ES2916092T3 - Nuevos receptores de linfocitos T e inmunoterapias basadas en el uso de los mismos - Google Patents

Nuevos receptores de linfocitos T e inmunoterapias basadas en el uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un constructo reconocedor de antígenos que se une específica y/o selectivamente a un péptido antigénico de MAGEA1 de SEQ ID N.º 133 cuando dicho antígeno es presentado por el HLA, en el que dicho constructo reconocedor de antígenos comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.º 49, SEQ ID N.º 50 y SEQ ID N.º 51, respectivamente, y las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.º 55, SEQ ID N.º 56 y SEQ ID N.º 57, respectivamente en el que dicho constructo reconocedor de antígenos comprende las secuencias de aminoácidos de las respectivas CDR con no más de un aminoácido modificado, en el que dicho aminoácido modificado es preferentemente el primer o el último aminoácido de la CDR respectiva y la modificación es una sustitución conservadora, y en el que dicho constructo reconocedor de antígenos no se une selectivamente a ninguno de los péptidos de las SEQ ID N.º 143 a 152.

Description

DESCRIPCIÓN
Novedosos receptores de células T e inmunoterapias utilizando los mismos
Campo de la invención
La presente invención atañe a constructos reconocedores de antígenos dirigidos contra el péptido MAGEA1-003, que deriva de un antígeno asociado a tumor (TAA). La invención proporciona en concreto moléculas basadas en un novedoso receptor de células T (TCR) que son selectivas y específicas hacia el TAA de la invención. El TCR de la invención, así como los fragmentos de unión al TAA que derivan del mismo, están destinados al uso en el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de enfermedades tumorales que expresan TAA. Además, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los constructos reconocedores del antígeno de la invención, los vectores que comprenden esos ácidos nucleicos, las células recombinantes que expresan los constructos reconocedores de antígeno y las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención.
Descripción
Se encontró que los genes de antígenos del melanoma (MAGE-A) expresan en una variedad de tumores de distinto origen histológico. Las proteínas codificadas por los genes MAGE son antígenos de rechazo al tumor que estimulan a células T citotóxicos (CTL) específicos, que tiene la capacidad de reconocer y destruir células cancerosas. Por consiguiente, los genes y proteínas MAGE constituyen un objetivo prioritario para el desarrollo de novedosos agentes antitumorales de carácter inmunoterápico. Las proteínas MAGE-A integran una subfamilia de los antígenos de cáncertestículo que se expresan fundamentalmente, si bien no exclusivamente, en la línea germinal. Asimismo, se expresan en diversos tipos de cáncer humano, donde están asociados a, y pueden impulsar, la transformación maligna. La expresión específica de los antígenos MAGE en los tumores, pero no en el tejido sano y normal circundante, convierte a esta familia de antígenos en candidatos sumamente interesantes para la transferencia adoptiva de células T dirigidos. Sin embargo, hasta la fecha no se conoce una inmunoterapia que sea satisfactoria debido a la carencia de anticuerpos provistos de la afinidad y la especificidad necesarias o de receptores de célula T que reconozcan los antígenos MAGE.
Las dianas de la inmunoterapia basada en las células T están constituidas por epítopos peptídicos derivados de proteínas específicas de los tumores o asociadas a los mismos, que son presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los antígenos asociados a tumores (TAA) pueden ser péptidos derivados de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc., que son expresados y que, en comparación con células inalteradas del mismo origen, normalmente están regulados al alza en las células del tumor correspondiente.
Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer selectivamente y destruir las células tumorales. El aislamiento de células T a partir de poblaciones de células infiltradas en los tumores o de la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Las células T CD8-positivas en particular, que reconocen las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) portadoras de péptidos que suelen tener de 8 a 10 residuos de aminoácidos derivados de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) localizados en el citosol, desempeñan un importante papel en esta respuesta. Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
Existen dos tipos de moléculas MHC: Las MHC de clase I y las MHC de clase II. Los complejos constituidos por péptidos y moléculas MHC de clase I son reconocidos por las células T CD8-positivas portadoras del receptor de célula T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por péptidos y moléculas MHC de clase II son reconocidos por las células T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y la caracterización de los antígenos asociados a tumor y de los correspondientes receptores de célula T es importante para el desarrollo de inmunoterapias contra el cáncer como son vacunas y terapias celulares.
En la reacción inmunitaria dependiente de las MHC de clase I, los péptidos no solo tienen que ser capaces de unirse a ciertas moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales, también tienen que ser reconocidos después por células T portadoras de receptores de célula T (TCR) específicos. Por consiguiente, los TAA son un punto de partida para el desarrollo de una terapia basada en células T como, entre otras, las vacunas antitumorales y las terapias celulares.
Alrededor del 90 por ciento de las células T de la sangre periférica expresan TCR que constan de un polipéptido a y un polipéptido p. Aparte de las células T ap, un pequeño porcentaje de células T (alrededor del 5% del total de células T) expresan un TCR constituido por un polipéptido y y un polipéptido 6. Las células T y6 abundan sobre todo en la mucosa intestinal, en el seno de una población de linfocitos conocidos como linfocitos intraepiteliales (IEL). A día de hoy aún se desconocen la mayoría de las moléculas antigénicas que activan a estas células T y6. Sin embargo, las células T y6 no están restringidas por el MHC y parecen ser capaces de reconocer proteínas enteras en lugar de requerir la presentación de los péptidos unidos a moléculas del MHC por parte de las células presentadoras de antígeno, aunque algunos reconocen las moléculas MHC de tipo IB. Las células T humanas Vy9/V62, que constituyen la principal población de células T y§ presente en la sangre periférica, son singulares porque responden con rapidez y especificidad a la presencia de un pequeño metabolito microbiano no peptídico, el HMB-Pp, un precursor del pirofosfato de isopentenilo.
Las cadenas que conforman el receptor de antígenos del célula T que posee todo clon de dicha célula están compuestas por una combinación única de dominios, a saber: variable (V), [diversidad (D)], de unión (J; del inglés Joining) y constante (C). En cada clon de célula T, la combinación de los dominios V, D y J en la cadena alfa y en la cadena beta, o bien en las cadenas delta y gamma, participa en el reconocimiento del antígeno, de tal modo que constituye una característica única y exclusiva de ese clon concreto y define un sitio de unión único, también conocido como el idiotipo del clon de célula T. En cambio, el dominio C no participa en la unión al antígeno.
El TCR es una proteína heterodimérica ubicada en la superficie celular que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y que está asociada con proteínas invariables del complejo CD3 que intervienen en la transducción de señales. Los TCR se dividen en las formas ap y y§, que si bien son similares desde el punto de vista estructural son bastante distintas en su localización anatómica y, probablemente, en sus funciones. La fracción extracelular de los TCR heterodiméricos nativos ap y y§ consta de dos polipéptidos, cada uno de los cuales posee un dominio constante en la parte más cercana a la membrana celular (proximal) y un dominio variable en el extremo más alejado de la misma (distal). Cada uno de los dominios constantes y variables alberga un puente disulfuro intracatenario. Los dominios variables contienen un bucle altamente polimórfico que es análogo a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) propias de los anticuerpos. El uso de la terapia génica con TCR permite solventar algunas trabas actuales. Permite dotar a las células T del propio paciente de las especificidades deseadas, así como generar el número suficiente de células T en un breve lapso de tiempo y evitar su agotamiento. El TCR se transduce en las células T de la memoria central o en las células T dotadas de características pluripotentes, con lo que puede obtenerse una mayor persistencia o mejor función tras la transferencia. Las células T provistas de los t Cr genomodificados serán transferidss mediante una infusión a los pacientes oncológicos que han quedado inmunodeprimidos (linfopénicos) a causa de la quimioterapia o la radioterapia, posibilitando así un injerto eficiente y al mismo tiempo anulando la depresión inmunitaria.
Si bien ha habido avances en el desarrollo de agentes dirigidos contra dianas moleculares como tratamiento contra el cáncer, en este campo sigue existiendo la necesidad de nuevos agentes antitumorales que tengan como diana molé­ culas altamente específicas de las células cancerosas. La presente descripción aborda esa necesidad dando a cono­ cer nuevos TCR del MAGEA1, los correspondientes constructos recombinantes de TCR, ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras que se unen específicamente a uno o varios epítopos del TAA dados a conocer, así como métodos para usar tales moléculas en el tratamiento contra el cáncer. El término TAA en el contexto de la invención designa en concreto las siguientes proteínas preferidas, a saber, las proteínas MAGEA1, fragmentos de las mismas, más en concreto péptidos antigénicos presentados por el sistema HLA, y preferentemente asociados con un trastorno proliferativo. El péptido antigénico de la invención es el péptido MAGEA1-003, provisto de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID N.° 133 que se expone más adelante en la Tabla 2. Los constructos de reconocimiento de antígenos dirigidos contra este péptido, en algunos casos presentados por HLA, se conocen por ejemplo a partir de WO2014/113236; Gong et al (2015) Chin.J.Cell Biol. 37(11):1481-9; Obenhaus et al (2015) Nature biotech. 33(4):402-7; y Ottaviani et al (2005) Cancer Immunol. Immunother. 52(12):1214-20.
La invención queda expuesta en el conjunto de reivindicaciones anexo.
Constructos reconocedores de antígenos
En un primer aspecto, la invención proporciona un constructo reconocedor de antígenos que se une específica y/o selectivamente a un péptido antigénico de MAGEA1 de SEQ ID N.° 133 cuando dicho antígeno es presentado por el HLA, en que dicho constructo reconocedor de antígenos comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51, respectivamente, y las secuencias CDR1, CDR2 and CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 55, SEQ ID N.° 56 y SEQ ID N.° 57, respectivamente, comprendiendo dicho constructo reconocedor de antígeno las secuencias de aminoácidos de las respectivas CDR con a lo sumo un aminoácido modificado, aminoácido modificado que es preferentemente el primer o el último aminoácido de la CDR correspondiente y modificación que es una sustitución conservadora, y en que dicho constructo reconocedor de antígenos no se une selectivamente a ninguno de los péptidos de las SEQ ID N.° 143 a 152 cuando estos son presentados por el HLA.
Además se describe, sin que forme parte de la invención, un constructo reconocedor de antígenos que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) 3 provista como mínimo de una identidad de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o preferentemente del 100% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entra las SEQ ID N.° 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 y 117.
Además se describe, sin que forme parte de la invención, un constructo reconocedor de antígenos que se une específicamente a un complejo formado por una molécula del HLA con el péptido del TAA, en el que dicho péptido comprende, o alternativamente consiste en, una variante del TAA que es homóloga al menos en un 66%, preferentemente al menos en un 77%, y más preferentemente aún al menos en un 88% (preferentemente al menos un 77% o al menos un 88% idéntica) a la secuencia de aminoácidos del TAA de la invención, en que dicha variante se une a una molécula del HLA de clase I o de clase II y/o induce la reacción cruzada de las células T con dicho péptido, o con una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que dicho péptido no es el polipéptido originario entero.
Tal y como se emplean aquí, los términos «idénticos» o «identidad» porcentual, cuando se empleen en cualquier punto de la presente memoria en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de proteína/polipéptido, concierne a dos o más secuencias o subsecuencias que son idénticas o que tienen (o tienen como mínimo) un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos idénticos (es decir, que guardan una identidad mínima de alrededor del 60%, preferentemente una identidad mínima del 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, y más preferentemente aún por lo menos de alrededor del 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o una identidad mayor en una región especificada -preferentemente a lo largo de las secuencias enteras-, cuando se comparan y se alinean para su máxima correspondencia con la ventana de comparación o la región designada) cuando se miden con algoritmos de comparación de secuencias, o bien se someten a alineación manual y a inspección visual (véase, por ejemplo, la página web de NCBI). En una forma de realización concreta, por ejemplo cuando se compara la secuencia proteínica o de ácidos nucleicos de un constructo reconocedor de antígeno de la invención con la de otra proteína o gen, la identidad porcentual se puede determinar mediante las búsquedas con el programa Blast sustentadas en el Human Olfactory Data Explorer (p. ej., https://genome.weizmann.ac.il/cgi-bin/horde/blastHorde.pl); en concreto en lo referente a la identidad de los aminoácidos, por medio de BLASTP 2.2.28+ con los parámetros siguientes: Matriz: BLOSUM62; Penalizaciones por hueco: Existencia: 11, Extensión: 1; Umbral de palabras aledañas: 11; Ventana para múltiples hits: 40.
