JPH10510149A - 植物組織における高められたビオチン生合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物ビオチン生合成経路における１種またはそれ以上の酵素のレベルが高められる時、植物内のビオチン生合成が高められることを示している。この事実に基づいて、植物組織における１種またはそれ以上のビオチン生合成酵素のレベルを高める方法は、植物組織におけるビオチンの高められたレベルを達成するための手段として提供される。特に、ビオチン生合成酵素を発現することができるキメラ遺伝子を植物組織内に導入することによるビオチンレベルを高める方法が提供される。従って、高められたレベルのビオチンを有する完全な植物体を包含するトランスジェニック植物組織もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 植物組織における高められたビオチン生合成 本発明は一般的には、ヒトおよび動物のための食糧源としての植物の栄養学的 価値を高める方法に関する。特に、本発明は植物および植物組織において高めら れたビタミンＨ産生を達成するための遺伝子操作技術の適用に関するものである 。 ビタミンＨ（ビタミンＢ₇，ビオチン）は全ての生物体のための必須の栄養素 である（Eisenberg，M.A.，Adv．Enzymol．38;317-372(1973)）。それは、酵素 によるカルボキシル化、脱カルボキシル化およびトランスカルボキシル化反応の 間にカルボキシル基の転移を促進するカルボキシラーゼに共有結合する補助因子 として作用する細胞代謝の基本的な成分である（Knowles，J.R.，Ann．Rev．Bio Chem．58: 195-221(1989)）。ビタミンＨの天然に生じるｄ異性体の化学構造は 以下のとおりである： ビオチン生合成は微生物において、主としてビオチン栄養要求性突然変異体の 単離および特徴づけを通して広 く研究されてきた（Eisenberg,同上）。この研究により、前駆体ピメロイルＣｏ Ａからビオチンの生合成のための大腸菌（E．coli）およびその他の微生物に共 通な４つの酵素段階が解明された（Eisenberg,同上; Pai，C.H., Canad．J．Mic robiol．15: 21-26(1969); del Campillo-Campbell 等，J．Bacteriol．94: 206 5-2066(1967)）。bioC（配列番号：１１）またはbioH遺伝子のいずれかを欠失し ている２種類の大腸菌突然変異体の分析は、これらの遺伝子の産物がビオチン合 成において役割を果たしているが、ピメロイルＣｏＡ以前の段階であることを示 唆している。ビオチンの生合成経路における共通の酵素段階は図１（Fig１）に 示されている。 この共通なビオチンの生合成経路における第１段階はピメロイルＣｏＡおよび Ｌ−アラニンから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（ＫＡＰ）の合成である。 この段階は、大腸菌においてbioF遺伝子によりコードされているＫＡＰシンター ゼとして知られている酵素により触媒される（Eisenberg,同上）。この遺伝子は 、クローン化されそして配列決定されている大腸菌ビオチンオペロンの一部であ る（Otsuka，A.J.等，J．Biol．Chem．263:19577-19585(1988)；ジーンバンク受 領番号Ｊ０４４２３）。 上記の共通なビオチンの生合成経路における第２段階はＫＡＰの７，８−ジア ミノペラルゴン酸（ＤＡＰ）への変換である。この段階は、bioA遺伝子によりコ ードさ れるＤＡＰアミノトランスフェラーゼとして知られている酵素により触媒される （Eisenberg およびStoner，Methods in Enzymology 62: 342-347，McCormickお よびWright編，Acad．Press 刊，NY(1979); Stoner およびEisenberg，J．Biol ．Chem．250:4037-4043(1975); StonerおよびEisenberg，J．Biol．Chem．250:4 029-4036(1975); Eisenberg,同上; Eisenberg およびStoner，J．Bacteriol．10 8: 1135-1140(1971); Pai，C.H.，J．Bacteriol．105:793-800(1971)）。bioA遺 伝子はまたクローン化されそして配列決定されている大腸菌ビオチンオペロンの 一部である（Otsuka，A.J.等，同上；ジーンバンク受領番号Ｊ０４４２３）。 上記の共通なビオチンの生合成経路における第３段階はＤＡＰのデスチオビオ チンへの変換である。この段階は、bioD遺伝子によりコードされるデスチオビオ チンシンテターゼとして知られている酵素により触媒される（Eisenberg，M.A. ，Ann．N.Y．Acad．Sci．447:335-349(1985); Cheeseman およびPai，J．Bacter iol．104:726-733(1970); Eisenberg およびKrell，J．Biol．Chem．244:5503-5 509(1969); Pai，C.H.，J．Bacteriol． 99:696-701(1969)）。bioD遺伝子はま たクローン化されそして配列決定されている大腸菌ビオチンオペロンの一部であ る（Otsuka，A.J.等，同上；ジーンバンク受領番号Ｊ０４４２３）。 上記の共通なビオチンの生合成経路における最終段階 はデスチオビオチンへの硫黄の付加および引き続く閉環によるビオチンの形成を 包含する。これらの段階は、bioB遺伝子によりコードされるビオチンシンターゼ として知られている酵素により触媒される（Eisenberg，M.A., Ann．N.Y．Acad ．Sci．447:335-349(1985); Pai，C.H.，J．Bacteriol．112: 1280-1287(1972) ）。 植物細胞におけるビオチン生合成経路もまた解明されている（Baldet，P.等， Eur．J．BioChem 217:479-485(1993)）。この経路は２つの付加的な経路を有し 、上記の全ての微生物に共通な経路に非常に類似している。第一に、植物におけ る経路はピメリン酸のピメロイルＣｏＡへの変換を包含する。この段階はピメロ イルＣｏＡシンテターゼとして知られている酵素により触媒される。この段階は また、全てに共通ではないかもしれないが、多数の微生物において起こり得る（ Gloeckler，R．等，Gene 87:63-70(1990): Eisenberg，M.，“Escherichia coli and Salmonella typhimurium．Cellular and Molecular Biology”，pp.544-55 0，Neidhardt，F.C．等編，Amer．Soc．Microbiol．刊，N.Y．(1987); Izumi，Y .等，Methods in Enzymology 62: 327-330，McCormickおよびWright編，Acad．P ress 刊，NY(1979); Izumi，Y.等，BioChem．Biopys．Acta 264:210-213(1972) ）。 第二に、デスチオビオチンのビオチンへの変換は中間体化合物９−メルカプト デスチオビオチンの創生を包含する（Baldet等，同上）。この中間体は微生物に おいて も起こり得るが、これは該生物におけるデスチオビオチンのビオチンへの変換が 完全に理解されておらず、そしてこの化合物が大腸菌bioB突然変異体の増殖を支 持するであろうことによる（Baldet等，同上）。上記中間体の存在は、ビオチン シンターゼの他に、デスチオビオチンのビオチンへの変換に包含され得る別の酵 素を示す。 植物およびいくつかの菌類以外の高等真核生物に対して、ビタミンＨは食餌の 一部でなければならない必須ビタミンである。動物におけるビタミンＨの欠乏は 成長速度の低下、脱毛症（体毛脱落）、鱗状皮膚炎、ならびに脚の浮腫および紅 斑等の多数の悪影響を有し得る（Nutritional Reviews 48: 352-355(1990): Kop inski，J.S.等，J．Nutrition 62: 751-759(1989); Poultry Science 67:590-59 5(1988); Marshall，M.W.，Nutirition Today 22-23:26-29(1987)）。ヒトにお いて、ビタミンＨ欠乏はまた、多くの先天的および後天的疾病と関連している（ Marshall，M.W.，同上）。 一般に、植物をベースとする食餌はビタミンＨの十分な食糧源として機能する のに足りる該ビタミンを含有しない。このことは特に飼育動物、例えばブタおよ びニワトリに対して当てはまる（Frigg，M.，Poultry Science 63:750-753(1983 )）。通常の食餌へのビタミンＨ補給により多数の生産動物において状況の改善 が観察された（Kopinski，J.S.等，British Journal of Nutrition 62:751-789 ）。結果として、追加のビタミンＨが多くの 動物の食餌中に食糧補給として配合される（Robel，E.J.，Poultry Science 70: 1716-1722(1991)）。 植物においてビオチン産生を増加させることができたならば、植物以外の供給 源からの動物およびヒトの食餌に追加のビタミンＨの必要性が減るか、または無 くなる。しかしながら、残念なことに、植物におけるこの経路またはその制御に ついて、植物内でのビオチン産生を増加させる目的を達成する程度に十分には知 られていない。 考えられ得るビオチン産生増加のための一つの試みはビオチン生合成経路にお ける中間体または酵素のレベルを変えることである。しかしながら、利用可能な 経路中間体および酵素のレベルに生じ得る変動にもかかわらず代謝産物合成が安 定に保持されるように代謝経路は典型的には強固に制御されるので、上記の試み は役立つことが期待されないであろう。代謝産物合成の制御は種々の機構を包含 し得る。微生物において代謝産物合成を制御するために使用される機構の古典的 な例は異化生成物抑制および酵素誘導（Dickson 等，Science 187:27-35(1975) 、フィードバック阻害（Stryer，L.，“Biochemistry”，2nd ed.，W.H.Freeman and Co.刊，San Francisco， pp.500-503(1981)）、減毒（Wu，A.およびPlatt T.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S．75: 5442（1978））および全体制御（M．Wol fner等，J．Mol．Biol．96: 273-290）を包含する。これらの機構のいくつかま たは全てはまた、植物における代謝経路制御に包含され得る。これ らの経路はさまざまな機構により堅固に典型的には制御されるので、ある経路に おける１つの酵素の量の増加がもしあるとしても、合成される最終生成物（代謝 産物）の最終的レベルへの上記増加の影響は予期できない。 