CN117143890A - 用于植物的除草剂耐受性的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术并且提供用于赋予对于原卟啉原氧化酶抑制剂除草剂的耐受性的新型重组DNA分子和工程蛋白。本发明还提供包含所述重组DNA分子的除草剂耐受转基因植物、种子、细胞、和植物部分以及使用其的方法。
Description
本申请是申请日为2016年7月29日、申请号为201680055282.2、发明名称为“用于植物的除草剂耐受性的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年8月3日提交的美国临时申请号62/200,428的优先权益，其公开内容特此以引用的方式整体并入。
序列表的并入
命名为MONS383WO_ST25.txt的文件中含有的序列表通过电子呈递与本文一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表的大小是69.4KB(在MS-WINDOWS中测量)并且创建于2016年7月27日。
背景
发明领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及编码提供对于抑制原卟啉原氧化酶的除草剂的耐受性的酶的重组DNA分子。
相关领域
农业作物生产经常利用使用生物技术的方法创造的转基因性状。异源性基因(还已知为转基因)可引入到植物中以产生转基因性状。转基因在植物中的表达在植物上赋予性状，诸如除草剂耐受性。转基因除草剂耐受性性状的实例包括草甘膦耐受性、草铵膦耐受性、和麦草畏耐受性。随着对于通常使用的除草剂具有抗性的杂草物种增加，本领域中需要新的除草剂耐受性性状。具体感兴趣的除草剂包括抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂，称为PPO除草剂。PPO除草剂提供对除草剂抗性杂草的范围的控制，从而使得赋予对于这些除草剂的耐受性的性状在与一种或多种其他除草剂耐受性性状组合的耕作系统中是特别有用的。
原卟啉原氧化酶在叶绿素和血红素生物合成途径两者中均发挥作用，在所述途径中原卟啉原氧化酶将原卟啉原IX转化为原卟啉IX。在原卟啉IX产生之后，叶绿素和血红素生物合成途径由于并入的金属离子不同而相异(铁用于血红素并且镁用于叶绿素)。此途径的分段跨原核生物和真核生物是保守的，并且跨原核生物和真核生物存在的许多PPO酶是相对相似的。一些原核生物(例如，蓝细菌)使用此途径用于叶绿素和血红素产生，而其他原核生物(例如，大肠杆菌)使用此途径用于血红素产生。
除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶(“iPPO”)已从多种原核生物和真核生物分离。在结构基础上，认为存在PPO酶的至少三种不同亚类：HemY(Hansson和Hederstedt，“Cloningand characterization of the Bacillus subtilis hemEHY gene cluster,whichencodes protoheme IX biosynthetic enzymes”Journal of Bacteriology 174(24):8081-8093(1992))、HemG(Sasarman等人，“Mapping of a new hem gene in Escherichiacoli K12”Microbiology 113:297-303(1979))、以及HemJ(Boynton等人，“Discovery of agene involved in a third bacterial protoporphyrinogen oxidase activitythrough comparative genomic analysis and functional complementation”Appliedand Environmental Microbiology 77(14):4795-4801(2011))。本发明提供是HemG家族成员的新型重组iPPO。尽管经过二十年的研究并且目前为止识别到多种iPPO，包含重组iPPO的转基因作物植物仍未商业化。强大的杂草控制平台部分地依赖于除草剂耐受性性状组的连续发展。识别并利用iPPO以创造转基因作物性状因此表示农业的进步。
发明概述
在一方面，本发明提供一种重组DNA分子，其包含可操作地连接到与选自SEQ IDNO:1-20的多肽序列具有至少85％序列同一性的编码多肽的核酸序列的异源性启动子，其中所述多肽具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。在某些实施方案中，所述多肽与选自SEQ ID NO:1-20之间的多肽序列具有至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、或至少99％序列同一性并且具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。在一些实施方案中，提供一种重组DNA分子，其中所述核酸序列选自由SEQ ID NO:22-63组成的组。在具体实施方案中，所述重组DNA分子编码包含选自由SEQ ID NO:1-20组成的组的氨基酸序列的多肽。因此本发明提供一种与选自SEQ ID NO:1-20之间的氨基酸序列的全长具有至少85％序列同一性的重组多肽，其中所述多肽具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。
在某些实施方案中，异源性启动子，例如在植物细胞中具有功能性的启动子可操作地连接到与本发明的多肽序列，例如选自SEQ ID NO:1-20的多肽序列具有至少85％序列同一性的编码多肽的核酸序列，其中所述多肽具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。此所得的DNA分子还可包含作用来定位细胞内的所述多肽的靶向序列。
在一方面，本发明提供一种包含本发明的重组DNA分子的DNA构建体。在一个实施方案中，此DNA构建体包含与本发明的核酸序列可操作地连接的作用来定位细胞内的所述多肽的靶向序列。所述DNA分子可存在于转基因植物、种子、或细胞的基因组中。在某些实施方案中，所述多肽向所述细胞、植物、种子、或植物部分赋予除草剂耐受性。
本发明的另一方面提供一种转基因植物、种子、细胞、或植物部分，其包含本发明的重组DNA分子或本发明的重组多肽。所述转基因植物、种子、细胞、或植物部分因此可具有，即表现对于至少一种PPO除草剂的耐受性。在一些实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞、或植物部分具有额外的转基因除草剂耐受性性状。
本发明的另一方面提供一种用于向植物、种子、细胞、或植物部分赋予除草剂耐受性的方法，其包括：在植物、种子、细胞、或植物部分中异源性地表达本发明的重组多肽。在所述方法的一些实施方案中，所述植物、种子、细胞、或植物部分具有由所述重组多肽赋予的原卟啉原氧化酶活性。在一些实施方案中，所述除草剂耐受性是对于选自由以下组成的组的至少一种PPO除草剂：三氟羧草醚、氟黄胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、炔恶草酮、恶草酮、吡草醚、嘧啶肟草醚以及S-3100。
本发明的另一方面涉及一种植物转化的方法，其包括以下步骤：a)将本发明的重组DNA分子引入到植物细胞中；以及b)从其再生包含所述重组DNA分子的转基因植物。所述方法还可包括选择对于至少一种PPO除草剂耐受的植物的步骤。所述方法还可包括将所再生的植物与其本身或与第二植物杂交并且从所述杂交种采集种子的步骤。
本发明的又一方面提供一种用于控制植物生长区域中的杂草的方法，其包括将包含所述转基因植物或种子的植物生长区域与至少一种PPO除草剂接触，其中所述转基因植物或种子对于所述PPO除草剂耐受并且其中杂草在植物生长区域中受控。
还提供一种识别编码具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列的方法，所述方法包括：a)使用包含编码候选除草剂耐受性蛋白质的重组DNA分子的细菌表达载体转化具有天然大肠杆菌PPO酶的基因敲除的大肠杆菌菌株；以及b)使用不含血红素的细菌培养基生长所述转化的大肠杆菌，其中使用所述细菌培养基的生长识别具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。
本发明还提供的是一种识别编码具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列的方法，所述方法包括：a)使用包含编码重组蛋白的重组DNA分子的细菌表达载体转化具有天然大肠杆菌PPO酶的基因敲除的大肠杆菌菌株；以及b)使用包含至少一种PPO除草剂的细菌培养基生长所述转化的大肠杆菌，其中细菌的生长识别具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。
本发明的另一方面涉及一种筛选除草剂耐受性基因的方法，其包括：a)在植物细胞中表达本发明的重组DNA分子；以及b)识别表现对于PPO除草剂的耐受性的植物细胞。
此外，本发明提供筛选除草剂耐受性基因的方法，其包括：a)在缺少HemG的细菌细胞中表达本发明的重组DNA分子，其中所述细菌细胞在PPO除草剂的存在下在不含血红素的培养基中生长；以及b)识别表现对于PPO除草剂的耐受性的细菌细胞。
在另一方面，本发明提供一种产生对于PPO除草剂和至少另一种除草剂耐受的植物的方法，其包括：a)获得包含本发明的重组DNA分子的植物；b)将所述转基因植物与对于至少另一种除草剂具有耐受性的第二植物杂交，以及c)选择由所述杂交产生的对于PPO除草剂和至少另一种除草剂具有耐受性的子代植物，这是本发明的另一方面。
在另一方面，本发明还提供一种用于减少除草剂耐受杂草的发育的方法，其包括：a)在作物生长环境中培养本发明的例如通过包含本发明的DNA分子对于PPO除草剂具有耐受性并且对于至少另一种除草剂具有耐受性的植物；以及b)向所述作物生长环境施加PPO除草剂和至少另一种除草剂，其中所述作物植物对于所述PPO除草剂和所述至少另一种除草剂耐受。在所述方法的某些实施方案中，所述PPO除草剂可选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟黄胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、炔恶草酮、恶草酮、吡草醚、嘧啶肟草醚以及S-3100。在所述方法的一些实施方案中，所述至少另一种除草剂选自由以下组成的组：ACC酶抑制剂、ALS抑制剂、EPSPS抑制剂、合成生长素、光合作用抑制剂、谷氨酰胺合成抑制剂、HPPD抑制剂、PPO抑制剂、以及长链脂肪酸抑制剂。在具体实施方案中，所述ACC酶抑制剂是芳氧基苯氧基丙酸酯或环己二酮；所述ALS抑制剂是磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、或三唑啉酮；所述EPSPS抑制剂是草甘膦；所述合成生物素是苯氧基除草剂、苯甲酸、羧酸、或缩氨基脲；所述光合作用抑制剂是三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑、或脲；所述谷氨酰胺合成抑制剂是草铵膦；所述HPPD抑制剂是异唑、吡唑啉酮、或三酮；所述PPO抑制剂是二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮、或尿嘧啶；或者所述长链脂肪酸抑制剂是氯乙酰胺、氧乙酰胺、或吡唑。
