ES2727575T3

ES2727575T3 - Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes, y Métodos de uso

Info

Publication number: ES2727575T3
Application number: ES16194593T
Authority: ES
Inventors: Timothy Hawkes; Michael Langford; Russell Viner; Bernardus Vernooij; Richard Dale
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2019-10-17
Anticipated expiration: 2030-01-22
Also published as: CA2749524A1; US8269068B2; EP3156489B1; CA2749524C; BRPI1007175A2; WO2010085705A2; ES2619279T3; EP2389442A4; US20120311740A1; BRPI1007229A2; US20120311738A1; CN102348802A; EP3156489A1; US9388393B2; US20120331580A1; US9051546B2; AR075151A1; CL2011001773A1; US9074177B2; US9057050B2

Abstract

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD que tiene actividad enzimática de HPPD, donde dicho polinucleótido deriva de una planta y donde dicho polipéptido de HPPD vegetal codificado por dicho polinucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con SEC ID NO: 27 y comprende la secuencia de aminoácidos FEFMAPPQA (SEC ID NO: 58), donde la primera A se sustituye por R, K o N.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes, y Métodos de uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) mutantes que confieren resistencia o tolerancia a herbicidas a plantas, y a las secuencia de ácidos nucleicos que los codifican. Los métodos de la invención se refieren a la producción y uso de plantas que expresan estos polipéptidos de HPPD mutantes, y que son resistentes a herbicidas de HPPD.

Antecedentes de la invención

Las hidroxifenilpiruvato dioxigenasas (HPPD) son enzimas que catalizan la reacción en la que parahidroxifenilpiruvato (HPP) se transforma en homogentisato. Esta reacción tiene lugar en presencia de hierro enlazado a enzima (Fe2+) y oxígeno. Los herbicidas que actúan inhibiendo HPPD son bien conocidos, e incluyen isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas, y pirazolinatos (Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) - The Herbicide Target”. In Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 211-220). La inhibición de HPPD bloquea la biosíntesis de plastoquinona (PQ) a partir de tirosina. PQ es un cofactor esencial en la biosíntesis de pigmentos carotenoideos que son esenciales para la fotoprotección de los centros fotosintéticos. Los herbicidas que inhiben la HPPD son blanqueadores móviles en el floema que provocan que los nuevos meristemos y hojas expuestos a la luz salgan blancos. En ausencia de carotenoides, la clorofila es fotodestruida y se convierte ella misma en un agente de fotodestrucción vía la fotogeneración de oxígeno singlete.

También se conocen métodos para proporcionar plantas que sean tolerantes a los herbicidas de HPPD y estos han incluido: 1) sobreexpresar la enzima HPPD para producir cantidades de enzima HPPD en la planta que sean suficientes con relación a un herbicida dado a fin de tener suficiente enzima funcional disponible a pesar de la presencia de su inhibidor; y 2) mutar la enzima HPPD diana en una HPPD funcional que sea menos sensible a los herbicidas. Respecto a las HPPD mutantes, mientras que una enzima HPPD mutante dada puede proporcionar un nivel útil de tolerancia a ciertos herbicidas inhibidores de HPPD, la misma HPPD mutante puede ser bastante inadecuada para proporcionar niveles comerciales de tolerancia a un herbicida diferente, más deseable, inhibidor de HPPD (véase, por ejemplo, Pub. Sol. de U.S. n22004/0058427; y Pub. Sol. PCT nos WO 98/20144 y WO 02/46387; véase también la Pub. Sol. de U.S. n° 2005/0246800 que se refiere a la identificación y al marcaje de variedades de haba de soja como relativamente tolerantes a HPPD). Por ejemplo, los herbicidas inhibidores de HPPD pueden diferir en lo que se refiere al espectro de malezas que controlan, su coste de producción y sus beneficios medioambientales.

En consecuencia, se necesitan nuevos métodos y composiciones para conferir tolerancia a herbicidas de HPPD en diversos cultivos y variedades de cultivos.

Breve sumario de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD). Las composiciones incluyen secuencias nucleotídicas y de aminoácidos para polipéptidos de HPPD mutantes. Los polipéptidos de la invención son HPPD mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD y que confieren resistencia o tolerancia en las plantas a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. En una realización, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD que tiene actividad enzimática de HPPD, donde dicho polinucleótido deriva de una planta y donde dicho polipéptido de HPPD codificado por dicho polinucleótido tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 27 y comprende la secuencia de aminoácidos FEFMAPPQA (SEC ID NO: 58), donde la primera A se sustituye por R, K o N.

En un aspecto, las composiciones de la divulgación comprenden un polipéptido de HPPD mutante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 27, donde el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD, y donde el polipéptido contiene una o más adiciones, sustituciones o supresiones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

1) R(K,A,R)SQI(Q,E)T (SEC ID NO: 28), donde la primera Q se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por A, G, M, T, S, C, R, F y más particularmente por P;

2) R(K,A,R)SQI(Q,E)T (SEC ID NO: 28), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por V, S, A, P, T, L o G;

3) (P,A,S)G(V,L)QH(I,L,M) (SEC ID NO: 29), donde la Q se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por N, R, G, A, S, T, E o C, y más particularmente por A o H;

4) G(I,V) LVD(R,K)D (SEC ID NO: 30), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por M o A;

5) ESGLN(S,G) (SEC ID NO: 31), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por M, H, G, F, C o I, y más particularmente por M;

6) F(A,S)EF(T,V) (SEC ID NO: 32), donde (A,S) se sustituye por cualquier aminoácido, particularmente por W, G, M, F, Y o H;

7) G(I,V) LVD(R,K)D (SEC ID NO: 30) y ESGLN(S,G) (SEC ID NO: 31), donde la L en ambas secuencias se sustituye por M;

8) EVELYGDVV (SEC ID NO: 37), donde la Y se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por D, V, E, K o A;

9) RFDHVVGNV (SEC ID NO: 38), donde la primera V se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como I, A, M o C;

10) DHVVGNVPE (SEC ID NO: 39), donde la G se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como H o C; 11) HVVGNVPEM (SEC ID NO: 40), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como C; 12) NVPEMAPVI (SEC ID NO: 41), donde la M se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como L; 13) GFHEFAEFT (SEC ID NO: 42), donde la F se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como M, I o L; 14) GTTESGLNS (SEC ID NO: 43), donde la S se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como T; 15) TTESGLNSV (SEC ID NO: 44), donde la G se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como R, S o A;

16) ESGLNSVVL (SEC ID NO: 45), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como R o M; 17) GLNSVVLAN (SEC ID NO: 46), donde la primera V se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como M, I, A o K;

18) LNSVVLANN (SEC ID NO: 47), donde la V se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como I; 19) SEAVLLPLN (SEC ID NO: 48), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como V o K; 20) EAVLLPLNE (SEC ID NO: 49), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como M o F; 21) VLLPLNEPV (SEC ID NO: 50), donde la tercera L se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como I, M o V;

22) LLPLNEPVH (SEC ID NO: 51), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como A; 23) HGTKRRSQI (SEC ID NO: 52), donde la R se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como G; 24) SQIQTYLEY (SEC ID NO: 53), donde la T se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como E; 25) QIQTYLEYH (SEC ID NO:54), donde la Y se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como F;

26) GVQHIALAS (SEC ID NO: 55), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como M, L o V; 27) GFEFMAPPQ (SEC ID NO: 57), donde la M se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como Q o L; 28) FEFMAPPQA (SEC ID NO: 58), donde la primera A se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como S, P, D, R, N, Y, K o H;

29) FMAPPQAKY (SEC ID NO: 59), donde la P se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como A o R; 30) QAKYYEGVR (SEC ID NO: 60), donde la Y se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como K, R, D, Q o E;

31) GVRRIAGDV (SEC ID NO: 61), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como R o L; 32) VLLQIFTKP (SEC ID NO: 62), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como V;

33) LLQIFTKPV (SEC ID NO: 63), donde la F se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como L;

34) LQIFTKPVG (SEC ID NO: 64), donde la T se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como S, P, D, R, N, Y o H;

35) IFTKPVGDR (SEC ID NO: 65), donde la P se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como N; 36) RPTFFLEMI (SEC ID NO: 66), donde la F se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como L;

37) FLEMIQRIG (SEC ID NO: 67), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como V o C; 38) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68), donde la cuarta G se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como A, S o T;

39) GGFGKGNFS (SEC ID NO: 69), donde la K se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como L, A, E o V;

40) GFGKGNFSE (SEC ID NO: 70), donde la G se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como I; 41) FGKGNFSEL (SEC ID NO: 71), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como I; 42) KGNFSELFK (SEC ID NO: 72), donde la S se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como N, G, K o Q;

43) GNFSELFKS (SEC ID NO: 73), donde la E se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como Q; 44) ELFKSIEDY (SEC ID NO: 74), donde la S se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como A; 45) LFKSIEDYE (SEC ID NO: 75), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido; tal como L o F; 46) HVVGNVPEM (SEC ID NO: 40), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una C, y la secuencia de aminoácidos ELGVLVDRD (SEC ID NO:76), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una M;

47) LNSVVLANN (SEC ID NO: 47), donde la segunda V se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una I, y la secuencia de aminoácidos ELGVLVDRD (SEC ID NO:76), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una M;

48) VLLPLNEPV (SEC ID NO: 50), donde la tercera L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una M, y la secuencia de aminoácidos VLLQIFTKP (SEC ID NO:62), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una V;

49) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68), donde la cuarta G se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una T, y la secuencia de aminoácidos ELGVLVDRD (SEC ID NO:76), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente una M;

50) FHEFAEFTAED (SEC ID NO: 76), donde la primera A, la segunda E, y la segunda F se sustituyen por cualquier otro aminoácido, particularmente donde la A se sustituye por una S o una W, la E se sustituye por una T y/o la F se sustituye por una A o una V;

51) HGTKRRSQIQ (SEC ID NO: 77), donde la primera R se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por una K, y la segunda R se suprime;

52) GTKRRSQIQ (SEC ID NO: 78), donde la segunda R se suprime;

53) FMAPPQAKY (SEC ID NO: 59), donde la segunda P se suprime;

54) GNFSELFKS (SEC ID NO: 73), donde la E se suprime;

55) GVRRIAGDV (SEC ID NO: 61), donde la I se suprime;

56) DQGVLLQIFTKP (SEC ID NO: 79), donde la primera L y la I se sustituyen por cualquier otro aminoácido, particularmente donde la A se sustituye por una M y/o la I se sustituye por una L;

57) GKGNFSELFK (SEC ID NO: 80), donde la F y la S se sustituyen por cualquier otro aminoácido, particularmente donde la F se sustituye por una G y/o la S se sustituye por una A;

58) KGNFSELFKS (SEC ID NO: 56), donde la primera S y la E se sustituyen por cualquier otro aminoácido, particularmente donde la S se sustituye por una N, G o K y/o la E se sustituye por una S o una A;

59) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68) donde la K se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como T, S, Q, L, A, I, H, E, G, M, C o V, preferiblemente T;

60) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68), donde la sexta G se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como R, E, D, H, M, F, W, N o C, preferiblemente H o C;

61) ESGLN(S,G) (SEC ID NO: 31), donde la primera G se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por R, S o A; y

62) VLLPLNEPV (SEC ID NO: 50), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como M, F o V.

En otro aspecto, las composiciones de la divulgación comprenden un polipéptido de HPPD mutante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:14 o con SEC ID NO:27, donde el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD, y donde el polipéptido contiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

1) R(K,A,R)SQI(Q,E)T (SEC ID NO: 28), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por V, S, A, P, T, L o G;

2) (P,A,S)G(V,L)QH(I,L,M) (SEC ID NO: 29), donde la Q se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por N, R, G, A, S, T, E o C, y más particularmente por A o H;

3) G(I,V) LVD(R,K)D (SEC ID NO: 30), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por M o A;

4) ESGLN(S,G) (SEC ID NO: 31), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente por M, H, G, F, C o I, y más particularmente por M;

5) F(A,S)EF(T,V) (SEC ID NO: 32), donde la (A,S) se sustituye por cualquier aminoácido, particularmente por W, G, M, F, Y o H;

6) RFDHVVGNV (SEC ID NO:38), donde la primera V se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como I, A, M o C;

7) GLNSVVLAN (SEC ID NO: 46), donde la primera V se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como M, I, A o K;

8) VLLPLNEPV (SEC ID NO: 50), donde la tercera L se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como I, M o V;

9) GFEFMAPPQ (SEC ID NO: 57), donde la M se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como Q o L; 10) FEFMAPPQA (SEC ID NO: 58), donde la primera A se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como S, P, D, R, N, Y, K o H;

11) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68), donde la cuarta G se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como A, S o T;

12) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68) donde la K se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como T, S, Q, L, A, I, H, E, G, M, C o V, preferiblemente T;

13) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68), donde la sexta G se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como R, E, D, H, M, F, W, N o C, preferiblemente H o C;

14) ESGLN(S,G) (SEC ID NO: 31), donde la primera G se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente R, S o A; y

15) VLLPLNEPV (SEC ID NO: 50), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido, tal como M, F o V.

Los polipéptidos de HPPD mutantes ejemplares según la divulgación corresponden a las secuencia de aminoácidos expuestas en SEC ID NOs: 14-26 y variantes y fragmentos de las mismas. Además, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican los polipéptidos de HPPD mutantes, por ejemplo, SEC ID NOs: 1-13. Las composiciones también incluyen casetes de expresión que comprenden un promotor enlazado de forma operable a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de HPPD mutante de la invención, sola o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. También se proporcionan plantas, células vegetales y semillas transformadas que comprenden un casete de expresión de la invención.

Las composiciones de la invención son útiles en métodos dirigidos a conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas, particularmente resistencia o tolerancia a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. En realizaciones particulares, los métodos comprenden introducir en una planta al menos un casete de expresión que comprende un promotor enlazado de forma operable a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de HPPD mutante de la invención. Como resultado, el polipéptido de HPPD mutante se expresa en la planta, y la HPPD mutante es menos sensible a herbicidas que inhiben HPPD, lo que conduce a una resistencia o tolerancia a herbicidas que inhiben HPPD.

En otros aspectos, también se proporcionan métodos para el ensayo, caracterización, identificación y selección de las HPPD mutantes de la actual invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los valores de Km y Vmax del polipéptido de HPPD derivado de Avena correspondiente a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 14.

Las Figuras 2A-2B muestran las determinaciones de la velocidad de asociación (Fig. 2A) y la velocidad de disociación (Fig. 2B) para un complejo de estructura B con el polipéptido de HPPD que corresponde a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 14.

La Figura 3 muestra una determinación de la velocidad de disociación para un complejo de estructura D con el polipéptido de HPPD correspondiente a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 14.

Las Figuras 4A-4C muestran las determinaciones de la velocidad de disociación a temperaturas del hielo para los complejos de estructura B con los polipéptidos de HPPD que corresponden a las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID NO: 14 (Fig. 4A), 24 (Fig. 4B) y 26 (Fig. 4c ).

La Figura 5 muestra la inhibición por mesotriona de la formación de piomelanina por parte de E. coli BL21 que expresa diferentes variantes de HPPD. Barra de la izquierda = (intervalo de error para n=3) A 430 nm promedio sin mesotriona presente en el medio y la barra de la derecha = (n=3) A 430 nm promedio con 12.5 ppm presentes en el medio. El control es el vector pET24 vacío donde no se expresa HPPD.

La Figura 6 muestra una representación del vector binario 17146 para la transformación de haba de soja, que confiere resistencia a HPPD con un gen de HPPD de avena optimizado con un codón de haba de soja que codifica SEC ID NO: 24. Este vector binario también contiene marcadores seleccionables PAT dobles para la selección de glufosinato.

La Figura 7 muestra una representación del vector binario 17147 para la transformación de haba de soja que confiere resistencia a HPPD con un gen de HPPD de avena optimizado con un codón de haba de soja que codifica SEC ID NO: 24, y que también confiere tolerancia a glifosato (marcador seleccionable).

La Figura 8 muestra una representación del vector binario 15764 que contiene un gen de HPPD de avena optimizado en los codones para haba de soja (que codifica SEC ID NO: 14) impulsado por el potenciador TMV omega y una caja TATA.

La Figura 9 muestra una representación del vector binario 17149 para la transformación de habas de soja que confiere tolerancia a herbicidas de HPPD y a glufosinato, que contiene un casete de expresión que expresa una variante de HPPD (SEC ID NO: 26) junto con dos casetes del gen PAT.

Las Figuras 10A-10D representan la dependencia respecto al tiempo de la inhibición de un mutante de HPPD (G408A) por parte de los compuestos herbicidas B (Figs. 10A-10B) y C (Figs. 10C-10D).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones y métodos dirigidos a conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD). Las composiciones incluyen secuencia de aminoácidos para polipéptidos de HPPD mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD, y sus variantes y fragmentos. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de HPPD mutantes de la invención. Se proporcionan además métodos para conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas, particularmente resistencia o tolerancia a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. También se divulgan métodos para controlar de forma selectiva malas hierbas en un campo en un lugar de cosecha, y para el ensayo, caracterización, identificación y selección de las HPPD mutantes de la actual invención que proporcionan tolerancia a herbicidas.

En el contexto de la presente invención, las expresiones hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (HPPD), 4-hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (4-HPPD) y p-hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (p-HPPD) son sinónimas.

“Herbicidas de HPPD” son herbicidas que son blanqueadores, y cuyo sitio principal de acción es HPPD. Muchos son bien conocidos y se describen aquí en otra parte y en la bibliografía (Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) - The Herbicide Target”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 211-220; Edmunds “Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) Inhibitors : Triketones”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 221-242). Como se usa aquí, la expresión “herbicidas de HPPD” se refiere a herbicidas que actúan directa o indirectamente para inhibir HPPD, en la que los herbicidas son blanqueadores, y en la que la inhibición de HPPD es al menos parte del modo de acción del herbicida sobre las plantas.

Como se usa aquí, las plantas que son sustancialmente “tolerantes” a un herbicida presentan, cuando se tratan con dicho herbicida, una curva de dosis/respuesta que está desplazada a la derecha cuando se compara con la mostrada por plantas similares no tolerantes sometidas de forma similar. Tales curvas de dosis/respuesta tienen en el eje x representada gráficamente la “dosis”, y en el eje y tienen representado gráficamente el “porcentaje de exterminio o daño”, “efecto herbicida”, etc. Las plantas tolerantes necesitarán típicamente al menos dos veces tanto herbicida como las plantas similares no tolerantes, a fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas que son sustancialmente “resistentes” al herbicida presentan pocas lesiones, si las presentan, necróticas, líticas, cloróticas u otras lesiones, o, al menos, ninguna que impacte significativamente sobre el rendimiento, cuando se someten al herbicida a concentraciones y tasas que se emplean típicamente por la comunidad agrícola para exterminar malas hierbas en el campo.

Como se usa aquí, “plantas similares no transgénicas” son plantas que son similares o iguales a las plantas transgénicas, pero que no contienen un transgén que confiera resistencia a herbicidas.

Como se usa aquí, el término “conferir” se refiere a proporcionar una característica o rasgo, tal como tolerancia o resistencia a herbicidas, y/u otros rasgos deseables, a una planta.

Como se describe aquí en otra parte, el término “heterólogo” significa procedente de otra fuente. En el contexto de ADN, “heterólogo” se refiere a cualquier ADN “no propio” extraño, incluyendo aquél procedente de otra planta de la misma especie. Por ejemplo, en la presente solicitud, un gen de HPPD de haba de soja que se expresó de forma transgénica nuevamente en una planta de haba de soja todavía se describiría como ADN “heterólogo”.

El artículo “un” y “una” se usan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, hasta al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A título de ejemplo, “un elemento” significa uno o más elementos. A lo largo de la memoria descriptiva, la palabra “que comprende”, o variaciones tales como “comprende” o “comprender”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas señalados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Una variedad de términos adicionales se definen o se caracterizan de otro modo aquí.

Secuencias de HPPD

Las composiciones de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos de HPPD mutantes, aislados o sustancialmente purificados, así como células hospedantes que comprenden los polinucleótidos de HPPD mutantes. Específicamente, la presente invención proporciona polipéptidos de HPPD mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD, y que confieren resistencia o tolerancia en plantas a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD, y sus variantes y fragmentos. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de HPPD mutantes de la invención.

Los polipéptidos de HPPD mutantes de la presente invención tienen cambios de aminoácidos en una o más posiciones con relación a la secuencia de tipo salvaje de partida de la que derivan, y presentan tolerancia mejorada a uno o más herbicidas inhibidores de HPPD. Las enzimas HPPD que presentan tolerancia mejorada a un herbicida de HPPD lo pueden hacer en virtud de presentar, con relación a la enzima de partida no mutada similar:

a) un valor de Km más bajo para el sustrato natural, 4-hidroxifenilpiruvato;

b) un valor de kcat más elevado para convertir 4-hidroxifenilpiruvato en homogentisato;

c) un menor valor de la constante de velocidad, kon, que gobierna la formación de un complejo de enzima:herbicida inhibidor de HPPD;

d) un valor incrementado de la constante de velocidad, koff, que gobierna la disociación de un complejo de enzima:herbicida inhibidor de HPPD; y/o

e) como resultado de cambios en uno o ambos de c) y d), un valor incrementado de la constante de equilibrio Ki (también denominada Kd), que gobierna la disociación del complejo de enzima:herbicida inhibidor de HPPD. Las secuencias de ADN que codifican tales HPPD mutadas mejoradas se usan en la provisión de plantas, cosechas, células vegetales y semillas de HPPD de la actual invención que ofrecen tolerancia o resistencia mejorada a uno o más herbicidas de HPPD en comparación con plantas similares que expresan igualmente la enzima de partida no mutada.

Los incrementos en el valor de koff son de valor particular a la hora de mejorar la capacidad de HPPD para conferir resistencia a un herbicida de HPPD. Como un ejemplo, los compuestos B y C presentan valores de Kd similares con respecto a la variante de HPPD de SEC ID NO: 14, pero difieren en que el valor de koff para el compuesto B es alrededor de 10 veces mayor en comparación con el valor de koff para el compuesto C y las plantas que expresan SEC ID NO: 14 presentan una resistencia superior al compuesto B que al compuesto C.

Se seleccionan mutaciones dirigidas al sitio de genes que codifican las HPPD derivadas de plantas para codificar cambios de aminoácidos seleccionados de la siguiente lista, ya sea individualmente o en combinación. Los genes que codifican tales formas mutantes de las HPPD de plantas son útiles para obtener plantas de cosechas resistentes a herbicidas que inhiben HPPD. Los genes de HPPD de plantas así modificados son especialmente adecuados para uso en plantas transgénicas a fin de conferir tolerancia o resistencia a herbicidas en las plantas de las cosechas.

En la técnica se conocen muchas secuencias de HPPD, y se pueden usar para generar secuencias mutantes de HPPD haciendo las correspondientes sustituciones, supresiones y adiciones de aminoácidos descritas aquí. La secuencia de aminoácidos de Avena sativa se expone en SEC ID NO: 27. Una variante con una única supresión de la HPPD de Avena sativa se expone en SEC. ID NO: 14. Por lo tanto, una secuencia conocida o sospechosa de HPPD se puede alinear con, por ejemplo, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 27, usando herramientas de alineamiento de secuencias estándar y se pueden realizar las correspondientes sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácidos descritas aquí con respecto a SEC ID NO: 14 o a SEC ID NO: 27 en la secuencia de referencia.

En una realización, las composiciones de la invención comprenden un polipéptido de HPPD mutante que tiene una identidad secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con SEC ID NO: 27 (la secuencia de aminoácidos de HPPD de Avena sativa) o donde la secuencia de aminoácidos de HPPD deriva de una planta, donde el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y donde el polipéptido contiene una o más adiciones, sustituciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos enumeradas en la columna 1 de la Tabla 1, combinadas además opcionalmente con mutaciones conocidas (véase, por ejemplo, WO2009/144079). En varias realizaciones, un aminoácido en una o más posiciones enumeradas en la columna 1 de la Tabla 1 se sustituye por cualquier otro aminoácido. En otra realización, el polipéptido comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos que corresponden a las sustituciones o adiciones de aminoácidos enumeradas en la columna 2 de la Tabla 1. En otra realización más, el polipéptido comprende una o más sustituciones que corresponden a una variante conservativa de los aminoácidos enumerados en la columna 2 de la Tabla 1. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 217 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 218 de SEC ID NO: 27), donde ese aminoácido se sustituye por alanina o una sustitución conservativa de la alanina; o el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 241 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 242 de SEC ID NO: 27), donde ese aminoácido se sustituye por triptófano o una sustitución conservativa del triptófano; o el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde al aminoácido de la posición 408 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 409 de SEC ID NO: 27), donde ese aminoácido se sustituye por alanina o una sustitución conservativa de la alanina. En aspectos particulares, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de HPPD muíante se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 y 26.

