ES2941965T3 - Nuevos receptores de linfocito T genomanipulados e inmunoterapias basadas en el uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a construcciones que reconocen antígenos contra antígenos COL6A3. La invención en particular proporciona nuevas moléculas basadas en receptores de células T (TCR) diseñadas que son selectivas y específicas para el antígeno COL6A3 que expresa el tumor. El TCR de la invención, y los fragmentos de unión al antígeno COL6A3 derivados del mismo, son útiles para el diagnóstico, tratamiento y prevención de enfermedades cancerosas que expresan COL6A3. Además se proporcionan ácidos nucleicos que codifican las construcciones que reconocen antígenos de la invención, vectores que comprenden estos ácidos nucleicos, células recombinantes que expresan las construcciones que reconocen antígenos y composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos receptores de linfocito T genomanipulados e inmunoterapias basadas en el uso de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención atañe a constructos que reconocen antígenos, en concreto antígenos COL6A3. La invención proporciona en concreto moléculas basadas en un nuevo receptor de linfocito T (TCR) genomanipulado que son selectivas y específicas hacia el antígeno tumoral COL6A3.El t Cr de la invención, así como los fragmentos que se unen al antígeno COL6A3 y que derivan del mismo, están destinados al uso en el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de enfermedades tumorales que expresan el COL6A3. Además, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los constructos reconocedores del antígeno de la invención, los vectores que comprenden esos ácidos nucleicos, las células recombinantes que expresan los constructos reconocedores del antígeno y las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención.
ANTECEDENTES
Los colágenos constituyen una superfamilia de proteínas que intervienen en el mantenimiento de la integridad de varios tejidos. Los colágenos son proteínas de la matriz extracelular cuyo elemento estructural común es un dominio helicoidal triple. El colágeno VI es uno de los principales componentes estructurales de las microfibrillas. La unidad estructural básica del colágeno VI es un heterotrímero formado por cadenas de colágeno alfa-1(VI), alfa-2(VI) y alfa-3(VI). La cadena alfa-1(VI) está codificada por el gen COL6A1 y la cadena alfa-2(VI) por el gen COL6A2. La proteína codificada por el gen COL6A3 es la subunidad alfa-3 del colágeno de tipo VI (cadena de colágeno alfa-3(VI)) (Bertini et al., 2002 Eur. J. Paediatr. Neurol 6:193-8). Está demostrado que la expresión génica de COL6A3 aparece asociada con la progresión del cáncer de mama y aparece elevada en el cáncer de colon (Smith MJ, et al. “Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification” British journal of cancer. 2009;100:1452-1464; Tilman G et al “Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells” Mol Cancer. 2007;6:80) y que puede servir como marcador pronóstico del carcinoma colorrectal (Qiao J et al. “Stroma derived COL6A3 is a potential prognosis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics” Oncotarget. 2015 Oct 6; 6(30): 29929­ 29946). En el genoma humano, el gen COL6A3 está localizado en el cromosoma 2q37 y contiene 44 exones. La proteína COL6A3 posee 3177 aminoácidos y contiene 12 dominios de tipo A del factor de Von Willebrand (vWA), un dominio de tipo 3 de la fibronectina y un dominio de la familia BPTI/Kunitz de inhibidores de las serina proteasas (KU).
Las dianas de la inmunoterapia basada en los linfocitos T están constituidas por epítopos peptídicos derivados de proteínas específicas de los tumores o asociadas a los mismos, que son presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los antígenos asociados a tumores (TAA, por sus siglas en inglés) pueden ser péptidos derivados de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc., que son expresados y que, en comparación con células inalteradas del mismo origen, normalmente están regulados al alza en las células del tumor correspondiente.
Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer selectivamente y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T específicos de antígenos tumorales entre poblaciones de células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en la defensa inmunitaria natural contra el cáncer. Los linfocitos T CD8-positivos en particular, que reconocen las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) portadoras de péptidos que suelen tener de 8 a 10 residuos de aminoácidos derivados de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) localizados en el citosol, desempeñan un importante papel en esta respuesta. Las moléculas del MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
El TCR es una proteína heterodimérica ubicada en la superficie celular que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y que está asociada con proteínas invariables del complejo CD3 que intervienen en la transducción de señales. Los t Cr se dividen en heterodímeros ap y y§, que si bien son similares desde el punto de vista estructural son bastante distintos en su localización anatómica y, probablemente, en sus funciones. La fracción extracelular del TCR heterodimérico nativo ap consta de dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales posee un dominio constante en la parte más cercana a la membrana celular (proximal) y un dominio variable en el extremo más alejado de la misma (distal). Cada uno de los dominios constantes y variables alberga un puente disulfuro intracatenario. Los dominios variables contienen bucles altamente polimórficos que son análogos a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) propias de los anticuerpos. El uso de la terapia génica con TCR permite solventar algunas trabas. Permite dotar a los linfocitos T del propio paciente de las especificidades deseadas, así como generar el número suficiente de ellos en un breve lapso de tiempo y evitar su agotamiento. El TCR se transduce en los linfocitos T de la memoria central o en los linfocitos T dotados de características pluripotentes, con el fin de asegurar en lo posible una mayor persistencia o mejor función tras la transferencia. El propósito último es administrar los linfocitos T provistos de los TCR genomodificados a través de una infusión a los pacientes oncológicos que han quedado inmunodeprimidos (linfopénicos) a causa de la quimioterapia o la radioterapia, posibilitando así un injerto eficiente y al mismo tiempo anulando la depresión inmunitaria.
La patente WO 2011/113819 describe linfocitos T que reconocen antígenos asociados a tumores, pero que se unen a tales antígenos con una baja afinidad y una limitada especificidad. De forma similar, la patente WO 2016/156202 concierne a antígenos asociados a tumores y receptores de linfocito T que se unen a tales antígenos.
Si bien ha habido avances en el desarrollo de agentes dirigidos contra dianas moleculares como tratamiento contra el cáncer, en este campo sigue existiendo la necesidad de nuevos agentes antitumorales que tengan como diana moléculas altamente específicas de las células cancerosas. La presente descripción aborda esa necesidad dando a conocer nuevos TCR genomanipulados reconocedores del COL6A3, los correspondientes constructos recombinantes de TCR, ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras que se unen específicamente a uno o varios epítopos del COL6A3 dados a conocer, así como métodos para usar tales moléculas en el tratamiento contra el cáncer.
DESCRIPCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones anexas.
En un primer aspecto el objeto de la invención se resuelve mediante un constructo reconocedor de antígeno que comprende un primer dominio que a su vez comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) acordes con las SEQ ID 6 (CDRa2) y 7 (CDRa3), y un segundo dominio que a su vez comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) acordes con las SEQ ID N.° 14 (CDRb2) y 15 (CDRb3), en el cual:
a) la CRDa1 del primer dominio es como se expone en la SEQ ID N.° 5 y la CDRb1 del segundo dominio es seleccionada entre una de las secuencias de aminoácidos acordes con las SEQ ID N.° 37 o 44, o
b) la CDRa1 del primer dominio es como se expone en la SEQ ID N.° 26 y la CDRb1 del segundo dominio es seleccionada entre una de las secuencias de aminoácidos acordes con las SEQ ID N.° 13 y 37 a 49, donde el constructo reconocedor de antígeno es un receptor de linfocito T (TCR) o un derivado o fragmento del mismo, derivado o fragmento este que conserva la capacidad de la molécula para unirse al antígeno y/o reconocerlo y se une de forma específica y/o selectiva a un polipéptido antigénico de COL6A3.
En otra revelación de la presente enseñanza que no queda cubierta por las reivindicaciones, la CDRa1 de un constructo reconocedor de antígeno puede tener una identidad de al menos un 25% aproximadamente, al menos un 30% aproximadamente, al menos un 35% aproximadamente, al menos un 40% aproximadamente, al menos un 45% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente, al menos un 55% aproximadamente, al menos un 60% aproximadamente, al menos un 65% aproximadamente, al menos un 70% aproximadamente, al menos un 75% aproximadamente, al menos un 80% aproximadamente, al menos un 85% aproximadamente, al menos un 90% aproximadamente, al menos un 95% aproximadamente, al menos un 96% aproximadamente, al menos un 97% aproximadamente, al menos un 98% aproximadamente, o al menos un 99% aproximadamente con la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 5.
En otra revelación de la presente enseñanza que no queda cubierta por las reivindicaciones, la CDRa2 de un constructo reconocedor de antígeno puede tener una identidad de al menos un 25% aproximadamente, al menos un 30% aproximadamente, al menos un 35% aproximadamente, al menos un 40% aproximadamente, al menos un 45% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente, al menos un 55% aproximadamente, al menos un 60% aproximadamente, al menos un 65% aproximadamente, al menos un 70% aproximadamente, al menos un 75% aproximadamente, al menos un 80% aproximadamente, al menos un 85% aproximadamente, al menos un 90% aproximadamente, al menos un 95% aproximadamente, al menos un 96% aproximadamente, al menos un 97% aproximadamente, al menos un 98% aproximadamente, o al menos un 99% aproximadamente con la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 6.
En otra revelación de la presente enseñanza que no queda cubierta por las reivindicaciones, la CDRa3 de un constructo reconocedor de antígeno puede tener una identidad de al menos un 25% aproximadamente, al menos un 30% aproximadamente, al menos un 35% aproximadamente, al menos un 40% aproximadamente, al menos un 45% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente, al menos un 55% aproximadamente, al menos un 60% aproximadamente, al menos un 65% aproximadamente, al menos un 70% aproximadamente, al menos un 75% aproximadamente, al menos un 80% aproximadamente, al menos un 85% aproximadamente, al menos un 90% aproximadamente, al menos un 95% aproximadamente, al menos un 96% aproximadamente, al menos un 97% aproximadamente, al menos un 98% aproximadamente, o al menos un 99% aproximadamente con la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 7.
