JP2000506011A

JP2000506011A - 植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーター

Info

Publication number: JP2000506011A
Application number: JP9531213A
Authority: JP
Inventors: エー．ジョンソン，マリー; エル．ボルラス，サンドラ; アール．ワード，エリック
Original assignee: ノバルティスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2000-05-23
Also published as: CA2247074C; AU724838B2; BR9707783A; PL328617A1; HU9901044D0; CN1175107C; KR19990087356A; EP0885305A1; HUP9900623A3; US6018105A; CN1212724A; HUP9901044A3; HUP9900623A2; WO1997032011A1; KR19990087454A; CN1212725A; JP2000506724A; AU724893B2; CZ272698A3; PL187545B1

Abstract

(57)【要約】植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）コード配列に天然に結合したプロモーター、及びその誘導体が提供される。これらのプロモーターは、植物細胞において、操作できるように連結された異種コード配列の発現を制御するために使用することができる。これらのプロモーターは、特に除草剤の標的酵素の修飾された形状、特にプロトックスの修飾された形状の発現に有用であり、対応する未修飾の酵素を阻害する除草剤に対する耐性を達成する。これらのプロモーターを含む組換えDNA分子及びキメラ遺伝子を提供し、更にこのようなキメラ遺伝子を含む植物組織及び植物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーター発明の分野本発明は、植物において、関連するDNA配列の転写プロモーターとして機能する、新規DNA配列に関する。更に詳細に述べると、本発明は、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス(protox)）のコード配列に天然に結合した新規プロモーターに関する。発明の背景 I.プロトックス酵素及びそのクロロフィル／ヘム生合成経路との関与クロロフィル及びヘムの生成につながる生合成経路は、多くの共通の段階を共有している。クロロフィルは、全ての緑色の光合成生物に存在する集光性色素である。ヘムは、ヘモグロビン、シトクローム、P450混合機能型オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びカタラーゼのコファクターであり（例えば、Lehningerの論文、Biochemistry、Worth Publishers、ニューヨーク（1975年）を参照のこと）、従って、全ての好気性生物にとって必要な成分である。クロロフィル及びヘムの生合成における最終の共通段階は、プロトポルフィリノーゲンIXのプロトポルフィリンIXへの酸化である。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（以後本願明細書においては、“プロトックス”と称す。）は、この最終酸化段階を触媒する酵素である（Matringeらの論文、Biochem.J.、260：2 31（1989））。酵素プロトックスは、酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev isiae)（Labbe-Bois及びLabbeの論文、Biosynthesisof Heme and Chlorophyll、 E.H.Dailey編集、McGraw Hill社、ニューヨーク、235-285頁(1990)）、オオムギのエチオプラスト（etioplast）（Jacobs及びJacobsの論文、Biochem.J.、244:2 19(1987)）、及びマウスの肝（Dailey及びKarrの論文、Biochem.、26:2697(1987 )）を含む多くの生物から、部分的に又は完全に精製されている。プロトックスをコードしている遺伝子は、２種の原核生物であるエシェリキア・コリ(Escheri chia coli)（Sasarmanらの論文、Can.J.Microbiol.、39:1155(1993)）及びバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)（Daileyらの論文、J.Biol.Chem.、269:8 13(1994)）から単離されている。これらの遺伝子は、配列の類似性を共有せず；それらの予想されるタンパク質生成物も、いかなるアミノ酸配列の同一性も共有していない。E.コリのタンパク質は、およそ21kDaであり、かつ細胞膜に結合している。B.サブチリスのタンパク質は、51kDaであり、可溶性で、細胞質活性がある。現在、プロトックスをコードしているcDNAが、ヒト（Nishimuraらの論文、J.B iol.Chem.、270(14)：8076-8080（1995））及び植物（1995年6月8日に出願され、1995年12月21日に第WO 95/34659号として公開された、国際特許出願第PCT/IB9 5/00452号）からも単離されている。 II．除草剤標的としてのプロトックス遺伝子作物中の雑草又は植物のような望ましくない植生を管理するための除草剤の使用は、ほとんど普遍的に実践されるようになってきている。これに関連した市場は、年間10億ドルを超えている。この甚だしい使用にもかかわらず、雑草の管理は、農業従事者にとって相変わらず重要かつ経費のかかる問題である。除草剤の効果的な使用には、堅実な管理が必要である。例えば、散布の時期及び方法、並びに雑草植物の成長の段階が、除草剤による良好な雑草の管理を得るには重要である。様々な雑草種が除草剤に抵抗性であるので、効果的な除草剤を製造することの重要性が増してきている。残念ながら、より強力であり、より広範な殺草スペクトルを有し、かつ土壌中でより速やかに分解するような除草剤は、作物へのより大きい植物毒性をも有し得る。この問題に対するひとつの解決法は、除草剤に抵抗性又は耐性である作物を開発することである。このような除草剤に対し抵抗性である作物の雑種又は品種は、作物損傷のリスクを伴わずに除草剤を使用することを可能にする。抵抗性の開発は、その除草剤に対する作物の感受性のために、以前はその使用が不可能であるか又は制限されていたような作物への除草剤の適用（例えば雑草発芽前の使用）を可能にすることができる。Andersonらの米国特許第4,761,373号は、様々なイミダゾリノン系又はスルホンアミド系除草剤に対する植物の抵抗性を開示している。この抵抗性は、変質アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素によってもたらされている。Goodmanらの米国特許第4,975,374号は、グルタミンシンターゼ(GS)を阻害することが公知である除草剤、例えばホスフィノチリシン及びメチオニンスルホキシイミンによる阻害に対し抵抗性である突然変異体グルタミンシンテターゼ(GS)をコードしている遺伝子を含む植物細胞及び植物体に関連している。Bedbrookらの米国特許第5,013,659号は、スルホン尿素系除草剤による阻害に対し抵抗性の植物をもたらす突然変異体アセトラクテートシンターゼを発現している植物を開示している。Somersらの米国特許第5,162,602号は、シクロヘキサンジオン系及びアリールオキシフェノキシプロパン酸系除草剤による阻害に対する植物耐性を開示している。この耐性は、変質アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCase)によってもたらされる。前述のプロトックス酵素は、様々な除草剤化合物の標的として働く。プロトックスを阻害する除草剤は、多くの異なる分子構造の種類を含む（Dukeらの論文、 Weed Sci．、39:465(1991)；Nandihalliらの論文、Pesticide Biochem.Physiol. 、43:193(1992)；Matringeらの論文、FEBS Lett.、245:35(1989)；Yanase及びAn dohの論文、Pesticide Biochem.Physiol.、35:70(1989)）。これらの除草剤化合物は、ジフェニルエーテル類（例えばアシフルオルフェン(acifluorfen)、5-[2- クロロ-4-(トリフルオロメチル)フェノキシ]-2-ニトロ安息香酸；そのメチルエステル；又はオキシフルオルフェン、2-クロロ-1-(3-エトキシ-4-ニトロフェノキシ)-4-(トリフルオロベンゼン)）、オキシジアゾール類（例えばオキシジアゾン、3-[2,4-ジクロロ-5-(1-メチルエトキシ)フェニル]-5-(1,1-ジメチルエチル) -1,3,4-オキサジアゾール-2-(3H)-オン）、環状イミド類（例えば、S-23142、N- (4-クロロ-2-フルオロ-5-プロパルギルオキシフェニル)-3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド；クロロフタリウム、N-(4-クロロフェニル)-3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド）、フェニルピラゾール類（例えばTNPP-エチル、エチル-2[1-(2 ,3,4-トリクロロフェニル)-4-ニトロピラゾリル-5-オキシ]プロピオネート；M&B 39279）、ピリジン誘導体類（例えばLS 82-556）、並びにフェノピレート及びそのO-フェニルピロリジノ-及びピペリジノ-カルバメートアナログを含む。これらの化合物の多くは、明らかに基質アナログとして作用し、該酵素によって触媒された正常な反応を競合的に阻害する。プロトックスに対する阻害作用は、典型的には、約395〜410nm で励起した後、約622〜635nmの蛍光を測定することによって決定される（例えば Jacobs及びJacobsの論文、Enzyme、28:206(1982)；Shermanらの論文、Plant Phy siol.、97:280(1991)を参照のこと）。このアッセイは、プロトポルフィリノーゲンIXは蛍光色素であり、かつプロトポルフィリンIXは非蛍光であるという事実を基にしたものである。プロトックス−阻害性除草剤の作用の予想される態様は、葉緑体におけるプロトポルフィリノーゲンIXの蓄積に関連している。この蓄積は、細胞質ゾルへの、プロトポルフィリノーゲンIXの漏れにつながり、細胞質ゾルではそれがペルオキシダーゼ活性によってプロトポルフィリンIXへと酸化されると考えられる。プロトポルフィリンIXは光暴露された場合、細胞質ゾルにおいて、シングレット酸素の生成を引き起こすことができる。このシングレット酸素は、その後、他の活性酸素種の生成を導き、このことは、脂質の過酸化及び急速な細胞死につながる膜破壊を惹起し得る（Leeらの論文、Plant Physiol.、102:881(1993)）。全てのプロトックス酵素が、植物のプロトックス酵素を阻害する除草剤に対して感受性があるわけではない。エシェリキア・コリ（Sasarmanらのの論文、Can. J.Microbiol.、39:1155(1993)）及びバチルス・サブチリス（Daileyらの論文、J .Biol.Chem.、269:813(1994)）から単離された遺伝子によってコードされた両方のプロトックス酵素は、これらの除草性阻害剤(herbcidal inhibitor)に対して抵抗性である。更に、フェニリミド系除草剤S-23142に対して抵抗性である単細胞藻類クラミドモナス・レインハルジチ(Chlamidomonas reinhardtii)の突然変異体が報告されている（Kataokaらの論文、J.Pesticide Sci.、15:449(1990)；S hibataらの論文、Research in Photosynthesis、第３巻、N.Murata編集、Kluwer ：オランダ、567-570頁(1992)）。これらの突然変異体の少なくとも1種は、該突然変異体が選択された除草性阻害剤に対してのみではなく、プロトックス阻害剤の他の種類に対しても抵抗性である修飾されたプロトックス活性を有すると思われる（Os hioらの論文、Z.Naturforsch、48c:339(1993)；Satoらの論文、ACS Symposium o n Porphyric Pesticides 、S.Duke編集、ACS Press：ワシントン(1994)）。突然変異体タバコ細胞株も、前述の阻害剤S-21432に対して抵抗性であることが報告されている（Cheらの論文、Z.Naturforsch、48c:350(1993)）。更に、植物のプロトックスコード配列の修飾された、阻害剤−抵抗性の型が、1995年6月8日に出願され、かつ1995年12月21日に第WO 95/34659号として公開された、国際特許出願第PCT/IB95/00452号に開示されている。 III.プロトックス遺伝子発現の調節これまでに行われたプロトックス遺伝子に関連した研究の大半は、プロトックス阻害剤に対する抵抗性をもたらし得るこの酵素のコード配列及び修飾に焦点を当てている。当該技術分野においては、植物におけるプロトックスコード配列の発現を制御しかつ促進する調節要素に関する情報は入手することができない。発明の要約本発明は、以後本願明細書においては一般に“プロトックスプロモーター”と称する、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）のコード配列に天然に結合されたプロモーター領域が、植物における異種コード配列の発現を促進するのに有用であるという発見を基にしている。前述の植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）コード配列に天然に結合したプロモーター領域が、植物における異種コード配列の発現の促進に有用であるという発見に従い、本発明は、植物のプロトックスプロモーター又はそれらの機能的同等物を含む単離されたDNA 分子を提供するものである。本発明は更に、異種（heterologous）コード配列に作用可能に連結された植物のプロトックスプロモーターを含むキメラ遺伝子を提供する。