TWI802557B - 用於轉導及擴增免疫細胞之方法及其用途 - Google Patents

用於轉導及擴增免疫細胞之方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供用於離體外經基因方式修飾且擴增免疫細胞的方法，尤其用於基於細胞之過繼性免疫療法。因此，提供用於轉導免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法實施例，其包括例如藉由用諸如慢病毒顆粒之重組反轉錄病毒顆粒轉導該等細胞來活化該等細胞且經基因方式修飾該等經活化細胞的步驟。亦提供由此等方法產生的經基因方式修飾之細胞。此等方法通常在封閉系統內執行，且在說明性實施例中，在封閉系統之單個腔室內執行。該等方法通常包括：在封閉系統內，在說明性實施例中，在封閉系統之單個腔室內，擴增細胞擴增介質中之該等經基因方式修飾之免疫細胞。因此，在說明性實施例中，本文提供分批饋入單反應器方法系統。

Description

用於轉導及擴增免疫細胞之方法及其用途 【相關申請案之交叉參考】
本申請案之美國對應案主張2017年1月18日申請之美國臨時申請案第62/447,894號、2017年1月19日申請之美國臨時申請案第62/447,913號及2017年3月3日申請之美國臨時申請案第62/467,062號的權益。此段落中所引用之此等申請案以全文引用之方式併入本文中。
本揭示內容是關於用於活體外轉導及擴增免疫細胞之方法。
在過繼性細胞療法中，自患者分離之免疫細胞可離體外(ex vivo)經基因方式修飾以表現合成蛋白質，該等合成蛋白質使得細胞能夠在其連續轉移回至患者中後執行新的治療功能。在將細胞轉移回至患者中之前，經修飾細胞通常離體外擴增以提供足夠數目之細胞以執行治療功能。用於基於細胞之過繼性免疫療法(adoptive immunotherapy)修飾及擴增免疫細胞的先前方 法可為困難的、勞動密集型的、成本高昂的，且包括可能發生污染之多個步驟。此外，此等方法可能受限於其幫助將受益於其之許多供體的效率，此是因為其可能要求特定技術或設備，使得其之部署可能僅限於專門的離體外製造設施。
仍需要相對簡單、安全的方法來分離免疫細胞，且離體外經基因方式修飾及擴增經基因方式修飾之免疫細胞。此等方法將擴增過繼性細胞療法(諸如嵌合抗原受體技術(chimeric antigen receptor technologies；CAR-T))之方法的部署，該等嵌合抗原受體技術對某些類型之癌症產生前所未有的治癒率，且為當前需要有效癌症治療的許多患者帶來希望。此等患者通常不具有健康或經濟手段去遠行許多英里至專門的離體外製造設施接受可對其有療效之治療。因此，仍需要用於執行更適合於廣泛部署之過繼性細胞療法之方法，此是因為其比現有方法更簡單且更具成本效益。
本文在實施方式中提供用於通常離體外轉導T細胞及/或NK細胞之眾多態樣及實施例。作為非限制性實例，本文中所提供之說明性方法包括以下步驟：在封閉系統內，在說明性實施例中，在封閉系統之單個腔室內，活化T細胞及/或NK細胞且經基因方式修飾經活化T細胞及/或NK細胞(例如藉由用重組反轉錄病毒或重組反轉錄病毒顆粒(通常為非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，且在說明性實施例中為非複製勝任型慢病毒顆粒)轉導T細胞及/或NK細胞)，以產生經基因方式修飾之T 細胞及/或NK細胞。通常，此類方法進一步包括自血液或血液部分富集PBMC以分離包含在活化步驟中經活化之T細胞及/或NK細胞的PBMC。此外，在說明性實施例中，此等方法通常包括在轉導T細胞及/或NK細胞之後，在封閉系統內，在說明性實施例中，在封閉系統之單個腔室內，擴增細胞擴增介質中的經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
在一些實施例中，藉由用包括編碼CAR之核苷酸序列轉導T細胞及/或NK細胞，可經基因方式修飾T細胞及/或NK細胞(在說明性實施例中，T細胞)以表現嵌合抗原受體(CAR)。根據本揭示內容之方法經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞可用於亦提供於本文中的各種方法中，包括用於執行過繼性細胞療法(諸如CAR療法，例如針對癌症之CAR療法)的方法。