En otra revelación de la presente enseñanza que no queda cubierta por las reivindicaciones, la CDRb1 de un constructo reconocedor de antígeno puede tener una identidad de al menos un 25% aproximadamente, al menos un 30% aproximadamente, al menos un 35% aproximadamente, al menos un 40% aproximadamente, al menos un 45% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente, al menos un 55% aproximadamente, al menos un 60% aproximadamente, al menos un 65% aproximadamente, al menos un 70% aproximadamente, al menos un 75% aproximadamente, al menos un 80% aproximadamente, al menos un 85% aproximadamente, al menos un 90% aproximadamente, al menos un 95% aproximadamente, al menos un 96% aproximadamente, al menos un 97% aproximadamente, al menos un 98% aproximadamente, o al menos un 99% aproximadamente con la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 13.
En otra revelación de la presente enseñanza que no queda cubierta por las reivindicaciones, la CDRb2 de un constructo reconocedor de antígeno puede tener una identidad de al menos un 25% aproximadamente, al menos un 30% aproximadamente, al menos un 35% aproximadamente, al menos un 40% aproximadamente, al menos un 45% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente, al menos un 55% aproximadamente, al menos un 60% aproximadamente, al menos un 65% aproximadamente, al menos un 70% aproximadamente, al menos un 75% aproximadamente, al menos un 80% aproximadamente, al menos un 85% aproximadamente, al menos un 90% aproximadamente, al menos un 95% aproximadamente, al menos un 96% aproximadamente, al menos un 97% aproximadamente, al menos un 98% aproximadamente, o al menos un 99% aproximadamente con la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 14.
En otra revelación de la presente enseñanza que no queda cubierta por las reivindicaciones, la CDRb3 de un constructo reconocedor de antígeno puede tener una identidad de al menos un 25% aproximadamente, al menos un 30% aproximadamente, al menos un 35% aproximadamente, al menos un 40% aproximadamente, al menos un 45% aproximadamente, al menos un 50% aproximadamente, al menos un 55% aproximadamente, al menos un 60% aproximadamente, al menos un 65% aproximadamente, al menos un 70% aproximadamente, al menos un 75% aproximadamente, al menos un 80% aproximadamente, al menos un 85% aproximadamente, al menos un 90% aproximadamente, al menos un 95% aproximadamente, al menos un 96% aproximadamente, al menos un 97% aproximadamente, al menos un 98% aproximadamente, o al menos un 99% aproximadamente con la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 15.
En el contexto de la presente invención, los inventores han identificado versiones genomanipuladas mejoradas del TCR reconocedor del COL6A3 R4P3F9 que contienen secuencias CDR1 mutadas en las cadenas alfa y beta que mejoran la estabilidad, el reconocimiento y la selectividad con respecto al R4P3F9 original. Estas variantes maduradas de TCR han sido seleccionadas con un método que consta de dos fases: en la primera se selecciona la estabilidad y en la segunda la afinidad de las variantes (véanse los ejemplos). Si bien los TCR de la invención comprenden regiones CDR1 mutadas, es probable que las CDR2 y/o las CDR también puedan ser mutadas con el fin de aumentar la afinidad o especificidad de la unión y/o la selectividad, y que tales CDR mutadas idealmente puedan ser incluidas en los constructos existentes.
La maduración de la afinidad permitió identificar variantes con una actividad de unión considerablemente más fuerte hacia el HLA-A*02/péptido COL6A3, al mismo tiempo que se conserva o incluso se mejora la especificidad. En comparación con el TCR original C-1 (TCR R4P3F9 que comprende las CDR naturales (WT), véase la Tabla 5), todas las variantes de la invención mejoraron la secreción de IFN-gamma, pues se consiguieron concentraciones elevadas del mismo con bajas concentraciones de carga del péptido.
Dentro del dominio variable, la CDR1 y la CDR2 radican en la región variable (V) de la cadena polipeptídica, y la CDR3 abarca algunas de las regiones V y todas las regiones de diversidad (D) y de unión (J). Se supone que la CDR3 es la más variable y es la principal CDR responsable de reconocer de manera específica y selectiva un antígeno. Sorprendentemente, ciertas CDR1 de t Cr parecen entrar en contacto con el péptido, por lo que también son responsables del reconocimiento selectivo. En el presente caso, sin estar ligado a una teoría concreta, el CDR1b mutado parece interaccionar con la posición 8 del COL6A3-péptido.
Los TCR heterodiméricos alfa-beta nativos poseen una cadena alfa y una cadena beta. Ambas cadenas comprenden sendas regiones constante, de unión y variable, a las que normalmente se suma en la cadena beta una región de diversidad corta intercalada entre la región de unión y la variable, si bien dicha región de diversidad se considera a menudo parte de la región de unión. Cada región variable comprende tres CDR (regiones determinantes de la complementariedad) intercaladas en una secuencia estructural, una de las cuales es la región hipervariable llamada CDR3. Existen varios tipos de regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios tipos de regiones variables de la cadena beta (Vp) que se distinguen por su estructura, por las secuencias CDR1 y CDR2 y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. En la nomenclatura IMGT, los tipos Va reciben un número único t RAv , mientras que los tipos Vp reciben un número único TRBV.
Preferentemente, el constructo reconocedor de antígeno de la invención comprende las respectivas CDR1 a CDR3 de una región variable del TCR genomanipulado de la invención dado a conocer en la presente memoria. Se prefieren constructos reconocedores de antígenos (p. ej. TCR ap y y§) de la invención que comprendan como mínimo una o, preferentemente, dos secuencias CDR1 maduradas.
Las variantes de CDR enseñadas aquí -en particular las variantes de la CDR1- se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Dichas sustituciones son de naturaleza conservadora cuando un aminoácido es reemplazado por otro aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, el reemplazo de una leucina por una isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras». Las sustituciones conservadoras enseñadas aquí se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr y Trp).
Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina.
A efectos de la presente memoria, el término «especificidad» o «especificidad antigénica» o «específico para» un antígeno dado, significa que el constructo reconocedor de antígenos se puede unir específicamente a dicho antígeno, un antígeno COL6A3, preferentemente con una afinidad elevada, cuando dicho antígeno es presentado por moléculas del sistema HLA, preferentemente del alelo HLA-A2. Por ejemplo, se puede considerar que un TCR, en calidad de constructo reconocedor de antígenos, posee «especificidad antigénica» hacia los antígenos COL6A3, si los linfocitos T que expresan ese TCR en respuesta al HLA que presenta el COL6A3 segregan como mínimo unos 200 pg/ml o más de interferón gamma (IFN-y) (p.ej. 250 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg ml o más, 2000 pg/ml o más, 2500 pg/ml o más, 5000 pg/ml o más) tras su cultivo simultáneo con células diana HLA A2-positivas estimuladas con una baja concentración de un antígeno COL6A3, como los antígenos y los epítopos COL6A3 proporcionados más adelante en la presente memoria (p. ej., aprox. 10-11 mol/l, 10-10 mol/l, 10-9 mol/l, 10-8 mol/l, 10-7 mol/l, 10-6 mol/l ó 10-5 mol/l). Otro criterio alternativo o adicional consiste en considerar un TCR como provisto de «especificidad antigénica» hacia COL6A3, si los linfocitos T que expresan ese TCR segregan como mínimo dos veces más IFN-y que el nivel de fondo de IFN-y resultante del cultivo simultáneo de linfocitos no transducidos con células diana estimuladas con una baja concentración de antígenos COL6A3. Tal «especificidad» como la descrita se puede analizar, entre otros medios, con un ELISA.
En una forma de realización alternativa o adicional de la invención, el constructo reconocedor de antígenos es estable y capaz de unirse específica y/o selectivamente a un antígeno COL6A3; preferiblemente el antígeno COL6A3 es un epítopo proteico o un péptido provisto de una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID N.° 1, o una variante de la misma, consistiendo la variante en una deleción, adición, inserción o sustitución de aminoácido de como máximo tres, preferentemente dos y más preferentemente aún un máximo de una posición de aminoácido.
El término «selectividad» o «reconocimiento y unión selectivas» se entiende que designa la facultad de un constructo reconocedor de antígenos, como un TCR o un anticuerpo, para reconocer selectivamente o unirse preferentemente a un único epítopo específico y que preferentemente muestra una reactividad cruzada nula o ínfima con otro epítopo. Preferentemente «selectividad» o «reconocimiento y unión selectivas» significa que el constructo reconocedor de antígenos (p. ej. un TCR) reconoce selectivamente o se une preferentemente a un único epítopo específico y preferentemente muestra una reactividad cruzada nula o ínfima con otro epítopo, en que dicho epítopo es único de una proteína, de tal modo que el constructo reconocedor de antígenos presenta una reactividad cruzada nula o ínfima con otro epítopo y otra proteína.
El constructo reconocedor de antígenos acorde con la invención es un receptor de linfocito T (TCR), o un derivado o fragmento del mismo. Un derivado o fragmento de un TCR de la invención conserva la capacidad para reconocer o unirse al antígeno de la molécula madre, en particular su especificidad y/o selectividad como se han explicado antes.
En una forma de realización de la invención, los TCR genomodificados de la invención son capaces de reconocer antígenos COL6A3 que son presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. «Presentados por el MHC de clase I», tal y como se emplea en la presente memoria, significa que el TCR desencadena una respuesta inmunitaria tras su unión a los antígenos peptídicos COL6A3 que le son presentados por una molécula del MHC de clase I. La molécula MHC de clase I puede ser cualquier molécula MHC de clase I conocida en la técnica, p. ej., moléculas HLA-A. En una forma de realización preferida de la invención, la molécula MHC de clase I es una molécula del HLA-A2.
La invención proporciona tanto un constructo reconocedor de antígenos monocatenario como constructos reconocedores bicatenarios, así como otras variantes moleculares. La invención proporciona en concreto un TCR genomanipulado como constructo reconocedor de antígenos, o un fragmento o derivado del mismo. El TCR genomanipulado es preferentemente de origen humano, por lo cual se entiende como generado a partir de un locus de un TCR humano y que, por consiguiente, comprende secuencias de TCR humanas. Además, el TCR de la invención se caracteriza como un t Cr con afinidad madurada, que es capaz de reconocer de forma específica y selectiva el antígeno peptídico COL6A3.
