KR19990087356A - 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제 유전자로부터의 프로모터 - Google Patents
식물 프로토포르피리노겐 옥시다제 유전자로부터의 프로모터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 암호화 서열과 자연적으로 결합된 프로모터 및 이의 유도체가 제공된다. 이들 프로모터를 사용하여 식물 세포에서 작동가능하게 결합된 이종성 암호화 서열의 발현을 조절할 수 있다. 특히, 이들 프로모터는 상응하는 비변형된 효소를 억제하는 제초제에 대한 내성을 제공하기 위해 변형된 형태의 제초제 표적 효소, 특히 변형된 형태의 프로톡스를 발현시키는데 유용하다. 이들 프로모터를 포함하는 재조합체 DNA 분자 및 키메라 유전자가 제공될 뿐만 아니라, 이와 같은 키메라 유전자를 함유하는 식물 조직 및 식물이 제공된다.
Description
I. 프로톡스 효소 및 이의 엽록소/헴 생합성 경로에서의 역할
엽록소 및 헴을 생성시키는 생합성 경로는 단수의 공통 단계로 이루어진다. 엽록소는 모든 녹색 광합성 생물체에 존재하는 광 수집 색소이다. 헴은 헤모글로빈, 시토크롬, P450 혼합-작용 옥시게나제, 퍼옥시다제 및 카탈라제의 보조인자[참조: Lehninger, Biochemistry. Worth Publishers, New York(1975)]이며, 모든 호기성 생물의 필수 성분이다.
엽록소 및 헴 생합성에서 마지막 공통 단계는 프로토포르피리노겐 IX가 프로토포르피린 IX로 산화하는 것이다. 프로토포르피리노겐 옥시다제(이하 "프로톡스(protox)"라 한다)는 이러한 마지막 산화 단계를 촉매하는 효소이다[참조: Matringe et al., Biochem. J. 260: 231(1989)].
프로톡스 효소는 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)[참조: Labbe-Bois and Labbe, In Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, ed. McGraw Hill: New York, pp. 235-285(1990)], 보리 에티오플라스트(etioplast)[참조: Jacobs and Jacobs, Biochem. J. 244: 219(1987)], 및 마우스 간[참조: Dailey and Karr, Biochem. 26: 2697(1987)]을 포함하는 다수의 생물체로부터 부분적으로 또는 완전히 정제된다. 프로톡스를 암호화하는 유전자가 2개의 원핵 생물체, 즉 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)[참조: Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155(1993)] 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)[참조: Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813(1994)]로부터 분리되었다. 이들 유전자는 서열 상동성이 없고; 이들의 예상된 단백질 생성물은 어떠한 아미노산 서열 동일성도 없다. 에스케리키아 콜라이 단백질은 약 21kDa이며, 세포 구성원과 관련된다. 바실루스 서브틸리스 단백질은 51kDa이고, 가용성의 세포질 활성을 가진다.
또한, cDNA를 암호화하는 프로톡스가 사람[참조: Nishimura et al., J. Biol. Chem. 270(14): 8076-8080(1995)] 및 식물[참조: 1995년 6월 8일자로 출원된 국제 특허원 제PCT/IB95/00452호, 1995년 12월 21일자로 제WO95/34659호로 공개됨]로부터 분리되었다.
II. 제초제 표적으로서의 프로톡스 유전자
작물중의 잡초 또는 식물과 같은 목적하지 않는 초목을 제어하기 위해 제초제를 사용하는 것은 통상의 관행이다. 관련 시장은 매년 10억불을 초과한다. 이들의 광범위한 사용에도 불구하고, 잡초 제어는 경작자에게 심각하고 고비용의 문제를 남긴다.
제초제의 효과적인 사용에는 확실한 관리가 요구되고 있다. 예를 들면, 적용 시간 및 방법 및 잡초 식물의 생육 단계가 제초제로 잡초를 효과적으로 제어하는데 중요하다. 여러가지 잡초 종은 제초제에 내성이 있기 때문에, 효과적인 제초제의 생산이 점차 중요해지게 되었다.
불운하게도, 효능이 보다 우수하고 잡초 범위가 보다 넓으며 토양내에서의 분해가 보다 신속한 제초제는 또한 작물 유해성이 보다 클 수 있다. 이러한 문제에 부합되는 특정 액제는 제초제에 저항성 및 내성을 갖는 작물을 발생시키게 되었다. 제초제에 내성이 있는 작물 하이브리드 또는 변종에는 작물에 대한 부수적인 손상의 위험없이 제초제가 사용된다.
내성의 발달은 제초제에 대한 작물의 민감성으로 인해 제초제의 사용이 이미 배제되거나 제한된 작물에 제초제를 적용할 수 있게 한다. 예를 들면, 안데슨 등(Anderson et al.)의 미국 특허 제4,761,373호는 각종 이미다졸리논 또는 설폰아미드 제초제에 내성이 있는 식물에 관한 것이다. 변화된 아세토하이드록시아시드 신타제(AHAS) 효소가 이러한 내성을 부여한다. 굳만 등(Goodman et al.)의 미국 특허 제4,975,374호는 글루타민 신세타제(GS), 예를 들어 포스피노트리신 및 메티오닌 설폭시민을 억제하는 것으로 알려진 제초제에 의한 억제에 내성이 있는 돌연변이체 글루타민 신세타제(GS)를 암호화하는 유전자를 함유하는 식물 세포 및 식물에 관한 것이다. 베드브룩 등(Bedbrook et al.)의 미국 특허 제5,013,659호은 설포닐우레아 제초제에 의한 억제에 대해 식물이 내성을 갖도록 하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제를 발현하는 식물에 관한 것이다. 소머스 등(Somers et al.)의 미국 특허 제5,162,602호는 사이클로헥산디온 및 아릴옥시페녹시프로파노산 제초제에 의한 억제에 내성이 있는 식물을 기술한다. 이러한 내성은 변화된 아세틸 조효소 A 카복실라제(ACCase)에 의해 부여된다.
프로톡스 효소는 각종 제초제 화합물을 위한 표적으로 사용된다. 프로톡스를 억제하는 제초제는 구조가 매우 상이한 분자 부류를 포함한다[참조: Duke et al., Weed Sci. 39: 465(1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193(1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35(1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70(1989)]. 이러한 제초제 화합물에는 디페닐에테르{예: 아시플루오르펜, 5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-2-니트로벤조산; 이의 메틸 에스테르; 또는 옥시플루오르펜, 2-클로로-1-(3-에톡시-4-니트로페녹시)-4-(트리플루오로벤젠)}, 옥시디아졸(예: 옥시디아존, 3-[2,4-디클로로-5-(1-메틸에톡시)페닐]-5-(1,1-디메틸에틸)-1,3,4-옥사디아졸-2-(3H)-온), 사이클릭 이미드(예: S-23142, N-(4-클로로-2-플루오로-5-프로파르길옥시페닐)-3,4,5,6-테트라하이드로프탈이미드; 클로로프탈림, N-(4-클로로페닐)-3,4,5,6-테트라하이드로프탈이미드), 페닐 피라졸(예: TNPP-에틸, 에틸 2-[1-(2,3,4-트리클로로페닐)-4-니트로피라졸릴-5-옥시]프로피오네이트; M&B 39279), 피리딘 유도체(예: LS 82-556), 및 페노피레이트 및 이의 O-페닐피롤리디노- 및 피페리디노카바메이트 동족체가 포함된다. 이들 화합물중 다수는 기질 동족체로서 작용하는 것이 명백한 효소에 의해 촉매된 통상의 반응을 경쟁적으로 억제한다.
전형적으로, 프로톡스에 대한 억제 효과는 약 395 내지 410nM에서 여기시킨 후 약 622 내지 635nM에서 형광을 측정함으로써 결정된다[참조: Jacobs and Jacobs, Enzyme 28: 206(1982); Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280(1991)]. 이러한 분석은 프로토포르피린 IX가 형광 색소이고 프로토포르피리노겐 IX가 비형광성이라는 사실에 기초하는 것이다.
프로톡스-억제 제초제의 예상된 작용 방식은 엽록체에 프로토포르피리노겐 IX을 축적시키는 것이다. 이러한 축적은 퍼옥시다제 활성에 의해 프로토포르피린 IX로 산화되는 경우 프로토포르피리노겐 IX를 시토졸에 연결시키는 것으로 생각된다. 광에 노출되는 경우, 프로토포르피린 IX는 시토졸내에 단일선 산소를 형성시킬 수 있다. 이러한 단일선 산소는 다른 반응성 산소 부류를 형성시킴으로써, 지질 과산화 및 막 분열을 차례로 유발하여 세포의 급속한 치사를 유도할 수 있다[참조: Lee et al., Plant Physiol. 102: 881(1993)].
모든 프로톡스 효소가 식물 프로톡스 효소를 억제하는 제초제에 민감한 것은 아니다. 에스케리키아 콜라이[참조: Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155(1993)] 및 바실루스 서브틸리스[참조: Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813(1994)]로부터 분리된 유전자에 의해 암호화된 2가지의 프로톡스 효소는 이들 제초성 억제제에 내성이 있다. 또한, 페닐이미드 제초제 S-23142에 내성이 있는 단세포 조류 클라마이도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 돌연변이체가 보고되어 있다[참조: Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15: 449(1990); Shibata et al., In Research in Photosynthesis, Vol. III, N. Murata, ed. Kluwer: Netherlands. pp. 567-570(1992)]. 이들 돌연변이체중 하나 이상은 돌연변이체가 선택된 제초제 억제제뿐만 아니라 다른 부류의 프로톡스 억제제에 대해 내성이 있는 변형된 프로톡스 활성을 갖는 것으로 여겨진다[참조: Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c: 339(1993); Sato et al., In ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C.(1994)]. 또한, 돌연변이체 담배 세포주는 억제제 S-21432에 대해 내성이 있는 것으로 보고되었다[참조: Che et al., Z. Naturforsch. 48c: 350(1993)]. 또한, 변형된, 억제제-내성 형태의 식물 프로톡스 암호화 서열이 1995년 6월 8일자로 출원되어 1995년 12월 21일자로 WO95/34659로서 공개된 국제 특허원 제PCT/IB95/00452호에 기술되어 있다.
III. 프로톡스 유전자 발현의 조절
프로톡스 유전자와 관련된 다수의 연구는 프로톡스 억제제에 대해 내성을 가질 수 있는 암호화 서열 및 이러한 효소의 변형에 촛점을 맞추어 수행되어 왔다. 식물에서 프로톡스 암호화 서열의 발현을 조절 및 촉진시키는 조절 요소에 대해서는 선행 기술에서 어떠한 정보도 이용할 수 없다.
발명의 요약
본 발명은, 본원에서 일반적으로 "프로톡스 프로모터"로 언급되는 식물의 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 암호화 서열과 자연적으로 결합된 프로모터 영역이 식물에서 이종 암호화 서열의 발현을 촉진하는데 유용하다는 발견에 기초한 것이다.
식물의 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 암호화 서열과 자연적으로 결합된 프로모터 영역이 식물에서 이종 암호화 서열의 발현을 촉진하는데 유용하다는 발견에 따라, 본 발명은 식물 프로톡스 프로모터 또는 이와 기능상 동등물을 포함하는 분리된 DNA 분자를 제공한다. 추가로 본 발명은, 이종 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 식물 프로톡스 프로모터를 포함하는 키메라(chimera) 유전자를 제공한다. 또한, 상기한 키메라 유전자를 포함하는 식물의 조직 및 식물을 제공한다.
본 발명의 한가지 양태에서, 프로톡스 프로모터를 사용하여 제초제 내성 형태의 표적 단백질을 발현시킴으로써 제초제에 내성을 제공한다. 이러한 양태에서, 프로톡스 프로모터는 비변형된 프로톡스 단백질의 억제제에 내성이 있는 제초제-내성 식물 프로톡스 단백질에 대한 암호화 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.
수 탁
하기의 벡터 분자는 하기에 지시된 날짜에 미국 일리노이주 61604 페오리아 노오쓰 유니버시티 스트리트 1815의 농업 연구 기관(Agricultural Research Service)의 북지역 연구 센터의 특허 배양물 수집 기관(NRRL)에 기탁되어 있다:
아라비돕시스(Arbidopsis) 프로톡스-1 프로모터를 포함하는 AraPT1Pro는 pWDC-11(NRRL #-21515)로서 1995년 12월 15일에 기탁되었다.
옥수수 프로톡스-1 암호화 서열의 나머지와 융합된 옥수수 프로톡스-1 프로모터를 포함한 플라스미드가 pWDC-14(NRRL #B-21546)로서 1996년 3월 19일 기탁되었다.
사탕무 프로톡스-1 프로모터를 포함한 플라스미드가 pWDC-20(NRRL #B-21650)으로서 1996년 12월 6일에 기탁되었다.
서열 목록의 설명
서열 1: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 2: 서열 1에 의해 암호화되는 아라비돕시스 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 3: 아라비돕시스 탈리아나 프로톡스-2 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 4: 서열 3에 의해 암호화되는 아라비돕시스 프로톡스-2 아미노산 서열.
서열 5: 옥수수 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 6: 서열 5에 의해 암호화되는 옥수수 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 7: 옥수수 프로톡스-2 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 8: 서열 7에 의해 암호화되는 옥수수 프로톡스-2 아미노산 서열.
서열 9: 밀 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 10: 서열 9에 의해 암호화되는 밀 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 11: 대두 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 12: 서열 11에 의해 암호화되는 대두 프로톡스-1 단백질.
