CZ296023B6 - Transgenní rostlina se změněnou aktivitou protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), která je tolerantní k herbicidu, semena a potomstvo rostliny a způsob přípravy takové rostliny - Google Patents
Transgenní rostlina se změněnou aktivitou protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), která je tolerantní k herbicidu, semena a potomstvo rostliny a způsob přípravy takové rostliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296023B6 CZ296023B6 CZ2002620A CZ2002620A CZ296023B6 CZ 296023 B6 CZ296023 B6 CZ 296023B6 CZ 2002620 A CZ2002620 A CZ 2002620A CZ 2002620 A CZ2002620 A CZ 2002620A CZ 296023 B6 CZ296023 B6 CZ 296023B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protox
- plant
- herbicide
- formula
- gene
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
- C12Y103/03004—Protoporphyrinogen oxidase (1.3.3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení poskytuje rostlinné buňky a rostliny tolerantní k herbicidu. Rostliny podle vynálezu (např. kukuřice, pšenice, čirok, žito, oves, trávy a rýže) jsou transformovány prokaryontními sekvencemi kódujícími protox divokého typu nebo modifikovanými sekvencemi kódujícími protox, která je tolerantní k herbicidu. Dále se týká způsobu kontroly růstu nežádoucí vegetace a způsobu selekce transformovaných rostlin.
Description
Transgenní rostlina se změněnou aktivitou protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), která je tolerantní k herbicidu, semena a potomstvo rostliny a způsob přípravy takové rostliny
Oblast techniky
Vynález se týká rostlinných buněk a rostlin tolerantních k herbicidu. Rostliny podle vynálezu (např. kukuřice, pšenice, čirok, žito, oves, trávy a rýže) jsou transformovány prokaryontními sekvencemi kódujícími protox divokého typu nebo modifikovanými sekvencemi kódujícími protox, která je tolerantní k herbicidu. Dále se vynález týká způsobu kontroly růstu nežádoucí vegetace a způsobu selekce transformovaných rostlin.
Dosavadní stav techniky
Biosyntetické cesty, které vedou k produkci chlorofylu a hernu mají řadu společných kroků. Chlorofyl je pigment, který dokáže využívat světlo a je přítomný ve všech zelených fytosyntetických organizmech. Hem je kofaktor hemoglobinu, cytochromů, P450 více funkčních oxygenáz, peroxidáz a kataláz (např. Lehninger, Biochemistry. Worth Publishers, New York (1975)) a je proto nezbytným komponentem pro všechny aerobní organizmy.
Poslední společný krok při biosyntéze chlorofylu a hernu je oxidace protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX. Protoporfyrinogenová oxidáza (dále jen „protox“) je enzym, který katalyzuje tento poslední oxidační krok. (Matringe et al., Biochem. J. 260:231 (1989)).
Enzym protox byl purifíkovaný buď částečně nebo zcela z řady organizmů, k nimž patří kvasinka Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, in Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, ed. McGraw Hill: New York, pp.235-285 (1990)), zetioplastů ječmene (Jakobs and Jakobs, Biochem. J. 244:219 (1987)), a z myších jater (Dailey and Karr, Biochem. 26:2697 (1987)). Geny, které kódují protox, byly izolovány ze dvou prokaryotických organizmů Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) a Bacillus substilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Tyto geny nemají podobné sekvence; ani nezpůsobují, že z nich odvozené proteiny mají společné sekvence aminokyselin. Molekulová hmotnost proteinu z E. coli je přibližně 21 kDa a nachází se v buněčné membráně. Molekulová hmotnost proteinu z B. subtilis je 51 kDa, je rozpustný a má cytoplazmatickou aktivitu.
V současné době není dostupných mnoho informací o enzymu protox, které by umožňovaly použít známé metody pro izolaci protox genů z vyšších eukaryontních organizmů (tj. zvířata, rostliny a všechny další vícebuněčné jaderné organizmy, které se odlišují od nižších eukaryontních organizmů jako jsou kvasinky, jednobuněčné řasy, protozoa atd).
Rada standardních metod pro izolaci nových proteinů a genů je založena na domněnce, že jestliže nové proteiny a geny mají primární strukturu (tj. aminokyselinu a DNK sekvence) významně podobnou se strukturou známých proteinů a genů, pak jejich funkce jsou stejné. Takové standardní metody jsou hybridizace nukleových kyselin a amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí za použití oligonukleotidových primerů, které odpovídají motivům konzervativní sekvence aminokyselin. Tyto metody se nezdály býti použitelné pro izolaci eukaryontních protox genů vzhledem současně dostupné strukturální informaci, protože neexistuje podstatná strukturální podobnost dokonce ani mezi známými prokaryotickými protox geny a proteiny.
Další způsob užívaný pro izolaci bíosyntetických genů z vyšších eukaryontů u jiných metabolických cest je komplementace mikrobiálních mutantů, které mají nedostatečnou aktivitu, o níž je zájem. Za tímto účelem, knihovna cDNK z vyšších eukaryontů je klonována do vektoru, který může přímo vyjádřit cDNK v mikrobiálním hostiteli. Vektor je pak transformován nebo jinak vnesen do mutantního mikrobu a je možno selektovat kolonie, které už nemají fenotyp mutanta.
-1 CZ 296023 B6
Tato strategie funguje pro izolaci genů z vyšších eukaryontů, které se vyskytují v několika metabolických cestách jako jsou biosyntéza histidinu (např. patent US 5290926 a WO 94/026909, Ward et al., zde jako reference), biosyntéza lyzinu (např. Frish et al., zde jako reference), biosyntéza lyzinu (např. Frish et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), biosyntéza purinu (např. Aimi et al., J. Biol. Chem. 265:9011 (1990)) a biosyntéza tryptofanu (např. Niyogi et al., Plant Cell 5:1011 (1993)). Přestože mikrobiální mutanty, které mají nedostatečnou protox aktivitu, jsou dostupné (např. E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) a Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106.724 (1982)), použití tohoto postupu pro izolaci cDNK kódující eukaryontní protox enzymatickou aktivitu je založeno na dostupné informaci.
Je pro to několik důvodů. První důvod, eukaryontní protox sekvence cDNK nemusí být vyjádřeny v mutantním mikrobu v dostatečné míře, například proto, že je použit kodon, který neodpovídá preferencím mikrobiálního hostitele. Druhý důvod, primární translační produkt odvozený z eukaryontních kódujících sekvencí nemusí produkovat funkční polypeptid, protože například k vytvoření polypeptidu s příslušnou aktivitou je třeba posttranslační modifikace, jako je glykozylace, a ta v mikrobech neprobíhá. Třetí důvod, eukaryontní protein nemá v mikrobiálním hostiteli předpokládanou aktivní konformaci, například protein je směrován do organelového membránového systému, který mikrobiální hostitel nemá. Tato poslední možnost je zvláště pravděpodobná u protox enzymu rostlin, který se vyskytuje v organelách rostlinných buněk, jež nejsou přítomny v mikrobiálním hostiteli. Zejména u rostlinných protox enzymů, které jsou spojovány s obalem chloroplastu a thylakoidovými membránami (Matringe et al., J. Biol. Chem. 267: 4646 (1992)), u nichž se předpokládá, že membránových systémů dosahují na základě posttranslačního mechanizmu, který zahrnuje tranzitní sekvence N-konce a intrinsické vlastnosti zralého peptidu (např. Kohorn and Tobin, Plant Cell 1:159 (1989), Li et al., Plant Cell 3:709 (1991), Li et al., J. Biol. Chem. 267:18999 (1992)).
Protox enzym hraje roli u jistých lidských onemocnění. Pacienti trpící nemocí, s vrozenou autozomálně dominantní dědičností, porphyria variegata, která je charakterizována neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi, mají sníženou protox aktivitu (Brenner and Bloomer, New Engl., J. Med. 302:765 (1980)). Vzhledem ktomu, že neexistuje dostatek informací o lidském protox enzymu a jeho genu, diagnostika a léčba této nemoci je velmi limitována.
Univerzální praxí se stalo použití herbicidů k ničení nežádoucí vegetace jako je plevel. Vynaložené náklady přesahují ročně částku jedné miliardy dolarů. Přesto plevel stále zůstává podstatným finančním problémem farmářů.
Účinné používání herbicidů vyžaduje dobré řízení. Například doba a metoda aplikace herbicidů a vývojová fáze plevelu jsou podstatná kritéria pro úspěšnou kontrolu plevelnosti plodin. Vzhledem k tomu, že různé druhy plevelných rostlin jsou rezistentní k herbicidům, produkce účinných herbicidů je stále důležitější.
Bohužel, herbicidy, které vykazují vyšší potenci, působí na širší spektrum plevelných rostlin a jsou v půdě rychleji degradovány, mohou také mít vyšší toxicitu k žádaným plodinám. Jedno řešení tohoto problému je vyvinout rostlinu, která je rezistentní nebo tolerantní k herbicidům. Hybridy plodin nebo různé varianty rezistentní k herbicidům umožňují jejich použití bez nebezpečí poškození plodiny. Vývoj rezistence může umožnit aplikaci herbicidu na plodinu, kde dříve jeho použití bylo nemožné nebo limitované díky její senzitivitě k herbicidu. Například U.S. Patent č. 4,761,373 Anderson et al., se týká rezistence rostlin k různým imidazolinonovým nebo sulfonamidovým herbicidům. Enzym pozměněné syntetázy acetohydroxykyseliny (AHAS) způsobuje tuto rezistenci. Patent US 4 975 374 Goodman et al., se týká rostlinných buněk a rostlin obsahující gen kódující mutantní glutaminovou syntetázu (GS). Tyto rostliny jsou rezistentní k herbicidům, které inhibují GS, například fosfinothricin a methionin sulfoximin. Patent US 5 013 659 Bedbrook et al., se týká rostlin, které exprimují mutantní acetolaktátovou synte
-2CZ 296023 B6 tážu, která propůjčuje rostlinám rezistenci k herbicidům, jejichž aktivní látka je sulfonylmočovina. Patent US 5 162 602 Somers et al., dokládá toleranci rostlin k herbicidům, jejichž účinek je postaven na působení látek cyclohexanedion a aryloxyfenoxypropanová kyselina. Tolerance je způsobena funkcí pozměněné acetyl koenzym A karboxylázou (ACCáza).
Protox enzym se jeví jako cílová sloučenina pro řadu herbicidních sloučenin. Herbicidy, které inhibují protox enzym zahrnují molekuly různých strukturálních tříd (Duke et al., Weed Sci 39:465 (1991), Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992), Matringe et al., FEBS Lett. 245:35 (1989), Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). Tyto sloučeniny s herbicidním účinkem zahrnují difenylethery {např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen, 2-chlorol-(3-ethoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)}, oxadiazoly, (např. oxidiazon, 3-[2,4dichloro-5-( 1 -methylethoxy)fenyl]-5-) 1, l-dimethylethyl)-l ,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalimin, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2-[l-(2,3,4-trichlorfenyl)^f-nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), deriváty pyridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy. Rada těchto sloučenin inhibuje enzymy katalyzované reakce nebo funguje jako substrátové analogy.
Inhibiční účinek protox inhibujících herbicidů je vysvětlován akumulací protoporfyrinogenu IX v chloroplastu, což vede průniku protoporfyrinogenu IX do cytozolu, kde je oxidován peroxidázovou aktivitou na protopyrfyrin IX. Po světelné expozici protoporfyrin IX může způsobit v cytozolu vytvoření formace singletového kyslíku. Tento singletový kyslík může vytvářet další reaktivní kyslíkové formace, které mohou způsobovat peroxidaci lipidů a rozrušení membrán, což vede k rychlému usmrcení buněk (Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993)).
Ne všechny protox enzymy jsou citlivé na herbicidy, které inhibují jejich rostlinné druhy. Protox enzymy, které jsou kódovány geny izolovanými zEscherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39:1155 (1993)) a zBacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)), jsou rezistentní k těmto herbicidům. Navíc, byly popsány mutanty jednobuněčné řasy Chlemydomonas reinhardtii, které jsou rezistentní fenylimidovému herbicidu S-23142 (Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15:449 (1990); Shibata et al., v Research in Photosynthesis, vol. III, N. Murata, ed. Kluver: Netherlands, pp. 567-570 (1992)). Nejméně jeden z těchto mutantů má pozměněnou protox aktivitu, což vede k rezistenci ne pouze na herbicidní inhibitor, jehož pomocí byl mutant selektován, ale také na další třídy protox inhibitorů (Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c:339 (1993); Sáto et al., v ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Dále byl popsán mutant buňky tabáku, který je rezistentní k inhibitoru S-21432 (Che et al., Z. Naturforsch. 48c:350 (1993).
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká chimérického genu, který obsahuje molekulu DNK kódující enzym protoporfyrinogenové oxidázy (protox) z prokaryontního organizmu.
Vzhledem k informacím, které tento vynález poskytuje, DNK kódující sekvence enzymu protoporfyrinogenové oxidázy (protox) z prokaryontního organizmu mohou být získány použitím standardní metody.
Vynález dále popisuje rekombinantní vektory obsahující zmíněné chimérické geny. Tyto rekombinantní vektory obsahují chimérický gen, který obsahuje promotor, výhodně promotor aktivní v rostlině, který je operabilně vázán k molekule DNK kódující enzym protopyrfyrinogenové oxidázy (protox), izolované z prokaryontního organizmu. Rekombinantní vektor může dále obsahovat signální sekvenci, která je operabilně vázána k řečené molekule DNK. Tato signální sek-3CZ 296023 B6 vence je schopná směrovat protein, kódovaný DNK molekulou, do chloroplastu nebo mitochondria.
Tento vynález dále poskytuje rostliny, rostlinné buňky, rostlinnou tkáň a rostlinná semena s pozměněnou protox aktivitou, které jsou rezistentní nebo při nejmenším tolerantní k působení herbicidů, jenž jsou za normálních podmínek přirozenými inhibitory protox aktivity v rostlinách. Předmětem vynálezu jsou rostliny, u kterých pozměněná protox aktivita je způsobena nadměrnou expresí protox enzymu divokého typu nebo expresí molekuly DNK, kódující protox enzym tolerantní k herbicidu. Zmíněný protox enzym tolerantní k herbicidu může být modifikovaná forma protox enzymu, který se přirozeně vyskytuje v prokaryontech. Rostliny, které jsou ve vynálezu zdůrazňovány, zahrnují jednoděložné, dvouděložné rostliny a zvláště pak hybridní rostliny. Preferovány jsou ty rostliny, jež jsou potenciálním cílem pro protox inhibující herbicidy, jde o agronomicky důležité plodiny takové jako kukuřice a další obilniny, jako jsou pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, turfové a krmné traviny, stejně jako bavlna, tabák, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejná a sója.
Vynález dále zahrnuje rostlinný množící materiál; semena ošetřená ochranným povlakem, který je tvořen přípravkem ze skupiny herbicidů, insekticidů, fungicidů, baktericidů, molluscicidů nebo jejich směsí.
Vynález popisuje metody produkce rostlin, rostlinných buněk, rostlinných tkání a semen jejich transgenického potomstva, které obsahuje enzym protox rezistentní nebo tolerantní k herbicidu v koncentraci, která inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu. Zmíněná rezistence nebo tolerance může být získána v transgenických rostlinách exprimující se molekuly DNK kódující modifikovanou formu protox enzymu, který se přirozeně vyskytuje v eukaryontu, v rostlině, v prokaryontech nebo protox enzymu, který je modifikovanou formou proteinu přirozeně se vyskytující prokaryontech.
Vynález popisuje přípravu transgenické rostliny kukuřice, kukuřičné tkáně a semen a jejich transgenického potomstva, které byly stabilně transformovány rekombinantní molekulou DNK, jenž obsahuje vhodný promotor, je funkční v rostlinách, operabilně svázaný se strukturním genem kódujícím nemodifikovaný prokaryontní protox enzym rezistentní k herbicidu.
Vynález se týká produkce rostlin, které exprimují pozměněný protox enzym, jenž je tolerantní k inhibici herbicidu v koncentraci inhibující aktivitu divokého typu nezměněného protox enzymu. Rostlina může být stabilně transformována rekombinantní molekulou DNK, která obsahuje strukturní gen kódující rezistentní protox nebo může být vytvořena přímou selekční metodou, kterou je izolována, charakterizována a vyvinuta linie rostlin rezistentní k herbicidu.
Dále vynález popisuje metodu pro kontrolu růstu nežádoucích rostlin. Jde o aplikaci účinného množství protox-inhibujícího herbicidu na populaci rostlin s pozměněnou protox aktivitou, která je rezistentní k herbicidu v koncentraci jenž inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu v rostlině. Touto cestou jsou především chráněny rostliny, které jsou potencionálním cílem protox-inhibujících herbicidů, zvláště pak agronomicky významné plodiny, například kukuřice a obilniny, mezi něž patří pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, a dále jde o turfové a krmné traviny, bavlna, tabák, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejná a sója. Mezi herbicidy s protox inhibiční aktivitou patří aryluracil, difenylether, oxidiazol, imid, fenyl pyrazol, derivát pyridinu, fenopylat a O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatový analog fenopylatu.
Vynález také zahrnuje rekombinantní produkci protox enzymu a metody použití rekombinantně produkovaného protoxu. Dále popisuje hostitelské buňky, zvláště buňky selektované ze skupiny rostlinných, zvířecích, bakteriálních, kvasinkových a hmyzích buněk, které jsou stabilně transformovány rekombinantní molekulou DNK, obsahující vhodný promotor. Promotor by měl být funkční v hostitelské buňce a měl by být operabilně vázán ke strukturnímu genu, který kóduje
-4CZ 296023 B6 nemodifikovaný nebo modifikovaný eukaryontní protox enzym, zmíněný hostitel je schopný exprimovat molekulu DNK.
Vynález poskytuje metody použití purifikovaného protoxu pro zjištění protox-inhibující aktivity u nových herbicidů a pro identifikaci protox mutantů, které jsou rezistentní na daný herbicid.
Vynález popisuje metodu na testování chemikálii z hlediska její schopnosti v rostlině inhibovat aktivitu protox enzymu, metoda spočívá v (a) kombinaci zmíněného protox enzymu a protoporfyrinogenu IX v první reakční směsi, za takových podmínek, že protox enzym je schopný katalyzovat konverzi protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX;
(b) kombinaci zmíněné chemikálie, protox enzymu a protoporfyrinogenu IX v druhé reakční směsi za stejných podmínek jako probíhá první reakce;
(c) excitování první a druhé reakční směsi v přibližném rozmezí 395 až 410 nM;
(d) porovnání fluorescence zmíněné první a druhé reakční směsi v přibližném rozmezí 622 až 635 nM;
jestliže fluorescence druhé reakční směsi je podstatně nižší než u první reakční směsi, znamená to, že zmíněná chemikálie je schopna inhibovat aktivitu popsaného protox enzymu.
Dalším se vynález týká metody umožňující identifikaci modifikovaného protox enzymu rezistentního k protox inhibitoru, který je přítomný v populaci buněk. Metoda se sestává z těchto kroků (a) kultivace populace buněk v přítomnosti protox inhibitoru v koncentraci, která inhibuje nemodifikovanou formu řečeného protox enzymu;
(b) selekce buněk (definovaných odst. (a)), jejichž růst není inhibován;
(c) izolace a identifikace protox enzymu přítomného v buňkách selektovaných z bodu (b).
Geny kódující pozměněný protox mohou být použity jako selekční markry při transformaci rostlinných buněk. Vynález dále poskytuje metodu selekce rostlin, rostlinné tkáně nebo rostlinných buněk transformovaných transgenem pocházející z netransformovaných rostlin. Tato metoda se sestává z těchto kroků (a) transformace rostliny, rostlinné tkáně nebo rostlinné buňky transgenem, který je schopný býti exprimován rostlinou, a genem kódujícím pozměněný protox rezistentní k protox inhibitoru;
(b) přenesení takto transformovaných rostlin nebo rostlinných buněk do média, které obsahuje protox inhibitor;
(c) selekce rostlin nebo rostlinných buněk, které v médiu přežijí.
Vynález dále popisuje sondy a metody pro detekci přítomnosti a formy protox genu a kvantifikace síly transkripce protoxu v organizmu. Tyto metody mohou být používány pro diagnostiku onemocnění, které jsou spojeny s pozměněnou formou protox enzymu nebo s pozměněnou silou jeho exprese.
Tento vynález souvisí s izolovanou molekulou DNK, která kóduje eukaryontní formu protoporfyrinogenové oxidázy (zde označenou jako „protox“), což je enzym, který katalyzuje oxidaci protporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX. DNK kódující sekvence a korespondující sekvence aminokyseliny protox enzymu zArabidopsis thaliana jsou popsány v SEQ IDč. 1-4 a 9-10. DNK kódující sekvence a korespondující sekvence aminokyseliny kukuřičného protox enzymu jsou popsány v SEQ ID č. 5-8.
Podle tohoto vynálezu může být izolována libovolná eukaryontní DNK kódující protox enzym. Jedna metoda používaná pro izolaci eukaryontních protox kódujících sekvencí je popsána v příkladu 1. Použitím této metody jsou identifikovány klony cDNK, kódující protox enzym, z knihovny cDNK klonů odvozených z eukaryontů. Metoda je založena na schopnosti těchto klonů propůjčit protox enzymatickou aktivitu mutantnímu hostitelskému organizmu, kde tato aktivita je nedostatečná Vhodné hostitelské organizmy jsou takové, které mohou být použity pro screening exprese cDNK knihoven a jejichž mutanty, kterým chybí protox aktivita, jsou dostupné nebo mohou být jednoduše vytvořeny. Mezi takové hostitelské organizmy patří E. coli (Sasrman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., 174:3953 (1992)) a Saccharomyces cerevisiae (Comadro et al., Biochem. Res. Comn. 106:724 (1982)).
V jiném případě eukaryontní protox kódující sekvence mohou být izolovány dobře známými postupy, založenými na homologii zmíněné sekvence se sekvencemi protox enzymu z Arabidopsis thaliana (SEQ ID č 1,3 a 9) Zea mays (SEQ ID č. 5 a 7). U těchto postupů je používána celá nebo část známé protox kódující sekvence jako sonda pro selektivní hybridizace s dalšími protox kódujícími sekvencemi, které jsou přítomny ve skupině klonovaných fragmentů genomické DNK nebo fragmentů cDNK (např. genomická nebo cDNK knihovna) pocházejících ze zvoleného organizmu. Tyto postupy zahrnují hybridizaci s DNK knihovnami kultivovanými na plotnách (buď plaky nebo kolonie; např. Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) a PCR amplifikaci za použití oligonukleotidových primerů, které korespondují s konzervativními oblastmi sekvencí protox aminokyselin (např. Innis et al., PCR Protocos, a Guide to Methods and Applications eds., Academie Press (1990)). Tyto metody jsou zvláště vhodné k izolaci protox kódujících sekvencí z organizmů, které jsou příbuzné z organizmy, z nichž je odvozena sekvence sondy. Například sonda, která je tvořena sekvencemi z Arabidopsis thaliana a z Zea mays je pravděpodobně vhodná pro izolaci protox kódujících sekvencí zjiných rostlinných druhů. Izolované eukaryontní protox sekvence, popsané v tomto vynálezu, mohou být manipulovány použitím standardních postupů genového inženýrství a tak jsou vhodné pro použití k libovolnému účelu. Například celá protox sekvence nebo její části mohou být použity jako sondy, které jsou schopny specificky hybridizovat s protox kódujícími sekvencemi a mRNK. Za účelem dosažení specifické hybridizace za různých podmínek, tyto sondy zahrnují sekvence, které jsou jedinečné mezi protox kódujícími sekvencemi. Jejich délka je nejméně 10 nukleotidů, preferují se sondy o délce 20 nukleotidů. Takové sondy mohou být používány pro amplifikaci a analýzu protox kódujících sekvencí ze zvoleného organizmu pomocí dobře známé metody, kterou je polymerázová řetězová reakce (PCR). Tato metoda je použitelná pro izolaci dalších protox kódujících sekvencí za žádaných organizmů nebo jako diagnostický test pro určení přítomnosti protox kódujících sekvencí v organizmu a dále pro odhalení souvislosti výskytu pozměněných kódujících sekvencí s určitým nepříznivým stavem, jako je u lidí autozomální dominantní onemocnění, které je charakterizované neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi. U tohoto onemocnění je snížena úroveň protox aktivity (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765 (1980)).
Protox specifické hybridizační sondy mohou být také používány k mapování umístění přirozeného eukaryontního protox genu(ů) v genomu vybraného organizmu. K tomuto účelu jsou vhodné standardní postupy založené na selektivní hybridizaci sondy k genomovým protox sekvencím. Tyto postupy se stávají z identifikace DNK polymorfizmů, které jsou obsaženy v sekvenci protox sondy, a z využití takového polymorfizmů k následné segregaci protox genu vztaženého k dalším markrům, jejichž pozice je známa při mapování populace, která je odvozená ze samooplodnění hybridu dvou polymorfních parentálních linií (např. Helentjaris et al., Plant
-6CZ 296023 B6
Mol. Biol. 5:109 (1985), Sommer et al., Biotechniques 12:82 (1992), DOvidio et al., Plant Mol. Biol. 15:169 (1990). Zatímco libovolná eukaryontní protox sekvence je použitelná jako sonda pro mapování protox genů eukaryontního organizmu, mezi preferované sondy patří ty protox sekvence, které jsou získány z organizmů příbuzných k zvolenému organizmu. Nejvíce preferované sondy jsou ty protox sekvence, které jsou ze samotného zvoleného organizmu. Mapování protox genů tímto způsobem je využitelné při šlechtění rostlin. Například tím, že je známa pozice mutantního protox genu v genetické mapě, který nese rezistenci k herbicidu, lemovací DNK markry mohou být identifikovány z referenční genetické mapy (např. Helentjaris, Trend Genet. 3:217 (1987)). Během introgrese herbicidní rezistence do nové šlechtěné linie, mohou být tyto markry použité k monitorování rozsahu k protoxu vázané lemovací chromozomální DNK, která je stále přítomna v opakujícím se původci po každém kole back-crossing.
Northen blot analýza, využívající protox specifické hybridizační sondy, může být použita ke kvantifikaci množství protox mRNK v organizmu. Tato metoda je vhodná pro diagnostický test k určení změny síly protox exprese, což může být spojeno s určitým nepříznivým stavem, jako je u lidí autozomální dominantní onemocnění, které je charakterizované neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi. U tohoto onemocnění je snížena úroveň protox aktivity (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765 (1980)).
Za účelem rekombinantní produkce enzymu v hostitelském organizmu, protox kódující sekvence je vložena do expresivní kazety, která je navržena pro zvoleného hostitele, a je vnesena do hostitele, kde je exprimována. Volba specifických regulačních sekvencí jako je promotor, signální sekvence, 5' a 3' nepřekládané sekvence a zesilovač transkripce je závislá na schopnostech odborníka. Výsledná molekula, obsahující jednotlivé elementy vázané k vhodnému čtecímu rámci, může být vložena do vektoru, který je schopen být transformován do hostitelské buňky. Vhodné expresivní vektory a metody pro rekombinantní produkci proteinů jsou charakterizovány pro hostitelské organizmy jako jsou E. coli (např. Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986), Brosius, DNK 8:759 (1989)), kvasinky (např. Schneider and Guarente, Meth. Enzymol. 194:373 (1991)) a hmyzí buňky (např. Luckow and Summers, Bio/Technol. 6:47 (1988)). Mezi ně patří plazmidy jako pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, lne., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) a expresivní vektory pro baculoviry, například ty, které jsou odvozeny z genomu jaderného polyedrického viru Autographica califomica (AcMNPV). Preferovaný baculovirus/hmyzí systém jsou pVIl 1392/SÍ21 buňky (Invitrogen, La Jolla, CA).
Rekombinantně produkovaný eukaryontní protox enzym je použitelný pro různé účely. Například dodává protox enzymatickou aktivitu in vitro. Dále může být použit pro testování herbicidních chemikálií in vitro, jejichž cíl působení není znám, přičemž lze určit jejich protox inhibiční aktivitu. Podobný test in vitro může být použit k identifikaci chemikálií, které inhibují protox aktivitu a které jsou proto považovány za kandidáty herbicidů. V jiném případě, rekombinantně produkovaný protox enzym může sloužit k hlubší charakterizaci jeho vztahu k známým inhibitorům, což vede k vytvoření nových herbicidů stejně jako k vytvoření enzymu, jenž je tolerantní k herbicidu.
Účinek inhibice na protox enzym se určuje měřením fluorescence při vlnové délce okolo 622 až 635 nm po excitaci při 395 až 410 nM (např. Jacobs and Jacobs, Enzyme 28:206 (1982)); Sherman et al., Plant. Physiol. 97:280 (1991)). Tento test je založen na principu, že protoporfyrin IX, na rozdíl od protoporfyrinogenu, je fluorescenční pigment. Proteinové extrakty jsou připravovány diferenciální centrifugací z vybraných subcelulámích frakcí, například etioplasty, mitochondria, mikrozomy nebo plazmatické membrány (např. Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993); Prado et al., Plant Physiol. 65:956 (1979); Jakson and Moore, in Plant Organelles. Reid, ed., pp. 1-12; Jacobs and Jacobs, Plant Physiol. 101:1181 (1993)). Protoporfyrinogen je připravován redukcí protoporfyrinu amalgamem sodným jak popisuje Jacobs and Jacobs (1982). Reakční směsi obsahují 100 mM Hepes (pH 7,5), 5 mM EDTA, 2mMDTT, přibližně 2 M protoporfyrinogen IX a přibližně 1 mg/ml proteinového extraktu. Před iniciací enzymové reakce jsou k enzymovému extraktu přidány roztoky inhibitoru v různých koncentracích například 1
-7 CZ 296023 B6 mM, 100 μΜ, 10 μΜ, 1 μΜ, 100 ηΜ, 10 ηΜ, 1 ηΜ, 100 ρΜ. Po přidání extraktu je měřena fluorescence po dobu několika minut a je vypočítána směrnice křivky (reakční rychlost) z lineární oblasti. Porovnáním směrnic inhibiční reakce a kontrolní reakce je určena IC50·
Vynález dále popisuje použití protox enzymu v testu pro identifikaci protox mutantů, které jsou rezistentní na inhibitor. Test probíhá následovně:
(a) inkubace prvního vzorku protoxu a jeho substrátu, protoporfyrinogenu IX, v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje protox inhibitor;
(b) měření enzymatické aktivity protoxu z bodu (a);
(c) inkubace prvního vzorku mutovaného protoxu a jeho substrátu v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje stejný protox inhibitor;
(d) měření enzymatické aktivity mutovaného protoxu zbodu (c); a (e) srovnání enzymatické aktivity obou protoxů.
Reakční směs a reakční podmínky jsou podobné jako u testu pro identifikaci protox inhibitorů (inhibitorový test). Modifikace jsou následující; První, protox mutant, získaný jak bylo dříve opsáno, je v jedné reakční směsi inhibitorového testu nahrazen protoxem divokého typu. Druhá, inhibitor protoxu divokého typuje přítomen v oboru reakčních směsích. Třetí, za účelem zjištění, zda došlo k vzrůstu nemutované aktivity, jsou porovnány mutovaná aktivita (aktivita enzymu v přítomnosti inhibitoru a mutovaného protoxu) a nemutovaná aktivita (aktivita enzymu v přítomnosti inhibitoru a protoxu divokého typu). Mutovaná aktivita je libovolné měření enzymatické aktivity mutovaného protox enzymu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Nemutovaná aktivita je libovolné měření enzymatické aktivity protox enzymu divokého typu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Podstatný vzrůst je definován jako zvýšení enzymatické aktivity, které je vyšší než je chyba měření. Preferuje se dvojnásobný vzrůst aktivity enzymu divokého typu v přítomnosti inhibitoru. Více preferovaný je 5-ti násobný vzrůst a nejžádanější je 10-ti a více násobný.
Herbicidy, které inhibují protox, zahrnují molekuly mnoha různých strukturálních tříd (Duke et al., Weed Sci. 39:465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245:35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). K těmto molekulám patří difenylethery {např. acifluorifen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen,
2- chloro-l-(3-ethoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)}, oxidiazoly (např. axidiazon,
3- [2,4-dichloro-5-( l-methylethoxy)fenyl]-5-( 1, l-dimethylethyl)-l ,3,4-oxadiazol-2-(3H)on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2-(1-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), deriváty pyridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidinoa piperidinokarbamatové analogy.
-8CZ 296023 B6
Podstatné difenylethery jsou ty, které mají tento obecný vzorec
NOj
Vzorec Iy kde
R je -COONa (Vzorec II), -CONHSO2CH3 (Vzorec III) nebo -COOCH2COOC2H5 (Vzorec IV; Maigrot et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 47-51 (1989)).
Další vhodné difenylethery jsou ty, kde R je
NOCH2COOCH3
CCH2OCH3 (Vzorec IVa; Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989)).
Další vhodné difenylethery mají vzorec:
(Vzorec IVb; bifenox, Dest et al., Proč. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)). Podstatná je také třída herbicidů známá jako imidy, které mají obecný vzorec
(Vzorec V)
-9CZ 296023 B6 kde Qjsou
O
O o
N—
O
N~—
HF2C 1
O (Vzorec VI) (Vzorec VII) (Vzorec VIII) (Vzorec IX)
(Vzorec IXa) (Vzorec IXb) (Hemper et al., (1995) in „Proceedings of the Eighth Intemational Congress of Pesticide Chemistry,“ Regdale et al., eds., Amer. Chem. Soc., Washington, D.C., pp. 42-48 (1994)).
A R] jsou H, Cl nebo F, R2 je Cl, R3 je optimálně substituovaný ether, thioether, ester, amino nebo alkyl skupina. V jiném případě R2 a R3 mohou dohromady tvořit 5-ti nebo 6-ti členný heterocyklický kruh. Příklady imidových herbicidů jsou
-10CZ 296023 B6
AN'CHF*
CHjSO2NH
N 'N
(Vzorec X)
CHj
(Vzorec XI)
(Vzorec XII)
Miuara et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds:35-40 (1993))
(Vzorec XIII)
-11 CZ 296023 B6
(Vzorec XIV)
(Vzorec XV)
(Vzorec XVI)
Herbicidní aktivity výše uvedených látek jsou popsány v Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (Vzorce X a XVI), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) 5 (Vzorce XII a XIII), Patent US 4 746 352 (Vzorec XI) a Abstracts of the Weed Science Society of America vol. 33, pg.9 (1993) (Vzorec XIV).
-12CZ 296023 B6
Mezi preferované imidové herbicidy patří aryluracily, mají obecný vzorec
(Vzorec XVII) kde R znázorňuje skupinu (C2_6-alkenyloxy)karbonyl-C1_4-alkyl, jak je doloženo v patentu US 5 183 492, který je zde začleněn jako reference.
Významné jsou také herbicidy mající obecný vzorec:
(Vzorec XVIII; thiadiazimin) (Weiler et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, pp.:29-34 (1993));
(Vzorec XIX; karfentrazon) (Van Saun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, pp.: 19-22 (1993));
-13CZ 296023 B6
N-substituované pyrazoly s obecným vzorcem:
(Vzorec XX) (Mezinárodní patent WO 94/08999, WO 93/10100 a U.S. Patent č. 5,405,829 Schering)
N-fenylpyrazoly, takové jako:
cf3 (Vzorec XXI; nipyraklofen) (str. 621 „The Pesticide Manual,“ 9th ed., ed. C. R. Worthing, British Crop Protection Council, Surrey (1991));
a 3-substituované-2-aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazoly (Lyga et al., Pesticide Sci. 42:29-36 (1994)).
Aplikační rozmezí dávky herbicidu, které inhibuje aktivitu protox enzymu, částečně závisí na vnějších faktorech jako jsou prostředí, doba a metoda aplikace. V případě imidových herbicidů, které jsou reprezentovány vzorci V až IX, a zvláště těch, jenž mají vzorce X až XVII, je rozmezí aplikační dávky 0,0001 až 10 kg/ha, preferováno je rozmezí 0,005 až 2 kg/ha. Tato dávka a koncentrace herbicidu mohou být rozdílné, závisí to na působení a na použité látce. Obě tyto veličiny lze určit dobře známými metodami.