Otra forma de realización de la invención proporciona de forma adicional o alternativa el constructo reconocedor de antígeno antes descrito, que estimula una respuesta inmunitaria, y preferentemente dicha respuesta inmunitaria se caracteriza por un incremento de los niveles de interferón gamma (IFN-y).
Los TCR de la invención se pueden proporcionar en forma de moléculas monocatenarias a o p, o y o 8, o alternativamente como constructos bicatenarios compuestos por una cadena a y otra p, o por una cadena y y otra 8.
Más preferentemente, en algunas formas de realización adicionales la invención dada a conocer se refiere a constructos reconocedores de antígeno que comprenden todas las regiones CDR1 a CDR3 de las cadenas de TCR genomanipuladas descritas en la presente memoria (véase la Tabla 1). Se pueden preferir constructos reconocedores de antígeno de la presente enseñanza que comprendan la secuencia natural o la secuencia genomodificada del CDR provista de tres, dos, y preferentemente un único residuo de aminoácido modificado. El residuo de aminoácido modificado de la presente enseñanza se puede seleccionar entre los siguientes supuestos: una inserción, una deleción o una sustitución de aminoácido. La enseñanza más preferida es que los tres, los dos, o preferentemente el único residuo de aminoácido modificado sea el primero o el último residuo de aminoácido de la secuencia de la CDR respectiva. Si la modificación consiste en una sustitución, entonces en la presente enseñanza es preferible que sea una sustitución de aminoácido conservadora.
Los TCR de la invención pueden comprender, además, una región constante derivada de cualquier especie adecuada, como es cualquier mamífero, p. ej., ser humano, rata, mono, conejo, asno o ratón. En una forma de realización de la invención, los TCR de la invención comprenden, además, una región constante humana. En ciertas formas de realización preferidas, la región constante del TCR de la invención puede ser levemente modificada, por ejemplo, con la introducción de secuencias heterólogas, preferentemente de secuencias de ratón, que pueden incrementar la estabilidad y la expresión del TCR. Además, se pueden introducir otras mutaciones estabilizadoras conocidas por los últimos avances en el campo (p. ej. DE 102016 123893.7) como reemplazos para los aminoácidos desfavorables en las regiones variables (V) y/o introducir un puente disulfuro entre los dominios constantes (C) del TCR y eliminar la cisteína desaparejada.
A efectos de la presente memoria, el término «murino» o «humano», cuando se refiere a un constructo reconocedor de antígeno, o a un TCR, o a cualquier componente de un TCR descrito en la presente memoria (p. ej., región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena a y/o cadena p), designa un TCR o un componente del mismo, que procede de un locus de TCR de ratón o de ser humano sin reorganizar.
En una forma de realización de la invención se proporcionan TCR quiméricos, cuyas cadenas de TCR comprenden secuencias procedentes de varias especies. Preferentemente, un TCR de la invención puede comprender una cadena a que comprende una región variable humana procedente de una cadena a y, por ejemplo, una región constate murina procedente de una cadena a de TCR murino.
En una forma de realización, el TCR de la invención es un TCR humano que comprende regiones variables humanas acordes con las susodichas formas de realización, así como regiones constantes humanas.
El TCR de la invención se puede proporcionar en forma de TCR monocatenario (TCRmc). Un TCRmc puede comprender un polipéptido procedente de una región variable de una primera cadena de TCR (p. ej., una cadena alfa) y un polipéptido procedente de una segunda cadena TCR entera (íntegra) (p. ej., una cadena beta), o viceversa. Asimismo, el TCRmc puede comprender opcionalmente uno o más conectores que unan los dos o más polipéptidos entre sí. El conector puede ser, por ejemplo, un péptido, que una entre sí dos cadenas sencillas, tal y como describe la presente memoria. También se puede proporcionar un TCRmc de la invención que esté fusionado con una citocina humana, como por ejemplo la IL-2, la IL-7 o la IL-15.
El constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención también se puede proporcionar con la forma de un complejo multimérico, que comprende como mínimo dos moléculas TCRmc, donde cada una de esas moléculas de TCRmc están fusionadas con al menos una biotina, y en que dichas TCRmc están interconectadas por la interacción entre la biotina y la estreptoavidina con el fin de formar dicho complejo multimérico. La creación de TCR multiméricos también es posible con otras estrategias similares que figuran incluidas en la presente memoria. Asimismo, se proporcionan complejos multiméricos de orden superior, que comprenden más de dos TCRmc de la invención.
A efectos de la presente invención, un TCR es una fracción provista de al menos un dominio variable de cadena alfa o beta del TCR y/o de cadena beta o delta del TCR. En general, comprenden tanto un dominio variable alfa de TCR como un dominio variable beta de TCR. Pueden ser heterodímeros ap o pueden tener un formato monocatenario. Para el uso en la terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap podría, por ejemplo, ser transfectado en forma de cadenas enteras provistas tanto de dominios citoplasmáticos como transmembrana. Si conviniese, podría incorporarse un puente disulfuro entre residuos de los respectivos dominios constantes.
En una forma de realización preferida, el constructo reconocedor de antígeno es un TCR humano, o un fragmento o derivado del mismo. Un TCR humano o un fragmento o derivado del mismo es un TCR que comprende más del 50% de la secuencia de TCR humana correspondiente. Preferentemente, solo una pequeña parte de la secuencia del TCR es de origen artificial o deriva de otras especies. Sin embargo, es sabido que los TCR quiméricos, p. ej. aquellos que siendo de origen humano incorporan secuencias murinas en los dominios constantes, resultan ventajosos. Así pues, se prefieren especialmente los TCR acordes con la presente invención que contengan secuencias murinas en la parte extracelular de sus dominios constantes.
También se prefiere que el constructo reconocedor de antígeno de la invención sea capaz de reconocer su antígeno peptídico a través del sistema de antígenos leucocíticos humanos (HLA), preferiblemente presentados a través del alelo HLA-A02. El término «presentado por (o a través de) el sistema HLA» en el contexto de la presente invención significa que el constructo reconocedor de antígeno se une al antígeno solo en el caso de que el péptido antigénico sea presentado por dicho HLA.
El constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención induce en una forma de realización preferida una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria que se caracteriza por el incremento de los niveles de interferón gamma (IFN-y).
El término «polipéptido» tal y como se emplea en la presente memoria incluye oligopéptidos y se refiere a una monocadena de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos. Con respecto a los polipéptidos de la invención, la fracción funcional puede ser cualquier fracción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR (o de una variante funcional del mismo), del cual forma parte, siempre que la fracción funcional se una específicamente a un antígeno COL6A3, preferentemente como las indicadas en la Tabla 1 de la presente memoria. El término «fracción funcional» cuando se usa en referencia a un TCR (o a una variante funcional del mismo) se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR de la invención (o de una variante funcional del mismo) que conserva la actividad biológica del TCR (o de una variante funcional del mismo) y que forma parte del mismo (del TCR original o de la variante funcional original del mismo). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR (o de una variante funcional del mismo) que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno COL6A3 (presentado por el HLA-A2), o de detectar, tratar o prevenir un cáncer, en un grado parecido, igual o superior al del TCR original (o al de una variante funcional del mismo).
La fracción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi-terminal de la fracción, o en ambos extremos, aminoácidos adicionales que no se hallan en la secuencia de aminoácidos propia del TCR original o de la variante funcional del mismo. Es conveniente que esos aminoácidos adicionales no interfieran con la función biológica de la fracción funcional, p. ej. su unión específica a antígenos COL6A3 y/o con la capacidad para detectar, tratar o prevenir el cáncer, etc. Aún más conveniente es que los aminoácidos adicionales potencien la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original o de la variante funcional del mismo.
Si bien no está cubierta por la invención reivindicada, la funcionalidad de unión del TCR de la invención se puede proporcionar incorporada en la estructura de un anticuerpo. El término «anticuerpo» en sus diversas formas gramaticales se usa en la presente memoria para referirse a moléculas de inmunoglobulina y a fracciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno o un paratopo. Tales moléculas también se denominan «fragmentos de unión con el antígeno» de las moléculas de inmunoglobulina. Además, en la presente memoria se da a conocer, aunque no esté cubierto por la invención reivindicada, un anticuerpo, o una fracción de unión con el antígeno del mismo, que se une específicamente a los antígenos descritos en la presente memoria. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que sea conocida en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. Y además puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo natural, p. ej. un anticuerpo aislado y/o purificado de un mamífero, como, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo genéticamente modificado, como por ejemplo un anticuerpo humanizado o uno quimérico. El anticuerpo puede aparecer en forma monomérica o polimérica.
La enseñanza indicada antes concierne a fracciones de unión al antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria. La fracción de unión al antígeno puede ser cualquier fracción que posea como mínimo un sitio de unión con el antígeno, tales como Fab, F(ab')2, dsFv, scFv, diacuerpos y triacuerpos. El fragmento de anticuerpo que es un fragmento monocatenario de región variable (scFv) consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo enlazado con un dominio V de una cadena ligera de anticuerpo a través de un péptido sintético, que puede ser creado con técnicas de ADN recombinante ordinarias. De forma similar, es posible preparar fragmentos de región variable estabilizados con puentes disulfuro (dsFv) mediante técnicas de a Dn recombinante que sirvan como fragmentos de anticuerpo de la invención; no obstante, los tipos de fragmentos de anticuerpo no se limitan a los citados, que se muestran a título de ejemplo. Asimismo, el anticuerpo, o la fracción de unión al antígeno del mismo, puede ser modificado para que contenga un marcador detectable, como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (p. ej. isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante), y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).
Los métodos adecuados para fabricar anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos ordinarios para la fabricación con hibridomas aparecen descritos en Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), en Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y en C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (201 1)), entre otras referencias. Existen además otros métodos alternativos, como los basados en la transformación de hibridomas con el EBV (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)), y los sistemas de expresión mediante vectores bacteriófagos (véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) que son conocidos en la técnica. Además, se describen métodos para producir anticuerpos en animales en las patentes de EE.UU. 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352, así como en la publicación de solicitud de patente en EE.UU. N.° 2002/0197266, entre otras referencias.
