KR20230166125A - Ppo-억제 제초제에 내성인 ppo 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로, 구체적으로, PPO 억제 제초제에 내성이 있는 PPO 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드는 모티프 "LLLNYI"를 포함하며, 여기서 상기 모티프의 3번 위치에 있는 류신 L이 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, 5번 위치의 티로신 Y가 임의의 다른 아미노산으로 치환된다. 상업용 작물을 포함한 식물에 사용하면 제초제 저항성 특성과 제초제 선택성에 따라 PPO 억제 제초제에 대한 식물 저항성을 크게 향상시켜 잡초 성장을 경제적으로 제어할 수 있다.

Description

PPO-억제 제초제에 내성인 PPO 폴리펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로, 특히, PPO 억제 제초제에 내성을 갖는 PPO 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
잡초는 농업 생산에서 작물 수확량에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나이다.제초제는 잡초 방제를 위한 주요 기술적 수단이다. 제초제 작용 방식은 식물에 대한 제초제 표적 부위에 따라, 미국잡초과학협회 (Weed Science Society of America (weedscience.org))에 의해 28개의 범주로 분류되며, 상기 그룹 14(그룹 14; HRAC 그룹 E)는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase; PPO) 억제제이다(http://www.weedscience.org/).
프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (PPOX, PPX 또는 PPO; EC 1.3.3.4)는 엽록소와 헴(heme)의 합성 경로에서 마지막에 위치한 공통 효소이다. 프로토포르피리노겐 IX(Protoporphyrinogen IX)는 산소 분자가 존재할 때, PPO에 의해 촉매되어 프로토포르피린 IX(Protoporphyrin IX)로 전환된다.
PPO는 식물에서 프로포르피리노겐 옥시다아제(proporphyrinogen oxidase)를 억제하고 반응을 촉매하는 기질 프로토포르피리노겐의 세포내 축적을 초래하는 식물의 중요한 제초제 표적 부위이다. 세포 내 엽록체와 미토콘드리아에 의해 프로토포르피리노겐이 축적되면, O2에 의한 프로포르피리노겐의 비효소성 산화가 발생한다. 빛 조건에서, 비효소성 산화(non-enzymatic oxidation)는 일중항산소 (singlet oxygen)를 생성한다. 일중항산소는 세포 내막 시스템에서 지질 산화를 초래하고, 상기 세포 내막 시스템의 산화 손상을 가져와 식물 세포를 죽인다(Future Med Chem. 2014 Apr; 6(6): 597-599. doi: 10.4155/fmc.14.29).
생물계에서 PPO 효소의 진화 관계는 염기서열 유사성을 연구하여 연구되었고, PPO 효소는 세 가지 범주로 나뉜다: HemG, HemJ, 및 HemY. 대부분의 경우, 단일 종은 상기 범주 중 하나만 보유한다. 그 중, HemG는 일반적으로 γ-프로테오박테리아(γ-proteobacteria)에 분포하고, HemJ는 α-프로테오박테리아(α-proteobacteria)에 분포하여, 다른 프로테오박테리아 및 시아노박테리아로 전달되는 반면, HemY는 진핵생물에서 유일한 PPO 효소이다 (Genome Biol Evol. 2014 Aug;6(8):2141 -55. doi: 10.1093/gbe/evu170).
PPO 유전자는 특정 생물에서 확인되었다. 예를 들어, 당업계에 알려진 상기 유전자로는 담배(nicotiana tabacum)의 PPO1(Genbank ID Y13465) 유전자 및 PPO2 유전자(Genbank ID Y13466), 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 PPO 유전자(Genbank ID D83139), 고초균(Bacillus subtilis)의 HemY 유전자(Genbank ID M97208), 마우스의 PPO 유전자(Genbank ID D45185), 인간의 PPO 유전자(Genbank ID D38537), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 PPO 유전자(Genbank ID Z71381), 대장균(Escherichia coli)의 hemG 유전자(Genbank ID X68660) 등이 있다.
일반적으로, 식물에는 PPO1 및 PPO2로 각각 명명된, 두 종류 이상의 PPO 유전자가 존재하며, 상기 PPO1은 일반적으로, 식물의 엽록체에, PPO2는 식물세포의 미토콘드리아에 위치한다. 그러나, 특정 아마란스과 식물의 PPO2 유전자의 mRNA는 번역 개시 부위(translation initiation sites, TIS)가 다르므로, 길이가 다른 PPO2 폴리펩타이드를 생성한다. 예를 들어, 시금치(Spinacia oleracea L)의 PPO2 유전자는 분자량이 각각 58KD 및 56KD인 두 개의 PPO 단백질을 발현하고, 두 개의 단백질은 길이가 26개의 폴리펩타이드만큼 차이가 있다. 여기서, 길이가 더 긴 단백질은 엽록체에 위치하고, 길이가 짧은 단백질은 미토콘드리아에 위치한다 (J Biol Chem. 2001 Jun 8;276(23):20474-81. doi: 10.1074/jbc.M101140200. Epub 2001 Mar 23).
특정 화합물에 의해 PPO 활성이 억제되면, 엽록소 및 헴의 생성 또한 억제된다. 기질 프로토포르피노겐 IX은 정상적인 포르피린 생합성 경로에서 분리되고, 엽록체에서 빠르게 분리되어 세포질로 들어간다. 프로토포르피리노겐 IX는 프로토포르피린 IX으로 산화되어 세포막에 축적된다. 축적된 프로토포르피린 IX는 빛과 산소 분자의 작용으로 활성도가 높은 일중항산소 (1O2)를 생성하고 세포막을 파괴하여, 식물 세포의 급속한 사멸을 초래한다. PPO를 억제하는 제초제의 사용으로 인해, 특정 PPO 저해 제초제에 내성을 갖는 잡초의 사례가 보고되고 있다 (Pest Manag Sci. 2014 Sep;70(9):1358-66. doi: 10.1002/ps.3728. Epub 2014 Feb 24).
예를 들어, 큰키 물대마(Amaranthus tuberculatus)에서, 제초제 락토펜(lactofen)에 대한 내성은 PPO2L 유전자의 위치 210에서 글리신(ΔG210)이 결실됨으로써 부여된다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Aug 15;103(33):12329-34. doi: 10.1073/pnas.0603137103. Epub 2006 Aug 7).
팔머 아마란스(palmer amaranth (Amaranthus palmeri))에서, 제초제 포메사펜(fomesafen)에 대한 내성은 PPO2 유전자(R98G, R98M)의 위치 98에서 아르기닌이 글라이신 또는 메싸이오닌으로 돌연변이됨으로써 부여된다 (Pest Manag Sci. 2017 Aug;73(8):1559-1563. doi: 10.1002/ps.4581. Epub 2017 May 16).
팔머 아마란스(Amaranthus palmeri)에서, 포메사펜에 대한 내성은 PPO2 유전자의 위치 399에서 글라이신이 알라닌(G399A)으로 돌연변이됨으로써 부여된다 (Front Plant Sci. 2019 May 15;10:568. doi: 10.3389/fpls.2019.00568. eCollection 2019).
돼지풀속(Ambrosia artemisiifolia)에서, 플루미옥사진(flumioxazin)에 대한 내성은 PPO2 유전자(R98L)의 위치 98에서 아르기닌이 류신으로 돌연변이됨으로써 부여된다.
왕바랭이(Eleusine indica)에서, 옥사디아존(oxadiazon)에 대한 내성은 PPO1 유전자(A212T)의 위치 212에서 알라닌이 트레오닌으로 돌연변이됨으로써 부여된다 (Pest Manag Sci. 2020 May;76(5):1786-1794. doi: 10.1002/ps.5703. Epub 2020 Jan 23).
본 발명은 PPO 억제 제초제에 내성이 있는 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 이에 대응하는 식물 게놈, 벡터 구성물, 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하기 위한 식물 세포 또는 식물의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 식물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 식물이 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선할 수 있도록 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 식물의 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 숙주세포, 식물세포, 식물 문제(plant issue), 식물 부분 또는 식물의 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하기 위한 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리 활성 단편 또는 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식물 재배지의 잡초를 방제하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 일부 용어는 다음과 같이 정의된다.
본 발명에서, 용어 "제초제"는 식물의 성장을 사멸, 제어, 또는 기타 불리하게 변형시킬 수 있는 활성 성분을 의미한다. "제초제 내성(herbicide tolerance)" 또는 "제초제 저항성(herbicide resistance)"이란, 정상 또는 야생형 식물을 죽이거나 생장을 억제할 수 있거나, 또는 야생형 식물과 비교하여 식물 성장 능력을 약화시키거나 중단시키는 제초제를 처리한 후에도 식물이 계속 자라는 상황을 의미한다. 상기 제초제에는 피리미딘디온(pyrimidinediones), 디페닐에테르(diphenyl-ethers), 페닐피라졸(phenylpyrazoles), N-페닐프탈리미드(N-phenylphthalimides), 티아디아졸(thiadiazoles), 옥사디아졸(oxadiazoles), 트리아졸리논(triazolinones), 옥사졸리딘디온(oxazolidinediones) 및 기타 화학구조가 다른 제초제로 나눌 수 있는 PPO-억제 제초제가 포함된다.
일반적으로, 본 발명에 기술되고 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 PPO-억제 제초제 및/또는 다른 제초제 화합물이 E/Z 이성질체와 같은 기하 이성질체를 형성할 수 있는 경우, 둘 다 그 자체로 순수한 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명에 따른 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명에 기술된 바와 같이 PPO 억제 제초제 및/도는 다른 제초제 화합물이 하나 이상의 키랄성 중심(centers of chirality)을 가지며, 결과적으로 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체로서 존재하는 경우, 둘 다 그자체로 순수한 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명에 따른 조성물에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 PPO 저해 제초제 및/또는 기타 제초제 화합물이 이온화 가능한 작용기를 갖는 경우, 농업적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 일반적으로 상기 양이온과 음이온이 각각 활성 화합물의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 양이온의 염과 산의 산 부가염이 적합하다. 바람직한 양이온은 알칼리 금속, 바람직하게 리튬, 나트륨 및 칼륨의 이온, 알칼리 토금속, 바람직하게 칼슘 및 마그네슘의 이온, 및 전이금속, 바람직하게 망간, 구리, 아연 및 철의 이온, 수소원자 1개 내지 4개가 C1-C4-알킬, 하이드록시-C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시-C1-C4-알킬, 하이드록시-C1-C4-알콕시-C1-C4-알킬, 페닐 또는 벤질로 추가된 암모늄 및 치환된 암모늄, 바람직하게, 암모늄, 메틸-암모늄, 아이소프로필-암모늄, 디메틸-암모늄, 다이아이소프로필-암모늄, 트리메틸-암모늄, 헵틸-암모늄, 도데실-암모늄, 테트라데실-암모늄, 테트라메틸-암모늄, 테트라에틸-암모늄, 테트라부틸-암모늄, 2-하이드록시에틸-암모늄(올라민염), 2-(2-히드록시에틸-1-옥시)에틸-1-암모늄(다이글라이콜아민염), 다이(2-히드록시에틸-1-)암모늄(다이올라민염), 트리스(2-히드록시에틸)암모늄 (트롤라민염), 트리스(2-히드록시프로필)암모늄, 벤질트리메틸암모늄, 벤질트리에틸암모늄 및 N,N,N-트리메틸에탄올암모늄 (콜린염), 추가적으로 포스포늄 이온, 설포늄 이온, 바람직하게는 트리(C1-C4-알킬)설포늄, 예를 들어 트리메틸설포늄, 및 설폭소늄 이온, 바람직하게는 트리(C1-C4-알킬)설폭소늄 이온, 그리고 마지막으로 N,N-비스-(3-아미노프로필)메틸아민 및 디에틸렌트리아민과 같은 다염기성 아민의 염이다. 유용한 산 첨가 염의 음이온은 주로, 염화물, 브롬화물, 불화물, 요오드화물, 황산수소염, 메틸황산염, 황산염, 인산이수소, 인산수소, 질산염, 중탄산염, 탄산염, 헥사플루오로규산염, 헥사플루오로인산염, 벤조산염의 철 및 또한 C1-C4 알칸산의 음이온이고, 바람직하게 포름산염, 초산염, 프로피온산염 및 낙산염의 음이온이다.
카르복실기를 갖는 본 발명에 기술된 PPO-억제 제초제 및/또는 다른 제초제 화합물은 산의 형태, 상술한 바와 같이 농업적으로 적합한 염의 형태 또는 농업적으로 허용되는 유도체 형태로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 모노- 및 다이-C1-C6 알킬아미드 또는 아릴아미드와 같은 아미드, 알릴에스테르, 프로파르길 에스테르, C1-C10-알킬 에스테르, 알콕시 알킬 에스테르, 테퓨릴 ((테트라하이드로푸란-2-일)메틸) 에스테르와 같은 에스테르 및 또한 C1-C10-알킬티오 에스테르와 같은 에스테르가 사용될 수 있다. 바람직한 모노 및 다이-C1-C6-알킬아미드는 메틸 및 디메틸아미드이다. 바람직한 아릴아미드는, 예를 들어, 아닐라이드 및 2-클로로아닐라이드이다. 바람직한 알킬 에스테르는, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 펜틸, 멕실(1-메틸헥실), 멥틸(1-메틸헵실), 헵틸, 옥틸 또는 아이소옥틸(2-에틸헥실) 에스테르이다. 바람직한 C1-C4-알콕시-C1-C4-알킬 에스테르는 직쇄 또는 분지형 C1-C4-알콕시 에틸 에스테르, 예를 들어, 2-메톡시 에틸 에스테르, 2-에톡시 에틸 에스테르, 2-부톡시 에틸 (부토틸)에스테르, 2-부톡시 프로필 에스테르 또는 3-부톡시 프로필 에스테르이다. 직쇄 또는 분지형 C1-C10-알킬티오 에스테르의 예는 에틸티오 에스테르이다.
일 실시예에서, 피리미딘디온(pyrimidinediones) 제초제는 부타페나실(butafenacil) (CAS NO: 134605-64-4), 사플루페나실(saflufenacil) (CAS NO: 372137-35-4), 벤즈펜디존(benzfendizone) (CAS NO: 158755-95-4), 티아페나실(tiafenacil) (CAS NO: 1220411-29-9), [3-[2-클로로-4-플루오로-5-(1-메틸-6-트리플루오로메틸-2,4-다이옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리미딘-3-일)페녹시]-2-피리딜록시]아세트산 에틸 에스테르 (에피리페나실(Epyrifenacil), CAS NO: 353292-31-6), 1-메틸-6-트리플루오로메틸 -3-(2,2,7-트리플루오로-3-옥소-4-프로프-2-이닐-3,4-디하이드로-2H-벤조[1,4]옥사진-6-일)-1H-피리미딘-2,4-다이온 (CAS NO: 1304113-05-0) 3-[7-클로로-5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)-1H-벤즈이미다졸-4-일]-1-메틸- 6-(트리플루오로메틸)-1H-피리미딘-2,4-디온 (CAS NO: 212754-02-4), 플루프로파실(flupropacil) (CAS NO: 120890-70-2), CN105753853A에 공개된 아이소옥사졸린(isoxazoline) 함유 우라실 (예를 들어. 화합물 ), WO2017/202768에 개시된 우라실 피리딘 및 WO2018/019842에 개시된 우라실을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다이페닐-에테르(diphenyl-ethers) 제초제는 포메사펜(fomesafen) (CAS NO: 72178-02-0), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen) (CAS NO: 42874-03-3), 아클로니펜(aclonifen) (CAS NO: 74070-46-5), 락토펜(lactofen) (CAS NO: 77501-63-4), 클로메톡시펜(chlomethoxyfen) (CAS NO: 32861-85-1), 클로르니트로펜(chlornitrofen) (CAS NO: 1836-77-7), 플루오로글리코펜-에틸(fluoroglycofen-ethyl) (CAS NO: 77501-90-7), 아시플루르펜 (acifluorfen) 또는 나트륨염(CAS NO: 50594-66-6 또는 62476-59-9), 비페녹스(bifenox) (CAS NO: 42576-02-3), 에톡시펜(ethoxyfen) (CAS NO: 188634-90-4), 에톡시펜-에틸(ethoxyfen-ethyl) (CAS NO: 131086-42-5), 플루오로니트로펜(fluoronitrofen) (CAS NO: 13738-63-1), 푸릴옥시펜(furyloxyfen) (CAS NO: 80020-41-3), 니트로플루오르펜(nitrofluorfen) (CAS NO: 42874-01-1) 및 할로사펜(halosafen) (CAS NO: 77227- 69-1)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐피라졸(phenylpyrazoles) 제초제는 피라플루펜-에틸(pyraflufen-ethyl) (CAS NO: 129630-19-9) 및 플루아졸레이트(fluazolate) (CAS NO: 174514-07-9를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
N-페닐-이미드(N-Phenyl-imides) 제초제는 플루미옥사진(flumioxazin) (CAS NO: 103361-09-7), 시니돈-에틸(cinidon-ethyl) (CAS NO: 142891-20-1), 플루미프로핀(flumipropyn) (CAS NO: 84478-52-4) 및 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl) (CAS NO: 87546-18-7)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
티아디아졸(thiadiazoles) 제초제는 플루티아세트-메틸(fluthiacet-methyl) (CAS NO: 117337-19-6), 플루티아세트(fluthiacet) (CAS NO: 149253-65-6) 및 티디아지민(thidiazimin) (CAS NO: 123249-43-4)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사디아졸(oxadiazoles) 제초제는 옥사디아르길(oxadiargyl) (CAS NO: 39807-15-3) 및 옥사디아존(oxadiazon) (CAS NO: 19666-30-9)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아졸리논(triazolinones) 제초제는 카르펜트라존(carfentrazone) (CAS NO: 128621-72-7), 카르펜트라존-에틸(carfentrazone-ethyl) (CAS NO: 128639-02-1), 설펜트라존(sulfentrazone) (CAS NO: 122836-35-5), 아자페니딘(azafenidin) (CAS NO: 68049-83-2) 및 벤카바존(bencarbazone) (CAS NO: 173980-17-1)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사졸리딘디온(oxazolidinediones) 제초제는 펜톡사존(pentoxazone) (CAS NO: 110956-75-7)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기타 제초제는 피라클로닐(pyraclonil) (CAS NO: 158353-15-2), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl) (CAS NO: 188489-07-8), 프로플루아졸(profluazol) (CAS NO: 190314-43-3), 트리플루디목사진(trifludimoxazin) (CAS NO: 1258836-72-4), N-에틸-3-(2,6-디클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복사미드 (CAS NO: 452098-92-9), N -테트라히드로푸르푸릴-3-(2,6-디클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복사미드 (CAS NO: 915396-43-9), N-에틸 -3-(2-클로로- 6-플루오로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복사미드 (CAS NO: 452099-05-7), N-테트라히드로푸르푸릴-3-(2-클로로-6-플루오로-4-트리플루오로메틸페녹시) -5-메틸-1H-피라졸-1-카르복스아미드 (CAS NO: 452100-03-7), 3-[7-플루오로-3-옥소-4-(프로프-2-이닐)-3,4-디히드로 - 2H-벤조[1,4]옥사진-6-일]-1,5-디메틸-6-티옥소[1,3,5]트리아지난-2,4-디온 (CAS NO: 451484-50-7), 2 -(2,2,7-트리플루오로-3-옥소-4-프로프-2-이닐-3,4-디히드로-2H-벤조[1,4]옥사진-6-일)-4,5,6,7 -테트라하이드로이소인돌-1,3-디온 (CAS NO: 1300118-96-0), 메틸(E)-4-[2-클로로-5-[4-클로로-5-(디플루오로메톡시)-1H-메틸피라졸-3- 일]-4-플루오로페녹시]-3-메톡시-부트-2-에노에이트 (CAS NO: 948893-00-3), WO2016/120116에 개시된 페닐피리딘(phenylpyridines), EP09163242.2에 개시된 벤조옥사지논(benzoxazinone) 유도체, 및 일반식 I로 표시되는 화합물 (특허 CN202011462769.7 참조)을 포함하나, 이에 제한되지 않고;
또 다른 실시예에서, Q는 , , , , , , , , , , , , , , , , 또는 를 나타내며;
Y는 할로겐, 할로겐화된 C1-C6 알킬 또는 시아노를 나타내고;
Z는 할로겐을 나타내며;
M은 CH 또는 N을 나타내고;
X는 -CX1X2-(C1-C6 알킬)n-, -(C1-C6 알킬)-CX1X2-(C1-C6 알킬)n- 또는 -(CH2)r-를 나타내며, n은 0 또는 1을 나타내고, r은 2보다 크거나 같은 정수를 나타내며;
X1 및 X2는 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 할로겐화 C1-C6 알킬, 할로겐화 C2-C6 알케닐, 할로겐화 C2-C6 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, C3-C6 사이클로알킬 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 알킬설파닐, 하이드록시 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 C1-C6 알킬, 페닐 또는 벤질을 나타내고;
X3 및 X4는 독립적으로 O 또는 S를 나타내며;
W는 하이드록실, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐옥시, C2-C6 알키닐옥시, 할로겐화 C1-C6 알콕시, 할로겐화 C2-C6 알케닐옥시, 할로겐화 C2-C6 알키닐옥시, C3-C6 사이클로알킬옥시, 페녹시, 설피드릴, C1-C6 알킬설파닐, C2-C6 알케닐설파닐, C2-C6 알키닐설파닐, 할로겐화 C1-C6 알킬설파닐, 할로겐화 C2-C6 알케닐설파닐, 할로겐화 C2-C6 알키닐설파닐, C3-C6 사이클로알킬설파닐, 페닐설파닐, 아미노 또는 C1-C6 알킬아미노를 나타낸다.