このようなキメラ遺伝子を含む植物組織及び植物体も提供する。本発明のひとつの態様において、前述のプロトックスプロモーターは、除草剤に対する耐性をもたらすために、植物において、除草剤の標的タンパク質の除草剤抵抗性型を発現することに使用される。この態様に従えば、前述のプロトックスプロモーターは、未修飾の植物プロトックスタンパク質の阻害剤に対して抵抗性である除草剤−抵抗性の植物プロトックスタンパク質のコード配列に、作用可能に連結し得る。寄託下記のベクター分子が、Agricultural Research Service、Patent Culture Co llection(NRRL)、Northern Regional Research Center、1815 North University Street,Peoria,Illinois 61604,U.S.A.に、下記の日付で寄託されている：アラビドプシスのプロトックス-1プロモーターを含むAraPTlProは、1995年12 月15日に、pWDC-11として寄託された（NRRL♯B-21515）。トウモロコシのプロトックス-1コード配列の残部に融合された、トウモロコシのプロトックス-1プロモーターを含むプラスミドは、1996年3月19日に、pWDC-14 として寄託された（NRRL ♯B-21546）。テンサイのプロトックス-1プロモーターを含むプラスミドは、1996年12月6日に、pWDC-20として、寄託された（NRRL ♯B-21650）。配列表の説明配列番号１：アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）のプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号２：配列番号１によってコードされたアラビドプシス(Arabidopsis)プロトックス-1アミノ酸配列。配列番号３：アラビドプシス・サリアナのプロトックス-2タンパク質のDNAコード配列。配列番号４：配列番号３によってコードされたアラビドプシスプロトックス-2のアミノ酸配列。配列番号５：トウモロコシのプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号６：配列番号５によってコードされたトウモロコシプロトックス-1のアミノ酸配列。配列番号７：トウモロコシのプロトックス-2タンパク質のDNAコード配列。配列番号８：配列番号７によってコードされたトウモロコシプロトックス-2のアミノ酸配列。配列番号９：コムギのプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号10：配列番号９によってコードされたコムギプロトックス-1のアミノ酸配列。配列番号11：ダイズのプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号12：配列番号11によってコードされたダイズプロトックス-1タンパク質。配列番号13：アラビドプシス・サリアナのプロトックス-1遺伝子由来のプロモーター配列。配列番号14：トウモロコシのプロトックス-1遺伝子由来のプロモーター配列。配列番号15：綿花のプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号16：配列番号15によってコードされた綿花プロトックス-1のアミノ酸配列。配列番号17：テンサイのプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号18：配列番号17によってコードされたテンサイのプロトックス-1のアミノ酸配列。配列番号19：ナタネのプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号20：配列番号19によってコードされたナタネプロトックス-1のアミノ酸配列。配列番号21：コメのプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号22：配列番号21によってコードされたコメプロトックス-1のアミノ酸配列。配列番号23：モロコシ(sorghum)のプロトックス-1タンパク質のDNAコード配列。配列番号24：配列番号23によってコードされたモロコシ(sorghum)プロトックス- 1のアミノ酸配列。配列番号25：トウモロコシのプロトックス-1のイントロン配列。配列番号26：テンサイのプロトックス-1遺伝子由来のプロモーター配列。定義この明細書で使用される“植物のプロトックスプロモーター”とは、植物において、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）コード配列の直ぐ上流に天然に存在し、かつその天然に存在する状態で、関連するプロトックスコード配列の転写の調節に寄与するような調節領域を意味するように使用される。この植物のプロトックスプロモーターは、転写を開始するための、RNAポリメラーゼの結合に直接関わるDNA領域、及び作用可能に連結されたコード配列の転写に影響を及ぼす別の上流の調節シス−エレメントを含んでいる。この明細書で使用される“遺伝子”とは、適当な宿主細胞において、(1)コード配列、及び(2)該コード配列の転写を促進しかつ調節するように関連する調節領域を含むDNA分子を意味するように使用される。このコード配列は、有用な転写産物（例えば、アンチセンスRNA）又はこのコードされた転写産物の翻訳によって産生されたポリペプチドをコードすることができる。遺伝子は、少なくとも、5'−3'方向に、プロモーター領域、コード配列及び転写ターミネーターを含む。遺伝子は、更に、最小のエレメントの一部として（例えば、該コード配列内のリーダーペプチド又はシグナルペプチド）、又は分離したエレメント（例えばイントロン）として存在し得る別の調節領域も含む。この明細書で使用された“キメラ遺伝子”とは、少なくとも1個の構成部分が、別の構成部分に関して異種であるような、天然には存在しない遺伝子を意味する。本発明を説明するためにここで使用された“キメラ遺伝子”とは、異種のコード列に作用可能に連結した本発明のプロモーターを含む遺伝子を意味する。プロモーター及びコード配列の間の関係についてここで使用されたように、用語“異種”(heterologous)とは、天然には存在しない関係を意味するように使用される。例えば、コード配列とは、これがプロモーター配列と関連する天然に存在するコード配列と異なるならば、このプロモーター配列に関して異種であると考えられる。これは、問題のプロモーターと天然に関連するコード配列の修飾された形態を含む。従って、修飾された、阻害剤-抵抗性プロトックスコード配列は、このコード配列の未修飾の阻害剤-感受性型に天然に関連するプロモーターに対して異種であると考えられる。これは更に、異なる植物種又は非植物種に由来するコード配列に作用可能に連結された本発明のプロモーターを含んでいる。この明細書で使用される場合、用語“実質的配列相同性”とは、ヌクレオチド配列（DNA又はRNAの場合）又はアミノ酸配列（タンパク質又はポリペプチドの場合）が、他のヌクレオチド又はアミノ酸配列と、実質的に構造的及び機能的な同等性(equivalence)を示すことを表すように使用される。実質的配列相同性を有する配列間の構造的又は機能的差異は、最小であり；すなわち、これらは、本出願において指摘されるように機能するその配列の能力には影響しないであろう。例えば、植物のプロトックスプロモーターであることが示されたDNA配列と実質的配列相同性を有する配列は、該植物のプロトックスプロモーターとして、関連するDNA配列の発現の同じレベル及びパターンを示すことができるであろう。ここで開示される配列と実質的配列相同性を有する配列は、通常開示された配列の突然変異のような変異型であるが、しかし更には合成配列であることもできる。 2種以上の異なる配列の間に著しい量の配列の一致又は類似性がある場合、もしくはこれらの異なる配列が同様の生理的特性を示す場合は、構造的差異は、最小であると考えられる。このような特性は、例えば免疫活性、酵素活性、構造タンパク質の完全性などを含むことができる。 2種のヌクレオチド配列は、これらの配列が、それらの間に少なくとも70％、より好ましくは80％、そして最も好ましくは90％の配列類似性を有する場合に、実質的配列相同性を有することができる。2種のアミノ酸配列は、これらのポリペプチドの活性部分の間に、少なくとも50％、好ましくは70％、及び最も好ましくは90％の類似性を有する場合に、実質的配列相同性を有する。プロモーターDN A配列の場合においても同様に、“実質的配列相同性”は、関連するDNA配列の発現を促進するために作用可能なプロモーターDNA配列の断片を意味する。このようなプロモーターDNA配列の作用可能な断片は、例えば制限酵素を用いる該プロモーターDNA配列の切断、該プロモーターDNA配列の配列に従った合成により、該プロモーターDNA配列に由来することができるか、またはPCR法を用いて得ることができる。Mullisらの論文、Meth.Enzymol．、155:335-350(1987)；Erich編集のPCR Technology 、Stockton Press（ニューヨーク、1989年）。プロモーターDNA配列と第二のDNA配列の2種について、プロモーターDNA配列が、第二のDNA配列の転写又は翻訳に影響するように位置した場合に、プロモーターDNA配列は第二のDNA配列に“作用可能に連結されている”と称される。例えば、第二のDNA配列がタンパク質生成をコードしているならば、該プロモーターDNA 配列が、第二DNA配列からのタンパク質の発現に影響する場合に、このプロモーターDNA配列は、第二のDNA配列に作用可能に連結されているであろう。例えば、同じキメラ構造体におけるコードDNA配列に物理的に付着したプロモーターDNA配列を含むDNA配列において、これら2種の配列は、おそらく作用可能に連結されているであろう。発明の詳細な説明本発明は、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（以後本願明細書においては、“プロトックス”と称する；1995年6月8日に出願され、1995年12月21 日に、第WO 95/34659号として公開された、その全文が参照として引用されている国際特許出願第PCT/IB95/00452号；及び同日に即時出願(instant application )として出願され、かつその全文も参照として組み込まれている、“植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードしているDNA分子及びそれらの阻害剤抵抗性突然の変異体”（事件整理番号第PH/5-20757/P1/CGC1847号）と称する同時係属国際出願第号を参照のこと）のコード配列に天然に関連するプロモーターDNA配列に関する。これらのプロトックスプロモーター配列は、植物における異種コード配列の発現に有用であることがわかっている。アラビドプシス・サリアナのプロトックス-1コード配列（配列番号１）のプロモーター配列が、配列番号13として提供されている。関連するコード配列をプローブとして用いての、このプロモーターのゲノムライブラリーからの単離を、実施例1に示す。トウモロコシのプロトックス-1コード配列（配列番号5）のプロモーター配列は、配列番号14に提供されている。関連するコード配列をプローブとして用いての、このプロモーターのゲノムライブラリーからの単離を、実施例４に示す。テンサイのプロトックス-1コード配列（配列番号17）のプロモーター配列は、配列番号26に提供されている。関連するコード配列をプローブとして用いての、このプロモーターのゲノムライブラリーからの単離を、実施例11に示す。本発明によって提供された情報を基に、アラビドプシス及びトウモロコシのプロトックス-1プロモーターを単離するために使用した方法は、現在、あらゆる植物のプロトックス遺伝子からプロモーター配列を単離するために使用することができる。興味深いプロモーターに結合したプロトックスコード配列とハイブリダイズするのに十分な相同性を共有するいずれかのプロトックスコード配列を、この方法においてプローブとして使用することができる。全植物に由来するプロトックス-1及びプロトックス-2コード配列の各々は、必要な程度の相同性を共有するように意図されているので、いずれのプロトックスコード配列をプローブとして使用するかの選択は、重要であるとはみなされない。しかしながら、ハイブリダイゼーションの結果を最適にするには、最も密に関連したプロトックスコード配列を使用することが好ましい。最も好ましくは、プローブとして使用されるコード配列は、注目のプロトックスプロモーターと同じ植物種に由来し、かつ該プロモーターと天然に関連するコード配列である。従って本発明は、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する単離したプロモーターDNA分子に関する。好ましくは、アラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、オオムギ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ(oilseed rape)、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草及び飼草(forage grass)、アワ及びコメからなる群から選択された植物に由来する、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する、単離されたプロモーターDNA分子である。より好ましくは、アラビドプシス、ダイズ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草、及びコメからなる群から選択された植物に由来する、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する、単離されたプロモーターDNA分子である。特に好ましくは、アラビドプシス、テンサイ及びトウモロコシからなる群から選択された植物に由来する、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する、単離されたプロモーターDNA分子である。最も好ましくは、アラビドプシスに由来する、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する、単離されたプロモーターDNA分子である。