서열 13: 아라비돕시스 탈리아나 프로톡스-1 유전자로부터의 프로모터 서열.
서열 14: 옥수수 프로톡스-1 유전자로부터의 프로모터 서열.
서열 15: 목화 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 16: 서열 15에 의해 암호화되는 목화 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 17: 사탕무 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 18: 서열 17에 의해 암호화되는 사탕무 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 19: 평지 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 20: 서열 19에 의해 암호화되는 평지 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 21: 벼 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 22: 서열 21에 의해 암호화되는 벼 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 23: 수수 프로톡스-1 단백질에 대한 DNA 암호화 서열.
서열 24: 서열 23에 의해 암호화되는 수수 프로톡스-1 아미노산 서열.
서열 25: 옥수수 프로톡스-1 인트론 서열.
서열 26: 사탕무 프로톡스-1 유전자로부터의 프로모터 서열.
정 의
본원에서 사용된 바와 같이, "식물 프로톡스 프로모터"는 식물에서 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 암호화 서열의 바로 상부에서 자연적으로 발생하고, 본래 발생한 상태에서 관련된 프로톡스 암호화 서열의 전사 조절에 관여하는 조절 영역을 언급하는데 사용된다. 식물 프로톡스 프로모터에는 전사를 개시하는 RNA 폴리머라제의 결합에 직접적으로 관련되는 DNA 영역 및 추가로 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 상부 조절-시스 요소가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "유전자"는 (1) 암호화 서열 및 (2) 적합한 숙주 세포에서 암호화 서열의 전사를 촉진하고 조절하는 관련된 조절 영역을 포함하는 DNA 분자를 언급하는데 사용된다. 암호화 서열은 유용한 전사체(예를 들어 안티센스 RNA) 또는 암호화된 전사체의 해독에 의해 생성되는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 유전자는 5' 내지 3' 방향으로 최소한 프로모터 영역, 암호화 서열 및 전사 터미네이터를 포함한다. 또한, 유전자는 최소 요소(예: 암호화 서열내의 리더 또는 시그날 펩타이드)의 부분 또는 구별된 요소(예: 인트론)의 일부로서 발생할 수 있는 추가의 조절 영역을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "키메라 유전자"는 하나 이상의 성분 부분이 다른 성분 부분과 비교하여 이종성인 자연적으로 발생하지 않는 유전자를 언급하는데 사용된다. 본 발명을 기술하기 위해 본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 유전자"는 이종 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 프로모터를 포함하는 유전자로 언급된다.
프로모터 및 암호화 서열 사이의 관계에 관해 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종"은 자연적으로 발생하지 않은 관계를 언급하는데 사용된다. 예를 들어, 암호화 서열이 프로모터 서열과 연관되어 자연적으로 발생하는 암호화 서열과 상이한 경우 프로모터 서열에 대하여 이종성인 것으로 간주한다. 이는 목적하는 프로모터와 자연적으로 결합된 암호화 서열의 변형된 형태를 포함한다. 따라서, 변형된, 억제제-내성 프로톡스 암호화 서열은 비변형된, 억제제-민감성 형태의 암호화 서열과 자연적으로 결합된 프로모터에 대해 이종성인 것으로 간주된다. 이는 추가로 상이한 식물 또는 비-식물 종으로부터의 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 프로모터를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적인 서열 상동성"은 기타의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 갖는 실질적인 구조적 등가 및 기능적 등가를 나타내는 뉴클레오타이드 서열(DNA 또는 RNA의 경우) 또는 아미노산 서열(단백질 또는 폴리펩타이드의 경우)을 지시하는데 사용된다. 임의의 실질적인 서열 상동성을 갖는 서열 사이의 기능적 또는 구조적 차이는 최소일 것이다; 즉, 이들이 본 발명에서 지시되는 바와 같이 기능하는 서열의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것이다. 예를 들어, 식물 프로톡스 프로모터로 밝혀진 DNA 서열과 실질적으로 서열 상동성을 갖는 서열은 식물 프로톡스 프로모터로서 관련된 DNA 서열이 동일한 수준 및 형태로 발현되도록 지시할 수 있다. 본원에서 밝혀진 서열과 실질적인 서열 상동성을 갖는 서열은 일반적으로 돌연변이와 같이 밝혀진 서열의 변이체이지만 또한 합성 서열일 수도 있다. 2개 이상의 서열 사이에 상당량의 서열이 중복되거나 유사할 경우, 또는 상이한 서열이 유사한 물리적 특성을 나타낼 경우, 구조적 차이는 최소인 것으로 간주된다. 상기한 특성에는 예를 들어 면역학적 반응성, 효소 활성 및 구조적 단백질 무결성등이 포함된다.
2개의 뉴클레오타이드 서열이 70%이상, 보다 바람직게는 80%이상 및 가장 바람직하게는 90%이상의 서열 유사성을 갖는다면, 2개의 뉴클레오타이드 서열은 실질적인 서열 상동성을 가질 수 있다. 2개의 아미노산 서열이 폴리펩타이드의 활성화 부분 사이에 50%이상, 바람직게는 70%이상 및 가장 바람직하게는 90%이상의 서열 유사성을 갖는다면, 2개의 아미노산 서열은 실질적인 서열 상동성을 가질 수 있다. 프로모터 DNA 서열의 경우, "실질적인 서열 상동성"은 또한 관련된 DNA 서열의 발현을 촉진하도록 작동될 수 있는 프로모터 DNA 서열 단편을 언급한다. 프로모터 DNA 서열의 작동가능한 상기의 단편은, 예를 들어 제한 효소를 사용하여 프로모터 DNA 서열을 절단하고, 프로모터 DNA 서열의 서열에 따라 합성함으로써 프로모터 DNA 서열로부터 유도하거나 PCR 기술을 사용하여 수득할 수 있다[참조: Mullis et al., Meth. Enzymol., 155: 335-350 (1987); Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press (New York 1989)].
프로모터 DNA 서열이 제2 DNA 서열의 전사 및 해독에 영향을 미치도록 2개의 서열이 붙어있을 경우, 프로모터 DNA 서열은 제2 DNA 서열과 "작동가능하게 연결"되었다고 한다. 예를 들어, 제2 DNA 서열이 단백질 생성을 암호하는 경우, 프로모터 DNA 서열이 제2 DNA 서열의 단백질 생성물을 발현시키는데 영향을 미친다면 프로모터 DNA 서열은 제2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 동일한 키메라 구조내의 암호화 DNA 서열에 물리적으로 부착된 프로모터 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열에서 2개의 서열은 작동가능하게 연결된 것과 같다.
본 발명은 식물에서 관련 DNA 서열의 전사 프로모터로서 작용하는 신규한 DNA 서열에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 암호화 서열과 자연적으로 결합되는 신규한 프로모터에 관한 것이다.
본 발명은 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제(본원에서 "프로톡스"로 언급)에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 프로모터 DNA 서열에 관한 것이다[참조 문헌: 전문이 참조로서 인용된 WO 95/34659로서 1995년 12월 21일 공개된 1995년 6월 8일자 국제 출원 번호 PCT/IB95/00452; 동일자로 출원되고 본원에서 전문이 참조로서 인용된 "DNA Molecules Encoding Plant Protoporphyrinogen Oxidase and Inhibitor Resistant Mutants Thereof"란 명칭의 공동-계류중인 국제 출원 번호 (참고 번호 PH/520757/P1/CGC1847)]. 이들 프로톡스 프로모터 서열은 식물에서 이종 암호화 서열의 발현에 유용한 것으로 밝혀졌다.
아라비돕시스 탈리아나 프로톡스-1 암호화 서열(서열 1)에 대한 프로모터 서열은 서열 13으로 제공된다. 실시예 1에서 기술한 프로브와 같이 관련된 암호화 서열을 사용하여 게놈 라이브러리로부터 상기 프로모터를 분리한다. 옥수수 프로톡스-1 암호화 서열(서열 5)에 대한 프로모터 서열은 서열 14로 제공된다. 실시예 4에서 기술한 프로브와 같이 관련된 암호화 서열을 사용하여 게놈 라이브러리로부터 상기 프로모터를 분리한다. 사탕무 프로톡스-1 암호화 서열(서열 17)에 대한 프로모터 서열은 서열 26으로 제공된다. 실시예 11에서 기술한 프로브와 같이 관련된 암호화 서열을 사용하여 게놈 라이브러리로부터 상기 프로모터를 분리한다.
본원에서 제공된 정보를 기초로, 아라비돕시스 및 옥수수 프로톡스-1 프로모터를 분리하는데 사용된 방법을 모든 식물의 프로톡스 유전자로부터 프로모터 서열을 분리하는데 사용할 수 있다. 흥미로운 프로모터와 관련된 프로톡스 암호화 서열에 하이브리드화되는 충분한 상동성을 공유하는 어떤 프로톡스 암호화 서열도 상기 방법에서 프로브로 사용할 수 있다. 모든 식물로부터의 개개의 프로톡스-1 및 프로톡스-2 암호화 서열이 필수적인 상동성 정도를 공유하도록 계획되기 때문에, 프로브로 사용되는 프로톡스 암호화 서열을 선택하는 것이 그리 중요하게 고려되지 않는다. 그러나, 최적의 하이브리드화 결과를 위해, 가장 밀접하게 관련된 프로톡스 암호화 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 프로브로 사용되는 암호화 서열은 흥미로운 프로톡스 프로모터로서 동종 식물로부터 유래되고, 프로모터와 자연적으로 결합된 암호화 서열이다.
따라서, 본 발명은 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 분리된 프로모터 DNA 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 아라비돕시스, 사탕수수, 대두, 보리, 목화, 담배, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 마초, 기장 및 벼로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물의 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 분리된 프로모터 DNA 분자이다. 보다 바람직하게는, 아라비돕시스, 대두, 목화, 담배, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 벼로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물의 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 DNA 분자이다. 특히 바람직하게는, 아라비돕시스, 사탕무 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물의 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 분리된 프로모터 DNA 분자이다. 가장 바람직하게는, 아라비돕시스의 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 분리된 프로모터 DNA 분자이다. 가장 바람직하게는, 옥수수의 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 분리된 프로모터 DNA 분자이다. 가장 바람직하게는, 사탕무의 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 분리된 프로모터 DNA 분자이다.
본 발명에는, 본원에서 정의한 바와 같이 본 발명에 따른 DNA 분자, 바람직하게는 약간 엄격한 조건하에서 10 뉴클레오타이드 이상인 당해 프로톡스 프로모터 서열의 인접 부분을 포함하는 당해 DNA 분자로부터 수득할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화되는 DNA 분자가 포함된다. 가장 바람직하게는, 다음의 조건하에서, 서열 13(아라비돕시스 프로톡스-1 프로모터), 서열 14(옥수수 프로톡스-1 프로모터) 또는 서열 26(사탕무 프로톡스-1 프로모터)의 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화되는 DNA 분자이다:
(a) 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이드(SDS), 0.5M NaPO4pH 7.0, 1mM EDTA중에 하이브리드화하고,
(b) 2X SSC, 1% SDS로 50℃에서 세척한다.
하이브리드의 안정성에 영향을 미치는 인자는 하이브리드화의 엄격함을 결정한다. 이러한 인자로서 DNA PROBE[George H. Keller and Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd, 1993, Section one: Molecular Hybridization Technology; Page 8ff]에서 제공되는 식에 따라 용이하게 계산할 수 있는 용점 Tm이 있다. 바람직한 하이브리드화 온도는 계산된 융점 Tm이 약 25℃ 이하, 바람직하게는 약 12 내지 15℃ 이하이고, 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 계산된 융점 Tm이 약 5 내지 10℃ 이하이다.
본 발명의 추가 양태는, (a) 식물 프로톡스 유전자 또는 mRAN와 특이적으로 하이브리드화될 수 있는, 프로톡스 단백질 또는 식물 프로톡스 프로모터 서열에 대한 10 뉴클레오타이드 이상의 서열의 인접 부분을 포함하는 뉴클레오타이드 프로브를 제조하는 단계, (b) 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 선택된 생물의 cDNA 단편의 모집단에서 단계 (a)에 따라 제조된 뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 다른 프로톡스 암호화 서열에 대하여 프로빙하는 단계 및 (c) 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분 및 프로톡스 단백질을 암호화하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 분리하고 증폭시키는 단계를 포함하여, 프로톡스 프로모터 서열을 포함하는 DNA 부분 및 프로톡스 단백질을 암호화하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 양태는, (a) 식물 프로톡스 유전자 또는 mRAN와 특이적으로 하이브리드화될 수 있는, 식물 프로톡스 단백질에 대한 10 뉴클레오타이드 이상의 암호화 서열의 인접 부분을 포함한 뉴클레오타이드 프로브를 제조하는 단계, (b) 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 선택된 생물의 cDNA 단편의 모집단에서 단계 (a)에 따라 제조된 뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 다른 프로톡스 암호화 서열 또는 프로톡스 프로모터 서열에 대하여 프로빙하는 단계 및 (c) 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 분리하고 증폭시키는 단계를 포함하여, 프로톡스 프로모터 서열을 포함하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 양태는 (a) 식물 프로톡스 유전자 또는 mRAN와 특이적으로 하이브리드화될 수 있는, 식물 프로톡스 단백질 또는 프로톡스 프로모터 서열에 대한 10 뉴클레오타이드 이상의 암호화 서열의 인접 부분을 포함한 뉴클레오타이드 프로브를 제조하는 단계, (b) 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 선택된 생물의 cDNA 단편의 모집단에서, 단계 (a)에 따라 제조된 뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 다른 프로톡스 암호화 서열 또는 프로톡스 프로모터 서열에 대하여 프로빙하는 단계 및 (c) 프로톡스 프로모터 서열을 포함하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 분리하고 증폭시키는 단계를 포함하여, 어떤 식물의 프로톡스 유전자로부터 프로톡스 프로모터 서열을 포함하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 추가로, 프로톡스 유전자의 암호화 영역 또는 프로모터 영역으로부터 수득할 수 있는, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 10 뉴클레오타이드 이상의 식물 프로톡스 유전자 또는 mRNA와 특이적으로 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오타이드 프로브의 용도를 포함한다.
