CN115427554A - 扩增t细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

一种扩增γδT细胞的体外方法，包括从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞、在存在氨基二膦酸盐和/或饲养细胞和至少一种细胞因子的情况下激活分离的γδT细胞、扩增激活的γδT细胞，以及任选地重新刺激扩增的γδT细胞。

Description

扩增T细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法
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背景
1.领域
本公开内容涉及T细胞的扩增和激活。一方面，本公开内容涉及可用于转基因表达的γδT细胞的扩增和激活。另一方面，本公开内容涉及γδT细胞的扩增和激活，同时耗尽α-和/或β-TCR阳性细胞。本公开内容还提供了包含扩增的γδT细胞和耗尽或减少α-和/或β-TCR阳性细胞的T细胞群。本公开还提供了使用所公开T细胞群的方法。
2.背景
γδT细胞代表表达γδTCR而非αβTCR的T细胞子集。γδT细胞可分为两个主要子集-组织结合的Vδ2阴性细胞和外周循环的Vδ2阳性细胞，更具体地说是Vγ9δ2。两个子集已被证明都具有抗病毒和抗肿瘤活性。与常规表达αβTCR的细胞不同，表达γδTCR的细胞识别其靶标而不依赖于经典的MHC I和II。与自然杀伤(NK)T细胞相似，γδT细胞表达NKG2D，其结合于非经典MHC分子，即，存在于受压细胞和/或肿瘤细胞上的MHC I类多肽相关序列A(MICA)和MHC I类多肽相关序列B(MICB)。γδTCR识别多种配体，例如，应激和/或肿瘤相关的磷酸抗原。γδT细胞通过多种机制(即TRAIL、FasL、穿孔素和颗粒酶分泌)介导其靶标的直接细胞溶解。此外，表达CD16的γδT细胞增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
γδΤ细胞(外周血中可能通常仅存在1％至5％的量)的一个问题是不能确保有足以用于医学治疗的γδΤ细胞的纯度和数量，尤其是收集少量血液，然后自其激活和/或增殖细胞时。增加患者采集血液量以确保足以用于医学治疗的γδΤ细胞的纯度和数量也带来了一个问题，即它给患者带来了很大的负担。
仍然需要能够制备足够数量的γδT细胞作为商业上可行的治疗产品的方法。权利要求中描述的实施方案提供了该技术问题的解决方案。
简要概述
本申请提供了一种扩增γδT细胞的方法，包括从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞、在存在饲养细胞和至少一种细胞因子的情况下激活分离的γδT细胞、以及扩增激活的γδT细胞。
本公开进一步提供了一种扩增γδT细胞的方法，包括从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞、在存在至少一种细胞因子和1)氨基二膦酸盐，2)饲养细胞或3)氨基二膦酸盐和饲养细胞其中之一或多项的情况下激活分离的γδT细胞、扩增激活的γδT细胞、以及重新刺激扩增的γδT细胞。
一方面，血液样本包含白细胞分离产物。
一方面，血液样本包含外周血单核细胞(PBMC)。
在某些方面，激活在存在氨基二膦酸盐的情况下进行。
在某些方面，氨基二膦酸盐包括帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其盐和/或其水合物。
在某些方面，氨基二膦酸盐包括唑来膦酸。
在某些方面，所述至少一种细胞因子选自白介素(IL)-1、IL-2、IL-12、IL-18、IL-15、IL-21、干扰素(IFN)-α和IFN-β组成的组。
在某些方面，所述至少一种细胞因子包括IL-2和IL-15。
一方面，分离包括使血液样本与抗α和抗βT细胞受体(TCR)抗体接触，并从血液样本中耗尽α-和/或β-TCR阳性细胞。
一方面，饲养细胞为肿瘤细胞或类淋巴母细胞系。
在某些方面，肿瘤细胞为K562细胞。
在某些方面，肿瘤细胞为包含至少一种重组蛋白的工程改造肿瘤细胞。
在某些方面，至少一种重组蛋白选自CD86、4-1BBL、IL-15及其任何组合组成的组。
在某些方面，IL-15为膜结合IL-15。
在某些方面，所述至少一种重组蛋白为4-1BBL和/或膜结合IL-15。
在某些方面，饲养细胞接受辐照。
在某些方面，分离的γδT细胞和饲养细胞以约1:1至约50:1(饲养细胞：分离的γδT细胞)的比例混合。在某些方面，分离的γδT细胞和饲养细胞以约2:1至约20:1(饲养细胞：分离的γδT细胞)的比例存在。在某些方面，分离的γδT细胞和饲养细胞以约1:1、约1:5:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1或约50:1(饲养细胞:分离的γδT细胞)的比例存在。
一方面，本申请的方法进一步包括在扩增之前，用重组病毒载体转导激活的γδT细胞。
一方面，扩增在不存在氨基二膦酸盐且存在至少一种细胞因子(例如IL-2和/或IL-15)的情况下进行。
在某些方面，本公开的方法包括重新刺激扩增的γδT细胞。
在某些方面，重新刺激包括使扩增的γδT细胞与另外的饲养细胞接触，所述另外的饲养细胞可与激活期间使用的饲养细胞相同或不同(如果存在)。
在某些方面，扩增的γδT细胞和另外的饲养细胞以约1:1至约50:1(另外的饲养细胞：扩增的γδT细胞)的比例混合。在某些方面，扩增的γδT细胞和另外的饲养细胞以约2:1至约20:1(另外的饲养细胞：扩增的γδT细胞)的比例存在。在某些方面，扩增的γδT细胞和另外的饲养细胞以约1:1、约1.5:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1或约50:1(另外的饲养细胞：扩增的γδT细胞)的比例存在。
一方面，另外的饲养细胞选自由单核细胞、PBMC及其组合组成的组。
在某些方面，另外的饲养细胞对人体受试者为自体细胞。
在某些方面，另外的饲养细胞对人体受试者为同种异体细胞。
在某些方面，另外的饲养细胞经耗尽αβT细胞。
在某些方面，另外的饲养细胞在重新刺激之前与氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)接触或用其进行脉冲处理。
一方面，另外的饲养细胞为肿瘤细胞或类淋巴母细胞细胞系。
在某些方面，肿瘤细胞为K562细胞。
在某些方面，肿瘤细胞为包含至少一种重组蛋白的工程改造肿瘤细胞。
在某些方面，至少一种重组蛋白选自由CD86、4-1BBL、IL-15及其任何组合组成的组。
在某些方面，IL-15为膜结合IL-15。
在某些方面，另外的饲养细胞接受辐照。
一方面，本申请涉及通过本公开的方法制备的扩增γδT细胞群，其中扩增γδT细胞的浓度为至少约1x 105个细胞/ml、至少约1x 106个细胞/ml、至少约1x 107个细胞/ml、至少约1x 108个细胞/ml或至少约1x 109个细胞/ml。
一方面，本申请涉及一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的通过本公开内容的方法制备的扩增γδT细胞。
一方面，癌症选自由急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(如：小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(如：非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合症、骨髓增生异常综合症、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤组成的组。
一方面，癌症是黑色素瘤。
一方面，本申请涉及一种治疗传染性疾病的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的通过本公开内容的方法制备的扩增γδT细胞。
一方面，传染性疾病选自由登革热、埃博拉、马尔堡病毒、结核病(TB)、脑膜炎和梅毒组成的组。
一方面，本申请涉及一种治疗自体免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的通过本公开内容的方法制备的扩增γδT细胞。
一方面，自体免疫性疾病选自由关节炎、慢性阻塞性肺疾病、强直性脊柱炎、克罗恩病(两种特发性炎症性肠道疾病“IBD”中的一种)、皮肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、Goodpasture氏综合症、Graves氏病、格林-巴厘综合症(GBS)、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、原发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、硬斑病、重症肌无力、嗜睡症、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、精神分裂症、硬皮病、干燥综合症、僵人综合症、颞动脉炎(也称作为“巨细胞动脉炎”)、溃疡性结肠炎(两种特发性炎症性肠道疾病“IBD”中的一种)、脉管炎、白斑病以及韦格纳肉芽肿组成的组。
一方面，本申请涉及一种制备γδT细胞的方法，其包括从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞，在不存在饲养细胞的情况下激活分离的γδT细胞，将含有编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体引入激活的γδT细胞中，以及在存在饲养细胞的情况下扩增转导的γδT细胞。
另一方面，可以在存在至少一种选自白介素(IL)-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、干扰素(IFN)-α和IFN-β组成的组中的细胞因子的情况下，进行激活、转导和/或扩增。
另一方面，饲养细胞可以为人细胞、非人细胞、病毒感染细胞、非病毒感染细胞、细胞提取物、颗粒、珠、丝或其组合。
另一方面，饲养细胞可以包括外周血单核细胞(PBMC)和/或类淋巴母细胞(LCL)。
另一方面，可在存在OKT3的情况下进行激活、转导和/或扩增。
另一方面，扩增的γδT细胞可以包括δ1和/或δ2T细胞。
另一方面，载体可以为病毒载体或非病毒载体。
另一方面，载体可以包括编码TCR的核酸和编码CD8αβ或CD8α的核酸。
附图简要说明
专利或申请档包含至少一个彩色画出的附图。在接到要求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开档的副本。
为了进一步理解本公开的本质、目的和优点，应参考以下详细描述并结合以下附图，其中类似的元件符号表示类似的元件。
图1显示了根据本公开内容实施方案的同种异体T细胞疗法。同种异体T细胞疗法可能包括从健康供体收集γδT细胞，通过病毒转导相关外源基因(如外源性TCR)进行γδT细胞工程改造，然后进行细胞扩增、收获扩增的工程改造γδT细胞，这些细胞在输注入患者之前可冷冻保存为T细胞产品。
图2显示了根据本公开内容实施方案的γδT细胞制造。γδT细胞的制造可能包括收集或获得白细胞或PBMC(例如，白细胞分离产物)，从PBMC或白细胞分离产物中耗尽αβT细胞，然后激活、转导、扩增γδT细胞，可选为重新刺激γδT细胞。
图3A和3B显示了用自体单核细胞重新刺激对γδT细胞扩增的影响。图3A显示了重新刺激过程。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。第3天，模拟转导激活的γδT细胞。第4天，扩增模拟转导的细胞。第7天，用在存在ZOL(100μM)的情况下从PBMC(Miltenyi)进行CD14+选择而获得的自体单核细胞以10(单核细胞)：1(γδT细胞)的比例重新刺激扩增细胞4小时。
图3B显示了与无重新刺激的情况相比，用单核细胞重新刺激增加了从两个供体(D1和D2)获得的γδT细胞的倍数扩增。10天后，重新刺激的细胞倍数扩增减少。到14天时，重新刺激细胞的倍数扩增降至类似无重新刺激的倍数扩增。
图4A和4B显示了用经辐照的自体单核细胞重新刺激对γδT细胞扩增的影响。图4A显示了重新刺激过程。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。第2天，模拟转导激活的γδT细胞。第3天，扩增模拟转导的细胞。第7天，用在存在ZOL(100μM)4小时的情况下经辐照(100Gy)的自体αβ-TCR表达T细胞耗尽的PBMC重新刺激扩增的细胞，比例为5：1或10：1(αβ-TCR表达T细胞耗尽的PBMC：γδT细胞)。
图4B显示了与无重新刺激的情况相比，用αβ-TCR表达T细胞耗尽的PBMC以5：1和10：1的比例重新刺激，增加了从两个供体(D1和D2)获得的γδT细胞的倍数扩增。
图5显示了用于生成图6-11中所呈列资料的扩增过程。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。第2天，模拟转导激活的γδT细胞。第3天，扩增模拟转导的细胞。第7天和第14天，用以下其中之一重新刺激扩增细胞：1)自体单核细胞(通过从PBMC(Miltenyi)进行CD14+选择以及用ZOL(100μM)脉冲处理4小时而获得)，比例5：1或10：1(单核细胞：γδT细胞)；或2)经辐照(100Gy)的自体αβ-TCR表达T细胞耗尽的PBMC(用ZOL(100μM)脉冲处理4小时)，比例10：1或20：1(αβ耗尽的PBMC：γδT细胞)。
图6A和6B显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对来自两个供体(D1(图6A)和D2(图6B))的γδT细胞扩增的影响。γδT细胞的激活和扩增如图5所示。
图7A-7C显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对来自一个供体的γδT细胞扩增的影响。γδT细胞的激活和扩增如图5所示。图7A显示了总γδT细胞的倍数扩增，图7B显示了δ2T细胞的倍数扩增，图7C显示了δ1T细胞的倍数扩增。
图8A-8C显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对来自第二个供体的γδT细胞扩增的影响。γδT细胞的激活和扩增如图5所示。图8A显示了总γδT细胞的倍数扩增，图8B显示了δ2T细胞的倍数扩增，图8C显示了δ1T细胞的倍数扩增。
图9显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激不会显著改变扩增γδT细胞的记忆表型。来自一个供体的γδT细胞的激活和扩增如图5所示，于第21天收获，并通过流式细胞仪分析，以通过检测细胞表面上的CD45、CD27和CCR7来确定记忆表型。在用10：1单核细胞重新刺激的扩增γδT细胞中检测到CD27表达略有增加。
图10显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激不会显著改变扩增γδT细胞的记忆表型。来自第二个供体的γδT细胞的激活和扩增如图5所示，于第21天收获，并通过流式细胞仪分析，以通过检测细胞表面上的CD45、CD27和CCR7来确定记忆表型。在用10：1单核细胞重新刺激的扩增γδT细胞中检测到CD27表达略有增加。
图11A和11B显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对扩增γδT细胞的生存力影响。来自两个供体的δT细胞的激活和扩增如图5所示，于第21天收获，并通过流式细胞仪分析，以确定活细胞在总γδT细胞群中所占的百分比。来自供体1的结果见图11A，供体2的结果见图11B。
图12A和12B显示了工程改造肿瘤衍生细胞的共培养对γδT细胞的影响。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。在存在或不存在ZOL的情况下，经辐照的肿瘤衍生细胞(K562)以2：1的比例(肿瘤衍生细胞：γδT细胞)被添加至一些样本中。其他样本在抗CD28或抗CD27 mAb包被的平板上培养。第3天，模拟转导激活的γδT细胞。第4天，扩增模拟转导的细胞。第21天，冷冻扩增的细胞。图12A和图12B显示了从两个供体(D1(图12A)和D2(图12B))获得的γδT细胞用经辐照的肿瘤衍生细胞+/-ZOL刺激具有比用抗CD28抗体+ZOL、抗CD27抗体+ZOL和ZOL单独(对照)刺激的细胞具有更高的倍数扩增。
图13A-C显示了γδT细胞激活期间各种肿瘤衍生细胞共培养的结果。图13A显示了从两个供体(D1(上图)和D2(下图))获得的γδT细胞于第0天在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下激活的倍数扩增，激活方式如下：1)没有肿瘤衍生细胞的情况下(对照)；2)用野生型肿瘤衍生细胞(K562 WT)；3)用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体1)；4)用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；5)在不存在ZOL的情况下用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；和6)在不存在ZOL的情况下用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)并于第7天和第14天重新刺激(K562变体2+IL-2+IL-15)。图13B和13C显示了供体1(图13B)和供体2(图13C)中的δ1(左图)和δ2(右图)T细胞的扩增。
图14A和14B显示了γδT细胞激活期间各种肿瘤衍生细胞的共培养结果。图14A和14B显示了在整个活细胞群中存在γδT细胞的百分比。简言之，从两个供体(D1(图14A)和D2(图14B))获得的细胞于第0天在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下激活，激活方式如下：1)没有肿瘤衍生细胞的情况下(对照)；2)用野生型肿瘤衍生细胞(K562 WT)；3)用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体1)；4)用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；5)在不存在ZOL的情况下用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；和6)在不存在ZOL的情况下用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)并于第7天和第14天重新刺激(K562变体2+IL-2+IL-15)。
图15显示，与唑来膦酸盐在培养物中的条件相比，培养物中缺乏唑来膦酸盐导致多克隆群(δ1和δ2γδT细胞皆然)。简言之，从两个供体(D1(上图)和D2(下图))获得的细胞于第0天在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下激活，激活方式如下：1)没有肿瘤衍生细胞的情况下(对照)；2)用野生型肿瘤衍生细胞(K562)；3)在不存在ZOL的情况下用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；4)在不存在ZOL的情况下用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)并于在第7天和第14天重新刺激(K562变体2+IL-2+IL-15)；5)用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；和6)用修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体1)。第21天收获细胞，并通过流式细胞术分析，以确定δ1和δ2群。
图16显示，肿瘤衍生的共培养物不会改变扩增γδT细胞的记忆表型。简言之，从两个供体(D1(上图)和D2(下图))获得的细胞于第0天在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下激活，激活方式如下：1)没有肿瘤衍生细胞的情况下(对照)；2)用野生型肿瘤衍生细胞；3)在不存在ZOL的情况下，用工程改造为表达4-1BBL和膜结合IL-15(mbIL15)的肿瘤衍生细胞；4)在不存在ZOL的情况下，用表达4-1BBL和mbIL15的肿瘤衍生细胞并于第7天和第14天重新刺激(表达4-1BBL和mbIL15+IL-2+IL-15的肿瘤衍生细胞)；5)用表达4-1BBL和mbIL15的肿瘤衍生细胞；和6)用表达CD86的肿瘤衍生细胞。第21天收获细胞，并通过流式细胞仪分析，以通过检测细胞表面上的CD45、CD27和CCR7来确定记忆表型。
图17A和17B显示了用经辐照的同种异体PBMC+/-LCL进行多次重新刺激对来自两个供体(D1(图17A)和D2(图17B))的γδT细胞扩增的影响。简言之，从两个供体(D1和D2)获得的细胞于第0天在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下激活，第2天模拟转导并在第3天扩增。在第7天和第14天，用以下重新刺激扩增的细胞：1)对照物(100U/ml IL-2+100ng/ml IL-15)；2)PBMC+LCL+OKT3(汇集自2-3个供体的25x106个经辐照的同种异体PBMC+5x106个经辐照的LCL+30ng/ml sOTK3+50U/ml IL-2)；3)PBMC(汇集自2-3个供体的25x106个经辐照的同种异体PBMC+50U/ml IL-2)；4)LCL(5x106个经辐照的LCL+50U/ml IL-2)或5)OKT3(30ng/ml sOTK3+50U/ml IL-2)。
图18A-C显示了用经辐照的同种异体PBMC+/-LCL进行多次重新刺激对来自两个供体的γδT细胞扩增的影响。γδT细胞如图17A-B所述进行激活和扩增。图18A和18B显示了来自两个供体的δ1T细胞倍数扩增。图18C显示了来自对照治疗(IL-2+IL-15)和PBMC+LCL+OKT3重新刺激治疗的两个供体第21天的流式细胞术结果。
图19A和19B显示了用PBMC+/-LCL重新刺激的两个供体的扩增γδT细胞的记忆表型。简言之，从两个供体(D1和D2)获得的细胞于第0天在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下激活，第2天模拟转导并在第3天扩增。第7天，用以下重新刺激扩增的细胞：1)对照物(100U/ml IL-2+100ng/ml IL-15)；2)PBMC+LCL+OKT3(汇集自2-3个供体的25x106个经辐照的同种异体PBMC+5x106个经辐照的LCL+30ng/ml OTK3+50U/ml IL-2)；3)PBMC(汇集自2-3个供体的25x106个经辐照的同种异体PBMC+50U/ml IL-2)；或4)LCL(5x106个经辐照的LCL+50U/ml IL-2)。第14天收获细胞，并通过流式细胞仪分析，以通过检测细胞表面上的CD45、CD27和CCR7来确定记忆表型。
20A和20B显示了用各种工艺制备的经TCR转导(TCR-T)或未经转导(NT)的γδT细胞针对肽阳性U2OS细胞(图20A)或肽阴性MCF7细胞(图20B)的杀伤活性。
图21显示了根据本公开一实施方案所述的T细胞制造工艺。
图22A-22D显示了通过对照工艺(图22A)、工艺1(图22B)、工艺2(图22C)和工艺3(图22D)制备的γδT细胞的倍数扩增。
图23A-23C显示了通过各种工艺制备的γδT细胞的表型CD27+CD45RA-(图23A)、CD62L+(图23B)和CD57+(图23C)。