最も好ましくは、トウモロコシに由来する、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する、単離されたプロモーター DNA分子である。最も好ましくは、テンサイに由来する、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する、単離されたプロモーターDNA分子である。本発明に含まれるのは、先に定義された本発明のDNA分子に、ハイブリダイズするDNA分子であるが、好ましくは、適度にストリンジェントな条件下で、少なくとも10個のヌクレオチドの長さの、前述のプロトックスプロモーター配列の隣接部分を含む前記DNA分子から入手可能なオリゴヌクレオチドプローブに、ハイブリダイズするDNA分子である。最も好ましいのは、下記の条件下で、配列番号1 3（アラビドプシスのプロトックス-1プロモーター）、配列番号14（トウモロコシのプロトックス-1プロモーター）又は配列番号26（テンサイのプロトックス-1 プロモーター）のいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA分子である：（a）７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO₄(pH7.0)、1mM EDTA中、5 0℃でのハイブリダイゼーション；及び (b)50℃での、２×SSC、１％SDS中での洗浄。ハイブリドの安定性に影響を及ぼす因子が、このハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。このような因子の1つは、融解温度Tmであり、これは、DNA PROBES（George H．Keller及びMark M.Manak、Macmillan Publishers Ltd.、1993年、第1節；Molecular Hybridization Technology；8ff頁）中に提供された式に従って、容易に算出することができる。好ましいハイブリダイゼーションの温度は、算出された融解温度Tm以下の約25℃、好ましくは算出された融解温度Tm以下の約12〜 15℃の範囲であり、及びオリゴヌクレオチドの場合は、融解温度Tm以下の約5〜1 0℃の範囲である。本発明の別の実施態様は、プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分、及びプロトックスタンパク質をコードしているDNA部分を含む、DNA分子の製造法であって、下記の工程：（a）植物のプロトックス遺伝子又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブを調製する工程、ここで該プローブは、少なくとも10個のヌクレオチドの長さで植物由来の、プロトックスタンパク質のコード配列の隣接部分又はプロトックスプロモーター配列を含む；（b）工程(a)に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選択された生物由来のクローニングされたゲノムDNA断片又はcDNA断片の集団を、別のプロトックスコード配列についてプローブする工程；及び（c）プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分及びプロトックスタンパク質をコードしているDNA部分を有するDNA分子を単離し、そして増幅する工程；を含む方法である。本発明の別の実施態様は、プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有するDNA分子の生成法であって、（a）植物のプロトックス遺伝子又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブを調製する工程、ここで該プローブは、少なくとも10個のヌクレオチドの長さの、植物由来のプロトックスタンパク質のコード配列の隣接部分を含む；（b）工程(a)に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選択された生物由来のクローニングされたゲノムDNA断片又はcDNA断片の集団を、別のプロトックスコード配列又はプロトックスプロモーター配列についてプローブする工程；及び（c）プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有するDNA分子を単離し、そして増幅する工程；を含む方法である。本発明の更なる実施態様は、いずれかの植物プロトックス遺伝子由来のプロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有する、DNA分子の単離法であって；（a）植物のプロトックス遺伝子又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブを調製する工程、ここで該プローブは、少なくとも10個のヌクレオチドの長さで植物由来の、プロトックスタンパク質のコード配列の隣接部分又はプロトックスプロモーター配列を含む；（b）工程(a)に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選択された生物由来のクローニングされたゲノムDNA断片又はcDNA断片の集団を、別のプロトックスコード配列又はプロトックスプロモーター配列をプローブする工程；及び（c）プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有するDNA分子を単離する工程；を含む方法である。本発明は更に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、長さが少なくとも10個のヌクレオチドの、植物のプロトックス遺伝子又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブの使用を具体化し、ここで該プローブは、該プロトックス遺伝子のコード領域又はプロモーター領域のいずれかから得ることができる。本発明はまた、該プローブのゲノムプロトックス配列への選択的ハイブリダイゼーションを基にした標準的技術を用いての、植物のプロトックス遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブの使用、又は選択された植物のゲノム内のプロトックス遺伝子（複数）の位置の地図作製を具体化する。本発明は、注目のプロモーターと関連するプロトックスコード配列にハイブリダイズするのに十分な相同性を共有するプロトックスコード配列のプローブとしての使用を具体化する。プローブとして使用したコード配列が、注目のプロトックスプロモーターと同種の植物に由来し、かつ該プロモーターに天然に関連するコード配列であるような、プロトックスコード配列を使用することが好ましい。本発明の植物プロトックスプロモーターは、配列番号13に記載のアラビドプシスプロトックス-1プロモーター配列、配列番号14に記載のゼア(Zea)・メイズ（トウモロコシ）プロトックス-1プロモーター配列、配列番号26に記載のテンサイプロトックス-1プロモーター配列、並びに、前述の他の植物種から入手できる対応するプロトックス-1プロモーター配列を含む。本発明は、同じく、例示されたプロトックスプロモーター配列と同じ態様で、作用可能に連結されたコード配列の発現を調節する能力を保持しているDNA配列の機能的断片を含む。このような機能的断片は、欠失分析又はプロトックスプロモーター活性を同定するために当該技術分野において使用される他の標準的技術（例えば、Lewinが編集した“Gen es IV”、Oxford Univ.Press、546-549頁（1990年）を参照のこと）によって同定することができる。本発明は、更に、作用可能に連結された配列に同等の発現のレベル及びパターンをもたらすような、植物遺伝子から入手できるプロトックスプロモーターと実質的配列相同性を有するDNA配列を含む。このようなプロモーター配列は、植物遺伝子から単離されたプロトックスプロモーターの修飾を通じて得ることができ、かつ該植物のプロトックスプロモーターと機能的に同等な誘導体であると考えられる。下記実施例において詳細に説明するように、本発明のDNA配列、ベクター及びトランスジェニック植物は、植物のプロトックス遺伝子由来のプロモーター配列を含む。このプロトックスプロモーターのDNA配列は、例えばアンチセンス転写産物のような、有用なRNA転写産物へと転写されるDNA配列のようなDNAコード配列、又は有用なタンパク質生成物の製造において最終的に発現されるコード配列に、作用可能に連結されていることが好ましい。好ましい実施態様において、前述のプロトックスプロモーターは、酵素の対応する未修飾型を阻害する濃度において除草剤に対し抵抗性であるような、修飾された除草剤標的酵素の発現を示すために使用される。従って本発明は、除草剤に対する耐性をもたらすために、植物において除草剤標的タンパク質の除草剤抵抗型を発現する、プロトックスプロモーターの使用に関連している。このような修飾された除草剤-抵抗性酵素は、イミダゾールグリセロールリン酸デヒラターゼ( dehyratase)（IGPD；1994年11月24日に公開された第WO 9426909号参照）、EPSP シンターゼ（米国特許第4,535,060号；第4,769,061号；第4,940,835号及び欧州特許第EP 550,633号を参照）、グルタミンシンテターゼ（GS；米国特許第4,975, 374号参照）、アセチルCoAカルボキシラーゼ（ACCase；米国特許第5,162,602号参照）、及びアセトラクテートシンターゼ（米国特許第4,761,373号；第5,304,7 32号；第5,331,107号；第5,013,659号；第5,141,870号；第5,378,824号を参照）を含む。最も好ましい実施態様において、前述のプロトックスプロモーターは、実施例2から3に詳細に説明したように、プロトックス阻害剤に対し抵抗性である、修飾されたプロトックス酵素の発現を指示するために使用される（更に、本願明細書にその関連部分が参照として組み込まれている、1995年6月8日に出願され、1995年12月21日に第WO 95/ 34659号として公開された、国際特許出願第PCT/IB95/00452号を参照のこと；同じく、同日に即時出願として出願された、“植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードしているDNA分子及びその阻害剤抵抗性の突然変異体”と称する同時係属出願を参照のこと）。本発明は、異種DNAコード配列に作用可能に連結された、植物のプロトックスプロモーターを含む発現カセットを有するキメラ遺伝子に関連している。好ましくは、前述の植物プロトックスプロモーターは、プロトックス-1遺伝子又はプロトックス-2遺伝子に由来するキメラ遺伝子である。特に好ましいのは、該植物プロトックスプロモーターは、プロトックス-1遺伝子に由来するキメラ遺伝子である。特に好ましいのは、該植物プロトックスプロモーターが、プロトックス-2遺伝子に由来するキメラ遺伝子である。好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、アラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、オオムギ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草及び飼草、アワ及びコメからなる群から選択された植物に由来するキメラ遺伝子である。より好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、アラビドプシス、ダイズ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草及びコメからなる群から選択された植物に由来するキメラ遺伝子である。特に好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、アラビドプシス、トウモロコシ及びテンサイからなる群から選択された植物に由来するキメラ遺伝子である。より好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、アラビドプシス及びトウモロコシからなる群から選択された植物に由来するキメラ遺伝子である。最も好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、配列番号13に記載の配列を有するキメラ遺伝子である。最も好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、配列番号14に記載の配列を有するキメラ遺伝子である。最も好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、配列番号26に記載の配列を有するキメラ遺伝子である。好ましくは、前記植物プロトックスプロモーターは、長さが少なくとも50 0個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも300個のヌクレオチドを有するキメラ遺伝子である。好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性又はプロトックス-2活性を有するアラビドプシス種のタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性又はプロトックス-2活性を有するトウモロコシのタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号６又は配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性を有するコムギのタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号10 に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性を有するダイズのタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性を有する綿花のタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号16に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、該DNA分子が、プロトックス-1活性を有するテンサイのタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号18に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性を有するアブラナのタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号20に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性を有するコメのタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する。