附图简述
图1.H_N90、H_N20、H_N60、H_N10、H_N30、H_N40、H_N50、H_N70、H_N100、以及H_N110蛋白质序列(SEQ ID NO:1-10)的比对，下面示出共有位置。
图2.在包含所测试的iPPO的大肠杆菌生长8小时处测量PPO除草剂的情况下的来自PPO细菌筛选系统的测定结果。
序列简述
SEQ ID NO:1是H_N90的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是H_N20的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是H_N60的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是H_N10的氨基酸序列，它是大肠杆菌野生型HemG原卟啉原氧化酶(NCBI GenBank登录号WP_021498199)。
SEQ ID NO:5是H_N30的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是H_N40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是H_N50的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是H_N70的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是H_N100的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是H_N110的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:17是分别对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、以及SEQ ID NO:9的缺少起始甲硫氨酸的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19是SEQ ID NO:11的氨基酸变体。
SEQ ID NO:20是SEQ ID NO:17的氨基酸变体。
SEQ ID NO:21是WH的氨基酸序列，它是来自糙果苋(Amaranthus tuberculatus)(水麻)的野生型原卟啉原氧化酶。
SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:31是分别编码SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的核苷酸序列，优化密码子以用于大肠杆菌表达。
SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41是分别编码SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的核苷酸序列，优化密码子以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:48是分别编码SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:17的核苷酸序列，优化密码子以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52分别是SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核苷酸变体。
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:53是编码SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
SEQ ID NO:54至SEQ ID NO:63是分别编码SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的核苷酸序列，优化密码子以用于单子叶植物表达。
详细描述
提供以下描述和定义是为了更好地限定本发明以及指导本领域的普通技术人员实践本发明。除非另外指出，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
本发明提供编码除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶(iPPO)的新型重组DNA分子和蛋白质。例如，在一个实施方案中，本发明提供编码用于在细胞和植物中表达的微生物衍生的iPPO的载体和表达盒。还提供用于产生对于PPO除草剂耐受的细胞和植物的方法。本发明还提供用于使用蛋白质工程和生物信息学工具来获得并改善iPPO的方法和组合物。
在具体方面，本发明提供重组DNA分子和蛋白质。如本文所用，术语“重组的”是指由基因工程引起并且由此通常不存在于自然界中的非天然发生的DNA、蛋白质、细胞、种子、或生物体。“重组DNA分子”是包含在自然界中非天然地发生并且由此由人类干预引起的DNA序列的DNA分子，诸如由彼此异源的至少两个DNA分子构成的DNA分子。重组DNA分子的实例是本文提供的可操作地连接到异源性调节元件或其他元件(诸如异源性启动子)的编码除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶的DNA分子。“重组蛋白”是包含非天然地发生并且由此由人类干预引起的氨基酸序列的蛋白质，诸如工程蛋白或嵌合蛋白。重组细胞、种子、或生物体是包含转基因DNA的细胞、种子、或生物体，例如包含重组DNA分子并且因此由植物转化产生的转基因细胞、种子、植物、或植物部分。
如本文所用，术语“基因工程”是指创造通常不存在于自然界中并且因此需要施加人类干预的非天然DNA、蛋白质、或生物体。基因工程可用于使用生物技术诸如分子生物学、蛋白质生物化学、细菌转化、以及植物转化中的一种或多种技术来在实验室中构想并创造的工程DNA、蛋白质、或生物体。例如，基因工程可用于使用分子生物学的技术诸如基因克隆、DNA连接、和DNA合成中的一种或多种来创造包括彼此异源的至少两个DNA分子的嵌合基因。嵌合基因可由可操作地连接的两个或更多个异源性DNA分子组成，诸如蛋白质编码序列可操作地连接到基因表达元件，诸如转运肽编码序列或异源性启动子。基因工程可用于创造工程蛋白，其多肽序列使用蛋白质工程技术诸如使用定点诱变的蛋白质设计和使用随机诱变和DNA改组的定向进化中的一种或多种来创造。工程蛋白可具有相对于野生型蛋白的编码序列的一个或多个缺失、插入、或取代，并且每个缺失、插入、或取代可由一个或多个氨基酸组成。在另一个实施方案中，工程蛋白可由可操作地连接的两个异源性肽组成，诸如酶可操作地连接到转运肽。
如本文所用，“除草剂不敏感的”意指在一种或多种PPO除草剂的存在下原卟啉原氧化酶(PPO)维持其酶活性中的至少一部分的能力。原卟啉原氧化酶的酶活性可通过本领域已知的任何手段来测量，例如通过其中在一种或多种PPO除草剂的存在下通过荧光、高效液相色谱法(HPLC)、或质谱法(MS)测量原卟啉原氧化酶产物的产生或原卟啉原氧化酶底物的消耗的酶测定来测量。用于测量原卟啉原氧化酶的酶活性的测定的另一个实例是细菌测定，诸如本文所述的生长测定，通过其重组原卟啉原氧化酶在以其他方式缺少PPO活性的细菌细胞中表达并且测量重组原卟啉原氧化酶补充此敲除表型的能力。除草剂不敏感性可以是对于特定除草剂的完全或部分不敏感性，并且可表达为对于特定PPO除草剂的耐受性或不敏感性百分比(％)。如本文所用，“除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶”或“iPPO”在一种或多种PPO除草剂的存在下表现出除草剂不敏感性。
如本文所用，“hemG敲除菌株”意指缺少HemG活性以至于其不能够在不含血红素的生长培养基上生长或使得其生长在血红素不存在下相对于包含功能性HemG的其他同基因菌株可检测地受损的生物体或生物体的细胞，诸如大肠杆菌。例如大肠杆菌的hemG敲除菌株可根据本领域的知识制备，例如根据大肠杆菌hemG序列(Ecogene登录号EG11485；Sasarman等人，“Nucleotide sequence of the hemG gene involved in theprotoporphyrinogen oxidase activity of Escherichia coli K12”Can J Microbiol39:1155-1161，1993)制备。
如本文所用，术语“转基因”是指由于人类干预(诸如植物转化方法)人工地并入到生物体的基因组中的DNA分子。如本文所用，术语“转基因的”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因的植物，并且“转基因性状”是指通过并入到植物基因组中的转基因的存在传达或赋予的特性或表型。由于此基因组改变，转基因植物是与相关野生型植物截然不同的事物，并且转基因性状是非天然地存在于野生型植物中的性状。本发明的转基因植物包含由本发明提供的重组DNA分子和工程蛋白。
如本文所用，术语“异源性的”是指来源于不同的来源并且因此在自然界中通常不相关的两种或更多种物质之间的关系。例如，如果此组合通常不存在于自然界中，则蛋白质编码重组DNA分子相对于可操作地连接的启动子是异源性的。此外，当特定重组DNA分子非天然地发生在细胞、种子、或生物体中时，所述特定重组DNA分子可相对于其所插入的此特定细胞、种子、或生物体是异源性的。
如本文所用，术语“分离的”是指至少部分地将分子与在其天然状态中通常与所述分子缔合的其他分子分开。在一个实施方案中，术语“分离的”是指与在其天然状态中通常侧接DNA分子的核酸分开的DNA分子。例如，如果天然地存在于细菌中的编码蛋白质的DNA分子不在编码蛋白质的所述DNA分子天然地存在于其中的细菌的DNA内，则所述DNA分子是分离的DNA分子。因此，例如由于重组DNA或植物转化技术融合到或可操作地连接到在自然界中不与其缔合的一种或多种其他DNA分子的DNA分子在本文中被认为是分离的。甚至当整合到宿主细胞的染色体中或与其他DNA分子一起存在于核酸溶液中时，此类分子也被认为是分离的。
如本文所用，术语“蛋白质编码DNA分子”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA分子。“蛋白质编码序列”意指编码蛋白质的DNA序列。“序列”意指核苷酸或氨基酸的顺序布置。蛋白质编码序列的边界可由5'末端处的翻译起始密码子和3'末端处的翻译终止密码子确定。蛋白质编码分子可包含编码蛋白质序列的DNA序列。如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”、以及“表达蛋白质”意指通过将DNA分子转录为信使RNA(mRNA)并且将mRNA翻译为多肽链(其最终折叠为蛋白质)的过程产生蛋白质。蛋白质编码DNA分子可操作地连接到DNA构建体中的异源性启动子以用于在使用重组DNA分子转化的细胞中表达所述蛋白质。如本文所用，“可操作地连接”意指两个DNA分子以使得一个DNA分子可影响另一个的功能的方式连接。可操作地连接的DNA分子可以是单一邻接的分子的一部分并且可相邻或可不相邻。例如，启动子与DNA构建体中的蛋白质编码DNA分子可操作地连接，在所述构建体中两个DNA分子布置成使得启动子可影响转基因的表达。