图24A-24D显示了通过各种工艺制备的表达PD1(图24A)、LAG3(图24B)、TIM3(图24C)和TIGIT(图24D)的γδT细胞％。
图25A和25B显示了通过各种工艺制备的γδT细胞的表达转基因(例如TCR)的γδT细胞％(图25A)以及整合TCR拷贝数(图25B)。
图26A-26C显示了通过对照工艺(图26A)、工艺2(图26B)和工艺3(图26C)制备的表达转基因(例如，CD8和与PRAME肽/MHC复合体结合的TCR)的γδT细胞％。
图27A显示了根据本公开另一实施方案所述的T细胞制造工艺。
图27B显示了通过各种工艺制备的γδT细胞的倍数扩增。
图28A-28C显示了通过在第0天用K562细胞刺激、然后在第2天以60μl(图28A)、120μl(图28B)和240μl(图28C)编码转基因的病毒载体转导而制备的表达转基因(例如CD8和TCR)的γδT细胞％。
图28D显示了通过图28A-28C所示工艺制备的γδT细胞中整合转基因的拷贝数。
图28E显示了通过在第2天以60μl编码转基因的病毒载体转导、然后在第4天用K562细胞刺激而制备的表达转基因(例如CD8和TCR)的γδT细胞％。
图28F显示了通过图28E所示工艺制备的γδT细胞中整合转基因的拷贝数。
图29显示了通过各种工艺制备的表达转基因(例如CD8和TCR)的γδT细胞％。
图30显示了根据本公开另一实施方案所述的γδT细胞制造工艺。
图31A-31D显示了通过各种工艺制备的γδT细胞对UACC257细胞(图31A)、U2OS细胞(图31B)、A375细胞(图31C)和MCF7细胞(图31D)的杀伤活性。
图32A-32C显示了通过各种工艺制备的γδT细胞中针对UACC257细胞(图32A)、U2OS细胞(图32B)和MCF7细胞(图32C)的IFNγ分泌。
图33A-33C显示了通过各种工艺制备的γδT细胞中针对UACC257细胞(图33A)、U2OS细胞(图33B)和MCF7细胞(图33C)的TNFα分泌。
图34A-34C显示了通过各种工艺制备的γδT细胞中针对UACC257细胞(图34A)、U2OS细胞(图34B)和MCF7细胞(图34C)的GM-CSF分泌。
图35A和35B显示了由通过各种工艺制备的获得自2个供体(供体1(图35A)和供体2(图35B))的γδT所诱导的UACC257细胞生长抑制。
图36显示了通过各种工艺制备的表达PD1、LAG3、TIM3或TIGIT的γδT细胞表达转基因(CD8和TCR)的％。
图37显示了根据本公开某些实施方案所述的γδT细胞制造工艺。
图38显示了通过各种方法制备的CD28+CD62L+γδT细胞。
图39A-39C显示了通过各种工艺制备的获得自3个供体(SD01004687(图39A)、D155410(图39B)和SD010000256(图39C))的γδT细胞倍数扩增。
图40A-40C显示了通过对照工艺(图40A)、HDACi+IL-21(w1)(图40B)和HDACi+IL-21(w2)(图40C)制备的δ1和δ2T细胞％。
图41A显示了通过各种工艺制备的CD28+CD62L+γδT细胞％。
图41B显示了通过各种工艺制备的CD27+CD45RA-γδT细胞％。
图41C显示了通过各种工艺制备的CD57+γδT细胞％。
图42显示了根据本公开某些实施方案所述的γδT细胞制造工艺。
图43A和43B显示了获自2个供体(D155410(图43A)和SD010004867(图43B))的表达IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα和IL-21R的γδT细胞％。
图44A-44C显示了通过各种工艺制备的获自3个供体(SD010004867(图44A)、D155410(图44B)和SD010000256(图44C))的γδT细胞倍数扩增。
图45A-45C显示了通过IL-12+IL-18启动(图45A)、IL-2+IL-15(图45B)和对照工艺(图45C)制备的δ1和δ2T细胞％。
图46A显示了通过各种工艺制备的CD27+CD45RA-γδT细胞％。
图46B显示了通过各种工艺制备的CD28+CD62L+γδT细胞％。
图46C显示了通过各种工艺制备的CD57+γδT细胞％。
图47A和47B显示了通过各种工艺制备的获自2个供体(D148960(图47A)和SD010000723(图47B))的δ1和δ2T细胞％。
图48A和48B显示了通过各种工艺制备的获自供体SD010000723的δ1(图48A)和δ2(图48B)T细胞％。
图49A和49B显示了通过各种工艺制备的获自供体D148960的δ1(图49A)和δ2(图49B)T细胞％。
详细说明
同种异体T细胞疗法可能基于遗传工程同种异体γδT细胞以表达外源TCR。除了通过异位TCR或CAR的特异性肿瘤识别之外，γδT细胞可能具有针对如本文所述多种肿瘤类型的活性。
本文所用的术语“γδT细胞”是指在其表面上表达独特的T细胞受体(TCR)——γδTCR的T细胞子集，其由1条γ链和1条δ链组成。术语“γδT细胞”具体包括γδT细胞的所有子集，包括但不限于Vδ1、Vδ2、Vδ3γδT细胞，以及幼稚、效应记忆、中央记忆和终末分化的γδT细胞。作为另一示例，术语“γδT细胞”包括Vδ4、Vδ5、Vδ7和Vδ8γδT细胞，以及Vγ2、Vγ3、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10和Vγ11γδT细胞。
“富集”细胞群或制剂系指衍生自起始混合细胞群的细胞群，其包含的特定细胞类型百分比大于所述起始细胞群中该细胞类型的百分比。例如，起始混合细胞群可以针对特定γδT细胞群进行富集。在一实施方案中，富集γδT细胞群包含的δ1细胞百分比高于起始群中的该细胞类型百分比。作为另一示例，富集γδT细胞群包含的δ1细胞百分比和δ3细胞百分比均高于起始群中的该细胞类型百分比。作为再一示例，富集γδT细胞群包含的δ1细胞百分比和δ4细胞百分比均高于起始群中的该细胞类型百分比。作为再一示例，富集γδT细胞群包含的δ1T细胞、δ3T细胞、δ4T细胞和δ5T细胞百分比高于起始群中的该细胞类型百分比。在另一实施方案中，富集γδT细胞群包含的δ2细胞百分比高于起始群中的该细胞类型百分比。在再一实施方案中，富集γδT细胞群包含的δ1细胞和δ2细胞百分比高于起始群中的该细胞类型百分比。在所有实施方案中，富集的γδT细胞群包含的αβT细胞群百分比较低。
本文所用的“扩增”系指富集制剂中所需或靶细胞类型(例如，δ1和/或δ2T细胞)的数目可高于初始或起始细胞群的数目。“选择性扩增”系指靶细胞类型(例如，δ1或δ2T细胞)可以优先于其他非靶细胞类型(例如，αβT细胞或NK细胞)进行扩增。在某些实施方案中，例如，本申请的激活剂可以选择性地扩增工程改造或非工程改造δ1T细胞，而不会显著扩增δ2T细胞。在其他的实施方案中，例如，本申请的激活剂可以选择性地扩增工程改造或非工程改造δ2T细胞，而不会显著扩增δ1T细胞。在某些实施方案中，例如，本申请的激活剂可以选择性地扩增工程改造或非工程改造δ1和δ3细胞，而不会显著扩增δ2T细胞。在某些实施方案中，例如，本申请的激活剂可以选择性地扩增工程改造或非工程改造δ1和δ4细胞，而不会显著扩增δ2T细胞。在某些实施方案中，例如，本申请的激活剂可以选择性地扩增工程改造或非工程改造δ1、δ3、δ4和δ5细胞，而不会显著扩增δ2T细胞。在本文背景下，术语“不会显著扩增”是指优先扩增的细胞群的扩增高于参考细胞群的至少10倍，优选为100倍，更优选为1,000倍。扩增的T细胞群可以，例如通过用于区分不同群细胞表面标志物的磁激活细胞分选(MACS)和/或萤光激活细胞分选(FACS)染色来表征。
γδT细胞的分离
在某些方面，本申请可以提供用于扩增工程改造或非工程改造的γδT细胞的离体方法。在某些情况下，所述方法可以采用一个或多个(例如，第一和/或第二)扩增步骤，其可能不包括有利于特定γδT细胞群扩增的细胞因子(例如IL-4、IL-2或IL-15或其组合)。在一些实施方案中，本申请可以提供用于从分离的混合细胞群中产生富集γδT细胞群的离体方法，包括使混合细胞群与一种或多种试剂接触，所述试剂选择地扩增δ1T细胞；δ1T细胞和δ3T细胞；δ1T细胞和δ4T细胞；或δ1、δ3、δ4和δ5T细胞，方式是通过分别与δ1TCR；δ1和δ4TCR；或δ1、δ3、δ4和δ5TCR的特异性表位结合，以提供富集γδT细胞群。在其他方面，本申请可以提供用于从分离的混合细胞群中产生富集γδT细胞群的离体方法，包括使混合细胞群与一种或多种试剂接触，所述试剂选择地扩增δ2T细胞，方式是通过与δ2TCR的特异性表位结合，以提供富集γδT细胞群。
一方面，本公开内容涉及T细胞的扩增和/或激活。另一方面，本公开内容涉及在不存在与γδTCR的特异性表位结合的试剂(例如，针对γδTCR的抗体)的情况下扩增和/或激活γδT细胞。另一方面，本公开内容涉及可用于转基因表达的γδT细胞的扩增和/或激活。
本公开内容还涉及γδT细胞的扩增和激活，同时耗尽α-和/或β-TCR阳性细胞。本公开内容还提供了包含扩增的γδT细胞和耗尽或减少α-和/或β-TCR阳性细胞的T细胞群。本公开还提供了使用所公开T细胞群的方法。
一方面，本文提供了用于生产大规模药品生产品质管制规范(GMP)级TCR工程改造Vγ9δ2T细胞的方法。
在不存在饲养细胞的情况下，向纯化的T细胞中添加IL-18增强了γδT细胞的扩增，其具有明显增加量的IL-2表面高亲和力受体(CD25或IL-2Ra)。此外，两性霉素B(一种Toll样受体2(TLR2)配体)可激活γδT细胞、CD8+T细胞和NK细胞，并增强CD25(高亲和力IL-2Rα)表面表达的检测。总之，这些观察结果强调了IL-2信号传导在唑来膦酸盐介导的Vγ9δ2T细胞激活和扩增中的关键作用。因此，为了最大化IL-2通过IL-2信号传导对于γδT细胞增殖的可用性(或最小化由大量αβT细胞所进行的IL-2隔离)，本公开的方法可能包括使用抗αβTCR市售GMP试剂耗尽来自正常PBMC的αβT细胞。由于重组IL-18目前并无作为市售GMP试剂提供，本公开的方法可能用低剂量两性霉素B补充培养以增加CD25表面表达以增强IL-2结合和信号传导，继而可以增强在激活/扩增期间的IL-2反应性。此外，可以加入IL-15，因为IL-15已被证明可增加经IPP处理的Vγ9δ2T细胞的增殖和存活。
图1显示了过继同种异体T细胞疗法的方法，其可递送“即用型”T细胞产物，例如，γδT细胞产物，用于快速治疗其肿瘤中表达相关靶标的特定癌症的合格患者。这种方法可能包括从健康供体收集γδT细胞，通过病毒转导相关外源基因(如外源性TCR)进行γδT细胞工程改造，然后进行细胞扩增、收获扩增的工程改造γδT细胞，这些细胞在输注入患者之前可冷冻保存为“即用型”T细胞产品。因此，该方法可消除个人化T细胞制造的需要。
为了分离γδT细胞，一方面，γδT细胞可从受试者或受试者的复杂样本中分离。一方面，复杂样本可能是外周血样本、脐带血样本、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活组织检查物、组织、淋巴，或直接接触外部环境的受试者的上皮部位样本或源自干前体细胞的样本。γδT细胞可能直接从受试者的复杂样本中分离，例如，通过用流式细胞技术分选表达一种或多种细胞表面标志物的γδT细胞。野生型γδT细胞可表现出许多可与γδT细胞相关的抗原识别、抗原呈递、共刺激和黏附分子。一种或多种细胞表面标志物，例如，特异性γδTCR、抗原识别、抗原呈递、配体、黏附分子或共刺激分子可用于从复杂样本中分离野生型γδT细胞。与γδT细胞相关或由其表达的各种分子可用于从复杂样本中分离γδT细胞。另一方面，本公开内容提供了分离Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+细胞或其任意组合的混合群的方法。
例如，可从受试者中收集外周血单核细胞，例如，采用血液成分单采机(包括Ficoll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare)系统或其他合适的装置/系统。例如，可采用流式细胞技术从收集的样本中纯化γδT细胞或所需亚群的γδT细胞。脐带血细胞也可在受试者出生期间从脐带血中获得。
在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物的阳性和/或阴性选择可用于直接自外周血样本、脐带血样本、肿瘤、肿瘤活组织检查、组织、淋巴或来自受试者的上皮样本分离γδT细胞或表达相似细胞表面标志物的γδT细胞群。例如，可以基于CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCRα、TCRβ、TCRα、TCRδ、NKG2D、CD70、CD27、CD30、CD16、CD337(NKp30)、CD336(NKp46)、OX40、CD46、CCR7和其他合适的细胞表面标志物的阳性或阴性表达从复杂样本中分离γδT细胞。
一方面，γδT细胞可从体外培养的复杂样本中分离。另一方面，在没有预先耗尽特定细胞群(例如，单核细胞、αβT细胞、B细胞和NK细胞)的情况下可激活和扩增全部的PBMC群。另一方面，可以在特异性激活和扩增之前产生富集的γδT细胞群。另一方面，可以在不存在天然或工程改造APC的情况下进行γδT细胞的激活和扩增。另一方面，可以使用固定的γδT细胞有丝分裂原(包括γδTCR特异的抗体)和其他γδTCR激活剂(包括凝集素)对来自肿瘤样本的γδT细胞进行分离和扩增。另一方面，可以在没有γδT细胞有丝分裂原(包括γδTCR特异的抗体)和其他γδTCR激活剂(包括凝集素)的情况下对来自肿瘤样本的γδT细胞进行分离和扩增。
一方面，γδT细胞分离自受试者(例如人受试者)的白细胞分离产物。另一方面，γδT细胞不是从外周血单核细胞(PBMC)中分离的。
图2显示了根据本公开内容实施方案的γδT细胞制造。该过程可能包括从白细胞分离产物中收集或获得白细胞或PBMC。白细胞分离术可能包括从供体收集全血并使用血液成分单采机分离组分。血液成分单采机分离出所需的血液组分，并将其余部分返回供体的血液循环。例如，可以使用血液成分单采设备收集白细胞、血浆和血小板，并将红细胞和中性粒细胞返回供体的血液循环。市售白细胞分离术产品可用于该程序。另一种方法是从血沉棕黄层获得白细胞。为了分离血沉棕黄层，从供体获得抗凝全血并离心。离心后，将血液分离成血浆、红细胞和血沉棕黄层。血沉棕黄层是位于血浆和红细胞层之间的层。与血沉棕黄层收集相比，白细胞分离收集可以获得更高的纯度和显著增加的单核细胞含量。白细胞分离术可能获得的单核细胞含量通常比血沉棕黄层获得的单核细胞含量高20倍。为了富集单核细胞，可能需要使用Ficoll梯度进行进一步分离。
为了从PBMC中耗尽αβT细胞，可通过磁分离将表达αβTCR的细胞与PBMC分离，例如，使用涂覆有抗αβTCR抗体的
Figure BDA0003893297060000191
磁珠，然后冷冻保存αβTCR-T细胞耗尽的PBMC。为了制造“即用型”T细胞产品，可在存在氨基二膦酸盐和/或异戊烯焦磷酸盐(IPP)和/或细胞因子(例如白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)和/或白细胞介素18(IL-18))和/或其他激活剂(例如，Toll样受体2(TLR2)配体)的情况下小/中等规模(例如，在24至4-6孔板或T75/T175烧瓶中)或大规模(例如，在50ml-100升袋中)解冻和激活冷冻保存的αβTCR-T细胞耗尽的PBMC，持续1-10天，例如2-6天。
一方面，分离的γδT细胞可回应于与一种或多种抗原接触而快速扩增。一些γδT细胞(例如Vγ9Vδ2+T细胞)可以在组织培养期间回应于与一些抗原(如：异戊二烯基焦磷酸盐、烷基胺和代谢物或微生物提取物)接触而在体外快速扩增。经刺激的γδT细胞可以表现出许多抗原呈递、共刺激和黏附分子，其可以促进从复杂样本中分离γδT细胞。复杂样本中的γδT细胞可以用至少一种抗原在体外刺激1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或其他合适的时间段。用合适的抗原刺激γδT细胞可以在体外扩增γδT细胞群。
可用于在体外刺激复杂样本中γδT细胞扩增的抗原非限制性实例可包括异戊烯-焦磷酸盐，例如异戊烯焦磷酸盐(IPP)、烷基胺、人微生物病原体代谢物、共生细菌代谢物、甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸盐(2M3B1PP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、法呢基焦磷酸盐(FPP)、二甲基烯丙基磷酸盐(DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸盐(DMAPP)、乙基三磷酸腺苷(EPPPA)、香叶基焦磷酸盐(GPP)、香叶基香叶基焦磷酸盐(GGPP)、异戊烯基三磷酸腺苷(IPPPA)、磷酸单乙基酯(MEP)、焦磷酸单乙酯(MEPP)、3-甲醯基-1-丁基焦磷酸盐(TUBAg 1)、X-焦磷酸盐(TUBAg 2)、3-甲醯基-1-丁基-尿苷三磷酸盐(TUBAg 3)、3-甲醯基-1-丁基-去氧胸苷三磷酸(TUBAg 4)、单乙基烷基胺、烯丙基焦磷酸盐、巴豆基焦磷酸盐、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸盐、巴豆基-γ-尿苷三磷酸盐、烯丙基-γ-尿苷三磷酸盐、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺和含氮二膦酸盐。
可以使用本文所述的激活和共刺激剂进行γδT细胞的激活和扩增，以触发特异性γδT细胞增殖和持久群。一方面，来自不同培养物的γδT细胞的激活和扩增可以实现不同的克隆或混合多克隆群亚群。另一方面，不同的激动剂可用于鉴定提供特异性γδ激活信号的药剂。另一方面，提供特异性γδ激活信号的试剂可以是针对γδTCR的不同单克隆抗体(MAb)。另一方面，可以使用伴随共刺激剂以帮助触发特异性γδT细胞增殖而不诱导细胞能量和细胞凋亡。这些共刺激剂可包括与γδ细胞上表达的受体结合的配体，如NKG2D、CD161、CD70、JAML、DNAX辅助分子-1(DNAM-1)、ICOS、CD27、CD137、CD30、HVEM、SLAM、CD122、DAP和CD28。另一方面，共刺激剂可以是对CD2和CD3分子上的独特表位特异的抗体。当在αβ或γδT细胞上表达时，CD2和CD3可具有不同的构象结构。另一方面，CD3和CD2的特异性抗体可导致γδT细胞的不同激活。
在某些方面，可以在存在诸如肿瘤细胞，例如K562细胞或类淋巴母细胞(LCL)的饲养细胞的情况下进行γδT细胞激活和/或扩增。在某些方面，对饲养细胞进行修饰，以表达一种或多种共刺激剂，例如CD86、4-1BBL、IL-15和膜结合IL-15(mbIL-15)。在某些方面，饲养细胞可以为自体细胞，例如单核细胞或PBMC。饲养细胞可以为经辐照的饲养细胞，例如γ辐照的饲养细胞。在某些方面，激活期间将饲养细胞与γδT细胞共培养。在某些方面，扩增期间，例如在一个或多个重新刺激步骤中，将饲养细胞与γδT细胞共培养。激活期间使用的饲养细胞与扩增期间使用的饲养细胞可以相同，也可以不同。
在某些方面，γδT细胞和饲养细胞以约1:1至约50:1(饲养细胞：γδT细胞)的比例存在。在某些方面，γδT细胞和饲养细胞以约2:1至约20:1(饲养细胞：γδT细胞)的比例存在。在某些方面，γδT细胞和饲养细胞以约1:1、约1:5:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1或约50:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
在γδT细胞工程改造之前，可以离体扩增γδT细胞群。可用于促进体外γδT细胞群扩增的试剂非限制性实例可能包括抗CD3或抗CD2、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40抗体、IL-2、IL-15、IL-12、IL-9、IL-33、IL-18或IL-21、CD70(CD27配体)、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、蜗牛凝集素(HPA)、蚕豆凝集素(VGA)或其他能够刺激T细胞增殖的合适有丝分裂原。
通过γδT细胞的基因工程改造可以增强γδT细胞识别广谱抗原的能力。一方面，可以工程改造γδT细胞以提供识别体内首选抗原的通用同种异体疗法。γδT细胞的基因工程改造可能包括稳定整合表达肿瘤识别部分(例如：αβTCR、γδTCR、嵌合抗原受体(CAR)(其将抗原结合和T细胞激活功能组合为单一的受体)、其抗原结合片段或淋巴细胞激活结构域)的构建体至分离γδT细胞的基因组，细胞因子(IL-15、IL-12、IL-2、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9、IL-23、IL1β)，以在体外和体内增强T细胞增殖、存活和功能。分离γδT细胞的基因工程改造还可能包括从分离γδT细胞的基因组中的一个或多个内源基因中(例如，MHC基因座)删除或破坏基因表达。
本文公开的T细胞制造方法可用于扩增经修饰以可靠和可再现方式表达高亲和力T细胞受体(工程改造TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。在一实施方案中，可对T细胞进行基因学修饰以表达一种或多种工程改造的TCR或CAR。本文所用的T细胞可以为αβT细胞、γδT细胞或天然杀伤T细胞。
工程改造的TCR
天然存在的T细胞受体包含两个亚基——一个α亚基和一个β亚基，每个都是通过在每个T细胞基因组中发生重组事件而产生的独特蛋白质。可筛选TCR库针对特定靶抗原的选择性。以这种方式，可以选择、克隆对靶抗原具有高亲和力和反应性的天然TCR，然后将其引入用于过继免疫疗法的T细胞群中。
在一实施方案中，可以通过引入编码TCR的亚基的多核苷酸来修饰T细胞，所述TCR的亚基具有形成TCR的能力，以赋予T细胞针对表达靶抗原的肿瘤细胞的特异性。在特别的实施方案中，与所述天然存在的亚基相比，所述亚基可以经过一次或多次氨基酸取代、缺失、插入或修饰，只要所述亚基保留形成TCR的能力，从而赋予转染T细胞归向靶细胞并参与免疫相关的细胞因子信号传导的能力。工程改造的TCR优选还以高亲和力结合展示相关肿瘤相关肽的靶细胞，并且任选地介导在体内有效杀伤提呈相关肽的靶细胞。
编码工程改造TCR的核酸可优选地自它们在T细胞的(天然存在的)染色体的天然环境中分离出来，并且可以掺入本文所述的合适载体中。有用的核酸和包含它们的载体都可以转移到细胞中，所述细胞可以优选为T细胞，更优选为γδT细胞。然后，经修饰的T细胞可能能够表达由转导的一种或多种核酸编码的TCR两条链。在优选实施方案中，工程改造的TCR可以是外源性TCR，因为它被引入通常不表达特定TCR的T细胞中。工程改造TCR的基本方面是，其对由主要组织相容性复合体(MHC)或类似免疫学成分提呈的肿瘤抗原可能具有高亲和力。与工程改造的TCR相反，CAR可被工程改造为以MHC非依赖性方式与靶抗原结合。
一方面，工程改造的TCR可以以CD8(CD8αβ异二聚体和/或CD8αα同二聚体)非依赖方式在γδT细胞中起作用。另一方面，工程改造的TCR可以以CD8(CD8αβ异二聚体和/或CD8αα同二聚体)依赖性方式在γδT细胞中起作用。在后一种情况下，可以通过表达编码TCR和CD8(CD8α和CD8β链或CD8α链)的外源核酸来修饰γδT细胞。一方面，可以用编码TCR和CD8(CD8α和CD8β链或CD8α链)的核酸(其可以驻留在相同载体上或在单独的载体上)转导或转染γδT细胞。
核酸编码的蛋白质可以与附着至TCR的α链或β链的氨基末端或羧基末端部分的其他多肽一起表达，只要该附着的其他多肽不干扰α链或β链形成功能性T细胞受体和MHC依赖性抗原识别的能力即可。