本発明は植物ビオチン生合成経路における１またはそれ以上の酵素活性のレベ ルを単に増加させることにより植物におけるビタミンＨレベルが増加し得るとい う発見に基づいている。本発明者はこの発見をビタミンＨの食糧源としての栄養 学的価値を高めるために植物において産生されるビオチンのレベルを増加させる ための一般的試みを開発するために利用した。 従って、一つの方法が、植物ビオチン生合成経路において酵素を発現し得る植 物にキメラ遺伝子を導入することにより、該植物におけるビタミンＨレベルを増 加させるために提供される。本発明のこの面に従って発現され得る酵素はピメロ イルＣｏＡシンテターゼ、ＫＡＰシンテターゼ、ＤＡＰアミノトランスフェラー ゼ、デスチオビオチンシンテターゼおよびビオチンシンターゼを包含するが、こ れらに限定されない。本発明によれば、キメラ遺伝子は非植物源、例えば微生物 （例としてバクテリア）からの酵素をコードしてもよいが、植物源からの酵素が 好ましい。本発明のこの面に従って、植物ビオチン生合成経路において１より多 い酵素をコードする多重キメラ遺伝子が植物内に導入されてビタミンＨレベルの より大きな増加を達成し得る。 本発明の別の面において、高められたビタミンＨレベルを有する、植物、種子 および培養組織等のトランスジェニック植物組織が提供され、該植物組織はピメ ロイルＣｏＡシンテターゼ、ＫＡＰシンテターゼ、ＤＡＰアミノトランスフェラ ーゼ、デスチオビオチンシンテターゼおよびビオチンシンターゼを包含するが、 これらに限定されない、植物ビオチン生合成経路において酵素を発現する１また はそれ以上のキメラ遺伝子を含有する。上記植物組織はビタミンＨの改良された 食糧源として使用され得る。 本発明のいくつかの面は本願の図１ないし３にさらに記載されている。 図１：ビオチンの生合成における酵素段階（Fig１） 図１はビオチンの共通な生合成経路をまとめて示す。 ボールドフェースの大文字は以下の化学構造を示す： Ａ…ピメロイル補酵素Ａ Ｂ…アラニン Ｃ…７−ケト−８−アミノペラルゴン酸 Ｄ…７，８−ジアミノペラルゴン酸 Ｅ…デスチオビオチン Ｆ…９−メルカプトデスチオビオチン Ｇ…ビオチン ローマ数字は以下の酵素活性を示す： Ｉ…ＫＡＰシンテターゼ（bioF） II…ＤＡＰアミノトランスフェラーゼ（bioA） III…デスチオビオチンシンテターゼ（bioD） IV…ビオチンシンターゼ（bioA） 図２：ｐＣＩＢ２００／１７６１bioAのＴ−ＤＮＡ領域（Fig２） 大腸菌bioA遺伝子が１．３ｋｂEcoRI 断片として、プラスミドｐＣＧＮ１７６ １の二重３５Ｓプロモーター（２×３５Ｓ）とｔｍ１ターミネーター（ｔｍ１３ ’）の間にクローン化された。４．３ｋｂXbaI発現カセットが次いで、左側境界 （ＬＢ）と右側境界（ＲＢ）Ｔ−ＤＮＡ配列の間のノパリンシンターゼプロモー ター（ｎｏｓ）およびターミネーター（ｎｏｓ３’）に機能的に連結されている カナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ５ｎｅｏ）を含有するプラスミドｐＣＩＢ２００ のXbaI部位中にクローン化された。転写の方向は水平な矢印により示される。制 限認識部位XbaI（Ｂ）、XhoI（Ｘ）およびEcoRI（Ｅ）は垂直な矢印によりそれ らのおよその位置に示されている。 図３：大腸菌ＢｉｏＢタンパク質とアラビドプシス（Arabidopsis）ＢｉｏＢ ｃＤＮＡクローンＮＲＲＬ Ｂ−２１３９８によりコードされるタンパク質との 比較 図３にはアラビドプシス（Ａ．ｔ．）ＢｉｏＢ ｃＤＮＡによりコードされる 推定アミノ酸配列（配列番号：１４）と大腸菌（Ｅ．ｃ．）ＢｉｏＢアミノ酸配 列（配列番号：８）との比較が示されている。 本発明は植物組織におけるビオチン生合成を高めるた めの一般的な試みを提供し、それによりビタミンＨの食糧源としてのそのような 組織の栄養学的価値を高める。本発明に従って、植物組織におけるビタミンＨの 量は該組織に存在する１またはそれ以上のビオチン生合成酵素の量を増加させる ことにより高められ得る。 本発明のために、「植物組織」という用語は植物、種子、それらの後代、培養 植物細胞および植物起源のあらゆるその他の組織を包含することが意図される。 本発明のために「ビオチン生合成酵素」は植物内でピメリン酸のビオチンへの 変換のために必要とされる１またはそれより多い段階を触媒する酵素として定義 される。ビオチン生合成酵素はピメロイルＣｏＡシンテターゼ、ＫＡＰシンテタ ーゼ、ＤＡＰアミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、デス チオビオチンシンテターゼを９−メルカプトデスチオビオチンに変換する酵素、 ９−メルカプトデスチオビオチンをビオチンに変換する酵素（少なくとも２つの 酵素変換段階がビオチンシンターゼと呼ばれるものと同じ酵素により実際に触媒 され得る）を包含するが、これらに限定されない。ビオチン生合成酵素およびそ れらをコードする遺伝子の天然供給源は植物および微生物を包含する。 植物または植物細胞中に存在するビオチン生合成酵素の量はあらゆる適当な手 段を用いて増加させることができる。特にこれは、植物細胞または組織中にビオ チン生合成酵素を発現し得るキメラ遺伝子を植物または植物細 胞中に形質転換し、それによって導入することにより行われ得る。そのようなキ メラ遺伝子は、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルが続くビオチ ン生合成酵素をコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結されている、植物内で遺 伝子発現を制御することができるプロモーターを含有する。 大腸菌、バチラス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）、バチラス・サ ブチリス（Bacillus subtilis）およびセラチア・マルセッセンス（Serratia ma rcescens）からのビオチン生合成酵素をコードするＤＮＡ分子が一般的に利用可 能である（１９９２年３月１７日にGloeckler 等に発行された米国特許第５０９ ６８２３号；Otsuka，A.J.等，J．Biol．Chem．263(36): 19577-19585(1988)；B ower，S.G．等による１９９５年１月２５日に公開番号第６３５５７２号として 公開された欧州特許出願第９４１０８９９８．９号；Sakurai，N．等，J．Biote ch．36: 63-73(1994)参照；またセラチア・マルセッセンスビオチンオペロン配 列に対するジーンバンク受領番号Ｄ１７４６８参照）。ＫＡＰシンテターゼに対 する大腸菌コード配列および相当するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１およ び２に示されている。ＤＡＰアミノトランスフェラーゼに対する大腸菌コード配 列および相当するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３および４に示されている 。デスチオビオチンシンテターゼに対する大腸菌コード配列および相当するアミ ノ酸配列は それぞれ配列番号：５および６に示されている。ビオチンシンターゼに対する大 腸菌コード配列および相当するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：７および８に 示されている。bioC遺伝子に対する大腸菌コード配列および相当するアミノ酸配 列はそれぞれ配列番号：１１および１２に示されている。bioC遺伝子は、ピメロ イルＣｏＡおよびＬ−アラニンから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（ＫＡＰ ）の、ＫＡＰシンテターゼとして知られている酵素により触媒される合成に先立 つ段階でビオチン生合成に関与するタンパク質をコードする。 ビオチン生合成酵素をコードするＤＮＡ分子はあらゆる所望の植物種から標準 的な分子生物学的技術の適用により単離され得る。他の代謝経路における様々な 生合成遺伝子をより高等な真核生物から単離するために成功裏に使用されてきた 一つの適当な試みは当該活性を欠いている微生物突然変異体の相補性である（例 えば参照によりその全体が本明細書に編入されるＷＯ９４／２６９０９（ヒスチ ジン生合成遺伝子）；Frisch等，Mol．Gen．Genet．228: 287(1991)(リジン生合 成遺伝子)；Aimi等，J．Biol．Chem．265: 9011（1990）（プリン生合成遺伝子 ）；およびNiyogi等，Plant Cell 5: 1011（1993）（トリプトファン生合成遺伝 子）参照）。この試みのために、当該植物からのｃＤＮＡのライブラリーが、微 生物宿主内でｃＤＮＡの発現を誘導し得るベクターにクローン化される。ベクタ ーは次に当該活性を欠いてい る微生物に形質転換されるか、または導入され、そして表現型ではもはや突然変 異体ではないコロニーが選択される。種々のビオチン生合成酵素活性を欠いてい る適当な微生物宿主生物がこの方法が使用される分野で容易に利用可能である（ del Campillo-Campbell 等，J．Bacteriol．94: 2065-2066(1967); Pai，C.H.， Canad．J．Micriobiol．15:21-26(1969); ClearyおよびCampbell，J．Bacteriol ．112:830-839(1972)）。 また、ビオチン生合成酵素のための植物または他の微生物コード配列は、公知 微生物のビオチン生合成コード配列に対する配列相同性に基づいて十分に公知の 方法に従って単離され得る。これらの技術において、公知ビオチン生合成コード 配列の全てまたは一部は、選択された植物からのクローン化ゲノムＤＮＡ断片ま たはｃＤＮＡ断片の集団（すなわちゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）内に存 在する相当するビオチン生合成コード配列に選択的にハイブリッド形成するプロ ーブとして使用される。そのような技術は平板培養ＤＮＡライブラリーのハイブ リッド形成スクリーニング（プラークまたはコロニー；例えばSambrook等，Mole cular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press 編，(1989)参照）およ び特定のビオチン生合成酵素の公知アミノ酸配列中に保存された配列ドメインに 相当するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによる増幅（例えばIn nis 等，PCR Protocols，a Guide to Methods and Applications ，Academic Press編，(1990)参照）を包含する。 ビオチン生合成酵素に対するコード配列は特定の栽培植物における最適な発現 のために遺伝子操作され得る。