Tabla 1. Mutaciones ejemplares de HPPD

En otra realización, las composiciones de la invención comprenden un polipéptido de HPPD muíante que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con SEC ID NO: 27 (la secuencia de aminoácidos de HPPD de Avena sativa) o en el que la secuencia de aminoácidos de HPPD deriva de una planta, donde el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y donde el polipéptido contiene una o más sustituciones en la secuencia de aminoácidos que corresponden a las posiciones de los aminoácidos enumeradas en la columna 1 de la Tabla 2, opcionalmente combinadas además con mutaciones conocidas (véase, por ejemplo, WO2009/144079). En diversas realizaciones, un aminoácido en una o más posiciones enumeradas en la columna 1 de la Tabla 2 se sustituye por cualquier otro aminoácido. En otra realización, el polipéptido comprende una o más sustituciones de aminoácidos que corresponden a las sustituciones de aminoácidos enumeradas en la columna 2 de la Tabla 2. En otra realización más, el polipéptido comprende una o más sustituciones que corresponden a una variante conservativa de los aminoácidos enumerados en la columna 2 de la Tabla 2. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 217 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 218 de SEC ID NO: 27), en la que el aminoácido se sustituye por alanina o una sustitución conservativa de la alanina; o el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 241 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 242 de SEC ID NO: 27), en la que el aminoácido se sustituye por triptófano o una sustitución conservativa del triptófano; o el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 408 de SEC ID NO: 14 (posición del aminoácido 409 de SEC ID NO: 27), en la que el aminoácido se sustituye por alanina o una sustitución conservativa de alanina. En aspectos particulares, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de HPPD mutante se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 y 26.

Tabla 2. Mutaciones de HPPD ejemplares

Los términos “polipéptido”, “péptido”, y “proteína” se usan aquí de forma intercambiable para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los polipéptidos de la invención se pueden producir a partir de un ácido nucleico descrito aquí, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, se puede producir una proteína truncada de la invención mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante de la invención en una célula hospedante apropiada, o, como alternativa, mediante una combinación de procedimientos ex vivo, tal como digestión con proteasas y purificación.

En consecuencia, la presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de HPPD mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD, y que confieren resistencia o tolerancia en plantas a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD, y sus variantes y fragmentos. En general, la invención incluye cualquier secuencias polinucleotídica que codifique cualquiera de los polipéptidos de HPPD mutantes descritos aquí, así como cualquier secuencias polinucleotídica que codifique polipéptidos de HPPD que tienen una o más sustituciones conservativas de aminoácidos con relación a los polipéptidos de HPPD mutantes descritos aquí. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los cinco grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: Alifático: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I); Aromático: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); Que contienen azufre: Metionina (M), Cisteína (C); Básico: Arginina I, Lisina (K), Histidina (H); Ácido: Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q).

En una realización, la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con SEC ID NO: 27 o en la que la secuencia de aminoácidos de HPPD deriva de una planta, en la que el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD, y en la que el polipéptido contiene una o más sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos tal como se describe en la presente. En aspectos particulares, la secuencia polinucleotídica codifica un polipéptido de HPPD mutante que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13.

Como se usa aquí, “ácido nucleico” incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma mono- o bicatenaria, y, excepto que se limite de otro modo, engloba análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos) que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales por cuanto se hibridan a ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a oligonucleótidos de origen natural.

Como se usan aquí, los términos “que codifica” o “codificado”, cuando se usan en el contexto de un ácido nucleico específico, significa que el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia nucleotídica en una proteína específica. La información mediante la cual una proteína es codificada se especifica mediante el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) con regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias no traducidas que intervienen (porejemplo, como en ADNc).

La invención engloba composiciones de polinucleótidos o de proteínas aislados o sustancialmente purificados. Un polinucleótido o proteína “aislado” o “purificado”, o una porción biológicamente activa de los mismos, está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o proteína como se encuentra en su entorno de origen natural. De este modo, un polinucleótido o proteína aislado o purificado está esencialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. De forma óptima, un polinucleótido “aislado” está libre de secuencias (óptimamente secuencias que codifican proteínas) que flanquean de forma natural el polinucleótido (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del que deriva el polinucleótido. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido aislado puede contener menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencia nucleotídica que flanquea de forma natural el polinucleótido en ADN genómico de la célula de la que deriva el polinucleótido. Una proteína que está sustancialmente libre de actividades enzimáticas que interfieren, y que es capaz de ser caracterizada con respecto a sus propiedades catalíticas, cinéticas y moleculares, incluye preparaciones bastante brutas de proteína (por ejemplo producidas recombinantemente en extractos celulares) que tienen menos de alrededor de un 98%, 95% 90%, 80%, 70 %, 60% o 50% (en peso seco) de proteína contaminante, así como preparaciones purificadas adicionalmente por métodos conocidos en la técnica para que tengan 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% (en peso seco) de proteína contaminante.

Las proteínas de la invención se pueden alterar de diversas maneras, incluyendo sustituciones, supresiones, truncamiento, e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son conocidos generalmente en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes y fragmentos de secuencias de aminoácidos de las proteínas de HPPD de mutantes mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones polinucleotídicas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente U.S. n° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York), y las referencias citadas allí. En el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) se puede encontrar una guía en cuanto a sustituciones apropiadas de aminoácidos que a menudo no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés. Pueden ser óptimas las sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido por otro que tenga propiedades similares.

Los polinucleótidos de la invención también se pueden usar para aislar secuencias correspondientes procedentes de otros organismos, particularmente otras plantas. De esta manera, se pueden usar métodos tales como PCR, hibridación, y similares, para identificar tales secuencias basándose en su homología de secuencia con las secuencias expuestas aquí.

En un enfoque de PCR, se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos para uso en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonar mediante PCR son generalmente conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véanse también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York).

En técnicas de hibridación todo o parte de un polinucleótido conocido se usa como una sonda que se hibrida de forma selectiva a otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ADNc clonados (es decir, librerías genómicas o de ADNc) procedentes de un organismo escogido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación y para construcción de librerías de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).

Por “que se hibrida a” o “que se hibrida específicamente a” se refiere a la unión, formación de dúplex, o hibridación de una molécula sólo a una secuencia nucleotídica particular en condiciones restrictivas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total). “Se une(n) sustancialmente” se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico diana, y abarca desemparejamientos menores que se pueden arreglar reduciendo la restricción del medio de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico diana.

“Condiciones restrictivas de hibridación” y “condiciones de de hibridación y lavado restrictivas”, en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como hibridaciones Southern y Northern, dependen de las secuencias, y son diferentes bajo parámetros medioambientales diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a mayores temperaturas. En Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays” Elsevier, Nueva York, se encuentra una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos. Generalmente, las condiciones de hibridación y de lavado muy restrictivas se seleccionan para que sean alrededor de un 5°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Típicamente, en “condiciones restrictivas” una sonda se hibridará a su subsecuencia diana, pero no a otras secuencias.

La Tm es la temperatura (en fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente emparejada. Las condiciones muy restrictivas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, llevándose a cabo la hibridación toda la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy restrictivas es 0,1 NaCl 5M a 72°C durante alrededor de un 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2X SSC a 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook, más abajo, para una descripción del tampón de SSC). A menudo, un lavado muy restrictivo va precedido por un lavado menos restrictivo, para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de restricción media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1X SSC a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja restricción para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6X SSC a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, alrededor de un 10 a 50 nucleótidos), las condiciones restrictivas implican típicamente concentraciones de sal menores que alrededor de un 1,0 M de ion Na, típicamente alrededor de un 0,01 a 1,0 M de concentración de ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es típicamente al menos alrededor de un 30°C. Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2X (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada, en el ensayo de hibridación particular, indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restrictivas todavía son sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto se produce, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

Lo siguiente son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para clonar secuencias nucleotídicas que son homólogos de secuencias nucleotídicas de referencia de la presente invención: una secuencia nucleotídica de referencia se hibrida preferiblemente a la secuencia nucleotídica de referencia en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPÜ4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 2X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, de forma más deseable en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPÜ4, 1 mM de EdTa a 50°C con lavado en 1X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, todavía de forma más deseable en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPÜ4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 0,5X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPÜ4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, más preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPÜ4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65°C.

También se divulgan fragmentos y variantes de las secuencias nucleotídicas descritas y proteínas codificadas consiguientemente. “Fragmento” quiere decir una porción de la secuencia nucleotídica o una porción de la secuencia de aminoácidos, y por tanto proteína codificada consiguientemente. Los fragmentos de una secuencia nucleotídica pueden codificar fragmentos proteicos que retienen la actividad biológica de la proteína de HPPD mutante, y por tanto tienen actividad enzimática de HPPD. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia nucleotídica que son útiles como sondas de hibridación o en reacciones de mutagénesis y barajado, para generar todavía más variantes de HPPD, generalmente no codifican proteínas de fragmentos que retienen actividad biológica. De este modo, los fragmentos de una secuencia nucleotídica pueden oscilar desde alrededor de un 20 nucleótidos, alrededor de un 50 nucleótidos, alrededor de un 100 nucleótidos, y hasta la secuencia nucleotídica de longitud completa que codifica los polipéptidos de la invención.

Un fragmento de una secuencia nucleotídica que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de HPPD mutante codificará al menos 15, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 180, 200, 250, 300, o 350 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de HPPD mutante de longitud completa. Los fragmentos en una secuencia nucleotídica que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína de HPPD.

Como se usa aquí, “secuencia de longitud completa”, en referencia a un polinucleótido específico, significa que tiene toda la secuencia de ácido nucleico de una secuencia de HPPD nativa o mutada. “Secuencia nativa” quiere decir una secuencia endógena, es decir, una secuencia no manipulada mediante ingeniería, encontrada en un genoma del organismo.

De este modo, un fragmento de una secuencia nucleotídica de la invención puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido de HPPD mutante, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación, etc., o cebador de PCR, usando métodos descritos más abajo. Una porción biológicamente activa de un polipéptido de HPPD mutante se puede preparar aislando una porción de una de las secuencias nucleotídicas de la invención, expresando la porción codificada de la proteína de HPPD mutante (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro), y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína de HPPD mutante. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia nucleotídica de la invención comprenden al menos 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, ó 1300 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia nucleotídica de longitud completa descrita aquí.

“Variantes” quiere decir secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos con referencia al polinucleótido, y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido de HPPD mutante. Como se usa aquí, un polinucleótido o polipéptido “de referencia” comprende una secuencia nucleotídica o secuencia de aminoácidos de HPPD mutante, respectivamente. Como se usa aquí, un polinucleótido o polipéptido “nativo” comprende una secuencia nucleotídica o secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. La persona experta en la técnica reconocerá que se pueden construir variantes de los ácidos nucleicos de la invención de manera que se mantenga el marco de lectura abierto. Para polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de HPPD mutantes de la invención. Las variantes alélicas de origen natural, tales como estas, se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se explica más abajo. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótido derivado sintéticamente, tales como aquellos generados, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, pero que todavía codifican una proteína de HPPD mutante de la invención. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con aquel polinucleótido particular según se determina mediante programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos aquí en otra parte.

Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar comparando el porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. De este modo, por ejemplo, se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido con un porcentaje de identidad de secuencia dado con los polipéptidos SEC ID NOs: 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, o 26. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos se puede calcular usando programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos aquí en otra parte. Cuando cualquier par dado de polinucleótidos de la invención se evalúa mediante comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que ellos codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a lo largo de la totalidad de las secuencias de HPPD descritas aquí es decir, cuando se comparan con las secuencias de HPPD de longitud completa descritas aquí.

Proteína “variante” quiere decir una proteína derivada de una proteína de referencia mediante supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína de HPPD mutante, y/o mediante sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína de HPPD mutante. Las proteínas variantes son biológicamente activas, esto es, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína de HPPD mutante, esto es, actividad enzimática de HPPD y/o tolerancia a herbicidas como se describe aquí. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético, o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína de HPPD mutante de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a lo largo de la totalidad de la secuencia de aminoácidos para la proteína de HPPD mutante, según se determina mediante programas de alineamiento de secuencias, y parámetros descritos aquí en otra parte. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de esa proteína en tan pocos como 1-15 restos de aminoácidos, tan pocos como 1-10, tales 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso un resto de aminoácido.

Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica, y se pueden lograr usando algoritmos matemáticos tales como el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48:443-453; y el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia, se pueden utilizar implementaciones computerizadas de estos algoritmos matemáticos. Tales implementaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA).

Apilamiento de genes

En ciertos aspectos, los polinucleótidos de la divulgación que codifican polipéptidos de HPPD mutantes, o sus variantes, que retienen actividad enzimática de HPPD (por ejemplo, una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, y 26) se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias polinucleotídicas de interés, a fin de crear plantas con un rasgo deseado. Un rasgo, como se usa aquí, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o grupos de secuencias. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican un polipéptido de HPPD mutante o una variante del mismo, que retiene actividad enzimática de HPPD, se pueden apilar con cualesquiera otros polinucleótidos que codifican polipéptidos que confieren un rasgo deseable, incluyendo, pero sin limitarse a, resistencia a enfermedades, insectos, y herbicidas, tolerancia al calor y a la sequía, tiempo reducido para la madurez de la cosecha, procesamiento industrial mejorado, tal como para la conversión de almidón o biomasa en azúcares fermentables, y calidad agronómica mejorada, tal como contenido elevado de aceite y contenido proteico elevado.

Los polinucleótidos ejemplares que se pueden apilar con polinucleótidos de la invención que codifican un polipéptido de HPPD mutante, o una variante del mismo, que retiene actividad enzimática de HPPD incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos que confieren resistencia a plagas/patógenos, tales como virus, nemátodos, insectos u hongos, y similares. Los polinucleótidos ejemplares que se pueden apilar con polinucleótidos de la invención incluyen polinucleótidos que codifican: polipéptidos que tienen actividad plaguicida y/o insecticida, tales como otras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas en las patentes U.S. nos 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol.

24:825, pentina (descrita en la patente U.S. n° 5.981.722), y similares; rasgos deseables para resistencia a enfermedades o a herbicidas (por ejemplo, genes de destoxificación de fumonixina (patente U.S. n° 5.792.931); genes de avirulencia y de resistencia a enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS), que conducen a resistencia a herbicidas, tales como las mutaciones S4 y/o Hra; resistencia a glifosato (por ejemplo, gen de 5-enolpirovil-chiquimato-3-fosfato-sintasa (EPSPS), descrito en las in Patentes U.S. nos 4.940.935 y 5.188.642; o el gen de glifosato N-acetiltransferasa (GAT), descrito en Castle et al. (2004) Science, 304:1151-1154; y en las Publicaciones de Solicitudes de Patentes U.S. nos 20070004912, 20050246798, y20050060767)); resistencia a glufosinato (por ejemplo, genes de fosfinotricin acetil transferasa PAT y BAR, descritos en las Patentes U.S. nos 5.561.236 y 5.276.268); resistencia a herbicidas que incluyen los herbicidas sulfonilurea, DHT (2,4D) y PPO (por ejemplo, glifosato acetiltransferasa, ariloxialcanoato dioxigenasa, acetolactato sintasa y protoporfirinógeno oxidasa); un citocromo P450 o una variante del mismo, que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas, entre otros, a herbicidas de HPPD (Solicitud de Patente U.S. n2 de serie 12/156.247; Patentes U.S. nos 6.380.465; 6.121.512; 5.349.127; 6.649.814; y 6.300.544; y Publicación Solicitud de Patente PCT n° WO 2007000077); y rasgos deseables para el procesamiento o procesar productos tales como aceite elevado (por ejemplo, patente U.S. n° 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (patente U.S. n° 5.952.544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintasas (SS), enzimas de ramificación de almidones (SBE), y enzimas de desramificación de almidones (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente U.S. n° 5.602.321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa, y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) que facilita la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)).

De este modo, en una realización, los polinucleótidos que codifican un polipéptido de HPPD mutante, o variante del mismo, que retiene actividad enzimática de HPPD, se apilan con uno o más polinucleótidos que codifican polipéptidos que confieren resistencia o tolerancia a un herbicida. En una realización, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a un inhibidor de HPPD. En otra realización, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a glifosato. En otra realización, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a glufosinato.

Estas combinaciones apiladas se pueden crear por cualquier método, incluyendo, pero sin limitarse a, reproducción cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TopCross, o transformación genética. Si las secuencias se apilan transformando genéticamente las plantas, las secuencias polinucleotídicas de interés se pueden combinar en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más rasgos deseados se puede usar como la diana para introducir rasgos adicionales mediante transformación subsiguiente. Los rasgos se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés proporcionados por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introdujeran dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación (trans) separados, o pueden estar contenidas en el mismo casete de transformación (cis). La expresión de las secuencias se puede llevar a cabo por el mismo promotor, o por promotores diferentes. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un casete de transformación que suprimirá la expresión del polipéptido de interés. Este se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión, para generar la combinación deseada de rasgos en la planta. Se reconoce además que se pueden apilar secuencias polinucleotídicas en una localización genómica deseada usando un sistema de recombinación específica del sitio. Véanse, por ejemplo, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855, y WO99/25853.

Casetes de expresión vegetales

Las composiciones de la invención pueden contener adicionalmente secuencias de ácidos nucleicos para la transformación y expresión en una planta de interés. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden estar presentes en constructos de ADN o casetes de expresión. “Casete de expresión”, como se usa aquí, significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica particular en una célula hospedante apropiada, que comprende un promotor enlazado operablemente a la secuencia nucleotídica de interés (es decir, un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables) que está operablemente enlazada a señales de terminación. También comprende típicamente secuencias requeridas para la traducción apropiada de la secuencia nucleotídica. La región codificante codifica habitualmente una proteína de interés, pero también codifica un ARN funcional de interés, por ejemplo ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección del sentido o antisentido. El casete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de interés puede ser quimérico, queriendo decir que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión puede ser también uno que sea de origen natural, pero se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al hospedante, es decir, la secuencia de ADN particular del casete de expresión no se encuentra de forma natural en la célula hospedante, y se debe de haber introducido en la célula hospedante o en un ancestro de la célula hospedante mediante un suceso de transformación. La expresión de la secuencia nucleotídica en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, o de un promotor inducible, que inicia la transcripción sólo cuando la célula hospedante se expone a cierto estímulo externo particular. Adicionalmente, el promotor puede ser también específico de un tejido u órgano o etapa de desarrollo particular.

La presente invención engloba la transformación de plantas con casetes de expresión capaces de expresar un polinucleótido de interés, es decir, un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. El casete de expresión incluirá en la dirección 5’-3’ de la transcripción una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor) y un marco de lectura abierto polinucleotídico. El casete de expresión puede comprender opcionalmente una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende un gen marcador seleccionable, para permitir la selección de transformantes estables. Los constructos de expresión de la invención pueden comprender también una secuencia líder, y/o una secuencia que permite la expresión inducible del polinucleótido de interés. Véase Guo et al. (2003) Plant J. 34:383-92 y Chen et al. (2003) Plant J. 36:731-40, para ejemplos de secuencias que permiten la expresión inducible.

Las secuencias reguladoras del constructo de expresión están enlazadas operablemente al polinucleótido de interés. Por “enlazadas operablemente” se quiere decir un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la segunda secuencia inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente enlazadas significa que las secuencias nucleotídicas que se enlazan son contiguas.

En la práctica de la invención se puede usar cualquier promotor capaz de dirigir la expresión en la planta de interés. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo al hospedante vegetal. Los términos “heterólogo” y “exógeno”, cuando se usan aquí, se refieren a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ADN o ARN) o un gen, se refieren a una secuencia que se origina de una fuente extraña a la célula hospedante particular, o, si procede de la misma fuente, está modificada de su forma original. De este modo, un gen heterólogo en una célula hospedante incluye un gen que es endógeno a la célula hospedante particular, pero que se ha modificado, por ejemplo, mediante el uso de barajado de ADN. Los términos también incluyen múltiples copias de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. De este modo, los términos se refieren a un fragmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedante en la que el elemento no se encuentra normalmente. Los segmentos de ADN exógenos se expresan para producir polipéptidos exógenos.

Una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) “homóloga” es una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) asociada de forma natural con una célula hospedante en la que se introduce.

La elección de los promotores a incluir depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, eficiencia, selectibilidad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y expresión preferencial por células o tejidos. Es una materia normal para un experto en la técnica modular la expresión de una secuencia seleccionando y colocando apropiadamente promotores y otras regiones reguladoras con relación a esa secuencia. Los promotores que se usan para la expresión del transgén o transgenes pueden ser un promotor vegetal fuerte, un promotor vírico, o promotores quiméricos compuestos de elementos tales como: la caja TATA de cualquier gen (o cajas TATA sintéticas, basadas en el análisis del gen de la planta), opcionalmente fusionado a la región 5’ a la caja TATA de promotores vegetales (que dirigen la expresión génica en tejidos y temporalmente apropiada), opcionalmente fusionado a uno o más potenciadores (tales como el potenciador 35S, el potenciador FMV, el potenciador CMP, el potenciador de la SUBUNIDAD PEQUEÑA DE RUBISCO, el potenciador de PLASTOCYANINA).

Los promotores constitutivos ejemplares incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7, y otros promotores constitutivos descritos en el documento WO 99/43838 y en la patente U.S. n° 6.072.050; el promotor CaMV 35S central (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632; y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol.

18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); el promotor de ALS (patente U.S. n° 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.

Los promotores vegetales o quiméricos apropiados son útiles para aplicaciones tales como la expresión de transgenes en ciertos tejidos, mientras que minimizan la expresión en otros tejidos, tales como semillas, o tejidos reproductivos. Los promotores de tipo celular o preferencialmente tisulares ejemplares conducen la expresión preferentemente en el tejido diana, pero también pueden igualmente conducir a cierta expresión en otros tipos celulares o tejidos. Los métodos para identificar y caracterizar regiones promotoras en ADN genómico vegetal incluyen, por ejemplo, los descritos en las siguientes referencias: Jordano, et al., Plant Cell, 1:855-866 (1989); Bustos, et al., Plant Cell, 1:839-854 (1989); Green, et al., EMBO J. 7, 4035-4044 (1988); Meier, et al., Plant Cell, 3, 309-316 (1991); y Zhang, et al., Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996).

En otras realizaciones de la presente invención, se pueden desear promotores inducibles. Los promotores inducibles llevan a cabo la transcripción en respuesta a estímulos externos, tales como agentes químicos, o estímulos medioambientales. Por ejemplo, los promotores inducibles pueden conferir transcripción en respuesta hormonas tales como ácido giberélico o etileno, o en respuesta a la luz o a la sequía.

Existe una variedad de terminadores transcripcionales para uso en casetes de expresión. Son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgén, y la poliadenilación de ARNm correcta. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés operablemente enlazada, puede ser nativa con el hospedante vegetal, o puede derivar de otra fuente (es decir extraña o heteróloga al promotor, a la secuencia de ADN de interés, al hospedante vegetal, o a cualquier combinación de los mismos). Los terminadores transcripcionales apropiados son aquellos que se sabe que funcionan en plantas, e incluyen el terminador CAMV 35S, el terminador tml, el terminador de nopalina sintasa, y el terminador rbcs E9 del guisante. Estos se pueden usar tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Además, se puede usar un terminador de la transcripción nativo del gen.

Generalmente, el casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados.

Se han encontrado numerosas secuencias para potenciar la expresión génica a partir de la unidad transcripcional, y estas secuencias se pueden usar conjuntamente con los genes de esta invención para incrementar su expresión en plantas transgénicas.

Se ha demostrado que diversas secuencias intrónicas potencian la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen Adhl del maíz potencian significativamente la expresión del gen de tipo salvaje bajo su promotor cognato cuando se introducen en células de maíz. Se encontró que el intrón 1 es particularmente efectivo y que potenció la expresión en constructos de fusión con el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (Callis et al. Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)). En el mismo sistema experimental, el intrón del gen bronce 1 del maíz tiene un efecto similar potenciando la expresión. Las secuencias intrónicas se han incorporado de forma habitual en vectores de transformación de plantas, típicamente en el líder no traducido.

También se sabe que un número de secuencias líder no traducidas, derivadas de virus, potencian la expresión, y estas son particularmente efectivas en células dicotiledóneas. Específicamente, se ha demostrado que las secuencias líder del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV, la “secuencia W”), el Virus del Moteado Clorótico del Maíz (MCMV), y el Virus del Mosaico de la Alfalfa (AMV), son efectivas potenciando la expresión (por ejemplo, Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)). Otras secuencias líder conocidas en la técnica incluyen, pero no se limitan a: líderes de picomavirus, por ejemplo líder de EMCV (región no codificante de 5’ de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., y Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130 (1989)); los líderes de potivirus, por ejemplo el líder de TEV (Virus del Jaspeado del Tabaco) (Allison et al. 1986); el líder de MDMV (Virus del Mosaico del Enanismo Maíz); Virology 154:9-20); el líder de la proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, D. G., y Samow, P., Nature 353: 90-94 (1991); el líder no traducido procedente del ARNm de proteína de revestimiento del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling, S. A., y Gehrke, L., Nature 325:622-625 (1987); el líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie, D. R. et al., Molecular Biology of RNA, páginas 237-256 (1989); y el líder del Virus Moteado Clorótico del Maíz (MCMV) (Lommel, S. A. et al., Virology 81:382-385 (1991). Véase también, Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987).

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden uno o más de los casetes de expresión descritos anteriormente. El constructo puede ser un vector, tal como un vector de transformación vegetal. En una realización, el vector es un vector de transformación vegetal que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia expuesta en SEC ID NO: 34, 35, 36 o 37.

Plantas

Como se usa aquí, la expresión “parte vegetal” o “tejido vegetal” incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden generar plantas, callos vegetales, racimos vegetales, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, fruta, pepitas, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, y similares.