본 발명은 추가로, 게놈 프로톡스 서열에 대한 프로브의 선택적인 하이브리드화에 기초한 표준 기술을 사용하여, 식물 프로톡스 유전자 또는 선택된 식물 게놈에서 프로톡스 유전자의 위치 지도에 대해 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 프로브의 용도를 포함한다.
본 발명은 프로브로서 흥미로운 프로모터와 결합된 프로톡스 암호화 서열과 하이브리드화되기에 충분한 상동성을 공유하는 프로톡스 암호화 서열의 용도를 포함한다. 바람직하게는, 프로브로 사용된 암호화 서열이 흥미로운 프로톡스 프로모터와 동종 식물의 것이고 프로모터와 자연적으로 결합된 암호화 서열인 프로톡스 암호화 서열의 용도를 포함한다.
본 발명의 식물 프로톡스 프로모터에는 서열 13에 기술된 아라비돕시스 프로톡스-1 프로모터 서열, 서열 14에 기술된 제아 메이즈(Zea mays, 옥수수) 프로톡스-1 프로모터 서열, 서열 26에 기술된 사탕무 프로톡스-1 프로모터 서열뿐만 아니라 상기한 모든 식물종으로부터 수득할 수 있는 상응하는 프로톡스-1 프로모터 서열이 포함된다. 또한, 본 발명은 예시된 프로톡스 프로모터 서열과 동일한 방법으로 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현을 조절하는 능력을 보유한 DNA 서열의 기능적 단편들을 포함한다. 이런 기능적 단편은 당해 기술 분야에서 프로톡스 프로모터 활성을 확인하는데 사용되는 결실 분석 또는 기타 표준 기술로 확인될 수 있다[참조: Lewin의 Gene V(Oxford Univ. Press) page 546-549, 1990]. 또한, 본 발명은 작동가능하게 연결된 서열상에 동일한 발현 수준 및 발현 패턴을 부여하는, 식물 유전자로부터 수득할 수 있는 프로톡스 프로모터와 실질적인 서열 상동성을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 상기 프로모터 서열은 식물 유전자로부터 분리된 프로톡스 프로모터의 변형을 통해 수득할 수 있고, 식물 프로톡스 프로모터의 기능상 동등한 유도체로 생각된다.
하기의 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열, 벡터 및 유전자이식(transgenic) 식물은 식물 프로톡스 유전자로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다. 프로톡스 프로모터 DNA 서열은 바람직하게는 암호화 DNA 서열, 예를 들어 안티센스 전사체와 같이 유용한 RNA 전사체로 전사될 수 있는 DNA 서열 또는 유용한 단백질 생성물의 생산시 최종적으로 발현되는 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다.
바람직한 양태에서, 프로톡스 프로모터는 상응하는 비변형된 형태의 효소를 억제하는 일정 농도의 제초제에 대해 내성이 있는 변형된 제초제 표적 효소의 발현을 유도하는데 사용된다. 따라서, 본 발명은 제초제에 대한 내성을 부여하는 제초제-내성 형태의 식물의 제초제 표적 단백질을 발현시키기 위한 프로톡스 프로모터의 용도에 관한 것이다. 이와 같이 변형된 제초제-내성 효소에는 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라타제(IGPD; 1994년 11월 24일 공개된 WO 9426909 참조), EPSP 신타제(미국 특허 제4,535,060호; 제4,769,061호, 제4,940,835호 및 EP 550,633 참조), 글루타민 신세타제(GS; 미국 특허 제4,975,374호 참조), 아세틸 조효소 A 카복실라제(ACCase; 미국 특허 제5,162,602호 참조) 및 아세토락테이트 신타제(미국 특허 제4,761,373호, 제5,304,732호, 제5,331,107호, 제5,013,659호, 제5,141,870호 및 제5,378,824호 참조)가 포함된다. 가장 바람직한 양태에서, 프로톡스 프로모터는 실시예 2 내지 3에서 설명하는 바와 같이 프로톡스 억제제에 대해 내성이 있는 변형된 프로톡스 효소의 발현을 유도하는데 사용된다[참조: 본원에서 관계된 부분이 참조로서 인용된, 1995년 6월 8일 출원되고 WO95/34659로서 1995년 12월 21일 공개된 국제 출원 번호 PCT/IB95/00452; 본 출원과 동일자로 제출된 "DNA Molecules Encoding Plant Protoporphyrinogen Oxidase and Inhibitor Resistant Mutants Thereof"이란 명칭으로 공동 계류중임].
본 발명은 이종 DNA 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 식물 프로톡스 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 키메라 유전자에 관한 것이다. 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 프로톡스 프로모터가 프로톡스-1 유전자 또는 프로톡스-2 유전자의 것이다. 특히 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 프로톡스 프로모터는 프로톡스-1 유전자의 것이다. 특히 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 프로톡스 프로모터는 프로톡스-2 유전자의 것이다.
식물 프로톡스 프로모터가 아라비돕시스, 사탕수수, 대두, 보리, 목화, 담배, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 마초, 기장 및 벼로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물로부터 유래하는 키메라 유전자가 바람직하다. 식물 프로톡스 프로모터가 아라비돕시스, 대두, 목화, 담배, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 벼로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물로부터 유래하는 키메라 유전자가 바람직하다. 식물 프로톡스 프로모터가 아라비돕시스, 옥수수 및 사탕무로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물로부터 유래하는 키메라 유전자가 특히 바람직하다. 식물 프로톡스 프로모터가 아라비돕시스 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물로부터 유래하는 키메라 유전자가 보다 바람직하다. 식물 프로톡스 프로모터가 서열 13에 기술된 서열을 갖는 키메라 유전자가 가장 바람직하다. 식물 프로톡스 프로모터가 서열 13에 기술된 서열을 갖는 키메라 유전자가 가장 바람직하다. 식물 프로톡스 프로모터가 서열 14에 기술된 서열을 갖는 키메라 유전자가 가장 바람직하다. 식물 프로톡스 프로모터가 서열 26에 기술된 서열을 갖는 키메라 유전자가 가장 바람직하다. 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 프로톡스 프로모터가 500 뉴클레오타이드 이상, 보다 바람직하게는 300 뉴클레오타이드 이상이다.
DNA 분자가 프로톡스-1 활성 또는 프로톡스-2 활성을 갖는 아라비돕시스 종의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 2 또는 서열 4에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성 또는 프로톡스-2 활성을 갖는 옥수수의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 6 또는 서열 8에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 밀의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 10에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 대두 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 12에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 목화의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 16에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 사탕무의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 18에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 평지의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 20에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 벼의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 22에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다. 또한, DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 수수의 단백질을 암호화하고, 단백질이 바람직하게는 서열 24에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자가 바람직하다.
추가로 본 발명은, 상응하는 비변형된 형태의 효소를 억제하는 수준의 제초제에 대해 내성이 있는, 식물의 단백질을 암호화하는 DNA 분자와 작동가능하게 연결된 식물 프로톡스 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 키메라 유전자에 관한 것이다.
바람직하게는, 키메라 유전자에서 이종 암호화 서열은 식물 효소의 변형된 제초제-내성 형태를 암호하한다. 특히 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 효소는 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라타제(IGPD), 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSP), 글루타민 신세타제(GS), 아세틸 조효소 A 카복실라제, 아세토락테이트 신타제, 히스티디놀 데하이드로게나제 및 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 효소는 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라타제(IGPD), 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSP), 글루타민 신세타제(GS), 아세틸 조효소 A 카복실라제, 아세토락테이트 신타제 및 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 효소는 진핵성 프로톡스이다. 보다 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 효소는 아미노산 치환체를 갖는 진핵성 프로톡스이고, 아미노산 치환체는 프로톡스 억제제에 대해 내성을 부여하는 성질을 갖는다. 가장 바람직하게는, 키메라 유전자에서 식물 효소는 프로톡스 억제제에 내성을 부여하는 성질을 가지며, "DNA Molecules Encoding Plant Protoporphyrinogen Oxidase"이란 명칭의 공동계류중인 국제 출원에 따른 진핵성 프로톡스이다.
바람직하게는, 키메라 유전자에서 DNA 분자는 아라비돕시스, 사탕수수, 대두, 보리, 목화, 담배, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 마초, 기장, 사료 작물 및 벼로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물의 단백질을 암호화한다. 보다 바람직하게는, 키메라 유전자에서 DNA 분자는 아라비돕시스, 대두, 목화, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀 및 수수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물의 단백질을 암호화한다. 특히 바람직하게는, 키메라 유전자에서 DNA 분자는 아라비돕시스, 밀, 대두 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물의 단백질을 암호화한다. 가장 바람직하게는, 키메라 유전자에서 DNA 분자는 대두 및 밀로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물의 단백질을 암호화한다.
추가로, 본 발명은 비변형된 식물 프로톡스 단백질 억제제에 내성이 있는 제초제-내성 식물 프로톡스 단백질을 발현시키는 본 발명의 키메라 유전자의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 당해 키메라 유전자를 숙주 게놈내로 안정하게 통합시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 프로모터 또는 이와 기능상 동등한 유도체를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기한 재조합 DNA 분자를 포함하는 재조합 DNA 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은, 당해 키메라 유전자를 포함하는, 식물, 식물 종자, 식물 조직 또는 식물 세포내로 안정하게 형질전환될 수 있는 재조합 벡터이다. 식물 및 이의 자손, 식물 종자, 식물 조직 또는 식물 세포는 비-식물원 또는 식물원, 바람직하게는 식물로부터 유래할 수 있는, 목적 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 발현시킬 수 있는 벡터로서 안정하게 형질전환된다. 식물 및 이의 자손, 식물 종자, 식물 조직 또는 식물 세포는, 비-식물원 또는 식물원, 바람직하게는 상응하는 비변형된 형태의 효소를 억제시키는 수준의 제초제에 내성이 있는 식물로부터 유래할 수 있는, 목적 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 벡터로서 안정하게 형질전환되는 것이 바람직하다.
추가로 본 발명은, 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 유전자로 안정하게 형질전환된 식물 및 이의 자손, 종자 및 배양된 조직을 포함하는 유전자이식 식물 조직에 관한 것이다. 비-식물원 또는 식물원, 바람직하게는 식물 조직에서 상응하는 비변형된 형태의 효소를 억제시키는 농도의 제초제에 내성이 있는 식물로부터 유래할 수 있는, 단백질을 발현시킬 수 있는 DNA 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 식물 프로톡스 프로모터를 포함한 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 키메라 유전자로 안정하게 형질전환되는 식물, 종자 및 배양된 조직을 포함한 유전자이식 식물 조직이 바람직하다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 안정하게 형질전환되고, 상기 DNA 분자를 발현시킬 수 있는 숙주를 포함한다. 숙주 세포는 식물 세포, 세균 세포, 효모 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택하는 것이 바람직하다.
추가로 본 발명은, 본원에서 교시한 바와 같이 변형된 억제제-내성 프로톡스 효소를 발현시키는 유전자에 의해 내성이 부여되는, 상기한 식물에서 자연적으로 발생하는 프로톡스 활성을 억제하는 제초제에 대해 내성이 있는 식물 및 이의 자손, 식물 조직 및 식물 종자에 관한 것이다. 대표적인 식물에는 제초제가 일반적으로 의도된 목적으로 적용될 수 있는 모든 식물이 포함된다. 농경학적으로 중요한 작물, 예를 들어 아라비돕시스, 대두, 사탕수수, 보리, 목화, 담배, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 마초, 기장 및 벼 등과 같은 피자식물 및 나자식물이 바람직하다. 농경학적으로 중요한 작물, 예를 들어 아라비돕시스, 목화, 대두, 평지, 사탕무, 담배, 옥수수, 벼, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 벼 등와 같은 피자식물 및 나자식물이 보다 바람직하다. 농경학적으로 중요한 작물, 예를 들어 아라비돕시스, 대두, 목화, 사탕무, 평지, 옥수수, 밀, 수수 및 벼 등과 같은 피자식물 및 나자식물이 보다 바람직하다.
본 발명의 유전자이식 식물은 당해 기술 분야에서 공지된 어떤 형질전환 방법에 의해서도 형질전환될 수 있다. 이러한 방법에는, 예를 들어 직접 감염 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)과 식물, 식물 조직 또는 세포의 공동-배양[참조: Horsch et al., Science, 225: 1229 (1985); Marton, "Cell Culture and Somatic Cell Genetic of plants", vol. 1, pp. 514-521 (1984)]; 원형질체로 직접 유전자 전달[참조: Paszkowski et al., EMBO J. 12: 2717 (1984); Loerz et al., Mol. Gen. & Genet. 1199:178 (1985); Fromm et al., Nature 319:719 (1986)]; 미세추진 충격(microprojectile bombardment)[참조: Klein et al., Bio/Technology, 6:559-563 (1988)]; 원형질체 배양된 세포 또는 조직에의 주입[참조: Reich et al., Bio/technology, 4:1001-1004 (1986)]; 또는 문헌[참조: De La Pena et al., Nature, 325:274-276 (1987); Hooykaas-Van Slogteren et al., Nature, 311:763-764 (1984); Grimsley et al., Bio/Technology, 6:185 (1988) 및 Grimsley et al., Nature, 325:117 (1988)]에 기술된 바와 같이 종자 또는 식물의 분열 조직내로의 주입에 의한 형질전환이 포함된다.