또 다른 실시예에서, 일반식 I로 표시되는 화합물은 화합물 A로부터 선택된다: Q는 를 나타내고; Y는 염소를 나타내며; Z는 불소를 나타내고; M은 CH를 나타내며; X는 -C*X1X2-(C1-C6 알킬)n-(C*는 키랄 중심, R 배열)을 나타내고, n은 0을 나타내며; X1은 수소를 나타내고; X2는 메틸을 나타내며; X3 및 X4는 독립적으로 O를 나타내고; W는 메톡시를 나타낸다.
본 발명을 수행하는 데 유용한 상술한 PPO-억제 제초제는 종종 하나 이상의 다른 제초제와 함께 가장 잘 적용되어 더 다양한 바람직하지 않은 식생을 방제하는 데 적합하다. 예를 들어, PPO-억제 제초제는 작물 식물이 자연적으로 내성이 있거나, 상술한 바와 같이, 하나 이상의 추가 형질 전환 유전자의 발현을 통해 내성을 갖는 추가 제초제와 함께 사용될 수 있다. 다른 표적 제초제와 함께 사용할 경우, 현재 청구된 화합물은 다른 제초제 또는 제초제들과 함께 배합되거나, 다른 제초제 또는 제초제들과 탱크 혼합되거나, 다른 제초제 또는 제초제들과 순차적으로 적용될 수 있다.
혼합물에 적합한 구성 요소는 예를 들어, 분류 b1) 내지 b15)의 제초제로부터 선택된다:
b1) 지질 생합성 억제제;
b2) 아세토락테이트 합성효소 억제제 (ALS 억제제);
b3) 광합성 억제제;
b4) 프로토포르피리노겐-IX 산화효소 억제제,
b5) 표백제 제초제;
b6) 에놀피루빌 시킴산(shikimate) 3-포스페이트 합성효소 억제제 (EPSP 억제제);
b7) 글루타민 합성효소 억제제;
b8) 7,8-디하이드로프테로에이트 합성효소 억제제(DHP 억제제);
b9) 유사분열 억제제;
b10) 초장쇄 지방산 합성 억제제(VLCFA 억제제);
b11) 셀룰로스 생합성 억제제;
b12) 디커플러 제초제;
b13) 옥신계 제초제;
b14) 옥신 수송 억제제; 및
b15) 브로모부타이드, 클로르플루레놀, 클로르플루레놀-메틸, 신메틸린, 쿠밀루론, 달라폰, 다조메트, 다이펜조콰트, 다이펜조콰트-메틸설페이트, 다이메티핀, DSMA, 딤론, 엔도탈 및 이의 염, 에토벤자니드, 플람프로프, 플람프로프-아이소프로필, 플람프로프-메틸, 플람프로프-M-아이소프로필, 플람프로프-M-메틸, 플루레놀, 플루레놀-부틸, 플루프리미돌, 포사민, 포사민-암모늄, 인다노판, 인다지플람, 말레산 하이드라지드, 메플루이디드, 메탐, 메티오졸린 (CAS NO: 403640-27-7) 메틸 아지드, 메틸 브로마이드, 메틸-딤론, 메틸 아이오다이드, MSMA, 올레산, 옥사지클로메폰, 펠라르곤산, 피리부티카브, 퀴노클라민, 트리아지플람, 트리디판 및 6-클로로-3-(2-사이클로프로필-6-메틸페녹시)-4-피리다지놀 (CAS 499223-49-3) 및 그 염과 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 기타 제초제; 농업적으로 허용되는 염 또는 유도체를 포함함.
또한, PPO-억제 제초제를 상기 기술한 다른 제초 화합물과 함께 사용하는 경우, 완화제와 함께 사용하는 것이 유용할 수 있다. 완화제는 원치 않는 식물에 대한 제초제의 제초 작용에 큰 영향을 주지 않으면서 유용한 식물에 대한 피해를 예방하거나 감소시키는 화합물이다. 완화제는 파종 전(예: 종자 처리, 새싹 또는 묘목) 또는 유용 식물의 출아 전 적용 또는 출아 후 적용에 사용될 수 있다.
더욱이, 완화제, PPO 억제 제초제 및/또는 다른 제초제는 동시에 또는 연속적으로 적용될 수 있다.
PPO-억제 제초제, 그룹 b1)-b15)의 제초 화합물 및 완화제는 각각 공지된 제초제 및 완화제이다, 예를 들어, WO2013/189984; The Compendium of Pesticide Common Names (http://www.alanwood.net/pesticides/); Farm Chemicals Handbook 2000, Volume 86, Meister Publishing Company, 2000; B.Hock, C.Fedtke, R.R.Schmidt, Herbizide [herbicide], Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1995; W.H.Ahrens, Herbicide Handbook, 7th edition, Weed Science Society of America, 1994, and K.K.Hatzios, Herbicide Handbook, supplement to the 7th edition, Weed Science Society of America, 1998 참조;
본 발명이 적용되는 식물은 특별히 제한되지 않으나 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물을 포함한다. 또한, 식물은 초본 식물 또는 목본 식물을 포함한다. 외떡잎 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae, Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과(Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 석장과(Burmanniaceae), 골풀과(Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 벼과(Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과(Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(Cyperaceae), 파초과(Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae), 난초과(Orchidaceae)에 속하는 식물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
쌍떡잎식물은 돌매화나무과(Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 철쭉과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과(Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과(Symplocaceae), 물푸레나무과(Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과(Orobanchaceae), 돌담배과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), 연복초과(Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과(Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과(Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 참나무과(Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과(Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(Polygonaceae), 상육과(Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과(Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과(Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 방기과(Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래과(Actinidiaceae), 차나무과(Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이귀개과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(Cruciferae), 버짐나무과(Platanaceae), 조록나무과(Hamamelidaceae), 돌나물과(Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과(Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과(Sterculiaceae), 팥꽃나무과(Thymelaeaceae), 보리수나무과(Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과(Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과(Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과(Alangiaceae), 층층나무과(Cornaceae), 두릅나무과(Araliaceae), 산형과(Umbelliferae (Apiaceae))에 속하는 식물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 실시예에서, 식물은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: (1) 식량 작물: Oryza spp., like Oryza sativa, Oryza latifolia, Oryza sativa L., Oryza glaberrima; Triticum spp., like Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum; Hordeum spp., like Hordeum vulgare, Hordeum arizonicum; Secale cereale; Avena spp., like Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantine, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida; Echinochloa spp., like Pennisetum glaucum, Sorghum (Sorghum bicolor), Sorghum vulgare, Triticale, Zea mays or corn, Millet, Rice, Foxtail millet, Proso millet, Sorghum bicolor, Panicum, Fagopyrum spp., Panicum miliaceum, Setaria italica, Zizania palustris, Eragrostis tef, Panicum miliaceum, Eleusine coracana; (2) 콩과식물 작물: Glycine spp. like Glycine max, Vicia spp., Vigna spp., Pisum spp., field bean, Lupinus spp., Vicia, Tamarindus indica, Lens culinaris, Lathyrus spp., Lablab, broad bean, mung bean, red bean, chickpea; (3) 오일 작물: Arachis hypogaea, Arachis spp, Sesamum spp., Helianthus spp. like Helianthus annuus, Elaeis like Eiaeis guineensis and Elaeis oleifera, rape, Brassica napus, Sesamum orientale, Brassica juncea, Oilseed rape, Camellia oleifera, oil palm, olive, castor-oil plant, Brassica napus L., canola; (4) 섬유질 작물: Agave sisalana, Gossypium spp. like Gossypium and Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Hibiscus cannabinus, Agave sisalana, Musa textilis Nee, Linum usitatissimum, Corchorus capsularis L, Boehmeria nivea (L.), Cannabis sativa, Cannabis sativa; (5) 과일 작물: Ziziphus spp., Cucumis spp., Passiflora edulis, Vitis spp., Vaccinium spp., Pyrus communis, Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Malus spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp. (strawberry), Crataegus spp., Diospyros spp., Eugenia unifora, Eriobotrya japonica, Dimocarpus longan, Carica papaya, Cocos spp., Averrhoa carambola, Actinidia spp., Prunus amygdalus, Musa spp. (banana), Persea spp. (Persea Americana), Psidium guajava, Mammea Americana, Mangifera indica, Canarium album (Olea europaea), Cocos nucifera, Malpighia emarginata, Manilkara zapota, Ananas comosus, Annona spp., Citrus reticulate (Citrus spp.), Artocarpus spp., Litchi chinensis, Ribes spp., Rubus spp., pear, peach, apricot, plum, red bayberry, lemon, kumquat, durian, orange, blueberry, hami melon, muskmelon, date palm, walnut tree, cherry tree; (6) 뿌리 줄기 작물: Manihot spp., Ipomoea batatas, Colocasia esculenta, tuber mustard, Allium cepa (onion), eleocharis tuberose (water chestnut), Cyperus rotundus, Rhizoma dioscoreae; (7) 채소 작물: Spinacia spp., Phaseolus spp., Lactuca sativa, Momordica spp, Petroselinum crispum, Capsicum spp., Solanum spp. (such as Solanum tuberosum, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum), Lycopersicon spp. (such as Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Kale, Luffa acutangula, lentil, okra, onion, potato, artichoke, asparagus, broccoli, Brussels sprouts, cabbage, carrot, cauliflower, celery, collard greens, squash, Benincasa hispida, Asparagus officinalis, Apium graveolens, Amaranthus spp., Allium spp., Abelmoschus spp., Cichorium endivia, Cucurbita spp., Coriandrum sativum, B.carinata, Rapbanus sativus, Brassica spp. (such as Brassica rapa ssp., canola, turnip rape, leaf mustard, cabbage, black mustard, Brussels sprout, Solanaceae (eggplant), sweet pepper, cucumber, luffa, Chinese cabbage, rape, calabash, Chinese chives, lotus, lotus root, lettuce; (8) 꽃 작물: Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Canna indica, Opuntia spp., Tagetes spp., Cymbidium (orchid), Crinum asiaticum L., Clivia, Hippeastrum rutilum, Rosa rugosa, Rosa Chinensis, Jasminum sambac, Tulipa gesneriana L., Cerasus sp. Pharbitis nil (L.) Choisy, Calendula officinalis L., Nelumbo sp., Bellis perennis L., Dianthus caryophyllus, Petunia hybrida, Tulipa gesneriana L., Lilium brownii, Prunus mume, Narcissus tazetta L., Jasminum nudiflorum Lindl., Primula malacoides, Daphne odora, Camellia japonica, Michelia alba, Magnolia liliiflora, Viburnum macrocephalum, Clivia miniata, Malus spectabilis, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Syzygium aromaticum, Rhododendron simsii, Rhododendron hybridum, Michelia figo (Lour.) Spreng., Cercis chinensis, Kerria japonica, Weigela florida, Fructus forsythiae, Jasminum mesnyi, Parochetus communis, Cyclamen persicum Mill., Phalaenophsis hybrid, Dendrobium nobile, Hyacinthus orientalis, Iris tectorum Maxim, Zantedeschia aethiopica, Calendula officinalis, Hippeastrum rutilum, Begonia semperflorens hybr, Fuchsia hybrida, Begonia maculate Raddi, Geranium; (9) 약용 작물: Carthamus tinctorius, Mentha spp., Rheum rhabarbarum, Crocus sativus, Lycium chinense, Polygonatum odoratum, Polygonatum Kingianum, Anemarrhena asphodeloides Bunge, Radix ophiopogonis, Fritillaria cirrhosa, Curcuma aromatica, Amomum villosum Lour., Polygonum multiflorum, Rheum officinale, Glycyrrhiza uralensis Fisch, Astragalus membranaceus, Panax ginseng, Panax notoginseng, Acanthopanax gracilistylus, Angelica sinensis, Ligusticum wallichii, Bupleurum sinenses DC., Datura stramonium Linn., Datura metel L., Mentha haplocalyx, Leonurus sibiricus L., Agastache rugosus, Scutellaria baicalensis, Prunella vulgaris L., Pyrethrum carneum, Cinchona ledgeriana, Hevea brasiliensis (wild), Piper Nigrum L.; (10) 원료 작물: Hevea brasiliensis, Ricinus communis, Vernicia fordii, Morus alba L., Hops Humulus lupulus, Betula, Alnus cremastogyne Burk., Rhus verniciflua stokes; (11) 목초지 작물: Agropyron spp., Trifolium spp., Miscanthus sinensis, Pennisetum sp., Phalaris arundinacea, Panicum virgatum, prairie grasses, Indiangrass, Big bluestem grass, Phleum pratense, turf, cyperaceae (Kobresia pygmaea, Carexpediformis, Carex humilis), Medicago sativa Linn, Phleum pratense L., Medicago sativa, Melilotus suavcolen, Astragalus sinicus, Crotalaria juncea, Sesbania cannabina, Azolla imbircata, Eichhornia crassipes, Amorpha fruticosa, Lupinus micranthus, Trifolium, Astragalus adsurgens pall, Pistia stratiotes linn, Alternanthera philoxeroides, Lolium; (12) 설탕 작물: Saccharum officinarum (Saccharum spp.), Beta vulgaris; (13) 음료 작물: Camellia sinensis, Camellia Sinensis, tea, Coffee (Coffea spp.), Theobroma cacao, Humulus lupulus Linn.; (14) 잔디 식물: Ammophila arenaria, Poa spp.(Poa pratensis (bluegrass)), Agrostis spp. (Agrostis matsumurae, Agrostis palustris), Lolium spp. (Lolium), Festuca spp. (Festuca ovina L.), Zoysia spp. (Zoysia japonica), Cynodon spp. (Cynodon dactylon/Bermuda grass), Stenotaphrum secunda tum (Stenotaphrum secunda tum), Paspalum spp. (Paspalum notatum), Eremochloa ophiuroides (centipede grass), Axonopus spp. (carpetweed), Bouteloua dactyloides (buffalo grass), Bouteloua var. spp. (Bouteloua gracilis), Digitaria sanguinalis, Cyperus rotundus, Kyllinga brevifolia, Cyperus amuricus, Erigeron canadensis, Hydrocotyle sibthorpioides, Kummerowia striata, Euphorbia humifusa, Viola arvensis, Carexrigescens, Carex heterostachya, turf; (15) 수목 작물: Pinus spp., Salix spp., Acer spp., Hibiscus spp., Eucalyptus spp., Ginkgo biloba, Bambusa sp., Populus spp., Prosopis spp., Quercus spp., Phoenix spp., Fagus spp., Ceiba pentandra, Cinnamomum spp., Corchorus spp., Phragmites australis, Physalis spp., Desmodium spp., Populus, Hedera helix, Populus tomentosa Carr, Viburnum odoratissinum, Ginkgo biloba L., Quercus, Ailanthus altissima, Schima superba, Ilex pur-purea, Platanus acerifolia, ligustrum lucidum, Buxus megistophylla Levl., Dahurian larch, Acacia mearnsii, Pinus massoniana, Pinus khasys, Pinus yunnanensis, Pinus finlaysoniana, Pinus tabuliformis, Pinus koraiensis, Juglans nigra, Citrus limon, Platanus acerifolia, Syzygium jambos, Davidia involucrate, Bombax malabarica L., Ceiba pentandra (L.), Bauhinia blakeana, Albizia saman, Albizzia julibrissin, Erythrina corallodendron, Erythrina indica, Magnolia gradiflora, Cycas revolute, Lagerstroemia indica, coniferous, macrophanerophytes, Frutex, Morus alba L.; (16) 견과류 작물: Bertholletia excelsea, Castanea spp., Corylus spp., Carya spp., Juglans spp., Pistacia vera, Anacardium occidentale, Macadamia (Macadamia integrifolia), Carya illinoensis Koch, Macadamia, Pistachio, Badam, other plants that produce nuts; (17) 기타작물: arabidopsis thaliana, Brachiaria eruciformis, Cenchrus echinatus, Setaria faberi, eleusine indica, Cadaba farinose, algae, Carex elata, ornamental plants, Carissa macrocarpa, Cynara spp., Daucus carota, Dioscorea spp., Erianthus sp., Festuca arundinacea, Hemerocallis fulva, Lotus spp., Luzula sylvatica, Medicago sativa, Melilotus spp., Morus nigra, Nicotiana spp., Olea spp., Ornithopus spp., Pastinaca sativa, Sambucus spp., Sinapis sp., Syzygium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Viola odorata, and the like.