Las plantas útiles en la presente invención incluyen plantas que son transgénicas para al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. El tipo de planta seleccionada depende de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, el uso aguas abajo del material vegetal cosechado, la susceptibilidad de la especie vegetal a la transformación, y las condiciones en las que se harán crecer, se cosecharán, y/o se procesarán las plantas. Un experto reconocerá además que factores adicionales para seleccionar variedades vegetales apropiadas para uso en la presente invención incluyen elevado potencial de rendimiento, buena fortaleza del tallo, resistencia a enfermedades específicas, tolerancia a la sequía, secado rápido, y suficiente calidad de grano para permitir el almacenamiento y el envío al mercado con pérdida mínima.

Las plantas según la presente invención incluyen cualquier planta que se cultive con el fin de producir material vegetal que es buscado por el hombre o animal para el consumo oral, o para la utilización en un proceso industrial, farmacéutico, o comercial. La invención se puede aplicar a cualquiera de una variedad de plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, maíz, trigo, arroz, cebada, haba de soja, algodón, sorgo, habas en general, colza/cánola, alfalfa, lino, girasol, alazor, mijo, centeno, caña de azúcar, remolacha azucarera, cacao, té, Brassica, algodón, café, batata, lino, cacahuete, clavo; vegetales tales como lechuga, tomate, cucurbitáceas, casabe, patata, zanahoria, rábano, guisante, lentejas, repollo, coliflor, brócoli, coles de Bruselas, pimientos, y piña; frutas de árboles tales como limón, manzanas, peras, melocotones, albaricoques, nueces, aguacate, plátano, y coco, y flores tales como orquídeas, claveles y rosas. Otras plantas útiles en la práctica de la invención incluyen pastos perennes, tales como pasto varilla, pastos de las praderas, pasto de la India, pasto de tallo azul gigante, y similares. Se reconoce que se pueden usar mezclas de plantas.

Además, el término “cosechas” se ha de entender también que incluye cosechas que se han hecho tolerantes a herbicidas o clases de herbicidas (tales como, por ejemplo, inhibidores de ALS, por ejemplo primisulfurón, prosulfurón y trifloxisulfurón, inhibidores de EPSPS (5-enol-pirovil-chiquimato-3-fosfato-sintasa), inhibidores de GS (glutamina sintetasa)) como resultado de métodos convencionales de reproducción o manipulación genética mediante ingeniería. Los ejemplos de cosechas que se han hecho tolerantes a herbicidas o clases de herbicidas mediante métodos de manipulación genética mediante ingeniería incluyen variedades de cosechas resistentes a glifosato y a glufosinato, comercialmente disponibles con los nombres comerciales ROUNDUPREADY® y LIBERTYLINK®. El método según la presente invención es especialmente adecuado para la protección de cosechas de haba de soja que también se han hecho tolerantes a glifosato y/o glufosinato, y en las que se usan herbicidas de HPPD en un programa de control de malas hierbas junto con otros de tales herbicidas (glufosinato y/o glifosato) para el control de malas hierbas.

Se contempla además que los constructos de la invención se pueden introducir en variedades vegetales que tienen propiedades mejoradas adecuadas u óptimas para un uso aguas abajo particular. Por ejemplo, la variabilidad genética de origen natural da como resultado plantas con resistencia o tolerancia a inhibidores de HPPD u otros herbicidas, y tales plantas son también útiles en los métodos de la invención. El método según la presente invención se puede optimizar además cruzando los transgenes que proporcionan un nivel de tolerancia con variedades de cultivo de haba de soja que muestran un nivel mejorado de tolerancia a inhibidores de HPPD que se encuentra en un pequeño porcentaje de líneas de haba de soja.

Transformación vegetal

Una vez que se ha clonado en un sistema de expresión un polinucleótido de HPPD mutante resistente o tolerante a herbicidas, solo o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables, se transforma en una célula vegetal. Los casetes de expresión de receptor y diana de la invención se pueden introducir en la célula vegetal de muchas maneras reconocidas en la técnica. El término “introducir”, en el contexto de un polinucleótido, por ejemplo un constructo nucleotídico de interés, quiere decir presentar a la planta el polinucleótido de manera que el polinucleótido gane acceso al interior de una célula de la planta. Cuando se va a introducir más de un polinucleótido, estos polinucleótidos se pueden ensamblar como parte de un único constructo nucleotídico, o como constructos nucleotídicos separados, y se pueden localizar en los mismos vectores de transformación o en diferentes vectores de transformación. En consecuencia, estos polinucleótidos se pueden introducir en la célula hospedante de interés en un suceso de transformación individual, en sucesos de transformación separados, o, por ejemplo, en plantas, como parte de un protocolo de reproducción. Los métodos de la invención no dependen del método particular para introducir uno o más polinucleótidos en una planta, sólo que el polinucleótido o polinucleótidos ganen acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación transitoria, métodos de transformación estable, y métodos mediados por virus.

“Transformación transitoria”, en el contexto de un polinucleótido, quiere decir que se introduce un polinucleótido en la planta y no se integra en el genoma de la planta.

Por “introducir de forma estable” o “introducido de forma estable”, en el contexto de un polinucleótido introducido en una planta, se quiere decir que el polinucleótido introducido se incorpora de forma estable en el genoma de la planta, y de este modo la planta se transforma de forma estable con el polinucleótido.

“Transformación estable” o “transformado de forma estable” quiere decir que un polinucleótido, por ejemplo un constructo nucleotídico descrito aquí, introducido en una planta, se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma, más particularmente por la progenie de múltiples generaciones sucesivas.

Aquellos de pericia normal en las técnicas de transformación vegetal conocen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación vegetal, y se pueden usar los genes pertinentes a esta invención conjuntamente con cualquiera de tales vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie diana para la transformación. Para ciertas especies diana, se pueden preferir diferentes marcadores de selección de antibióticos o de herbicidas. Los marcadores de selección usados habitualmente en transformación incluyen el gen nptll, que confiere resistencia a canamicina y antibióticos relacionados (Messing y Vierra Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), los genes pat y bar, que confieren resistencia al herbicida glufosinato (también denominado fosfinotricina; véanse White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990) y las patentes U.S. nos 5.561.236 y 5.276.268), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), y el gen de dhfr, que confiere resistencia a metatrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), el gen de EPSPS, que confiere resistencia a glifosato (patentes U.S. nos 4.940.935 y 5.188.642), el gen de glifosato N-acetiltransferasa (GAT), que también confiere resistencia a glifosato (Castle et al. (2004) Science, 304:1151-1154; Pub. Sol. de patentes U.S. nos 20070004912, 20050246798, y 20050060767); y el gen de manosa-6-fosfato isomerasa, que proporciona la capacidad para metabolizar manosa (patentes U.S. nos 5.767.378 y 5.994.629). Como alternativa, y en una realización preferida, el gen de HPPD de la actual invención se usa él mismo, como el marcador seleccionable, en combinación con el uso de un herbicida de HPPD como agente de selección.

Los métodos para la regeneración de plantas también son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se han utilizado vectores plasmídicos Ti para el suministro de ADN extraño, así como la captación directa de ADN, liposomas, electroporación, microinyección, y microproyectiles. Además, se pueden utilizar bacterias del género Agrobacterium para transformar células vegetales. A continuación se dan descripciones de técnicas representativas para transformar plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, así como una técnica de transformación de plástidos representativa.

Muchos vectores están disponibles para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Estos poseen típicamente al menos una secuencia frontera de T-DNA, e incluyen vectores tales como pBIN 19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Para la construcción de vectores útiles en la transformación con Agrobacterium, véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 2006/0260011.

La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens soslaya la necesidad de secuencias de T-DNA en el vector de transformación escogido, y en consecuencia se pueden utilizar vectores que carecen de estas secuencias, además de vectores tales como aquellos descritos anteriormente que contienen las secuencias de T-DNA. Las técnicas de transformación que no se basan en Agrobacterium incluyen la transformación vía bombardeo con partículas, captación de protoplastos (por ejemplo, PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende enormemente de la selección preferida para la especie que se transforma. Para la construcción de tales vectores, véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente U.S. n° 20060260011.

Para la expresión de una secuencia nucleotídica de la presente invención en plástidos vegetales, se usa el vector de transformación de plástidos pPH143 (el WO 97/32011, véase el Ejemplo 36). La secuencia nucleotídica se inserta en pPH143, sustituyendo de ese modo la secuencia codificante de PROTOX. Este vector se usa entonces para la transformación plastídica y la selección de transformantes para resistencia a espectinomicina. Como alternativa, la secuencia nucleotídica se inserta en pPH143, de forma que sustituye al gen aadH. En este caso, los transformantes se seleccionan para resistencia a inhibidores de PROTOX.

Las técnicas de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en la técnica, e incluyen técnicas a base de Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas sin Agrobacterium implican la captación de material genético exógeno directamente por los protoplastos o células. Esto se puede lograr mediante captación mediada por PEG o por electroporación, suministro mediado por bombardeo con partículas, o microinyección. Los ejemplos de estas técnicas se describen por Paszkowski et al. EMBO J. 3:2717-2722 (1984); Potrykus et al. Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985); Reich et al. Biotechnology 4:1001-1004 (1986); y Klein et al. Nature 327:70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas se regeneran en plantas completas usando técnicas estándar conocidas en la técnica.

La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotiledóneas, debido a su elevada eficiencia de transformación y a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación mediada por Agrobacterium implica típicamente la transferencia del vector binario que posee el ADN extraño de interés (por ejemplo, pCIB200 o pCIB2001) a una cepa de Agrobacterium apropiada, que puede depender del complemento de genes vir portados por la cepa hospedante de Agrobacterium en un plásmido Ti corresidente, o cromosómicamente (por ejemplo, cepa CIB542 para pCIB200 y pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5:159-169 (1993)). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium se logra mediante un procedimiento de emparejamiento triparental usando E. coli que posee el vector binario recombinante, una cepa de E. coli auxiliar que posee un plásmido tal como pRK2013 y que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a la cepa diana de Agrobacterium. Como alternativa, el vector binario recombinante se puede transferir a Agrobacterium mediante transformación con ADN (Hofgen y Willmitzer Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).

La transformación de la especie vegetal diana mediante Agrobacterium recombinante implica habitualmente el cocultivo de la Agrobacterium con explantes procedentes de la planta, y siguiendo protocolos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado se regenera en medio seleccionable que posee el marcador de resistencia a antibióticos o a herbicidas presente entre las fronteras de T-DNA del plásmido binario.

Otro enfoque para transformar células vegetales con un gen implica propulsar partículas inertes o biológicamente activas en los tejidos y células vegetales. Esta técnica se describe en las patentes U.S. nos 4.945.050, 5.036.006, y 5.100.792, todas de Sanford et al. Generalmente, este procedimiento implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células en condiciones efectivas para penetrar la superficie exterior de la célula y producir la incorporación en el interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector se puede introducir en la célula revistiendo las partículas con el vector que contiene el gen deseado. Como alternativa, la célula diana puede estar rodeada por el vector, de manera que el vector es portado en la célula por la estela de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células de levadura secas, bacteria seca o un bacteriófago, conteniendo cada uno ADN que se busca introducir) también pueden ser propulsadas en un tejido de célula vegetales.

La transformación de la mayoría de las especies de monocotiledóneas se ha convertido ahora también en algo normal. Las técnicas preferidas incluyen la transferencia génica directa en protoplastos usando técnicas mediante PEG o electroporación, y bombardeo con partículas en el tejido del callo. Las transformaciones se pueden llevar a cabo con una única especie de ADN, o con múltiples especies de ADN (es decir, cotransformación), y estas dos técnicas son adecuadas para uso con esta invención. La cotransformación puede tener la ventaja de evitar la construcción completa del vector, y de generar plantas transgénicas con loci sin enlazar para el gen de interés y el marcador seleccionable, permitiendo la eliminación del marcador seleccionable en generaciones subsiguientes, considerándose esto deseable. Sin embargo, una desventaja del uso de la cotransformación es la frecuencia menor de 100% con la que la especie de ADN separada se integra en el genoma (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)).

Las Solicitudes de Patentes EP 0292435, EP 0392225, y WO 93/07278, describen técnicas para la preparación de callo y protoplastos a partir de una línea consanguínea de élite de maíz, la transformación de los protoplastos usando PEG o electroporación, y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603-618 (1990)) y Fromm et al. (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) han publido técnicas para la transformación de la estirpe del maíz derivada de A188 usando bombardeo con partículas. Además, WO 93/07278 y Koziel et al. (Biotechnology 11:194-200 (1993)) describen técnicas para la transformación de estirpes consanguíneas de élite de maíz mediante bombardeo con partículas. Esta técnica utiliza embriones inmaduros de maíz de una longitud de 1,5-2,5 mm, cortados de una mazorca de maíz 14-15 días después de la polinización, y un dispositivo PDS-1000He Biolistics para el bombardeo.

La transformación de arroz también se puede llevar a cabo mediante técnicas de transferencia génica directa utilizando protoplastos o bombardeo con partículas. Las transformaciones mediadas por protoplastos se han descrito para los tipos Japónica e Índica (Zhang et al. Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338:274-277 (1989); y Datta et al. Biotechnology 8:736-740 (1990)). Ambos tipos también son transformables de forma habitual usando bombardeo con partículas (Christou et al. Biotechnology 9:957-962 (1991)). Además, WO 93/21335 describe técnicas para la transformación de arroz vía electroporación.

La Solicitud de Patente EP 0332581 describe técnicas para la generación, transformación, y regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de Dactylis y trigo. Además, la transformación del trigo se ha descrito por Vasil et al. (Biotechnology 10:667-674 (1992)) usando bombardeo con partículas en células de callo regenerable a largo plazo tipo C, y también por Vasil et al. (Biotechnology 11:1553-1558 (1993)) y Weeks et al. (Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993)) usando bombardeo con partículas de embriones inmaduros y callo derivado de embriones inmaduros. Sin embargo, una técnica preferida para la transformación de trigo implica la transformación de trigo mediante bombardeo con partículas de embriones inmaduros, e incluye una etapa con alto contenido de sacarosa o una etapa con alto contenido de maltosa antes del suministro génico. Antes del bombardeo, se colocan en placas cualquier número de embriones (0,75-1 mm de longitud) en medio MS con 3% de sacarosa (Murashiga y Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) y 3 mg/l de 2,4-D para la inducción de embriones somáticos, que se deja transcurrir en la oscuridad. En el día escogido del bombardeo, los embriones se retiran del medio de inducción y se colocan en el osmótico (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa añadida a la concentración deseada, típicamente 15%). Los embriones se dejan plasmolizar durante 2-3 horas y después son bombardeados. Veinte embriones por placa diana son típicos, aunque no críticos. Un plásmido que posee el gen apropiado (tal como pCIB3064 o pSOG35) se hace precipitar sobre partículas de oro de tamaño micrométrico usando procedimientos estándar. Cada placa de embriones es disparada con el dispositivo de helio DuPont BIOLISTICS® usando una presión de estallido de alrededor de un 1000 psi usando un tamiz de malla 80 estándar. Tras el bombardeo, los embriones se colocan nuevamente en la oscuridad para que se recuperen durante alrededor de un 24 horas (todavía en osmótico). Después de 24 h, los embriones se retiran del osmótico y se colocan nuevamente en medio de inducción, en el que permanecen durante alrededor de un un mes antes de la regeneración. Aproximadamente un mes después, los explantes embriónicos con callo embriogénico en desarrollo se transfieren a medio de regeneración (MS+1 mg/litro NAA, 5 mg/litro GA), que contiene además el agente de selección apropiado (10 mg/l basta en el caso de pCIB3064, y 2 mg/l de metotrexato en el caso de pSOG35). Después de aproximadamente un mes, los retoños desarrollados se transfieren a recipientes estériles más grandes conocidos como “GA7”, que contienen MS de fuerza media, 2% de sacarosa, y la misma concentración de agente de selección.

También se ha descrito la transformación de monocotiledóneas usando Agrobacterium. Véanse, WO 94/00977 y la patente U.S. n° 5.591.616. Véase también, Negrotto et al. Plant Cell Reports 19:798-803 (2000).

Por ejemplo, se puede usar arroz (Oryza sativa) para generar plantas transgénicas. Se pueden usar diversas variedades de cultivo del arroz (Hiei et al., 1994, Plant Journal 6:271-282; Dong et al., 1996, Molecular Breeding 2:267-276; y Hiei et al., 1997, Plant Molecular Biology 35:205-218). También, los diversos constituyentes de los medios descritos más abajo se pueden variar en cantidad o se pueden sustituir. Las respuestas embriogénicas se inician y/o los cultivos se establecen a partir de embriones maduros cultivando en medio MS-CIM (sales basales de MS, 4,3 g/litro; vitaminas B5 (200X), 5 ml/litro; sacarosa, 30 g/litro; prolina, 500 mg/litro; glutamina, 500 mg/litro; hidrolizado de caseína, 300 mg/litro; 2,4-D (1 mg/ml), 2 ml/litro; ajustar pH hasta 5,8 con KOH 1 N; Phytagel, 3 g/litro). Tanto los embriones maduros en las etapas iniciales de respuesta del cultivo o las estirpes del cultivo establecidas se inoculan y cocultivan con la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium) que contiene la construcción vectorial deseada. Agrobacterium se cultiva a partir de lotes de glicerol sobre medio YPC sólido (100 mg/L de espectinomicina y cualquier otro antibiótico apropiado) durante alrededor de un 2 días a 28°C. Agrobacterium se resuspende en medio MS-CIM líquido. El cultivo de Agrobacterium se diluye hasta una OD600 de 0,2-0,3, y se añade acetosiringona hasta una concentración final de 200 p.M. La acetosiringona se añade antes de mezclar la disolución con los cultivos de arroz para inducir al Agrobacterium para la transferencia de ADN a las células vegetales. Para la inoculación, los cultivos vegetales se sumergen en la suspensión bacteriana. La suspensión bacteriana líquida se retira y los cultivos inoculados se colocan en medio de cocultivo y se incuban a 22°C durante dos días. Los cultivos se transfieren entonces a medio MS-CIM con ticarcilina (400 mg/litro) para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Para los constructos que utilizan el gen marcador seleccionable de PMI (Reed et al. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37:127-132), los cultivos se transfieren a medio de selección que contiene manosa como fuente de hidratos de carbono (MS con 2% de manosa, 300 mg/litro de ticarcilina) después de 7 días, y se cultivan durante 3-4 semanas en la oscuridad. Las colonias resistentes se transfieren entonces para la regeneración en medio de inducción (MS sin 2,4-D, 0,5 mg/litro de IAA, 1 mg/litro de zeatina, 200 mg/litro de timentina, 2% de manosa y 3% de sorbitol) y se hacen crecer en la oscuridad durante 14 días. Las colonias que proliferan se transfieren entonces a otra ronda de medio de inducción de regeneración y se mueven a la habitación de crecimiento iluminada. Los brotes regenerados se transfieren a recipientes GA7 con medio GA7-1 (MS sin hormonas y con 2% de sorbitol) durante 2 semanas, y después se mueven al invernadero donde son suficientemente grandes y tienen raíces adecuadas. Las plantas se transplantan al suelo en el invernadero (generación T0), se hacen crecer hasta la madurez, y la semilla T1 se cosecha.

Las plantas obtenidas vía transformación con una secuencia de ácido nucleico de interés en la presente invención pueden ser cualquiera de una amplia variedad de especies vegetales, incluyendo aquellas monocotiledóneas y dicotiledóneas; sin embargo, las plantas usadas en el método de la invención se seleccionan preferiblemente de la lista de cosechas diana agronómicamente importantes expuestas aquí en otra parte. La expresión de un gen de la presente invención, en combinación con otras característica importantes para la producción y calidad, se pueden incorporar en estirpes vegetales a través de reproducción. Los enfoques y técnicas de reproducción son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Welsh, Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley and Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood D.R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983); Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Segunda Edición, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D. P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); y Wricke y Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlín (1986).

Para la transformación de plástidos, se hacen germinar semillas de Nicotiana tabacum c.v. “Xanthiene”, siete por placa, en una disposición circular de 1” en un medio de agar T, y 12-14 días después de sembrar se bombardean con partículas de volframio de 1 pm (M10, Biorad, Hercules, Calif.) revestidas con ADN procedente de los plásmidos pPH143 y pPH145, esencialmente como se describe (Svab, Z. y Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917). Las plántulas bombardeadas se incuban en medio T durante dos días, después de lo cual se cortan las hojas y se colocan con el lado abaxial hacia arriba en luz brillante (350-500 pmoles de fotones/m2/s) en placas de medio RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. y Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530) que contiene 500 pg/ml de dihidrocloruro de espectinomicina (Sigma, St. Louis, MO). Los brotes resistentes que aparecen por debajo de las hojas cloróticas, tres a ocho semanas después del bombardeo, se subclonan en el mismo medio selectivo, se deja que se forme callo, y los brotes secundarios se aíslan y se subclonan. La segregación completa de copias genómicas de plástidos transformados (homoplasmicidad) en subclones independientes se evalúa mediante técnicas estándar de transferencia Southern (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Se separa ADN celular total digerido con BamHI/EcoRI (Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346349) en geles de agarosa con 1% de Tris-borato (TBE), se transfiere a membranas de nailon (Amersham), y se sonda con secuencias de ADN cebadas al azar marcadas con 32P que corresponden a un fragmento de ADN de BamHI/HindIII de 0,7 kb procedente de pC8 que contiene una porción de la secuencia que selecciona plástidos rps7/12. Los brotes homoplásmicos se enraízan asépticamente en medio MS/IBA que contiene espectinomicina (McBride, K. E. et al. (1994) PNAS 91,7301 -7305), y se transfieren al invernadero.

Las propiedades genéticas manipuladas mediante ingeniería en las semillas y plantas transgénicas descritas anteriormente se perpetúan mediante reproducción sexual o crecimiento vegetativo, y de este modo se pueden mantener y propagar en las plantas de la progenie. Generalmente, el mantenimiento y la propagación hacen uso de métodos agrícolas conocidos, desarrollados para satisfacer fines específicos tales como el arado, la siembra o el cosechado.

El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas y semillas transgénicas según la invención se puede hacer adicionalmente en la reproducción vegetal. Dependiendo de las propiedades deseadas, se toman diferentes medidas de reproducción. Las técnicas pertinentes son bien conocidas en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, hibridación, reproducción endogámica, reproducción por retrocruzamiento, reproducción de múltiples líneas, mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. De este modo, las semillas y plantas transgénicas según la invención se pueden usar para la reproducción de líneas vegetales mejoradas que, por ejemplo, incrementan la efectividad de métodos convencionales, tales como el tratamiento con herbicidas o plaguicidas, o permiten dispensarlos con dichos métodos debido a sus propiedades genéticas modificadas.

Muchos métodos adecuados para la transformación que usan marcadores de selección adecuados, tales como canamicina, vectores binarios tales como procedentes de Agrobacterium, y regeneración de plantas, como, por ejemplo, procedentes de discos de hojas de tabaco, son bien conocidos en la técnica. Opcionalmente, igualmente una población de control vegetal se transforma con un polinucleótido que expresa la HPPD de control. Como alternativa, una planta dicotiledónea no transformada, tal como Arabidopsis o tabaco, se puede usar como un control, puesto que, en este caso, expresa su propia HPPD endógena.

Resistencia a herbicidas

La presente invención proporciona plantas, células vegetales, tejidos y semillas transgénicas que se han transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica una HPPD mutante o variante de la misma que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas, sola o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables.