如本文所用，“DNA构建体”是包含两个或更多个异源性DNA序列的重组DNA分子。DNA构建体可用于转基因表达并且可包含在载体和质粒中。DNA构建体可用于载体中以用于转化的目的，即将异源性DNA引入到宿主细胞中，以产生转基因植物和细胞，并且由此还可包含在转基因植物、种子、细胞、或植物部分的质粒DNA或基因组DNA中。如本文所用，“载体”意指可用于细菌或植物转化的目的的任何重组DNA分子。如序列表中所列的重组DNA分子可例如插入到载体中作为构建体的一部分，所述构建体具有可操作地连接到在植物中作用来影响由重组DNA分子编码的工程蛋白的表达的基因表达元件的重组DNA分子。可用于操纵DNA分子以用于制备和使用重组DNA构建体和植物转化载体的一般方法是本领域熟知的并且例如详细描述于包括MR Green和J Sambrook，“Molecular Cloning:ALaboratoryManual”(第四版)ISBN:978-1-936113-42-2，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(2012)的手册和实验室指南中。DNA构建体或包含DNA构建体的载体的组分包括可操作地连接到可转录DNA序列的一个或多个基因表达元件，诸如以下项：用于可操作地连接的DNA、可操作地连接的蛋白质编码DNA分子、和可操作地连接的3’未翻译区(UTR)的表达的启动子。可用于实践本发明的基因表达元件包括但不限于以下类型元件中的一种或多种：启动子、5’UTR、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、靶向序列、3’UTR、以及一个或多个选择性标记物转基因。
本发明的DNA构建体可包含可操作地连接到由本发明提供的蛋白质编码DNA分子的启动子，其中所述启动子驱动重组蛋白分子的表达。可用于实践本发明的启动子包括在细胞中发挥作用以用于可操作地连接的多核苷酸的表达的那些启动子，诸如细菌或植物启动子。植物启动子是不同的并且是本领域熟知的，并且包括例如是诱导型、病毒型、合成型、组成型、时间调节型、空间调节型、和/或时空调控型的那些启动子。
在本发明的一个实施方案中，本文提供的DNA构建体包含可操作地连接到编码具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性的多肽分子的异源性核酸的靶向序列，其中所述靶向序列促进定位细胞内的多肽分子。靶向序列在本领域中已知为信号序列、靶向肽、定位序列、以及转运肽。靶向序列的实例是叶绿体转运肽(CTP)、线粒体靶向序列(MTS)、或双重叶绿体和线粒体靶向肽。通过促进细胞内的蛋白质定位，靶向序列可增加重组蛋白的积聚，保护蛋白质免于蛋白降解，和/或增强除草剂耐受性的水平，并且因此降低除草剂施加之后转基因细胞、种子、或生物体中的损伤水平。
可与本发明结合使用的CTP和其他靶向分子是本领域已知的并且包括但不限于拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP(Klee等人，Mol Gen Genet.210:437-442，1987)、矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等人，PNAS 83:6873-6877，1986)、玉米cab-m7信号序列(Becker等人，Plant Mol Biol.20:49-60，1992；PCT WO 97/41228)、线粒体前序列(例如Silva Filho等人，Plant Mol Biol30:769-780，1996)、以及豌豆谷胱苷肽还原酶信号序列(Creissen等人，Plant J.8:167-175，1995；PCT WO 97/41228)。
本发明的重组RNA分子可通过本领域已知的方法合成并且完全地或部分地修饰，其中希望提供可用于DNA操纵的序列(诸如限制性酶识别位点或基于重组的克隆位点)、植物优选的序列(诸如植物密码子使用或Kozak共有序列)、或可用于DNA构建体设计的序列(诸如间隔子或连接子序列)。本发明包括与本文提供的重组DNA分子或多肽序列中的任一个具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、以及至少99％序列同一性并且具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性的重组DNA分子和工程蛋白。如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“序列同一性％”是指当两个序列最佳地比对时(在比较窗口上适当的核苷酸或氨基酸插入、缺失、或缺口总计小于参考序列的20％的情况下)与测试(“目标”)序列(或其互补链)相比参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或多肽序列中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员熟知的，并且可通过工具诸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法和通过例如使用默认参数的这些算法的计算机化实现方式诸如作为Wisconsin(Accelrys公司，San Diego，CA)、MEGAlign(DNAStar公司，1228S.Park街，Madison，WI 53715)、和MUSCLE(3.6版)(Edgar，“MUSCLE:multiple sequence alignmentwith high accuracy and high throughput”Nucleic Acids Research32(5):1792-7(2004))的序列分析软件包的一部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA来实施。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共享的相同组分的数量除以所比对的参考序列片段的部分中的组分的总数量(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个序列的比较可针对全长序列或其部分或针对更长序列。
工程蛋白可通过改变(即，修饰)野生型蛋白以产生具有修饰的特性的新蛋白质来产生，所述修饰的特性例如特定细胞定位模式(诸如靶向到叶绿体或线粒体)、或可用的蛋白质特性的新型组合(诸如改变的V最大、Km、Ki、IC50)、底物特异性、抑制剂/除草剂特异性、底物选择性、与细胞中的其他组分(诸如伙伴蛋白或膜)相互作用的能力、以及蛋白质稳定性等等。修饰可在蛋白质中的特定氨基酸位置处进行，并且可以是使用不同的氨基酸取代在自然界中(即，在野生型蛋白中)存在于此位置处的氨基酸。由本发明提供的工程蛋白因此提供相对于存在于自然界中的相似蛋白质具有一种或多种改变的蛋白质特性的新蛋白质。在本发明的一个实施方案中，工程蛋白具有改变的蛋白质特性，诸如引起与相似的野生型蛋白相比对于一种或多种除草剂的降低的敏感性、或在表达工程蛋白的转基因植物上赋予对于一种或多种除草剂的除草剂耐受性的改善的能力的那些蛋白质特性。在一个实施方案中，本发明提供一种工程蛋白和编码其的重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自表1的至少一个氨基酸取代并且与本文提供的工程蛋白序列(包括但不限于SEQ ID NO:1-20)中的任一个具有至少约70％序列同一性、约80％序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性、以及约99％序列同一性。氨基酸突变可在蛋白质中作为单个氨基酸取代进行或与一个或多个其他突变(诸如一个或多个其他氨基酸取代、缺失、或添加)组合。突变可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
表1：氨基酸取代。
| 残基 | 保守取代 | 残基 | 保守取代 |
| Ala | Ser | Leu | Ile；Val |
| Arg | Lys | Lys | Arg；Gln |
| Asn | Gln；His | Met | Leu；Ile |
| Asp | Glu | Phe | Met；Leu；Tyr |
| Gln | Asn | Ser | Thr；Gly |
| Cys | Ser | Thr | Ser；Val |
| Glu | Asp | Trp | Tyr |
| Gly | Pro | Tyr | Trp；Phe |
| His | Asn；Gln | Val | Ile；Leu |
| Ile | Leu；Val |
如本文所用，“野生型”意指天然发生的相似的但是不相同的版本。“野生型DNA分子”或“野生型蛋白”是DNA分子或蛋白质的天然发生的版本，即预先存在于自然界中的DNA分子或蛋白质的版本。可用于与由本发明提供的工程蛋白进行比较的野生型蛋白的实例是来自拟南芥的原卟啉原氧化酶。“野生型植物”是与转基因植物相同类型的非转基因植物，并且由此与具有除草剂耐受性性状的转基因植物在遗传上不同。可用于与转基因玉米植物进行比较的野生型植物的实例是非转基因LH244玉米(ATCC保藏号PTA-1173)和01DKD2近交玉米(I294213)(ATCC保藏号PTA-7859)。对于转基因大豆植物，示例性比较株系是非转基因A3555大豆(ATCC保藏号PTA-10207)，并且对于转基因棉花植物，示例性比较株系是非转基因Coker 130(植物品种保护号8900252)。
转基因植物&除草剂
本发明的一方面包括包含由本发明提供的重组DNA分子和工程蛋白的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物、以及转基因种子。包含重组DNA分子和工程蛋白的这些细胞、组织、植物、以及种子表现出对于一种或多种PPO除草剂的除草剂耐受性，并且任选地表现出对于一种或多种额外的除草剂的耐受性。
用于与本发明一起使用的用于转化宿主植物细胞的合适的方法实际上包括可将DNA引入到细胞中(例如，其中将重组DNA构建体稳定地整合到植物染色体中)的任何方法并且是本领域熟知的。用于将重组DNA构建体引入到植物中的示例性的且广泛利用的方法是本领域技术人员熟知的土壤杆菌(Agrobacterium)转化系统。用于将重组DNA构建体引入到植物中的另一种示例性方法是通过定点整合的方法将重组DNA构建体插入到预先确定的位点处的植物基因组中。定点整合可通过本领域已知的任何方法来实现，例如通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、TALE内切核酸酶、或RNA指导的内切核酸酶(例如CRISPR/Cas9系统)来实现。转基因植物可通过植物细胞培养方法从转化的植物细胞再生。相对于转基因纯合的转基因植物(即，转基因的两个等位基因拷贝)可通过将包含单个转基因等位基因的转基因植物与其本身(例如R0植物)进行自花授粉(自交)以产生R1种子来获得。所产生的R1种子的四分之一相对于所述转基因是纯合的。从发芽的R1种子生长的植物可使用SNP测定、DNA测序、或允许杂合子与纯合子之间的差异的热扩增测定针对接合性进行测试，称为接合性测定。