일 구현예에 있어서, 식물은 식물은 벼(Oryza sativa L.), 수수(Sorghum bicolor), 밀(Triticum aestivum), 보리(Hordeum vulgare), 조(Setaria italica), 옥수수(Zea mays), 사탕수수(Saccharum officinarum), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 콩(Glycine max), 땅콩(Arachis hypogaea), 담배(Nicotiana tabacum), 목화(Gossypium hirsutum), 무(Raphanus sativus), 양배추(Brassica oleracea), 고구마(Dioscorea esculenta), 참마(Dioscorea cayenensis), 카사바(Manihot esculenta), 감자(Solanum tuberosum), 토마토(Solanum lycopersicum), 고추(Capsicum annuum), 가지(Solanum melongena), 수박(Citrullus lanatus), 호박(Cucurbita moschata), 오이(Cucumis sativus), 상추(Lactuca sativa), 참깨(Sesamum indicum), 유채(Brassica napus), 해바라기(Helianthus annuus), 뽕나무(Morus alba), 동부콩(Vigna unguiculata), 딸기(Fragaria ananassa), 사과(Malus Domestica), 복숭아 (Prunus persica), 체리 (Prunus pseudocerasus), 살구 (Prunus armeniaca), 포도덩굴 (Vitis vinifera), 파파야 (Carica papaya) 또는 알팔파 (Medicago sativa)이다.
본 발명에 있어서, "식물 조직" 또는 "식물 부분"이라는 용어에는 식물 세포, 원형질체, 식물 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 블록 및 식물 배아, 꽃가루, 난자, 종자, 잎, 줄기, 꽃, 가지, 묘목, 열매, 속, 수상 꽃차례, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥 등을 포함한다.
본 발명에서, "식물 세포"는 예를 들어 캘러스와 같은 미분화 조직, 배아, 식물 부분, 식물 또는 종자와 같은 분화 조직을 형성할 수 있는 식물로부터 유래되거나 식물에서 발견되는 모든 세포를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "숙주 유기체"는 돌연변이 단백질을 코딩하는 핵산이 도입될 수 있는 임의의 단일 또는 다세포 유기체를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 예를 들어 대장균(Eescherichia coli)과 같은 박테리아, 효모(예: 사카로마이세스 세레비지애(saccharomyces cerevisiae)), 곰팡이(예: 아스퍼질러스(aspergillus)), 식물 세포, 식물 등을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 PPO 억제 제초제에 내성을 갖는 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편에 대해 개시하며, 상기 폴리펩타이드는 모티프 "LLLNYI"(즉, "류신-류신-아스파틸-티로신-아이소류신")를 포함하고, 모티프 내의 위치 3의 류신 L이 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, 위치 5의 티로신 Y가 임의의 다른 아미노산으로 치환된다.
일 구현예에 있어서, 상기 모티프 "LLLNYI"에서 위치 3의 류신 L은 세린 S로 돌연변이 되고, "LLSNYI"로 약칭되며; 또는
위치 3의 류신 L은 아이소류신 I로 돌연변이 되고, "LLINYI"로 약칭되며; 또는
위치 3의 류신 L은 글라이신 G로 돌연변이 되고, "LLGNYI"로 약칭되며; 또는
위치 3의 류신 L은 트레오닌 T로 돌연변이 되고, "LLTNYI"로 약칭되며; 또는
위치 3의 류신 L은 발린 V로 돌연변이 되고, "LLVNYI"로 약칭되며; 또는
위치 3의 류신 L은 트립토판 W로 돌연변이 되고, "LLWNYI"로 약칭되며; 또는
위치 5의 타이로신 Y가 메싸이오닌 M으로 돌연변이 되고, "LLLNMI"로 약칭되며; 또는
위치 5의 타이로신 Y가 아이소류신 I로 돌연변이 되고, "LLLNII"로 약칭되며; 또는
위치 5의 타이로신 Y가 류신 L로 돌연변이 되고, "LLLNLI"로 약칭되며; 또는
위치 5의 타이로신 Y가 발린 V으로 돌연변이 되고, "LLLNVI"로 약칭된다.
다른 구현예에 있어서, 모티프 "LLLNYI"내에서, 위치 3의 류신 L은 임의의 다른 아미노산으로 치환되고, 위치 5의 티로신 Y는 임의의 다른 아미노산으로 치환된다.
다른 구현예에 있어서, 모티프 "LLLNYI"내에서 위치 3의 류신 L은 세린 S로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 아이소류신 I로 돌연변이되며, "LLSNII"로 약칭되고; 또는
위치 3의 류신 L은 트레오닌 T로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 아이소류신 I로 돌연변이되며, "LLTNII"로 약칭되고; 또는
위치 3의 류신 L은 트레오닌 T로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 발린 V로 돌연변이되며, "LLTNVI"로 약칭되고; 또는
위치 3의 류신 L은 세린 S로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 발린 V로 돌연변이되며, "LLSNVI"로 약칭되고; 또는
위치 3의 류신 L은 발린 V로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 류신 L로 돌연변이되며, "LLVNLI"로 약칭되고; 또는
위치 3의 류신 L은 트립토판 W로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 류신 L로 돌연변이되며, "LLWNLI"로 약칭된다.
일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 19 중 어느 하나에 규정된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 자유롭게 결합된 아미노산 서열의 돌연변이체 및 상기 돌연변이체 단편을 포함하고, 상기 돌연변이는 상술된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
다른 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 것을 제외하고, 서열번호 1 내지 19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 바람직하게, 폴리펩타이드 아미노산 서열은 상술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 것을 제외하고, 서열번호 1 내지 19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열이다.
다른 구현예에 있어서, 야생형 벼 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 1에 제시된 야생형 벼 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 옥수수 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 2에 제시된 야생형 옥수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 유채 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 3에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 유채 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 4에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 땅콩 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 5에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 땅콩 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 6에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 439 및 441에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 콩 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 7에 제시된 야생형 콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 430 및 432에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 수수 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 8에 제시된 야생형 수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 밀 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 9, 10 또는 11에 제시된 야생형 밀 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 418 및 420에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 토마토 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 12에 제시된 야생형 토마토 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 감자 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 13에 제시된 야생형 감자 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 444 및 446에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 담배 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 14에 제시된 야생형 담배 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 440 및 442에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 애기장대 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 15에 제시된 야생형 애기장대 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 육지면 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 16에 제시된 야생형 육지면 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 426 및 428에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 무 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 17에 제시된 야생형 무 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 425 및 427에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 조 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 18에 제시된 야생형 조 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 422 및 424에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
야생형 양배추 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 19에 제시된 야생형 양배추 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
다른 구현예에 있어서, 야생형 벼 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 1에 제시된 야생형 벼 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L423S, L423I, L423G, Y425M, Y425I 및 Y425V로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L423S/Y425I; 또는
야생형 옥수수 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 2에 제시된 야생형 옥수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L424T, L424S, L424V, Y424W, Y426V, Y426I 및 Y426L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L424T/Y426V, L424S/Y426V, L424V/Y426L, L424W/Y426L 또는 L424S/Y426I; 또는
야생형 유채 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 3에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L424S 및 Y426I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L424S/Y426I; 또는
야생형 유채 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 4에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L423S 및 Y425I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L423S/Y425I; 또는
야생형 땅콩 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 5에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L445S 및 Y447I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L445S/Y447I; 또는
야생형 땅콩 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 6에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 439 및 441에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L439S 및 Y441I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L439S/Y441I; 또는
야생형 콩 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 7에 제시된 야생형 콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 430 및 432에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L430S 및 Y432I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L430S/Y432I; 또는
야생형 수수 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 8에 제시된 야생형 수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L423S 및 Y425I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L423S/Y425I; 또는
야생형 밀 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 9, 10 또는 11에 제시된 야생형 밀 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 418 및 420에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L418S 및 Y420I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L418S/Y420I; 또는
야생형 토마토 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 12에 제시된 야생형 토마토 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L445S 및 Y447I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L445S/Y447I; 또는
야생형 감자 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 13에 제시된 야생형 감자 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 444 및 446에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L444S 및 Y446I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L444S/Y446I; 또는
야생형 담배 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 14에 제시된 야생형 담배 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 440 및 442에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L440S 및 Y442I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L440S/Y442I; 또는
야생형 애기장대 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 15에 제시된 야생형 애기장대 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L423S 및 Y425I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L423S/Y425I; 또는
야생형 육지면 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 16에 제시된 야생형 육지면 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 426 및 428에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L426S 및 Y428I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L426S/Y428I; 또는
야생형 무 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 17에 제시된 야생형 무 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 425 및 427에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L425S 및 Y427I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L425S/Y427I; 또는
야생형 조 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 18에 제시된 야생형 조 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 422 및 424에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L422S 및 Y424I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가지며: L422S/Y424I; 또는
야생형 양배추 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 19에 제시된 야생형 양배추 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치(에만) L424S 및 Y426I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 갖는다: L424S/Y426I.
다른 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 20 내지 48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 가지며, 바람직하게, 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 20 내지 48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열이다.
"모티프" 또는 "합의 서열"이라는 용어는 진화적으로 관련된 단백질의 서열에서 짧게 보존된 영역을 의미한다. 모티프는 흔히 도메인의 고도로 보존된 부분이지만 도메인의 일부만 포함하거나 보존된 도메인 외부에 위치할 수도 있다(모티프의 모든 아미노산이 정의된 도메인 외부에 있는 경우).
"단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"라는 용어는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 아미노산 잔기인 화학적 유사체의 중합체를 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 본 발명의 단백질 및 폴리펩타이드는 재조합적으로 생산되거나 화학적으로 합성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 아미노산 치환에 관한 용어의 경우, 첫 번째 문자는 특정 서열의 특정 위치에 자연적으로 발생하는 아미노산을 나타내고, 다음 숫자는 서열번호 1에 해당하는 위치를 나타내며, 두 번째 문자는 자연적으로 발생하는 아미노산을 대체하는 다른 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, L423S는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 423번 위치의 류신이 세린으로 치환되었음을 나타낸다. 이중 또는 다중 돌연변이의 경우, 각 돌연변이는 "/"로 구분된다. 예를 들어, L423S/Y425I는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 423번째 류신이 세린으로 치환되고, 425번째 티로신이 아이소류신으로 치환되어 두 돌연변이가 특정 돌연변이 OsPPO1 단백질에 모두 존재함을 의미한다.
본 발명의 단백질 내 특정 아미노산 위치(번호)는 표준 서열 정렬 도구, 예를 들어 두 서열을 정렬할 때 사용되는 스미스-워터만 알고리즘(Smith-Waterman algorithm) 또는 CLUSTALW2 알고리즘을 사용하여 관심 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1 또는 서열번호 2 내지 19 등에 정렬함으로써 결정되며, 정렬 점수가 가장 높을 때 서열이 정렬된 것으로 간주된다. 정렬 점수는 Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983), "Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726-730에 개시된 방법에 따라 계산될 수 있다. ClustalW2(1.82) 알고리즘에 사용되는 기본 매개변수는 바람직하게는 단백질 간격 개방 페널티 = 10.0; 단백질 간격 확장 페널티 = 0.2; 단백질 매트릭스 = Gonnet; 단백질/DNA 말단 간격 = -1; 단백질/DNA GAPDIST = 4이다.
바람직하게는, 다중 정렬에 대한 기본 매개변수 (간격 개방 페널티: 10 og, 간격 확장 페널티: 0.05)를 일치시키기 위해 AlignX 프로그램(벡터 NTI 세트의 일부)이 사용되고, 본 발명의 단백질 내의 특정 아미노산의 위치는 서열번호 1의 단백질의 아미노산 서열로 정렬함으로써 결정된다.
아미노산 서열의 동일성은 미국 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 이용 가능한 기본 매개변수와 함께 제공되는 BLAST 알고리즘(Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215:403-10)을 사용하는 통상적인 방법에 의해 결정될 수 있다.
또한 단백질의 활성 및 기능에 악영향을 미치지 않으면서 단백질의 구조를 변경할 수 있다는 것, 예를 들어 단백질 분자의 활성 및/또는 3차원적 구성에 악영향을 미치지 않으면서 단백질의 아미노산 서열에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 도입할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 보존적 아미노산 치환의 예 및 구현예를 알고 있다. 구체적으로, 특정 부위의 아미노산 잔기는 치환하고자 하는 아미노산과 동일한 그룹에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있으며, 즉, 비극성 아미노산 잔기가 다른 비극성 아미노산 잔기로 치환되고, 극성이 하전되지 않은 아미노산 잔기는 다른 극성이 하전되지 않은 아미노산 잔기로 치환되며, 염기성 아미노산 잔기는 또 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환되고, 산성 아미노산 잔기는 산성 아미노산 잔기로 치환된다. 치환이 단백질의 생물학적 활성을 손상시키지 않는 한, 하나의 아미노산이 동일한 그룹에 속하는 다른 아미노산으로 치환되는 보존적 치환은 본 발명의 범위에 속한다.
따라서, 본 발명의 돌연변이 단백질은 상기 돌연변이 외에 아미노산 서열의 보존적 치환 등의 다른 돌연변이를 하나 이상 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 또한 비보존적 치환이 본 발명의 단백질의 원하는 기능 및 생물학적 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 한, 하나 이상의 다른 비보존적 치환을 추가로 함유하는 돌연변이 단백질을 포함한다.
당업계에 널리 공지된 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 잔기는 단백질의 N- 및/또는 C-말단에서 결실될 수 있으며, 단백질은 여전히 기능 및 활성을 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 원하는 기능 및 활성을 유지하면서 돌연변이 단백질의 N- 및/또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여된 단편에 관한 것이다. 본 발명의 범위 내에서, 단편은 생리활성 단편을 의미한다. 본 발명에서, "생리활성 단편"은 본 발명의 돌연변이 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 본 발명의 돌연변이 단백질의 일부를 의미한다. 예를 들어, 돌연변이 단백질의 생리활성 단편은 단백질의 N- 및/또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 25, 1 내지 10 또는 1 내지 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 모이어티가 결여되어 있지만, 여전히 전장 단백질의 원하는 생물학적 활성을 유지하는 생리활성 단편일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이"라는 용어는 정상 서열 또는 야생형 서열 또는 참조 서열에 대한 폴리펩타이드의 단일 아미노산 변이 및/또는 핵산 서열의 최소한의 단일 뉴클레오타이드 변이를 의미한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 제초제 내성이 없는 PPO 단백질의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대한 폴리펩타이드의 단일 아미노산 변이 및/또는 핵산 서열의 최소한의 단일 뉴클레오티드 변이를 의미한다. 특정 구현예에서, 돌연변이는 참조 PPO 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 위치, 예를 들어, 서열 번호 1 내지 19 중 어느 하나에 기재된 바와 같이, 또는 다른 종의 상동 유전자의 상동 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 돌연변이는 치환, 결실, 역전 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환, 결실, 삽입 또는 역전은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환, 결실, 삽입 또는 역전은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다.
"야생형"이라는 용어는 돌연변이와 관련이 있으며, 특정 집단에서 가장 빈도가 높은 표현형 또는 이러한 표현형을 가진 시스템, 유기체 및 유전자를 의미한다. 일부 예에서, 야생형 대립유전자는 유전자좌의 표준 대립유전자, 또는 특정 집단에서 가장 높은 빈도를 갖는 대립유전자를 의미하며, 특정 아미노산 또는 핵산 서열로 표현될 수 있다. 예를 들어, 야생형 벼 PPO 단백질은 서열번호 1로 표시될 수 있다. 예를 들어, 야생형 옥수수 PPO 단백질은 서열번호 2로 표시될 수 있다.
(1) PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 단편을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 부분 서열, 또는 이의 상보적 서열;
(2) 엄격한 조건 하에서 (1)에 나타낸 서열에 혼성화되는 핵산 서열; 및
(3) 유전자 코드의 축퇴로 인해 (1)에 나타낸 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 상보적인 서열.
일 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 분자이다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산", "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"이라는 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 이들의 단편 또는 일부를 지칭하는 데 상호 교환적으로 사용된다. 핵산은 DNA, RNA 또는 이들의 하이브리드를 포함할 수 있으며, 천연 또는 합성 기원일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 mRNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 핵산은 증폭된 핵산(예: 중합효소연쇄반응 사용)을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드에 대한 단일 문자 코드는 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2422, 표 1에 설명되어 있다. 이와 관련하여, 뉴클레오타이드 명칭 "R"은 구아닌 또는 아데닌과 같은 퓨린을 의미하고, "Y"는 사이토신 또는 티민(RNA인 경우 우라실)과 같은 피리미딘을 의미하며; "M"은 아데닌 또는 사이토신을 의미하고; "K"는 구아닌 또는 티민을 의미하며; "W"는 아데닌 또는 티민을 의미한다. 핵산을 지칭할 때, "단리된"이라는 용어는 자연적으로 발생하는 게놈의 상당 부분과 분리되어 있고/있거나 해당 핵산에 자연적으로 수반되는 다른 세포 구성 요소와 실질적으로 분리되어 있는 핵산을 의미한다. 예를 들어, 합성(예: 연속 염기 축합)으로 생산된 임의의 핵산은 분리된 것으로 간주된다. 마찬가지로, 프라이머 확장 반응(예: PCR)에 의해 재조합적으로 발현, 클로닝, 생산되거나 게놈에서 절단된 핵산도 분리된 것으로 간주된다.
유전자 코드의 축퇴성으로 인해 다양한 상이한 핵산 서열이 본원에 개시된 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 동일한 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 생성할 수 있으므로, 본 발명은 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 식물과 같은 숙주 유기체에서 이종 유전자의 높은 발현을 달성하기 위해, 숙주 선호 코돈을 사용하여 유전자를 최적화시켜 발현을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물 게놈을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 식물 게놈은 적어도 하나의 돌연변이로 변형된다. 다른 구현예에 있어서, 식물 게놈은 적어도 2개의 돌연변이로 변형된다.
일 구현예에 있어서, 색소체 PPO 유전자는 벼 색소체 OsPPO1와 같은 식물 게놈 돌연변이에 의해 변형된다. 다른 구현예에 있어서, 색소체 PPO 유전자 대립유전자는 BnPPO1-C5 또는 BnPPO1-A10과 같은 식물 게놈 돌연변이에 의해 변형된다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상동성 또는 비상동성 프로모터를 포함하는 벡터 컨스트럭트을 제공한다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 컨스트럭트을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 숙주 세포는 식물 세포이다.
본 발명은 또한 유전자 편집 방법을 사용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 벡터 컨스트럭트을 식물 세포에서 생산하는 단계, 또는 형질전환 방법을 사용하여 식물세포 에 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 벡터 컨스트럭트을 식물 세포에 도입하는 단계를 포함하는, PPO 억제 제초제에 대한 내성을 획득하거나 개선시키기 위한 식물 세포의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물 세포 또는 상기 방법에의해 생산된 식물 세포를 재생시키는 단계를 포함하는, PPO 억제 제초제에 대한 내성을 획득하거나 개선시키기 위한 식물의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생산된 식물을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 식물 또는 식물 세포는 비형질전환이다.
다른 구현예에 있어서, 상기 식물 또는 식물 세포는 형질전환이다.