Ciertas formas de realización de la invención también conciernen a TCR, o a fragmentos funcionales y polipéptidos de los mismos, que son TCR solubles. Tal y como se define en la presente memoria, el término «receptor de linfocito T soluble» se refiere a variantes truncadas heterodiméricas o monocatenarias de TCR nativos, las cuales comprenden al menos los dominios variables de la cadena a y de la cadena p del TCR enlazados por un conector polipeptídico (SEQ ID N.° 22, 24, 25 y 27). Las variantes solubles de los TCR normalmente carecen como mínimo de los dominios transmembrana y citosólico de la proteína nativa; a veces es preferible que tales constructos solubles no contengan ninguna secuencia de dominio constante. Los constructos a base de receptores solubles de linfocito T de la invención comprenden, en formas de realización preferidas, constructos consistentes en secuencias del dominio variable de la cadena a y p como las dadas a conocer en la presente memoria, unidas por una secuencia conectora adecuada. La secuencia del dominio variable (aminoácidos o ácidos nucleicos) de las cadenas a y p del TCR soluble pueden ser idénticas a las secuencias correspondientes de un TCR nativo o pueden comprender secuencias de las cadenas a y p del TCR soluble que sean variantes con respecto a las secuencias correspondientes del TCR nativo. A efectos de la presente memoria, el término «receptor de linfocito T soluble» abarca los TCR solubles provistos de secuencias variantes y no variantes del dominio variable de las cadenas a y p del TCR soluble. Las variaciones pueden radicar en las regiones estructurales de las secuencias del dominio variable de las cadenas a y p del TCR soluble y pueden incluir, sin ánimo de limitación, mutaciones por deleción, inserción o sustitución de aminoácidos, así como cambios en la secuencia de ácidos nucleicos que no alteren la secuencia de aminoácidos. El TCR soluble de la invención conservará en cualquier caso la funcionalidad de unión de las moléculas TCR originales de las cuales deriven.
El susodicho problema se resuelve además mediante un ácido nucleico que codifique un constructo reconocedor de antígeno de la invención, o cualquiera de los susodichos constructos proteicos o polipeptídicos. El ácido nucleico tendrá preferentemente: (a) una hebra que codifique un constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención; (b) una hebra complementaria de la hebra (a); o (c) una hebra que hibride en condiciones rigurosas (astringentes) con una molécula descrita en (a) o (b). Las condiciones rigurosas son conocidas por las personas versadas en la materia, concretamente se pueden consultar en Sambrook et al, «Molecular Cloning». Además de lo anterior, el ácido nucleico puede contener opcionalmente otras secuencias que sean necesarias para expresar la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente a la proteína, específicamente para su expresión en una célula de mamífero o humana. El ácido nucleico usado puede estar contenido en un vector adecuado que permita la expresión en una célula de la secuencia de ácido nucleico correspondiente al polipéptido. No obstante, los ácidos nucleicos también se pueden usar para transformar una célula presentadora de antígeno, que podría no ser una célula presentadora de antígeno clásica, como son las células dendríticas, de tal modo que ella misma produjera las proteínas correspondientes en su superficie celular.
A efectos de la presente memoria, «ácido nucleico» incluye «polinucleótido», «oligonucleótido» y «molécula de ácido nucleico», y en general designa un polímero de ADN o de ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, que puede contener un enlace entre nucleótidos naturales, no naturales o alterados, como un enlace fosforamidato o fosforotioato, en lugar del enlace fosfodiéster que se halla entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado.
Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. A efectos de la presente memoria, el término «recombinante» se refiere a: (I) moléculas que son construidas fuera de células vivas mediante la unión de segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos con moléculas de ácidos nucleicos que se pueden replicar en una célula viva; o (II) moléculas que son el resultado de la replicación de las descritas en el precedente punto (I). A efectos de la presente memoria, la replicación puede ser una replicación en condiciones in vitro o en condiciones in vivo. El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, o fracciones funcionales o variantes funcionales de los mismos que se describen en la presente memoria.
Además, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico acorde con la invención tal y como se ha descrito antes. Es conveniente que el vector sea un vector de expresión o un vector de expresión recombinante. En el contexto de la presente invención, el término «vector de expresión recombinante» se refiere a un constructo de ácido nucleico que posibilita la expresión de un ARNm, una proteína o un polipéptido en el seno de una célula hospedadora adecuada. El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante, y se puede usar para transformar o transfectar cualquier hospedador adecuado. Los vectores aptos incluyen los diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o bien para ambas, tales como plásmidos y virus. Ejemplos de vectores de expresión animales son pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo. Preferentemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral. El vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicas para cada tipo de célula hospedadora (bacteria, hongo, planta o animal, entre otras), en la cual se va a introducir el vector con el propósito de que tenga lugar la expresión del ácido nucleico de la invención. Asimismo, el vector de la invención puede incluir uno o varios genes marcadores, que permitan la selección de las células hospedadoras transformadas o transfectadas. El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor normativo o nativo enlazado funcionalmente con la secuencia de nucleótidos que codifica los constructos de la invención, o con la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica los constructos de la invención. Los promotores susceptibles de selección incluyen, entre otros tipos, promotores específicos del desarrollo o de tejido, inducibles, débiles o potentes. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden ser diseñados para generar una expresión transitoria o una expresión estable, o ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden diseñar para generar una expresión constitutiva o bien inducible.
La invención también atañe a una célula hospedadora que comprende un constructo reconocedor de antígeno acorde con la invención. En concreto, la célula hospedadora de la invención comprende un ácido nucleico, o un vector como el descrito antes en la presente memoria. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, vegetal, animal, fúngica o algal, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacteriana o protozoaria. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, como por ejemplo un ser humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherida o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. A los efectos de producir un TCR, un polipéptido o una proteína que sean recombinantes, es preferible que la célula hospedadora sea una célula de mamífero, p. ej. una célula de ovario de hámster chino (CHO). Más preferentemente aún, es conveniente que la célula hospedadora sea una célula humana. Si bien la célula hospedadora puede ser una célula de cualquier tipo, procedente de cualquier tipo de tejido y perteneciente a cualquier estadio del desarrollo, es preferible que sea un leucocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononucleada de sangre periférica (PBMC). Más preferentemente aún es que la célula hospedadora sea un linfocito T. El linfocito T puede ser cualquier linfocito T, como un linfocito T cultivado, p. ej. un linfocito T primario, o un linfocito T procedente de una estirpe cultivada de linfocitos T, como p. ej. Jurkat, SupT1, etc., o bien un linfocito T obtenido de un mamífero, preferentemente un linfocito T o un precursor de linfocito T extraído a un paciente humano. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T puede proceder de numerosas fuentes, tales como sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos o líquidos corporales, entre otras. Los linfocitos T también se pueden enriquecer o purificar. Preferentemente, el linfocito T es un linfocito T humano. Más preferentemente aún, el linfocito T es un linfocito T aislado de un humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede pertenecer a cualquier estadio del desarrollo, incluidos entre otros, un linfocito T CD4-positivo y/o CD8-positivo, linfocitos T cooperadores CD4-positivos, como p. ej. linfocitos Th1 y Th2, linfocitos T CD8-positibos (p. ej. linfocitos T citotóxicos), células infiltradas en tumores (TIL), linfocitos T de memoria, linfocitos T vírgenes, y similares. Preferentemente, el linfocito T es un linfocito T CD8-positivo o un linfocito T CD4-positivo.
Preferentemente, la célula hospedadora de la invención es un linfocito, preferiblemente un linfocito T, como un linfocito T CD4-positivo o un linfocito T CD8-positivo. Aún más preferente, la célula hospedadora es un linfocito T oncorreactivo que actúa específicamente contra las células tumorales que expresan COL6A3.
Otro aspecto más de la presente invención se refiere a los constructos reconocedores de antígeno, los ácidos nucleicos, los vectores, las composiciones farmacéuticas y/o la célula hospedadora que se exponen en la presente memoria destinados al uso en medicina. En una forma de realización preferida, el uso en medicina incluye el uso para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad tumoral, como una enfermedad tumoral benigna o maligna. La enfermedad tumoral se caracteriza por la expresión del COL6A3, en una célula cancerosa o tumoral de dicha enfermedad.
Con respecto a las susodichas aplicaciones médicas de los constructos reconocedores de antígeno y los otros materiales derivados de los mismos, el cáncer susceptible de diagnóstico y/o tratamiento puede ser cualquier cáncer, incluido cualquiera de los siguientes: cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer óseo, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer del ano, del canal anal o anorrectal, cáncer ocular, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de la nariz, la cavidad nasal o del oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de rinofaringe, linfoma no hodgkiniano, cáncer bucofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de partes blandas, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Tipos de cáncer preferidos son el cáncer de cuello uterino, bucofaríngeo, ano, canal anal, anorrectal, vagina, vulva o pene. Un cáncer especialmente preferido es el cáncer positivo para COL6A3, incluido el cáncer gástrico y gastrointestinal.
Los constructos, los TCR y los ácidos nucleicos de la invención están destinados en particular para el uso en inmunoterapia, preferentemente en la terapia adoptiva de linfocitos T. La administración de los compuestos de la invención puede, por ejemplo, implicar la infusión de los linfocitos T de la invención en el paciente en cuestión. Preferiblemente, tales linfocitos T son linfocitos T autólogos del paciente que en condiciones in vitro se transducen con un ácido nucleico o con un constructo reconocedor de antígeno de la presente invención.
WO 2016/011210 da a conocer células genomodificadas para la terapia de adopción, incluidas células citocidas naturales (NK) y linfocitos T, así como composiciones que contienen las células y métodos para su administración a individuos. Las células pueden contener receptores de antígenos genomodificados que se unen específicamente a los antígenos, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR) y los receptores coestimuladores.
El objetivo de la invención también se resuelve con un método de fabricación de una estirpe celular que expresa el constructo reconocedor de antígeno específico del COL6A3, el cual comprende:
a. Proporcionar una célula hospedadora adecuada
b. Proporcionar un constructo genético que comprenda una secuencia codificante que codifique un constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
c. Introducir en la citada célula hospedadora adecuada el citado constructo genético, y
d. La expresión del citado constructo genético por la citada célula hospedadora adecuada.