被工程改造的TCR识别的抗原可包括但不限于癌症抗原，包括血液系统癌症和实体瘤上的抗原。示例性抗原包括但不限于α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs和VEGFR2。
一方面，本公开的T细胞可以表达美国专利申请公开号2017/0267738、美国专利申请公开号2017/0312350、美国专利申请公开号2018/0051080、美国专利申请公开号2018/0164315、美国专利申请公开号2018/0161396、美国专利申请公开号2018/0162922、美国专利申请公开号2018/0273602、美国专利申请公开号2019/0016801、美国专利申请公开号2019/0002556、美国专利申请公开号2019/0135914、美国专利10,538,573、美国专利10,626,160、美国专利申请公开号2019/0321478、美国专利申请公开号2019/0256572、美国专利10,550,182、美国专利10,526,407、美国专利申请公开号2019/0284276、美国专利申请公开号2019/0016802、美国专利申请公开号2019/0016803、美国专利申请公开号2019/0016804、美国专利10,583,573、美国专利申请公开号2020/0339652、美国专利10,537,624、美国专利10,596,242、美国专利申请公开号2020/0188497、美国专利10,800,845、美国专利申请公开号2020/0385468、美国专利10,527,623、美国专利10,725,044、美国专利申请公开号2020/0249233、美国专利10,702,609、美国专利申请公开号2020/0254106、美国专利10,800,832、美国专利申请公开号2020/0123221、美国专利10,590,194、美国专利10,723,796、美国专利申请公开号2020/0140540、美国专利10,618,956、美国专利申请公开号2020/0207849、美国专利申请公开号2020/0088726、和美国专利申请公开号2020/0384028中所述的TCR和抗原结合蛋白；本文所述的这些专利公开内容和序列表透过引用整体并入本文。T细胞可以为αβT细胞、γδT细胞或天然杀伤T细胞。在一实施方案中，本文所述的TCR可以为单链TCR或可溶性TCR。
嵌合抗原受体(CAR)
本文公开的T细胞制造方法可包括修饰T细胞以表达一个或多个CAR。T细胞可以为αβT细胞、γδT细胞或天然杀伤T细胞。在各种实施方案中，本公开提出了采用设计用于表达将细胞毒性重定向至肿瘤细胞的CAR的载体进行基因学工程改造的T细胞。CAR分子将针对靶抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与激活T细胞受体的细胞内结构域相组合，以产生表现出特异性抗肿瘤细胞性免疫活性的嵌合蛋白。本文所用的术语“嵌合”描述由不同蛋白质或不同来源DNA的部分组成。
CAR可以包含与特异性靶抗原结合的细胞外结构域(也称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CAR的主要特征可能是其能够重新定向免疫效应细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或产生以主要组织相容性(MHC)非依赖方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子，充分利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向作用能力。
在特定的实施方案中，CAR可以包含细胞外结合结构域，其包括但不限于抗体或其抗原结合片段、束缚配体、或共受体的细胞外结构域，其与系为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的靶抗原特异性结合。在某些实施方案中，TAA或TSA可以在血液癌细胞上表达。在另一实施方案中，TAA或TSA可以在实体瘤细胞上表达。在特定的实施方案中，实体瘤可以是胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、除非小细胞肺癌以外的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脾癌、皮肤癌、除胶质母细胞瘤以外的脑癌、肾癌、甲状腺癌等等。
在特定实施方案中，TAA或TSA可以选自由α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs和VEGFR2组成的组。
一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的肿瘤相关抗原(TAA)肽包括，例如，美国专利公开号20160187351、美国专利公开号20170165335、美国专利公开号20170035807、美国专利公开号20160280759、美国专利公开号20160287687、美国专利公开号20160346371、美国专利公开号20160368965、美国专利公开号20170022251、美国专利公开号20170002055、美国专利公开号20170029486、美国专利公开号20170037089、美国专利公开号20170136108、美国专利公开号20170101473、美国专利公开号20170096461、美国专利公开号20170165337、美国专利公开号20170189505、美国专利公开号20170173132、美国专利公开号20170296640、美国专利公开号20170253633、美国专利公开号20170260249、美国专利公开号20180051080和美国专利公开号20180164315所述的TAA肽，本文所述的这些专利公开内容和序列表透过引用整体并入本文。
一方面，本文所述的T细胞选择性地识别提呈上述一个或多个专利和公开内容中所述TAA肽的细胞。
另一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的TAA包括选自SEQ IDNO:6至SEQ ID NO:166的至少一种。一方面，T细胞选择性地识别提呈SEQ ID NO:6-166或本文所述任何专利或申请中所述TAA肽的细胞。
Figure BDA0003893297060000251
Figure BDA0003893297060000261
Figure BDA0003893297060000271
Figure BDA0003893297060000281
CAR的结合结构域
在特定的实施方案中，本文考虑的CAR包含与肿瘤细胞上表达的靶多肽(例如，靶抗原)特异性结合的细胞外结合结构域。本文所用的术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、
“细胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可以互换使用，并提供能与目的靶抗原特异性结合的CAR。结合结构域可以包括具有特异性识别并结合生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤蛋白、脂质、多糖或其他细胞表面靶分子或其组分)能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽。结合结构域可包括用于目的生物分子的任何天然存在、合成、半合成或重组产生的结合伴侣。
在特定实施方案中，CAR的细胞外结合结构域可包括抗体或其抗原结合片段。“抗体”系指结合剂，其为至少包含一条轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，其特异性地识别并结合靶抗原的表位，例如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，例如被免疫细胞识别的那些核酸。抗体可包括其抗原结合片段。所述术语还可以包括基因工程改造的形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合物抗体(例如，双特异性抗体)及其抗原结合片段。另请参阅Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
在特定实施方案中，靶抗原可以为α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽的表位。
轻链和重链可变区可以包含被三个高变区，也称为“互补决定区”或“CDR”打断的“框架”区。CDR可通过常规方法定义或鉴定，例如通过根据Kabat et al(Wu,TT and Kabat,E.A.,J Exp Med.132(2):211-50,(1970)；Borden,P.and Kabat E.A.,PNAS,84:2440-2443(1987)所述的序列；(请参阅Kabat et al,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，其透过引用并入本文)，或通过根据Chothia et al(Choithia,C.and Lesk,A.M.,J Mol.Biol,196(4):901-917(1987),Choithia,C.et al,Nature,342:877-883(1989))所述的结构。上述参考文献的内容通过引用整体并入本文。不同轻链或重链的框架区序列在诸如人之类的物种中可能是相对保守的。系为组成轻链和重链的组合框架区之抗体的框架区可用于在三维空间中定位和排列CDR。CDR主要负责与抗原表位结合。每条链的CDR通常可以称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始依次编号，并且通常还可以通过特定CDR所在位置的链来识别。因此，位于抗体重链可变结构域中的CDR可以称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体轻链可变结构域中的CDR称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性的抗体(即，针对不同抗原的不同组合位点)可能具有不同的CDR。尽管不同的抗体之间CDR不同，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
提及“VH”或“VH”系指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其他抗体片段的可变区。提及“VL”或“VL”系指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其他抗体片段的可变区。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由转染了单个抗体轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法来产生，例如，通过将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合而制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体可以包括人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一种物种(例如人)的框架残基和来自另一物种(诸如小鼠)的CDR(通常赋予抗原结合特性)。在特定优选的实施方案中，本文公开的CAR可以包含系为嵌合抗体或其抗原结合片段的抗原特异性结合结构域。
在某些实施方案中，抗体可以是与肿瘤细胞上表面蛋白特异性结合的人源化抗体(例如人源化单克隆抗体)。“人源化”抗体为免疫球蛋白，包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR。人源化抗体可以通过基因工程改造构建(例如，参见美国专利号5,585,089，其内容通过引用整体并入本文)。
在实施方案中，CAR的细胞外结合结构域可包含抗体或其抗原结合片段，包括但不限于骆驼Ig(骆驼科动物抗体(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、bis-scFv、(scFv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。
本文所用的“骆驼Ig”或“骆驼VHH”系指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte,et al,FASEB J.,21:3490-3498(2007)，其内容通过引用整体并入本文)。“重链抗体”或“骆驼科抗体”系指含有两个VH结构域且无轻链的抗体(Riechmann L.et al,J.Immunol.Methods 231:25-38(1999)；WO94/04678；W094/25591；美国专利号6,005,079；其内容通过引用整体并入本文)。
“IgNAR”或“免疫球蛋白新抗原受体”系指来自鲨鱼免疫库的一类抗体，其由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同二聚体组成。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有一个抗原结合位点和残余“Fc”片段，其名称反映了其能够容易结晶。Fab片段包含重链和轻链可变结构域，还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的区别在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中是指恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab′。F(ab')2抗体片段最初生成为成对Fab'片段，在它们之间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，这样，轻链和重链就可以缔合成类似于两链Fv物种的“二聚体”结构。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含与相同多肽链(VH-VL)内的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于无法允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体在，例如，EP404,097；WO 1993/01161；Hudson et al,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger et al,PNASUSA 90:6444-6448(1993)中有更充分的描述。三抗体和四抗体也在Hudson et al,Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。上述参考文献的内容通过引用整体并入本文。
“单结构域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”系指由抗体重链的可变区(VH结构域)或抗体轻链的可变区(VL结构域)组成的抗体片段(Holt,L.,et al,Trends inBiotechnology,21(11):484-490，该文中的内容通过引用整体并入本文)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单个多肽链和任一方向(例如VL-VH或VH-VL)存在。通常情况下，scFv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，请参见，例如，Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburgand Moore eds.,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315，该文中的内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，scFv与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合。
CAR的接头
在某些实施方案中，CAR可以在各个结构域之间，例如在VH和VL结构域之间包含接头残基，其被添加以适当地间隔和构象分子。CAR可以包含一个、两个、三个、四个或五个或五个以上的接头。在特定实施方案中，接头的长度可以为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸或约10至约20个氨基酸，或任何中间的氨基酸长度。在一些实施方案中，接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多氨基酸。接头的说明性示例包括甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(Gi_sSi_5)n，其中n为至少一、两、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对而言是非结构化的，因此可能能够充当融合蛋白(例如CAR)的结构域之间的中性系链。甘氨酸可能比丙氨酸进入显著更多的phi-psi空间，并且与具有较长侧链的残基相比受限制的可能性要少得多(请参阅Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992)，该文中的内容通过引用整体并入本文)。普通技术人员可认识到，在特定实施例中，CAR的设计可以包括可能是全部或部分柔性的接头，使得所述接头可以包括柔性接头以及赋予柔性较差结构的一个或多个部分，以提供所需的CAR结构。
在特定实施方案中，CAR可以包括scFV，其可以进一步包含可变区连接序列。
“可变区连接序列”是一个氨基酸序列，其将重链可变区连接至轻链可变区，并提供与两个亚结合结构域相互作用相容的间隔子功能，从而获得的多肽与可能包含相同轻链和重链可变区的抗体一样，对同一靶分子保留特异性结合亲和力。在一实施方案中，可变区连接序列的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸。在一特定实施方案中，可变区连接序列可以包含甘氨酸-丝氨酸聚合物(Gi_sSi_5)n，其中n为至少1、2、3、4或5的整数。在另一实施方案中，可变区连接序列包含一个(G4S)3氨基酸接头。
CAR的间隔子结构域
在特定实施方案中，CAR的结合结构域可跟随一个或多个“间隔子结构域”，其是指使抗原结合结构域移动远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活的区域(Patel et al,Gene Therapy,1999；6:412-419，该文中的内容通过引用整体并入本文)。间隔子结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔子结构域可以为免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如，CH2和CH3。间隔子结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一实施方案中，间隔子结构域可以包括IgG1的CH2和CH3。
CAR的铰链结构域
CAR的结合结构域通常可跟随一个或多个“铰链结构域”，其可以在使抗原结合结构域远离效应细胞表面定位以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中起作用。CAR通常可以包括结合结构域和跨膜结构域(TM)之间的一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于CAR的示例性铰链结构域可能包括源自1型膜蛋白(例如，CD8a、CD4、CD28和CD7)的细胞外区的铰链区，其可能为这些分子的野生型铰链区，也可能被改变。在另一实施方案中，铰链结构域可以包括CD8α铰链区。
CAR的跨膜(TM)结构域
“跨膜结构域”可以是CAR的一部分，其可以融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域，并且将CAR锚定至免疫效应细胞的质膜。TM结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。示例性TM结构域可以衍生自T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154(至少包括其跨膜区)。在一实施方案中，CAR可以包含衍生自CD8a的TM结构域。在另一实施方案中，本文考虑的CAR包含衍生自CD8α的TM结构域和短寡肽或多肽接头，优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，其连接CAR的TM结构域和细胞内信号传导结构域。甘氨酸-丝氨酸接头提供了特别合适的接头。
CAR的细胞内信号传导结构域
在特定实施方案中，CAR可以包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”系指CAR的一部分，其参与结合于靶抗原的有效CAR的资讯转导至免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或用结合于细胞外CAR结构域的抗原引发其他细胞反应。
术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或帮助或包括细胞因子分泌的活性。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其可以转导效应子功能信号并指导细胞执行专门的功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但是在很多情况下，不必使用整个结构域。就可以使用细胞内信号传导结构域的截短部分程度而言，可使用此类截短部分代替整个结构域，只要可以转导效应子功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域可指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还可能需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞激活是由以下两类不同细胞内信号传导结构域介导的：通过TCR(例如，TCR/CD3复合体)起始抗原依赖性一级激活的一级信号传导结构域；以抗原非依赖性方式作用从而提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选实施方案中，CAR可以包括细胞内信号传导结构域，其可包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“一级信号传导结构域”。一级信号传导结构域可以以刺激性方式或抑制性方式调节TCR复合体的一级激活。以刺激方式起作用的一级信号传导结构域可能包含信号传导基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。在本发明中特别使用且包含ITAM的一级信号传导结构域的说明性示例可以包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的结构域。在特定优选实施方案中，CAR可以包括CD3ζ一级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内一级信号传导和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序串联连接至跨膜结构域的羧基末端。