Vynález dále prezentuje rostliny, rostlinnou tkáň a rostlinná semena, která jsou tolerantní k herbicidům, jež inhibují přirozeně se vyskytující protox aktivitu v těchto rostlinách, kde tolerance je způsobena pozměněnou aktivitou protox enzymu. Jsou preferovány agronomicky důležité plodiny, tj. krytosemenné a nahosemenné rostliny jako jsou bavlna, sója, řepka, cukrová řepa, kukuřice, rýže, pšenice, ječmen, oves, žito, čirok, proso, krmné a turfové traviny a podobně.
„Pozměněnou aktivitou protox enzymu“ je míněna protox enzymatická aktivita, která je odlišná od té přirozeně se vyskytující v rostlině (tj. protox aktivita, která se vyskytuje přirozeně nezávisle na přímém či nepřímém zásahu člověka), jenž je rezistentní k herbicidům inhibujícím přirozeně se vyskytující aktivitu. Pozměněná protox enzymatická aktivita může být rostlině udělena, podle vynálezu, zvýšením exprese na herbicid citlivého protoxu divokého typu, expresí pozměněného herbicid-tolerantního eukaryontního protox enzymu v rostlině, expresí nemodifikované nebo
-14CZ 296023 B6 modifikované bakteriální formy protox enzymu, který je k herbicidu v rostlinách rezistentní nebo kombinací těchto postupů.
Dosažení pozměněné protox enzymatické aktivity pomocí zvýšené exprese vede ktomu, že v rostlině je takové množství protox enzymu, které je přinejmenším dostatečné k překonání inhibice růstu způsobené herbicidem. Hladina exprimovaného protoxu obecně dosahuje nejméně dvojnásobku, lépe pětinásobku a v nejlepším případě více jak desetinásobku množství přirozeně exprimovaného. Silnější exprese může být způsobena tím, že se protox gen divokého typu vyskytuje ve více kopiích; může být dále zapříčiněna vícenásobným výskytem protox kódujících sekvence v protox genu (tj. amplifikace genu) nebo mutací nekódující, regulační sekvence endogenního protox genu v rostlině. Rostliny obsahující takovou pozměněnou protox enzymatickou aktivitu mohou být získány přímou selekcí. Tato metoda je v oboru známa (Somers et al., v US 5 162 602 a Anderson et al., v US 4 761 373). Tyto rostliny mohou být získány metodami genového inženýrství. Zvýšená exprese na herbicid citlivého protoxu může také být provedena stabilní transformací rostlinné buňky molekulou rekombinantní nebo chimérické DNK, která obsahuje promotor schopný řídit expresi příbuzného strukturního genu v rostlinné buňce a je vázaná k homolognímu nebo heterolognímu strukturnímu genu kódujícímu protox. „Homologním“ je míněn ten protox gen, který je izolován z organizmu taxonomicky identického s cílovou rostlinou buňkou, „heterologní“ je ten protox gen, který je získán z organizmu, jenž je taxonomicky odlišný od cílové rostlinné buňky. Homologní protox geny mohu být získány komplementací bakteriálního nebo kvasinkového auxotrofního mutantu cDNK expresní knihovnou získané z cílové rostliny. Například příklad 1 a Snustad et al., Genetics 120:1111-1114 (1988) (kukuřičná glutaminová syntetáza); Delauney et al., Mol. Genet. 221:299-305 (1990) sójová pyrrolin-5karboxylatová reduktáza); Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228:287-293 (1991) (kukuřičná dihydrodipicolinatová syntetáza); Eller et al., Plant Mol. Biol. 18:557-566 (1992) (3-izopropylmalatová dehydrogenáza chloroplastu řepky); Proč. Nati. Acad. Sci., USA 88:1731-1735 (1991); Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992) (dihydroorotatová dehydrogenáza) a další reference umístěné na jiném místě. Další známé metody zahrnují testování genomové nebo cDNK knihovny, například na sekvence, které cross-hybridizují se specifickými NK sondami nebo testování expresních knihoven na produkci protox enzymů, které cross-reagují se specifickými protilátkovými sondami. Preferovaná metoda zahrnuje komplementací E. coli hemG auxotrofního mutantu cDNK knihovnou z kukuřice nebo Arabidopsis thaliana.
Mezi promotory funkční v rostlinách nebo v rostlinných buňkách, tj. ty, které jsou schopny řídit expresi příbuzných strukturálních genů, takových jako je protox, v rostlinách, patří 19S nebo 35S promotory květákového mozaikového viru (CaMV) a CaMV zdvojený promotor, promotory nopalinové syntetázy, promotory k patogenezi-vztaženého proteinu (PR), promotory malé podjednotky ribulozové bifosfátové karboxylázy (ssuRBISCO) a podobně. Preferovány jsou promotor rýžového aktinu (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991)), promotor kukuřičného ubiquitinu (EP 0 342 925; Taylor et al., Plant Cell Rep. 12:491 (1993)), a Pr-1 promotor z tabáku, Arabidopsis nebo z kukuřice (mezinárodní patentová přihláška PCT/IB95/00002 Rayls et al., reference na jiném místě). Dále jsou preferovány 35S promotor a zesílený nebo zdvojený 35S promotor, takový jako popisuje Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987) a zdvojený 35S promotor klonovaný do pCGN2113, uložený jako ATCC 40587, který je doložen v EP-A 0 392 225, reference na jiném místě. Samy promotory mohou být modifikovány za účelem pozměnění jejich síly, což může zvýšit expresi protoxu. Z důvodu řízeného transportu exprimovaného protox enzymu do místa působení, mohou být signální nebo transportní peptidy fúzovány s protox kódující sekvencí za vzniku chimérické DNK konstrukce. Příklady signálních peptidů zahrnují ty, které jsou přirozeně vázány k rostlinným k patogenezi-vztaženým proteinům, např., PR-1, PR-2 a podobně (Payne et al., Plant. Mol. Biol. 11:89-94 (1988). Příklady tranzitních peptidů zahrnují tranzitní peptidy chloroplastu jak popisuje Von Heijne et al., Plant. Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst et al., Gene 65:59 (1988) a mitochondriální tranzitní peptidy, které popisuje Bountry et al., Nátuře 328:340-342 (1987). Chloroplastové a mitochondriální tranzitní peptidy jsou v tomto vynálezu použitelné jako protox enzymatická aktivita, typicky se objevující v mitochondriu a v chloroplastu. Nejvíce preferované
-15 CZ 296023 B6 jsou chloroplastové tranzitní peptidy. Jsou považovány za primární báze pro působení protox inhibujících herbicidů (Witkowski and Halling, Plant Physiol. 87:632 (1988); Lehnen et al., Pestic. Biochem. Physiol. 37:239 (1990); Duke et al., Weed Sci 39:465 (1991)). Také jsou zahrnuty sekvence, které ovlivňují lokalizaci kódovaného proteinu do různých buněčných částí jako jsou vakuoly. Například Neuhaus et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:10362-10366 (1991) a Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 42:21-53 (1991). Relevantní doložení této publikace je formou reference.
Konstrukce chimérické DNK podle vynálezu obsahují vícenásobné kopie promotoru nebo protox strukturních genů. Konstrukce mohou zahrnovat v každém otevřeném čtecím rámci, spolu s dalšími funkčními elementy, kódující sekvence pro markry a jiné peptidy, takové jako jsou signální a tranzitní peptidy. Příprava takových konstrukcí patří do základních dovedností odborníka.
Použitelné markry zahrnují peptidy poskytující rezistenci na herbicidy, antibiotika nebo léky, například rezistenci na hygromycin, kanamycin, G418, gentamycin, linkomycin, methotrexat, fosfínotricin a podobně. Tyto markry mohou být použity pro selekci buněk transformovaných konstrukcemi chimérické DNK. Dalšími použitelnými markry jsou peptidické enzymy, které mohou být jednoduše detekovány viditelnou reakcí, například, barevnou reakcí jako je luciferáza, β-glukuronidáza nebo β-galaktozidáza.
Pozměněná aktivita protox enzymu může být dosažena vytvořením nebo identifikací modifikovaných forem izolované eukaryontní protoxové kódující sekvence, která má nejméně jednu substituci aminokyseliny, adicí nebo delecí, která kóduje pozměněnou rezistenci protox enzymu k herbicidu, jenž inhibuje nepozměněnou, přirozeně se vyskytující formu (tj. formy, které se vyskytují přirozeně v eukaryontním organizmu a nejsou manipulovány buď přímo metodami rekombinace DNK nebo nepřímo selekčním šlechtěním atd.). Geny kódující takové enzymy mohou být získány řadou metod. První obecná strategie zahrnuje přímou a nepřímou mutagenezi mikrobů. Například genově manipulovatelné mikroby jako jsou E. coli nebo S. cerevisiae mohou být předmětem náhodné mutageneze in vivo, která může být provedena například UV světlem, ethyl nebo methyl methan sulfonátem. Metody mutageneze jsou popsány vMiller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); a Patent US 4 975 374 (Goodman et al.). Mikroorganizmus po mutagenezi obsahuje eukaryontní protox gen citlivý na herbicid a jeho protox aktivita je nesena právě tímto genem. Buňky pozměněné mutagenezi jsou kultivovány v přítomnosti herbicidu v koncentracích, které inhibují nemodifikovaný protox enzym. Kolonie mutagenizovaného mikrobu, které rostou v přítomnosti inhibitoru lépe než kolonie nemutagenizovaného mikrobu (tj. vykazují rezistenci k inhibitoru), jsou selektovány pro další analýzu. Z těchto kolonií jsou buď klonováním nebo amplifíkací polymerázovou řetězovou reakcí izolovány protox geny a jsou objasněny jejich sekvence. Sekvence kódující pozměněnou protox enzymatickou aktivitu jsou pak klonovány do mikrobu, kam vnáší rezistenci na inhibitor.
Druhá metoda, kterou lze získat mutantní na herbicid rezistentní alely eukaryontního protox enzymu zahrnuje přímou selekci v rostlině. Účinek protox inhibitoru, který už byl uveden, na růst rostlin jako jsou Arabidopsis, sója nebo kukuřice může být určen kultivací sterilizovaných semen na plotnách na jednoduchém médiu, které obsahuje minimální množství solí, se vzrůstající koncentrací inhibitoru. Vhodné koncentrace se pohybují v rozmezí 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 a 3000 ppm. Nejnižší dávky, jejichž inhibice růstu může být reprodukovatelně detekovaná se používá v dalších pokusech.
Mutageneze rostlinného materiálu může být použita ke zvýšení frekvence výskytu rezistentních alel v selektované populaci. Mutagenizovaný osivový materiál je odvozen z různých zdrojů, které zahrnují chemickou nebo fyzikální mutagenezi semen, chemickou nebo fyzikální mutagenezi
-16CZ 296023 B6 pylu (Neuffer, v Maize for Biological Research. Sheridan, ed. Univ. Press, Grand Forks, ND., pp. 61-64 (1982)), jenž je použit pro oplodnění a pak jsou shromážděna Mi mutantní semena. V případě Arabidopsis, M2 semena (Lehleovi semena, Tucson, AZ), tj. semena potomstva rostlin vyrostlá ze semen, která byla mutagenizována chemikáliemi jako je ethyl methan sulfonát nebo fyzikální cestou za použití gamma záření nebo rychlých neutronů, jsou kultivovány na plotně v hustotě 10 000 semen /plotnu (10 cm v průměru) na médiu s minimálním množstvím solí s příslušnou koncentrací inhibitoru, který slouží k selekci rezistence. Semenáče, které rostou a zůstávají zelené po dobu 7 až 21 dní jsou přesazeny do půdy, pokračují v růstu až do vytvoření semen. Potomstvo těchto semen je testováno, zdaje rezistentní k herbicidu. Jestliže rezistence je dominantní, předpokládá se, že rostliny, jejichž semeno se dělí 3:l=rezistentní:citlivý, jsou heterozygotní v generaci M2. Rostliny, které produkují všechna semena rezistentní, jsou považovány za homozygotní v generaci M2. Mutageneze intaktních semen a testování jejich M2 dceřinných semen může také probíhat v jiných rostlinných druzích, například v sóje (patent US 5 084 082 (Sebastian)). Další způsob získání semen s tolerancí na herbicid je oplodnění chemickou nebo fyzikální cestou mutagenizovým pylem.
Potvrzení, že rezistence je založena na pozměněném protox genu, je možné dvěma způsoby. První způsob, alely protox genu z rostlin, vykazující rezistenci k inhibitoru, mohou být izolovány použitím PCR. Při této metodě jsou použity příměry sestaveny na základě konzervativních oblastí protox cDNK sekvence Aradopsis a kukuřice, uvedeny v SEQ ID č.:1,3,5,7 nebo upřednostněny jsou primery, založeny na sekvencích nepozměněného protox genu z rostliny, která se používá pro vytvoření rezistentních alel. Po sekvenování, za účelem zjištění přítomnosti mutací v kódující sekvenci, alely mohou být testovány, zda jsou schopny přenést rezistenci na inhibitor na rostlinu, která je jimi transformována. Tyto rostliny mohou být buď Arabidopsis nebo libovolná rostlina, jejíž růst je ovlivněn inhibitorem. Druhý způsob, protox geny mohou být mapovány za účelem zjištění polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP) (např. Chang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:6856-6860 (1988); nam et al., Plant Cell 1: 699-705 (1989). Rezistence může být mapována nezávisle použitím stejných markrů. Jestliže je rezistence způsobena mutací protox genu, stopa rezistence povede do pozice, která je nerozlišitelná od pozice protox genu.
Třetí způsob je selekce v kultuře rostlinných buněk. Explanty rostlinné tkáně, například embrya, listové disky atd., aktivně rostoucí kalus nebo rostlinné suspenzní kultury jsou kultivovány na definovaném médiu bez hernu za přítomnosti zvyšující se koncentrace herbicidu nebo podobného inhibitoru, který je vhodný pro použití v laboratorních podmínkách. U různých kultur jsou referovány různé stupně růstu. Jisté kultury, jde o rychle rostoucí druhy kolonií, rostou dokonce v přítomnosti normálně inhibující koncentrace inhibitoru. Četnost výskytu těchto rychle rostoucích druhů kolonií lze zvýšit působením chemického nebo fyzikálního mutagenu před vystavením tkání nebo buněk působení herbicidu. Putativní rezistenci přenášející alely protox genu jsou izolovány a testovány, jak je popsáno v následujících paragrafech. Tyto alely, nesoucí rezistenci na herbicid, mohu pak být manipulovány za účelem dosažení optimální exprese a jsou transformovány do rostliny. V jiném případě rostliny mohou být vytvořeny z tkáně nebo buněčných kultur, které obsahují tyto alely.
Čtvrtý způsob zahrnuje mutagenezi na herbicid citlivých protox genů divokého typu v bakterii a kvasince, což je následováno kultivací mikroba v médiu bez hernu, ale s inhibující koncentrací inhibitoru, a selekcí těch kolonií, které rostou v přítomnosti inhibitoru. Rostlinná cDNK, jako je Aradopsis nebo kukuřičná cDNK, kódující protox je klonována do mikrobu, kterému jinak chybí protox aktivita. Takovými mikroby mohou být například E. coli, S.typhimurium a S. cerevisiae autotrofní mutanty zahrnující kmen E. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), kmeny S. typhimurium TE2483 nebo TT13680 (Xu et al., J. Bacteriol. 174:3953 (1992)) a kvasinkový mutant hem 14-1 (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106:724 (1982)). Transformovaný mikrob je pak předmětem in vivo mutageneze, jak bylo právě popsáno, nebo in vitro mutageneze pomocí libovolných chemických nebo fyzikálních metod, například použitím bissulfítu sodného (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983)); methoxylaminu (Kadonaga et al., Nucleic Acid Res. 13: 1733-1745 (1985)); na oligonukleotidy směro
-17CZ 296023 B6 váná saturační mutageneze (Hutchinson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:710-714 (1986)); nebo různé strategie chybné polymerázové inkorporace (např. Shortle et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64:313-319 (1988); a Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)). Kolonie, které rostou v přítomnosti normálně inhibující koncentrace inhibitoru, jsou izolovány a purifikovány opakovanou selektivní kultivací. Jejich plazmidy jsou purifikovány a retransformací do mikrobu, který nemá protox aktivitu, je testována schopnost přenášet rezistenci na inhibitor. Pak jsou určeny DNK sekvence protox cDNK plazmidových inzertů, které prošly tímto testem.
Po té co je rezistentní protox alela identifikována, může být genově manipulována za účelem optimální exprese v rostlině. Ta může obsahovat pozměněnou kódující sekvenci pro optimální expresi alely nesoucí rezistenci v rostlině. Metody vhodné pro modifikaci kódujících sekvencí za účelem dosažení optimální exprese v daných druzích plodin jsou dobře popsány, (např. Perlak et al., Proč. Nati. Acad. Sci. Usa 88:3324 (1991); Koziel et al., Bio/technol. 11:194 (1993)). Genově manipulovaná protox alela pro optimální expresi může také zahrnovat operabilně vázanou příslušnou regulační sekvenci (tj. promotor, signální sekvence, terminátory transkripce). Preferované protmotory jsou ty, které umožňují silnou konstituční expresi nebo ty, jenž umožňují specifickou silnou expresi v tkáních, které jsou náchylné k poškození působením herbicidu.
Existuje mnoho způsobů, které jsou použitelné pro vnesení rekombinantních DNK molekul do rostlinné buňky. Volba metody závisí na typu transformované rostliny, tj. zda je jedno- nebo dvouděložná. Vhodné metody pro transformaci rostlinných buněk jsou mikroinjektáž (Crossway et al., Bio Technique 4:320-334 (1986), elektroporace (Riggs et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)), transformace zprostředkovaná Agrobacterium (Hinche et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)), přímý transfer genu (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)) a akcelerace balistické částice za použití přístroje od firmy Agracetus, lne., Madison, Wisconsin a Dupont, lne., Wilmington, Delaware (např. Sanford et al., patent US 4 945 050; a McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)). Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987) (cibule); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (sója); McCaba et al., Bio/Technology 6:923-926 (1988) (sója); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (rýže); Klein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (1988) (kukuřice); Klein et al., Bio/Technology 6:559-563 (1988) (kukuřice); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (kukuřice); Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618(1990) (kukuřice).
Dále vynález popisuje transgenické rostliny, zejména transgenické plodné rostliny ve smyslu dříve popsaných procesů a jejich asexuální a/nebo sexuální potomstvo, které jsou stále rezistentní nebo nejméně tolerantní k inhibici herbicidem v koncentraci, která inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu v rostlinách. Preferované jsou hybridy rostlin, které jsou rezistentní nebo přinejmenším tolerantní k inhibici herbicidem, v koncentracích, jenž inhibují v rostlině se přirozeně vyskytující protox aktivitu.
Transgenická rostlina podle vynálezu může být dvouděložní nebo jednoděložní. Preferovány jsou jednoděložní rostliny Graminaceae, knimž patří Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzea, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.
Zvláště preferované jsou transgenické rostliny kukuřice, pšenice, ječmene, čiroku, žita, ovsa, turfových travin a rýže.
Z dvouděložních rostlin jsou preferovány sója, bavlna, tabák, cukrová třtina, řepka olejná a slunečnice.
Expresivním potomstvem se rozumí asexuálně i sexuálně vytvořené potomstvo transgenických rostlin. Tato definice také zahrnuje všechny mutanty a variace získatelné známými metodami,
-18CZ 296023 B6 jako je např., buněčná fúze a selekce mutantu, a které stále vykazují charakteristické vlastnosti počáteční transformované rostliny, dohromady se všemi produkty, vzniklými křížením a fúzí transformovaného rostlinného materiálu.
Dalším předmětem vynálezu je proliferační materiál transgenických rostlin.
Proliferační materiál transgenických rostlin je definovaný podle vynálezu jako libovolný materiál, který se může množit sexuálně nebo asexuálně in vivo nebo in vitro. Zvláště preferovány jsou protoplasty, buňky, kalí, tkáň, orgány, semena, embrya, pil, vaječné buňky a zygoty spolu s dalším libovolným propagačním materiálem, který se dá získat ztransgenických rostlin.
Dále vynález popisuje části rostlin, jako jsou například květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, jenž byly transformovány ve smyslu procesu popsaném ve vynálezu a proto obsahují část transgenických buněk.
Dříve než je množící materiál (plody, hlízy, obilí, semeno), zvláště semeno, prodáván jako komerční produkt, je ošetřen ochranným povlakem, který obsahuje herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy molluscicidy nebo jejich směsi. Tyto látky se mohou vyskytovat dohromady s dalšími nosiči, povrchově aktivními látkami nebo aplikaci umožňujícími adjuvans, které ovlivňují vlastnosti přípravku v smyslu poskytnutí ochrany proti poškození způsobeném bakteriálními, plísňovými a zvířecími škůdci.
Za účelem ochrany osiva, ochranný povlak může být aplikován na osivo buď impregnací hlíz nebo obilí kapalným přípravkem nebo jejich potažením kombinovaným mokrým nebo suchým přípravkem. Ve speciálních případech je možné použít další metody aplikace, například ošetření pupenů nebo plodů.
Rostlinné osivo podle vynálezu obsahující DNK sekvenci, která kóduje eukaryontní protein mající protoporfyrinogen oxidázovou aktivitu (protox), může být ošetřeno ochranným povlakem, jenž obsahuje ochrannou látku jako je kaptan, karboxin, thiram (TMTD®), methalaxyl (Apron®) a pirimifosmethyl (Actellic®) a další látky, které se běžně užívají pro tento účel.
Dalším předmětem vynálezu rostlinný propagační materiál pro kultivaci rostlin, ale zvláště pak rostlinné osivo, které je ošetřeno ochranným povlakem, který je v širokém měřítku užíván pro tento účel.
K herbicidu rezistentní protox alela je získána přímou selekcí rostliny nebo rostlinné buněčné kultury, ze které může být rostlina vytvořena. Použitím tradičních šlechtických metod může být vyvinuta na herbicid tolerantní plodina, kde není potřeba genově manipulovaná alela a její transformace do rostliny. V jiném případě může být izolována na herbicid rezistentní alela, která je genově manipulována za účelem optimální exprese a pak je transformována do požadované rostliny.
Geny kódující pozměněnou protox rezistenci na protox inhibitor mohou být použity i jako selekční markry u metod rostlinné buněčné transformace. Například rostliny, rostlinná tkáň nebo rostlinné buňky transformované transgeny mohou být také transformovány genem kódujícím pozměněný protox, který je schopný exprese v rostlině. Tímto způsobem transformované buňky jsou přeneseny do média obsahující protox inhibitor. Za těchto podmínek přežívají pouze transformované buňky. Jako selekční agents se mohou použít protox inhibitory difenylethery {např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-ethoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)}, oxidiazoly, (např. oxid iazon, 3-[2,4-dichloro-5-( l-methylethoxy)fenyl]-5-) 1,1 -dimethylethyl)-1,3,4— oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2-(1-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitropyrazolyl-5
-19CZ 296023 B6 oxyjpropionat; M&B 39279), deriváty pyridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy. Tato metoda je aplikovatelná na libovolnou rostlinnou buňku, která je schopna být transformována pozměněným protox kódujícím genem, a může být použita spolu s libovolným transgenem. Exprese transgenů a protox genu běží ze stejného promotoru, který je funkční v rostlinných buňkách nebo z oddělených promotorů. Vynález bude podrobněji popsán v příkladech. Tyto příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci, nejsou limitující ani jinak specifikující.
Uložení
Následující molekuly vektoru jsou uloženy v Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Datum uložení je dále uvedeno.
Protox-1, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 5. 4. 1994 jako pWDC-2(#B-21238).
Protox-2, ve vektoru pFL61 byl uložen 5. 4. 1994 jako pWDC-1 (NRRL #B-21237).
MzProtox-1, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 20. 5. 1994 jako pWDC-4 sNRRL(#B21260), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č: 5.
MzProtox-1, ve vektoru pBluescript SK byl znovu uložen 11. 7. 1994 jako pWDC-4 s NRRL(#B-21260N), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 5.
MzProtox-2, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 20. 5. 1994 jako pWDC-3 sNRRL(#B21259), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 7.
Protox-3, ve vektoru pFL61 byl uložen 10. 7. 1994 jako pWDC-5 s (NRRL#B-21280).
PMzC-1 Val, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 30. 9. 1994 jako pWDC-8 pod přístupovým označením NRRL#21340.
PAraC-2Cys ve vektoru pFL61 byl uložen 14. 11. 1994 jako pWDC-7 pod přístupovým označením NRRL#2133 9N.
Příklady provedení vynálezu
Standardní metody DNK rekombinace a molekulárního klonování, zde používané, jsou dobře známy v oboru a jsou popsány v T. Maniatis, E. F. Fritsch a J. Sambrook, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) a T. J. Šilhavý, M. L. Berman a L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).
Příklad 1
Izolace Arabidopsis cDNK kódující protox geny funkční komplementací E. coli mutantu.
Byla získána a amplifíkována cDNK knihovna v plazmidovém vektoru pFL61 (Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992)) v Arabidopsis thaliana (Landsberg). Druhá Arabidopsis (Colombia cDNK knihovna ve vektoru UniZap lambda (Stratagene) byla získána a amplifíkována jako pBluescript plazmidy pomocí in vivo excize fágového materiálu. E. coli hemG mutant SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) byl získán a udržován na L médiu obsahující 20 mg/ml
-20CZ 296023 B6 hematinu (United States Biochemicals). Plazmidové knihovny byly transformovány do SASX38 elektroporací za použití přístroje Bio-Rad Gene Pulser za podmínek doporučených výrobcem. Buňky byly naneseny na L agar obsahující lOOmg/ml ampicilinu . v hustotě přibližně 500 000 transformantů/10 cm plotny. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 40 hodin v šeru a byly selektovány pro schopnost růst bez přítomnosti exogenního hernu. Hemové prototrofy byly získány z FL61 knihovny v hustotě 400/107 a zpBluescript knihovny v hustotě 2/107. Plazmidová DNK byla izolována ze 24 kolonií za účelem sekvenční analýzy. Každá z těchto 24 DNK byla retransformována do SASX38 za účelem potvrzení schopnosti komplementovat.
Sekvenční analýza odhalila dvě třídy putativních protox klonů. Devět z nich bylo označeno „Protox-1“. Každý byl odvozen ze stejného genu a dva byly klony plné délky. CDNK je velká 1719 bp a kóduje protein o molekulární váze 57,7 kDa. N-konec peptidové sekvence má rysy charakteristické pro chloroplastový tranzitní peptid o velikosti 60-ti aminokyselin. Databázový průzkum za použití GAP programu (devaraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984) odhalil homologii s B. subtilis hemY (protox) proteinem (Hansson an Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)). Tyto dva proteiny jsou z 53 % podobný a 31 % identický s oblastmi vysoké homologie, obsahující navrženou dinukleotidovou vazebnou oblast hemY proteinu (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)).
Dalších 15 cDNK klonů bylo označeno „Protox-2“. Tyto klony také vznikly z jednoho genu. cDNK o plné délky má 1738 bp a kóduje protein o molekulární váze 55,6 kDa. N-konec je trochu podobný mitochondriálnímu transitnímu peptidů. Protein Protox-2 je částečně homologní s Protox-1 (53% podobnost, 28% identity) a s protox z B. subtilis (50% podobnost a 27% identity).
Protox-1 ve vektoru pBluescript SK byl uložen 5. 4. 1994 jako pWDC-2 (NRRL#B-21238).
Protox-2 ve vektoru pFL61 byl uložen 5.4. 1994 jako pWDC-1 (NRRL#B-21237).
Arabidopsis cDNK kódující protox-1 obsažený v pWDC-2 a protox-2 obsažený v pWDC-1 jsou uvedeny v SEQ ID č.: 1 a 3.
Příklad 2
Izolace kukuřičných cDNK kódujících protox geny funkční komplementací mutantu E. coli.
Zea Mays (B73 inbrední) cDNK knihovna ve vektoru lambda UniZap byla získána od firmy Stratagene a konvertována na pBluescript knihovnu pomocí in vivo excize. Další kukuřičná cDNK knihovna ve vektoru UniZap byla získána od firmy Clontech a podobně byla konvertována do pBluescript plazmidů. Selekce funkčních kukuřičných protox genů byla právě popsána pro případ Arabidopsis knihovny v příkladu 1.
Byly izolovány dva hemové prototrofy z knihovny od Stratagene v množství 107 transformantů, dále byly rekomplentovány a sekvenovány. Tyto cDNK byly identické a potvrdila se homologie s Arabidopsis Protox-1. Tento kukuřičný klon označený MzProtox-1 není kompletní. cDNK má 1698 bp a kóduje pouze putativní zralý protox enzym; cDNK nemá sekvenci tranzitního peptidů a nemá ani iniciační methionininový kodon. Gen je ze 68 % identický jako Arab Protox-1 na úrovni nukleotidů a ze 78 % identický (87% podobnost) na úrovni aminokyselin (uvedeno vTab. 1).
Jeden hemový prototrof byl získán z knihovny od firmy Clontech v množství 107 transformantů, byl dále rekomplementován a sekvenován. cDNK se jeví být kompletní, má 2061 bp a kóduje protein o molekulární váze 59kDa. Tento klon je kukuřičný homolog Arabidopsis Protox-2 a je označen MzProtox-2. Gen je z 58 % identický jako Arab Protox-2 na úrovni nukleotidů a z 58 %
-21 CZ 296023 B6 identický (76% podobnost) na úrovni aminokyselin (uvedeno v Tab.2). Kukuřičný klon má sekvence N-konce o 30 aminokyselin delší ve srovnání s Arabidopsis klonem. Stejně jako u Arabidopsis klonů, homologie mezí dvěma kukuřičnými protox geny je poměrně nízká; dvě protinové sekvence jsou z 31 % identické.
MzProtox-1 ve vektoru pBluescript SK byl uložený 20. 5. 1994 jako pWDC-4 sNRRL(#B21260), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 5.
MzProtox-1, ve vektoru pBluescript SK byl znovu uložen 11. 7. 1994 jako pWDC-4 ío s NRRL(#B-21260N), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 5.
MzProtox-2, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 20. 5. 1994 jako pWDC-3 sNRRL(#B21259), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 7.
Příklad 3
Izolace dalších protox genů založená na sekvenční homologii známých protox kódujících sekvencí.
Fágová nebo plazmidová knihovna je nanesena na plotnu vdensitě přibližně 10 000 plaků na 10 cm Petriho misky. Filtrační membrána s plaky je kultivován a přes noc při teplotě 37 °C. Filtrační membrána splaky je pak hybridizo vána s jednou z cDNK, které jsou uvedeny v SEQ ID č.: 1,3,5 nebo 7. Sonda je značená 32P-dCTP pomocí metody „random priming“ a PrimeTime kitu 25 (Intemational Biotechnologies, lne., New Haven, CT). Podmínky hybridizace jsou 7% sodium dodecyl sulfát (SDS), 0,5 M NaPO4 pH 7,0, lmM EDTA, teplota 50 °C. Hybridizace trvá přibližně přes noc, pak je filtr promyt 2X SSC, 1% SDS. Pozitivně hybridizující plaky jsou detekovány autoradiografií. Byl získán jeden plak, z něhož byly izolovány cDNK inzerty. Sekvence těchto inzertů byly určeny pomocí metody řetězové terminace za použití dideoxy terminátorů 30 značených fluorescenčním barvivém (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA).
Tento standardní protokol může být použit odborníkům pro získání protox genů, sekvenčně homologních se známými protox sekvencemi, z dalších eukaryontů, zvláště pak z vyšších rostlin.
Odvozené sekvence aminokyselin proteinu, který je kódován sekvencemi ukázanými v SEQ ID č.: 2 a 6 jsou uvedeny v Tab. 1. Odvozené sekvence aminokyselin proteinu, který je kódován sekvencemi ukázanými v SEQ ID č.: 4 a 8 jsou uvedeny v Tab. 2.
Tabulka 1
Srovnání Protox-1 sekvencí aminokyselin Arabidopsis (SEQ ID č.: 2) a kukuřice (SEQ IDč.: 6) procento podobnosti: 87,13 procento identity: 78,008
Protox-1 .Pep x Mzprotox-1 .Pep
Identická rezidua jsou znázorněny vertikálními čarami, které spojují sekvence. Sekvence jsou uvedeny pomocí programu GAP, který je popsán vDeveraux et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984).
-22CZ 296023 B6
GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100 ..ΙΙΗΙΙΙΙΙΙΜΙ.ΙΙΗΙΙ:) I I I I : . 1 . | | | | .
....NSADCVVVGGGISGLCTAQALATRH..GVGDVLVTEARARPGGNIT 44
101 T. .REENGFLWEEGPNSFQPSDPMjLTMWDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148 I I·I:1:11I1IIII1IIIII:III -1 I I 1 i i I I I I : 111.1 I 11 11 I
TVERPEEGYLWEEGPNSFQPSDPVLTMAVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVLW 94
149 NGKLRPVPSKLTDLPFFDLMSIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV 198 :111111111 . I I I 1 I I I I I I . I I : I I I : Η I ! I 1 I - I I I I I I I I I I 1 I
EGKLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGLGALGIRPPPPGREESVEEFV 144
199 RRNLGDEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGG 248 I I I I I · 1 I I 1 I I I I I I I I II1II11IIIII11 i I I I I I : 1 1 I I 1 I I I 1
145 RRNLGAlEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194
249 TFKAIQERKNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRMLPEAISARLGSKV 298 I:I>IIII ... II:·I i:II1II - I II I : I I II 1 I I I I; I I ... I I I I |
195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244
99 ΚΙδΜΚΙδΘΧΤΚΕΕδσσϊΝΙ,ΤΥΕΤΡΟΟίνενβεκεννΜΤνΡΕΗνΑΒΟΕΙΡΡ 348 111111.:111 :. II 1 · I i I I : 1 :1 I I I . I 1 I : I I : II . I I I . : I I I
245 KLSWKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGWSVQAKSVIMTIPSYVASNILRP 294
349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398 I I .. I I : I I I :: I I I I I II 1 ·: I I I I I I I I . I I I I I I I I . I I I I II|1.|
295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRKECLIDGELQGFGQLHPRSQ 344
399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRILLLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 448 IIII1111III11IIIIIIIl:IIII I I II . I I I I I: II. I: I I U I 11
345 GVETLGTIYSSSLFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESELVEAVD 394
449 RDLRKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSSLTSSGY 498 llllllll.....Hl I I I I I I I I I I I I I 11 I I : I : I : · 1 I .. I ..: 11
395 RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAALDRGGY 444
499 EGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYETAIEVNNFMSRYAYK* 538 : 1 I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I . í : : . : I : . : I Η I I
445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYESASQISDFLTKYAYK* 484
Tabulka 2
Srovnáni Protox-2 sekvencí aminokyselin Arabidopsis (SEQ ID č.: 4) a kukuřice (SEQ ID č.: 8) procento podobnosti: 75,889 ío procento identity: 57,905
Protox-2.Pep x Mzprotox-2.Pep
-23CZ 296023 B6
............-...............MASGAVAD . HQ1EAVSGKRVAV 21 •I |:|: .: 1-.::.1 ||
MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 50
VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71 I 1 I I I I I I I I 1 I : I : - i : I I I I I I I . : 1 - I I I : I . :.1::(111111
VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 100
MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121 111:1 1-:.1:11111.:111:1 II.IIIII: : 1 . I . : : I .: | .
101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150
122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167 I I I I I I . I I : ·: : : I I I I : I I . I : 1 1 I : . .111:.1 :||||.|
151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200
168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGArRTKFA 217 I I I I : : I I I I : I I I I : I I : I I I : : 1 . I I . I I I : I : . : I I : I I I I I . I : |
201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250
218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267 lil:· : · ..(.1.::..1.1(11.1111 1 : . I ..::.(::.1:..