同じく好ましいキメラ遺伝子は、そのDNA分子が、プロトックス-1活性を有するモロコシのタンパク質をコードしていて、好ましくは該タンパク質が、配列番号24 に記載のアミノ酸配列を有する。本発明は、更に該酵素の対応する未修飾型を阻害する濃度で、除草剤に対し抵抗性である、植物由来のタンパク質をコードしているDNA分子に作用可能に連結された植物プロトックスプロモーターを含む発現カセットを有するキメラ遺伝子に関する。この異種コード配列が、植物酵素の修飾された除草剤-抵抗性型をコードしているような、キメラ遺伝子が好ましい。特に好ましくは、この植物酵素は、イミダゾールグリセロールリン酸デヒラターゼ(IGPD)、5-エノルピルビルシキメート -3-リン酸シンターゼ(EPSP)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アセトラクテートシンターゼ、ヒスチジノールデドロゲナーゼ及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロックス）からなる群から選択されたキメラ遺伝子である。より好ましいのは、該植物酵素は、イミダゾールグリセロールリン酸デヒラターゼ(IGPD)、5-エノルピルビルシキメート-3-リン酸シンターゼ(EPSP)、グルタミンシンテターゼ（GS）、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アセトラクテートシンターゼ及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロックス）からなる群から選択されたキメラ遺伝子である。特に好ましいのは、該植物酵素は、真核生物のプロトックスであるキメラ遺伝子である。より好ましくは、該植物酵素は、アミノ酸置換を有する真核生物のプロトックスであり、このアミノ酸置換がプロトックス阻害剤に対する抵抗性をもたらす特性を有するようなキメラ遺伝子である。最も好ましくは、該植物酵素が、“植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードしているDNA分子及びその阻害剤抵抗性の突然変異体”と称する同時係属出願である国際出願第＿＿号に従う、プロトックス阻害剤に対する抵抗性をもたらす特性を有するような、真核生物のプロトックスであるようなキメラ遺伝子である。好ましくは、そのDNA分子は、アラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、オオムギ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草及び飼草、アワ、まぐさ及びコメからなる群から選択された植物由来のタンパク質をコードしているようなキメラ遺伝子である。より好ましくは、そのDNA分子は、アラビドプシス、ダイズ、綿花、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシからなる群から選択された植物由来のタンパク質をコードしているようなキメラ遺伝子である。特に好ましくは、そのDNA分子は、アラビドプシス、コムギ、ダイズ、及びトウモロコシからなる群から選択された植物由来のタンパク質をコードしているようなキメラ遺伝子である。最も好ましくは、そのDNA分子は、ダイズ及びコムギからなる群から選択された植物由来のタンパク質をコードしているようなキメラ遺伝子である。本発明は、更に未修飾の植物プロトックスタンパク質の阻害剤に対して抵抗性である、除草剤抵抗性植物のプロトックスタンパク質を発現するために、本発明のキメラ遺伝子を使用することに関する。本発明は、更に宿主ゲノムへの、該キメラ遺伝子の安定した組込みに関する。本発明は、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）プロモーター、又はその機能的に同等な誘導体を含む組換えDNA分子に関する。本発明は、更にこの組換えDNA分子を含む組換えDNAベクターに関する。本発明の別の目的は、前記ベクターが、植物体、植物種子、植物組織又は植物細胞へ安定して形質転換されることが可能であるような、前述のキメラ遺伝子を含む組換えベクターである。このベクターにより安定して形質転換された植物体及びその後代、植物種子、植物組織又は植物細胞は、所望のタンパク質をコードしているDNA分子の発現が可能であり、該タンパク質は、非植物又は植物を起源とすることができ、好ましくは植物に由来することができる。好ましくは、組換えベクターであり、ここで該ベクターにより安定して形質転換された植物体及びその後代、植物種子、植物組織又は植物細胞は、所望のタンパク質をコードしているDNA分子を発現することが可能であり、該タンパク質は、非植物又は植物を起源とすることができ、好ましくは該酵素の対応する未修飾型を阻害する濃度で除草剤に対し抵抗性である植物に由来することができる。本発明は更に、少なくとも１種の本発明のキメラ遺伝子によって安定して形質転換された、植物体及びそれらの後代、種子、及び培養組織を含むトランスジェニック植物組織に関する。好ましくは、タンパク質を発現することが可能なDNA コード配列に作用可能に連結された植物プロトックスプロモーターを含む発現カセットを有する少なくとも１種のキメラ遺伝子によって安定して形質転換された、植物体、種子及び培養組織を含むトランスジェニック植物組織であり、これは非植物又は植物を起源とすることができ、これは該植物組織の酵素の対応する未修飾型を阻害する濃度で除草剤に対して抵抗性であるような植物に由来することが好ましい。更に本発明は、本発明のベクターにより、安定して形質転換された宿主細胞を包含しており、この宿主細胞は、該DNA分子を発現することが可能である。植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞からなる群から選択された宿主細胞が好ましい。本発明は、更にこれらの植物において、天然に存在するプロトックス活性を阻害する除草剤に対し耐性である植物体及びその後代、植物組織及び植物種子に向けられ、ここでこの耐性は、本願明細書において示されるような修飾された阻害剤-抵抗性プロトックス酵素を発現している遺伝子によってもたらされる。代表的植物は、これらの除草剤が、それらの通常意図された目的のために適用され得るあらゆる植物を含む。好ましくは、農耕学的に重要な作物、すなわちアラビドプシス、ダイズ、サトウキビ、オオムギ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草及び飼草、アワ及びコメなどのような被子植物及び裸子植物である。より好ましくは、農耕学的に重要な作物、すなわちアラビドプシス、綿花、ダイズ、油料種子ナタネ、サトウキビ、タバコ、トウモロコシ、コメ、コムギ、オートムギ、ライムギ、テンサイ、芝草などのような被子植物及び裸子植物である。特に好ましくは、農耕学的に重要な作物、すなわちアラビドプシス、ダイズ、綿花、サトウキビ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ及びコメなどのような被子植物及び裸子植物である。本発明のトランスジェニック植物は、当該技術分野において公知のいずれかの形質転換法により、形質転換することができる。これらの方法は、例えば、植物体、植物組織又は細胞の、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる直接感染又は共存培養法による形質転換；Horschらの論文、Science、225 :1229(1985)；Martonの論文、“植物の細胞培養及び体細胞遺伝子”、第1巻、51 4-521頁(1984)）；プロトプラストへの直接の遺伝子導入；Paszkowskiらの論文、EMBO J.、12:2717(1984)；Loerzらの論文、Mol.Gen.&Genet．、1199:178(1985 )；Frommらの論文、Nature、319:719(1986)；微量注入撃込み(microprojectile bombardment)法、Kleinらの論文、Bio/Technology、6:559-563(1988)；プロトプラスト培養細胞及び組織への注入（Reichらの論文、Bio/Technology、4:1001-10 04(1986)；又はDe La Penaらの論文、Nature、325:274-276(1987)；Hooykaas-Va n Slogterenらの論文、Nature、311:763-764(1984)；Grimsleyらの論文、Bio/Te chnology、6:185(1988)）；及びGrimsleyらの論文、Nature、325:177(1988)によって明らかにされた苗木及び植物の分裂組織への注入法を含む。前述のトランスジェニック種子及び植物体へ遺伝子操作された遺伝的特性は、有性繁殖又は栄養生長によって受け継がれ、従って後代植物において維持されかつ繁殖され得る。一般にこの維持及び繁殖は、耕運、種まき又は収穫のような特定の目的に合致するように開発された公知の農業法の使用をもたらす。水耕又は温室技術のような特定の方法も、適用することができる。成長している作物は、昆虫又は感染症によって引き起こされた攻撃及び損傷、更には雑草植物との競争に晒されているので、収穫を改善するために、雑草、植物病害、昆虫、線虫、及び他の有害な状態を管理するための手段が実施される。これらは、土壌の耕運又は雑草及び感染植物の除去のような機械的手段、更には除草剤、殺菌剤、生殖体撲滅薬、殺線虫剤、成長調節物質、熟成剤及び殺虫剤のような農芸化学品の適用を含む。本発明のトランスジェニック植物及び種子の有利な遺伝的特性の使用は、更に、有害生物、除草剤又は侵襲に対する耐性のような改善された特性、改善された栄養価、増加した収穫高、もしくは倒伏又は実こぼれによる減収を少なくする構造の改善を伴う植物の開発を目指すような、植物の育種をもたらすことができる。この様々な育種工程は、交配する細胞系の選択、親系の受粉の指示、又は適当な後代植物の選択のような、良く定義されたヒトの介在によって特徴づけられる。所望の特性に応じて、様々な育種法が行われる。これらの関連技術は、当該技術分野において周知であり、ハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交雑、多系交配、品種混合、種間ハイブリダイゼーション、異数体法などを含むが、これらに限定されるものではない。ハイブリダーゼーション法は、更に機械的、化学的又は生化学的方法により、雄性又は雌性の不稔植物を得るための植物の不稔化を含む。異なる系統の花粉を有する雄性不稔植物の交雑受粉は、雌性不稔ではなく雄性不稔植物のゲノムが、両方の親系の特性を一様に得るであろうということを確証する。従って本発明のトランスジェニック種及び植物は、例えば除草剤又は殺虫剤の処理のような常法の効果が増強するように改善された植物系の育種に使用することができ、もしくはこれらの修飾された遺伝特性により前述の方法の適用を可能にする。あるいは、その最適化された遺伝的“装置”が、同等の有害な発育条件に耐えることができないような生産物よりも、より良い品質の生産物の収穫を得ることができるような改善された侵襲耐性を伴う新規作物を、得ることができる。種子の製造においては、種子の発芽の質及び均一性が、生産物の特性として必須であるが、農家によって収穫されかつ販売された種子の発芽の質及び均一性は、重要ではない。作物を、他の作物及び雑草の種から隔離することは困難であるので、種子伝染病を管理し、かつ良く発芽する種子を製造するために、かなりの程度かつ良く定義された種子製造法が、混入のない種子の生長、馴化及び販売の分野で経験を積んだ種子製造業者によって開発されている。従って、自分の作物から収穫した種子を用いるかわりに、特定の品質基準に合致する証明書つきの種子を購入することは、農業従事者にとって一般的に実践されている。種子として使用される繁殖材料は、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺擬軟体動物剤又はそれらの混合物を含む、保護コーティングで、通常処理されている。通常使用される保護コーティングは、カプタン、カルボキシン、チラム(TMTD（登録商標）)、メタラキシル（Apron（登録商標））、及びピリミホス-メチル（Actellic（登録商標））のような化合物を含む。望ましいならば、これらの化合物は、更に、有害な細菌、真菌又は動物によって引き起こされる損傷に対して保護するために、製剤の技術分野において通常使用される担体、界面活性剤又は散布促進アジュバントと共に、配合される。これらの保護コーティングは、液体製剤に繁殖材料を液浸することにより、もしくは湿式又は乾式製剤の組み合わせによるコーティングにより、塗布することができる。芽又は実の段階で指示された処理のような、他の塗布法も、同じく可能である。本発明の別の態様は、本発明のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物材料、又はトランスジェニック種子の使用を特徴とする、先に例示したような新規農業法を提供することである。本発明は、除草剤に対する耐性をもたらすために、本発明のキメラ遺伝子を、植物において除草剤標的タンパク質の除草剤抵抗型を発現するのに十分量含むトランスジェニック植物又はその後代を使用するような農業法を示す。本発明の方法に従って形質転換された植物の後代を育種するために、下記の方法を使用することができる：下記実施例において示されたように製造されたトウモロコシ植物を、当該技術分野において公知であるように、温室の鉢又は土壌において生育し、花を咲かせる。成熟した雄花の穂から花粉を得、同じ植物、同胞植物又はいずれか望ましいトウモロコシ植物の穂への受粉に用いる。同様に、形質転換された植物に生じる穂を、同じ植物、同胞植物又はいずれか望ましいトウモロコシ植物から得た花粉により、受粉することができる。