GGA TAT GTT TTG GAG TAT GAA ACG CCA GAA GGG GTT GTT TCG GTG 816
Lys Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Val
260 265 270
CAG GCT AAA AGT GTT ATC ATG ACT ATT CCA TCA TAT GTT GCT AGC AAC 864
Gin Ala Lys Ser Val Tle Met Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asn
275 280 285
ATT TTG CGT CCA CTT TCA. AGC GA.T GCT GCA GAT GCT CTA TCA AGA TTC 912
Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ser A.sp Ala Ala Asp Ala Leu Ser Arg Phe
80CZ 297325 B6
290 295 300
TAT TAT CCA CCG GTT GCT GCT GTA ACT GTT TCG TAT CCA AAG GAA GCA
Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala
305 310 315 320
ATT AGA AAA GAA TGC TTA ATT GAT GGG GAA CTC CAG GGC TTT GGC CAG
Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin
325 330 335
TTG CAT CCA CGT AGT CAA .GGA GTT GAG ACA TTA GGA ACA ATA TAC AGT
Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser
340 345 350
TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGT GCT CCT GAC GGT AGG GTG TTA CTT CTA
Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro A.sp Gly Arg Val Leu Leu Leu
355 350 365
AAC TAC ATA GGA GGT GCT ACA AAC ACA GGA ATT GTT TCC AAG ACT GAA
Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu
370 375 3S0
AGT GAG CTG GTC GAA GCA GTT GAC CGT GAC CTC CC-A AAA ATG CTT ATA
Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile
385 390 395 400
AAT TCT . ACA GCA GTG GAC CCT TTA GTC CTT GGT GTT CGA GTT TGG CCA
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
Asn Ser Thr Ala Val 405 Asp Pro Leu Val Leu 410 Gly Val Arg Val Trp 415 Pro
CAA GCC ATA CCT CAG TTC CTG GTA GGA CAT CTT GAT CTT CTG GAA GCC
Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Glu Ala
420 425 430
GCA AAA GCT GCC CTG GAC CGA GGT GGC TAC GAT GGG CTG TTC CTA GGA
Ala Lys Ala Ala Leu A.sp Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly
435 440 445
GGG AAC TAT GTT GCA GGA GTT GCC CTG GGC AGA TGC GTT GAG GGC GCG
Gly Asn Tyr val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala
450 455 460
TAT GAA AGT GCC TCG CAA ATA TCT GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC
Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser A.sp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr
465 470 47S 480
1296
1344
1392
1440
-81 CZ 297325 B6
AAG TGATGAAAGA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT TGCATAGATG
1493
Lys
AGGTGCCTCC GGGGAAAAAA AAGCTTGAAT AGTATTTTTT ATTCTTATTT TGTAAATTGC 1553
ATTTCTGTTC TTTTTTCTAT CAGTAATTAG TTATATTTTA GTTCTGTAGG AGATTGTTCT 1613
GTTCACTGCC CTTCAAAAGA AATTTTATTT TTCATTCTTT TATGAGAGCT GTGCTACTTA 1673
ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΆΑΑΑΆΑΑΑ 1691
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 481 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
Ala 2 Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Tle Ser Gly Leu Cys Thr Ala
5 10 15
Gin Ala Leu Ala Thr Arg His Cly Val Gly Asp Val Leu Val Thr Glu
20 25 30
Ala Arg Ala Arg Pro Gly Gly Asn Tle Thr Thr Val Glu Arg Pro G1U
35 40 45
Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp
50 55 60
Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
65 70 75 80
Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu
85 90 95
Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Ala Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met
100 105 110
82CZ 297325 B6
Ser Ile Pro Gly Lys 115 Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg
120 125
Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg
133 135 140
Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
145 150 155 160
Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe
165 17 0 175
Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Thr C-ly Gly Ser Ile Ile Gly Gly
160 185 190
Thr Ile Lvs Thr Ile Gin Glu Arg Ser Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg
195
200
05
Asp Ala Arg Leu 210 Pro Lys Pro 215 Lys Gly Gin Thr Val Ala 220 Ser Phe Arg
Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ser
225 230 235 240
Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asp
245 250 255
Lys Gly Tyr Val Leu Glu Tyx* Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Val
260 265 270
Gin Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asn
275 280 285
Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Ser Arg Phe
290 295 300
Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala
305 310 315 320
Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin
325 330 335
Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser
340 345 350
-83 CZ 297325 B6
Ser Ser Leu Phe 355 Pro Asn Arg Ala Pro 360 Asp Gly Arg Val Leu Leu 365 Leu
Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu
370 375 380
Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile
385 390 395 400
Asn Ser Thr Ala Val Asp Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro
405 410 415
Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val Gly nis Leu Asp Leu Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly
435 440 445
Gly Asn Tyr Val zAla Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala
450 455 460
Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr
485 470 475 480
x/s (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2061 párů bází (3) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární iii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Zea mays (kukuřice)
-84CZ 297325 B6 (víi) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-3 (NRRL B-21259) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 64..1698 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-2 kukuřice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT
CAA ATG CTC GCT TTG ACT GCC TCA . GCC TCA . TCC GCT ’ TCG TCC : CAT CCT 108
Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro
1 5 10 15
TAT CC-C CAC GCC TCC GCG CAC ACT CGT CGC CCC CGC CTA CGT GCG GTC 156
Tyr Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val
20 25 30
CTC GCG ATG GCG GGC TCC GAC GAC ccc CGT GCA GCG CCC GCC AGA TCG 204
Leu Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser
35 40 45
GTC GCC GTC GTC GGC GCC GGG GTC AGC GGG CTC GCG GCG GCG TAC AGG 252
Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg
50 55 60
CTC AGA CAG AGC GGC GTG AAC GTA ACG GTG TTC GAA GCG GCC GAC AGG 300
Leu Arg Gin Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg
65 70 75
GCG GGA GGA AAG ATA CGG ACC AAT TCC GAG GGC GGG TTT GTC TGG GAT 348
Ala Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp
80 85 90 95
GAA GGA GCT AAC ACC ATG ACA GAA GGT GAA TGG GAG GCC AGT AGA CTG 396
Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu
100 105 110
ATT GAT i GAT CTT GGT CTA CAA GAC AAA CAG CAG TAT CCT AAC tcc CAA 444
Ile Asp Asp Leu Gly Leu Gin Asp Lys Gin Gin Tyr Pro Asn Ser Gin
115 120 125
-85CZ 297325 B6
CAC AAG CGT TAC ATT GTC AAA GAT GGA GCA CCA GCA CTG ATT CCT TCG 492
His Lys Arg Tyr 130 Ile Val Lys Asp Gly Ala 135 Pro Ala Leu 140 Ile Pro Ser
GAT CCC ATT TCG CTA ATG AAA AGC AGT GTT CTT TCG ACA AAA TCA AAG 540
Asp Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys
145 150 155
ATT GCG TTA TTT TTT GAA CCA TTT c^c TAC AAG AAA GCT AAC ACA AGA 588
Ile Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg
160 165 170 175
AAC TCT GGA AAA GTG TCT GAG GAG CAC TTG AGT GAG AGT GTT GGG AGC 636
Asn Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser val Gly Ser
180 185 190
TTC TGT GAA CGC CAC TTT GGA AGA GAA GTT GTT GAC TAT TTT GTT GAT 684
Phe Cys Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp
195 200 205
CCA TTT GTA GCT GGA ACA AGT GCA GGA GAT CCA GAG TCA CTA TCT ATT 732
Pro Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile
210 215 220
CGT CAT GCA TTC CCA GCA TTG TTG GAA AGA AAG TAT GGT TCA 780
Arg Eis Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser
225 230 235
GTT ATT GTT GGT GCC ATC TTG TCT AAG CTA GCA GCT AAA GGT GAT CCAB28
Val Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Gly AspPro
240 245 250255
GTA AAG ACA AGA CAT GAT TCA TCA GGG AAA AGA AGG AAT AGA CGA GTG876
Val Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val
260 265270
TCG TTT TCA CAT GGT GGA ATG CAG TCA CTA ATA AAT GCA CTT CAC 924
Ser Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gin Ser Leu Ile Asn Ala Leu His
275 280 285
AAT GAA GTT GGA GAT GAT AAT GTG AAG CTT GGT ACA GAA GTG TTG TCA 972
Asn Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser
290 295 300
TTG GCA TGT ACA TTT GAT GGA GTT CCT GCA CTA GGC AGG TGG TCA ATT 1020
-86CZ 297325 B6
Leu Ala 305 Cys Thr Phe Asp Gly Val 310 Pro A.la Leu Gly 315 Arg Trp Ser Ile
TCT GTT GAT TCG AAG GAT AGC GGT GAC AAG GAC CTT GCT AGT AAC CAA 1068
Ser Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gin
320 325 330 335
ACC TTT GAT GCT GTT ATA ATG ACA GCT CCA TTG TCA AAT GTC CGG AGG 1116
Thr Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg
340 345 350
ATG AAG TTC ACC AAA GGT GGA GCT CCG GTT GTT CTT GAC TTT CTT CCT 1164
Met Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro
355 360 365
AAG ATG GAT TAT CTA CCA CTA TCT CTC ATG GTG ACT GCT TTT AAG AAG 1212
Lys Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys
370 375 380
GAT GAT GTC AAG AAA CCT CTG GAA GGA TTT GGG GTC TTA ATA CCT TAC 1260
Asp Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr
385 390 395
AAG GAA CAG CAA AAA CAT GGT CTG AAA ACC CTT GGG ACT CTC TTT TCC 1308
Lys Glu Gin Gin Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser
400 405 410 415
TCA ATG ATG TTC CCA GAT CGA GCT CCT GAT GAC CAA TAT TTA rnj* ip ACA 1356
Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro A.sp Asp Gin Tyr Leu Tyr Thr
420 425 430
ACA TTT GTT GGG GGT AGC CAC AAT AGA GAT CTT GCT GGA GCT CCA ACG 1404
Thr Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr
435 440 445
TCT ATT CTG AAA CAA CTT GTG ACC TCT GAC CTT AAA AAA CTC TTG GGC 1452
Ser Ile Leu Lys Gin Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly
450 455 460
GTA GAG GGG CAA CCA ACT TTT GTC AAG CAT GTA TAC TGG GGA AAT GCT 1500
Val Glu Gly Gin Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala
465 470 475
TTT CCT TTG TAT GGC CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA 1548
Phe Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu
87CZ 297325 B6
480 485 490 495