상기한 바와 같이 유전자이식 종자 및 식물내로 유전자 조작된 유전성은 생식 생장 또는 영양 생장에 의해 전달되어 식물의 자손에서 유지되고 증식된다. 일반적으로 상기한 유지 및 증식은 경작, 씨뿌림 또는 수확과 같은 특정 목적에 맞도록 개발된 공지된 농업 방법을 이용한다. 또한, 수경법 또는 온실 기술과 같은 특별한 방법을 적용할 수 있다. 생장하는 작물은 곤충 또는 감염에 의해 공격과 손상을 받기 쉬울 뿐만 아니라 잡초와 경쟁해야 하기 때문에, 생산을 증진시키기 위해 잡초, 식물 질병, 곤충, 선충 및 기타 불리한 조건을 제어하기 위한 방책이 취해진다. 여기에는 경운, 잡초 또는 감염된 식물의 제거와 같은 기계적인 방책 뿐만 아니라, 제초제, 살진제, 배우자 불임 유기제, 살선충제, 생장 조절제, 숙성제 및 살충제와 같은 농화학품의 적용이 포함된다.
본 발명에 따른 유전자이식 식물 및 종자의 유리한 유전성은, 충해, 제초제 또는 스트레스에 대한 내성, 개선된 영양가, 증가된 수율, 또는 도복 및 흩어짐이 보다 적게 발생하는 개선된 구조와 같이 개선된 성질을 갖는 식물을 개발할 목적으로 식물 육종에 이용할 수 있다. 각종 육종 단계는 교배시킬 계통의 선택, 모 계통의 직접적인 수분 또는 적절한 자손 식물의 선택과 같이 사람에 의한 공지된 조정에 의해 특성화된다. 관련 기술은 당해 기술 분야에서는 공지된 것이고, 하이브리드화, 동계 교배, 여교배, 다계통 교배, 각종 융합, 종간 하이브리드화 및 이수화 기술 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 또한, 하이브리드화 기술은 기계적, 화학적 또는 생화학적 수단에 의해 웅성 불임 또는 자성 불임 식물을 생성하는 식물의 불임화를 포함한다. 상이한 계통의 꽃가루로 웅성 불임 식물을 교배시키는 수분 작용은 자성 불임 식물을 제외한 웅성 불임 식물의 게놈이 양쪽 부모 계통의 성질은 일정하게 획득하는 것을 보장한다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자이식 종자 및 식물은, 제초제 또는 살충제 처리와 같은 통상적인 방법의 유효성을 증가시키거나 이들의 변형된 유전성에 기인하여 상기 방법이 필요없는 개선된 식물 계통의 번식에 사용될 수 있다. 달리는, 최적화된 유전적 "장치"에 기인하여 수득할 수 있는 개선된 스트레스-내성의 신규한 작물은, 비교가능한 반대의 개발 조건에서 내성이 없는 생성물보다 고품질로 수확된 생성물을 생산한다.
경작자에 의해 수확되고 판매된 종자의 발아성 및 균질성은 중요하지 않지만, 종자 생산에 있어서 종자의 발아성 및 균질성은 본질적인 생산 특성이다. 종자 전염병을 억제하고 훌륭한 발아성을 갖는 종자를 생산하기 위해 곡물을 다른 곡물 및 잡초로부터 보호하는 것은 어렵지만, 정당한 가격의 확실한 종자 생산 실례가 순수한 종자의 생장, 상태 조절 및 판매 분야에 경험있는 종자 생산자에 의해 개발되고 있다. 따라서, 경작자 자신의 작물로부터 수확된 종자를 사용하는 대신 특별한 품질 기준에 부합되는 증명된 종자를 구입하는 것이 일반적이다. 종자로서 사용된 증식 물질은, 통상적으로 제초제, 살충제, 살진제, 살균제, 살선충제, 의연체 동물 억제제 또는 이의 혼합물을 포함한 보호 피복제로 처리한다. 통상적으로 사용되는 보호 피복제에는, 캅탄, 카복신, 티람(TMTDR), 메탈락실(ApronR) 및 피리미포스-메틸(ActellicR)과 같은 화합물이 포함된다. 필요하다면, 이들 화합물은, 세균, 곰팡이 또는 동물 기생충에 의해 야기되는 피해에 대한 보호를 제공하는 제형화 분야에서 통상적으로 사용되는 추가의 담체, 계면활성제 또는 적용-촉진 보조제와 함께 제형화된다. 보호 피복제는, 액체 제형을 증식 물질에 침지시키거나 배합된 습윤 또는 무수 제형으로 피복시킴으로써 적용할 수 있다. 또한, 싹 또는 열매에 직접적인 처리와 같은 다른 적용 방법이 가능하다.
본 발명의 추가 양태는, 본 발명에 따른 유전자이식 식물, 유전자이식 식물 물질 또는 유전자이식 종자의 사용으로 특징화되는, 상기 예시한 방법과 같은 신규한 농업적 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은, 본 발명의 키메라 유전자가 제초제에 대한 내성을 부여하는 식물의 제초제 표적 단백질의 제초체-내성 형태를 발현시키기에 충분한 양으로 포함되는 유전자이식 식물 또는 이의 자손을 사용하는 농업적 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따라 형질전환된 식물의 자손을 번식시키는데 있어서, 다음과 같은 방법을 사용할 수 있다: 하기에 기술할 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 생산된 옥수수 식물을 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이 온실 또는 토양중의 포트에서 성장시키고 개화시킨다; 성숙한 수술로부터 꽃가루를 수득하고, 이를 동일한 식물, 동기 식물 또는 다른 바람직한 옥수수의 이삭을 수분하는데 사용한다. 유사하게, 형질전환된 식물에서 개발된 이삭은 동일한 식물, 동기 식물 또는 다른 바람직한 옥수수 식물로부터 수득할 수 있는 꽃가루로 수분할 수 있다. 상기 방법으로 수득한 형질전환된 자손은 도입된 유전자(들) 및/또는 관련된 DNA(유전형) 또는 부여된 표현형에 의해 비-형질전환된 자손과 구별할 수 있다. 유사하게 형질전환된 자손은, 바람직한 특성을 갖는 임의의 식물이 정상적으로 수행하는 것처럼, 자가 수정하거나 다른 식물과 교배될 수 있다. 유사하게, 상기 방법에 의해 생산된 담배 또는 다른 형질전환된 식물은 바람직한 특성을 갖는 자손을 생산하기 위해 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이 자가 수정하거나 교배될 수 있다. 유사하게, 당해 기술 분야에서 공지된 방법 및 본 발명의 방법의 조합에 의해 생산된 다른 유전자이식 생물은 바람직한 특성을 갖는 자손을 생산하기 위해 당해 기술 분야에서 공지된 방법으로서 번식시킬 수 있다.
본 발명은, 하기에 기술될 실시예에 어떤 제한적 의미를 주지 않으면서 하기 실시예에서 보다 자세하게 설명된다.
실시예 1
아라비돕시스 탈리아나 프로톡스-1 프로모터 서열의 분리
아라비돕시스 탈리아나(콜롬비아, 식물 전체)로부터 제조된 람다 잽(Lamda Zap) Ⅱ 게놈 DNA 라이브러리를 스트라타진(Stratagene)사로부터 구입한다. 약 125,000개의 파지를 15㎝의 페트리 디쉬당 25,000pfu(플라크 형성 단위)의 밀도로 플레이팅하고, 콜로니/플라크 스크린 막(NEN Dupont사)상에 복제물을 올린다. 플라크 복제물은 랜덤 프라이밍 방법(ramdom priming method, Life Technologies사)에 의해32P-dCTP로 표지된 아라비돕시스 프로톡스-1 cDNA(서열 1)로 프로빙한다. 문헌[참조: Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984)]에 기술된 바와 같이 하이브리드화 및 세척 조건을 65℃로 한다. 양성으로 하이브리드화된 플라크를 정제하고, 생체내에서 pBluescript 플라스미드내로 잘라낸다. 게놈 DNA 삽입체로부터의 서열은 형광 염료(Applied Biosystems, Inc.)로 표지된 디데옥시 터미네이터를 사용한 연쇄 종결 방법에 의해 측정한다. 한가지 클론인 AraPT1Pro는 프로톡스-1 단백질 암호화 서열의 개시 메티오닌(ATG)으로부터 상부의 아라비돕시스 서열 580bp를 포함하는 것으로 측정되었다. 또한, 이 클론은 프로톡스-1 cDNA의 1241bp로 확장된 암호화 서열 및 인트론을 포함한다. 5'의 비암호화 단편 580bp는 아라비돕시스 프로톡스-1 프로모터로 추정되고, 서열은 서열 13에 기술되어 있다.
AraPT1Pro는 1995년 12월 14일 pWDC-11로서 기탁되었다(NRRL #B-21515).
실시예 2
천연 아라비돕시스 프로톡스-1 프로모터하에서 변화된 프로톡스-1 유전자를 발현시키는 식물 형질전환 벡터의 작제
변화된 적절한 아라비돕시스 프로톡스-1 cDNA의 전체 길이의 cDNA를 EcoRⅠ-XhoⅠ의 부분적 절단 단편으로서 분리하고, 식물 발현 벡터 pCGN1761ENX(1995년 6월 8일 출원되고 WO 95/34659로서 1995년 12월 21일 공개된 PCT/IB 95/00452의 실시예 9를 참조)로 클로닝한다. 이 플라스미드를 NcoⅠ 및 BamHⅠ으로 절단하여 전체 프로톡스-1 cDNA와 아그로박테리움 투메파시엔스의 tml 유전자의 3' 비해독된 서열로부터의 전사 터미네이터를 포함한 단편을 생산한다. 상기한 AraPT1Pro 플라미스드를 NcoⅠ 및 BamHⅠ으로 절단하여 pBluescript 및 추정된 아라비돕시스 프로톡스-1 프로모터 580bp를 포함하는 단편을 생산한다. 이들 두 단편을 접합하여 천연 프로톡스 프로모터에 융합된 변화된 프로톡스 cDNA를 생산한다. 프로톡스-1 프로모터/프로톡스-1 cDNA/tml 터미네이터 융합체를 포함한 발현 카세트를 KpnⅠ으로 절단하고, 한 쌍의 pCIB200 벡터내로 클로닝한다. 한 쌍의 플라스미드를 전기천공에 의해 아그로박테리움내로 형질전환시킨 후 진공 침투 방법(Bechtold et al. C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199 (1993))을 사용하여 아라비돕시스내로 형질전환시킨다. 변화된 프로톡스 유전자를 발현하는 형질전환체를 카나마이신상에서 선택하거나, 다양한 농도의 프로톡스 억제 제초제상에서 선택한다.
실시예 3
천연 프로톡스-1 프로모터/변화된 프로톡스-1 융합체의 발현에 의한 제초제-내성 식물의 생산
상기한 공정을 사용하여, 프로톡스-1 서열(서열 1)에서 뉴클레오타이드 1306 내지 1308이 TAC에서 ATG(티로신에서 메티오닌)로의 변화를 포함한 아라비돕시스 프로톡스-1 cDNA를 천연 프로톡스-1 프로모터 단편과 융합시키고, 아라비돕시스 탈리아나내로 형질전환시킨다. 상기 변화된 프로톡스-1 효소(AraC-2Met)는 세균 발현 시스템에서 시험할 경우, 자연적으로 발생하는 효소보다 각종 프로톡스-억제 제초제에 대해 10배 이상의 내성을 보여준다[본 출원과 동일자로 제출된 "DNA Molecules Encoding Plant Protoporphyrinogen Oxidase and Inhibitors Resistant Mutant Thereof"란 명칭의 공동 계류중인 국제 출원(참조 번호 PH/5-20757/P1/CGC1847)을 참조하라]. 진공 침투된 식물의 종자를 수집하고, 화학식 ⅩⅦ의 프로톡스 억제 아릴우라실 제초제의 농도 범위(10.0nM 내지 1.0uM)에서 플레이팅한다. 야생형 아라비돕시스를 사용한 다중 실험은 정상적인 종자 발아를 억제하는데 상기 화합물 10.0nM의 농도면 충분하다는 것을 보여준다. 천연 프로톡스-1 프로모터에 융합된 AraC-2Met 변화된 효소를 발현시키는 유전자이식 종자가 500nM 농도 이하의 제초제에서 정상적인 아라비돕시스 발아를 생성한다는 것은 야생형 아라비돕시스와 비교하여 50배 이상의 제초제 내성을 보여준다. 따라서, 상기한 프로모터/변화된 프로톡스 효소 융합체는 식물 형질전환에 대한 효과적인 선별 마커로서 기능한다. 프로톡스-억제 제초제 100.0nM에서 발아되는 몇몇 식물을 토양에 옮겨심고, 2 내지 3주 생장시키고, 프로톡스-억제 제초제의 다양한 농도에서 분무 분석을 시험한다. 벡터가 없는 대조군 형질전환체와 비교하여, AraPT1Pro/AraC-2Met 유전자이식체는 제초제 분무에 10배 이상의 내성을 갖는다.