如本文所用，“PPO抑制剂除草剂”或“PPO除草剂”是靶向并抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的酶活性的化学品，所述原卟啉原氧化酶催化原卟啉原IX脱氢以形成原卟啉IX，其是血红素和叶绿素的前体。原卟啉原氧化酶的抑制导致形成反应性氧物质，从而引起细胞膜破裂和最终易感细胞死亡。PPO除草剂是本领域熟知的并且是可商购获得的。PPO除草剂的实例包括但不限于二苯醚(诸如三氟羧草醚、其盐和酯、苯草醚、治草醚、其盐和酯、氟乳醚、其盐和酯、氟除草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、甲氧除草醚、乙羧氟草醚、其盐和酯、乳氟禾草灵、其盐和酯、乙氧氟草醚、以及氟黄胺草醚、其盐和酯)；噻二唑(诸如哒草氟和噻二唑草胺)；吡唑烷二酮或苯基尿嘧啶(诸如双苯嘧草酮、氟丙嘧草酯、乙基[3-2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]醋酸盐(CAS登记号353292-31-6并且本文中称为S-3100)、flupropacil、嘧啶肟草醚、以及tiafenacil)；苯基吡唑(诸如异丙吡草酯、吡草醚和吡草醚)；二唑(诸如炔恶草酮和恶草灵)；三唑啉酮(诸如唑啶草酮、bencarbazone、唑草酮、其盐和酯、以及甲磺草胺)；噁唑烷二酮(诸如环戊草酮)；N-苯基邻苯二甲酰亚胺(诸如吲哚酮草酯、苯氧乙酸、氟烯草酸、以及丙炔氟草胺)；苯并噁嗪酮衍生物(诸如1,5-二甲基-6-硫代-3-(2,2,7-三氟-3,4-二氢-3-氧代-4-丙-2-炔基-2H-1,4-苯并恶嗪-6-基基)-1,3,5-三嗪-2,4-二酮)；氟哒嗪草酯和氟哒嗪草酯-乙基；双唑草腈；以及氟唑草胺。由本发明提供的原卟啉原氧化酶和细胞、种子、植物、以及植物部分表现出对于一种或多种PPO除草剂的除草剂耐受性。
除草剂可施加到包含由本发明提供的植物和种子的植物生长区域作为用于控制杂草的方法。由本发明提供的植物和种子具有除草剂耐受性性状并且由此对于施加一种或多种PPO除草剂耐受。除草剂施加可以是推荐的商业比率(1X)或其任何分数或倍数，诸如推荐的商业比率的两倍(2X)。根据除草剂和配方，除草剂比率可表达为酸当量/磅/英亩(lbae/英亩)或酸当量/克/公顷(g ae/ha)或表达为磅活性成分/英亩(lb ai/英亩)或克活性成分/公顷(g ai/ha)。除草剂施加包括至少一种PPO除草剂。植物生长区域在除草剂施加时可包含或可不包含杂草植物。用于在控制杂草的区域中使用的PPO除草剂的除草有效剂量在生长季节可由范围是约0.1X至约30X标记比率组成。一些示例性PPO除草剂的1X标记比率在表2中提供。一(1)英亩等同于2.47105公顷，并且一(1)英镑等同于453.592克。除草剂比率可如下在英制与公制之间转换：(lb ai/ac)乘以1.12＝(kg ai/ha)并且(kg ai/ha)乘以0.89＝(lb ai/ac)。
表2：示例性PPO除草剂
除草剂施加可与一种、两种PPO除草剂、或若干种PPO除草剂的组合或任何其他相容的除草剂顺序地混合或罐装混合。组合的或单独的一种除草剂或两种或更多种除草剂的多次施加可在生长季节用于包含本发明的转基因植物的区域以用于控制广泛范围的双子叶杂草、单子叶杂草、或两者，例如，两次施加(诸如种植前施加和出苗后施加或出苗前施加和出苗后施加)或三次施加(诸如种植前施加、出苗前施加、和出苗后施加或出苗前施加和两次出苗后施加)。
如本文所用，“耐受性”或“除草剂耐受性”意指植物、种子、或细胞抵抗施加时的除草剂的毒性作用的能力。除草剂耐受作物可继续生长并且不受施加的化学品的存在的影响或最小地受其影响。如本文所用，“除草剂耐受性性状”是将与野生型植物相比的改善的除草剂耐受性赋予到植物的转基因性状。可产生具有本发明的除草剂耐受性性状的涵盖的植物可包括例如任何植物，包括作物植物诸如大豆(例如，大豆(Glycine max))、玉米(玉米(maize))、棉花(棉属(Gossypium sp.))、以及油菜等等。
本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞、以及植物部分还可包含一种或多种额外的性状。额外的性状可通过将包含具有由本发明提供的重组DNA分子的转基因的植物与包含一种或多种额外的性状的另一株植物杂交来引入。如本文所用，“杂交”意指培育两株个体植物以产生子代植物。两株植物因此可杂交以产生包含来自每个亲本的合乎需要的性状的子代。如本文所用的“子代”意指亲本植物的任何代的后代，并且转基因子代包含由本发明提供并且从至少一株亲本植物遗传的DNA构建体。额外的性状也可通过将此额外的转基因性状的DNA构建体与包含由本发明提供的重组DNA分子的DNA构建体(例如，与作为用于植物转化的相同载体的一部分存在的所有DNA构建体)共转化或通过将额外的性状插入到包含由本发明提供的DNA构建体的转基因植物中或反之亦然(例如，通过使用植物转化或在转基因植物或植物细胞上进行基因组编辑的方法中的任一种)来引入。此类额外的性状包括但不限于增加的抗昆虫性、增加的水利用效率、增加的产率性能、增加的抗旱性、增加的种子质量、改善的营养质量、杂种种子产生、以及除草剂耐受性，其中所述性状相对于野生型植物进行测量。示例性额外的除草剂耐受性性状可包括对于一种或多种除草剂的转基因或非转基因耐受性，所述一种或多种除草剂诸如ACC酶抑制剂(例如芳氧基苯氧基丙酸酯和环己二酮)、ALS抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、以及三唑啉酮)、EPSPS抑制剂(例如草甘膦)、合成生长素(例如苯氧基、苯甲酸、羧酸、缩氨基脲)、光合作用抑制剂(例如三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑、以及脲)、谷氨酰胺合成抑制剂(例如草铵膦)、HPPD抑制剂(例如异唑、吡唑啉酮、和三酮)、PPO抑制剂(例如二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮、以及尿嘧啶)、以及长链脂肪酸抑制剂(例如氯乙酰胺、氧乙酰胺、和吡唑)等等。示例性抗昆虫性性状可包括对于鳞翅目、鞘翅目、半翅目、以及同翅目等等中的一个或多个目内的一种或多种昆虫成员的抗性。此类额外的性状是本领域技术人员熟知的；例如，并且此类转基因性状的列表由美国农业部(USDA)动植物卫生检验局(APHIS)提供。
使用本发明的多核苷酸(诸如表达构建体)转化的细胞可在将此细胞再生到转基因植物中之前或之后针对所述多核苷酸或其编码的酶活性的存在进行选择。包含此多核苷酸的转基因植物可因此例如通过识别包含所述多核苷酸或所编码的酶活性和/或表现相对于其他同基因对照植物的改变的性状的转基因植物进行选择。此性状可以是例如对于PPO除草剂的耐受性。
包含由本发明提供的转基因性状的转基因植物和子代可在本领域已知的任何培育方法的情况下使用。在具有两种或更多种转基因性状的植物株系中，转基因性状可在具有三种或更多种转基因性状的植物株系中独立地分离、连接、或两者的组合。还涵盖与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，如无性繁殖。用于不同性状和作物的培育方法的描述是本领域技术人员熟知的。为了确认特定植物或种子中转基因的存在，可执行各种测定。此类测定包括例如分子生物学测定，诸如Southern和northern印迹、PCR、和DNA测序；生物化学测定，诸如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过酶功能进行；植物部分测定，诸如叶或根测定；以及还通过分析整株植物的表型。
将转基因性状渗入到植物基因型中通过回交转换的过程来实现。转基因性状所渗入到的植物基因型可称为回交转换基因型、株系、近交体、或杂交体。相似地，缺少所需转基因性状的植物基因型可称为非转换基因型、株系、近交体、或杂交体。
已详细描述本发明，将显而易见的是，在不脱离所附权利要求书中所限定的本发明的范围的情况下，修改、变型和等效实施方案是可能的。此外，应理解，本公开中的实施例作为非限制性实施例提供。
实施例
包括以下实施例以证明本发明的实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。更具体地，将显而易见的是，在化学上和生理学上均相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时实现相同或相似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替换和修改均被认为是在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
实施例1：微生物原卟啉原氧化酶发现
使用生物信息学方法和新型原卟啉原氧化酶细菌筛选系统从微生物序列数据库识别新型原卟啉原氧化酶。使用大肠杆菌HemG的序列(SEQ ID NO:4)作为起始序列以用于微生物序列数据库的生物信息学分析。生物信息学分析从多种细菌来源识别到HemG PPO家族的三十三种新型推定的原卟啉原氧化酶。使用系统发育树映射比较编码这些推定的HemGPPO酶的序列并且发现是相当多样化的。由于其表示系统发育树上的个体独特的集群成员，从三十三种新型推定的原卟啉原氧化酶的此组选择十种用于进一步分析。
十种所选择的HemG PPO酶的编码序列针对大肠杆菌表达进行优化以消除存在于野生型DNA序列中的任何罕有密码子。然后将十种HemG PPO酶的大肠杆菌优化的编码序列克隆到细菌表达载体中。将天然地存在于水麻(糙果苋)中的除草剂敏感的PPO酶克隆到细菌表达载体中以用作PPO功能和除草剂敏感性两者的对照(称为“WH”并且提供为SEQ IDNO:21；NCBI GenBank登录号ABD52326；Patzoldt等人“A codon deletion confersresistance to herbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidase”Proceedings ofthe National Academy of Science USA.103(33):12329-12334(2006))。水麻PPO酶不是HemG家族成员。将天然地存在于大肠杆菌中的HemG PPO酶克隆到细菌表达载体中以用作PPO活性的对照并且还测定其除草剂敏感性(称为H_N10并且提供为SEQ ID NO:4)。