"형질전환" 식물이란 용어는 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물을 의미한다. 바람직하게, 이종 폴리뉴클레오타이드는 게놈 내에 안정적으로 통합되어 폴리뉴클레오타이드가 다음 세대로 전달되도록 한다. 이종 폴리뉴클레오타이드는 단독 또는 재조합 발현 카세트의 일부로서 게놈에 통합될 수 있다. "형질전환"은 본 발명에서 다음과 같이 처음에 상기와 같이 변경된 형질전환 유기체 또는 세포 뿐만 아니라 초기 형질 전환 유기체 또는 세포로부터의 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것을 포함하여 이종 핵산의 존재에 의해 유전자형이 변경된 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분 또는 식물을 지칭하는 데 사용된다. 본 발명에 사용된 용어 "형질전환"은 통상적인 식물 육종 방법(예: 교배) 또는 자가 수정, 무작위 교차 수정, 비재조합 바이러스 형질전환, 비재조합 박테리아 형질 전환, 비재조합 전위 또는 자발적 돌연변이와 같은 자연 발생적 사건에 의한 게놈(염색체 또는 염색체 외) 변경을 포함하지 않는다.
"유전자 편집 식물", "유전자 편집 식물 부분" 또는 "유전자 편집 식물 세포"라는 용어는 유전자 편집 시스템을 통해 편집된 하나 이상의 내인성 유전자를 포함하는 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 의미한다.
"유전자 편집 시스템"이라는 용어는 세포에 도입될 때 내인성 DNA 서열의 표적 좌위를 변형시킬 수 있는 단백질, 핵산 또는 이들의 조합을 의미한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 수많은 유전자 편집 시스템은 당업계에 공지되어 있으며, 징크-핑거 뉴클레이즈 시스템(zinc-finger nuclease systems, ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레이즈 시스템(transcription activator-like effector nuclease systems, TALEN) 및 CRISPR/Cas시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 "유전자 편집"이라는 용어는 일반적으로 게놈에 DNA를 삽입, 삭제, 변형 또는 대체하는 기술을 의미한다. 예를 들어, 유전자 편집은 당업자가 사용하는 일반적인 조작 방법일 수 있는 녹인 (Knock-in) 방법을 포함할 수 있다. "Gene Target: A Practical Method"( Edited by Joyner, Oxford University Press, 2000) 참조.
본 발명은 또한 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편을 생성하기 위해 PPO 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자에 변형을 도입하는 단계를 포함하는, 식물이 PPO-억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하도록 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 식물의 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하는 방법을 제공하며, 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 식물에 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리 활성 단편을 발현시키는 단계를 포함하고;
또는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편이 발현되는 식물을 다른 식물과 혼성화하는 단계, 및 PPO-억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선할 수 있는 식물 또는 이의 일부를 스크리닝하는 단계를 포함하고;
또는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편이 발현되도록 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 식물의 PPO 활성을 갖는 단백질을 유전자 편집하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 숙주 세포, 식물 세포, 식물 줄기, 식물 부분 또는 식물이 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하기 위한 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리 활성 단편 또는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 곰팡이 세포이다.
제초제 저항성 PPO 단백질은 당업자에게 널리 알려진 방법을 사용하여 추출 및 정제함으로써 천연 공급원으로부터 얻을 수 있다. 또는, 화학적 합성에 의해 제조된 합성 단백질 또는 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 재조합 단백질로 얻을 수 있다. 화학적으로 합성하는 경우, 당업계에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성 방법을 이용하여 단백질을 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 사용하는 경우, 제초제 저항성 PPO 단백질을 인코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 숙주 세포에 형질 전환시킨 후, 숙주 세포를 배양하여 원하는 단백질을 발현시킨 다음 숙주 세포로부터 제초제 저항성 PPO 단백질을 회수한다. 단백질이 선택된 숙주 세포에서 발현된 후, 예를 들어, 단백질 침전제 처리 (염분 제거), 원심 분리, 초음파 파쇄, 한외 여과, 투석, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 일반적인 생화학 분리 기술이 이의 분리 및 정제에 사용될 수 있다. 일반적으로, 고순도로 단백질을 분리하기 위해 이러한 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
제초제 저항성 PPO 핵산 분자는 표준 분자 생물학적 기술, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 방법을 사용하여 분리되거나 제조될 수 있다. 대안적으로, 시판되는 것을 사용할 수도 있다.
본 발명에서 제공되는 PPO 단백질은 식물에 도입되어 식물의 제초제 저항성 강화에 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 제초제 저항성 PPO 유전자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 식물에 도입될 수 있으며, 식물 형질전환용 발현 벡터를 이용하여 형질전환 또는 유전자 편집될 수 있다.
벡터에 포함될 수 있는 적절한 프로모터는 식물 형질전환 또는 유전자 편집을 위해 당업계에서 일반적으로 사용되는 임의의 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 식물 형질전환 또는 유전자 편집에 일반적으로 사용되는 프로모터는 SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 합성효소(nopaline synthase, nos) 프로모터, 현삼 모자이크 바이러스(figwort mosaic virus) 35S 프로모터, 사탕수수 간균형 바이러스(sugarcane bacilliform virus) 프로모터, 코멜리나 황색 반점 바이러스(commelina yellow mottle virus) 프로모터, 리불로스-1,5-비스포스페이트 탈탄산효소 (ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase, ssRUBISCO)의 작은 서브유닛으로부터의 광유도성 프로모터, 벼 세포질 3탄당인산 이성질화 효소 (triosephosphate isomerase, TPI) 프로모터, 애기장대의 아데닌 포스포리보실 전달효소 (adeninephosphoribosyltransferae, APRT) 프로모터, 옥토핀 합성효소(octopine synthase) 프로모터, BCB(청동결합단백질) 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
식물 형질전환 또는 유전자 편집 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 일으키는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며, 예를 들어, 근두암종균(Agrobacterium tumefaciens)의 노팔린 합성효소 유전자에서 유래한 NOS 3'-말단, 근두암종균의 옥토핀 합성효소 유전자로부터 유래된 옥토핀 합성효소 3'-말단, 토마토 또는 감자의 단백질 분해효소 억제제 I 또는 II 유전자의 3'-말단, CaMVPoly A 신호 서열, 벼 α-아밀라아제 유전자의 3'-말단 및 파세올린(phaseolin) 유전자의 3'-말단을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 형질전환 벡터에서, 엽록체에서 제초제 저항성 PPO 유전자를 발현시키기 위해, PPO 유전자의 5'-말단에 엽록체 표적화에 필요한 수송 펩타이드를 연결시킬 수 있다.
상기 벡터는 리포터 분자로서 선별마커를 인코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 선별마커의 예로는 항생제 (예를 들어, 네오마이신, 카르베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 클로람페니콜 등) 또는 제초제(글리포세이트, 글루포시네이트, 포스피노트리신 등)-내성 유전자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터 형질 전환 방법에는 아그로박테리아 매개 형질 전환, 전기 천공, 미세 입자 충격, 폴리에틸렌 글리콜 매개 흡수 등을 사용하여 재조합 플라스미드를 식물에 도입하는 방법이 포함된다.
본 발명에서 식물 형질전환 수용체에는 식물 세포(현탁배양 세포를 포함), 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 새싹 및 성숙한 식물이 포함된다.
또한, 형질전환 또는 유전자 편집 식물의 범위에는 유전자가 도입된 현대 식물뿐만 아니라 이의 클론 또는 자손(T1 세대, T2 세대 또는 임의의 후속 세대)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 제공된 PPO-억제 제초제에 내성인 PPO 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 트랜스제닉 또는 유전자 편집 식물, 유성 및 무성 생식에 의해 얻어진 상술된 PPO-억제 제초제에 내성인 PPO 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 자손 및 제초제 내성을 유전적으로 지닌 식물도 포함된다. 본 발명의 범위는 또한 상기 형질전환 또는 유전자 편집 식물의 모든 교배 및 융합 산물과 함께 초기 형질전환 또는 유전자 편집 식물의 특성을 나타내는 모든 돌연변이 및 변이체를 포함한다. 또한, 본 발명의 범위는 본 발명의 방법에 의해 미리 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 변형된 식물로부터 유래된 종자, 꽃, 줄기, 열매, 잎, 뿌리, 덩이줄기, 결절근과 같은 식물의 일부 또는 그 자손으로서, 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 변형된 세포의 적어도 일부를 구성하는 것도 포함한다.
본 발명은 또한 제초적 유효량의 PPO-억제 제초제를 재배지에 적용하는 단계를 포함하는, 식물 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공하는데, 상기 식물은 상기 식물 또는 상기 방법에 의해 생산된 식물을 포함한다.
일 구현예에서, 하나의 PPO-억제 제초제는 잡초를 방제하기 위해 사용된다.
다른 구현예에서, 둘 이상의 PPO-억제 제초제는 잡초를 방제하기 위해 순차적으로 또는 평균적으로 사용된다.
다른 구현예에서, PPO-억제 제초제는 하나 이상의 추가 제초제와 조합하여 적용된다.
본 발명에서, "재배지"라는 용어는 토양과 같이 본 발명의 식물이 재배되는 장소를 포함하며, 예를 들어, 식물 종자, 식물 묘목 및 재배된 식물도 포함한다. "제초 유효량"이란, 예를 들어, 대상 잡초의 성장 또는 발달을 방지 또는 억제하거나 잡초를 고사시키는 등, 대상 잡초의 성장 또는 발달에 영향을 미치기에 충분한 제초제의 양을 의미한다. 유리하게는, 상기 제초 유효량은 본 발명의 식물 종자, 식물 묘목 또는 식물의 성장 및/또는 발달에 크게 영향을 미치지 않는다. 당업자는 통상적인 실험을 통해 이러한 제초 유효량을 결정할 수 있다.
본 발명은 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이러한 실시예는 철저하고 완전하며 당업자에게 본 발명의 범위를 완전히 전달할 수 있도록 제공된다. 유사한 참조번호는 전체적으로 유사한 요소를 나타낸다.
본 명세서에서는 다양한 요소 또는 구성요소를 설명하기 위해 "제1", "제2", "제3" 등의 용어가 사용될 수 있지만, 이들 요소 또는 구성요소는 이러한 용어에 의해 제한되어서는 안된다. 이러한 용어는 하나의 요소 또는 구성 요소를 다른 요소 또는 구성 요소와 구별하는 데에만 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 이를 한정하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시되지 않는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용될 때 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)", 또는 "포함한다(includes)" 및/또는 "포함하는(including)"는 용어는 언급된 특징, 요소 및/또는 구성요소의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 요소 또는 구성요소 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 나열된 항목 중 하나 이상의 관련 항목의 모든 조합을 포함한다.
본 발명이 다수의 실시예와 관련하여 상세히 설명되었으나, 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명은 본 명세서에 기재되지 않았으나 본 발명의 범위에 상응하는 임의의 변형, 변경, 치환 또는 이에 상응하는 배열을 포함하도록 수정될 수 있다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다: 돌연변이 형태는 돌연변이 형태를 갖는 PPO에 대한 PPO 억제 제초제의 억제 효과를 감소시킬 수 있지만, 동시에 이러한 돌연변이는 PPO 자체의 촉매 활성을 감소시키지 않는다. PPO 억제 제초제에 대한 식물의 저항성은 유전자 편집에 의해 내인성 PPO를 이러한 돌연변이 형태로 변형시키거나 형질전환 수단에 의해 이러한 PPO 돌연변이 형태를 갖는 유전자를 식물에 도입함으로써 크게 개선될 수 있다. 이러한 PPO 돌연변이 형태는 제초제 저항성 특성 및 제초제 선택성에 따라 상업 작물을 포함한 식물에 사용되어 잡초 성장을 경제적으로 제어할 수 있다.
도 1은 다양한 식물로부터 PPO 아미노산 서열의 정렬을 나타내고, 표시된 박스는 스크리닝 부위에서 보존된 아미노산 모티프를 나타내며, 위에서부터 연속적으로 나타낸다: 벼(Oryza sativa L.), 옥수수(Zea mays), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 콩(Glycine max), 담배(Nicotiana tabacum), 수수(Sorghum bicolor), 토마토(Solanum lycopersicum), 보리(Hordeum vulgare), 유채(Brassica napus), 땅콩(Arachis hypogaea), 밀(Triticum aestivum), 양배추(Brassica oleracea), 조(Setaria italica), 무(Raphanus sativus), 감자(Solanum tuberosum), 육지면(Gossypium hirsutum), 참마(Dioscorea cayenensis), 카사바(Manihot esculenta), 고추(Capsicum annuum), 호박(Cucurbita moschata), 오이(Cucumis sativus), 상추(Lactuca sativa), 참깨(Sesamum indicum), 해바라기(Helianthus annuus), 뽕나무(Morus alba), 동부(Vigna unguiculata), 딸기(Fragaria ananassa), 사과(Malus domestica), 복숭아(Prunus persica), 체리(Prunus pseudocerasus), 살구(Prunus armeniaca), 포도 덩굴(Vitis vinifera), 파파야(Carica papaya), 알팔파(Medicago sativa).
도 2는 pET44a 빈 벡터와 벼 OsPPO1 야생형 유전자(WT)로 형질 전환한 후, 화합물 A를 0 nM, 100 nM, 300 nM 및 1000 nM (나노몰)으로 처리한 PPO 결핍 대장균 (ΔhemG)의 세포 성장 수준을 나타낸다.
도 3은 화합물 A를 0 nM 및 500 nM 농도로 처리하였을 때, OsPPO1 야생형 유전자 (WT로 표시) 또는 다양한 OsPPO1 돌연변이 유전자에 의해 형질전환된 PPO-결핍 대장균 (ΔhemG) 형질전환체의 세포 성장 수준을 나타낸다.
도 4는 화합물 A를 각각 0 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM 및 100 μM 농도로 처리했을 때, OsPPO1 야생형 유전자(WT로 표시) 또는 다양한 OsPPO1 돌연변이 유전자에 의해 변형된 PPO 결핍 대장균(ΔhemG) 형질전환체의 세포 성장 수준을 나타낸다.
도 5는 화합물 A를 각각 0 μM, 5 μM, 50 μM, 100 μM 농도로 처리했을 때, ZmPPO1 야생형 유전자(ZmPPO1-WT로 표시) 또는 다양한 ZmPPO1 돌연변이 유전자에 의해 변형된 PPO 결핍 대장균(ΔhemG) 형질전환체의 세포 성장 수준을 나타낸다.
도 6은 컴파운드 A, 사플루페나실(saflufenacil), 및 플루미옥사진(flumioxazin)과 같은 다양한 PPO 억제 제초제에 대한 다른 작물 내성 부위 조합의 내성 테스트를 나타낸다.
도 7은 에피리페나실(epyrifenacil), 설펜트라존(sulfentrazone) 및 티아페나실(tiafenacil)과 같은 다양한 PPO 억제 제초제에 대한 다른 작물 내성 부위 조합의 내성 테스트를 나타낸다.
도 8은 포메사펜(fomesafen) 및 트리플루디목사진(trifludimoxazin)과 같은 다양한 PPO 억제 제초제에 대한 다른 작물 내성 부위 조합의 내성 테스트를 나타낸다.
도 9는 각각 100 nM 플루미옥사진, 100 nM 옥시플루오르펜, 500 nM 사플루페나실, 5 μM 피라클로닐, 1 μM 카르펜트라존-에틸 및 10 μM 포메사펜으로 처리했을 때, OsPPO1 야생형 유전자(WT로 표시) 또는 다양한 OsPPO1 돌연변이 유전자에 의해 변형된 PPO 결핍 대장균(ΔhemG) 형질전환체의 세포 성장 수준을 나타낸다.
도 10은 돌연변이 효소 활성 측정을 나타낸다. 벼 OsPPO1 야생형(WT로 표시), Y425I, 및 L423S/Y425I의 효소 동역학 곡선 간의 차이도 나타낸다. 효소 활성 L423S/Y425 돌연변이체는 WT보다 높은 반면, 효소 활성 Y425I는 WT보다 낮다.
도 11은 야생형 균주와 비교하여 화합물 A를 9 g/ha의 비율로 처리한 경우, L423S/Y425I 부위에서 상동 대체된 벼 모종 균주의 생육 성능을 나타낸다.
도 12는 다양한 농도의 화합물 A로 처리된 과발현된 콩 PPO1의 WT 및 L430S/Y432I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 콩 PPO1 WT 및 L430S/Y432I는 모두 애기장대에서 화합물 A에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 화합물 A에 대한 과발현된 L430S/Y432I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-GmPPO1 WT는 과발현된 콩 PPO1을 나타내며; pHSE-GmPPO1 L430S/Y432I는 과발현된 콩 PPO1 L430S/Y432I를 나타낸다.
도 13은 다양한 농도의 화합물 A로 처리된 과발현된 유채 PPO1 WT 및 L424S/Y426I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 유채 PPO1 WT 및 L424S/Y426I는 모두 애기장대에서 화합물 A에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 화합물 A에 대한 과발현된 L424S/Y426I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-BnPPO1-C5 WT는 과발현된 유채 PPO1을 나타내며; pHSE-BnPPO1-C5L424S/Y426I는 과발현된 유채 PPO1 L424S/Y426I를 나타낸다.
도 14는 다양한 농도의 화합물 A로 처리된 과발현된 옥수수 PPO1 WT 및 L424W/Y426L 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 옥수수 PPO1 WT 및 L424W/Y426L는 모두 애기장대에서 화합물 A에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 화합물 A에 대한 과발현된 L424W/Y426L의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-ZmPPO1 WT는 과발현된 옥수수 PPO1을 나타내며; pHSE-ZmPPO1 L424W/Y426L는 과발현된 옥수수 PPO1 L424W/Y426L를 나타낸다.
도 15는 다양한 농도의 화합물 A로 처리된 과발현된 벼 PPO1 WT 및 L423S/Y425I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 벼 PPO1 WT 및 L423S/Y425I는 모두 애기장대에서 화합물 A에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 화합물 A에 대한 과발현된 L423S/Y425I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-OsPPO1 WT는 과발현된 벼 PPO1을 나타내며; pHSE-OsPPO1 L423S/Y425I는 과발현된 벼 PPO1 L423S/Y425I를 나타낸다.
도 16은 다양한 농도의 플루미옥사진으로 처리된 과발현된 벼 PPO1 WT 및 L423S/Y425I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 벼 PPO1 WT 및 L423S/Y425I는 모두 애기장대에서 플루미옥사진에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 플루미옥사진에 대한 과발현된 L423S/Y425I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-OsPPO1 WT는 과발현된 벼 PPO1을 나타내며; pHSE-OsPPO1 L423S/Y425I는 과발현된 벼 PPO1 L423S/Y425I를 나타낸다.
도 17은 다양한 농도의 사플루페나실로 처리된 과발현된 벼 PPO1 WT 및 L423S/Y425I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 벼 PPO1 WT 및 L423S/Y425I는 모두 애기장대에서 사플루페나실에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 사플루페나실에 대한 과발현된 L423S/Y425I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-OsPPO1 WT는 과발현된 벼 PPO1을 나타내며; pHSE-OsPPO1 L423S/Y425I는 과발현된 벼 PPO1 L423S/Y425I를 나타낸다.
도 18은 다양한 농도의 플루미옥사진으로 처리된 과발현된 콩 PPO1 WT 및 L430S/Y432I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 콩 PPO1 WT 및 L430S/Y432I는 모두 애기장대에서 플루미옥사진에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 플루미옥사진에 대한 과발현된 L430S/Y432I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-GmPPO1 WT는 과발현된 콩 PPO1을 나타내며; pHSE-GmPPO1 L430S/Y432I는 과발현된 콩 PPO1 L430S/Y432I를 나타낸다.