En el contexto de la presente invención se entenderá que en cualesquiera formas de realización en las que se indique que «comprenden» ciertas características de la invención, se debe entender que incluyen algunas de las formas de realización más preferidas de la descripción más restringida de «consistente en» o «consistente básicamente en» las mismas características idénticas de la presente invención.
El constructo reconocedor de antígenos comprende, además, una secuencia del dominio CDR1 y CDR2. Dentro del dominio variable, la CDR1 y la CDR2 radican en la región variable (V) de la cadena polipeptídica, y la CDR3 abarca algunas de las regiones V y todas las regiones de diversidad (D) y de unión (J). La Cd R3 es la más variable y es la principal CDR responsable de reconocer de manera específica y selectiva un antígeno.
Los TCR heterodiméricos alfa-beta nativos poseen una cadena alfa y una cadena beta. Cada cadena comprende sendas regiones constante, de unión y variable, a las que normalmente se suma en la cadena beta una región de diversidad corta intercalada entre la región de unión y la variable, si bien dicha región de diversidad se considera a menudo parte de la región de unión. Cada región variable comprende tres CDR (regiones determinantes de la complementariedad) intercaladas en una secuencia estructural, una de las cuales es la región hipervariable llamada CDR3. Existen varios tipos de regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios tipos de regiones variables de la cadena beta (Vp) que se distinguen por su estructura, por las secuencias CDR1 y c DR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. En la nomenclatura IMGT, los tipos Va reciben un número único t Ra V, mientras que los tipos Vp reciben un número único TRBV. Para más información sobre los anticuerpos inmunoglobulinas y los genes de los TCR véase el sistema de información internacional ImMunoGeneTics®, Lefranc M-P et al. (Nucleic Acids Res. 2015 Jan; 43(Database issue):D413-22; y http://www.imgt.org/).
Así pues, en una forma de realización adicional el constructo reconocedor de antígenos de la invención comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 en una combinación como la presentada más adelante en la Tabla 1 de la presente memoria, que muestra el correspondiente alelo de la cadena variable junto con la secuencia de la CDR3. Preferentemente, un constructo reconocedor de antígenos de la invención comprende las respectivas CDR1 a CDR3 de una región variable del TCR R37P1C9 de la invención dada a conocer en la presente memoria (véanse más adelante la Tabla 1 y el apartado de Ejemplos).
A efectos de la presente memoria, el término «especificidad» o «especificidad antigénica» o «específico para» un antígeno dado, significa que el constructo reconocedor de antígenos se puede unir específicamente a dicho antígeno, preferentemente un antígeno TAA, más preferentemente con una afinidad elevada, cuando dicho antígeno es presentado por moléculas del sistema HLA, preferentemente del alelo HLA-A2. Por ejemplo, se puede considerar que un TCR, en calidad de constructo reconocedor de antígenos, posee «especificidad antigénica» hacia los TAA, si las células T que expresan ese TCR segregan como mínimo unos 200 pg/ml o más de interferón gamma (IFN-y) (p. ej., 250 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg ml o más, 2000 pg/ml o más, 2500 pg/ml o más, 5000 pg/ml o más) tras su cultivo simultáneo con células diana h La A2-positivas estimuladas con una baja concentración de un antígeno TAA, como los antígenos y los epítopos de TAA proporcionados más adelante en la presente memoria (p. ej., aprox. 10'11 mol/l, 10'1° mol/l, 10'9 mol/l, 10'8 mol/l, 10'7 mol/l, 10'6 mol/l o 10'5 mol/l). Otro criterio alternativo o adicional consiste en considerar un TCR como provisto de «especificidad antigénica» hacia el TAA, si las células T que expresan ese TCR segregan como mínimo dos veces más IFN-y que el nivel de fondo de IFN-y resultante del cultivo simultáneo de linfocitos no transducidos con células diana estimuladas con una baja concentración de antígenos TAA. Tal «especificidad» como la descrita se puede analizar, entre otros medios, con un ELISA. En una forma de realización alternativa o adicional de la invención, el constructo reconocedor de antígenos se une selectivamente a un péptido antigénico derivado de TAA; preferiblemente el péptido antigénico derivado de TAA es un epítopo proteico o un péptido provisto de una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID N.° 133, o una variante de la misma, consistiendo dicha variante en una deleción, adición, inserción o sustitución de aminoácido de como máximo tres, preferentemente dos y más preferentemente aún un máximo de una posición de aminoácido. En ciertas formas de realización, el constructo reconocedor de antígenos de la invención se une selectivamente a cualquiera de los péptidos modificados MAGEA1-003 mostrados en las SEQ ID N.° 132 a 142 y 154 a 162. El constructo reconocedor de antígenos de la invención no se une selectivamente a ninguno de los péptidos mostrados en las SEQ ID N.° 143 a 152.
El término «selectividad» o «reconocimiento y unión selectivas» se entiende que designa la facultad de un constructo reconocedor de antígenos, como un TCR o un anticuerpo, para reconocer selectivamente o unirse preferentemente a un único epítopo específico y que preferentemente muestra una reactividad cruzada nula o sustancialmente nula con otro epítopo. Preferentemente «selectividad» o «reconocimiento y unión selectivos» significa que el constructo reconocedor de antígenos (p. ej., un TCR) reconoce selectivamente o se une preferentemente a un único epítopo específico y preferentemente muestra una reactividad cruzada nula o sustancialmente nula con otro epítopo, en que dicho epítopo es único de una proteína, de tal modo que el constructo reconocedor de antígenos presenta una reactividad cruzada nula o sustancialmente nula con otro epítopo y otra proteína.
El constructo reconocedor de antígenos acorde con la invención se selecciona preferentemente de un anticuerpo, o un derivado o fragmento del mismo, o un receptor de célula T (TCR), o un derivado o fragmento del mismo. Un derivado o fragmento de anticuerpo o de TCR de la invención debe conservar preferentemente la capacidad para reconocer o unirse al antígeno de la molécula madre, en particular su especificidad y/o selectividad como se han explicado antes. Esa funcionalidad de unión se puede conservar mediante la presencia de una región CDR3 tal y como se define en la presente memoria.
Los TCR de la invención son capaces de reconocer los antígenos TAA que son presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. «Presentados por el MHC de clase I», tal y como se emplea en la presente memoria, significa que el TCR desencadena una respuesta inmunitaria tras su unión a los antígenos TAA que le son presentados por una molécula del MHC de clase I. La molécula MHC de clase I puede ser cualquier molécula MHC de clase I conocida en la técnica, p. ej., moléculas HLA-A. En una forma de realización preferida de la invención, la molécula MHC de clase I es una molécula del HLA-A2.
La invención proporciona tanto un constructo reconocedor de antígenos monocatenario como constructos reconocedores bicatenarios.
En una forma de realización, el dominio variable de cadena alfa del TCR presenta al menos una mutación con respecto al dominio de cadena alfa del TCR R37P1C9 mostrado en la Tabla 1; y/o el dominio variable de cadena beta del TCR tiene como mínimo una mutación con respecto al dominio de cadena alfa del TCR R37P1C9 mostrado en la Tabla 1. En una forma de realización, un TCR que comprende al menos una mutación en el dominio variable de cadena alfa del TCR y/o del dominio variable de cadena beta del TCR está provisto de afinidad de unión a, y/o de una semivida de unión con un complejo formado por el péptido de TAA-molécula HLA, que como mínimo duplica la del TCR que comprende un dominio variable de cadena alfa no mutado y/o un dominio variable de cadena beta no mutado.
Las cadenas alfa de TCR de la presente descripción pueden, además, comprender un dominio transmembrana de cadena alfa y/o un dominio intracelular de cadena alfa. Las cadenas beta de TCR de la presente descripción pueden, además, comprender un dominio transmembrana de cadena beta y/o un dominio intracelular de cadena beta.
La invención proporciona en concreto un TCR como constructo reconocedor de antígenos, o un fragmento o derivado del mismo. El TCR es preferentemente de origen humano, por lo cual se entiende como generado a partir de un locus de un TCR humano y que, por consiguiente, comprende secuencias de TCR humanas. Además, el TCR de la invención se puede caracterizar porque es de origen humano y reconoce específicamente un antígeno TAA de la invención.
Otra forma de realización de la invención proporciona de forma adicional o alternativa el constructo reconocedor de antígeno antes descrito, que estimula una respuesta inmunitaria, y preferentemente dicha respuesta inmunitaria se caracteriza por un incremento de los niveles de interferón gamma (IFN-y).
Los TCR de la invención se pueden proporcionar en forma de moléculas monocatenarias a o p, o y y 5, o alternativamente como constructos bicatenarios compuestos por una cadena a y otra p, o por una cadena y y otra 5.
El constructo reconocedor de antígenos de la invención puede comprender una cadena a o y de TCR; y/o una cadena p o 5 de TCR; en el que la cadena a o y del TCR comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 provistas las secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID N.° 49, SEQ ID N.° 50 y SEQ ID N.° 51, respectivamente, y/o en el que la cadena p o 5 del TCR comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos correspondientes a las Se Q ID N.° 55, SEQ ID N.° 56 y SEQ ID N.° 57, respectivamente .
Los constructos reconocedores de antígenos que comprenden las regiones CDR1 a CDR3 de las cadenas del TCR R37P1C9 descritas en la presente memoria (véase la Tabla 1), comprenden la respectiva secuencia de la CDR de la invención provista de un único residuo de aminoácido modificado. Lo más preferible es que el único residuo de aminoácido modificado sea el primero o el último residuo de aminoácido de la secuencia de la CDR respectiva.
Si el constructo reconocedor de antígeno de la invención está compuesto por al menos dos cadenas de aminoácidos, como un TCR bicatenario, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, el constructo reconocedor de antígeno puede comprender en su primera cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 51, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 57.
Se describen, sin que formen parte de la invención, constructos reconocedores de antígenos compuestos por al menos dos cadenas de aminoácidos, como un TCR bicatenario, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, constructos reconocedores de antígenos que comprenden en su primera cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 3, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 9; o en su primera cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 15, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 21; o en su primera cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 27, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 33; o bien en su primera cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 39, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 45; o bien en su primera cadena polipeptídica una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 63, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 69; o bien en su primera cadena polipeptídica una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 75, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 81; o bien en su primera cadena polipeptídica una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 87, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 93; o bien en su primera cadena polipeptídica una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 99, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 105; o bien en su primera cadena polipeptídica una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 111, y en su segunda cadena polipeptídica la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 117. En ciertas formas de realización, la CDR3 del t Cr bicatenario de la invención puede comprender una sustitución conservadora. Las mutaciones de las secuencias de CDR3 de las SEQ ID N.° 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 y 117 como las proporcionadas antes incluyen preferentemente una sustitución, deleción, adición o inserción de un máximo de tres, preferentemente dos, y lo más preferible como máximo un solo residuo de aminoácido. En algunas formas de realización, la primera cadena polipeptídica puede ser una cadena a o y de TCR, y la segunda cadena polipeptídica puede ser una cadena p o 8 de TCR. Se prefiere la combinación de un TCR ap o YS.
El TCR, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, está compuesto en ciertas formas de realización por una cadena a de TCR y otra cadena p de TCR, o bien por una cadena Y y otra 8. Ese TCR bicatenario comprende regiones variables en cada una de sus cadenas, y tales regiones variables comprenden a su vez una secuencia CDR1, otra CDR2 y otra CDR3. Los TCR de la invención comprenden las secuencias CDR1 a CDR3 como las comprendidas en la secuencia de aminoácidos de la cadena variable de la SEQ ID N.° 52 y la SEQ ID N.° 58 (R37P1C9). Se describen, sin que formen parte de la invención, TCR que comprenden las secuencias CDR1 a CDR3 como las comprendidas en la secuencia de aminoácidos de la cadena variable de la SEQ ID N.° 4 y SEQ ID N.° 10 (R26P1A9), o la SEQ ID N.° 16 y la SEQ ID N.° 22 (R26P2A6); o la SEQ ID N.° 28 y la SEQ ID N.° 34 (R26P3H1) o la SEQ ID N.° 40 y la SEQ ID N.° 46 (R35P3A4), o la SEQ ID N.° 64 y la SEQ ID N° 70 (R37P1H1), o la SEQ ID N.° 76 y la SEQ ID N.° 82 (R42P3A9), o la SEQ ID N.° 88 y la SEQ ID N.° 94 (R43P3F2), o la SEQ ID N.° 100 y la SEQ ID N.° 106 (R43P3G5), o la SEQ ID N.° 112 y la SEQ ID N.° 118 (R59P2E7).