CAR可以包含一个或多个共刺激信号传导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的疗效和扩增。本文所用的术语“共刺激信号结构域”或“共刺激结构域”系指共刺激分子的细胞内信号结构域。此类共刺激分子的说明性示例可以包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAP10、LAG3、HVEM、NKD2C和CD83。在一实施方案中，CAR可以包含一个或多个选自由CD28、CD137和CD134组成组的共刺激信号传导结构域以及一个CD3ζ一级信号传导结构域。
在一实施方案中，CAR可以包含：scFv，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-Al+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；源于选自以下组成组的多肽的跨膜结构域：CD8α；CD4、CD45、PD1和CD152；以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，其选自由以下组成的组：CD28、CD54、CD134、CD137、CD152、CD273、CD274和CD278；和CD3ζ以及信号传导结构域。
在另一实施方案中，CAR可以包含：scFv，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；铰链结构域，其选自由以下组成的组：IgG1铰链
/CH2/CH3和CD8α以及CD8α；源于选自由以下组成组的多肽的跨膜结构域：CD8α；
CD4、CD45、PD1和CD152；以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，其选自由以下组成的组：CD28、CD 134和CD 137；和CD3ζ一级信号传导结构域。
在再一实施方案中，CAR可以包含：进一步包括接头之scFv，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；铰链结构域，其选自由以下组成的组：IgG1铰链/CH2/CH3和CD8α以及CD8α；跨膜结构域，其包含源自选自由以下组成组的多肽的TM结构域：CD8a；CD4、CD45、PD1和CD 152，以及一个短寡肽或多肽接头，优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间，其将TM结构域连接至CAR的细胞内信号传导结构域；以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，选自由以下组成的组：CD28、CD 134和CD137；和CD3ζ一级信号传导结构域。
在一特定实施方案中，CAR可以包含：scFv，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；含有CD8α多肽的铰链结构域；含有约3个氨基酸的多肽接头的CD8α跨膜结构域；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，其选自由以下组成的组：CD28、CD134和CD137；和CD3ζ一级信号传导结构域。
病毒
一方面，“病毒”是指天然存在的病毒以及人造病毒。根据本公开一些实施方案的病毒可能是包膜病毒或无包膜病毒。细小病毒(例如AAV)是无包膜病毒的实例。在一优选实施方案中，病毒可能是包膜病毒。在优选实施方案中，病毒可能是逆转录病毒，特别是慢病毒。可以促进真核细胞病毒感染的病毒包膜蛋白可能包括HIV-1衍生慢病毒载体(LV)，这些载体用来自水疱性口炎病毒(VSV-G)、修饰的猫内源性逆转录病毒(RD114TR)和修饰的长臂猿白血病病毒(GALVTR)的包膜糖蛋白(GP)处理成为假型。这些包膜蛋白可以有效地促进其他病毒的进入，例如细小病毒，包括腺相关病毒(AAV)，从而证明它们的广泛效率。例如，可使用其他病毒包膜蛋白，包括莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)4070env(如Merten et al.,J.Virol.79:834-840,2005一文中所述；其通过引用并入本文)、RD114 env(SEQ ID NO:2)、嵌合包膜蛋白RD114pro或RDpro(通过用HIV-1基质/衣壳(MA/CA)切割序列取代RD114的R肽切割序列构建的RD114-HIV嵌合体，如Bell et al.Experimental Biology andMedicine2010；235:1269–1276一文中所述；其通过引用并入本文)、杆状病毒GP64 env(如Wang etal.J.Virol.81:10869-10878,2007一文中所述；其通过引用并入本文)或GALV env(如Merten et al.,J.Virol.79:834-840,2005一文中所述；其通过引用并入本文)或其衍生物。
RD114TR
RD114TR是嵌合包膜糖蛋白，其由猫白血病病毒RD114的细胞外和跨膜结构域和双嗜性小鼠白血病病毒包膜的细胞质尾部(TR)构成。RD114TR假型载体可介导基因有效转移入人造血祖细胞和NOD/SCID再生细胞中。Di Nunzio et al.,Hum.Gene Ther:811-820(2007)一文的内容通过引用整体并入本文。RD114假型载体还可以在大型动物模型中介导有效的基因转移(Neff et al.,Mal.Ther.2:157-159(2004)；Hu et al.,Mal.Ther:611-617(2003)和Kelly et al.,Blood Cells,Molecules,&Diseases 30:132-143(2003))各参考文献的内容通过引用整体并入本文。
本公开内容可能包括具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％序列同一性的RD114TR变体。例如，可能使用与RD114TR(SEQ ID NO:1)具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的RD114TR变体(RD114TRv1(SEQ ID NO:5))。一方面，本公开内容提供了具有修饰氨基酸残基的RD114TR变体。修饰的氨基酸残基可能选自氨基酸插入、缺失或取代基。一方面，本文描述的取代是保守氨基酸取代。也就是说，RD114TR的氨基酸可以被具有相似性质的其他氨基酸取代(保守变化，例如，相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或3-片结构的倾向)。一方面，RD114TR可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。另一方面，RD114TR可以具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。再一方面，RD114TR可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。保守取代的非限制性实例可见，例如，Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company，其内容通过引用整体并入。
另一方面，本公开内容可能包括与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的变体。
一方面，保守取代可能包括由Dayhoff在“The Atlas of Protein Sequence andStructure.Vol.5”,Natl.Biomedical Research中所述的取代，其内容通过引用整体并入本文。例如，一方面，属于以下组之一的氨基酸可彼此交换，因此构成保守交换：第1组：丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、天冬醯胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；第2组：半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)；第3组：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸
(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)；第4组：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；第5组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)；和第6组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)。
一方面，保守氨基酸取代可包括用相同类别中的另一个取代氨基酸，例如，(1)非极性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；(2)不带电的极性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；和(4)碱性：Lys、Arg、His。其他保守氨基酸取代也可以按如下进行：(1)芳香族：Phe、Tyr、His；(2)质子供体：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；和(3)质子受体：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln(参见美国专利号10106805)。
另一方面，保守取代可以根据表A进行。用于预测蛋白质修饰耐受性的方法可参见，例如，Guo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,101(25):9205-9210(2004)，其内容通过引用整体并入。
表A
Figure BDA0003893297060000391
一方面，RD114TR假型逆转录病毒载体在转导后约10天的转基因表达为约20％至约60％、约30％至约50％或约35％至约45％。一方面，在相同条件下，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约20％至约60％、约30％至约50％或约35％至约45％，而转导后10天VSV-G假型载体的转基因表达为约5％至约25％、约2％至约20％、约3％至约15％或约5％至约12％。再一方面，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约40％，而转导后10天VSV-G假型载体的转基因表达为约3.6％。
再一方面，RD114TR假型逆转录病毒载体在转导后约5天的转基因表达为约20％至约50％、约15％至约30％或约20％至约30％。一方面，在相同条件下，转导后5天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约20％至约50％、约15％至约30％或约20％至约30％，而转导后5天VSV-G假型载体的转基因表达为约10％至约20％、约15％至约25％或约17.5％至约20％。再一方面，转导后5天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约24％，而转导后5天VSV-G假型载体的转基因表达为约19％。
另一方面，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为转导后10天VSV-G假型载体的转基因表达的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍、约11倍或约12倍或更多。
一方面，本公开内容提供了使用具有RD114TR假型(例如，SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5或其变体)的逆转录病毒来转导T细胞的方法。另一方面，与具有VSV-G假型(例如，SEQID NO:3)的逆转录病毒相比，具有RD114TR假型(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或其变体)的逆转录病毒可更有效地转导T细胞。另一方面，RD114TR包膜用于假型化慢病毒载体，然后用于以极高的效率转导T细胞。
可用各种方法产生工程改造的γδT细胞。例如，编码包含肿瘤识别或其他类型识别部分的表达盒的多核苷酸可通过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统(例如，慢病毒或逆转录病毒系统)或其他合适的方法，如：转染、电穿孔、转导、脂质转染、磷酸钙(CaPO4)、纳米工程改造物质(如Ormosil)，病毒传递方法，包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒或其他合适的方法稳定地引入γδT细胞。许多病毒方法已用于人基因治疗，例如WO 1993020221中描述的方法，其内容通过引用整体并入本文。可用于工程改造γδT细胞的病毒方法的非限制性实例可包括γ-逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒或腺病毒相关病毒方法。
图2显示了激活T细胞可以通过用病毒载体(例如：RD114TRγ-逆转录病毒载体和RD114TR慢病毒载体)转导，将相关外源基因(例如：针对特定癌抗原的αβTCR和CD8)表达到分离γδT细胞中来进行工程改造。病毒载体还可含有转录后调控元件(PRE)，例如：土拨鼠PRE(WPRE)，以通过增加细胞核和细胞质mRNA水平来增强转基因的表达。还可使用一种或多种调节元件，包括小鼠RNA转运元件(RTE)、猿猴逆转录病毒1型(SRV-1)的组成型转运元件(CTE)和人热休克蛋白70的5'非翻译区(Hsp70 5′UTR)和/或与WPRE组合使用以增加转基因表达。转导可以进行一次或多次以实现小规模(例如24至4-6孔板)或中/大规模的稳定转基因表达1/2至5天，例如1天。
RD114TR是嵌合糖蛋白，其含有与鼠白血病病毒的细胞质尾(TR)融合的猫内源病毒(RD114)的细胞外和跨膜结构域。一方面，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达相对于VSV-G假型载体更高。
还可以使用其他病毒包膜蛋白，例如VSV-G env、MLV 4070env、RD114 env、嵌合包膜蛋白RD114pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。
非病毒载体
所述载体为非病毒载体，因为其不基于病毒。它不包含为了使载体进入细胞的任何病毒成分。非病毒载体可以选自质粒、微环、黏性质粒、人工染色体(例如、BAC)、线性共价封闭(LCC)DNA载体(例如、微环、微载体和微结)、线性共价封闭(LCC)载体(例如、MIDGE、MiLV、辅助、微质粒)、微型内含子质粒、pDNA表达载体或核酸酶介导遗传编辑(例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN))以及成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)。
在一些实施方案中，用于递送核酸的非病毒载体系统可包括由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)和具有PTD/CPP功能的肽序列组成的聚合物缀合物。例如，具有PTD/CPP功能的蛋白质可以为TAT-肽或与TAT-肽有关的肽序列。例如，与TAT肽有关的序列可以为十肽序列GRKKKRRQRC(SEQ ID NO:167)。可以替代地使用其他熟知的TAT-肽相关序列。除了对于细胞内酶(例如，在内核体、溶酶体中)的稳定性之外，根据本申请所述的用于递送核酸的非病毒载体系统在细胞外环境中也可能非常稳定。例如，与PEI相比，在存在高浓度肝素、
Figure BDA0003893297060000411
BALF和DNase I下，TAT-PEG-PEI-多聚体的稳定性可能显著更高。
在一些实施方案中，还可使用基于非病毒递送系统，例如“睡美人(SB)转座子系统”(是指将DNA序列引入脊椎动物染色体的合成DNA转座子系统)将本文所述的多肽(例如TCR和CAR)引入效应细胞，例如T细胞。该系统的描述，例如可参见美国专利号6,489,458和8,227,432，其内容通过引用整体并入本文。
睡美人转座子系统可以由睡美人(SB)转座酶和SB转座子组成。DNA转座子以简单的剪切和粘贴方式从一个DNA位点转移至另一个DNA位点。转位可能是一个精确的过程，其中可以从一个DNA分子中切除定义的DNA片段，然后移至相同或不同DNA分子或基因组中的另一位点。与其他Tc1/水手型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入受体DNA序列的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可以在同一DNA分子中的其他位置，也可以在另一DNA分子(或染色体)中。在包括人类在内的哺乳动物基因组中，大约有2亿个TA位点。TA插入位点可以在转座子整合过程中复制。TA序列的这种复制可能是转位的标志，可在某些实验中用于确定机制。转座酶可以在转座子内编码，或者转座酶可以由另一种来源提供，在这种情况下，转座子成为非自主元件。非自主转座子可用作基因工具，因为插入后它们不能独立继续切除和重新插入。设想将SB转座子用作非病毒载体，以将基因引入脊椎动物基因组并进行基因治疗。
简言之，使睡美人(SB)系统(Hackett et al.,Mol Ther 18:674-83,(2010))适于基因修饰T细胞(Cooper et al.,Blood 105:1622-31,(2005))。这涉及两个步骤：(i)表达SB转座子[即，嵌合抗原受体(CAR)以重新定向T细胞特异性(Jin et al.,Gene Ther 18:849-56,(2011)；Kebriaei et al.,Hum Gene Ther 23:444-50,(2012))]和SB转座酶的DNA质粒电转移，以及(ii)源自K562细胞系(也称为AaPC(激活和繁殖细胞))的设计人工抗原提呈细胞(AaPC)上稳定表达整合子T细胞的繁殖和扩增。以上引用的参考文献的内容通过引用整体并入本文。在一实施方案中，SB转座子系统可包括编码mbIL-15、细胞标签和/或CAR的编码序列。在一实施方案中，SB转座子系统可包括编码mbIL-15、细胞标签和/或TCR的编码序列。在另一实施方案中，消除第二步骤(ii)，并且可以将基因修饰的T细胞冷冻保存或立即注入患者体内。在一些实施方案中，基因修饰的T细胞在输注到患者体内之前可不冷冻保存。在一些实施方案中，睡美人转座酶可以为SB11、SB100X或SB110。
根据本申请所述的用于递送核酸的非病毒载体系统可以作为药学上可接受组合物的一部分通过吸入、口服、直肠、肠胃外静脉内、肌肉内或皮下、脑池内、阴道内、腹膜内、血管内、局部(粉剂、软膏或滴剂)、通过气管内插管、气管内滴注或喷雾剂施用至患者。
一方面，工程改造(或转导)的γδT细胞可以离体扩增而不受抗原呈递细胞或氨基二膦酸盐的刺激。本公开的抗原反应性工程改造T细胞可以离体和体内扩增。另一方面，本公开内容的工程改造γδT细胞活性群可以离体扩增，而无需抗原呈递细胞、抗原肽、非肽分子或小分子化合物(例如，氨基二膦酸盐)的抗原刺激，但是使用某些抗体、细胞因子、有丝分裂原或融合蛋白，例如：IL-17Fc融合、MICA Fc融合和CD70 Fc融合。可用于扩增γδT细胞群的抗体实例可能包括抗CD3、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40、抗NKG2D或抗CD2抗体，细胞因子的实例可能包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-18、IL-9、IL-7和/或IL-33，有丝分裂原的实例可能包括CD70人CD27的配体、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆有丝分裂原(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、蜗牛凝集素(HPA)、蚕豆凝集素(VGA)或其他能够刺激T细胞增殖的合适有丝分裂原。另一方面，工程改造的γδT细胞群可在少于60天、少于48天、36天、少于24天、少于12天或少于6天内扩增。
另一方面，本公开内容提供了用于离体扩增用于过继转移疗法的工程改造γδT细胞群的方法。本公开内容的工程改造γδT细胞可离体扩增。本公开内容的工程改造γδT细胞可在体外扩增而不经APC激活或不与APC和氨基磷酸盐共培养。
另一方面，γδT细胞群可在体外扩增少于36天、少于35天、少于34天、少于33天、少于32天、少于31天、少于30天、少于29天、少于28天、少于27天、少于26天、少于25天、少于24天、少于23天、少于22天、少于21天、少于20天、少于19天、少于18天、少于17天、少于16天、少于15天、少于14天、少于13天、少于12天、少于11天、少于10天、少于9天、少于8天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天或少于3天。
图2显示了转导或工程改造的γδT细胞的扩增可在存在细胞因子(例如：IL-2、IL-15、IL-18等)的情况下以小/中等规模(例如：烧瓶/G-Rex)或大规模(例如：50ml-100升袋)进行，持续7-35天，例如14-28天。
在某些方面，在扩增期间可将γδT细胞群重新刺激一次或多次。例如，可以将工程改造的(或转导的)γδT细胞群离体扩增一段时间，然后通过使扩增γδT细胞与饲养细胞接触来重新刺激。例如，饲养细胞可以为单核细胞、PBMC或单核细胞和PBMC的组合。在其他方面，在扩增期间不会重新刺激γδT细胞群。
在某些方面，饲养细胞对人体受试者为自体细胞。一方面，饲养细胞对人体受试者为同种异体细胞。
在某些方面，饲养细胞经耗尽αβT细胞。
在某些方面，在向γδT细胞群添加之前，饲养细胞用氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)进行脉冲处理。
另一方面，饲养细胞可以为细胞系，例如肿瘤细胞系或类淋巴母细胞系。另一方面，饲养细胞可以为肿瘤细胞，例如自体肿瘤细胞。一方面，肿瘤细胞可以为K562细胞。在某些方面，饲养细胞为工程改造的肿瘤细胞，其包含至少一种重组蛋白，例如细胞因子。例如，细胞因子可以为CD86、4-1BBL、IL-15及其任何组合。在某些方面，IL-15为膜结合IL-15。
在某些方面，饲养细胞为本文所述的任何饲养细胞组合。例如，饲养细胞可以为选自自体单核细胞、同种异体单核细胞、自体PBMC、同种异体PBMC、肿瘤细胞、自体肿瘤细胞、工程改造肿瘤细胞、K562细胞、肿瘤细胞系和类淋巴母细胞系的两种或更多种饲养细胞的组合。在某些方面，饲养细胞为PBMC和类淋巴母细胞系的组合。
在某些方面，饲养细胞接受辐照，例如，γ辐照。
在某些方面，扩增的γδT细胞和饲养细胞以约1:1至约50:1(饲养细胞：扩增的γδT细胞)的比例存在。例如，扩增的γδT细胞和饲养细胞以约2:1至约20:1(饲养细胞：扩增的γδT细胞)的比例存在。在某些方面，扩增的γδT细胞和饲养细胞以约1:1、约1:5:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1或约50:1(饲养细胞:扩增的γδT细胞)的比例存在。