En una realización, las plantas transgénicas de la invención presentan resistencia o tolerancia a la aplicación de herbicida en una cantidad desde alrededor de un 5 hasta alrededor de un 2,000 gramos por hectárea (g/ha), incluyendo, por ejemplo, alrededor de un 5 g/ha, alrededor de un 10 g/ha, alrededor de un 15 g/ha, alrededor de un 20 g/ha, alrededor de un 25 g/ha, alrededor de un 30 g/ha, alrededor de un 35 g/ha, alrededor de un 40 g/ha, alrededor de un 45 g/ha, alrededor de un 50 g/ha, alrededor de un 55 g/ha, alrededor de un 60 g/ha, alrededor de un 65 g/ha, alrededor de un 70 g/ha, alrededor de un 75 g/ha, alrededor de un 80 g/ha, alrededor de un 85 g/ha, alrededor de un 90 g/ha, alrededor de un 95 g/ha, alrededor de un 100 g/ha, alrededor de un 110 g/ha, alrededor de un 120 g/ha, alrededor de un 130 g/ha, alrededor de un 140 g/ha, alrededor de un 150 g/ha, alrededor de un 160 g/ha, alrededor de un 170 g/ha, alrededor de un 180 g/ha, alrededor de un 190 g/ha, alrededor de un 200 g/ha, alrededor de un 210 g/ha, alrededor de un 220 g/ha, alrededor de un 230 g/ha, alrededor de un 240 g/ha, alrededor de un 250 g/ha, alrededor de un 260 g/ha, alrededor de un 270 g/ha, alrededor de un 280 g/ha, alrededor de un 290 g/ha, alrededor de un 300 g/ha, alrededor de un 310 g/ha, alrededor de un 320 g/ha, alrededor de un 330 g/ha, alrededor de un 340 g/ha, alrededor de un 350 g/ha, alrededor de un 360 g/ha, alrededor de un 370 g/ha, alrededor de un 380 g/ha, alrededor de un 390 g/ha, alrededor de un 400 g/ha, alrededor de un 410 g/ha, alrededor de un 420 g/ha, alrededor de un 430 g/ha, alrededor de un 440 g/ha, alrededor de un 450 g/ha, alrededor de un 460 g/ha, alrededor de un 470 g/ha, alrededor de un 480 g/ha, alrededor de un 490 g/ha, alrededor de un 500 g/ha, alrededor de un 510 g/ha, alrededor de un 520 g/ha, alrededor de un 530 g/ha, alrededor de un 540 g/ha, alrededor de un 550 g/ha, alrededor de un 560 g/ha, alrededor de un 570 g/ha, alrededor de un 580 g/ha, alrededor de un 590 g/ha, alrededor de un 600 g/ha, alrededor de un 610 g/ha, alrededor de un 620 g/ha, alrededor de un 630 g/ha, alrededor de un 640 g/ha, alrededor de un 650 g/ha, alrededor de un 660 g/ha, alrededor de un 670 g/ha, alrededor de un 680 g/ha, alrededor de un 690 g/ha, alrededor de un 700 g/ha, alrededor de un 710 g/ha, alrededor de un 720 g/ha, alrededor de un 730 g/ha, alrededor de un 740 g/ha, alrededor de un 750 g/ha, alrededor de un 760 g/ha, alrededor de un 770 g/ha, alrededor de un 780 g/ha, alrededor de un 790 g/ha, alrededor de un 800 g/ha, alrededor de un 810 g/ha, alrededor de un 820 g/ha, alrededor de un 830 g/ha, alrededor de un 840 g/ha, alrededor de un 850 g/ha, alrededor de un 860 g/ha, alrededor de un 870 g/ha, alrededor de un 880 g/ha, alrededor de un 890 g/ha, alrededor de un 900 g/ha, alrededor de un 910 g/ha, alrededor de un 920 g/ha, alrededor de un 930 g/ha, alrededor de un 940 g/ha, alrededor de un 950 g/ha, alrededor de un 960 g/ha, alrededor de un 970 g/ha, alrededor de un 980 g/ha, alrededor de un 990 g/ha, alrededor de un 1.000, g/ha, alrededor de un 1.010 g/ha, alrededor de un 1.020 g/ha, alrededor de un 1.030 g/ha, alrededor de un 1.040 g/ha, alrededor de un 1.050 g/ha, alrededor de un 1.060 g/ha, alrededor de un 1.070 g/ha, alrededor de un 1.080 g/ha, alrededor de un 1.090 g/ha, alrededor de un 1.100 g/ha, alrededor de un 1.110 g/ha, alrededor de un 1.120 g/ha, alrededor de un 1.130 g/ha, alrededor de un 1.140 g/ha, alrededor de un 1.150 g/ha, alrededor de un 1.160 g/ha, alrededor de un 1.170 g/ha, alrededor de un 1.180 g/ha, alrededor de un 1.190 g/ha, alrededor de un 1.200 g/ha, alrededor de un 1.210 g/ha, alrededor de un 1.220 g/ha, alrededor de un 1.230 g/ha, alrededor de un 1.240 g/ha, alrededor de un 1.250 g/ha, alrededor de un 1.260 g/ha, alrededor de un 1.270 g/ha, alrededor de un 1.280 g/ha, alrededor de un 1.290 g/ha, alrededor de un 1.300 g/ha, alrededor de un 1.310 g/ha, alrededor de un 1.320 g/ha, alrededor de un 1.330 g/ha, alrededor de un 1.340 g/ha, alrededor de un 1.350 g/ha, alrededor de un 360 g/ha, alrededor de un 1.370 g/ha, alrededor de un 1.380 g/ha, alrededor de un 1.390 g/ha, alrededor de un 1.400 g/ha, alrededor de un 1.410 g/ha, alrededor de un 1.420 g/ha, alrededor de un 1.430 g/ha, alrededor de un 1.440 g/ha, alrededor de un 1.450 g/ha, alrededor de un 1.460 g/ha, alrededor de un 1.470 g/ha, alrededor de un 1.480 g/ha, alrededor de un 1.490 g/ha, alrededor de un 1.500 g/ha, alrededor de un 1.510 g/ha, alrededor de un 1.520 g/ha, alrededor de un 1.530 g/ha, alrededor de un 1.540 g/ha, alrededor de un 1.550 g/ha, alrededor de un 1.560 g/ha, alrededor de un 1.570 g/ha, alrededor de un 1.580 g/ha, alrededor de un 1.590 g/ha, alrededor de un 1.600 g/ha, alrededor de un 1.610 g/ha, alrededor de un 1.620 g/ha, alrededor de un 1.630 g/ha, alrededor de un 1.640 g/ha, alrededor de un 1.650 g/ha, alrededor de un 1.660 g/ha, alrededor de un 1.670 g/ha, alrededor de un 1.680 g/ha, alrededor de un 1.690 g/ha, alrededor de un 1.700 g/ha, alrededor de un 1.710 g/ha, alrededor de un 1.720 g/ha, alrededor de un 1.730 g/ha, alrededor de un 1.740 g/ha, alrededor de un 1.750 g/ha, alrededor de un 1.760 g/ha, alrededor de un 1.770 g/ha, alrededor de un 1.780 g/ha, alrededor de un 1.790 g/ha, alrededor de un 1.800 g/ha, alrededor de un 1.810 g/ha, alrededor de un 1.820 g/ha, alrededor de un 1.830 g/ha, alrededor de un 1.840 g/ha, alrededor de un 1.850 g/ha, alrededor de un 1.860 g/ha, alrededor de un 1.870 g/ha, alrededor de un 1.880 g/ha, alrededor de un 1.890 g/ha, alrededor de un 1.900 g/ha, alrededor de un 1.910 g/ha, alrededor de un 1.920 g/ha, alrededor de un 1.930 g/ha, alrededor de un 1.940 g/ha, alrededor de un 1.950 g/ha, alrededor de un 1.960 g/ha, alrededor de un 1.970 g/ha, alrededor de un 1.980 g/ha, alrededor de un 1.990 g/ha, o alrededor de un 2.000.

Los niveles medios y de distribución de tolerancia o resistencia a herbicidas de un intervalo de sucesos de transformación vegetal primario se evalúan de la manera normal basándose en el daño a la planta, síntomas de clorosis meristemática, etc., en un intervalo de diferentes concentraciones de herbicidas. Estos datos se pueden expresar en términos de, por ejemplo, valores GR50, derivados de curvas de dosis/respuesta que representan gráficamente las “dosis” en el eje x, y representan gráficamente en el eje y el “porcentaje de exterminio”, “efecto herbicida”, “números de plantas verdes que emergen”, etc., en las que valores incrementados de GR50 corresponden a niveles incrementados de tolerancia inherente a inhibidores (por ejemplo, valor incrementado de Ki/KmHPP) y/o el nivel de expresión de polipéptido de HPPD expresado.

Los métodos de la presente divulgación son especialmente útiles para proteger cosechas de la lesión herbicida de herbicidas inhibidores de HPPD de las clases de química de HPPD descritas a continuación. En un aspecto, se seleccionan del grupo que consiste en:

a) un compuesto de fórmula (Ia)

donde R1 y R2 son hidrógeno o juntos forman un puente de etileno;

R3 es hidroxi o feniltio-; R4 es halógeno, nitro, alquilo C1-C4, (alcoxi C1 -C4)-(alquil C1-C4)-, (alcoxi C1-C4)-(alcoxi C1-C4)-(alquil C1-C4)-;

X es metino, nitrógeno o C-R5 donde R5 es hidrógeno, alcoxi C1-C4, (haloalcoxi C1 -C4)-(alquil C1-C4)- o un grupo

R6 es alquilsulfonil C1-C4- o haloalquilo C1-C4;

b) un compuesto de fórmula (Ib)

donde R1 es hidroxi, fenilcarbonil-(alcoxi C1-C4)- o fenilcarbonil-(alcoxi C1-C4)- donde el resto de fenilo está sustituido en la posición para con halógeno o alquilo C1-C4, o fenilsulfoniloxi- o fenilsulfoniloxi- donde el resto de fenilo está sustituido en la posición para con halógeno o alquilo C1-C4;

R2 es alquilo C1-C4;

R3 es hidrógeno o alquilo C1-C4; R4 y R6 son independientemente halógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4 o alquilsulfonil C1-C4-; y

R5 es hidrógeno, alquilo C1-C4, (alcoxi C1-C4)-(alcoxi C1-C4)- o un grupo

d) un compuesto de fórmula (Id)

R2 es alquilo C1-C4;

R3 es hidrógeno; y R4, R5 y R6 son independientemente alquilo C1-C4;

e) un compuesto de fórmula (Ie)

R2 y R4 son independientemente halógeno, haloalquilo C1-C4 o alquilsulfonil C1-C4-; y

R3 es hidrógeno;

f) un compuesto de fórmula (If)

donde R1 es ciclopropilo;

R3 es hidrógeno;

g) un compuesto de fórmula (Ig) o fórmula (Ih)

donde:

R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, (alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3) y (alcoxi C1-C3)-(alcoxi C2-C3)-(alquilo C1-C3);

R5 es hidrógeno o metilo;

R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, flúor, cloro, hidroxilo y metilo;

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C6, haloalquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C3-C6, alcoxi C1-C6, cicloalcoxi C4-C7, haloalcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, alquilsulfonilo C1-C6, haloalquiltio C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, dialquilamino C2-C6, dialquilaminosulfonilo C2-C6, alquilaminosulfonilo C1-C6, (alcoxi C1-C6)-(alquilo C1-C6), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi C2-C6), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi C2-C6)-(alquilo C1-C6), (alquenil C3-C6)-(alcoxi C2-C6), (alquinil C3-C6)-(alcoxi C1-C6), (alcoxi C1-C6)carbonilo, (alquil C1-C6)carbonilo, (alquenil C1-C4)-S(O)p-R' , (alquilenoíl CrC4)-CO2-R', (alquilenoíl C1-C4)-(CO)N-R'R', fenil, feniltio, fenilsulfinilo, fenilsulfonilo, fenoxi, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo y heteroarilo o heteroariloxi de 5 o 6 miembros, donde el heteroarilo contiene de uno a tres heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre, donde el componente fenilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, haloalcoxi C1-C3, halo, ciano y nitro;

X = O o S;

n = 0 o 1 ;

m = 0 o 1 siempre que si m = 1 entonces n = 0 y si n=1 entonces m = 0;

p = 0, 1 o 2;

R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C6;

R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, (alquil C1-C6)carbonil-(alquilo C1-C3), (cicloalquil C3-C6)alquenoílo, por ejemplo, ciclohexilmetilenilo, (alquinil C3-C6)alquilenoílo, por ejemplo, propargilo, (alquenil C2-C6)alquilenilo, por ejemplo, alilo, (alcoxi CrC6)-(alquilo C1-C6), ciano-(alquilo C1-C6), arilcarbonil-(alquilo C1-C3) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3), aril-(alquilo C1-C6) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi C1-C6)-(alquilo C1-C6) y un (heteroaril de 5 o 6 miembros)-(alquilo C1-C3) o heterociclil-(alquilo C1-C3), donde el heteroarilo o heterociclilo contiene de uno a tres heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre, donde el componente heterociclilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado el grupo que consiste en halo, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3 y alcoxi C1-C3;

Q se selecciona del grupo que consiste en:

donde

A1 se selecciona del grupo que consiste en O, C(O), S, SO, SO2 y (CReRf)q;

q = 0, 1 o 2 ;

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4 que puede estar mono, di o trisustituido con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)-carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo, fenilo y heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterocíclico no son halógeno; o

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo, fenilo o heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterocíclico no son halógeno; o

Ra y Rb juntos forman un anillo carbocíclico de 3 a 5 miembros que puede estar sustituido con alquilo C1-C4 y puede estar interrumpido por oxígeno, azufre, S(O), SO2, OC(O), NRg o por C(O); o

Ra y Rc juntos forman una cadena de alquileno C1-C3 que puede estar interrumpida por oxígeno, azufre, SO, SO2, OC(O), NRh o por C(O); siendo posible a su vez que la cadena de alquileno C1-C3 esté sustituida con alquilo C1-C4; Rg y Rh son cada uno, independientemente el uno del otro, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo o (alcoxi C1-C4)carbonilo;

Ri es alquilo C1-C4;

R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, sustituido opcionalmente con halógeno y/o alcoxi C1-C3; y cicloalquilo C3-C6 sustituido opcionalmente con halógeno y/o alcoxi C1-C3;

R9 se selecciona del grupo que consiste en ciclopropilo, CF3 e i.-Pr;

R10 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, I, Br, SR11, S(O)R11, S(O)2R11 y CO2R11; y

R11 es alquilo C1-4;

h) un compuesto de fórmula (Ij), (Ik) o (Im)

o una sal agronómicamente aceptable de dicho compuesto, donde:

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, (alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3), (alcoxi C1-C3)-(alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3), (alcoxi C1-C3)-(haloalquilo C1-C3), (alcoxi C rC 3)-(alcoxi C1-C3)-(haloalquilo C1-C3), (cicloalcoxi oxasustituido C4-C6)-(alquilo C1-C3), (cicloalquil oxasustituido C4-C6)-(alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3), (cicloalcoxi oxasustituido C4-C6)-(haloalquilo C1-C3), (cicloalquilo oxasustituido C4-C6)-(alcoxi C1-C3)-(haloalquilo C1-C3), [(alcanosulfonil C1-C3)-(alquilamino C1-C3)]-(alquilo C1-C3), [(alcanosulfonilo C1-C3)-(cicloalquilamino C3-C4)]-(alquilo C1-C3), (alquil C1-C6)carbonil-(alquilo C1-C3), (cicloalquil C3-C6)-(alquenoílo C2-C6), alquinilo C3-C6, alquenilo C2-C6, ciano-(alquilo C1-C6), arilcarbonil-(alquilo C1-C3) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, aril-(alquilo C1-C6) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, arilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, (heteroarilo de 5 o 6 miembros)-(alquilo C1-C3) y heterociclilo-(alquilo C1-C3), donde el heteroarilo o heterociclilo contiene de uno a tres heteroátomos cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre y donde el componente arilo, heterociclilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, haloalcoxi C1-C3, (alquilo C1-C6)-S(O)p-, (haloalquilo CrC6)-S(O)p-, ciano y nitro; R5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, cloro, fluoro y metilo;

R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, flúor, cloro, hidoxilo y metilo;

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, ciano, nitro, halógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C6, haloalquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6, aril-(alquenilo C2-C6), (alquinilo C3-C6), alcoxi Ci-C6, cicloalcoxi C4-C7, haloalcoxi C1-C6, (alquil Ci-C6)-S(O)p, (cicloalquil C3-C6)-S(O)p, (haloalquil C1-C6)-S(O)p, (halocicloalquil C3-C6)-S(O)p, (alquil C1-C6)carbonilamino, [(alquil C1-C6)carbonil](alquilamino C1-C3), [(cicloalquil C3-C6)carbonil]amino, [(cicloalquil C3-C6)carbonil](alquilamino C1-C3), arilcarbonilamino, (arilcarbonil)-(alquilamino C1-3), (heteroarilcarbonil)amino, (heteroarilcarbonil)(alquilamino C1-C3), amino, alquilamino C1-C6, dialquilamino C2-C6, alquenilamino C2-C6, (alcoxi CrC6)-(alquilamino C2-C6), [(alcoxi C1 -C6)-(alquil C2-C4)]-(alquilamino C1-C6), cicloalquilamino C3-C6, ciclohaloalquilamino C3-C6, (alcoxi C1-C3)-(cicloalquilamino C3-C6), alquinilamino C3-C6, dialquilamino en el cual los sustituyentes se unen para formar un anillo de 4-6 miembros (por ejemplo, pirrolidinilo, piperidinilo) que contiene opcionalmente oxígeno (por ejemplo, morfolinilo) y/o sustituido opcionalmente con alcoxi C1-C3 y/o halógeno (especialmente flúor), dialquilaminosulfonilo C2-C6, alquilaminosulfonilo C1-C6, (alcoxi C1-C6)-(alquilo C1-C6), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi C2-C6), (alcoxi CrC6)-(alcoxi C2-C6)-(alquilo C1-C6), (alquenilo C3-C6)-(alcoxi C2-C6), (alquinilo C3-C6)-(alcoxi C1-C6), (alcoxi C1-C6)carbonilo, (alquil C1-C6)carbonilo, (alquilenil C rC 4)-S(O)p-R', (alquilenil C1-C4)-CO2-R', (alquilenil C1-C4)-(CO)N-R'R', arilo (por ejemplo, fenilo), aril-(alquilo C1-C3), aril-S(O)p, heteroaril-S(O)p, ariloxi (por ejemplo, fenoxi), un heteroarilo de 5 o 6 miembros, heteroaril-(alquilo C1-C3) y heteroariloxi, donde el heteroarilo contiene de uno a tres heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre, donde el componente arilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, haloalcoxi C1-C3, halo, ciano y nitro;

X1 = N-(O)n o C-R8;

X2 = O o S;

n = 0 o 1 ;

p = 0, 1 o 2 ;

R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, (alquil C1-C6)carbonilo-(alquilo C1-C3), (cicloalquilo C3-C6)-(alquenilo C2-C6), por ejemplo, ciclohexilmetilenilo, alquinilo C3-C6 (por ejemplo, propargilo), alquenilo C2-C6 (por ejemplo, alilo), (alcoxi C1 -C6)-(alquilo C1-C6), ciano-(alquil C1-C6), arilcarbonil-(alquilo C1-C3) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3), aril-(alquilo C1-C6) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi CrC6)-(alquilo C1-C6), arilo, un heteroarilo de 5 o 6 miembros, (un heteroarilo de 5 o 6 miembros)-(alquilo C1-C3) y heterociclil-(alquilo C1-C3), donde el heteroarilo o heterociclilo contiene de uno a tres heteroátomos cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre y donde el componente arilo, heterociclilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3 y alcoxi C1-C3, ciano y nitro;

Q se selecciona del grupo que consiste en:

donde

A1 se selecciona el grupo que consiste en O, C(O), S, SO, SO2 y (CReRf)q;

q = 0, 1 o 2 ;

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4 que puede estar mono, di o trisustituido con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C rC4)carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo, fenilo y heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C rC4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterociclilo no son halógeno; o

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C rC 4)carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil CrC4)carbonilo, fenilo o heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C rC 4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterocíclico no son halógeno; o

Ra y Rc juntos forman una cadena de alquileno C1-C3 que puede estar interrumpida por oxígeno, azufre, SO, SO2, OC(O), NRh o por C(O); siendo posible a su vez que la cadena de alquileno C1-C3 esté sustituida con alquilo C1-C4; Rg y Rh son cada uno independientemente el uno del otro alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo o (alcoxi C rC 4)carbonilo;

Ri es alquilo C1-C4;

Rj se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C4 y cicloalquilo C3-C6;

R3 se selecciona el grupo que consiste en alquilo C1-C6, sustituido opcionalmente con halógeno y/o alcoxi C1-C3, y cicloalquilo C3-C6 sustituido opcionalmente con halógeno y/o alcoxi C1-C3;

R9 se selecciona del grupo que consiste en ciclopropilo, CF3 e i.-Pr;

R10 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, I, Br, SR11, S(O)R11, S(O)2R11 y CO2R11; y R11 es alquilo C1-4.

Con relación a las estructuras (Ia)-(Im) descritas aquí:

Halógeno engloba flúor, cloro, bromo o yodo. En consecuencia lo mismo es aplicable a halógeno en el contexto de otras definiciones tales como haloalquilo o halofenilo.

Los grupos haloalquilo que tienen una longitud de cadena de 1 a 6 átomos de carbono son, por ejemplo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 2-fluoroetilo, 2-cloroetilo, pentafluoroetilo, 1,1 -difluoro-2,2,2-tricloroetilo, 2,2,3,3-tetrafluoroetilo y 2,2,2-tricloroetilo, heptafluoro-npropilo y perfluoro-n-hexilo.

Los radicales alquilenilo adecuados incluyen, por ejemplo, CH2, CHCH3, C(CH3)2, CH2CHCH3, CH2CH(C2H5).

Los radicales haloalquenilo adecuados incluyen grupos alquenilo sustituidos una o más veces con halógeno, donde el halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo y, especialmente, fluoro o cloro, por ejemplo, 2,2-difluoro-1 -metilvinilo, 3-fluoropropenilo, 3-cloropropenilo, 3-bromopropenilo, 2,3,3-trifluoropropenilo, 2,3,3-tricloropropenilo y 4,4,4-trifluorobut-2-en-1-ilo. Los radicales alquenilo C2-C6 preferidos sustituidos una, dos o tres veces con halógeno son aquellos que tienen una longitud de cadena de 2 a 5 átomos de carbono. Los radicales haloalquilalquinilo adecuados incluyen, por ejemplo, grupos alquilalquinilo sustituidos una o más veces con halógeno, donde el halógeno es bromo o yodo y, especialmente, fluoro o cloro, por ejemplo, 3-fluoropropinilo, 5-cloropent-2-in-1-ilo, 5-bromopent-2-in-1-ilo, 3,3,3-trifluoropropinilo y 4,4,4-trifluoro-but-2-in-1-ilo. Los grupos alquilalquinilo preferidos sustituidos una o más veces con halógeno son aquellos que tienen una longitud de cadena de 3 a 5 átomos de carbono.

Los grupos alcoxi tienen preferiblemente una longitud de cadena de 1 a 6 átomos de carbono. Un alcoxi es, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi o ferf-butoxi o un isómero de pentiloxi o hexiloxi, preferiblemente metoxi y etoxi. Un alquilcarbonilo es preferiblemente acetilo o propionilo. Un alcoxicarbonilo es, por ejemplo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, n-butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, sec-butoxicarbonilo o ferf-butoxicarbonilo, preferiblemente metoxicarbonilo, etoxicarbonilo o tert-butoxicarbonilo.

Un haloalcoxi es, por ejemplo, fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, 2,2,2-trifluoroetoxi, 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi, 2-fluoroetoxi, 2-cloroetoxi, 2,2-difluoroetoxi o 2,2,2-tricloroetoxi, preferiblemente difluorometoxi, 2-cloroetoxi or trifluorometoxi.

Los grupos alquiltio tienen preferiblemente una longitud de cadena de 1 a 6 átomos de carbono. Un alquiltio es, por ejemplo, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, n-butiltio, isobutiltio, sec-butiltio o ferf-butiltio, preferiblemente metiltio o etiltio. Un alquilsulfinilo es, por ejemplo, metilsulfinilo, etilsulfinilo, propilsulfinilo, isopropilsulfinilo, n-butilsulfinilo, isobutilsulfinilo, sec-butilsulfinilo o fert-butilsulfinilo, preferiblemente metilsulfinilo o etilsulfinilo.

Un alquilsulfonilo es, por ejemplo, metilsulfonilo, etilsulfonilo, propilsulfonilo, isopropilsulfonilo, n-butilsulfonilo, isobutilsulfonilo, sec-butilsulfonilo o ferf-butilsulfonilo, preferiblemente metilsulfonilo o etilsulfonilo.

Un alquilamino es, por ejemplo, metilamino, etilamino, n-propilamino, isopropilamino o un isómero de butilamino. Dialquilamino es, por ejemplo, dimetilamino, metiletilamino, dietilamino, n-propilmetilamino, dibutilamino o diisopropilamino. Se da preferencia a los grupos alquilamino que tienen una longitud de cadena de 1 a 4 átomos de carbono.

Un cicloalquilamino o dicicloalquilamino es, por ejemplo, ciclohexilamino o diciclopropilamino.

Los grupos alcoxialquilo tienen preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono. Un alcoxialquilo es, por ejemplo, metoximetilo, metoxietilo, etoximetilo, etoxietilo, n-propoximetilo, n-propoxietilo, isopropoximetilo o isopropoxietilo. Los grupos alquiltioalquilo tienen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono. Un alquiltioalquilo es, por ejemplo, metiltiometilo, metiltioetilo, etiltiometilo, etiltioetilo, n-propiltiometilo, n-propiltioetilo, isopropiltiometilo, isopropiltioetilo, butiltiometilo, butiltioetilo o butiltiobutilo.

Los grupos cicloalquilo tienen preferentemente de 3 a 6 átomos de carbono anulares y pueden estar sustituidos con uno o más grupos metilo; preferiblemente no están sustituidos, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.

El fenilo, incluido el fenilo como parte de un sustituyente tal como fenoxi, bencilo, benciloxi, benzoílo, feniltio, fenilalquilo, fenoxialquilo o tosilo, puede estar en una forma mono o polisustituida, en cuyo caso los sustituyentes podrán estar, según se desee, en la posición o posiciones orfo, mefa y/o para.

El heterociclilo incluye, por ejemplo, morfolinilo y tetrahidrofurilo.

El heteroarilo, incluido el heteroarilo como parte de un sustituyente tal como heteroariloxi, se refiere a un heteroarilo de cinco o seis miembros que contiene de uno a tres heteroátomos, donde cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre. Se debe sobreentender que el componente heteroarilo puede estar opcionalmente mono o polisustituido. Por lo tanto, el término heteroarilo incluye, por ejemplo, furanilo, tiofenilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, pirazolilo, isotiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirazinilo, pirimidinilo y triazolilo.