Ciertas formas de realización de la invención se refieren a un TCR, o a un fragmento del mismo, compuesto por una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en que dicho TCR comprende la región variable provista como mínimo de una identidad de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o preferentemente del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las cadenas a y p conformes a las SEQ ID N.° 52 y 58. Además se describe un TCR, o un fragmento del mismo, compuesto por una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en que dicho TCR comprende las secuencias de región variable provistas como mínimo de una identidad de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o preferentemente del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las cadenas a y p acordes con las SEQ ID N.° 4 y 10 respectivamente, o 16 y 22 respectivamente, o 28 y 34 respectivamente, o 40 y 46 respectivamente, o 64 y 70 respectivamente, o 76 y 82 respectivamente, u 88 y 94 respectivamente, o 100 y 106 respectivamente, o 112 y 118 respectivamente.
Los TCR de la invención pueden comprender, además, una región constante derivada de cualquier especie adecuada, como es cualquier mamífero, p. ej., ser humano, rata, mono, conejo, asno o ratón. En una forma de realización de la invención, los TCR de la invención comprenden, además, una región constante humana. En ciertas formas de realización preferidas, la región constante del TCR de la invención puede ser levemente modificada, por ejemplo, con la introducción de secuencias heterólogas, preferentemente de secuencias de ratón, que pueden incrementar la estabilidad y la expresión del TCR.
Ciertas formas de realización de la invención se refieren a un TCR, o a un fragmento del mismo, compuesto por una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en que dicho TCR comprende la región constante provista como mínimo de una identidad de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, o preferentemente del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las cadenas a y p conformes a las SEQ ID N.° 5 y 11 respectivamente, o 17 y 23 respectivamente, o 29 y 35 respectivamente, o 41 y 47 respectivamente, o 53 y 59 respectivamente, o 65 y 71 respectivamente, o 77 y 83 respectivamente, u 89 y 95 respectivamente, o 101 y 107 respectivamente, o 113 y 119 respectivamente.
En otra forma de realización, el constructo reconocedor de antígeno puede comprender un fragmento de unión de un TCR, en el que dicho fragmento de unión comprende las CDR1 a c DR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 49, 50, 51 o 55, 56, 57.
En otras formas de realización de la invención, el constructo reconocedor de antígeno que ha sido descrito antes en la presente memoria es un TCR, o un fragmento del mismo, compuesto por al menos una secuencia de la cadena a de TCR y una secuencia de cadena p de TCR, en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 49 a 51, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 55 a 57. Se describe, sin que forme parte de la invención, un TCR, o un fragmento del mismo, compuesto por al menos una secuencia de la cadena a de TCR y otra de la cadena p de TCR, en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 1 a 3, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 7 a 9; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 13 a 15, y dicha secuencia de cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 19 a 21; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 25 a 27, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 31 a 33; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 37 a 39, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 43 a 45; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 61 a 63, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 67 a 69; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 73 a 75, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 79 a 81; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 85 a 87, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 91 a 93; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 97 a 99, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 103 a 105; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 109 a 111, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende las secuencias CDR1 a CDR3 provistas de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 115 a 117.
En otras formas de realización de la invención, el constructo reconocedor de antígeno que ha sido descrito antes en la presente memoria es un TCR, o un fragmento del mismo, que comprende al menos una secuencia de la cadena a de TCR y una secuencia de cadena p de TCR, en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 52, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 58. Se describe, sin que forme parte de la invención, un t Cr , o un fragmento del mismo, que comprende al menos una secuencia de la cadena a de TCR y otra de la cadena p de TCR, en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 4, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 10; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 16, y dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 22; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 28, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 34; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 40, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 46; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 64, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 70; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 76, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 82; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 88, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 94; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 100, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 106; o en que dicha secuencia de la cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 112, y en que dicha secuencia de la cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable provista de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 118.
En otras formas de realización de la invención el constructo reconocedor de antígeno que ha sido descrito antes en la presente memoria es un TCR, o un fragmento del mismo, que además comprende una región constante de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N.° 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113 y 119, preferentemente en que el TCR está compuesto de al menos una secuencia de cadena a de TCR y de una secuencia de cadena p de TCR, en que la secuencia de dicha cadena a de TCR comprende una región constante provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N.° 5, 17, 29, 41, 53, 65, 77, 89, 101 y 113.
En otras formas de realización la invención proporciona constructos reconocedores de antígenos que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 54, y una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 60.
Se dan a conocer asimismo constructos reconocedores de antígenos como los descritos antes en la presente memoria que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 6, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 12. Además, se dan a conocer TCR que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 18, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 24. Además, se dan a conocer constructos reconocedores de antígeno que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 30, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 36. Además, se dan a conocer constructos reconocedores de antígeno que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 42, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 48. Además, se dan a conocer constructos reconocedores de antígeno que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 66, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 72. Además, se dan a conocer constructos reconocedores de antígeno que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 78, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 84. Además, se dan a conocer constructos reconocedores de antígeno que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 90, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 96. Además, se dan a conocer constructos reconocedores de antígeno que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 102, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 108. Además, se dan a conocer constructos reconocedores de antígeno que son TCR y que comprenden una primera cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 114, y de una segunda cadena de TCR provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 120.
A efectos de la presente memoria, el término «murino» o «humano», cuando se refiere a un constructo reconocedor de antígeno, o a un TCR, o a cualquier componente de un TCR descrito en la presente memoria (p. ej., región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena a y/o cadena p), designa un TCR o un componente del mismo, que procede de un locus de TCR de ratón o de ser humano sin reorganizar, respectivamente.
En una forma de realización de la invención se proporcionan TCR quiméricos, cuyas cadenas de TCR comprenden secuencias procedentes de varias especies. Preferentemente, un TCR de la invención puede comprender una cadena a que comprende una región variable humana procedente de una cadena a y, por ejemplo, una región constate murina procedente de una cadena a de TCR murino.
En una forma de realización, el TCR de la invención es un TCR humano que comprende regiones variables humanas acordes con las susodichas formas de realización, así como regiones constantes humanas.
En ciertas formas de realización el constructo reconocedor de antígeno está murinizado o humanizado. Estos términos se emplean cuando se introducen secuencias de aminoácidos procedentes de otras especies en el constructo de la invención.
El TCR de la invención se puede proporcionar en forma de TCR monocatenario (TCRmc). Un TCRmc puede comprender un polipéptido procedente de una región variable de una primera cadena de TCR (p. ej., una cadena alfa) y un polipéptido procedente de una segunda cadena TCR entera (íntegra) (p. ej., una cadena beta), o viceversa. Asimismo, el TCRmc puede comprender opcionalmente uno o más conectores que unan los dos o más polipéptidos entre sí. El conector puede ser, por ejemplo, un péptido, que una entre sí dos cadenas sencillas, tal y como describe la presente memoria. También se puede proporcionar un TCRmc de la invención que esté fusionado con una citocina humana, como por ejemplo la IL-2, la IL-7 o la IL-15.
El constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención también se puede proporcionar con la forma de un complejo multimérico, que comprenda como mínimo dos moléculas TCRmc, donde cada una de esas moléculas de TCRmc estén fusionadas con al menos una biotina, u otra molécula de interconexión o conector, y en que dichas TCRmc estén interconectadas por la interacción entre la biotina y la estreptoavidina con el fin de formar dicho complejo multimérico. La creación de TCR multiméricos también es posible con otras estrategias similares conocidas en la disciplina que figuran incluidas en la presente memoria. Asimismo, se proporcionan complejos multiméricos de orden superior, que comprenden más de dos TCRmc de la invención.
A efectos de la presente invención, un TCR es una fracción provista de al menos un dominio variable de cadena alfa o beta del TCR y/o de cadena beta o delta del TCR. En términos generales, comprende tanto un dominio variable de la cadena alfa del TCR como un dominio variable de la cadena beta del TCR, o alternativamente un dominio variable de la cadena gamma del TCR como un dominio variable de la cadena delta del TCR. Pueden ser heterodímeros apfy8 o pueden tener un formato monocatenario. Para el uso en la terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap o y§ podría, por ejemplo, ser transfectado en forma de cadenas enteras provistas tanto de dominios citoplasmáticos como transmembrana. Si conviniese, podría incorporarse un puente disulfuro entre residuos de los respectivos dominios constantes.
En una forma de realización preferida, el constructo reconocedor de antígeno es un TCR humano, o un fragmento o derivado del mismo. Un TCR humano o un fragmento o derivado del mismo es un TCR que comprende más del 50% de la secuencia de TCR humana correspondiente. Preferentemente, solo una pequeña parte de la secuencia del TCR es de origen artificial o deriva de otras especies. Sin embargo, es sabido que los TCR quiméricos, p. ej., aquellos que siendo de origen humano incorporan secuencias murinas en los dominios constantes, resultan ventajosos. Así pues, se prefieren especialmente los TCR acordes con la presente invención que contengan secuencias murinas en la parte extracelular de sus dominios constantes.
También se prefiere que el constructo reconocedor de antígeno de la invención sea capaz de reconocer su antígeno a través del sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA), preferiblemente presentados a través del alelo HLA-A02. El término «presentado por (o a través de) el sistema HLA» en el contexto de la presente invención significa que el constructo reconocedor de antígeno se une al antígeno solo en el caso de que el péptido antigénico sea presentado por dicho HLA.
El constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención induce en una forma de realización preferida una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria que se caracteriza por el incremento de los niveles de interferón gamma (IFN-y).
La invención también proporciona un polipéptido que comprende una fracción funcional del TCR R37P1C9 (o de variantes funcionales del mismo) descrito en la presente memoria. Se da a conocer, sin que forme parte de la invención, un polipéptido que comprende una parte funcional de cualquiera de los TCR (o variantes funcionales de los mismos) descritos en la presente memoria, por ejemplo, de cualquiera de los TCR seleccionados de R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 y R59P2E7, que aparecen en el apartado de Ejemplos y en la Tabla 1. El término «polipéptido» tal y como se emplea en la presente memoria incluye oligopéptidos y se refiere a una monocadena de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos. Con respecto a los polipéptidos de la invención, la fracción funcional puede ser cualquier fracción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR (o de una variante funcional del mismo), del cual forma parte, siempre que la fracción funcional se una específicamente a un antígeno TAA, preferentemente tal y como se indica en la Tabla 2 de la presente memoria, y a los péptidos MAGEA1-003_A1 a A9 (SEQ ID N.° 134 a 142) y MAGEA1-003_T1 a T9 (SEQ ID N.° 154 a 162). El término «fracción funcional» cuando se usa en referencia a un TCR (o a una variante funcional del mismo) se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR de la invención (o de una variante funcional del mismo) que conserva la actividad biológica del TCR (o de una variante funcional del mismo) y que forma parte del mismo (del TCR original o de la variante funcional original del mismo). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR (o de una variante funcional del mismo) que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno TAA (presentado por el HLA), o de detectar, tratar o prevenir un cáncer, en un grado parecido, igual o superior al del TCR original (o al de una variante funcional del mismo). En referencia al TCR original (o a una variante funcional del mismo), la fracción funcional puede comprender, por ejemplo, alrededor de un 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% o más de las secuencias variables del TCR original (o de una variante funcional del mismo).
La fracción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi-terminal de la fracción, o en ambos extremos, aminoácidos adicionales que no se hallan en la secuencia de aminoácidos propia del TCR original o de la variante funcional del mismo. Es conveniente que esos aminoácidos adicionales no interfieran en la función biológica de la fracción funcional, p. ej., su unión específica a los antígenos TAA y/o en la capacidad para detectar, tratar o prevenir el cáncer, etc. Aún más conveniente es que los aminoácidos adicionales potencien la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original o de la variante funcional del mismo.