251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300
268 VLSLS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK 312 lili. :: : · . :. I I : I . I : I . : I 1 I 1 I I I I I : | 1 :
301 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350
313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362 I I - I I I . I · I : I 11 . ::I:III:::I.I - I:. |I:Η II Η I I | | |
351 RMKFTKGGAPVVLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400
363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFXGGSRNQELAKASTDEL 411 I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I 1 I . Η I I I : I I I : I . : | | | . | . 1
401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450
412 KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461 I I:III II.:1IIIII:I. I - I II .11111: . I . I I: I I I: I I I . :
451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSŠVLEAIEKMEKN 500
462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509
IIIIIIII1 ::11.11. 1111:11111.111111 ......:
501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*... 545
Příklad 4
Izolace kontaminujícího kvasinkového protox klonu z Arabidopsis cDNK knihovny.
Za účelem identifikace řídce se vyskytující cDNK s protox aktivitou proběhlo druhé testování
Arabidopsis knihovny ve vektoru pFL61. Výsledkem byly opět stovky komplementujících klonů, ío Přibližně 600 jich bylo jednotlivě inokulováno na mřížkované plotny a ty byly kultivovány při teplotě 28 °C po dobu 18 hod. Byla připravena kopie této plotny na kolonie/plaky testovací membránu (NEN) podle instrukcí výrobce. Protox-1 a Protox-2 cDNK byly vystřiženy z jejich vektorů štěpením endonukleázami EcoRI/Xhol a Notl. Inzerty byly separovány elektroforézou na 1% SeaPlaque GTG (FMC) agaróze, excizovány a značeny 32P metodou „random priming“ (Life
-24CZ 296023 B6
Technologies). Jedna sada testovacích membrán byla hybridizována s každou sondou. Byly dodrženy podmínky hybridizace a promývání jak je popisují Church a Gilbert, 1984.
Kolonie (~20), které neprokázaly jasnou hybridizaci s Protox-1 nebo Protox-2 byly pomnoženy v kapalném médiu a byla z nich izolována plazmidová DNK. DNK byly štěpeny restriktázou Notl, duplikátní vzorky byly naneseny do 1% agarózového gelu a pak byly přeneseny na Gene Screen Plus (NEN) membránu (New England Nuclear). Sondy dvou známých protox genů byly označeny a použity k hybridizaci, jak již bylo popsáno. Byly nalezeny dva identické klony, které neodpovídaly Protox-1 ani Protox-2. Bylo ukázáno, že tento klon rekomplementuje SASX38 mutanta, ačkoliv roste velmi pomalu, byl označen Protox-3.
Protox-3 ve vektoru pFL61 byl uložen 8. 6. 1994 jako pWDC-5 (NRRL#B-21280). Zjistilo se, že tato kódující sekvence je odvozena z kvasinkové DNK, která byla přítomna jako hlavní kontaminant v Arabidopsis cDNK knihovně. Kvasinková DNK kódující protox-3 obsažená v pWDC-5 je uvedena v SEQ ID č.: 9.
Příklad 5
Demonstrace citlivosti klonu rostlinného protoxu k protox inhibujícímu herbicidu v bakteriálním systému.
Kultury Protox-1/SASX38, Protox-2/SASX38 a pBluescript/XLl-Blue byly kultivovány v L médiu za přítomnosti amp100. 100 μΐ každé kultury bylo naneseno na plotnu na L amp100 médium, obsahující různé koncentrace (1,0 nM až 10 mM) protox inhibujícího aryluracilového herbicidu (vzorec XVII). Duplikátní sada ploten byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 18 hod. v šeru nebo v úplné tmě.
Protox+ E. coli kmen XLl-Blue není citlivý k herbicidu v libovolné koncentraci, což souvisí s referovanou rezistencí přirozeného bakteriálního enzymu na podobné herbicidy. Protox-1/SASX38 byl jasně citlivý, došlo k skoro úplné eliminaci porostu bakterií inhibitorem v koncentraci již 10 nM. Protox-2/SASX38 byl také citlivý, ale pouze při vyšších koncentracích (10M) herbicidu. Účinek herbicidu na oba kmeny s rostlinným protoxem byl výraznější při kultivaci v šeru, zjevný však byl i v případě, kdy plotny byly drženy v úplné tmě. Toxicita herbicidu byla úplně eliminována přidáním hematinu v koncentraci 20 mg/ml.
Rozdílná tolerance dvou kmenů s rostlinným protoxem je způsobena spíše různě silnou expresí uvedených plazmidů než rozdílnou citlivostí enzymu. Protox-1/SASX38 roste daleko pomaleji než Protox-2/SASX38 v libovolném médiu bez přítomnosti hernu. Navíc, kmen MzProtox2/SASX38 s růstovou rychlostí srovnatelnou s Arab Protox-1/SASX38, je také velmi citlivý na herbicid už v koncentračním rozmezí 10-100 nM. Počáteční charakterizace kvasinkového Protox-3 klonu indikuje, že klon je také citlivý na herbicid.
Příklad 6
Selekce rostlinných protox genů rezistentních na protox inhibující herbicidy v E. coli expresivním systému.
Inhibice rostlinných protox enzymů v bakteriálním systému je použitelná na testování na herbicid rezistentních mutací v rostlinných genech ve velkém měřítku. Počáteční na dávku odpovídající pokusy, provedené nanesením kapalné kultury na plotnu, daly vznik rezistentním koloniím, které se objevují ve vysoké frekvenci dokonce i při vysokých koncentracích herbicidu. Tato rezistence není odvozena z plazmidů, je založena na retransformaci/test citlivosti na herbicid. Tento pro
-25CZ 296023 B6 biem se dá prakticky obejít transformací protox plazmidů do SASX38 mutantu a jeho přímým nanesením na plotnu, která obsahuje herbicid.
Rostlinné protox plazmidy jsou mutagenizovány různými způsoby. Například použitím publikovaných postupů pro chemikálie (např. sodium bisulfit (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983); methoxylamin (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13:1733-1745 (1985); na oligonukleotidy směrovaná saturační mutageneze (Hutchinson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:710-714 (1986) nebo různé strategie chybné polymerázové inkorporace (např. Shortle et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64:313-319 (1988); a Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)). Očekávané „up-promotor“ mutanty, vzniklé při mutagenezi celého plazmidu, jsou eliminovány reklonováním kódující sekvence do vektoru divokého typu a jeho testováním. Výsledkem je pravděpodobná vyšší exprese, což vede k lepšímu růstu v nepřítomnosti herbicidu. Je také možné vizuální rozpoznání mutantů nesoucích kódující sekvence.
Libovolný rostlinný protox gen exprimující rezistenci na herbicid v bakteriálním systému může být manipulován za účelem optimální exprese a může být transformován do rostlin za použití standardních metod, jak je zde popsáno. Výsledné rostliny mohu pak být ošetřeny herbicidem za účelem potvrzení a kvantifikace úrovně rezistence, která byla vnesena pomocí protox genu.
Příklad 7
Konstrukce za účelem exprese na herbicid rezistentních mikrobiálních protox genu(ů) v rostlinách.
Kódující sekvence hemY protox genu z B. subtilis (Hansson an Hederstedt 1992, Deiley et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)) a hemG protox genu zE. coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) byly izolovány z laboratorních kmenů pomocí PCR amplifikace za standardních podmínek. Primery byly navrženy podle publikovaných dat. Tyto geny jsou známy, že kódují na herbicid rezistentní formy protox enzymu.
Použitím standardních metod překrývající se PCR fúze (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, lne. (1994)), oba bakteriální geny byly fúzovány s dvěmi rozdílnými chloroplastovými sekvencemi tranzitního peptidu (CTP) z Arabidopsis. První byl CTP ze syntetázy acetohydroxylové kyseliny (AHAS, Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987)), který umožňuje import do stroma chloroplastu. Druhý byl gen plastocyaninu z Arabidopsis (Vorst et al., Gene 65:59 (1988)), který kóduje bipartitní tranzitní peptid. Oblast N-konce tohoto CTP směruje proteiny do chloroplastu, zatímco C-konec do thylakoidové membrány. Všechny čtyři fúze byly klonovány za 2X35S protmotor do binárního expresivního vektoru, který byl navržen pro produkci transgenických rostlin transformací za pomoci agrobacterium.
Následující protox cDNK z Arabidopsis a kukuřice, chloroplastový tranzitní peptid zProtox-1 nebo MzProtox-1 mohou být také fúzovány ke dvěma bakteriálním protox proteinům stejným způsobem jak je výše uvedeno.
Vektory shora popsané mohou pak být transformovány do žádaných rostlinných druhů a výsledné transformanty jsou testovány, zda byla zvýšena jejich rezistence na herbicid.
-26CZ 296023 B6
Příklad 8
Oblast umožňující přepínání mezi Arabidopsis/B. subtilis geny, za účelem produkce chimérického, na herbicid rezistentního protoxu.
Jeden z přístupů jak vytvořit protox gen, který je rezistentní na herbicid a zároveň v rostlině vykazuje účinnou protox enzymatickou aktivitu, je fúze části(í) bakteriálního a rostlinného genu. Z výsledných chimérických genů jsou pak vybrány ty, které jsou schopny v rostlině poskytnout na herbicid rezistentní protox aktivitu. Například Protox peptidové sekvence z Arabidopsis a B. subtilis (hemY) jsou významně kolineární s oblastí vysoké homologie. Sekvence kódující hemY byla klonována do pBluescript a byla testována její schopnost exprimovat na herbicid rezistentní protox aktivitu v SASX38. Chimérické geny Protox-1/hemY jsou konstruovány za použití fúzní PCR metody, pak následuje jejich ligace zpět do vektoru pBluescript. Přechod je přibližně uprostřed proteinů. Komplementací je testována protox funkce těchto fúzí. Jejich kultivací za přítomnosti herbicidu, kde intaktní Protox-1 a hemY slouží jako kontroly, je testována jejich rezistence na herbicid.
Příklad 9
Produkce k herbicidu tolerantních rostlin pomocí nadměrné exprese rostlinných protox genů.
Za účelem exprese proteinu Arabidopsis nebo kukuřice v transgenických rostlinách, příslušná cDNK v plné délce byla vložena do rostlinného expresivního vektoru pCGN1761ENX, který byl odvozen z pCGN1761, popis následuje. pCGN1761 byl štěpen v jeho jediném EcoRI restrikčním místě, a lígován do fragmentu dvouřetězové DNK, který zahrnuje dva oligonukleotidy o sekvenci 5ΆΑΤ TAT GAC GTA ACG TAG GAA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T 3' (SEQ ID č.:l 1) a 5'AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3' (SEQ ID č.:12). Výsledný plazmid pCGN1761ENX obsahuje jediná restrikční místa EcoRI, Notl, a Xhol, která leží mezi zdvojeným 35S promotorem, který pochází z květákového mozaikového viru (Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987)), a 3'-koncem nepřekládaných sekvencí tmi genu Agrobacterium tumefaciens. Tento plazmid je štěpen a ligován do fragmentu obsahujícího kompletní protox cDNK, který je výsledkem restrikčního štěpení plazmidů nesoucích protox cDNK. Z tohoto plazmidu je vystřižen Xbal fragment, který obsahuje Arabidopsis protox cDNK, jenž je lemována zdvojeným 35S promotorem a 3'-koncem nepřekládaných sekvencí tmi genu z A. tumefaciens. Tento Xbal fragment je vložen do binárního vektoru pCIB200, do jeho Xbal restrikčního místa, které leží mezi T-DNK hraničními sekvencemi. Výsledný plazmid označený pCIB200protox je transformován do kmene A. tumefaciens CIB542. (např. Uknes et al., Plant Cell 5:159-169 (1993).
Listové disky rostliny Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc jsou infikovány kmenem A. tumefaciens CIB542, který nese pCIB200IGPD jak popsal Horsh et al., Science 227:1229 (1985). Výhonky rezistentní na kanamycin z 15-ti nezávislých listových disků byly přeneseny do kořenového média, pak přesazeny do půdy a vzniklé rostliny byly dále pěstovány ve skleníku do stádia zralosti. Semena těchto rostlin byla shromážděna a nechala se vyklíčit na MS agarovém médiu, které obsahovalo kanamycin. Z každého nezávislého primárního transformanta bylo, ve skleníku, pěstováno více jednotlivých, na kanamycin rezistentních, semenáčů do jejich stádia zralosti a pak byly shromážděny jejich semena. Tato semena byla naklíčena na MS agaru, jenž obsahoval kanamycin.
Rostlinné linie, které daly vznik semenáčům s kanamycinovou rezistencí, jsou homozygotní z hlediska vloženého genu a staly se předmětem dalšího zkoumání. Děrovačkou papíru byly nastříhány listové disky každé z 15-ti nezávislých transgenických linií a byly umístěny na MS agar, který obsahuje různé vzrůstající koncentrace protox inhibujícího herbicidu.
-27CZ 296023 B6
Po třech týdnech dvě sady 10-ti disků z každé linie byly váženy. Transgenické linie, které jsou více rezistentní k inhibitoru než netransformované rostliny divokého typu byly selektovány k další analýze.
Z každé této linie byla extrahována RNK z listů. Celková RNK z každé nezávislé homozygotní linie a z netransgenických rostlin, která je užívána jako kontrola, byla separována elektroforézou na agarózovém gelu s formaldehydem (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Gel byl blotován na nylonovou membránu (Ausubel et al., supra.) a hybridizován s radioaktivně značenou protox cDNK z Arabidopsis. Hybridizační a promývací podmínky byly stejné jako popisuje Church and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984). Membrána je hodnocena autoradiografem a intenzitní RNK pruhy odpovídající protox transgenům byly detekovány ve všech k herbicidu tolerantních transgenických rostlinných liniích.
Aby bylo možné dále určit sílu rezistence linie s nadměrnou expresí protoxu, rostliny pěstované ve skleníku byly ošetřeny různými koncentrovanými protox inhibujícím herbicidem.
Příklad 10
Růst suspenzní kultury tabákových buněk.
Média:
MX1: Toto médium se skládá z Murashigeových a Skoogových („MS“, T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15:473-497, 1962) hlavních solí, vedlejších solí a Fe-EDTA (Gibco #500-1117; 4,3 g/1), 100 mg/1 myo-inositol, 1 mg/1 kyseliny nikotinové, 1 mg/1 pyridoxinu-HCl, 10 mg/1 thiaminu-HCl, 2-3 g/1 sacharózy, 0,4 mg/1 kyseliny 2,4-dichlorofenoxyoctové a 0,04 mg/1 kinetinu, pH 5,8. Médium je sterilizováno autoklávováním.
N6: Toto médium obsahuje makroelementy, mikroelementy a Fe-EDTA jak popisuje C-C.Chu et al., Scientia Sinica 18:659 (1975), a následující organické sloučeniny: pyridoxin-HCl (0,5 mg/1, thiamin-HCl (0,1 mg/1), kyselinu nikotinovou (0,5 mg/1), glycin (2,0 mg/1) a sacharózu (30,0 g/1). Roztok je autoklávován. Konečné pH je 5,6.
Poznámka: Makroelementy jsou připraveny jako lOx koncentrovaný zásobní roztok a mikroelementy jako lOOx koncentrovaný zásobní roztok. Zásobní roztok vitaminů je připraven lOOx koncentrovaný.
Suspenze buněk Nicotiana tabacum linie S3 (Harms and DiMaio, J. Plant. Physiol. 137:513-519, (1991)) jsou kultivovány v kapalném médiu MX1. Erlenmeyerovy lahve o objemu lOOml, obsahující 25 ml média MX1, byly inokulovány 10 ml sedmidenní kultury buněk. Buňky byly kultivovány při teplotě 25 °C, ve tmě na orbitální míchačce při 100 rpm (s výkyvem 2 cm). Buňky jsou subkultivovány v sedmi denních intervalech inokulaci alikvotních vzorků do čerstvého média, což je provedeno následovně: asi 90 % buněčné suspenze je slito nebo odpipetováno a doplněno čerstvým médiem do žádaného objemu suspenze. Za 10 dní z 250-350 mg buněk inokula naroste 5-8 gramů čerstvé buněčné biomasy.
Příklad 11
Produkce tabákové buněčné kultury, která toleruje herbicidní protox inhibitory, kultivací buněk na pevném selekčním médiu.
-28CZ 296023 B6
Buňky jsou předkultivovány, jak je uvedeno v příkladu 10. Buňky jsou od média odděleny sedimentací a následnou centrifugám' při 500 x g. Buňky jsou pak ředěny čerstvým médiem, aby se dosáhlo vhodné hustoty pro nanesení na plotny, což je okolo 10 000 jednotek tvořících kolonie na ml (CFU/ml). Buňky v malém objemu média (přibližně 1 ml) jsou rozetřeny na povrch pevného média (MX1, 0,8% agar), které obsahuje požadovanou koncentraci inhibitoru. Na jednu Petriho misku je použito 20 až 30 ml média. Vhodná koncentrace je určena z křivky, která znázorňuje odezvu na jednotlivé dávky inhibitoru (příklad 14), a je nejméně dvakrát vyšší než je hodnota IC50 pro citlivé buňky divokého typu.
Plotny z buňkami na selekčním médiu jsou inkubovány za normálních růstových podmínek při 25 až 28 °C, ve tmě až do doby, kdy se vytvoří kolonie. Vybrané buněčné kolonie jsou přeneseny do čerstvého média, které obsahuje žádanou koncentraci inhibitoru.
U preferované modifikaci popsané metody je nejprve rozetřen malý objem předkultivované suspenze buněk v tekutém médiu na povrch pevného média. Na plotnu je přidán stejný objem teplého tekutého média (1,2 až 1,6% agar), který je držen v tekutém stavu při teplotě 40 °C, pohybem plotny dojde k promíchání buněk s médiem a k rozptýlení buněk po celé ploše plotny, před tím, než médium ztuhne.
V jiném případě mohou být buňky smíchány s roztaveným agarem před nanesením na povrch selekčního média. Tato metoda má výhodu, že buňky jsou uloženy a imobilizovány v tenké vrstvě tuhnoucího média na povrchu selekčního média. Tento způsob umožňuje lepší aeraci buněk ve srovnání s buňkami, které jsou přidány do celého objemu média, což je 20 až 30 ml.
Příklad 12
Produkce tabákové buněčné kultury, která toleruje herbicidní protox inhibitory, kultivací buněk v tekutém selekčním médiu.
Buňky, které jsou kultivovány stejným způsobem, jak je uvedeno v příkladu 10, jsou vneseny ve vhodné hustotě do média MX1, jenž obsahuje požadovanou koncentraci herbicidního protox inhibitoru. Buňky rostou za stejných podmínek, jak je popsáno v příkladu 10. Buňky jsou po 7 až 10-ti dnech subkultivovány, což závisí na rychlosti růstu, v čerstvém médiu, které obsahuje příslušnou koncentraci inhibitoru.
Buňky rostou pravděpodobně pomaleji v závislosti na koncentraci inhibitoru, než buňky rostoucí v médiu bez inhibitoru.
Příklad 13
Produkce tabákových buněk se zvýšenou hladinou protox enzymu.
Za účelem získání buněčné kultury nebo kalusu se zvýšenou hladinou protox enzymu, suspenze buněk nebo kalusu je přenášena do médií s postupně se zvyšující koncentrací herbicidního protox inhibitoru. Zvláště následující krok je důležitý.
Kolonie buněk selektované z těch, které vyrostly na plotnách, jak je popsáno v příkladu 11, jsou přeneseny do MX1 média, jenž obsahuje stejnou koncentraci protox inhibitoru, jako je užívána v příkladu 11 k vytvoření suspenzní kultury. V jiném případě vybrané kultury buněčných suspenzí z příkladu 12, jsou subkultivovány v kapalném médiu MX1, které obsahuje stejnou koncentraci protox inhibitoru, jako je užívána k selekci podle příkladu 12.
-29CZ 296023 B6
Kultury jsou subkultivovány až 20x v týdenních intervalech v MX1 médiu, které obsahuje vždy vyšší koncentraci herbicidu. Buňky jsou kultivovány až v 10-ti subkulturách v médiu, které obsahuje danou vyšší koncentraci herbicidu. Pak jsou přeneseny do MX1 média, jenž obsahuje další vyšší koncentraci herbicidu.
V jiném případě kousky selektovaného kalusu z příkladu 11 jsou přeneseny do tuhnoucího MX1 média, které obsahuje požadovanou koncentraci herbicidu. Následuje přenos do média s vyšší koncentrací herbicidu, stejně jak je uvedeno v předchozím odstavci, s výjimkou, že se používá pevné médium.
Příklad 14
Měření růstu buněk v suspenzní kultuře v závislosti na dávce herbicidu.
Za účelem získání křivky závislosti růstu na dávce herbicidu, je určován růst buněk při různých koncentracích herbicidu. V suspenzi kultivované buňky tabáku S3 divokého typu, citlivé na herbicidní protox inhibitor, a buňky selektované pro toleranci na herbicid nebo transgenické buňky jsou po dobu 2-4 dny ve vysoké hustotě předkultivovány v kapalném médiu stejným způsobem jako v příkladu 11. Použité médium je odstraněno, buňky jsou promyty a je přidáno čerstvé médium bez herbicidu, v takovém množství, aby byla dosažena požadovaná hustota buněk (okolo 150 mg FW buněk na ml suspenze). 2,5 ml buněčné suspenze, obsahující přibližně 250-300 mg FW buněk, je pak inokulováno do přibližně 30 ml kapalného média s požadovanou koncentrací herbicidu, které je obsažené ve 100 ml Erlenmeyerových lahvích. Je důležité každou láhev inokulovat stejným množstvím buněk. Je inokulováno 3 až 6 lahví pro jednu koncentraci herbicidu. Koncentrace herbicidu se pohybuje v rozmezí 0 (=kontrola), 0,1 ppb, 0,3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1 000 ppb, 3 000 ppb a 10 000 ppb. Několik vzorků inokulované kultury je odebráno v čase inokulace k určení biomasy buněk v inokulované láhvi.
Buňky jsou pak inkubovány při teplotě 28 °C, ve tmě, po dobu 10-ti dnů. Buňky jsou separovány vakuovou filtrací a vážením je určena biomasa buněk. Vážením po usušení lze získat hodnotu suché biomasy.
Růst buněk je určen jako výtěžek z 10-ti denní kultivace a je vyjádřen jako procento vztažené k růstu buněk v médiu bez herbicidu podle vzorce: (konečná biomasa buněk rostlých za přítomnosti herbicidu minus biomasa inokula krát 100 děleno celkovou biomasou buněk rostlých bez herbicidu minus biomasa inokula). Hodnoty IC50 jsou určeny z grafu závislosti (relativní buněčná biomasa na koncentraci herbicidu). IC50 udává koncentraci herbicidu, při které růst buněk dosahuje 50 % hodnoty růstu kontrolního pokusu (buňky jsou kultivovány bez herbicidu).
U modifikované metody několik kousků kalusu, získaných z na rezistentní buněčné kultury způsobem stejným jako v příkladech 11 a 13, je přeneseno do tuhnoucího média vhodného pro kultivaci kalusu, která obsahuje různé koncentrace herbicidu. Relativní růst je určen po 2 až 6-ti týdenní kultivaci vážením kousků kalusu a porovnáním s růstem kontrolní kultury v médiu bez herbicidu. Metoda růstu v suspenzi je preferována pro svou přesnost.
Příklad 15
Určení křížové tolerance.
Za účelem určení rozsahu, ve kterém buňky vykazují toleranci k analogickým nebo jiným herbicidům, je podle příkladu 14 provedena kultivace buněk ve stoupající koncentraci vybraných herbicidů. Relativní růst buněk a jejich hodnota IC50 je určena pro každý herbicid. Tyto hodnoty jsou pak porovnány.
-30CZ 296023 B6
Příklad 16
Určování stability k herbicidu tolerantního fenotypu.
Za účelem stanovení, zda na herbicid tolerantní fenotyp buněčné kultury je stabilní po určitý časový úsek, buňky jsou přeneseny z média obsahující herbicid do média bez herbicidu. Buňky jsou kultivovány jak popisuje příklad 10, v médiu bez herbicidu po dobu tří měsíců, subkultivací ve vhodných intervalech (7-10 dnů v případě suspenzní kultury: 3 až 6 týdnů v případě kultivace kalusu). Známé množství buněk je pak zpět přenesena do média, které obsahuje herbicid a kultivována po dobu 10-ti dnů (suspenzní kultury) nebo po dobu 4 týdnů (kultivace kalusu). Relativní růst je určen stejným způsobem jako v příkladu 14.
Příklad 17
Indukce a kultivace embryogenního kalusu z tkáně kukuřičného štítku.
až 14 dnů po opylení jsou sebrány klasy z samoopylujících se rostlin kukuřice inbrední linie Funk 2717. Po odstranění slupek jsou klasy sterilizovány po dobu 15 minut v 20% roztoku komerčního bělidla Chlorox s několika kapkami detergentů, který je přidán z důvodu lepšího smáčení. Klasy jsou pak několikrát omyty sterilní vodou. Všechny další kroky jsou prováděny asepticky v digestoři. Embrya o délce 1,5 až 2,5 mm jsou vyjmuta z jádra spatulou a jsou umístěna embryonální osou směrem dolů na MS médium, které obsahuje 2 mg/1 kyseliny 2,4-dichlorofenoxyoctové (2,4-D) a 3% sacharózu a je ztuženo 0,24% Gelrite®.
Po 2 až 4 týdenní kultivaci při teplotě 28 °C ve tmě se tvoří embryonální kalus na štítkových tkáních embryí. Kalus je vyjmut z axplantátu a je přenesen do čerstvého ztuženého MS média, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D. Subkultivace je opakována v intervalu jednoho týdne. Jsou subkultivovány pouze ty části kalusu, které mají embryogenní morfologii.
Příklad 18
Selekce kultur buněk kukuřice, které jsou tolerantní kherbicidním protox inhibitorům.
a) Selekce použitím embryogenního kalusu: embryogenní kalus, jehož vznik je popsán v příkladu 17 je přenesen do média pro udržování kalusu, které se skládá z N6 média obsahující 2 mg/1 2,4-D 3% sacharózu a protox inhibitor o koncentraci, jenž je dostatečná k potlačení růstu, ale neovlivňuje embryogenezi kultury, a je ztužené 0,24% Gelrite®. Aby došlo ke zvýšení frekvence výskytu k herbicidu tolerantním mutantům, kultura může být před selekcí ošetřena chemickým mutagenem, například ethylmetan sulfonát nebo fyzikálním mutagenem, například UV světlem, v koncentraci, která je nižší než je ta, která inhibuje růst (příklad 14). Kultury jsou kultivovány při 28 °C ve tmě. Kalus po 14-ti denní kultivaci je přenesen do čerstvého média stejného složení. Subkultivovány jsou pouze kultury, které mají požadovanou embryogenní morfologii známou jako drobivý embryogenní kalus typu II. Kultury jsou pomnožovány subkultivací v týdenních intervalech ve dvou až deseti subkultivačních v čerstvém médiu. V tomto médiu jsou subkultivovány pouze nejrychleji rostoucí kultury. Rychle rostoucí kalus je pak přenesen do média pro jeho udržování, které obsahuje protox inhibující herbicid ve vhodné koncentraci jak je definováno v příkladu 11. V případě, že kalus dobře roste v přítomnosti herbicidu dané koncentrace, obvykle po pěti až deseti týdenních subkultivacích, kalus je přenesen do média, které obsahuje třikrát vyšší koncentraci inhibitoru a je subkultivován až do doby, kdy je získána dobře rostoucí kultura. Tento proces je opakován za použití média, které obsahuje protox inhibitor v koncentraci,
-31 CZ 296023 B6 jenž je desetkrát vyšší než je původní vhodná koncentrace a dále média obsahující 20x a 40x vyšší koncentrace.
Když je vyprodukován dostatečný kalus je přenesen na regenerační médium, které je vhodné pro dozrání embrya a regeneraci rostliny. Embryogenní kalus rostoucí v přítomnosti každé z použitých koncentrací herbicidu je přenesen do regeneračního média.
b) Selekce použitím embryogenních suspenzních kultur: Embryogenní suspenzní kultury imbrední linie kukuřice Funk 2717, která vznikla podle příkladu 24 a je udržována subkultivací v týdenních intervalech v čerstvém kapalném médiu N6, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D. Aby došlo ke zvýšení frekvence výskytu k herbicidu tolerantním mutantům, kultura může být před selekcí ošetřena chemickým mutagenem, například ethylmetan sulfonát nebo fyzikálním mutagenem, například UV světlem, v koncentraci, která je nižší než je ta, která inhibuje růst (příklad 14). Kultuty jsou kultivovány na míchačce při 120 rpm při teplotě 28 °C ve tmě. Médium je vyměňováno v týdenních intervalech. Kultury jsou ředěny médiem podle jejich růstu. Snahou je udržet koncentraci buněk okolo 10 ml buněk na 50 ml média. Rychlost růstu každé subkultury je kontrolována a pouze rychle rostoucí kultury s požadovanou drolivou embryogenní morfologií se uchovává pro další subkulturu. Po dvou až deseti subkultivacích v médiu, jehož složkou je N6 médium, vzrůstá růstová rychlost nejméně dvakrát až třikrát během týdenní subkultivace. Kultury jsou pak přeneseny do N6 média, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D a třikrát vyšší dávku inhibitoru než je původní. Rostoucí kultury jsou opakovaně subkultivovány v tomto médiu a vznikají dvě až deset subkultur, jak je výše popsáno. Pro další subkultivaci jsou vybrány rychle rostoucí kultury s požadovanou drolivou embryogenní morfologii. Tyto kultury jsou přeneseny do N6 média, které obsahuje 2 mg 2,4-D a desetkrát vyšší koncentraci inhibitoru než je původní. Postup subkultivace rostoucích kultur s požadovanou drobivou embryogenní morfologií je opakován až do doby, kdy jsou získány rychle rostoucí kultury. Tyto kultury jsou pak přeneseny do N6 média, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D a 30-ti násobně vyšší koncentraci inhibitoru než je ta původní.
Za účelem regenerace rostlin z každé embryogenní suspenzní kultury selektované pro každou zmíněnou koncentraci herbicidu, jsou kultury nejprve přeneseny do N6 média ztuženého 0,24% Gelrite® a obsahujícího 2 mg/1 2,4-D a koncentraci inhibitoru, ve které byla kultura kultivována pro produkci embryogenního kalusu. Embryogenní kalus je subkultivován v čerstvém médiu až do doby, kdy je získáno dostatečné množství kalusu pro regeneraci. Jsou subkultivovány pouze kultury s požadovanou embryogenní morfologií.
Příklad 19
Regenerace rostlin kukuřice získaných ze selektovaného kalusu nebo suspenzní kultury.
Rostliny jsou regenerovány ze selektovaných embryogenních kultur kalusu z příkladu 13 přenesením do čerstvého regeneračního média. Užívaná regenerační média jsou: 0N6 médium, které se skládá z N6 média bez 2,4-3 nebo N61 skládající se z N6 média obsahujícího 0,25 mg/1 2,4-D a 10 mg/1 kinetinu (6-furfurylaminopurin) nebo N62, jehož složkou je N6 médium s obsahem 2,4D o koncentraci 0,1 mg/1 a kinetinu o koncentraci 1 mg/1. Všechna média jsou ztužena 0,24% Gelrite®. Kultury jsou kultivovány při teplotě 28 °C za přístupu světla (10-100pEinstein/m2sec, 16 hod. denně, z bílých fluorescenčních lamp). Kultury jsou subkultivovány v čerstvém médiu každé dva týdny. Rostlinky se vyvinou během 3 až 8 týdnů. Rostlinky nejméně 2 cm vysoké jsou vyjmuty z kalusu a jsou přeneseny do média, které podporuje tvorbu kořenů. Používají se různá média tohoto druhu. Médium, jehož složkou je buď N6 nebo MS médium neobsahuje vitaminy ani obvyklé množství solí nebo jeho obsah solí je redukován na polovinu, obsah sacharózy je redukován na lg/1 a dále buď vůbec neobsahuje růst regulující sloučeniny nebo obsahuje 0,1 mg/1 kyseliny a-naftalenoctové. Poté, co se dostatečně vyvinou kořeny, rostlinky jsou přesazeny do květináčové směsi, která obsahuje vermikulit, rašelinu a zahradní půdu. Po přesazení je odstraněn
-32CZ 296023 B6 celý zbývající kalus a agar je smyt a listy jsou přestřihnuty na polovinu. Rostlinky rostou ve skleníku. Ze začátku jsou kryty průhledným plastovým kelímkem z důvodu udržení vlhkosti a ochrany před přímým světlem. Po aklimatizaci jsou přesazeny a rostou do dosažení zralosti. Hnojivo Peters 20-20-20 (Grace Sierra) je používáno pro zdravý vývoj rostliny. Kvetoucí rostliny jsou opylovány, preferuje se samoopylení.
Příklad 20
Konstrukce vektorů pro transformaci rostlin.
Rada transformačních vektorů je dostupná pro transformaci rostlin. Geny popsané v tomto vynálezu mohou být konjugovány s libovolným z těchto vektorů. Volba vektoru záleží na preferované metodě transformace a druhu rostliny, do kterého je transformace směrována. Pro různé cílové druhy rostlin jsou preferovány různé antibiotikové nebo herbicidní selekční markéry. Rutině používané selekční markry pro transformaci zahrnují nptll gen, který nese rezistenci na kanamycin a příbuzná antibiotika (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nátuře 304:184187 (1983)), bar gen, který konferuje rezistenci na herbicid fosfínotricin (White et al., Nucl. Acids. Res. 18:1062 (1990, Spencer et al., Theor. Appl. Gent. 79:625-631 (1990)), hph gen, který nese rezistenci na antibiotikum hygromycin (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4:2929-2931), a dhfr gen, který konferuje rezistenci na methotrexat (Bourouis et al., EMBO J. 2(7):1099-1104(1983)).
(1) Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci pomocí Agrobacterium
Rada vektorů je použitelná pro transformaci pomocí Agrobacterium tumefaciens. Tyto vektory většinou nesou nejméně jednu T-DNK hraniční sekvenci a zahrnují vektory jako je pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Dále je popsána konstrukce dvou typických vektorů.
Konstrukce pCIB200 a pCIB2001
Binární vektory pCIB200 a pCIB2001 jsou užívány pro konstrukci rekombinantních vektorů použitelných spolu s Agrobacterium a byly konstruovány následujícím způsobem. PTJS75kan byl vytvořen štěpením Narl pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455 (1985)), což umožňuje excizi genu nesoucí rezistenci na tetracyklin. Pak následuje inzerce AccI fragmentu zplazmidu pUC4K, který nese NPTII (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nátuře 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990)). Xhol linkry byly ligovány k EcoRV fragmentu, který obsahuje pravou a levou T-DNK hraniční sekvence, rostlinný selektovatelný nos/nptll chimérický gen a pUC polylinker (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), a restriktázou Xhol štěpený fragment byl klonován do Sáli štěpeného pTJS75kan za účelem vytvoření pCIB200 (EP 0 332 104, příklad 19 [1338]). pCIB200 obsahuje vpolylinkru následující restrikční místa: EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal a Sáli. pCIB2001 je odvozen od pCIB200, je vytvořen inzercí dalších restrikčních míst do polylinkru. Vyskytují se v něm tyto restrikční místa: EcoRi, Sstl, KpnI, BglII, Xbal, Sáli, MLUI, Bell, AvrlI, Apal, Hpal a Stul. PCIB2001 také obsahuje rostlinnou a bakteriální selekci na kanamycin, levou a pravou T-DNK hraniční sekvenci pro transformaci zprostředkovanou Agrobakterium, trfA odvozený zRK2 pro mobilizaci mezi E. coli a dalšími hostiteli a OriT a OriV funkce také odvozené z RK2. Polylinker pCIB2001 je vhodný pro klonování rostlinných expresivních kazet, které obsahují jejich vlastní regulační signály.
Konstrukce pCIBlO a jeho na hygromycin selekčních derivátů
Binární vektor pCIBlO obsahuje gen kódující rezistenci na kanamycin pro selekci v rostlinách, pravou a levou T-DNK hraniční sekvence a inkorporované sekvence z plazmidu pRK252, který je použitelný v širokém rozmezí hostitelů. Tyto sekvence umožňují replikaci v E. coli
-33CZ 296023 B6 i v Agrobacterium. Jeho konstrukce je popsána Rothsteinem et al., Gene 53:153-161 (1987)). Byly konstruovány různé deriváty odvozené od pCIBlO, které mají inkorporovaný gen pro hygromycin B fosfotransferázu (Grity et al., Gene 25:179-188 (1983)). Tyto deriváty umožňují selekci buněk transgenických rostlin pouze na hygromycin (pCIB743) nebo na hygromycin a kanamycin (pCIB715, pCIB717) (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987).