创建原卟啉原氧化酶细菌筛选系统以针对原卟啉原氧化酶活性测试重组蛋白并且因此确认它们是功能性PPO酶。此筛选系统在包含大肠杆菌PPO酶(SEQ ID NO:4)的基因敲除的大肠杆菌中使用功能性拯救测定。所利用的hemG敲除大肠杆菌菌株在不含血红素的细菌培养基(诸如LB培养基)上显示非常小的生长，但是当细菌培养基增补有游离血红素时或当活性重组原卟啉原氧化酶在大肠杆菌中表达时，生长恢复。hemG敲除大肠杆菌菌株因此可在重组蛋白表达的情况下用于快速地且容易地测定蛋白质的原卟啉原氧化酶活性。
使用包含编码所述十种推定的HemG PPO酶、大肠杆菌HemG PPO酶、和水麻PPO酶的基因的细菌表达载体转化hemG敲除大肠杆菌菌株。然后将细菌在LB培养基板上划线接种，所述LB培养基板是不含血红素的细菌培养基。重组PPO酶的表达拯救大肠杆菌的生长，从而在LB板上引起生长。转化的hemG敲除大肠杆菌菌株在LB板上的生长指示蛋白质序列作为原卟啉原氧化酶发挥作用。十种HemG PPO酶(SEQ ID NO:1-10)和水麻PPO酶(SEQ ID NO:21)在此测定中能够复原转化的hemG敲除大肠杆菌菌株的生长，从而确认其PPO活性。PPO酶的蛋白质序列的比对与共有位置提供为图1。使用此测定，可筛选大量的新型或工程蛋白以确认并测量原卟啉原氧化酶活性。
实施例2：原卟啉原氧化酶抑制剂不敏感性
使用除草剂细菌筛选系统识别对于PPO除草剂耐受的新型原卟啉原氧化酶。此筛选系统使用在具有PPO除草剂的LB液体培养基中的hemG敲除大肠杆菌菌株的生长测定以识别对于PPO除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶。
使用包含确认的原卟啉原氧化酶活性的细菌表达载体转化hemG敲除大肠杆菌菌株并且在LB液体培养基中进行培养。将五种不同的PPO除草剂(三氟羧草醚(1mM)、丙炔氟草胺(0.5mM)、乳氟禾草灵(0.5mM)、氟黄胺草醚(1mM)、以及S-3100(100uM)，表示三种不同的PPO化学亚类)中的一种的纯化结晶形式添加到培养基。表达重组蛋白并且测量大肠杆菌生长速率。从时间零至二十四小时在所选时间点处在PPO除草剂存在和不存在下针对不同变体测量生长曲线(OD600)。在PPO除草剂的存在下转化的hemG敲除大肠杆菌菌株在LB培养基中的生长指示用于转化大肠杆菌的基因编码除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶(iPPO)。
新型原卟啉原氧化酶在此测定的情况下用于针对不敏感性测试PPO除草剂。发现提供为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的十种原卟啉原氧化酶均在PPO除草剂的存在下对LB培养基中的hemG敲除大肠杆菌菌株赋予正常生长速率，从而指示这些蛋白质是除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶(iPPO)(图2)。表达水麻PPO(SEQ ID NO:21)的hemG敲除大肠杆菌菌株对于全部五种PPO除草剂均是敏感的，从而确认所述测定能够在对于除草剂中的每种敏感与不敏感的原卟啉原氧化酶之间进行区分。使用此测定，可筛选大量的新型或工程蛋白以确认在PPO除草剂的存在下的原卟啉原氧化酶活性。
实施例3：原卟啉原氧化酶(PPO)酶测定
以酶方式表征原卟啉原氧化酶来测量每种PPO酶的底物结合亲和力(Km)和对于PPO除草剂的敏感性(IC50)。来自水麻、大豆、和玉米的野生型植物PPO酶用于与微生物HemG原卟啉原氧化酶(提供为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10)进行比较。
通常通过由Grossmann等人(“The Herbicide Saflufenacil(KixorTM)is a NewInhibitor of Protoporphyrinogen IX Oxidase Activity”Weed Science，58(1):1-9(2010))描述的程序从黄化的子叶(大豆，大豆(Glycine max))、黄化的叶/胚芽鞘(玉米，玉米(Zea mays))和伸展的顶叶(水麻，糙果苋)制备黄化质体和叶绿体。在连续黑暗中将大豆(A3555)和玉米(LH244)种子放置在有水的烧杯中的两片湿润的发芽纸(Anchor Paper公司，Saint Paul，Minnesota，USA)之间，持续八至十天。水麻植物在温室中生长30天。采集组织，放置在湿润的纸巾片之间，直至在液氮中使用研杵研磨至细粉为止。将均化缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，500mM蔗糖，1mM EDTA，1mM氯化镁，以及2g/升牛血清白蛋白)在4:1下(ml均化缓冲液比g鲜重组织)添加到冷冻粉末，剧烈混合并且通过四层预润湿的MiraclothTM(Merck-Millipore，Darmstadt，Germany)进行过滤。将滤液在9299g下离心五分钟。将沉淀重悬浮在均化缓冲液中并且在150g下离心两分钟。将上清液在4000g下离心十五分钟。所有的离心步骤在4℃下进行。将沉淀(完整质粒部分)重悬浮在50mM Tris-HCl(pH7.4)、2mM EDTA和20％(v/v)甘油中并且在-80℃下以等分式样保存。通过Bradford方法(MMBradford，“A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utility the principle of protein-dye binding”AnalyticalBiochemistry，72:248-254(1976))测量质粒制备中的总蛋白，以牛血清白蛋白作为标准。
在大肠杆菌hemG敲除细胞系中表达选择的PPO酶。使用来自过夜培养物的细菌细胞接种20ml的新鲜培养基。使这些培养物在20℃下生长大约48小时至高浓度培养物。通过离心采集细菌细胞，并且将细胞沉淀在-80℃下保存，直至执行酶测定为止。将冷冻的细菌沉淀重悬浮在提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.6，1mM EDTA&1mM MgCl2)中并且在冰浴中进行超声处理(Sonics VibraCellTM，Newtown，CT USA)，持续30秒的三个循环，循环之间具有一分钟的休息期。将破碎细胞在4℃下在200g下离心2分钟，并且在使用提取缓冲液稀释之后将上清液用于PPO酶测定。通过Bradford方法(1976)测量总蛋白，以牛血清白蛋白作为标准。
通过使用钠汞齐还原可商购获得的原卟啉来合成原卟啉原IX(protogen)，如由JMJacobs和NJ Jacobs(“Measurement of Protoporphyrinogen Oxidase Activity”inCurrent Protocols in Toxicology(1999)8.5.1-8.5.13，John Wiley&Sons公司)所描述的。将原卟啉(Proto)添加到20％乙醇中的0.01N氢氧化钾并且在黑暗中搅拌直至溶解为止(约40分钟)。将0.8ml的体积放置在具有包括O环的螺旋顶帽的2-ml聚丙烯小瓶中，并且添加约1g(刮刀尖端的量，油排干)的钠汞齐(产品号451908，Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，在油下保存)。立即将管封端并且使用涡旋混合器剧烈混合并且通过松开顶帽约每30秒进行一次排气，直至溶液在UV光下不再发出红色荧光为止(约五分钟)。使用氩气吹扫反应小瓶并且短暂离心以使剩余的钠汞合金沉淀。立即使用0.1M DTT和0.5M Tris-HCl、pH 7.5的溶液1:1(v/v)稀释上清液，并且使用氩气吹扫小瓶。将所得的溶液分成较小的等分式样到0.5ml聚丙烯封端管中，所述管在添加等分式样之后立即使用氩气吹扫。使用铝箔覆盖封端管并且在-80℃下保存。针对酶测定，将protogen等分式样解冻，在冰上覆盖保存，并且在同一天使用。通过从初始材料中的Proto浓度减去如通过荧光HPLC(由Matsumoto等人，“Porphyrin Intermediate Involved in Herbicidal Action of delta-Aminolevulinic Acid on Duckweed(Lemna paucicostata Hegelm.)”PesticideBiochem.and Phys.48:214-221(1994)所描述的方法)测量的最终protogen溶液(通常约1％的初始材料)中的Proto浓度并且假定样品中没有显著的杂质来计算制品中的protogen的浓度。所制备并且在这些条件下保存的Protogen稳定持续至少六个月。
通常如由Grossmann.等人(2010)所描述的测量植物质粒提取物和细菌提取物制品中的PPO活性。将十微升的质粒提取物(40μg总蛋白)或细菌提取物(不同细菌提取物的16至35μg总蛋白)添加到测定缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.4，5mM DTT，1mM EDTA和0.085％(v/v)Tween 80)。作为来自在丙酮中制备的100X储备溶液的两微升体积添加S-3100(还已知为“SYN-523”；例如U.S.Patent Publication US20100062941A1)。分析级S-3100由Sumitomo化学公司提供。全部测定在1％(v/v)丙酮的最终浓度中运行。将提取物(质粒或细菌)、缓冲液、和S-3100在30℃下(植物提取物)或37℃下(细菌提取物)孵育五分钟，之后添加两微升的protogen以启动测定。全部测定在200微升的最终体积下在96孔黑色聚苯乙烯微量滴定板(3925，Corning公司，Corning，New York)中进行。在将protogen(3μM的IC50测量值；Km测量值可变)添加到所有孔之后，将板在30℃下(植物提取物)或37℃下(细菌提取物)孵育，之后启动数据采集。在/>M5多模式微板读取器(MolecularDevices，Sunnyvale，California)中分别在405mm的激发波长和630mm的发射波长的情况下在30℃下(植物提取物)或37℃下(细菌提取物)测量随时间的荧光。通过将加热灭活(在100℃下五分钟)提取物添加到测定混合物来运行测定空白。
原卟啉原氧化酶的底物(原卟啉原)结合亲和力测量为Km。使用动力学软件包(Molecular Devices，Sunnyvale，California)使用等轴双曲线拟合计算评估的每种PPO的表观Km值。对于PPO除草剂S-3100的酶活性敏感性测量为得到对照活性的50％抑制的浓度(IC50)。根据S-3100浓度相对于PPO活性的半对数曲线图在图形上确定评估的每种PPO的S-3100IC50值。
发现来自三种植物来源(水麻、大豆、或玉米)的PPO酶和微生物HemG PPO酶(SEQID NO:1至SEQ ID NO:10)的Km相似，范围是0.3uM至2.0uM。所测试的三种植物PPO酶对于S-3100敏感，分别具有0.009uM、0.004uM、和0.003uM的IC50值。相比之下，来自细菌来源(SEQID NO:1至SEQ ID NO:10)的PPO酶对于S-3100不敏感，具有大于100uM的IC50值。数据在表3中提供。