El polipéptido puede comprender una fracción funcional derivada de una o de ambas cadenas a y p de los TCR de la invención o de las variantes funcionales de los mismos, de tal forma que la fracción funcional comprenda las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región o regiones variables de la cadena a y/o la cadena p de un TCR de la invención o de una variante funcional. En una forma de realización de la invención, el polipéptido puede comprender una fracción funcional que comprenda la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID N.° 51 y 57 (CDR3 de las regiones variables del TCR R37P1C9 de la invención). A este respecto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID N.° 52 y/o 58 (las regiones variables de una cadena a o p del TCR R37P1C9 de la invención).
En ciertos casos, el constructo de la invención puede contener además otras secuencias de aminoácidos, como, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifique una inmunoglobulina o una fracción de la misma, en cuyo caso la proteína de la invención puede ser una proteína de fusión. A este respecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en la presente memoria junto con al menos otro polipéptido más. El otro polipéptido puede concurrir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede hacerlo como un polipéptido que se exprese en tándem junto con uno de los polipéptidos de la invención descritos en la presente memoria. El otro polipéptido puede incluir cualquier molécula peptídica o proteinácea, o una fracción de la misma, que incluya sin limitación, una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula del MHC, una molécula CD1, p. ej., CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.
La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido de la invención y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido de la invención y/o del otro polipéptido. Los métodos adecuados para fabricar proteínas de fusión son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes. En ciertas formas de realización de la invención, los TCR (y las fracciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos), los polipéptidos, y las proteínas de la invención se pueden expresar como una sola proteína que comprenda un péptido conector que conecte la cadena a con la cadena p, y conecte la cadena y con la cadena 8. A este respecto, los TCR (y las variantes funcionales y las fracciones funcionales de los mismos), los polipéptidos y las proteínas de la invención comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones variables del TCR de la invención y pueden comprender además un péptido conector. El péptido conector puede facilitar ventajosamente la expresión de un TCR recombinante (incluidas las fracciones funcionales y las variantes funcionales del mismo), un polipéptido y/o una proteína en una célula hospedadora. El péptido conector puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. Las secuencias de conexión para los constructos de TCR monocatenarios son bien conocidas en la técnica. Tal constructo monocatenario puede comprender, además, una o dos secuencias de dominio constante. Una vez que la célula hospedadora exprese el constructo provisto de péptido conector, el péptido conector puede ser escindido, lo que dará como resultado la separación de las cadenas a y p o de las cadenas y y 8.
El TCR de la invención puede ser modificado con el fin de evitar el emparejamiento incorrecto de las cadenas que lo componen. El término «emparejamiento incorrecto» se refiere al emparejamiento incorrecto entre una cadena transgénica de TCR a/Y o p/8 de la invención con una cadena endógena 0/y o p/8 de TCR, circunstancia que se traduciría en la expresión difusa en la superficie celular de un heterodímero transgénico de TCR ap/Y8, que reduciría la afinidad funcional de las células T modificadoa. Preferentemente, la Q ubicada en la posición 44 del dominio variable del TCR de acuerdo con la numeración IMGT es sustituida por otro aminoácido en una o en ambas cadenas del TCR de la invención. El sustituto se escogerá preferentemente entre el grupo consistente en R, D, E, K, I, W y V.
Como ya se ha mencionado antes, la funcionalidad de unión del TCR de la invención se puede proporcionar incorporada en la estructura de un anticuerpo. Por ejemplo, las secuencias CDR del TCR de la invención, posiblemente incluyendo 3, 2 o 1 residuos estructurales adicionales en los extremos N-terminal y/o C-terminal, pueden ser insertadas directamente en una secuencia variable de cadena ligera o pesada de anticuerpo. El término «anticuerpo» en sus diversas formas gramaticales se usa en la presente memoria para referirse a moléculas de inmunoglobulina y a fracciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno o un paratopo. Tales moléculas también se denominan «fragmentos de unión con el antígeno» de las moléculas de inmunoglobulina. La invención proporciona además un anticuerpo, o una fracción de unión con el antígeno del mismo, que se une específicamente a los antígenos descritos en la presente memoria. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que sea conocida en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. Y además puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo natural, p. ej., un anticuerpo aislado y/o purificado de un mamífero, como, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo genéticamente modificado, como por ejemplo un anticuerpo humanizado o uno quimérico. El anticuerpo puede aparecer en forma monomérica o polimérica.
El término «anticuerpo» incluye, sin limitación, formas modificadas genéticamente o modificadas de cualquier otro modo de inmunoglobulinas, tales como anticuerpos intracelulares, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados (p. ej., creados con el «injerto de CDR»), fragmentos de anticuerpo y anticuerpos heteroconjugados (p. ej., anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, etc.). El término «anticuerpo» incluye cis-diacuerpos y minicuerpos. Así pues, todas y cada una de las formas de realización proporcionadas en la presente memoria donde se haga referencia a «anticuerpos» o a «constructos similares a anticuerpos» también abarcan formas de realización con anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, fragmentos scFv, constructos con receptor de anticuerpo quimérico (CAR), diacuerpo y/o minicuerpo, a menos que se indique explícitamente otra cosa. El término «anticuerpo» incluye un polipéptido de la familia de las inmunoglobulinas o un polipéptido que comprende fragmentos de una inmunoglobulina que es capaz de unirse de forma no covalente, reversible y específica a un antígeno pertinente, preferentemente el TAA de la invención, tal y como se da a conocer en la presente memoria. A título de ejemplo, una unidad estructural de anticuerpo comprende un tetrámero. En ciertas formas de realización, un anticuerpo entero puede estar compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, en las que cada uno de esos pares está compuesto por una cadena «ligera» y otra «pesada» (unidas por un puente disulfuro). La estructura de los anticuerpos y los isotipos son bien conocidas por las personas versadas en la materia (consúltese por ejemplo Janeway's Immunobiology, 9.a edición, 2016).
Los genes de las inmunoglobulinas reconocidos en los mamíferos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la infinidad de genes de la región variable de la inmunoglobulina (para más información sobre los genes de la inmunoglobulina véase el Sistema de información internacional ImMunoGeneTics®, Lefranc M-P et al, Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D413-22; y http://www.imgt.org/). En las cadenas enteras, las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. En las cadenas enteras, las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta y épsilon, que a su vez definen las siguientes clases de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos que es la principal responsable del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) designan esas regiones en las cadenas ligera y pesada. Tal y como se emplea en la presente invención, un «anticuerpo» abarca todas las variaciones del anticuerpo y de los fragmentos del mismo. Así pues, dentro del ámbito de este concepto quedan englobados los anticuerpos enteros, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios (scFv), Fab, Fab' y las versiones multiméricas de tales fragmentos (p. ej., F(ab')2) con una especificidad de unión idéntica, básicamente idéntica o similar. En ciertas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a un péptido del TAA de la invención. Los constructos reconocedores de antígenos preferidos de acuerdo con la invención incluyen una cadena pesada de anticuerpo, preferentemente el dominio variable de la misma, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, y/o una cadena ligera de anticuerpo, preferentemente el dominio variable de la misma, o un fragmento de unión al antígeno de la misma. De forma similar, es posible preparar fragmentos de región variable estabilizados con puentes disulfuro (dsFv) mediante técnicas de ADN recombinante que sirvan como fragmentos de anticuerpo de la invención; no obstante, los tipos de fragmentos de anticuerpo no se limitan a los citados, que se muestran a título de ejemplo. Asimismo, el anticuerpo, o la fracción de unión al antígeno del mismo, puede ser modificado para que contenga un marcador detectable, como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante), y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro). En ciertos casos, la secuencia de la CDR3 del TCR puede ser ligeramente modificada, pero es preferible que lo sea como máximo en 3 residuos de aminoácidos, preferentemente solo en dos y, más preferentemente aún, en una sola posición de aminoácido, con respecto a las secuencias de la CDR3 expuestas en las SEQ ID N.° 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 y 117. Preferentemente, los anticuerpos comprenden la CDR3, preferentemente todas las regiones CDR1 a CDR3 en la combinación, tal y como se indica para el t Cr de la invención en la Tabla 1, en cada caso independientemente, y opcionalmente con un máximo de tres, o dos, o preferentemente una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en comparación con tales secuencias.
Los métodos adecuados para fabricar anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos estándar de hibridomas se describen en por ejemplo Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), and C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)). Alternativamente, otros métodos, tales como los métodos de hibridoma EBV (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), and Roder et al, Methods Enzymol, 121, 14067 (1986)), y los sistemas de expresión de vectores de bacteriófagos (véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) son conocidos en la técnica. Además, los métodos para producir anticuerpos en animales no humanos se describen, por ejemplo, en las patentes U.S. 5,545,806, 5,569,825, y 5,714,352, y la publicación de solicitud de patente U.S No. 2002/0197266.
Ciertas formas de realización de la invención también conciernen a TCR, o a fragmentos funcionales y polipéptidos de los mismos, que son TCR solubles. A efectos de la presente memoria, el término «receptor de célula T soluble» se refiere a variantes truncadas heterodiméricas de TCR nativos, que comprenden fracciones extracelulares de la cadena a y de la cadena p del TCR que, por ejemplo, permanecen unidas por un puente disulfuro, pero que carecen de los dominios transmembrana y citosólico de la proteína nativa. Los términos «secuencia de la cadena a del receptor de célula T soluble» y «secuencia de la cadena p del receptor de célula T soluble» se refieren a secuencias de las cadenas a y p del TCR que carecen de los dominios transmembrana y citosólico. La secuencia (de aminoácidos o de ácidos nucleicos) de las cadenas a y p del TCR soluble pueden ser idénticas a las secuencias correspondientes de un TCR nativo o pueden comprender secuencias de las cadenas a y p del TCR soluble que sean variantes, en comparación con las secuencias del correspondiente TCR nativo. A efectos de la presente memoria, el término «receptor de célula T soluble» abarca los TCR solubles provistos de secuencias variantes y no variantes de las cadenas a y p de TCR soluble. Las variaciones pueden radicar en las regiones variables o constantes de las secuencias de las cadenas a y p de TCR soluble y pueden incluir, sin ánimo de limitación, mutaciones por deleción, inserción o sustitución de aminoácidos, así como cambios en la secuencia de ácidos nucleicos que no alteren la secuencia de aminoácidos. Los TCR solubles de la invención conservarán en cualquier caso la funcionalidad de unión de las moléculas originales de las cuales deriven.
El susodicho problema se resuelve además mediante un ácido nucleico que codifique un constructo reconocedor de antígeno de la invención, o cualquiera de los susodichos constructos proteicos o polipeptídicos. El ácido nucleico tendrá preferentemente: (a) una hebra que codifique un constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención; (b) una hebra complementaria de la hebra (a); o (c) una hebra que se hibride en condiciones rigurosas (restrictivas) con una molécula descrita en (a) o (b). Las condiciones rigurosas son conocidas por las personas versadas en la materia, concretamente se pueden consultar en Sambrook et al, “Molecular Cloning”. Además de lo anterior, el ácido nucleico puede contener opcionalmente otras secuencias que sean necesarias para expresar la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente a la proteína, específicamente para su expresión en una célula de mamífero o humana. El ácido nucleico usado puede estar contenido en un vector adecuado para posibilitar la expresión en la célula en cuestión de la secuencia de ácido nucleico correspondiente al péptido. No obstante, los ácidos nucleicos también se pueden usar para transformar una célula presentadora de antígeno, que podría no ser una célula presentadora de antígeno clásica, como son las células dendríticas, de tal modo que ella misma produjera las proteínas correspondientes en su superficie celular.