El método puede comprender, además, un paso de presentación del citado constructo reconocedor de antígeno en la superficie de la citada célula hospedadora adecuada.
En otras formas de realización preferidas, el constructo genético es un constructo de expresión que comprende una secuencia promotora enlazada funcionalmente con dicha secuencia codificante.
Preferentemente, dicho constructo reconocedor de antígeno procede de un mamífero, y preferiblemente es de origen humano. La célula hospedadora adecuada que se prefiere para el uso en el método de la invención es una célula de mamífero, como una célula humana, en particular un linfocito T humano. Los linfocitos T para el uso en la invención ya han sido descritos pormenorizadamente en la presente memoria.
La invención también abarca formas de realización en las que dicho constructo reconocedor antígeno es un TCR modificado, y en la que dicha modificación consiste en la adición de dominios funcionales, como un marcador o un principio activo terapéutico. Asimismo, abarca TCR provistos de dominios alternativos, como un dominio de anclaje a membrana alternativo en lugar de la región transmembrana endógena.
Es conveniente que el sistema de transfección destinado a introducir el constructo genético en la citada célula hospedadora adecuada sea un sistema basado en un vector retroviral. Tales sistemas son bien conocidos por las personas versadas en la materia.
En una de sus formas de realización, la presente invención también comprende una etapa adicional del método que consiste en el aislamiento y la purificación del constructo reconocedor de antígeno a partir de la célula y, opcionalmente, en la reconstitución de los fragmentos traducidos de dicho constructo en un linfocito T.
En un aspecto alternativo de la invención, se provee un linfocito T obtenido o que puede ser obtenido mediante un método para la producción de un receptor de linfocito T (TCR), que es específico para células tumorales y que presenta una avidez elevada, tal y como se ha descrito antes en la presente memoria. Tal linfocito T depende de la célula hospedadora usada en el método de la invención, por ejemplo, un linfocito T humano o no humano, pero preferentemente un TCR humano.
Los TCR (incluidas sus variantes funcionales), los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes y las células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) que forman parte de la presente invención se pueden aislar y/o purificar. A efectos de la presente memoria, el término «aislado» significa que ha sido sacado de su entorno natural. Tal y como se emplea en la presente memoria, el término «purificado» significa que ha ganado en pureza, entendida la «pureza» como un término relativo y no necesariamente interpretable como una pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser como mínimo de en torno al 50% o puede ser superior al 60%, 70%o, 80%, 90% o 95%, o bien ser del 100%.
Los constructos reconocedores de antígeno, los TCR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes y las células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) que forman parte de la presente invención serán designados todos ellos de manera colectiva como «materiales del TCR de la invención» de aquí en adelante y podrán ser formulados en una composición, como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los constructos reconocedores de antígeno, los TCR, fracciones funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión y células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) descritos en la presente memoria, así como un vehículo, excipiente y/o estabilizante aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualesquiera de los materiales de TCR de la invención pueden comprender más de un material de TCR de la invención, como, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR distintos (incluidas las fracciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos). Alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR de la invención en combinación con otros medicamentos o principios activos farmacéuticos, como quimioterápicos, p. ej. asparraginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. Preferentemente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el vehículo puede ser cualquiera de los usados habitualmente para el material de TCR de la presente invención en consideración. Tales vehículos farmacéuticos son bien conocidos por las personas versadas en la materia y están públicamente disponibles. Es preferible que el vehículo farmacéutico no cause efectos secundarios perjudiciales ni toxicidad si se emplea siguiendo las condiciones de uso pertinentes.
Así pues, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los productos de la invención y de materiales de TCR de la invención que se describen en la presente memoria, en concreto cualesquiera proteínas, ácidos nucleicos o células hospedadoras. En una forma de realización preferida la composición farmacéutica está destinada a servir como inmunoterapia, preferentemente la terapia adoptiva con células.
Preferentemente, el material de TCR se administra mediante inyección, por ejemplo, intravenosa. Cuando el material de TCR de la invención sea una célula hospedadora que exprese el TCR de la invención (o una variante funcional del mismo), el vehículo farmacéutico para las células que se administrarán mediante inyección puede incluir cualquier vehículo isotónico como, por ejemplo, solución salina normal (aprox. 0,90% p/v de NaCl en agua, aprox. 300 mOsm/l de NaCl en agua, o aprox. 9,0 g de NaCl por litro de agua), solución de electrólitos NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL, EE.UU.), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL, EE.UU.), o una solución de dextrosa de aprox. el 5% en agua, o solución de lactato sódico compuesta (Ringer). En una forma de realización, el vehículo farmacéutico se complementa con albúmina de suero humana.
A efectos de la invención, la cantidad o la dosis del material de TCR de la invención (p. ej. el número de células cuando el material de TCR de la invención sea una o más células) que se ha de administrar debe ser la suficiente para influir, p. ej. para generar una respuesta preventiva o terapéutica, en el sujeto o en el animal durante un plazo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR de la invención debe bastar para unirse a un antígeno tumoral, o para detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período comprendido aproximadamente entre las 2 horas o más, p. ej. 12 o 24 horas o más, desde el momento de la administración. En ciertas formas de realización, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis vendrá determinada por la eficacia del material de TCR de la invención en particular y del estado del animal o de la persona que va a ser tratada, así como de su peso corporal.
Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención, los TCR (incluidas las variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras o poblaciones de células se puedan usar en métodos para tratar o prevenir el cáncer, o los estados precancerosos positivos para el COL6A3. Se cree que los TCR de la invención (y las variantes funcionales de los mismos) se unen específicamente al antígeno COL6A3, de tal modo que cuando el TCR (o el polipéptido o la proteína de la invención relacionados y las variantes funcionales de los mismos) se expresa en una célula, es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expresa los antígenos COL6A3 de la invención. A este respecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad, en particular el cáncer, en un mamífero, el cual comprende la administración al mamífero de cualquiera de las composiciones farmacéuticas, constructos reconocedores de antígeno, en particular los TCR (y las variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique alguno de los TCR (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, o cualquier célula o población de células que comprenda un vector recombinante, que codifique cualquiera de los constructos de la invención (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad en el mamífero, siendo dicha enfermedad un cáncer, preferentemente un cáncer positivo para el COL6A3.
Algunos ejemplos de vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico o de diluyentes útiles para la presente invención son estabilizantes como SPGA, carbohidratos (sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa o dextrano, entre otros), proteínas como albúmina o caseína, agentes portadores de proteínas como suero bovino o leche descremada y tampones (tampón fosfato, por ejemplo).
A efectos de la presente memoria, los términos «tratar» y «prevenir» así como las palabras derivadas de los mismos, no implican necesariamente el tratamiento o la prevención al 100% o en términos absolutos. Más bien existen diversos grados de tratamiento o de prevención de los que cualquier persona versada en la materia reconocerá como dotados de un posible efecto terapéutico o benéfico. A este respecto, los métodos descritos en la presente memoria pueden proporcionar cualquier grado de tratamiento o de prevención de una enfermedad en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método descrito en la presente memoria pueden incluir el tratamiento o la prevención de una o más enfermedades o síntomas de la enfermedad, p. ej. el cáncer, que está siendo tratada o prevenida. Por ejemplo, el tratamiento o la prevención pueden incluir la promoción de la regresión de un tumor. Asimismo, a los efectos de la presente memoria, «prevención» puede abarcar el retraso en la aparición de la enfermedad, o de un síntoma o trastorno de la misma.
Se da a conocer, sin que quede cubierto por la invención reivindicada, un método para tratar el cáncer que comprende la administración de un t Cr , un ácido nucleico o una célula hospedadora de la presente descripción en combinación con al menos un agente quimioterápico y/o radioterapia.
También se proporciona un método para el tratamiento del cáncer in vitro contra un precáncer positivo para COL6A3, cáncer que es seleccionado entre un cáncer que sobreexpresa el COL6A3, que lo tiene mutado y/o presenta un antígeno asociado a tumor derivado del COL6A3, comprendiendo tal método:
a) transformación de una célula obtenida de un sujeto que necesita un tratamiento contra el cáncer con al menos un vector que codifique un constructo reconocedor de antígeno de la presente invención para producir una célula transformada;
c) expansión de la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas;
También se da a conocer, sin que quede cubierto por la invención reivindicada, un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, el cual comprende:
a) aislamiento de una célula procedente de un donante sano;
b) transformación de la célula con un vector que codifique un constructo reconocedor de antígeno de la presente invención para producir una célula transformada;
c) expansión de la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas; y
d) administración de la pluralidad de células transformadas a dicho sujeto.
También se proporciona un método in vitro para detectar el cáncer en una muestra biológica, el cual comprende:
a) puesta en contacto de la muestra biológica con un constructo reconocedor de antígeno de la presente descripción;
b) detección de la unión del constructo reconocedor de antígeno a la muestra biológica; en que dicho cáncer es seleccionado entre un cáncer que sobreexpresa el COL6A3, que lo tiene mutado y/o presenta un antígeno asociado a tumor derivado del COL6A3.
En ciertas formas de realización, el método para la detección del cáncer se lleva a cabo en condiciones in vitro, in vivo o in situ.
Asimismo, se da a conocer, sin que quede cubierto por la invención reivindicada, un método para detectar la presencia de una enfermedad en un mamífero. El método comprende: (I) La puesta en contacto de una muestra que comprenda una o más células del mamífero con cualquiera de los TCR (y variantes funcionales de los mismo), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos que forman parte de la invención, o bien de las composiciones farmacéuticas descritas aquí, de tal modo que formen un complejo; y (II), la detección de este complejo, siendo su detección indicadora de la presencia de la enfermedad en el mamífero, enfermedad que sería cáncer, y más en concreto una neoplasia maligna positiva para el COL6A3.
Con respecto al método para detectar una enfermedad en un mamífero, la muestra de células puede ser una muestra que contenga células enteras, lisados de las mismas, o una fracción de las células enteras o de los lisados, como p. ej. una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción consistente en proteínas enteras, o una fracción consistente en ácidos nucleicos.
A efectos del método de detección de la invención, el contacto es en condiciones in vitro.