실시예 4
옥수수 프로톡스-1 프로모터 서열의 분리
람다 FIX Ⅱ 벡터내의 제아 메이즈(Zea Mays, 미주리에서 17번 근친교배, 황변된 종자) 게놈 DNA 라이브러리를 스트라타진사로부터 구입한다. 약 250,000pfu의 라이브러리를 15㎝ 플레이트당 50,000파지의 밀도로 플레이팅하고, 콜로니/플라크 스크린 막(NEN Dupont사)상에 복제물을 올린다. 플라크 복제물은 랜덤 프라이밍 방법(Life Technologies사)에 의해32P-dCTP로 표지된 옥수수 프로톡스-1 cDNA(서열 1)로 프로빙한다. 문헌[참조: Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984)]에 기술된 바와 같이 하이브리드화 및 세척 조건을 65℃로 한다. 람다 파지 DNA를 위저드 람다 프렙 DNA 정제 시스템(Wizard Lamda Preps DNA purification System, Promega사)을 사용하여 3개의 양성 하이브리드화된 파지로부터 분리한다. 제한 절단에 의한 분석, 하이브리드화 형태 및 DNA 서열 분석으로, cDNA 클론으로 먼저 분리된 옥수수 프로톡스-1 암호화 서열 5'에 위치한 옥수수 게놈 DNA 약 3.5kb를 포함한 람다 클론을 확인한다. 이 단편은 옥수수 프로톡스-1 프로모터를 포함하는 것으로 생각된다. 이 단편의 서열을 서열 14에 기술한다. 뉴클레오타이드 1 내지 3532의 서열은 5' 비암호화 서열에 포함된다. 뉴클레오타이드 3533 내지 3848의 서열은 옥수수 프로톡스-1 단백질의 5' 말단을 암호화한다.
나머지 옥수수 프로톡스-1 암호화 서열에 융합된 서열 14의 서열을 포함한 플라스미드는 1996년 3월 19일 pWDC-14로서 기탁되었다(NRRL #B-21546).
실시예 5
식물 형질전환 벡터의 작제
식물 형질전환에 수많은 형질전환 벡터를 이용할 수 있고, 본 발명의 프로모터 및 키메라 유전자를 어떤 벡터와도 결합하여 사용할 수 있다. 이에 사용하기 위한 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환시킬 표적 생물종에 의존적이다. 특정 표적 생물종에 있어서는 상이한 항생제 또는 제초제 선택 마커가 바람직하다. 형질전환에 일상적으로 사용되는 선택 마커에는 카나마이신 및 관련 항생제에 대하여 내성을 부여하는 nptⅡ 유전자[참조: Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)], 제초제 포스피노트리신에 대하여 내성을 부여하는 bar 유전자[참조: White et al., Nucl Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al, Theor Appl Genet 79: 625-631 (1990)], 항생제 하이그로마이신에 대하여 내성을 부여하는 hph 유전자[참조: Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931] 및 메토트렉세이트에 대하여 내성을 부여하는 dhfr 유전자[참조: Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)]가 포함된다.
Ⅰ. 아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터의 작제
아그로박테리움 투메파시엔스를 사용한 형질전환에 많은 벡터를 이용할 수 있다. 이는 전형적으로 1개 이상의 T-DNA 경계 서열을 운반하고, pBIN 19[참조: Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)] 및 pXYZ와 같은 벡터를 포함한다. 2가지의 전형적인 벡터의 작제가 하기에 기술되어 있다.
pCIB200 및 pCIB2001의 작제: 한 쌍의 벡터 pCIB200 및 pCIB2001를 아그로박테리움에 사용하기 위한 재조합 벡터를 작제하는데 사용하고, 다음과 같은 방법으로 작제한다. 테트라사이클린-내성 유전자를 절단하고, 이어서 NPTⅡ를 운반하는 pUC4K[참조: Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al, Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)]의 AccⅠ 단편을 삽입시킨 pTJS75[참조: Schmidhauser & Helinsk, J Bacteriol. 164: 446-455 (1985)]를 NarⅠ으로 절단하여 pTJS75kan을 제조한다. T-DNA 경계의 좌우, 식물의 선택적 nos/nptⅡ 키메라 유전자 및 pUC 폴리링커[참조: Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)]를 포함하는 pCIB7의 EcoRⅠ 단편을 XhoⅠ 링커와 접합시키고, XhoⅠ-절단 단편을 SalⅠ-절단된 pTJS75kan으로 클로닝시켜 pCIB200을 제조한다[참조: EP 0 332 104, 실시예 19 (1338)]. pCIB200은 다음과 같이 독특한 폴리링커 제한 부위를 포함한다: EcoRⅠ, SstⅠ, KpnⅠ, BglII, XbaⅠ 및 SalⅠ. pCIB2001은 추가의 제한 부위로 폴리링커를 삽입하여 제조한 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커에서 독특한 제한 부위는 EcoRⅠ, SstⅠ, KpnⅠ, BglⅡ, XbaⅠ, SalⅠ, MluⅠ, BclⅠ, AvrⅡ, ApaⅠ, HpaⅠ 및 StuⅠ이다. 이들 독특한 제한 부위를 포함하는 것 이외에, pCIB2001은 또한 식물 및 세균 카나마이신 선택, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 좌우 T-DNA 경계, E. Coli 및 기타 숙주 사이의 이동을 위한 RK2-유도된 trfA 기능, 및 또한 RK2로부터의 OriT 및 OriV 기능을 포함한다. pCIB2001 플리링커는 자체의 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다.
pCIB10 및 이의 하이그로마이신 선택 유도체의 작제는 다음과 같다: 한 쌍의 벡터 pCIB10에는 식물에서 선택을 위해 카나마이신 내성을 암호화하는 유전자, 및 T-DNA 좌우 경계 서열이 포함되고, E. Coli 및 아그로박테리움 모두에서 복제를 가능하게 하는 광범위한 숙주-범위의 플라스미드 pRK252 서열이 혼입되어 있다. 이의 작제는 문헌[참조: Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)]에 기술되어 있다. 문헌[참조: Gritz et al., Gene 25: 179-188 (1983)]에 기술한 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 혼입시켜 pCIB10의 다양한 유도체를 작제한다. 이들 유도체는 하이그로마이신(pCIB743)상에서 또는 하이그로마이신 및 카나마이신(pCIB715, pCIB717)상에서 유전자이식 식물 세포의 선택을 가능하게 한다.
Ⅱ. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터의 작제
아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하지 않은 형질전환은 형질전환 벡터를 선택하는데 있어서 T-DNA 서열에 대한 필요성을 피하여 결과적으로 T-DNA 서열을 포함한 상기 종류의 벡터 이외에 이들 서열이 결핍된 벡터가 사용될 수 있다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술에는 입자 충격(particle bombardment), 원형질 흡수(예를 들어 PEG 및 전기천공) 및 미세주입(microinjection)에 의한 형질전환이 포함된다. 벡터의 선택은 형질전환될 바람직한 생물종의 선택에 크게 의존한다. 하기에, 몇몇 전형적인 벡터의 작제를 기술한다.
pCIB3064의 작제: pCIB3064는 제초제 바스타(또는 포스피리노트리신)에 의한 선택과 조합되어 직접적인 유전자 전달 기술에 적합한 pUC-유도된 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 E. Coli GUS 유전자에 작동가능하게 융합된 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 전사 터미네이터를 포함하고, 이는 PCT 공개 특허원 WO 93/07278에 기술되어 있다. 이 벡터의 35S 프로모터는 시작 부위의 2개의 5' ATG 서열을 포함한다. 이들 부위를 표준 PCR 기술을 사용하여 ATG를 제거하는 방식으로 돌연변이시키고, 제한 부위 SapⅠ 및 PvuⅡ를 생성한다. 신규한 제한 부위는 독특한 SalⅠ 부위로부터 96 및 36bp 떨어져 있고, 실질적인 시작 부위로부터 101 및 42bp 떨어져있다. 생성된 pCIB246의 유도체는 pCIB3025로 지정한다. GUS 유전자를 SalⅠ 및 SacⅠ으로 절단하여 pCIB3025로부터 잘라낸 후, 말단을 블런트로 만들고, 재접합하여 pCIB3060을 생성한다. 플라스미드 pJIT82를 존 인스 센터(John Innes Center, Norwich)로부터 수득하고, 스트렙토마이세스 비리도크로모겐으로부터의 bar 유전자를 포함한 400bp의 SmaⅠ 단편을 잘라내어 pCIB3060[참조: Thompson et al., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)]의 HpaⅠ 부위에 삽입한다. 이로써 CaMV 53S 프로모터 및 제초제 선택에 대한 터미네이터의 조절하의 bar 유전자, 암피실린 내성에 대한 유전자(E. Coli에서의 선택을 위해) 및 독특한 부위 SphⅠ, PstⅠ, HindⅢ 및 BamHⅠ을 갖는 폴리링커를 포함하는 pCIB3064를 생성한다. 이 벡터는 자체적인 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다
pSOG19 및 pSOG35의 작제: pSOG35는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선택적인 마커로서 E. Coli 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 이용하는 형질전환 벡터이다. 35S 프로모터(약 800bp), 옥수수 Adh 1 유전자로부터의 인트론 6(약 550bp) 및 pSOG10으로부터의 GUS 비해독된 리더 서열 18bp를 증폭시키는데 PCR을 사용한다. 또한, E. Coli 디하이드로폴레이트 리덕타제 유형 Ⅱ 유전자를 암호화하는 250bp의 단편을 PCR로 증폭시키고, 이들 두 PCR 단편을 pUC19 벡터 골격 및 노팔린 신타제 터미네이터를 포함하는 pBI221(클론테크, Clontech)로부터의 SacI-PstI 단편으로 조립한다. 이들 단편들의 조립은 인트로 6 서열과 융합된 35S 프로모터, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 터미네이터를 포함하는 pSOG19를 생성한다. pSOG19에서 GUS 리더를 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(Maize Chlorotic Mottle Virus, MCMV)의 리더 서열로서 대체하여 벡터 pSOG35를 생성한다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성에 대한 pUC 유전자를 포함하고, 식물 프로톡스 프로모터를 포함한 키메라 유전자 서열과 같은 외부 서열의 클로닝에 사용할 수 있는 HindⅢ, SphⅠ, PstⅠ 및 EcoRⅠ 부위를 갖는다.
실시예 6
키메라 유전자/식물 발현 카세트의 작제
식물 프로톡스 프로모터의 조절하에 유전자이식 식물에서의 발현이 의도된 암호화 서열은 적합한 프로톡스 프로모터 및 상부의 적합한 전사 터미네이터하에서 발현 카세트로 조립할 수 있다. 생성된 키메라 유전자는 실시예 5에서 상기한 식물 형질전환 벡터로 용이하게 전달될 수 있다.
Ⅰ. 프로톡스 프로모터 선택
본 발명에 따라, 키메라 유전자는 식물 프로톡스 프로모터를 포함한다. 키메라 유전자에서 사용되는 특정 프로톡스 프로모터를 선택하는 것은, 일반적으로 밀접하게 관련된 식물종, 가장 바람직하게는 생성된 키메라 유전자를 포함시키고자 하는 식물종과 동일한 프로톡스 프로모터를 사용하는 것이 바람직하지만, 주로 개별적인 연구자에 달려 있다. 예를 들어, 키메라 유전자가 옥수수에 포함될 경우, 외떡잎 식물을 사용하는 것이 바람직하고, 옥수수 프로톡스 프로모터를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
Ⅱ. 전사 터미네이터
각종 전사 터미네이터를 발현 카세트에서 사용할 수 있다. 이들은 전달유전자에 있어서의 전사의 종결 및 이의 정확한 폴리아데닐화를 유발한다. 적절한 전사 터미네이터는 식물에서 기능이 공지된 것으로, CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 노팔린 신타제 터미네이터, 완두 rbcS E9 터미네이터 뿐만 아니라 자연적으로 식물 프로톡스 유전자와 관련된 터미네이터(즉, "프로톡스 터미네이터")가 있다. 이들은 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 모두에서 사용될 수 있다.
Ⅲ. 발현 향상 또는 조절을 위한 서열
전사 단위내에서 이로부터의 유전자 발현을 향상시키는 무수한 서열이 밝혀졌고, 이들 서열은 유전자이식 식물에서 본 발명의 유전자와 결합하여 이의 발현을 증가시키는데 사용할 수 있다.
각종 인트론 서열이 특히 외떡잎 식물 세포에서 발현을 향상시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 옥수수 Adh1 유전자의 인트론은, 옥수수 세포로 도입될 경우, 이의 동족 프로모터하에서 야생형 유전자의 발현을 크게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 특히, 인트론 1은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 갖는 작제물과 융합시 특히 효과적이고 향상되게 발현시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)]. 동일한 실험 시스템에서, 옥수수 브롬즈 1 유전자의 인트론이 발현을 향상시키는데 유사한 효과를 갖는다[참조: Callis et al. 상기 참조]. 인트론 서열은 일상적으로 식물 형질전환 벡터, 특히 비-해독된 리더로 혼입된다.
바이러스로부터 유도된 무수한 비-해독된 리더 서열이 또한 발현을 향상시키는 것으로 공지되었고, 이들은 특히 쌍떡잎 식물에서 효과적이다. 특히, 담배의 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus, TMV, "W-서열"), 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV) 및 알파파 모자이크 바이러스(Alfafa Mosaic Virus)로부터의 리더 서열이 발현을 향상시키는데 효과적인 것으로 나타났다[참조: Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)].