AAG ATG GAG AAA AAC CTT CCA GGG TTC TTC TAC GCA GGA AAT AGC AAG 1596
Lys Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys
500 505 510
GAT GGG CTT GCT GTT GGA AGT GTT ATA GCT TCA GGA AGC AAG GCT GCT 1644
Asp Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala
515 520 525
GAC CTT GCA ATC TCA TAT CTT GAA TCT CAC ACC AAG CAT AAT AAT TCA 1692
Asp Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser
530 535 540
CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 1745
His
545
CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA 1805
ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA 1865
AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATG7TCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC 1925
TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGTA 1985
ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA 2045
ΑΑΑΆΑΑΑΑΑΑ AAAAAA 2061
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 544 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro Tyr 15 10 15
-88CZ 297325 B6
Arg His Ala Ser Ala . His Thr Arg Arg Pro > Arg Leu Arg Ala Val Leu
20 25 30
Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser Val
35 40 45
Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu
50 55 60
Arg Gin Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp .Arg Ala
65 70 75 80
Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu
85 90 95
Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu Ile
100 105 110
Asp Asp Leu Gly Leu Gin Asp Lys Gin Gin Tyr Pro Asn Ser Gin His
115 120 125
Lys Arg Tyr Ile Val Lys Asp Gly Ala Pro A.la Leu Ile Pro Ser Asp
130 135 140
Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ile
145 150 155 160
Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg Asn
165 170 175
Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser Phe
180 185 190
Cys Glu Arg His i Phe < Gly Arg ' Glu ' Val ’ Val . Asp ' Tyr Phe Val . Asp Pro
195 200 205
Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg
210 215 220
His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser Val
225 230 235 240
Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys .Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro Val
245 250 255
-89CZ 297325 B6
Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val Ser
260 265 270
Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gin Ser Leu Ile Asn Ala Leu His Asn
275 260 265
Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser Leu
250 295 300
Ala Cys tjix* phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile Ser
305 310 315 320
Val A.sp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gin Thr
325 330 335
Phe /-.sp Ala Val Ile Met rnjx,— Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg Met
340 345 350
Lys Phe Φ'- -r- Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro Lys
355 360 365
xr — — riG x. .Asp Tyr AjSU Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys Asp
370 375 380
Asp V a Á Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr Lys
3 S5 390 395 400
Glu Gin Gin Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser
405 410 415
Met Met Phe Pro .Asp Arp Ala Pro Asp Asp Gin Tyr Leu Tyr Thr Thr
420 425 430
Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr Ser
435 440 445
Ile Leu Lys Gin Leu Val Thr Ser A.sp Leu Lys Lys Leu Leu Gly Val
450 455 460
Glu Gly Gin Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala Phe
455 470 475 480
Pro Leu ty-r Gly His A.sp Tyr Ser ’ Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu Lys
485 490 495
-90CZ 297325 B6
Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys Asp
500 505 510
Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala ser Gly Ser Lys Ala Ala Asp
515 520 525
Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser His
530 535 540
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1811 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Triticum aestivum (pšenice) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ;· (B) KLON: pWDC-13 (NRRL B-21545) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 3..1589 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-1 pšenice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
GC GCA ACA ATG GCC ACC GCC ACC GTC GCG GCC GCG TCG CCG CTC CGC
Ala Thr Met Ala Thr Ala Thr Val Ala Ala Ala Ser Pro Leu Arg
10 15
GGC AGG GTC ACC GGG CGC CCA CAC CGC GTC CGC CCG CGT TGC GCT ACC
Gly Arg Val Thr Gly Arg Pro His -Arg Val Arg Pro Arg Cys Ala Thr
25 30
-91 CZ 297325 B6
GCG AGC AGC GCG ACC Thr GAG Glu ACT Thr CCG GCG GCG CCC GGC GTG CGG CTG TCC 143
Ala Ser Ser Ala 35 Pro Ala 40 Ala Pro Gly Val Arg 45 Leu Ser
GCG GAA TGC GTC ATT GTG GGC GCC GGC ATC AGC GGC CTC TGC ACC GCG 191
Ala Glu Cys Val Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala
50 55 60
CAG GCG CTG GCC ACC CGA TAC GGC GTC AGC GAC CTG CTC GTC ACG GAG 239
Gin Ala Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Ser Asp Leu Leu Val Thr Glu
65 70 75
GCC CGC GAC CGC CCG GGC GGC AAC ATC ACC ACC GTC GAG CGT CCC GAC 287
Ala Arg Asp Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Asp
80 85 90 95
GAG GGG TAC CTG TGG GAG GAG GGA CCC AAC AGC TTC CAG CCC TCC GAC 335
Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp
100 105 110
CCG GTC CTC ACC ATG GCC GTG GAC AGC GGG CTC AAG GAT GAC TTG GTG 383
Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
115 120 125
TTC GGG GAC CCC AAC GCG CCC CGG TTC GTG CTG TGG GAG GGG AAG CTG 431
Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu
130 135 140
AGG CCG GTG CCG TCG AAG CCA GGC GAC CTG CCT TTC TTC AGC CTC ATG 479
Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp Leu Pro Phe Phe Ser Leu Met
145 150 155
AGT ATC CCT GGG AAG CTC AGG GCC GGC CTT GGC GCG CTC GGC ATT CGC 527
Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg
160 165 170 175
CCA CCT CCT CCA GGG CGC GAG GAG TCG GTG GAG GAG TTT GTG CGC CGC 575
Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg
180 185 190
AAC CTC GGT GCC GAG GTC TTT GAG CGC CTC ATC GAG CCT TTC TGC TCA 623
Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
195 200 205
GGT GTA TA.T GCT GGT GAT CCT TCG AAG CTT AGT ATG AAG GCT GCA TTT 671
-92CZ 297325 B6
719
Gly Val Tyr 210 Ala Gly Asp Pro Ser Lys 215 Leu Ser Met Lys 220 Ala Ala Phe
GGG AAG GTC TGG AGG TTG GAG GAG ATT GGA GGT AGT ATT ATT GGT GGA
Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly
225 230 235
ACC ATC AAG GCG ATT CAG GAT AAA GGG AAG AAC CCC AAA CCG CCA AGG
Thr Ile Lys Ala Ile Gin Asp Lys Gly Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg
240 245 250 255
GAT CCC CGA CTT CCG GCA CCA AAG GGA CAG ACG GTG GCA TCT TTC AGG
Asp Pro Arg Leu Pro A.la Pro Lys Gly Gin Thr Val Ala Ser Phe A.rg
260 265 270
AAG GGT CTA GCC ATG CTC CCG AAT GCC ATC GCA TCT AGG CTG GGT AGT
Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Ala Ser Arg Leu Gly Ser
275 280 285
AAA GTC AAG CTG TCA TGG AAG CTT ACG AGC ATT ACA AAG GCG GAC AAC
Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ala Asp Asn
290 295 300
767
815
863
911
CAA GGA TAT GTA TTA GGT TAT GAA ACA. CCA GAA GGA CTT GTT TCA GTG 959
Gin Gly Tyr 305 Val Leu Gly Tyr 310 Glu Thr Pro Glu Gly Leu 315 Val Ser Val
CAG GCT AAA AGT GTT ATC ATG ACC ATC CCG TCA TAT GTT GCT AGT GAT 1007
Gin Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp
320 325 330 335
ATC TTG CGC CCA CTT TCA ATT GAT GCA GCA GAT GCA CTC TCA AAA TTC 1055
Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ile Asp A.la Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe
340 345 350
TAT TAT CCG CCA GTT GCT GCT GTA ACT GTT TCA TAT CCA AAA GAA GCT 1103
Tyr Tyr Pro Pro Val A.la Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys G-iu Ala
355 360 365
ATT AGA AAA GAA TGC TTA ATT GAT GGG GAG CTC CAG GGT TTC GGC CAG 1151
Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly C-lu Leu Gin Gly Phe Gly Gin
370 375 380
TTG CAT CCA CGT AGC CAA GGA GTC GAG ACT TTA GGG ACA ATA TAT AGC 1199
Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser
-93 CZ 297325 B6
395
390
385
TCT TCT CTC TTT CCT AAT CGT GCT CCT GCT GGA AGA GTG TTA CTT CTG
Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Ala Gly Arg val Leu Leu Leu
400 405 410 415
AAC TAT ATC GGG GGT TCT ACA AAT ACA GGG ATC GTC TCC AAG ACT GAG 1295
Asn Tyr Ile Gly Gly 42 0 Ser Thr Asn Thr Gly 425 Ile Val Ser Lys Thr 430 Glu
AGT GAC TTA GTA GGA GCC GTT GAC CGT GAC CTC AGA AAA ATG TTG ATA 1343
Ser Asp Leu Val Gly Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile
435 440 445
AAC CCT AGA GCA GCA GAC CCT TTA GCA TTA GGG GTT CGA GTG TGG CCA 1391
Asn Pro Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Leu Gly Val Arg Val Trp Pro
450 455 460
CAA GCA ATA CCA CAG TTT TTG ATT GGG CAC CTT GAT CGC CTT GCT GCT 1439
Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Ile Gly His Leu Asp Arg Leu Ala Ala
465 470 475
GCA AAA TCT GCA CTG GGC CAA GGC GGC TAC GAC GGG TTG TTC CTA GGA 1487
Ala Lys Ser Ala Leu Gly Gin Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly
480 485 490 495
GGA AAC TAC GTC GCA GGA GTT GCC TTG GGC CGA TGC ATC GAG GGT GCG 1535
Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Ile Glu Gly Ala
500 505 510
GAG AGT GCC TCA CAA GTA TCT GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC
Glu Ser Ala Ser Gin Val Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr
515 520 525
1583
AAG TGA TGGAAGTAGT GCATCTCTTC ATTTTGTTGC ATATACGAGG TGAGGCTAGG
1639
Lys
ATCGGTAAAA CATCATGAGA TTCTGTAGTG TTTCTTTAAT TGAAAAAACA AATTTTAGTG 1699
ATGCAATATG TGCTCTTTCC TGTAGTTCGA GCATGTACAT CGGTATGGGA TAAAGTAGAA 1759
TAAGCTATTC TGCAAAAGCA GTGATTTTTT TTGAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1811
-94CZ 297325 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 528 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
Ala Thr Met. Ala Thr A.la Thr Val 5 Ala Ala Ala 10 . Ser Pro Leu Arg 15 Gly
Arg Val Thr Gly Arg Pro His Arg Val Arg Pro Arg Cys Ala Thr Ala
20 25 30
Ser Ser Ala Thr Glu Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Arg Leu Ser Ala
35 40 45
Glu Cys Val Zle Val Gly Ala Gly Zle Ser Gly Leu Cys Thr Ala Gin
50 55 60
Ala Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Ser Asp Leu Leu Val Thr Glu Ala
65 70 75 80
A.rg Asp Arg Pro Gly Gly Asn Zle Thr Thr Val Glu Arg Pro Asp C-lu
85 90 95
Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro
100 105 110
Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe
115 12 0 125
Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg
130 135 140
Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp Leu Pro Phe Phe Ser Leu Met Ser
145 150 155 160
Zle Pro Gly Lys : Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu ' Gly Ile Arg Pro
165 170 175
Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg . Arg Asn
-95CZ 297325 B6
180
Leu Gly Ala Glu
195
Val Tyr Ala Gly
210
Lys Val Trp Arg
225
Ile Lys Ala Ile
Val Phe Glu Arg
200
Asp Pro Ser Lys
215
Leu Glu Glu Ile
230
Gin Asp Lys Gly
245
Ala Pro Lys Gly
Leu Pro Asn Ala
280
Trp Lys Leu Thr
295
Gly Tyr Glu Thr
310
Ile Met Thr Ile
325
Ser Ile Asp Ala
Ala Ala Val Thr
6 0
Leu Ile Asp Gly
375
Gin Gly Val Glu
390 \sn Arg Ala Pro
405
Ser Thr Asn Thr
Pro Arg Leu Pro
260
Gly Leu Ala Met
275
Val Lys Leu Ser
290
Gly Tyr Val Leu
05
Ala Lys Ser Val
Leu Arg Pro Leu
340
Tyr Pro Pro Val
355
Arg Lys Glu Cys
370
His Pro Arg Ser
385
Ser Leu Phe Pr
Tyr Zle Gly
185
Leu Ile Glu
Leu Ser Met Lys
220
Gly Gly Ser Ile
235
Lys Asn Pro Lys
250
Gin Thr Val Ala
265
Ile Ala Ser Arg
Ser Ile Thr Lys
300
Pro Glu Gly Leu
315
Pro Ser Tyr Val
330
Ala Asp Ala Leu
Val Ser Tyr Pro
Glu Leu Gin Gly
380
Thr Leu Gly Thr
395
Ala Gly Arg Val
410
Gly Ile Val Ser
190
Phe Cys Ser Gly
205
Ala Ala Phe Gly
Ile Gly Gly Thr
240
Pro Pro Arg Asp
255
Ser Phe Arg Lys
270
Leu Gly Ser Lys
285
Ala Asp Asn Gin
Val Ser Val Gin
320
Ala Ser Asp Ile
335
Ser Lys Phe Tyr
350
Lys Glu Ala Ile
365
Phe Gly Gin Leu
Ile Tyr Ser Ser
400
Leu Leu Leu Asn
415
Lys Thr Glu Ser
-96CZ 297325 B6
420 425 430
Asp Leu Val Gly Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn
435 440 445
Pro Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin
450 455 460
Ala Ile Pro Gin Phe Leu Ile Gly His Leu Asp Arg Leu Ala Ala Ala
465 470 475 480
Lys Ser Ala Leu Gly Gin Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly Gly
485 490 495
Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Ile Glu Gly Ala Tyr
500 505 510
Glu Ser Ala Ser Gin Val Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys
515 520 525
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1847 páru bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární íii) TYP MOLEKULY: cDNA (lii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: sója (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-12 (NRRL B-21516)
(.ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 55..1683 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „protox-1 sóji
CL 297325 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
CTTTAGCACA GTGTTGAAGA TAACGAACGA ATAGTGCCAT TACTGTAACC AACC ATG Met 1
GTT TCC GTC TTC AAC GAG ATC CTA Leu TTC CCG CCG AAC Asn CAA ACC CTT CTT 105
Val Ser Val Phe 5 Asn Glu Ile Phe 10 Pro Pro Gin Thr 15 Leu Leu
CGC CCC TCC CTC CAT TCC CCA ACC TCT TTC TTC ACC TCT CCC ACT CGA 153
Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr Arg
20 25 30
AAA TTC CCT CGC TCT CGC CCT AAC CCT ATT CTA CGC TGC TCC ATT GCG 201
Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile Ala
35 40 45
GAG GAA TCC ACC GCG TCT CCG CCC AAA ACC AGA GAC TCC GCC CCC GTG 249
Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro Val
55 60 65
GAC TGC GTC GTC
Asp Cys Val Val
GTC GGC GGA GGC GTC
Val Gly Gly Gly Val
AGC GGC CTC TGC
Ser Gly Leu Cys
ATC GCC CAG 297
Ile Ala Gin
GCC CTC GCC Ala Leu Ala ACC Thr 85 AAA CAC Lys His GCC AAT GCC AAC GTC GTC GTC ACG GAG GCC 345
Ala Asn Ala Asn 90 Val Val Val Thr 95 Glu Ala
CGA GAC CGC GTC GGC GGC AAC ATC ACC ACG ATG GAG AGG GAC GGA TAC 393
Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly Tyr
100 105 110
CTC TGG GAA GAA GGC CCC AAC AGC TTC CAG CCT TCT GAT CCA ATG CTC 441
Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Met Leu
115 120 125
ACC ATG GTG GTG GAC AGT GGT TTA AAG GAT GAG CTT GTT TTG GGG GAT 489
Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly Asp
130 135 140 145
CCT GAT GCA CCT CGG TTT GTG TTG'TGG AAC AGG AAG TTG AGG CCG GTG 537
Pro Asp Ala Pro Arg Phe ' Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro Val
150 155 160
-98CZ 297325 B6
CCC GGG AAG Pro Gly Lys CTG Leu 165 ACT Thr GAT TTG CCT TTC TTT GAC TTG ATG AGC ATT GGT 585
Asp Leu Pro Phe 170 Phe Asp Leu Met Ser 175 Ile Gly
GGC AAA ATC AGG GCT GGC TTT GGT GCG CTT GGA ATT CGG CCT CCT CCT 633
Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Pro
180 185 190
CCA GGT CAT GAG GAA TCG GTT GAA GAG TTT GTT CGT CGG AAC CTT GGT 681
Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly
195 200 205
GAT GAG GTT GAA CGG TTG ATA GAG CCT TGT TCA GGG GTC TAT 729
Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr
210 215 220 225
GCA GGC GAT CCT TCA AAA TTA AGT ATG AAA GCA GCA TTC GGG AAA GTT 777
Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val
230 235 240
TGG AAG CTG GAA AAA AAT GGT GGT AGC ΛΤΤ GGT GGA ACT TTC AAA 825
Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys
245 250 255
GCA ATA CAA GAG AGA . AAT GGA GCT TCA . AAA CCA CCT CGA GAT CCG CGT 873
Ala Ile Gin Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg
260
265
270
CTG Leu CCA Pro 275 AAA CCA AAA GGT CAG ACT GTT GGA TCT TTC CGG AAG GGA CTT 921
Lys Pro Lys Gly Gin 280 Thr Val Gly Ser Phe 285 Arg Lys Gly Leu
ACC ATG TTG CCT GAT GCA ATT TCT GCC AGA CTA GGC AAC AAA GTA AAG 969
Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val Lys
290 295 300 305
TTA TCT TGG AAG CTT TCA AGT ATT AGT AAA CTG GAT AGT GGA GAG TAC 1017
Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu Tyr
310 315 320
AGT TTG ACA TAT GAA ACA CCA GAA GGA GTG GTT TCT TTG CAG TGC AAA 1065
Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu- Gly Val Val Ser Leu Gin Cys Lys
325 330 335
-99CZ 297325 B6
1113
ACT GTT GTC CTG ACC ATT CCT TCC TAT Tyr GTT GCT AGT ACA TTG CTG CGT Leu Arg
Thr Val Val Leu Thr 340 Ile Pro Ser 345 Val Ala Ser Thr 350 Leu
CCT CTG TCT GCT GCT GCT GCA GAT GCA CTT TCA . AAG TTT TAT TAC CCT
Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro
355 360 365
CCA GTT GCT GCA GTT TCC ATA TCC TAT CCA AAA GAA GCT ATT AGA TCA
Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Ser
370 375 380 385
GAA TGC TTG ATA GAT GGT GAG TTG AAG GGG TTT GGT CAA TTG CAT CCA
Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin Leu His Pro
390 395 400
CGT AGC CAA GGA GTG GAA ACA TTA GGA ACT ATA TAC AGC TCA TCA CTA
Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu
405 410 415
TTC CCC AAC CGA GCA CCA CCT GGA AGG GTT CTA CTC TTG AAT TAC ATT
Phe Pro Asn Arg .Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile
420 425 430
GGA GGA GCA ACT AAT ACT GGA ATT TTA TCG AAG ACG GAC AGT GAA CTT
Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu Leu
435 440 445
GTG GAA ACA GTT GAT CGA GAT TTG . AGG . AAA . ATC CTT ATA AAC CCA AAT
1161
1209
1257
1305
1353
1401
1449
Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Tle Leu Ile Asn Pro Asn 450 455 460465
GCC CAG GAT CCA TTT GTA GTG GGG GTG AGA CTG TGG CCT CAA GCTATT
Ala Gin Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gin AlaIle
470 475480
CCA CAG TTC TTA GTT GGC CAT CTT GAT CTT CTA GAT GTT GCT ΆΑΑGCT
Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala LysAla
485 490495
TCT ATC AC-A AAT ACT GGG TTT GAA GGG CTC TTC CTT GGG GGT AATTAT
Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly AsnTyr
500 505510
GTG TCT GGT GTT GCC TTG GGA CGA TGC GTT GAG GGA GCC TAT GAG GTA
1497
1545
1593
1641
100CZ 297325 B6
Val Ser 515 Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val 520 Glu Gly 525 Ala Tyr Glu Val
GCA GCT GAA GTA AAC GAT TTT CTC ACA AAT AGA GTG TAC AAA 1683
Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys
530 535 540
TAGTAGCAGT TTTTGTTTTT GTGGTGGAAT GGGTGATGGG ACTCTCGTGT TCCATTGAAT 1743
TATAATAATG TGAAAGTTTC TCAAATTCGT TCGATAGGTT TTTGGCGGCT TCTATTGCTG 1803
ATAATGTAAA ATCC7CTTTA AGTTTGAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1847
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 543 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gin Thr Leu
4. 5 10 15
Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr
20 25 30
Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile
35 40 45
Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala
65 70 75 80
Gin Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly
100 105 110
- 101 CZ 297325 B6
Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe
Gin Pro
Ser Asp Pro Met
115
120
125
Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly
130 135 140
Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro
145 150 155 160
Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile
165 170 175
Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro
180 185 190
Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu : Phe Val Arg Arg Asn Leu
195 200 205
Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu PxO Phe Cys Ser Gly Val
210 215 220
Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys
225 230 235 240
Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe
245 250 255
Lys Ala Ile Gin Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro
260 2Ó5 270
Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly
275 280 285
Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val
290 295 300
Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gin Cys
325 330 335
Lys Thr Val Val Leu 1 Thr Ile Pro Ser Tyr Val . Ala Ser Thr Leu Leu
340 345 350
- 102CZ 297325 B6
Arg Pro Leu 355 Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr
360 365
Pro Pro Val Ala Ala Val Ser lle Ser Tyr Pro Lys Glu Ala lle Arg
370 375 380
Ser Glu Cys Leu lle Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin Leu His
385 390 395 400
Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr lle Tyr Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr
420 425 430
lle Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly lle Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu
435 440 445
Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys lle Leu lle Asn Pro
450 455 460
Asn Ala Gin Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gin Ala
4 55 470 475 480
lle Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys
485 490 495