Asimismo, la detección del complejo puede darse a través diversos modos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los constructos reconocedores de antígeno (y las variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células o TCR, o fracciones de unión al antígeno de los mismos que forman parte de la invención y que se describen en la presente memoria, pueden ser marcados con un marcaje detectable como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (isotiocianato de fluoresceína (FOTC), ficoeritrina (PE), etc.), una enzima (fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, etc.), y partículas elementales (partículas de oro, etc.).
A efectos de los métodos de la invención, en los que se administren células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser alogénicas o autólogas del mamífero en cuestión. Preferentemente, las células serán autólogas del mamífero.
Con respecto a las susodichas aplicaciones médicas del material de TCR de la invención, el cáncer susceptible de diagnóstico y/o de tratamiento puede ser cualquier cáncer, incluido cualquiera de los siguientes: cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer óseo, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer del ano, del canal anal o anorrectal, cáncer ocular, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de la nariz, la cavidad nasal o el oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer rinofaríngeo, linfoma no hodgkiniano, cáncer bucofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de partes blandas, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Tipos de cáncer preferidos son el cáncer de cuello uterino, bucofaríngeo, ano, canal anal, anorrectal, vagina, vulva o pene. Un tipo de cáncer especialmente preferido es el cáncer positivo para COL6A3, como el cáncer gástrico o gastrointestinal.
En general, la invención proporciona un método para tratar a un sujeto aquejado de un tumor o enfermedad tumoral que comprende la administración de los constructos reconocedores de antígeno, ácidos nucleicos, vectores, composiciones farmacéuticas y/o célula hospedadora que la presente invención da a conocer. Preferentemente el sujeto es un sujeto que precisa un tratamiento de esa naturaleza. En las formas de realización preferida el sujeto es un mamífero, preferentemente un paciente humano, que está aquejado por un tumor o enfermedad tumoral, que es positiva para COL6A3.
A continuación, se pasará a describir con más detalle la presente invención mediante una serie de ejemplos en los que se aludirá a figuras y secuencias adjuntas que describen las formas de realización preferidas de los mismos, sin que con ello se pretenda limitar el alcance de la invención. En las figuras y secuencias:
La Figura 1 muestra la conversión de un TCR en un TCR monocatenario Va/Vp estabilizado (scTv) mediante su expresión en la superficie de células de levadura. Las moléculas ScTv expresadas en la superficie de Saccharomyces cerevisiae EBY100 transformadas se tiñeron con anticuerpos anti-Vbetal marcados con FITC y tetrámeros HLA-A*02/COL6A3-002 marcados con ficoeritrina (PE). El scTv R4P3F9 no modificado (cuadro izquierdo, SEQ ID N.° 22) se compara con un clon scTv portador de mutaciones puntuales únicas destinadas a estabilizar la estructura del scTv (cuadro derecho), que se seleccionó de una colección de scTv obtenida mediante mutagénesis aleatoria.
La Figura 2 muestra la maduración de la afinidad del scTv a través de la expresión en la superficie de levaduras. Moléculas de scTv estabilizadas con y sin la CDR1 beta de afinidad madurada se tiñeron con tetrámeros HLA-A*02 que contenían el COL6A3-002 (SEQ ID N.° 1) y se contratiñeron con una mezcla de tetrámeros HLA-A*02 provistos de 9 péptidos (SEQ ID N.° 28 a 36) con una elevada similitud de secuencia con el COL6A3-002. Los scTv estabilizados (SEQ iD N.° 27) provistos de una secuencia de la CDR1 de la cadena beta no madurada RSGDLS (SEQ ID N.° 13) se comparan con clones scTv provistos de las secuencias de la CDR1 de la cadena beta de afinidad madurada AMDHPY (SEQ ID N.° 40) y ARWHRN (SEQ ID N.° 39).
La Figura 3 muestra los perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de las variantes de fusión anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S 75-1 a 75-25.
La Figura 4 muestra la cinética de unión a HLA-A*02/COL6A3-002 de las variantes de fusión anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S 75-1 a 75-25 medida con interferometría de biocapa. Se indican las concentraciones de HLA-A*02/COL6A3-002 utilizadas en los análisis.
La Figura 5 muestra el análisis de unión de las variantes de fusión anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S 75-1 a 75-25 medido con la interferometría de biocapa (BLI). La concentración utilizada en los análisis consistió en 1 pM de HLA-A*02 formando complejos con los péptidos similares indicados.
La Figura 6 expone una comparación de la cinética de unión de diferentes variantes de fusión anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S a HLA-A*02/COL6A3-002 y a HLA-A*02/COL6A1-001 (SEQ ID N.° 30). Se indican las concentraciones analizadas de moléculas Fab-scTv.
La Figura 7 muestra la tinción con tetrámeros HLA-A*02/COL6A3-002 marcados con PE de la variante madurada de TCR R4P3F9 expresada en linfocitos T CD8+ humanos. A modo de control, se usaron linfocitos sin TCR (ficticio) o portadores del t Cr 1G4 específico para NYESO1-001 y la tinción con tetrámeros HLA-A*02/NYESO1-001 marcados con PE.
La Figura 8 muestra la secreción de IFN-gamma por parte de linfocitos T CD8+ que expresaban la variante madurada de TCR R4P3F9 como respuesta al COL6A3-002.A modo de control, se usaron linfocitos sin TCR (ficticio) o portadores del TCR 1G4 específico para NYESO1-001. La secreción de IFN-gamma se determinó mediante ELISA tras el cultivo conjunto de linfocitos T CD8+ sometidos a electroporación con células T2 cargadas con una dilución en serie del COL6A3-002.
La Figura 9 muestra la secreción de IFN-gamma por parte de linfocitos T CD8+ que expresaban la variante madurada de TCR R4P3F9 como respuesta al COL6A3-002 y a diferentes péptidos similares a este. A modo de control, se usaron linfocitos sin TCR (ficticio) o portadores del TCR 1G4 específico para NYESO1-001. La secreción de IFN-gamma se determinó mediante ELISA tras el cultivo conjunto de linfocitos T CD8+ sometidos a electroporación con células T2 cargadas con 10 pM del COL6A3-002 o de péptidos similares a este.
La Figura 10 muestra la tinción con tetrámeros de péptido-HLA- A*02 marcados con PE de la variante madurada de TCR R4P3F9 expresada en linfocitos T CD8+ humanos. A modo de control, se usaron linfocitos sin TCR (ficticio) o portadores del t Cr 1G4 específico para NYESO1-001 y la tinción con tetrámeros HLA-A*02/NYESO1-001 marcados con PE.
La Figura 11 muestra la secreción de IFN-gamma por parte de linfocitos T CD8+ humanos que expresaban la variante madurada de TCR R4P3F9 como respuesta al COL6A3-002 o al COL6A1-001. A modo de control, se usaron linfocitos sin TCR (ficticio) o portadores del TCR 1G4 específico para NYESO1-001. La secreción de IFN-gamma se determinó mediante ELISA tras el cultivo conjunto de linfocitos T CD8+ sometidos a electroporación con células T2 cargadas con una dilución en serie del COL6A3-002 o del COL6A1-001.
La Figura 12 muestra la secreción de IFN-gamma por parte de linfocitos T CD8+ humanos primarios que expresaban variantes del TCR R4P3F9 a raíz de su cultivo conjunto con diferentes estirpes de células tumorales. SF539, SW982 y Hs840. Los linfocitos T presentan diferentes niveles del péptido diana. Las células MCF-7 no presentan el péptido diana. Como controles se analizaron células efectoras carentes de TCR exógenos junto con células portadoras de los TCR de interés. La secreción de interferón gamma se determinó mediante ELISA. El asterisco (*) marca un punto de datos que está fuera de la escala.
Tabla 1: Secuencias peptídicas de la invención (posiciones de acuerdo con la numeración IMGT:
(Frangois Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Protein displays: TRAV humana (Homo sapiens); Repertorio IMGT. IMGT®, the international ImMunoGenetics information system® http://www.imgt.org.; Creado: 16/03/2011. Versión: 03/06/2016; Frangois Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Protein displays: TRBV humana (Homo sapiens); Repertorio IMGT. IMGT®, the international ImMunoGenetics information system® http://www.imgt.org.; Creado: 16/03/2011. Versión: 03/06/2016.)
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EJEMPLOS
Los receptores de linfocito T (TCR) nativos que reconocen antígenos tumorales suelen presentar una afinidad menor que los TCR que reconocen antígenos víricos, lo cual podría explicar el fenómeno de elusión inmunitaria de los tumores (Aleksic et al. 2012). Por consiguiente, es conveniente disponer de variantes de los TCR con gran afinidad destinadas al uso como constructos reconocedores de antígeno en terapias con células adoptivas, o como módulo de reconocimiento en estrategias basadas en TCR solubles, es decir, usando moléculas biespecíficas (Hickman et al.
2016). Esta invención se refiere, pues, a la modificación y la optimización del receptor de linfocito T natural R4P3F9 (SEQ ID N.° 2 y 10) que reconoce específicamente el péptido asociado a tumor COL6A3-002 (SEQ ID N.° 1) con una afinidad de 60 pM aproximadamente (DE102016115246).
Ejemplo 1: Generación de scTv estables
En la presente invención, el TCR R4P3F9 previamente investigado (SEQ ID N.° 2 y 10) se convirtió en un constructo de TCR monocatenario (scTv, SEQ ID N.° 22) para su maduración a través de la exposición en la superficie de levaduras mediante la combinación de sendos dominios variables alfa (SEQ ID N.° 4) y beta (SEQ ID N.° 12) provistos con apéndices de los respectivos dominios constantes (SEQ ID N.° 9 y 17) y una secuencia conectora de glicinaserina. El ADN de la secuencia correspondiente se sintetizó y se transformó en Saccharomyces cerevisiae EBY100 (MATa AGA1::GAL1AGA1::URA3 ura352 trp l leu2delta200 his3delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R canl GAL) (ATCC® MYA 4941™) junto con un vector para la expresión en levadura portador de una secuencia líder y de la proteína de adhesión de levadura Aga2p (Se Q ID N.° 20), basado en el plásmido pCT302 (Boder et al. 2000). La proteína de fusión resultante de la recombinación homóloga en la levadura (SEQ ID N.° 19) contiene un péptido señal en el extremo N-terminal de la proteína Aga2p, encargado de que la proteína de interés se exprese en la superficie celular (Boder et al. 1997), así como epítopos peptídicos cortos que incluyen secuencias conectoras (SEQ ID N.° 21 y 23) para los controles de la expresión y la proteína de interés, es decir, del scTv R4P3F9 (SEQ ID N.° 22) o de sus variantes. La transformación se llevó a cabo del modo descrito en DE102016121899, y dio como resultado hasta 109 clones de levadura por colección. Las colecciones se generaron mediante PCR con mutagénesis aleatoria que abarcó la secuencia génica entera del scTv R4P3F9.