表3.从植物或微生物来源纯化的酶的PPO酶活性
实施例4：原卟啉原氧化酶的酶优化
蛋白质优化用于改善或改变新型原卟啉原氧化酶的酶特性。蛋白质工程的一种或多种方法用于优化酶。蛋白质工程方法的非限制性实例包括丙氨酸扫描突变；同源性扫描突变；Pro/Gly扫描突变；区域交换或突变(Region Swaps or Mutations)；以及这些各种技术的组合(参见，M Lehmann和M Wyss，Current Opinion in Biotechnology12(4):371-375(2001)；B Van den Burg和VGH Eijsink，Current Opinion in Biotechnology 13(4):333-337(2002)；以及Weiss等人，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 97(16):8950–8954(2000))。合成编码工程原卟啉原氧化酶的DNA序列并且克隆到细菌表达载体中。所述载体用于转化hemG敲除大肠杆菌菌株以用于如实施例1所述的初始高通量细菌拯救筛选。使用如实施例2所述的细菌生长测定针对对于一种或多种PPO除草剂的敏感性筛选拯救hemG敲除大肠杆菌菌株的工程原卟啉原氧化酶。可替代地，在具有或没有PPO除草剂的培养基上铺板转化的hemG敲除大肠杆菌菌株。表现出对于PPO除草剂的耐受性的工程变体在细菌表达系统中表达，并且在如实施例3所述的连续荧光测定的情况下使用纯化蛋白质进行详细生物化学表征。选择对于PPO除草剂不敏感的工程变体以用于克隆到植物转化载体中、植物转化、和植物中测试。
实施例5：玉米中HemG PPO酶的表达和测试
微生物HemG PPO酶在转基因玉米植物中表达，并且针对PPO除草剂耐受性分析转基因植物。构建包含编码提供为SEQ ID NO:1-20的微生物HemG PPO酶中的一种的重组DNA分子的植物转化载体。编码PPO酶的DNA序列可包括在5’末端处的甲硫氨酸的密码子，通常已知为起始密码子，或者可消除此密码子以促进转运肽序列与编码序列的5’末端的可操作连接。在氨基末端处包括甲硫氨酸的PPO酶蛋白序列的实例提供为SEQ ID NO:1-10。在氨基末端处没有甲硫氨酸的PPO酶蛋白序列的实例提供为SEQ ID NO:11-20。针对植物转化，将编码推定的PPO酶的核苷酸序列针对双子叶植物或单子叶植物表达进行密码子优化。表4提供对应于转化载体中的微生物HemG PPO酶的蛋白质和核苷酸序列的SEQ ID NO。
表4.对应于PPO变体的SEQ ID NO
在两种不同的靶向肽(TP)序列和两种不同的3’UTR序列的情况下使用启动子加前导序列加内含子的两种不同组合创造用于表达HemG PPO H_N10(SEQ ID NO:4)的四种植物转化载体。将植物转化构建体注释为构建体1、构建体6、构建体11、以及构建体16。针对玉米植物中测试，使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和本领域已知的标准方法转化未成熟玉米(LH244)胚胎。
使用包含编码HemG PPO H_N10(SEQ ID NO:4)的基因的植物转化构建体6和16产生转基因玉米植物。从R0植物采集叶样品并且通过PCR进行筛选以确定插入到植物基因组中的转基因的拷贝的数量。将包含单拷贝(单拷贝)的植物进行自交和异型杂交以分别生成R1和F1种子以用于未来测试。包含多拷贝(多拷贝)的植物如下进行喷涂：(1)在大约V5生长阶段处5g/ha S-3100，接着在大约V7生长阶段处10g/ha S-3100，总计施加15g/ha S-3100，或者(2)在大约V5生长阶段处10g/ha S-3100。在每个批次的最后处理之后7天在以零为无损伤和100为完全作物死亡的0-100的标度上评定损伤的平均百分比。喷涂的非转基因LH244玉米用作对照并且当使用总计15g/ha S-3100处理(处理1)时显示43.3％的平均损伤并且当使用总计10g/ha S-3100处理(处理2)时显示26.7％的平均损伤。表达HemG H_N10(SEQ ID NO:4)的转基因玉米植物优于对照植物，所述转基因植物当使用总计15g/ha S-3100处理(处理1)时具有28.9％的平均损伤并且当使用总计10g/ha S-3100处理(处理2)时具有24.2％的平均损伤。数据在表5中提供。
表5：转基因玉米除草剂耐受性I
| 处理 | 蛋白质 | 构建体 | 所测试的植物 | 平均损伤 |
| 1 | n/a | 非转基因 | 12 | 43.3 |
| 1 | H_N10 | 6 | 18 | 28.9 |
| 2 | n/a | 非转基因 | 6 | 26.7 |
| 2 | H_N10 | 16 | 12 | 24.2 |
使用包含分别编码HemG PPO酶H_N90(SEQ ID NO:1)、H_N10(SEQ ID NO:4)、H_N60(SEQ ID NO:3)、H_N110(SEQ ID NO:10)、以及H_N40(SQ ID NO:6)的基因的植物转化构建体6、20、21、22、以及23产生转基因玉米植物。这五种构建体具有相同的启动子加前导序列加内含子组合，具有两种不同的靶向肽(TP)序列和相同的3’UTR序列。从R0植物取叶样品并且通过PCR进行分析以确定转基因拷贝数量。将多至12个独特的事件/构建体的单拷贝植物移植到盆，进行自交和异型杂交以分别生成R1和F1种子，以用于未来测试。在大约V5生长阶段处使用40克/ha S-3100喷涂多拷贝植物和额外的单拷贝植物，并且在处理之后7天进行损伤评级。记录表达每种PPO酶的所有植物的平均损伤百分比(％)和认为高度耐受(小于10％损伤)的植物的数量，其中每株植物是独特的单拷贝或多拷贝转化体。表达H_N10(SEQID NO:4)的转基因玉米植物具有39.5％的总体平均损伤并且在所测试的139株植物中产生31株高度耐受的植物。表达H_N60(SEQ ID NO:3)的转基因玉米植物具有55.8％的总体平均损伤并且在所测试的86株植物中产生19株高度耐受的植物。表达H_N90(SEQ ID NO:1)的转基因玉米植物具有31.4％的最低总体平均损伤并且在所测试的99株植物中产生44株高度耐受的植物。表达H_N40(SEQ ID NO:6)的转基因玉米植物具有47.0％的总体平均损伤并且在所测试的98株植物中产生最高比例的高度耐受的植物，具有53株高度耐受的植物。表达H_N110(SEQ ID NO:10)的转基因玉米植物具有43.0％的平均损伤，但是不产生任何高度耐受的植物。数据在表6中提供。
表6：转基因玉米除草剂耐受性II
R0转基因玉米数据证明当在转基因植物中表达时五种微生物HemG PPO酶H_N90(SEQ ID NO:1)、H_N10(SEQ ID NO:4)、H_N60(SEQ ID NO:3)、H_N40(SEQ ID NO:6)、以及H_N110(SQ ID NO:10)产生降低的损伤率，并且因此赋予对于PPO除草剂的作物耐受性。
针对除草剂耐受性在温室中测试从将在两种构建体构型中的一种中表达H_N10(SEQ ID NO:4)的单拷贝R0植物进行异型杂交产生的转基因F1植物。在V3生长阶段处使用40克/ha S-3100处理植物，并且在处理之后七天进行损伤评级。在构建体6构型中表达H_N10(SEQ ID NO:4)的转基因玉米植物在18个事件中引起产生高度耐受的植物(10％或更少损伤)的13个事件，但是构建体16构型不引起产生高度耐受的植物的事件。
针对除草剂耐受性在田间测试从将在两种构建体构型(构建体6和16)中的一种中表达H_N10(SEQ ID NO:4)的单拷贝R0植物进行异型杂交产生的转基因F1植物。分离此F1群体(50％半合子和50％无转基因)，并且在损伤评级之前不实施转基因植物的选择。期待此群体的总体平均损伤评级高于均质转基因群体，因为难以从转基因植物辨别非转基因植物。使用两个平行测定和3个处理/构建体在两个位置处实施试验。非转基因玉米植物用作阴性对照。除草剂施加处理如下进行：处理1是在V2处接着(fb)V4处接着V8处施加0.036lbai/英亩S-3100；处理2：是在V2处接着V4处接着V8处施加0.072lb ai/英亩S-3100；处理3：是在V2处接着V4处接着V8处施加0.144lb ai/英亩S-3100。在处理之后5至7天在V2生长阶段处(CIPV2)和在V4生长阶段处(CIPV4)评定作物损伤百分比评级(误差V2和误差V4是最小显著差数(LSD)的一半)。将两个位置的作物损伤评级组合。所有非转基因植物和具有使用构建体16生成的事件的植物在三个处理中的每个的V2和V4除草剂施加之后均显示94.6％-99.5％之间的损伤。具有使用构建体6生成的事件的植物在V2除草剂施加之后显示仅30％至50％损伤，并且在V4除草剂施加之后显示没有损伤。数据在表7中提供。
表7.包含H_N10(SEQ ID NO:4)的F1玉米的功效田间试验
F1转基因玉米温室和田间数据证明当在转基因植物中表达时微生物HemG PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)产生降低的损伤率并且因此赋予对于PPO除草剂的作物耐受性
实施例6：大豆植物中HemG PPO酶的表达和测试
微生物HemG PPO酶在转基因大豆植物中表达，并且针对PPO除草剂耐受性分析转基因植物。构建包含编码微生物HemG PPO酶中的一种的重组DNA分子的植物转化载体，所述微生物HemG PPO酶提供为H_N10(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:13)；H_N20(SEQ ID NO:12)；H_N30(SEQ ID NO:14)；H_N40(SEQ ID NO:15)；H_N50(SEQ ID NO:16)；H_N90(SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19)；以及H_N100(SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20)。
在大豆中，使用根瘤土壤杆菌和本领域已知的标准方法，使用转化构建体1和11转化离体胚胎(A3555)。转化构建体1和11具有相同的启动子加前导序列加内含子组合、相同的3’UTR序列、相同的微生物HemG PPO H_N10(SEQ ID NO:4)，但是在靶向肽(TP)序列方面不同。再生的R0转基因小植物在温室中生长。使用210g/ha丙炔氟草胺(ValentU.S.A.公司，Walnut Creek CA)喷涂表示由构建体11产生的二十个单拷贝R0大豆事件并且表达微生物PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的植物。在V3发育阶段处为三片完全发育的三叶叶片喷涂除草剂，并且在处理之后8天评定损伤评级。记录认为高度耐受(15％或更少损伤)的植物的百分比。在施加210g/ha丙炔氟草胺之后，非转基因大豆对照植物具有30％的平均损伤评级并且没有高度耐受的植物。表达微生物PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的大豆植物具有22％的平均损伤评级，并且所测试的植物中的9％对于除草剂高度耐受。