貫穿本揭示內容提供態樣及實施例之細節，諸如上文所論述之非限制性例示性方法。為了清楚起見，此發明內容部分中所提供之此等非限制性例示性實施例並不意欲且不應解釋為限制提供於此整個揭示內容中之揭示內容之範疇。
圖1顯示用於分離PBMC，且自經分離PBMC活化、轉導、擴增並採集T細胞及/或NK細胞。
圖2顯示在執行實例1中所提供之活化、轉導及擴增方法後細胞之離體外擴增倍數、轉導百分比及存活率。棒(bars)指 示擴增倍數。線(line)顯示轉導效率百分比。棒頂上的數字顯示各治療小組之存活百分比。注意用於活化、轉導及擴增之介質M1-M4(詳見實例1)。注意RetroNectin預治療。在G-Rex腔室、培養板或袋中活化且轉導細胞。針對於擴增，細胞如所提及保留於G-Rex腔室(直接G-Rex)中或自板(G-Rex之板)及袋(Cultilife袋)轉移至G-Rex腔室。
圖3顯示為CD4+或CD8+之CD3+細胞的百分比。注意用於活化、轉導及擴增之介質M1-M4(詳見實例1)。注意RetroNectin預治療。在G-Rex腔室、培養板或袋中活化且轉導細胞。針對於擴增，細胞如所提及保留於G-Rex腔室(直接G-Rex)中或自板(G-Rex之板)及袋(Cultilife袋)轉移至G-Rex腔室。
圖4顯示在存在或不存在抗CD28抗體及具有不同補充物之介質的情況下活化及擴增之細胞之擴增倍數、存活百分比以及CD3+eTAG+細胞的百分比。
圖5顯示在第0天或第2天在存在或不存在IL-7及NAC之情況下活化及擴增之細胞的CD3+eTAG+細胞之百分比。
圖6顯示在PBMC經受活化步驟前第0天之供體13、21及28之血液及PBMC的體積以及CD3+細胞、CD+CD8+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD56+細胞及CD-CD56+細胞之百分比。
圖7A至圖7C顯示在來自用編碼Axl MRB-CAR或Ror2 MRB-CAR的慢病毒顆粒製劑轉導之供體13、21及28之PBMC之擴增期間介質中之乳酸鹽濃度。
圖8A至圖8C顯示來自在用編碼Axl MRB-CAR或Ror2 MRB-CAR的慢病毒顆粒製劑轉導之後擴增的供體13、21及28之PBMC的擴增倍數及存活百分比。
圖9顯示來自在用編碼Axl MRB-CAR或Ror2 MRB-CAR的慢病毒顆粒製劑轉導之後擴增的供體13、21及28之PBMC的採集日以及所採集細胞中之CD3+eTAG+細胞、CD3+細胞、CD3+CD8+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD56+細胞及CD3-CD56+細胞之百分比。
圖10顯示針對4個供體(1至4)單獨處理之兩個樣本A或B在活化前第0天的血液體積及PBMC產量以及第0天樣本中之CD3+、CD3+CD8+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD56+細胞、CD3-CD56+細胞、CD14+單核球及CD14+淋巴球之百分比。
圖11A及圖11B顯示在活化及轉導後，在擴增期間，第4天、第6天、第8天、第10天及第12天的樣本1A、1B、2A、2B、3A及4A之介質中之乳酸鹽(11A)及葡萄糖(11B)濃度。圖10中提供樣本一致性。
圖12顯示在活化、轉導及擴增後所採集的經擴增細胞之總數(活細胞總數)、擴增倍數、所採集細胞之細胞存活率以及樣本1A、1B、2A、2B、3A及4A中所採集細胞中之CD3+eTAG+細 胞、CD3+細胞、CD3+CD8+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD56+細胞及CD3-CD56+細胞之百分比。圖10中提供樣本一致性。
定義
如本文中所使用之術語「周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells)」或「PBMC」是指具有圓核之任何周邊血液細胞。PBMC包括淋巴球(諸如T細胞、B細胞及NK細胞)、及單核球。