El proceso de selección de los clones de levadura portadores del scTv que mejor se expresaba y que se unía selectivamente al COL6A3-002 en el contexto del HLA-A*02 se efectuó siguiendo básicamente las indicaciones descritas por Smith et al. 2015. Con objeto de confirmar la variante del scTv R4P3F9 provista de la conformación correcta y de expresión profusa, expuesto en la superficie de las levaduras, se usó un anticuerpo anti-Vbeta1 (Beckman Coulter, clon b L37.2), junto con tetrámeros HLA-A*02/COL6A3-002 (Figura 1). La conversión del scTv por exposición en la superficie de levaduras reveló dos mutaciones estabilizadoras cruciales en la región estructural junto con las secuencias originales de la CDR para que el scTv se presentara adecuadamente en la superficie celular, en concreto la bQ43K (SEQ ID N.° 24) y la bL72S (SEQ ID N.° 25), ambas localizadas en la cadena beta. Asimismo, durante la maduración de la estabilidad la posición 29 de la CDR1 de la cadena alfa (SEQ ID N.° 5) pasó de ser ocupada por una glicina a serlo por una arginina (CDRa1 mutante 1, SEQ ID N.° 26), lo que comportó una mejor unión de los tetrámeros.
Ejemplo 2: Maduración de la afinidad de los scTv estabilizados
A fin de crear moléculas scTv dotadas de mayor afinidad de unión hacia HLA-A*02/COL6A3-002, se degeneró la CDRb1 (SEQ ID N.° 13) usando el armazón del scTv R4P3F9S estabilizado que se había descubierto antes (SEQ ID N.° 27) y que expresaba las mutaciones estabilizadoras aG29R, bQ43K y bL72S. Los residuos de la CDRb1 fueron objeto de mutaciones al azar por medio de oligocebadores de ADN degenerado siguiendo básicamente el método descrito por Smith et al. 2015. La genoteca de ADN resultante se transformó tal y como se describe en el ejemplo 1. Para conservar la selectividad de unión del scTv, se recurrió a la selección negativa con tetrámeros HLA-A*02 portadores de péptidos derivados de tejidos normales (SEQ ID N.° 28 a 36), cuya secuencia muestra una gran similitud con el péptido c Ol6A3-002.
Para la selección de las variantes del scTv R4P3F9S que eran selectivas y cuya afinidad había mejorado se usaron concentraciones decrecientes de tetrámeros HLA-A*02/COL6A3-002 en cada tanda de selección. Al cabo de tres tandas se aislaron y secuenciaron los clones scTv aislados, con lo que se obtuvo una gama de secuencias de la CDRb1 de afinidad madurada (SEQ ID N.° 37 a 49). En el caso de los scTv portadores de secuencias maduradas de la CDRb1 se confirmó una mejora acusada de la unión al COL6A3-002, al tiempo que se mantenía la selectividad de unión a dicho péptido, pues no se observó que 9 péptidos similares se unieran al receptor (Figura 2).
Ejemplo 3: Producción de proteínas de fusión biespecíficas constituidas por el scTv unido a un anticuerpo
Los scTv estabilizados y de afinidad madurada específicos de HLA-A*02/COL6A3-002 se pueden expresar fusionándolos con un anticuerpo dirigido contra CD3 que permite tanto redirigirlos específicamente contra tumores como la activación de los linfocitos T, independientemente de su especificidad natural. Los inventores generaron proteínas de fusión biespecíficas formadas por un anticuerpo ligado a un TCR que comprendían una cadena pesada de Fab anti-CD3 (UCHT1) (SEQ ID N.° 51) fusionada con variantes del scTv R4P3F9S (SEQ ID N.° 50, 64, 65 y 66) y una cadena ligera de Fab anti-CD3 (UCHT1) (SEQ ID N.° 52). Las proteínas de fusión Fab-scTv resultantes tienen una masa molecular aproximada de 75 kDa. Con las distintas secuencias CDR1 de la cadena alfa (SEQ ID N.° 5 y 26) y la cadena beta (SEQ ID N.° 13 y 37 a 49) del scTv R4P3F9S se expresaron diversas variantes de fusión Fab-scTv (75-1 a 75-25, Tabla 2) en células ExpiCHO transfectadas de forma transitoria por el fabricante. Las proteínas se purificaron con cromatografía de exclusión por tamaño y con proteína L. Todas las variantes de fusión se sintetizaron con rendimientos comprendidos entre 80 pg y 1 mg (Tabla 2) y, a la vista de los análisis de cromatografía de exclusión por tamaño, se formaron sistemáticamente heterodímeros del tamaño previsto (Figura 3).
Tabla 2: Nomenclatura y rendimientos de las proteínas de fusión biespecíficas Fab-scTv. Las moléculas están formadas por las SEQ ID N.° 50 y 52 y por las variantes indicadas de CDRa1 y CDRb1.
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a orientación beta-alfa del scTv
Ejemplo 4: unión de la proteína de fusión Fab-scTv al COL6A3-002 y a otros péptidos similares
La afinidad de la unión de las proteínas de fusión anti-CD3-scTv R4P3F9S hacia los monómeros HLA-A*02 con COL6A3-002 o con otros péptidos similares se midió con interferometría de biocapa. Las mediciones se realizaron con un sistema Octet RED384 aplicando los ajustes recomendados por el fabricante. En suma, moléculas purificadas de Fab-scTv se cargaron en biosensores (FAB2G) antes de proceder al análisis con diluciones seriadas de HLA-A*02/COL6A3-002. En comparación con las variantes 75-1 y 75-24 que contenían la CDRa1 natural (WT) y la CDRb1 natural (WT), las variantes de Fab-scTv provistas de secuencias CDRa1 y/o CDRb1 maduradas mostraron afinidades de unión más elevadas, hasta 40 veces mayores (Tabla 3, Figura 4). A fin de evaluar la selectividad de la unión a HLA-A*02/COL6A3-002, se analizó la unión de las moléculas purificadas de Fab-scTv cargadas en biosensores FAB2G a otros péptidos similares (SEQ ID N.° 28 a 36) presentes en una concentración de 1 j M, cada uno formando complejos con HlA-A*02. A excepción de HLA-A*02/c Ol6A1-001 (SEQ ID N.° 30), que se unió a la mayoría de las variantes de Fab-scTv que contenían la CDRal madurada (SEQ ID N.° 26), la unión de las variantes de Fab-scTv a los otros péptidos similares (Figura 5) fue nula, lo cual avala la elevada selectividad de la unión. En el caso de ciertas variantes de Fab-scTv se investigó el intervalo terapéutico entre la unión de HLA-A*02/COL6A3-002 y de HLA-A*02/COL6A1 001 cargando complejos de péptido-HLA biotinilados en biosensores (SA) y analizando series de diluciones de las variantes de Fab-scTv. La variante 75-10, que comprendía la secuencia de la CDRa1 madurada (SEQ ID N.° 26) y la CDRbl natural (WT) (SEQ ID N.° 13), mostró una afinidad de unión 8 veces mayor con HLA-A*02/COL6A3-002 que con HLA-A*02/COL6A1-001, pero en el caso de la variante de Fab-scTv 75-13, que comprendía la CDRbl madurada (SEQ ID N.° 39), se detectó una afinidad de unión hasta 57 veces mayor, lo cual avala la mejora del intervalo terapéutico (Tabla 4, Figura 6).
Tabla 3: Afinidad de unión de las proteínas de fusión Fab-scTv hacia HLA-A*02/COL6A3-002.
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Tabla 4: Comparación de la afinidad de unión de las proteínas de fusión Fab-scTv con HLA-A*02/COL6A3-002 y con HLA-A*02/COL6A1-001.