在某些方面，可以使用某些抗体、细胞因子、有丝分裂原或融合蛋白(例如，IL-17Fc融合蛋白、MICA Fc融合蛋白和CD70 Fc融合蛋白)来重新刺激本公开的扩增γδT细胞群。可用于重新刺激扩增γδT细胞群抗体的实例可能包括抗CD3、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40、抗NKG2D或抗CD2抗体，细胞因子的实例可能包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-18、IL-9、IL-7和/或IL-33，有丝分裂原的实例可能包括CD70(人CD27的配体)、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆有丝分裂原(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、蜗牛凝集素(HPA)、蚕豆凝集素(VGA)或其他能够刺激T细胞增殖的合适有丝分裂原。
扩增γδT细胞的重新刺激可以通过使扩增γδT细胞与本文所述的重新刺激剂(例如，饲养细胞、抗体、细胞因子、有丝分裂原、融合蛋白等)的任何组合接触来进行。
在某些方面，在扩增期间，对扩增的γδT细胞进行一次重新刺激。在其他方面，在扩增期间，对扩增的γδT细胞重新刺激一次以上。例如，在扩增期间，可以对扩增的γδT细胞重新刺激两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次或更多次。根据扩增的条件和长度，本领域技术人员可以容易地优化扩增期间执行的重新刺激次数。
在某些方面，在扩增期间，对扩增的γδT细胞每天进行重新刺激。在某些方面，在扩增期间，对扩增的γδT细胞每天重新刺激一次以上。在其他方面，对扩增的γδT细胞每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每七天一次、每八天一次、每九天一次、每十天一次、每十一天一次、每十二天一次、每十三天一次、每十四天一次等进行重新刺激。在其他方面，对扩增的γδT细胞每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次等进行重新刺激。在其他方面，对扩增的γδT细胞每两周一次、每三周一次、每四周一次等进行重新刺激。根据扩增的条件和长度，本领域技术人员可以容易地优化扩增期间执行重新刺激之间的时间长度。
应当理解的是，在扩增期间执行多个重新刺激时，每次重新刺激可以相同或不同。例如，可以使用任何量的本文所述重新刺激剂的任何组合来进行每次重新刺激。对于每次重新刺激，所使用的特定重新刺激剂及其用量可以相同或不同。
然后可将扩增转导的T细胞产物冷冻保存为“即用型”T细胞产物，用于输注到患者体内。
治疗方法
可以给予含有本文所述的工程改造γδT细胞的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，药物组合物可以以足以治愈或至少部分阻止疾病或病症症状的量给予已患有疾病或病症的受试者。还可给予工程改造γδT细胞以减少病症发展、感染或恶化的可能性。用于治疗用途的有效量工程改造γδT细胞群可能根据疾病或病症的严重程度和病程、先前疗法、受试者的健康状况、体重和/或对药物的反应和/或治疗医师的判断而不同。
本公开内容的工程改造γδT细胞可用于治疗需要治疗病症(例如，本文所述的癌症、传染病和/或免疫性疾病)的受试者。
用γδT细胞治疗受试者病症(例如，疾病)的方法可能包括给予受试者治疗有效量的工程改造γδT细胞。本公开内容的γδT细胞可以以各种方案(例如，时间、浓度、剂量、治疗之间的间隔和/或制剂)施用。在接受本公开的工程改造γδT细胞之前，还可以用，例如，化学疗法、放射疗法或两者的组合对受试者进行预处理。在施用于受试者之前，还可以冷冻或冷冻保存工程改造的γδT细胞群。工程改造的γδT细胞群可包括表达相同、不同或相同和不同肿瘤识别部分组合的两种或更多种细胞。例如，工程改造的γδT细胞群可包括几种不同的工程改造γδT细胞，其被设计用于识别不同抗原或相同抗原的不同表位。
本公开内容的γδT细胞可用于治疗各种病症。一方面，本公开内容的工程改造γδT细胞可用于治疗癌症，包括实体瘤和恶性血液病。癌症的非限制性实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(如：小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(如：非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合症、骨髓增生异常综合症、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤。
一方面，本公开的工程改造γδT细胞可以用于治疗传染性疾病，例如：病毒或细菌感染，如：登革热、埃博拉病毒、马尔堡病毒，结核病(TB)、脑膜炎或梅毒，优选情况是，该方法用于传染性生物体的抗生素耐药菌株、自体免疫性疾病、寄生虫感染(例如，疟疾)和其他疾病，如：MS和Morbus帕金森，只要免疫方面给出的答案是MHC-I类分子。
再一方面，本公开内容的工程改造γδT细胞可用于治疗免疫性疾病，例如，自体免疫性疾病。自体免疫性疾病的实例(包括未正式宣布为自体免疫性疾病的疾病)有关节炎、慢性阻塞性肺疾病、强直性脊柱炎、克罗恩病(两种特发性炎症性肠道疾病“IBD”中的一种)、皮肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、Goodpasture氏综合症、Graves氏病、格林-巴厘综合症(GBS)、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、原发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、硬斑病、重症肌无力、嗜睡症、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、精神分裂症、硬皮病、干燥综合症、僵人综合症、颞动脉炎(也称作为“巨细胞动脉炎”)、溃疡性结肠炎(两种特发性炎症性肠道疾病“IBD”中的一种)、脉管炎、白斑病以及韦格纳肉芽肿。
可以在病症临床发作之前、发作期间和发作之后向受试者提供本公开内容的γδT细胞治疗。在疾病临床发作后1天、1周、6个月、12个月或2年后，可向受试者提供治疗。在疾病临床发作后可能提供给受试者治疗超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。在疾病临床发作后可能提供给受试者治疗少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年。治疗还可能包括在临床试验中治疗人受试者。治疗可包括向受试者施用包含本公开内容的工程改造γδT细胞的药物组合物。
另一方面，向受试者施用本公开内容的工程改造γδT细胞可以调节受试者体内内源性淋巴细胞的活性。另一方面，向受试者施用工程改造γδT细胞可以向内源性T细胞提供抗原并且可增强免疫应答。另一方面，记忆T细胞可以为CD4+T细胞。另一方面，记忆T细胞可以为CD8+T细胞。另一方面，向受试者施用本公开内容的工程改造γδT细胞可激活另一种免疫细胞的细胞毒性。另一方面，其他免疫细胞可以为CD8+T细胞。另一方面，其他免疫细胞可以为天然杀伤T细胞。另一方面，向受试者施用本公开内容的工程改造γδT细胞可抑制调节性T细胞。另一方面，调节性T细胞可以为FOX3+Treg细胞。另一方面，调节性T细胞可以为FOX3-Treg细胞。其活性可通过本公开内容的工程改造γδT细胞调节的细胞非限制性实例可能包括：造血干细胞；B细胞；CD4；CD8；红血球；白血球；树突细胞，包括树突抗原呈递细胞；白细胞；巨噬细胞；记忆B细胞；记忆T细胞；单核细胞；自然杀伤细胞；中性粒细胞；T辅助细胞；和T杀伤细胞。
在大多数骨髓移植期间，环磷醯胺与全身照射组合可常规用于防止受试者免疫系统对移植体的造血干细胞(HSC)产生排斥。一方面，可以进行供体骨髓与白细胞介素-2(IL-2)离体孵育以增强供体骨髓中杀伤性淋巴细胞的产生。白细胞介素-2(IL-2)是野生型淋巴细胞生长、增殖和分化所必需的细胞因子。目前关于将γδT细胞过继转移到人体中的研究可能需要共同施用γδT细胞和白细胞介素-2。然而，低剂量和高剂量的IL-2都可能具有高度的毒副作用。IL-2毒性可在多个器官/系统中表现出来，最显著的是心脏、肺、肾和中枢神经系统。另一方面，本公开内容提供了用于向受试者施用工程改造γδT细胞而不共同施用天然细胞因子或其修饰形式(例如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21)的方法。另一方面，工程改造的γδT细胞可以在不与IL-2共同施用的情况下施用于受试者。另一方面，工程改造的γδT细胞可以在手术期间施用于受试者，例如，骨髓移植而不共同施用IL-2。
给药方法
可以以任何顺序或同时向受试者施用一种或多种工程改造的γδT细胞群。如果同时施用，多重工程改造的γδT细胞可以为单次统一的剂量，例如：静脉内注射，或以多剂量提供，例如，多次静脉内输注、皮下注射或丸剂。工程改造的γδT细胞可以一起包装或单独包装在单个包装中或在多个包装中。可以以多剂量给予一种或所有工程改造的γδT细胞。如果不是同时施用，多次剂量之间的时间间隔可能不同而至多为大约一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或大约一年。另一方面，工程改造的γδT细胞可以在施用于受试者后在受试者体内扩增。可以冷冻工程改造γδT细胞以提供细胞以相同的细胞制剂进行多次治疗。本公开内容的工程改造γδT细胞和包含该细胞的药物组合物可以作为套件包装。套件可包括使用工程改造γδT细胞和包含该细胞的组合物的说明书(例如，书面说明书)。
另一方面，治疗癌症、传染病或免疫性疾病的方法包括向受试者施用治疗有效量的工程改造γδT细胞，其中所述给药治疗癌症、传染病或免疫性疾病。在另一实施方案中，治疗有效量的工程改造γδT细胞可以施用至少约10秒、30秒、1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。另一方面，治疗有效量的工程改造γδT细胞可以施用至少一周。另一方面，治疗有效量的工程改造γδT细胞可以施用至少二周。
本文所述的工程改造γδT细胞可以在疾病或病症发生之前、发生期间或发生之后施用，并且施用含有工程改造γδT细胞的药物组合物的时间可能不同。例如，工程改造的γδT细胞可以用作预防剂，并且可以连续给予有病症或疾病倾向的受试者，以减少疾病或病症发生的可能性。可以在症状发作期间或症状发作之后尽可能快地给予受试者工程改造的γδT细胞。工程改造γδT细胞可以在症状发作后立即、症状发作后的前3小时内、症状发作后的前6小时内、症状发作后的前24小时内、症状发作后的前48小时内或症状发作后的任何一段时间内给予。初始施用可通过任何实用的途径，例如：通过本文描述的任何途径使用本文描述的任何制剂给予。另一方面，本公开内容的工程改造γδT细胞可以是静脉内施用。一种或多种剂量的工程改造γδT细胞可在癌症、传染病、免疫性疾病、败血症或骨髓移植开始后尽快施用，并持续一段用于治疗免疫性疾病所必需的时间，例如，从约24小时到约48小时、从约48小时到约1周、从约1周到约2周、从约2周到约1个月、从约1个月到约3个月。对于癌症治疗，可以在癌症发作后数年和其他治疗之前或之后施用一剂或多剂量的工程改造γδT细胞。另一方面，工程改造的γδT细胞可以施用至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。每个受试者的治疗时间可能不同。
保存
一方面，γδT细胞可以在冷冻介质中配制并置于低温储存装置例如：液氮冷冻器(-196℃)或超低温冷冻器(-65℃、-80℃、-120℃或-150℃)中长期储存至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年或至少5年。冷冻培养基可以含有二甲基亚碸(DMSO)和/或氯化钠(NaCl)和/或右旋糖和/或硫酸葡聚糖和/或羟乙基淀粉(HES)以及生理pH缓冲剂，以将pH保持在约6.0至约6.5、约6.5至约7.0、约7.0至约7.5、约7.5至约8.0或约6.5至约7.5之间。冷冻保存的γδT细胞可以解冻并通过用本文所述的抗体、蛋白质、肽和/或细胞因子刺激进行进一步加工。冷冻保存的γδT细胞可以解冻并用本文所述的病毒载体(包括逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体)或非病毒手段(包括RNA、DNA，例如转座子和蛋白质)进行基因修饰。可以进一步以每mL冷冻介质中至少约101、102、103、104、105、106、107、108、109或至少约1010个细胞冷冻保存修饰的γδT细胞以产生至少约1、5、10、100、150、200、500个小瓶量的细胞库。冷冻保存的细胞库可以保留其功能并且可以解冻并进一步刺激和扩增。另一方面，可以在合适的封闭容器(例如：细胞培养袋和/或生物反应器)中刺激和扩增解冻的细胞，以产生大量细胞作为同种异体细胞产物。冷冻保存的γδT细胞可以在低温储存条件下维持其生物学功能至少约6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、15个月、18个月、20个月、24个月、30个月、36个月、40个月、50个月或至少约60个月。另一方面，制剂中不使用防腐剂。冷冻保存的γδT细胞可以解冻并作为同种异体即用型细胞产物输注到多个患者中。
一方面，本文所述的工程改造γδT细胞可能存在于组合物中，含量为至少1×103个细胞/ml、至少2×103个细胞/ml、至少3×103个细胞/ml、至少4×103个细胞/ml、至少5×103个细胞/ml、至少6×103个细胞/ml、至少7×103个细胞/ml、至少8×103个细胞/ml、至少9×103个细胞/ml、至少1×104个细胞/ml、至少2×104个细胞/ml、至少3×104个细胞/ml、至少4×104个细胞/ml、至少5×104个细胞/ml、至少6×104个细胞/ml、至少7×104个细胞
/ml、至少8×104个细胞/ml、至少9×104个细胞/ml、至少1×105个细胞/ml、至少2×105个细胞/ml、至少3×105个细胞/ml、至少4×105个细胞/ml、至少5×105个细胞/ml、至少6×105个细胞/ml、至少7×105个细胞/ml、至少8×105个细胞/ml、至少9×105个细胞/ml、至少1×106个细胞/ml、至少2×106个细胞/ml、至少3×106个细胞/ml、至少4×106个细胞/ml、至少5×106个细胞/ml、至少6×106个细胞/ml、至少7×106个细胞/ml、至少8×106个细胞/ml、至少9×106个细胞/ml、至少1×107个细胞/ml、至少2×107个细胞/ml、至少3×107个细胞/ml、至少4×107个细胞/ml、至少5×107个细胞/ml、至少6×107个细胞/ml、至少7×107个细胞
/ml、至少8×107个细胞/ml、至少9×107个细胞/ml、至少1×108个细胞/ml、至少2×108个细胞/ml、至少3×108个细胞/ml、至少4×108个细胞/ml、至少5×108个细胞/ml、至少6×108个细胞/ml、至少7×108个细胞/ml、至少8×108个细胞/ml、至少9×108个细胞/ml、至少1×109个细胞/ml或更多、从约1×103个细胞/ml至约至少1×108个细胞/ml、从约1×105个细胞/ml至约至少1×108个细胞/ml或从约1×106个细胞/ml至约至少1×108个细胞/ml。
为了开发可存活的同种异体T细胞产物，例如，其可以被工程改造以表达肿瘤抗原特异性TCR，例如嵌合CD8α-CD4tm/细胞内蛋白，本公开的实施方案可能包括可以最大限度地提高γδT细胞产量，同时最大限度地减少最终同种异体产物中存在残留αβT细胞的方法。例如，本公开内容的实施方案可能包括通过耗尽αβT细胞并用分子(例如：两性霉素B、N-乙醯半胱氨酸(NAC)(或高剂量谷氨醯胺/谷氨酸)、IL-2和/或IL-15补充生长培养物来扩增和激活γδT细胞的方法。
一方面，根据本公开内容的一个方面，本文描述的方法可以用于产生自体或同种异体产物。
通过参考以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例不用来限制权利要求的范围。
实施例施
实施例1
扩增期间用自体细胞重新刺激γδT细胞导致扩增增强和延长。
图3A和3B显示了用自体单核细胞重新刺激对γδT细胞扩增的影响。图3A显示了用于生成图3B中所呈列资料的扩增过程。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。第3天，模拟转导激活的γδT细胞。第4天，扩增模拟转导的细胞。第7天，扩增细胞用自体单核细胞(从PBMC(Miltenyi)进行CD14+选择并用ZOL(100μM)脉冲处理4小时而获得)重新刺激，比例为10(单核细胞)：1(γδT细胞)。第14天冷冻扩增细胞。
图3B显示了与无重新刺激的情况相比，用自体单核细胞重新刺激增加了从两个供体(D1和D2)获得的γδT细胞的倍数扩增。10天后，重新刺激的细胞倍数扩增减少。到14天时，重新刺激细胞的倍数扩增降至类似无重新刺激的倍数扩增。
图4A和4B显示了用经辐照的自体αβ耗尽的PBMC重新刺激对γδT细胞扩增的影响。图4A显示了用于生成图4B中所呈列资料的扩增过程。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。第2天，模拟转导激活的γδT细胞。第3天，扩增模拟转导的细胞。第7天，用经辐照(100Gy)的自体αβ-TCR表达T细胞耗尽的PBMC(用ZOL(100μM)脉冲处理4小时)重新刺激扩增的细胞，比例为5：1或10：1(αβ耗尽的PBMC：γδT细胞)。
图4B显示了与无重新刺激的情况相比，用αβ耗尽的PBMC以5：1和10：1的比例重新刺激，增加了从两个供体(D1和D2)获得的γδT细胞的倍数扩增。
图5-11显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对γδT细胞扩增的影响。
图5显示了用于生成图6-11中所呈列资料的扩增过程。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。第2天，模拟转导激活的γδT细胞。第3天，扩增模拟转导的细胞。第7天和第14天，用以下其中之一重新刺激扩增细胞：1)自体单核细胞(通过从PBMC(Miltenyi)进行CD14+选择以及用ZOL(100μM)脉冲处理4小时而获得)，比例5：1或10：1(单核细胞：γδT细胞)；或2)经辐照(100Gy)的自体αβ-TCR表达T细胞耗尽的PBMC(用ZOL(100μM)脉冲处理4小时)，比例10：1或20：1(αβ耗尽的PBMC：γδT细胞)。
图6A和6B显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对来自两个供体的γδT细胞扩增的影响。图6A显示了来自供体1的资料。在对照样本和低比例单核细胞：γδT细胞中，扩增在大约第14天达到平稳期。但是，第7天和第14天用单核细胞以10：1(单核细胞：γδT细胞)的比例或用经辐照αβ耗尽的PBMC以20：1(αβ耗尽的PBMC：γδT细胞)的比例重新刺激γδT细胞可以防止出现这种平稳期，从而显著增强扩增至少17天。例如，在第7天和第14天用经辐照αβ耗尽的PBMC以20：1(αβ耗尽的PBMC：γδT细胞)的比例重新刺激时，δ2细胞在第17天达到2498倍扩增，而没有达到平稳期。
图6B显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对来自第二个供体的γδT细胞扩增的影响。与图5B所示的资料类似，在对照样本和低比例单核细胞：γδT细胞中，扩增在大约第14天达到平稳期。但是，第7天和第14天用单核细胞以5：1或10：1(单核细胞：γδT细胞)的比例或用经辐照αβ耗尽的PBMC以10：1或20：1(αβ耗尽的PBMC：γδT细胞)的比例重新刺激γδT细胞可以防止出现这种平稳期，从而显著增强扩增至少17天。例如，在第7天和第14天用经辐照αβ耗尽的PBMC以20：1(αβ耗尽的PBMC：γδT细胞)的比例重新刺激时，δ2细胞在第17天达到305倍扩增，而没有达到平稳期。
图7A-C和8A-C显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对来自两个供体的γδT细胞扩增的影响。这些资料也汇总于下面的表1中。
表1.第21天与对照条件相比扩增的倍数变化。
Figure BDA0003893297060000531
Figure BDA0003893297060000541
如表1和图7A-C所示，供体1的倍数扩增低于供体2(参见图8A-C)。此结果可归因于第21天观察到的对照样本扩增突然增加。尽管如此，在两个供体中都很明显，用经辐照自体αβ耗尽的PMBC进行重新刺激会导致总γδT细胞的倍数扩增度高于用自体单核细胞重新刺激时。这种作用似乎主要归因于δ2T细胞的增加。
图9和10显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激不会显著改变扩增γδT细胞的记忆表型。在两个供体中用10：1单核细胞重新刺激的扩增γδT细胞中均检测到CD27表达略有增加。
图11A和11B显示了用自体单核细胞或经辐照的自体αβ耗尽的PBMC多次重新刺激对扩增γδT细胞生存力的影响。在重新刺激条件下观察到扩增γδT细胞生存力降低。这种影响在用经辐照自体αβ耗尽的PBMC重新刺激的γδT细胞(20个PBMC：1个γδT细胞)中最为明显。重新刺激后，生存力趋于下降，并在一周内反弹。
实施例2
用肿瘤衍生细胞刺激γδT细胞可增强并延长扩增。
图12A和12B显示了工程改造肿瘤衍生细胞的共培养对γδT细胞的影响。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。经辐照的肿瘤衍生细胞(K562)以2：1的比例(肿瘤衍生细胞：γδT细胞)被添加至一些样本中。其他样本在抗CD28或抗CD27 mAb包被的平板上培养。第3天，模拟转导激活的γδT细胞。第4天，扩增模拟转导的细胞。第21天冷冻扩增的细胞。
图12A和图12B显示了从两个供体(D1(图12A)和D2(图12B))获得的γδT细胞用经辐照的肿瘤衍生细胞+/-ZOL刺激具有比用抗CD28抗体+ZOL、抗CD27抗体+
ZOL和ZOL单独(对照)刺激的细胞具有更高的倍数扩增。
实施例3
用肿瘤衍生细胞刺激γδT细胞并重新刺激可增强并延长γδT细胞的扩增。
表2汇总了该实验中测试的条件。简言之，从两个供体获得的γδT细胞于第0天在存在IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)+/-唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)+/-肿瘤衍生细胞(2个肿瘤衍生细胞：1个T细胞)+/-重新刺激的情况下激活如下：a)没有肿瘤衍生细胞的情况下(对照)；b)用野生型经辐照的肿瘤衍生细胞(K562 WT)；c)在不存在ZOL的情况下用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；c-重新刺激)在不存在ZOL的情况下用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)并于第7天和第14天重新刺激；d)用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；和e)用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体1)。第2天模拟转导细胞，并于第3天扩增。第7、10、14和17天喂养细胞，并在第7和14天任选重新刺激。第21天冷冻细胞。
表2.