如本文中所使用之術語「免疫細胞」通常包括衍生自在骨髓中產生之造血幹細胞(HSC)之白血細胞(白血球)。「免疫細胞」包括例如淋巴球(T細胞、B細胞、自然殺手(NK)(CD3-CD56+)細胞)及衍生自骨髓之細胞(嗜中性細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞)。「T細胞」包括表現CD3之所有類型之免疫細胞，其包括輔助T細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、調節性T細胞(Treg)及γ-δ T細胞，以及NK T細胞(CD3+及CD56+)。熟練的業內人士將瞭解，如貫穿本揭示內容所使用，T細胞及NK細胞可僅包括T細胞，僅包括NK細胞，或包括T細胞及NK細胞兩者。在本文中所提供之某些說明性實施例及態樣中，T細胞經活化及轉導。此外，在本文中所提供之某些說明性組合物實施例及態樣中提供T細胞。「細胞毒性細胞」包括CD8+ T細胞、自然殺手(NK)細胞、NK-T細胞、T細胞及嗜中性細胞(其為能夠介導細胞毒性反應之細胞)。
如本文中所使用之術語「經基因方式修飾」包括將外源性核酸引入至細胞中之方法，無論是否將該等外源性核酸整合至細胞之基因組中。
如本文中所使用之術語「經基因方式修飾之細胞」包括含有外源性核酸之細胞，無論是否將該等外源性核酸整合至細胞之基因組中。
如本文中所使用，「淋巴消耗」涉及例如藉由投與淋巴消耗試劑(諸如單株抗體或細胞毒性藥物)減少供體中之淋巴球之數目的方法。部分身體或全身分級輻射療法亦可導致淋巴消耗。淋巴消耗試劑可為能夠在將其向哺乳動物投與時減少該哺乳動物中之功能性淋巴球之數目的化學化合物或組合物。此類試劑之一個實例為一或多種化學治療劑。此類試劑及劑量為已知的，且可視待治療之供體而定由治療醫師來選擇。淋巴消耗試劑之實例可包括(但不限於)氟達拉濱(fludarabine)、環磷醯胺、克拉屈濱(cladribine)、地尼白介素(denileukin diftitox)或其組合。
如本文中所使用之術語「嵌合抗原受體」或「CAR」或「CARs」是指工程化受體，其將抗原特異性移植至細胞上，例如T細胞、NK細胞、巨噬細胞及幹細胞。CAR可包括至少一個抗原特異性靶向區(ASTR)、鉸鏈或柄域、跨膜域(TM)、一或多個共刺激域(CSD)及胞內活化域(IAD)。在某些實施例中，CSD視情況存在。在另一實施例中，CAR為對兩種不同 抗原或抗原決定基具有特異性之雙特異性CAR。在ASTR與靶標抗原特異性結合之後，IAD活化胞內訊號傳導。舉例而言，IAD可以非MHC限制之方式將T細胞特異性及反應性重定向於所選擇之靶標，從而利用抗體之抗原結合特性。非MHC限制的抗原識別給與表現CAR之T細胞不依賴於抗原處理而識別抗原之能力，因此繞過腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在T細胞中表現時，CAR有利地不與內源性T細胞受體(TCR)α鏈及β鏈二聚。
如本文中互換地使用，術語「聚核苷酸」及「核酸」是指任何長度之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)之聚合形式。因此，此術語包括(但不限於)：單鏈、雙鏈或多鏈的DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體，或包含嘌呤鹼基及嘧啶鹼基或其他天然、以化學方式或生物化學方式修飾之非天然或衍生之核苷酸鹼基的聚合物。
如本文中所使用之術語「抗體」及「免疫球蛋白」包括任何同型之抗體或免疫球蛋白；保留與抗原之特異性結合的抗體片段，包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、(Fab')2Fv、scFv、二價scFv及Fd片段；嵌合抗體；人類化抗體；單鏈抗體以及包含抗體及非抗體蛋白質之抗原特異性靶向區之融合蛋白質。
如本文中所使用之術語「抗體片段」包括完整抗體之一部分，例如完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；及 由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段(稱為「Fab」片段，每一者具有單個抗原結合位點)及一殘餘「Fe」片段(一種反映容易結晶之能力的指示)。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原之F(ab')2片段。