Ⅳ. 세포내에서 유전자 생성물의 표적화
유전자 생성물을 표적화하는 각종 기작이 식물에 존재하는 것으로 공지되어 있으며, 이런 기작의 기능을 조절하는 서열이 다소 상세히 특성화되어 있다. 예를 들어, 엽록체에 대한 유전자 생성물의 표적화는 각종 단백질의 아미노 말단에서 발견된 시그날 서열에 의해 조절되고, 이는 엽록체가 생산한 성숙 단백질을 이입하는 동안 절단된다[참조: Comai et al. J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)]. 이 시그날 서열은 이종 유전자 생성물과 융합되어 이종 생성물을 엽록체내로 이입시킬 수 있다[참조: van den Broeck et al, Nature 313: 358-363 (1985)]. 적절한 시그날 서열을 암호화하는 DNA는 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 신타제 효소, GS2 단백질 및 엽록체에 집중되는 것으로 공지된 기타의 많은 단백질을 암호화하는 cDNA의 5' 말단으로부터 분리될 수 있다.
기타 유전자 생성물은 미토콘드리아 및 퍼옥시좀과 같은 다른 세포 기관에 집중된다[참조: Unger et al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)]. 또한, 상기한 기관으로 이종 유전자 생성물의 표적화를 실행하도록 이들 생성물을 암호화하는 cDNA를 조작할 수 있다. 상기한 서열의 예로는 핵-암호화 ATP아제 및 미토콘드리아에 특이적인 아스파르테이트 아미노 트랜스퍼라제 이소형이 있다[참조: Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516 (1985)].
또한, 기타 세포 구획에서 유전자 생성물을 표적화하는 서열이 특성화되어 있다. 아미노 말단 서열은 ER, 아포플라스트 및 호분 세포로부터의 세포외 분비에 대한 표적화에 관여한다. 또한, 카복시 말단 서열과 결합된 아미노 말단 서열은 유전자 생성물의 액포 표적화에 관여한다[참조: Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)].
상기한 적절한 표적화 서열을 흥미로운 전달유전자 서열과 융합시킴으로써 임의의 세포 기관 또는 세포 구획에 전달유전자 생성물을 유도할 수 있다. 엽록체 표적화를 위해, 예를 들어 RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 신타제 유전자 또는 GS2 유전자로부터 선택된 엽록체 시그날 서열을 전달유전자의 아미노 말단 ATG의 구조에 융합시킨다. 선택된 시그날 서열은 공지된 절단 부위를 반드시 포함해야하며, 작제된 융합물은 절단에 필요한 절단 부위 다음의 아미노산이 어떤 것인지 고려해야만 한다. 몇몇 경우에서, 상기 필요성은 절단 부위 및 전달유전자 ATG 사이에 소수의 아미노산을 부가하거나 선택적으로 전달유전자 서열내에 몇몇 아미노산을 대체함으로써 충족시킬 수 있다. 엽록체 이입을 위해 작제된 융합물은 시험관내에서 전사된 작제물을 시험관내에서 해독한 후 문헌[참조: Bartlett et al. In:Edelmann et al.(Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. pp. 1081-1091 (1982); Wasmann et al. Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)]에 기술된 방법을 사용하여 시험관내 엽록체 흡수의 효능을 시험할 수 있다. 이런 작제 기술은 당해 기술 분야에서 공지된 것이고, 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에서 동일하게 적용할 수 있다. 전달유전자의 발현에 필요한 표적 선택은, 주어진 경로에 대한 출발점으로서 요구된 전구체의 세포내 국지성에 의존적이다. 이는 몇몇 경우에서는 미토콘드리아 또는 퍼옥시좀이지만, 일반적으로는 시토졸 또는 엽록체일 수 있다. 전달유전자 발현 생성물은 일반적으로 ER, 아포플라스트 또는 액포에 대한 표적화를 필요로 하지 않는다.
세포내 표적화에 대해 상기한 기작은 식물 프로톡스 프로모터와의 결합에 사용되어 프로모터로부터 유도된 표적화 시그날에 대해 상이한 발현 형태를 갖는 프로모터의 전사 조절하에서 특이적인 세포 표적화 목적을 수행할 수 있다.
실시예 7
쌍떡잎 식물의 형질전환
쌍떡잎 식물에 대한 형질전환 기술은 당해 기술 분야에서 공지된 것이고, 아그로박테리움-기본된 기술 및 아그로박테리움을 요구하지 않는 기술이 포함된다. 비-아그로박테리움 기술은 원형질체 또는 세포에 의한 직접적인 외인성 유전 물질의 흡수를 수반한다. 이는 PEG 또는 전기천공-매개된 흡수, 입자 충격-매개된 운반 또는 미세주입에 의해 수행될 수 있다. 이들 기술의 예는 문헌[참조: Paszkowaski et al., EMBO J 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), and Klein et al.,Nature 327: 70-73 (1987)]에 기술되어 있다. 각 경우에서, 형질전환된 세포는 당해 기술 분야에서 공지된 표준 기술을 사용하여 식물 전체로 재생된다.
아그로박테리움-매개된 형질전환은, 이의 형질전환 효율이 높고 많은 상이한 종을 사용하는 이의 광범위한 용도 때문에 쌍떡잎 식물의 형질전환을 위해 바람직한 기술이다. 아그로박테리움에 의해 일상적으로 형질전환되는 많은 작물 종에는 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 평지, 감자, 대두, 알파파 및 포플러가 포함된다[참조: EP 0 317 511(목화), EP 0 249 432(토마토, Calgene), WO 87/07299(브래시카, Calgene), US 4,795,855(포플러)] .
재조합 아그로박테리움에 의한 표적 식물종의 형질전환은 일반적으로 식물의 이식편과 아그로박테리움의 공동배양을 수반하고, 당해 기술 분야에서 익히 공지된 프로토콜을 따른다. 형질전환된 조직은 한 쌍의 플라스미드 T-DNA 경계사이에 존재하는 항생제-내성 또는 제초제-내성 마커를 포함하는 선택적 배지상에서 재생된다.
실시예 8
외떡잎 식물의 형질전환
대부분의 외떡잎 식물종의 형질전환은 현재 일반적인 것이다. 바람직한 기술에는 PEG 또는 전기천공 기술을 사용한 원형질체로의 직접적인 유전자 전달 및 유합 조직내로의 입자 충격이 포함된다. 형질전환은 단일종의 DNA 또는 다종의 DNA(즉, 공동-형질전환)로 수행될 수 있고, 이들 두 기술은 본 발명에 사용하기에 적합하다. 공동-형질전환은 복잡한 벡터 작제를 피할 수 있고, 흥미로운 유전자 및 선택적인 마커에 연결되지 않은 유전적 위치를 갖는 유전자이식 식물을 생성하고, 후속의 증식에서 바람직한 것으로 여겨지는 선택 마커의 제거가 가능하다는 잇점이 있다. 그러나, 공동-형질전환을 사용할 경우의 단점은 개개의 DNA 종류가 게놈에 통합되는 빈도가 100% 미만이라는 것이다[참조: Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096(1986)].
특허원 EP 0 292 453(Ciba-Geigy), EP 0 392 225(Ciba-Geigy), WO 93/07278(Ciba-Geigy) 및 미국 특허 제5,350,689(Ciba-Geigy)는 옥수수의 선택된 근친교배 계통으로부터 유합 조직 및 원형질체의 제조, PEG 및 전기천공을 사용한 원형질체의 형질전환 및 형질전환된 원형질체로부터 옥수수를 증식시키는 기술을 기술하고 있다. Gordon-Kamm 등 및 Fromm 등[참조: Plant Cell 2: 603-618 (1990) 및 Biotechnology 8: 833-839 (1990)]은 입자 충격을 사용한 A188-유도된 옥수수 계통의 형질전환 기술을 발표하였다. 또한, 특허원 WO 93/07278(Ciba-Geigy) 및 문헌[참조: Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993)]에는 입자 충격을 사용하여 옥수수의 선택된 근친교배 계통의 형질전환 기술을 기술하고 있다. 이 기술은 수분 후 14 내지 15일째 옥수수 이삭으로부터 잘라낸 1.5 내지 2.5㎜ 길이의 미숙한 옥수수 씨눈 및 충격을 위해 PDS-1000He 바이오리스틱 장치를 사용한다.
벼의 형질전환은 원형질 또는 입자 충격을 사용한 직접적인 유전자 전달 기술에 의해 수행된다. 원형질체-매개된 형질전환은 일본형(Japonica type) 및 인도형(Indica type)에 대해 기술된다[참조: Zhang et al., Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)]. 또한, 양쪽 형태는 입자 충격을 사용하여 일상적으로 형질전환된다[참조: Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991)].
특허원 EP 0 332 581(Ciba-Geigy)에는 푸이디에(Pooideae) 원형질체 생성, 형질전환 및 증식 기술이 기술되어 있다. 이들 기술은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀의 형질전환을 가능하게 한다. 또한, 장기간 증식될 수 있는 유합 세포 C 유형내로 입자 충격을 사용한 밀의 형질전환이 문헌[참조: Vasil et al., Biotechnology 10: 667-674 (1992)]에 기술되어 있고, 미숙한 씨눈 및 미숙한 씨눈-유도된 유합 세포의 입자 충격을 사용한 밀의 형질전환이 또한 Vasil 등 및 Weeks 등의 문헌[Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) and Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)]에 기술되어 있다. 그러나, 밀의 형질전환을 위한 바람직한 기술은 미숙한 씨눈의 입자 충격에 의한 밀의 형질전환을 수반하고, 유전자 전달 단계에 선행한 고-수크로즈 또는 고-말토즈 단계를 포함한다. 충격에 선행하여, 암실에서 실시되는 체세포 씨눈의 유도를 위해 특정수의 씨눈(0.75 내지 1㎜ 길이)을 3% 수크로즈[Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)] 및 2,4-D 3㎎/ℓ를 포함한 MS 배지상에 플레이팅한다. 충격 선택일에, 씨눈을 유도 배지로부터 제거하고 삼투 배지(즉, 바람직한 농도, 전형적으로 15%로 가해진 수크로즈 또는 말토즈를 갖는 유도 배지)상에 둔다. 씨눈을 2 내지 3시간 동안 원형질분리시킨 후 충격을 가한다. 중요하지는 않지만, 통상적으로 표적 플레이트 당 씨눈은 20개이다. 적절한 유전자-함유 플라스미드(예를 들어 pCIB3064 또는 pSG35)를 표준 공정을 사용하여 마이크로미터 크기의 금 입자상에 침전시킨다. 각각의 씨눈 플레이트를 표준 80 메쉬 스크린을 사용한 약 1000psi의 파열압을 사용하여 듀폰 바이오리스틱 헬륨 장치로 발사한다. 충격을 가한 후, 씨눈을 다시 암실에 두고, 약 24시간 동안 회복시킨다(여전히 삼투 배지). 24시간 후, 씨눈을 삼투 배지로부터 제거하고, 유도 배지상에 다시 두어 증식하기 전 약 1개월 동안 방치한다. 약 1개월 후, 씨눈발생 유합 세포를 발달시키는 씨눈 이식편을, 적절한 선택제(pCIB3064의 경우 바스타 10㎎/ℓ이고, pSOG35의 경우 메토트렉세이트 2㎎/ℓ)를 추가로 함유한 증식 배지(MS + NAA 1㎎/ℓ, GA 5㎎/ℓ)로 전달한다. 약 1개월 후, 발달된 발아를 1/2 농도의 MS, 2% 수크로즈 및 동일한 농도의 선택제를 함유한, "GA7s"로 공지된 보다 큰 멸균 용기로 옮긴다. WO 94/13822는 밀의 형질전환 방법을 기술하고 있고, 이는 본원에서 참고로서 인용된다.
실시예 9
천연 옥수수 프로톡스-1 프로모터하에서 변화된 프로톡스-1 유전자를 발현시키는 식물 형질전환 벡터의 작제
3848bp의 옥수수 게놈 단편(서열 14)을 SalⅠ-KpnⅠ으로 부분적으로 절단된 생성물로서 분리된 람다 파지로부터 잘라내고, 아미노산 164에서 알라닌이 루신으로 대체된 변화된 옥수수 프로톡스-1 cDNA로부터 유도된 KpnⅠ-NotⅠ 단편(서열 6)과 접합시킨다. 이로써 천연 옥수수 프로톡스-1 프로모터와 세균 시스템에서 제초제에 대한 내성을 부여하는 것으로 나타난 총 길이의 cDNA와의 융합물을 생성한다["DNA Molecules Encoding Plant Protoporphyrinogen Oxidase and Inhibitor Resistant Mutants Thereof"(참고 번호 PH/5-20757/P1/CGC1847)란 명칭의 공동 계류중인 국제 출원, 실시예 8 내지 13을 참조하라]. 이 융합물은 CaMV 35S 터미네이터 서열을 포함한 pUC18 유도된 벡터로 클로닝되어 프로톡스 프로모터/변화된 프로톡스 cDNA/터미네이터 카세트를 생성한다. 이 카세트를 포함한 플라스미드를 pWCo-1으로 지정한다.
옥수수 형질전환을 위한 제2 작제물은 옥수수 게놈 클론으로부터의 암호화 서열에서 발견된 제1 인트론을 옥수수 cDNA로 조작하여 생성한다. 인트론(서열 25)은 길이가 93bp이고, 서열 5의, 정확하게는 실시예 4에 기술된 람다 클론에서 자연적인 함유물처럼 보이는 바와 같이 뉴클레오타이드 203 및 204 사이에 삽입되어 있다. 상기 인트론-함유 형태의 발현 카세트는 pWCo-2로 지정한다.