特定の栽培種における最適発現を達成するために コード配列を変更する方法はよく知られている（例えばPerlak等，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 88:3324(1991); Koziel 等，Bio/technol．11:194(1993)参照） 。 ビオチン生合成酵素をコードするＤＮＡ配列は標準的な遺伝子操作技術を使用 して本発明に係るキメラ遺伝子を構築するための植物用に設計された発現カセッ ト中に挿入されてもよい。特定の制御配列、例えば選択された植物宿主内での発 現の望ましいパターンおよび発現レベルを達成するのに適したプロモーター、シ グナル配列、５’および３’非翻訳配列およびエンハンサーの選択は当該分野で はルーチンワークの程度である。適当な読み枠内に連結された個々の要素（エレ メント）を含有する生成分子は宿主植物細胞内に形質転換され得るベクター中に 挿入されてもよい。 植物または植物細胞内で機能し得るプロモーターの例（すなわち関連異種コー ド配列の発現を駆動し得るもの，例として植物細胞内でビオチン生合成酵素をコ ードするもの）はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓまたは３５ ＳプロモーターおよびＣａＭＶ二重プロモーター；ノパリンシンターゼプロモー ター；病原関連（ＰＲ）タンパク質プロモーター；リブロースビスホス フェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓｕＲＵＢＩＳＣＯ）プロモー ター等を包含する。イネアクチンプロモーター（McElroy等，Mol．Gen．Genet． 231:150(1991)）、トウモロコシユビキチンプロモーター（ＥＰ０３４２９２６ ；Taylor等，Plant Cell Rep．12：491(1993)）およびタバコ、アラビドプシス またはトウモロコシからのＰＲ−１プロモーター（参照によりその全体が本明細 書に編入されるＥＰ−Ａ−３３２１０４およびＷＯ９５／１９４３３参照）が好 ましい。Kay 等，Science 236:1299-1302(1987)に記載されるような３５Ｓプロ モーターおよび高められた、または二重３５Ｓプロモーター、および参照により その全体が本明細書に編入される関連文献ＥＰ−Ａ−３９２２２５に開示されて いる、ＡＴＣＣ４０５８７として寄託されたｐＣＧＮ２１１３中にクローン化さ れた二重３５Ｓプロモーターが好ましい。プロモーター自体は当該分野で認識さ れている技術に従って関連コード配列の発現を高めるためにプロモーター強度を 操作するために変更され得る。本発明に使用するための好ましいプロモーターは 高レベルの構造性発現を付与するものであり、またより好ましくは動物またはヒ トの食料中に配合される組織に特異的高レベル発現を付与するものである。 シグナルまたは移送（トランジット）ペプチドは、所望の作用部位への発現さ れたＢＢＥの移送を導くために、本発明のキメラＤＮＡ構築物においてＢＢＥコ ード配列 に操作可能に融合され得る。これは使用されるビオチン生合成酵素が植物起源で はなく、微生物、例えばバクテリアからクローン化された場合に重要であり得る 。シグナルペプチドの例は植物病原関連タンパク質、例えばＰＲ−１，ＰＲ−２ 等に天然に連結されたものを包含する。例えばPayne 等，Plant Mol．Biol．11: 89-94(1988)参照。移送ペプチドの例は葉緑体移送ペプチド（トランジットペプ チド，導入ペプチド）、例えばVon Heijne等，Plant Mol．Biol．Rep．9;104-12 6(1991); Mazur 等，Plant Physiol．85:1110(1987); Vorst等，Gene 65:59（19 88）に記載されたもの、およびミトコンドリア移送ペプチド、例えばBoutry等， Nature 328: 340-342(1987)に記載されたものを包含する。コードされたタンパ ク質の種々の細胞画分、例えば液胞への局在化を導く配列もまた包含される。例 えばNeuhaus 等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:10362-10366(1991)およびChr ispeels，Ann．Rev．Plant．Physiol．Plant．Mol．Biol．42: 21-53(1991)参照 。これら刊行物の関連する開示は参照によりその全体が本明細書に編入される。 本発明のキメラＤＮＡ構築体はプロモーターの多数のコピーまたはビオチン生 合成酵素のコード配列の多数のコピーを含み得る。さらに、構築体はマーカーの ためのコード配列およびその他のペプチド、例えばシグナルまたは移送ペプチド のコード配列を、各々ＤＮＡ分子内のその他の機能的要素と適当な読み枠で包含 し得る。その ような構築体の調製は当該分野の通常の技術レベルである。 有用なマーカーは除草剤、抗生物質または薬剤耐性、例えばハイグロマイシン 、カナマイシン、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、リンコマイシン、メトトレキセー ト、グリホセート、ホスフィノトリシン等に対する耐性を付与するペプチドを包 含する。これらのマーカーは本発明のキメラＤＮＡ構築体で形質転換された細胞 を形質転換されていない細胞から選択するために使用され得る。その他の有用な マーカーは可視反応、例えば着色反応より容易に検出され得るペプチド性酵素、 例えばルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼであ る。 植物発現のために設計されたキメラ遺伝子、例えば上記のものは当業界で認識 される多数の方法で植物細胞中に導入され得る。当業者は方法の選択が形質転換 が標的化された植物のタイプ（単子葉または双子葉植物）および／またはオルガ ネラ（すなわち核，葉緑体，ミトコンドリア）により決まることを知っている。 植物細胞を形質転換する適当な方法はマイクロインジェクション（Crossway等， Bio Techniques 4: 320-334(1986)）、エレクトロポレーション（Riggs 等，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 83:5602-5606(1986)）、アグロバクテリウム仲介形質 転換（Hinchee 等，Biotechnology 6:915-921(1988)）直接遺伝子移入（Paszkow ski等，EMBO J．3:2717 -2722(1984)）およびウイスコンシン州マジソンのAgracetus，Inc．およびデラ ウエア州ワシントンのDupont，Inc.から利用可能な装置を使用する弾道粒子加速 （ballistic particle acceleration）を包含する（例えばSanford 等，米国特 許第４９４５０５０号；およびMcCabe等，Biotechnology 6:923-926(1988)）参 照；また、Weissinger等，Annual Rev．Genet．22:421-477(1988);Sanford 等， Particulate Science and Technology 5:27-37(1987)（タマネギ）；Christou等 ，Plant Physiol．87:671-674(1988)（ダイズ）；McCabe等，Bio/Technology 6: 923-926(1988)（ダイズ）；Datta 等，Bio/Technology 8: 736-740(1990)（イ ネ）；Klein 等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:4305-4309(1988)（トウモロ コシ）；Klein 等，Bio/Technotogy 6: 559-563(1988)（トウモロコシ）；Klein 等，Plant Physiol．91：440-444(1988)（トウモロコシ）；Fromm 等，Bio/Tec hnology 8: 833-839(1990)；およびGordon-Kamm 等，Plant Cell 2: 603-618(19 90)（トウモロコシ）；Svab等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:8526-8530(199 0)（タバコ葉緑体）；Gordon-Kamm等，“Transgenic Plants"，vol.2，pp.21-33 ，Academic Press刊（1993）（トウモロコシ）参照。 ビオチン生合成酵素をコードするキメラ遺伝子が特定の植物種内に形質転換さ れたら、伝統的な育種技術を用いて、その種内で増殖させるか、または同一種の 他の品 種（変種）、特に市販の品種等に移され得る。また、ビオチン生合成酵素のコー ド配列は単離され、最適発現のために遺伝子操作され、そして次に所望の品種へ の形質転換のために使用され得る。両方の場合において、得られる品種は高レベ ルのビタミンＨを有するハイブリッド植物および種子、特にハイブリッド種子の 作出に使用され得る。 本発明はさらに、植物組織内でビオチン生合成酵素を発現し得る少なくとも１ 種のキメラ遺伝子で安定に形質転換された植物、種子および培養組織を包含する トランスジェニック植物組織に関する。そのようなキメラ遺伝子の発現はコード されたビオチン生合成酵素のレベルにおける増加を生じる。 本発明のトランスジェニック植物組織は、１またはそれ以上のビオチン生合成 酵素をコードするその中に含まれるキラメ遺伝子の発現から生じる高められたレ ベルのビタミンＨを含有する。植物組織内でビオチン生合成酵素を発現し得るキ メラ遺伝子を含むトランスジェニック植物組織に関連する「高められたレベルの ビタミンＨ（高レベルのビタミンＨ）」という表現は、相当する遺伝子のバック グランドを有する非トランスジェニック植物組織に見出されるレベルより高いビ タミンＨのレベルを意味することが意図されている。 本発明の代表的植物は動物またはヒト用の食料に配合され得るあらゆる植物を 包含する。農業経済学的に重要 な動物またはヒト用の食用作物、例えばタバコ、ダイズ、アブラナ、テンサイ、 トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、サトウモロコ シ、雑穀（キビ等，millet）、芝生(turf)、飼草（フォレージ，forage）、カノ ーラ(canola)等が好ましい。 本発明に係る植物増殖材料（果実，塊茎，穀粒，種子）および特に種子が市販 品として販売される前に、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺バクテリア剤、線虫駆除 剤、軟体動物駆除剤またはこれら化合物のいくかつの混合物からなる保護コーテ ィングで通常処理される。所望するならば、これらの化合物は、バクテリア、菌 類または動物有害生物により引き起こされる被害に対する保護を与えるために製 剤業界で慣用のその他の担体、界面活性剤または施用促進助剤と一緒に製剤化さ れる。 