この方法で得られた形質転換された後代は、導入遺伝子（複数）及び／又は付随するDNA（遺伝子型）の存在、又はもたらされた表現型により、形質転換されていない後代と区別することができる。この形質転換された後代は、同様に、望ましい特徴を持ついずれかの植物で通常行われるように、自殖(self)又は他の植物と交配することができる。同様に、この方法で製造されたタバコ又は他の形質転換された植物は、望ましい特性を持つ後代を産生するために、当該技術分野において公知であるように、自殖または交配することができる。同様に、当該技術分野において公知の方法及び本発明の方法を組み合わせることによって製造された他のトランスジェニック生物は、望ましい特性を備えた後代を製造するために、当該技術分野において公知であるように、育種することができる。本発明は、下記実施例により、より詳細に説明されるが、ここに記されたものに限定されるものではない。実施例実施例1. アラビドプシス・サリアナのプロトックス-1プロモーター配列の単離アラビドプシス・サリアナ（コロンビア、全植物体）から作成したラムダZapI IゲノムDNAライブラリーは、ストラータジーン社から購入した。およそ125,000 ファージを、15cmのペトリ皿当たり25,000pfu（プラーク形成単位）の密度でプレーティングし、かつデュプリケートのリフト(lift)を、コロニー／プラークスクリーン膜（NENデュポン社）上に形成した。これらのプラークリフトを、アラビドプシスのプロトックス-1 cDNA（ランダムプライミング法により、32P-dCTP で標識した配列番号１（ライフテクノロジー社））でプローブした。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、Church及びGilbertの論文、Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 81:1991-1995(1984)に記載されているように、65℃であった。陽性(posit ive)にハイブリダイズしたプラークを精製し、かつin vivoにおいて、pBluescri ptプラスミドへ切出した。このゲノムDNA由来の挿入配列を、チェーンターミネーション法により、蛍光色素で標識したジデオキシターミネーター（アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。１種のクローンAraPT1Proは、プロトックス-1タンパク質コード配列の開始メチオニン(ATG)の上流に580bpのアラビドプシス配列を含むことが断定された。このクローンは、更にプロトックス-1cDNA 配列の1241bpに及ぶコード配列及びイントロンを含む。580bpの5'側非コード断片は、アラビドプシスのプロトックス-1プロモーターであると推定され、かつこの配列を配列番号13に示した。 AraPTlProは、1995年12月14日に、pWDC-11として寄託した(NRRL ♯B-21515)。実施例2. 天然のアラビトプシスプロトックス-1プロモーターに続く(behind)修飾プロトックス-1遺伝子を発現している植物の形質転換ベクターの構築適当な修飾アラビトプシスプロトックス-1cDNAの完全な長さのcDNAを、EcoRI- Xholの部分消化断片として単離し、かつ植物の発現ベクターpCGN1761ENXにクローニングした（1995年6月8日に出願され、かつ1995年12月21日に第WO 95/34659 号として公開された、国際特許出願第PCT/IB95/00452号に記された、実施例９を参照のこと）。このプラスミドをNcoI及びBamHIで消化し、完全なプロトックス- 1cDNAと、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのtml遺伝子の3'側未翻訳配列からの転写ターミネーターで構成された断片を形成した。前述のAraPT1ProプラスミドをNcoI及びBamHIで消化し、pBluescript及び580bpの推定アラビドプシスプロトックス-1プロモーターで構成された断片を形成した。これら2種の断片のライゲーションは、天然のプロトックスプロモーターへの変質プロトックスcDNA の融合体を生じた。プロトックス-1プロモーター／プロトックス-1 cDNA/tmlターミネーター融合体を含む発現カセットを、KpnIで切出し、かつバイナリーのベクターpCIB200へとクローニングした。このバイナリーのプラスミドは、電気穿孔法を用いて、アグロバクテリウムへと、その後真空浸透法によりアラビドプシスへと形質転換した（Bechtoldらの論文、C.R.Acad.Sci.Paris.、31:1194-1199( 1993)）。変質プロトックス遺伝子を発現している形質転換体は、カナマイシン又はプロトックスを阻害する除草剤の様々な濃度について、選択した。実施例3. 天然のプロトックス-1プロモーター／修飾プロトックス-1融合体の発現による除草剤耐性植物の製造前述の方法を用いて、プロトックス-1配列（配列番号１）における、ヌクレオチド1306-1308でのTACからATG（チロシンからメチオニン）への変化を含むアラビトプシスプロトックス-1 cDNAを、天然のプロトックス-1プロモーター断片に融合し、かつアラビドプシス・サリアナに形質転換した。この修飾プロトックス-1酵素（AraC-2Met）は、細菌の発現システムにおいて試験した場合、様々なプロトックスを阻害する除草剤に対し、天然に生じる酵素よりも10倍以上の耐性を示した（この出願と同日に出願された、“植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードしているDNA分子及びその阻害剤抵抗性の突然変異体”と称する同時係属国際出願（事件整理番号第PH/5-20757/P1/CGC1847号）を参照のこと）。真空浸透した植物に由来する種子を収集し、かつ処方XVIIのプロトックス阻害性アリールウラシル系除草剤の範囲（10.0nM−1.0μM）でプレーティングした。野生型アラビドプシスを用いる多くの実験は、この化合物の10.0nMの濃度が、正常な種子の発芽を妨げるのに十分であることを示した。天然のプロトックス-1プロモーターに融合されたAraC-2Met変質酵素を発現しているトランスジェニック種子は、除草剤濃度500 nMまでは、正常なアラビドプシスの苗木を生じ、これは、野生型アラビドプシスと比較した場合に、少なくとも50倍高い除草剤耐性を示している。従ってこのプロモーター／変質プロトックス酵素融合体は、植物の形質転換の効果的な選択マーカーとして機能する。100.0nMのプロトックス阻害性除草剤上で発芽したいくつかの植物体を、土壌に移植し、2〜3週間生育し、かつ様々な濃度のプロトックス阻害性除草剤を用い、噴霧アッセイ(spray assay)により試験した。空のベクターの対照形質転換体と比較した場合に、このトランスジェニックAraPT1Pro/Ar aC-2Metは、除草剤の噴霧に対し、10倍以上の耐性があった。実施例4. トウモロコシのプロトックス-1プロモーター配列の単離ラムダFIX IIベクター中のゼア・メイズ（ミズリー17近交系、黄化芽ばえ）のゲノムDNAライブラリーは、ストラータジーン社から購入した。およそ250,000pfuのこのライブラリーを、15cm皿当たり50,000ファージの密度でプレーティングし、かつデュプリケートのリフトを、コロニー／プラークスクリーン膜（NENデュポン社）上に形成した。これらのプラークリフトを、ランダムプライミング法により、32P-dCTPで標識したトウモロコシのプロトックス-1 cDNA（配列番号5）でプローブした（ライフテクノロジー社）。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、Church及びGilbertの論文、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA、81:1991-1995(1984)に記載されているように、65℃であった。Wiz ard Lambda Preps DNA精製システム（プロメガ社）を用いて、３種の陽性ハイブリダイズファージから、ラムダファージDNAを単離した。制限酵素消化による分析、ハイブリダイゼーションパターン、及びDNA配列分析により、先にcDNAクローンとして単離されたトウモロコシのプロトックス-1コード配列の5'側に位置した、約3.5kbのトウモロコシゲノムDNAを含むラムダクローンを同定した。この断片は、トウモロコシのプロトックス-1プロモーターを含むように意図されている。この断片の配列は、前記配列番号14である。ヌクレオチド1〜3532までのこの配列は、5'側の非コード配列で構成される。ヌクレオチド3533〜3848までのこの配列は、トウモロコシのプロトックス-1タンパク質の5'末端をコードしている。前述のトウモロコシプロトックス-1コード配列の残部に融合された配列番号14 を有するプラスミドは、1996年3月19日に、pWDC-14として寄託した(NRRL ♯B-21 546)。実施例5. 植物の形質転換ベクターの構築非常に多くの形質転換ベクターが、植物の形質転換について利用可能であり、そして本発明のプロモーター及びキメラ遺伝子を、いずれかのこのようなベクターと共に使用することができる。使用するベクターの選択は、好ましい形質転換法及び形質転換の標的種によって左右されるであろう。ある標的種については、様々な抗生物質及び除草剤の選択マーカーが好ましい。形質転換において通常使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連した抗生物質に対する抵抗性をもたらすnpt11遺伝子（Messing及びVier raの論文、Gene、19:259-268(1982)；Bevanらの論文、Nature、304:184-187(198 3)）、除草剤ホスフィノチリシンに対する抵抗性をもたらすbar遺伝子（Whiteらの論文、Nucl．Acids Res.、18:1062(1990)；Spencerらの論文、Theor．Appl．G enet．、79:625-631(1990)）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性をもたらすhph遺伝子（Blochinger及びDigglmannの論文、Mol cell Biol、4:2929-2931 ）、及びメトトレキセートに対する抵抗性をもたらすdhfr遺伝子（Bourouisらの論文、EMBO J．、2(7):1099-1104(1983)）を含む。 I.アグロバクテリウムの形質転換に適したベクターの構築多くのベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる形質転換に利用可能である。これらは、典型的には少なくとも1個のT-DNA境界配列を保持し、かつpBIN19（Bevanの論文、Nucl.Acids Res.(1984)）及びpXYZのようなベクターを含む。２種の典型的ベクターの構築について、下記に示した。 pCIB200及びpCIB2001の構築：バイナリーベクターのpCIB200及びpCIB2001を、アグロバクテリウムで用いる組換えベクターの構築のために使用し、そして下記の方法で構築した。pTJS75kanを、pTJS75のNarI消化によって作製し（Schmidhau ser及びHelinskiの論文、J Bacteriol.、164:446-455(1985)）、テトラサイクリン-抵抗性遺伝子を切出し、その後NPTIIを保持するpUC4K由来のAccI断片に挿入した（Messing及びVierraの論文、Gene、19:259-268(1982)；Bevanらの論文、Na ture、304:184-187(1983)；McBrideらの論文、Plant Molecular Biology、14:266-276(1990)）。XhoIリンカーを、pCIB7の EcoRV断片にライゲーションし、これは、左右のT-DNA境界配列、植物の選択可能なnos/nptllキメラ遺伝子及びpUCポリリンカー（Rothsteinらの論文、Gene、53: 153-161(1987)）を含み、かつこのXhoIで消化した断片を、SalIで消化したpTJS7 5kanへとクローニングし、pCIB200を形成した（欧州特許第EP 0 332 104号の実施例19[1338]も参照のこと）。pCIB200は、ユニークポリリンカー制限酵素切断部位を含む：EcoRI、Sstl、Kpnl、BglII、XbaI、及びSalI。pCIB2001は、pCIB20 0の誘導体であり、これは別の制限酵素切断部位のポリリンカーへの挿入によって作製した。pCIB2001のポリリンカーのユニーク制限酵素切断部位は、EcoRI、S stI、KpnI、BglII、XabI、SalI、MluI、BclI、AvrII、Apal、HpaI、及びStuIであった。pCIB2001は、これらのユニーク制限酵素切断部位を含むことに加えて、植物及び細菌のカナマイシン選択性、アグロバクテリウムが介在した形質転換のための左右のT-DNA境界配列、E.coli及び他の宿主の間の移動(mobilization)のためのRK2由来のtrfA機能、並びに同じくRK2由来のOriT及びOriV機能も有する。このpCIB2001ポリリンカーは、それ自身の調節シグナルを含む植物の発現カセットのクローニングに適している。 pCIB10及びそのハイグロマイシン選択性誘導体の構築：バイナリーベクターpC IB10は、植物選択のためのカナマイシン抵抗性をコードしている遺伝子、左右の T-DNA境界配列、及びE.coli及びアグロバクテリウムの両方における複製を可能にする広範な宿主域のプラスミドpRK252由来の組込み(incorporates)配列を含んでいる。その構築は、Rothsteinらの論文、Gene、53:153-161(1987)に記されている。Gritzらの論文、Gene、25:179-188(1983)に記されたような、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼの遺伝子を組込んでいるpCIB10の様々な誘導体が、構築されている。これらの誘導体は、ハイグロマイシン単独での（pCIB743）、又はハイグロマイシン及びカナマイシン（pCIB7 15、pCIB717）での、トランスジェニック植物細胞の選択が可能である。 II．アグロバクテリウム以外の形質転換に適したベクターの構築アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いない形質転換は、選択された形質転換ベクター中のT-DNA配列が不要であり、その結果としてこれらの配列が欠損しているベクターを、T-DNA配列を含む前述のもののようなベクター類のほかに使用することができる。