Ala Ser lle Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn
500 505 510
Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu
515 520 525
Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys
53 0 535 540
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 583 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
-103CZ 297325 B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1..583 (C) DALŠÍ INFORMACE: /funkce = „promotor protox-1 Arabidopsis (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
GAATTCCGAT CGAATTATAT AATTATCATA AATTTGAATA AGCATGTTGC CTTTTATTAA 60
AGAGGTTTAA TAAAGTTTGG TAATAATGGA CTTTGACTTC AAACTCGATT CTCATGTAAT 120
ΤΑΑΤΤΆΑΤΑΤ TTACATCAAA ATTTGGTCAC TAATATTACC AAATTAATAT ACTAAAATGT 180
TAATTCGCAA ATAAAACACT AATTCCAAAT AAAGGGTCAT TATGATAAAC ACGTATTGAA 240
CTTGATAAAG CAAAGCAAAA ATAATGGGTT TCAAGGTTTG GGTTATATAT GACAAAAAAA 300
AAAAAAGGTT TGGTTATATA TCTATTC-GGC CTATAACCAT GTTATACAAA TTTGGGCCTA 360
ACTAAAATAA TAAAATAAAC GTAA7GGTCC TTTTTATATT TGGGTCAAAC CCAACTCTAA 420
ACCCAAACCA AAGAAAAAGT ATACGGTACG GTACACAGAC TTATGGTGTG TGTGATTGCA 480
GGTGAATATT TCTCGTCGTC TTCTCCTTTC TTCTGAAGAA GATTACCCAA TCTGAAAAAA 540
ACCAAGAAGC TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG 583
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;
(A) DÉLKA: 3848 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne
- 104CZ 297325 B6 (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 1..3848 (C) DALŠÍ INFORMACE: /funkce = „promotor protox-1 kukuřice,, (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
TCGATCTTTC TAGGCTGATC CCCAAATCTT CCTCCGAAGC CCCTGGCGCC TCTGCCCCTT60
GGAGCTGGTG GCCTGAAAGA GCTTTGCTGT TGCCCCGAAG ATTGTGAGGT ATATTGTGAC120
CTCTGAGACT GACTTCCTTT GTCGTCACTT TGAGTGGAGT TATGGATTGA CCTGACGTGC180
CTCAGATGGA TTCTTCCTCC GAAGCCCCTG GTCATTTCGG AGAATCTGTA ATCTTATTCC240
CTTCTTTGGC GAAAATCTGT CAGCTTGGAT GTACTCATCC ATCTTCTGAA GCAGCTTCTC300
CAGAGTTTGT GGAGGCTTCC TGGCGAAATA TTGGGCTGTA GGTCCTGGAC GAAGACCCTT360
GATCATGGCC TCAATGACAA TCTCATTGGG CACCGTAGGC GCTTGTGCCC TCAATCGCAA420
GAACCTTCGT ACATATGCCT GAAGGTATTC TTCGTGATCT TGTGTGCATT GGAACAGAGC480
CTGAGCTGTG ACCGACTTCG TTTGAAAGCC TTGGAAGCTA GTAACCAACA TGTGCTTAAG540
CTTCTGCCAC GACGTGATAG TCCC7GGCCG AAGAGAAGAA TACCATGTTT GGGCTACATT600
CCGGACTGCC ATGACGAAGG ACTTCGCCAT GACTACAGTG TTGACCCCAT ACGAAGATAT660
AGTTGCTTCG TAGCTCATCA GAAACTGCTT TGGATCTGAG TGCCCATCAT ACATGGGGAG720
CTGAGGTGGC TTGTATGATG GGGGCCATGG GGTAGCCTGC AGTTCTGCTG CCAAGGGAGA780
AGCATCATCA AAAGTAAAGG CATCATGATT AAAATCATCA TACCATCCAT CCTCGTTGAA840
TAAGCCTTCT TGACGAAGCT CCCTGTGTTG GGGCCTTCGA TCTTGTTCAT CTTGAACAAG900
ATGACGCACT TCTTCAGTGG CT7CGTCGAT CTTTCTTTGG AGATCAGCCA GTCGCACCAT960
CTTCTCCTTC TTTCTTTGTA CTTGTTGATG GATGATCTCC ATGTCCCTGA TCTCTTGGTC1020
CAACTCCTCC TCTTGGAGTG TCAGACTGGT GGCTTTCCTC TTCTGGCTTC GAGCCTCTCG1080
- 105CZ 297325 B6
AAGAGAAAGA GTTTCTTGAT TTGGGTCCAG CGGCTGCAGT GCAGTGGTCC CTGGTGCTGA 1140
AGCTTTCTTC GGTGGCATGA CAAAGGTCAG TGCTTGCCGA AGGTGGTCGA AAAGGGTTCA1200
CTAGAGGTGG GAGCCAATGT TGGGGACTTC TCAAGTGCTA TGAGTTAAGA ACAAGGCAAC1260
ACAAAATGTT AAATATTAAT AGCTTTCATC TTTCGAAGCA TTATTTCCCT TTGGGTATAA1320
TGATCTTCAG ACGAAAGAGT CCTTCATCAT TGCGATATAT GTTAATAGAA GGAGGAGCAT1380
ATGAAATGTA AGAGACAACA TGAACAATCG TGTAGCATTG TTAATTCATC ATCATTTTAT1440
TATTATGGAA AAATAGAAAC AATATTGAAT TACAAATGTA CCTTTGGCTT GACAGAAGAT1500
AAAAGTACAA GCTTGACGCA CGAGCAAGTA CAAGTCAGTG TGAACAGTAC GGGGGTACTG1560
TTCATCTATT TATAGGCACA GGACACAGCC TGTGAGAAAT TACAGTCATG CCCTTTACAT1620
TTACTATTGA CTTATAGAAA AATCTATGAG GACTGGATAG CCTTTTCCCC TTTAAGTCGG1680
TGCCTTTTTC CGCGATTAAG CCGAATCTCC CTTGCGCATA GCTTCGGAGC ATCGGCAACC1740
TTCGTCACGA TCA.TGCCCTT CTCATTGTGT ATGCTTTTAA TCCTGAATTC GAAGGTACCT1800
GTCCATAAAC CATACTTGGA AGACATTGTT AAATTATGTT TTTGAGGACC TTCGGAGGAC1860
GAAGGCCCCC AACAGTCGTG TTTTTGAGGA CCTTCGGAAG ATGAAGGCCC CCAACAAGAC1920
CTATCCATAA AACCAACCTA TCCACAAAAC CGACCCCATT CACCCTTCAT TTGCCTCACC1980
AACAACCCTA ATTAGGTTGT TGGTTTAAAT TTTTTAGGGT CAATTTGGTC ATCACCATCC2040
ACTGTCACTC CACAAACTCA ATATCAATAA ACAGACTCAA TCACCCAAAC TGACCATACC2100
CATAAAACCG CCCCACCCTT CTAGCGCCTC GCCAGAAACC AGAAACCCTG ATTCAGAGTT2160
CAAACTTAAA ACGACCATAA CTTTCACCTT GGAACTCGAA TCAGGTCCAT TTTTTTCCAA2220
ATCACACAAA ATTAAATTTC GCATCCGATA ATCAAGCCAT CTCTTCACTA TGGTTTTAAG2280
TGTTGCTCAC ACTAGTGTAT TTATGGACTA ATCACCTGTG TATCTCATAC AATAACATAT2340
CAGTACATCT AAGTTGTTAC TCAATTACCA AAACCGAATT ATAGCCTTCG AAAAAGGTTA2400
TCGACTAGTC ACTCAATTAC CAAAACTAAA CTTTAGACTT TCATGTATGA CATCCAACAT2460
- 106CZ 297325 B6
GACACTGTAC TGGACTAAAC CACCTTTCAA GCTACACAAG GAGCAAAAAT AACTAATTTT2520
CGTAG77GTA GGAGCTAAAG TATATGTCCA CAACAATAGT TAAGGGAAGC CCCCAAGGAC2580
TTAAAAGTCC TTTTACCTCT TGAAACTTTT GTCGTGGTCT ACTTTTTCAC TTTAAACTTC2640
AAAATTTGAC ATTTTATCAC CCCTTAACTC TTAAAACCAT TTAAATTACA TTCTTACTAG2700
ATTATAGATG ATTTTGTTGT GAAAAGTTTT TAAGACATGT TTACACATTG ATTAAAATCA2760
TTTGTTCAAT TTCCTAGAGT TAAATCTAAT CTTATTAAAA CTATTAGAGA TACTTTCACG2820
AGCTCTAAA7 ATTTTTATTT TTTCATTATG GAA7TTTGTT AGAATTCTTA TAGACCTTTT2880
TTTGTGG7TT AAAAGCCTTG CCATGTTTTT AACAAGTTTT TTTTCTATTT TTTGAAATTT2540
TCTTGGAAAC CACT7CTAAC CCGGTAGAAG ATTTATTTTG CTACACTTAT ATCTACAACA3000
AAATCAACTT ATGAAATTGT CTTGGAAACT ACCTCTAACC CGGTAGAATG AATTTGAATG3060
7JAATTAAAC CAACTTACGG AATCGCCCAA CATATGTCGA TTAAAGTGGA TATGGATACA 3120
TATGAAGAAG CCCTAGAGAT AATCTAAATG GTTTCAGAAT TGAGGGTTAT TTTTTGAAGT 3180
TTGATGGGAA GATAAGACCA TAACGGTAGT TCACAGAGAT AAAAGGGTTA rprprjvjírpiprjArt 3240
AAATATTTGT GCTGCAATTG ATCCTG7GCC TCAAATTCAG CCTGCAACCA AGGCCAGGTT 3300
CTAGAGCGAA CAAGGCCCAC GTCACCCGTG GCCCGTCAGG CGAAGCAGGT CTTGTGCAGA 3360
CTTTGAGAGG GATTGGATAT CAACGGAACC AATCACGCAC GGCAATGCGA TTCCCAGCCC 3420
ACCTGTAACG TTCCAGTGGG CCATCC7TAA CTCCAAGCCC AACGGCCC7A CCCCATCTCG 3480
TCGTGTCATC CACTCCGCCG CACAGGCGCT CAGCTCCGCA ACGCCGCCGG AAATGGTCGC 2540
CGCCACAGCC ACCGCCATGG CCACCGCTGC ATCGCCGCTA CTCAACGGGA CCCGAATACC 3600
TGCGCGGCTC CGCCATCGAG GACTCAGCGT GCGCTGCGCT GCTGTGGCGG GCGGCGCGGC 3660
CGAGGCACCG GCATCCACCG GCC-CGCGGCT GTCCGCGGAC TGCGTTGTGG TGGGCGGAGG 3720
CATCAGTGGC CTCTGCACCG CGCAGGCGCT GGCCACGCGG CACGGCGTCG GGGACGTGCT 3780
- 107CZ 297325 B6
TGGGAAGAAG GCCCCAACAG TTTTCAGCCC TCCGATCCTA TTCTAACCAT GGCCGTGGAT420
AGTGGATTGA AGGACGATTT GGTTTTAGGT GACCCTAATG CACCGCGATT TGTACTATGG480
GAGGGAAAAC TAAGGCCTGT GCCCTCCAAG CCAACCGACT TGCCGTTTTT TGATTTGATG540
AGCATTGCTG GAAAACTTAG GGCTGGGTTC GGGGCTATTG GCATTCGGCC TCCCCCTCCG600
GGTTATGAAG AATCGGTGGA GGAGTTTGTG CGCCGTAATC TTGGTGCTGA GGTTTTTGAA660
CGCTTTATTG AACCATTTTG TTCAGGTGTT TATGCAGGGG ATCCTTCAAA ATTAAGCATG720
AAAGCAGCAT TTGGAAGAGT ATGGAAGCTA GAAGAGATTG GTGGCAGCAT CATTGGTGGC780
ACTTTCAAGA CAATCCAGGA GAGAAATAAG ACACCTAAGC CACCCAGAGA CCCGCGTCTG840
CCAAAACCGA AGGGCCAAAC AGTTGGATCT TTTAGGAAGG GACTTACCAT GCTGCCTGAG900
GCAATTGCTA ACAGTTTGGG TAGCAATGTA AAATTATCTT GGAAGCTTTC CAGTATTACC960
AAATTGGGCA ATGGAGGGTA TAACTTGACA TTTGAAACAC CTGAAGGAAT GGTATCTCTT1020
CAGAGTAGAA GTGTTGTAAT GACCATTCCA TCCCATGTTG CCAGTAACTT GTTGCATCCT1080
CTCTCGGCTG CTGCTGCAGA TGCATTATCC CAATTTTATT ATCCTCCAGT TGCATCAGTC1140
ACAGTCTCCT ATCCAAAAGA AGCCATTCGA AAAGAATGTT TGATTGATGG TGAACTTAAG1200
GGGTTTGGCC AGTTGCACCC ACGCAGCCAA GGAATTGAAA CTTTAGGGAC GATATACAGT1260
TCATCACTTT TCCCCAATCG AGCTCCATCT GGCAGGGTGT TGCTCTTGAA CTACATAGGA1320
GGAGCTACCA ACACTGGAAT TTTGTCCAAG ACTGAAGGGG AACTTGTAGA AGCAGTTGAT1380
CGTGATTTGA GAAAAATGCT TATAAATCCT AATGCAAAGG ATCCTCTTGT TTTGGGTGTA1440
AGAGTATGGC CAAAAGCCAT TCCACAGTTC TTGGTTGGTC ATTTGGATCT CCTTGATAGT1500
GCAAAAATGG CTCTCAGGGA TTCTGGG7TT CATGGACTGT TTCTTGGGGG CAACTATGTA1560
TCTGGTGTGG CATTAGGACG GTGTG7GGAA GGTGCTTACG AGGTTGCAGC TGAAGTGAAG1620
GAATTCCTGT CACAATATGC ATACAAATAA TATTGAAATT CTTGTCAGGC TGCAAATGTA1680
- 109CZ 297325 B6
GAAGTCAGTT ATTGGATAGT ATCTCTTTAG CTAAAAAATT GGGTAGGGTT TTTTTTGTTA 1740
GTTCCTTGAC CACTTTTTGG GGTTTTCATT AGAACTTCAT ATTTGTATAT. CATGTTGCAA 1800
TATCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1826
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 539 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
Met 1 Thr Ala Leu Ile 5 Asp Leu Ser Leu Leu 10 Arg Ser Ser Pro Ser 15 Val
Ser Pro Phe Ser Ile Pro His His Gin His Pro Pro Arg Phe Arg Lys
20 25 30
Pro Phe Lys Leu Arg Cys Ser Leu Ala Glu Gly Pro Thr Ile Ser Ser
35 40 45
Ser Lys Ile Asp Gly Gly Glu Ser Ser Ile Ala Asp Cys Val Ile Val
50 55 60
Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu Ala Thr Lys
65 70 75 80
His Arg Asp Val Ala Ser Asn Val Ile Val Thr Glu Ala Arg Asp Arg
85 90 95
Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Asp Gly Tyr Leu Trp Glu
100 105 110
Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin- Pro Ser Asp Pro Ile Leu Thr Met Ala
115 120 125
110CZ 297325 B6
Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val
Leu Gly Asp Pro Asn Ala
130
135
140
Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys
145 150 155 160
Pro Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Ala Gly Lys Leu
165 170 175
Arg Ala Gly Phe Gly Ala Ile Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro Gly Tyr
180 185 190
Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val
195 200 205
Phe Glu Arg Phe Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp
210 215 220
Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Arg Val Trp Lys Leu
225 230 235 240
Glu Glu Ile Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Thr Ile Gin
245 250 255
Glu Arg Asn Lys Thr Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys
260 2c5 270
Pro Lys Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu
275 280 285
Pro Glu Ala Ile Ala Asn Ser Leu Gly Ser Asn Val Lys Leu Ser Trp
290 295 300
Lys Leu Ser Ser Ile Thr Lys Leu Gly Asn Gly Gly Tyr Asn Leu Thr
305 310 315 320
Phe Glu Thr Pro Glu Gly Met Val Ser Leu Gin Ser Arg Ser Val Val
325 330 335
Met Thr Ile Pro Ser His Val Ala Ser Asn Leu Leu His Pro Leu Ser
340 345 350
Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu- Ser Gin Phe Tyr Tyr Ρ2ΓΟ Pro Val Ala
355 360 3 65
- 111 CZ 297325 B6
Ser Val . Thr Val . Ser Tyr Pro Lys Glu . Ala . Ile Arg r Lys Glu Cys Leu
370 375 380
Ile Asp Gly ' Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin Leu His Pro Arg Ser Gin
385 390 395 400
Gly Ile Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn
405 410 415
Arg Ala Pro Ser Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala
420 425 430
Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala
435 440 445
Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Asn Ala Lys Asp
450 455 460
Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Lys Ala Ile Pro Gin Phe
465 470 475 480
Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Ser Ala Lys Met Ala Leu Arg
485 490 495
Asp Ser Gly Phe His Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly
500 505 510
Val . Ala Leu Gly Arg Cys ' Val < Glu Gly Ala Tyr 1 Glu Val Ala Ala Glu
515 520 525
Val Lys i Glu Phe : Leu Ser Gin. Tyr . Ala 1 Tyr : Lys
530 535
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM i ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1910 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-112CZ 297325 B6 (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris (cukrová řepa) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-16 (NRRL B-21595N) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..1680 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „kódující oblast protox-1 z cukrové řepy (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
ATGAAATCAA . TGGCGTTATC AAACTGCATT CCACAGACAC AGTGCATGCC ATTGCGCAGC 60
AC-CGGGCATT ACAGGGGTAA TTGTATCATG TTGTCAATTC CATGTAGTTT AATTGGAAGA 120
CGAGGTTATT ATTCACATAA GAAGAC-GAGG ATGAGCATGA GTTGCAGCAC AAGCTCAGGC 180
TCAAAGTCAG CGGTTAAAGA AGCAGGA7CA GGATCAGGTG CAGGAGGATT GCTAGACTGC 240
GTAATCGTTG GAGGTGGAAT TAGCGGGCTT TGCATCGCGC AGGCTCTTTG TACAAAACAC 300
TCCTCTTCCT CTTTATCCCC ΑΆΑΤΤΤΤΑΊΆ GTTACAGAGG CCAAAGACAG AGTTGGCGGC 360
AACATCGTCA CTGTGGAGGC CGATGGCTAT ATCTGGGAGG AGGGACCCAA TAGCTTCCAG 420
CCTTCCGACG CGGTGCTCAC CATGGCGGTC GACAGTGGCT TGAAAGATGA GTTGGTGCTC 480
GGAGATCCCA ATGCTCCTCG CTTTGTGCTA TGGAATGACA AATTAAGGCC CGTACCTTCC 540
AGTCTCACCG ACCTCCCTTT CTTCGACCTC ATGACCATTC CGGGCAAGAT TAGGGCTGCT 600
CTTGGTGCTC TCGGATTTCG CCCTTCTCCT CCACCTCATG AGGAATCTGT TGAACACTTT 660
GTGCGTCGTA ATCTCGGAGA TGAGGTCtTT GAACGCTTGA TTGAACCCTT TTGTTCAGGT 720
GTGTATGCCG GTGATCCTGC 1 CAAGCTGAGT . ATGAAAGCTG CTTTTGGGAA GGTCTGGAAG 780
TTGGAGCAAA AGGGTGGCAG CATAATTGGT
GGCACTCTCA AAGCTATACA GGAAAGAGGG
840
-113 CZ 297325 B6
AGTAATCCTA AGCCGCCCCG TGACCAGCGC CTCCCTAAAC CAAAGGGTCA GACTGTTGGA900
TCCTTTAGAA AGGGACTCGT TATGTTGCCT ACCGCCATTT CTGCTCGACT TGGCAGTAGA960
GTGAAACTAT· CTTGGACCCT TTCTAGTATC GTAAAGTCAC TCAATGGAGA ATATAGTCTG1020
ACTTATGATA CCCCAGATGG CTTGGTTTCT GTAAGAACCA AAAGTGTTGT GATGACTGTT1080
CCATCATATG TTGCAAGTAG GCTTCTTCGT CCACTTTCAG ACTCTGCTGC AGATTCTCTT1140
TCAAAATTTT ACTATCCACC AGTTGCAGCA GTGTCACTTT CCTATCCTAA AGAAGCGATC1200
AGATCAGAAT GCTTGATTAA TGGTGAACTT CAAGGTTTCG GGCAACTACA TCCCCGCAGT1260
CAGGGTGTGG AAACCTTGGG AACAATTTAT AGTTCGTCTC TTTTCCCTGG TCGAGCACCA1320
CCTGGTAGGA TCTTGATCT? GAGCTACATC GGAGGTGCTA AAAATCCTGG CATATTAAAC 1380 AAGTCGAAAG ATGAACTTGC CAAGACAGTT GACAAGGACC TGAGAAGAAT GCTTATAAAT1440
CCTGATGCAA AACTTCCTCG TGTACTGGGT GTGAGAGTAT GGCCTCAAGC AATACCCCAG1500
TTTTCTATTG GGCACTTTGA TCTGCTCGAT GCTGCAAAAG CTGCTC7GAC AGATACAGGG1560
GTCAAAGGAC TGTTTCTTGG TGGCAACTAT GTTTCAGGTG TTGCCTTGGG GCGGTGTATA1620
GAGGGTGCTT ATGAGTCTGC AGCTGAGGTA GTAGATTTCC TCTCACAGTA CTCAGACAAA1680
TAGAGCTTCA GCATCCTGTG TAATTCAACA CAGGCCTTTT TGTATCTGTT GTGCGCGCAT1740
GTAGTCTGGT CGTGGTGCTA GGATTGATTA GTTGCTCTGC TGTGTGATCC ACAAGAATTT1800
TGATGGAATT TTTCCAGATG TGGGCATTAT ATGTTGCTGT CTTATAAATC CTTAATTTGT1860
ACGTTTAGTG AATTACACCG CATTTGATGA CTAAAAAAAA ΑΆΑΑΑΑΑΑΑΑ1910 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 560 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní
- 114CZ 297325 B6
(ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) POPIS SEKVENCE : SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM
Met Lys Ser Met Ala Leu Ser Asn Cys Ile Pro Gin Thr Gin Cys Met
1 5 10 15
Pro Leu Arg Ser Ser Gly His Tyr Arg Gly Asn Cys Ile Met Leu Ser
20 25 30
Ile Pro Cys Ser Leu Ile Gly Arg Arg Gly Tyr Tyr Ser His Lys Lys
35 40 45
Arg Arg Met Ser Met Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Ser Lys Ser Ala
50 55 60
Val Lys Glu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gly Gly Leu Leu Asp Cys
65 70 75 80
Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu
85 90 95
Cys Thr Lys His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Pro Asn Phe Ile Val Thr
100 105 110
Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Val Thr Val Glu Ala Asp
115 120 125
Gly Tyr Ile Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Ala
130 135 140
Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu
145 150 155 160
Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Asp Lys Leu Arg
165 170 175
Pro Val Pro Ser Ser Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Thr
180 185 190
Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly Phe Arg Pro
195 200 205
- 115CZ 297325 B6
Ser Pro Pro Pro His Glu Glu Ser Val
Glu His
Phe Val Arg Arg Asn
210
215
220
Leu 225 Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu lle Glu Pro Phe Cys Ser Gly 240
230 235
Val Tyr Ala Gly Asp 245 Pro Ala Lys Leu Ser 250 Met Lys Ala Ala Phe 255 Gly
Lys Val Trp Lys 260 Leu Glu Gin Lys Gly 265 Gly Ser lle lle Gly Gly 270 Thr
Leu Lys Ala lle Gin Glu Arg Gly Ser Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp
275 280 285
Gin Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys
290 295 300
Gly Leu Val Met Leu Pro Thr Ala lle Ser Ala Arg Leu Gly Ser Arg
3 05 310 315 320
Val Lys Leu Ser Trp Thr Leu Ser Ser lle Val Lys Ser Leu Asn Gly
325 330 335
Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Asp Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Arg
340 345 350
Thr Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser Tyr Val Ala Ser Arg Leu
355 360 365
Leu Arg Pro Leu Ser Asp Ser Ala Ala Asp Ser Leu Ser Lys Phe Tyr
370 375 380
Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Leu Ser Tyr Pro Lys Glu Ala lle
385 390 395 400
Arg Ser ' Glu Cys Leu lle . Asn Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin Leu
405 410 415
His
Pro Arg Ser Gin Gly Val
Glu Thr Leu Gly Thr lle Tyr Ser Ser
420
425
430
Ser Leu Phe
Pro Gly Arg Ala- Pro Pro Gly Arg lle
Leu lle Leu Ser
435
440
445
-116CZ 297325 B6
Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Asn Pro Gly Ile Leu Asn Lys 460 Ser Lys Asp
450 455
Glu Leu Ala Lys Thr Val Asp Lys Asp Leu Arg Arg Met Leu Ile Asn
465 470 475 480
Pro Asp Ala Lys Leu Pro Arg Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin
485 490 495
Ala Ile Pro Gin Phe Ser Ile Gly His Phe Asp Leu Leu Asp Ala Ala
500 505 510
Lys Ala Ala Leu Thr Asp Thr Gly Val Lys Gly Leu Phe Leu Gly Gly
515 520 525
Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Ile Glu Gly Ala Tyr
530 535 540
Glu Ser Ala Ala Glu Val Val Asp Phe Leu Ser Gin Tyr Ser Asp Lys
545 550 555 560
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1784 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Brassica napus (řepka olejka) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-17 (NRRL B-21615) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 47..1654 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „kódující oblast protox-1 řepky olejky
-117CZ 297325 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
GGGCCCCCCC CAAAATTGAG GATTCTCCTT CTCGCGGGCG ATCGCCATGG ATTTATCTCT60
TCTCCGTCCG CAGCCATTCC TATCGCCATT CTCAAATCCA TTTCCTCGGT CGCGTCCCTA120
CAAGCCTCTC AACCTCCGTT GCTCCGTATC CGGTGGATCC GTCGTCGGCT CTTCTACAAT180
CGAAGGCGGA GGAGGAGGTA AAACCGTCAC GGCGGACTGC GTGATCGTCG GCGGAGGAAT240
CAGCGGCCTG TGCATTGCGC AAGCGCTCGT GACGAAGCAC CCAGACGCTG CAAAGAATGT300
GATGGTGACG GAGGCGAAGG ACCGTGTGGG AGGGAATATC ATCACGCGAG AGGAGCAAGG360
GTTTCTATGG GAAGAAGGTC CCAATAGCTT TCAGCCGTCT GATCCTATGC TCACTATGGT420
GGTAGATAGT GGTTTGAAAG ATGATCTAGT CTTGGGAGAT CCTACTGCTC CGAGGTTTGT480
GTTGTGGAAT GGGAAGCTGA GGCCGGTTCC GTCGAAGCTA ACTGACTTGC CTTTCTTTGA540
CTTGATGAGT ATTGGAGGGA AGATTAGAGC TGGGTTTGGT GCCATTGGTA TTCGACCTTC600
ACCTCCGGGT CGTGAGGAAT CAGTGGAAGA GTTTGTAAGG CGTAATCTTG GTGATGAGGT660
TTTTGAGCGC TTGATTGAAC CCTTTTGCTC AGGTGTTTAT GCGGGAGATC CTGCGAAACT720
GAGTATGAAA GCAGCTTTTG GGAAGGTTTG C-AAGCTAGAG GAGAATGGTG GGAGCATCAT780
TGGTGGTGCT TTTAAGGCAA TTCAAGCGAA AAATAAAGCT CCCAAGACAA CCCGAGATCC840
GCGTCTGCCA AAGCCAAAGG GCCAAACTGT TGGTTCTTTC AGGAAAGGAC TCACAATGCT900
GCCAGAGGCA ATCTCCGCAA GGTTGGGTGA CAAGGTGAAA GTTTCTTGGA AGCTCTCAAG960
TATCACTAAG CTGGCCAGCG GAGAATATAG CTTAACTTAC GAAACTCCGG AGGGTATAGT1020
CACTGTACAG AGCAAAAGTG TAGTGATGAC TGTGCCATCT CATGTTGCTA GTAGTCTCTT1080
GCGCCCTCTC TCTGATTCTG CAGCTGAAGC. GCTCTCAAAA CTCTACTATC CGCCAGTTGC1140
AGCCGTATCC ATCTCATACG CGAAAGAAGC AATCCGAAGC GAATGCTTAA TAGATGGTGA1200
- 118CZ 297325 B6
ACTAAAAGGG TTCGGCCAGT TGCATCCACG CACGCAAAAA GTGGAAACTC TTGGAACAAT 1260
ATACAGTTCA TCGCTCTTTC CCAACCGAGC ACCGCCTGGA AGAGTATTGC TATTGAACTA 1320
CATCGGTGGA GCTACCAACA CTGGGATCTT ATCAAAGTCG GAAGGTGAGT TAGTGGAAGC 1380
AGTAGATAGA GACTTGAGGA AGATGCTGAT AAAGCCAAGC TCGACCGATC CACTTGTACT 1440
TGGAGTAAAA TTATGGCCTC AAGCCATTCC TCAGTTTCTG ATAGGTCACA TTGATTTGGT 1500
AGACGCAGCG AAAGCATCGC TCTCGTCATC TGGTCATGAG GGCTTATTCT TGGGTGGAAA 1560
TTACGTTGCC GGTGTAGCAT TGGGTCGGTG TGTGGAAGGT GCTTATGAAA CTGCAACCCA 1620
AGTGAATGAT TTCATGTCAA GGTATGCTTA CAAGTAATGT AACGCAGCAA CGATTTGATA 1680
CTAAGTAGTA GATTTTGCAG AAGAACACTC TGTTTGTGAA AAATTCAAGT 1740
CTGTGATTGA GTAAATTTAT GTATTATTAC ΤΑΑΑΑΑΆΆΑΑ AAAA 1784
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 536 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
Met Asp Leu Ser Leu Leu Arg Pro Gin Pro Phe Leu Ser Pro Phe Ser
1 5 10 15
Asn Pro Phe Pro Arg Ser Arg Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Leu Arg Cys
20 25 30
Ser Val Ser Gly Gly Ser VaL Val Gly Ser Ser Thr Ile Glu Gly Gly
35 40 45
-119CZ 297325 B6
Gly Gly Gly Lys Thr Val Thr Ala Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly
50 55 60
Ile Ser G ly Leu Cys Ile Ala Gin Ala Leu Val Thr Lys His Pro Asp
65 70 75 80
Ala Ala Lys Asn Val Met Val Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Gin Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro
100 105 110
Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val A.sp Ser
115 12 0 125
Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe
13 0 135 140
Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu .Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp
145 150 155 160
Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly
165 170 175
Gly Ala Ile G-y Ile •Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser
180 185 190
Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ala Lys
210 215 220
Leu Ser Met Lys Ala A.la Prie Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Glu Asn
225 230 235 240
Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Ala Phe Lys Ala Ile Gin Ala Lys Asn
245 250 255
Lys Ala Pro Lys Thr Thr Arg A.sp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly
260 265 270
Gin Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Glu Ala
275 280 285
- 120CZ 297325 B6
Ile
Ser
Ala
Arg Leu Gly
290
Asp
295
Lys
Val
Lys
Val
Ser Trp Lys
300
Leu
Ser
Ser Ile Thr Lys Leu Ala Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr
305 310 315 320
Pro Glu Gly Ile Val Thr Val Gin Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val
325 330 335
Pro Ser His Val Ala Ser Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser Asp Ser Ala
340 345 350
Ala Glu Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser
355 350 365
Zle Ser Tyr Ala Lys Glu Ala Ile Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly
370 375 380
Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gin Leu His Pro Arg Thr Gin Lys Val Glu
385 390 395 400
Thr Leu. Gly φ *·> y Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Pro Asn Arg Ala Pro
4'05 410 415
Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly C-ly z\j_a Thr Asn Thr
420 425 430
Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg
435 440 445
Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lvs Pro Ser Ser Thr Asp Pro Leu Val
450 455 460
Leu Gly Val Lys Leu Trp Pro Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Ile Gly
465 470 475 4B0
His Ile Asp Leu Val Asp Ala Ala Lys Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly
485 490 495
His Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu
500 505 510
Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala. Tyr Glu Thr Ala Thr Gin Val Asn Asp
515 520 525
- 121 CZ 297325 B6
Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys
530 535 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1224 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Oryza sativa (rýže) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-18 (NRRL B-21648) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..936 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „částečný kódující úsek protox-1 rýže (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
CGGGCTTTGA AGGCTGCATT TGGGAAGGTG TGGAGGCTGG AGGATACTGG AGGTAGCATT 60
ATTGGTGGAA CCATCAAGAC AATCCAGGAG AGGGGGAAAA ACCCCAAACC GCCGAGGGAT 120
CCCCGCCTTC CAACGCCAAA GGGGCAGACA GTTGCATCTT TCAGGAAGGG TCTGACTATG 180
CTCCCGGATG CTATTACATC TAGGTTGGGT AGCAAAGTCA AACTTTCATG GAAGTTGACA 240
AGCATTACAA AGTCAGACAA CAAAGGATAT GCATTAGTGT ATGAAACACC AGAAGGGGTG 300
GTCTCGGTGC AAGCTAAAAC TGTTGTCATG ACCATCCCAT CATATGTTGC TAGTGATATC 360
TTGCGGCCAC TTTCAAGTGA TGCAGCAC-AT GCTCTGTCAA TATTCTATTA TCCACCAGTT 420
- 122CZ 297325 B6
GCTGCTGTAA CTGTTTCATA TCCAAAAGAA GCAATTAGAA AAGAATGCTT AATTGACGGA 480
GAGCTCCAGG GTTTCGGCCA GCTGCATCCG CGTAGTCAGG GAGTTGAGAC TTTAGGAACA 540
ATATATAGCT CATCACTCTT TCCAAATCGT GCTCCAGCTG GAAGGGTGTT ACTTCTGAAC 600
TACATAGGAG GTTCTACAAA TACAGGGATT GTTTCCAAGA CTGAAAGTGA GCTGGTAGAA 660
GCAGTTGACC GTGACCTCAG GAAGATGCTG ATAAATCCTA GAGCAGTGGA CCCTTTGGTC 720
CTTGGCGTCC GGGTATGGCC ACAAGCCATA CCACAGTTCC TCATTGGCCA TCTTGATCAT 780
CTTGAGGCTG CAAAATCTGC CCTGGGCAAA GGTGGGTATG ATGGATTGTT CCTCGGAGGG 840
AACTATGTTG CAGGAGTTGC CCTGGGCCGA TGCGTTGAAG GTGCATATGA GAGTGCCTCA 900
CAAATATCTG ACTACTTGAC CAAGTACGCC TACAAGTGAT CAAAGTTGGC CTGCTCCTTT 960
TGGCACATAG ATGTGAGGCT TCTAGCAGCA AAAATTTCAT GGGCATCTTT TTATCCTGAT 1020
TCTAATTAGT TAGAATTTAG AATTGTAGAG GAATGTTCCA TTTGCAGTTC ATAATAGTTG 1080
TTCAGATTTC AGCCATTCAA TTTGTGCAGC CATTTACTAT ATGTAGTATG ATCTTGTAAG 1140
TACTACTAAG AACAAATCAA TTATATTTTC CTGCAAGTGA CATCTTAATC GTCAGCAAAT 1200
CCAGTTACTA GTAAAAAAAA AAAA
1224 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 312 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
Arg Ala Leu Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Asp Thr
- 123 CZ 297325 B6
1 5 10 15
Gly Gly Ser lle lle Gly Gly Thr lle Lys Thr lle Gin Glu Arg Gly
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Thr Pro Lys Gly
35 40 45
Gin Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala
50 55 60
lle Thr Ser Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr
55 70 75 80
Ser lle Thr Lys Ser Asp Asn Lys Gly Tyr Ala Leu Val Tyr Glu Thr
85 90 95
Pro Glu Gly Val Val Ser Val C-ln Ala Lys Thr Val Val Met Thr lle
100 105 110
Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp lle Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala
115 120 125
Ala Asp Ala Leu Ser lle Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr
130 135 140
Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala lle Arg Lys Glu Cys Leu lle Asp Gly
145 150 155 160
Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu
165 170 175
Thr Leu Gly Thr lle Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro
180 185 190
Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu A.sn Tyr lle Gly Gly Ser Thr Asn Thr
195 200 205
Gly lle Val Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg
210 215 220
Asp Leu Arg Lys Met Leu lle Asn Pro Arg Ala Val Asp Pro Leu Val
225 230 235 240
Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin Ala lle Pro Gin Phe Leu lle Gly
- 124CZ 297325 B6
245 250 255
His Leu Asp His Leu Glu Ala Ala Lys Ser Ala Leu Gly Lys Gly Gly
260 265 270
Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu
275 280 285
Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser Asp
290 295 300
Tyr Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys
305 310 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1590 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Sorghum bicolor (čirok) (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON; pWDC-19 (NRRL B-21649) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..1320 (C) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „částečný kódující úsek protox-1 čiroku (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
TCCACCGTCG AGCGCCCCGA GGAAGGGTAC CTCTGGGAGG AGGGTCCCAA CAGCTTCCAG 60
- 125CZ 297325 B6
CCATCCGACC CCGTTCTCTC CATGGCCGTG GGGGACCCCA ACGCGCCACG GTTCGTGCTG AAGCCCGCCG ACCTCCCGTT CTTCGATCTC C7CGGCGCGC TTGGCATCCG CCCGCCTGCT GTGGGCCGCA ACCTCGGTGC TGAGGTCTTT GTCTATGGTG GCGATCCTTC CAAGCTCAGT TTAGAAGAAG CTGGAGGTAG TATTATTGGT AAGAATCC.AA AACGACCGAG GGATCCCCGC TCTTTCAGGA AGGGTCTTGC CACGCTTCCA GTCAAACTAT CATGGAAACT CACGAGCATG GAGTATGAAA CACCAGAAGG GGTTGTTTTG CCATCATA7G TTGCTAGCGA CATTTTGCGT TC.-AGATTCT A7TATCCACC AGT7GCTGCT AGAAAAGAAT GCTTAATTGA TGGGGAACTC CAAGGAGTTG AGACATTAGG AACAATATAC GCTGGTAGGG TGTTACTTCT AAACTACATA A^GACTGAAA GTGAGCTGGT AGAAGCAGTT CCTACAGCAG TGGACCCTTT AGTCCTPGGT TTCCVGGTAG GACATCTTGA TCTTCTGGAG 7ATAATGGGC TGTTCCTAGG AGGGAACTAT GAGGGCGCAT ATGAGAGTGC CGCGCAAATA TGA7GGAAGA AGTGGAGCGC TGCTTGTTAA GGAGTAGTAA AAGGCGTCAC GAGTAT7TTT
GACAGCGGGC TGAAGGATGA CCTGGTTTTT TGGGAGGCGA AGCTGAGGCC CGTGCCATCC ATGAGCATCC CTGGCAAGCT CAGGGCCGGT CCAGGCCGCG AGGAGTCAGT GGAGGAGTTT GAGCGCCTAA TTGAGCCTTT CTGCTCAGGT ATGAAGGCTG CATTTGGGAA GGTGTGGCGG GGAACCATCA AGACGATTCA GGAGAGGGGC CTTCCGAAGC CAAAAGGGCA GACAGTTGCA AATGCCATCA CATCCAGCTT GGGTAGTAAA ACAAAATCAG ATGGCAAGGG GTATGTTTTG GTGCAGGCTA AAAGTGTTAT CATGACCATT CCACTTTCAG GTGATGCTGC AGATGTTCTA GTAACGGTTT CGTATCCAAA GGAAGCAATT CAGGGTTTTG GCCAGTTGCA TCCACGTAGT AGCTCATCAC TCTTTCCAAA TCGTGCTCCT GGAGGTGCTA CAAACACAGG AATTGTTTCC GACCG7GACC TCCGAAAAAT GCTTATAAAT GTCCGAGTTT GGCCACAAGC CATACCTCAG GCCGCAAAAT CTGCCCTGGA CCAAGGTGGC GTTGCAGGAG TTGCCCTGGG CAGATGCATT TATGACTTCT TGACCAAGTA CGCCTACAAG TTGTTATGTT GCATAGATGA GGTGAGACCA CATTCTTATT TTGTAAATTG CACTTCTGTT
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440
- 126CZ 297325 B6
TTTTTTTCCT GTCAGTAATT AGTTAGATTT TAGTTATGTA GGAGATTGTT GTGTTCACTG 1500
CCCTACAAAA GAATTTTTAT TTTGCATTCG TTTATGAGAG CTGTGCAGAC TTATGTAACG 1560
TTTTACTGTA AGTATCAACA AAATCAAATA 1590
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 440 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
Ser Thr Val Glu Arg Pro Glu Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro
1 5 10 15
Asn Ser Phe Gin Pro Ser Asp Pro Val Leu Ser Met Ala Val Asp Ser
20 25 30
Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe
35 40 45
Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Ala Asp
50 55 60
Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly
65 70 75 80
Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Ala Pro Gly Arg Glu Glu Ser
85 90 95
Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg
100 105 110
Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys
115 120 125
- 127CZ 297325 B6
Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Ala
130 135 140
Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Ile Lys Thr Ile Gin Glu Arg Gly
145 150 155 160
Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys C-ly
165 170 175
Gin Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala
iao 185 190
Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr
195 200 205
Ser Met Thr Lys Ser Asp Gly Lys Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr
210 215' 220
Pro Glu «ir Val Val Leu Val Gin Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile
225 230 235 240
Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp Ile Leu Arg Pro Leu Ser Gly Asp Ala
245 250 255
Ala Asp Val Leu Ser Arg
Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr
260
265
270
Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala
Ile Arg Lys Glu Cys
Leu
Ile Asp Gly
275
280
285
Glu Leu 290 Gin Gly Phe Gly Gin 295 Leu His Pro Arg Ser 300 Gin Gly Val Glu
Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro
305 310 315 320
Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr
325 330 335
Gly Ile Val Ser Lys Φ^Ι *“ Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg
340 345 350
Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Thr Ala Val Asp Pro Leu Val
355 360 365
- 128CZ 297325 B6
Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin Ala lle Pro Gin Phe Leu Val Gly
370 375 380
His Leu Asp Leu Leu Glu Ala Ala Lys Ser Ala Leu Asp Gin Gly Gly
385 390 395 400
Tyr Asn Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu
405 410 415
Gly Arg Cys lle Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ala Gin lle Tyr Asp
420 425 430
Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys
435 440 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 93 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS·, /popis = „sekvence intronu protox-1 kukuřice (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
GTACGCTCCT CGCTGGCGCC GCAGCGTCTT CTTCTCAGAC TCATGCGCAG CCATGGAATT
GAGATGCTGA ATGGATTTTA TACGCGCGCG CAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2606 párů baží
- 129CZ 297325 B6 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgarís (cukrová řepa) (ví i) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: pWDC-20 (NRRL B-21650) (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 1..6 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Sáli” (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: komplement (1..538) (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „částečná cDNA protox-1 cukrové řepy ve směru 3'-5' (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:
(B) POZICE: 539..2606 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „oblast promotoru protox-1 cukrové řepy uvedená ve směru 3'-5’ (částečná sekvence fragmentu Pstl-Sall o velikosti ~ 3 kb subklonovaná z pWDC-20) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
GTCGACCTAC GCACATGCCA CATTCCACAT TCCACGTTAG GAATTGAATT GAATTGAATT 60
ATGATTATGA ATAATGAAGA GACAGAATTA CCGCCATGGT GAGCACCGCG TCGGAAGGCT 120
GGAAGCTATT GGGTCCCTCC TCCCAGATAT AGCCATCGGC CTCCACAGTG ACGATGTTGC 180
CGCCAACTCT GTCTTTGGCC TCTGTCACTA TAAAATTTGG GGATAAAGAG GACTGTTTTG 240
TACAAAGAGC CTGCGCGATG CAAAGCCCGC- TAATTCCACC TCCAACGATT ACGCAGTCTA 300
GCAATCCTCC TGCTCCTGAT CCTGATCCTG ATCCTGCTTC TTTAACCGCT GACTTTGAGC 360
- 130CZ 297325 B6
TCCTCTTCTT ATGTGAATAA taacctcgtc TGATACAATT GCCCCTGTAA TGCCCGCTGC TGCAGTTTGA TAACGCCATT GATTTCATCT TATATCCCCT TCTTGCTTGC TCGGGAATTC GTTTCTAGTT AAAAAGTTTT TTATAAATAG TAACCATACT TGTTTGGTGG AGGTGGTGCG CAA7ACCTAC TTATGCTTAA GGATACGGAT AGCTGGACTG ACTAACATCT GAATTTGTTT CGAAATTTCT CTGGATGCTA AAAATGTCTT CTTCAATGAG GAGGTTCTTG ATTTGCATGT TAGATTCAGT AATAAGTGGT GTTAAAAGTA TAATTTTTTT TA7TTGTTTG AAAGTTGCC7 AACACCTTTT TTAATTACAT GGAAATCGAA ACCGCCTTAA AATATAAGCT GAAGA7GTCT AAGCAATTAT AACACAACAT CTCCGCCTCT T7G77GAAAC AATCAAAGTA ACATGGTG7G TATATAGTGA 7TTTGTTTAA TCCATAGTCA CCAAATTTTT TGCTCAAAAT CCCTAAACAT CAGCATGCTT GCCATGGGTA AATAAGACTT ATTGGTTTTA G7TTG7CTCC AACGTAAAAC CAATCTCGTT ATCTTGGAAG C77GAAAGCC GAAGACAAAA TTACAACTAA GAAGAGGTCA
CTGAGCTTGT GCTGCAACTC ATGCTCATCC TTCCAATTAA ACTACATGGA ATTGACAACA TGTGCAATGG CATGCACTGT GTCTGTGGAA CTCTCTCGCT CTCTCGCCCT CCTTATCCTC TAATTAACCT TATATCAAAA TGAAACAACT TACTCTAAAT AAACGATTAC ATGTATCTTC TAACCGGTAA CTTAGCTTTG TAACTCACCT TCTTTTAAAC TCTCAGGCAT TGACCTATGT CTCTGGTTAT ATATGCAATT T7AACTGAAT TAACGGGGTT TATGAGGACT AAATTATCTC ATG.AGCGTGA AAATGCATTC TTAACGGCTA AAAAGTACT’·' GGAAAAATGA TTAAGCGACT TGTCTTGGGT ATCTTAACAT GTATTTATCA AAGTTTGAAA AAAAAAAATC ATACTCACTA CACTAACAGA GTGCATGTGA AGCACCCCCA TCAAAATTCC TACAAATACA TCTAATAAAC TCAA7TGCGG ATGCTTCTCA TTCCAGACTT ACAAC7CACA TAATGGTACC CAAAGAATAC TGTAGCTGTG TAAGTTTGAC TAACATGTTT AGGGGCAAAT CTCGAATCCA CAAACTCATC AATGATGTGA AATACACCAC AAAATTCA7A ATAATCTTGT T7GTACTTTC AC7ACGTCGA
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
- 131 CZ 297325 B6
AAAAACCACA
AAGACATTTC
CTTATCTT^C
ATCATATACT
ATAAAAGCAT
TCCAACTTGC
AATAAAAATG
CCAAAGTGAT
TCTAACTACA
TTCTAATGAA
AATGACATTG
ACGATTATGT
TAGAAATATA
AACAAGCAAA
CTTAAACTCA
TGTCATCACT
GTGTAAACCT
TTTATGAATG
CCAATTGTCA
ATACTATCAT
CTTCAAAGTT
AATCCTTGTG
CAGTACCTAC
1740
1800
1860
1920
1980
CAACATAGTT CCTAAAGATT
2040
ATAAAGCCAT TAAATAACCA GTTTTATGTT ATTTCGTGAC
ACGAAGTAAT TTATAGTCAT TTTGTGGCCA CTTAATTCAT TTAATACCCA GTATATTTAT 2100
AAGTTACCAG CTTAAGTAGT TTTGTGACCA TCTCTACATA CTTCCTCCGG TCCATAATAA 2160
GGGGGCGTTT GGTTGCAACG GGGTAAAGGG AATGGAATCA AGAAAGGGAG AGGAGAGGAA 2220
AGGAAAAGAA AACCCTTAGA TTTAGAGTGG TGTTTGGTTA AGATAATGTT AATTCTCTTT 2280
CTTCCTCTTT C7TACCCTTC TTCCACCCTA GCACCACCAC TCCTCCCTCT GTTACTATTC 2340
TCCACGCCGC C7CTCCCTAC CCCAGTAACA CCACC7TGTC GGCCCCCCGG TCTTCCCCTT 2400
CCCGCGACGG TTCCCCCCTC CCCTGCGCCG TCACG7CGTC CCCCTCACCT CCCTGCACCG 2460
TCGAGT7ATC CCCCTCCCCT GCGCGTCGCG TTCTCCCCTC CCTCACCATC GCGTTCTCCC 2520
CTCCC7CACC GTCGCGTTCT CCCCTCCCTC ACCGTCGCGG TCTCCCCTCC CTCACCGTCG 2580
CGGTCTCTCT TTCCCTCCCC CTGCAG 2606
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PclP Pla - PCR primer pro horní řetězec plastidového genu 15 clpP“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne
- 132CZ 297325 B6 (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE:/poznámka = „místoEcoRI“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
GCGGAATTCA TACTTATTTA TCATTAGAAA G (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PclP Plb - PCR primer pro dolní řetězec plastidového genu clpP“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE:/poznámka = „místo Xbal“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
GCGTCTAGAA AGAACTAAAT ACTATATTTC AC 32 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PclP_P2b - PCR primer pro horní řetězec plastidového genu clpP“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne
- 133CZ 297325 B6 (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Ncol“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
GCGCCATGGT AAATGAAAGA AAGAACTAAA 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „TrpslóPla - PCR primer pro horní řetězec 3'netranslatovaného úseku Xbal/HindlII“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Xbal“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
GCGTCTAGAT CAACCGAAAT TCAATTAAGG 30
- 134CZ 297325 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „Trpsló Plb - PCR primer pro dolní řetězec 3'netranslatovaného úseku Xbal/HindlII“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé (B) POZICE: 4..9 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo HindlII“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
CGCAAGCTTC AATGGAAGCA ATGATAA 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PCR primer minpsb U - 5'netranslatovaný úsek plastidového genu psbA dlouhý 38 nt (tupý konec/NcoI) včetně start-kodonu ATG (primer pro horní řetězec)“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
GGGAGTCCCT GATGATTAAA TAAACCAAGA TTTTAC 36
- 135CZ 297325 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 40 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „PCR primer minpsb L - 5'netranslatovaný úsek plastidového genu psbA dlouhý 38 nt (tupý konec/NcoI) včetně start-kodonu ATG (primer pro dolní řetězec)“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
CATGGTAAAA TCTTGGTTTA TTTAATCATC AGGGACTCCC 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „APRTXPla - PCR primer pro horní řetězec pro amplifikací 5' úseku mutantního genu protox z Arabidopsis“ (iii) HYPOTETICKÁ: ne (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: různé (B) POZICE: 5..10 (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = „místo Ncol/start kodon ATG“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
GGGACCATGG ATTGTGTGAT TGTCGGCGGA GG 32
- 136CZ 297325 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „APRTXPlb - PCR primer pro horní řetězec pro amplifíkaci 5' úseku mutantního genu protox z Arabidopsis (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
CTCCGCTCTC CAGCTTAGTG ATAC 24
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (8)

1. Izolovaná molekula DNA obsahující úsek kódující modifikovanou protoporíyrinogenoxidázu (protox), přičemž nemodifikovaná protox je rostlinná protox a modifikace sestává z první aminokyselinové substituce, která je vybrána ze skupiny obsahující:
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající glycinu jako 165. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
c) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
d) polohu odpovídající cysteinu jako 159. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
e) polohu odpovídající isoleucinu jako 419. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
f) polohu odpovídající valinu jako 356. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
g) polohu odpovídající šeřinu jako 421. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
h) polohu odpovídající valinu jako 502. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
i) polohu odpovídající alaninu jako 211. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
j) polohu odpovídající glycinu jako 212. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
k) polohu odpovídající isoleucinu jako 466. aminokyselině v sekvenci id. č. 10,
l) polohu odpovídající prolinu jako 369. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
- 137CZ 297325 B6
m) polohu odpovídající alaninu jako 226. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
n) polohu odpovídající tyrosinu jako 432. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
o) polohu odpovídající valinu jako 517. aminokyselině v sekvenci id. č. 12,
p) polohu odpovídající tyrosinu jako 428. aminokyselině v sekvenci id. č. 16,
q) polohu odpovídající prolinu jako 365. aminokyselině v sekvenci id. č. 16, a
r) polohu odpovídající tyrosinu jako 449. aminokyselině v sekvenci id. č. 18.
a druhé aminokyselinové substituce, která je vybrána ze skupiny obsahující:
I) polohu odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2,
II) polohu odpovídající threoninu jako 249. aminokyselině v sekvenci id. č. 2,
III) polohu odpovídající prolinu jako 118. aminokyselině v sekvenci id. č. 2,
IV) polohu odpovídající asparaginu jako 425. aminokyselině v sekvenci id. č. 2, a
V) polohu odpovídající tyrosinu jako 498. aminokyselině v sekvenci id. č. 2., přičemž první aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že uděluje rezistenci k inhibitoru protox, a druhá aminokyselinová substituce má tu vlastnost, že zesiluje rezistenci udělenou první aminokyselinovou substitucí.