Los compuestos de fórmula Ij pueden contener centros asimétricos y pueden estar presentes como un único enantiómero, parejas de enantiómeros en cualquier proporción o, cuando esté presente más de un centro asimétrico, contener diastereoisómeros en todas las proporciones posibles. Normalmente, uno de los enantiómeros tiene una mayor actividad biológica en comparación con las otras posibilidades.

De manera similar, cuando haya alquenos disustituidos, estos podrán estar presentes en la forma E o Z o como mezclas de ambos en cualquier proporción.

Además, los compuestos de fórmula Ij que comprenden Q1, Q5, Q6 o Q7 o cuando R1 es hidrógeno pueden estar en equilibrio con formas tautoméricas alternativas con hidroxilo. Se debe sobreentender que todas las formas tautoméricas (único tautómero o mezclas de los mismos), mezclas racémicas e isómeros únicos están incluidos en el alcance de la presente invención.

El experto también comprenderá que si n es 1 en relación con la fórmula Ij para formar el W-óxido, entonces el nitrógeno y el oxígeno estarán cargados como corresponde (N+ O-).

En un aspecto preferido de la presente divulgación, X2 es oxígeno.

En otro aspecto preferido, R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, (alcoxi C1-C3)-(alquilo C1-C3), (alcoxi C1-C3)-(alcoxi C2-C3)-(alquilo C1-C3), haloalquilo C1-C6, (alcoxi C1-C3)-(haloalquilo C1-C3) y fenilo.

En otro aspecto preferido, R1 es arilo, preferentemente fenilo, o un heteroarilo de 5 o 6 miembros que contiene de uno a tres heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre y donde el arilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, alcoxi C1-C3, haloalcoxi C1-C3, (alquil C1-C6)-S(O)p-, (haloalquil CrC6)-S(O)p-, ciano y nitro.

En otro aspecto preferido, R5 es hidrógeno.

En otro aspecto preferido, R6 es hidrógeno o fluoro.

En otro aspecto preferido Rj se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, metilo y ciclopropilo.

En otro aspecto preferido, el compuesto herbicida es de fórmula (Ik):

En un aspecto más preferido de la presente divulgación, el compuesto herbicida es de fórmula (Ik) donde Q es Q1, en particular donde A1 es CReRf y donde Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf son hidrógeno y donde q = 1. En otro aspecto preferido de la presente invención, Q es Q1, donde A1 es CReRf y donde, R1, Rd, Re y Rf son hidrógeno, Ra y Rc forman juntos una cadena de etileno y donde q = 1.

En otro aspecto preferido, cuando el compuesto herbicida es de fórmula (Ik) y donde R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, (alcoxi C1-C6)-(alcoxi C2-C6), (alcoxi C1-C6)-(alquilo C1-C6), (alcoxi C rC 6)-(alcoxi C2-C6)-(alquilo C1-C6), alquilamino C1-C6, dialquilamino C1-C6, alquenilamino C2-C6, (alcoxi CrC6)-(alquilamino C2-C3), [(alcoxi CrC6)-(alquil C2-C4)]-(alquilamino C1-C6), cicloalquilamino C3-C6, cicloalquilamino C3-C6, (alcoxi C rC 3)-(cicloalquilamino C3-C6), alquinilamino C3-C6 y grupo dialquilamino en el cual los sustituyentes se unen para formar un anillo de 4-6 miembros, que contiene opcionalmente oxígeno y/o está sustituido opcionalmente con alcoxi C1-C3 y/o halógeno, especialmente flúor. En un aspecto aún más preferido, R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, cloro, metilo, etilo, 1-metiletilo, ciclopropilo, fluorometilo, 1 -fluoroetilo, 1,1 -difluoroetilo, 2,2-difluoroetilo, 1 -fluoro-1 -metiletilo, 2,2,2-trifluoroetilo, difluoroclorometilo, metoxi, etoxi, metoximetilo, 1-metoxietilo, 2-metoxietoxi, 2-metoxietoximetilo, (2-metoxietil)amino y (2-metoxietil)metilamino.

En otro aspecto preferido, el compuesto herbicida es de fórmula (Im):

En otro aspecto preferido de la presente divulgación, el compuesto herbicida es de fórmula (Im), donde Q es Q1, en particular donde A1 es CReRf y donde Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf son hidrógeno, y donde q = 1. En otro aspecto preferido de la presente divulgación, Q es Q1, donde A1 es CReRf y donde R^ , Rd, Re y Rf son hidrógen forman una cadena de etileno y donde q = 1.

En otro aspecto preferido donde el compuesto herbicida es de fórmula (Im) y donde R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, ciano, halógeno, nitro, haloalquilo C1-C6, (alcoxi C rC 3)-(haloalquilo C1-C3), (alcoxi C1-C3)-(alcoxi C2-C6)-(haloalquilo C1-C3), haloalcoxi C1-C6, (alquil CrC6)-S(O)p, (cicloalquil C3-6)-S(O)p, (haloalquil C1-C6)-S(O)p, (halocicloalquil C3-C6)-S(O)p, aril-S(O)p y heteroaril-S(O)p. En un aspecto aún más preferido, R7 se selecciona del grupo que consiste en cloro, fluoro, ciano, nitro, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, 1-fluoroetilo, 1,1 -difluoroetilo, 1 -fluoro-1 -metiletilo, difluoroclorometilo, difluorometoxi, trifluorometoxi, 1 , 1 -difluoroetoxi, metilsulfinilo, metilsulfonilo, etilsulfinilo, etilsulfonilo, fenilsulfinilo y fenilsulfonilo.

En aspectos preferidos adicionales, los compuestos herbicidas de HPPD son compuestos bicíclicos tal como se describe en WO2009/016841.

En un aspecto particular, el inhibidor de HPPD se selecciona del grupo que consiste en benzobiciclón, mesotriona, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, 4-hidroxi-3-[[2-(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona, cetospiradox o el ácido libre del mismo, benzofenap, pirasulfotol, pirazolinato, pirazoxifeno, topramezona, [2-cloro-3-(2-metoxietoxi)-4-(metilsulfonil)fenil](1-etil-5-hidroxi-1 H-pirazol-4-il)metanona, (2,3-dihidro-3,3,4-trimetil-1,1-dioxidobenzo[£>]tien-5-il)(5-hidroxi-1 -metil-1 H-pirazol-4-il)metanona, isoxaclortol, isoxaflutol, a-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-p-oxo-4-cloro-bencenopropanonitrilo y a-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-p-oxo-4-(trifluorometil)bencenopropanonitrilo.

En la técnica existe sobrada constancia de otros inhibidores de HPPD y se pueden utilizar en los métodos de la presente divulgación, incluidos inhibidores de HPPD que tienen los siguientes números de registro de Chemical Abstracts: benzobiciclón (CAS RN 156963-66-5), mesotriona (CAS RN 104206-82-8), sulcotriona (CAS RN 99105

77-8), tefuriltriona (CAS Rn 473278-76-1), tembotriona (CAS Rn 335104-84-2), 4-hidroxi-3-[[2-(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona (CAS RN 352010-68-5), cetospiradox (CAS RN 192708-91-1) o su ácido libre (CAS RN 187270-87-7), benzofenap (CAS RN 82692-44-2), pirasulfotol (CAS RN 365400-11-9), pirazolinato (CAS RN 58011-68-0), pirazoxifeno (Cas RN 71561-11-0), topramezona (CAS RN 210631-68-8), [2-cloro-3-(2-metoxietoxi)-4-(metilsulfonil)fenil](1-etil-5-hidroxi-1 H-pirazol-4-il)metanona (Cas RN 128133-27-7), (2,3-dihidro-3,3,4-trimetil-1,1-dioxidobenzo[£>]tien-5-il)(5-hidroxi-1-metil-1 H-pirazol-4-il)metanona (CAS

RN 345363-97-5), isoxaclortol (CAS RN 141112-06-3), isoxaflutol (Cas RN 141112-29-0), a-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-p-oxo-4-clorobencenopropanonitrilo (CAS RN 143701-66-0) y a-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-poxo-4-(trifluorometil)bencenopropanonitrilo (CAS RN 143701-75-1).

El nivel de expresión de HPPD mutante debería ser suficiente para reducir sustancialmente (respecto a plantas tratadas de la misma manera pero que carecen transgenes de HPPD mutante) el nivel de residuo del herbicida original en todo el tejido de la planta. Obviamente, un experto en la técnica comprenderá que ciertas enzimas de HPPD mutantes pueden conferir resistencia a ciertos subgrupos de química de HPPD y una enzima puede que no proporcione resistencia a todas las HPPD.

Métodos de uso

La presente divulgación también proporciona un método para controlar selectivamente malas hierbas en un locus, que comprende plantas de cosechas y malas hierbas, en el que las plantas se obtienen por cualquiera de los métodos de la actual invención descritos anteriormente, en el que el método comprende la aplicación al locus de una cantidad controladora de malas hierbas de uno o más herbicidas. En estos métodos de invención se puede usar cualquiera de las plantas transgénicas descritas aquí. El término “locus” puede incluir suelo, semillas, y plántulas, así como una vegetación establecida. Los herbicidas se pueden aplicar adecuadamente preemergencia o posemergencia de la cosecha o malas hierbas.

La expresión “cantidad controladora de malas hierbas” quiere incluir funcionalmente una cantidad de herbicida que es capaz de afectar al crecimiento o desarrollo de una mala hierba. De este modo, la cantidad puede ser suficientemente pequeña para simplemente retrasar o suprimir el crecimiento o desarrollo de una mala hierba dada, o la cantidad puede ser suficientemente grande para destruir irreversiblemente una mala hierba dada.

De este modo, la presente divulgación proporciona un método para controlar malas hierbas en un locus, que comprende aplicar al locus una cantidad controladora de malas hierbas de uno o más herbicidas, en el que el locus comprende una planta transgénica que se ha transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas de HPPD, sola o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. En un aspecto, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a un herbicida, incluyendo, por ejemplo, herbicidas seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de HPPD, glifosato y glufosinato. En otro aspecto, el locus comprende una planta transgénica que se ha transformado con cualquier combinación de moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, incluyendo una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que confiere resistencia o tolerancia a un herbicida, en combinación con al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona plantas transgénicas y métodos útiles para el control de especies vegetales indeseadas en campos de cosechas, en los que las plantas de cosechas se hacen resistentes a la química de HPPD mediante transformación para expresar genes que codifican polipéptidos de HPPD mutantes, y en los que se aplica un herbicida de HPPD como una aplicación desde la parte superior en cantidades capaces de exterminar o alterar el crecimiento de especies vegetales indeseadas (especies de malas hierbas, o, por ejemplo, plantas de cosechas sobrantes o “maleza” o “espontánea” en un campo de plantas de cosecha deseables). La aplicación puede ser pre- o post-emergencia de las plantas de la cosecha o de la especie indeseada, y se puede combinar con la aplicación de otros herbicidas a los que la cosecha es tolerante de forma natural, o a los que es resistente vía la expresión de uno o más transgenes distintos de resistencia a herbicidas. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud U.S. n° 2004/0058427 y la Publicación de Solicitud PCT n° WO 98/20144.

En otro aspecto, la divulgación también se refiere a un método para proteger plantas de cosecha de la lesión herbicida. En el cultivo de plantas de cosecha, especialmente a escala comercial, la rotación correcta de la cosecha es crucialmente importante para la estabilidad del rendimiento (el logro de rendimientos elevados de buena calidad a lo largo de un período prolongado) y para el éxito económico de un negocio agronómico. Por ejemplo, a lo largo de grandes áreas de las principales regiones de los Estados Unidos donde se hace crecer el maíz (el “cinturón de maíz central”), se hace crecer soja como la cosecha subsiguiente al maíz, en alrededor de unl 75% de los casos. El control selectivo de las malas hierbas en cosechas de maíz está siendo llevado a cabo cada vez más usando herbicidas inhibidores de HPPD. Aunque esa clase de herbicidas tiene excelente idoneidad para ese fin, puede dar como resultado daño fitotóxico agronómicamente inaceptable a las plantas de la cosecha en las cosechas subsiguientes (daño “residual”). Por ejemplo, ciertas variedades de soja son sensibles a restos incluso muy pequeños de tales herbicidas inhibidores de HPPD. En consecuencia, las plantas resistentes o tolerantes a herbicidas de la invención también son útiles para plantarlas en un locus de cualquier remanente a corto plazo de herbicida procedente de una aplicación previa (por ejemplo, plantando una planta transgénica de la invención en el año siguiente a la aplicación de un herbicida, para reducir el riesgo de daño procedente de restos de suelo del herbicida).

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo ilustrativo y no a modo limitante.

Ejemplos

Ejemplo 1. Clonación, expresión y ensayo de SEC ID NO: 14 de HPPD derivada de Avena, y determinación de los valores de kcat, KmHPP y Ki (kon y koff) frente a diversos herbicidas de HPPD.

La secuencia de ADN (SEC ID NO: 1) sintetizada mediante GeneArt (Regensburg, Alemania) que codifica una HPPD derivada de Avena sativa (SEC ID NO: 14), se clonó en pET24a y se expresó en E. coli BL21(DE3) con selección de 50 mg/ml de canamicina como se describe en la Publicación de la Solicitud PCT n° WO 02/46387. Los cultivos nocturnos que se hicieron crecer a 30°C se usaron para inocular 3 x 1 litro de LB en matraces de agitación, a una relación 1:100. Los cultivos se hicieron crecer a 37°C, 220 rpm, hasta que se alcanzó una A1cm600nm de 0,6 0,8. La temperatura se redujo hasta 15°C, y se indujo con 0,1 mM de IPTG. Los cultivos se hicieron crecer toda la noche, y las células se cosecharon después de centrifugar durante 15 minutos a 10.000 g. Las células se almacenaron a -20°C hasta la extracción. Un pelete celular procedente de 3 litros de cultivo en matraz de agitación (~12 g) se descongeló en tampón de extracción (50 mM de Tris, 10 de mM ascorbato de sodio, 2 mM de DTT, 2 mM de AEBSF, 10 mM de inhibidor de tripsina, 1 mM de EDTA, pH 7,66) a una relación de 1 ml de tampón:1 g de pasta celular. El extracto se hizo pasar a través del destructor celular a 30.000 psi, y se centrifugó a 50.000 g durante 25 minutos a 4°C. Opcionalmente el extracto se intercambia de tampón en Sepadex G25. Los sobrenadantes se colocaron en perlas en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80°C. Los niveles de expresión de HPPD se estimaron mediante análisis de transferencia Western, usando como patrón Avena purificada (1-10 ng). Los extractos se diluyeron 1:6000, y se cargaron 1-10 ml sobre 12% de SDS PAGE. Además, la expresión se cuantificó comparando SDS PAGE inducido y no inducido con tinción de COOMASSIE® (Imperial Chemicals Industries, Ltd., Londres UK). Los geles se transfirieron sobre membranas de PVDF, y se llevaron a cabo transferencias Western usando suero anti-HPPD de trigo de conejo (1:6600) como anticuerpo primario, y anticuerpos enlazados a FITC anti-conejo de cabra (1:600) como secundario. La detección de las bandas se llevó a cabo haciendo un barrido en un Fluorimager™ 595 (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cuantificación de los picos se llevó a cabo usando ImageQuant™ (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK). El ADN plasmídico se volvió a aislar de todas las cepas transformadas, y se confirmó la secuencia de ADN a lo largo de la región codificante.

Por Western, se estimó que el nivel de expresión del polipéptido de SEC ID NO: 14 expresado en el extracto de E. coli era alrededor de un 10-14 mg/ml de una concentración total de proteína soluble de 33,5 mg/ml.

La concentración de HPPD activa en el extracto también se estimó de forma más exacta mediante titulación de sitios activos. Por ejemplo, se añadió un intervalo de volúmenes de extracto (típicamente 0-20 pl) a 50 mM de tampón de BisTrisPropano, a pH 7,0 y a 25°C, que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 pg/ml de catalasa bovina y 3 nmoles de compuesto de Estructura A marcado con 14C (1,81 GBq/mmol), en un volumen de ensayo final total de 425 pl.

Estructura A

La reacción de unión de proteína radiomarcada se extinguió después de 3 minutos mediante adición de 100 pl de 1 mM de Estructura A “fría”. La proteína se intercambió en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1M de KCl mediante cromatografía rápida en una columna NAP5 G25 Sephadex (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y 14C unido a las fracciones proteicas se midió en un líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). La concentración de sitio de unión de HPPD en el extracto se calculó a partir de la titulación como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente PCT n° WO 02/46387, y se estimó como 94,9, 78,3, y 82,3 (media 85,2) pM en un extracto, y 47,2 pM en otro ejemplo.

En un método alternativo, se calculó el título del sitio activo en función de un ensayo de titulación basado en la actividad que se llevó a cabo preincubando varias relaciones de extracto y soluciones de la estructura A con el fin de lograr una valoración exacta del sitio activo; después se diluyó rápidamente en la solución del ensayo que contenía pHPP 100-200 pM para su ensayo inmediato cuantificando por HPLC/UV la formación del homogentisato después de 30-40 s (es decir, un tiempo lo suficientemente corto para que no se produzca una asociación y disociación significativa del inhibidor en la escala temporal del ensayo) tal como se describe a continuación.

Los valores de KmHPP y kcat de la HPPD expresada se estimaron basándose en los ensayos llevados a cabo a 25°C en disolución de 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 pg/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO), y un intervalo de concentraciones (típicamente 0,5x-10x Km) de 4-hidroxifenilpiruvato. Típicamente, los ensayos en un volumen final de 110 pl se iniciaron con la adición de enzima, y se detuvieron de forma exacta después de 20, o preferiblemente 10 ó 15 segundos, con adición mezclada en remolinos de 20 pl de ácido perclórico al 25%. La disolución de ensayo se transfirió a viales de Chromacol 03-CVG HPLC, se cerraron herméticamente, y la cantidad de homogentisato formada en una alícuota de 40 pl se determinó mediante inyección en una columna de HPLC Aqua C185p 75 x 4,6 mm HPLC de fase inversa que corre con 5,5% de acetonitrilo 0,1% de TFA (Tampón A) a 1,5 ml/min. La columna se eluyó a 1,5 ml/minuto usando un lavado de 2 minutos en tampón A, seguido de un lavado de 2 minutos en una mezcla 30/70 de tampón A y 100% de acetonitrilo, y un lavado adicional de 3,5 minutos en tampón A. La elución de homogentisato se monitorizó mediante UV a 292 nm, y la cantidad formada en cada reacción se cuantificó comparando con una curva de calibración patrón.

Los valores de Km y Vmax se determinaron (por ejemplo Figura 1) usando un ajuste de mínimos cuadrados no lineal usando el software Grafit 4™ (Erithacus Software, Middlesex, UK). Los valores de Kcat se determinaron dividiendo la velocidad máxima, Vmax, expresada en nmoles/segundo, entre el número de nmoles de enzima HPPD (basado en la concentración determinada mediante titulación de sitios activos).

A partir de un conjunto de experimentos separados similares a aquellos que produjeron los datos mostrados en la Figura 1, en un extracto de SEC ID NO: 14 de HPPD se estimó el valor de Km como 6,17, 4,51, 6,09, 6,13, 4,37, 4,62, 5,41,5,13 y 6 pM (Km media = 5,38 pM). Los valores de kcat correspondientes fueron 4,92, 6,25, 7,08, 6,26, 5,5, 6,77, 6,89, 7,12 y 7,39 s-1 (kcat media = 6,46 s-1). Obsérvese que para este cálculo, y de forma estándar aquí, Mr se tomó como ~94 kD, y se supuso un sitio activo por dímero (es decir, la mitad de actividad de los sitios así como la unión del inhibidor; véanse Garcia et al. (2000) Biochemistry, 39:7501-7507; Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) - The Herbicide Target”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 211 -220). Si se hubiera aceptado la suposición alternativa de un sitio activo por monómero, entonces los valores calculados de kcat, en consecuencia, se habrían dividido a la mitad.

Las velocidades de asociación (gobernadas por una constante de velocidad de asociación, kon) para la formación de los complejos de enzima:inhibidor, EI y velocidades de disociación (gobernadas por una constante de velocidad de disociación, kott) se determinaron por métodos conocidos en la técnica y esencialmente como se describe en Hawkes et al. (2001) Proc. Bright. Crop. Prot. Conf. Weeds, 2:563-568 y en la Publicación de Solicitud de Patente PCT n° WO 02/46387).

Por ejemplo, las velocidades de asociación se midieron, a tiempo cero, añadiendo ~60 pmoles de HPPD a 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25°C que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 mg/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO) y un exceso (~300 pmoles) de 14C-inhibidor en un volumen de ensayo total de 425 ml, y, a diversos puntos de tiempo (0-180 s), extinguiendo la reacción de unión del radiomarcador mediante adición y mezclamiento rápido de 100 ml de estructura A “tría” 1 mM. Las muestras de proteína extinguidas a diferentes tiempos se intercambiaron entonces en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1 M de KCl mediante cromatografía rápida a través de una columna NAP5 G25 Sephadex (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cantidad de 14C unido a las tracciones proteicas se cuantiticó en un líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Los datos se ajustaron según el esquema más abajo, a tin de derivar el valor de la constante de velocidad aparente de segundo orden, k2, que gobierna la velocidad de asociación de la enzima y el inhibidor radiomarcado. Se usó un intervalo de concentraciones de enzima y de inhibidor. Opcionalmente, la constante de velocidad se puede obtener a partir de experimentos similares en los que la enzima (a ~0,05-0,2 mM de sitios de unión) y, en este caso, inhibidor sin marcar (a ~0,5 a 2 mM) se hacen reaccionar durante un intervalo de tiempos cortos (0-60 s) en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25°C que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 mg/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO), y entonces se extinguió mediante dilución rápida en disolución de ensayo que contiene 100-200 mM de HPP para el ensayo inmediato mediante cuantiticación por HPLC/UV de la tormación de homogentisato después de 30-40 s (es decir, un tiempo suticientemente corto de manera que la disociación y asociación del inhibidor no se produce signiticativamente en la escala de tiempo del ensayo) como se describe anteriormente. Otros métodos ejemplares se describen en la Publicación de Solicitud de Patente PCT n° WO 02/46387.

Las velocidades de disociación (k1 en el esquema más abajo) se obtuvieron a partir de estudios de velocidad de intercambio, en los que el inhibidor de ensayo, I, o su pareja de intercambio, J, se radiomarcaron, y los datos se ajustaron según el esquema más abajo. Como se señala en Hawkes et al. (2001) Proc. Bright. Crop. Prot. Conf. Weeds, 2:563-568, las preparaciones de HPPD parecen típicamente contener un 15-30% de una tracción que se intercambia más rápidamente (unión más débil) de sitios de unión al inhibidor. Esta puede ser una torma ligeramente dañada de la enzima (mantiene la actividad catalítica y puede que tenga una Km para el sustrato más elevada) y, excepto cuando las velocidades de disociación son tan elevadas que las tracciones que se intercambian de manera rápida y lenta son indistinguibles, las velocidades de disociación se retieren siempre al comportamiento de la tracción principal que se intercambia de manera más lenta, que representa el 70-85% de la masa de los sitios de unión al inhibidor de HPPD presentes en los extractos ensayados.

K 3

E J ~ K 4 ^ EJ

Las velocidades de disociación se determinaron preincubando, por ejemplo, ~200 pmoles de sitios de unión a HPPD (determinados como se describe anteriormente mediante titulación de los sitios activos en una reacción de 3 min. con la estructura A) en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25°C que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 mg/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO) que contiene ~1,0 nmoles de 14C inhibidor a 25°C en un volumen de ensayo total de 1,3 ml. Después de 30 minutos, se inició la reacción de intercambio con adición de 100 ml de 1 mM de estructura A “tría” con mezclamiento a conciencia, e, inmediatamente, se extrajeron 150 ml y se cargaron en una columna NAP5, la proteína se intercambió en 50 mM de tampón de 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1 M de KCl mediante cromatogratía rápida (< 2 min.) a través de una columna NAP5 G25 Sephadex (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cantidad de 14C unido a proteína se midió mediante líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Se retiraron alícuotas adicionales y se midieron de la misma manera a diversos tiempos durante minutos u horas según se requiere, a tin de determinar la cinética de intercambio.

En una variante del método útil para distinguir mejor entre velocidades de disociación que tueron relativamente rápidas (por ejemplo, en las que t / < 15 min. a 25°C), la temperatura del experimento se redujo desde 25°C hasta la temperatura del hielo. En este caso, las velocidades de disociación se determinaron preincubando ~200 pmoles de HPPD en tampón de reacción (50 mM de BTP pH 7, 25 mM de ascorbato de Na, 4 mg/ml de catalasa bovina, y 10% de glicerol) que contiene ~1,0 nmoles de 14C inhibidor a 25°C en un volumen de ensayo total de 1,3 ml. Después de 30 minutos, la vasija de reacción se transtirió a hielo. Después de otros 10 minutos a temperatura del hielo, se inició la reacción de intercambio mediante adición de 100 ml de 1 mM de Estructura A, con mezclamiento a conciencia, y se extrajeron 150 ml y se cargaron en una columna NAP5 en una habitación fría a ~5-82C, a fin de cuantificar la cantidad de radiomarcador que queda unido a la proteína a diversos tiempos desde el comienzo de intercambio a la temperatura del hielo.