アグロバクテリウムに頼ることの無い形質転換法は、パーティクルガン(particle bombardment)法、プロトプラストの取込み（例えば PEG及び電気穿孔法）及び微量注入法による形質転換を含む。ベクターの選択は、主に形質転換される種にとって好ましい選択よって決まる。いくつかの典型的ベクターの構築について、下記に示した。 pCIB3064の構築：pCIB3064は、除草剤バスタ（又はホスフィノチリシン）による選択と組み合わせた、直接の遺伝子導入法に適したpUC由来のベクターである。このプラスミドpCIB246は、CaMV 35Sプロモーター及びCaMV 35S転写ターミネーターに作用可能に融合したE.coli GUS遺伝子を含み、そしてこれはPCT公開第W O 93/07278号に開示されている。このベクターの35Sプロモーターは、開始部位の5'側に２個のATG配列を含む。これらの部位は、標準のPCR法を用いて、ATGを取除くように変異され、かつ制限酵素切断部位SspI及びPvuIIを生じた。この新規の制限酵素切断部位は、ユニークSalI部位から96及び37bp、並びに実際の開始部位から101及び42bp離れていた。得られたpCIB246の誘導体は、pCIB3025と称する。次にこのGUS遺伝子を、pCIB3025からSalI及びSacIによる消化により切出し、その末端を、平滑にし、かつ再ライゲーションし、プラスミドpCIB30 60を作製した。プラスミドpJIT82は、John Innes Centre,Norwichから入手し、そしてストレプトミセス・ビリドクロモゲネスのbar遺伝子を有する400bpのSmaI 断片を切出し、そしてpCIB3060のHpaI部位に挿入した（Thompsonらの論文、EMBO J．、6:2519-2523(1987)）。これによりpCIB3064が生じ、これは除草剤選択のためのCaMV 35Sプロモーター及びターミネーターの制御下にあるbar遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子（E.coliにおける選択のため）及びポリリンカーを含み、このポリリンカーはSphl、Pstl、HindIII、及びBamHIのユニーク切断部位を伴う。このベクターは、それ自身の調節シグナルを含む植物の発現カセットのクローニングに適している。 pSOG19及びpSOG35の構築：pSOG35は、メトトレキセートに対する抵抗性をもたらす選択マーカーとしてE.coli遺伝子のジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を使用する形質転換ベクターである。PCRを用いて、35Sプロモーター（〜800bp）、トウモロコシのAdh1遺伝子由来のイントロン6（〜550bp）、及びpSOG10由来のGUS 未翻訳のリーダー配列の18bpを増幅した。E.coliデヒドロ葉酸レダクターゼII型遺伝子をコードしている250bp断片も、PCRにより増幅し、かつこれらの２種のPC R断片を、pUC19ベクターの骨格及びノパリンシンターゼのターミネーターを含む pBI221（クローンテック社）由来のSacI-PstI断片と組合わせた。これらの断片の集合は、pSOG19を形成し、これは該イントロン6配列と融合している35Sプロモーター、GUSリーダー、DHFR遺伝子及びノパリンシンターゼのターミネーターを含む。pSOG19中のGUSリーダーの、トウモロコシ・クロロチック(Chlorotic)・モトル(Mottle)・ウイルス(MCMV)由来のリーダー配列による置換は、ベクターpSOG 35を形成する。pSOG19及び pSOG35は、アンピシリン抵抗性のpUC遺伝子を保持し、かつ植物のプロトックスプロモーターを含むキメラ遺伝子配列のような外来配列のクローニングに利用可能なHindIII、SphI、PstI及びEcoRI切断部位を有する。実施例6. キメラ遺伝子／植物の発現カセットの構築植物プロトックスプロモーターの制御下でトランスジェニック植物において発現することを意図されるコード配列は、適当なプロトックスプロモーターに続き、かつ適当な転写ターミネーターの上流の発現カセット中で組立てることができる。その後得られたキメラ遺伝子を、実施例５で説明した植物の形質転換ベクターへと容易に転移することができる。 I.プロトックスプロモーターの選択本発明のキメラ遺伝子は、植物のプロトックスプロモーターを含むであろう。前記キメラ遺伝子において使用した特定のプロトックスプロモーターの選択は一般に、好ましくは、得られるキメラ遺伝子を含有させることを意図された種と、密接に関連した、もしくは最も好ましくはそれと同じである植物種からのプロトックスプロモーターを使用するが、本質的には個々の研究者次第である。例えば、このキメラ遺伝子をトウモロコシ植物に含有させることが意図される場合は、単子葉植物由来のプロトックスプロモーターを使用することが好ましく、かつトウモロコシのプロトックスプロモーターを使用することが最も好ましい。 II．転写ターミネーター発現カセットにおいて使用するために、様々な転写ターミネーターが入手可能である。これらは、導入遺伝子以外の転写の終結及びその正確なポリアデニル化に寄与している。適当な転写ターミネーターは、植物における機能が公知のものであり、かつCaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウのrbcS E9ターミネーター、更には植物プロトックス遺伝子に天然に結合したターミネーター（すなわち“プロトックスターミネーター”）を含んでいる。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方において使用することができる。 III.発現の増強又は調節のための配列転写ユニット内の遺伝子発現を増強する多くの配列がわかっていて、かつこれらの配列は、本発明の遺伝子と共に、トランスジェニック植物においてそれらの発現を増強するために使用することができる。様々なイントロン配列は、特に単子葉植物細胞において、発現を増強することが示されている。例えばトウモロコシAdh1遺伝子のイントロン類は、トウモロコシ細胞へと導入される場合、そのコグネイト(cognate)プロモーターの下で、野生型遺伝子の発現を著しく増強することがわかっている。イントロン1は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築体において、特に効果的でありかつ発現を増強することがわかった（Callisらの論文、Genes Develop.、1:1183-1200(1987)）。同じ実験系において、トウモロコシのbronze 1遺伝子由来のイントロンは、発現の増強において同様の効果を有する（前述のC allisらの論文）。イントロン配列は、通常植物の形質転換ベクター、典型的には非翻訳リーダーに組み込まれる。ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列も、同じく発現を増強することが公知であり、かつこれらは特に双子葉植物細胞において効果的である。特にタバコモザイクウイルス由来のリーダー配列（TMV、“W-配列”）、トウモロコシ・クロロチック・モトル・ウイルス(MCMV)、及びアルファルファモザイクウイルス(A MV)が、発現を増強することにおいて効果的であることが示されている（例えばGallieらの論文、Nucl.Acids Res.、15:8693-8711(1987)；Skuzeskiらの論文、Plant Molec.B iol.、15:65-79(1990)）。 IV．細胞内の遺伝子産物の標的化遺伝子産物の標的化の様々な機序が、植物において存在することが公知であり、かつこれらの機序が機能するのを制御する配列は、かなり詳細に特徴付けられている。例えば、葉緑体に対する遺伝子産物の標的化は、各種タンパク質のアミノ末端において認められたシグナル配列によって制御され、かつこれは葉緑体の移入時に切断され、成熟タンパク質を生じる（例えばComaiらの論文、J.Biol.Ch em.、263:15104-15109(1988)）。これらのシグナル配列は、異種遺伝子産物に融合し、葉緑体への異種産物の移入に作用することができる（van den Broeckらの論文、Nature、313:358-363(1985)）。適当なシグナル配列をコードしているDNA は、RUBISCOタンパク質、CABタンパク質、EPSPシンターゼ酵素、GS2タンパク質、及び葉緑体に局在することが公知であるその他の多くのタンパク質をコードしているcDNA類の5'末端から単離することができる。他の遺伝子産物は、ミトコンドリア及びペルオキシソームのような他の細胞小器官に局在している（例えばUngerらの論文、PlantMolec.Biol.、13:411-418(19 89)）。これらの産物をコードしているcDNAも、同じくこれらの細胞小器官に向けて異種遺伝子産物を標的化するように操作することができる。このような配列の例は、核によりコードされたATPアーゼ及びミトコンドリアに特異的なアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのアイソホーム(isoform)である。細胞タンパク質本体に対する標的化は、Rogersらの論文(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:65 12-6516(1985))に記されている。更に、他の細胞区画に対する遺伝子産物の標的化を生じる配列がが特徴付けられている。アミノ末端配列は、ER、アポプラスト、及びアリューロン細胞からの細胞外分泌の標的化に寄与している（Koehler及びHoの論文、Plant cell、2:769-783(1990)。更にカルボキシ末端配列と結合したアミノ末端配列は、遺伝子産物の液胞標的化に寄与している（Shinshiらの論文、Plant Molec.Bio l.、14:357-368(1990)）。注目の導入遺伝子配列に前述の適当な標的化配列を融合することによって、いずれかの細胞小器官又は細胞区画に対して導入遺伝子産物を向けることが可能である。葉緑体の標的化のために、例えば、RUBISCO遺伝子、CAB遺伝子、EPSPシンターゼ遺伝子又はGS2遺伝子由来の葉緑体シグナル配列が、該導入遺伝子のアミノ末端ATGにフレームを合わせて融合される。この選択されたシグナル配列は、公知の制限酵素切断部位を含まなければならず、そしてこの構築された融合体は、切断に必要な切断部位の後方のアミノ酸を考慮しなければならない。いくつかの場合には、この必要要件は、切断部位及び導入遺伝子ATGの間の少数のアミノ酸の追加、あるいは導入遺伝子配列内のいくつかのアミノ酸の交互置換によって満たすことができる。葉緑体移入のために構築された融合体は、in vitroで転写された構築体のin vitroでの翻訳、それに続くBartlettらの論文（Edelmannらの編集のMethods in Chloroplast Molecular Biology(Elsevier)、1081-1091頁(19 82)）；Wasmannらの論文（Mol.Gen.Genet.、205:446-453(1986)）に示された方法を用いるin vitroの葉緑体の取込みによって、葉緑体取込みの有効性について試験することができる。これらの構築法は、当該技術分野において周知であり、かつミトコンドリア及びペルオキシソームに同様に利用することができる。前述の導入遺伝子の発現には標的化の選択が必要であり、所定の経路の出発点として必要な前駆体の細胞局在によって左右される。これは、いくつかの場合においてはミトコンドリア及びペルオキシソームであり得るが、通常は細胞質ゾル又は葉緑体であろう。導入遺伝子の発現の産物は、通常ER、アポプラスト又は液胞への標的化が不要であろう。細胞標的化に関する前述の機序は、標的化シグナルが誘導されるプロモーターのものとは異なる発現パターンを有するプロモーターの転写調節の下で、特定の細胞標的化の目標に影響を及ぼすように、植物プロトックスプロモーターと共に利用することができる。実施例7. 双子葉植物の形質転換双子葉植物の形質転換法は、当該技術分野において周知であり、かつアグロバクテリウムをベースとした方法及びアグロバクテリウムを必要としない方法を含む。非アグロバクテリウム的方法は、プロトプラスト又は細胞による直接の外来性遺伝子物質の取込みに関連している。これは、PEG又は電気穿孔法が介在した取込み、パーティクルガン法が介在した送達、又は微量注入法によって達成することができる。これらの方法の例は、Paszkowskiらの論文、EMBO J、3:2717-272 2(1984)；Potrykusらの論文、Mol.Gen.Genet.、199:169-177(1985)；Reichらの論文、Biotechnology、4:1001-1004(1986)；及びKleinらの論文、Nature、327:7 0-73(1987)に記されている。それぞれの場合において、形質転換された細胞は、当該技術分野において公知の標準的方法を用いて、全植物体へと再生される。アグロバクテリウムが介在した形質転換が、その形質転換の高い効率及び多くの異なる種での広範な有用性のために、双子葉植物の形質転換にとっては好ましい方法である。アグロバクテリウムによって日常的に形質転換可能な多くの作物種は、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿花、油料種子ナタネ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファー、及びポプラを含む（欧州特許第EP 0 317 511号（綿花）、欧州特許第EP 0 249 432号（トマト、カルゲネ社）、国際特許公開第WO 87/07299号（アブラナ、カルゲネ社）、米国特許第4,795,855号（ポプラ）））。組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常該植物由来の外植片によるアグロバクテリウムの共存培養法、その後の当該技術分野における周知の方法に関連している。形質転換された組織は、バイナリープラスミドT-DN A境界配列の間に存在する抗生物質又は除草剤の抵抗性マーカーを含む選択培地上で再生される。実施例8. 単子葉植物の形質転換ほとんどの単子葉植物種の形質転換は、現在日常的になってきている。