如本文中所使用之術語「單鏈Fv」、「scFv」或「sFv」是指包括抗體之VH域及VL域之抗體片段，其中此等域存在於單個多肽鏈中。在一些實施例中，Fv多肽進一步包括在VH域與VL域之間的多肽連接子，其使得sFv能夠形成針對抗原結合之所需結構。對於sFv之綜述，參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
如本文中所使用之術語「親和性(affinity)」是指兩種試劑之可逆結合的平衡常數，且被表述為解離常數(Kd)。親和性可比抗體針對不相關胺基酸序列之親和性高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍，或更高。抗體對於靶蛋白之親和性可為例如約100奈莫耳(nM)至約0.1nM、約100nM至約1皮莫耳(pM)，或約100nM至約1飛莫耳(fM)或更高。如本文中所使用，術語「親合力(avidity)」是指兩種或更多種試劑之複合物在稀釋後對於解離的抗性。關於抗體及/或抗原結合片段，術語「免疫反應性」及「優先結合」在本文中互換地 使用。
如本文中所使用之術語「結合(binding)」是指歸因於例如共價相互作用、靜電相互作用、疏水相互作用及離子相互作用及/或氫鍵相互作用(包括諸如鹽橋鍵及水橋鍵之相互作用)而在兩個分子之間的直接締合。非特異性結合應是指親和性低於約10-7M之結合，例如親和性低於10-6M、10-5M、10-4M等之結合。
如本文中所使用之術語「區」為多肽或聚核苷酸之任何區段。
如本文中所使用之術語「域」為具有功能性及/或結構性特性之多肽或聚核苷酸之區。
如本文中所使用之術語「柄」或「柄域」是指提供結構性可撓性且與側翼多肽區間隔的可撓性多肽連接區，且可由天然或合成多肽組成。柄可衍生自免疫球蛋白(例如，IgG1)之鉸鏈或鉸鏈區，其通常被定義為自人類IgG1之Glu216拉伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22：161-206)。可藉由將形成重鏈間二硫鍵(S-S)之第一個半胱胺酸殘基及最後一個半胱胺酸殘基置放於相同位置中來將其他IgG同型之鉸鏈區與IgG1序列進行比對。柄可為天然存在或非天然存在的，其包括(但不限於)經改變之鉸鏈區，如美國專利第5,677,425號中所揭示。柄可包括衍生自任何類別或子類別之抗體的完整鉸鏈區。柄亦可包括衍生自CD8、CD28或在提供可撓性且與側翼區 間隔時提供類似功能之其他受體的區。
如本文中所使用之術語「鉸鏈區」是指提供結構性可撓性且與側翼多肽區間隔的可撓性多肽連接區(本文中亦稱為「鉸鏈」或「間隔子」)，且可由天然或合成多肽組成。衍生自免疫球蛋白(例如，IgG1)之「鉸鏈區」通常被定義為自人類IgG1之Glu216拉伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22：161-206)。可藉由將形成重鏈間二硫鍵(S-S)之第一個半胱胺酸殘基與最後一個半胱胺酸殘基置放於相同位置中來將其他IgG同型之鉸鏈區與IgG1序列進行比對。鉸鏈區可為天然存在或非天然存在的，其包括(但不限於)經改變之鉸鏈區，如美國專利第5,677,425號中所揭示。鉸鏈區可包括衍生自與CH1域之類別或子類別不同的類別或子類別之抗體的完整鉸鏈區。術語「鉸鏈區」亦可包括衍生自CD8、CD28或在提供可撓性且與側翼區間隔時提供類似功能之其他受體的區。