2. Molekula DNA podle nároku 1, kde rostlinná protox je vybrána ze skupiny obsahující sekvence id. č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22 a 24.
3. Molekula DNA podle nároku 1 nebo 2, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 a první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze vybrané ze skupiny obsahující
a) polohu odpovídající alaninu jako 164. aminokyselině v sekvenci id. č. 6,
b) polohu odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
4. Molekula DNA podle nároku 3, kde se druhá aminokyselinová substituce vyskytuje v poloze odpovídající šeřinu jako 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 a první aminokyselinová substituce se vyskytuje v poloze odpovídající tyrosinu jako 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6.
5. Molekula DNA podle nároku 4, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny obsahující cystein, isoleucin, leucin, threonin, valin a methionin.
6. Molekula DNA podle nároku 4, kde tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 305. aminokyselině v sekvenci id. č. 2 je nahrazen leucinem a tyrosin vyskytující se v poloze odpovídající 370. aminokyselině v sekvenci id. č. 6 je nahrazen methioninem.
-138CZ 297325 B6
7. Způsob přípravy rostlin, které jsou tolerantní nebo rezistentní k herbicidu, který inhibuje rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se
I) transformuje rostlinný materiál izolovanou molekulou DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6,
II) selektuje se takto transformovaný materiál a
III) transformovaný materiál se regeneruje na celé, morfologicky normální, fertilní rostliny.
8. Způsob zabránění růstu nežádoucí vegetace, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se na rostliny získané způsobem podle nároku 7 a nežádoucí vegetaci aplikuje herbicid inhibující protoporfyrinogenoxidázu v účinném množství, které je dostatečné k zabránění růstu nežádoucí vegetace aniž by došlo k podstatnému ovlivnění rostlin získaných způsobem podle nároku 7.
CZ0272698A 1996-02-28 1997-02-27 Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru CZ297325B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1361296P 1996-02-28 1996-02-28
US1270596P 1996-02-28 1996-02-28
US2000396P 1996-06-21 1996-06-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ272698A3 CZ272698A3 (cs) 1998-12-16
CZ297325B6 true CZ297325B6 (cs) 2006-11-15

Family

ID=27359690

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0272698A CZ297325B6 (cs) 1996-02-28 1997-02-27 Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru
CZ982727A CZ272798A3 (cs) 1996-02-28 1997-02-27 Promotory rostlinných protoporfyrinogenoxidázových genů

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ982727A CZ272798A3 (cs) 1996-02-28 1997-02-27 Promotory rostlinných protoporfyrinogenoxidázových genů

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6018105A (cs)
EP (2) EP0885305A1 (cs)
JP (2) JP3961570B2 (cs)
KR (2) KR19990087356A (cs)
CN (2) CN1212725A (cs)
AU (2) AU724838B2 (cs)
BR (2) BR9707783A (cs)
CA (2) CA2247074C (cs)
CZ (2) CZ297325B6 (cs)
HU (2) HUP9901044A3 (cs)
PL (3) PL187094B1 (cs)
UA (1) UA70912C2 (cs)
WO (2) WO1997032011A1 (cs)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US6084155A (en) * 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
WO1997004088A1 (en) * 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene
WO1998029554A1 (en) * 1996-12-27 1998-07-09 Sumitomo Chemical Co., Ltd. Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation
ZA98371B (en) * 1997-01-31 1999-07-16 Du Pont Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides.
CA2303403A1 (en) * 1997-09-11 1999-03-18 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to photobleaching herbicide
EP1062351B1 (en) * 1998-03-11 2006-05-10 Syngenta Participations AG Novel plant plastid promoter sequence
US6362398B1 (en) 1998-03-11 2002-03-26 Syngenta Participations Ag ClpP plastid promoter sequence
AU769868B2 (en) 1998-04-10 2004-02-05 Sumitomo Chemical Company, Limited A method for evaluating the ability of a compound to inhibit the protoporphyrinogen oxidase activity
AU753020B2 (en) * 1998-04-30 2002-10-03 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for giving resistance to weed control compounds to plants
US6906245B1 (en) 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
JP4788011B2 (ja) * 1998-04-30 2011-10-05 住友化学株式会社 雑草防除剤耐性の付与方法
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US6492578B1 (en) 1998-07-10 2002-12-10 Calgene Llc Expression of herbicide tolerance genes in plant plastids
ES2281183T3 (es) * 1998-07-10 2007-09-16 Calgene Llc Expresion de genes de tolerancia a herbicida en plastidios vegetales.
CA2347774A1 (en) * 1998-11-10 2000-05-18 David John Nevill Herbicidal composition
GB9828201D0 (en) * 1998-12-21 1999-02-17 Zenco No 4 Ltd Genetic modification of compositae
AU6277600A (en) * 1999-07-27 2001-02-13 Syngenta Participations Ag Novel chimeric genes
EP1200611A1 (en) * 1999-08-13 2002-05-02 Syngenta Participations AG Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase
US6617498B1 (en) * 1999-09-03 2003-09-09 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Inducible promoters
CN1461345A (zh) * 1999-10-11 2003-12-10 白镜焕 用原卟啉原氧化酶基因增加农作物产量或单产的方法
JP4821036B2 (ja) * 1999-10-29 2011-11-24 住友化学株式会社 除草剤耐性植物
WO2001036606A2 (de) * 1999-11-16 2001-05-25 Basf Plant Science Gmbh Protoporphyrinogen-ix-oxidase und seine verwendung
JP5111706B2 (ja) 1999-12-16 2013-01-09 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物における異種ポリペプチドの発現のためのｄｎａ構築物
AU2001260114A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-24 Syngenta Participations Ag Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US6713259B2 (en) * 2000-09-13 2004-03-30 Monsanto Technology Llc Corn event MON810 and compositions and methods for detection thereof
AR037413A1 (es) * 2001-11-27 2004-11-10 Valent Biosciences Corp Composicion herbicida intensificada
AU2003303589B2 (en) 2002-12-26 2008-04-24 Syngenta Participations Ag Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
EP1687429B1 (en) 2003-10-06 2011-01-12 Syngenta Participations AG Promoter functional in plant plastids
CA2558621C (en) 2004-03-08 2013-04-30 Syngenta Participations Ag Promoter from maize prolamin seed storage protein and uses thereof
JP4720223B2 (ja) * 2004-05-18 2011-07-13 住友化学株式会社 除草活性化合物耐性植物
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
US9347046B2 (en) 2009-01-22 2016-05-24 Syngenta Participations Ag Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
ES2727575T3 (es) 2009-01-22 2019-10-17 Syngenta Participations Ag Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes, y Métodos de uso
US9012719B2 (en) 2009-02-06 2015-04-21 Syngenta Participations Ag Modification of multidomain enzyme for expression in plants
UA112969C2 (uk) * 2010-08-03 2016-11-25 Сібас Юс Ллс Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх)
JP2012056817A (ja) * 2010-09-10 2012-03-22 Kochi Univ Of Technology 単細胞藻類の細胞破砕液を利用したアミノ酸含有有機液肥
UA121371C2 (uk) 2010-12-16 2020-05-25 Басф Агро Б. В. Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
CN104107437B (zh) * 2013-06-09 2015-08-26 厦门成坤生物技术有限公司 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法
BR112016002851B1 (pt) 2013-08-12 2022-02-22 BASF Agro B.V. Molécula de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ppo, método para controlar vegetação indesejada e uso do ácido nucleico
UA123757C2 (uk) 2013-08-12 2021-06-02 Басф Агро Б. В. Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду
MX2017016521A (es) * 2015-06-17 2018-08-15 Basf Agro Bv Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas.
CN111423990B (zh) * 2020-04-10 2021-08-27 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法
US20240124432A1 (en) 2020-11-24 2024-04-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
JP2024512660A (ja) * 2021-04-02 2024-03-19 チンタオ、キングアグルート、ケミカル、コンパウンド、カンパニー、リミテッド Ｐｐｏ阻害型除草剤に対する耐性を有するｐｐｏポリペプチドおよびその使用
CN115247157A (zh) * 2021-04-02 2022-10-28 青岛清原化合物有限公司 对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽及应用
CA3214498A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CN115340987B (zh) * 2021-05-12 2023-12-01 北京大北农生物技术有限公司 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
WO2023169984A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CN116891836A (zh) * 2022-03-29 2023-10-17 青岛清原种子科学有限公司 对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo2多肽及应用
WO2023222589A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2024012968A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrimidinone derivatives

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034659A1 (en) * 1994-06-16 1995-12-21 Ciba-Geigy Ag Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0360750A3 (en) * 1988-09-22 1991-01-02 Ciba-Geigy Ag Novel herbicide tolerant plants
NZ231658A (en) * 1988-12-12 1992-05-26 Fmc Corp Inhibitors of protoporphyrinogen oxidase and compositions for killing tumour cells
CN1039283C (zh) * 1988-12-12 1998-07-29 Fmc公司 卟啉的应用
US5086169A (en) * 1989-04-20 1992-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Isolated pollen-specific promoter of corn
US5451513A (en) * 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
DK0459643T3 (da) * 1990-05-18 2001-01-02 Commw Scient Ind Res Org Rekombinant promotor til genekspression i enkimbladede planter
IL98405A0 (en) * 1990-06-11 1992-07-15 Fmc Corp Pharmaceutical compositions containing enzyme inhibiting agents
US5290926A (en) * 1990-09-14 1994-03-01 Ciba-Geigy Corporation Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase
EP0724637B2 (en) * 1994-06-14 2002-06-05 Neurocrine Biosciences, Inc. Corticotropin-releasing factor 2 receptors
WO1997004088A1 (en) * 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene
US6472586B1 (en) * 1995-08-10 2002-10-29 Rutgers, The State University Of New Jersey Nuclear-encoded transcription system in plastids of higher plants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034659A1 (en) * 1994-06-16 1995-12-21 Ciba-Geigy Ag Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms

Also Published As

Publication number Publication date
CA2247074C (en) 2008-06-10
AU724838B2 (en) 2000-09-28
BR9707783A (pt) 1999-07-27
PL328617A1 (en) 1999-02-01
HU9901044D0 (en) 1999-06-28
CN1175107C (zh) 2004-11-10
KR19990087356A (ko) 1999-12-27
EP0885305A1 (en) 1998-12-23
HUP9900623A3 (en) 2001-11-28
US6018105A (en) 2000-01-25
CN1212724A (zh) 1999-03-31
HUP9901044A3 (en) 2001-11-28
HUP9900623A2 (hu) 1999-06-28
WO1997032011A1 (en) 1997-09-04
KR19990087454A (ko) 1999-12-27
CN1212725A (zh) 1999-03-31
JP2000506724A (ja) 2000-06-06
AU724893B2 (en) 2000-10-05
CZ272698A3 (cs) 1998-12-16
PL187545B1 (pl) 2004-07-30
KR100493500B1 (ko) 2006-09-20
HUP9901044A2 (hu) 1999-07-28
AU1984697A (en) 1997-09-16
BR9707769A (pt) 1999-07-27
AU2065497A (en) 1997-09-16
CZ272798A3 (cs) 1998-11-11
WO1997032028A1 (en) 1997-09-04
EP0883682A1 (en) 1998-12-16
JP3961570B2 (ja) 2007-08-22
UA70912C2 (uk) 2004-11-15
CA2247797A1 (en) 1997-09-04
CA2247074A1 (en) 1997-09-04
JP2000506011A (ja) 2000-05-23
PL187094B1 (pl) 2004-05-31
PL328651A1 (en) 1999-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ297325B6 (cs) Molekula DNA kódující modifikovanou rostlinnou protoporfyrinogenoxidázu rezistentní k inhibitoru
US6308458B1 (en) Herbicide-tolerant plants and methods of controlling the growth of undesired vegetation
US6808904B2 (en) Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling
US5939602A (en) DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US20020073443A1 (en) Herbicide tolerance achieved through plastid transformation
US6288306B1 (en) Methods of selecting plants, plant tissue or plant cells resistant to a protoporphyrinogen oxidase inhibitor
CA2381927A1 (en) Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase
WO2001068826A2 (en) Protoporphyrinogen oxidase (&#39;protox&#39;) genes
US6023012A (en) DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20100227