Las velocidades de disociación (k1) de los inhibidores de HPPD que no se pueden radiomarcar o que presentan otros problemas de medición (por ejemplo niveles elevados de unión no específica a proteína de fondo, que se puede medir como unión del radiomarcador que persiste en presencia de concentraciones elevadas de inhibidor “frío”) se pueden medir indirectamente. En este caso, primero se forma el complejo enzimático (~0,1-0,2 mM) con el inhibidor sin marcar, y después se obtuvo la cinética de intercambio ahuyentándolo con una concentración elevada de estructura A marcada con 14C y monitorizando la velocidad a la cual el marcador se une a la proteína. La estructura A es un inhibidor particularmente potente con cinética conocida y en un exceso de 20 veces o más, ocupara, en el equilibrio, >95% de los sitios de unión en la competición de intercambio con los otros inhibidores ensayados aquí, y de hecho con la mayoría de los otros inhibidores (los expertos en la técnica diseñarán por supuesto las concentraciones del experimento/relativas y ajustarán los datos en consecuencia). Los métodos ejemplares también se describen en la Publicación de Solicitud de Patente PCT n° WO 02/46387.

Los datos de velocidades de asociación y de disociación ejemplares (y los valores de ki derivados) se obtuvieron para la SEC ID NO: 11 de HPPD derivada de Avena para los siguientes compuestos como se indica.

Estructura A (14C a 1,81 GBq/mmol)

Velocidad de disociación (k1 = 1,67 E - 05 s-1). 25°C, método radioquímico directo.

Velocidad de disociación (k2 = 8,50 E 04 M-1 s-1). 25°C, método radioquímico directo.

Kd = 1,96E-10 M.

Relación Kd/ Km = 0,000036

Estructura B (14C a 1,425GBq/mmol)

Velocidad de disociación k1 (media) = 8,1 E-04 s-1 a 25°C (los experimentos individuales produjeron k1 = 8,00 E - 04, 8,88 E - 04, 7,50 E - 04 y 8,00E -04, según se determina mediante el método radioquímico directo). Medida a temperatura de hielo k1 = 1,21 E- 05 s-1 (los experimentos individuales produjeron 1,16 E - 05 s-1, 1,0 E - 05 s-1, 1,2 E - 05 s-1, 1,5 E - 05 s-1 mediante el método radioquímico directo.

La velocidad de asociación k2 (media) 6,7 E 04 s-1 M-1 a 25°C (los experimentos individuales produjeron k2 = 6,35 E 04, 7,50 E 04, 6,2 E 04 según se determina mediante el método radioquímico directo). Para mesotriona, que tiene una velocidad de disociación relativamente rápida, los estimados para la velocidad de asociación basándose en el método a base de actividad fueron más variables, oscilando desde 4,2 E 04 s-1 M-1, 4,9 E 04 s-1 M-1 hasta 7,5 E 04 s-1 M-1 a 25°C.

Kd se estimó así a partir del dato radioquímico como 1,16 E -08 M, que corresponde a una relación Kd/ Km de 0,00217.

Estructura C (14C a 0,774 GBq/mmol)

Velocidad de disociación k1 (media) = 7,04 E - 05 s-1 a 25°C (Los experimentos individuales dieron k1 = 7,80 E - 05, 9,17 E - 05, 4,5 E - 05, 6 E - 05, 7 E - 05 y 7,80 E - 05 según se estimó mediante el método radioquímico indirecto. Velocidad de asociación k27,50 E 03 s-1 M-1 a 25°C según se estimó mediante el método radioquímico directo, está muy de acuerdo con los estimados a partir del método a base de actividad enzimática de 7,50 E 03 s-1 M-1, 7,80 E 03 s-1 M-1, 7,60 E 03 s-1 M-1, 7,20 E 03 s-1 M-1 y 1,0 E 04 s-1 M-1 a 25°C.

Basándose en el método radioquímico, el estimado de Kd = 9,4 E - 09 M.

Por lo tanto, el estimado de la relación Kd/ Km es entonces= 0,0017.

Estructura D (14C a 1,036GBq/mmol)

Velocidad de disociación k1 = 3,96 E -05 s-1 a 25°C según se determina usando el método radioquímico directo (mediciones individuales de 4,17 E - 05 s-1 y 3,75 E - 05 s-1).

Velocidad de asociación k2 = 3,20 E 04 M-1 s-1 a 25°C según se determina mediante el método radioquímico directo. Esto está bastante de acuerdo con los estimados procedentes del método a base de actividad para una velocidad de disociación de 3,20 E 04 M-1 s-1 y 5,7 E 04 M-1 s-1.

Basado en los métodos radioquímicos, el estimado de Kd = 1,23 E - 9 M.

El estimado de la relación Kd/Km = 0,00023.

Estructura E

Velocidad de disociación k1 = 4,17 E - 05 s-1 a 25°C según se determina mediante el método radioquímico indirecto (mediciones individuales de 5,50 E - 05 s-1 y 2,85 E - 05 s-1).

Velocidad de asociación k2 = 1,30 E 05 M-1 s-1 a 25°C según se determina mediante el método no radioquímico directo.

El estimado de Kd = 3,21 E - 10M

El estimado de la relación Kd/ Km = 0,000059.

Ejemplo 2. Clonación, expresión y ensayo de variantes adicionales de las SEC ID NOs: 12-20 de las HPPD derivadas de Avena y determinación de los valores de kcat, KmHPP y Ki (kon y koff) frente a diversos herbicidas de HPPD.

Secuencias de ADN, que corresponden a las SEC ID NOs: 2-14, que codifican polipéptidos de HPPD que corresponden a las SEC ID NOs: 15-26 derivadas de Avena sativa, se sintetizaron mediante GeneArt (Regensburg, Alemania), se clonaron en pET24a, y se expresaron en E. coli BL21(DE3) con selección con 50 mg/ml de canamicina como se describe en la Pub. Sol. PCT n° WO 02/46387. Las células se hicieron crecer, se prepararon extractos proteicos, y se llevaron a cabo medidas de los títulos de sitios activos de HPPD y cinéticas (de los valores de kcat, KmHPP, k1, k2 y Ki), como se describe en el Ejemplo 1.

En el presente ejemplo, se usaron las siguientes secuencias de HPPD:

La SEC ID NO: 15 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de A por Q en el motivo de secuencia GVQHIA (residuos 1-6 de SEC ID NO:55).

La SEC ID NO: 16 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de G por Q en el motivo de secuencia GVQHIA (residuos 1-6 de SEC ID NO:55).

La SEC ID NO: 17 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de S por Q en el motivo de secuencia GVQHIA (residuos 1-6 de SEC ID NO:55).

La SEC ID NO: 18 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de T por I en el motivo de secuencia SQIQTY (residuos 1-6 de SEC ID NO:53).

La SEC ID NO: 19 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de A por I en el motivo de secuencia SQIQTY (residuos 1-6 de SEC ID NO:53).

La SEC ID NO: 20 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de S por I en el motivo de secuencia SQIQTY (residuos 1-6 de SEC ID NO:53).

La SEC ID NO: 21 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de V por I en el motivo de secuencia SQIQTY (residuos 1-6 de SEC ID NO:53).

La SEC ID NO: 22 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de M por L en el motivo de secuencia SGLNS (residuos 5-9 de SEC ID NO:43).

La SEC ID NO: 23 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de W for A en el motivo de secuencia FAEFT (residuos 5-9 of SEC ID NO:42).

HPPD SEC ID NO: 24 se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de M por L en el motivo de secuencia G(I,V)LVDRD (SEC ID NO:30).

La SEC ID NO: 25 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de A por L en el motivo de secuencia G(I,V)LVDR (residuos 1-6 de SEC ID NO:30).

La SEC ID NO: 26 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 14 mediante la sustitución de M por L en el motivo de secuencia G(I,V)LVDR (residuos 1-6 de SEC ID NO:30) y mediante la sustitución de M por L en el motivo de secuencia SGLNS (residuos 5-9 de SEC ID NO:43).

Se obtuvieron los valores (generalmente determinados radioquímicamente) de kon (k2), koff (k1) y Ki (todos a 25 °C) para las HPPD del presente ejemplo frente a varias estructuras del inhibidor tal como se muestra en la Tabla 3. Los valores que se proporcionan para la referencia de SEC ID NO: 14 en la Tabla 3 son los valores promedio de varios experimentos como los descritos anteriormente. Todos los experimentos con las otras HPPD incluyeron medidas contiguas a SEC ID NO: 14 como control comparativo. En los experimentos, las relaciones entre las velocidades de asociación y disociación relativas a este control contiguo fueron reproducibles incluso cuando los valores absolutos variaron en un cierto grado. Por lo tanto, los valores que se proporcionan en la Tabla 3 para las SEC ID NOs: 15-26 de HPPD están normalizados frente a los valores de control promedio para la SEC ID NO: 14 de HPPD de acuerdo con estas relaciones observadas.

Tabla 3. Resumen de los valores de kon, koff y Kd para las variantes de HPPD

Estructura A Estructura B ko n(tó ) kott(k1) K d ktm (k2j k o i!(k íl Kd Variante de HPPD f * M /s nM f s M / $ nM S E C ID N O 14 86000 V V i- 05 0,20 67000 8 ,106 -04 11,6

S E C ID N O 15 350QQ 3,335 -OS 0,95 7COOO 8 ,00 £ -04 11,4

S E C ID N O 16 NO NO NO: 53000 2,CCE -03 37,7

S E C ID N O 17 NO NO ND 53G00 il i fU íu f iuP. . m ^{t i w}18,9 S E C ID N O 18 42000 1,675 -05 0 ,40 38000 6 ,OCc -04 17,1

S E C ID N O 19 ND NO ND 3SG0O ?,5G £ 04 19,7

S E C ID N O 20 NO ND ND 31500 9,G0E -04 28,6

S E C ID N O 21 88300 1,675 -05 0,20 70000 6 ,0DE -04 O O P C^l

S E C ID N O 22 $5000 1,086 -05 0 ,13 70000 1 ,206 - 03 17,1

S E C ID N O 23 85000 2 ,835 -05 0,33 7COCO 7,QC£ -04 10,0

S E C ID N O 24 85000 2 ,305 -05 0,27 70000 1 ,576 -03 22,4

S E C ID N O 25 NO ND ND 20000 8 ,QUE -04 40,0

S E C ID N O 26 NO NO ND 70000 3 ,006 -03 42,9

Estructura C Estructura D

koff(k1) ...I d .. ' Variante de HPPD ,'s M / s nM h /M / • nM S E C ID N O 14 7500 / / • I f •»'» v 32000 t‘5 1,2 S E C ID N O 15 7500 t,13E -04 . 17,/ ND 2,37£ -05 NO

S E C ID N O 16 4500 1,20E -04 26,7 ND ND NO

S E C ID N O 17 9400 $,$5E -05 7,1 ND NO NO

S E C ID N O 18 7500 9 ,_{m i ,} -05 11,9 NO 3,96£ -'05 NO

S E C ID N O 19 7500 0,605 -05 8,9 NO NO NO

S E C ID N O 20 10100 6,60f. *05 6,6 ND ?4D NO

S E C ID N O 21 7500 9,00E -05 11,9 ND 3,96E -05 ND

S E C ID N O 22 4400 Í , 001: -05 . 23,9 NO 2,37E -06 NO

S E C ID N O 23 7500 ND NO ND ¿ , m -06 NO S E C ID N O 24 4900 7,82E -05 16,0 32000 9 Ii8F -0 _{w W}6 2,9

S E C ID N O 25 4800 1,136 04 23,0 ND NO NO

S E C ID N O 26 ND 9,00E -05 ND NO ND ND

Por ejemplo, la velocidad de disociación de la mesotriona (estructura B) de SEC ID NO: 14 de HPPD fue claramente diferente de la de SEC ID NO: 24 (veánse las Figuras 4A-4C) siendo la bondad del ajuste sensible a cambios pequeños en koff. A partir de estos datos, se puede observar que la mesotriona se disoció alrededor de dos veces más rápido de SEC Id NO: 26 de HPPD que de SEC ID NO: 24 de HPPD, y de SEC ID NO: 24 de HPPD alrededor de dos veces más rápido que de SEC ID NO: 14 de HPPD. Por lo general, las estimaciones absolutas de koff obtenidas de los ajustes a los datos fueron reproducibles en un ±10% y normalmente mejores.

Cuando las velocidades de disociación se volvieron relativamente rápidas (t1/2 < 10 minutos) también fue útil realizar medidas comparativas a la temperatura del hielo con el fin de confirmar de manera más exacta la diferencia entre una HPPD y otra. Por lo tanto, por ejemplo, a temperaturas del hielo, la disociación de la mesotriona de SEC ID NO: 14 de HPPD estuvo gobernada por una constante de velocidad, koff, de 1,16 E-05 s-1 (mucho más lenta que el valor de 8,1 E-04 s-1 estimado a 25 °C) mientras que para SEC ID NOS: 22, 24 y 26, las velocidades de disociación correspondientes de la mesotriona a la temperatura del hielo fueron de 2,17 E-05 s-1, 2,25 E-05 s-1 y 4,17 E-05 s-1; estos valores presentan una coherencia proporcionada buena con los de 25 °C (véase la Tabla 3).

Se extrajeron varias conclusiones de los datos de la Tabla 3. Las propiedades de SEC ID NOs: 15-17 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a asparagina (Q) en la secuencia de aminoácidos GVQHI proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (valores más lentos de kon y/o valores más rápidos de koff) con relación a, por ejemplo, las Estructuras A, B y C.

Los datos de SEC ID NO: 18-21 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a isoleucina (I) en la secuencia de aminoácidos SQIQTY proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (principalmente mediante valores más lentos de kon) con relación a, por ejemplo, las Estructuras A y B.

Los datos de SEC ID NO: 22 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos ESGLN proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (principalmente mediante valores más rápidos de koff) con relación a, por ejemplo, las Estructuras B y C.

Los datos de SEC ID NO: 23 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a alanina (A) en la secuencia de aminoácidos EFAEF proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (principalmente mediante valores más rápidos de koff) con relación a, por ejemplo, la Estructura A.

Los datos de SEC ID NOs: 24 y 25 de HPPD indicaron que ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos G(I,V)LVDRD proporcionaron mejoras significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD en la tolerancia (mediante valores más rápidos de koff y/o valores más lentos de kon) con relación a, por ejemplo, la Estructura A, la Estructura B, la Estructura C y la Estructura D.

Los datos de SEC ID NO: 26 de HPPD indicaron que la combinación de ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos ESGLN con ciertas sustituciones a leucina (L) en la secuencia de aminoácidos G(I,V)LVDRD proporcionaron mejoras aún más significativas respecto a SEC ID NO: 14 de HPPD (y sobre y superiores al efecto de cualquiera de los cambios solos) en la tolerancia (principalmente mediante valores más rápidos de koff) con relación a, por ejemplo, la Estructura B.

Nuevamente, tal como se describió para el Ejemplo 1, se determinaron los valores de kcat y Km para varias HPPD de la invención expresadas en extractos y los valores se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Valores de Km y kcat de varias HPPD

Varias de las variantes de HPPD tuvieron valores de Km bajos similares a SEC ID NO: 14 de HPPD y valores superiores de Ki/Km con relación a los diversos herbicidas de HPPD y, por lo tanto, la sobreexpresión en plantas se espera que proporcione una mayor tolerancia a herbicidas respecto a estos herbicidas. Por ejemplo, SEC ID NO: 24 de HPPD fue dos veces más resistente a mesotriona que SEC ID NO: 14 de HPPD ya que mostró una relación de Ki/Km de 0,0047 en comparación con 0,0021.

Además, todas las secuencias anteriores, así como también las colecciones de variantes mutadas en las mismas posiciones de amino que mostraron niveles alterados y mejorados de tolerancia a herbicidas son útiles para ser incluidas en procesos de mutagénesis y barajado con el fin de generar aún más HPPD mutadas y barajadas útiles como transgenes para conferir tolerancia a herbicidas. Por ejemplo, los mutantes divulgados en la Tabla 5 son útiles para generar un polipéptido mutante de HPPD tolerante a herbicidas y para su inclusión en reacciones de recombinación para generar más HPPD.

Tabla 5. Ejemplos de mutaciones útiles en polipéptidos de HPPD tolerantes a herbicidas

Como otro ejemplo, los mutantes divulgados en la Tabla 6 también son útiles para generar un polipéptido mutante de HPPD tolerante a herbicidas y para su inclusión en reacciones de recombinación para generar más HPPD.

Tabla 6. Ejemplos de mutaciones útiles en polipéptidos de HPPD tolerantes a herbicidas

Mutación Región de aminoácidos de SEC ID NO:14

La Tabla 7 resume los datos de los estudios cinéticos de un grupo de mutantes de SEC ID NO: 14 de HPPD expresados respecto al control, “ninguna” significa SEC ID NO: 14 de HPPD no mutada. Los experimentos se llevaron a cabo tal como se ha descrito en la Tabla 4. “Sulc” se refiere a sulcotriona y “nd” significa “no determinado”. Para V217I, L2711, L271V, V258M y A326R, se estimaron los valores relativos de kcat a partir de comparaciones con las velocidades iniciales en extractos celulares de HPPD preparadas y expresadas de manera similar en ensayos de actividad enzimática convencionales a pH 7,0, 25 °C y con una concentración de sustrato de HPP 120 pM. Los mutantes V217I, V258M y A326R, M325^ly L358M de SEC ID NO: 14 son enzimas de HPPD activas que ofrecen algo de resistencia a sulcotriona y también pueden ofrecer resistencia a B. K411T ofrece una resistencia significativa a E y especialmente ya que el aumento superior a 5X en Kd respecto a este herbicida comprende principalmente una mejora en la velocidad de disociación (3,5X) más que en la velocidad de asociación. L358M, M325L y K411T ofrecen todos ellos mejoras respecto a D. Para la tolerancia a herbicidas L271I y L271V parece que ofrecen ventajas significativas en kcat respecto a la enzima no mutada.

Tabla 7. Valores cinéticos relativos de varios mutantes de SEC ID NO: 14

Se sobreentenderá que la mayoría de las sustituciones en aminoácidos dentro de la región del sitio activo de HPPD sumamente conservada y que se encuentren a 8 Á o menos de los átomos de la mesotriona unida (de acuerdo con la interpretación de los datos cristalográficos de rayos X publicados de HPPD de arabidopsis y de maíz y el modelo de homología construido con la HPPD de avena) dan como resultado enzimas desactivadas o funcionales solo en parte. A partir de los alineamientos de secuencias de HPPD (activas) de la base de datos, se seleccionaron alrededor de 60 mutantes sencillos o dobles de SEC ID NO: 14 como mutantes en los que se podían realizar cambios en algunos residuos sin pérdida de la actividad enzimática (suponiendo que fueran cambios que representaran parte de la extensión de la variación de secuencia que se observa entre las HPPD naturales en estas posiciones). Estos mutantes se generaron, se hicieron crecer, se expresaron las HPPD y los extractos se prepararon y estudiaron para determinar su actividad catalítica y resistencia a mesotriona (con relación al control, SEC ID NO: 14 no mutada). Incluso entre este conjunto privilegiado, la mayoría mostró una actividad catalítica significativamente alterada y/o fueron significativamente más sensibles a sulcotriona que el control. Y287F y I370V fueron mutaciones neutras con valores de kcat y resistencia a sulcotriona similares (dentro del 20%) a los de la enzima no mutada. Entre un conjunto adicional de aproximadamente 70 mutantes que engloban residuos que están hasta a 10 Á de los átomos de los inhibidores unidos, algunas mutaciones neutras más de este tipo (con relación a SEQ ID NO: 14) fueron G254S, G254A, E416Q, V258M, V258I, V258A, V258K, S415K, S415Q, I421L, A326S, L269M, L269F, S420A, T372S, Y172V e I299M. Estas mutaciones adicionales se pueden combinar todas ellas opcionalmente con mutaciones que confieren resistencia para producir variantes catalíticamente activas de enzimas resistentes a herbicidas de HPPD de la presente invención.

Un muíante adicional de SEC ID NO: 14 de HPPD, G408A, mostró unos valores cinéticos de inhibición respecto a B y C que muestran que este mutante fue relativamente resistente a la inhibición por estos compuestos. La evolución temporal de la inhibición no fue sencilla y no se pudo ajustar al modelo cinético descrito anteriormente. El método experimental utilizado fue similar al descrito anteriormente para medir las velocidades de unión al inhibidor monitorizando la actividad enzimática. La evolución temporal de la inhibición se muestra en las Figuras 10A-10D. Se incubó enzima a alrededor de 75 nM con inhibidor a 0,15 o 0,6 pM para diferentes tiempos de hasta 260 s y a continuación se ensayó inmediatamente durante un periodo de 150 s tras la adición de HPP 115 pM (y, por lo tanto, con [S] ~ 30 X Km también ralentizó drásticamente cualquier unión adicional al inhibidor). En el caso del mutante parece que hubo una fase rápida inicial de inhibición que después se ralentizó y dejó la enzima inhibida solo parcialmente. En el caso de la enzima de control, la inhibición continuó (o tendió) hasta una inhibición completa. Aunque tenga en cuenta que en el caso de la inhibición de la enzima de control por parte del compuesto B no se alcanzó completamente un 100%. El ~8% de actividad residual en este caso fue un artefacto del método debido a la velocidad de disociación relativamente rápida del compuesto B que permitió que se recuperara algo de actividad durante el ensayo de 150 s utilizado para monitorizar el progreso de la reacción entre la enzima y el inhibidor. Este artefacto es insignificante con inhibidores que se disocian más lentamente tales como C. Durante el tiempo del experimento y a 0,6 pM de B, la inhibición del mutante G408A parece que se equilibró hasta una actividad residual de aproximadamente el 35%. Parece que esto no fue debido a que B presentara una velocidad de disociación aún más rápida de G208A que de la enzima de control ya que, a la temperatura del hielo, la velocidad de disociación determinada radioquímicamente de B respecto a G408A pareció ser indistinguible de la velocidad observada con SEC ID NO: 14 de HPPD de control. El mutante G408 también mostró una kcat y kcat/Km similar a SEC ID NO: 14 de HPPD. Sea cual sea la explicación, tanto B como C parece que inhiben la HPPD mutante G408A en menor medida que la enzima de control. También cabe destacar que la actividad de G408A pareció ser inestable ya que la actividad de control en ausencia del inhibidor disminuyó a lo largo del transcurso del experimento. La adición de inhibidor pareció detener este descenso de la actividad y en experimentos adicionales se confirmó que la actividad del mutante G408A era inestable en ausencia de inhibidor o sustrato pero que el inhibidor la estabilizaba y parecía ser no menos estable que la enzima salvaje a lo largo de la evolución temporal del ensayo prolongado en presencia de sustrato o cuando estaba parcialmente inhibida por un herbicida de HPPD. Por lo tanto, a pesar de una cierta inestabilidad, el mutante G408A es útil solo o combinado con otras mutaciones para proporcionar tolerancia útil a herbicidas cuando hay herbicida presente en los tejidos vegetales en los que se expresa.

Aparte de los experimentos cinéticos enzimáticos, se demostró además una mejor resistencia a los herbicidas de HPPD cuando las HPPD de la presente invención se expresaron en E. coli y se evaluaron visualmente las resistencias a herbicidas comparativas de las diversas HPPD mediante la producción de piomelanina. Por ejemplo, se expresaron SEC ID NO: 14 de HPPD y SEC ID NO: 24 de HPPD a partir de un vector pET24 en células E. coli BL21. Hechas crecer sin adición de IPTG, hubo una expresión suficiente de HPPD para que los cultivos se volvieran marrones lentamente debido a la producción del pigmento piomelanina (que es el resultado de la autooxidación de homogentisato derivado de HPPD). Las células se hicieron crecer a partir de un inóculo de partida del 10% en 0,5 ml de caldo L que contenía 50 pg de canamicina ml-1 en placas de 45 pocillos durante 48-96 h a 15 °C. Normalmente, el color de la piomelanina en el medio se leyó (a 430 nm) después de ~72 h. Se notó que la adición de 12,5 ppm de mesotriona provocó, de manera significativa, proporcionalmente menos inhibición del desarrollo del color de piomelanina en las células que expresaban SEC ID NO: 24 de HPPD que en las que expresaban SEC ID NO: 14 de HPPD. La Figura 5 compara la absorbancia del medio obtenido después de 72 h en triplicados contiguos que se hicieron crecer de E. coli que expresa SEC ID NOs: 14, 18 y 24 de HPPD, hechos crecer todos en la misma placa.

Las células que expresan SEC ID NO: 24 de HPPD, que mostraron la relación más elevada de Ki/Km, mostraron uniformemente la menor diferencia de color entre las células que se hicieron crecer con y sin 12,5 ppm de mesotriona presente en el medio. Se observó lo mismo cuando la mesotriona se sustituyó por 20 ppm de sulcotriona (datos que no se muestran) lo que indica que SEC ID NO: 24 ofrece una mejor tolerancia a sulcotriona así como también a mesotriona. De manera similar, las células que expresaban el mutante G408A también mostraron una resistencia relativa a SEC ID NO: 14 de HPPD respecto a sulcotriona de acuerdo con el ensayo de piomelanina con 25 ppm de sulcotriona.

Ejemplo 3. Preparación y estudio de líneas vegetales transgénicas estables que expresan una enzima de HPPD heteróloga.