En ciertas formas de realización, los polipéptidos de los constructos reconocedores de antígeno pueden ser codificados por ácidos nucleicos y expresados en condiciones in vivo o in vitro. Así pues, en ciertas formas de realización, se proporciona un ácido nucleico que codifica un constructo reconocedor de antígeno. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico codifica una parte o un monómero de un constructo reconocedor de antígeno de la invención (por ejemplo, una de las dos cadenas de un TCR de la invención), y/u otro ácido nucleico codifica otra parte o un monómero de un constructo reconocedor de antígeno de la invención (por ejemplo, la otra de las dos cadenas del TCR). En ciertas formas de realización, el ácido nucleico codifica dos o más cadenas polipeptídicas del constructo reconocedor de antígeno, por ejemplo, como mínimo 2 cadenas del TCR. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas del constructo reconocedor de antígeno pueden incluir sitios de escisión para el ácido nucleico entre al menos dos secuencias de cadena, pueden codificar un sitio de inicio de la transcripción o de la traducción entre dos o más secuencias de cadena, y/o codificar sitios diana para proteólisis entre dos o más cadenas del constructo reconocedor de antígeno.
A efectos de la presente memoria, «ácido nucleico» incluye «polinucleótido», «oligonucleótido» y «molécula de ácido nucleico», y en general designa un polímero de ADN o de ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (p. ej., aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y puede contener un enlace entre nucleótidos naturales, no naturales o alterados, como un enlace fosforamidato o fosforotioato, en lugar del enlace fosfodiéster que se halla entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado.
Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. A efectos de la presente memoria, el término «recombinante» se refiere a: (i) moléculas que son construidas fuera de las células vivas mediante la unión de segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos con moléculas de ácidos nucleicos que se pueden replicar en una célula viva; o (ii) moléculas que son el resultado de la replicación de las descritas en el precedente punto (i). A efectos de la presente memoria, la replicación puede ser una replicación en condiciones in vitro o en condiciones in vivo. El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, o fracciones funcionales o variantes funcionales de los mismos que se describen en la presente memoria.
Además, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico acorde con la invención tal y como se ha descrito antes. Es conveniente que el vector sea un vector de expresión o un vector de expresión recombinante.
En el contexto de la presente invención, el término «vector de expresión recombinante» se refiere a un constructo de ácido nucleico que posibilita la expresión de un ARNm, una proteína o un polipéptido en el seno de una célula hospedadora adecuada. El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante, y se puede usar para transformar o transfectar cualquier hospedador adecuado. Los vectores aptos incluyen los diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o bien para ambas, tales como plásmidos y virus. Ejemplos de vectores de expresión en animales son pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo. Preferentemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral. El vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicas para cada tipo de célula hospedadora (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal), en la cual se va a introducir el vector con el propósito de que tenga lugar la expresión del ácido nucleico de la invención. Asimismo, el vector de la invención puede incluir uno o varios genes marcadores, que permitan la selección de las células hospedadoras transformadas o transfectadas. El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor normativo o nativo enlazado funcionalmente con la secuencia de nucleótidos que codifica los constructos de la invención, o con la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica los constructos de la invención. Los promotores susceptibles de selección incluyen, entre otros tipos, promotores específicos del desarrollo o de tejido, inducibles, débiles o potentes. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden ser diseñados para generar una expresión transitoria o una expresión estable, o ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden diseñar para generar una expresión constitutiva o bien inducible.
La invención también atañe a una célula hospedadora que comprende un constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención. En concreto, la célula hospedadora de la invención comprende un ácido nucleico, o un vector como el descrito antes en la presente memoria. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, vegetal, animal, fúngica o algal, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacteriana o protozoaria. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, como por ejemplo un ser humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherida o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. A los efectos de producir un TCR, un polipéptido o una proteína que sean recombinantes, es preferible que la célula hospedadora sea una célula de mamífero. Lo más preferible es que la célula hospedadora sea una célula humana. Si bien la célula hospedadora puede ser una célula de cualquier tipo, procedente de cualquier tipo de tejido y perteneciente a cualquier estadio del desarrollo, es preferible que sea un leucocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononucleada de sangre periférica (PBMC). Más preferentemente aún es que la célula hospedadora sea una célula T. La célula T puede ser cualquier célula T, como una célula T cultivada, p. ej., una célula T primaria, o una célula T procedente de una estirpe cultivada de células T, como, p. ej., Jurkat, SupT1, etc., o bien una célula T obtenida de un mamífero, preferentemente una célula T o un precursor de célula T extraída a un paciente humano. Si se obtiene de un mamífero, la célula T puede proceder de numerosas fuentes, tales como sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos o líquidos corporales, sin limitación. Las células T también se pueden enriquecer o purificar. Preferentemente, la célula T es una célula T humana. Más preferentemente aún, la célula T es una célula T aislada de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede pertenecera cualquier estadio del desarrollo, incluidos entre otros, una célula T CD4-positiva y/o CD8-positiva, células T cooperadoras CD4-positivas, como, p. ej., células Th1 y Th2, células T CD8-positivas (p. ej., células T citotóxicas), células infiltradas en tumores (TIL), células T de memoria, células T vírgenes, y similares. Preferentemente, la célula T es una célula T CD8-positiva o una célula T CD4-positiva.
Preferentemente, la célula hospedadora de la invención es un linfocito, preferiblemente una célula T, como una célula T CD4-positiva o una célula T CD8-positiva. Aún más preferentemente, la célula hospedadora es una célula T oncorreactiva que actúa específicamente contra las células tumorales que expresan TAA.
El objetivo de la invención también se resuelve con un método de fabricación de un constructo reconocedor de antígeno específico del TAA, o de una estirpe celular que exprese el constructo reconocedor de antígeno específico del TAA, el cual comprende:
a. Proporcionar una célula hospedadora adecuada
b. Proporcionar un constructo genético que comprende una secuencia codificante que codifica un constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención dada a conocer en la presente memoria
c. Introducir en la citada célula hospedadora adecuada el citado constructo genético, y
d. La expresión del citado constructo genético por la citada célula hospedadora adecuada
El método puede comprender, además, un paso de presentación del citado constructo reconocedor de antígeno en la superficie de la citada célula hospedadora adecuada.
En otras formas de realización preferidas, el constructo genético es un constructo de expresión que comprende una secuencia promotora enlazada funcionalmente con dicha secuencia codificante.
Preferentemente, dicho constructo reconocedor de antígeno procede de un mamífero, y preferiblemente es de origen humano. La célula hospedadora adecuada que se prefiere para el uso en el método de la invención es una célula de mamífero, como una célula humana, en particular una célula T humana. Las células T para el uso en la invención ya han sido descritas pormenorizadamente en la presente memoria.
La invención también abarca formas de realización en las que dicho constructo reconocedor de antígeno es un TCR modificado, y en la que dicha modificación consiste en la adición de dominios funcionales, como un marcador o un principio activo terapéutico. Asimismo, abarca TCR provistos de dominios alternativos, como un dominio de anclaje a membrana alternativo en lugar de la región transmembrana endógena.
Es conveniente que el sistema de transfección destinado a introducir el constructo genético en la citada célula hospedadora adecuada sea un sistema basado en un vector retroviral. Tales sistemas son bien conocidos por las personas versadas en la materia.
En una de sus formas de realización, la presente invención también comprende una etapa adicional del método que consiste en el aislamiento y la purificación del constructo reconocedor de antígeno a partir de la célula y, opcionalmente, en la reconstitución de los fragmentos traducidos de dicho constructo en una célula T.
En un aspecto alternativo de la invención, se provee una célula T obtenida o que puede ser obtenido mediante un método para la producción de un receptor de célula T (TCR), que es específico para células tumorales y que presenta una afinidad elevada, tal y como se ha descrito antes en la presente memoria. Tal célula T depende de la célula hospedadora usada en el método de la invención, por ejemplo, una célula T humana o no humana, pero preferentemente un TCR humano.
El término «aislado», tal y como se emplea en la presente memoria en el contexto de un polipéptido, como un constructo reconocedor de antígeno (un ejemplo del cual puede ser un anticuerpo), se refiere a un polipéptido que es purificado de otras proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico, experimental o cualesquier otro. Un constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención puede ser un constructo, que se une a antígeno, recombinante, sintético o modificado (no natural). El término «aislado» tal y como se emplea en la presente memoria en el contexto de un ácido nucleico o de una célula se refiere o bien a un ácido nucleico o a una célula que es purificado/a de entre ADN, ARN, proteínas o polipéptidos o cualquier otro contaminante (como otras células) que interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico, experimental o cualesquier otro, o bien a un ácido nucleico recombinante, sintético o modificado (no natural). En este contexto, una proteína o polipéptido o un ácido nucleico que sea «recombinante» es todo aquel fabricado con técnicas recombinantes. Los métodos y las técnicas destinadas a la producción de ácidos nucleicos y proteínas recombinantes son bien conocidos en la materia.
Métodos de tratamiento y enfermedades
Las referencias a los métodos de tratamiento que aparecen en los párrafos siguientes de esta descripción han de ser interpretadas como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención destinados al uso como método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapias.
Otro aspecto más de la presente invención se refiere a los constructos reconocedores de antígeno, los ácidos nucleicos, los vectores, las composiciones farmacéuticas y/o la célula hospedadora que se exponen en la presente memoria destinados al uso en medicina. En una forma de realización preferida, el uso en medicina incluye el uso para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad tumoral, como una enfermedad tumoral benigna o maligna. La enfermedad tumoral es, por ejemplo, una enfermedad tumoral que se caracteriza por la expresión del TAA, en una célula cancerosa o tumoral de dicha enfermedad.
Con respecto a las susodichas aplicaciones médicas de los constructos reconocedores de antígeno y los otros materiales derivados de los mismos, pertenecientes al mismo o que codifiquen el mismo, en concordancia con la presente revelación, las enfermedades susceptibles de tratamiento o de diagnóstico pueden ser cualquier trastorno proliferativo, preferentemente caracterizado por la expresión del TAA o de la secuencia del epítopo del TAA de la invención, por ejemplo cualquier tipo de cáncer, incluidos cualquiera de los siguientes: cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer óseo, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer del ano, del canal anal o anorrectal, cáncer ocular, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de la nariz, la cavidad nasal o del oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de rinofaringe, linfoma no hodgkiniano, cáncer bucofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de los tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Tipos de cáncer preferidos son el cáncer de cuello uterino, bucofaríngeo, de ano, del canal anal, anorrectal, de vagina, vulva o pene. Un cáncer especialmente preferido es el cáncer positivo para TAA, incluido preferentemente el melanoma y el cáncer gástrico y gastrointestinal.
Los constructos, proteínas, TCR, anticuerpos, polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención están destinados en particular para el uso en inmunoterapia, preferentemente en la terapia adoptiva de células T. La administración de los compuestos de la invención puede, por ejemplo, implicar la infusión de las células T de la invención en el paciente en cuestión. Preferiblemente, tales células T son células T autólogas del paciente que en condiciones in vitro se transducen con un ácido nucleico o con un constructo reconocedor de antígeno de la presente invención.
Los constructos reconocedores de antígeno, los TCR, polipéptidos, proteínas (incluidas las variantes funcionales de todos ellos), los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) y los anticuerpos (incluidas las fracciones de unión al antígeno de los mismos) que forman parte de la presente invención serán designados todos ellos de manera colectiva como «materiales del TCR de la invención» de aquí en adelante y podrán ser formulados en una composición, como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los constructos reconocedores de antígeno, los TCR, polipéptidos, proteínas, fracciones funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) y los anticuerpos (incluidas las fracciones de unión al antígeno de los mismos) descritos en la presente memoria, así como un vehículo, excipiente y/o estabilizante aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualesquiera de los materiales de TCR de la invención pueden comprender más de un material de TCR de la invención, como, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR distintos (incluidas las fracciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos). Alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR de la invención en combinación con otros medicamentos o principios activos farmacéuticos, como antineoplásicos, p. ej., asparraginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. Preferentemente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el vehículo puede ser cualquiera de los usados habitualmente para el material de TCR de la presente invención en consideración. Tales vehículos farmacéuticos son bien conocidos por las personas versadas en la materia y están públicamente disponibles. Es preferible que el vehículo farmacéutico no cause efectos secundarios perjudiciales ni toxicidad si se emplea siguiendo las condiciones de uso.