Figure BDA0003893297060000551
Figure BDA0003893297060000561
图13A-C显示了γδT细胞激活期间各种肿瘤衍生细胞共培养的结果。图13A显示了从两个供体(D1(左图)和D2(右图))获得的γδT细胞于第0天在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下激活的倍数扩增，激活方式如下：1)没有肿瘤衍生细胞的情况下(对照)；2)用野生型经辐照的肿瘤衍生细胞(K562WT)；3)用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体1)；4)用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；5)在不存在ZOL的情况下用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)；和6)在不存在ZOL的情况下用经辐照的修饰的肿瘤衍生细胞(K562变体2)并于第7天和第14天重新刺激。
图13B和13C显示了供体1(图13B)和供体2(图13C)中的δ1(左图)和δ2(右图)T细胞的扩增。
图14A和14B显示了供体1(图14A)和供体2(图14B)的整个活细胞群中存在γδT细胞的百分比。
图15显示，与唑来膦酸盐在培养物中的条件相比，培养物中缺乏唑来膦酸盐导致多克隆群(δ1和δ2γδT细胞皆然)。第21天收获细胞，并通过流式细胞术分析，以确定δ1和δ2群。
图16显示，肿瘤衍生的细胞共培养物不会改变扩增γδT细胞的记忆表型。第21天收获细胞，并通过流式细胞仪分析，以通过检测细胞表面上的CD45、CD27和CCR7来确定记忆表型。
实施例4
扩增期间用同种异体细胞重新刺激γδT细胞导致扩增增强和延长。
图17A和17B显示了用经辐照的同种异体PBMC重新刺激对γδT细胞扩增的影响。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2(100U/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，激活αβ-TCR表达T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)耗尽的外周血单核细胞(PBMC)(“γδT细胞”)。第2天，模拟转导激活的γδT细胞。第3天，扩增模拟转导的细胞。第7天，扩增γδT细胞被分为五个独立的组，以检查同种异体饲养细胞的重新刺激作用。具体而言，2x106个扩增γδT细胞置于每个治疗组中。治疗组如下：1)IL-2+IL-15(对照)；2)PBMC+LCL+OKT3+IL-2；3)PBMC+IL-2；4)LCL+IL-2；5)OKT3+IL-2。对于每个组，PBMC＝汇集自2-3个供体的同种异体PBMC，辐照并以25x106个细胞的量添加。LCL＝经辐照的类淋巴母细胞，并以5x106个细胞的量添加。OKT3＝可溶性OKT3，一种激活抗CD3抗体，添加量为30ng/ml。IL-2的添加量为50U/ml。
第14天重复每种重新刺激处理，于第21天收获细胞并进行分析。
图17A-B显示了与无重新刺激的情况相比，用同种异体PBMC和/或LCL重新刺激增加了从两个供体(D1和D2)获得的γδT细胞的倍数扩增，而没有生长平稳期。
图18A-C显示了用同种异体PBMC和/或LCL重新刺激产生多克隆(δ1和δ2γδT细胞)群。图18A和18B显示了两个供体的δ1细胞存在占活细胞的百分比。此资料表明，δ1细胞的存在具有供体依赖性。图18C显示了第21天两个供体对照治疗(IL-2+IL-15)和PBMC+LCL+OKT3治疗(存在IL-2)的结果。
图19A-B显示了用PBMC和/或LCL重新刺激后，扩增γδT细胞群的记忆表型。在第14天而不是第21天测量记忆表型，因此仅在第7天重新刺激一次。扩增γδT细胞群通过流式细胞术分析，以通过检测细胞表面上的CD45、CD27和CCR7来确定记忆表型。图19A显示了在扩增γδT细胞群上的CD27检测。用PBMC+LCL+OKT3重新刺激的扩增γδT细胞中，CD27的百分比似乎略有下降。图19B显示了CD45和CCR7表达。在用PBMC和用PBMC+LCL+OKT3重新刺激的扩增γδT细胞中，CCR7的百分比增加。
实施例5
产生用唑来膦酸盐脉冲处理的同种异体PBMC用于激活γδT细胞。
如以上实施例1中所示，用唑来膦酸盐(ZOL)脉冲处理、然后进行辐照的新鲜自体PBMC可用于在第7天和任选地在其他重新刺激步骤(例如，第14天等)用于重新刺激γδT细胞。但是，此方法需要从临床供体处收集数次样本。
为了避免需要多次收集，可以产生经ZOL脉冲处理的PBMC同种异体库，以用于一次或多次重新刺激。这些PBMC同种异体库按以下方式生成：从供体中收集的冷冻同种异体PBMC(包括αβT细胞)解冻，并用100μM ZOL脉冲处理4小时。然后，这些经ZOL处理的同种异体PBMC进行洗涤并冷冻。含有ZOL处理的同种异体PBMC的冷冻小瓶以50Gy辐照，并保存以备将来使用。在制造过程的第7天，这些经ZOL处理的经辐照同种异体PBMC解冻进行重新刺激。
实施例6
转导γδT细胞的肽特异性杀伤活性
通过表3中所示的扩增方法制备转导γδT细胞。
表3
Figure BDA0003893297060000591
以上工艺从工艺1产生了6.8％的肽/MHC-特异性TCR转导γδT(Tet+)细胞，从工艺2产生了21.9％的Tet+细胞，从工艺3产生了47.4％的Tet+细胞，从对照工艺产生了28.8％的Tet+细胞。为了确定TCR转导的γδT细胞(TCR-T)的肽特异性杀伤活性，效应T细胞(即，通过工艺1、2、3或对照工艺扩增的γδT细胞)与肿瘤细胞(例如，肽阳性U2OS细胞，其中每个细胞可提呈约242个拷贝，和肽阴性MCF-7细胞)以3：1(效应细胞：肿瘤细胞)的比例进行共培养。非转导γδT细胞(NT)用作阴性对照。使用Incucyte活细胞分析系统即时分析肿瘤细胞的生存力/死亡。图20A显示，针对肽阳性U2OS细胞，通过工艺3扩增的γδT细胞(TCR-T)的杀伤活性显著高于通过工艺1或工艺2扩增的杀伤活性，并且与通过对照工艺(TCR-T)扩增的杀伤活性相似。通过工艺2、工艺3和对照工艺扩增的γδTCR-T细胞显示出比其各自γδNT细胞更高的杀伤活性。通过工艺1扩增的γδTCR-T细胞和γδNT细胞的杀伤活性之间似乎无显著差异。图20B显示，针对肽阴性MCF-7，通过各种工艺扩增的γδT细胞(TCR-T)的杀伤活性似乎与各自的未转导γδT细胞(NT)细胞的杀伤活性相似。这些结果表明，通过工艺2、工艺3和对照工艺扩增的TCR转导γδT细胞可以以肽特异性方式识别和杀死肿瘤细胞。
实施例7
γδT细胞制造的优化
图21显示了γδT细胞的制造工艺，例如对照工艺和工艺1-3(表3)，其中可在存在饲养细胞和/或激动剂I或II(例如，抗CD3、抗CD28、抗41BB、抗ICOS、抗CD40和抗OX40抗体)的情况下解冻、激活和/或扩增细胞。饲养细胞于第0天(工艺1)或第7天(重新刺激)和第14天(重新刺激)(工艺2和工艺3)添加。图22A-22D显示，通过对照工艺(无饲养细胞)(图22A)制备的γδT细胞中观察到的生长平稳期通过饲养细胞刺激(例如，工艺1(图22B)、工艺2(图22C)和工艺3(图22D))克服。通过对照工艺、工艺2和工艺3产生的细胞中观察到激活后γδT细胞损失在工艺1产生细胞时得到改善。另一方面，工艺2和工艺3产生的γδT细胞比工艺1产生的γδT细胞表现出更高的倍数扩增。通过工艺3产生的γδT细胞至少扩增了10,000倍。
通过工艺3产生的γδT细胞表现出“更年轻的”T细胞表型
分析了由对照工艺和工艺1-3产生的γδT细胞的表型。图23A显示了由工艺3在第14天和第21天产生的γδT细胞比由对照工艺、工艺1和工艺2产生的γδT细胞具有更高％的γδT细胞表现出Tcm表型，例如，CD27+CD45RA-。同样地，通过工艺3在第14天和第21天产生的γδT细胞比对照工艺、工艺1和工艺2产生的γδT细胞具有更高％的γδT细胞表现出Tcm表型，例如CD62L+(图23B)，以及更低％的γδT细胞表现出非Tcm表型，例如CD57+(图23C)。(n＝4；平均值+SD；与对照相比采用图基事后检验法的ANOVA；****p<0.0001；***p<0.001；**p<0.01；*p<0.5)。
对通过各种工艺产生的γδT细胞中免疫检查点蛋白表达的影响
为了确定通过各种工艺产生的γδT细胞中免疫检查点蛋白表达，确定了PD1+(图24A)、LAG3+(图24B)、TIM3+(图24C)和TIGIT+(图24D)γδT细胞百分比。图24A显示，在第14天，与对照工艺(C)相比，工艺1-3所产生的PD1+γδT细胞百分比降低。另一方面，由工艺1产生的PD1+γδT细胞的百分比从第14天到第21天呈增加状态。由工艺2和工艺3产生的PD1+γδT细胞的百分比从第14天到第21天似乎相当。图24B显示，第14天由工艺2和3产生的LAG3+γδT细胞百分比与对照工艺(C)相比增加。虽然从第14天到第21天由工艺2和工艺3产生的LAG3+γδT细胞百分比似乎相当，但是从第14天到第21天由工艺1产生的LAG3+γδT细胞百分比增加。图24C显示，从第14天到第21天由工艺1-3产生的TIM3+γδT细胞％降低。图24D显示，从第14天到第21天由工艺1-3产生的TIGIT+γδT细胞％降低。
对通过各种工艺产生的γδT细胞的转基因表达的影响
由工艺1-3和对照工艺(C)产生的γδT细胞通过编码CD8αβ和TCRαβ的病毒载体(PTE.CD8.TCR.WPRE)转导，接着进行靶肽(PRAME)/MHC四聚体(Tet)染色。图25A显示，第一次重新刺激后第14天，由工艺3产生的PTE.CD8.TCR.WPRE转导的Tet+γδT细胞％高于工艺1、工艺2和对照工艺产生的％。非转导(NT)细胞用作阴性对照。通过工艺3产生的PTE.CD8.TCR.WPRE转导的γδT细胞比对照工艺(18.4％，图26A)和工艺2(12.1％，图26B)产生的γδT细胞可产生更多的CD8+PRAME Tet+γδT细胞(39％，图26C)。MFI在各转导条件下相似。图25B显示，通过工艺3产生的掺入γδT细胞的转基因拷贝数为约2拷贝/细胞，这与对照工艺产生的拷贝数相当，并且高于工艺1和工艺2产生的拷贝数。
工艺1中初始K562刺激对转导和扩增的影响
为了确定初始K562刺激对通过工艺1制备的γδT细胞产物的影响，如图27A所示，在第2天用PTE.CD8.TCR.WPRE转导之前于第0天刺激γδT细胞，或在第2天用PTE.CD8.TCR.WPRE转导后于第4天刺激γδT细胞。图27B显示在有或没有转导的情况下于第4天刺激的γδT细胞的倍数扩增比在第0天刺激的低。图28A-28C显示，对于在第0天用K562细胞刺激的γδT细胞，用60μl、120μl和240μl PTE.CD8.TCR.WPRE转导的γδT细胞分别产生8.62％、17.5％和31.1％的CD8+PRAME Tet+细胞。图28D显示了整合转基因的拷贝数。尽管用240μl PTE.CD8.TCR.WPRE转导的γδT细胞产生了31.1％的CD8+PRAME Tet+细胞(图28C)，但整合转基因的拷贝数为7.53拷贝/细胞，其超过了5拷贝/细胞的安全极限。相比之下，图28E显示，用60μl PTE.CD8.TCR.WPRE转导、然后在第4天用K562细胞刺激的γδT细胞产生了31.8％的CD8+PRAME Tet+细胞，整合转基因的拷贝数为1.71拷贝/细胞。这些资料表明，虽然转导后第4天的K562刺激可产生足够的转导，从而比转导前第0天刺激的T细胞产物更好、更安全，但它可能会限制扩增。
重新刺激对转基因表达的影响
图29显示，转基因(PTE.CD8.TCR.WPRE)表达，例如，CD8+PRAME Tet+γδ细胞％(1)对于由工艺1(n＝2)在第4天刺激产生的细胞，从第14天到第21天增加；(2)对于由工艺2(n＝4)在第7天和第14天重新刺激产生的细胞，从第7天到第21天降低；(3)对于由工艺3(n＝4)在第7天和第14天重新刺激产生的细胞，从第7天到第14天增加，然后从14天到第21天降低。对于由对照工艺产生的细胞，转基因表达保持在相似的水平。
对通过各种工艺产生的γδT细胞功能的影响
图30显示了在第7天第一次重新刺激后于第14天进行的功能评估。由工艺2和3以及对照工艺(C)产生的γδT细胞用PTE.CD8.TCR.WPRE转导(分别为2-T、3-T和C-T)，也可以不转导(分别为2-NT、3-NT和C-NT)。用相同TCR进行转导或不进行转导的CD8+αβT细胞作为阳性对照(P-T和P-NT)。如此制备的细胞与靶细胞，例如UACC257(每个细胞约1081个目标肽)、U2OS(每个细胞约242个目标肽)、A375(每个细胞约51个目标肽)和MCF-7(每个细胞0个目标肽)一起孵育，效应子/靶标比例为3：1，然后进行细胞毒性试验。将效应细胞对转导效率标准化。图31A-31C分别显示，在第一次重新刺激之后，由工艺2(2-T)和工艺3(3-T)产生的γδT细胞针对UACC257、U2OS和A375细胞的溶细胞活性低于CT和PT的溶细胞活性。图31D显示，由工艺2(2-T)和工艺3(3-T)产生的γδT细胞针对非靶MCF7细胞的溶细胞活性最小。(与对照相比，采用图基事后检验法的ANOVA；n＝4个供体；**p<0.01；*p<0.5)
图32A和32B分别显示，在第一次重新刺激之后，由工艺2(2)和工艺3(3)产生的γδT细胞针对UACC257和U2OS细胞的IFNγ分泌与对照工艺(C)产生的IFNγ分泌相当，效应子/靶标比例为3：1。将效应细胞对转导效率标准化。图32C显示，由工艺2(2)和工艺3(3)产生的γδT细胞针对非靶MCF7细胞的IFNγ分泌最小。未转导(NT)细胞作为阴性对照。用相同TCR进行转导的CD8+αβT细胞作为阳性对照(P)。(n＝2个供体；2个技术重复/供体)
图33A和33B分别显示，在第一次重新刺激之后，由工艺2(2)和工艺3(3)产生的γδT细胞针对UACC257和U2OS细胞的TNFα分泌与对照工艺(C)产生的TNFα分泌相比下降，效应子/靶标比例为3：1。将效应细胞对转导效率标准化。图33C显示，由工艺2(2)和工艺3(3)产生的γδT细胞针对非靶MCF7细胞的TNFα分泌最小。未转导(NT)细胞作为阴性对照。用相同TCR进行转导的CD8+αβT细胞作为阳性对照(P)。(n＝2个供体；2个技术重复/供体)
图34A显示，在第一次重新刺激之后，由工艺3(3)产生的γδT细胞针对UACC257的GM-CSF分泌与工艺2(2)和对照工艺(C)产生的GM-CSF分泌相比增加，效应子/靶标比例为3：1。将效应细胞对转导效率标准化。图34B显示，针对表达较少数目靶肽的U2OS细胞未观察到GM-CSF的这种增加。图34C显示，由工艺2(2)和工艺3(3)产生的γδT细胞针对非靶MCF7细胞的GM-CSF分泌最小。未转导(NT)细胞作为阴性对照。用相同TCR进行转导的CD8+αβT细胞作为阳性对照(P)。(n＝2个供体；2个技术重复/供体)此外，未转导细胞与转导细胞之间在IL-6、穿孔素和颗粒酶B的表达水平上无差异。经过测试但低于检测限制的其他分析物包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70和IL-17a。
通过各种工艺产生的γδT细胞杀死肿瘤细胞
肿瘤细胞杀伤测定以5：1的效应子/靶标比例进行。使用UACC257细胞(每个细胞约1081个靶肽)将效应细胞对转导效率标准化。如图所示，UACC257细胞在三个不同的时间点添加进行测定。图35A显示，UACC257肿瘤细胞生长受到由工艺1(第4天刺激)、工艺2和对照工艺产生的获自供体1的γδT细胞的抑制。用相同TCR进行转导的CD8+αβT细胞作为阳性对照(P)。图35B显示，UACC257肿瘤细胞生长受到由工艺2、工艺3和对照工艺产生的获自供体2的γδT细胞的抑制。用相同TCR进行转导的CD8+αβT细胞作为阳性对照(P)。
免疫检查点分子(例如LAG3、PD-1、TIGIT和TIM3)在通过各种工艺经过多达3次肿瘤刺激后(1、2和3)产生的PTE.CD8.TCR.WPRE所转导的γδT细胞中的表达被确定。图36显示，通过工艺1、工艺2和对照工艺产生的γδT细胞中，LAG3、PD-1、TIGIT和TIM3的表达似乎相当。用相同TCR进行转导的CD8+αβT细胞作为阳性对照(阳性)。
实施例8
组蛋白脱乙醯基酶抑制剂(HDACi)和IL-21对γδT细胞制造的影响
Wang等人的文献显示，HDACi和IL21可以合作将人类效应子CD8+T细胞重新编程为记忆T细胞。(Cancer Immunol Res June 1 2020(8)(6)794-805；其内容在此通过引用整体并入)。例如，用HDACi(例如，辛二醯苯胺异羟肟酸(SAHA)或帕比司他(Pano))预处理肿瘤浸润淋巴细胞，培养2周后，在IL-21存在的情况下，可以增加TcmαβT细胞(CD28+CD62L+)。
为了测试HDACi+IL-21对由工艺3饲养细胞制备的T细胞产物的影响，图37显示了实验设计，例如在条件4下，γδT细胞可以在第0天在存在唑来膦酸盐+IL-2+IL-15的情况下激活，从第0天到第6天在存在IL-2+IL-15的情况下扩增，然后在第7天由工艺3饲养细胞在没有细胞因子的情况下再次刺激，接着从第8天到第14天在存在HDACi+IL-21+IL-2+IL-15的情况下进行扩增。在条件5下，γδT细胞可以在第0天在存在唑来膦酸盐+IL-2+IL-15的情况下激活，从第0天到第6天在存在HDACi+IL-21+IL-2+IL-15的情况下扩增，然后在第7天由工艺3饲养细胞在没有细胞因子的情况下再次刺激，接着从第8天到第14天在存在IL-2+IL-15的情况下进行扩增。
图38显示，在不存在HDACi和IL-21的情况下，在第7天和第14天通过工艺3饲养细胞(汇集的经辐照同种异体PBMC+LCL+OKT3)重新刺激与工艺1饲养细胞(辐照的K562-41BBL-mbIL15)、工艺2饲养细胞(唑来膦酸盐脉冲处理的经辐照同种异体PBMC)和对照工艺(无饲养细胞)再次刺激相比，前者在第14天和第21天产生更多的CD28+CD62L+γδT细胞。对于所有工艺，在第14天第二次重新刺激后，CD28+CD62L+γδT细胞数量减少。(n＝4；平均值+SD；与对照组相比，经多次比较的ANOVA；***p<0.0005；*p<0.5)
考察了第7天通过工艺3饲养细胞(汇集的辐照同种异体PBMC+LCL+OKT3)首次重新刺激后，在条件4(IL-21+HDACi(w2))和条件5(IL-21+HDACi(w1))下的γδT细胞倍数扩增。图39A-39C显示了，从用对照工艺(无IL-21+HDACi)、第1周(w1)期间用IL-21+HDACi(条件5)和第2周(w2)期间用IL-21+HDACi(条件4)处理的3个不同供体(SD01004687(图39A)、D155410(图39B)和SD01000256(图39C)获得的γδT细胞的倍数扩增。结果显示，第1周(w1)期间用IL-21+HDACi(条件5)制备的γδT细胞倍数扩增低于第2周(w2)期间用IL-21+HDACi(条件4)和对照工艺制备的γδT细胞。但是，这种减少在存在IL-2+IL-15的情况下扩增细胞后，于第14天恢复(**表示工艺3饲养细胞重新刺激)。
考察了第7天通过工艺3饲养细胞首次重新刺激后，在条件4(IL-21+HDACi(w2))和条件5(IL-21+HDACi(w1))下的δ2和δ1T细胞。图40A-40C显示了，用对照工艺(图40A)、IL-21+HDACi(w1)(图40B)和IL-21+HDACi(w2)(图40C)处理的活δ2和δ1T细胞的百分比。图40B显示了与通过对照工艺(图40A)制备相比，在存在HDACi+IL21(IL-21+HDACi(w1))的情况下第一周培养期间，δ2T细胞数量减少。图40C显示，在存在HDACi+IL21(IL-21+HDACi(w2))的情况下第二周培养期间，δ2和δ1T细胞与通过对照工艺(图40A)制备的相当。(**表示工艺3饲养细胞重新刺激)
图41A显示，在第一周培养期间(IL-21+HDACi(w1))(条件5)的HDACi+IL-21在第二周期间改为IL-2+IL-15导致CD28+CD62L+TcmγδT细胞减少。另一方面，在第一周培养期间的IL-2+IL-15在第二周期间改为IL-21+HDACi(w2)(条件4)导致CD28+CD62L+TcmγδT细胞增加。(n＝3；平均值+SD；与对照组相比，经多次比较的ANOVA；****p<0.0001，**p<0.005)
类似地，图41B显示，在第一周培养期间(IL-21+HDACi(w1))(条件5)的HDACi+IL-21在第二周期间改为IL-2+IL-15导致CD27+CD45RA-TcmγδT细胞减少。另一方面，在第一周培养期间的IL-2+IL-15在第二周期间改为IL-21+HDACi(w2)(条件4)导致CD27+CD45RA-TcmγδT细胞增加。(n＝3；平均值+SD；与对照组相比，经多次比较的ANOVA；****p<0.0001，**p<0.005)
图41C显示，在第一周培养期间(IL-21+HDACi(w1))(条件5)或第二周培养期间(IL-21+HDACi(w2))(条件4)的HDACi+IL-21对CD57+γδT细胞几乎没有影响。(n＝3；平均值+SD；与对照组相比，经多次比较的ANOVA；**p<0.0005；*p<0.5)
总之，HDACi+IL-21可以促进γδT细胞中的Tcm。但是，在去除HDACi+IL-21之后，可以恢复这种Tcm表型。此外，如果在第一周培养期间(第0天至第7天)使用HDACi+IL-21，则HDACi+IL-21可能会影响扩增以及δ1和δ2T细胞亚群的百分比。
实施例9
在存在IL-12和IL-18的情况下重新刺激对γδT细胞制造的影响
图42显示，在第0天，将PBMC中表达αβTCR的T细胞耗尽，随后在存在唑来膦酸盐(ZOL)(5μM)、IL-2和IL-15的情况下激活。然后在存在IL-2和IL-15的情况下扩增细胞。第7天，在存在IL-2和IL-15的情况下连续扩增细胞，或者在存在IL-12和IL-18且没有IL-2和IL-15的情况下从第7天至第14天扩增细胞(细胞因子转换)。细胞因子转换降低了γδT细胞扩增，这表明用IL-12和IL-18长期培养可能会对γδT细胞的生长产生负面影响。在第0、7、10和14天，测定表达IL-2受体(例如，IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2γ)、IL-7受体(例如，IL-7Rα)和IL-21受体(IL-21R)的γδT细胞％。结果显示，从第7天到第14天，细胞因子从IL-2+IL-15转换为在没有IL-2和IL-15的情况下的IL-12+IL-18，增加了从两个供体(D155410(图43A)和SD010004867(图43B))获得的细胞中表达IL-2Rα、IL-2Rγ和IL-21R的γδT细胞％。虚线表示IL-12+IL-18的条件(细胞因子转换)。细胞因子转换对表达IL-2Rβ和IL-7Rα的γδT细胞％几乎没有影响。
为了测试在条件3(第7天重新刺激的IL-12+IL-18启动和重新刺激后的IL-2+IL-15)对γδT细胞扩增的影响，对通过条件1(对照)、条件2(IL-2+IL-15)和条件3(图37所示)产生的细胞倍数扩增进行了比较。与对照和条件2(IL-2+IL-15)相比，IL-12+IL-18启动(条件3)对γδT细胞扩增几乎没有影响。从3个供体(SD01004687(图44A)、D155410(图44B)和SD010000256(图44C))获得的细胞中，用IL-12+IL-18启动和不用IL-12+IL-18启动(IL-2+IL-15)的γδT细胞之间的倍数扩增无显著差异。此外，与对照工艺(图45C)相比，用IL-12+IL-18启动(图45A)和不用IL-12+IL-18启动(IL-2+IL-15)(图45B)制备的δ1T细胞％和δ2T细胞％之间无显著差异。通过如图37所示之条件1(对照)、条件2(IL-2+IL-15)和条件3(IL-12+IL-18启动)制备的δ2T细胞表型于第14天(IL-12+IL-18启动后7天)进行了评估，n＝3个供体。图46A显示，与对照和IL-2+IL-15相比，通过IL-12+IL-18启动制备的γδT细胞的Tcm表型(例如，CD27+CD45RA-)显著降低。图46B显示，与对照和IL-12+IL-18启动相比，通过IL-2+IL-15制备的γδT细胞的Tcm表型(例如，CD28+CD62L+)显著降低。图46C显示，在通过对照、IL-2+IL-15和IL-12+IL-18启动产生的细胞中，γδT细胞的非Tcm表型(例如，CD57+)最少。
总之，细胞因子转换或IL-12+IL-18启动可能不会影响扩增或δ1和δ2T细胞亚群的百分比。与对照方法相比，截至第14天，细胞因子转换或IL-12+IL-18启动可减少TcmγδT细胞。
实施例10
使用野生型(WT)K562与K562-41BBL-mbIL15进行初始刺激对γδT细胞制造的影响
表4
Figure BDA0003893297060000671
Figure BDA0003893297060000681
从两个供体(D148960和SD01000723)获得的γδT细胞使用根据表4所示工艺的K562 WT、K562-41BB-mbIL15或K562-CD86(工程改造为表达CD86的K562细胞)饲养细胞进行初始刺激而制备。
结果表明，通常情况下，通过工艺b-f制备的获自两个供体(D148960(图47A)和SD01000723(图47B))的泛γδT细胞的倍数扩增高于工艺a(对照)制备的。用K562WT(工艺b)或K562-41BB-mbIL15(工艺c、d和e)进行初始刺激产生相当的结果。通常情况下，通过工艺b-f制备的获自两个供体(D148960(图48A和48B)和SD01000723(图49A和49B))的δ1和δ2亚群T细胞的倍数扩增高于工艺a(对照)制备的。
本专利说明书中引用的所有参考文献均透过引用并入本文，如同每篇参考文献被具体和单独地指出透过引用并入。任何参考文献的引用均为其在申请日之前的公开内容，不应解释为认可本公开内容无权先于凭借之前发明的此类参考文献。
应当理解，上述每个元素或者两个或更多个元素一起也可以在与上述类型不同的其他类型方法中找到有用的应用。在无进一步分析的情况下，前述内容同样充分地揭示本公开的要点，其他人可以透过应用当前知识，容易地将其适用于各种应用场合而不会遗漏从现有技术观点来看公平构成所附权利要求中阐述的本公开的通用或具体方面基本特点的特征。前述实施方案仅作为示例呈现；本公开内容的范围仅透过以下权利要求进行限制。