使用5g/ha S-3100喷涂表示由构建体11产生的十个多拷贝R0大豆事件并且表达微生物PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的植物。在V3发育阶段处为三片完全发育的三叶叶片喷涂除草剂，并且在处理之后8天进行损伤评级。记录认为高度耐受(25％或更少损伤)的植物的百分比。在施加S-3100(5g/ha)之后，非转基因大豆对照植物具有60％的平均损伤评级并且没有高度耐受的植物。表达微生物PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的大豆植物具有47％的平均损伤评级，并且所测试的植物中的30％对于除草剂高度耐受。
使用三个除草剂施加比率中的一个喷涂温室中的单拷贝转基因R1大豆植物：处理1是在V4处接着(fb)R1处施加5克ai/ha S-3100；处理2是在V4处接着R1处施加10克ai/haS-3100；处理3是在V4处接着R1处施加30克ai/ha S-3100。在处理之后十天评定V2处的作物损伤百分比(CIPV2)评级。非转基因植物具有89％至100％的平均损伤评级，并且在R1生长阶段处对于评级是不可获得的。由构建体1产生并且表达微生物PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的植物具有范围是3％至15.7％的损伤评级。数据在表8中提供。
表8：R1大豆的温室S-3100功效筛选
高通量植物转化和筛选方法用于在早期转化小植物组织中针对除草剂耐受性评估转基因植物中的大量构建体。这实现对构建体构型和PPO酶的更快且更大体积筛选。
编码七种微生物HemG PPO酶H_N10(SEQ ID NO:13)；H_N20(SEQ ID NO:12)；H_N30(SEQ ID NO:14)；H_N40(SEQ ID NO:15)；H_N50(SEQ ID NO:16)；H_N90(SEQ ID NO:11，SEQID NO:18，SEQ ID NO:19)；以及H_N100(SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20)的基因可操作地连接到三十七种不同的靶向肽并且克隆到基础植物转化载体中。这允许使用用于基因表达的相同启动子和3’UTR元件进行七种不同的HemG PPO酶与三十七种不同的靶向肽的并列比较。这些植物转化构建体用于使用根瘤土壤杆菌和本领域已知的标准方法转化大豆离体胚胎(种质A3555)。针对每种构建体接种四百个外植体，从而引起十二个容器/构建体。无菌PPO除草剂溶液用于除草剂耐受性测试。除草剂溶液由作物油浓缩物中的0.3g的S-3100(5.0mL)和495mL的去离子水组成。这通过0.45微米Rapid-FlowTM组织培养物过滤器单元和不含表面活性剂的醋酸纤维素膜过滤器单元(VWR，Radnor，PA，USA)进行过滤。所得的无菌溶液在施加之前进行摇动。
在转化后五周，使用双流程的无菌PPO除草剂溶液喷涂十二个植物容器/构建体中的四个。然后将所处理的小植物封闭在容器中并且在喷涂后每天接受至少15小时的光暴露，持续四天。在S-3100施加后第四天结束时，对所处理的小植物进行照相并且在绿色着色(绿色着色表示与光漂白组织相比的健康光合作用植物组织)相对于损害的视觉标度上进行评分。评分值是：0，针对差耐受性、高损害、低绿色着色；1，针对一定程度的耐受性、平均损害、中度绿色着色；以及2，针对良好耐受性、低损害、高绿色着色。每种构建体的评分呈现在表9中，其中n.d.指示未实施分析。结果指示在此高通量筛选中，大量构建体提供对于PPO除草剂的耐受性。
表9.针对除草剂耐受性的高通量大豆筛选：着色分数
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对应于具有2的分数的构建体的未喷涂容器中的小植物在转化后大约7周进行移植并且使用本领域已知的标准方法生长为R0植物。也生长对应于0和1的非耐受分数的小植物来充当阴性对照。R0植物在长日照苗圃条件下(在80℉下18小时光照，然后在74℉下6小时黑暗)在温室中生长大约四周。在十一周时，使用以上所述的双流程的相同除草剂溶液(0.3g的S-3100)喷涂R0植物。处理之后七天采集除草剂损伤评级。
在十一周时对R0植物的除草剂耐受性施加的结果确认在五周时高通量筛选中观察到的低百分比损伤评级分数。30％或以上的任何损伤评级等同于非转基因大豆损伤评级。一些构建体在提供对于除草剂施加的非常好的耐受性方面表现突出。例如，TP1在PPOH_N90(SEQ ID NO:11)的情况下具有仅3％损伤并且在PPO H_N30(SEQ ID NO:14)或PPO H_N40(SEQ ID NO:15)的情况下具有仅5％损伤；TP20在PPO H_N90(SEQ ID NO:11)的情况下具有仅5％损伤。相比之下，TP32在PPO H_N90(SEQ ID NO:11)的情况下具有50％的损伤分数。数据在表10中提供，其中n.d.指示未实施分析。
表10.R0转基因大豆除草剂耐受性：损伤分数百分比
| 靶向肽 | H_N20 | H_N30 | H_N40 | H_N50 | H_N90 | H_N100 |
| TP1 | n.d. | 5 | 5 | n.d. | 3 | 15 |
| TP2 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 35 | n.d. |
| TP3 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 30 | n.d. |
| TP4 | n.d. | n.d. | 15 | n.d. | n.d. | n.d. |
| TP5 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| TP6 | 25 | n.d. | n.d. | 40 | 25 | 30 |
| TP7 | 20 | n.d. | 40 | n.d. | 15 | 30 |
| TP8 | n.d. | n.d. | 30 | n.d. | 40 | n.d. |
| TP9 | n.d. | 35 | n.d. | 40 | 30 | n.d. |
| TP10 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 30 | 35 |
| TP11 | n.d. | 35 | n.d. | n.d. | 30 | n.d. |
| TP12 | 20 | n.d. | n.d. | n.d. | 30 | 50 |
| TP13 | 20 | n.d. | 15 | 40 | 15 | n.d. |
| TP14 | n.d. | n.d. | 35 | 40 | 25 | n.d. |
| TP15 | 30 | 35 | 30 | 40 | 35 | 30 |
| TP16 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 35 | n.d. |
| TP17 | 25 | n.d. | n.d. | 40 | 15 | n.d. |
| TP18 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 30 | n.d. |
| TP19 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| TP20 | 20 | n.d. | n.d. | n.d. | 5 | 35 |
| TP21 | n.d. | n.d. | 35 | n.d. | 25 | n.d. |
| TP22 | n.d. | n.d. | n.d. | 40 | 30 | 30 |
| TP23 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 30 | 35 |
| TP24 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| TP25 | n.d. | n.d. | 15 | 35 | n.d. | n.d. |
| TP26 | n.d. | 35 | n.d. | n.d. | 40 | n.d. |
| TP27 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 35 | n.d. |
| TP28 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 30 | 35 |
| TP29 | 30 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 40 |
| TP30 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| TP31 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| TP32 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 50 | 40 |
| TP33 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 25 | n.d. |
| TP34 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 35 | n.d. |
| TP35 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 15 | 35 |
| TP36 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | 15 | n.d. |
| TP37 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
为了进一步评估大豆中的植物转化构建体，使用根瘤土壤杆菌和本领域已知的标准方法，使用植物转化载体转化离体胚胎(A3555)。再生的R0转基因小植物在温室中生长并且分成组。使用一种或多种PPO除草剂/组喷涂所述组以评估除草剂耐受性。例如，使用110gai/ha(0.09lb ai/英亩)或220g ai/ha(0.19lb ai/英亩)的比率下的乳氟禾草灵在大约V2-V4生长阶段处喷涂R0转基因植物。在处理之后一至十四天针对损伤对植物进行评估，并且记录损伤分数。叶样品用于识别具有转基因DNA插入片段的单拷贝的转基因植物，并且将包含仅单拷贝并且通过除草剂喷涂测试的R0植物进行自交以产生R1种子。
R1植物在温室中生长并且分成组。使用一种或多种PPO除草剂/组喷涂所述组以评估除草剂耐受性。例如，PPO除草剂乳氟禾草灵在220g ai/ha(0.19lb ai/英亩)的比率下在出苗前和/或在V2至V6生长阶段处施加。在处理之后一至十四天针对损伤对植物进行评估，并且记录损伤分数。未喷涂的转基因植物用于与未喷涂的野生型植物的表型比较。