好ましい方法は、PEG又は電気穿孔法を用いるプロトプラストへの直接の遺伝子導入、及びカルス組織へのパーティクルガン法を含む。形質転換は、単一のDNA種又は複数のDNA種（すなわち共形質転換）で行うことができ、かつこれらの方法は両方とも、本発明と共に使用するのに適している。共形質転換は、複雑なベクター構築を避け、かつ興味深い遺伝子及び選択マーカーの連結していない座を持つトランスジェニック植物を生じる点で利点があり、これはその次の世代における選択マーカーの除去を可能にするので、望ましいこととみなされるべきである。しかし共形質転換を用いる欠点は、個別のDNA種が、該ゲノムに組み込まれる頻度が100％未満であることである（Schocherらの論文、Biotechnology、4:1093-109 6(1986)）。欧州特許出願第EP 0 292 435号（チバ・ガイギー社）、第EP 0 392 225号（チバ・ガイギー社）、第WO 93/07278号（チバ・ガイギー社）及び米国特許第5,350 ,689号（チバ・ガイギー社）は、トウモロコシのelite同系繁殖系からカルス及びプロトプラストを調製する方法、PEG 又は電気穿孔法を用いるプロトプラストの形質転換法、及び形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生法を開示している。Gordon-Kammらの論文、Plant Cell、2:603-618(1990)及びFrommらの論文、Biotechnology、8:833 -839(1990)は、パーティクルガン法を用いるA188由来のトウモロコシ系統の形質転換法を公開している。更に国際特許出願第WO93/07278号（チバ・ガイギー社）及びKozielらの論文、Biotechnology,，11:194-200(1993))は、パーティクルガン法による、トウモロコシのelite同系繁殖系の形質転換法を開示してる。この方法は、受粉後14〜15日のトウモロコシ穂から切取った長さ1.5〜2.5mmの未熟のトウモロコシ胚、及び撃込みのためのPDS-1000Heバイオリスティック（biolisti c）装置を用いる。コメの形質転換も、同様にプロトプラストを用いる直接の遺伝子導入法又はパーティクルガン法によって行うことができる。プロトプラストが介在した形質転換は、ジャポニカ型及びインディカ型について公開されている（Zhangらの論文、Plant Cell Rep、7:379-384(1988)；Shimamotoらの論文、Nature、338:274-27 7(1989)；Dattaらの論文、Biotechnology、8:736-740(1990)）。両型とも、パーティクルガン法を用いて日常的に形質転換されている（Christouらの論文、Biot echnology、9:957-962(1991)）。欧州特許出願第EP 0 332 581号（チバ・ガイギー社）は、ポーイデアエ（Pooi deae）のプロトプラストの発生、形質転換及び再生の方法を開示している。これらの方法は、ダクチリス（Dactylis）及びコムギの形質転換を可能にする。更に、パーティクルガン法を用いるC型長期再生可能カルスの細胞へのコムギの形質転換は、Vasilらの論文、Biotechnology、10:667-674(1992)に示されていて、更に未熟胚及び未熟胚由来のカルスのパーティクルガン法を用いる、Vasilらの論文、Biotechnology、11:1553-1558(1993)及びWeeksらの論文、Plant Physiol. 、102:1077-1084(1993)にも示されている。しかし、コムギの形質転換にとって好ましい方法は、未熟胚のパーティクルガン法によるコムギの形質転換であり、かつ遺伝子の供給前に高ショ糖液過程又は高マルトース液過程のいずれかを含む。撃込みの前に、ある数の胚（長さ0.75〜1mm）を、体細胞胚の導入のために、３％ショ糖及び3mg/l 2,4-Dを含むMS培地（Murashige及びSkoogの論文、Physiol ogia Plantarum、15:473-497(1962)）にプレーティングし、これは暗室で進行することができる。撃込みに選択された日に、胚を誘導培地から取り除き、そして浸透液(osmoticum)（すなわち、望ましい濃度、典型的には15％で添加されたショ糖又はマルトースの導入培地）上に播種する。この胚を、２〜３時間原形質分離させ、その後撃ち込んだ。１個の標的プレートにつき20個の胚が、典型的であるが、これは必須ではない。適当な遺伝子-保持プラスミド（pCIB3064又はpSG35 など）を、標準的方法を用いて、大きさがマイクロメーターの金粒子上に沈殿した。各胚のプレートを、デュポン社のバイオリスティック・ヘリウム装置で、標準の80メッシュスクリーンを使い、バースト圧〜1000psiで撃った。撃込み後、これらの胚を暗室に戻し、約24時間で回収した（依然浸透液中に在る）。24時間後、これらの胚を浸透液から取り出し、導入培地に戻して播種し、再生以前に約１月間放置した。およそ１ヶ月後、発生している胚形成カルスを伴う胚の外植片を、更に適当な選択試薬（pCIB3064の場合は10mg/lバスタ、及びpSOG35の場合は 2mg/lメトトレキシエート）を含む再生培地（MS+1mg/l NAA、5mg/l GA）に移した。約１ヶ月後、発生した新芽(shoot)を、強度が半分のMS、２％ショ糖及び同濃度の選択試薬を含む、“GA7s ”として公知のより大きい滅菌容器に移した。国際特許公開第WO 94/13822号は、コムギの形質転換法を開示していて、これは参照として本願明細書に組み込む。実施例9. 天然のトウモロコシのプロトックス-1プロモーターに続く修飾プロトックス-1遺伝子を発現する植物形質転換ベクターの構築 3848bpのトウモロコシのゲノム断片（配列番号14）を、単離したラムダファージクローンから、SalI-KpnI部分消化産物として切出し、かつ164位のアミノ酸をアラニンからロイシンへ変化させた修飾トウモロコシプロトックス-1 cDNAに由来するKpnI-NotI断片（配列番号６）とライゲーションした。これは、天然のトウモロコシプロトックス-1プロモーターの完全な長さのcDNAへの融合体を生成し、これは細菌系において除草剤耐性をもたらすことが示された（“植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードしているDNA分子及びそれらの阻害剤抵抗性の突然変異体”（事件整理番号第PH/5-20757/P1/CGC1847号）と称する対応する同時係属出願された国際特許出願第＿＿号を参照のこと、実施例８〜13 ）。この融合体は、CaMV 35Sターミネーター配列を含むベクターに由来するpUCl 8へとクローニングし、プロトックスプロモーター／変質プロトックスcDNA／ターミネーターカセットを作成した。このカセットを含むプラスミドは、pWCo-1と称される。トウモロコシの形質転換のための第二の構築体は、トウモロコシのゲノムクローン由来のコード配列中に認められた第一のイントロンのトウモロコシcDNAへの戻し遺伝子操作によって生成される。この挿入は、標準的オーバーラッピングPC R融合法を用いて行われる。このイントロン（配列番号25）は、長さが93bpであり、かつ実施例４に説明されたラムダクローン中の天然の状況においてまさに見られるように、配列番号5のヌクレオチド203及び204の間に挿入された。この発現カセットのイントロン含有型を、pWCo-2と称した。実施例10. トランスジェニックトウモロコシ植物におけるトウモロコシプロトックス-1プロモーター活性の証明トウモロコシプロトックスプロモーター／修飾プロトックス融合体で形質転換されたトウモロコシ植物は、該導入遺伝子に特異的なプライマーによるPCR分析法を用いて同定した。全RNAを、PCR陽性植物から調製し、スーパースクリプトM- MLV （ライフテクノロジー社）を用いて、推奨される条件下で、逆転写した。この逆転写反応物２μｌを、該修飾プロトックス配列に対して特異的であるように設計されたPCR反応において用いた。この反応において、形質転換されていない対照は、生成物を生じなかったが、pWCo-1で形質転換された植物の約85％が、陽性の結果を生じ、このことは、該導入遺伝子に由来するmRNAが存在することを示している。このことは、トウモロコシのプロトックスプロモーターの活性にいくつかのレベルがあることを示している。トランスジェニクなトウモロコシ植物由来のRNAも、プローブとして配列番号5の放射標識したトウモロコシプロトックスcDNA断片を用いて、標準的ノーザンブロット分析法を施すことができる。形質転換していない対照のそれよりも著しく高い、プロトックス-1mRNAのレベルが、トランスジェニックなトウモロコシ植物のいくつかにおいて検出された。このmR NAレベルの上昇は、おそらくクローニングされたトウモロコシプロトックスプロモーター由来の修飾プロトックス-1mRNAの発現に起因するであろう。実施例11. テンサイのプロトックス-1プロモーター配列の単離ラムダFix IIベクター中の、テンサイのゲノムライブラリーは、ストラータジーン社により調製された。実施例４においてトウモロコシについて示したように、このライブラリーのおよそ300,000pfuをプレーティングし、かつテンサイのプロトックス-1 cDNA配列（配列番号17）でプローブした。制限酵素消化による分析、ハイブリダイゼーションパターン及びDNA配列分析から、以前にcDNAクローンとして単離されたテンサイのコード配列の５'側に位置した約7kb のテンサイのゲノムDNAを含むラムダクローンであることを確認した。2606bpのP stI-SaII断片は、該ラムダクローンから、pBluescriptベクターにサブクローニングした。この断片は、５'側の非コード配列の2068bpを含み、かつテンサイのプロトックス-1プロモーター配列を含む。更にプロトックス-1コード配列の第一の453bp及びこのコード配列に含まれる85bpの第一のイントロンを含む。この断片の配列は、配列番号26に述べている。配列番号26の配列を含むプラスミドは、1996年12月６日に、pWDC-20として寄託された（NRRL ♯B-21650）。実施例12. テンサイの天然のプロトックス-1プロモーターに続くテンサイの修飾プロトックス-1遺伝子を発現している植物の形質転換ベクターの構築テンサイのゲノム断片（配列番号26）を、実施例11において示したゲノムサブクローンから、５'側非コード配列の2068bp及びテンサイのプロトックス-1コード配列の最初の300bpを含む、SacI-BsrGI断片として切出した。この断片を、第4 49位のアミノ酸チロシンのメチオニンへの変更を含む変質テンサイプロトックス -1cDNA由来のBerGI-NotI断片にライゲーションした（配列番号18）。これは、天然のテンサイプロトックス-1プロモーターの、細菌システムにおいて除草剤耐性をもたらすことが示されている完全な長さのcDNAへの融合体を生成した（同時係属出願第＿＿号（事件整理番号第PH/5 -20757/P1/CGC1847号））。この融合体は、CaMV 35Sターミネーター配列を有するベクター由来のpUC18へとクローニングされ、プロトックスプロモーター／変質プロトックスcDNA/ターミネーターカセットを生じた。このカセットを含むプラスミドは、pWCo-3として寄託した。実施例13. 天然のテンサイプロトックス-1プロモーター／修飾テンサイプロトックス-1融合体の発現による除草剤耐性植物の作製 pWCo-3由来の発現カセットを、アグロバクテリウム法、プロトプラスト法及びバイオリスティックな形質転換法などの、双子葉植物に適用できるいずれかの形質転換法を用いて、テンサイに形質転換した。修飾プロトックス-1酵素を発現しているトランスジェニックなテンサイを、RNA-PCRによって同定し、かつプロトックス-阻害性除草剤に対する、非形質転換のテンサイにとっては致死的な濃度での耐性を試験した。本発明は、その詳細な実施態様を参照にして説明されているが、これは、多くの変更、修飾及び具体化が可能であり、従ってこのような変更、修飾及び具体化は、本発明の精神及び範囲の中であるとみなされることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０２０，００３ (32)優先日平成８年６月21日(1996．6．21) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ワード，エリックアール. アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27705 ダーハム，モントゴメリーストリート 3003

Claims