種子を処理するために、保護コーティングは塊茎または穀粒を液体製剤に浸漬 するか、またはそれらを混合水和剤もしくは乾燥製剤で被覆することにより、種 子に適用され得る。特別な場合において、植物への施用のその他の方法、例えば 芽または果実への直接処理が可能である。 本発明に係る植物種子はビオチン生合成酵素の産生をコードするＤＮＡ配列を 含有し、そして種子処理化合物、例えばカプタン、カルボキシン、チラム（登録 商標ＴＭＴＤ）、メタラキシル〔登録商標アプロン(Apron)〕、ピリミホス−メ チル〔登録商標アクテリック(Actellic )〕および種子処理に慣用である他のものを含有する種子保護コーティングで処 理されてもよい。ビオチン生合成酵素の産生をコードする植物増殖材料そして特 に種子を提供することが本発明の他の目的であり、該材料は種子処理において慣 用の種子保護コーティングで処理されている。 本発明は以下の詳細な実施例を参照してさらに説明される。これらの実施例は 説明の目的のみのものであり、そして特記しない限り制限を意図するものではな い。 実施例 ここで使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当業界 で十分に知られており、そしてT.Maniatis，E.F.Fritsch およびJ.Sambrook，Mo lecular Cloning: A Laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Col d Spring Harbor，NY(1982)およびT.J.Silhavy，M.L.Berman およびL.W.Enquist ，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spr ing Harbor，NY(1984)およびAusubel，F.M. M等，Current Protocols in Molecu lar Biology，Greene Publishing Assoc.およびWiley-Interscience 刊(1987)に 記載されている。 実施例１：ビオチン生合成酵素をコードするキメラ遺伝子で形質転換された植物 における高レベルのビタミンＨ 一般的に、大腸菌bioA遺伝子は、自身のビタミンＨを産生する能力を欠失して いるアラビドプシスbio1栄養要 求変異種の組織において発現された。従来の生化学による証拠は、アラビドプシ スのbio1突然変異体がbioA遺伝子によりコードされるＤＡＰアミノトランスフェ ラーゼ酵素が欠損していることを示唆していた。bioA遺伝子を発現する生成トラ ンスジェニック植物からの組織はビタミンＨの不在下で増殖するばかりでなく、 非形質転換の対照植物に比べ高レベルのビタミンＨを驚くべきことに含有してい た。これらの結果は、ビオチン生合成酵素をコードするキメラ遺伝子の発現によ り植物組織中のビタミンＨのレベルが高められ得ることを示す。本実施例のため の特定の詳細は以下に示されている。 大腸菌Ｋ１２株からのbioA遺伝子（配列番号：３）は標準的ＰＣＲプロトコル （Perkin Elmer）を用いるＡｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼで増幅された。使 用された前方向(forward)および逆方向(reverse)オリゴヌクレオチドプライマー は以下のとおりであった： 下線を付したヌクレオチドはそれぞれbioA遺伝子の５’および３’末端に相当 する。下線が付されていない塩基はEcoRI 制限認識部位GAATTCおよび８または１ ０ヌ クレオチドのスペーサーを含有する。１３７６塩基対産物はＴＡクローニングキ ット（Invitrogen; カリフォルニア州サンジエゴ）で提供されるプロトコルおよ び試薬を用いてｐＣＲＩＩベクター内に直接連結された。プラスミドＤＮＡはマ ジック・ミニプレップ・キット（Promega;ウイスコンシン州マジソン）を用いて 正確なbioA挿入物を含む細胞から調製され、次いでケイ光染料で標識されたジデ オキシターミネーター（Applied Biosystems,Inc.，カリフォルニア州フォスタ ーシティ）を用いる連鎖停止法により配列決定し、増幅およびクローン化産物の 忠実度が確認された。確認されたbioA配列を含有するプラスミドＤＮＡはEcoRI （Promega;ウイスコンシン州マジソン）で消化されて１．３ｋｂbioA挿入物が放 出され、次に１％シープラークアガロース（FMC,メイン州ロックランド）上で精 製された。このEcoRI 断片は次いでｐＣＧＮ１７６１〔二重３５Ｓプロモーター （Kay 等，Science 236:1299-1302(1987)）およびｔｍ１３’ターミネーターをE coRI 部位の両側に有する植物発現カセット〕のEcoRI 部位に連結された。この 連結混合物はエレクトロポレーション（Life Technologies;メリーランド州ガイ サースバーグ）によりＸＬ−１ブルーエレクトロコンピタント細胞（XL-1 Blue electrocompetant cell）（Stratagene; カリフォルニア州ラジョラ）中に形質 転換された。 発現のために正しい配向にあるbioA遺伝子を含んでい たプラスミドは標準的な制限分析（BamHI での）により同定された。二重３５Ｓ プロモーター、bioAコード領域およびｔｍ１３’終結配列を含有する発現ユニッ トはｐＣＧＮ１７６１から所望領域の少し外側にある制限部位を認識するXbaIで 切除された。４．９ｋｂXbaI断片は次いで二元プラスミドｐＣＩＢ２００のＴ− ＤＮＡ部分内のXbaI部位に連結された（図２を対比）。得られるプラスミドｐＣ ＩＢ２００／１７６１bioAは次にアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ag robacterium tumefaciens）ｃ５８ＧＶ３１０１株（Bechtold等，C.R Acad．Sci ．Paris．Sciences de la vie 316: 1194-1199(1993)）に標準的方法を用いるエ レクトロポレーションにより移送された。ｐＣＩＢ２００／１７６１bioA二元ベ クターを含むアグロバクテリウム細胞は真空浸透法（Bechtold等，同上）を用い てビオチン補足ホモ接合性biol／biolアラビドプシス植物体を形質転換するため に使用された。 安定な形質転換体を選択するために、浸透が行われた植物からの種子がカナマ イシンを含有する無ビオチン培地上に平板培養された。ビオチンの不在下で生長 した１つのカナマイシン耐性植物（biol／Ａ）が土壌に移植され、そして標準的 微生物アッセイ系（Scheiner，J.等，J．Agric．Food Chem．23:1157-1162(1975 )）を用いて脱水素化ビオチンアッセイ媒体（Difco;ミシガン州デトロイト）で もって全ビオチン産生がアッセイされた。対 照Ｃｏ１−０植物からの葉組織は新鮮重量ｍｇあたり全ビタミンＨ１８．１ｐｇ を含み、bio1／Ａ植物からの同齢の葉は新鮮重量ｍｇあたり全ビタミンＨ３８． ２ｐｇを産生していた。このことは、非形質転換対照植物に比べ、大腸菌bioA遺 伝子を発現する突然変異組織において産生される全ビタミンＨにおいて２倍の増 加を意味する。また、bio1／Ａ植物からのカナマイシン耐性Ｔ₂後代もまた高め られたレベルのビタミンＨを含有していた。 実施例２：追加のビオチン生合成酵素（ＢＢＥ）遺伝子の公知ＢＢＥコード配列 に対する配列相同性に基づいた単離 ファージまたはプラスミドライブラリーが１０ｃｍペトリ皿上に約１００００ プラークの濃度に平板培養され、そしてプラークのフィルターリフト（濾紙によ る吸い上げ）が３７℃でのプレートの一晩増殖後に行われる。プラークリフトが 配列番号：１、３、５、７および１１で示されるｃＤＮＡの１つとプローブ（探 針）され、プライムタイムキット（International Biotechnologies，Inc.,コネ チカット州ニューヘブン）によるライダムプライマー法により³²Ｐ−ｄＣＴＰで 標識される。ハイブリッド形成条件は５０℃での７％ドデシル硫酸ナトリウム（ ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡである。一 晩のハイブリッド形成後、フィルターは２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで洗浄される。 陽性のハイブリッド形成プラークはオートラジオグラフィー により検出される。単一プラークまでの精製後、ｃＤＮＡ挿入物が単離され、そ してそれらの配列がケイ光染料で標識されたジデオキシターミネーター（Applie d Biosystems，Inc.，カリフォルニア州フォスターシティ）を用いる連鎖停止法 により配列決定される。 上記の標準的実験プロトコルは、あらゆるその他の真核細胞、特にその他の高 等植物種からの公知ＢＢＥコード配列に実質的に相同なＢＢＥ遺伝子を得るため に当業者により使用され得る。 実施例３：バクテリア栄養要求性突然変異体の機能的相補性による植物ビオチン 生合成遺伝子の単離 一般に、ビオチン生合成酵素の一つが欠損している大腸菌の栄養要求性突然変 異体は、ｃＤＮＡから製造された発現される植物遺伝子のライブラリーで形質転 換される。植物遺伝子はバクテリア内で植物ｃＤＮＡの発現を誘導し得るファー ジミド・ベクター内で全部まとめてクローン化される。形質転換されたバクテリ アは次いでビオチンの不在下の選択条件下で増殖される。これらの条件下で増殖 するコロニーは、植物ｃＤＮＡが最初の大腸菌突然変異体には欠いている機能を 付与するので、それら自身のビオチンを合成する能力を有する。 特に、大腸菌突然変異体はビオチン生合成経路における各段階に利用可能であ る。これらの突然変異体は大腸菌ジェネティック・ストック・センター（E．col i Genetic Stock Center）（コネチカット州ニューヘブン）か ら入手され得る。バクテリアは標準技術を用いて電気的に受容能（elctrocompet ant）が与えられ、そして形質転換まで−７０℃で凍結される。 発現される植物遺伝子のプラスミドライブラリーを創生するための一般的スキ ームはまずラムダファージ中に標準的ｃＤＮＡライブラリーを構築することであ り、そして次に全体のライブラリーに関して生体内切除反応を行い、そして単一 のコロニーを得るために低濃度で平板培養することである。大腸菌コロニーはプ レートの表面から溶離され、ペレット化され、そして次にプラスミドＤＮＡを調 製するために使用される。この場合において、切除反応に続いて増殖する各コロ ニーが最初のファージ生成ライブラリーからの単一ｃＤＮＡを提示する。別の戦 略はＤＮＡストックセンター（例えばオハイオ州コロンバスのアラビドプシス・ ストックセンター）、市販品、または大学の研究機関から既に構築されたｃＤＮ Ａライブラリーを入手することである。