序列名单
<110> 伊玛提克斯美国公司
<120> 扩增 T 细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法
<130> P209WO; 3000011-020977
<150> US 62/980,844
<151> 2020-02-24
<150> US 63/038,008
<151> 2020-06-11
<150> US 63/082,881
<151> 2020-09-24
<160> 167
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白 RD114TR
<400> 1
Met Lys Leu Pro Thr Gly Met Val Ile Leu Cys Ser Leu Ile Ile Val
1 5 10 15
Arg Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Ala Leu Val Gln Lys
20 25 30
Gln His Gly Lys Pro Cys Glu Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Ala
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Ile Gln Gln Val Thr Cys Pro Gly Lys Thr Ala Tyr
50 55 60
Leu Met Thr Asn Gln Lys Trp Lys Cys Arg Val Thr Pro Lys Ile Ser
65 70 75 80
Pro Ser Gly Gly Glu Leu Gln Asn Cys Pro Cys Asn Thr Phe Gln Asp
85 90 95
Ser Met His Ser Ser Cys Tyr Thr Glu Tyr Arg Gln Cys Arg Arg Ile
100 105 110
Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Ser
115 120 125
Leu Asn Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Gln Ser
130 135 140
Pro Cys Arg Gly Ser Ile Asn Gln Pro Val Cys Trp Ser Ala Thr Ala
145 150 155 160
Pro Ile His Ile Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Lys Arg Val
165 170 175
Trp Thr Val Gln Lys Arg Leu Glu Gln Ile His Lys Ala Met Thr Pro
180 185 190
Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Leu Pro Lys Val Arg Asp Asp Leu
195 200 205
Ser Leu Asp Ala Arg Thr Phe Asp Ile Leu Asn Thr Thr Phe Arg Leu
210 215 220
Leu Gln Met Ser Asn Phe Ser Leu Ala Gln Asp Cys Trp Leu Cys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu Thr
245 250 255
Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile Pro
260 265 270
Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Ser
275 280 285
Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val Thr
290 295 300
Phe Thr Asn Cys Thr Ser Val Ala Asn Val Ser Ser Pro Leu Cys Ala
305 310 315 320
Leu Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr
325 330 335
Leu Pro Gln Asn Trp Thr Arg Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu Pro
340 345 350
Asp Ile Asp Ile Asn Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile
355 360 365
Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro Leu
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly
385 390 395 400
Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu Ile
405 410 415
Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln
420 425 430
Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp
435 440 445
Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys
450 455 460
Cys Cys Phe Tyr Ala Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile Arg
465 470 475 480
Thr Leu Gln Glu Glu Leu Gln Lys Arg Arg Glu Ser Leu Ala Ser Asn
485 490 495
Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Phe Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Leu
500 505 510
Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Gly Pro Cys
515 520 525
Val Phe Asn Arg Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val
530 535 540
Gln Ala Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Lys Pro Leu
545 550 555
<210> 2
<211> 662
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猫内源性病毒
<400> 2
Met Lys Pro Pro Ala Gly Met Val Phe Leu Trp Val Leu Thr Ser Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Ile Gly Ala Lys Ile Val Lys Glu Gly Asn Pro His Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Leu Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Ser Gly Glu Val Val
35 40 45
Trp Glu Val Gln Gly Asn His Ala Leu Asn Thr Trp Trp Pro Pro Leu
50 55 60
Thr Pro Asp Phe Cys Gln Leu Ala Ala Gly Leu Asp Thr Trp Asp Ile
65 70 75 80
Pro Ala Arg Ser Pro Lys Asn Leu Gln Ser Tyr Met Gly Glu Arg Ile
85 90 95
Gln Gln Met Thr Ala His Gly Cys Ser Ser Pro Thr Ala Arg Cys Arg
100 105 110
Leu Ala Gln Ala Glu Phe Tyr Val Cys Pro Arg Asp Asn Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Thr Ala His Arg Cys Gly Gly Tyr Glu Glu Tyr Phe Cys Ser Ala
130 135 140
Trp Gly Cys Glu Thr Thr Gly Asp Ala Tyr Trp Gln Pro Thr Ser Ser
145 150 155 160
Trp Asp Leu Ile Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Thr Lys Pro Asp Pro Asp
165 170 175
Gly His Thr Cys Tyr Tyr Lys Lys Gly Thr Glu Gly Tyr His His Trp
180 185 190
Ile Ser Pro Leu Ser Leu Pro Leu Lys Ile Thr Phe Thr Asp Ser Gly
195 200 205
Lys Arg Ala Leu Gly Trp Gln Thr Gly Tyr Thr Trp Gly Leu Arg Trp
210 215 220
Tyr Leu Pro Gly Lys Asp Arg Gly Ile Val Leu Lys Ile Lys Leu Lys
225 230 235 240
Ile Asp Thr Ile Thr Gln Thr Val Gly Pro Asn Leu Val Leu Ala Asp
245 250 255
Gln Lys Ala Pro Val Gln Leu Ala Ile Pro Val Gln Pro Pro Arg Ala
260 265 270
Pro Thr Gln Thr Pro Gly Ile Asn Pro Val Asn Ser Thr Leu Ser Pro
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Ser Leu Gly Tyr Pro Thr Pro Pro Leu Asp Arg Ala Gln Gly Asp Arg
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Leu Leu Asn Leu Val Gln Gly Val Tyr Leu Thr Leu Asn Leu Thr Ala
305 310 315 320
Pro Asn Gln Thr Gln Asp Cys Trp Leu Cys Leu Thr Ala Lys Pro Pro
325 330 335
Tyr Tyr Gln Gly Val Ala Ile Ile Gly Asn Phe Thr Asn His Thr Asn
340 345 350
Ala Pro Leu Arg Cys Ser Thr Thr Pro Arg His Gly Leu Thr Leu Thr
355 360 365
Glu Val Thr Gly His Gly Leu Cys Ile Gly Lys Ile Pro Pro Ser His
370 375 380
Gln Asn Leu Cys Ser Gln Thr Ile Pro Ser Val Gly Gln Gly Pro Tyr
385 390 395 400
Tyr Leu Thr Ala Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Val Cys Asn Thr Gly Leu
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Thr Pro Cys Ile Ser Leu Gln Val Leu Asn Asn Thr Ala Asp Tyr Cys
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Ile Leu Ile Glu Leu Trp Pro Lys Ile Phe Tyr His Asp Ser Glu Tyr
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Ile Tyr Gly His Tyr Glu Pro Gly Gly Arg Phe Arg Arg Glu Pro Val
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Ser Leu Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Gly Leu Thr Met Gly Ser Leu
465 470 475 480
Ala Ala Gly Ile Gly Thr Gly Thr Ala Ala Leu Ile Glu Thr Asn Gln
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Thr Gly Ile Val Arg Asp Ser Met Ala Lys Leu Arg Glu Arg Leu Lys
565 570 575
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Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Arg Gln Phe Asp Ala Glu
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<213> 人工序列
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<223> 水疱性口炎病毒
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260 265 270
Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile
275 280 285
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Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
500 505 510
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<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 长臂类人猿白血病病毒
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Gly Lys Leu Ser Lys Asp Trp Ile Thr Gly Lys Thr Trp Gly Leu Arg
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Leu Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu
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Thr Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile
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Pro Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu
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Ser Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val
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Tyr Leu Pro Gln Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu
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Pro Asp Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala
355 360 365
Ile Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro
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Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr
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Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu
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Ile Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp
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435 440 445
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Cys Val Phe Ser Arg Leu Met Ala Phe Ile Asn Asp Arg Leu Asn Val
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Val His Ala Met Val Leu Ala Gln Gln Tyr Gln Ala Leu Lys Ala Glu
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Phe Leu Val Asp Gly Ser Ser Ala Leu
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Phe Leu Phe Asp Gly Ser Ala Asn Leu Val
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Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu
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Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu
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Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val
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Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
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Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 61
Gly Leu Leu Gly Lys Val Thr Ser Val
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Lys Met Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu
1 5
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Tyr Leu Glu Asp Gly Phe Ala Tyr Val
1 5
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val
1 5 10
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met
1 5
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Ile Ser Leu Asp Glu Val Ala Val Ser Leu
1 5 10
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Lys Leu Ile Gly Asn Ile His Gly Asn Glu Val
1 5 10
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Ile Leu Leu Ser Val Leu His Gln Leu
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Leu Asp Ser Glu Ala Leu Leu Thr Leu
1 5
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Val Leu Gln Glu Asn Ser Ser Asp Tyr Gln Ser Asn Leu
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
His Leu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Ala Gln Val
1 5 10
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Ser Leu Val Glu Asn Ile His Val Leu
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Ser Leu Ser Glu Lys Ser Pro Glu Val
1 5
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Ala Met Phe Pro Asp Thr Ile Pro Arg Val
1 5 10
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Phe Thr Ala Glu Phe Leu Glu Lys Val
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Ala Leu Tyr Gly Asn Val Gln Gln Val
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Leu Phe Gln Ser Arg Ile Ala Gly Val
1 5
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Ile Leu Ala Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Arg Val
1 5 10
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu
1 5
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Leu Leu Leu Pro Leu Glu Leu Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val
1 5
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Ala Ile Leu Asn Val Asp Glu Lys Asn Gln Val
1 5 10
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Arg Leu Phe Glu Glu Val Leu Gly Val
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Tyr Leu Asp Glu Val Ala Phe Met Leu
1 5
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Lys Leu Ile Asp Glu Asp Glu Pro Leu Phe Leu
1 5 10
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Lys Leu Phe Glu Lys Ser Thr Gly Leu
1 5
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Ser Leu Leu Glu Val Asn Glu Ala Ser Ser Val
1 5 10
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5 10
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Gly Leu Tyr Pro Val Thr Leu Val Gly Val