Así pues, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los productos de la invención y de materiales de TCR de la invención que se describen en la presente memoria, en concreto cualesquiera proteínas, ácidos nucleicos o células hospedadoras. En una forma de realización preferida la composición farmacéutica está destinada a servir como inmunoterapia, preferentemente la terapia adoptiva con células.
Preferentemente, el material de TCR de la invención se administra mediante inyección, por ejemplo, intravenosa. Cuando el material de TCR de la invención sea una célula hospedadora que exprese el t Cr de la invención (o una variante funcional del mismo), el vehículo farmacéutico para las células que se administrarán mediante inyección puede incluir cualquier vehículo isotónico como, por ejemplo, solución salina normal (aprox. 0,90% p/v de NaCl en agua, aprox. 300 mOsm/l de NaCl en agua, o aprox. 9,0 g de NaCl por litro de agua), solución de electrólitos NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL, EE. UU.), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL, EE. UU.), o una solución de dextrosa de aprox. el 5% en agua, o solución de lactato (de Ringer). En una forma de realización, el vehículo farmacéutico se complementa con seroalbúmina humana.
A efectos de la invención, la cantidad o la dosis del material de TCR de la invención (p. ej., el número de células cuando el material de TCR de la invención sea una o más células) que se ha de administrar debe ser la suficiente para influir, p. ej., para generar una respuesta preventiva o terapéutica, en el sujeto o en el animal durante un plazo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR de la invención debe bastar para unirse a un antígeno tumoral, o para detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período comprendido aproximadamente entre las 2 horas o más, p. ej., 12 o 24 horas o más, desde el momento de la administración. En ciertas formas de realización, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis será determinada por la eficacia del material de TCR de la invención en particular y del estado del animal (por ejemplo, humano), así como del peso corporal del animal (por ejemplo, humano) que va a ser tratado.
Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención, los constructos reconocedores de antígeno, los TCR (incluidas las variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras o poblaciones de células se puedan usar en métodos para tratar o prevenir el cáncer, o los estados precancerosos positivos para TAA. Se cree que los TCR de la invención (y las variantes funcionales de los mismos) se unen específicamente al TAA de la invención, de tal modo que cuando el TCR (o el polipéptido o la proteína de la invención relacionados y las variantes funcionales de los mismos) se expresa en una célula, como una célula T, es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expresa el TAA de la invención, preferentemente de presentar péptidos del TAA a través del MHC I o II sobre la superficie de dicha célula diana. A este respecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad, en particular el cáncer, en un mamífero, el cual comprende la administración al mamífero de cualquiera de las composiciones farmacéuticas, constructos reconocedores de antígeno, en particular los TCR (y las variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifique alguno de los TCR (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas descritos en la presente memoria, o cualquier célula hospedadora o población de células que comprenda un ácido nucleico o vector recombinante, que codifique algunos de los constructos de la invención (y las variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritas en la presente memoria, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad en el mamífero, siendo preferentemente dicha enfermedad un cáncer, como un cáncer que exprese el TAA de la invención.
Algunos ejemplos de vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico o de diluyentes útiles para la presente invención son estabilizantes como SPGA, carbohidratos (sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa o dextrano, entre otros), proteínas como albúmina o caseína, agentes portadores de proteínas como suero bovino o leche descremada y tampones (tampón fosfato, por ejemplo).
A efectos de la presente memoria, los términos «tratar» y «prevenir» así como las palabras derivadas de los mismos, no implican necesariamente el tratamiento o la prevención al 100% o en términos absolutos. Más bien existen diversos grados de tratamiento o de prevención de los que cualquier persona versada en la materia reconocerá como dotados de un posible efecto terapéutico o benéfico. A este respecto, los métodos de la invención pueden proporcionar cualquier grado de tratamiento o de prevención de una enfermedad en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método de la invención pueden incluir el tratamiento o la prevención de una o más enfermedades o síntomas de la enfermedad, p. ej., el cáncer, que está siendo tratada o prevenida. Por ejemplo, el tratamiento o la prevención pueden incluir la promoción de la regresión de un tumor. Asimismo, a los efectos de la presente memoria, «prevención» puede abarcar el retraso en la aparición de la enfermedad, o de un síntoma o trastorno de la misma.
Se da a conocer, además, a un método para tratar el cáncer que comprende la administración de un TCR, un ácido nucleico o una célula hospedadora de la presente descripción en combinación con al menos un agente antineoplásico y/o radioterapia.
Se da a conocer, además, a un método para detectar una proteína TAA, o un complejo formado por una molécula del MHC con la proteína TAA (epítopo proteico del TAA), en una muestra (biológica) -como la obtenida de un sujeto o paciente- que comprende la puesta en contacto de la muestra con un constructo reconocedor de antígeno que se una específicamente a dicho péptido TAA, o al complejo péptido TAA/MHC, y la detección de la unión entre dicho constructo reconocedor de antígeno y dicho péptido TAA, o dicho complejo de péptido TAA/MHC. En ciertas formas de realización, el constructo reconocedor de antígeno es un TCR o un anticuerpo, o constructos similares, o preferentemente el constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención descrita en la presente memoria. En ciertas formas de realización, la muestra (biológica) es una muestra de un tumor o un cáncer (como cualquiera de los descritos a lo largo de la presente memoria), por ejemplo, una muestra que comprende células tumorales o cancerosas.
También se da a conocer un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, el cual comprende:
a) Aislamiento de una célula de dicho sujeto
b) Transformación de la célula con al menos un vector que codifique un constructo reconocedor de antígeno de la presente invención para producir una célula transformada
c) Expansión de la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas; y
d) Administración de la pluralidad de células transformadas a dicho sujeto.
También se da a conocer un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, el cual comprende:
a) Aislamiento de una célula procedente de un donante sano
b) Transformación de la célula con un vector que codifique un constructo reconocedor de antígeno de la presente invención para producir una célula transformada
c) Expansión de la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas; y
d) Administración de la pluralidad de células transformadas a dicho sujeto.
También se proporciona un método in vitro para detectar el cáncer en una muestra biológica, el cual comprende:
a) Puesta en contacto de la muestra biológica con un constructo reconocedor de antígeno de la presente descripción
b) Detección de la unión del constructo reconocedor de antígeno a la muestra biológica.
Asimismo, se proporciona un método para detectar la presencia de una enfermedad en un mamífero. El método comprende: (i) La puesta en contacto de una muestra que comprenda una o más células del mamífero con cualquiera de los TCR (y las variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos que forman parte de la invención, o bien de las composiciones farmacéuticas descritas aquí, de tal modo que formen un complejo, y la detección de este complejo, siendo su detección indicadora de la presencia de la enfermedad en el mamífero, en la que la enfermedad es cáncer, tal como una neoplasia maligna positiva para TAA.
Con respecto al método de la invención para detectar una enfermedad en un mamífero, la muestra de células puede ser una muestra que contenga células enteras, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de células enteras, como, p. ej., una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción consistente en proteínas enteras, o una fracción consistente en ácidos nucleicos.
A efectos del método de detección de la invención, el contacto tiene lugar en condiciones in vitro en lo que concierne al mamífero.
Asimismo, la detección del complejo puede darse a través diversos modos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los constructos reconocedores de antígeno (y las variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células o anticuerpos o TCR, o fracciones de unión al antígeno de los mismos que forman parte de la invención y que se describen en la presente memoria, pueden ser marcados con un marcador detectable como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (isotiocianato de fluoresceína (FOTC), ficoeritrina (PE), etc.), una enzima (fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, etc.), y partículas de elementos (partículas de oro, etc.).
A efectos de los métodos de la invención, en los que se administren células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser alogénicas o autólogas del mamífero en cuestión. Preferentemente, las células son autólogas del mamífero.
Con respecto a las susodichas aplicaciones médicas del material de TCR de la invención, el cáncer susceptible de diagnóstico y/o de tratamiento puede ser cualquier cáncer, incluido cualquiera de los siguientes: cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer óseo, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer del ano, del canal anal o anorrectal, cáncer ocular, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de la nariz, la cavidad nasal o el oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer rinofaríngeo, linfoma no hodgkiniano, cáncer bucofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de los tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Tipos de cáncer preferidos son el cáncer de cuello uterino, bucofaríngeo, de ano, del canal anal, anorrectal, de vagina, vulva o pene. Un cáncer especialmente preferido es el cáncer positivo para TAA, como el cáncer de piel, o preferentemente como el melanoma y el cáncer gástrico o gastrointestinal.
En general, la invención proporciona constructos reconocedores de antígeno, ácidos nucleicos, vectores, composiciones farmacéuticas y/o célula hospedadora que la presente invención da a conocer para el uso en el ttratamiento de un tumor o de una enfermedad tumoral en un sujeto. Preferentemente el sujeto es un sujeto que precisa un tratamiento de esa naturaleza. En las formas de realización preferidas el sujeto es un mamífero, preferentemente un paciente humano, que está aquejado por un tumor o enfermedad tumoral, que es positiva para TAA.
A continuación, se pasará a describir con más detalle la presente invención mediante una serie de ejemplos en los que se aludirá a figuras y secuencias adjuntas que describen las formas de realización preferidas de los mismos, sin que con ello se pretenda limitar el alcance de la invención. En las figuras y secuencias:
Figura 1: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P1A9 (SEQ ID N.° 1 a 12), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ iD N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T c D8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas (Y) de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente
Figura 2: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P2A6 (SEQ ID N.° 13 a 24), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 3: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P3H1 (SEQ ID N.° 25 a 36), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos.
Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 4: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R35P3A4 (SEQ ID N.° 37 a 48), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 5: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R37P1C9 (SEQ ID N.° 49 a 60), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T c D8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 6: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R37P1H1 (SEQ ID N.° 61 a 72), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T c D8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectiavamente.
Figura 7: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R42P3A9 (SEQ ID N.° 73 a 84), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T c D8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 8: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R43P3F2 (SEQ ID N.° 85 a 96), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T c D8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 9: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R43P3G5 (SEQ ID N.° 97 a 108), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T c D8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 10: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R59P2E7 (SEQ ID N.° 109 a 120), tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del MAGEA1-003 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9 (SEQ ID N.° 134 a 142) o el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 11: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P1A9 (SEQ ID N.° 1 a 12) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151) o RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 12: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P2A6 (SEQ ID N.° 13 a 24) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151) o RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 13: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P3H1 (SEQ ID N.° 25 a 36) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151) o RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 14: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R35P3A4 (SEQ ID N.° 37 a 48) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151), RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 15: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R37P1C9 (SEQ ID N.° 49 a 60) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151), RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 16: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R37P1H1 (SEQ ID N.° 61 a 72) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151), RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 17: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R42P3A9 (SEQ ID N.° 73 a 84) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151) o RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 18: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R43P3F2 (SEQ ID N.° 85 a 96) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151) o RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 19: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R43P3G5 (SEQ ID N.° 97 a 108) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151) o RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 20: Liberación de IFN-y por parte de células T CD8+ sometidas a electroporación con ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R59P2E7 (SEQ iD N.° 109 a 120) tras la incubación conjunta con células diana T2 cargadas con péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133) o con los péptidos homólogos pero no relacionados TMEM175-001 (SEQ ID N.° 143), EPAS-001 (SEQ ID N.° 144), PTRF-001 (SEQ ID N.° 145), GALNTL4-001 (SEQ ID N.° 146), PSME2-001 (SEQ ID N.° 147), KIAA103-002 (SEQ ID N.° 148), NSD1-001 (SEQ ID N.° 149), TBC1D9-002 (SEQ ID N.° 150), TMTC4-001 (SEQ ID N.° 151) o RASAL2-002 (SEQ ID N.° 152), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con células T c D8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ sometidas a electroporación para absorber ARN, solas o incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0004) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0005) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 21: Tinción con tetrámeros de HLA-A*02/MAGEA1-003 o con tetrámeros de HLA-A*02/NYESO1-001 de células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN de las cadenas alfa y beta de los R26P2A6 y R26P3H1, respectivamente. Como controles se utilizaron células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir en ellas el ARN del TCR 1G4, que se une específicamente al complejo HLA-A*02/NYESO1-001, así como células T CD8+ sometidas a una electroporación ficticia que sirvieron como controles.