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Ejemplo 5: Uso de los TCR de afinidad madurada para la expresión en células
La modificación de los linfocitos T para que expresen TCR que reconozcan un complejo de HLA y péptido específico de tumor constituye una alternativa prometedora para redirigir los linfocitos T contras las células cancerosas. Puesto que el uso de secuencias CDR1 maduradas puede mejorar la afinidad de los TCR de membrana hacia HLA-A*02/COL6A3-002, se procedió a insertar las secuencias mutantes identificadas CDRa1 y CDRb1 en el TCR R4P3F9 originario (SEQ ID N.° 2 y 10). Las variantes mutantes del TCR resultantes de la inserción (C-1 a C-18, Tabla 15) se expresaron en linfocitos T CD8+ humanos tras someterlos a electroporación para introducir en ellos los respectivos ARNm generados mediante la transcripción in vitro de las secuencias de ADN amplificadas por PCR. A efectos de servir como control, se expresó el TCR 1G4 (SEQ ID N.° 53 y 57), que va dirigido contra el péptido NYESO1-001 (SEQ ID N.° 61). Los linfocitos T CD8+ sometidos a la electroporación para introducir en ellos el ARN permanecieron en incubación hasta el día siguiente, momento en que se procedió a analizar la expresión de las variantes de TCR introducidas mediante la tinción con tetrámeros HLA-A*02/COL6A3-002 o HLA-A*02/NYESO1-001 marcados con ficoeritrina (PE). La variante C-1 del TCR R4P3F9 originario mostró una tinción mínima con los tetrámeros HLA-A*02/COL6A3-0o2, en cambio las variantes C-2 a C-18 de dicho TCR, provistas con CDRa1 y/o CDRb1 maduradas, quedaron teñidas sustancialmente por los tetrámeros (Figura 7). Se investigó la activación funcional de los linfocitos T CD8+ (20.000 células/pocillo) que expresaban distintas variantes maduradas del TCR R4P3F9 determinando las concentraciones de IFN-gamma secretadas a raíz de su cultivo conjunto con células T2 (20.000 células/pocillo) cargadas con distintas diluciones en serie del péptido COL6A3-002 (SEQ ID N.° 1) o con 10 pM del COL6A3-002 y con otros péptidos similares (SEQ ID N.° 28 a 36). En comparación con la variante C-1 del TCR R4P3F9 originario, las variantes maduradas del TCR C-2 a C-18 mostraron un incremento de la secreción de IFN-gamma que alcanzó sus niveles máximos con concentraciones bajas del péptido (Figura 8). Como era previsible, no se observó secreción de IFN-gamma por parte de los linfocitos T que no expresaban ningún TCR o que expresaban el TCR de control 1G4, que es específico para el péptido NYESO1-001.Para analizar la selectividad del reconocimiento del COL6A3-002 mostrada por las variantes maduradas del TCR R4P3F9 se analizó la secreción de IFN-gamma como respuesta a las células T2 cargadas con distintos péptidos similares (SEQ ID N.° 28 a 36), análisis que reveló distintos perfiles de selectividad de las variantes maduradas del citado TCR. Resulta sumamente interesante que las variantes del TCR C-5 (SEQ ID N.° 62 y 2) y C-14 (SEQ ID N.° 62 y 63), que comprenden la misma CDRb1 madurada (SEQ ID N.° 40), no mostrasen ninguna reactividad cruzada hacia el COL6A1-001 no hacia otros péptidos similares (Figura 9), lo que convierte a estas dos variantes del TCR R4P3F9 de afinidad madurada en las candidatas más prometedoras para reconocer y actuar contra tumores por medio de TCR celulares.
Tabla 5: Nomenclatura de las variantes de TCR celulares. Las moléculas están formadas por las SEQ ID N.° 2 y 10 y las variantes indicadas de CDRa1 y CDRb1.
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Ejemplo 6 : Intervalo de reconocimiento del COL6A3-002 y del COL6A1-001 por parte de las variantes celulares de TCR
La expresión en células y el análisis de las variantes del R4P3F9 se llevaron a cabo del modo antes descrito. En consonancia con lo observado en experimentos anteriores (Figura 7), la tinción de los linfocitos T que expresaban las variantes C-2 a C-18 del TCR R4P3F9 con los tetrámeros de HLA-A*02/COL6A3-002 marcados con PE aumentó en comparación con los que expresaban el TCR originario C-1. Además, las variantes C-12 y C-17 del TCR reconocieron y se unieron al complejo HLA-A*02/COL6A1-001 (Figura 10). La expresión de todas las variantes maduradas del R4P3F9 mejoró la activación funcional de los linfocitos T CD8+ como respuesta a las células T2 cargadas con una dilución en serie del COL6A3-002 (SEQ ID N.° 1) hasta alcanzar valores de la CE50 que fueron de 5 a 90 veces más bajos que los observados con el TCR originario C-1 (Figura 11, Tabla 6). El valor más bajo de la CE50 se observó con la variante C-14. De nuevo, las variantes C-5 (SEQ ID N.° 62 y 2) y C-14 (SEQ ID N.° 62 y 63) del TCR, que comprendían la misma CDRb1 madurada (SEQ ID N.° 40), no mostraron ninguna reactividad cruzada con el COL6A1-001, mientras que otras variantes mostraron un potente reconocimiento, con intervalos de la CE50 (COL6A3-002 frente a COL6A1-001) tan bajos como un factor 5.
Tabla 6: Valores de la CE50 [nM] correspondientes a la secreción de IFN-y por parte de linfocitos T que expresaban variantes del R4P3F9 tras su cultivo conjunto con células T2 cargadas con COL6A3-002 o con COL6A1-001.
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a fase de meseta no alcanzada
Ejemplo 7: Eficacia de las dos variantes maduradas del R4P3F9 C-5 y C-14 contra estirpes de células tumorales La expresión en células y el análisis de las variantes del R4P3F9 se llevaron a cabo del modo antes descrito.
La expresión de las dos variantes maduradas del R4P3F9 C-5 (SEQ ID N.° 62 y 2) y C-14 (SEQ ID N.° 62 y 63) mejoró la activación funcional de los linfocitos T CD8+ contra las estirpes de células tumorales que presentaban el COL6A3-002 (SEQ ID N.° 1) en comparación con el TCR originario C-1 (Figura 12). Las estirpes de células tumorales usadas en el estudio presentan el péptido diana en cantidades distintas. Las células SF530 son portadoras de ~4000 copias de HLA-A*02/COL6A3-002 por célula y las células SW982 son portadoras de ~460 copias por célula. A diferencia del TCR originario C-1, que no propició una potente activación de los linfocitos cuando estos se cultivaron junto con estirpes celulares portadoras de la diana, la variante C-14 del TCR incluso aumentó más la activación funcional que la variante C-5 del TCR. Estos datos concuerdan con las mejoras de la CEsoobservadas con los TCR C-1 a C-5 y el C-14 (Tabla 6). Ninguno de los citados TCR reconoció la estirpe de células tumorales MCF-7, que no es portadora de la diana.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Constructo reconocedor de antígenos que comprende un primer dominio y un segundo dominio, dominios que comprenden tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) cada uno; el primer dominio comprende las secuencias de aminoácidos acordes con las SEQ ID N.° 6 (CDRa2) y 7 (CDRa3), y el segundo dominio comprende las secuencias de aminoácidos acordes con las SEQ ID N.°: 14 (CDRb2) y 15 (CDRb3), en que
a) la CDRal del primer dominio es como se expone en la SEQ ID N.° 5 y la CDRbl del segundo dominio es seleccionada entre una de las secuencias de aminoácidos acordes con las SEQ ID N.° 37 o 44, o
b) la CDRa1 del primer dominio es como se expone en la SEQ ID N.° 26 y la CDRb1 del segundo dominio es seleccionada entre una de las secuencias de aminoácidos acordes con las SEQ ID N.° 13 y 37 a 49, y el constructo reconocedor de antígenos es un receptor de linfocito T (TCR) o un derivado o fragmento del mismo, derivado o fragmento este que conserva la capacidad de la molécula para unirse al antígeno y/o reconocerlo y se une de forma específica y/o selectiva a un polipéptido antigénico de COL6A3.
2. El constructo reconocedor de antígeno acorde con la reivindicación 1, en que dicho constructo reconocedor de antígeno es estable y capaz de unirse específica y/o selectivamente a un péptido antigénico de COL6A3 que comprende la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 1, en particular en el contexto con MHC.
3. El constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en que dicho primer dominio forma parte de una cadena a o y de TCR; y o en que dicho segundo dominio forma parte de una cadena p o 8 de TCR.
4. El constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que dicho constructo reconocedor de antígeno es un constructo reconocedor de antígeno monocatenario, y preferentemente este constructor reconocedor de antígeno monocatenario es un TCR monocatenario.
5. El constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que el constructo reconocedor de antígeno es un TCR soluble.
6. Ácido nucleico que codifica un constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.
8. Una célula hospedadora recombinante que comprende un constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector acorde con la reivindicación 7, célula hospedadora que preferentemente es una célula de mamífero, más preferentemente una célula humana.
9. La célula hospedadora de la reivindicación 8, célula hospedadora que es
a) un linfocito, preferentemente un linfocito T o una célula progenitora de linfocito T, más preferentemente un linfocito T CD4 o CD8 positivo, u
b) otra célula que no es un linfocito.
10. Composición farmacéutica que comprende el constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el ácido nucleico acorde con la reivindicación 6, o el vector acorde con la reivindicación 7, o la célula hospedadora acorde con la reivindicación 8 o 9, y un vehículo, estabilizante y/o excipiente farmacéuticamente aceptables.
11. Método para producir el constructo reconocedor de antígeno específico de COL6A3 acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:
a. Proporcionar una célula hospedadora adecuada
b. Proporcionar un constructo genético que comprenda una secuencia codificante que codifique un constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
c. Introducir en la citada célula hospedadora adecuada el citado constructo genético, y
d. expresar el citado constructo genético en dicha célula hospedadora. El método preferentemente comprende, además, el aislamiento y la purificación del constructo reconocedor de antígeno a partir de la célula hospedadora adecuada y, opcionalmente, la reconstitución del constructo reconocedor de antígeno en un linfocito T.
12. El constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el ácido nucleico acorde con la reivindicación 6, el vector acorde con la reivindicación 7, la célula hospedadora acorde con la reivindicación 8 o 9, o la composición farmacéutica acorde con la reivindicación 10, para el uso en medicina.
13. El constructo reconocedor de antígeno acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el ácido nucleico acorde con la reivindicación 6, el vector acorde con la reivindicación 7, la célula hospedadora acorde con la reivindicación 8 o 9, o la composición farmacéutica acorde con la reivindicación 10, para el uso en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del cáncer, cáncer que es seleccionado entre un cáncer positivo que sobreexpresa el COL6A3, que lo tiene mutado, y/o presenta un antígeno asociado a tumor derivado de COL6A3.
14. Método in vitro para tratar un precáncer positivo para COL6A3, cáncer que es seleccionado entre un cáncer que sobreexpresa el COL6A3, que lo tiene mutado, y/o presenta un antígeno asociado a tumor derivado del COL6A3, método que comprende
a) transformación de una célula obtenida del sujeto que necesita el tratamiento antitumoral con al menos un vector acorde con la reivindicación para producir una célula transformada; y
b) expansión de la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas.
15. Método in vitro para detectar el cáncer en una muestra biológica, el cual comprende:
a) Puesta en contacto de la muestra biológica con el constructo reconocedor de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
b) Detección de la unión del constructo reconocedor de antígeno a la muestra biológica,
en que dicho cáncer es seleccionado entre un cáncer que sobreexpresa el COL6A3, que lo tiene mutado, y/o presenta un antígeno asociado a tumor derivado de COL6A3.
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