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Glu Glu Leu
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Ala Leu Tyr Val Gln Ala Pro Thr Val
1 5
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Lys Leu Ile Tyr Lys Asp Leu Val Ser Val
1 5 10
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Ser Leu Leu Asp Tyr Glu Val Ser Ile
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Leu Leu Gly Asp Ser Ser Phe Phe Leu
1 5
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Phe Leu Phe Val Asp Pro Glu Leu Val
1 5
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Ser Glu Trp Gly Ser Pro His Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Ala Leu Ser Glu Leu Glu Arg Val Leu
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Val Leu Leu Asn Glu Ile Leu Glu Gln Val
1 5 10
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Lys Met Ser Glu Leu Gln Thr Tyr Val
1 5
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Ala Leu Leu Glu Gln Thr Gly Asp Met Ser Leu
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile Thr Val
1 5 10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Lys Gln Phe Glu Gly Thr Val Glu Ile
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Lys Leu Gln Glu Glu Ile Pro Val Leu
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ala Leu Ala Gly Ile Val Thr Asn Val
1 5
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Lys Val Leu Glu His Val Val Arg Val
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Leu Leu Trp Gly Asn Leu Pro Glu Ile
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Ser Leu Met Glu Lys Asn Gln Ser Leu
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu
1 5
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Ala Leu Gly Asp Lys Phe Leu Leu Arg Val
1 5 10
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Phe Leu Met Lys Asn Ser Asp Leu Tyr Gly Ala
1 5 10
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Lys Leu Ile Asp His Gln Gly Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Gly Pro Gly Ile Phe Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro
1 5 10
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
Ala Leu Asn Glu Ser Leu Val Glu Cys
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Gly Leu Ala Ala Leu Ala Val His Leu
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 133
Leu Leu Leu Glu Ala Val Trp His Leu
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Ser Ile Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Leu
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Phe Leu Leu Asp Lys Pro Gln Asp Leu Ser Ile
1 5 10
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Tyr Leu Leu Asp Met Pro Leu Trp Tyr Leu
1 5 10
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Gly Leu Leu Asp Cys Pro Ile Phe Leu
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
Val Leu Ile Glu Tyr Asn Phe Ser Ile
1 5
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
1 5 10
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Val
1 5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Lys Leu Gln Glu Glu Leu Asn Lys Val
1 5
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Lys Leu Met Asp Pro Gly Ser Leu Pro Pro Leu
1 5 10
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Ala Leu Ile Val Ser Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val
1 5
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Ala Leu Asp Pro Ser Gly Asn Gln Leu Ile
1 5 10
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Ile Leu Ile Lys His Leu Val Lys Val
1 5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149
Val Leu Leu Asp Thr Ile Leu Gln Leu
1 5
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Ser Met Asn Gly Gly Val Phe Ala Val
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Met Leu Ala Glu Lys Leu Leu Gln Ala
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val
1 5
<210> 154
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Ala Leu Trp Leu Pro Thr Asp Ser Ala Thr Val
1 5 10
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Gly Leu Ala Ser Arg Ile Leu Asp Ala
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Ala Leu Ser Val Leu Arg Leu Ala Leu
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Leu
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
Val Tyr Leu Pro Lys Ile Pro Ser Trp
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159
Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu
1 5
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 160
Val Tyr Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ile
1 5
<210> 161
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 161
Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe
1 5 10
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 162
Val Leu Ser Pro Phe Ile Leu Thr Leu
1 5
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 163
His Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val
1 5
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 164
Ala Leu Arg Glu Glu Glu Glu Gly Val
1 5
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 165
Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr
1 5 10
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 166
Thr Leu Asp Glu Lys Val Ala Glu Leu
1 5
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT肽
<400> 167
Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Gln Arg Cys
1 5 10

Claims (80)

1.权利要求内容为：
一种制备γδT细胞的方法，其包括：
从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞，
在存在饲养细胞以及至少一种任选地选自白介素(IL)-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、干扰素(IFN)-α和IFN-β组成的组中的细胞因子的情况下，激活分离的γδT细胞，
将含有编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体引入激活的γδT细胞中，以及
扩增引入的γδT细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中，血液样本包含白细胞分离产物。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，血液样本包含外周血单核细胞(PBMC)。
4.权利要求1至3任一项中所述的方法，其中，所述激活进一步在存在氨基二膦酸盐的情况下进行。
5.权利要求4所述的方法，其中氨基二膦酸盐包括帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其盐和/或其水合物。
6.权利要求4或5所述的方法，其中氨基二膦酸盐包含唑来膦酸。
7.权利要求1至6任一项中所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括IL-2和IL-15。
8.权利要求1至7任一项中所述的方法，其中，所述分离包括使血液样本与抗α和抗βT细胞受体(TCR)抗体接触，并从血液样本中耗尽α-和/或β-TCR阳性细胞。
9.权利要求1至8任一项中所述的方法，其中，所述饲养细胞为人细胞、非人细胞、病毒感染细胞、非病毒感染细胞、细胞提取物、颗粒、珠、丝或其组合。
10.权利要求9的方法，其中，人细胞为K562细胞。
11.权利要求9或10所述的方法，其中，所述人细胞为包含至少一种重组蛋白的工程改造肿瘤细胞。
12.权利要求11所述的方法，其中，所述至少一种重组蛋白选自由CD86、4-1BBL、IL-15及其任何组合组成的组。
13.权利要求12所述的方法，其中，所述IL-15为膜结合IL-15。
14.权利要求1至13任一项中所述的方法，其中，所述饲养细胞接受辐照。
15.权利要求1至14任一项中所述的方法，其中，所述分离的γδT细胞和饲养细胞以约1:1至约50:1(饲养细胞：分离的γδT细胞)的比例混合。
16.权利要求1至15任一项中所述的方法，其中，所述载体为病毒载体或非病毒载体。
17.权利要求1至16任一项中所述的方法，其中，所述扩增在不存在氨基二膦酸盐的情况下以及存在至少一种细胞因子的情况下进行。
18.权利要求1至17任一项中所述的方法，其进一步包括重新刺激扩增的γδT细胞。
19.权利要求18所述的方法，其中，所述重新刺激包括使扩增的γδT细胞与另外的饲养细胞接触。
20.权利要求19所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞可与饲养细胞相同或不同。
21.权利要求19或20所述的方法，其中，所述扩增的γδT细胞和另外的饲养细胞以约1:1至约50:1(另外的饲养细胞：扩增的γδT细胞)的比例混合。
22.权利要求19至21任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞选自由单核细胞、PBMC及其组合组成的组。
23.权利要求19至22任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞对人体受试者为自体细胞。
24.权利要求19至23任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞对人体受试者为同种异体细胞。
25.权利要求19至24任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞经耗尽αβT细胞。
26.权利要求19至25任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞与氨基二膦酸盐接触。
27.权利要求26所述的方法，其中氨基二膦酸盐包含唑来膦酸。
28.权利要求19所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞为人细胞、非人细胞、病毒感染细胞、非病毒感染细胞、细胞提取物、颗粒、珠、丝或其组合。
29.权利要求28的方法，其中，人细胞为K562细胞。
30.权利要求28或29所述的方法，其中，所述人细胞为包含至少一种重组蛋白的工程改造肿瘤细胞。
31.权利要求30所述的方法，其中，所述至少一种重组蛋白选自由CD86、4-1BBL、IL-15及其任何组合组成的组。
32.权利要求31所述的方法，其中，所述IL-15为膜结合IL-15。
33.权利要求19至32任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞接受辐照。
34.一種擴增γδT細胞的體外方法，包括
从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞，
在存在至少一种任选地选自白介素(IL)-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、干扰素(IFN)-α和IFN-β组成的组中的细胞因子以及一个或多个氨基二膦酸盐或饲养细胞的情况下，激活分离的γδT细胞，
扩增激活的γδT细胞，以及
重新刺激扩增的γδT细胞。
35.权利要求34所述的方法，其中，血液样本包含白细胞分离产物。
36.权利要求34或35所述的方法，其中，血液样本包含外周血单核细胞(PBMC)。
37.权利要求34至36任一项中所述的方法，其中，所述氨基二膦酸盐存在，并包括帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其盐和/或其水合物。
38.权利要求34至37任一项中所述的方法，其中，所述氨基二膦酸盐存在，并包括唑来膦酸。
39.权利要求34至38任一项中所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括IL-2和IL-15。
40.权利要求34至39任一项中所述的方法，其中，所述分离包括使血液样本与抗α和抗βT细胞受体(TCR)抗体接触，并从血液样本中耗尽α-和/或β-TCR阳性细胞。
41.权利要求34至40任一项中所述的方法，其中，所述饲养细胞存在，并且为人细胞、非人细胞、病毒感染细胞、非病毒感染细胞、细胞提取物、颗粒、珠、丝或其组合。
42.权利要求41的方法，其中，人细胞为K562细胞。
43.权利要求41或42所述的方法，其中，所述人细胞为包含至少一种重组蛋白的工程改造肿瘤细胞。
44.权利要求43所述的方法，其中，所述至少一种重组蛋白选自由CD86、4-1BBL、IL-15及其任何组合组成的组。
45.权利要求44所述的方法，其中，所述IL-15为膜结合IL-15。
46.权利要求41至45任一项中所述的方法，其中，所述饲养细胞接受辐照。
47.权利要求41至46任一项中所述的方法，其中，所述分离的γδT细胞和饲养细胞以约1:1至约50:1(饲养细胞：分离的γδT细胞)的比例混合。
48.权利要求34至47任一项中所述的方法，其进一步包括在扩增之前用重组病毒载体转导激活的γδT细胞。
49.权利要求34至48任一项中所述的方法，其中，所述扩增在不存在氨基二膦酸盐的情况下以及存在至少一种细胞因子的情况下进行。
50.权利要求34至49任一项中所述的方法，其中，所述重新刺激包括使扩增的γδT细胞与另外的饲养细胞接触。
51.权利要求50所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞可与饲养细胞相同或不同。
52.权利要求50或51所述的方法，其中，所述扩增的γδT细胞和另外的饲养细胞以约1:1至约50:1(另外的饲养细胞：扩增的γδT细胞)的比例混合。
53.权利要求50至52任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞选自由单核细胞、PBMC及其组合组成的组。
54.权利要求50至53任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞对人体受试者为自体细胞。
55.权利要求50至54任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞对人体受试者为同种异体细胞。
56.权利要求50至55任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞经耗尽αβT细胞。
57.权利要求50至56任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞与氨基二膦酸盐接触。
58.权利要求57所述的方法，其中氨基二膦酸盐包含唑来膦酸。
59.权利要求50所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞为人细胞、非人细胞、病毒感染细胞、非病毒感染细胞、细胞提取物、颗粒、珠、丝或其组合。
60.权利要求59的方法，其中，人细胞为K562细胞。
61.权利要求59或60所述的方法，其中，所述人细胞为包含至少一种重组蛋白的工程改造肿瘤细胞。
62.权利要求61所述的方法，其中，所述至少一种重组蛋白选自由CD86、4-1BBL、IL-15及其任何组合组成的组。
63.权利要求62所述的方法，其中，所述IL-15为膜结合IL-15。
64.权利要求50至63任一项中所述的方法，其中，所述另外的饲养细胞接受辐照。
65.一种通过权利要求1至64任一项中所述的方法制备的扩增γδT细胞群，其中扩增γδT细胞的密度为至少约1x105个细胞/ml、至少约1x106个细胞/ml、至少约1x107个细胞/ml、至少约1x108个细胞/ml或至少约1x109个细胞/ml。
66.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的通过权利要求1至64任一项中所述的方法制备的扩增γδT细胞或权利要求65的扩增γδT细胞群。
67.权利要求66所述的方法，其中，所述癌症选自由急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(如：小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(如：非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合症、骨髓增生异常综合症、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤组成的组。
68.权利要求67的方法，其中癌症是黑色素瘤。
69.一种治疗传染性疾病的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的通过权利要求1至64任一项中所述的方法制备的扩增γδT细胞或权利要求65的扩增γδT细胞群。
70.权利要求69的方法，其中，所述传染性疾病选自由登革热、埃博拉、马尔堡病毒、结核病(TB)、脑膜炎和梅毒组成的组。
71.一种治疗自体免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的通过权利要求1至64任一项中所述的方法制备的扩增γδT细胞或权利要求65的扩增γδT细胞群。
72.权利要求71的方法，其中，所述自体免疫性疾病选自由关节炎、慢性阻塞性肺疾病、强直性脊柱炎、克罗恩病(两种特发性炎症性肠道疾病“IBD”中的一种)、皮肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、Goodpasture氏综合症、Graves氏病、格林-巴厘综合症(GBS)、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、原发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、硬斑病、重症肌无力、嗜睡症、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、精神分裂症、硬皮病、干燥综合症、僵人综合症、颞动脉炎(也称作为“巨细胞动脉炎”)、溃疡性结肠炎(两种特发性炎症性肠道疾病“IBD”中的一种)、脉管炎、白斑病以及韦格纳肉芽肿组成的组。
73.一种制备γδT细胞的方法，其包括：
从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞，
在不存在饲养细胞的情况下激活分离的γδT细胞，
将含有编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体引入激活的γδT细胞中，以及
在存在饲养细胞的情况下扩增转导的γδT细胞。
74.权利要求73所述的方法，其中，所述激活、转导和/或扩增在存在至少一种选自白介素(IL)-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、干扰素(IFN)-α和IFN-β组成的组中的细胞因子的情况下进行。
75.权利要求73或74所述的方法，其中，所述饲养细胞为人细胞、非人细胞、病毒感染细胞、非病毒感染细胞、细胞提取物、颗粒、珠、丝或其组合。
76.权利要求73至75任一项中所述的方法，其中，所述饲养细胞包含外周血单核细胞(PBMC)和/或类淋巴母细胞(LCL)。
77.权利要求73至76任一项中所述的方法，其中，所述激活、转导和/或扩增在存在OKT3的情况下进行。
78.权利要求73至77任一项中所述的方法，其中，所述载体为病毒载体或非病毒载体。
79.权利要求1至64任一项中所述的方法，其中，所述扩增γδT细胞包含δ1和/或δ2T细胞。
80.权利要求1至64以及73至79任一项中所述的方法，其中，所述载体包含编码TCR的核酸和编码CD8αβ或CD8α的核酸。
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