適当なベクター内にｃＤＮＡライブラリ ーを構築するための詳細は使用されるカリフォルニア州ラジョラのStratageneか らのキットと共に供給される仕様書に記載されている。ｐブルースクリプト（pB luescript）プラスミドは挿入された植物ｃＤＮＡの発現を駆動するように配向 されたＩＰＴＧ誘導性１ａｃＺプロモーターを有する。 ｃＤＮＡライブラリーから単離されたプラスミドＤＮＡ約１００ｎｇは、ジー ン−パルサー・エレクトロポレ ーター（登録商標Gene-Pulser electroporator）（Bio-Rad Laboratories，ニュ ーヨーク州メルビル）およびキュベットを０．１ｃｍ電極間隙でもって、標準的 設定（１．７キロボルト／ｃｍを２００オームの抵抗および２５μＤの静電容量 で１０ミリセカンド）を用いてコンピテント大腸菌突然変異細胞（氷上で解凍さ れた）をエレクトロポレーション処理するために使用される。エレクトロポレー ションされた細胞は１ｍＬ ＳＯＣ（Life Technologies,メリーランド州ガイザ ースバーグ）中に再懸濁され、そして激しく攪拌しながら（ロータリーシェーカ ー上２００ｒｐｍ）３７℃で１時間保温される。胞は臨床用遠心分離機において 室温にて最大速度で５分間ペレット化される。細胞ペレットはボーゲル−ボーナ ーＥ最小培地（Vogel，H.J．およびD.M．Bonner，J.Biol．Chem．218:97-106（1 956））５ｍＬ中に再懸濁され、過剰なビオチンが洗い落とされる。ペレット化 および洗浄段階がさらに２回繰り返され、最後のペレットは最小培地１ｍＬ中に 再懸濁される。その一部１００μＬが、アンピシリン（プラスミドを選択するた め）、ＩＰＴＧ（植物遺伝子の発現を駆動するプロモーターを誘導するため）お よび大腸菌株が増殖のために必要とするビオチン以外のあらゆる栄養素（すなわ ちチアミン）を含有する最小培地を有する１．５％寒天プレート上に広げられる 。コロニーを形成するまで、プレートは３７℃で２ないし３日保温される。プラ スミドＤＮＡは、ＬＢ培 地に滅菌楊枝で拾い上げた単一コロニーを接種することにより開始した１ｍＬの 一晩培養液から単離される。上記の大腸菌栄養要求変異種を再び形質転換するこ とにより高効率ビオチン相補性に対してプラスミドが再試験される。高い効率で 相補性であるプラスミドからの挿入物はプローブとしてサザンおよびノーザンブ ロットで、遺伝子のコピー数を調べるため、および植物における発現パターンを 特徴づけるために使用され得る。 実施例４：植物形質転換ベクターの構築 多数の形質転換ベクターは植物形質転換のために利用可能であり、そしてビオ チン生合成酵素をコードする遺伝子はそのようなベクターと結合して使用され得 る。使用するベクターの選択は好ましい形質転換技術および形質転換のための標 的種に依存する。ある種の標的種にとって、異なる抗生物質または除草剤選択マ ーカーが好ましいかもしれない。形質転換において慣用の選択マーカーは、カナ マイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するnptII 遺伝子（Messing & Vierra，Gene 19:259-268(1982); Bevan 等，Nature 304: 184-187(1983)）、除 草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するbar 遺伝子（White 等，Nucl A cids Res 18:1062(1990)，Spencer等，Theor Appl Genet 79:625-631(1990)）、 抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph 遺伝子（Blochinger & D iggelmann，Mol Cell Biol．4: 2929-2931）およびメトトレキセートに対する 耐性を付与するdhfr遺伝子（Bourouis等，EMBO J．2(7)：1099-1104(1983)を包 含する。 （１）アグロバクテリウム形質転換に適当なベクターの構築 多くのベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエンスを用いる形質転換 に適している。これらは典型的には少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列を有し 、そしてベクター例えばｐＢＩＮ１９（Bevan 等，NucL Acids Res（1984））お よびｐＸＹＺを包含する。下に２種の典型的なベクターの構築が記載される。 ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築 二元ベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１はアグロバクテリウムと 共に使用するための組換えベクターの構築のために使用され、そして以下のよう に構築された。ｐＴＪＳ７５ｋａｎがｐＴＪＳ７５（Schmidhauser & Helinski ，J．Bacteriol．164: 446-455(1985)）のNarI消化により創生されてテトラサイ クリン耐性遺伝子の切除を可能にし、次にＮＰＴIIを有するｐＵＣ４Ｋ（Messin g & Vierra，Gene 19;259-268(1982); Bevan 等，Nature 304: 184-187(1983)） ；McBride 等，Plant Molecular Biology 14: 266-276(1990)）からのAccI断片 が挿入される。XhoIリンカーが、左側および右側Ｔ−ＤＮＡ境界、植物選択性no s/nptII キメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカーを含有するｐＣＩＢ７のEcoRV 断片（Rothstein 等，Gene 53:153-161(1987)）に連 結され、そしてXhoI消化断片がSalI消化ｐＴＪＳ７５ｋａｎにクローン化されて ｐＣＩＢ２００が創生された（ＥＰ０３３２１０４の実施例１９もまた参照）。 ｐＣＩＢ２００は以下のユニークポリリンカー制限部位を含有する：EcoRI，Sst I，KpnI，BglII，XbaIおよびSalI。ｐＣＩＢ２００１は追加の制限部位をポリリ ンカー内に挿入することにより創生されたｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣ ＩＢ２００１のポリリンカー内のユニーク制限部位はEcoRI，SstI，KPnI，BglII ，XbaI，SalI，MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaIおよびStuIである。ｐＣＩＢ２ ００１はこれらのユニーク制限部位を含む他に、植物およびバクテリアカナマイ シン選択、アグロバクテリウム仲介形質転換のための左側および右側Ｔ−ＤＮＡ 境界、大腸菌と他の宿主との間の移動のためのＲＫ２−誘導trfA機能、およびＲ Ｋ２からのOriTおよびOriV機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーはそれ ら自身の制御シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適している。 ｐＣＩＢ１０およびそれらのハイグロマイシン選択誘導体の構築 二元ベクターｐＣＩＢ１０は植物内での選択のためのカナマイシン耐性をコー ドする遺伝子、Ｔ−ＤＮＡ右側および左側境界配列を含有し、そして大腸菌とア グロバクテリウムの両方での複製を可能にする広い宿主範囲のプラスミドｐＲＫ ２５２からの配列を内包する。その構 築はRothstein 等，Gene 53:153-161(1987)に記載されている。Gritz 等，Gene 25:179-188(1983)に記載されるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの ための遺伝子を内包するｐＣＩＢ１０の種々の誘導体が構築されている。これら の誘導体はハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）またはハイグロマイシンお よびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５，ｐＣＩＢ７１７）でトランスジェニック植 物細胞の選択を可能にする。 （２）非アグロバクテリウム形質転換に適するベクターの構築 アグロバクテリウム・チュメファシエンスを使用しない形質転換は選択された 形質転換ベクター中にＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、そして結果的に、これ らの配列を欠失しているベクターがＴ−ＤＮＡ配列を含む上記もの等のベクター の他に利用され得る。アグロバクテリウムを利用しない形質転換技術は粒子打ち 込み、プロトプラスト取込み（例えばＰＥＧおよびエレクトロポレーション）お よびマイクロインジェクションによる形質転換を包含する。ベクターの選択は形 質転換される種の好ましい選択に大きく依存している。以下にいくつかの典型的 なベクターの構築が記載される。 ｐＣＩＢ３０６４の構築 ｐＣＩＢ３０６４は除草剤バスタ（ホスフィノトリシン）による選択と組み合 わせられる直接遺伝子移入技術に適当なｐＵＣ誘導ベクターである。プラスミド ｐＣＩ Ｂ２４６はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを大腸菌ＧＵＳ遺伝子およびＣａＭＶ３ ５Ｓ転写ターミネーターに操作可能に融合されて含有し、そして国際出願公開Ｗ Ｏ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは開 始部位の２つのＡＴＧ配列５’を含有する。これらの部位は、ＡＴＧを除去し、 かつ制限部位SspIおよびPvuII を生成するように、標準的ＰＣＲ技術を用いて突 然変異された。新しい制限部位はユニークSalI部位から９６ｂｐおよび３７ｂｐ 離れ、そして実際の開始部位から１０１ｂｐおよび４２ｂｐ離れていた。ｐＣＩ Ｂ２４６の得られる誘導体はｐＣＩＢ３０２５と表記された。ＧＵＳ遺伝子は次 にSalIおよびSacIでの消化によりｐＣＩＢ３０２５から切り出され、末端がブラ ント化され、そして再び連結してプロモーターｐＣＩＢ３０６０が創生された。 プラスミドｐＪＩＴ８２はノーウイッチのJohn Innes Centre から入手され、そ してストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogen es）からbar 遺伝子を含有する４００ｂｐSmaI断片が切り出され、そしてｐＣＩ Ｂ３０６０のHpaI部位に挿入された（Thompson等，EMBO J．6:2519-2523(1987) ）。