En el presente ejemplo, los genes de HPPD mutantes derivados de HPPD de Avena fueron las secuencias expuestas en SEC ID NOs: 1-13 (optimizadas para tabaco) u, opcionalmente, están optimizadas en codones según la cosecha diana (por ejemplo, haba de soja) y preparadas sintéticamente y obtenidas comercialmente a partir de GeneArt (Regensburg, Alemania). Cada secuencia se diseña para tener sitios 5’ Nde1 y 3’BamH1 para facilitar la clonación directa. Por ejemplo, las secuencias expuestas en SEC ID NOs: 11, 12 o 13 se clonan en un vector binario adecuado para la transformación vegetal a base de Agrobacterium.

En un ejemplo particular, los genes que codifican SEC ID NO: 14 de HPPD y SEC ID NO: 24 de HPPD se clonaron en constructos de expresión idénticos como se describe más adelante y se transformaron en tabaco.

Tal como se describe en la Pub. Sol. de patente PCT n° WO 02/46387, la secuencia nucleotídica codificante de HPPD se edita mediante PCR (o se sintetiza inicialmente) para incluir sitios 5’ Nco1 y 3’ Kpn1 (y para eliminar cualquiera de tales sitios internos). A continuación, este producto se liga en pMJBI. pMJBI fue un plásmido derivado de pUC19 que contiene el promotor CaMV35S mejorado doble operable en plantas, un potenciador TMV omega y el terminador de la transcripción NOS. En la Figura 2 de la Pub. Sol. de patente PCT n° WO 98/20144, se muestra una representación esquemática del plásmido resultante. El casete de expresión, que comprende el promotor 35S mejorado doble, el líder TMV omega, el gen de 4-HPPD y el terminador nos se corta usando Hind III/Eco R1 (digerido de Eco R1 parcial) y se clona en pBIN 19 digerido de forma similar y se transforma en células competentes de E. coli TOP 10. El ADN recuperado de la E. coli se usa para transformar Agrobacterium tumefaciens LBA4404, y las bacterias transformadas se seleccionan en medio que contiene rifampicina y canamicina. El tejido de tabaco se somete a transformación mediada por Agrobacterium, usando métodos bien descritos en la técnica o como se describe aquí. Por ejemplo, una placa maestra de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector binario que expresa HPPD se usa para inocular 10 ml de LB (caldo L) que contiene 100 mg/l de rifampicina más 50 mg/l de canamicina, usando una única colonia bacteriana. Esto se incuba toda la noche a 28°C, agitando a 200 rpm. Este cultivo nocturno completo se usa para inocular un volumen de 50 ml de LB que contiene el mismo antibiótico. Nuevamente, esto se cultiva toda la noche a 28°C, agitando a 200 rpm. Las células de Agrobacterium se peletizan centrifugando a 3000 rpm durante 15 minutos, y después se resuspenden en medio MS (Murashige y Skoog) que contiene 30 g/l de sacarosa, pH 5,9 hasta una Od (600 nM) = 0,6. Esta suspensión se dispensa en alícuotas de 25 ml en cápsulas de Petri.

Cultivos de brotes de tabaco micropropagados de forma clonal se usaron para escindir hojas jóvenes (todavía no expandidas completamente). La nervadura central y los márgenes externos de las hojas se eliminan y se desechan, y la lámina que queda se corta en cuadrados de 1 cm. Estos se transfieren a la suspensión de Agrobacterium durante 20 minutos. Los explantes se retiran entonces, se embadurnan en papel de filtro estéril para eliminar la suspensión en exceso, después se transfieren a medio NBM sólido (medio MS que contiene 30 g/l de sacarosa, 1 mg/l de BAP (bencilaminopurina) y 0,1 mg/l de NAA (ácido naftalenoacético) a pH 5,9, y solidificado con 8 g/l de plantagar), con la superficie abaxial de cada explante en contacto con el medio. Se transfirieron aproximadamente 7 explantes por placa, que entonces se cierran herméticamente y se mantienen en una incubadora alumbrada a 25°C durante un fotoperíodo de 16 horas durante 3 días.

Los explantes se transfieren entonces sobre medio NMB que contiene 100 mg/l de canamicina más antibiótico, para evitar el crecimiento adicional de Agrobacterium (200 mg/l de timentina con 250 mg/l de carbenicilina). Entonces se llevó a cabo el subcultivo adicional sobre este mismo medio cada 2 semanas.

A medida que los brotes comienzan a regenerarse a partir de las explantas de hojas que forman callos, se retiran a medio de alargamiento de brotes (medio MS, 30 g/l de sacarosa, 8 g/l de plantagar, 100 mg/l de canamicina, 200 mg/l de timentina, 250 mg/l de carbenicilina, pH 5,9). Las plantas transgénicas estables enraízan fácilmente en 2 semanas. Para proporcionar múltiples plantas por suceso para permitir finalmente ensayar más de un herbicida por planta transgénica, todos los brotes que enraízan se micropropagan para generar 3 o más clones enraizados.

Las plantas transgénicas putativas que están enraizando y que muestran un crecimiento vigoroso del brote en el medio que incorpora canamicina se analizan mediante PCR usando cebadores que amplificaron un fragmento de 500 pb en el transgén de HPPD. La evaluación de este mismo cebador montado en tabaco sin transformar mostró de forma concluyente que estos cebadores no amplificarían secuencias del gen de HPPD de tabaco nativo.

Los brotes transformados se dividen en 2 ó 3 clones y se regeneran a partir de callo resistente a canamicina. Los brotes se enraízan en agar MS que contiene canamicina. Las explantas enraizadas que sobreviven se vuelven a enraizar para proporcionar aproximadamente 70-80 eventos resistentes a canamicina y positivos a PCR a partir de cada evento.

Una vez enraizadas, las plántulas se transfieren desde agar y se ponen en macetas en 50% de turba, 50% de John Innes Soil n° 3 con un fertilizante de liberación lenta en macetas redondas de 3 pulgadas, y se dejan regadas regularmente para establecerse durante 8-12 días en el invernadero. Las condiciones del invernadero son de alrededor de un 24-27°C día, 18-21°C noche, y aproximadamente un fotoperíodo de 14 horas. La humedad se ajusta a ~65%, y los niveles de luz usados son de hasta 2000 pmoles/m2 al nivel del banco.

De este modo se produjeron dos poblaciones transgénicas, cada una de alrededor de 80 plantas de tabaco y que comprenden, como alternativa, un gen de HPPD que codifica SEC ID NO: 14 de HPPD o SEC ID NO: 24 de HPPD dentro de casetes de expresión que, de otro modo, son idénticos. Se hicieron crecer estas dos poblaciones hasta alrededor de la etapa foliar 2-4 y a continuación cada una se dividió en dos subpoblaciones, una que comprendía aquellas plántulas que después de surgir del cultivo tisular eran bastante más grandes y más avanzadas y la otra población que comprendía las plantas más pequeñas. Por lo tanto, las poblaciones con tamaños pequeños de SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 24 parecieron ser visualmente similares y comparables unas a otras, al igual que lo hicieron las dos poblaciones de plantas más grandes.

Cada una de las dos poblaciones más pequeñas se pulverizaron con 300 g/ha de mesotriona y las dos poblaciones más grandes con 500 g/ha. Se mezcló Callisto® en agua con 0,2-0,25% de tensioactivo X-77 y se pulverizó desde un brazo de grúa en un pulverizador de carril adecuado que se mueve a 2 mph, con una boquilla a alrededor de 2 pulgadas desde las partes superiores de la planta. El volumen de pulverización fue de 200 l/ha.

Se evaluaron las plantas para determinar el daño y se les asignó una calificación 13 días después del tratamiento (DAT). La totalidad de las cuatro poblaciones parecieron ser sumamente resistentes a los tratamientos con herbicida pero las poblaciones que expresaban SEC ID NO: 24 de HPPD más que las poblaciones control con SEC ID NO: 14. De las dos poblaciones con tamaños más grandes pulverizadas con 500 g/ha únicamente 4 de 38 (10%) de plantas positivas por PCR morfológicamente normales (surgió una que era quimérica) que expresaban SEC ID NO: 24 mostraron síntomas de daños por el herbicida mientras que 9 de un total de 33 (27%) de las plantas que expresaban SEC ID NO: 14 mostraron daño. Se apreció poco daño en las dos poblaciones con tamaños más pequeños pulverizadas con 300 g/ha de mesotriona; aquí 2 de 28 plantas que expresaban SEC ID NO: 24 mostraron un daño visible debido al herbicida en comparación con 4 de 26 plantas que expresaban SEC ID NO: 14.

Las plantas de los eventos que mostraron el daño menor se hacen crecer hasta la floración, a continuación se introducen en bolsas y se permite que se autofertilicen. Las semillas de los eventos seleccionados se recogen y se plantan de nuevo en macetas y se estudian de nuevo para determinar la resistencia a herbicidas en una prueba de pulverización para determinar la resistencia a herbicidas de HPPD (por ejemplo, mesotriona). Los eventos con una única copia entre las líneas de plantas T1 se identifican por su relación de segregación 3:1 (con respecto a canamicina y/o herbicida) y por RT-PCR cuantitativa. Las semillas del tabaco T1 (var. Samsun) seleccionadas de esta manera se siembran en macetas con un diámetro de 3 pulgadas que contienen un 50% de turba y un 50% de John Innes Soil n° 3.

Ejemplo 4. Construcción de vectores de transformación de haba de soja

Se construyeron vectores binarios para transformación de dicotiledóneas (haba de soja) con un promotor, tal como un promotor sintético que contiene un potenciador transcripcional CaMV 35S y uno FMV y una caja TATA sintética que dirigen la expresión de una secuencia codificante de HPPD, tal como SEC ID NO: 24, seguido del terminador de 3’ del gen Nos. El gen de HPPD se optimizó en los codones para la expresión de haba de soja basándose en la secuencia de aminoácidos predicha de la región codificante del gen de HPPD. En el caso de que no se usara como marcador seleccionable la propia HPPD, se construyeron vectores de transformación binarios de Agrobacterium que contenían un casete de expresión de HPPD añadiendo un gen marcador seleccionable de la transformación. Por ejemplo, el vector de transformación binario 17146 (SEC ID NO: 33) contiene un casete de expresión para la variante de HPPD (SEC ID NO: 24) enlazado con dos casetes del gen PAT (uno con el promotor 35S y uno con el promotor CMP, y ambos genes PAT van seguidos por el terminador nos) para la selección a base de glufosinato durante el proceso de transformación. Otro vector de transformación binario (17147) (SEC ID NO: 34) contiene el casete de expresión de la variante de HPPD (SEC ID NO: 24) y también un casete de marcador seleccionable de EPSPS. El vector 17147 se transformó en haba de soja, y se obtuvieron plantas transgénicas usando selección con glifosato después de la transformación, mediada por Agrobacterium, de dianas de semillas inmaduras. De manera similar, se construyó el vector binario 15764 (SEC ID NO: 35) para comprender los casetes de expresión para expresar la variante de HPPD (SEC ID NO: 14) junto con un gen marcador seleccionable bar y se construyó el vector binario 17149 (SEC ID NO: 36) para comprender un casete de expresión que expresa la variante de HPPD (SEC ID NO: 26) junto con dos casetes del gen PAT. En todos los casos, las secuencias de ADN que codifican los genes de HPPD se optimizaron en los codones para la expresión en haba de soja.

Los vectores binarios descritos anteriormente se construyeron usando una combinación de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como PCR de solapamiento, síntesis de ADN, subclonación y ligación de fragmentos de restricción. Sus estructuras únicas se obtienen explícitamente en las Figuras 6 (vector 17146), 7 (vector 17147), 8 (vector 15764) y 9 (vector 17149) y en los listados de secuencias (SEC ID NOs: 33-36). A continuación, se proporciona información adicional con respecto a los vectores mostrados en las Figuras 6-9.

Las abreviaturas usadas en la Figura 6 (vector 17146) se definen según lo siguiente:

cAvHPPD-04

Principio: 1024 Final: 2343

Gen de HPPD de avena optimizado en los codones para haba de soja que codifica SEC ID NO: 24

cPAT-03-01

Principio: 3209 Final: 3760

S. viridochromogenes sintético Hoescht AO2774 PAT, codones vegetales; idéntico a la proteína Q57146 de fosfinotricin acetil transferasa

cPAT-03-02

Principio: 5062 Final: 5613

Proteína fosfinotricin acetil transferasa de S. viridochromogenes PAT Q57146, ADN de cPAT-03-01, con sitios BamHI, Bgl2 mutados

cSpec-03

P rinc ip io : 6346 F ina l: 7134

También denominado aadA; gen que codifica la enzima aminoglucósido 3’ adeniltransferasa, que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina para mantenimiento del vector en E. coli y AgrobacteriumTambién conocido como cSPEC-03

cVirG-01

Principio: 7434 Final: 8159

virG (putativo) procedente de pAD1289 con codón de Principio TTG. virGN54D procede de pAD1289 descrito en Hansen et al. 1994, PNAS 91:7603-7607

cRepA-01

Principio: 8189 Final: 9262

Proteína de replicación RepA, pVS1

eNOS-01

Principio: 168 Final: 259

Secuencia potenciadora de NOS putativa procedente de 15235 como se encuentra en la frontera derecha de ciertos vectores binarios.

eFMV-03

Principio: 396 Final: 589

Región potenciadora del virus del mosaico de la escrofularia (FMV)

e35S-05

Principio: 596 Final: 888

Cambios de pb de C a T y C a A en la región del potenciador 35S del virus del mosaico de la coliflor

eTMV-02

Principio: 953 Final: 1020

Secuencia líder de TMV Omega 5’UTR que se piensa que potencia la expresión. EMBL: TOTMV6

eFMV-03

Principio: 4054 Final: 4247

Región potenciadora procedente del virus del mosaico de la escrofularia (FMV)

e35S-05

Principio: 4254 Final: 4546

eNOS-01

Principio: 4557 Final: 4648

Secuencia del potenciador NOS putativa procedente de 15235 como se encuentra en la frontera derecha de ciertos vectores binarios

bNRB-05

Principio: 4 Final: 259 (complementario)

Región de frontera derecha/ T-DNA de NOS; puede influir en los promotores. EMBL Nos: J01826, V00087, AF485783.

bNRB-01 -01

P rinc ip io : 101 F ina l: 125 (com p le m e n ta rio )

Repetición de frontera derecha de T-DNA del plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens

bNLB-03

Principio: 5937 Final: 6066 (complementario)

Región de frontera izquierda de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens

bNRB-01 -01

Principio: 5972 Final: 5996 (complementario)

Región de repetición de frontera izquierda de 25 pb de T-DNA del plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens

prCMP-04

Principio: 4655 Final: 5051

Promotor y líder del virus del rizado de la hoja amarilla de galán de noche (principio aagggagc?). genbank AF364175. US20040086447. prCMP-01 con un truncamiento de un par de bases en el extremo 5’, y un truncamiento de 2 pares de bases en el extremo 3’

pr35S-04-01

Principio: 2664 Final: 3184

Promotor 35S procedente del virus del mosaico de la coliflor. EMBL: CAMVG2

oVS1 -02

Principio: 9305 Final: 9709

Origen de replicación y región de partición de plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al. 1984, Plasmid 11: 206 220); similar al Número de Acceso GenBank U10487; sirve como origen de replicación en el hospedante de Agrobacterium tumefaciens

oCOLE-06

Principio: 10387 Final: 11193 (complementario)

El origen de replicación de ColE1 funcional en E. coli derivó de pUC19

tNOS-05-01

Principio: 2360 Final: 2612

Terminador sintético de nopalina sintetasa

tNOS-05-01

Principio: 3794 Final: 4046

Terminador sintético de nopalina sintetasa

tNOS-05-01

Principio: 5642 Final: 5894

Terminador sintético de nopalina sintetasa

Las abreviaturas usadas en la Figura 7 (vector 17147) se definen como lo siguiente:

cAvHPPD-04

Principio: 1024 Final: 2343

Gen de HPPD de avena optimizado en los codones para haba de soja, que codifica SEC ID NO: 24 cGmEPSPS-01

Principio: 3672 Final: 5249

Versión optimizada en los codones para haba de soja de ADNc de EPSPS de haba de soja mutante doble cSpec-03

Principio: 5982 Final: 6770

También denominado aadA; gen que codifica la enzima aminoglucósido 3’ adeniltransferasa, que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina para mantenimiento del vector en E. coli y Agrobacterium. También conocido como cSPEC-03

cVirG-01

Principio: 7070 Final: 7795

virG (putativo) procedente de pAD1289 con codón de Principio TTG. virGN54D procedió de pAD1289 descrito en Hansen et al. 1994, PNAS 91:7603-7607

cRepA-01

Principio: 7825 Final: 8898

Proteína de replicación de RepA, pVS1

Descripción de la ubicación original:

eNOS-01

Principio: 168 Final: 259

Secuencia del potenciador NOS putativa procedente de 15235 como se encuentra en la frontera derecha de ciertos vectores binarios.

eFMV-03

Principio: 396 Final: 589

Región potenciadora del virus del mosaico de la escrofularia (FMV)

e35S-05

Principio: 596 Final: 888

eTMV-02

Principio: 953 Final: 1020

eFMV-03

Principio: 2664 Final: 2857

Región potenciadora del virus del mosaico de escrofularia (FMV)

e35S-05

Principio: 2864 Final: 3156

eNOS-01

Principio: 3167 Final: 3258

bNRB-05

P rinc ip io : 4 F ina l: 259 (co m p le m e n ta rio )

Región de frontera derecha/T-DNA de NOS; puede influir en los promotores. EMBL Nos: J01826, V00087, AF485783.

bNRB-01 -01

Principio: 101 Final: 125 (complementario)

Repetición de frontera derecha de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens

bNLB-03

Principio: 5573 Final: 5702 (complementario)

bNLB-01 -01

Principio: 5608 Final: 5632 (complementario)

Región de repetición de frontera izquierda de 25 pb de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens

prCMP-04

Principio: 3265 Final: 3661

Promotor y líder del virus del rizado de la hoja amarilla de galán de noche (principio aagggagc?). genbank AF364175. US20040086447. prCMP-01 con truncamiento de 1 par de bases en el extremo 5’ y truncamiento de 2 pares de bases en el extremo 3’.

Descripción de la ubicación original:

oVS1 -02

Principio: 8941 Final: 9345

Origen de la replicación y región de partición procedente del plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al. 1984, Plasmid 11: 206-220); similar al Número de Acceso GenBank U10487; sirve como origen de replicación en el hospedante de Agrobacterium tumefaciens.

oCOLE-06

Principio: 10023 Final: 10829 (complementario)

El origen de replicación de ColE1 funcional en E. coli derivó de pUC19

tNOS-05-01

Principio: 2360 Final: 2612

Terminador sintético de nopalina sintetasa

tNOS-05-01

Principio: 5278 Final: 5530

Terminador sintético de nopalina sintetasa

Las abreviaturas usadas en la Figura 8 (vector 15764) se definen según lo siguiente:

cAvHPPD-03

Principio: 450 Final: 1769 (complementario)

Gen de HPPD de avena optimizado en los codones para haba de soja que codifica SEC ID NO 14

cPATBAR-07

P rinc ip io : 3034 F ina l: 3585

Gen BAR X17220 de S. hygroscopicus (sitio Bgl2 mutado), proteína fosfinotricin acetil transferasa caa35093. cSpec-03

Principio: 4334 Final: 5122

estreptomicina adenililtransferasa; de Tn7 (aadA)

cVirG-01

Principio: 5422 Final: 6147

Gen de virulencia G de Agrobacterium tumefaciens (virGN54D, que contiene el codón de Principio TTG) virGN54D procedió de pAD1289 descrito en Hansen et al. 1994, PNAS 91:7603-7607

cRepA-03

Principio: 6177 Final: 7250

Proteína de replicación de RepA, pVS1 con A a G en nt735

eTMV-02

Principio: 1773 Final: 1840 (complementario)

Secuencia líder del virus del mosaico del tabaco (TMV_Omega 5'UTR que se piensa que potencia la expresión. EMBL: TOTMV6

e35S-05

Principio: 1905 Final: 2197 (complementario)

Región potenciadora 35S del virus del mosaico de la coliflor con cambios de pb de C a T y de C a A.

eFMV-03

Principio: 2204 Final: 2397 (complementario)

Potenicador del virus del mosaico de la escrofularia.

bNRB-04

Principio: 5 Final: 144 (complementario)

Región de frontera derecha de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens. Difiere de bNRB-03 en 20 pb en el extremo 5’.

bNRB-01 -01

Principio: 102 Final: 126 (complementario)

Repetición de frontera derecha de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens.

bNLB-03

Principio: 3925 Final: 4054 (complementario)

Región de frontera izquierda de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens. (Zambryski et al.

1980, Science, 209:1385-1391) EMBL n2 J01825.

bNLB-01 -01

Principio: 3960 Final: 3984 (complementario)

Región de frontera izquierda de 25 pb de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens. pr35S-04-01

Principio: 2494 Final: 3014

Promotor 35S; promotor definido originalmente en el mapa con una longitud de 641 pb; no hay una coincidencia exacta en la bibliografía (LF julio de 2004)

oVS1 -02

Principio: 7293 Final: 7697

Origen de replicación y región de partición del plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al. 1984, Plasmid 11: 206 220); similar al número de acceso de GenBank U10487; actúa como un origen de replicación en el hospedante Agrobacterium tumefaciens

oCOLE-06

Principio: 8375 Final: 9181 (complementario)

Origen de replicación ColE1 funcional en E. coli

tNOS-05-01

Principio: 181 Final: 433 (complementario)

Terminador NOS: 3'UTR del gen nopalina sintasa

tNOS-05-01

Principio: 3619 Final: 3871

Terminador NOS: 3'UTR del gen nopalina sintasa

Las abreviaturas usadas en la Figura 9 (vector 17149) se definen según lo siguiente:

cAvHPPD-05

Principio: 1024 Final: 2343

Secuencia optimizada en los codones para haba de soja que codifica SEC ID NO: 26 de HPPD

cPAT-03-01

Principio: 3209 Final: 3760

S. viridochromogenes sintético Hoescht AO2774 PAT, codones vegetales; idéntico a la proteína Q57146 de fosfinotricin acetil transferasa

cPAT-03-02

Principio: 5062 Final: 5613

Proteína fosfinotricin acetil transferasa de S. viridochromogenes PAT Q57146, ADN de cPAT-03-01, con sitios BamH1, Bgl2 mutados

cSpec-03

Principio: 6346 Final: 7134

También denominado aadA; gen que codifica la enzima aminoglucósido 3’ adeniltransferasa, que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina para mantenimiento del vector en E. coli y Agrobacterium. También conocido como cSPEC-03

cVirG-01

Principio: 7434 Final: 8159

cRepA-01

Principio: 8189 Final: 9262

Proteína de replicación RepA, pVS1

Descripción de la ubicación original

eNOS-01

Principio: 168 Final: 259

eFMV-03

Principio: 396 Final: 589

Región potenciadora del virus del mosaico de la escrofularia (FMV)

e35S-05

Principio: 596 Final: 888

Cambios de pb de C a T y C a A en la región potenciadora 35S del virus del mosaico de la coliflor

eTMV-02

Principio: 953 Final: 1020

Secuencia líder de TMV Omega 5'UTR que se piensa que potencia la expresión. EMBL: TOTMV6

eFMV-03

Principio: 4054 Final: 4247

Región potenciadora procedente del virus del mosaico de la escrofularia (FMV)

e35S-05

Principio: 4254 Final: 4546

eNOS-01

Principio: 4557 Final: 4648

bNRB-05

Principio: 4 Final: 259 (complementario)

bNRB-01 -01

Principio: 101 Final: 125 (complementario)

bNLB-03

Principio: 5937 Final: 6066 (complementario)

bNLB-01 -01

Principio: 5972 Final: 5996 (complementario)

prCMP-04

P rinc ip io : 4655 F ina l: 5051

Promotor y líder del virus del rizado de la hoja amarilla de galán de noche (principio aagggagc?). genbank: AF364175. US20040086447. prCMP-01 con un truncamiento de un par de bases en el extremo 5’ y un truncamiento de 2 pares de bases en el extremo 3’

pr35S-04-01

Principio: 2664 Final: 3184

Promotor 35S procedente de CaMV. EMBL: CAMVG2 (100% de coincidencia contra este registro EMBL) oVS1 -02

Principio: 9305 Final: 9709

Origen de replicación y región de partición de plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al. 1984, Plasmid 11: 206 220); similar al número de acceso GenBank U10487; sirve como origen de replicación en el hospedante Agrobacterium tumefaciens

oCOLE-06

Principio: 10387 Final: 11193 (complementario)

El origen de replicación ColE1 funcional en E.coli derivó de pUC19

tNOS-05-01

Principio: 2360 Final: 2612

Terminador sintético de nopalina sintetasa

tNOS-05-01

Principio: 3794 Final: 4046

Terminador sintético de nopalina sintetasa

tNOS-05-01

Principio: 5642 Final: 5894

Terminador sintético de la nopalina sintetasa

Ejemplo 5: Transformación de haba de soja y selección de plantas resistentes a herbicidas.