도 19는 다양한 농도의 사플루페나실로 처리된 과발현된 콩 PPO1 WT 및 L430S/Y432I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 콩 PPO1 WT 및 L430S/Y432I는 모두 애기장대에서 사플루페나실에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 사플루페나실에 대한 과발현된 L430S/Y432I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-GmPPO1 WT는 과발현된 콩 PPO1을 나타내며; pHSE-GmPPO1 L430S/Y432I는 과발현된 콩 PPO1 L430S/Y432I를 나타낸다.
도 20은 다양한 농도의 플루미옥사진으로 처리된 과발현된 옥수수 PPO1 WT 및 L424W/Y426L 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 옥수수 PPO1 WT 및 L424W/Y426L는 모두 애기장대에서 플루미옥사진에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 플루미옥사진에 대한 과발현된 L424W/Y426L의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-ZmPPO1 WT는 과발현된 옥수수 PPO1을 나타내며; pHSE-ZmPPO1 L424W/Y426L는 과발현된 옥수수 PPO1 L424W/Y426L를 나타낸다.
도 21은 다양한 농도의 사플루페나실로 처리된 과발현된 옥수수 PPO1 WT 및 L424W/Y426L 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 옥수수 PPO1 WT 및 L424W/Y426L는 모두 애기장대에서 사플루페나실에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 사플루페나실에 대한 과발현된 L424W/Y426L의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-ZmPPO1 WT는 과발현된 옥수수 PPO1을 나타내며; pHSE-ZmPPO1 L424W/Y426L는 과발현된 옥수수 PPO1 L424W/Y426L를 나타낸다.
도 22는 다양한 농도의 플루미옥사진으로 처리된 과발현된 유채 PPO1 WT 및 L424S/Y426I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 유채 PPO1 WT 및 L424S/Y426I는 모두 애기장대에서 플루미옥사진에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 플루미옥사진에 대한 과발현된 L424S/Y426I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-BnPPO1-C5 WT는 과발현된 유채 PPO1을 나타내며; pHSE-BnPPO1-C5L424S/Y426I는 과발현된 유채 PPO1 L424S/Y426I를 나타낸다.
도 23은 다양한 농도의 사플루페나실로 처리된 과발현된 유채 PPO1 WT 및 L424S/Y426I 애기장대 종자를 나타낸다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 과발현된 유채 PPO1 WT 및 L424S/Y426I는 모두 애기장대에서 사플루페나실에 대해 일정 수준의 내성을 나타내지만, 사플루페나실에 대한 과발현된 L424S/Y426I의 내성은 과발현된 야생형의 내성보다 훨씬 높다. 여기서, 야생형은 야생형 애기장대를 나타내고; pHSE-BnPPO1-C5 WT는 과발현된 유채 PPO1을 나타내며; pHSE-BnPPO1-C5L424S/Y426I는 과발현된 유채 PPO1 L424S/Y426I를 나타낸다.
도 24는 다양한 농도의 화합물 A를 살포한 과발현 벼 PPO1 WT 및 L423S/Y425I 벼 모종의 시험 결과를 나타낸다. 여기서 WT는 화이다오(Huaidao) 5호 야생형; MT1 및 MT2는 과발현된 벼 PPO1 WT; MT3 및 MT4는 과발현된 벼 PPO1 L423S/Y425I를 나타낸다.
본 발명은 아래의 실시예와 함께 더욱 상세히 설명될 것이다. 실시예에서 설명되는 모든 방법 및 동작은 예시적인 방법으로 제공되며, 이를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 식물에서 추출한 PPO의 아미노산 서열 정렬
동물, 식물, 박테리아 및 곰팡이에 존재하는 PPO는 산소 분자가 있을 때 프로토포르피리노겐 IX를 프로토포르피린 IX로 전환하는 촉매 역할을 한다. PPO는 페로헴과 엽록소를 주요 합성 산물로 사용하는 테트라피롤 생합성의 마지막 핵심 효소이다. 식물에는 두 개의 PPO 동종효소가 있으며 각각 미토콘드리아와 엽록체에 위치한다. 도 1은 벼 (NCBI 번호 XM_015770568.2 (서열번호 1)), 옥수수 (NCBI 번호 NM_001112094(서열번호 2)), 유채 (NCBI 번호 BnPPO1-C5: XM_013841402.2(서열번호 3); BnPPO1-A10: XM_013810914.2(서열번호 4)), 땅콩 (NCBI 번호 AhPPO1-A: XM_025762937.2(서열번호 5); AhPPO1-B: XM_025820369.2(서열번호 6)), 콩 (NCBI 번호 XM_003535957.4(서열번호 7)), 수수(NCBI 번호 XM_002455439.2(서열번호 8)), 밀 (NCBI 번호 TaPPO1-A: XP_037432241.1(서열번호 9); TaPPO1-B: XM_037583444.1(서열번호 10); TaPPO1-D: (서열번호 11)), 토마토 (NCBI 번호 NM_001348379.1(서열번호 12)), 감자 (NCBI 번호 NP_001275224.1(서열번호 13)), 담배 (NCBI 번호 XM_016654498.1(서열번호 14)), 애기장대 (NCBI 번호 AT4G01690(서열번호 15)), 육지면 (NCBI 번호 XM_016840317.1(서열번호 16)), 무 (NCBI 번호 XP_018459031.1(서열번호 7)), 조 (NCBI 번호 XP_004967639.1(서열번호 18)), 양배추 (NCBI 번호 XM_013731605.1(서열번호 19)), 참마 (NCBI 번호 XP_039129342.1), 카사바 (NCBI 번호 XM_021757904.2), 고추 (NCBI 번호 XM_016683798.1), 호박 (NCBI 번호 XM_023107680.1), 보리 (NCBI 번호 XM_045092307.1), 오이 (NCBI 번호 XM_004149431.3), 양상추 (NCBI 번호 XM_023904577.2), 참깨 (NCBI 번호 XM_011081162.2), 해바라기 (NCBI 번호 XM_022132124.2), 뽕나무 (NCBI 번호 XM_010093132.2), 동부콩 (NCBI 번호 XM_017556834.1), 딸기 (NCBI 번호 XM_004289391.2), 사과 (NCBI 번호 XM_008383404.3), 복숭아 (NCBI 번호 XM_007221411.2), 체리 (NCBI 번호 XM_021956996.1), 살구 (NCBI 번호 XM_034353497.1), 포도 덩굴 (NCBI 번호 XM_002273757.4), 파파야 (NCBI 번호 XM_022041496.1), 알팔파 (NCBI 번호 XM_013613689.3)를 포함하는 다양한 식물의 PPO 아미노산 서열 정렬을 보여주며, PPO 단백질 모티프 LLLNYI가 서로 다른 식물 종간에 보존적임을 나타낸다. 따라서 상기 모티프의 해당 부위에서 돌연변이의 생물학적 효과는 여러 종에 걸쳐 일관되게 나타날 수 있다.
실시예 2: 벼 프로포피리노겐 산화효소 PPO1 유전자 복제
벼(Oryza sativa, Japonica Group) 프로토포르피리노겐 IX 산화효소(PPO) 유전자는 1번 염색체의 Os01g18320 부위에 위치한다. 프라이머 NusOs-F:acgattgatgacgacgacaagATGGCGGCGGCGGCGGCG 및 NusOs-R:tccacgagctcccggactcTTACTTGTACGCATACTTGGTC는 cDNA 서열과 벡터 pET-44a 서열에 따라 설계 및 합성되었다. 야생형 벼의 cDNA를 주형으로 사용하고 Kod DNA 중합효소를 PCR 증폭에 사용하였다. 증폭은 다음의 조건에서 수행되었다: 98℃에서 2분, 98℃에서 20초, 65℃에서 30초, 68℃에서 60초, 35사이클; 마지막으로 68℃에서 5분 동안 증폭. 증폭된 단편은 아가로스 겔 전기영동에서 1.6Kb로 나타났으며, 회수 후 자외선 흡수를 통해 DNA 농도를 측정하였다.
pET-44a(노바젠) 플라스미드를 37℃에서 1시간 동안 PshAI(NEB, 뉴잉글랜드 바이오랩스, 미국 보스턴)에 의해 분해한 다음 65℃로 가열하여 PshAI를 불활성화시켰다. 동일한 양의 OsPPO1DNA 단편과 PshAI 선형화된 pET-44a 벡터를 혼합한 다음, 동일한 양의 2×Gibson 어셈블리 마스터 믹스(Hanbio, Shanghai, China)를 추가하였다. 혼합 후, 균질한 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 배양하였다. 5 μL의 결찰 제품을 사용하여 컴피턴트 대장균 DH5a를 형질 전환하고, 박테리아 용액을 100 ppm의 암피실린을 함유한 LB 고체 배지 플레이트의 표면에 펴서 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 개별 클론을 선택하고 개별 박테리아 콜로니 PCR을 통해 올바른 클론을 확인하였다. 그 후 37℃에서 하룻밤 동안 3개의 올바른 클론을 배양하고 충분한 플라스미드 DNA를 추출하여 Qingke Biotechnology Co., Ltd., (Beijing, China) 로 보내 생어(Sanger) 시퀀싱을 진행하였다. 사용 된 시퀀싱 프라이머는 NUS-F : GCTGCTGCGAAATTTGAACG 및 NUS-R : TACAGCTGTGCGGCCGCAAG이었다. 염기서열 분석 결과, 정확한 전장 벼 OsPPO1 코딩 영역 DNA를 얻을 수 있었으며, 발현된 야생형 벼 PPO의 발현 벡터는 pET44a-OsPPO1 WT로 명명되었다.
벼 OsPPO1의 제초제에 대한 내성은 PPO 결핍 대장균(ΔhemG)을 사용하여 테스트하였다. ΔhemG 균주는 hemG형 PPO 유전자가 결여되고 카나마이신 내성을 갖는 대장균 균주이다(Watanabe N, Che F S, Iwano M, et al. Dual Targeting of Spinach Protoporphyrinogen Oxidase II to Mitochondria and Chloroplasts by Alternative Use of Two In-frame Initiation Codons[J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(23):20474-20481). 상기에서 제조된 복제된 벼 OsPPO1 플라스미드를 ΔhemG의 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 전기 형질 전환을 통해 녹아웃 박테리아의 PPO 활성을 회복시켰다. 벼 OsPPO1 플라스미드는 암피실린과 카나마이신이 첨가된 LB 한천 배지에서 배양할 수 있었다.
상기 시스템이 화합물 A에 대한 벼 PPO1 유전자 내성의 진화 스크리닝에 사용될 수 있는지 확인하기 위해 야생형 벼 pET44a-OsPPO1 WT의 상보성 균주를 사용하여 PPO 억제 제초제가 포함된 플레이트에서 상보성 균주의 성장 차이를 테스트하였다. 형질 전환된 상보성 균주 ΔhemG/pET44a 및 ΔhemG/pET44a-OsPPO1 WT의 클론을 선별하여 100ul LB 배지에 재현탁시켰다. 그런 다음 희석된 용액을 1/10의 계수로 4회 연속으로 다시 희석하였다. 그런 다음 각 희석 용액의 3μl를 화합물 A가 포함된 LB 한천 배지(배양 접시)에 0nM, 300nM, 1000nM의 농도로 첨가하였다. LB 한천 배지를 28℃에서 배양하고 40~48시간 배양 후 성장 억제 효과를 평가하였다.
도 2에서 나타낸 바와 같이, 제초제가 없는 배양배지에서 ΔhemG/pET44a 상보 균주는 성장하지 못한 반면, 형질전환 벼의 상보 균주인 ΔhemG/pET44a-OsPPO1 WT는 정상적으로 성장할 수 있어 보완된 OsPPO1이 결함이 있는 대장균에서 정상적인 PPO 기능을 수행할 수 있음을 보여주었다.
또한 야생형 벼 ΔhemG/pET44a-OsPPO1 WT 보완 균주의 성장이 300nM에서 억제되고 화합물 A의 농도가 다른 배지에서 플레이트에서 클론이 자라지 않는 것을 알 수 있었다. 또한 이 시스템은 화합물 A에 대한 벼 OsPPO1 유전자 내성의 진화 스크리닝에 사용될 수 있음을 입증하였다.
실시예 3: PPO-결핍 대장균(ΔhemG)을 사용하여 벼의 화합물 A에 대한 OsPPO1 내성 부위를 스크리닝
화합물 A에 대한 벼 OsPPO1 유전자의 내성 부위를 선별하기 위해, 실시예 1의 서로 다른 식물에서 추출한 PPO 아미노산의 정렬 결과에 따라 벼에서 모티프 LLLNYI를 갖는 부위에 아미노산의 포화 돌연변이를 수행하였다. 이는 아미노산 코딩 서열을 NNK로 변경하는 원하는 돌연변이를 포함하는 프라이머와 다른 적합한 기존 프라이머의 PCR 증폭을 통해 달성되었다. NNK에서 N은 A/T/G/C를 나타내고 K는 G/T를 나타내며, NNK 코돈은 20개의 아미노산 또는 스톱 코돈 중 하나를 인코딩할 수 있다. 따라서 이는 포화 돌연변이 유발이었다. 참조: Kille S, Acevedo-Rocha CG, Parra LP, Zhang ZG, Opperman DJ, ReetzMT, AcevedoJP (2013) Reducing codon redundancy and screening effort of combinatorial protein libraries created by saturation mutagenesis. ACS Synth Biol 2(2):83-92; Directed Evolution Library Creation: methods and protocols 2nd ed. Edited by Elizabeth M.J. Gillam, Janine N. Copp and David F. Ackerley New York, NY United States: Springer, 2014.doi:10.1007/978-1-4939-1053-3. 수많은 돌연변이가 생산되었다. 제작된 서로 다른 부위의 포화 라이브러리 플라스미드를 ΔhemG 컴피턴트 세포로 형질전환시키고, 실시예 2의 대장균 스크리닝 시스템을 이용하여 화합물 A에 대한 서로 다른 부위의 벼 PPO1 유전자의 내성에 대한 스크리닝 테스트를 수행한 후, 정상적으로 성장하는 저항성 화합물 A가 포함된 플레이트에서 클론을 선택하고 이의 유전자형을 확인했다. 6개의 단일 아미노산 돌연변이가 스크리닝되었으며, 이는 각각 L423S(서열 번호: 20), L423I(서열 번호: 21), L423G(서열 번호: 22), Y425M(서열 번호: 23), Y425I(서열번호 24) 및 Y425V(서열번호 25)이었다. 야생형과 비교하여, 이들 내성 돌연변이체는 도 3에 나타낸 바와 같이 500nM 화합물 A를 함유하는 LB 배지에서 정상적으로 성장하였다.
구체적인 실험 방법:
1. PCR 증폭은 합성된 OsPPO1-423-F 및 OsPPO1-423-R을 프라이머로, 실시예예 2에서 제조된 pET44a-OsPPO1 WT 플라스미드를 템플릿으로 하여 Kod DNA 중합효소를 사용하여 수행하였다. 증폭은 다음 조건에서 수행되었다: 98℃에서 3분, 98℃에서 20초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분, 35사이클, 72℃에서 5분. 아가로스 겔 전기영동으로 검출한 후, 정확한 크기(약 9KB)의 밴드를 회수하고 자외선 흡광도를 통해 농도를 측정하였다.
2. 회수산물 5μl를 동량의 2×Gibson Assembly Master Mix(Hanbio, Shanghai, China)에 첨가하고 잘 혼합한 후 50℃에서 1시간 동안 배양하였고; 라이게이션 생성물 5 ul를 사용하여 컴피턴트 대장균 DH5a를 형질전환하였고, 균액을 100ppm의 암피실린을 함유한 LB 고체배지 플레이트 표면에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트 위의 모든 클론(콜로니)을 폐기하고 플라스미드를 추출한 후 UV 흡수를 통해 DNA를 정량화하였다.
3. 제작된 플라스미드 100ng을 ΔhemG 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 500nM 화합물 A가 포함된 LB 배지 플레이트에 도말하고 밤새 배양하였다. 화합물 A가 포함된 플레이트에서 정상적으로 성장하는 저항성 클론을 선별하여 유전자형을 확인하였다.
벼 PPO 돌연변이체 제조에 사용되는 프라이머
프라이머명 프라이머 서열 (5，-3，)
NusOs-F acgattgatgacgacgacaagATGGCGGCGGCGGCGGCG
NusOs-R tccacgagctcccggactcTTACTTGTACGCATACTTGGTC
OsPPO1-421-F CCGGCGGGTCGTGTTNNKCTGCTGAACTATATC
OsPPO1-421-R AACACGACCCGCCGGCGCAC
OsPPO1-422-F CCGGCGGGTCGTGTTCTGNNKCTGAACTATATCGGC
OsPPO1-422-R CAGAACACGACCCGCCGGCGCACGG
OsPPO1-423-F GGTCGTGTTCTGCTGNNKAACTATATCGGCGGTAG
OsPPO1-423-R CAGCAGAACACGACCCGCCGGCGCACG
OsPPO1-424-F TCGTGTTCTGCTGCTGNNKTATATCGGCGGT
OsPPO1-424-R CAGCAGCAGAACACGACCCGCCGGCGC
OsPPO1-425-F GTTCTGCTGCTGAACNNKATCGGCGGTAGCACC
OsPPO1-425-R GTTCAGCAGCAGAACACGACCCGCCG
OsPPO1-426-F CTGCTGCTGAACTATNNKGGCGGTAGCACCAA
OsPPO1-426-ROsPPO1-423S/425I-F
OsPPO1-423S/425I-R		 ATAGTTCAGCAGCAGAACACGACCCGC
GGTGTTACTTTCCAACATCATAGGAGGTTCTACAAAT
GTATTTGTAGAACCTCCTATGATGTTGGAAAGTAACACC
실시예 4: PPO 결핍 대장균(ΔhemG)을 사용하여 벼 OsPPO1 저항성 부위 조합의 제초제 내성 확인
PPO 저해 제초제에 대한 벼 OsPPO1의 내성을 더욱 향상시키기 위해, 화합물 A에 대한 내성을 갖는 스크리닝 된 단일 돌연변이체 L423S 및 Y425I를 바람직하게 선택 및 조합하고, 이들의 제초제에 대한 내성을 대장균 스크리닝 시스템을 사용하여 시험하였다. 스크리닝된 단일 부위 또는 부위 조합을 0μM, 1μM, 10μM, 20μM, 50μM 및 100μM의 다양한 농도로 화합물 A를 함유한 플레이트에서 배양하고 이들의 성장 억제를 관찰한 결과, L423S / Y425I 부위 조합 (서열번호 26)도 화합물 A에 대한 내성을 나타냄을 알 수 있었다. 스크리닝 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 A의 농도가 증가함에 따라 특정 부위 조합에서 유의한 성장 억제가 발생했지만 돌연변이 부위 조합인 L423S/Y425I는 100μM 농도의 화합물 A 처리로 더 높은 내성을 보였으며 정상적인 성장도 나타났다. 이러한 결과는 돌연변이 부위 L423S/Y425I 조합이 단일 돌연변이인 L423S와 Y425I에 비해 제초제 화합물 A에 대한 벼의 내성을 향상시켰음을 나타낸다.