これにより、除草剤選択のためのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミ ネーターの制御下にあるbar 遺伝子、アンピシリン耐性のための遺伝子（大腸菌 における選択）およびユニーク部位SPhI，PstI，HindIII およびBamHI を有する ポリリンカーを含有するｐＣ ＩＢ３０６４が創生された。このベクターはそれ自身の制御シグナルを含む植物 発現カセットのクローニングに適している。 ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築 ｐＳＯＧ３５はメトトレキセートに対する耐性を付与する選択マーカーとして 大腸菌遺伝子ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）を利用する形質転換ベ クターである。ＰＣＲは３５Ｓプロモーター（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡ ｄｈ１遺伝子からのイントロン６（〜５５０ｂｐ）およびｐＳＯＧ１０からのＧ ＵＳ非翻訳リーダー配列１８ｂｐを増幅するために使用された。大腸菌ジヒドロ ホレートレダクターゼII型遺伝子をコードする２５０ｂｐ断片もまたＰＣＲによ り増幅され、そしてこれら２つのＰＣＲ断片は、ｐＵＣ１９ベクター骨格および ノパリンシンターゼターミネーターを含有するｐＢＩ２２１（Clontech）からの SacI−PstI断片と共に組み込まれた。これらの断片の組み込みにより、イントロ ン６配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリンシンターゼターミネ ーターと融合して３５Ｓプロモーターを含有するｐＳＯＧ１９が創生された。ｐ ＳＯＧ１９中のＧＵＳリーダーをトウモロコシ・クロロティック・モトル・ウイ ルス〔Maize Chlorotic Mottle Virus（ＭＣＭＶ）〕からのリーダー配列と置換 すると、ベクターｐＳＯＧ３５が創生された。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５ はアンピシリン耐性のためのｐＵＣ遺伝子を保持 し、そして外来配列のクローニングに利用可能なHindIII、SphI、PstIおよびEco RI 部位を有する。 実施例５：植物発現カセットの構築 トランスジェニック植物における発現が意図された遺伝子配列は最初に、適当 なプロモーターの下流で、かつ適当な転写ターミネーターの上流にある、発現カ セット内に組み込まれる。次いでこれらの発現カセットは実施例４に記載された 植物形質転換ベクターに容易に移送され得る。 プロモーター選択 発現カセットにおいて使用されるプロモーターの選択はトランスジェニック植 物内の移入遺伝子（トランス遺伝子）の空間的および時間的発現パターンを決定 する。選択されたプロモーターは特定の細胞タイプ（例えば葉表皮細胞，葉肉細 胞，根皮層細胞）または特定の組織もしくは器官（根，葉または花等）において 移入遺伝子を発現し、そしてこの選択は該移入遺伝子の発現の所望の場所を反映 する。また、選択されたプロモーターは光誘導化またはその他の時間的制御プロ モーターの下で遺伝子の発現を駆動してもよい。他の変法は選択されたプロモー ターが化学的に制御されることである。これにより、所望の時にのみ、そして化 学誘導剤での処理により引き起こされる時にのみ、移入遺伝子の発現の誘導の可 能性を提供する。 転写ターミネーター 種々の転写ターミネーターは発現カセット内での使用に適している。これらは 移入遺伝子以降の転写の終結およびその正確なポリアデニル化に関連する。適当 な転写ターミネーターおよび植物内で機能することが知られているものは、Ｃａ ＭＶ３５Ｓターミネーター、tml ターミネーター、ノパリンシンターゼターミネ ーター、エンドウrbcSＥ９ターミネーターを包含する。これらは単子葉および双 子葉植物の両方に使用され得る。 発現の増加および制御のための配列 多数の配列が転写ユニット内で遺伝子発現を増加させることが見出され、そし てこれらの配列は本発明の遺伝子と結合されて使用され、トランスジェニック植 物において発現を増加させ得る。 種々のイントロン配列は特に単子葉植物細胞において発現を増加させることが 示されている。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンは、トウモロコシ 細胞に導入された場合に、その同族プロモーターの下で野生型遺伝子の発現を顕 著に高めることが見出されている。イントロン１はクロラムフェニコール・アセ チルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築体において特に有効で発現が高めら れることが見出されていた（Callis等，Genes Develop．1: 1183-1200(1987)） 。これと同様の実験系において、トウモロコシbronze1 遺伝子からのイントロン は発現の増加に同様の有効性を有していた（Callis等，同上）。イントロン配列 は容易に植物形質転換ベク ター内、典型的には非翻訳リーダー内に組み込まれている。 ウイルスから誘導された多数の非翻訳リーダー配列もまた発現を高めることが 知られており、そしてこれらは双子葉植物細胞において特に有効である。特に、 タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ，「Ｗ配列」）、トウモロコシ・クロロティッ ク・モトル・ウイルス（ＭＣＭＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（Ａ ＭＶ）からのリーダー配列が発現を高めることにおいて有効であることが示され ている（例えばGallie等，Nucl．Acids．Res．15: 8693-8711(1987)；Skuzeski 等，Plant Molec．Biol．15:65-79(1990)）。 細胞内の遺伝子産物の標的化 遺伝子産物を標的化するための種々の機構が植物に存在することが知られてお り、そしてこれらの機構の機能を制御する配列がある程度詳細に特徴づけられて いる。これらの機構は種々の細胞画分、例えば葉緑体、ミトコンドリア、ペルオ キシソーム、核、ＥＲ、アポプラストおよび液胞に関連タンパク質を標的化する ことが見出されている同定された移送ペプチドまたは内部アミノ酸配列を通常利 用する。 葉緑体標的化 遺伝子産物の葉緑体への標的化は、種々のタンパク質のアミノ末端に見出され 、そして葉緑体輸送の間に切断されて成熟タンパク質が得られるシグナル配列に より制 御される（例えばComai 等，J．Biol．Chem．263: 15104-15109(1988)）。これ らのシグナル配列は異種遺伝子産物に融合されて葉緑体に異種産物の輸送を起こ し得る（van den Broeck等，Nature 313: 358-363(1985)）。適当なシグナル配 列をコードするＤＮＡはＲＵＢＩＳＣＯタンパク質をコードするｃＤＮＡ、ＣＡ Ｂタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質および葉緑体に局在 化されることが知られている多くの他のタンパク質の５’末端から単離され得る 。 Chen & Jagendorf（J．Biol．Chem．268: 2363-2367(1993)）は異種移入遺伝 子の輸送のための葉緑体転移ペプチドの成功裏の使用を記載している。使用され るこのペプチドはニコチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifo lia）由来のrbcS遺伝子からの転移ペプチドである（Poulsen等，Mol．Gen．Gene t．205: 193-200(1986)）。制限酵素DraIおよびSphIたはTsp509I およびSphIを 用いると、この転移ペプチドをコードするＤＮＡ配列はプラスミドｐｒｂｃＳ− ８Ｂ（Poulsen等，同上）から切除され得、そして上記の構築への使用のために 操作され得る。DraI−SphI断片は開始rbcSＡＴＧ開始コドンに対して−５８から 、輸送切断部位の直後の成熟ペプチドの最初のアミノ酸（これもまたメチオニン ）を含み、それまで伸長し、一方、TsP509I −SphI断片は開始rbcSＡＴＧ開始コ ドンに対して−８から、成熟ペプチドの最初のアミノ酸を含み、それまで伸長す る。 従って、これらの断片は選択されたプロモーター（例えば３５Ｓ，ＰＲ−１ａ， アクチン、ユビキノン他）の非翻訳リーダーへの転写融合を生成するあらゆる選 択された発現カセットのポリリンカーに適当に挿入され得、転移ペプチドの下流 に正しく融合されたＢＢＥ遺伝子の挿入を可能にする。この種の構築は当業界で は日常的なことである。例えば、DraI末端は既にブラントであり、５’Tsp509I 部位はＴ４ポリメラーゼ処理によりブラントにされ得るか、またはリンカーもし くはアダプター配列に連結されて選択されたプロモーターへの融合を促進しても よい。３’SphI部位はそのまま保持されても、また選択されたＢＢＥ遺伝子の引 き続く挿入のための利用可能で適当な制限部位を作るように選択されたベクター 中への挿入を促進するためのリンカー配列のアダプターに連結されてもよい。理 想的には、SphI部位のＡＴＧは保持され、そして選択されたＢＢＥ遺伝子の第１ のＡＴＧを含有する。Chen & Jagendorf（同上）は葉緑体輸送のために理想的な 切断のためのコンセンサス配列を提供し、そして各々場合において、メチオニン は成熟タンパク質の最初の位置にあることが好ましい。次の位置には、より多く の変更があり、そしてそのアミノ酸はそれほど重要ではない。あらゆる場合にお いて、融合構築体はBartlett等，Edelmann等編，Methods in Chloroplast Molec ular Biology，Elsevier．pp 1081-1091（1982）およびWasmann 等，Mol．Gen． Genet．205: 446-453（1986） に記載された方法を用いて試験管内での輸送の効率が評価され得る。典型的には 、最良の試みは、アミノ末端に修飾を持たない選択されたＢＢＥ遺伝子を用いて 融合体を生成することであるが、該融合体が高い効率で葉緑体に輸送されないこ とが明らかである場合に修飾を持つだけであり、その場合の修飾は刊行された文 献に従って行われ得る（Chaen & Jagendorf，同上；Wasmann等，同上；Ko & Ko ，J．Biol．Chem．267:13910-13916(1992)）。 その他の植物細胞画分への標的化 その他の遺伝子産物はオルガネラ、例えばミトコンドリアおよびペルオキシソ ームに局在化される（例えばUnger 等，Plant Molec．Biol．13:411-418(1989) ）。これらの産物をコードするｃＤＮＡはまた、異種遺伝子産物の上記オルガネ ラへの標的化が行われるように操作され得る。そのような配列の例は核コード化 ＡＴＰアーゼ（nuclear-encoded ATPase）およびミトコンドリアに対する特異的 アスパルテートアミノトランスフェラーゼアイソフォームである。