(2) Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci bez použití Agrobacterium
Transformace bez použití Agrobacterium tumefaciens obchází požadavek na T-DNK sekvence ve vybraném transformačním vektoru a proto vektory, kterým tyto sekvence chybí mohou být využívány vedle vektorů, takových jako je ten co byl výše popsán a co obsahuje T-DNK sekvence. Transformační metody, které nevyužívají Agrobacterium, zahrnují transformace pomocí ostřelování částicemi, příjem do protoplastu (např. PEG a elektroporace) a mikroinjektáž. Volba vektoru závisí většinou na preferované selekci vhodné pro druhy, které jsou transformovány. Dále je popsána konstrukce některých vektorů.
Konstrukce pCIB3064 pCIB3064 je vektor odvozený z vektoru pUC, vhodný pro metody přímého transferu genu v kombinaci se selekcí na herbicid basta (nebo fosfínotricin). Plazmid pCIB246 obsahuje CaMV 35S promotor v operační fúzi s genem GUS z E. coli a CaMV 35S terminátor transkripce a je popsán v PCT přihlášce WO 93/07278. 35S promotor tohoto vektoru obsahuje dvě ATG sekvence 5'-konc startovacího místa. Tyto místa byla mutována za použití standardní PCR metody takovým způsobem, jako je odstranění ATG a vytvoření SspI a PvuII restrikčních míst. Nová restrikční místa byla 96 a 37 bp daleko od jediného Sáli místa a 101 a 42 bp daleko od skutečného startovacího místa. Výsledný derivát pCIB246 byl označen pCIB3025. GUS gen byl pak vystřižen štěpením pCIB3025 restrikčními enzymy Sáli a Sací. Konce byly zarovnány a gen byl znovu ligován za účelem vytvoření plazmidu pCIB3060. Plazmid pJIT82 byl získán z John Innes Centre, Norwich a 400 bp fragment, obsahující bar gen z Streptomyces virichromogenes byl vystřižen a vnesen do Hpal místa vektoru pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J.6:2519-2523 (1987)). Takto vznikl pCIB3064, který obsahuje bar gen, jenž je kontrolován CaMV 35S promotorem, a terminátor pro selekci na herbicid, gen nesoucí rezistenci na ampicilin (pro selekci v E. coli) a polylinker s restrikčními místy Sphl, Pstl, HindlII a BamHI. Tento vektor je vhodný pro klonování rostlinných expresivních kazet, které obsahují jejich vlastní regulační signály.
Konstrukce pSOG19 a pSOG35 pSOG35 je transformační vektor, který využívá jako selekční markér gen dihydrofolatové reduktázy (DHFR). Tento gen propůjčuje rezistenci na methotrexat. Pomocí PCR byl amplifíkován promotor 35S (~800 bp), intron 6, který pochází z Adhl genu kukuřice (~550 bp) [Lou et al., Plant J. 3:393-403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12:3983-4000, 1984] a 18 bp nepřekládané vedoucí sekvence genu GUS zpSOGlO. Dále byl amplifikován PCR 250 bp velký fragment, který kóduje gen dihydrofolátové reduktázy typu II z E. coli. Tyto dva fragmenty byly spojeny s Sacl-Pstl fragmentem z pBI221 (Clontech), který obsahuje základní řetězec z vektoru pUC19 a terminátor nopalinové syntetázy. Spojením těchto fragmentů vznikl pSOG19, který obsahuje 35S promotor ve fůzi s intronem 6, s vedoucími sekvencemi GUS genu, s genem DHFR a terminátorem nopalinové syntetázy. Záměnou vedoucí sekvence GUS genu vpSOG19 za vedoucí sekvenci viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV) vznikl vektor pSOG35. pSOG19 a pSOG35 nesou pUC gen kódující rezistenci na ampicilin a mají HindlII, Sphl, Pstl a EcoRI restrikční místa, která jsou vhodná pro klonování cizích sekvencí.
pSOG 10
Tento vektor exprimující β-glucuronidázu (GUS) byl odvozen z plazmidu pBI121, získaný z Clontech Laboratories, Palo Alto, Califomia. Z plazmidu pB428 byl amplifikován pomocí PCR
-34CZ 296023 B6 intron 6 kukuřičného Adhl genu, jak popisuje Bennetzen et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 81:4125-4128 (1987). Při této amplifikaci byly použity primery SON0003 a SON0004.
SON0003: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3'
SOŇO 004: 5'-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3'
Produkt PCR byl štěpen restrikční endonukleázou BamHI, BamHI místo se nachází na 5'-konci každého PCR primerů. Výsledný fragment DNK byl purifíkován na agarózovém gelu a ligován do BamHI místa pBI121, které se nachází mezi promotorem CaMV35S a GUS genem.Ligovaná DNK byla transformovaná do E. coli a klony s Adhl intronem 6, který má stejnou orientaci jako GUS gen, byly identifikovány restrikční analýzou.
pSOG19
Tento vektor exprimující dihydrofolatovou reduktázu (DHFR) vznikl fúzí promotoru 35S a Adhl intronu 6 z vektoru pSOGlO s genem DHFR, který pochází z plazmidu pHCO, popsaný v Bourouis a Jarry, EMBO J. 2:1099-1104 (1983). Promotor 35S a Adhl intron 6 byl vytvořen amplifikaci PCR fragmentu pocházející z vektoru pSOGlO, byly použity primery SON0031 a SON0010.
SON0031: 5'-CATGAGGGACTGACCACCCGGGATC-3'
SON0010: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'
Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Pstl a BspHI a byl purifíkován na agarózovém gelu.
Oblast kódující DHFR byla vytvořena PCR amplifikaci pHCO za použití primerů SON0016 aSON0017.
SOŇO016: 5'-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3'
SON0017: 5'CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3'
Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Nsol a Sací a purifíkován na agarózovém gelu.
Oba fragmenty výše popsané byly ligovány do fragmentu vektoru vytvořeného štěpením vektoru pBI121 restrikčními endonukleázami Pstl a Sací. Takto vzniklý fragment je 3 kb velký a obsahuje oblast Nos terminátoru a oblast pUC19 z vektoru pBI121 a byl purifíkován na agarózovém gelu. Tato třícestná ligace spojila 35S promotor-Adhl intron 6-DHFR gen-Nos termina tor ve správném pořadí a se správnou orientací, což zaručuje funkční expresi v rostlinách.
pSOG30
Tento vektor exprimující GUS byl odvozen z pSOGlO inzercí vedoucí sekvence viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV), popsáno vLommel et al., Virology 181:382-385 (1991), třícestnou ligací do nepřekládané vedoucí sekvence 35S-GUS genu.
Syntetizované řetězce 17 bp velké vedoucí sekvence MCMV kapsidového proteinu plus příslušná restrikční místa byly spojeny. Výsledný dvouřetězcový fragment byl štěpen endonukleázami BamHI a Ncol a purifíkován na akrylamidovém gelu.
-35CZ 296023 B6
Oblast kódující GUS gen byla amplifíkována pomocí PCR za použití primerů SON0039 a SON0041 a vektor pBI 121 byl použit jako templat.
SON0039: 5'-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA~3
SON0041': 5'-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'
Tyto primery přičlenily Ncol restrikční místo k 5'-konci genu GUS a Sací místo k 3'-konci genu GUS. Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Sací a byl purifikován na agarózovém gelu.
GUS gen byl vyjmut z plazmidu pSOGlO štěpením restrikční endonukleázou Sací a částečným štěpením s endonukleázou BamHI. Výsledný vektor, který má BamHI a Sací místa, kde je inzert kódující oblasti za 35S promotorem-Adhl intronem 6, byl purifikován na agarózovém gelu.
Tyto tři fragmenty výše popsané byly ligovány třícestnou ligací ke genovou fúzí vytvořené struktuře: 35S promotor-Adhl intron 6-MCMV vedoucí sekvence-Nos terminátor, vše se vyskytuje v základním řetězci z vektoru pUC19.
pSOG35
Vektor nesoucí DHFR selekční markér je identický jako pSOG19, s výjimkou, že MCMV vedoucí sekvence je vložena do nepřekládané vedoucí sekvence DHFR genu za účelem zesílení translace. Tato struktura byla vytvořena ve dvou krocích. Nejdříve oblast kódující GUS ve vektoru pSOG32, což je stejný vektor jako je pSOG30 s výjimkou, že obsahuje spíše modifikovaný Adh promotor než 35S, byla nahrazena oblastí kódující DHFR z vektoru pSOG19, excizí GUS genu pomocí restrikčních endonukleáz Ncol a Sací a ligací do DHFR genu jako NcoI-SacI fragment. Výsledek je vektor pSOG33, který nese genovou strukturu Adh promotor-Adhl intron 6vedoucí sekvence MCMV-DHFR kódující oblast-Nos terminátor. Tato struktura má BglII místo mezi promotorem a intronem a Sací místo mezi kódující oblastí a terminátorem. BglII-SacI fragment byl izolován štěpením pomocí restrikčních endonukleáz a byl purifikován na agarózovém gelu a ligován do BamHI a Sací míst vektoru pSOG30, místo Adhl intron 6-MCMV vedoucí sekvence-DHFR kódující oblasti vektoru pSOG33.
Příklad 21
Konstrukce rostlinných expresivních kazet.
Genové sekvence zamýšlené pro expresi v transgenických rostlinách jsou nejdříve spojeny do expresivních kazet, tak, že před nimi leží vhodný promotor a za nimi vhodný terminátor transkripce. Tyto expresivní kazety mohou být jednoduše přeneseny do rostlinných transformačních vektorů jak je popsáno v příkladu 19.
Výběr promotoru
Výběr promotoru užívaného v expresivních kazetách je určen prostorovým a časovým expresivním patemem transgenu v transgenických rostlinách. Selektované promotory exprimují transgeny ve specifických buněčných typech (jako jsou listové epidermální buňky, mezofylové buňky, buňky kořenového kortexu) nebo ve specifických tkáních a orgánech (např. kořeny, listy nebo květy) a tento výběr bude záviset na požadované lokaci exprese transgenu. V jiném případě vybraný promotor může regulovat expresi genu, který je pod světlem indukovaným nebo jinak regulovaným promotorem. Další alternativa je, že vybraný promotor je chemicky regulován, což umožňuje indukovat expresi transgenu pouze po ošetření chemickým induktorem.
-36CZ 296023 B6
Terminátory transkripce
Rada terminátorů transkripce je dostupná pro použití v expresních kazetách. Tyto terminátory jsou zodpovědné za ukončení transkripce transgenu a jeho správnou polyadenilaci. Příslušné transkripční terminátory a ty, o nichž je známo, že fungují v rostlinách, zahrnují CaMV 35S terminátor, tmi terminátor, terminátor nopalinové syntezázy a rbcS E9 terminátor hrášku. Tyto terminátory mohou být použity jak vjednoděložních tak i v dvouděložních rostlinách.
Sekvence pro regulaci nebo zvýšení exprese
O řadě sekvencí je známo, že zesilují expresi genu z transkripční jednotky. Tyto sekvence mohou být použity v konjugaci s geny tohoto vynálezu za účelem zvýšení síly jejich exprese v transgenických rostlinách.
Různé intronové sekvence zesilují expresi, zvláště v jednoděložních rostlinách. Například introny kukuřičného genu Adhl, jsou-li vneseny do buněk kukuřice, podstatně zvyšují expresi genu divokého typu, která je regulována jeho promotorem. Intron 1 je zvláště účinný. Zesiluje expresi, je-li v konstrukcích spojen s genem chloramfenikolové acetyltransferázy (Callis et al., Genes Develop.l:1183-1200 (1987)). Intron z kukuřičného genu bronze 1 podobně zesiluje expresi ve stejném pokusném systému (Callis et al., supra). Sekvence intronu jsou rutinně vkládány do rostlinných transformačních vektorů, většinou do nepřekládané vedoucí sekvence.
Rada nepřekládaných vedoucích sekvencí pocházející z virů také zesiluje expresi. Tyto sekvence jsou zvláště účinné v buňkách dvouděložních rostlin. Vedoucí sekvence z tabákového mozaikového viru (TMV, „W-sekvence“), viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV) a mozaikového viru vojtěšky (AMV) jsou účinné při zesílení exprese (např. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15:65—79 (1990)).
Směrování genových produktů do buněk
V rostlinách existují různé mechanizmy pro směrování genových produktů. Sekvence, které řídí tyto mechanizmy, jsou zde charakterizovány v některých detailech. Například, směrování genových produktů do chloroplastu je řízeno signální sekvencí, která se nachází v N-konci různých proteinů a která je štěpena během chloroplastového importu, jenž umožňuje dozrání proteinu (např. Comai et al., J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)). Tyto signální sekvence mohou být fúzovány k produktům heterogenních genů a mohu ovlivnit import heterogenních produktů do chloroplastu (van den Brock et al., Nátuře 313:358-363 (1985)). DNK, kódující příslušné signální sekvence, může být izolována z 5'-konce cDNK, jenž kódují RUBISCO protein, CAB protein, EPSP syntetázový enzym, GS2 protein a mnoho dalších proteinů, jenž jsou lokalizovány v chloroplastu.
Další genové produkty mohou být směrovány do jiných organel jako jsou mitochondrion aperoxisom (např. Unger et al., Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)). cDNK kódující tyto produkty mohou být manipulovány za účelem směrování produktů heterogenních genů do zmíněných organel. Příklady takových sekvencí jsou v jádru kódované ATPázy a specifické izoformy aspartátové aminotransferázy určené pro mitochondrie. Směrování buněčných proteinů popisuje Rogers et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)).
Dále byly charakterizovány sekvence, které způsobují směrování genových produktů do dalších buněčných částí. Sekvence N-konce jsou zodpovědné za směrování do ER, do apoplastu a za extracelulámí sekreci z buněk lepku (Koehler & Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)). Sekvence N-konce konjugované se sekvencemi c-konce odpovídají za směrování genových produktů do vakuol (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14:357—368 (1990)).
-37CZ 296023 B6
Fúzí příslušných výše popsaných sekvencí se sekvencemi transgenů je možné směrovat produkt transgenů do libovolné organely nebo buněčné části. Za účelem směrování do chloroplastu je příslušná chloroplastová signální sekvence z genu RUBISCO a CAB genu, z genu EPSP syntetázy nebo z GS2 genu fúzována do rámce s ATG N-konce transgenů. Selektovaná signální sekvence by měla zahrnovat známé štěpící místo a vytvořená fúze by měla brát v úvahu libovolnou aminokyselinu za místem štěpení, která je pro štěpení nutná. V některých případech tento požadavek může být zajištěn vnesením malého množství aminokyselin mezi štěpící místo a ATG transgenů nebo v jiném případě záměnou některých aminokyselin v sekvencích transgenů. Účinnost fúzí konstruovaných pro import do chloroplastu může být testována in vitro translací přepisovaných konstrukcí in vitro, což je následováno in vitro příjmem chloroplastu za použití metod popsaných (Bartlett et al., v: Edelmann et al (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. Pp 1081-1091 (1982); Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986)). Tyto dobře známé konstrukční metody jsou stejně aplikovatelné jak v mitochondriu tak i peroxizomech. Volba směrování, která může být žádána pro expresi transgenů, závisí na buněčné lokalizaci prekurzoru. Tento prekurzor je nutný jako počáteční místo pro danou cestu. Jedná se obvykle o cytosolický nebo chloroplastový, ačkoliv může být v některých případech i mitochondriální nebo peroxizomální. Produkty exprese transgenů normálně nevyžadují směrování do ER, apoplastu nebo vakuol.
Výše popsaný mechanizmus buněčného směrování může být využíván ne pouze v konjugaci s jejich podobným promotorem, ale také v konjugaci s heterolognímy promotory, které ovlivňují specifické buněčné směrování za podmínek transkripční regulace promotoru, jehož expresní patem je odlišný od paternu promotoru, od něhož je směrovací signál odvozen.
Příklad 22
Transformace dvouděložních rostlin
Metody transformace dvouděložných rostlin jsou dobře známy a zahrnují metody zprostředkované Agrobacterium a metody, které nepotřebují Agrobacterium. U metody bez účasti Agrobacterium dochází k příjmu exogenního genetického materiálu přímo protoplasty nebo buňkami. Toto může být uskutečněno pomocí PEG nebo elektroporací, ostřelováním částicemi nebo mikroinjektáží. Příklady těchto metod jsou popsány Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986) a Klein et al., Nátuře 327:70-73 (1987). V každém případě transformované buňky použitím standardních metod dorůstají v celé rostliny.
Transformace zprostředkovaná Agrobacterium je preferována v případech transformací dvouděložních rostlin, protože je vysoce účinná a je široce využitelná pro mnoho různých druhů rostlin. Rada různých plodin zahrnující tabák, rajčata, slunečnice, bavlnu, řepku olejnou, brambory, sóju, vojtěšku a topoly (EP 0 317 511 (bavlna), EP 0 249 432 (rajčata, Calgene), WO 87/07299 (Brassice, Calgene), US 4 795 855 (topol)) jsou rutinně transformovány pomocí Agrobacterium. Tento způsob transformace typicky zahrnuje přenos binárního vektoru nesoucího cizorodou DNK (např. pCIB200 nebo pCIB2001) do příslušného kmene Agrobacterium, jehož volba závisí na komplementu vir genů nesených hostitelským kmenem Agrobacterium buď na plazmidu Ti nebo na chromozomu (např. kmen CIB542 pro pCIB200 a pCIB2001 (Uknes et al., Plant Cell 5:159— 169 (1993)). Přenos rekombinantního binárního vektoru do Agrobacterium je uskutečněn triparentálním kopulačním způsobem za použití E. coli nesoucího rekombinantní binární vektor a pomocného kmene E. coli, který nese plazmid jako je pRK2013 a který je schopný mobilizovat rekombinantní binární vektor do cílového kmene Agrobakterium. V jiném případě rekombinantní binární vektor může být přenesen do Agrobacterium transformací DNK (Hófgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877 (1988)).
-38CZ 296023 B6
Transformace cílových rostlinných druhů pomocí rekombinantního Agrobacterium obvykle zahrnuje kultivaci Agrobacterium s explanty pocházející z rostliny a dále se postupuje podle dobře známých protokolů. Transformovaná tkáň, která obsahuje na herbicid nebo antibiotikum rezistentní markér mezi T-DNK hraničními sekvencemi na binárním plazmidu, je regenerovaná na selekčním médiu.
Příklad 23
Transformace jednoděložných rostlin
Transformace většiny monoděložních druhů se také stává rutinou. Preferovanou metodou je přímý transfer genu do protoplastů za použití PEG nebo elektroporace a do tkáně kalusu ostřelováním částicemi. Transformace mohou probíhat s DNK jednoho druhu nebo s DNK více druhů (tj. kotransformace). Obě tyto metody jsou vhodné pro použití v tomto vynálezu. Ko-transformace má tu výhodu, že lze obejít komplexní konstrukci vektoru a lze vytvořit transgenické rostliny s nespojenými loky pro gen a selekční markér a lze v následujících generacích odstranit selekční markér, jestli je to požadováno. Nevýhodou použití ko-transformace je nižší frekvence než 100%, se kterou je separovaná DNK integrovaná do genomu (Schocher et al., Biotechnology 4:1093-1096(1986)).
Patentové přihlášky EP 0 292 435 (Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (Ciba-Geigy) a WO 93/07278 (Ciba-Geigy) popisují metody přípravy kalusu a protoplastů z elitní imbrední linie kukuřice, transformaci protoplastů použitím PEG nebo elektroporace a regeneraci rostlin kukuřice z transformovaných protoplastů. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)) a Fromm et al., Biotechnology 8:833-839 (1990) publikovali metody pro transformaci A188 odvozené kukuřičné linie za použití ostřelování částicemi. Přihláška WO 93/07278 (Ciba-Geigy) a Koziel et al., Biotechnology 11:194-200 (1993)) popisuje transformaci elitních imbredních linií kukuřice pomocí metody ostřelování částicemi. Tato metoda využívá nezralá embrya kukuřice o délce 1,5 až 2,5 mm excizovaná z kukuřičného klasu 14 až 15 dnů po opylení. Pro ostřelování byl použit přístroj PDS-lOOOHe Biolistics.
Transformace rýže může probíhat metodami přímého přenosu genu za využití protoplastů a ostřelování částicemi. Transformace zprostředkovaná protoplasty byla popsána pro rýži typu Japonica a Indica (Zhang et al., Plant Cell Rep. 7:379-384 (1988); Shimamoto et al., Nátuře 338:274-277 (1989); Datta et al., Biotechnology 8:736-740 (1990)). Oba typy jsou rutinně transformovatelné použitím metody ostřelování částicemi (Christou et al., Biotechnology 9:957-962 (1991)).
Patentová přihláška EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) popisuje metody pro generaci, transformaci a regeneraci Pooideae protoplastů. Tyto metody umožňují transformaci Dactylis a pšenice. Transformace pšenice do buněk typu C dlouhodobě regenerovatelného kalusu byla popsána Vasil et al., Biotechnology 10:667—674 (1992)) za použití metody ostřelování částicemi. Také (Vasil et al., Biotechnology 11:1553-1558 (1993) a Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993)) popisuje ostřelování částicemi nezralých embryí a kalusu z nezralých embryí. Pro transformaci pšenice je preferovaná metoda, kde nezralá embrya jsou ostřelována částicemi spolu s krokem, kdy embrya před příjmem genu jsou vystavena vysoké koncentraci sacharózy nebo maltózy. Před ostřelováním libovolné množství embryí (o délce 0,75-1 mm) je naneseno na plotnu s MS médiem s 3% sacharózou (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)) a 3 mg/1 2,4-D za účelem indukce somatických embryí, které takto přežívají ve tmě. V den ostřelování jsou embrya odebrána z indukčního média a jsou umístěna na osmoticum (tj. indukční médium se sacharózou nebo maltózou v požadované koncentraci, většinou 15 %). Embrya plazmolyzují 2 až 3 hodiny a pak jsou ostřelovány. Většinou se dává 20 embryí na cílovou plotnu, není to však kritický počet. Příslušný plazmid nesoucí gen (jako je pCIB3064 nebo pSG35) je standardní metodou precipitován na zlatých mikrometrových částicích. Každá plotna s embryi je
-39CZ 296023 B6 ostřelována DuPont Biolistics'heliovým přístrojem za použití průrazného tlaku -1000 psi a standardního síta s 80-ti oky. Po ostřelování jsou embrya umístěna zpět do tmy a nechají se vzpamatovat asi 24 hodin (stále na osmo tikům). Po 24 hodinách jsou embrya vyjmuta z osmotika a umístěna zpět na indukční médium, kde zůstanou po dobu asi jednoho měsíce před regenerací. Přibližně o měsíc později jsou embryonální explanty s vyvíjejícím se embryogením kalusem přeneseny do regeneračního média (MS+1 mg/1 NAA, 5mg/l GA), které dále obsahuje příslušné selekční agents (10 mg/1 basta v případě pCIB3064 a 2 mg/1 methotrexatu v případě pSOG35). Po přibližně jednom měsíci vyvinuté pupeny jsou přeneseny do velkých sterilních nádob, známých jako „GA7“, které obsahují na polovinu ředěné médium MS, 2% sacharózu a stejnou koncentraci selekčního agents. Patentová přihláška 08/147,161 popisuje metody transformace pšenice a je zde vložena jako reference.
Příklad 24
Selekce rostlinných protox genů rezistentních na protox inhibující herbicidy v E. coli expresivním systému.
Plazmid pWDC-4 kódující chloroplastevý protox enzym kukuřice je transformován do náhodně mutagenizovaného kmene XLl-Red (Stratagene, Lo Jolla, CA). Transformanty jsou naneseny na plotnu s L médiem, které obsahuje 50 mg/1 ampicilinu a jsou inkubovány 48 hodin při 37 °C. Porost transformovaných buněk je seškrábnut z ploten a je připravena plazmidová DNK pomocí Wizard Megaprep sady (Promega, Madison, WI). Plazmidová DNK izolovaná z tohoto mutovaného kmene pravděpodobně obsahuje přibližně jednu nahodile zaměněnou bázi na 2000 nukleotidů (green et al., Stratagies 7(2):32-34 (1994)).
Mutovaná plazmidová DNK je přenesena do hemG mutantu SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) a ten je nanesen na plotnu obsahující L médium s 100 g/ml ampicilinu a dále na plotny, které obsahují různé koncentrace protox inhibujícího herbicidu. Plotny jsou inkubovány 2 až 3 dny při teplotě 37 °C. Plazmidová DNK je izolována ze všech kolonií, které rostou v přítomnosti koncentrací herbicidu, jenž účinně zabíjejí kmen divokého typu. Izolovaná DNK je pak transformována do SASX38 a je nanesena na plotnu s herbicidem za účelem potvrzení rezistence nesené na plazmidů.
Mutovaná DNK plazmidů pWDC-4 je opět izolována z rezistentních kolonií a protox kódující sekvence je vystřižena štěpením EcoRI a Xhol. Excizovaná protox kódující sekvence je pak znovu klonována do nemutogenizovaného vektoru pBluescript a znovu testována na rezistenci na protox inhibující herbicid stejným způsobem jak je shora popsáno.
Tento proces eliminuje mutace nekódujících sekvencí, které propůjčují rezistence, takové jako „up-promotor“ mutanty (tj. mutanty, jejichž rezistence je způsobena mutacemi, jejichž následkem zesílila exprese nemodifikovaného protoxu) a zůstávají pouze mutanty, jejichž rezistence je způsobena mutacemi v sekvenci kódující protox. Je určena DNK sekvence pro všechny putativní na herbicid tolerantní protox geny identifikovaná pomocí popsaného procesu a mutace jsou odhaleny srovnáním mutované sekvence se pWDC-4 protox sekvencí divokého typu.
Použitím shora popsané metody byla identifikována rezistence způsobená mutací, která konvertuje C na T nukleotidu 498 v pWDC-4 sekvenci (SEQ ID č.: 5). Plazmid nesoucí tuto mutaci byl označen pMzC-1 Val. Tato záměna konvertuje GCT kodon pro alanin v aminokyselině 166 (SEQ ID č.: 6) na GTT kodon pro valin. Výsledkem je protox enzym, který je v bakteriálním testu nejméně lOx více rezistentní na protox inhibující herbicid.
PMzC-Val ve vektoru pBluescript byl uložen 30. 9. 1994 pod označením pWDC-8 v Agricultural Research Culture Collection a přístupové označení je NRRL#21340.
-40CZ 296023 B6
Stejná strategie byla použita pro vyhledávání na herbicid rezistentních forem Arabidopsis Protox-1 genu v různých vektorech. Byla identifikována jedna rezistenci způsobující mutace. Jde o záměnu C na T v nukleotidu 689 v sekvenci vpWDC-2 (SEQ IDč.: 1); tento plazmid byl označen pAraC-lVal. Tato záměna je identická jako vmutantu pMzC-lVal, konvertuje GCT kodon pro alanin v aminokyselině 220 (SEQ ID č.: 2) na GTT kodon pro valin v pozici, která koresponduje s pozicí v Arabidopsis protox proteinové sekvenci.
Druhý gen nesoucí rezistenci obsahuje záměnu A na G v nukleotidu 1307 v sekvenci pWDC-2 (SEQ ID č.:l); tento plazmid je označen pAraC-2Cys. Tato záměna konvertuje TAC kodon pro tyrosin v aminokyselině 426 (SEQ ID č.:2) na TGC kodon pro cystein. Korespondující kodon pro tyrosin v protox-1 sekvenci kukuřice v nukleotidová pozici 1115-1117 (SEQ IDč.:5; pozice aminokyseliny 372 SEQ ID č.:6) může být podobně mutován za účelem vytvoření na herbicid rezistentní formy tohoto enzymu.
Třetí rezistentní mutant má zaměněný G za A v nukleotidové pozici 691 v sekvenci pWDC-2 (SEQ ID č.:l); tento plazmid byl označen pAraC-3Ser. Tato mutace konvertuje GGT kodon pro glycin v aminokyselině 221 (SEQ ID č.:2) na AGT kodon pro serin v pozici kodonu přilehlé k mutaci vpAraC-1. Korespondující kodon pro glycin v protox-1 sekvenci kukuřice v pozici nukleotidu 497-499 (SEQ ID č.:5; pozice aminokyseliny 167 SEQ ID č.:6) může být podobně mutován za účelem vytvoření na herbicid rezistentní formy tohoto enzymu.
Výsledkem všech výše popsaných mutací je protox enzym, který je v bakteriálním testu nejméně lOx více rezistentní na protox inhibující herbicid.
PAraC-2Cys ve vektoru pFL61 byl uložen 14. 11. 1994 pod označením pWDC-7 v Agricultural Research Culture Collection a přístupové označení je NRRL#21339N.
Příklad 25
Dodatečné substituce v na herbicid rezistentním kodonu v pozicích identifikovaných náhodným výběrem
Aminokyseliny, které jsou náhodným výběrem identifikovány jako místa herbicidní rezistence, jsou zaměněny za jiné aminokyseliny. Pak je testována jejich funkce a tolerance k herbicidu v bakteriálním systému. Je provedena na oligonukleotid směrovaná mutageneze Arabidopsis Protox-1 sekvence za použití Transformer Site-Directed Mutagenesis sady (Clontech, Palo Alto, CA). Výměny aminokyselin jsou potvrzeny sekvenční analýzou. Mutované plazmidy jsou přeneseny do SASX38 a mutanty jsou naneseny na L-amp100 médium za účelem testování funkce a na médium z různými koncentracemi protox inhibujícího herbicidu za účelem testování jejich tolerance na herbicid.
Tento postup byl aplikován na kodon pro alanin na nukleotidy 688-690 a na kodon pro tyrosin na nukleotidy 1306-1308 Arabidopsis protox sekvence (SEQ ID č.:l). Výsledky ukazují, že kodon pro alanin v nukleotidech 688-690 může být změněn na kodon pro valin, threonin, leucin nebo cystein, což vede ke vzniku na herbicid rezistentnímu protox enzymu, který udrží svoji funkci. Výsledky dále demonstrují, že kodon pro tyrozin v nukleotidech 1306-1308 může být změněn na kodon pro cystein, izoleucin, valin nebo threonin, což vede ke vzniku na herbicid rezistentnímu protox enzymu, který udrží svoji funkci.
-41 CZ 296023 B6
Příklad 26
Demonstrace rezistentní mutační křížové tolerance k různým protox inhibujícím látkám
Rezistentní mutované plazmidy, selektované na rezistenci na jediný herbicid, jsou testovány s řadou dalších protox inhibujících látek. Kmen SASX38, který obsahuje plazmid divokého typu, je nanesen na plotnu s koncentrační škálou pro každou látku za účelem určení letální koncentrace těchto látek. Rezistentní mutantní plazmidy v SASX38 jsou naneseny na plotnu a je hodnocena jejich schopnost přežít působení každé látky v koncentraci, která je nejméně 10 krát vyšší než je koncentrace, která je letální pro kmen SASX38 obsahující plazmid divokého typu.
Výsledky testování křížové tolerance ukazují, že každá z identifikovaných mutací, propůjčuje toleranci k různým protox inhibujícím látkám. Výsledky zvláště ukazují, $
1) AraCl-Val mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, jenž mají vzorce IV, XI, XIII, XIV, XV a XVII;
2) AraC-2Cys mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorec XI, XIII, XV a XVII;
3) MzC-lVal mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorce XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI a XVII;
4) AraC-3Ser mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorce IV, XII, XIII, XIV, XV a XVII.
Příklad 27
Produkce rostlin tolerantních k herbicidu nadměrnou expresí rostlinných protox genů
Arabidopsis Protox-1 kódující sekvence z divokého typu a z mutantních genů AraC-lVal nesoucích rezistenci jsou vystřiženy částečným štěpením endonukleázami EcoRI a Xhol a jsou klonovány do rostlinného expresivního plazmidu pCGN1761ENX. Expresivni kazety obsahující fúze 2x35S-Protox gen byly vystřiženy restrikční endonukleázou Xbal a klonovány do binárního vektoru pCIB200. Tyto binární protox plazmidy jsou přeneseny elektroporací do Agrobacterium a pak do Arabidopsis za použití metody vakuové infiltrace (Bechtold etal., 1993). Transformanty jsou selektovány na kanamycin a z řady nezávislých linií vzniklo semeno označené T2. Tato semena jsou nanesena na plotnu na GM médium, které obsahuje různé koncentrace protox inhibujícího herbicidu a je hodnoceno jejich klíčení a schopnost přežít. Řada transgenických linií, které mají nadměrnou produkci buď protoxu divokého typu nebo rezistentního mutovaného protoxu, produkuje podstatné množství zelených semenáčů v přítomnosti herbicidu o koncentraci, jenž je letální pro kontrolní rostlinu nesoucí prázdný vektor.
-42CZ 296023 B6
SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) jméno: Ciba-Geigy (B) ulice: Klybeckstr. 141 (C) město: Basilej (E) země: Švýcarsko (F) pošt. směr. č. (ZIP): 4002 (G) telefon: +41 61 69 11 11 (H) telefax +41 61 696 79 76 (I) telex: 962 991 (ii) Název vynálezu: Izolovaná molekula DNK kódující protoporfyrinogenovou oxidázu v eukaryontech, způsob její manipulace a její farmaceutické použití, vektor a hostitel.