【特許請求の範囲】 1. 植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）プロモーター又はその機能的に同等の誘導体を含む、単離されたDNA分子。 2. 植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのコード配列と天然に関連する植物のプロトックスプロモーターを含む、単離されたDNA分子。 3. 前記植物が、アラビドプシス(Arabidopsis)の種である、請求項２に記載の単離されたDNA分子。 4. 前記DNA分子が、配列番号13に記載のヌクレオチド配列、及びこれと適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする全てのDNA分子を含む、請求項３に記載の単離されたDNA分子。 5. 前記植物がトウモロコシである、請求項2に記載の単離されたDNA分子。 6. 前記DNA分子が、配列番号14に記載のヌクレオチド配列、及びこれと適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする全てのDNA分子を含む、請求項５に記載の単離されたDNA分子。 7. 前記植物がテンサイである、請求項2に記載の単離されたDNA分子。 8. 前記DNA分子が、配列番号26に記載のヌクレオチド配列、及びこれと適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする全てのDNA分子を含む、単離されたDNA分子。 9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）プロモーター又はその機能的に同等の誘導体を含む、組換えDNA分子。 10．異種DNAコード配列に作用可能に連結された植物プロトックスプロモーターを含む、キメラ遺伝子。 11．前記植物プロトックスプロモーターが、プロトックス-1遺伝子に由来する、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 12．前記植物プロトックスプロモーターが、プロトックス-2遺伝子に由来する、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 13．前記プロトックスプロモーターが、アラビドプシス、ダイズ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草及びコメからなる群から選択された植物に由来する、請求項10 に記載のキメラ遺伝子。 14．前記プロモーターが、アラビドプシス、テンサイ及びトウモロコシからなる群から選択された植物に由来する、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 15．前記プロモーターが、アラビドプシス及びトウモロコシからなる群から選択された植物に由来する、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 16．前記プロモーターが、テンサイに由来する、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 17．前記プロモーターが、少なくとも300個のヌクレオチドの長さである、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 18．前記プロモーターが、少なくとも500個のヌクレオチドの長さである、請求項17に記載のキメラ遺伝子。 19．前記プロモーターが、アラビドプシスに由来し、かつ前述の配列番号13に記載の配列を有する、請求項11のキメラ遺伝子。 20．前記プロモーターが、トウモロコシに由来し、かつ前述の配列番号14に記載の配列を有する、請求項11のキメラ遺伝子。 21．前記プロモーターが、テンサイに由来し、かつ配列番号26に記載の配列を有する、請求項11に記載のキメラ遺伝子。 22．前記異種コード配列が、植物酵素の修飾された除草剤-抵抗性型をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 23．前記植物酵素が、イミダゾールグリセロールリン酸デヒラターゼ(IGPD)、 5-エノルピルビルシキメート-3-リン酸シンターゼ(EPSP)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アセトラクテートシンターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロックス）からなる群から選択された、請求項22に記載のキメラ遺伝子。 24．前記植物酵素がプロトックスである、請求項23に記載のキメラ遺伝子。 25．前記植物酵素がアミノ酸置換を有する真核生物のプロトックスであり、このアミノ酸置換が、プロトックス阻害剤に対する抵抗性をもたらす特性を有する、請求項23に記載のキメラ遺伝子。 26．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性又はプロトックス-2活性を有するアラビドプシス種由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 27．前記タンパク質が、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載のキメラ遺伝子。 28．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性又はプロトックス-2活性を有するトウモロコシ由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 29．前記タンパク質が、配列番号６又は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項28に記載のキメラ遺伝子。 30．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性を有するコムギ由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 31．前記タンパク質が、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む、請求項30に記載のキメラ遺伝子。 32．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性を有するダイズ由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 33．前記タンパク質が、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む、請求項32に記載のキメラ遺伝子。 34．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性を有する綿花由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 35．前記タンパク質が、配列番号16に記載のアミノ酸配列を含む、請求項34に記載のキメラ遺伝子。 36．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性を有するテンサイ由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 37．前記タンパク質が、配列番号18に記載のアミノ酸配列を含む、請求項36に記載のキメラ遺伝子。 38．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性を有するアブラナ由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 39．前記タンパク質が、配列番号20に記載のアミノ酸配列を含む、請求項38に記載のキメラ遺伝子。 40．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性を有するコメ由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 41．前記タンパク質が、配列番号22に記載のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載のキメラ遺伝子。 42．前記異種DNA分子が、プロトックス-1活性を有するモロコシ由来のタンパク質をコードしている、請求項10に記載のキメラ遺伝子。 43．前記タンパク質が、配列番号24に記載のアミノ酸配列を含む、請求項42に記載のキメラ遺伝子。 44．請求項９に記載の組換えDNA分子を含む組換えDNAベクター。 45．請求項10〜43のいずれか1項に記載のキメラ遺伝子を含む組換えベクターであって、植物体、植物種子、植物組織又は植物細胞へ安定して形質転換されることが可能である組換えベクター。 46．請求項10〜43のいずれか1項に記載のキメラ遺伝子を含む植物組織。 47．請求項10〜43のいずれか1項に記載のキメラ遺伝子を含む植物体及びその後代。 48．前記植物が、アラビドプシス、サトウキビ、ダイズ、オオムギ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草及び飼草、アワ及びコメからなる群から選択される、請求項 47に記載の植物。 49．前記植物が、アラビドプシス、ダイズ、綿花、タバコ、テンサイ、油料種子ナタネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、芝草、及びコメからなる群から選択される、請求項47に記載の植物。 50．除草剤に対する耐性をもたらすために、植物において、除草剤標的タンパク質の除草剤抵抗型を発現するための、プロトックスプロモーターの使用。 51．未修飾の植物プロトックスタンパク質の阻害剤に対し抵抗性である除草剤抵抗性植物プロトックスタンパク質を発現するための、請求項25のキメラ遺伝子の使用。 52．注目のプロモーターに結合した、プロトックスコード配列にハイブリダイズするために十分な相同性を共有するプロトックスコード配列のプローブとしての使用。 53．前述のプローブとして使用されるコード配列が、注目のプロトックスプロモーターと同種の植物に由来し、かつ該プロモーターに天然に関連するコード配列である、請求項52に記載のプロトックスコード配列の使用。 54．下記の工程を含む、プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分及びプロトックスタンパク質をコードしているDNA部分を有するDNA分子の製造法： (a) 植物のプロトックス遺伝子又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブを調製する工程、ここで該プローブが、少なくとも 10個のヌクレオチドの長さで植物由来の、プロトックスタンパク質のコード配列の隣接部分を含む； (b) 工程(a)に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選択された生物由来のクローニングされたゲノムDNA断片又はcDNA断片の集団を、別のプロトックスコード配列についてプローブする工程；及び (c) プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分及びプロトックスタンパク質をコードしているDNA部分を有するDNA分子を、単離し、そして増幅する工程。 55．下記の工程を含む、プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有するDNA分子の製造法： (a) 植物のプロトックス遺伝子又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブを調製する工程、ここで該プローブが、少なくとも 10個のヌクレオチドの長さで植物由来の、プロトックスタンパク質のコード配列の隣接部分を含む； (b) 工程(a)に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選択された生物由来のクローニングされたゲノムDNA断片又はcD NA断片の集団を、別のプロトックスコード配列についてプローブする工程；及び (c) プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有するDNA分子を、単離し、そして増幅する工程。 56．下記の工程を含む、いずれかの植物の、プロトックス遺伝子由来のプロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有するDNA分子を単離する方法： (a) 植物のプロトックス遺伝子又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブを調製する工程、ここで該プローブが、少なくとも 10個のヌクレオチドの長さで植物由来の、プロトックスタンパク質のコード配列の隣接部分を含む； (b) 工程(a)に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、選択された生物由来のクローニングされたゲノムDNA断片又はcDNA断片の集団を、別のプロトックスコード配列についてプローブする工程；及び (c) プロトックスプロモーター配列を含むDNA部分を有するDNA分子を単離する工程。 57．前述の請求項10から25のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を含む遺伝子導入植物又はその後代を、植物において除草剤標的タンパク質の除草剤抵抗型を示すのに十分な量で用い、該除草剤に対する耐性をもたらす、農業的方法。 58．更に前記DNA分子に作用可能に連結されたシグナル配列を含む、請求項10 に記載のキメラ遺伝子であって、該シグナル配列が、クロロプラストへの、該DN A分子によってコードされたタンパク質の標的化を可能にする、キメラ遺伝子。 59．更に前記DNA分子に作用可能に連結されたシグナル配列を含む、請求項10 に記載のキメラ遺伝子であって、該シグナル配列が、ミトコンドリアへの、該DNA分子によってコードされたタンパク質の標的化を可能にする、キメラ遺伝子。 60．前記植物酵素が、イミダゾールグリセロールリン酸デヒラターゼ(IGPD)、 5-エノルピルビルシキメート-3-リン酸シンターゼ(EPSP)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アセトラクテートシンターゼ、及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）からなる群から選択される、請求項22に記載のキメラ遺伝子。 61．前記DNA分子が、配列番号13に記載のヌクレオチド配列を含み、かつ全てのDNA分子が、下記の条件下で、これとハイブリダイズされている、請求項３に記載の単離されたDNA分子： (a) ７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO₄pH7.0、1mM EDTA中、5 0℃でのハイブリダーゼーション；及び (b) ２×SSC、１％ SDS、50℃での洗浄。 62．前記DNA分子が、配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含み、かつ全てのDNA分子が、下記の条件下で、これとハイブリダイズされている、請求項５に記載の単離されたDNA分子： (a) ７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO₄ pH7.0、1mM EDTA中、5 0℃でのハイブリダーゼーション；及び (b) ２×SSC、１％ SDS、50℃での洗浄。 63．前記DNA分子が、配列番号26に記載のヌクレオチド配列を含み、かつ全てのDNA分子が、下記の条件下で、これとハイブリダイズされている、請求項７に記載の単離されたDNA分子： (a) ７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO₄ pH7.0、1mM EDTA中、5 0℃での、ハイブリダーゼーション；及び (b) ２×SSC、１％ SDS、50℃での洗浄。