細胞のタンパ ク質体への標的化はRogers等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:6512-6516(1985 )に記載されている。 さらに、遺伝子産物のその他の細胞画分への標的化を引き起こす配列が特徴づ けられている。アミノ末端配列はＥＲ、アポプラストへの標的化、およびアリュ ーロン細胞から細胞外分泌に関連する（Koehler & Ho，Plant Cell 2: 769-783(1990)）。また、アミノ末端配列はカルボキシ末端配列と一緒 になって、遺伝子産物の液胞標的化に関連する（Shinshi 等，Plant Molec．Bio l．14:357-368(1990)）。 移入遺伝子標的化 上記の適当な標的化配列を当該の移入遺伝子配列に融合することにより、あら ゆるオルガネラまたは細胞画分に移入遺伝子産物を導くことが可能である。例え ば、葉緑体標的化のために、アラビドプシスＢｉｏＢ遺伝子（実施例８参照）、 ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子またはＧＳ２ 遺伝子からの葉緑体シグナル配列が移入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧへ読み枠内に 融合される。選択されたシグナル配列は公知切断部位を含むべきであり、そして 構築された融合体は、切断に必要とされる切断部位の後ろのアミノ酸を考慮すべ きである。いくつかの場合において、この要求は切断部位と移入遺伝子ＡＴＧと の間に少数のアミノ酸を付加するか、または移入遺伝子内のいくつかのアミノ酸 を置換することにより実現され得る。葉緑体輸送のために構築された融合体は、 Bartlett等，Edelmann等編，Methods in Chloroplast Molecular Biology，Else vier．pp 1081-1091（1982）およびWasmann 等，Mol．Gen．Genet．205: 446-45 3(1986)に記載された方法を用いて試験管内転写構築体の試験管内翻訳、それに 続いて試験管内葉緑体取込みによる葉緑体取込みの効率が試験され得 る。これらの構築技術は当業界で十分に公知であり、そしてミトコンドリアおよ びペルオキシソームにも同様に適用可能である。移入遺伝子の発現に必要とされ 得る標的化の選択は当該経路に対する開始点として必要とされる前駆体の細胞内 の位置に依存する。これは、いくつかの場合においてミトコンドリアおよびペル オキシソームであるかもしれないが、通常細胞質または葉緑体である。移送遺伝 子発現の産物はＥＲ、アポプラストまたは液胞への標的化を通常必要としない。 細胞標的化のための上記機構は、標的化シグナルを誘導するプロモーターの転 写制御とは異なる発現パターンを有するプロモーターの転写制御下で特定の細胞 標的化目標を遂げるために、同族プロモーターと関連するばかりでなく、異種プ ロモーターとも関連する。 実施例６：双子葉植物の形質転換 双子葉植物のための形質転換技術は当業界で十分に公知であり、そしてアグロ バクテリウムをベースとする技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術 を包含する。非アグロバクテリウム技術はプロトプラストまたは細胞による直接 的な外来遺伝子材料の取込みを包含する。これはＰＥＧまたはエレクトロポレー ションが介在する取込み、粒子打ち込みが介在する移送、またはマイクロインジ ェクションにより行われ得る。これらの技術の例はPaszkowski等，EMBO J 3: 27 17-2722(1984)，Potrykus等，Mol．Gen．Genet．199: 169-177(1985)，Re ich 等，Biotechnology 4:1001-1004 (1986)およびKlein 等，Nature 327: 70-7 3(1987)に記載されている。各々の場合において、形質転換された細胞は当業界 で公知の標準的技術を用いて完全植物体に再生される。 アグロバクテリウム介在形質転換は、形質転換の高い効率および多くの異なる 種との広範囲の利用性の故に、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術であ る。アグロバクテリウムにより容易に形質転換され得る多くの作物種はタバコ、 トマト、ヒマワリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファおよ びポプラ〔ＥＰ−０３１７５１１（ワタ），ＥＰ−０２４９４３２（トマト，Ca lgene に対して），ＷＯ８７／０７２９９（ブラッシカ(Brassica)，Calgene に 対して），ＵＳ４７９５８５５（ポプラ）〕を包含する。アグロバクテリウム形 質転換は、共通に内在するＴｉプラスミドまたは染色体のいずれかにある宿主ア グロバクテリウム菌株により保持されるvir 遺伝子の補体(complememt)に依存す る適当なアグロバクテリウム菌株への当該の外来ＤＮＡを有する二元ベクター（ 例えばｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１）の導入を典型的には包含する（ 例えばｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１に対するＣＩＢ５４２菌株（Ukne s 等，Plant Cell 5: 159-169(1993)）。アグロバクテリウムへの組換え二元ベ クターの導入は組換え二元ベクターを保有する大腸菌、ｐＲＫ２０１３のような プラスミドを保有し、かつ標的アグロバク テリウム菌株への組換え二元ベクターの移動を可能にするヘルパー大腸菌株を用 いる三親交雑法により行われる。また、組換え二元ベクターはＤＮＡ形質転換に よりアグロバクテリウムに移送され得る（Hofgen & Willmitzer，Nucl．Acids R es．16:9877（1988））。 組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は植物からの外植片と アグロバクテリウムの共培養を含み、そして当業界で十分に公知のプロトコルに 従う。形質転換された組織は二元プラスミドＴ−ＤＮＡ境界の間に存在する抗生 物質または除草剤耐性マーカーを有する選択性培地上で再生される。 実施例７：単子葉植物の形質転換 多くの単子葉植物種の形質転換もまた今ではルーチンとなってきている。好ま しい技術はＰＥＧまたはエレクトロポレーション技術を用いるプロトプラスト中 への直接遺伝子導入、およびカルス組織中への粒子打ち込みを包含する。形質転 換は単一のＤＮＡ種でもって行われても、多数のＤＮＡ種でもって行われてもよ く（すなわち同時形質転換）、そして両方のこれらの技術は本発明での使用に適 している。同時形質転換は複雑なベクター構築の回避および当該遺伝子の非連鎖 遺伝子座や選択性マーカーを有するトランスジェニック植物の作出という利点を 有し、次世代における選択性マーカーの除去を可能にするが、これは望ましいと 見なされるべきである。しかしながら、同時形質転換の使用の欠点は、別々のＤ Ｎ Ａ種がゲノム内に組み込まれる頻度が１００％未満であることである（Schocher 等，Biotechnology 4:1093-1096(1986)）。 特許出願ＥＰ−０２９２４３５（Ciba-Geigyに対して）、ＥＰ−０３９２２２ ５（Ciba-Geigyに対して）およびＷＯ９３／０７２７８（Ciba-Geigyに対して） はトウモロコシの優良近交系からのカルスおよびプロトプラストの生成、ＰＥＧ またはエレクトロポレーションを用いるプロトプラストの形質転換および形質転 換されたプロトプラストからトウモロコシ植物体の再生のための技術を記載して いる。Gordon-Kamm 等，Plant Cell 2: 603-618(1990)およびFromm 等，Biotech nology 8:833-839(1990)）は粒子打ち込みを用いるＡ１８８−誘導トウモロコシ 系の形質転換のための技術を公開している。さらに、出願ＷＯ９３／０７２７８ （Ciba-Geigyに対して）およびKoziel等，Biotechnology 11: 194-200(1993)は 粒子打ち込みによるトウモロコシの優良近交系の形質転換のための技術を記載し ている。この技術は受粉１４−１５日後のトウモロコシ雌穂から切り出された長 さ１．５〜２．５ｍｍの未熟トウモロコシ胚および打ち込みのためのＰＤＳ−１ ０００Ｈｅバイオリスティクス(Biolistics)装置を利用する。 イネの形質転換はまた、プロトプラストまたは粒子打ち込みを利用する直接遺 伝子導入により行われ得る。プロトプラスト仲介形質転換はジャポニカ(Japonic a)型お よびインディカ(Indica)型に対して記載されている（Zhang 等，Plant Cell Rep ．7:379-384(1988); Shimamoto 等，Nature 338: 274-277(1989); Datta 等，Bi otechnology 8:736-740(1990)）。両方の型はまた、粒子打ち込みを用いて容易 に形質転換可能である（Christou等，Biotechnology 9:957-962(1991)）。 特許出願ＥＰ−０３３２５８１（Ciba-Geigyに対して）はプーイデアエ(Pooid eae)プロトプラストの生成、形質転換および再生のための技術を記載している。 これらの技術はダクチリス(Dactylis)およびコムギの形質転換を可能にする。さ らに、コムギの形質転換は、Ｃ型長期再生性カルスの細胞への粒子打ち込みを用 いるVasil等，Biotechnology 10: 667-674(1992)により、そして未熟胚および未 熟胚誘導カルスの粒子打ち込みを用いるVasil 等，Biotechnology 11: 1553-155 8(1993)およびWeeks 等，Plant Physiol．102: 1077-1084(1993)により記載され ている。しかしながら、コムギの形質転換のための好ましい技術は未熟胚の粒子 打ち込みによるコムギの形質転換を含み、そして遺伝子移送に先立つ高ショ糖ま たは高マルトース段階のいずれかを包含する。打ち込み前に、かなり多数の胚（ 長さ０．７５〜１ｍｍ）が３％ショ糖を有するＭＳ培地（Murashige & Skoog，P hysiologia Plantarum 15:473-497(1962)および暗所での進行を可能にする体細 胞胚の誘導のために３ｍｇ／ｍｌ２，４−Ｄを含有する培地上で平板培養される 。打ち込 みの選択された日に、胚は誘導培地から取り出され、そしてオスモティカム(osm oticum)（すなわち所望濃度，典型的には１５％で添加されたショ糖およびマル トースを含有する誘導培地）上に置かれる。胚は２〜３時間、原形質分離され、 次に打ち込まれる。標的プレートあたり２０個の胚が典型的であるが、重要では ない。適当な遺伝子保持プラスミド（例えばｐＣＩＢ３０６４またはｐＳＯＧ３ ５）は標準的操作を用いてマイクロメーターサイズの金粒子上に沈澱される。