실시예 10
유전자이식 옥수수 식물에서 옥수수 프로톡스-1 프로모터 활성의 증명
옥수수 프로톡스 프로모터/변화된 프로톡스 융합물로 형질전환된 옥수수 식물은 전달유전자에 특이적인 프라이머로 PCR 분석을 사용하여 확인한다. 총 RNA를 PCR 양성 식물로부터 제조하고, 슈퍼스크립트(Superscript) M-MLV(Life Technologies 사)를 사용하여 추천된 조건하에서 역-전사시킨다. 역전사 반응물 2㎕를 변화된 프로톡스 서열에 대해 특이적으로 고안된 PCR 반응에 사용한다. 상기 반응에서 비형질전환된 대조군이 생성물을 생산하지 않는 반면, pWCo-1으로 형질전환된 식물의 약 85%가 전달유전자로부터 유도된 mRNA의 존재를 나타내는 양성 결과를 생성하였다. 이는 옥수수 프로톡스 프로모터에 대한 어느 정도의 활성 수준을 증명한다. 또한, 유전자이식 옥수수 식물로부터의 RNA는 프로브로서 서열 5로부터의 방사능표지된 옥수수 프로톡스 cDNA 단편을 사용한 표준 노던 블롯팅 분석을 실시한다. 비형질전환된 대조군 농도를 크게 능가하는 프로톡스-1 mRNA 농도가 몇몇 유전자이식 옥수수 식물에서 검출되었다. 이런 상승된 mRNA 농도는 클로닝된 옥수수 프로톡스 프로모터로부터의 변화된 프로톡스-1 mRNA의 발현에 기인한 것으로 추정된다.
실시예 11
사탕무 프로톡스-1 프로모터 서열의 분리
사탕무 게놈 라이브러리는 람다 FIX Ⅱ 벡터내에서 스트라타진사에 의해 제조되었다. 라이브러리 약 300,000pfu를 플레이팅하고, 실시예 4에서 옥수수에 대해 기술한 바와 같이 사탕무 프로톡스-1 cDNA 서열(서열 17)로 프로빙한다. 제한 절단에 의한 분석, 하이브리드화 형태 및 DNA 서열 분석으로, cDNA 클론으로 먼저 분리된 사탕무 암호화 서열에 대해 5' 방향으로 위치한 약 7kb의 사탕무 게놈 DNA를 함유한 람다 클론을 확인하였다. 2606bp의 PstⅠ-SalⅠ 단편을 람다 클론으로부터 pBluescript 벡터내로 서브클로닝한다. 상기 단편은 2068bp의 5' 비암호화 서열을 포함하고, 사탕무 프로톡스-1 프로모터 서열을 포함한다. 또한, 이는 프로톡스-1 암호화 서열의 처음 453bp 및 암호화 서열내에 포함된 85bp의 제1 인트론을 포함한다. 이 단편의 서열은 서열 26에 기술되어 있다.
서열 서열 26을 포함한 플라스미드를 pWDC-20(NRRL #B-21650)으로서 1996년 2월 6일 기탁하였다.
실시예 12
천연 사탕무 프로톡스-1 프로모터하에서 변화된 사탕무 프로톡스-1 유전자를 발현시키는 식물 형질전환 벡터의 작제
사탕무 게놈 단편(서열 26)을 5' 비암호화 서열 2068bp 및 사탕무 프로톡스-1 암호화 서열의 처음 300bp를 포함한 SacⅠ-BsrGⅠ 단편으로서 실시예 11에서 기술한 게놈 서브클론으로부터 잘라낸다. 이 단편을, 아미노산 449에서 티로신이 메티오닌으로 치환된 변화된 사탕무 프로톡스-1 cDNA(서열 18)로부터 유도된 BsrGⅠ-NotⅠ 단편과 접합한다. 이로써 천연 사탕무 프로톡스-1 프로모터와 세균 시스템에서 제초제 내성을 부여하는 것으로 나타난 cDNA 총 길이와의 융합물을 생성한다(공동 계류중인 국제 출원 NO. (참고 번호 PH/5-20757/P1/CGC1847). 이 융합물을 CaMV 35S 터미네이터 서열을 포함한 pUC18-유도된 벡터내로 클로닝하여 프로톡스 프로모터/변화된 프로톡스 cDNA/터미네이터 카세트를 생성한다. 이 카세트를 포함하는 플라스미드를 pWCo-3이라 지정한다.
실시예 13
천연 사탕무 프로톡스-1 프로모터/변화된 사탕무 프로톡스-1 융합물의 발현에 의해 제초제 내성 식물의 생산
pWCo-3으로부터의 발현 카세트를 쌍떡잎 식물에 적용할 수 있는, 아그로박테리움, 원형질체 및 바이오리스틱 형질전환 기술을 포함한 임의의 형질전환 방법을 사용하여 사탕무내로 형질전환시킨다. 변화된 프로톡스-1 효소를 발현하는 유전자이식 사탕무는 RNA-PCR에 의해 확인하고, 비형질전환된 사탕무에 치명적인 농도에서 프로톡스-억제 제초제에 대한 내성을 시험한다.
본 발명은 이의 특별한 양태를 참조로 기술하고 있지만, 수많은 변화, 변형 및 양태가 가능하다는 것을 이해하고, 따라서 모든 상기한 변화, 변형 및 양태는 본 발명의 정신 및 범주내에 있는 것으로 간주한다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인 : 존슨, 마리에, 볼라쓰, 산드라, 워드, 에릭
(ii) 발명의 명칭 : 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제 유전자로부터의 프로모터
(iii) 서열 수 : 26
(iv) 통신 주소 :
(A) 주소 : 노바르티스 코포레이션
(B) 거리 : 피 오 박스 2005 화이트 플레인스 로오드 520
(C) 도시 : 테리타운
(D) 주 : 뉴욕
(E) 국가 : 미국
(F) 우편 번호 : 10591-9005
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 형태 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환
(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1, Version #1.30
(vi) 현재 출원 정보 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 번호 :
(vii) 선행 출원 정보 :
(A) 출원 번호 : US 60/012,705
(B) 출원일 : 1996년 2월 28일
(vii) 선행 출원 정보 :
(A) 출원 번호 : US 60/013,612
(B) 출원일 : 1996년 2월 28일
(vii) 선행 출원 정보 :
(A) 출원 번호 : US 60/020,003
(B) 출원일 : 1996년 6월 21일
(viii) 변호인/대리인 정보 :
(A) 성명 : 메이그스 제이 티모티
(B) 등록 번호 : 38,241
(C) 참조/도켓 번호 : CGC 1846
(xi) 원거리통신 정보 :
(A) 전화 번호 : (919) 541-8587
(B) 팩스 번호 : (919) 541-8689
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1719개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-2(NRRL B-21238)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 31..1644
(D) 기타 정보 : /생성물="아라비돕시스 프로톡스-1"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 537개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1738개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-2(NRRL B-21237)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 70..1596
(D) 기타 정보 : /생성물="아라비돕시스 프로톡스-2"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 508개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1691개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 제아 메이스(Zea mays(옥수수))
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-4(NRRL B-21260)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 1..1443
(D) 기타 정보 : /생성물="옥수수 프로톡스-1 cDNA"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 481개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 2061개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 제아 메이스(Zea mays(옥수수))
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-3(NRRL B-21259)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 64..1698
(D) 기타 정보 : /생성물="옥수수 프로톡스-2"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 544개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1811개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)(밀)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-13(NRRL B-21545)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 3..1589
(D) 기타 정보 : /생성물="밀 프로톡스-1"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 528개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1847개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 대두
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-12(NRRL B-21516)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 55..1683
(D) 기타 정보 : /생성물="대두 프로톡스-1"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 543개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 583개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA(게놈)
(iii) 가설 : 없음
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : 프로모터
(B) 위치 : 1..583
(D) 기타 정보 : /기능="아라비돕시스 프로톡스-1 프로모터"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 3848개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA(게놈)
(iii) 가설 : 없음
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : 프로모터
(B) 위치 : 1..3848
(D) 기타 정보 : /기능="옥수수 프로톡스-1 프로모터"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1826개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)(목화)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-15(NRRL B-21594)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 31..1647
(D) 기타 정보 : /생성물="목화 프로톡스-1 암호화 영역"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 539개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 쇄 : 관련 없음
(D) 형태 : 관련 없음
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1910개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 베타 불가리스(Beta vulgaris)(사탕무)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-16(NRRL B-21595N)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 1..1680
(D) 기타 정보 : /생성물="사탕무 프로톡스-1 암호화 영역"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 560개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 쇄 : 관련 없음
(D) 형태 : 관련 없음
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1784개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 브라씨카 나푸스(Brassica napus)(평지)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-17(NRRL B-21615)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 47..1654
(D) 기타 정보 : /생성물="평지 프로톡스-1 암호화 영역"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 536개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 쇄 : 관련 없음
(D) 형태 : 관련 없음
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1224개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 오리자 사티브(Oryza sative)(벼)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-18(NRRL B-21648)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 1..936
(D) 기타 정보 : /생성물="벼 프로톡스-1 부분 암호화 영역"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 312개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 쇄 : 관련 없음
(D) 형태 : 관련 없음
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1590개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 소르굼 비콜로(Sorghum bicolor)(수수)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-19(NRRL B-21649)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 1..1320
(D) 기타 정보 : /생성물="수수 프로톡스-1 부분 암호화 영역"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 440개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 쇄 : 관련 없음
(D) 형태 : 관련 없음
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 25에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 93개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : 다른 핵산
(ix) 특성 :
(A) 기술 : /desc="옥수수 프로톡스-1 인트론 서열"
(xi) 서열 기술 :
(2) 서열 26에 대한 정보:
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 2606개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄 : 일본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA(게놈)
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센스 : 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 생물 : 베타 불가리스(Beta vulgaris)(사탕무)
(vii) 중간체 공급원 :
(B) 클론 : pWDC-20(NRRL B-21650)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 1..6
(D) 기타 정보 : /주목="SalI 부위"
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 상보성(1..538)
(D) 기타 정보 : /주목="3'에서 5' 방향으로 사탕무 프로톡스-1의 부분 cDNA"
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : misc_특성
(B) 위치 : 539..2606
(D) 기타 정보 : /주목="3'에서 5' 방향으로 나타낸 사탕무 프로톡스-1 프로모터 영역(pWDC-20으로부터 서브클로닝된 약 3kb PstI-SalI 단편의 부분 서열)"
(xi) 서열 기술 :
Claims (63)
- 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 프로모터 또는 이의 기능상 동등한 유도체를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제에 대한 암호화 서열과 자연적으로 결합된 식물 프로톡스 프로모터를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 제2항에 있어서, 식물이 아라비돕시스(Arabidopsis) 종인 분리된 DNA 분자.
- 제3에 있어서, DNA 분자가 서열 13에 기술된 뉴클레오타이드 서열 및 적당히 엄격한 조건하에 이와 하이브리드화하는 모든 DNA 분자를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 제2항에 있어서, 식물이 옥수수인 분리된 DNA 분자.
- 제5항에 있어서, DNA 분자가 서열 14에 기술된 뉴클레오타이드 서열 및 적당히 엄격한 조건하에 이와 하이브리드화하는 모든 DNA 분자를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 제2항에 있어서, 식물이 사탕무인 분리된 DNA 분자.
- 제7항에 있어서, DNA 분자가 서열 26에 기술된 뉴클레오타이드 서열 및 적당히 엄격한 조건하에 이와 하이브리드화하는 모든 DNA 분자를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 기술된 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스) 프로모터 또는 이의 기능상 동등한 유도체를 포함하는 재조합체 DNA 분자.
- 이종성 DNA 암호화 서열과 작동가능하게 결합된 식물 프로톡스 프로모터를 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 식물 프로톡스 프로모터가 프로톡스-1 유전자로부터 유래하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 식물 프로톡스 프로모터가 프로톡스-2 유전자로부터 유래하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 프로톡스 프로모터가 아라비돕시스, 대두, 목화, 담배, 사탕무, 오일시드 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 벼로 이루어진 그룹중에서 선택된 식물로부터 유래하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 프로모터가 아라비돕시스, 사탕무 및 옥수수로 이루어진 그룹중에서 선택된 식물로부터 유래하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 프로모터가 아라비돕시스 및 옥수수로 이루어진 그룹중에서 선택된 식물로부터 유래하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 프로모터가 사탕무로부터 유래하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 프로모터의 뉴클레오타이드 길이가 300개 이상인 키메라 유전자.
- 제17항에 있어서, 프로모터의 뉴클레오타이드 길이가 500개 이상인 키메라 유전자.
- 제11항에 있어서, 프로모터가 아라비돕시스로부터 유래하고 서열 13에 기술된 서열을 갖는 키메라 유전자.
- 제11항에 있어서, 프로모터가 옥수수로부터 유래하고 서열 14에 기술된 서열을 갖는 키메라 유전자.
- 제11항에 있어서, 프로모터가 사탕무로부터 유래하고 서열 26에 기술된 서열을 갖는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 암호화 서열이 변형된 제초제-내성 형태의 식물 효소를 암호화하는 키메라 유전자.
- 제22항에 있어서, 식물 효소가 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라타제(IGPD), 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSP), 글루타민 신세타제(GS), 아세틸 조효소 A 카복실라제, 아세토락테이트 신타제, 히스티디놀 데하이드로게나제 및 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 키메라 유전자.
- 제23항에 있어서, 식물 효소가 프로톡스인 키메라 유전자.