(iii) Počet sekvencí: 20 (iv) Počítačem čitelná forma:
(A) typ média: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: Patentln Relesase #1.0, verze #1.25 (EPO) (2) Informace o SEQ ID č.: 1:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 1719 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 31 1644 (C) další informace: /poznámka= „Arabidopsis protox-1 cDNK;sekvence z pWDC-2“
-43CZ 296023 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 1:
TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG 54
Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro
5
ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA | 102 | |||||||||||||||
Thr Thr Gin Ser Leu 10 | Leu | Pro Ser Phe Ser Lys 15 | Pro Asn Leu Arg Leu 20 | |||||||||||||
AAT | GTT | TAT | AAG | CCT | CTT | AGA | CTC | CGT | TGT | TCA | GTG | GCC | GCT | GGA | CCA | 150 |
Asn | Val | Tyr | Lys | Pro | Leu | Arg | Leu | Arg Cys | Ser | Val | Ala | Gly Gly | Pro | |||
25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
ACC | GTC | GGA | TCT | TCA | AAA | ATC | GAA GGC | GGA | GGA | GGC | ACC | ACC | ATC | ACG | 198 | |
Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Lys | Ile | Glu Gly | Gly | Gly | Gly | Thr | Thr | Ile | Thr | ||
45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
ACG | GAT | TGT | GTG | ATT | GTC | GGC | GGA | GGT | ATT | AGT | GGT | CTT | TGC | ATC | GCT | 246 |
Thr | Asp Cys | Val | Ile | Val | Gly | Gly Gly | Ilé | Ser | Gly | Leu | Cys | Ile | Ala | |||
60 | 65 | 70 | ||||||||||||||
CAG | GCG | CTT | GCT | ACT | AAG | CAT | CCT | GAT | GCT | GCT | CCG | AAT | TTA | ATT | GTG | 294 |
Gin | Ala | Leu | Ala | Thr | Lys | His | Pro | Asp | Ala | Ala | Pro | Asn | Leu | Ile | Val | |
75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
ACC | GAG | GCT | AAG | GAT | CGT | GTT | GGA | GGC | AAC | ATT | ATC | ACT | CGT | GAA | GAG | 342 |
Thr | Glu | Ala | Lys | Asp | Arg | Val | Gly Gly | Asn | Ile | Ile | Thr | Arg | Glu | G1U | ||
90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
AAT | GGT | TTT | CTC | TGG | GAA | GAA | GGT | CCC | AAT | AGT | TTT | CAA | CCG | TCT | GAT | 390 |
Asn | Gly | Phe | Leu | Trp | Glu | Glu | Gly | Pro | Asn | Ser | Phe | Gin | Pro | Ser | Asp | |
105 | 110 | 115 | 120 | |||||||||||||
CCT | ATG | CTC | ACT | ATG | GTG | GTA | GAT | AGT | GGT | TTG | AAG | GAT | GAT | TTG | GTG | 438 |
Pro | Met | Leu | Thr | Met | Val | Val | Asp | Ser | Gly | Leu | Lys Asp Asp | Leů | Val | |||
125 | 130 | 135 | ||||||||||||||
TTG | GGA | GAT | CCT | ACT | GCG | CCA | AGG | TTT | GTG | TTG | TGG | AAT | GGG | AAA | TTG | 486 |
Leu | Gly | Asp | Pro | Thr | Ala | Pro | Arg | Phe | Val | Leu | Trp | Asn | Gly Lys | Leu | ||
140 | 145 | 150 | ||||||||||||||
AGG | CCG | GTT | CCA | TCG | AAG | CTA | ACA | GAC | TTA | CCG | TTC | TTT | GAT | TTG | ATG | 534 |
Arg | Pro | Val | Pro | Ser | Lys | Leu | Thr | Asp | Leu | Pro | Phe | Phe | Asp | Leu | Met | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
AGT | ATT | GGT | GGG | AAG | ATT | AGA | GCT | GGT | TTT | GGT | GCA | CTT | GGC | ATT | CGA | 582 |
Ser | ile | Gly Gly | Lys | Ile | Arg | Ala | Gly | Phe | Gly | Ala | Leu | Gly | Ile | Arg | ||
170 | 175 | 180 | ||||||||||||||
CCG | TCA | CCT CCA | GGT | CGT | GAA | GAA | TCT < | GTG i | GAG : | GAG | TTT ! | GTA | CGG < | CGT | 630 | |
Pro | Ser | Pro | Pro | Gly | Arg | Glu | Glu | Ser ' | Val ’ | Glu i | Glu | Phe | val | Arg Arg |
185 190 195 200
-44CZ 296023 B6
AAC | CTC | GGT GAT | GAG | GTT | TTT | GAG | CGC | CTG | ATT | GAA | CCG | TTT | TGT TCA | 678 | |
Asn | Leu | Gly Asp | Glu | val | Phe | Glu | Arg | Leu | Ile | Glu | Pro | Phe | Cys Ser | ||
205 | 210 | 215 | |||||||||||||
GGT | GTT | TAT | GCT | GGT | GAT | CCT | TCA | AAA | CTG | AGC | ATG | AAA | GCA | GCG TTT | 726 |
Gly | Val | Tyr | Ala | Gly | Asp | Pro | Ser | Lys | Leu | Ser | Met | Lys | Ala | Ala Phe | |
220 | 225 | 230 | |||||||||||||
GGG | AAG | GTT | TGG | AAA. | CTA | GAG | CAA | AAT | GGT | GGA | AGC | ATA | ATA | GCST GGT | 774 |
Gly | Lys | Val | Trp Lys | Leu | Glu | Gin | Asn | Gly Gly | Ser | Ile | Ile Gly Gly | ||||
235 | 240 | 245 | |||||||||||||
ACT | TTT | AAG | GCA ATT | CAG | GAG | AGG | AAA | AAC | GCT | CCC | AAG | GCA GAA CGA | 822 | ||
Thr | Phe | Lys | Ala | Ile | Gin | Glu | Arg | Lys | Asn | Ala | Pro | Lys | Ala | Glu Arg | |
250 | 255 | 260 | |||||||||||||
GAC | CCG | CGC | CTG | CCA | AAA | CCA | CAG | GGC | CAA | ACA | GTT | GGT | TCT | TTC AGG | 870 |
Asp | Pro | Arg | Leu | Pro | Lys | Pro | Gin | Gly | Gin | Thr | Val | Gly | Ser | Phe Arg | |
265 | 270 | 275 | 280 | ||||||||||||
AAG | GGA | CTT | CGA | ATG | TTG | CCA | GAA | GCA | ATA | TCT | GCA | AGA | TTA | GGT AGC | 918 |
Lys | Gly | Leu | Arg | Met | Leu | Pro | Glu | Ala | Ile | Ser | Ala | Arg | Leu | Gly Ser | |
285 | 290 | 295 | |||||||||||||
AAA | GTT | AAG | TTG | TCT | TGG | AAG | CTC | TCA | GGT | ATC | ACT | AAG | CTG | GAG AGC | 966 |
Lys | Val | Lys | Leu | Ser | Trp | Lys | Leu | Ser | Gly | Ile | Thr | Lys | Leu | Glu Ser | |
300 | 305 | 310 | |||||||||||||
GGA | GGA | TAC | AAC | TTA | ACA | TAT | GAG | ACT | CCA | GAT | GGT | TTA | GTT | TCC GTG | 1014 |
Gly | Gly Tyr | Asn | Leu | Thr | Tyr | Glu | Thr | Pro | Asp Gly | Leu | Val | Ser Val | |||
315 | 320 | 325 | |||||||||||||
CAG | AGC | AAA | AGT | GTT | GTA | ATG | ACG | GTG | CCA TCT | GAT | GTT | GCA | AGT GGT | 1062 | |
Gin | Ser | Lys | Ser | Val | Val | Met | Thr | Val | Pro | Ser | His | Val | Ala | Ser Gly | |
330 | 335 | 340 | |||||||||||||
CTC | TTG | CGC | CCT | CTT | TCT | GAA TCT | GCT | GCA | AAT | GCA | CTC | TCA | AAA CTA | 1110 | |
Leu | Leu | Arg | Pro | Leu | Ser | Glu | Ser | Ala | Ala | Asn | Ala | Leu | Ser | Lyš Leu | |
345 | 350 | 355 | 360 |
TAT TAC | CCA | CCA | GTT | GCA | GCA | GTA | TCT | ATC | TCG | TAC CCG | AAA | GAA GCA | 1158 | |
Tyr Tyr | Pro | Pro | Val | Ala | Ala | Val | Ser | Ile | Ser | Tyr Pro | Lys | Glu Ala | ||
365 | 370 | 375 | ||||||||||||
ATC | CGA | ACA | GAA | TGT | TTG | ATA | GAT | GGT | GAA | CTA | AAG GGT | TTT | GGG CAA | 1206 |
Ile | Arg | Thr | Glu | cys | Leu | Ile | Asp | Gly | Glu | Leu | Lys Gly | Phe | Gly Gin | |
380 | 385 | 390 | ||||||||||||
TTG | CAT | CCA | CGC | ACG | CAA | GGA | GTT | GAA | ACA | TTA | GGA ACT | ATC | TAC AGC | 1254 |
Leu | His | Pro | Arg | Thr | Gin | Gly | Val | Glu | Thr | Leu | Gly Thr | ile | Tyr Ser |
395 400 405
-45CZ 296023 B6
TCC TCA CTC Ser Ser Leu | TTT CCA AAT | CGC GCA CCG | CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG | 1302 | ||||||||||||
Phe | Pro Asn | Arg 415 | Ala | Pro | Pro | Gly Arg Ile 420 | Leu | Leu | Leu | |||||||
410 | ||||||||||||||||
AAC | TAC | ATT | GGC | GGG | TCT | ACA | AAC | ACC | GGA | ATT | CTG | TCC | AAG | TCT | GAA | 1350 |
tón | Tyr | Ile | Gly Gly | Ser | Thr | Asn | Thr | Gly | ile | Leu | Ser | Lys | Ser | Glu | ||
425 | 430 | 435 | 440 | |||||||||||||
GGT | GAG | TTA | GTG | GAA | GCA | GTT | GAC | AGA | GAT | TTG | AGG | AAA | ATG | CTA | ATT | 1398 |
Gly | Glu | Leu | Val | Glu | Ala | Val | Asp Arg Asp | Leu | Arg | Lys | Met | Leu | Ile | |||
445 | 450 | 455 | ||||||||||||||
AAG | CCT | AAT | TCG | ACC | GAT | CCA | CTT | AAA | TTA | GGA | GTT | AGG | GTA | TGG | CCT | 1446 |
Lys | Pro | Asn | Ser | Thr | Asp | Pro | Leu | Lys | Leu | Gly | Val | Arg | Val | Trp | Pro | |
460 | 465 | 470 | ||||||||||||||
CAA | GCC | ATT | CCT | CAG | TTT | CTA GTT | GCT | CAC | TTT | GAT | ATC | CTT | GAC | ACG | 1494 | |
Gin | Ala | Ile | Pro | Gin,Phe | Leu | Val | Gly | His | Phe | Asp | Ile | Leu | Asp | Thr | ||
475 | 480 | 485 | ||||||||||||||
GCT | AAA | TCA | TCT | CTA | ACG | TCT | TCG | GGC | TAC | GAA | GGG | CTA | TTT | TTG | GGT | 1542 |
Ala | Lys | Ser | Ser | Leu | Thr | Ser | Ser | Gly Tyr | Glu | Gly | Leu | Phe | Leu | Gly | ||
490 | 495 | 500 | ||||||||||||||
GGC | AAT | TAC | GTC | GCT | GGT | CTA | GCC | TTA | GGC | CGG | TCT | CTA | GAA | GGC | GCA | 1590 |
Gly | Asn | oyr | Val | Ala | Gly | Val | Ala | Leu | Gly Arg Cys | Val | Glu | Gly | Ala | |||
505 | 510 | 515 | 520 | |||||||||||||
TAT | GAA | ACC | GCG | ATT | GAG | GTC | AAC | AAC | TTC | ATG | TCA | CGG | TAC | GCT | TAC | 1638 |
Tyr | Glu | Thr | Ala | Ile | Glu | Val | Asn | Asn | Phe | Met | Ser | Arg Tyr | Ala | Tyr | ||
525 | 530 | 535 |
AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT 1691
Lys
TTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA
1719 (2) Informace o SEQ ID č.: 2:
(i) Charakteristika sekvencí:
(A) délka: 537 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
-46CZ 296023 B6 (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 2:
Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gin Ser Leu Leu Pro Ser
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Phe | Ser | Lys | Pro | Asn | Leu | Arg | Leu | Asn | Val | -Tyr | Lys | Pro | Leu | Arg | Leu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Arg | Cys | Ser | Val | Ala | Gly | Gly | Pro | Thr | Val | Gly | Ser | Ser | Lys | Ile | Glu |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Gly | Thr | Thr | Ile | Thr | Thr | Asp | Cys | Val | Ile | val | Gly | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Ile | Ser | Gly | Leu | cys | Ile | Ala | Gin | Ala | Leu | Ala | Thr | Lys | His | Pro |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Asp | Ala | Ala | Pro | Asn | Leu | Ile | Val | Thr | Glu | Ala | Lys | Asp | Arg | Val | Gly |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Gly | Asn | Ile | Ile | Thr | Arg | Glu | Glu | Asn | Gly | Phe | Leu | Trp | Glu | Glu | Gly |
100 105 110
Pro | Asn | Ser | Phe | Gin | Pro | Ser | Asp | Pro | Met | Leu Thr Met | Val | Val | Asp |
115 | 120 | 125 | |||||||||||
Ser | Gly | Leu | Lys Asp Asp | Leu | Val | Leu | Gly | Asn Pro Thr | Ala | Pro | Arg | ||
130 | 135 | 140 | |||||||||||
Phe | Val | Leu | Trp | Asn | Gly Lys | Leu | Arg | Pro | Val Pro Ser | Lys | Leu | Thr | |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||
Asp | Leu | Pro | Phe | Phe | Asp | Leu | Met | Ser | ile | Gly Gly Lys | Ile | Arg Ala | |
165 | 170 | 175 | |||||||||||
Gly | Phe | Gly | Ala | Leu | Gly | Ile | Arg | Pro | Ser | Pro Pro Gly Arg | Glu | Glu | |
180 | 185 | 190 | |||||||||||
Ser | Val | Glu | Glu | Phe | val | Arg Arg | Asn | Leu Gly Asp Glu. Val | Phe | Glu | |||
195 | 200 | 205 |
Arg Leu
Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser
215 220
210
-47CZ 296023 B6
Lys 225 | Leu Ser | Met | Lys | Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys | Leu Glu Gin 240 | |||||||
230 | 235 | |||||||||||
Asn | Gly Gly | Ser | Ile 245 | Ile | Gly Gly Thr | Phe 250 | Lys | Ala | Ile | Gin | Glu 255 | Arg |
Lys | Asn Ala | Pro 260 | Lys | Ala | Glu Arg Aso 265 | Pro | Arg | Leu | Pro | Lys 270 | Pro | Gin |
Gly | Gin Thr 275 | Val | Gly | Ser | Phe Arg Lys 280 | Gly | Leu | Arg | Met 285 | Leu | Pro | Glu |
Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu
290 295 300
Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu
305 310 315 320
Thr | Pro | Asp Gly | Leu | Val | Ser | Val | Gin | Ser | Lys | Ser | Val | Val Met Thr |
325 | 330 | 335 | ||||||||||
Val | Pro | Ser His | Val | Ala | Ser | Gly | Leu | Leu | Arg | Pro | Leu | Ser Glu Ser |
340 | 345 | 350 | ||||||||||
Ala | Ala | Asn Ala | Leu | Ser | Lys | Leu | Tyr Tyr | Pro | Pro | Val | Ala Ala Val | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||
Ser | Ile | Ser Tyr | Pro | Lys | Glu | Ala | Ile | Arg | Thr | Glu | Cys | Leu Ile Asp |
370 | 375 | 380 | ||||||||||
Gly | Glu | Leu Lys | Gly | Phe | Gly | Gin | Leu | His | Pro | Arg | Thr | Gin Gly Val |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||
Glu | Thr | Leu Gly | Thr | Ile | Tyr | Ser | Ser | Ser | Leu | Phe | Pro | Asn Arg Ala |
405 | 410 | 415 | ||||||||||
Pro | Pro | Gly Arg | Ile | Leu | Leu | Leu | Asn | Tyr | ile | Gly Gly | Ser Thr Asn | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||
Thr | Gly | Ile Leu | Ser | Lys | Ser | Glu | Gly | Glu | Leu | Val | Glu | Ala Val Asp |
435 | 440 | 445 | ||||||||||
Arg Asp | Leu Arg Lys | Met | Leu | Ile | Lys | Pro | Asn | Ser | Thr | Asp Pro Leu | ||
450 | 455 | 460 | ||||||||||
Lys | Leu | Gly Val | Arg | Val | Trp | Pro | Gin | Ala | Ile | Pro | Gin | Phe Leu Val |
465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||
Gly | Bis | Phe Asp | Ile | Leu | Asp | Thr | Ala | Lys | Ser | Ser | Leu | Thr Ser Ser |
485 | 490 | 495 | ||||||||||
Gly Tyr | Glu Gly | Leu | Phe | Leu | Gly Gly | Asn | Tyr | Val | Ala | Gly Val Ala | ||
500 | 505 | 510 | ||||||||||
Leu Gly Arg Cys | Val | Glu | Gly Ala Tyr | Glu | Thr | Ala | Ile | Glu Val Asn | ||||
515 | 520 | 525 | ||||||||||
Asn | Phe | Met Ser | Arg Tyr | Ala Tyr Lys | ||||||||
530 | 535 |
-48CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 3:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 1738 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 70..1596 (C) další informace: /poznámka^ „Arabidopsis protox-2 cDNK; sekvence z pWDC-1“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 3:
TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGCTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG 60
CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108
Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp fíis Gin Ile Glu Ala
5 10
GTT TCA GGA AAA AGA | GTC Val | GGA GTC GTA GGT' GCA GCT GTA AGT GGA CTT | 156 | |||||||||||||
Val Ser Gly 15 | Lys Arg | Ala 20 | Val Val Gly | Ala Gly Val Ser 25 | Gly Leu | |||||||||||
GCG | GCG | GCT | TAC | AAG | TTG | AAA | TCG | AGG | GCT | TTG | AAT | GTG | ACT | CTG | TTT | 204 |
Ala | Ala | Ala | Tyr | Lys | Leu | Lys | Ser | Arg Gly | Leu | Asn | Val | Thr | Val | Phe | ||
30 | 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
GAA | GCT | GAT | GGA | AGA | GTA | GCT | GGG | AAG | TTG | AGA | ACT | CTT | ATG | CAA AAT | 252 | |
Glu | Ala | Asp Gly Arg | Val | Gly Gly Lys | Leu | Arg | Ser | Val | Met | Gin | Asn | |||||
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
GGT | TTG | ATT | TGG GAT | GAA | GGA | GCA | AAC | ACC | ATG | ACT | GAG | GCT | GAG | CCA | 300 | |
Gly | Leu | Ile | Trp Asp | Glu | Gly | Ala | Asn | Thr | Met | Thr | Glu | Ala | Glu | Pro | ||
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
GAA GTT | GGG | AGT | TTA | CTT | GAT | GAT | CTT | GGG | CTT | CGT | GAG | AAA | CAA | CAA | 348 | |
Glu | Val | Gly | Ser | Leu | Leu | Asp | Asp | Leu | Gly | Leu | Arg | Glu | Lys | Gin | Gin | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
TTT | CCA | ATT | TCA | GAG | AAA | AAG | CGG | TAT | ATT | GTG | CGG | AAT | GGT | CTA | CCT | 396 |
Phe | Pro | Ile | Ser | Gin | Lys | Lys | Arg | Tyr | ile | Val | Arg | Asn | Gly | Val | Pro | |
95 | 100 | 105 |
-49CZ 296023 B6
GTC ATC CTA CCT | ACC Thr | AAT CCC ATA GAG CTC GTC ACA ACT ACT GTC CTC | 444 | ||||||||||||
val 110 | Met Leu Pro | Asn Pro 115 | Ile | Glu | Leu Val Thr Ser Ser Val Leu | ||||||||||
120 | 125 | ||||||||||||||
TCT | ACC | CAA | TCT | AAG | TTT | CAA | ATC | TTC | TTC | GAA | CCA | TTT | TTA TGG | AAG | 492 |
Ser | Thr | Gin | Ser | Lys 130 | Phe | Gin | Ile | Leu | Leu 135 | Glu | Pro | Phe | Leu Trp 140 | Lys | |
AAA | AAG | TCC | TCA | AAA | CTC | TCA | GAT | GCA | TCT | GCT | GAA | GAA | ACT GTA | AGC | 540 |
Lys | Lys | Ser | Ser 145 | Lys | Val | Ser | Asp | Ala 150 | Ser | Ala | Glu | Glu | Ser Val 155 | Ser | |
GAG | TTC | TTT | CAA | CGC | CAT | TTT | GGA | CAA | GAG | GTT | CTT | GAC | TAT CTC | ATC | 588 |
Glu | Phe | Phe 160 | Gin | Arg | His | Phe | Gly 165 | Gin | Glu | Val | Val | Asp 170 | Tyr Leu | Ile | |
GAC | CCT | TTT GTT | GGT | GGA | ACA | ACT | GCT | GCG | GAC | CCT | GAT | TCC CTT | TCA | 636 | |
Asp | Pro 175 | Phe | Val | Gly | Gly | Thr 180 | Ser | Ala | Ala | Asp | Pro 185 | Asp | Ser Leu | Ser | |
ATC | AAG | CAT | TCT | TTC | CCA | GAT | CTC | TCG | AAT | CTA | GAG | AAA | ACT TTT | GGC | 684 |
Met 190 | Lys | His | Ser | Phe | Pro 195 | Asp | Leu | Trp | Asn | Val 200 | Glu | Lys | Ser Phe | Gly 205 | |
TCT | ATT | ATA | CTC | GCT | GCA ATC | AGA | ACA | AAG | TTT | GCT | GCT | AAA GCT | GCT | 732 | |
Ser | Ile | Ile | Val | Gly 210 | Ala | Ile | Arg | Thr | Lys 215 | Phe | Ala | Ala | Lys Gly Gly 220 | ||
AAA | ACT | AGA | GAC | ACA | AAG | ACT | TCT | CCT | GGC | ACA | AAA | AAG | GCT TCG | CCT | 780 |
Lys | Ser | Arg | Asp 225 | Thr | Lys | Ser | Ser | Pro 230 | Gly | Thr | Lys | Lys | Gly Ser 235 | Arg | |
GGG | TCA | TTC | TCT | TTT | AAG | GGG | GGA ATG | CAG | ATT | CTT | CCT | GAT ACG | TTC | 828 | |
Gly | Ser | Phe 240 | Ser | Phe | Lys | Gly | Gly 245 | Met | Gin | Ile | Leu | Pro 250 | Asp Thr | Leu | |
TCC | AAA | ACT | CTC | TCA | CAT | GAT | GAG | ATC | AAT | TTA | GAC | TCC | AAG CTA | CTC | 876 |
Cys | Lys 255 | Ser | Leu | Ser | His | Asp 260 | Glu | Ile | Asn | Leu | Asp 265 | Ser | Lys Val | Leu | |
TCT | TTG | TCT | TAC | AAT | TCT | GGA | TCA | AGA | CAG | GAG | AAC | TCG | TCA TTA | TCT | 924 |
Ser 270 | Leu | Ser | Tyr | Asn | Ser 275 | Gly | Ser | Arg | Gin | Glu 280 | Asn | Trp | Ser Leu | Ser 285 | |
TCT | CTT | TCG | CAT | AAT | GAA | ACG | CAG | AGA | CAA | AAC | CCC | CAT | TAT GAT | GCT | 972 |
cys | Val | Ser | His | Asn 290 | Glu | Thr | Gin | Arg | Gin 295 | Asn | Pro | His | Tyr Asp 300 | Ala | |
CTA | ATT | ATG | ACG | GCT | CCT | CTC | TGC | AAT | GTC | AAG | GAG | ATC | AAG GTT | ATC | 1020 |
Val | Ile | Met | Thr 305 | Ala | Pro | Leu | Cys | Asn 310 | Val | Lys | Glu , | Met | Lys Val 315 | Met |
-50CZ 296023 B6
AAA GGA GGA CAA CCC | TTT CAG Phe Gin | CTA AAC TTT CTC CCC GAG | ATT AAT | TAC Tyr | 1068 | |||||||||||
Lys | Gly | Gly Gin Pro 320 | Leu Asn Phe 325 | Leu | Pro | Glu 330 | lle | Asn | ||||||||
ATG | CCC | CTC | TCG | GTT | TTA | ATC | ACC | ACA | TTC | ACA | AAG | GAG | AAA | GTA | AAG | 1116 |
Met | Pro | Leu | Ser | Val | Leu | lle | Thr | Thr | Phe | Thr | Lys | Glu | Lys | Val | Lys | |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
AGA | CCT | CTT | GAA | GGC | TTT | GGG | GTA | CTC | ATT | CCA | TCT | AAG | GAG | CAA | AAG | 1164 |
Arg | Pro | Leu | Glu | Gly | Phe | Gly | Val | Leu | lle | Pro | Ser | Lys | Glu | Gin | Lys | |
350 | 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
CAT | GGT | TTC | AAA | ACT | CTA | GGT | ACA | CTT | TTT | TCA | TCA | ATG | ATG | TTT | CCA | 1212 |
His | Gly | Phe | Lys | Thr | Leu | Gly Thr | Leu | Phe | Ser | Ser | Met | Met | Phe | Pro | ||
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
GAT | CGT | TCC | CCT | AGT | GAC | GTT | CAT | CTA | TAT | ACA | ACT | TTT | ATT | GGT | GGG | 1260 |
Asp | Arg | Ser | Pro | Ser | Asp | Val | His | Leu | Tyr | Thr | Thr | Phe | Ue | Gly Gly | ||
385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
AGT | AGG | AAC | CAG GAA | CTA | GCC | AAA | GCT | TCC | ACT | GAC | GAA | TTA | AAA | CAA | 1308 | |
Ser | Arg | Asn | Gin | Glu | Leu | Ala | Lys | Ala | Ser | Thr | Asp | Glu | Leu | Lys | Gin | |
400 | 405 | 410 | ||||||||||||||
GTT | GTG | ACT | TCT | GAC | CTT | CAG | CGA | CTG | TTG | GGG | GTT | GAA | GGT | GAA | CCC | 1356 |
Val | Val | Thr | Ser | Asp | Leu | Gin | Arg | Leu | Leu | Gly | Val | Glu | Gly | Glu | Pro | |
415 | 420 | 425 | ||||||||||||||
GTG | TCT | GTC | AAC | CAT | TAC | TAT | TGG | AGG | AAA | GCA | TTC | CCG | TTG | TAT | GAC | 1404 |
Val | Ser | Val | Asn | His | Tyr | Tyr | Trp | Arg | Lys | Ala | Phe | Pro | Leu | Tyr | Asp | |
430 | 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
AGC | AGC | TAT | GAC | TCA | GTC | ATG | GAA | GCA | ATT | GAC | AAG | ATG GAG | AAT | GAT | 1452 | |
Ser | Ser | Tyr Asp | Ser | Val | Met | Glu | Ala | lle | Asp | Lys | Met | Glu | Asn | Asp | ||
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
CTA | CCT | GGG | TTC | TTC | TAT | GCA | GGT | AAT | CAT | CGA | GGG | GGG | CTC | TCT | GTT | 1500 |
Leu | Pro | Gly | Phe | Phe | Tyr | Ala | Gly | Asn | His | Arg | Gly | Gly | Leu | Ser | Val | |
465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
GGG | AAA | TCA | ATA | GCA | TCA | GGT | TGC | AAA | GCA | GCT | GAC | CTT | GTG | ATC | TCA | 1548 |
Gly | Lys | Ser | lle | Ala | Ser | Gly Cys | Lys | Ala | Ala | Asp | Leu | Val | lle | Ser | ||
480 | 485 | 490 | ||||||||||||||
TAC | CTG | GAG | TCT | TGC | TCA | AAT | GAC | AAG | AAA | CCA | AAT | GAC | AGC | TTA | TAACATTGTC | |
1603 | ||||||||||||||||
Tyr | Leu | Glu | Ser | cys | Ser | Asn Asp | Lys | Lys | Pro | Asn | Asp | Ser | Leu |
495 500 505
AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663
CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1723
ACTATTTATG TAAAA (2) Informace o SEQ ID č.: 4:
(i) Charakteristika sekvencí:
(A) délka: 508 aminokyselin
1738
-51 CZ 296023 B6 (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 4:
Met | Ala | Ser | Gly | Ala | Val | Ala | Asp | His | Gin | Ile | Glu | Ala | Val | Ser | Gly |
I | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Lys | Arg | Val | Ala | Val | Val | Gly | Ala | Gly | Val | Ser | Gly | Leu | Ala | Ala | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Tyr | Lys | Leu | Lys | Ser | Arg | Gly | Leu | Asn | Val | Thr | Val | Phe | Glu | Ala | Asp |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Arg | Val | Gly | Giy | Lys | Leu | Arg | Ser | Val | Met | Gin | Asn | Gly | Leu | Ile |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Trp | Asp | Glu | Gly | Ala | Asn | Thr | Met | Thr | Glu | Ala | Glu | Pro | Glu | Val | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ser | Leu | Leu | Asp | Asp | Leu | Gly | Leu | Arg | Glu | Lys | Gin | Gin | Phe | Pro | ile |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Gin | Lys | Lys | Arg | Tyr | Ile | Val | Arg | Asn | Gly | Val | Pro | Val | Met | Leu |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Pro | Thr | Asn | Pro | Ile | Glu | Leu | Val | Thr | Ser | Ser | Val | Leu | Ser | Thr | Gin |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Lys | Phe | Gin | Ile | Leu | Leu | Glu | Pro | Phe | Leu | Trp | Lys | Lys | Lys | Ser |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ser | Lys | Val | Ser | Asp | Ala | Ser | Ala | Glu | Glu | Ser | Val | Ser | Glu | Phe | Phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Gin | Arg | His | Phe | Gly | Gin | Glu | Val | Val | Asp | Tyr | Leu | Ile | Asp | Pro | Phe |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | Gly | Gly | Thr | Ser | Ala | Ala | Asp | Pro | Asp | Ser | Leu | Ser | Met | Lys | His |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Phe | Pro | Asp | Leu | Trp | Asn | Val | Glu | Lys | Ser | Phe | Gly | Ser | Ile | Ile |
-52CZ 296023 B6
195 | 200 | 205 | |||||||||||
Val | Gly | Ala | Ile | Arg | Thr | Lys | Phe | Ala Ala Lys | Gly Gly Lys | Ser | Arg | ||
210 | 215 | 220 | |||||||||||
Asp | Thr | Lys Ser | Ser | Pro | Gly | Thr | Lys Lys Gly | Ser | Arg Gly | Ser | Phe | ||
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||
Ser | Phe | Lys Gly Gly | Met | Gin | Ile | Leu Pro | Asp | Thr | Leu Cys Lys | Ser | |||
245 | 250 | 255 | |||||||||||
Leu | Ser | His | Asp | Glu | Ile | Asn | Leu | Asp Ser | Lys | Val | Leu Ser | Leu | Ser |
260 | 265 | 270 | |||||||||||
Tyr | Asn | Ser | Gly | Ser | Arg | Gin | Glu | Asn Trp | Ser | Leu | Ser Cys | Val | Ser |
275 | 280 | 285 | |||||||||||
His | Asn | Glu | Thr | Gin | Arg | Gin | Asn | Pro His | Tyr | Asp | Ala Val | Ile | Met |
290 | 295 | 300 | |||||||||||
Thr | Ala | Pro | Leu | Cys | Asn | Val | Lys | Glu Met | Lys | Val | Met Lys | Gly Gly | |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||
Gin | Pro | Phe | Gin | Leu | Asn | Phe | Leu | Pro Glu | Ile | Asn | Tyr Met | Pro | Leu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||
Ser | Val | Leu | Ile | Thr | Thr | Phe | Thr | Lys Glu | Lys | Val | Lys Arg | Pro | Leu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||
Glu | Gly | Phe | Gly | Val | Leu | Ile | Pro | Ser Lys | Glu | Gin | Lys His | Gly | Phe |
355 | 360 | 365 | |||||||||||
Lys | Thr | Leu | Gly | Thr | Leu | Phe | Ser | Ser Met | Met | Phe | Pro Asp Arg | Ser | |
370 | 375 | 380 | |||||||||||
Pro | Ser | Asp | Val | His | Leu | Tyr | Thr | Thr Phe | Ile | Gly | Gly Ser | Arg | Asn |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||
Gin | Glu | Leu | Ala | Lys | Ala | Ser | Thr | Asp Glu | Leu | Lys | Gin Val | Val | Thr |
405 | 410 | 415 | |||||||||||
Ser | Asp | Leu | Gin | Arg | Leu | Leu | Gly | Val Glu | Gly | Glu | Pro Val | Ser | Val |
420 | 425 | 430 | |||||||||||
Asn | His | Tyr Tyr Trp Arg Lys | Ala | Phe Pro | Leu | Tyr | Asp Ser | Ser | Tyr | ||||
435 | 440 | 445 | |||||||||||
Asp | Ser | Val | Met | Glu | Ala | Ile | Asp | Lys Met | Glu | Asn | Asp Leu | Pro | Gly |
450 | 455 | 460 | |||||||||||
Phe | Phe | Tyr | Ala | Gly | Asn | His . | Arg Gly Gly | Leu | Ser | Val Gly Lys | Ser | ||
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||
Ile | Ala | Ser | Gly Cys | Lys | Ala | Ala | Asp Leu | Val | Ile | Ser Tyr Leu | Glu | ||
485 | 490 | 495 | |||||||||||
Ser | Cys | Ser | Asn Asp Lys | Lys | Pro | Asn Asp | Ser | Leu |
500 505
-53 CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 5:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 1698 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 2 1453 (C) další informace: /poznámka= „Arabidopsis protox-1 cDNK (ne v plné délce); sekvence z pWDC-4“
-54CZ 296023 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 5:
G AAT TCG GCG GAC TGC GTC GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC 46
Asn Ser Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
TGC | ' ACC | GCG | ; CAG | ; GCG | ; ctg | GCC ACG | CGG | : CAC | GGC | GTC | GGG GAC | GTG | CTT | 94 | |
Cys | Thr | Ala | . Gin | . Ala | , Leu | Ala Thr | Arg | His | Giy | Val | Gly Asp | Val | Leu | ||
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
GTC | ACG | GAG | GCC | CGC | GCC | CGC CCC | GGC | GGC | AAC | ATT | ACC | ACC | GTC | GAG | 142 |
Val | Thr | Glu | Ala | Arg | Ala | Ařg Pro | Gly Gly | Asn | Ile | Thr | Thr | Val | Glu | ||
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
CGC | CCC | GAG | GAA | GGG | TAC | CTC TGG | GAG | GAG | GGT | CCC | AAC | AGC | TTC | CAG | 190 |
Arg | Pro | Glu | Glu | Gly Tyr | Leu Trp | Glu | Glu | Gly | Pro | Asn | Ser | Phe | Gin | ||
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
CCC | TCC | GAC | CCC | GTT | CTC | ACC ATG | GCC | GTG | GAC | AGC | GGA | CTG | AAG | GAT | 238 |
Pro | Ser | Asp | Pro | Val | Leu | Thr Met | Ala | Val | Asp | Ser | Gly | Leu | Asp | ||
65 | 70 | 75 | |||||||||||||
GAC | TTG | GTT | TTT | GGG | GAC | CCA AAC | GCG | CCG | CGT | TTC | GTG | CTG | TGG | GAG | 286 |
Asp | Leu | Val | Phe | Gly Asp | Pro Asn | Ala | Pro | Arg | Phe | Val | Leu | Trp | Glu | ||
80 | 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
GGG | AAG | CTG | AGG | CCC | GTG | CCA TCC | AAG | CCC | GCC | GAC | CTC | CCG | TTC | TTC | 334 |
Gly | Lys | Leu | Arg | Pro | Val | Pro Ser | Lys | Pro | Ala | Asp | Leu | Pro | Phe | Phe | |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
GAT | CTC | ATG | AGC | ATC | CCA | GGG AAG | CTC | AGG | GCC | GGT | CTA | GGC | GCG | CTT | 382 |
Asp | Leu | Met | Ser | Ile | Pro | Gly Lys | Leu | Arg | Ala | Gly | Leu | Gly | Ala | Leu | |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
GGC | ATC | CGC | CCG | CCT | CCT | CCA GGCCGC | GAA | GAG | TCA | GTG | GAG | GAG | TTC | 430 | |
Gly | ile | Arg | Pro | Pro | Pro | Pro Gly Arg | Glu | Glu | Ser | Val | Glu | Glu | Phe | ||
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
GTG | CGC | CGC | AAC | CTC | GGT | GCT GAG | GTC | TTT | GAG | CGC | CTC | ATT | GAG | CCT | 478 |
Val | Arg | Arg | Asn | Leu | Gly' Ala Glu | Val | Phe | Glu | Arg | Leu | Ile | Glu | Pro | ||
145 | 150 | 155 | |||||||||||||
TTC | TGC | TCA GGT | GTC | TAT GCT GGT | GAT | CCT | TCT | AAG | CTC | AGC | ATG | AAG | 526 | ||
Phe | Cys | Ser | Gly | val | Tyr Ala Gly Asp | Pro | Ser | Lys | Leu | Ser | Met | Lys | |||
160 | 165 | 170 | 175 | ||||||||||||
GCT | GCA | TTT | GGG | AAG | GTT | TGG CGG | TTG | GAA | GAA | ACT | GGA | GGT | AGT | ATT | 574 |
Ala | Ala | Phe | Gly Lys | Val | Trp Arg | Leu | Glu | Glu | Thr | Glv Gly | Ser | Ile | |||
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
ATT | GGT | GGA | ACC . | ATC | AAG | ACA ATT | CAG | GAG | AGG | AGC | AAG AAT | CCA AAA | 622 | ||
Ile | Gly Gly | Thr | Ile | Lys | Thr Ile | Gin | Glu | Arg | Ser | Lys Asn Pro Lys |
195 200 205
-55 CZ 296023 B6
CCA CCG AGG Pro Pro Arg | GAT Asp | GCC. CGC CTT CCG-AAG | CCA AAA GGG CAG ACA GTT GCA | 670 | ||||||||||||
Ala | Arg Leu | Pro 215 | Lys | Pro | Lys | Gly | Gin Thr Val Ala 220 | |||||||||
210 | ||||||||||||||||
TCT | TTC | AGG | AAG | GGT | CTT | GCC | ATG | CTT | CCA | AAT | GCC | ATT | ACA TCC AGC | 718 | ||
Ser | Phe | Arg | Lys Gly | Leu | Ala | Met | Leu | Pro | Asn | Ala | lle | Thr | Ser | Ser | ||
225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
TTG | GGT | AGT | AAA | GTC | AAA | CTA | TCA | TGG | AAA | CTC | ACG | AGC | ATT | ACA | AAA | 766 |
Leu | Gly | Ser | Lys | Val | Lys | Leu | Ser | Trp | Lys | Leu | Thr | Ser | lle | Thr | Lys | |
240 | 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
TCA | GAT | GAC | AAG | GGA | TAT | GTT | TTG | GAG | TAT | GAA | ACG | CCA | GAA | GGG | GTT | 814 |
Ser | Asp | Asp Lys | Gly | Tyr | Val | Leu | Glu | Tyr | Glu | Thr | Pro | Glu | Gly | Val | ||
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
GTT | TCG | GTG CAG | GCT | AAA | AGT | GTT | ATC | ATG | ACT | ATT | CCA | TCA | TAT | GTT | 862 | |
Val | Ser | Val | Gin | Ala | Lys | Ser | Val | lle | Met | Thr | lle | Pro | Ser | Tyr | Val | |
275 | 280 | 285 |
GCT Ala | AGC AAC ATT TTG | CGT CCA Arg Pro | CTT TCA AGC GAT GCT GCA GAT GCT CTA | 910 | ||||||||||||
Ser | Asn lle 290 | Leu | Leu 295 | Ser | Ser Asp Ala | Ala Asp Ala 300 | Leu | |||||||||
TCA | AGA | TTC | TAT | TAT | CCA | CCG | GTT | GCT | GCT | GTA | ACT | GTT | TCG | TAT | CCA | 958 |
Ser | Arg | Phe | Tyr | Tyr | Pro | Pro | Val | Ala | Ala | Val | Thr | Val | Ser | Tyr | Pro | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
AAG | GAA | GCA | ATT | AGA | AAA | GAA | TGC | TTA | ATT | GAT | GGG | GAA | CTC | CAG | GGC | 1006 |
Lys | Glu | Ala | lle | Arg Lys | Glu | Cys | Leu | lle | Asp | Gly | Glu | Leu | Gin | Gly | ||
320 | 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
ΊΤΤ | GGC | CAG | TTG | CAT | CCA | CGT | AGT | CAA | GGA | GTT | GAG | ACA | TTA | GGA | ACA | 1054 |
Phe | Gly | Gin | Leu | His | Pro | Arg | Ser | Gin | Gly | Val | Glu | Thr | Leu | Gly | Thr | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
ATA | TAC | AGT | TCC | TCA | CTC | TTT | CCA AAT | CGT | GCT | CCT | GAC | GGT | AGG | GTG | 1102 | |
lle | Tyr | Ser | Ser | Ser | Leu | Phe | Pro | Asn. | Arg | Ala | Pro | Asp Gly | Arg | Val | ||
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
TTA | CTT | CTA | AAC | TAC | ATA | GGA GGT | GCT | ACA | AAC | ACA | GGA | ATT | GTT | TCC | 1150 | |
Leu | Leu | Leu | Asn | Tyr | lle | Gly Gly | Ala | Thr | Asn | Thr | Gly | lle | Val | Ser | ||
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
AAG | ACT | GAA | AGT | GAG | CTG | GTC | GAA | GCA | GTT | GAC | CGT | GAC | CTC | CGA | AAA | 1198 |
Lys | Thr | Glu | Ser | Glu | Leu | Val | Glu | Ala | Val | Asp Arg Asp | Leu | Arg | Lys | |||
385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
ATG | CTT | ATA | AAT | TCT | ACA | GCA | GTG | GAC | CCT | TTA | GTC CTT | GGT | GTT | CGA | 1246 | |
Met | Leu | lle | Asn | Ser | Thr Ala | Val | Asp | Pro | Leu | Val Leu | Gly Val Arg | |||||
400 | 405 | 410 | 415 |
-56CZ 296023 B6
GIT TGG CCA CAA GCC ΆΤΑ CCT CAG TTC CTG GTA GGA CAT CTT GAT CTT1294
Val Trp Pro Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu
420 425430
CTG GAA GCC GCA AAA GCT GCC CTG GAC CGA GGT GGC TAC GAT GGG CTG1342