各 プレートの胚は標準の８０メッシュスクリーンを用いて〜１０００ｐｓｉの破裂 圧によりデュポン・バイオリスティクス・ヘリウム装置で打ち込まれる。打ち込 みの後、胚は暗所に戻され、約２４時間（依然としてオスモティカム上で）回復 される。２４時間後、胚はオスモティカムから取り出され、誘導培地上に戻され 、そこで再生まで約１ヵ月保持される。約１ヵ月後、生長する胚形成性カルスを 有する胚外植片は適当な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合には１０ｍｇ／ｌバス タそしてｐＳＯＧ３５の場合には２ｍｇ／ｌメトトレキセート）をさらに含有す る再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／リットルＮＡＡ，５ｍｇ／リットルＧＡ）に移され る。約１ヵ月後、発生した苗条（シュート）は、半分の強度のＭＳ、２％ショ糖 および同濃度の選択剤を含有する「ＧＡ７ｓ」として知られる大型滅菌容器に移 される。特許出願ＷＯ９４／１３８２２はコムギの形質転換のための方法を記載 しており、そして参照により本 明細書に編入される。 実施例８：発現配列Ｔａｇ（ＥＳＴ）に対する配列相同性に基づいたアラビドプ シスビオチン生合成遺伝子（ＢｉｏＢ相同体）の単離 この例はバクテリアおよび酵母からのＢｉｏＢタンパク質の相同体をコードす るアラビドプシスからの全長ｃＤＮＡクローンの単離を記載する。ＢｉｏＢタン パク質はビオチンへのデスチオビオチンの変換における酵素の役割を果たしてい る。この反応の正確な性質はあらゆる生物において十分に理解されていないが、 中間体９−メルカプトデスチオビオチンの形成を明らかに包含している。 ＥＳＴデータベース 上記クローンを単離するために使用される方法はＥＳＴ（発現配列ｔａｇ）に 対する相同性が基準とされていた。ＥＳＴはランダムに単離され、そしてある生 物から単離されたｍＲＮＡのプールから誘導された発現遺伝子の部分的に配列決 定されたｃＤＮＡクローンである。ＥＳＴはｍＲＮＡ集合体からランダムに生成 され、そして利用可能な限られた配列情報のみを有して生成されるので、単離の 態様に基づいて特定の機能または活性と典型的に関連づけることができない。し かしながら、ＥＳＴは公知機能を有する遺伝子に対する配列相同性に基づいて特 定の機能または活性と関連づけることができる。 現在までアラビドプシスから１４０００を越えるＥＳ Ｔクローンが生成され、そして配列決定されている。これらのクローンは発現さ れるアラビドプシス遺伝子の全数の一部を表現する。各ＥＳＴに対して、これら のクローンの各末端からの遺伝子配列の約３００塩基対が全て６つの可能な読み 枠で翻訳され、そしてジーンバンクデータベースにおける全ての公知タンパク質 配列に対するＢＬＡＳＴ相同性サーチ（S.F.Altschul等，J．Mol．Biol．215:40 3-410(1990)）により比較されている。定期的に、生成されたＥＳＴクローンの リストはＡＡＴＤＢ（an Arabidopsis thaliana data base）と呼ばれる電子的 データベースに公開されており、該データベースはＥＳＴに対する同定情報（ク ローン名，ジーンバンク受領番号，ＤＮＡ配列）および翻訳されたＥＳＴ配列に 対して最大の相同性を有する上記ＢＬＡＳＴサーチからの同定されたタンパク質 配列のリストを包含する。これらのクローンの保存はオハイオ州立大学(the Ohi os State University)（オハイオ州コロンバス）で大腸菌に保持され、一般に分 配されている。 アラビドプシスから全長ＢｉｏＢ相同体の単離 ８６Ｅ１２と記載されるＥＳＴクローン（ジーンバンク受領番号Ｔ２０５２９ ）はＡＡＴＤＢで大腸菌ＢｉｏＢタンパク質に相同性を有することが報告されて いた。この部分的ｃＤＮＡクローンはオハイオ州立大学センターにあるアラビド プシス・ストックセンターから入手され、そしてＡＡＴＤＢで８６Ｅ１２として 挙げられてい たものと同じであることが配列分析により確認された。８６Ｅ１２からの８００ 塩基対の挿入物が単離され、そして標準的な分子生物学的技術を用いて精製され た。この挿入物をプローブとして用いて、１．１ｋｂ転写物がアラビドプシスの 葉から単離されたＲＮＡのノーザンブロットで検出され、８６Ｅ１２が全長クロ ーンではないことを示した。単一バンドがプローブとして８６Ｅ１２挿入物を用 いる全体のアラビドプシスＤＮＡのサザンブロットで検出され、８６Ｅ１２に相 当するアラビドプシスゲノム内の遺伝子が単一コピーであることが示唆された。 ８６Ｅ１２からの８００ｂｐ挿入断片は次に、アラビドプシスｃＤＮＡライブ ラリーからの全長クローンを単離するためのプローブとして使用された。約２５ ００００のプラークが８６Ｅ１２からの標識された８００ｂｐ挿入物を用いてス クリーニングされた。標識された挿入物にハイブリッド形成した３つのクローン は均一になるまで精製され、そして標準的制限分析により比較された。３つの全 てのクローンは、１つのクローンが３’末端にXhoIクローニング部位を欠損して いたことを除いて、組成において類似していた。２つの残りのクローンは同一で あることが明らかとなり、一方（ｐＭＡＰ１０１）が完全に配列決定され、そし て次にイリノイ州ペオリアのアグリカルチチュラル・リサーチ・サービス・カル チャー・コレクションに寄託された。この寄託は大腸菌細胞 ストックとして１９９５年２月６日になされ、そして受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２ １３９８が付与されている。このクローンからの挿入物のＤＮＡ配列は配列番号 ：１３に示されている。このｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸 配列は配列番号：１４に示されている。 この遺伝子によりコードされる推定タンパク質配列と大腸菌ＢｉｏＢタンパク 質との比較は、２つのポリペプチドの全長にわたり５０％を越える同一性および ６０％を越える相同性を示した（図３参照）。植物とバクテリアとの進化的分岐 を考慮すると、相同性の上記レベルは顕著であり、そしてクローン化された植物 ｃＤＮＡが大腸菌ＢｉｏＢタンパク質の機能的相同体であるタンパク質をコード している確固とした証拠である。 この比較のもう一つの興味深い特徴は植物ＢｉｏＢ相同体のアミノ末端にある 過剰アミノ酸残基の数である。過剰アミノ酸のこの伸びは葉緑体移送ペプチドの 典型的な特徴を有し、ビオチン生合成経路における上記タンパク質および他の酵 素がおそらく植物内で葉緑体に局在し、そしてそこで活性であることを示す。従 って、上記遺伝子および他のＢＢＥコード遺伝子を発現して本発明に係る高めら れたビオチン合成を達成するために、発現は葉緑体に方向づけられることが好ま しい。これは葉緑体移送ペプチドコード配列を本来含有するＢＢＥコード遺伝子 、例えば本例に記載されたアラビドプシス遺伝子に対する何らかの修飾を必要と しない。葉緑体移送ペプチド コード配列、例えばバクテリアＢＢＥコード遺伝子を本来含有しないＢＢＥコー ド遺伝子のために、実施例５に記載された葉緑体移送ペプチドコード配列（「葉 緑体標的化」の項参照）は葉緑体にＢＢＥを標的化するために付加され得る。 本明細書に記載した本発明の様々な変更は当業者に明らかであろう。そのよう な変更は添付の請求の範囲の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １. 植物細胞におけるビオチン生合成酵素の量を増加させることからなる植 物細胞においてビタミンＨの量を増加させる方法。 ２. 前記ビオチン生合成酵素を発現し得るキメラ遺伝子で植物細胞を形質転 換することにより前記ビオチン生合成酵素の量を増加させる請求項１記載の方法 。 ３. 前記ビオチン生合成酵素がピメロイルＣｏＡシンテターゼ、ＫＡＰシン テターゼ、ＤＡＰアミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、 デスチオビオチンを９−メルカプトデスチオビオチンに変換する酵素およびビオ チンシンターゼからなる群から選択される請求項２記載の方法。 ４. ビオチン生合成酵素をコードするキメラ遺伝子を含有する高められたレ ベルのビタミンＨを有する植物組織であって、上記キメラ遺伝子は上記植物組織 において上記ビオチン生合成酵素を発現することができる、上記植物組織。 ５. 前記ビオチン生合成酵素がピメロイルＣｏＡシンテターゼ、ＫＡＰシン テターゼ、ＤＡＰアミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、 デスチオビオチンを９−メルカプトデスチオビオチンに変換する酵素およびビオ チンシンターゼからなる群から選択される請求項４記載の植物組織。 ６. ビオチン生合成酵素をコードするキメラ遺伝子を含有する高められたレ ベルのビタミンＨを有する植物であって、上記キメラ遺伝子は上記植物において 上記ビオチン生合成酵素を発現することができる、上記植物。 ７. 前記ビオチン生合成酵素がピメロイルＣｏＡシンテターゼ、ＫＡＰシン テターゼ、ＤＡＰアミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、 デスチオビオチンを９−メルカプトデスチオビオチンに変換する酵素およびビオ チンシンターゼからなる群から選択される請求項６記載の植物。 ８. 前記植物がアラビドプシス、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、カノーラ 、タバコからなる群から選択される請求項７記載の植物。 ９. ビオチン生合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する単離され たＤＮＡ分子であって、上記ヌクレオチド配列は配列番号：１４に記載のタンパ ク質をコードする、上記単離されたＤＮＡ分子。 １０. 前記ヌクレオチド配列が配列番号：１３に記載されたものである請求項 ９記載の単離されたＤＮＡ分子。 １１. 異種植物プロモーターに操作可能に連結された請求項９記載の単離され たＤＮＡ分子を含有するビオチン生合成酵素を発現し得るキメラ遺伝子。 １２. 請求項１１記載のキメラ遺伝子を含有する高められたレベルのビタミン Ｈを有する植物。 １３. 葉緑体移送ペプチドに操作可能に融合されたビオチ ン生合成酵素をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された植物プロモ ーターを含有するキメラ遺伝子。 １４. 前記ビオチン生合成酵素がバクテリア内に天然に生じる請求項１３記載 のキメラ遺伝子。 １５. 請求項１３記載のキメラ遺伝子を含有する高められたレベルのビタミン Ｈを有する植物。 １６. 前記キメラ遺伝子を含有する植物品種または植物ハイブリッドを育種す るために請求項６、１２または１５記載の植物を使用する方法。 １７. 種子を製造するために請求項１６記載の得られた植物品種を使用する方 法。 １８. ハイブリッド種子が製造される請求項１７記載の方法。