- 제23항에 있어서, 식물 효소가 프로톡스 억제제에 내성을 부여하는 아미노산 치환체를 갖는 진핵성 프로톡스인 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성 또는 프로톡스-2 활성을 갖는 아라비돕시스 종으로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제26항에 있어서, 단백질이 서열 2 또는 서열 4에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성 또는 프로톡스-2 활성을 갖는 옥수수로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제28항에 있어서, 단백질이 서열 6 또는 서열 8에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 밀로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제30항에 있어서, 단백질이 서열 10에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 대두로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제32항에 있어서, 단백질이 서열 12에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 목화로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제34항에 있어서, 단백질이 서열 16에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 사탕무로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제36항에 있어서, 단백질이 서열 18에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 평지로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제38항에 있어서, 단백질이 서열 20에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 벼로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제40항에 있어서, 단백질이 서열 22에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, 이종성 DNA 분자가 프로톡스-1 활성을 갖는 수수로부터의 단백질을 암호화하는 키메라 유전자.
- 제42항에 있어서, 단백질이 서열 24에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
- 제9항의 재조합체 DNA 분자를 포함하는 재조합체 DNA 벡터.
- 식물, 식물 종자, 식물 조직 또는 식물 세포를 안정하게 형질전환시킬 수 있는, 제10항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 재조합체 벡터.
- 제10항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 식물 조직.
- 제10항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 식물 및 이의 자손.
- 제47항에 있어서, 식물이 아라비돕시스, 사탕수수, 대두, 보리, 목화, 담배, 사탕무, 오일시드 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장 및 벼로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물.
- 제47항에 있어서, 식물이 아라비돕시스, 대두, 목화, 담배, 사탕무, 오일시드 평지, 옥수수, 밀, 수수, 호밀, 귀리, 잔디 및 벼로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물.
- 제초제에 대해 내성을 부여하기 위해 식물에서 제초제 내성 형태의 제초제 표적 단백질을 발현하는 프로톡스 프로모터의 용도.
- 변형되지 않은 식물 프로톡스 단백질의 억제제에 대해 내성이 있는 제초제 내성 식물 프로톡스 단백질을 발현하는 제25항에 따른 키메라 유전자의 용도.
- 프로브로서 목적하는 프로모터와 결합된 프로톡스 암호화 서열과 하이브리드화하기에 충분한 상동성을 갖는 프로톡스 암호화 서열의 용도.
- 제52항에 있어서, 프로브로서 사용된 암호화 서열이 목적하는 프로톡스 프로모터와 동이한 식물 종으로부터 유래하고, 프로모터와 자연적으로 결합된 암호화 서열인 프로톡스 암호화 서열의 용도.
- (a) 뉴클레오타이드 길이가 10개 이상인 식물로부터의 프로톡스 단백질에 대한 암호화 서열의 인접 부분을 포함하고, 식물 프로톡스 유전자 또는 mRNA와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 프로브를 제조하는 단계;(b) 단계 (a)에 따라 제조된 뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 선택된 생물로부터의 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편의 모집단에서 다른 프로톡스 암호화 서열을 프로빙하는 단계;(c) 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분 및 프로톡스 단백질을 암호화하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 분리하여 증폭시키는 단계를 포함하는, 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분 및 프로톡스 단백질을 암호화하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 제조하는 방법.
- (a) 뉴클레오타이드 길이가 10개 이상인 식물로부터의 프로톡스 단백질에 대한 암호화 서열의 인접 부분을 포함하고, 식물 프로톡스 유전자 또는 mRNA와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 프로브를 제조하는 단계;(b) 단계 (a)에 따라 제조된 뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 선택된 생물로부터의 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편의 모집단에서 다른 프로톡스 암호화 서열을 프로빙하는 단계;(c) 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 분리하여 증폭시키는 단계를 포함하는, 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 제조하는 방법.
- (a) 뉴클레오타이드 길이가 10개 이상인 식물로부터의 프로톡스 단백질에 대한 암호화 서열의 인접 부분을 포함하고, 식물 프로톡스 유전자 또는 mRNA와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 프로브를 제조하는 단계;(b) 단계 (a)에 따라 제조된 뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 선택된 생물로부터의 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편의 모집단에서 다른 프로톡스 암호화 서열을 프로빙하는 단계;(c) 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 분리하는 단계를 포함하는, 식물 프로톡스 유전자로부터의 프로톡스 프로모터 서열을 함유하는 DNA 부분을 포함하는 DNA 분자를 제조하는 방법.
- 제10항 내지 제25항중 어느 한 항에 따른 키메라 유전자를, 제초제에 대한 내성을 부여하기 위해 식물에서 제초제 내성 형태의 제초제 표적 단백질을 발현하기에 충분한 양으로 포함하는 유전자이식 식물 또는 이의 자손이 사용되는 농업적 방법.
- 제10항에 있어서, DNA 분자에 의해 암호화된 단백질을 엽록체에 표적화시킬 수 있는, DNA 분자에 작동가능하게 결합된 시그날 서열을 추가로 포함하는 키메라 유전자.
- 제10항에 있어서, DNA 분자에 의해 암호화된 단백질을 미토콘드리아에 표적화시킬 수 있는, DNA 분자에 작동가능하게 결합된 시그날 서열을 추가로 포함하는 키메라 유전자.
- 제22항에 있어서, 식물 효소가 이미다졸글리세롤 포스페이트 데하이드라타제(IGPD), 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSP), 글루타민 신세타제(GS), 아세틸 조효소 A 카복실라제, 아세토락테이트 신타제 및 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 키메라 유전자.
- 제3항에 있어서, DNA 분자가 서열 13에 기술된 뉴클레오타이드 서열, 및 (a) 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4(pH 7.0), 0.1mM EDTA내에서 50℃에서의 하이브리드화 및 (b) 2×SSC, 1% SDS에서 50℃에서의 세척 조건하에 상기 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 모든 DNA 분자를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 제5항에 있어서, DNA 분자가 서열 14에 기술된 뉴클레오타이드 서열, 및 (a) 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4(pH 7.0), 0.1mM EDTA내에서 50℃에서의 하이브리드화 및 (b) 2×SSC, 1% SDS에서 50℃에서의 세척 조건하에 상기 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 모든 DNA 분자를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 제7항에 있어서, DNA 분자가 서열 26에 기술된 뉴클레오타이드 서열, 및 (a) 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4(pH 7.0), 0.1mM EDTA내에서 50℃에서의 하이브리드화 및 (b) 2×SSC, 1% SDS에서 50℃에서의 세척 조건하에 상기 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 모든 DNA 분자를 포함하는 분리된 DNA 분자.
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| US6084155A (en) * | 1995-06-06 | 2000-07-04 | Novartis Ag | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
| WO1997004088A1 (en) * | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene |
| WO1998029554A1 (en) * | 1996-12-27 | 1998-07-09 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation |
| ZA98371B (en) * | 1997-01-31 | 1999-07-16 | Du Pont | Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides. |
| CA2303403A1 (en) * | 1997-09-11 | 1999-03-18 | Nihon Nohyaku Co., Ltd. | Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to photobleaching herbicide |
| EP1062351B1 (en) * | 1998-03-11 | 2006-05-10 | Syngenta Participations AG | Novel plant plastid promoter sequence |
| US6362398B1 (en) | 1998-03-11 | 2002-03-26 | Syngenta Participations Ag | ClpP plastid promoter sequence |
| AU769868B2 (en) | 1998-04-10 | 2004-02-05 | Sumitomo Chemical Company, Limited | A method for evaluating the ability of a compound to inhibit the protoporphyrinogen oxidase activity |
| AU753020B2 (en) * | 1998-04-30 | 2002-10-03 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for giving resistance to weed control compounds to plants |
| US6906245B1 (en) | 1998-04-30 | 2005-06-14 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants |
| JP4788011B2 (ja) * | 1998-04-30 | 2011-10-05 | 住友化学株式会社 | 雑草防除剤耐性の付与方法 |
| AR020078A1 (es) | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
| US6492578B1 (en) | 1998-07-10 | 2002-12-10 | Calgene Llc | Expression of herbicide tolerance genes in plant plastids |
| ES2281183T3 (es) * | 1998-07-10 | 2007-09-16 | Calgene Llc | Expresion de genes de tolerancia a herbicida en plastidios vegetales. |
| CA2347774A1 (en) * | 1998-11-10 | 2000-05-18 | David John Nevill | Herbicidal composition |
| GB9828201D0 (en) * | 1998-12-21 | 1999-02-17 | Zenco No 4 Ltd | Genetic modification of compositae |
| AU6277600A (en) * | 1999-07-27 | 2001-02-13 | Syngenta Participations Ag | Novel chimeric genes |
| EP1200611A1 (en) * | 1999-08-13 | 2002-05-02 | Syngenta Participations AG | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase |
| US6617498B1 (en) * | 1999-09-03 | 2003-09-09 | Pioneer-Hi-Bred International, Inc. | Inducible promoters |
| CN1461345A (zh) * | 1999-10-11 | 2003-12-10 | 白镜焕 | 用原卟啉原氧化酶基因增加农作物产量或单产的方法 |
| JP4821036B2 (ja) * | 1999-10-29 | 2011-11-24 | 住友化学株式会社 | 除草剤耐性植物 |
| WO2001036606A2 (de) * | 1999-11-16 | 2001-05-25 | Basf Plant Science Gmbh | Protoporphyrinogen-ix-oxidase und seine verwendung |
| JP5111706B2 (ja) | 1999-12-16 | 2013-01-09 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物における異種ポリペプチドの発現のためのｄｎａ構築物 |
| AU2001260114A1 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-24 | Syngenta Participations Ag | Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
| US6713259B2 (en) * | 2000-09-13 | 2004-03-30 | Monsanto Technology Llc | Corn event MON810 and compositions and methods for detection thereof |
| AR037413A1 (es) * | 2001-11-27 | 2004-11-10 | Valent Biosciences Corp | Composicion herbicida intensificada |
| AU2003303589B2 (en) | 2002-12-26 | 2008-04-24 | Syngenta Participations Ag | Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor |
| EP1687429B1 (en) | 2003-10-06 | 2011-01-12 | Syngenta Participations AG | Promoter functional in plant plastids |
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| JP4720223B2 (ja) * | 2004-05-18 | 2011-07-13 | 住友化学株式会社 | 除草活性化合物耐性植物 |
| CA2584934A1 (en) | 2007-04-17 | 2008-10-17 | University Of Guelph | Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof |
| US9347046B2 (en) | 2009-01-22 | 2016-05-24 | Syngenta Participations Ag | Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use |
| ES2727575T3 (es) | 2009-01-22 | 2019-10-17 | Syngenta Participations Ag | Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes, y Métodos de uso |
| US9012719B2 (en) | 2009-02-06 | 2015-04-21 | Syngenta Participations Ag | Modification of multidomain enzyme for expression in plants |
| UA112969C2 (uk) * | 2010-08-03 | 2016-11-25 | Сібас Юс Ллс | Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх) |
| JP2012056817A (ja) * | 2010-09-10 | 2012-03-22 | Kochi Univ Of Technology | 単細胞藻類の細胞破砕液を利用したアミノ酸含有有機液肥 |
| UA121371C2 (uk) | 2010-12-16 | 2020-05-25 | Басф Агро Б. В. | Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу |
| US10041087B2 (en) | 2012-06-19 | 2018-08-07 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
| AR091489A1 (es) | 2012-06-19 | 2015-02-11 | Basf Se | Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo) |
| CN104107437B (zh) * | 2013-06-09 | 2015-08-26 | 厦门成坤生物技术有限公司 | 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法 |
| BR112016002851B1 (pt) | 2013-08-12 | 2022-02-22 | BASF Agro B.V. | Molécula de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ppo, método para controlar vegetação indesejada e uso do ácido nucleico |
| UA123757C2 (uk) | 2013-08-12 | 2021-06-02 | Басф Агро Б. В. | Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду |
| MX2017016521A (es) * | 2015-06-17 | 2018-08-15 | Basf Agro Bv | Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas. |
| CN111423990B (zh) * | 2020-04-10 | 2021-08-27 | 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 | 一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法 |
| US20240124432A1 (en) | 2020-11-24 | 2024-04-18 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compounds |
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Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0360750A3 (en) * | 1988-09-22 | 1991-01-02 | Ciba-Geigy Ag | Novel herbicide tolerant plants |
| NZ231658A (en) * | 1988-12-12 | 1992-05-26 | Fmc Corp | Inhibitors of protoporphyrinogen oxidase and compositions for killing tumour cells |
| CN1039283C (zh) * | 1988-12-12 | 1998-07-29 | Fmc公司 | 卟啉的应用 |
| US5086169A (en) * | 1989-04-20 | 1992-02-04 | The Research Foundation Of State University Of New York | Isolated pollen-specific promoter of corn |
| US5451513A (en) * | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
| DK0459643T3 (da) * | 1990-05-18 | 2001-01-02 | Commw Scient Ind Res Org | Rekombinant promotor til genekspression i enkimbladede planter |
| IL98405A0 (en) * | 1990-06-11 | 1992-07-15 | Fmc Corp | Pharmaceutical compositions containing enzyme inhibiting agents |
| US5290926A (en) * | 1990-09-14 | 1994-03-01 | Ciba-Geigy Corporation | Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase |
| EP0724637B2 (en) * | 1994-06-14 | 2002-06-05 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Corticotropin-releasing factor 2 receptors |
| US5767373A (en) * | 1994-06-16 | 1998-06-16 | Novartis Finance Corporation | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
| WO1997004088A1 (en) * | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene |
| US6472586B1 (en) * | 1995-08-10 | 2002-10-29 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Nuclear-encoded transcription system in plastids of higher plants |
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