실시예 4: PPO 결핍 대장균(ΔhemG)을 사용하여 벼 OsPPO1 저항성 부위 조합의 제초제 내성 확인
구체적인 실험 방법:
1. 합성된 OsPPO1-423S/425I-F와 OsPPO1-423S/425I-R을 프라이머로, 실시예 2에서 제작한 pET44a-OsPPO1 WT 플라스미드를 주형으로 Kod DNA 중합효소를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다.증폭은 다음 조건 하에서 수행되었다: 98℃에서 3분; 98℃에서 20초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분, 35주기; 72℃에서 5분. 아가로스 겔 전기영동으로 검출한 후 정확한 크기(약 9KB)의 밴드를 회수하고 자외선 흡수로 농도를 결정하였다.
2. 회수산물 5μl를 동량의 2×Gibson Assembly Master Mix(Hanbio, Shanghai, China)에 첨가하고 잘 혼합한 후 50℃에서 1시간 동안 배양하였고; 라이게이션 생성물 5 ul를 사용하여 컴피턴트 대장균 DH5a를 형질전환하였으며, 균액을 100ppm의 암피실린이 포함된 LB 고체배지 플레이트 표면에 코팅하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트 위의 모든 클론(콜로니)을 폐기하고 플라스미드를 추출한 후 UV 흡수를 통해 DNA를 정량화했다.
3. 제작된 플라스미드 100ng을 ΔhemG 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 500nM 화합물 A가 포함된 LB 배지 플레이트에 깔고 밤새 배양하였다. 성장 억제가 관찰되었다.
4. 형질전환된 상보 균주 ΔhemG/pET44a-OsPPO1 WT, ΔhemG/pET44a-OsPPO1 L423S, ΔhemG/pET44a-OsPPO1 Y425I 및 ΔhemG/pET44a-OsPPO1 L423S/Y425I의 클론을 선택하고 100ul LB 배지에 재현탁한 다음 희석하였고, 그런 다음 용액을 1/10 계수로 4번 연속으로 다시 희석하였다. 이어서, 각 희석액 3μl를 화합물 A를 0nM, 1nM, 10nM, 20nM, 50nM 및 100nM의 농도로 함유하는 LB 한천 배지(배양 접시)에 첨가하였다. LB 한천배지는 28℃에서 배양하였고, 배양 40~48시간 후에 성장저해를 평가하였다.
실시예 5: 화합물 A에 대한 옥수수 ZmPPO1의 돌연변이 LL L N Y I 단백질 모티프의 내성 확인
다른 식물에서 PPO1 보존 단백질 모티프 LLLNYI의 돌연변이가 제초제에 대한 저항성을 부여할 수 있는지 확인하기 위해 단백질 모티프 LLLNYI의 세 번째 위치에 있는 류신 잔기와 다섯 번째 위치에 있는 티로신 잔기의 돌연변이 조합을 상기 예와 동일한 방법으로 수행하여 제초제 화합물 A를 포함하는 LB 배지를 사용하여 스크리닝한 결과 생육 저해가 관찰되었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 야생형 ZmPPO1-WT(서열번호 2)와 비교하여, L424T/Y426V를 포함하는 단백질 모티프 LLLNYI의 세 번째 위치의 류신 잔기와 다섯 번째 위치의 티로신 잔기의 돌연변이 조합(서열번호 27), L424S/Y426V(서열번호 28), L424V/Y426L(서열번호 29) 및 L424W/Y426L(서열번호 30)은 5μM 농도의 화합물 A가 포함된 플레이트에서 억제 없이 정상적으로 성장하였다. 이들 중 대부분은 화합물 A의 농도가 증가함에 따라 높은 내성을 나타냈는데, 이는 다른 식물에서 PPO 보존 단백질 모티프 LLLNYI의 해당 부위의 돌연변이에 의해 부여된 제초제에 대한 내성도 일관된 효과를 나타냄을 보여준다.
실시예 6: 다른 작물의 PPO1에서 화합물 A 및 기타 PPO 저해 제초제에 대한 LL L N Y I 단백질 모티프 돌연변이의 내성 확인
다른 작물에서 PPO 보존 단백질 모티프 LLLNYI의 해당 부위 돌연변이에 의해 부여되는 제초제 내성에 대한 영향을 추가로 확인하기 위해 야생형 벼 PPO1의 OsPPO1 WT (서열번호 1), 돌연변이 벼 PPO1의 OsPPO1 L423S/Y425I (서열번호 26), 야생형 옥수수 PPO1의 ZmPPO1WT (서열번호 2), 돌연변이 옥수수 PPO1의 ZmPPO1 L424S / Y426I (서열번호 31), 야생형 밀 PPO1의 TaPPO1-A WT (서열번호 9), 돌연변이 밀 PPO1의 TaPPO1-A L418S/Y420I (서열번호 38), 야생형 유채 PPO1의 BnPPO1-A10 WT (서열번호 4), 돌연변이 유채 PPO1의 BnPPO1-A10 L423S/Y425I (서열번호 33), 야생형 목화 PPO1의 GhPPO1 WT (서열번호 16), 돌연변이 목화 PPO1의 GhPPO1 L426S/Y428I(서열번호 45), 야생형 애기장대 PPO1의 AtPPO1 WT(서열번호 15) 및 돌연변이 애기장대 PPO의 AtPPO1 L423S/Y425I (서열번호 44)를 실시예 3 및 실시예 4에서 설명한 것과 동일한 방법과 표 2와 같은 프라이머를 사용하여 상보적으로 PPO 결핍 대장균 (ΔhemG)으로 구성하고 형질 전환하였다. 야생형 PPO1 유전자 또는 다양한 작물에서 다양한 돌연변이 PPO1 유전자로 형질 전환된 PPO 결핍 대장균(ΔhemG) 클론을 선별하여 100ul LB 배지에 재현탁시킨 다음 희석 용액을 10분의 1 계수로 다시 두 번 희석하였다. 그런 다음 각 희석 용액의 3μl를 화합물 A를 각각 0.1μM, 0. 5μM, 1μM, 10μM 및 100μ의 농도, 사플루페나실은 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 10μM 및 100μM의 농도, 플루미옥사진은 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 10μM 및 100μM의 농도, 에피리페나실은 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 10μM 및 100μM 의 농도, 설펜트라존은 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 10μM 및 100μM 농도, 티아페나실은 0.1μM, 0. 5μM, 1μM, 10μM 및 100μM의 농도, 포메사펜은 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 10μM 및 100μM의 농도, 트리플루디목사진은 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 10μM 및 100μM의 농도를 포함하는 LB 한천 배지(배양 접시)에 첨가하였다. LB 한천 배지를 인큐베이터에서 28℃로 배양하고 40~48시간 배양한 후 성장 억제 효과를 평가하였다. 결과는 도 6 내지 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 3 및 실시예 4의 저항성 부위 또는 조합이 다른 PPO 제초제에도 내성이 있음을 나타낸다.
프라이머명 프라이머 서열 (5，-3，)
NusOs-F acgattgatgacgacgacaagATGGCGGCGGCGGCGGCG
NusOs-R tccacgagctcccggactcTTACTTGTACGCATACTTGGTC
OsPPO1-423S/425I-F GGTGTTACTTTCCAACATCATAGGAGGTTCTACAAAT
OsPPO1-423S/425I-R GTATTTGTAGAACCTCCTATGATGTTGGAAAGTAACACC
TaPPO1A-F ccgcgcggcagccatATGGCCGGCGCAACAATG
TaPPO1A-R tttgttagcagccggatcTCACTTGTAGGCATACTTGGTC
TaPPO1-418S/420I-F GGAAGAGTGTTACTTtcGAACatTATCGGGGGTTC
TaPPO1-418S/420I-R AAGTAACACTCTTCCAGCAGGAGCACG
ZmPPO1-T38F ccgcgcggcagccatatggctgctgtggcgggcggcg
ZmPPO1-R tttgttagcagccggatctcacttgtaggcatacttggtcaag
ZmPPO1-424S/426I-F ggtagggtgttacttAGCaacATTataggaggtgct
ZmPPO1-424S/426I-R aagtaacaccctaccgtcaggagcacg
AtPPO1-F tgccgcgcggcagccatatgTCagtggccggtggaccaac
AtPPO1-R tttgttagcagccggatcttacttgtaagcgtaccgtgacatg
AtPPO1-423S/425I-F ggaagaattttgctgAGCaacATTattggcgggtctacaaac
AtPPO1-423S/425I-R cagcaaaattcttccgggcggtgc
GhPPO1-F TGCCGCGCGGCAGCCATatgacggctctaatcgacc
GhPPO1-R GCTTTGTTAGCAGCCGGATCCttatttgtatgcatattgtg
GhPPO1-426S/428I-F ggcagggtgttgctctCgaacATCataggaggag
GhPPO1-426S/428I-R gagcaacaccctgccagatggagctcg
BnPPO1-A10-F cgcgcggcagccatATGGATTTCTCTCTTCTCCGTCCGGC
BnPPO1-A10-R gttagcagccggatcTTACTTGTAAGCATACCTTGACAT
BnPPO1-A10-426S/428I-F GGAAGAGTGTTGCTATcGAACatCATCGGTGGAGCTAC
BnPPO1-A10-426S/428I-R TAGCAACACTCTTCCAGGTGGTGCT
실시예 7: 벼 OsPPO1의 저항성 부위 또는 조합의 다른 유형의 PPO 제초제에 대한 내성 확인
실시예 3과 실시예 4의 저항성 부위 또는 조합이 다른 PPO 제초제에도 내성을 보이는지 확인하기 위해, 일부 부위 또는 조합을 선택하여 다른 유형의 PPO 제초제에 대한 내성을 검증하는 것이 바람직하다. 야생형(WT) OsPPO1 유전자 또는 다양한 돌연변이 OsPPO1 유전자에 의해 변형된 PPO 결핍 대장균(ΔhemG) 형질전환체의 클론을 선별하여 100ul LB 배지에 다시 현탁시킨 다음 희석 용액을 10분의 1 계수로 두 번 연속 희석하였다. 그런 다음 각 희석 용액 3μl을 각각 플루미옥사진(농도 100nM), 옥시플루오르펜(농도 100nM), 사플루페나실(농도 500nM), 피라클로닐(농도 5μM), 카르펜트라존-에틸(농도 1μM), 포메사펜(농도 10μM)이 포함된 LB 한천 배지(배양 접시)에 첨가하였다. 한천 배지를 온도조절 배양기에서 28℃로 배양하고 40~48시간 배양 후 성장 억제 효과를 평가하였다. 결과는 도 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 3과 실시예 4의 저항성 부위 또는 조합이 다른 PPO 제초제에도 내성이 있음을 나타낸다.
실시예 8: 벼 OsPPO1의 내성 부위 조합 단백질(폴리펩타이드)의 시험관 내 효소 활성 및 내성 시험
1. 프로토포르피리노겐의 제조
PPO에 의해 촉매되는 기질인 프로토포르피린젠은 프로토포르피린을 아말감 나트륨으로 환원하여 제조하였다. 10 mg의 프로토포르피린을 10 mL 용매에 용해시키고 0.2 g / mL의 비율로 20 % 아말감 나트륨을 첨가하고 2 시간 동안 반응시킨 다음 어두운 곳에서 질소 보호하에 여과하였다. 반응이 완료된 후 반응 용액은 무색 또는 밝은 갈색이되어야한다. 반응 용액을 반응 완충액(100mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 0.1% Tween 20/80)으로 첨가하여 희석하고, 10% 염산을 사용하여 pH를 약 8.0으로 조정하였다. 최종적으로 약 100μM 농도의 프로토포르피리노겐을 얻어 하위포장하여 액체 질소 또는 -80℃ 온도에서 보관했다.
2. OsPPO1 단백질의 발현 및 정제
1) PCR 증폭은 pET44a-OsPPO1-WT 및 스크리닝 돌연변이를 주형으로 하고 28MBP-OsPPO1-T38F: CCGCGCGGCAGCCATATGGCGGGTTCTGGTACGATTG 및 28MBP-OsPPO1-T38Rn: GAGCTCGAATTCGGATCCTTACTTGTACGCATACTTGGTCAG를 프라이머와 함께 Kod DNA 중합효소를 사용하여 수행하였다. 증폭은 다음 조건 하에서 수행되었다: 95℃에서 3분; 10초 동안 98℃; 30초 동안 60℃; 68℃에서 1분, 35사이클; 68℃에서 5분. 아가로스 겔 전기영동으로 검출한 후 정확한 크기(약 1.5KB)의 밴드를 회수하고 자외선 흡수로 농도를 측정하였다.
2) 회수산물 4μl와 pET28a-MBP 벡터 1μl를 동량의 2×Gibson Assembly Master Mix(Hanbio, Shanghai, China)에 첨가하고 혼합한 후 50℃에서 1시간 동안 배양하였다. 라이게이션 생성물 5 ul를 사용하여 컴피턴트 대장균 DH5a를 형질전환하였고, 균액을 100 mg/L의 황산 카나마이신을 함유한 LB 고체배지 플레이트 표면에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트의 모든 클론을 선택하고 서열을 분석했다.
3) 제작된 융합발현벡터 pET28a-MBP-OsPPO1을 E. coli BL21(DE3)에 옮겨 0.5 mM IPTG로 유도발현시킨 후 Ni-NTA 컬럼으로 정제한 후 트롬빈 분해, 투석, 2차적으로 덱스트린 컬럼과 Ni 컬럼으로 정제되었다. 구체적인 방법은 다음과 같았다. OsPPO1 효소 재조합 발현 벡터를 BL21(DE3) 세포에 형질전환시키고, 그 클론을 10ml의 LB 배지에 선별하여 37℃에서 밤새 진탕기에서 200rpm으로 Kana resistance로 배양한 후, 1L TB 배지를 함유하는 2L 진탕 플라스크를 OD600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 진탕기에서 37℃ 및 200rpm으로 배양하고, 18℃ 온도로 냉각하고 밤새 0.5mM IPTG로 유도 발현을 실시하였다. 4000xg에서 원심분리하여 균주를 수집하였다. 수집된 균주를 Ni-완충액 A(50mM Tris pH 8.0, 500mM NaCl, 50mM imidazole)로 재현탁하고 고압 세포 균질기로 균질화한 후 4000xg, 4℃에서 30분간 원심분리하였고; 상층액을 Ni 컬럼으로 정제한 후 SDS-PAGE로 순도를 확인하였다. 단백질의 양에 따라 트롬빈 효소를 첨가하고 50mM Tris pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM DTT 완충액으로 투석하였다. 둘째 날에는 덱스트린 컬럼과 Ni 컬럼으로 연속적으로 정제하였고; 관심 단백질이 포함된 용출액을 수집, 농축, 하위 포장하고 나중에 사용할 수 있도록 -80℃ 온도에 보관하였다.
3. OsPPO1의 활성 테스트
효소의 기질 친화도 및 촉매 활성 측정: 반응 완충액(100mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 0.1% Tween 20/80)을 사용하여 다양한 농도의 기질 프로토포르피리노겐을 함유하는 반응 용액을 제조하였으며, 테스트 농도는 0.125, 0.5, 2, 4, 8 및 16 μM이었다. OsPPO1 효소를 10μM로 희석하고 5μl를 검은색 96웰 ELISA 플레이트에 흡수시킨 후, 총 부피가 100μl에 도달할 때까지 반응 용액을 첨가하였다. 효소의 최종 농도는 500nM이었다. 용액을 즉시 잘 혼합하고 형광 마이크로플레이트 리더로 모니터링하였다. 혼합물은 410nm에서 자극되었고 630nm에서 검출되었다. 도 10과 같이 반응 곡선이 작성되었다.
실시예 9: 제초제 저항성을 얻기 위한 CRISPR/cas9에 의해 매개되는 벼 PPO1 돌연변이의 상동 치환
제초제 저항성을 갖는 비형질전환 벼를 얻기 위해, 상술한 L423S/Y425I 돌연변이 부위 조합을 CRISPR/cas9을 매개로 한 상동치환을 실시하였다. 벼 OsPPO1 유전자에는 9개의 엑손과 8개의 인트론이 존재하는데, 두 개의 표적 부위인 L423S와 Y425I는 8번째 엑손에 위치하였다.
gRNA의 설계: L423S의 윗부분과 Y425I의 아랫부분에 각각 하나의 gRNA를 설계하고 각 부위에서 각각 한 번씩 절단하였고; 두 부위 사이의 DNA는 상동 치환 방법으로 동시에 교체되었다. 벼 OsPPO1의 서열은 가능한 모든 gRNA를 평가하기 위해 http://crispor.tefor.net/crispor.py에 입력되었다. 특이성 점수 값이 90보다 큰 원칙에 따라(Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, Agarwala V, Li Y, Fine EJ, Wu X, Shalem O, Cradick TJ, Marraffini LA, Bao G, Zhang F. Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):827-32. doi: 10.1038/nbt.2647. Epub 2013 Jul 21), 오프 타겟 효과를 피하고 가능한 한 길이를 줄이기 위해 다음 두 가지 gRNA를 선택하였다: gRNA : Osppo1 gRNA5-2 : acatgaactagtaatgattgggg (상단 가닥); 및 Osppo1 gRNA8-3: agcagctggagttgaaaaacagg (하단 가닥), 밑줄이 그어진 부분은 PAM 서열이었다.
복구 템플릿 설계: 선택된 두 개의 표적 RNA에 의해 절단된 DNA 단편의 길이는 1212bp였다. 그러나 423번과 425번 부위의 가까운 위치로 인해 복구 템플릿을 설계하는 동안 왼쪽 상동 부위의 길이는 1127bp, 오른쪽 상동 부위의 길이는 82bp로 결정되었다. 또한, 벡터에서 복구 템플릿을 절단하기 위해 왼쪽과 오른쪽 끝에 각각 분해 표적 부위를 남겨두었다. 따라서, 템플릿의 총 길이는 1258bp였다(서열번호 49).
편집 벡터: Osppo1 gRNA5-2 및 Osppo1 gRNA8-3은 각각 벼 U3 프로모터에 의해 발현되었다. 따라서 두 개의 gRNA 발현 카세트는 복구 템플릿과 함께 GenScript (Nanjing) Co., Ltd.로 보내 합성을 진행하였다. 합성된 두 개의 gRNA 발현 카세트와 벡터 pRGEB32 (Addgene#63142)를 BsaI 효소로 효소 분해한 후, 아가로스 겔 전기 영동으로 검출한 다음 정제 및 회수하고 T4DNA 리가아제 (NEB, New England Biolabs, Boston, USA)로 결찰 및 형질전환하여 편집 벡터를 생성하였다.
유전자 총에 의한 형질 전환, 스크리닝, 분화, 발근 및 토양 재배 모종: 상기에서 제작한 편집 벡터는 서열 분석 및 다중 효소 분해에 의해 검증된 후 유전자 총에 의해 매개되는 벼 형질전환을 위해 합성된 복구 템플릿 DNA와 함께 사용되었다.
유전자 총에 의해 매개되는 벼 캘러스의 구체적인 형질전환 방법:
1. 화이다오 5호 및 진징 818 벼 품종의 고품질 종자를 선별하여 70% 알코올과 20% 차아염소산나트륨으로 구성된 용액으로 소독한 후 멸균수로 세척하고 캘러스 유도 배지에 접종하였다. 1주일 배양 후 배아를 제거하고 박리된 캘러스를 캘러스 유도 배지에 접종하였다. 2 주 후, 후속 형질전환을 위해 하위 배양을 수행하였다.