El material vegetal de haba de soja se puede transformar de forma adecuada y se pueden regenerar plantas fértiles mediante muchos métodos que son bien conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, las plantas transgénicas de haba de soja fértiles morfológicamente normales se pueden obtener mediante: 1) la producción de tejido embriogénico somático procedente de, por ejemplo, cotiledón inmaduro, hipocotilo u otro tejido adecuado; 2) transformación mediante bombardeo con partículas o infección con Agrobacterium; y 3) regeneración de plantas. En un ejemplo, como se describe en la patente U.S. n° 5.204.944, se corta tejido de cotiledón procedente de embriones inmaduros de haba de soja, preferiblemente al que se le ha eliminado el eje embriónico, y se cultiva en medio que contiene hormonas, para formar material vegetal embriogénico somático. Este material se transforma usando, por ejemplo, métodos de ADN directos, bombardeo con microproyectiles revestidos con ADN o infección con Agrobacterium, se cultiva en un medio de selección adecuado y se regenera, opcionalmente también en presencia continua de agente de selección, en plantas de haba de soja transgénicas fértiles. Los agentes de selección pueden ser antibióticos tales como canamicina, higromicina, o herbicidas tales como fosfinotricina o glifosato, o, como alternativa, la selección se puede basar en la expresión de un gen marcador visualizable, tal como GUS. Como alternativa, los tejidos diana para la transformación comprenden tejido meristemático en vez de embriogénico somaclonal, u, opcionalmente, es tejido de flores o formador de flores. Otros ejemplos de transformaciones de haba de soja se pueden encontrar, por ejemplo, mediante el método de suministro de ADN físico, tal como bombardeo con partículas (Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; McCabe et al. (1988) Bio/technology 6:923-926), triquitas (Khalafalla et al. (2006) African J. of Biotechnology 5:1594-1599), inyección de haces de aerosol (patente U.S. n° 7.001.754), o mediante métodos de suministro mediados por Agrobacterium (Hinchee et al. (1988) Bio/Technology 6:915-922; patente U.S. n° 7.002.058; Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20040034889; Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447; Paz et al. (2006) Plant Cell Report 25:206-213). El gen de HPPD también se puede suministrar en un orgánulo tal como un plástido, para conferir resistencia incrementada a herbicidas (Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20070039075).

Las plantas transgénicas de haba de soja se pueden generar con los vectores binarios descritos anteriormente (Ejemplo 4) que contienen variantes del gen de HPPD con diferentes métodos de transformación. Opcionalmente, el gen de HPPD puede proporcionar el medio de selección e identificación de tejido transgénico. Por ejemplo, se usó un vector para transformar dianas de semillas inmaduras como se describe (Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447) para generar plantas de haba de soja de HPPD transgénicas directamente usando inhibidor de HPPD, tal como mesotriona, como agente de selección. Opcionalmente, los genes de HPPD se pueden presentar en el polinucleótido junto con otras secuencias que proporcionan medios adicionales de selección/identificación de tejido transformado, incluyendo, por ejemplo, los genes conocidos que proporcionan resistencia a canamicina, higromicina, fosfinotricina, butafenacilo, o glifosato. Por ejemplo, vectores binarios diferentes que contienen los genes marcadores seleccionables PAT o EPSPS como se describe en el Ejemplo 4 se transformaron en una diana de semilla de haba de soja inmadura para generar plantas tolerantes a herbicidas de HPPD usando transformación mediada por Agrobacterium y selección con glufosinato o glifosato (Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447).

Como alternativa, las secuencias marcadoras seleccionables pueden estar presentes en polinucleótidos separados, y se usa un proceso de, por ejemplo, cotransformación y coselección. Como alternativa, en lugar de un gen marcador seleccionable, se puede usar un gen marcador puntuable, tal como GUS, para identificar un tejido transformado.

Se puede usar un método a base de Agrobacterium para la transformación de haba de soja para generar plantas transgénicas usando glufosinato, glifosato o inhibidor de HPPD mesotriona como agente de selección, usando semillas de haba de soja inmaduras como se describe (Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447).

Ejemplo 6: Crecimiento de plantas transgénicas de haba de soja, análisis y evaluación de la tolerancia a herbicidas.

Se llevaron plantas T0 procedentes de cultivo de tejido al invernadero, en el que se transplantaron en suelo saturado con agua (mezcla para cepellones y plántulas REDI-EARTH, Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA o mezcla de germinación Fafard) mezclado con 1% de MARATHON granular (Olympic Horticultural Products, Co., Mainland, PA) a 5-10 g/gal de suelo en macetas cuadradas de 2”. Las plantas se cubrieron con cúpulas para la humedad y se colocaron en una cámara Conviron (Pembina, ND) con las siguientes condiciones medioambientales: 24°C día; 20°C noche; fotoperíodo de 16-23 h de luz-1-8 h de oscuridad; y humedad relativa de 80%.

Después de que las plantas se establecieran en el suelo y aparecieran nuevos crecimientos (~1-2 semanas), se tomaron muestras de las plantas y se ensayaron para determinar la presencia del transgén deseado mediante análisis TAQMAN® usando sondas apropiadas para los genes de HPPD, o promotores (por ejemplo prCMP). Todas las plantas positivas se transplantaron en macetas cuadradas de 4” que contenían suelo Fafard n°3. Se incorporó un fertilizante de liberación lenta Sierra 17-6-12 en el suelo, a la tasa recomendada. Las plantas se vuelven a colocar entonces en un invernadero estándar para aclimatizarlas (~1 semana). Las condiciones medioambientales fueron: 27°C día; 21°C noche; fotoperíodo de 14 h (con luz complementaria); humedad ambiental. Después de aclimatarse (~1 semana), se tomaron muestras de las plantas y se ensayaron detalladamente para detectar la presencia y número de copias de transgenes insertados. Se hacen crecer plantas transgénicas de haba de soja hasta madurez, para la producción de semillas T1. Las plantas T1 se hicieron crecer y después de análisis TAQMAN®, se hicieron crecer las plantas homozigotas para la producción de semillas. Las semillas transgénicas y las plantas de la progenie se usaron para evaluar posteriormente su comportamiento de tolerancia a herbicidas y sus características moleculares.

Las plantas de haba de soja homozigotas procedentes de 2 eventos generados con el vector 15764 (Figura 8) y múltiples eventos generados con el vector 17147 (Figura 7) que expresan SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 24, respectivamente, a partir de dos casetes de expresión de HPPD idénticos se hicieron crecer y se ensayaron para determinar su tolerancia a una gama de herbicidas de HPPD. La Tabla 8 resume los resultados de estos ensayos a partir de plantas pulverizadas en la etapa de crecimiento V2. Cada punto de datos representa la calificación de daño promedio a partir de n = 7 réplicas.

Tabla 8. Resultados de los ensayos de pulverización con herbicida contra los eventos de haba de soja con vector 15764 y 17147

El evento 1 fue más tolerante a mesotriona y el evento 2 fue el segundo evento 15764 más tolerante seleccionado a partir de una población de aproximadamente 90. Estos eventos se usaron para comparar el rendimiento de cinco eventos 17147. Cuatro de estos, SF, S8, S7 y S3 no se habían preseleccionado por el nivel de tolerancia (más que para confirmar resistencia, naturaleza no quimérica y presencia del gen) mientras que el evento restante, T0, se había preseleccionado como el más resistente de los cinco eventos 17147 en un ensayo de campo preliminar.

Las plantas estuvieron en macetas de plástico de 4 x 4 x 4 pulgadas y se hicieron crecer en un régimen de luz de 15/9 horas (luz del día complementada con luz artificial en los invernaderos) con una temperatura mínima nocturna de 18 °C y una temperatura máxima diurna de 27 °C. El suelo fue mezcla VBRC regular (mezcla 1:1 de suelo de campo Vero y Mezcla Fafard II) donde el suelo de campo Vero es un 98% de arena y un 2% de arcilla. Los tratamientos con el compuesto B = CALLISTO® 4 SC (480 g ai/l), con el compuesto C (200 g ai/l) EC, con IFT = Balance Pro 4 SC (480 g ai/l) y con el compuesto E = Laudis 3,5 SC (420 g ai/l) incluyeron un 0,25% v/v de INDUCE (un tensioactivo no iónico) y sulfato de amonio (N-PAK líquido AmS) con una tasa equivalente a 8,5 lb/galón. El volumen del pulverizado fue de 150 l/ha y las calificaciones del daño reflejan evaluaciones a 14 DAT.

Resulta sorprendente que a partir de un conjunto tan pequeño de eventos 17147 la totalidad de los cinco eventos ensayados proporcionara tolerancia a mesotriona y a isoxaflutol equivalente a uno de los mejores eventos 15764, el evento 2, y ciertamente que dos de ellos, T0 y S7, superaran el rendimiento del evento 15764 más tolerante, el evento 1, que se seleccionó entre muchos.

Los datos in vitro y, en particular los datos de la velocidad de disociación, muestran que SEC ID NO: 24 es 2 y 2,3 veces superior a SEC ID NO: 14 respecto a B e IFT pero neutra respecto a C y E. El hecho de que las plantas que expresan SEC ID NO: 24 de HPPD mostraran un patrón alterado de manera similar a la tolerancia a herbicidas concuerda con esto. Por lo tanto, por ejemplo, los eventos SF y S8 muestran una tolerancia similar o mejor tanto a IFT como a B que 6W pero, a diferencia de 6W, esencialmente no tolerancia al compuesto E o al C. De manera similar, los únicos eventos 17147, T0 y S7, que muestran una tolerancia a E y C que es similar a la del evento 4R también muestran una tolerancia superior que 4R a B e IFT. Los datos in vitro tienen un valor predictivo en las plantas y SEC ID NO: 24 proporciona una mejor tolerancia a mesotriona e IFT pero no, por ejemplo, a tembotriona.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, se pueden poner en práctica ciertos cambios y modificaciones.

Aspectos

Aspecto 1: Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEC ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o 26;

b) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos R(K,A,R)SQI(Q,E)T (SEC ID NO:28), donde la primera Q se sustituye por cualquier otro aminoácido; c) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos R(K,A,R)SQI(Q,E)T (SEC ID NO:28), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

d) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos (P,A,S)G(V,L)QH(I,L,M) (SEC ID NO:29), donde la Q se sustituye por cualquier otro aminoácido;

e) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos G(I,V) LVD(R,K)D (SEC ID NO:30), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

f) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos ESGLN(S,G) (SEC ID NO:31), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

g) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos F(A,S)EF(T,V) (SEC ID NO:32), donde la A se sustituye por cualquier otro aminoácido;

h) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende las secuencias de aminoácidos G(I,V) LVD(R,K)D (SEC ID NO:30) y ESGLN(S,G) (SEC ID NO:31), donde la L en ambas secuencias se sustituye por M;

i) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos EVELYGDVV (SEC ID NO:37), donde la Y se sustituye por cualquier otro aminoácido;

j) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos RFDHVVGNV (SEC ID NO:38), donde la primera V se sustituye por cualquier otro aminoácido;

k) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos DHVVGNVPE (SEC ID NO:39), donde la G se sustituye por cualquier otro aminoácido;

l) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos HVVGNVPEM (SEC ID NO:40), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido;

m) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos NVPEMAPVI (SEC ID NO:41), donde la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;

n) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GFHEFAEFT (SEC ID NO:42), donde la segunda F se sustituye por cualquier otro aminoácido;

o) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GTTESGLNS (SEC ID NO:43), donde la primera S se sustituye por cualquier otro aminoácido;

p) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos TTESGLNSV (SEC ID NO:44), donde la G se sustituye por cualquier otro aminoácido;

q) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos ESGLNSVVL (SEC ID NO:45), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido;

r) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GLNSVVLAN (SEC ID NO:46), donde la V se sustituye por cualquier otro aminoácido;

s) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos LNSVVLANN (SEC ID NO:47), donde la segunda V se sustituye por cualquier otro aminoácido;

t) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos SEAVLLPLN (SEC ID NO:48), donde la primera L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

u) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos EAVLLPLNE (SEC ID NO:49), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

v) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos VLLPLNEPV (SEC ID NO:50), donde la tercera L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

w) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos LLPLNEPVH (SEC ID NO:51), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido;

x) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos HGTKRRSQI (SEC ID NO:52), donde la primera R se sustituye por cualquier otro aminoácido;

y) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos SQIQTYLEY (SEC ID NO:53), donde la T se sustituye por cualquier otro aminoácido;

z) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos QIQTYLEYH (SEC ID NO:54), donde la Y se sustituye por cualquier otro aminoácido;

aa) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GVQHIALAS (SEC ID NO:55), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

bb) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GFEFMAPPQ (SEC ID NO:57), donde la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;

cc) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos FEFMAPPQA (SEC ID NO:58), donde la primera A se sustituye por cualquier otro aminoácido;

dd) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos FMAPPQAKY (SEC ID NO:59), donde la segunda P se sustituye por cualquier otro aminoácido;

ee) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos QAKYYEGVR (SEC ID NO:60), donde la segunda Y se sustituye por cualquier otro aminoácido;

ff) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GVRRIAGDV (SEC ID NO:61), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

gg) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos VLLQIFTKP (SEC ID NO:62), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

hh) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos LLQIFTKPV (SEC ID NO:63), donde la F se sustituye por cualquier otro aminoácido;

ii) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos LQIFTKPVG (SEC ID NO:64), donde la T se sustituye por cualquier otro aminoácido;

jj) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos IFTKPVGDR (SEC ID NO:65), donde la P se sustituye por cualquier otro aminoácido;

kk) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos RPTFFLEMI (SEC ID NO:66), donde la segunda F se sustituye por cualquier otro aminoácido;

ll) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos FLEMIQRIG (SEC ID NO:67), donde la primera I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

mm)un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GGCGGFGKG (SEC ID NO:68), donde la cuarta G se sustituye por cualquier otro aminoácido;

nn) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GGFGKGNFS (SEC ID NO:69), donde la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;

oo) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GFGKGNFSE (SEC ID NO:70), donde la tercera G se sustituye por cualquier otro aminoácido;

pp) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos FGKGNFSEL (SEC ID NO:71), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido;

qq) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos KGNFSELFK (SEC ID NO:72), donde la S se sustituye por cualquier otro aminoácido;

rr) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GNFSELFKS (SEC ID NO:73), donde la E se sustituye por cualquier otro aminoácido;

ss) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos ELFKSIEDY (SEC ID NO:74), donde la S se sustituye por cualquier otro aminoácido;

tt) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos LFKSIEDYE (SEC ID NO:75), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

uu) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos HVVGNVPEM (SEC ID NO:40), donde la N se sustituye por cualquier otro aminoácido, y la secuencia de aminoácidos ELGVLVDRD (SEC ID NO:76), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

vv) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos LNSVVLANN (SEC ID NO:47), donde la segunda V se sustituye por cualquier otro aminoácido, y la secuencia de aminoácidos ELGVLVDRD (SEC ID NO:76), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

ww) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos VLLPLNEPV (SEC ID NO:50), donde la tercera L se sustituye por cualquier otro aminoácido, y la secuencia de aminoácidos VLLQIFTKP (SEC ID NO:62), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

xx) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GGCGGFGKG (SEC ID NO:68), donde la cuarta G se sustituye por cualquier otro aminoácido, y la secuencia de aminoácidos ELGVLVDRD (SEC ID NO:76), donde la segunda L se sustituye por cualquier otro aminoácido;

yy) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos FHEFAEFTAED (SEC ID NO:76), donde la primera A, la segunda E y la segunda F se sustituyen por cualquier otro aminoácido;

zz) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos HGTKRRSQIQ (SEC ID NO:77), donde la primera R se sustituye por cualquier otro aminoácido y la segunda R se suprime; aaa) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GTKRRSQIQ (SEC ID NO:78), donde la segunda R se suprime;

bbb) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos FMAPPQAKY (SEC ID NO:59), donde la segunda P se suprime;

ccc) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GNFSELFKS (SEC ID NO:73), donde la E se suprime;

ddd) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GVRRIAGDV (SEC ID NO:61), donde la I se suprime;

eee) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos DQGVLLQIFTKP (SEC ID NO:79), donde la primera L y la I se sustituyen por cualquier otro aminoácido; fff) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos GKGNFSELFK (SEC ID NO:80), donde la primera F y la S se sustituyen por cualquier otro aminoácido;

ggg) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEC ID NO:27, donde dicho polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia de aminoácidos KGNFSELFKS (SEC ID NO:56), donde la primera S y la E se sustituyen por cualquier otro aminoácido.

Aspecto 2: Un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD que tiene actividad enzimática de HPPD, donde dicho polinucleótido deriva de una planta y donde dicho polipéptido de HPPD vegetal codificado por dicho polinucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con SEC ID NO: 27 y comprende

al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

a) FEFMAPPQA (SEC ID NO: 58), donde la primera A se sustituye por cualquier otro aminoácido;

b) GGCGGFGKG (SEC ID NO: 68), donde la cuarta G se sustituye por cualquier otro aminoácido;

c) GVRRIAGDV (SEC ID NO: 61), donde la I se sustituye por cualquier otro aminoácido;

d) GFGKGNFSE (SEC ID NO: 70), donde la tercera G se sustituye por cualquier otro aminoácido;

e) G(I,V)LVD(R,K)D (SEC ID NO: 30), donde la L se sustituye por cualquier otro aminoácido.

Aspecto 3: El polipéptido del aspecto 1 o 2, donde dicho polipéptido comprende una o más sustituciones o supresiones de aminoácidos correspondientes a las sustituciones y deleciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 1 o la Tabla 2.

Aspecto 4: Un polinucleótido que codifica un péptido de acuerdo con los aspectos 1 a 3.

Aspecto 5: El polinucleótido del aspecto 1 a 4, donde la secuencia nucleotídica está optimizada para la expresión en una planta.

Aspecto 6: Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de los aspectos 1 a 5, enlazado operablemente a un promotor que dirige la expresión en una planta o célula vegetal.

Aspecto 7: El casete de expresión del aspecto 6 que comprende además una secuencia polinucleotídica enlazada operablemente que codifica un polipéptido que confiere un rasgo deseable.

Aspecto 8: El casete de expresión del aspecto 7, donde dicho rasgo deseable es la resistencia o tolerancia a un herbicida.

Aspecto 9: El casete de expresión del aspecto 8, donde dicho rasgo deseable es la resistencia o tolerancia a un inhibidor de HPPD, glifosato o glufosinato.

Aspecto 10: El casete de expresión del aspecto 9, donde dicho polipéptido que confiere un rasgo deseable es un citocromo P450 o una variante del mismo.

Aspecto 11: El casete de expresión del aspecto 9, donde dicho polipéptido que confiere un rasgo deseable es una EPSPS (5-enol-pirovil-chiquimato-3-fosfato-sintasa).

Aspecto 12: El casete de expresión del aspecto 9, donde dicho polipéptido que confiere un rasgo deseable es una fosfinotricin acetil transferasa.

Aspecto 13: Un vector que comprende un casete de expresión de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 6-12. Aspecto 14: Un método para conferir resistencia o tolerancia a un inhibidor de HPPD en una planta, comprendiendo dicho método introducir en dicha planta al menos un casete de expresión según uno cualquiera de los aspectos 6 12.

Aspecto 15: Una célula vegetal transformada que comprende al menos un casete de expresión según uno cualquiera de los aspectos 6-12.

Aspecto 16: La célula vegetal del aspecto 15, donde dicha célula vegetal es una célula vegetal de arroz, cebada, patata, boniato, canola, girasol, centeno, avena, trigo, maíz, haba de soja, remolacha azucarera, tabaco, pasto Miscanthus, pasto varilla, cártamo, árboles, algodón, mandioca, tomate, sorgo, alfalfa, remolacha azucarera y caña de azúcar.

Aspecto 17: La célula vegetal del aspecto 16, donde dicha célula vegetal es una célula vegetal de haba de soja. Aspecto 18: Una planta, parte de una planta, o semilla que comprende la célula vegetal de los aspectos 15 a 17. Aspecto 19: Un método para controlar malas hierbas en un locus, comprendiendo dicho método aplicar a dicho locus una cantidad controladora de malas hierbas de uno o más inhibidores de HPPD, donde dicho locus comprende una planta de acuerdo con el aspecto 18.

Aspecto 20: El método del aspecto 19, donde dicho inhibidor de HPPD se selecciona del grupo que consiste en: a) un compuesto de fórmula (Ia)

donde R1 y R2 son hidrógeno o juntos forman un puente de etileno;

R3 es hidroxi o feniltio-; R4 es halógeno, nitro, alquilo C1-C4, (alcoxi C rC ^a lq u il C1-C4)-, (alcoxi C rC 4)-(alcoxi C1-C4)-(alquil C1-C4)-;

R6 es alquiisulfonil C1-C4- o haloalquilo C1-C4;

b) un compuesto de fórmula (Ib)

R1 y R2 son independientemente alquilo C1-C4; y los ácidos libres de los mismos;

c) un compuesto de fórmula (Ic)

R2 es alquilo C1-C4;

R5 es hidrógeno, alquilo C1-C4, (alcoxi C1-C4)-(alcoxi C1-C4)- o un grupo

d) un compuesto de fórmula (Id)

R2 es alquilo C1-C4;

R3 es hidrógeno; y R4, R5 y R6 son independientemente alquilo C1-C4;

e) un compuesto de fórmula (Ie)

R3 es hidrógeno;

f) un compuesto de fórmula (If)

R3 es hidrógeno; y

g) un compuesto de fórmula (Ig) o fórmula (Ih)

donde:

R5 es hidrógeno o metilo;

X = O o S;

n = 0 o 1;

m = 0 o 1 siempre que si m = 1 entonces n = 0 y si n=1 entonces m = 0;

p = 0, 1 o 2;

R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, (alquil Ci-C6)carbonil-(alquilo C1-C3), (cicloalquil C3-C6)alquenoílo, por ejemplo, ciclohexilmetilenilo, (alquinil C3-C6)alquilenoílo, por ejemplo, propargilo, (alquenil C2-C6)alquilenilo, por ejemplo, alilo, (alcoxi CrC6)-(alquilo C1-C6), ciano-(alquilo C1-C6), arilcarbonil-(alquilo C1-C3) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3), aril-(alquilo C1-C6) (donde el arilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, alcoxi C1-C3, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3), (alcoxi C1-C6)-(alcoxi CrC6)-(alquilo C1-C6) y un (heteroaril de 5 o 6 miembros)-(alquilo C1-C3) o heterociclil-(alquilo C1-C3), donde el heteroarilo o heterociclilo contiene de uno a tres heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre, donde el componente heterociclilo o heteroarilo puede estar sustituido opcionalmente con un sustituyente seleccionado el grupo que consiste en halo, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3 y alcoxi C1-C3;

Q se selecciona del grupo que consiste en:

donde

A1 se selecciona del grupo que consiste en O, C(O), S, SO, SO2 y (CReRf)q;

q = 0, 1 o 2;

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4 que puede estar mono, di o trisustituido con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C rC 4)-carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo, fenilo y heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C1-C4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterocíclico no son halógeno; o

Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C rC 4)carbonilo, alquiltio C1-C4, alquilsulfinilo C1-C4, alquilsulfonilo C1-C4, (alquil C1-C4)carbonilo, fenilo o heteroarilo, siendo posible a su vez que los grupos fenilo y heteroarilo estén mono, di o trisustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi C1-C4, halógeno, hidroxi, ciano, hidroxicarbonilo, (alcoxi C rC 4)carbonilo, alquilsulfonilo C1-C4 y haloalquilo C1-C4, donde los sustituyentes del nitrógeno en el anillo heterocíclico no son halógeno; o

Ri es alquilo C1-C4;

R9 se selecciona del grupo que consiste en ciclopropilo, CF3 e i.-Pr;

R11 es alquilo C1-4.

Aspecto 21: El método del aspecto 20, donde dicho inhibidor de HPPD es mesotriona.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD que tiene actividad enzimática de HPPD, donde dicho polinucleótido deriva de una planta y donde dicho polipéptido de HPPD vegetal codificado por dicho polinucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con SEC ID NO: 27 y comprende la secuencia de aminoácidos FEFMAPPQA (SEC ID NO: 58), donde la primera A se sustituye por R, K o N.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, donde la secuencia nucleotídica está optimizada para la expresión en una planta.

3. Un polipéptido codificado por el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, enlazado operablemente a un promotor que dirige la expresión en una planta o célula vegetal.

5. El casete de expresión de la reivindicación 4 que comprende además una secuencia polinucleotídica enlazada operablemente que codifica un polipéptido que confiere un rasgo deseable.

6. El casete de expresión de la reivindicación 5, donde dicho rasgo deseable es la resistencia o tolerancia a un herbicida.

7. El casete de expresión de la reivindicación 6, donde dicho rasgo deseable es la resistencia o tolerancia a un inhibidor de HPPD, glifosato o glufosinato.

8. El casete de expresión de la reivindicación 5, donde dicho polipéptido que confiere un rasgo deseable es un citocromo P450 o una variante del mismo.

9. El casete de expresión de la reivindicación 5, donde dicho polipéptido que confiere un rasgo deseable es una EPSPS (5-enol-pirovil-chiquimato-3-fosfato-sintasa).

10. El casete de expresión de la reivindicación 5, donde dicho polipéptido que confiere un rasgo deseable es una fosfinotricin acetil transferasa.

11. Un vector que comprende un casete de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.

12. Un método para conferir resistencia o tolerancia a un inhibidor de HPPD en una planta, comprendiendo dicho método transformar dicha planta con al menos un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.

13. Una célula vegetal transformada que comprende al menos un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.

14. La célula vegetal de la reivindicación 13, donde dicha célula vegetal es una célula vegetal de haba de soja.

15. Una planta, parte de una planta, o semilla que comprende la célula vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14.