Leu Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp. Gly Leu
435 440445
TTC CTA GGA GGG AAC TAT GTT GCA GGA GTT GCC CTG GGC AGA TGC GTT1390
Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val
450 455460
GAG GGC GCG TAT GAA AGT GCC TCG CAA ATA TCT GAC TTC TTG ACC AAG1438
Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser Asp Phe Leu Thr Lys
465 470475
TAT GCC TAC AAG TGATGAAAGA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT1490
Tyr Ala Tyr Lys
480
TGCATAGATG AGGTGCCTCC GGGGAAAAAA AAGCTTGAAT AGTATTTTTT ATTCTTATTT1550
TGTAAATTGC ATTTCTGTTC TTTTTTCTAT CAGTAATTAG TTATATTTTA GTTCTGTAGG1610
AGATTGTTCT GTTCACTGCC CTTCAAAAGA AATTTTATTT TTCATTCITT TATGAGAGCT1670
GTGCTACTTA ΑΑΑΆΑΑΑΑΑΑ ΑΑΆΑΑΑΑΑ1698 (2) Informace o SEQ ID č.: 6:
(i) Charakteristika sekvencí:
(A) délka: 483 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: protein
-57CZ 296023 B6 (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 6:
Asn | Ser | Ala | Asp | Cys | Val | val | Val | Gly | Gly | Gly | Ile | Ser | Gly | Leu | Cys |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Thr | Ala | Gin | Ala | Leu | Ala | Thr | Arg | His | Gly | Val | Gly | Asp | val | Leu | Val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Thr | Glu | Ala | Arg | Ala | Arg | Pro | Gly | Gly | Asn | Ile | Thr | Thr | Val | Glu | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Pro | Glu | Glu | Gly | Tyr | Leu | Trp | Glu | Glu | Gly | Pro | Asn | Ser | Phe | Gin | Pro |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ser | Asp | Pro | Val | Leu | Thr | Met | Ala | Val | Asp | Ser | Gly | Leu | Lys | Asp | Asp |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Leu | Val | Phe | Gly | Asp | Pro | Asn | Ala | Pro | Arg | Phe | Val | Leu | Trp | Glu | Gly |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Lys | Leu | Arg | Pro | Val | Pro | Ser | Lys | Pro | Ala | Asp | Leu | Pro | Phe | Phé | Asp |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Leu | Met | Ser | Ile | Pro | Gly | Lys | Leu | Arg | Ala | Gly | Leu | Gly | Ala | Leu | Gly |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ile | Arg | Pro | Pro | Pro | Pro | Gly | Arg | Glu | Glu | Ser | Val | Glu | Glu | Phe | Val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Arg | Arg | Asn | Leu | Gly | Ala | Glu | Val | Phe | Glu | Arg | Leu | Ile | Glu | Pro | Phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Cys | Ser | Gly | Val | Tyr | Ala | Gly | Asp | Pro | Ser | Lys | Leu | Ser | Met | Lys | Ala |
165 | 170 | 175 |
-58CZ 296023 B6
Ala Phe Gly | Lys Val | Trp Arg | Leu Glu 185 | Glu Thr Gly | Gly Ser | Ile Ile | ||||
180 | 190 | |||||||||
Gly Gly | Thr 195 | Ile Lys | Thr | Ile | Gin 200 | Glu | Arg Ser Lys | Asn Pro 205 | Lys | Pro |
Pro Arg 210 | Asp | Ala Arg | Leu | Pro 215 | Lys | Pro | Lys Gly Gin 220 | Thr Val | Ala | Ser |
Phe Arg Lys 225 | Gly Leu | Ala 230 | Met | Leu | Pro | Asn Ala Ile 235 | Thr Ser | Ser | Leu 240 | |
Gly Ser | Lys | Val Lys 245 | Leu | Ser | Trp Lys | Leu Thr Ser 250 | Ile Thr | Lys 255 | Ser | |
Asp Asp | Lys | Gly Tyr 260 | Val | Leu | Glu | Tyr 265 | Glu Thr Pro | Glu Gly 270 | Val | Val |
Ser Val | Gin 275 | Ala Lys | Ser | Val | Ile 280 | Met | Thr Ile Pro | Ser Tyr 285 | Val | Ala |
Ser Asn 290 | Ile | Leu Arg | Pro | Leu 295 | Ser | Ser | Asp Ala Ala 300 | Asp Ala | Leu | Ser |
Arg Phe 305 | Tyr | Tyr Pro | Pro 310 | Val | Ala | Ala | Val Thr Val 315 | Ser Tyr | Pro | Lys 320 |
Glu Ala | Ile | Arg Lys 325 | Glu | Cys | Leu | Ile | Asp Gly Glu 330 | Leu Gin | Gly 335 | Phe |
Gly Gin | Leu | His Pro 340 | Arg | Ser | Gin | Gly 345 | Val Glu Thr | Leu Gly 350 | Thr | Ile |
Tyr Ser | Ser 355 | Ser Leu | Phe | Pro | Asn 360 | Arg | Ala Pro Asp | Gly Arg 365 | Val | Leu |
Leu Leu 370 | Asn | Tyr Ile | Gly | Gly 375 | Ala | Thr | Asn Thr Gly 380 | Ile Val | Ser | Lys |
Thr Glu 385 | Ser | Glu Leu | val 390 | Glu | Ala | Val | Asp Arg Asp 395 | Leu Arg Lys | Met 400 | |
Leu Ile | Asn | Ser Thr 405 | Ala | Val | Asp | Pro | Leu Val Leu 410 | Gly Val | Arg 415 | Val |
Trp Pro | Gin | Ala Ile 420 | Pro | Gin | Phe | Leu 425 | Val Gly His | Leu Asp 430 | Leu | Leu |
Glu Ala | Ala 435 | Lys Ala | Ala | Leu | Asp Arg 440 | Gly Gly Tyr Asp Gly 445 | Leu | Phe |
Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu 450 455 460
Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr
465 470 475 480
Ala Tyr Lys
-59CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 7:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 2061 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 64 1698 (C) další informace: /poznámka^ „protox-2 cDNK z kukuřice; sekvence zpWDC-3“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 7:
CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60
CAA ATG Met | CTC Leu | GCT TTG ACT GCC TCA GCC TCA TCC GCT TCG TCC CAT CCT | 108 | |||||||||||||
Ala Leu | Thr 5 | Ala | Ser Ala | Ser | Ser 10 | Ala Ser | Ser His Pro 15 | |||||||||
1 | ||||||||||||||||
TAT | CGC | CAC | GCC | TCC | GCG | CAC | ACT | CGT | CGC | CCC | CGC | CTA | CGT | GCG | GTC' | 156 |
Tyr Arg | His | Ala | Ser 20 | Ala | His | Thr | Arg | Arg 25 | Pro | Arg | Leu | Arg | Ala 30 | Val | ||
CTC | GCG | ATG | GCG GGC | TCC | GAC | GAC | CCC | CGT | GCA | GCG | CCC | GCC | AGA | TCG | 204 | |
Leu | Ala | Met | Ala 35 | Gly | Ser | Asp | Asp | Pro 40 | Arg | Ala | Ala | Pro | Ala 45 | Arg | Ser | |
GTC | GCC | GTC | GTC | GGC | GCC | GGG | GTC | AGC | GGG | CTC | GCG | GCG | GCG | TAC | AGG | 252 |
Val | Ala | Val 50 | Val | Gly | Ala | Gly | Val 55 | Ser | Gly | Leu | Ala | Ala 60 | Ala | Tyr Arg |
-60CZ 296023 B6
CTC | AGA | CAG | AGC | GGC | GTG | AAC | GTA | ACG | GTG | TTC | GAA | GCG | GCC GAC | AGG | 300 |
Leu | Arg | Gin | Ser | Gly | Val | Asn | Val | Thr | Val | Phe | Glu | Ala | Ala Asp | Arg | |
65 | 70 | 75 | |||||||||||||
GCC | GGA | GGA | AAG | ATA | CGG | ACC | AAT | TCC | GAG | GGC | GGG | TTT | GTC Ί&3 | GAT | 348 |
Ala | Gly | Gly | Lys | Ile | Arg | Thr | Asn | Ser | Glu | Gly | Gly | Phe | Val Trp Asp | ||
80 | 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
GAA | GGA | GCT | AAC | ACC | ATG | ACA | GAA | GGT | GAA | TGG | GAG | GCC | ACT AGA | CTG | 396 |
Glu | Gly | Ala | Asn | Thr | Met | Thr | Glu | Gly | Glu | Trp | Glu | Ala | Ser Arg | Leu | |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
ATT | GAT | GAT | CTT | GGT | CTA | CAA | GAC | AAA | CAG | CAG | TAT | CCT | AAC TCC | CAA | 444 |
Ile | Asp Asp | Leu | Gly | Leu | Gin | Asp Lys | Gin | Gin | Tyr | Pro | Asn Ser | Gin | |||
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
CAC | AAG | CGT | TAC | ATT | GTC | AAA | GAT | GGA | GCA | CCA | GCA | CTG | ATT CCT | TCG | 492 |
His | Lys Arg Tyr | Ile | Val | Lys | Asp Gly | Ala | Pro | Ala | Leu | Ile Pro | Ser | ||||
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
GAT | CCC | ATT | TCG | CTA | ATG | AAA | AGC | AGT | GTT | CTT | TCG | ACA | AAA TCA AAG | 540 | |
Asp | Pro | Ile | Ser | Leu | Met | Lys | Ser | Ser | Val | Leu | Ser | Thr | Lys Ser | Lys | |
145 | 150 | 155 | |||||||||||||
ATT | GCG | TTA | TTT | TTT | GAA | CCA | TTT | CTC | TAC | AAG | AAA | GCT | AAC ACA AGA | 588 | |
Ile | Ala | Leu | Phe | Phe | Glu | Pro | Phe | Leu | Tyr | Lys | Lvs | Ala | Asn Thr | Arg | |
160 | 165 | 170 | 175 | ||||||||||||
AAC | TCT | GGA | AAA | GTG | TCT | GAG | GAG | CAC | TTG | AGT | GAG | AGT | GTT GGG | AGC | 636 |
Asn | Ser | Gly | Lys | Val | Ser | Glu | Glu | His | Leu | Ser | Glu | Ser | Val Gly | Ser | |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
TTC | TGT | GAA | CGC | CAC | TTT | GGA | AGA | GAA | GTT | GTT | GAC | TAT | TTT GTT | GAT | 684 |
Phe | Cys | Glu | Arg | His | Phe | Gly Arg | Glu | Val | Val | Asp | Tyr | Phe Val | Asp | ||
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
CCA | TTT | GTA | GCT | GGA | ACA | AGT | GCA | GGA | GAT | CCA | GAG | TCA | CTA TCT | ATT | 732 |
Pro | Phe | val | Ala | Gly | Thr | Ser | Ala | Gly Asp | Pro | Glu | Ser | Leu Ser | Ile | ||
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
CGT | CAT | GCA | TTC | CCA | GCA | TTG | TGG | AAT | TTG | GAA | AGA | AAG | TAT GCT | TCA | 780 |
Arg | His | Ala | Phe | Pro | Ala | Leu | Trp | Asn | Leu | Glu | Arg | Lys | Tyr Gly | Ser | |
225 | 230 | 235 | |||||||||||||
GTT | ATT | GTT | GGT | GCC | ATC | TTG | TCT | AAG | CTA | GCA | GCT | AAA | GCT GAT | CCA | 828 |
val | Ile | val | Gly | Ala | Ile | Leu | Ser | Lys | Leu | Ala | Ala | Lys Gly Asp | Pro | ||
240 | 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
GTA | AAG | ACA | AGA | CAT | GAT | TCA | TCA | GGG | AAA | AGA | AGG | AAT AGA CGA | CTG | 876 | |
Val | Lys | Thr | Arg | His | Asp | Ser | Ser | Gly | Lys | Arg Arg Asn Arg Arg | Val | ||||
260 | 265 | 270 |
-61 CZ 296023 B6
TCG TTT TCA TTT CAT GGT GGA ATG CAG TCA CTA ATA AAT GCA CTT CAC | 924 | ||||||||||||||
Ser | Phe Ser | Phe His Gly Gly 275 | Met Gin Ser 280 | Leu Ile Asn | Ala Leu His 285 | ||||||||||
AAT | GAA | GTT | GGA | GAT | GAT | AAT | GTG | AAG | CTT | GGT | ACA | GAA | GTG | TTG TCA | 972 |
Asn | Glu | val 290 | Gly | Asp Asp | Asn | Val 295 | Lys | Leu | Gly | Thr | Glu 300 | Val | Leu Ser | ||
TTG | GCA | TGT | ACA | TTT | GAT | GGA | GTT | CCT | GCA | CTA | GGC | AGG | TGG | TCA ATT | 1020 |
Leu | Ala 305 | Cys | Thr | Phe | Asp | Gly 310 | Val | Pro | Ala | Leu | Gly 315 | Arg Trp | Ser Ile | ||
TCT | GTT | GAT | TCG | AAG | GAT | AGC | GGT | GAC | AAG | GAC | CTT | GCT | AGT | AAC CAA | 1068 |
Ser 320 | Val | Asp | Ser | Lys | Asp 325 | Ser | Gly Asp | Lys | Asp 330 | Leu | Ala | Ser | Asn Gin 335 | ||
ACC | TTT | GAT | GCT | GTT | ATA | ATG | ACA | GCT | CCA | TTG | TCA | AAT | GTC | CGG AGG | 1116 |
Thr | Phe | Asp | Ala | val 3'40 | Ile | Met | Thr | Ala | Pro 345 | Leu | Ser | Asn | Val | Arg Arg 350 | |
ATG | AAG | TTC | ACC | AAA | GGT | GGA GCT | CCG | GTT | GTT | CTT | GAC | TTT | CTT CCT | 1164 | |
Met | Lys | Phe | Thr 355 | Lys | Gly Gly | Ala | Pro 360 | Val | Val | Leu | Asp | Phe 365 | Leu Pro | ||
AAG | ATG | GAT | TAT | CTA | CCA | CTA | TCT | CTC | ATG | GTG | ACT | GCT | TTT | AAG AAG | 1212 |
Lys | Met | Asp Tyr 370 | Leu | Pro | Leu | Ser 375 | Leu | Met | Val | Thr | Ala 380 | Phe | Lys Lys | ||
GAT | GAT | GTC | AAG | AAA | CCT | CTG | GAA | GGA | TTT | GGG | GTC | TTA | ATA | CCT TAC | 1260 |
Asp | Asp 385 | Val | Lys | Lys | Pro | Leu 390 | Glu | Gly | Phe | Gly | Val 395 | Leu | Ile | Pro Tyr | |
AAG | GAA | CAG | CAA | AAA | CAT | GGT | CTG | AAA | ACC | CTT | GGG | ACT | CTC | TTT TCC | 1308 |
Lys 400 | Glu | Gin | Gin | Lys | His 405 | Gly | Leu | Lys | Thr | Leu 410 | Gly | Thr | Leu | Phe Ser 415 | |
TCA | ATG | ATG | TTC | CCA | GAT | CGA | GCT | CCT | GAT | GAC | CAA | TAT | TTA | TAT ACA | 1356 |
Ser | Met | Met | Phe | Pro 420 | Asp Arg | Ala | Pro | Asp Asp 425 | Gin | Tyr | Leu | Tyr Thr 430 | |||
ACA | TTT | GTT | GGG | GGT | AGC | CAC | AAT | AGA | GAT | CTT | GCT | GGA | GCT | CCA ACG | 1404 |
Thr | Phe | Val | Gly Gly 435 | Ser | HÍ5 | Asn | Arq 440 | Asp | Leu | Ala | Gly | Ala 445 | Pro Thr | ||
TCT | ATT | CTG | AAA | CAA | CTT | GTG | ACC | TCT | GAC | CTT | AAA | AAA | CTC | TTG GGC | 1452 |
Ser | Ile | Leu 450 | Lys | Gin | Leu | Val | Thr 455 | Ser | Asp | Leu | Lys | Lys 460 | Leu | Leu Gly | |
GTA | GAG | GGG | CAA | CCA | ACT | TTT | GTC | AAG | CAT | GTA | TAC | TGG | GGA . | AAT GCT | 1500 |
Val | Glu 465 | Gly | Gin | Pro | Thr | Phe 470 | Val | Lys | His | Val | Tyr 475 | Trp Gly | Asn Ala |
-62CZ 296023 B6
TTT CCT Phe Pro 480 | TTG TAT GGC | CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA | |||||||||||||
Leu | Tyr Gly | His Asp 485 | Tyr | Ser | Ser Val 490 | Leu | Glu | Ala | Ile Glu 495 | ||||||
AAG | ATG | GAG | AAA | AAC | CTT | CCA | GGG | TTC | TTC | TAC | GCA | GGA | AAT | AGC | AAG |
Lys | Met | Glu | Lys | Asn | Leu | Pro | Gly | Phe | Phe | Tyr | Ala | Gly | Asn | Ser Lys | |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
GAT | GGG | CTT | GCT | GTT | GGA AGT | GTT | ATA | GCT | TCA | GGA | AGC | AAG | GCT | GCT | |
Asp | Gly | Leu | Ala | Val | Gly | Ser | Val | Ile | Ala | Ser | Gly | Ser | Lys | Ala | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
GAC | CTT | GCA | ATC | TCA | TAT | CTT | GAA | TCT | CAC | ACC | AAG | CAT | AAT | AAT | TCA |
ASp | Leu | Ala | Ile | Ser | Tyr | Leu | Glu | Ser | His | Thr | Lys | His | Asn | Asn | Ser |
530 | 535 | 540 |
CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT
His
545
CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GftACACATGC GTGACGTGTA ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTACT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA aaaaaaaaaa aaaaaa
1548
1596
1644
1692
1745
1805
1865
1925
1985
2045
2061 (2) Informace o SEQ ID č.: 8:
(i) Charakteristika sekvencí:
(A) délka: 544 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární io (ii) Typ molekuly: protein
-63CZ 296023 B6
(iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: | 8: | |||||||||||||
Met | Leu Ala | i Leu | i Thr | Ala | . Ser | : Ala | . Ser | Ser | ‘ Ala | . Ser | Ser | : His | Pro | ' Tyr. |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Arg | His Ala | Ser | ' Ala | His | Thr | : Arg Arg | Pro | 1 Arg | ' Leu | . Arg | • Ala | Val | Leu | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Ala | Met Ala | Gly | Ser | Asp Asp | Pro | Arg | Ala | Ala | Pro | Ala | Arg | Ser | Val | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Ala | Val Val | Gly | Ala | Gly | Val | Ser | Gly | Leu | Ala | Ala | Ala | Tyr | Arg | Leu |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Arg | Gin Ser | Gly | Val | Asn | Val | Thr | Val | Phe | Glu | Ala | Ala | Asp Arg | Ala | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
Gly Gly Lys | Ile | Arg | Thr | Asn | Ser | Glu | Gly Gly | Phe | Val | Trp | Asp | Glu | ||
85 | 90 | 95 | ||||||||||||
Gly Ala Asn | Thr | Met | Thr | Glu | Gly | Glu | Trp | Glu | Ala | Se'r | Arg | Leu | Ile | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||
Asp Asp Leu | Gly | Leu | Gin | Asp Lys | Gin | Gin | oyr | Pro | Asn | Ser | Gin | His | ||
115 | 120 | 125 | ||||||||||||
Lys | Arg Tyr | Ile | Val | Lys Asp Gly | Ala | Pro | Ala | Leu | Ile | Pro | Ser | Asp | ||
130 | 135 | 140 | ||||||||||||
Pro | Ile Ser | Leu | Met | Lys | Ser | Ser | Val | Leu | Ser | Thr | Lys | Ser | Lys | Ile |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
Ala | Leu Phe | Phe | Glu | Pro | Phe | Leu | Tyr Lys | Lys | Ala | Asn | Thr | Arg | Asn | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||
Ser | Gly Lys | Val | Ser | Glu | Glu | His | Leu | Ser | Glu | Ser | Val | Giy | Ser | Phe |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||
cys | Glu Arg | His | Phe | Gly Arg | Glu | Val | Val | Asp Tyr | Phe | Val | Asp | Pro | ||
195 | 200 | 205 | ||||||||||||
Phe | Val Ala | Gly | Thr | Ser Ala | Gly Asp | Pro | Glu | Ser | Leu | Ser | Ile | Arg |
210 215 220
-64CZ 296023 B6
His Ala Phe 225 | Pro Ala Leu 230 | Trp Asn Leu Glu Arg Lys 235 | Tyr Gly Ser Val 240 |
Ile Val Gly | Ala Ile Leu | Ser Lys Leu Ala Ala Lys | Gly Asp Pro Val |
245 | 250 | 255 | |
Lys Thr Arg | His Asp Ser | Ser Gly Lys Arg Arg Asn | Arg Arg Val Ser |
260 | 265 | 270 | |
Phe Ser Phe | His Gly Gly | Met Gin Ser Leu Ile Asn | Ala Leu His Asn |
275 | 280 | 285 | |
Glu Val Gly Asp Asp Asn | Val Lys Leu Gly Thr Glu | Val Leu Ser Leu | |
290 | 295 300 | ||
Ala Cys Thr | Phe Asp Gly | Val Pro Ala Leu Gly Arg | Trp Ser Ile Ser |
305 | 310 | 315 | 320 |
Val Asp Ser | Lys Asp Ser | Gly Asp Lys Asp Leu Ala | Ser Asn Gin Thr |
325 | 330 | 335 | |
Phe Asp Ala | Val Ile Met | Thr Ala Pro Leu Ser Asn | Val Arg Arg Met |
340 | 345 | 350 | |
Lys Phe Thr | Lys Gly Gly | Ala Pro Val Val Leu Asp | Phe Leu Pro Lys |
355 | 360 | 365 | |
Met Asp Tyr | Leu Pro Leu | Ser Leu Met Val Thr Ala | Phe Lys Lys Asp |
370 | 375 380 | ||
Asp Val Lys | Lys Pro Leu | Glu Gly Phe Gly Val Leu | Ile Pro Tyr Lys |
385 | 390 | 395 | 400 |
Glu Gin Gin | Lys His Gly | Leu Lys Thr Leu Gly Thr | Leu Phe Ser Ser |
405 | 410 | 415 | |
Met Met Phe | Pro Asp Arg | Ala Pro Asp Asp Gin Tyr | Leu Tyr Thr Thr |
420 | 425 | 430 | |
Phe Val Gly | Gly Ser His | Asn Arg Asp Leu Ala Gly | Ala Pro Thr Ser |
435 | 440 | 445 | |
Ile Leu Lys | Gin Leu Val | Thr Ser As o Leu Lys Lys | Leu Leu. Gly Val |
450 | 455 460 | ||
Glu Gly Gin | Pro Thr Phe | Val Lys His Val Tyr Trp | Gly Asn Ala Phe |
465 | 470 | 475 | 480 |
Pro Leu Tyr | Gly His Asp | Tyr Ser Ser Val Leu Glu | Ala Ile Glu Lys |
485 | 490 | 495 | |
Met Glu Lys | Asn Leu Pro | Gly Phe Phe Tyr Ala Gly | Asn Ser Lys Asp |
500 | 505 | 510 | |
Gly Leu Ala | Val Gly Ser | Val Ile Ala Ser Gly Ser | Lys Ala Ala Asp |
515 | 520 | 525 | |
Leu Ala Ile | Ser Tyr Leu | Glu Ser His Thr Lys His | Asn Asn Ser His |
530 535 540
-65CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 9:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 1697 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 29 1501 (C) další informace: /poznámka^ “protox-3 cDNK z kvasinky; sekvence z pWDC-5“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 9:
TTGGCATTTC CCTTGAACCA ACAATTCT ATG TCA ΑΊΤ GCA ATT TGT GGA GGA 52
Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly
5
GGT ATA | GCT GGT CTT AGT | ACA GCA TTT TAT CTT GCT AGA TTG ATT CCA | 100 | |||||||||||||
Gly | Ile 10 | Ala Gly | Leu | Ser | Thr 15 | Ala | Phe Tyr | Leu Ala Arg 20 | Leu Ile Pro | |||||||
AAA | TGT | ACT | ATT | GAT | TTG | TAC | GAA | AAA | GGT | CCT | CGT | TTA | GGT | GGA TGG | 148 | |
Lys | Cys | Thr | Ile | Asp | Leu | Tyr | Glu | Lys Gly | Pro | Arg | Leu | Gly Gly Trp | ||||
25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
CTT | CAG | TCG | GTC | AAA | ATC | CCG | TGT | GCA- GAT | TCT | CCA | ACA | GGAACG | GTT | 196 | ||
Leu | Gin | Ser | Val | Lys | Ile | Pro | Cys | Ala | Asp | Ser | Pro | Thr | Gly | Thr | Val | |
45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
TTG | TTT | GAG | CAA | GGT | CCT | AGA | ACT | CTT | CGT | CCT | GCT | GGG GTT | GCT | GGC | 244 | |
Leu | Phe | Glu | Gin | Gly | Pro | Arg | Thr | Leu | Arg | Pro | Ala | Gly | Val | Ala | Gly | |
60 | 65 | 70 | ||||||||||||||
TTA | GCA | AAC | TTA | GAT | TTA | ATT | AGC | AAG | TTG | GGC | ATC | GAA | GAC | AAG | TTG | 292 |
Leu | Ala | Asn | Leu | Asp | Leu | Ile | Ser | Lys | Leu | Gly | Ile | Glu | Asp | Lys | Leu | |
75 | 80 | 85 |
-66CZ 296023 B6
TTA AGG ATT TCG AGC AAT TCT CCC AGC GCA AAA AAC CGA TAT ATT TAT | 340 | |||||||||||||||
Leu | Arg Ile 90 | Ser Ser Asn Ser 95 | Pro | Ser | Ala | Lys Asn 100 | Arg | Tyr Ile Tyr | ||||||||
TAC | CCA | GAT | CGC | TTA | AAT | GAA | ATT | CCT | TCA | AGC | ATT | TTA | GGG | AGT | ATA | 388 |
Tyr | Pro | Asp | Arg | Leu | Asn | Glu | Ile | Pro | Ser | Ser | Ile | Leu | Gly | Ser | Ile | |
105 | 110 | 115 | 120 | |||||||||||||
AAG | TCG | ATT | ATG | CAG | CCT | GCT | TTG | CGT | CCG | ATG | CCT | TTG | GCT | ATG | ATG | 436 |
Lys | Ser | Ile | Met | Gin | Pro | Ala | Leu | Arg | Pro | Met | Pro | Leu | Ala | Met | Met | |
125 | 130 | 135 |
CTT Leu | GAG CCC TTT CGT AAA | ACT AAG CGA GAT TCG ACA GAT GAA AGC GTG | 484 | |||||||||||||
Glu | Pro | Phe Arg Lys 140 | Ser Lys Arg 145 | Asp Ser Thr | Asp Glu Ser 150 | Val | ||||||||||
GGT | TCA | TTT | ATG | AGA | AGA | AGA | TTT | GCT | AAA | AAC | CTT | ACG | GAT | AGA | GTT | 532 |
Gly | Ser | Phe 155 | Met | Arg | Arg | Arg | Phe 160 | Gly | Lys | Asn | Val | Thr 165 | Asp | Arg | Val | |
ATG | ACT | GCA | ATG | ATA | AAT | GCT | ATT | TAT | GCT | GGT | GAT | TTG | AAT | GAT | TTG | 580 |
Met | Ser 170 | Ala | Met | Ile | Asn | Gly 175 | Ile | Tyr | Ala | Gly | Asp 180 | Leu | Asn | Asp | Leu | |
TCT | ATG | CAT | TCT | AGC | ATG | TCT | GGA | TTT | TTA | GCG | AAG | ATT | GAA | AAA | AAG | 628 |
Ser 185 | Met | His | Ser | Ser | Met 190 | Phe | Gly | Phe | Leu | Ala 195 | Lys | Ile | Glu | Lys | Lys 200 | |
TAT | GGA | AAC | ATT | ACT | TTG | GGA | TTA | ATT | AGA | GCT | CTT | CTT | GCA | CCT | GAA | 676 |
Tyr | Gly | Asn | Ile | Thr 205 | Leu | Gly | Leu | Ile | Arg 210 | Ala | Leu | Leu | Ala | Arg 215 | Glu | |
ATA | TTA | TCT | CCT | GCT | GAG | AAA | GCT | TTG | GAA | AGC | AGC | ACT | ACT | CGC | AGA | 724 |
Ile | Leu | Ser | Pro 220 | Ala | Glu | Lys | Ala | Leu 225 | Glu | Ser | Ser | Thr | Thr 230 | Arg | Arg | |
GCC | AAA | AAC | AGC | AGA | GCT | GTC | AAA | CAG | TAT | GAA' ATC | GAC | AAG | TAT | CTT | 772 | |
Ala | Lys | Asn 235 | Ser | Arg | Ala | Val | Lys 240 | Gin | Tyr | Glu | Ile | Asp 245 | Lys | Tyr | Val | |
GCT | TTC | AAG | GAA | GGG | ATT | GAG | ACT | ATT | ACA | TTG | TCA ATA | GCA | GAT | GAA | 820 | |
Ala | Phe 250 | Lys | Glu | Gly | Ile | Glu 255 | Thr | Ile | Thr | Leu | Ser 260 | Ile | Ala | Asp | Glu | |
TTA | AAA | AAA | ATG | CCG | AAT | GTC | AAG | ATA | CAT | CTA | AAC | AAA | CCG | GCC | CAA | 868 |
Leu 265 | Lys | Lys | Met | Pro | Asn 270 | Val | Lys | Ile | His | Leu 275 | Asn | Lys | Pro | Ala | Gin 280 | |
ACT | TTG | GTT | CCA | CAT | AAA ACT | CAG | TCT | CTT | CTA | GAC | CTC | AAT | GCT CAA | 916 | ||
Thr | Leu | Val | Pro | His 285 | Lys | Thr | Gin | Ser | Leu 290 | Val | Asp | Val | Asn | Gly Gin 295 |
67CZ 296023 B6
GCT Ala | TAC GAG TAT | GTT GTG TTT GCA AAC TCT TCT CGC AAT | TTA GAG | AAT Asn | 964 | |||||||||||
Tyr | Glu Tyr 300 | Val Val Phe | Ala | Asn Ser 305 | Ser | Arg | Asn | Leu 310 | Glu | |||||||
CTA | ATA | TCT | TGT | CCT | AAA | ATG | GAA | ACT | CCG | ACG | TCG | AGT | GTT | TAT | GTC | 1012 |
Leu | Ile | Ser | Cys | Pro | Lys | Met | Glu | Thr | Pro | Thr | Ser | Ser | Val | Tyr | Val | |
315 | 320 | 325 | ||||||||||||||
GTC | AAC | GTT | TAT | TAT | AAG | GAC | CCT | AAT | GTT | CTT | CCA | ATC | CGT | GGT | TTT | 1060 |
Val | Asn | Val | Tyr Tyr | Lys | Asp | Pro | Asn | Val | Leu | Pro | Ile | Arg | Gly | Phe | ||
330 | 335 | 340 | ||||||||||||||
GGG | CTT | TTG | ATT | CCA | TCA | TGC | ACT | CCA | AAT | AAT | CCG | AAT | CAT | GTT | CTT | 1108 |
Gly | Leu | Leu | Ile | Pro | Ser | Cys | Thr | Pro | Asn | Asn | Pro | Asn | His | Val | Leu | |
345 | 350 | 355 | 360 | |||||||||||||
GGT | ATC | GTT | TTT | GAT | AGT | GAG | CAA | AAC | AAC | CCT | GAA | AAT | GGA AGC | AAG | 1156 | |
Gly | Ile | Val | Phe | Asp | Ser | Glu | Gin | Asn | Asn | Pro | Glu | Asn | Gly | Ser | Lys | |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||||
GTC | ACT | GTC | ATG | ATG | GGA | GGG | TCT | GCT | TAT | ACA | AAA | AAT | ACT | TCT | TTG | 1204 |
Val | Thr | val | Met | Met | Gly | Gly | Ser | Ala | Tyr | Thr | Lys | Asn | Thr | Ser | Leu | |
380 | 385 | 390 | ||||||||||||||
AM | CCA | ACC | AAC | CCC | GAA | GAA | GCC | GTT | AAC | AAT | GCT | CTC | AAA | GCT | TTG | 1252 |
Ile | Pro | Thr | Asn | Pro | Glu | Glu | Ala | Val | Asn | Asn | Ala | Leu | Lys | Ala | Leu | |
395 | 400 | 405 | ||||||||||||||
CAG | CAT | ACT | TTA | AAA | ATA | TCC | AGT | AAG | CCA | ACA | CTC | ACG | AAT | GCA ACA | 1300 | |
Gin | His | Thr | Leu | Lys | Ile | Ser | Ser | Lys | Pro | Thr | Leu | Thr | Asn | Ala | Thr | |
410 | 415 | 420 | ||||||||||||||
TTA | CAA | CCA | AAT | TGC | ATC | CCT | CAA | TAT | CGT | GTT | GGG | CAT | CAA | GAT | AAT | 1348 |
Leu | Gin | Pro | Asn | Cys | Ile | Pro | Gin | Tyr Arg | Val | Gly | HÍS | Gin | Asp | Asn | ||
425 | 430 | 435 | 440 | |||||||||||||
CTT | AAT | TCT | TTG | AAA | TCT | TGG | ATT | GAG | AAA | AAT | ATG | GGA | GGG | CGA | ATT | 1396 |
Leu | Asn | Ser | Leu | Lys | Ser | Trp | Ile | Glu | Lys | Asn | Met | Gly Gly Arg | Ile | |||
445 | 450 | 455 | ||||||||||||||
CTT | CTA | ACT | GGA | AGT | TGG | TAT | AAT | GGT | GTT | AGT | ATT | GGG GAT TGT | ATT | 1444 | ||
Leu | Leu | Thr | Gly | Ser | Trp Tyr | Asn | Gly | Val | Ser | Ile | Gly Asp Cys | Ile | ||||
460 | 465 | 470 | ||||||||||||||
ATG | AAT | GGA | CAT | TCA | ACA GCT | CGA | AAA | CTA GCA | TCA | TTG | ATG AAT | TCT | 1492 | |||
Met | Asn | siy | His | Ser | Thr Ala | Arg | Lys | Leu Ala | Ser | Leu | Met Asn | Ser | ||||
475 | 480 | 485 |
TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA 1548
Ser Ser
490
TTTTATGAGT TGAAAATGCC ACTTGTGAAA TAATTTTGCA CAAGCCCTTT TATTACAGAC
GTATATGCGA GGACATTCGA CAAACGTTTG AAATTAAAAA TCATATGCCT TTTAGCTTAA
GACATCAAGG TCATGAATAA TAAAATTTT
1608
1668
1697
-68CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 10:
(i) Charakteristika sekvencí:
(A) délka: 490 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 10:
Met Ser Ile Ala Ile | Cys Gly | Gly Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr | Ala | |||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Phe | Tyr | Leu | Ala | Arg | Leu Ile | Pro | Lys | Cys | Thr | Ile | Asp | Leu | Tyr | Glu |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Lys | Gly | Pro | Arg | Leu | Gly Gly | Trp | Leu | Gin | Ser | Val | Lys | Ile | Pro | cys |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Ala | Asp | Ser | Pro | Thr | Gly Thr | Val | Leu | Phe | Glu | Gin | Gly | Pro | Arg | Thr |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Leu | Arg | Pro | Ala | Gly | Val Ala | Gly | Leu | Ala | Asn | Leu | Asp | Leu | Ile | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
Lys | Leu | Gly | Ile | Glu | Asp Lys | Leu | Leu | Arg | Ile | Ser | Ser Asn | Ser | Pro | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||
Ser | Ala | Lys | Asn | Arg | Tyr Ile | Tyr Tyr | Pro | Asp Arg | Leu | Asn | Glu | Ile | ||
100 | 105 | 110 | ||||||||||||
Pro | Ser | Ser | Ile | Leu | Gly Ser | Ile | Lys | Ser | Ile | Met | Gin | Pro | Ala | Leu |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||
Arg | Pro | Met | Pro | Leu | Ala Met | Met | Leu | Glu | Pro | Phe | Arg Lys | Ser | Lys | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||
Arg | Asp | Ser | Thr | Asp | Glu Ser | Val | Gly | Ser | Phe | Met | Arg Arg Arg | Phe | ||
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
Gly | Lys | Asn | Val | Thr | Asp Arg | val | Met | Ser | Ala | Met | Ile | Asn | Gly | Ile |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||
Tyr | Ala | Gly Asp | Leu | Asn Asp | Leu | Ser | Met | His | Ser | Ser | Met | Phe | Gly | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||
Phe | Leu | Ala Lys | Ile | Glu Lys | Lys Tyr Gly | Asn | Ile | Thr | Leu | Gly | Leu |
195 200 205
-69CZ 296023 B6
Ile | : Arg Ala | i Leu | i Leu | i Ala | Arg | Glu | 1 Ile | Leu | : Ser | Pro | Ala | Glu | Lys | Ala | |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Leu | Glu | i Ser | Ser | • Thr | Thr | Arg | Arg | Ala | Lys | Asn | Ser | Arg | Ala | Val | Lys |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Tyr | Glu | Ile | Asp | Lys | Tyr | val | Ala | Phe | Lys | Glu | Gly | Ile | Glu | Thr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ile | Thr | Leu | Ser | Ile | Ala | Asp | Glu | Leu | Lys | Lys | Met | Pro | Asn | Val | Lys |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ile | His | Leu | Asn | Lys | Pro | Ala | Gin | Thr | Leu | Val | Pro | His | Lys | Thr | Gin |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ser | Leu | Val | Asp | Val | Asn | Gly | Gin | Ala | Tyr | Glu | Tyr | Val | val | Phe | Ala |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Asn | Ser | Ser | Arg | Asn | Leu | Glu | Asn | Leu | Ile | Ser | Cys | Pro | Lys | Met | Glu |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Thr | Pro | Thr | Ser | Ser | Val | Tyr | Val | Val | Asn | Val | Tyr | Tyr Lys Asp | Pro | ||
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Asn | Val | Leu | Pro | Ile | Arg Gly | Phe | Gly | Leu | Leu | Ile | Pro | Ser | Cys | Thr | |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Pro | Asn | Asn | Pro | Asn | His | Val | Leu | Gly | Ile | Val | Phe | Asp | Ser | Glu | Gin |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asn | Asn | Pro | Glu | Asn | Gly | Ser | Lys | Val | Thr | Val | Met | Met | Gly Gly | Ser | |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ala | Tyr | Thr | Lys | Asn | Thr | Ser | Leu | Ile | Pro | Thr | Asn | Pro | Glu | Glu | Ala |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Val | Asn | Asn | Ala | Leu | Lys | Ala | Leu | Gin | His | Thr | Leu | Lys | Ile | Ser | Ser |
405 410 415
Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr Leu Gin Pro Asn Cys Ile Pro Gin 420 425430
Tyr Arg Val Gly His Gin Asp Asn Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile 435 440445
Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn 450 455460
Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg
465 | 470 475 | 480 |
Lys Leu Ala Ser Leu | Met Asn Ser Ser Ser | |
485 | 490 |
-70CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 11:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 41 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotidy užívané pro konstrukci pCGN1761ENX (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 11:
AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T 41 (2) Informace o SEQ ID č.: 12:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 40 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotidy užívané pro konstrukci pCGN1761ENX (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 12:
AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT 40 (2) Informace o SEQ ID č.: 13:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0003 užívaný pro konstrukci pSOGlO (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne
-71 CZ 296023 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 13:
CTCGGATCCAGCAGATTCAAGAAGGTACAG 31 (2) Informace o SEQ ID č.: 14:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0004 užívaný pro konstrukci pSOGlO (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 14:
ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG 31 (2) Informace o SEQ ID č.: 15:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 26 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0004 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 15:
CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC 26 (2) Informace o SEQ ID č.: 16:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0010 užívaný pro konstrukci pSOG19
-72CZ 296023 B6 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 16:
AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24 (2) Informace o SEQ ID č.: 17:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0016 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 17:
GCTACCATGGCCACAATAGAACACC 24 (2) Informace o SEQ ID č.: 18:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 23 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0017 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 18:
CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG 23 (2) Informace o SEQ ID č.: 19:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 28 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární
-73CZ 296023 B6 (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0039 užívaný pro konstrukci Psog30 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 19:
CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA 28 (2) Informace o SEQ ID č.: 20:
(i) Charakteristiky sekvencí:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0041 užívaný pro konstrukci pSOG30 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 20:
ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC 2 4
Claims (21)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Rostlina a její potomstvo, včetně jejich částí, mající změněnou aktivitu protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), přičemž tato změněná aktivita protox propůjčuje rostlině a jejímu potomstvu toleranci k herbicidu v takovém množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu, a změněná aktivita protox je rostlině propůjčena expresí molekuly DNK, která kóduje enzym protox tolerantní k herbicidu, přičemž tento enzym protox tolerantní k herbicidu se přirozeně vyskytuje u prokaryont.