2. 미세투사물(microprojectile) 및 유전자총 형질전환 준비
(1) 금 분말 현탁액의 제조: 금 분말 30mg (직경 0.6μm)을 수입한 1.5mL EP 튜브로 무게를 측정하고, 여기에 70 % 에탄올 1mL를 첨가한 후, 완전히 교반하고 상층액을 원심 분리하여 버린 후, 멸균수를 첨가하여 3 회 반복세척을 진행하였다. 멸균 글리세롤(50%) 500μL를 첨가하고 완전히 교반하여 60μg/μL 농도의 금 분말 현탁액을 제조한 후 -20℃에서 보관하였다.
(2) DNA 래핑 : 25μL의 금 분말 현탁액 (60μg/μL), 편집 벡터 및 복구 템플릿 (1:10), 25μL의 CaCl2 (SIGMA) (2.5 mol / L) 및 10μL의 스페르미딘 (0.1 mol / L)을 1.5mL 원심 분리 튜브에 연속적으로 첨가하였다. 상기 혼합 시료를 3~5분간 완전히 교반한 후, 10분간 얼음 위에 놓고 원심분리하여 상층액을 버린 후; 마지막으로 무수 에탄올 30μL를 첨가하여 재현탁하고 최종 부피를 측정하였다.
(3) 유전자 총 충격 : 슈퍼 클린 벤치를 청소하고 벤치 상판을 알코올로 닦고 기기를 조정하고 작동 지침에 따라 폭격을 수행하였다. 충격 매개 변수는 27 진공도, 1100 psi, 6cm로 조정되었다. 충격 후, 캘러스를 25 ℃에서 16 시간 동안 암조건에서 배양 한 다음 캘러스를 25 ℃의 회수 배지로 옮겨 1 주일 동안 암조건에서 배양하였다.
(4) 저항성 캘러스 스크리닝 및 식물 분화 : 캘러스를 스크리닝을 위해 스크리닝 배지로 옮기고 배지를 2 주마다 교체하였다. 4주간의 스크리닝 후 샘플을 채취하여 표적 교체가 발생했는지 여부를 검출하였다.
(5) 양성 반응을 보인 캘러스를 분화 배지로 옮겨 28℃의 광배양기에서 분화 배양을 수행하였다.
저항성 캘러스를 벼 모종에 유도한 후 형질전환 벼 유전체 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 PCR 증폭 시험을 수행하였다. 그 결과, 벼 OsPPO1 유전자의 L423S/Y425I 부위를 동시에 치환하여 T0세대 벼 계통을 성공적으로 획득하였다. 획득한 T0세대 벼 모종의 컴파운드 A에 대한 내성을 확인하기 위해 벼 모종에 컴파운드 A를 9g/ha의 비율로 처리한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 처리 3일 후 고사한 야생형 계통에 비해 L423S/Y425I 부위에서 상동 치환된 계통은 정상적으로 성장하여 벼 OsPPO1 유전자의 L423S/Y425I 부위 돌연변이가 식물에 제초제 내성을 부여한 것으로 나타났다. 종자를 수확하여 재배한 재배지에서 T1 세대와 T2 세대의 벼 모종을 획득하였다. 획득된 T1 세대 및 T2 세대의 벼 모종도 화합물 A에 내성이 있음이 입증되었으며, 화합물 A에 대한 T2 세대 벼 모종의 내성은 표 3에 나타내었다.
테스트 제품 비율(g a.i./ha) 효능 (식물 독성) 순위
T2-세대 벼 야생형 벼
4.25% Compound A 15 1 5
30 2 7
60 4 8
120 6 9
참고: 0 - 차이 없음, 1 - 약간 탄 식물, 2 - 상당히 탄 식물, 3 - 심하게 탄 식물, 4 - 약간 시든 식물, 5 - 상당히 시든 식물, 6 - 심하게 시든 식물, 7 - 소수가 죽은 식물, 8 - 대다수가 죽은 식물, 9 - 모두 죽은 식물.
실시예 10: 애기장대에서 화합물 A에 대한 다른 작물의 PPO1에서 LLLNYI 단백질 모티프 돌연변이의 내성을 과발현
다양한 작물의 PPO1에서 화합물 A에 대한 LLLNYI 단백질 모티프 돌연변이의 내성을 신속하게 확인하기 위해 벼, 옥수수, 콩 및 유채에서 과발현된 야생형 및 돌연변이 PPO1 유전자의 벡터를 각각 제작하였다.
1. 과발현 벡터의 제작
1) 프라이머: 야생형과 돌연변이체를 증폭시키기 위해 선택된 제한효소 절단부위와 유전자 자체의 염기서열에 따라 프라이머를 디자인하였다. 설계된 프라이머는 Beijing Qingke Biotechnology Co., Ltd.에서 합성하였다.
프라이머명 프라이머 서열 (5，-3，)
401V-OsPPO1-F gatactcgagtaatctagaatggccgccgccgccgcag
401V-OsPPO1-R cgaacgaaagctctgagctctcacttgtaggcgtacttg
401V-ZmPPO1-F gatactcgagtaatctagaatggtcgccgccaccgcc
401V-ZmPPO1-R cgaacgaaagctctgagctctcacttgtaggcatacttg
401V-GmPPO1-F gatactcgagtaatctagaAtggtttccgtcttcaac
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2) PCR 증폭: 관심 유전자는 합성 된 프라이머와 Q5DNA 중합 효소(NEB, New England Biolabs, Boston, USA)를 사용하여 증폭되었다. 증폭된 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 검출하고 TIAN Quick Midi Purification 키트의 작동 지침에 따라 회수하였다. 회수가 완료된 후 추출된 DNA의 농도를 Nanodrop으로 측정하였다.
3) 과발현 벡터 제작: 회수된 PPO1 단편과 XbaI 및 SacI에 의해 분해된 플라스미드 pHSE401V, HanBio Biotechnology Co., Ltd.(Shanghai)의 HB-in fusionTM 심리스 클로닝 키트를 이용하여 과발현 벡터를 제작한 후, 양성 클론을 얻기 위해 컴피턴트 대장균 DH5α에 형질전환하고, 염기서열 및 제한 엔도뉴클레아제 분해로 확인을 거쳐 추후 사용하기 위해 Agrobacterium으로 형질전환하였다.
2. 꽃차례 침지에 의한 애기장대의 형질전환
1) 파종 : 통통하고 춘화된 야생형 애기장대 종자를 선별하여 75% 알코올로 1분간 처리하고, 10% NaClO로 6분간 소독한 후 멸균수로 5~6회 세척하였다. 멸균이 완료된 종자를 MS배지 플레이트에 1주일 동안 놓아둔 후 멸균된 영양토양(영양토양:질석=1:1)에 이식하여 (25±2)℃의 온실에서 16시간/8시간의 광주기(명암)로 배양하였다.
2) 아그로박테리움의 활성화 및 준비: 저온에서 보관된 발현 벡터를 가진 아그로박테리움 균주를 클라리트로마이신과 리팜피신을 함유한 내성 플레이트에 도말하였다. 단일 콜로니를 골라내어 해당 항생제를 첨가한 5mL 액체 LB 배지에 접종하고 28℃, 250rpm에서 18~24시간 동안 쉐이커에서 배양하였다. 그런 다음 동일한 조건에서 1:100 접종에 따라 배양을 확대하고 OD6000이 1.0-1.5 범위가 될 때까지 박테리아 용액의 총 부피를 50ml로 맞추었다.
3) 형질전환 용액의 제조: 배양된 박테리아 용액을 6000rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 분리하였다. OD6000이 약 0.8이 될 때까지 5% 수크로오스을 함유한 형질전환 용액에 스테인을 다시 현탁시켰다. SilwetL-77(0.02%-0.04%)을 박테리아 용액에 첨가하고 잘 혼합하였다.
4) 애기장대 꽃차례 형질전환: 성장 상태가 양호하고 꽃차례가 무성한 형질전환되지 않은 애기장대를 선택하여 형질전환 시키고, 형질 전환 전에 가위로 열매 꼬투리를 식물에서 잘라내었다. 애기장대 꽃차례를 준비된 형질전환 용액에 0.5~1분간 담가두었다. 그런 다음 형질전환된 애기장대 모종을 어둡고 습한 조건에 24시간 동안 두었다. 일주일 후 형질전환을 반복하였다.
5) 형질전환 계통의 스크리닝
침지된 애기장대 꽃차례를 형질 전환한 후, 애기장대 T0 세대 종자를 수집하여 30 mg/L 하이그로마이신을 함유한 내성 MS 플레이트에 파종하여 양성 식물을 선별하였다. 선별된 양성 모종을 흙이 담긴 화분에 옮겨온 후 온실에 배치하여 재배하여 다음과 같은 결과를 얻었다: 과발현 벼 OsPPO1 L423S/Y425I 및 과발현 애기장대 WT 모종 또는 애기장대에서의 이벤트; 과발현 콩 GmPPO1 L430S/Y432I 및 과발현 GmPPO1 WT 모종 또는 애기장대에서의 이벤트; 과발현된 유채 BnPPO1-C5 L424S/Y426I 및 과발현된 BnPPO1-C5 WT 모종 또는 애기장대에서의 이벤트; 과발현 옥수수 ZmPPO1 L424T/Y426V, ZmPPO1 L424S/Y426V, ZmPPO1 L424V/Y426L, ZmPPO1 L424W/Y426L, ZmPPO1 L424S/Y426I 및 과발현 ZmPPO1 WT 모종 또는 애기장대에서의 이벤트.
3. 제초제 저항성 시험
도 12 내지 23에 나타낸 바와 같이. 다양한 작물에서 얻은 과발현 돌연변이 종자와 야생형 애기장대 종자를 다양한 농도의 PPO 억제 제초제 화합물이 포함된 MS 배지(페트리 접시)에서 저항성 테스트를 실시하였다. 야생형 애기장대와 비교했을 때, 다른 작물에서 추출한 PPO1의 LLLNYI 단백질 모티프 돌연변이 과발현체와 과발현체 PPO1 WT 모두 본 발명의 제초제에 대해 일정 수준의 내성/내성을 보였으며, 50nM의 적용 농도에서 내성 수준은 유사했다. 그러나, 2μM의 더 높은 적용 농도에서는 다른 작물에서 과발현된 PPO1의 LLLNYI 단백질 모티프 돌연변이는 여전히 저항성을 보인 반면, 다른 작물에서 과발현된 PPO1 WT는 야생형 애기장대 대조군과 차이가 없었으며, 이러한 결과는 다른 작물에서 PPO1의 LLLNYI 단백질 모티프 돌연변이의 과발현 후 해당 작물이 PPO 억제 제초제에 대한 내성이 더 높아질 수 있음을 시사한다.
실시예 11: 제초제 저항성을 얻기 위한 벼 OSPPO1 L423S/Y425I 돌연변이 과발현
식물에서 얻은 돌연변이체의 화합물 A에 대한 내성을 추가로 테스트하기 위해, 벼에서 선별한 돌연변이체 L423S/Y425I를 벼에서 과발현시켰다.
1. 과발현 벡터의 제작
1) 프라이머: 돌연변이 L423S/Y425I를 증폭시키기 위해 선택된 제한효소 절단 부위와 유전자 자체의 염기서열에 따라 프라이머를 디자인하였다. PPO1-F:GCCAGTGCCAAGCTCTGCAGattcgggtcaaggcgga 및 PPO1-R:ACATGATTACGAATTCtctagtaacatagatgacaccgcgc로 구성된 설계된 프라이머는 Beijing Qingke Biotechnology Co., Ltd.에서 합성되었다.
2) PCR 증폭: 관심 유전자는 합성 된 프라이머와 Q5DNA 중합 효소(NEB, New England Biolabs, Boston, USA)를 사용하여 증폭되었다. 증폭된 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 검출하고 TIAN Quick Midi Purification 키트의 작동 지침에 따라 회수하였다. 회수가 완료된 후 추출된 DNA의 농도를 Nanodrop으로 측정하였다.
3) 벼 과발현 벡터 제작: 벼 과발현 벡터 pCAMBIA1301-OsPPO1 L423S/Y425I는 회수된 PPO1 단편과 KpnI 및 Hind III로 분해된 플라스미드 pCAMBIA1301을 이용하여 HanBio Biotechnology Co., Ltd., (Shanghai)의 HB-in fusionTM 심리스 클로닝 키트를 사용하여 제작한 후 컴피턴트 E.coli DH5α에 형질전환하여 양성 클론을 얻었다. 양성 클론은 시퀀싱 및 제한 엔도뉴클레이스 분해로 확인된 후 아그로박테리움으로 형질 전환되었다.
2. 벼 캘러스의 아그로박테리움 매개 형질전환 및 형질전환 이벤트의 발생:
1) 벼 과발현 벡터 pCAMBIA1301-OsPPO1 L423S / Y425I 및 pCAMBIA1301-OsPPO1 WT의 벡터 플라스미드 100ng을 흡인하여 각각 컴피턴트 Agrobacterium EH105에 첨가하였고, 얼음 위에 5분 동안 보관한 후, 액체 질소에 5분 동안 침지하여 급속 냉동하였고 37℃에서 5분 동안 꺼내서 5분 동안 방치하였으며, 마지막으로 얼음 위에 5분 동안 두었고; 여기에 500 μl의 YEB 용액 배양액(무항생제)을 첨가하고 28℃, 분당 200 rpm에서 2~3시간 동안 쉐이커에서 배양한 뒤, 3500 rpm/분에서 원심분리하여 콜로니를 수집하고, 수집된 세포를 YEB(클라리트로마이신+리팜피신) 플레이트에 코팅하여 28℃ 배양기에서 2일간 배양하고, 단일 클론을 선별하여 액체 배지에서 배양하고 박테리아의 수명을 유지하기 위해, -80℃에서 보관하였다.
2) 아그로박테리움 배양: 형질 전환된 아그로박테리움 단일 클론을 골라내어 28℃의 쉐이커에서 YEB 액체 배지(클라리트로마이신 + 리팜피신)에서 OD600이 0.5가 될 때까지 배양하고, 콜로니를 3500rpm으로 수집하고, 캘러스 형질전환을 위해 같은 양의 AAM(1ml AAM + 1μl 1000×AS) 액체 배지로 희석하였다.
3) 화이다오 5호 벼 품종에서 캘러스 유도: 아그로박테리움을 준비하기 전에 먼저 벼 캘러스를 준비하였다. 볍씨를 껍질을 벗기고 세척수가 맑아질 때까지 필요한 만큼 멸균수로 세척하였다. 그런 다음 씨앗을 70 % 알코올로 30 초 동안 소독 한 다음 5 % 차아염소산 나트륨으로 소독하였다. 수평 쉐이커에서 20분간 배양한 후 차아염소산나트륨으로 소독하고 멸균수로 5회 세척한 후 멸균 흡수지에 올려 씨앗의 표면 수분을 자연 건조시킨 다음 유도 배지에 접종하여 28℃에서 캘러스 배양을 진행하였다.
4) 아그로박테리움에 의한 벼 캘러스 형질전환: 직경 3mm의 화이다오 5호 캘러스를 10일 동안 하위 배양을 위해 선택하고 캘러스를 50ml 원심 분리 튜브에 수집하였다. 농도가 조절된 아그로박테리움 박테리아 용액을 캘러스가 들어 있는 원심분리기 튜브에 넣고 원심분리기 튜브를 28℃, 200rpm의 쉐이커에 올려 20분간 형질전환시켰고; 형질전환이 완료된 후 박테리아 용액을 배출하고 캘러스를 멸균 여과지 위에 놓고 약 20 분 동안 공기 건조시키고 AAM (1ml AAM + 30 μL 1000 × AS) 액체 배양액으로 적신 멸균 여과지를 덮은 공동 배양 접시에서 공동 배양하였으며; 형질전환 3일 후, 아그로박테리아를 세척 및 제거한 후(즉, 멸균수로 5회 세척한 후 세팔로스포린 항생제 500 mg/L로 20분간 세척) 캘러스를 선별하여 50 mg/L 하이그로마이신 선별 배지에서 배양하였다.
5) 저항성 캘러스 선별, 분화 및 발근 : 공동 배양된 캘러스를 1 차 선별 (2 주)을 위해 선별 배지로 옮겼고; 1 차 선별이 완료된 후, 새로 자란 캘러스를 2 차 선별 (2 주)을 위해 선별 배지 (50mg/L 하이그로 마이신 함유)로 옮겼으며; 선별 완료 후, 성장 상태가 좋은 황백색 캘러스 분화를 위해 골라 내고 3 ~ 4 주 후에 약 1cm의 묘목을 얻었다. 분화된 모종은 발근 배지에 옮겨 발근 배양하고, 발근한 모종은 순화 처리를 거친 후 온실에서 재배하기 위해 흙이 담긴 화분에 옮겨 심었으며; 과발현된 OsPPO1 L423S/Y425I 및 과발현된 OsPPO1 WT 모종 또는 이벤트를 획득하였다.
3. 형질 전환 모종 (T0 세대)의 제초제 내성 검출 : T0 세대 벼 모종의 과발현된 벼 OsPPO1 L423S / Y425I 및 OsPPO1 WT에 대한 내성 테스트를 위해 다양한 농도의 화합물 A를 살포하였다. 도 24에서 나타낸 바와 같이 야생형 화이다오 5호와 비교했을 때, 과발현된 벼 OsPPO1 L423S/Y425I와 과발현된 OsPPO1 WT는 모두 화합물 A에 대해 일정 수준의 내성/저항성을 나타냈다. 이들의 저항성 수준은 45g/ha 적용 농도에서는 비슷했지만 135g/ha 및 270g/ha와 같은 더 높은 적용 농도에서는 과발현 OsPPO1 L423S/Y425I가 여전히 저항성을 보인 반면 과발현 OsPPO1 WT는 야생형 대조군과 차이가 없었으며, 이는 OsPPO1 L423S/Y425I가 과발현된 벼가 화합물 A에 대한 내성이 더 높다는 것을 나타낸다.
동시에, 많은 시험을 통해 본 발명의 해당 저항성 부위 또는 조합을 형질전환 기술 또는 유전자 편집 기술로 다른 식물에 도입하면 PPO 억제 제초제에 대해서도 내성을 부여하는 것으로 밝혀져 산업적 가치가 우수하다는 것을 알 수 있다.
설명에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각 간행물 또는 특허 출원이 개별적으로 그리고 구체적으로 본 문서에 참조로 통합된 것처럼 본 문서에 참조로 통합되어 있다.
전술한 본 발명은 명확한 이해를 위해 실시예 및 구현예를 통해 보다 상세하게 설명되었으나, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에서 특정 변경 및 수정이 가능하며 상기 변경 및 수정은 모두 본 발명의 범위에 속한다는 것은 자명하다.