Figura 22: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P1A9 (SEQ ID N.° 1-12) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133), o con diversas variantes del MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (SEQ ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 23: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P2A6 (SEQ ID N.° 13-24) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133), o con diversas variantes del MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 24: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P3A1 (SEQ ID N.° 25-36) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133), o con diversas variantes del MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ solss sometidas a la electroporación para introducir el ARN o incubads conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 25: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R35P3A4 (SEQ ID N.° 37-48) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133), o con diversas variantes del MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 26: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R37P1C9 (SEQ ID N.° 49-60) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) o con diversas variantes de MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la Se Q ID N.° 1 (SEQ ID N.° 154-162) o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T c D8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 27: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R37P1H1 (SEQ ID N.° 61-72) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133), o con diversas variantes de MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la s Eq ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de un donante. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas.
Figura 28: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R42P3A9 (SEQ ID N.° 73-84) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133), o con diversas variantes del MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de un donante. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas.
Figura 29: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R43P3F2 (SEQ ID N.° 85-96) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133), o con diversas variantes del MAGEA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 30: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R43P3G5 (SEQ ID N.° 97-108) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (Se Q ID N.° 133), o con diversas variantes del m Ag EA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 31: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R59P2E7 (SEQ ID N.° 109-120) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas o con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133), o con diversas variantes del m Ag EA1-003 con sustitución de treonina en las posiciones 1-9 de la SEQ ID N.° 1 (Se Q ID N.° 154-162), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon células T CD8+ solas sometidos a la electroporación para introducir el ARN, o bien incubadas conjuntamente con células diana no cargadas. El donante 1 (TCRA-0006) se muestra en el eje de ordenadas Y de la izquierda, y el donante 2 (TCRA-0007) en el eje de ordenadas Y de la derecha, respectivamente.
Figura 32: Secreción de IFN-y por células T CD8+ sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta de los TCR R35P3A4 (SEQ ID N.° 37-48), R37P1C9 (SEQ ID N.° 49-60) y R43P3G5 (SEQ ID N.° 97-108) tras su incubación conjunta con diferentes estirpes de células tumorales. U266B1 y UACC-257 presentan la diana; KMM-1, NCI-H2023, L-1236, MCF-7 y A-375 no la presentan. Como controles se emplearon células diana T2 cargadas con el MAGEA1-003 o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 153) y células T CD8+ solos sometidas a electroporación para introducir el ARN.
Figura 33: Secreción de IFN-y por células T previamente sometidas a la transducción mediante un lentivirus de diferentes constructos que contenían las cadenas alfa y beta de los TCR R35P3A4 (SEQ ID N.° 37-48; constructos R35D y R35G), R37P1C9 (SEQ ID N.° 49-60; constructos R37D y R37G) y R43P3G5 (SEQ ID N.° 97-108; constructos R43A y R43H) tras su incubación conjunta con diferentes células primarias y tipos celulares derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Como controles se emplearon células de las estirpes U266B1 y UACC-257 y células T solas.
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Figura 34: Secreción de IFN-y por células T previamente sometidas a la transducción mediante un lentivirus de diferentes constructos que contenían las cadenas alfa y beta del TCR R37P1C9 para evaluar el reconocimiento mediado por el LV-R37D del MAGEA1-003 procesado endógenamente y presentado.(A) Células T procedentes de tres donantes sanos, tanto no sometidas a transducción (NT) como sometidas a la misma con el LV-R37D se cultivaron conjuntamente con 3 estirpes distintas de células tumorales. Producción de IFN-y en presencia de estirpes de células tumorales HLA-A*02+ que expresan endógenamente el MAGEA1 (UACC257 y U266B1) o que no lo presentan en la superficie (KMM1). Aparecen indicadas las dianas E:T. (B) Producción de IFN-y en presencia de células T2 estimuladas con el péptido MAGEA1 añadido en distintas concentraciones (dilución en serie). Los cultivos conjuntos se ajustaron para tener una relación E:T de 4:1 (60.000 células T y 15.000 células T2). Se muestran la media y la desviación estándar del IFN-y segregado al cabo de 20 h en tres réplicas (donantes) con mediciones duplicadas efectuadas con ELISA.
Figura 35: Valoración de la potencia de la actividad citolítica contra células tumorales MAGEA1+ manifestada por células T previamente sometidas a transducción lentivírica para que expresaran el TCR R37P1C9 (constructo R37D). Se evaluó la respuesta citotóxica desplegada por células T sometidas a transducción con el LV-R37D como no transducidos (NT) contra tres tipos de células tumorales, a saber: (A) U138MG, MAGEA1+ (HLA-A*02+); (B) U138MG, MAGEA1 - (HLA-A*02+); y (C) U2-OS, MAGEA1+ (HLA-A*02+). Las valoraciones se efectuaron con diversos cocientes E:T (en el caso de A y de B) o con un cociente E:T de 10:1 (en el caso de C) en un ensayo de citotoxicidad de 96 horas con microscopía de fluorescencia. Los resultados presentados corresponden a las medias ± DE de 3 réplicas. NT: no sometidos a transducción. En las gráficas A y B, el % de citólisis = (área bajo la curva de la muestra experimental que contenía células T / área bajo la curva de las dianas tumorales solas) * 100, donde el área bajo la curva se calcula a partir de mediciones longitudinales del crecimiento, tal y como se muestra en la gráfica C; los valores de citólisis (%) negativos se igualaron a 0.
Figura 36: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R26P1A9 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM. Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes sanos distintos.
Figura 37: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R26P2A6 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM. Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes sanos distintos.
Figura 38: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R35P3A4 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM.
Figura 39: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R37P1C9 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM. Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes sanos distintos.
Figura 40: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R37P1H1 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM.
Figura 41: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R42P3A9 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM.
Figura 42: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R43P3F2 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM. Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes sanos distintos.
Figura 43: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R43P3G5 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM. Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes sanos distintos.
Figura 44: Secreción de IFN-y por células T CD8+ previamente sometidas a electroporación para introducir el ARN de las cadenas alfa y beta del TCr R59P2E7 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana T2 cargadas con el péptido MAGEA1-003 (SEQ ID N.° 133) en presencia de diversas concentraciones de carga del péptido de entre 10 pM y 10 pM. Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron de células T CD8+ procedentes de dos donantes sanos distintos.
Tabla 1: Secuencias de los TCR de la invención
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Tabla 2: Secuencias de péptidos de la invención
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Ejemplos
[0105] Diez TCR específicos de MAGEA1-003 (R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1C9, R37P1H1, R42p 3a 9, R43P3F2, R43P3G5 y R59P2E7, véase la Tabla 1), que codifican cada uno cadenas alfa y beta de TCR específicas de tumor, se aislaron y se amplificaron a partir de células T procedentes de donantes sanos. Las células procedentes de donantes sanos se estimularon in vitro mediante un método descrito previamente (Walter et al., 2003 J Immunol., Nov 15;171(10):4974-8) y las células diana específicas fueron células seleccionadas una a una mediante multímeros HLA-A*02 antes de ser destinadas al aislamiento de los TCR. Las secuencias de TCR se aislaron con la técnica 5'-RACE mediante métodos ordinarios como los descritos, por ejemplo, en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 4.a edición, de Green y Sambrook. Las regiones variables de las cadenas alfa y beta de los TCR R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1 R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5, R59P2E735P3A4, R37P1C9 y R37P1H1 se secuenciaron y se crearon constructos de expresión mediante síntesis de genes para proseguir con la caracterización funcional.
R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 y R59P2E7 derivan de un donante negativo para HLA-A*02 (contexto alorreactivo) y R35P3A4, R37P1C9 y R37P1H1 derivan de un donante positivo para HLA-A*02.
Los TCR de interés se expresaron en células T humanas mediante transducción, p. ej. mediante la introducción de ARNm por electroporación o la transducción con lentivirus. En el caso de la transducción con lentivirus, se descongelaron los PBMC y se dejaron en reposo hasta el día siguiente, antes de activarlos con anticuerpos inmovilizados. Los linfocitos activados se transdujeron con un vector lentívirico que codificaba el TCR específico del MAGEA1 y se expandieron en presencia de citocinas. Las células T se recolectaron y se concentraron mediante centrifugación, y acto seguido se conservaron criogenizadas.
Las células T se evaluaron mediante la prueba de secreción de IFN-y tras su cultivo conjunto con distintas células diana, como células T2 cargadas con diferentes péptidos, así como con estirpes de células tumorales y células primarias procedentes de tejidos sanos. Los datos referentes a la activación de las células T se muestran en forma de concentraciones absolutas de IFN-y o restadas a la secreción de fondo tal y como se indica más adelante. La eficacia de las células T CD8+ que expresaban los TCR R35P3A4, R37P1C9 y r 43P3G5 se determina, entre otros medios, mediante estudios de activación de las células T (secreción de IFN-y) o ensayos de actividad citolítica en los que como células diana se utilizaron diferentes estirpes de células tumorales. La caracterización del perfil de seguridad de los TCR de interés se abordó analizando la posible activación de las células T que expresaban los TCR tras su cultivo conjunto con distintos tipos de células primarias aisladas de tejidos sanos y de células derivadas de células progenitoras pluripotentes (iPSC) procedentes de donantes HLA-A*02-positivos (Figura 33). Los tipos de células se seleccionaron de tal modo que abarcasen órganos esenciales tales como el cerebro, el corazón o el hígado y distintos tejidos tales como el epitelio, el endotelio o el músculo liso. Las estirpes de células tumorales se analizaron comparándolas directamente como controles positivos y negativos.
El método de sustracción de la secreción de fondo del IFN-y consiste en:
Mediabg (TCRoi; co) _ [media(TCRoi; co)-media(TCRoi; solo efectores)]-[media(ficticios; co)-media(ficticios; solo efectores)]
Se calculó la respectiva DEbg:
DEbg (TCRoi; co) - [DE(TCRoi; co)2 DE(TCRoi; solo efectores)2 DE(ficticios;co)2 DE( ficticios; solo efectores)2]A[1/2]
TCRoi - linfocitos efectores que expresan el TCR de interés
Ficticios - linfocitos efectores que no expresan el TCR exógeno
Co - linfocitos efectores cultivados conjuntamente con células diana
Solo efectores - linfocitos efectores no cultivados conjuntamente
Media(bg) - secreción media de IFN-y (una vez restada la secreción de fondo)
DE(bg) - desviación estándar (una vez restada la secreción de fondo)
Ejemplo 1: Receptor de célula T R26P1A9
TCR R26P1A9 (SEQ ID N.° 1 a 12) está restringido al MAGEA1-003 presentado por HLA-A*02 (SEQ ID N.° 133) (véase la Figura 11). R26P1A9 reconoce específicamente a MAGEA1-003 puesto que las células T CD8+ primarios humanos que reexpresan dicho TCR segregan IFN-y tras su incubación conjunta con células diana HLA-A*02+, cargados o con el péptido MAGEA1-003 o con variantes de MAGEA1-003 provistas de sustituciones de alanina y treonina (Figuras 1 y 22). TCR R26P1A9 reconoce específicamente a MAGEA1-003, pero no a diversos péptidos cuya secuencia muestra un alto grado de similitud con la de MAGEA1-003 (Figura 11). El péptido NYESO1-001 sirve como control negativo. TCR R26P1A9 tiene un EC50 de 6nM (Figura 36).
Ejemplo 2: Receptor de célula T R26P2A6
TCR R26P2A6 (SEQ ID N.° 13 a 24) está restringido al MAGEA1-003 presentado por HLA-A*02 (SEQ ID N.° 133) (véase la Figura 12). R26P2A6 reconoce específicamente a MAGEA1-003 puesto que las células T CD8+ primarios humanos que reexpresan dicho TCR segregan IFN-y tras su incubación conjunta con células diana HLA-A*02+, cargados o con el péptido MAGEA1-003 o con variantes de MAGEA1-003 provistas de sustituciones de alanina y treonina (Figuras 2 y 23). TCR R26P2A6 reconoce específicamente a MAGEA1-003, pero no a diversos péptidos cuya secuencia muestra un alto grado de similitud con la de MAGEA1-003 (Figura 12). El péptido NYESO1-001 sirve como control negativo. TCR R26P1A9 tiene un EC50 de 100nM (Figura 37).