- 2. Rostlina podle nároku 1, kde prokaryont je vybrán ze skupiny obsahující E. coli, B. subtilis a S. typhimurium.
- 3. Rostlina podle nároku 1, kde molekula DNK obsahuje gen hemG z E. coli.
- 4. Rostlina podle nároku 1, kde molekula DNK obsahuje gen hemYz B. subtilis.
- 5. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, která je dvouděložná rostlina.
- 6. Rostlina podle nároku 5, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahujíc sóju, bavlnu, tabák, cukrovou řepu a řepku olejnou.-74CZ 296023 B6
- 7. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, která je jednoděložná rostlina.
- 8. Rostlina podle nároku 7, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, turfové trávy a rýži.
- 9. Semeno rostliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.
- 10. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, která je hybridní rostlina.
- 11. Rozmnožovací materiál rostliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, který je ošetřen ochranným povlakem.
- 12. Rozmnožovací materiál podle nároku 11, který obsahuje přípravek vybraný ze skupiny obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, molluscicidy nebo jejich směsi.
- 13. Rozmnožovací materiál podle nároku 11 nebo 12, který obsahuje semena.
- 14. Způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se na populaci rostlin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 aplikuje účinné množství herbicidu inhibujícího protox.
- 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že rostlina je vybrána ze skupiny obsahující sóju, bavlnu, tabák, cukrovou řepu, řepku olejnou, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, turfové trávy a rýži.
- 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že herbicid inhibující protox je vybrán ze skupiny obsahující aryluracil, difenylether, oxidiazol, imid, fenylpyrazol, derivát pyridinu, 3-substituovaný-2-aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazol, fenopylat a O-fenylpyrrolidin- apiperidinkarbamátové analogy fenopylatu.
- 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že herbicid inhibující protox je imid vzorceQ (Vzorec V), kde Q je-75CZ 296023 B6 nebo (Vzorec VI) (Vzorec IXa) nebo nebo (Vzorec VII) (Vzorec VIII) (Vzorec IX) nebo (Vzorec IXb), a kde Ri je H, Cl, nebo F, R2 je Cl a R3 je optimálně substituovaná etherová, thioetherová, esterová skupina, aminoskupina nebo alkylová skupina, přičemž R2 a R3 mohou společně tvořit 5-ti nebo 6-ti členný heterocyklický kruh.
- 18. Způsob podle nároku 17, vyznačuj ící se tím, že imid je vybrán ze skupiny obsahující N CHjC14jSO2NH (Vzorec X); (Vzorec XI);-76CZ 296023 B6
Cl----. /c /' Ηδΰ2ΟΟΟΟΗ20 xrt XN OCHF2 1 ch3 (Vzorec XII); 0 b —Cl X SC^COOCFb (Vzorec XIII}; OF (Vzorec XIV);OCFfeCOOCsHn (Vzorec XV);-77 CZ 296023 B6 (Vzorec XVI) a (Vzorec XVII) kde R je alkenyloxykarbonylalkylová skupina, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku a alkylová skupina obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku.5 - 19. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že herbicid inhibující protox má vzorec vybraný ze skupiny obsahující:(Vzorec XVIII),-78CZ 296023 B6 (Vzorec XIX), (Vzorec XX) a (Vzorec XXI) ,
- 20 Způsob přípravy hostitelské buňky, které obsahuje izolovanou molekulu DNK kódující prokaryontní protein mající aktivitu protoporfyrinogenové oxidázy (protox), vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se hostitelská buňka transformuje molekulou DNA kódující 5 enzym protox tolerantní k herbicidu, kterýžto enzym protox tolerantní k herbicidu se přirozeně vyskytuje v prokaryontech.
- 21. Způsob přípravy rostlinné buňky, která obsahuje izolovanou molekulu DNK kódující prokaryontní protein mající aktivitu protoporfyrinogenové oxidázy (protox), vyznačující se ío t í m , že zahrnuje krok, kdy se rostlinná buňka transformuje molekulou DNA kódující enzym protox tolerantní k herbicidu, kterýžto enzym protox tolerantní k herbicidu se přirozeně vyskytuje v prokaryontech.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26119894A | 1994-06-16 | 1994-06-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ296023B6 true CZ296023B6 (cs) | 2005-12-14 |
Family
ID=22992309
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19963674A CZ295884B6 (cs) | 1994-06-16 | 1995-06-08 | Izolovaná molekula DNK kódující protoporfyrinogenovou oxidázu, expresní kazeta, rekombinantní vektor, hostitelská buňka a transgenní rostlina, které obsahují takovou izolovanou molekulu |
CZ2002620A CZ296023B6 (cs) | 1994-06-16 | 1995-06-08 | Transgenní rostlina se změněnou aktivitou protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), která je tolerantní k herbicidu, semena a potomstvo rostliny a způsob přípravy takové rostliny |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19963674A CZ295884B6 (cs) | 1994-06-16 | 1995-06-08 | Izolovaná molekula DNK kódující protoporfyrinogenovou oxidázu, expresní kazeta, rekombinantní vektor, hostitelská buňka a transgenní rostlina, které obsahují takovou izolovanou molekulu |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US5767373A (cs) |
EP (1) | EP0769059B1 (cs) |
JP (1) | JP3673925B2 (cs) |
CN (3) | CN100432229C (cs) |
AT (1) | ATE296888T1 (cs) |
AU (2) | AU706763B2 (cs) |
BG (1) | BG64394B1 (cs) |
BR (1) | BR9508030A (cs) |
CA (1) | CA2189349C (cs) |
CZ (2) | CZ295884B6 (cs) |
DE (1) | DE69534247T2 (cs) |
DK (1) | DK0769059T3 (cs) |
ES (1) | ES2239757T3 (cs) |
FI (1) | FI964958A (cs) |
HK (1) | HK1039794B (cs) |
HU (1) | HUT76353A (cs) |
MX (1) | MX237061B (cs) |
PL (3) | PL183091B1 (cs) |
PT (1) | PT769059E (cs) |
RO (3) | RO122046B1 (cs) |
RU (2) | RU2266332C2 (cs) |
SK (1) | SK284895B6 (cs) |
UA (1) | UA71536C2 (cs) |
WO (1) | WO1995034659A1 (cs) |
Families Citing this family (436)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5939602A (en) * | 1995-06-06 | 1999-08-17 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof |
US5767373A (en) | 1994-06-16 | 1998-06-16 | Novartis Finance Corporation | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
US6808904B2 (en) * | 1994-06-16 | 2004-10-26 | Syngenta Participations Ag | Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling |
US6023012A (en) * | 1996-02-28 | 2000-02-08 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase |
US6084155A (en) * | 1995-06-06 | 2000-07-04 | Novartis Ag | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
DE19524623A1 (de) * | 1995-07-06 | 1997-01-09 | Basf Ag | 5-Pyrazolylbenzoesäure-Derivate |
WO1997004088A1 (en) | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene |
KR970021314A (ko) * | 1995-10-11 | 1997-05-28 | 김선중 | 제초제 지항성 식물체의 제조방법 |
DE19542520A1 (de) * | 1995-11-15 | 1997-05-22 | Basf Ag | Substituierte 1-Methyl-3-phenylpyrazole |
JP2000506011A (ja) * | 1996-02-28 | 2000-05-23 | ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト | 植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーター |
NZ335101A (en) * | 1996-11-07 | 2000-11-24 | Zeneca Ltd | Herbicide resistant plants comprising more that one resistence gene |
DE19650216A1 (de) * | 1996-12-04 | 1998-06-10 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Verfahren zur Beeinflussung der Chlorophyllbiosynthese in Pflanzen |
CA2276053C (en) * | 1996-12-27 | 2007-10-23 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation |
ZA98371B (en) * | 1997-01-31 | 1999-07-16 | Du Pont | Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides. |
EP1020525A4 (en) * | 1997-09-11 | 2004-08-25 | Nihon Nohyaku Co Ltd | PROTOPORPHYRINOGEN OXIDASE, WHICH IS TOLERANT TO HERBICIDES NEEDING LIGHT |
AU769868B2 (en) | 1998-04-10 | 2004-02-05 | Sumitomo Chemical Company, Limited | A method for evaluating the ability of a compound to inhibit the protoporphyrinogen oxidase activity |
US6906245B1 (en) | 1998-04-30 | 2005-06-14 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants |
JP4788011B2 (ja) * | 1998-04-30 | 2011-10-05 | 住友化学株式会社 | 雑草防除剤耐性の付与方法 |
AU753020B2 (en) * | 1998-04-30 | 2002-10-03 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for giving resistance to weed control compounds to plants |
DE19836684A1 (de) | 1998-08-13 | 2000-02-17 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Reiskulturen |
AR023523A1 (es) * | 1999-04-19 | 2002-09-04 | Syngenta Participations Ag | Tratamiento herbicida para semillas |
AU5532700A (en) * | 1999-06-15 | 2001-01-02 | Syngenta Participations Ag | Herbicide target genes and methods |
AU6277600A (en) * | 1999-07-27 | 2001-02-13 | Syngenta Participations Ag | Novel chimeric genes |
US6294345B1 (en) | 1999-07-27 | 2001-09-25 | Syngenta Participations Ag | Genes encoding proteins essential for plant growth and methods of use |
EP1200611A1 (en) * | 1999-08-13 | 2002-05-02 | Syngenta Participations AG | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase |
AU7965700A (en) * | 1999-10-11 | 2001-04-23 | Kyoung-Whan Back | Process for increasing crop yield or biomass using protoporphyrinogen oxidase gene |
JP4821036B2 (ja) * | 1999-10-29 | 2011-11-24 | 住友化学株式会社 | 除草剤耐性植物 |
JP4821038B2 (ja) * | 1999-10-29 | 2011-11-24 | 住友化学株式会社 | 除草剤耐性植物 |
EP1235906B8 (de) * | 1999-11-26 | 2008-01-23 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur mutagenese von nukleotidsequenzen aus pflanzen, algen, oder pilzen |
EP1240185A2 (en) * | 1999-12-16 | 2002-09-18 | Syngenta Participations AG | Herbicide target genes and methods |
WO2001068826A2 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Syngenta Participations Ag | Protoporphyrinogen oxidase ('protox') genes |
DE10032633A1 (de) * | 2000-07-05 | 2002-01-17 | Bayer Ag | Verfahren zum Auffinden von Hemmstoffen der Protoporphyrinogen-Oxidase |
WO2002014523A2 (en) * | 2000-08-11 | 2002-02-21 | Syngenta Participations Ag | Methods for stable transformation of plants |
DE10052454A1 (de) * | 2000-10-23 | 2002-05-02 | Angelika Weber | Verfahren und Vorrichtung zur automatischen Pflanzenauswahl und automatischen Zusammenstellung von Pflanzgruppen |
US6982169B2 (en) * | 2001-01-15 | 2006-01-03 | Morphotek, Inc. | Chemical inhibitors of mismatch repair |
EP1925672A1 (en) | 2001-06-22 | 2008-05-28 | Syngeta Participations AG | Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides |
WO2003003162A2 (en) * | 2001-06-29 | 2003-01-09 | Clinomics Biosciences, Inc. | Evaluating neuropsychiatric diseases using a specimen-linked database |
AR037413A1 (es) * | 2001-11-27 | 2004-11-10 | Valent Biosciences Corp | Composicion herbicida intensificada |
US7598430B2 (en) * | 2002-03-20 | 2009-10-06 | J.R. Simplot Company | Refined plant transformation |
US20050034188A1 (en) * | 2002-03-20 | 2005-02-10 | J. R. Simplot Company | Refined plant transformation |
EP2322629A3 (en) | 2003-04-29 | 2011-11-02 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Novel glyphosate-n-acetyltransferase (GAT) genes |
US6849579B2 (en) * | 2003-06-25 | 2005-02-01 | Pbi Gordon Corporation | Synergistic quinclorac herbicidal compositions |
US20070169227A1 (en) | 2003-12-16 | 2007-07-19 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same |
EP2333051A1 (en) | 2003-12-16 | 2011-06-15 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Dominant gene suppression transgenes and methods of using same |
US7780793B2 (en) * | 2004-02-26 | 2010-08-24 | Applied Materials, Inc. | Passivation layer formation by plasma clean process to reduce native oxide growth |
US20050230350A1 (en) * | 2004-02-26 | 2005-10-20 | Applied Materials, Inc. | In-situ dry clean chamber for front end of line fabrication |
US20060051966A1 (en) * | 2004-02-26 | 2006-03-09 | Applied Materials, Inc. | In-situ chamber clean process to remove by-product deposits from chemical vapor etch chamber |
JP4720223B2 (ja) * | 2004-05-18 | 2011-07-13 | 住友化学株式会社 | 除草活性化合物耐性植物 |
EA200701844A1 (ru) * | 2005-03-21 | 2008-04-28 | Басф Акциенгезельшафт | Инсектицидные смеси |
WO2006119318A2 (en) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Purdue Research Foundation | Methods for increasing the yield of fermentable sugars from plant stover |
US7842856B2 (en) | 2005-08-25 | 2010-11-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Herbicide resistance gene, compositions and methods |
US7671254B2 (en) * | 2005-08-25 | 2010-03-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Herbicide resistance gene, compositions and methods |
BRPI0708480A2 (pt) * | 2006-03-02 | 2011-05-31 | Athenix Corp | processos e composições para aperfeiçoada atividade de enzima em plantas transgênicas |
US7951995B2 (en) | 2006-06-28 | 2011-05-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof |
US8268553B2 (en) | 2007-06-01 | 2012-09-18 | Sapphire Energy, Inc. | High throughput screening of genetically modified photosynthetic organisms |
JP2010538616A (ja) | 2007-09-11 | 2010-12-16 | サファイア エナジー,インコーポレイティド | 光合成生物による分子生成 |
US8314222B2 (en) | 2007-10-05 | 2012-11-20 | Sapphire Energy, Inc. | System for capturing and modifying large pieces of genomic DNA and constructing organisms with chloroplasts |
US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
AU2008321074A1 (en) * | 2007-11-13 | 2009-05-22 | Sapphire Energy, Inc. | Production of Fc-fusion polypeptides in eukaryotic algae |
US7947877B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-05-24 | Monosanto Technology LLC | Plants and seeds of spring canola variety SCV328921 |
US8829282B2 (en) * | 2008-05-14 | 2014-09-09 | Monsanto Technology, Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV425044 |
US7935870B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-05-03 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV354718 |
US7964774B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-06-21 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV384196 |
NZ589879A (en) | 2008-06-27 | 2012-08-31 | Sapphire Energy Inc | Induction of flocculation in photosynthetic organisms |
US8697941B2 (en) | 2008-07-23 | 2014-04-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans |
US8748695B2 (en) * | 2008-07-23 | 2014-06-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans |
US20120060243A1 (en) | 2008-09-26 | 2012-03-08 | Peter Beetham | Herbicide-Resistant AHAS-Mutants and Methods of Use |
US8373025B2 (en) | 2009-02-09 | 2013-02-12 | Chromatin Germplasm, Llc | Herbicide resistant sorghum |
MX2011013224A (es) | 2009-06-09 | 2012-06-01 | Pioneer Hi Bred Int | Promotor de endospermo temprano y metodos de uso. |
US8071848B2 (en) * | 2009-06-17 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV218328 |
JP5735517B2 (ja) | 2009-09-30 | 2015-06-17 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | アニオン性農薬の低揮発性アミン塩 |
US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
CA2775146A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Somatic ovule specific promoter and methods of use |
GB0920891D0 (en) | 2009-11-27 | 2010-01-13 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal compositions |
WO2011094205A1 (en) * | 2010-01-26 | 2011-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Hppd-inhibitor herbicide tolerance |
US8138394B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-03-20 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV431158 |
US8148611B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-04-03 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV453784 |
US8143488B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-03-27 | Monsanto Technoloy LLC | Plants and seeds of spring canola variety SCV470336 |
EA029482B1 (ru) | 2010-03-08 | 2018-04-30 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений |
US8581048B2 (en) * | 2010-03-09 | 2013-11-12 | Monsanto Technology, Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV119103 |
US8153865B2 (en) * | 2010-03-11 | 2012-04-10 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV152154 |
US9324576B2 (en) | 2010-05-27 | 2016-04-26 | Applied Materials, Inc. | Selective etch for silicon films |
US20120122223A1 (en) | 2010-08-03 | 2012-05-17 | Cibus Us Llc | Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes |
UA112969C2 (uk) * | 2010-08-03 | 2016-11-25 | Сібас Юс Ллс | Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх) |
AU2015271948A1 (en) * | 2010-08-03 | 2016-01-21 | Cibus Europe B.V. | Mutated protoporphyrinogen IX oxidase (PPX) genes |
AU2011289286B2 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for targeting sequences of interest to the chloroplast |
EP2460404A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Basf Se | Compositions containing identical polyamine salts of mixed anionic pesticides |
WO2012071039A1 (en) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | Pioner Hi-Bred International, Inc. | Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof |
CA2810180C (en) | 2010-11-24 | 2015-07-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof |
WO2012074868A2 (en) | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Ms Technologies, Llc | Optimized expression of glyphosate resistance encoding nucleic acid molecules in plant cells |
TWI667347B (zh) | 2010-12-15 | 2019-08-01 | 瑞士商先正達合夥公司 | 大豆品種syht0h2及偵測其之組合物及方法 |
WO2012080975A1 (en) | 2010-12-16 | 2012-06-21 | Basf Se | Plants having increased tolerance to herbicides |
US10283321B2 (en) | 2011-01-18 | 2019-05-07 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing system and methods using capacitively coupled plasma |
US8771539B2 (en) | 2011-02-22 | 2014-07-08 | Applied Materials, Inc. | Remotely-excited fluorine and water vapor etch |
US9064815B2 (en) | 2011-03-14 | 2015-06-23 | Applied Materials, Inc. | Methods for etch of metal and metal-oxide films |
US8999856B2 (en) | 2011-03-14 | 2015-04-07 | Applied Materials, Inc. | Methods for etch of sin films |
US8648230B2 (en) | 2011-03-18 | 2014-02-11 | Ms Technologies, Llc | Regulatory regions preferentially expressing in non-pollen plant tissue |
US8513487B2 (en) | 2011-04-07 | 2013-08-20 | Zenon LISIECZKO | Plants and seeds of spring canola variety ND-662c |
US8513494B2 (en) | 2011-04-08 | 2013-08-20 | Chunren Wu | Plants and seeds of spring canola variety SCV695971 |
AU2012251750B2 (en) | 2011-05-02 | 2015-07-09 | Basf Se | A method for enhancing the performance of a pesticide with guanidines |
US8507761B2 (en) | 2011-05-05 | 2013-08-13 | Teresa Huskowska | Plants and seeds of spring canola variety SCV372145 |
US8513495B2 (en) | 2011-05-10 | 2013-08-20 | Dale Burns | Plants and seeds of spring canola variety SCV291489 |
GB201109239D0 (en) | 2011-06-01 | 2011-07-13 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal compositions |
CA2835391A1 (en) | 2011-06-01 | 2012-12-06 | Basf Se | Method of preparing an aqueous tank mix comprising a base |
PE20141541A1 (es) | 2011-07-22 | 2014-10-25 | Ricetec Ag | Metodos y composiciones para producir arroz resistente a inhibidores de accasa |
US9303270B2 (en) | 2011-07-22 | 2016-04-05 | Ricetec Aktiengesellschaft | Rice resistant to HPPD and accase inhibiting herbicides |
US8771536B2 (en) | 2011-08-01 | 2014-07-08 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch for silicon-and-carbon-containing films |
EP2739141A1 (en) | 2011-08-02 | 2014-06-11 | Basf Se | Aqueous composition comprising a pesticide and a base selected from an alkali salt of hy-drogencarbonate |
US8785729B2 (en) | 2011-08-09 | 2014-07-22 | Nunhems, B.V. | Lettuce variety redglace |
US8679982B2 (en) | 2011-08-26 | 2014-03-25 | Applied Materials, Inc. | Selective suppression of dry-etch rate of materials containing both silicon and oxygen |
US8679983B2 (en) | 2011-09-01 | 2014-03-25 | Applied Materials, Inc. | Selective suppression of dry-etch rate of materials containing both silicon and nitrogen |
US8754293B2 (en) | 2011-09-09 | 2014-06-17 | Nunhems B.V. | Lettuce variety intred |
CA2848685A1 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control comprising topical application of a glutamine synthetase polynucleotide |
CA2848680C (en) | 2011-09-13 | 2020-05-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US10760086B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-09-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
UA116091C2 (uk) | 2011-09-13 | 2018-02-12 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Способи та композиції для боротьби з бур'янами |
CN103975068A (zh) | 2011-09-13 | 2014-08-06 | 孟山都技术公司 | 用于杂草控制的方法和组合物 |
MX350771B (es) | 2011-09-13 | 2017-09-15 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para el control de malezas. |
EP2756083B1 (en) | 2011-09-13 | 2020-08-19 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for weed control |
AR088155A1 (es) | 2011-09-13 | 2014-05-14 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para el control de malezas |
US10829828B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US10806146B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-10-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US9840715B1 (en) | 2011-09-13 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants |
BR112014005954A2 (pt) | 2011-09-13 | 2020-12-01 | Monsanto Technology Llc | métodos e composições químicas agrícolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene dhps em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene dhps |
US9920326B1 (en) | 2011-09-14 | 2018-03-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for increasing invertase activity in plants |
US8927390B2 (en) | 2011-09-26 | 2015-01-06 | Applied Materials, Inc. | Intrench profile |
US8808563B2 (en) | 2011-10-07 | 2014-08-19 | Applied Materials, Inc. | Selective etch of silicon by way of metastable hydrogen termination |
WO2013070436A1 (en) | 2011-11-08 | 2013-05-16 | Applied Materials, Inc. | Methods of reducing substrate dislocation during gapfill processing |
US20130167262A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11268 |
WO2013096810A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11482 |
US9380756B2 (en) | 2012-01-04 | 2016-07-05 | Nunhems B.V. | Lettuce variety multigreen 50 |
US20130180008A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi Bred International Inc | Ovule Specific Promoter and Methods of Use |
US9006515B2 (en) | 2012-01-06 | 2015-04-14 | Pioneer Hi Bred International Inc | Pollen preferred promoters and methods of use |
AU2013209738A1 (en) | 2012-01-17 | 2014-08-07 | Australian Center For Plant Functional Genomics, Pty, Ltd | Plant transcription factors, promoters and uses thereof |
BR102013002599B1 (pt) | 2012-02-01 | 2022-04-05 | Dow Agrosciences Llc | Molécula de ácido nucleico isolada ou recombinante, método para gerar uma célula vegetal tolerante a glifosato e usos da mesma |
US9644213B2 (en) | 2012-03-09 | 2017-05-09 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Method of enhancing plant drought tolerance by expression of NDR1 |
US9783814B2 (en) | 2012-03-13 | 2017-10-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
WO2013138309A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
UY34688A (es) | 2012-03-21 | 2013-09-30 | Basf Se | Adyuvante de mezcla en tanque líquido o particulado que comprende una base seleccionada de una mezcla de carbonato e hidrógenocarbonato |
IN2014DN08570A (cs) | 2012-03-21 | 2015-05-22 | Basf Se | |
AR093743A1 (es) | 2012-03-21 | 2015-06-24 | Basf Se | Adyuvante de mezcla en tanque que contiene glifosato que comprende una base seleccionada de un carbonato y/o fosfato |
UY34690A (es) | 2012-03-21 | 2013-09-30 | Basf Se | Adyuvante de mezcla de tanque que comprende un poliglucosido de alquilo y una base |
US8859857B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-10-14 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV259778 |
US8802935B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-08-12 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV942568 |
US8835720B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-09-16 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV967592 |
US8878009B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-11-04 | Monsanto Technology, LLP | Plants and seeds of spring canola variety SCV318181 |
CN102747013B (zh) * | 2012-05-22 | 2014-10-15 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3 |
UY34822A (es) | 2012-05-24 | 2013-12-31 | Seeds Ltd Ab | Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética |
BR112014031260A2 (pt) | 2012-06-15 | 2019-08-20 | Du Pont | métodos e composições que envolvem variantes de als com preferência de substrato nativo |
US10041087B2 (en) | 2012-06-19 | 2018-08-07 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
AR091489A1 (es) | 2012-06-19 | 2015-02-11 | Basf Se | Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo) |
AU2013279599A1 (en) | 2012-06-21 | 2015-01-15 | Basf Se | An aqueous composition comprising dicamba and a drift control agent |
EA026560B1 (ru) | 2012-07-03 | 2017-04-28 | Басф Се | Высококонцентрированный водный препарат, содержащий анионный пестицид и основание |
EP2869699A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-05-13 | BASF Corporation | Drift control agent comprising polypropylene glycol and a triblock polymer |
US9267739B2 (en) | 2012-07-18 | 2016-02-23 | Applied Materials, Inc. | Pedestal with multi-zone temperature control and multiple purge capabilities |
US9373517B2 (en) | 2012-08-02 | 2016-06-21 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing with DC assisted RF power for improved control |
US9034770B2 (en) | 2012-09-17 | 2015-05-19 | Applied Materials, Inc. | Differential silicon oxide etch |
US9023734B2 (en) | 2012-09-18 | 2015-05-05 | Applied Materials, Inc. | Radical-component oxide etch |
US9390937B2 (en) | 2012-09-20 | 2016-07-12 | Applied Materials, Inc. | Silicon-carbon-nitride selective etch |
US9132436B2 (en) | 2012-09-21 | 2015-09-15 | Applied Materials, Inc. | Chemical control features in wafer process equipment |
US20150259696A1 (en) | 2012-10-11 | 2015-09-17 | Shane E. Abbitt | Guard cell promoters and uses thereof |
EP2908620A4 (en) | 2012-10-18 | 2016-07-27 | Monsanto Technology Llc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING PHYTOPARASITES |
US8765574B2 (en) | 2012-11-09 | 2014-07-01 | Applied Materials, Inc. | Dry etch process |
US8969212B2 (en) | 2012-11-20 | 2015-03-03 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch selectivity |
US8980763B2 (en) | 2012-11-30 | 2015-03-17 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch for selective tungsten removal |
US9064816B2 (en) | 2012-11-30 | 2015-06-23 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch for selective oxidation removal |
US20140173781A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for producing and selecting transgenic wheat plants |
US9111877B2 (en) | 2012-12-18 | 2015-08-18 | Applied Materials, Inc. | Non-local plasma oxide etch |
BR112015015055A2 (pt) | 2012-12-21 | 2017-10-03 | Pioneer Hi Bred Int | Método para desintoxicar um herbicida análogo de auxina, método para controlar pelo menos uma erva em uma área de cultivo, método para testar uma resposta de planta a um ou mais compostos |
US8921234B2 (en) | 2012-12-21 | 2014-12-30 | Applied Materials, Inc. | Selective titanium nitride etching |
US10683505B2 (en) | 2013-01-01 | 2020-06-16 | Monsanto Technology Llc | Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression |
CN105358695B (zh) | 2013-01-01 | 2019-07-12 | A.B.种子有限公司 | 将dsRNA引入植物种子以调节基因表达的方法 |
US10000767B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-06-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
US10256079B2 (en) | 2013-02-08 | 2019-04-09 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing systems having multiple plasma configurations |
US9362130B2 (en) | 2013-03-01 | 2016-06-07 | Applied Materials, Inc. | Enhanced etching processes using remote plasma sources |
US9040422B2 (en) | 2013-03-05 | 2015-05-26 | Applied Materials, Inc. | Selective titanium nitride removal |
US8801952B1 (en) | 2013-03-07 | 2014-08-12 | Applied Materials, Inc. | Conformal oxide dry etch |
US10170282B2 (en) | 2013-03-08 | 2019-01-01 | Applied Materials, Inc. | Insulated semiconductor faceplate designs |
CN105263329B (zh) | 2013-03-13 | 2020-09-18 | 孟山都技术公司 | 用于杂草控制的方法和组合物 |
CN105074008A (zh) | 2013-03-13 | 2015-11-18 | 孟山都技术有限公司 | 用于杂草控制的方法和组合物 |
WO2014159306A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate application for weed control in brassica |
WO2014160122A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof |
CN105339380A (zh) | 2013-03-14 | 2016-02-17 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫害虫的组合物和方法 |
EP2970995A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use |
WO2014153242A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use |
US20140283211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and Compositions for Plant Pest Control |
US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US20140271097A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Applied Materials, Inc. | Processing systems and methods for halide scavenging |
WO2014143996A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides |
BR112015023709A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Pioneer Hi Bred Int | polipeptídeo phi-4, polinucleotídeo, composição, método para inibir o crescimento, método para controlar uma população, planta, semente, cassete de expressão, método para expressar em uma planta um polinucleotídeo, método para proteger uma planta, proteína de fusão |
US8895449B1 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-25 | Applied Materials, Inc. | Delicate dry clean |
US9114438B2 (en) | 2013-05-21 | 2015-08-25 | Applied Materials, Inc. | Copper residue chamber clean |
US9493879B2 (en) | 2013-07-12 | 2016-11-15 | Applied Materials, Inc. | Selective sputtering for pattern transfer |
BR112016000555B1 (pt) | 2013-07-19 | 2022-12-27 | Monsanto Technology Llc | Método para controlar uma infestação da espécie de leptinotarsa em uma planta, composição inseticida e construção de dna recombinante |
US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
US20160219812A1 (en) | 2013-07-25 | 2016-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for producing hybrid brassica seed |
CA2920591A1 (en) | 2013-08-12 | 2015-02-19 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
UY35701A (es) * | 2013-08-12 | 2015-02-27 | Basf Se | Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa (ppo) |
WO2015023846A2 (en) | 2013-08-16 | 2015-02-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
US9773648B2 (en) | 2013-08-30 | 2017-09-26 | Applied Materials, Inc. | Dual discharge modes operation for remote plasma |
BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
US8956980B1 (en) | 2013-09-16 | 2015-02-17 | Applied Materials, Inc. | Selective etch of silicon nitride |
AU2014334590A1 (en) | 2013-10-18 | 2016-04-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate-N-acetyltransferase (GLYAT) sequences and methods of use |
US20150113681A1 (en) * | 2013-10-23 | 2015-04-23 | Syngenta Participations Ag | Composition and method for enhancing plant transformation |
US20160272997A1 (en) | 2013-10-25 | 2016-09-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Stem canker tolerant soybeans and methods of use |
US8951429B1 (en) | 2013-10-29 | 2015-02-10 | Applied Materials, Inc. | Tungsten oxide processing |
US9909131B2 (en) | 2013-11-04 | 2018-03-06 | Dow Agrosciences Llc | Optimal soybean loci |
BR112016009963A2 (pt) | 2013-11-04 | 2017-12-05 | Beeologics Inc | composições e métodos para controlar artrópodes parasitas e infestações por praga |
US9576809B2 (en) | 2013-11-04 | 2017-02-21 | Applied Materials, Inc. | Etch suppression with germanium |
UA120502C2 (uk) | 2013-11-04 | 2019-12-26 | Дау Агросайєнсиз Елелсі | Спосіб отримання трансгенної рослини маїсу |
TWI671404B (zh) | 2013-11-04 | 2019-09-11 | 美商陶氏農業科學公司 | 最適玉米基因座(二) |
US9236265B2 (en) | 2013-11-04 | 2016-01-12 | Applied Materials, Inc. | Silicon germanium processing |
US9520303B2 (en) | 2013-11-12 | 2016-12-13 | Applied Materials, Inc. | Aluminum selective etch |
US9245762B2 (en) | 2013-12-02 | 2016-01-26 | Applied Materials, Inc. | Procedure for etch rate consistency |
US9117855B2 (en) | 2013-12-04 | 2015-08-25 | Applied Materials, Inc. | Polarity control for remote plasma |
UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
US9263278B2 (en) | 2013-12-17 | 2016-02-16 | Applied Materials, Inc. | Dopant etch selectivity control |
US9287095B2 (en) | 2013-12-17 | 2016-03-15 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor system assemblies and methods of operation |
CN106029890B (zh) * | 2013-12-18 | 2022-04-12 | 巴斯夫农业公司 | 对除草剂具有增强的耐受性的植物 |
US9190293B2 (en) | 2013-12-18 | 2015-11-17 | Applied Materials, Inc. | Even tungsten etch for high aspect ratio trenches |
TW201527314A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(三) |
TW201527312A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(一) |
TW201527316A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(五) |
TW201527313A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(二) |
CN105979770B (zh) | 2014-01-15 | 2019-07-05 | 孟山都技术公司 | 用于使用epsps多核苷酸的杂草控制的方法和组合物 |