R2植物通过将纯合的转基因R1植物进行自交并且采集种子来生成。R2植物在一个或多个田间位置处进行评估或以温室测定进行评估。施加除草剂处理，并且在除草剂施加之后一至十四天在以零为无损伤和100为完全作物死亡的0-100的标度上针对作物损伤对曲线图或植物进行估量。
实施例7：叶盘测定
采用叶盘测定以用于表达重组PPO酶的转基因植物的除草剂耐受性的快速且损害最小的评定。从玉米和大豆植物的最嫩的全绿的叶采样叶组织。使用具有柱塞的一次性生物活检打孔器( 公司，York，Pennsylvania)从叶样品切割五个4-mm直径的叶盘，并且将叶盘放置到具有盖子的24孔聚苯乙烯板中的1ml孵育溶液(1mM MES，pH6.5，1％w/v蔗糖，1％(v/v)丙酮)中。针对除草剂耐受性分析，将S-3100添加到孵育溶液至1微摩尔每升的最终浓度。施加真空侵入并且将叶盘的板在室温下(23℃-24℃)在连续黑暗中孵育一天，接着在26℃-27℃下在顶置式荧光灯和白炽灯(520uE)下连续光照孵育一天(大豆)或两天(玉米)。然后在从0(最低损伤)至4(最高损伤)的标度上对叶盘损伤进行视觉地评分，其中较低分数指示对于PPO除草剂的较好耐受性。
来自使用构建体6产生并且表达PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的转基因玉米植物的叶盘显示基于0.4的平均叶盘分数的显著除草剂耐受性。此结果与在使用构建体6转化并且表达PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的整株植物中观察到的PPO除草剂耐受性一致。来自使用构建体1和构建体11产生并且表达PPO酶H_N10(SEQ ID NO:4)的转基因大豆植物的叶盘显示使用构建体1的植物具有显著的除草剂耐受性，损伤评级为零，而使用构建体11的整株植物具有1.6的损伤评级并且非转基因植物具有2.6的损伤评级。
实施例8：棉花中HemG PPO酶的表达和测试
微生物HemG PPO酶在转基因棉花植物中表达，并且针对PPO除草剂耐受性分析转基因植物。在棉花中，使用根瘤土壤杆菌和本领域已知的标准方法，使用这些载体转化离体胚胎(Coker 130)。再生的R0转基因小植物在温室中生长并且分成组。所述组用于喷涂PPO除草剂(一种PPO除草剂/组)以评估耐受性。例如，使用110g ai/ha(0.09lb ai/英亩)或220g ai/ha(0.19lb ai/英亩)的比率下的乳氟禾草灵在大约2-4真叶生长阶段处喷涂R0转基因小植物。在处理之后一至十四天针对损伤对植物进行评估，并且记录损伤分数。叶样品用于识别具有转基因插入片段的单拷贝的转基因植物。将包含仅单拷贝并且通过除草剂喷涂测试的R0植物进行自交以产生R1种子。
R1植物在温室中生长并且分成组。使用一种或多种PPO除草剂/组喷涂所述组以评估除草剂耐受性。例如，PPO除草剂乳氟禾草灵在220g ai/ha(0.19lb ai/英亩)(1X)的比率下在出苗前和/或在两个真叶阶段至第一开花阶段处施加。在处理之后一至十四天针对损伤对植物进行评估，并且记录损伤分数。未喷涂的转基因植物用于与未喷涂的野生型植物的表型比较。
R2植物通过将纯合的转基因R1植物进行自交并且采集种子来生成。R2植物在一个或多个田间位置处进行评估或以温室测定进行评估。施加除草剂处理，并且在除草剂施加之后一至十四天在以零为无损伤和100为完全作物死亡的0-100的标度上针对作物损伤对曲线图或植物进行估量。
Claims (31)
1.一种重组DNA分子，其包含可操作地连接到编码蛋白质的与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少85％序列同一性的核酸序列的异源性启动子：SEQ ID NO:2-10和12-20，其中所述蛋白质具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述核酸序列选自由SEQ ID NO:23-31、33-41、43-48、50-53和55-63组成的组。
3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述蛋白质包含选自由SEQ ID NO:2-10和12-20组成的组的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源性启动子在植物细胞中具有功能性。
5.如权利要求4所述的重组DNA分子，其中所述核酸序列可操作地连接到编码作用来定位细胞内的可操作地连接的蛋白质的靶向序列的DNA分子。
6.一种DNA构建体，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
7.如权利要求6所述的DNA构建体，其中所述重组DNA包括编码作用来定位细胞内的所述蛋白质的靶向序列的可操作地连接的DNA分子。
8.如权利要求7所述的DNA构建体，其中所述蛋白质向所述细胞赋予除草剂耐受性。
9.如权利要求6所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体存在于转基因植物、种子、或细胞的基因组中。
10.一种重组多肽，其与选自SEQ ID NO:2-10和12-20的氨基酸序列的全长具有至少85％序列同一性，其中所述多肽具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。
11.一种转基因植物、种子、细胞、或植物部分，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
12.如权利要求11所述的转基因植物、种子、细胞、或植物部分，其中所述转基因植物、种子、细胞、或植物部分具有额外的转基因除草剂耐受性性状。
13.如权利要求11所述的转基因植物、种子、细胞、或植物部分，其限定为对于至少一种PPO除草剂具有除草剂耐受性。
14.一种如权利要求11所述的种子。
15.一种转基因植物、种子、细胞、或植物部分，其包含如权利要求10所述的重组多肽。
16.一种用于向植物、种子、细胞、或植物部分赋予除草剂耐受性的方法，其包括：在所述植物、种子、细胞、或植物部分中异源性地表达如权利要求10所述的重组多肽。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述植物、种子、细胞、或植物部分具有由所述重组多肽赋予的原卟啉原氧化酶活性。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述除草剂耐受性是对于选自由以下组成的组的至少一种PPO除草剂：三氟羧草醚、氟黄胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、炔恶草酮、恶草酮、吡草醚、嘧啶肟草醚以及S-3100。
19.一种植物转化的方法，其包括以下步骤：
a)将如权利要求1所述的重组DNA分子引入到植物细胞中；以及
b)从其再生包含所述重组DNA分子的植物。
20.如权利要求19所述的方法，其还包括选择对于至少一种PPO除草剂耐受的植物的步骤。
21.如权利要求19所述的方法，其还包括将所再生的植物与其本身或与第二植物杂交并且从所述杂交种采集种子的步骤。
22.一种用于控制植物生长区域中的杂草的方法，其包括将包含如权利要求11所述的转基因植物或种子的植物生长区域与至少一种PPO除草剂接触，其中所述转基因植物或种子对于所述PPO除草剂耐受并且其中杂草在所述植物生长区域中受控。
23.一种识别编码具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使用包含编码候选除草剂耐受性蛋白质的重组DNA分子的细菌表达载体转化具有天然大肠杆菌PPO酶的基因敲除的大肠杆菌菌株；以及
b)使用不含血红素的细菌培养基生长所述转化的大肠杆菌，其中使用所述细菌培养基的生长识别具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。
24.一种识别编码具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)使用包含编码重组蛋白的重组DNA分子的细菌表达载体转化具有天然大肠杆菌PPO酶的基因敲除的大肠杆菌菌株；以及
b)使用包含至少一种PPO除草剂的细菌培养基生长所述转化的大肠杆菌，其中细菌的生长识别具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。
25.一种筛选除草剂耐受性基因的方法，其包括：
a)在植物细胞中表达如权利要求1所述的重组DNA分子；以及
b)识别表现对于PPO除草剂的耐受性的植物细胞。
26.一种筛选除草剂耐受性基因的方法，其包括：
a)在缺少HemG的细菌细胞中表达如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述细菌细胞在PPO除草剂的存在下在不含血红素的培养基中生长；以及
b)识别表现对于PPO除草剂的耐受性的细菌细胞。
27.一种产生对于PPO除草剂和至少另一种除草剂耐受的植物的方法，其包括：
a)获得如权利要求11所述的植物；以及
b)将所述转基因植物与对于所述至少另一种除草剂具有耐受性的第二植物杂交，以及
c)选择由所述杂交产生的对于PPO除草剂和所述至少另一种除草剂具有耐受性的子代植物。
28.一种用于减少除草剂耐受杂草的发育的方法，其包括：
a)在作物生长环境中培养如权利要求12所述的植物；以及
b)向所述作物生长环境施加PPO除草剂和至少另一种除草剂，其中所述作物植物对于所述PPO除草剂和所述至少另一种除草剂耐受。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述PPO除草剂选自由以下组成的组：三氟羧草醚、氟黄胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、氟噻甲草酯、炔恶草酮、恶草酮、吡草醚、嘧啶肟草醚以及S-3100。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述至少另一种除草剂选自由以下组成的组：ACC酶抑制剂、ALS抑制剂、EPSPS抑制剂、合成生长素、光合作用抑制剂、谷氨酰胺合成抑制剂、HPPD抑制剂、PPO抑制剂、以及长链脂肪酸抑制剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述ACC酶抑制剂是芳氧基苯氧基丙酸酯或环己二酮；所述ALS抑制剂是磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、或三唑啉酮；所述EPSPS抑制剂是草甘膦；所述合成生物素是苯氧基除草剂、苯甲酸、羧酸、或缩氨基脲；所述光合作用抑制剂是三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑、或脲；所述谷氨酰胺合成抑制剂是草铵膦；所述HPPD抑制剂是异唑、吡唑啉酮、或三酮；所述PPO抑制剂是二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮、或尿嘧啶；或者所述长链脂肪酸抑制剂是氯乙酰胺、氧乙酰胺、或吡唑。
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