Ejemplo 3: Receptor de célula T R26P3H1
TCR R26P3H1 (SEQ ID N.° 25 a 36) está restringido al MAGEA1-003 presentado por HLA-A*02 (SEQ ID N.° 133) (véase la Figura 13). R26P3H1 reconoce específicamente a MAGEA1-003 puesto que las células T CD8+ primarios humanos que reexpresan dicho TCR segregan IFN-y tras su incubación conjunta con células diana HLA-A*02+, cargados o con el péptido MAGEA1-003 o con variantes de MAGEA1-003 provistas de sustituciones de alanina y treonina (Figuras 3 y 24). Esto TCR reconoce específicamente a MAGEA1-003, pero no a diversos péptidos cuya secuencia muestra un alto grado de similitud con la de MAGEA1-003 (Figura 13). El péptido NYESO1-001 sirve como control negativo. El TCR tiene un EC50 de 16nM.
Ejemplo 4: Receptor de célula T R35P3A4
TCR R35P3A4 (SEQ ID N.° 37 a 48) está restringido al MAGEA1-003 presentado por HLA-A*02 (SEQ ID N.° 133) (véase la Figura 14). R35P3A4 reconoce específicamente a MAGEA1-003 puesto que las células T CD8+ primarios humanos que reexpresan dicho TCR segregan IFN-y tras su incubación conjunta con células diana HLA-A*02+ y fijan a ellos tetrámeros HLA-A*02, respectivamente, cargados o con el péptido MAGEA1-003 o con variantes de MAGeA I-003 provistas de sustituciones de alanina y treonina (Figuras 4 y 25) Este TCR reconoce específicamente a MAGEA1-003, pero no a diversos péptidos cuya secuencia muestra un alto grado de similitud con la de MAGEA1-003 (Figura 14). El péptido NYESO1-001 sirve como control negativo. El TCR tiene un EC50 de 16nM (Figura 38) y una afinidad de 29 |jM.
En el caso de las células T CD8+ que expresaban el TCR R35P3A4 no se observó activación tras el cultivo conjunto con tipos de células procedentes de tejidos sanos que eran HLA-A*02 positivas (véase la Figura 33), pero en cambio sí mostraron actividad contra las estirpes de células tumorales UACC-257 y U266B1 que expresan el HLA-A*02 y el MAGEA1 como gen originario del péptido MAGEA1-003 (Figuras 32 y 33). En las células T CD8+ que expresaban el TCR 1G4 específico del péptido NYESO1 y utilizado como control sí se observó un patrón de reactividad, pues reaccionaron contra las estirpes de células tumorales HLA-A*02 positivas que expresaban el NYESO1, pero no contra el conjunto indicado de células procedentes de tejidos sanos.
La activación de las células T tras el cultivo conjunto con estirpes celulares que expresaban el HLA-A*02 y el MAGEA1 refleja el reconocimiento por parte de los TCR R35P3A4 de los complejos pHLA diana que son expresados endógenamente y presentados (pHLA = péptido presentado por el sistema de antígenos leucocitarios humanos).
Ejemplo 5: Receptor de célula T R37P1C9
TCR R37P1C9 (SEQ ID N.° 49 a 60) está restringido al MAGEA1-003 presentado por HLA-A*02 (SEQ ID N.° 133) (véase la Figura 15). R37P1C9 reconoce específicamente a MAGEA1-003 puesto que las células T CD8+ primarios humanos que reexpresan dicho TCR segregan IFN-y tras su incubación conjunta con células diana HLA-A*02+, cargados o con el péptido MAGEA1-003 o con variantes de MAGEA1-003 provistas de sustituciones de alanina y treonina (Figuras 5 y 26). Este TCR reconoce específicamente a MAGEA1-003, pero no a diversos péptidos cuya secuencia muestra un alto grado de similitud con la de MAGEA1-003 (Figura 15). El péptido NYESO1-001 sirve como control negativo. El TCR tiene un EC50 de 13nM (Figuras 34B y 39) y una afinidad de 8,7 j M.
La reexpresión de R37P1C9 en células T CD8+ primarios humanos conduce a la unión selectiva de los tetrámeros HLA-A*02/MAGEA1-003, pero no a la de los tetrámeros HLA-A*02/NYESO1-001 (Figura 21). Como controles se usaron la reexpresión del TCR 1G4, que es específico de NYESO1-001, y la expresión ficticia.
En el caso de las células T CD8+ que expresaban el TCR R37P1C9 no se observó activación tras el cultivo conjunto con tipos de células procedentes de tejidos sanos que eran HLA-A*02 positivas (véase la Figura 33), pero en cambio sí mostraron actividad contra las estirpes de células tumorales UACC-257 y U266B1 que expresan el HLA-A*02 y el MAGEA1 como gen originario del péptido MAGEA1-003 (Figuras 32 y 33).En las células T CD8+ que expresaban el TCR 1G4 específico del péptido NYESO1 y utilizado como control sí se observó un patrón de reactividad, pues reaccionaron contra las estirpes de células tumorales HLA-A*02 positivas que expresaban el NYESO1, pero no contra el conjunto indicado de células procedentes de tejidos sanos.
La activación de las células T tras el cultivo conjunto con estirpes celulares que expresaban el HLA-A*02 y el MAGEA1 refleja el reconocimiento por parte de los TCR R37P1C9 de los complejos pHLA expresados endógenamente y presentados, con independencia del método de inserción génica empleado, como p. ej. electroporación de ARNm, transducción lentivírica, etc. (Figuras 32 y 34).
Ejemplo 6: Receptor de célula T R37P1H1
TCR R37P1H1 (SEQ ID N.° 61 a 72) está restringido al MAGEA1-003 presentado por HLA-A*02 (SEQ ID N.° 133) (véase la Figura 16). R37P1H1 reconoce específicamente a MAGEA1-003 puesto que las células T CD8+ primarios humanos que reexpresan dicho TCR segregan IFN-y tras su incubación conjunta con células diana HLA-A*02+, cargados o con el péptido MAGEA1-003 o con variantes de MAGEA1-003 provistas de sustituciones de alanina y treonina (Figuras 6 y 27). Este TCR reconoce específicamente a MAGEA1-003, pero no a diversos péptidos cuya secuencia muestra un alto grado de similitud con la de MAGEA1-003 (Figura 16). El péptido NYESO1-001 sirve como control negativo. El TCR tiene un EC50 de 26nM (Figura 40).
La reexpresión de R37P1H1 en células T CD8+ primarios humanos conduce a la unión selectiva de los tetrámeros HLA-A*02/MAGEA1-003, pero no a la de los tetrámeros HLA-A*02/NYESO1-001 (Figura 21). Como controles se usaron la reexpresión del TCR 1G4, que es específico del péptido NYESO1-001, así como la expresión ficticia.
Ejemplo 7: Receptor de célula T R42P3A9
TCR R42P3A9 (SEQ ID N.° 73 a 84) está restringido al MAGEA1-003 presentado por HLA-A*02 (SEQ ID N.° 133) (véase la Figura 17). R42P3A9 reconoce específicamente a MAGEA1-003 puesto que las células T CD8+ primarios humanos que reexpresan dicho TCR segregan IFN-y tras su incubación conjunta con células diana HLA-A*02+, cargados o con el péptido MAGEA1-003 o con variantes de MAGEA1-003 provistas de sustituciones de alanina y

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un constructo reconocedor de antígenos que se une específica y/o selectivamente a un péptido antigénico de MAGEA1 de SEQ ID N.° 133 cuando dicho antígeno es presentado por el HLA, en el que dicho constructo reconocedor de antígenos comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 49, SEQ ID N.° 50 y s Eq ID N.° 51, respectivamente, y las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 55, SEQ ID N.° 56 y SEQ ID N.° 57, respectivamente
en el que dicho constructo reconocedor de antígenos comprende las secuencias de aminoácidos de las respectivas CDR con no más de un aminoácido modificado, en el que dicho aminoácido modificado es preferentemente el primer o el último aminoácido de la CDR respectiva y la modificación es una sustitución conservadora, y en el que dicho constructo reconocedor de antígenos no se une selectivamente a ninguno de los péptidos de las SEQ ID N.° 143 a 152.
2. Un constructo reconocedor de antígenos que se une específica y/o selectivamente a un péptido antigénico de MAGEA1 de la SEQ ID N.° 133 cuando dicho antígeno es presentado por el HLA, en el que dicho constructo reconocedor de antígenos es un receptor de célula T (TCR) o fragmento de la misma y comprende las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) CDR1 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N.° 49 y la SEQ ID N.° 51, respectivamente y las secuencias de la CDR1 y la CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidosde la SEQ ID N.° 55 y la SEQ ID N.° 57, respectivamente,
en el que dicho constructo reconocedor de antígenos comprende las secuencias de aminoácidos de la CDR respectiva con no más de un aminoácido modificado, en el que dicho aminoácido modificado es preferentemente el primer o el último aminoácido de la CDR respectiva y la modificación es una sustitución conservadora, y en el que dicho constructo reconocedor de antígenos no se une selectivamente a ninguno de los péptidos de las SEQ ID N.° 143 a 152.
3. El constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que dicho constructo reconocedor de antígenos comprende además:
la CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 50 y la CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 56.
4. El constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el constructo reconocedor de antígenos es un anticuerpo, o un derivado o fragmento del mismo, o un receptor de célula T ap (TCR), o un derivado o fragmento del mismo, o un TCR y§, o un derivado o fragmento del mismo.
5. El constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
6. El constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en el que dicho TCR es un TCR monocatenario (TCRmc) y/o un TCR soluble.
7. El constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una región de cadena variable del TCR que tiene al menos 90%, preferentemente del 95%, de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID N.° 52 y 58.
8. El constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el constructo reconocedor de antígenos es un TCR, o un fragmento del mismo, que comprende al menos una secuencia de cadena a de TCR y una de p de TCR, en el que dicha secuencia de cadena a de TCR comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 52, y en el que dicha secuencia de cadena p de TCR comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 58.
9. Un ácido nucleico que codifica un constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Una célula hospedadora que comprende un constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o un vector de acuerdo con la reivindicación 10, opcionalmente la célula hospedadora es un linfocito, preferentemente un linfocito T o un progenitor de linfocito T, más preferentemente una célula T CD4 o CD8 positiva.
12. Una composición farmacéutica que comprende el constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10, o la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 11, y un vehículo, estabilizante y/o excipiente farmacéuticamente aceptables.
13. El constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10, o la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 11, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, para el uso en medicina, opcionalmente para el uso en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad proliferativa.
14. El constructo reconocedor de antígenos, el ácido nucleico, el vector, o la célula hospedadora, o la composición farmacéutica, para el uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la enfermedad proliferativa es cáncer, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer cerebral, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y conductos biliares, cáncer de esófago, o una combinación de los mismos.
15. El constructo reconocedor de antígenos, el ácido nucleico, el vector, o la célula hospedadora, o la composición farmacéutica, para el uso de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en que el constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10, o la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 11, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 es un compuesto inmunoterapéutico.
16. El constructo reconocedor de antígenos, el ácido nucleico, el vector, o la célula hospedadora, o la composición farmacéutica, para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho uso comprende una transferencia de células inmunitarias adoptivas al paciente que necesita el tratamiento, tal como la transferencia de células T autólogas o heterólogas.
17. Un método para producir un constructo reconocedor de antígenos específico de MAGEA1, que comprende:
a) proporcionar una célula hospedadora adecuada
b) proporcionar un constructo genético que comprenda una secuencia codificante que codifique un constructo reconocedor de antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8
c) introducir en dicha célula hospedadora adecuada dicho constructo genético
d) la expresión de dicho constructo genético por la dicha célula hospedadora adecuada.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, que además comprende el aislamiento y la purificación del constructo reconocedor de antígenos a partir de la célula hospedadora adecuada y, opcionalmente, la reconstitución del constructo reconocedor de antígenos en una célula T.
19. Un método in vitro para detectar el cáncer en una muestra biológica que comprende:
e) puesta en contacto de la muestra biológica con el constructo reconocedor de antígenos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y
f) detección de la unión del constructo reconocedor de antígenos a la muestra biológica.
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