Claims (23)

  1. 폴리펩타이드는 모티프 "LLLNYI"를 포함하고, 상기 모티프 내 위치 3의 류신 L이 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, 위치 5의 타이로신 Y는 다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, PPO 억제 제초제에 내성을 갖는 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  2. 제1항에 있어서, 모티프 "LLLNYI" 내에서 위치 3의 류신 L이 세린 S로 돌연변이 되고; 또는
    위치 3의 류신 L이 아이소류신 I로 돌연변이 되고; 또는
    위치 3의 류신 L이 글라이신 G로 돌연변이 되고; 또는
    위치 3의 류신 L이 트레오닌 T로 돌연변이 되고; 또는
    위치 3의 류신 L이 발린 V로 돌연변이 되고; 또는
    위치 3의 류신 L이 트립토판 W로 돌연변이 되고; 또는
    위치 5의 타이로신 Y가 메싸이오닌 M으로 돌연변이 되고; 또는
    위치 5의 타이로신 Y가 아이소류신 I로 돌연변이 되고; 또는
    위치 5의 타이로신 Y가 류신 L으로 돌연변이 되고; 또는
    위치 5의 타이로신 Y가 발린 V로 돌연변이 되는 것을 특징으로 하는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  3. 제1항에 있어서, 모티프 "LLLNYI"내에서 위치 3의 류신 L이 임의의 다른 아미노산으로 치환되고, 위치 5의 티로신 Y가 임의의 다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  4. 제3항에 있어서, 모티프 "LLLNYI"내에서 위치 3의 류신 L은 세린 S로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 아이소류신 I로 돌연변이되거나; 또는
    위치 3의 류신 L은 트레오닌 T로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 아이소류신 I로 돌연변이되고; 또는
    위치 3의 류신 L은 트레오닌 T로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 발린 V로 돌연변이되고; 또는
    위치 3의 류신 L은 세린 S로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 발린 V로 돌연변이되고; 또는
    위치 3의 류신 L은 발린 V로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 류신 L로 돌연변이되고; 또는
    위치 3의 류신 L은 세린 S로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 발린 V로 돌연변이되고; 또는
    위치 3의 류신 L은 발린 V로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 류신 L로 돌연변이되고; 또는
    위치 3의 류신 L은 트립토판 W로 돌연변이되고, 위치 5의 티로신 Y는 류신 L로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 19 중 어느 하나에 규정된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 자유롭게 결합된 아미노산 서열의 돌연변이체 및 상기 돌연변이체 단편을 포함하고, 상기 돌연변이는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 것을 제외하고, 서열번호 1 내지 19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 벼 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 1에 제시된 야생형 벼 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 옥수수 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 2에 제시된 야생형 옥수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 유채 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 3에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 유채 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 4에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 땅콩 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 5에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 땅콩 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 6에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 439 및 441에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 콩 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 7에 제시된 야생형 콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 430 및 432에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 수수 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 8에 제시된 야생형 수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 밀 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 9, 10 또는 11에 제시된 야생형 밀 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 418 및 420에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 토마토 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 12에 제시된 야생형 토마토 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 감자 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 13에 제시된 야생형 감자 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 444 및 446에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 담배 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 14에 제시된 야생형 담배 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 440 및 442에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 애기장대 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 15에 제시된 야생형 애기장대 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 육지면 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 16에 제시된 야생형 육지면 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 426 및 428에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 무 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 17에 제시된 야생형 무 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 425 및 427에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 조 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 18에 제시된 야생형 조 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 422 및 424에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖거나; 또는
    야생형 양배추 PPO1의 아미노산 서열과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 19에 제시된 야생형 양배추 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 갖는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  8. 제7항에 있어서, 야생형 벼 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 1에 제시된 야생형 벼 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 L423S, L423I, L423G, Y425M, Y425I 및 Y425V로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L423S/Y425I; 또는
    야생형 옥수수 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 2에 제시된 야생형 옥수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치에 L424T, L424S, L424V, Y424W, Y426V, Y426I 및 Y426L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L424T/Y426V, L424S/Y426V, L424V/Y426L, L424W/Y426L 또는 L424S/Y426I; 또는
    야생형 유채 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 3에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치에 L424S 및 Y426I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L424S/Y426I; 또는
    야생형 유채 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 4에 제시된 야생형 유채 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 L423S 및 Y425I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L423S/Y425I; 또는
    야생형 땅콩 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 5에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치에 L445S 및 Y447I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L445S/Y447I; 또는
    야생형 땅콩 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 6에 제시된 야생형 땅콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 439 및 441에 대응하는 하나 이상의 위치에 L439S 및 Y441I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L439S/Y441I; 또는
    야생형 콩 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 7에 제시된 야생형 콩 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 430 및 432에 대응하는 하나 이상의 위치에 L430S 및 Y432I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L430S/Y432I; 또는
    야생형 수수 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 8에 제시된 야생형 수수 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 L423S 및 Y425I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L423S/Y425I; 또는
    야생형 밀 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 9, 10 또는 11에 제시된 야생형 밀 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 418 및 420에 대응하는 하나 이상의 위치에 L418S 및 Y420I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L418S/Y420I; 또는
    야생형 토마토 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 12에 제시된 야생형 토마토 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 445 및 447에 대응하는 하나 이상의 위치에 L445S 및 Y447I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L445S/Y447I; 또는
    야생형 감자 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 13에 제시된 야생형 감자 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 444 및 446에 대응하는 하나 이상의 위치에 L444S 및 Y446I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L444S/Y446I; 또는
    야생형 담배 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 14에 제시된 야생형 담배 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 440 및 442에 대응하는 하나 이상의 위치에 L440S 및 Y442I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L440S/Y442I; 또는
    야생형 애기장대 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 15에 제시된 야생형 애기장대 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 423 및 425에 대응하는 하나 이상의 위치에 L423S 및 Y425I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L423S/Y425I; 또는
    야생형 육지면 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 16에 제시된 야생형 육지면 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 426 및 428에 대응하는 하나 이상의 위치에 L426S 및 Y428I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L426S/Y428I; 또는
    야생형 무 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 17에 제시된 야생형 무 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 425 및 427에 대응하는 하나 이상의 위치에 L425S 및 Y427I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L425S/Y427I; 또는
    야생형 조 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 18에 제시된 야생형 조 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 422 및 424에 대응하는 하나 이상의 위치에 L422S 및 Y424I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 가짐: L422S/Y424I; 또는
    야생형 양배추 PPO1의 아미노산과 비교하여, PPO 폴리펩타이드의 아미노산 서열은, 서열번호 19에 제시된 야생형 양배추 PPO1 단백질의 아미노산 서열의 424 및 426에 대응하는 하나 이상의 위치에 L424S 및 Y426I로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖고; 바람직하게는 다음과 같은 돌연변이를 갖는, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편: L424S/Y426I.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 20 내지 48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편.
  10. 다음으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드:
    (1) 청구항 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 PPO 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 생리활성 단편을 인코딩하는 핵산서열 또는 이의 부분 서열 또는 상보적인 서열;
    (2) 엄격한 조건 하에서 (1)에 나타낸 서열에 혼성화되는 서열; 및
    (3) 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)로 인해 (1)에 나타낸 서열과 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열 또는 그의 상보적인 서열;
    바람직하게, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 분자임.
  11. 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물 게놈.
  12. 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상동성 또는 비상동성 프로모터를 포함하는 벡터 컨스트럭트.
  13. 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제12항에 따른 벡터 컨스트럭트을 포함하는 숙주세포; 바람직하게, 숙주 세포는 식물 세포임.
  14. 유전자 편집 방법을 사용하여 식물세포에서 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제12항에 따른 벡터 컨스트럭트을 생산하거나, 형질전환 방법을 이용하여 식물세포에 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제12항에 따른 벡터 컨스트럭트을 도입하는 단계를 포함하는, PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하기 위한 식물 세포의 생산 방법.
  15. 제13항에 따른 식물 세포 또는 제14항에 따른 방법에 의해 생산된 식물 세포를 재생하는 단계를 포함하는, PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하기 위한 식물 세포의 생산 방법.
  16. 제15항에 따른 방법에 의해 생산된 식물.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편을 생성하기 위해 PPO 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자에 변형을 도입하는 단계를 포함하는, 식물이 PPO-억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하도록 하는 방법.
  18. 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 식물의 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하는 방법으로, 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 식물에 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리 활성 단편을 발현시키는 단계를 포함하거나;
    또는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편이 발현되는 식물을 다른 식물과 혼성화하는 단계, 및 PPO-억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선할 수 있는 식물 또는 이의 일부를 스크리닝 하는 단계를 포함하거나;
    또는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편이 발현되도록 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 식물의 PPO 활성을 갖는 단백질을 유전자 편집하는 단계를 포함함.
  19. 숙주 세포, 식물 세포, 식물 줄기, 식물 부분 또는 식물의 PPO 억제 제초제에 대한 내성을 얻거나 개선하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 PPO 폴리펩타이드 또는 이의 생리활성 단편 또는 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드의 용도로, 바람직하게, 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 진균 세포임.
  20. 제초적 유효량의 PPO-억제 제초제를 재배지에 적용하는 단계를 포함하는, 식물 재배지에서 잡초를 방제하는 방법으로, 상기 식물은 제1항에 따른 식물 또는 제15항, 제17항 또는 제18항에 따른 방법에 의해 생산된 식물을 포함함.
  21. 제20항에 있어서, PPO-억제 제초제가 하나 이상의 추가 제초제와 조합하여 적용되는 방법.
  22. 제11항에 따른 식물 게놈, 제13항에 따른 숙주 세포, 제16항에 따른 식물, 제15항, 제17항, 제18항 또는 제20항에 따른 방법, 또는 제19항에 따른 용도에 있어서, 상기 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎 식물이고; 바람직하게, 식물은 벼(Oryza sativa L.), 수수(Sorghum bicolor), 밀(Triticum aestivum), 보리(Hordeum vulgare), 조(Setaria italica), 옥수수(Zea mays), 사탕수수(Saccharum officinarum), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 콩(Glycine max), 땅콩(Arachis hypogaea), 담배(Nicotiana tabacum), 목화(Gossypium hirsutum), 무(Raphanus sativus), 양배추(Brassica oleracea), 고구마(Dioscorea esculenta), 참마(Dioscorea cayenensis), 카사바(Manihot esculenta), 감자(Solanum tuberosum), 토마토(Solanum lycopersicum), 고추(Capsicum annuum), 가지(Solanum melongena), 수박(Citrullus lanatus), 호박(Cucurbita moschata), 오이(Cucumis sativus), 상추(Lactuca sativa), 참깨(Sesamum indicum), 유채(Brassica napus), 해바라기(Helianthus annuus), 뽕나무(Morus alba), 동부콩(Vigna unguiculata), 딸기(Fragaria ananassa), 사과(Malus Domestica), 복숭아 (Prunus persica), 체리 (Prunus pseudocerasus), 살구 (Prunus armeniaca), 포도덩굴 (Vitis vinifera), 파파야 (Carica papaya) 또는 알팔파 (Medicago sativa)임.
  23. 제15항, 제17항, 제18항 또는 제20항에 따른 방법, 또는 제19항에 따른 용도에 있어서, 상기 PPO 억제 제초제는 피리미딘디온(pyrimidinediones), 디페닐-에테르(diphenyl-ethers), 페닐피라졸(phenylpyrazoles), N-페닐프탈이미드(N-phenylphthalimides), 티아디아졸(thiadiazoles), 옥사디아졸(oxadiazoles), 트리아졸리논(triazolinones), 옥사졸리딘디온(oxazolidinediones) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이고, 바람직하게,
    (1) 피리미딘디온에는 다음이 포함됨: 부타페나실(butafenacil), 사플루페나실(saflufenacil) 벤즈펜디존(benzfendizone), 티아페나실(tiafenacil), [3-[2-클로로-4-플루오로-5-(1-메틸-6-트리플루오로메틸-2,4-다이옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리미딘-3-일)페녹시]-2-피리딜록시]아세트산 에틸에스테르 ([3-[2-Chloro-4-fluoro-5-(1-methyl-6-trifluoromethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-3-yl) phenoxy]-2-pyridyloxy]acetic acid ethyl ester), 1-메틸-6-트리플루오로메틸-3-(2,2, 7-트리플루오로-3-옥소-4-프로-2-이니일-3,4-디하이드로-2H-벤조[1,4]옥사진-6-일)-1H-피리미딘-2,4-디온 (1-methyl-6-trifluoromethyl-3-(2,2,7-trifluoro -3-oxo-4-prop-2-ynyl-3,4-dihydro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-yl)-1H-pyrimidine-2,4-dione), 3-[7-클로로-5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)-1H-벤지미다졸-4-일]-1-메틸-6-(트리플루오로메틸)-1H-피리미딘-2,4디온(3-[7-chloro-5-fluoro-2-(trifluoromethyl)-1H-benzimidazol-4-yl]-1-methyl-6-(trifluoromethyl)-1H- pyrimidine-2,4-dione), 플루프로파실(flupropacil), 및 ;
    (2) 디페닐 에테르에는 다음이 포함됨: 포메사펜(fomesafen), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen), 아클로니펜(aclonifen), 락토펜(lactofen), 클로메톡시펜(chlomethoxyfen), 클로르니트로펜(chlornitrofen), 플루오로글리코펜-에틸(fluoroglycofen-ethyl), 아시플루오르펜(acifluorfen) 또는 나트륨염, 비페녹스(bifenox), 에톡시펜(ethoxyfen), 에톡시펜-에틸(ethoxyfen-ethyl), 플루오로니트로펜(fluoronitrofen), 푸리록시펜(furyloxyfen), 니트로플루오르펜(nitrofluorfen) 및 할로사펜(halosafen);
    (3) 페닐피라졸에는 다음이 포함됨: 피라플루펜-에틸(pyraflufen-ethyl) 및 플루아졸레이트(fluazolate);
    (4) N-페닐프탈이미드에는 다음이 포함됨: 플루미옥사진(flumioxazin), 시니돈-에틸(cinidon-ethyl), 플루미프로핀(flumipropyn) 및 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl);
    (5) 티아디아졸에는 다음이 포함됨: 플루티아세트-메틸(fluthiacet-methyl), 플루티아세트(fluthiacet) 및 티디아지민(thidiazimin);
    (6) 옥사디아졸에는 다음이 포함됨: 옥사디아르길(oxadiargyl) 및 옥사디아존(oxadiazon);
    (7) 트리아졸리논에는 다음이 포함됨: 카르펜트라존(carfentrazone), 카르펜트라존-에틸(carfentrazone-ethyl), 설펜트라존(sulfentrazone), 아자페니딘(azafenidin) 및 벤카르바존(bencarbazone);
    (8) 옥사졸리딘디온에는 다음이 포함됨: 펜톡사존(pentoxazone);
    기타 제초제는 다음을 포함한다: 피라클로닐(pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸(profluazol), 트리플루디목사진(trifludimoxazin), N-에틸-3-(2,6-디클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복사미드(N-ethyl-3-(2,6- dichloro-4-trifluoromethylphenoxy)-5-methyl-1H-pyrazole-1-carboxamide), N -테트라히드로푸르푸릴-3-(2,6-디클로로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복사미드(N-tetrahydrofurfuryl-3- (2,6-dichloro-4-trifluoromethylphenoxy)-5-methyl-1H-pyrazole-1-carboxamide), N-에틸 -3-(2-클로로- 6-플루오로-4-트리플루오로메틸페녹시)-5-메틸-1H-피라졸-1-카르복사미드(N-ethyl-3-(2- chloro-6-fluoro-4-trifluoromethylphenoxy)-5-methyl-1H-pyrazole-1-carboxamide), N-테트라히드로푸르푸릴-3-(2-클로로-6-플루오로-4-트리플루오로메틸페녹시) -5-메틸-1H-피라졸-1-카르복사미드(N-tetrahydrofurfuryl-3-(2-chloro-6-fluoro-4-trifluoromethylphenoxy)-5-methyl-1H-pyrazole-1- carboxamide), 3-[7-플루오로-3-옥소-4-(프로프-2-이닐)-3,4-디히드로 - 2H-벤조[1,4]옥사진-6-일]-1,5-디메틸-6-티옥소[1,3,5]트리아지난-2,4-디온 (3-[7-Fluoro-3-oxo-4-(prop-2-ynyl)-3,4-dihydro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-yl]-1,5- dimethyl-6-thioxo[1,3,5]triazinane-2,4-dione), 2 -(2,2,7-트리플루오로-3-옥소-4-프로프-2-이닐-3,4-디히드로-2H-벤조[1,4]옥사진-6-일)-4,5,6,7 -테트라하이드로이소인돌-1,3-디온(2-(2,2,7-Trifluoro-3-oxo-4-prop-2-ynyl-3,4-dihydro- 2H-benzo[1,4]oxazin-6-yl)-4,5,6,7-tetrahydroisoindole-1,3-dione), 메틸(E)-4-[2-클로로-5-[4-클로로-5-(디플루오로메톡시)-1H-메틸피라졸-3- 일]-4-플루오로페녹시]-3-메톡시-부트-2-에노에이트(methyl (E)-4-[2-chloro-5-[4- chloro-5-(difluoromethoxy)-1H-methylpyrazol-3-yl]-4-fluorophenoxy]-3-methoxy-but-2-enoate), 페닐피리딘(phenylpyridines), 벤조옥사지논(benzoxazinone) 유도체, 및 일반식 I로 표시되는 화합물 ,
    상기, Q는 , , , , , , , , , , , , , , , , 또는 를 나타내고;
    Y는 할로겐, 할로겐화된 C1-C6 알킬 또는 시아노를 나타내며;
    Z는 할로겐을 나타내고;
    M은 CH 또는 N을 나타내며;
    X는 -CX1X2-(C1-C6 알킬)n-, -(C1-C6 알킬)-CX1X2-(C1-C6 알킬)n- 또는 -(CH2)r-를 나타내며, n은 0 또는 1을 나타내고, r은 2보다 크거나 같은 정수를 나타내고;
    X1 및 X2는 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 할로겐화 C1-C6 알킬, 할로겐화 C2-C6 알케닐, 할로겐화 C2-C6 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, C3-C6 사이클로알킬 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 알킬설파닐, 하이드록시 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 C1-C6 알킬, 페닐 또는 벤질을 나타내며;
    X3 및 X4는 독립적으로 O 또는 S를 나타내고;
    W는 하이드록실, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐옥시, C2-C6 알키닐옥시, 할로겐화 C1-C6 알콕시, 할로겐화 C2-C6 알케닐옥시, 할로겐화 C2-C6 알키닐옥시, C3-C6 사이클로알킬옥시, 페녹시, 설피드릴, C1-C6 알킬설파닐, C2-C6 알케닐설파닐, C2-C6 알키닐설파닐, 할로겐화 C1-C6 알킬설파닐, 할로겐화 C2-C6 알케닐설파닐, 할로겐화 C2-C6 알키닐설파닐, C3-C6 사이클로알킬설파닐, 페닐설파닐, 아미노 또는 C1-C6 알킬아미노를 나타내며;
    더 바람직하게, Q는 를 나타내고; Y는 염소를 나타내며; Z는 불소를 나타내고; M은 CH를 나타내며; X는 -C*X1X2-(C1-C6 알킬)n-을 나타내고, n은 0을 나타내고; X1은 수소를 나타내고; X2는 메틸을 나타내고; X3 및 X4는 독립적으로 O를 나타내고; W는 메톡시를 나타냄; 여기서 C*는 키랄 중심이고, 화합물은 R 배열임.
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