US9287134B2 (en) | 2014-01-17 | 2016-03-15 | Applied Materials, Inc. | Titanium oxide etch |
US9396989B2 (en) | 2014-01-27 | 2016-07-19 | Applied Materials, Inc. | Air gaps between copper lines |
US9293568B2 (en) | 2014-01-27 | 2016-03-22 | Applied Materials, Inc. | Method of fin patterning |
US9385028B2 (en) | 2014-02-03 | 2016-07-05 | Applied Materials, Inc. | Air gap process |
WO2015120270A1 (en) | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Pioneer Hi Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
CN106536545A (zh) | 2014-02-07 | 2017-03-22 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
TW201538518A (zh) | 2014-02-28 | 2015-10-16 | Dow Agrosciences Llc | 藉由嵌合基因調控元件所賦予之根部特異性表現 |
US9499898B2 (en) | 2014-03-03 | 2016-11-22 | Applied Materials, Inc. | Layered thin film heater and method of fabrication |
US9299575B2 (en) | 2014-03-17 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Gas-phase tungsten etch |
US9299538B2 (en) | 2014-03-20 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Radial waveguide systems and methods for post-match control of microwaves |
US9299537B2 (en) | 2014-03-20 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Radial waveguide systems and methods for post-match control of microwaves |
US9136273B1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-15 | Applied Materials, Inc. | Flash gate air gap |
US9903020B2 (en) | 2014-03-31 | 2018-02-27 | Applied Materials, Inc. | Generation of compact alumina passivation layers on aluminum plasma equipment components |
BR112016022711A2 (pt) | 2014-04-01 | 2017-10-31 | Monsanto Technology Llc | composições e métodos para controle de pragas de inseto |
US9269590B2 (en) | 2014-04-07 | 2016-02-23 | Applied Materials, Inc. | Spacer formation |
US9309598B2 (en) | 2014-05-28 | 2016-04-12 | Applied Materials, Inc. | Oxide and metal removal |
US9847289B2 (en) | 2014-05-30 | 2017-12-19 | Applied Materials, Inc. | Protective via cap for improved interconnect performance |
US9406523B2 (en) | 2014-06-19 | 2016-08-02 | Applied Materials, Inc. | Highly selective doped oxide removal method |
US9378969B2 (en) | 2014-06-19 | 2016-06-28 | Applied Materials, Inc. | Low temperature gas-phase carbon removal |
CA2953347A1 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
US11807857B2 (en) | 2014-06-25 | 2023-11-07 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression |
EP3569067A3 (en) | 2014-06-26 | 2020-01-22 | BASF Agrochemical Products B.V. | Seed treatment with acetolactate synthase (als) inhibitors |
US9425058B2 (en) | 2014-07-24 | 2016-08-23 | Applied Materials, Inc. | Simplified litho-etch-litho-etch process |
CA2955842A1 (en) | 2014-07-29 | 2016-02-04 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
US9159606B1 (en) | 2014-07-31 | 2015-10-13 | Applied Materials, Inc. | Metal air gap |
US9496167B2 (en) | 2014-07-31 | 2016-11-15 | Applied Materials, Inc. | Integrated bit-line airgap formation and gate stack post clean |
US9378978B2 (en) | 2014-07-31 | 2016-06-28 | Applied Materials, Inc. | Integrated oxide recess and floating gate fin trimming |
US9165786B1 (en) | 2014-08-05 | 2015-10-20 | Applied Materials, Inc. | Integrated oxide and nitride recess for better channel contact in 3D architectures |
US9659753B2 (en) | 2014-08-07 | 2017-05-23 | Applied Materials, Inc. | Grooved insulator to reduce leakage current |
WO2016022516A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
US9553102B2 (en) | 2014-08-19 | 2017-01-24 | Applied Materials, Inc. | Tungsten separation |
US9355856B2 (en) | 2014-09-12 | 2016-05-31 | Applied Materials, Inc. | V trench dry etch |
CA2961733A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
US9368364B2 (en) | 2014-09-24 | 2016-06-14 | Applied Materials, Inc. | Silicon etch process with tunable selectivity to SiO2 and other materials |
US9355862B2 (en) | 2014-09-24 | 2016-05-31 | Applied Materials, Inc. | Fluorine-based hardmask removal |
US9613822B2 (en) | 2014-09-25 | 2017-04-04 | Applied Materials, Inc. | Oxide etch selectivity enhancement |
US9966240B2 (en) | 2014-10-14 | 2018-05-08 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for internal surface conditioning assessment in plasma processing equipment |
US9355922B2 (en) | 2014-10-14 | 2016-05-31 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for internal surface conditioning in plasma processing equipment |
MX2017004745A (es) | 2014-10-16 | 2017-10-20 | Pioner Hi-Bred Int Inc | Proteinas insecticidas y metodos de uso. |
EP3214938A1 (en) | 2014-11-07 | 2017-09-13 | Basf Se | Agrochemical adjuvant containing 2-oxo-1,3-dioxolan-4 carboxylates |
US11637002B2 (en) | 2014-11-26 | 2023-04-25 | Applied Materials, Inc. | Methods and systems to enhance process uniformity |
US9299583B1 (en) | 2014-12-05 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Aluminum oxide selective etch |
US10224210B2 (en) | 2014-12-09 | 2019-03-05 | Applied Materials, Inc. | Plasma processing system with direct outlet toroidal plasma source |
US10573496B2 (en) | 2014-12-09 | 2020-02-25 | Applied Materials, Inc. | Direct outlet toroidal plasma source |
WO2016099916A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
US9502258B2 (en) | 2014-12-23 | 2016-11-22 | Applied Materials, Inc. | Anisotropic gap etch |
WO2016109840A2 (en) | 2014-12-31 | 2016-07-07 | Synthetic Genomics, Inc. | Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing |
US9343272B1 (en) | 2015-01-08 | 2016-05-17 | Applied Materials, Inc. | Self-aligned process |
US11257693B2 (en) | 2015-01-09 | 2022-02-22 | Applied Materials, Inc. | Methods and systems to improve pedestal temperature control |
US9373522B1 (en) | 2015-01-22 | 2016-06-21 | Applied Mateials, Inc. | Titanium nitride removal |
UA124255C2 (uk) | 2015-01-22 | 2021-08-18 | Монсанто Текнолоджі Елелсі | Інсектицидна композиція та спосіб боротьби з leptinotarsa |
US9449846B2 (en) | 2015-01-28 | 2016-09-20 | Applied Materials, Inc. | Vertical gate separation |
US20160225652A1 (en) | 2015-02-03 | 2016-08-04 | Applied Materials, Inc. | Low temperature chuck for plasma processing systems |
US9728437B2 (en) | 2015-02-03 | 2017-08-08 | Applied Materials, Inc. | High temperature chuck for plasma processing systems |
US9881805B2 (en) | 2015-03-02 | 2018-01-30 | Applied Materials, Inc. | Silicon selective removal |
WO2016186986A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Pioneer Hi Bred International Inc | Insecticidal proteins and methods for their use |
CN107750125A (zh) | 2015-06-02 | 2018-03-02 | 孟山都技术有限公司 | 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法 |
US10655136B2 (en) | 2015-06-03 | 2020-05-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants |
CA2986265A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
AU2016280215B2 (en) * | 2015-06-17 | 2022-07-28 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
EP3331997B1 (en) | 2015-08-03 | 2024-01-24 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants |
US9741593B2 (en) | 2015-08-06 | 2017-08-22 | Applied Materials, Inc. | Thermal management systems and methods for wafer processing systems |
US9691645B2 (en) | 2015-08-06 | 2017-06-27 | Applied Materials, Inc. | Bolted wafer chuck thermal management systems and methods for wafer processing systems |
CN116003550A (zh) | 2015-08-06 | 2023-04-25 | 先锋国际良种公司 | 植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法 |
US9349605B1 (en) | 2015-08-07 | 2016-05-24 | Applied Materials, Inc. | Oxide etch selectivity systems and methods |
US10504700B2 (en) | 2015-08-27 | 2019-12-10 | Applied Materials, Inc. | Plasma etching systems and methods with secondary plasma injection |
US10378023B2 (en) | 2015-09-01 | 2019-08-13 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants |
CA3002995A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
EP4257694A3 (en) | 2015-12-22 | 2023-12-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
US11096344B2 (en) | 2016-02-05 | 2021-08-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic loci associated with brown stem rot resistance in soybean and methods of use |
CA3018384A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
US10504754B2 (en) | 2016-05-19 | 2019-12-10 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for improved semiconductor etching and component protection |
US10522371B2 (en) | 2016-05-19 | 2019-12-31 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for improved semiconductor etching and component protection |
EP3458591A1 (en) | 2016-05-20 | 2019-03-27 | BASF Agro B.V. | Dual transit peptides for targeting polypeptides |
CN117947200A (zh) | 2016-06-16 | 2024-04-30 | 纽希得营养澳大利亚私人有限公司 | 优良种事件油菜ns-b50027-4 |
CN116287385A (zh) | 2016-06-16 | 2023-06-23 | 纽希得营养澳大利亚私人有限公司 | 近交转基因油菜品系ns-b50027-4及其种子 |
EP3472323A1 (en) | 2016-06-16 | 2019-04-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
UA127388C2 (uk) | 2016-06-24 | 2023-08-09 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Регуляторний елемент рослини і спосіб його застосування |
WO2018005589A1 (en) | 2016-06-28 | 2018-01-04 | Cellectis | Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences |
US9865484B1 (en) | 2016-06-29 | 2018-01-09 | Applied Materials, Inc. | Selective etch using material modification and RF pulsing |
EP3478052B1 (en) | 2016-07-01 | 2021-08-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
US11149030B2 (en) | 2016-07-27 | 2021-10-19 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
WO2018022777A1 (en) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for gene expression in plants |
AR109292A1 (es) | 2016-08-05 | 2018-11-14 | Ricetec Ag | Métodos y composiciones para combinaciones de mutaciones asociadas con la resistencia / tolerancia a herbicidas en el arroz |
US10629473B2 (en) | 2016-09-09 | 2020-04-21 | Applied Materials, Inc. | Footing removal for nitride spacer |
US10062575B2 (en) | 2016-09-09 | 2018-08-28 | Applied Materials, Inc. | Poly directional etch by oxidation |
US10062585B2 (en) | 2016-10-04 | 2018-08-28 | Applied Materials, Inc. | Oxygen compatible plasma source |
US10546729B2 (en) | 2016-10-04 | 2020-01-28 | Applied Materials, Inc. | Dual-channel showerhead with improved profile |
US9934942B1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-03 | Applied Materials, Inc. | Chamber with flow-through source |
US9721789B1 (en) | 2016-10-04 | 2017-08-01 | Applied Materials, Inc. | Saving ion-damaged spacers |
US10062579B2 (en) | 2016-10-07 | 2018-08-28 | Applied Materials, Inc. | Selective SiN lateral recess |
US9947549B1 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-17 | Applied Materials, Inc. | Cobalt-containing material removal |
BR112019008800A2 (pt) | 2016-11-01 | 2019-07-16 | Pioneer Hi Bred Int | polipeptídeo inseticida, composição inseticida, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, célula de planta ou planta transgênica, método para inibir o crescimento ou exterminar uma população de praga de inseto agrícola, método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto, método para controlar infestação de inseto lepidoptera e/ou coleoptera em uma planta transgênica e fornecer gerenciamento de resistência de inseto e uso de pelo menos um polipeptídeo inseticida |
US10163696B2 (en) | 2016-11-11 | 2018-12-25 | Applied Materials, Inc. | Selective cobalt removal for bottom up gapfill |
US9768034B1 (en) | 2016-11-11 | 2017-09-19 | Applied Materials, Inc. | Removal methods for high aspect ratio structures |
US10242908B2 (en) | 2016-11-14 | 2019-03-26 | Applied Materials, Inc. | Airgap formation with damage-free copper |
US10026621B2 (en) | 2016-11-14 | 2018-07-17 | Applied Materials, Inc. | SiN spacer profile patterning |
EA201991300A1 (ru) | 2016-12-20 | 2019-12-30 | Басф Агро Б.В. | Растения, обладающие повышенной толерантностью к гербицидам |
US10566206B2 (en) | 2016-12-27 | 2020-02-18 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for anisotropic material breakthrough |
US10431429B2 (en) | 2017-02-03 | 2019-10-01 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for radial and azimuthal control of plasma uniformity |
US10403507B2 (en) | 2017-02-03 | 2019-09-03 | Applied Materials, Inc. | Shaped etch profile with oxidation |
US10043684B1 (en) | 2017-02-06 | 2018-08-07 | Applied Materials, Inc. | Self-limiting atomic thermal etching systems and methods |
US10319739B2 (en) | 2017-02-08 | 2019-06-11 | Applied Materials, Inc. | Accommodating imperfectly aligned memory holes |
US10943834B2 (en) | 2017-03-13 | 2021-03-09 | Applied Materials, Inc. | Replacement contact process |
US10319649B2 (en) | 2017-04-11 | 2019-06-11 | Applied Materials, Inc. | Optical emission spectroscopy (OES) for remote plasma monitoring |
US11109591B2 (en) | 2017-04-24 | 2021-09-07 | Taminco Bvba | Single phase liquids of alkanolamine salts of dicamba |
US11276590B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-03-15 | Applied Materials, Inc. | Multi-zone semiconductor substrate supports |
US11276559B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-03-15 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing chamber for multiple precursor flow |
US10049891B1 (en) | 2017-05-31 | 2018-08-14 | Applied Materials, Inc. | Selective in situ cobalt residue removal |
US10497579B2 (en) | 2017-05-31 | 2019-12-03 | Applied Materials, Inc. | Water-free etching methods |
US10920320B2 (en) | 2017-06-16 | 2021-02-16 | Applied Materials, Inc. | Plasma health determination in semiconductor substrate processing reactors |
US10541246B2 (en) | 2017-06-26 | 2020-01-21 | Applied Materials, Inc. | 3D flash memory cells which discourage cross-cell electrical tunneling |
US10727080B2 (en) | 2017-07-07 | 2020-07-28 | Applied Materials, Inc. | Tantalum-containing material removal |
US10541184B2 (en) | 2017-07-11 | 2020-01-21 | Applied Materials, Inc. | Optical emission spectroscopic techniques for monitoring etching |
US10354889B2 (en) | 2017-07-17 | 2019-07-16 | Applied Materials, Inc. | Non-halogen etching of silicon-containing materials |
US10170336B1 (en) | 2017-08-04 | 2019-01-01 | Applied Materials, Inc. | Methods for anisotropic control of selective silicon removal |
US10043674B1 (en) | 2017-08-04 | 2018-08-07 | Applied Materials, Inc. | Germanium etching systems and methods |
US10297458B2 (en) | 2017-08-07 | 2019-05-21 | Applied Materials, Inc. | Process window widening using coated parts in plasma etch processes |
EP3688171A1 (en) | 2017-09-25 | 2020-08-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
US10283324B1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-07 | Applied Materials, Inc. | Oxygen treatment for nitride etching |
US10128086B1 (en) | 2017-10-24 | 2018-11-13 | Applied Materials, Inc. | Silicon pretreatment for nitride removal |
IL274683B (en) | 2017-11-29 | 2022-09-01 | Basf Se | Plants with increased resistance to herbicides |
US10256112B1 (en) | 2017-12-08 | 2019-04-09 | Applied Materials, Inc. | Selective tungsten removal |
CA3026528A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-15 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for ppo herbicide tolerance |
US10903054B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-01-26 | Applied Materials, Inc. | Multi-zone gas distribution systems and methods |
US11328909B2 (en) | 2017-12-22 | 2022-05-10 | Applied Materials, Inc. | Chamber conditioning and removal processes |
US10854426B2 (en) | 2018-01-08 | 2020-12-01 | Applied Materials, Inc. | Metal recess for semiconductor structures |
US10964512B2 (en) | 2018-02-15 | 2021-03-30 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing chamber multistage mixing apparatus and methods |
US10679870B2 (en) | 2018-02-15 | 2020-06-09 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing chamber multistage mixing apparatus |
TWI766433B (zh) | 2018-02-28 | 2022-06-01 | 美商應用材料股份有限公司 | 形成氣隙的系統及方法 |
US10593560B2 (en) | 2018-03-01 | 2020-03-17 | Applied Materials, Inc. | Magnetic induction plasma source for semiconductor processes and equipment |
US10319600B1 (en) | 2018-03-12 | 2019-06-11 | Applied Materials, Inc. | Thermal silicon etch |
US10497573B2 (en) | 2018-03-13 | 2019-12-03 | Applied Materials, Inc. | Selective atomic layer etching of semiconductor materials |
CN111867377B (zh) | 2018-03-14 | 2023-05-23 | 先锋国际良种公司 | 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 |
BR112020018675A2 (pt) | 2018-03-14 | 2021-01-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Proteínas inseticidas de plantas e métodos para a sua utilização |
US10573527B2 (en) | 2018-04-06 | 2020-02-25 | Applied Materials, Inc. | Gas-phase selective etching systems and methods |
US10490406B2 (en) | 2018-04-10 | 2019-11-26 | Appled Materials, Inc. | Systems and methods for material breakthrough |
US10699879B2 (en) | 2018-04-17 | 2020-06-30 | Applied Materials, Inc. | Two piece electrode assembly with gap for plasma control |
US10886137B2 (en) | 2018-04-30 | 2021-01-05 | Applied Materials, Inc. | Selective nitride removal |
BR112020023800A2 (pt) | 2018-05-22 | 2021-02-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos |
BR112020026640A2 (pt) | 2018-06-28 | 2021-04-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Métodos para selecionar plantas transformadas |
US10872778B2 (en) | 2018-07-06 | 2020-12-22 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods utilizing solid-phase etchants |
US10755941B2 (en) | 2018-07-06 | 2020-08-25 | Applied Materials, Inc. | Self-limiting selective etching systems and methods |
US10672642B2 (en) | 2018-07-24 | 2020-06-02 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for pedestal configuration |
US11049755B2 (en) | 2018-09-14 | 2021-06-29 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor substrate supports with embedded RF shield |
US10892198B2 (en) | 2018-09-14 | 2021-01-12 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for improved performance in semiconductor processing |
US11062887B2 (en) | 2018-09-17 | 2021-07-13 | Applied Materials, Inc. | High temperature RF heater pedestals |
US11417534B2 (en) | 2018-09-21 | 2022-08-16 | Applied Materials, Inc. | Selective material removal |
US11682560B2 (en) | 2018-10-11 | 2023-06-20 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for hafnium-containing film removal |
US11121002B2 (en) | 2018-10-24 | 2021-09-14 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for etching metals and metal derivatives |
US11653588B2 (en) | 2018-10-26 | 2023-05-23 | Deere & Company | Yield map generation and control system |
US11240961B2 (en) | 2018-10-26 | 2022-02-08 | Deere & Company | Controlling a harvesting machine based on a geo-spatial representation indicating where the harvesting machine is likely to reach capacity |
US11641800B2 (en) | 2020-02-06 | 2023-05-09 | Deere & Company | Agricultural harvesting machine with pre-emergence weed detection and mitigation system |
US11467605B2 (en) | 2019-04-10 | 2022-10-11 | Deere & Company | Zonal machine control |
US11672203B2 (en) | 2018-10-26 | 2023-06-13 | Deere & Company | Predictive map generation and control |
US11178818B2 (en) | 2018-10-26 | 2021-11-23 | Deere & Company | Harvesting machine control system with fill level processing based on yield data |
US11957072B2 (en) | 2020-02-06 | 2024-04-16 | Deere & Company | Pre-emergence weed detection and mitigation system |
US11589509B2 (en) | 2018-10-26 | 2023-02-28 | Deere & Company | Predictive machine characteristic map generation and control system |
US11079725B2 (en) | 2019-04-10 | 2021-08-03 | Deere & Company | Machine control using real-time model |
US20210395758A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for ochrobactrum-mediated plant transformation |
US11437242B2 (en) | 2018-11-27 | 2022-09-06 | Applied Materials, Inc. | Selective removal of silicon-containing materials |
US11721527B2 (en) | 2019-01-07 | 2023-08-08 | Applied Materials, Inc. | Processing chamber mixing systems |
US10920319B2 (en) | 2019-01-11 | 2021-02-16 | Applied Materials, Inc. | Ceramic showerheads with conductive electrodes |
US11778945B2 (en) | 2019-04-10 | 2023-10-10 | Deere & Company | Machine control using real-time model |
US11234366B2 (en) | 2019-04-10 | 2022-02-01 | Deere & Company | Image selection for machine control |
WO2021043642A1 (en) | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Basf Se | Polymers for spray drift control of pesticide spray |
AU2020381748A1 (en) | 2019-11-15 | 2022-05-26 | Basf Corporation | Methods of using a composition comprising an anionic pesticide and a buffer |
US12035648B2 (en) | 2020-02-06 | 2024-07-16 | Deere & Company | Predictive weed map generation and control system |
US11477940B2 (en) | 2020-03-26 | 2022-10-25 | Deere & Company | Mobile work machine control based on zone parameter modification |
CN111423990B (zh) * | 2020-04-10 | 2021-08-27 | 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 | 一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法 |
EP4164382A1 (en) | 2020-06-15 | 2023-04-19 | Basf Se | A stable, solvent-free, self-emulsifiable concentrate |
BR112022027035A2 (pt) | 2020-07-14 | 2023-04-11 | Pioneer Hi Bred Int | Proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas |
CA3191142A1 (en) | 2020-08-26 | 2022-03-03 | Vindara, Inc. | Method and/or compositions for lettuce (lactuca sativa) breeding and/or varieties developed thereby |
US11474523B2 (en) | 2020-10-09 | 2022-10-18 | Deere & Company | Machine control using a predictive speed map |
US11844311B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-19 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11983009B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-05-14 | Deere & Company | Map generation and control system |
US11946747B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-04-02 | Deere & Company | Crop constituent map generation and control system |
US11825768B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-11-28 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11849671B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-26 | Deere & Company | Crop state map generation and control system |
US11727680B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-08-15 | Deere & Company | Predictive map generation based on seeding characteristics and control |
US11711995B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-08-01 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11845449B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-19 | Deere & Company | Map generation and control system |
US11675354B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-06-13 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11650587B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-05-16 | Deere & Company | Predictive power map generation and control system |
US11592822B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-02-28 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11871697B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-01-16 | Deere & Company | Crop moisture map generation and control system |
US11895948B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-02-13 | Deere & Company | Predictive map generation and control based on soil properties |
US11849672B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-26 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11874669B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-01-16 | Deere & Company | Map generation and control system |
US11635765B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-04-25 | Deere & Company | Crop state map generation and control system |
US11889788B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-02-06 | Deere & Company | Predictive biomass map generation and control |
US11864483B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-01-09 | Deere & Company | Predictive map generation and control system |
US12013245B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-06-18 | Deere & Company | Predictive map generation and control system |
US11927459B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-03-12 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11889787B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-02-06 | Deere & Company | Predictive speed map generation and control system |
CN116568673A (zh) | 2020-11-24 | 2023-08-08 | 先正达农作物保护股份公司 | 除草化合物 |
WO2022206580A1 (zh) * | 2021-04-02 | 2022-10-06 | 青岛清原化合物有限公司 | 对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽及应用 |
AU2022253338A1 (en) | 2021-04-07 | 2023-10-12 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compounds |
CA3221821A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Philip Matthew JOYCE | Herbicidal compositions |
AU2022309104A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-12-07 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compositions |
JP2024522912A (ja) | 2021-07-09 | 2024-06-21 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 除草剤組成物 |
AU2022308318A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-12-07 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compositions |
WO2023031161A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Plants having increased tolerance to herbicides |
AR127152A1 (es) | 2021-09-27 | 2023-12-20 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Plantas de girasol no transgénicas que tienen tolerancia aumentada a herbicidas |
WO2023169984A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compounds |
US12058951B2 (en) | 2022-04-08 | 2024-08-13 | Deere & Company | Predictive nutrient map and control |
WO2023222589A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compounds |
WO2024012968A1 (en) | 2022-07-13 | 2024-01-18 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal pyrimidinone derivatives |
WO2024020360A1 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Pairwise Plants Services, Inc. | Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc' |
WO2024132649A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compositions |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT89915B (pt) | 1988-03-08 | 1994-10-31 | Ciba Geigy Ag | Processo para a preparacao de sequencias de dna regulaveis quimicamente |
EP0360750A3 (en) * | 1988-09-22 | 1991-01-02 | Ciba-Geigy Ag | Novel herbicide tolerant plants |
US5693507A (en) | 1988-09-26 | 1997-12-02 | Auburn University | Genetic engineering of plant chloroplasts |
CN1039283C (zh) * | 1988-12-12 | 1998-07-29 | Fmc公司 | 卟啉的应用 |
NZ231658A (en) * | 1988-12-12 | 1992-05-26 | Fmc Corp | Inhibitors of protoporphyrinogen oxidase and compositions for killing tumour cells |
NZ237549A (en) | 1990-03-23 | 1993-06-25 | Gist Brocades Nv | Production of enhanced levels of enzymes in the seeds of transgenic plants and the use of these seeds |
GB9009307D0 (en) | 1990-04-25 | 1990-06-20 | Ici Plc | Dna,constructs,cells and plant derived therefrom |
US5451513A (en) | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
IL98405A0 (en) * | 1990-06-11 | 1992-07-15 | Fmc Corp | Pharmaceutical compositions containing enzyme inhibiting agents |
DK162790D0 (da) | 1990-07-06 | 1990-07-06 | Novo Nordisk As | Plantecelle |
IE913215A1 (en) | 1990-09-13 | 1992-02-25 | Gist Brocades Nv | Transgenic plants having a modified carbohydrate content |
US5290926A (en) * | 1990-09-14 | 1994-03-01 | Ciba-Geigy Corporation | Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase |
CA2087036A1 (en) * | 1991-05-09 | 1992-11-10 | Mitchell C. Tarczynski | Transgenic plants with altered polyol content |
US5409823A (en) | 1992-09-24 | 1995-04-25 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for the production of hybrid seed |
US5693506A (en) | 1993-11-16 | 1997-12-02 | The Regents Of The University Of California | Process for protein production in plants |
US5576198A (en) | 1993-12-14 | 1996-11-19 | Calgene, Inc. | Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids |
GB9401780D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-03-23 | Nickerson Biocem Ltd | Modified plants |
US5545817A (en) | 1994-03-11 | 1996-08-13 | Calgene, Inc. | Enhanced expression in a plant plastid |
US5530191A (en) | 1994-03-24 | 1996-06-25 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Method for producing cytoplasmic male sterility in plants and use thereof in production of hybrid seed |
US5767373A (en) * | 1994-06-16 | 1998-06-16 | Novartis Finance Corporation | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
US6023012A (en) * | 1996-02-28 | 2000-02-08 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase |
US5939602A (en) * | 1995-06-06 | 1999-08-17 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof |
US5608144A (en) | 1994-08-12 | 1997-03-04 | Dna Plant Technology Corp. | Plant group 2 promoters and uses thereof |
US6020312A (en) * | 1994-09-13 | 2000-02-01 | Nce Pharmaceuticals, Inc. | Synthetic antibiotics |
US6084155A (en) * | 1995-06-06 | 2000-07-04 | Novartis Ag | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
WO1997004088A1 (en) | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene |
US6472586B1 (en) | 1995-08-10 | 2002-10-29 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Nuclear-encoded transcription system in plastids of higher plants |
JP2000506011A (ja) | 1996-02-28 | 2000-05-23 | ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト | 植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーター |
US6376744B1 (en) | 1996-03-06 | 2002-04-23 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Plastid transformation in Arabidopsis thaliana |
-
1995
- 1995-06-06 US US08/472,028 patent/US5767373A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-08 RO ROA200300143A patent/RO122046B1/ro unknown
- 1995-06-08 ES ES95918724T patent/ES2239757T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-08 PT PT95918724T patent/PT769059E/pt unknown
- 1995-06-08 DK DK95918724T patent/DK0769059T3/da active
- 1995-06-08 CN CNB951936298A patent/CN100432229C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-08 PL PL95344457A patent/PL183091B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 SK SK1610-96A patent/SK284895B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 AT AT95918724T patent/ATE296888T1/de active
- 1995-06-08 EP EP95918724A patent/EP0769059B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-08 PL PL95350720A patent/PL186842B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 PL PL95317759A patent/PL184242B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 RO RO96-02348A patent/RO120003B1/ro unknown
- 1995-06-08 MX MX9606459A patent/MX237061B/es active IP Right Grant
- 1995-06-08 AU AU24538/95A patent/AU706763B2/en not_active Ceased
- 1995-06-08 HU HU9603175A patent/HUT76353A/hu not_active Application Discontinuation
- 1995-06-08 CZ CZ19963674A patent/CZ295884B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 CZ CZ2002620A patent/CZ296023B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 RO ROA200300280A patent/RO121886B1/ro unknown
- 1995-06-08 BR BR9508030A patent/BR9508030A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 WO PCT/IB1995/000452 patent/WO1995034659A1/en active IP Right Grant
- 1995-06-08 RU RU2001130932/13A patent/RU2266332C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 RU RU97100774/13A patent/RU2192468C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 JP JP50137096A patent/JP3673925B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-08 CA CA2189349A patent/CA2189349C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-08 DE DE69534247T patent/DE69534247T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-06 UA UA97010166A patent/UA71536C2/uk unknown
-
1996
- 1996-12-11 FI FI964958A patent/FI964958A/fi unknown
-
1997
- 1997-01-06 BG BG101115A patent/BG64394B1/bg unknown
-
1998
- 1998-01-29 US US09/015,683 patent/US6288306B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 US US09/071,296 patent/US6177245B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-12 US US09/191,998 patent/US6307129B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-19 US US09/196,268 patent/US6282837B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-23 AU AU50101/99A patent/AU750445B2/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-03-21 CN CNB011118377A patent/CN1193096C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-03-29 CN CNB011121262A patent/CN1263856C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-02-22 HK HK02101331.4A patent/HK1039794B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6288306B1 (en) | Methods of selecting plants, plant tissue or plant cells resistant to a protoporphyrinogen oxidase inhibitor | |
JP3961570B2 (ja) | 植物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするdna分子およびその阻害物質耐性突然変異体 | |
US6308458B1 (en) | Herbicide-tolerant plants and methods of controlling the growth of undesired vegetation | |
US6808904B2 (en) | Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling | |
AU5536000A (en) | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase | |
WO2001068826A2 (en) | Protoporphyrinogen oxidase ('protox') genes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20140608 |