如本文中所使用之術語「經分離多肽」為已經鑒別且自其天然環境之組分分隔及/或回收之多肽。其天然環境之雜質組分為將干擾多肽之診斷或治療用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施例中，多肽將(1)純化至按抗體重量計高於90%、高於95%或高於98%，如利用洛瑞法(Lowry method)所測定，例如，高於99重量%，(2)藉助於旋轉杯定序儀純化至足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或(3)利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原條件或非還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或銀染料純化至均一性。經分離多肽包括 重組細胞內之原位多肽，因為多肽之天然環境之至少一種組分將不存在。在一些情況下，經分離多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文中所使用之術語「幹細胞」通常包括多能(pluripotent/multipotent)幹細胞。「幹細胞」包括例如胚胎幹細胞(ES)、間充質幹細胞(MSC)、誘導型多能幹細胞(iPS)及定型祖細胞(造血幹細胞(HSC)、骨髓衍生細胞等)。
如本文中所使用之術語「治療(treatment/treating)」及類似者是指獲得所需藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分地預防疾病或其症狀而言可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或由疾病引起之不良影響而言可為治療性的。如本文中所使用之「治療」涵蓋哺乳動物中之(例如，人類中之)疾病之任何治療，且包括：(a)預防在易患疾病但尚未被診斷為患有其之供體中發生疾病；(b)抑制疾病，亦即，遏止其發展；及(c)減輕疾病，亦即，引起疾病消退。
如本文中互換地使用之術語「供體(individual)」、「供體(subject)」、「宿主」及「患者」是指哺乳動物，其包括(但不限於)人類、鼠類(例如，大鼠、小鼠)、兔類(例如，兔)、非人類靈長類、犬、貓及有蹄類動物(例如，馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。如本文中所提及之「供體」為提供血液之人類供體。
如本文中所使用之術語「有效量(effective amount)」、「治 療有效量」或「有效量(efficacious amount)」是指在向哺乳動物或其他供體投與以用於治療疾病時足以影響疾病之此類治療的試劑之量或兩種試劑之組合量。「治療有效量」將視試劑、疾病及其嚴重程度以及待治療供體之年齡、體重等而變化。
如本文中所使用之術語「生理學」條件、「正常」條件或「正常生理學」條件為諸如但不限於以下之條件：溫度、pH、滲透壓、重量莫耳滲透濃度、氧化應激(stress)及電解質濃度，以及將被視為在投與部位處或在作用部位處之組織或器官處對於供體而言是處於正常範圍內的其他參數。
應理解，本發明及本文中所提供之態樣及實施例並不限於所揭示之特定實例，因此當然可能有變化。亦應理解，本文中所使用之技術僅是出於揭示特定實例及實施例之目的，且並不意欲為限制性的，此是因為本發明之範疇將僅由隨附申請專利範圍所限定。
當提供值之範圍時，應理解，在該範圍之上限與下限之間的各中間值(除非上下文另外明確指示，否則為下限單位之十分之一)與該陳述範圍中之任何其他值或中間值均涵蓋在本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括在較小範圍中，且亦涵蓋在本發明內，該陳述範圍中之任何特異性排除之極限除外。當所陳述範圍包括極限之一個或兩個時，排除彼等所包括之極限之一個或兩個之範圍亦包括在本發明中。當針對範圍給定多個低值及多個高值時，熟練的業內人士將認識到，所選擇範圍將包括低於高值之低值。
本說明書中之所有標題均為易於閱讀起見，且並非為限制性的。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者所通常理解相同之含義。儘管類似於或等效於本文中所揭示之彼等的任何方法及材料亦可用於本發明之實現或測試，但現在揭示較佳的方法及材料。
必須注意，除非上下文另外明確指示，否則如本文中所使用及在隨附申請專利範圍中，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，例如，提及「嵌合抗原受體」包括複數個此等嵌合抗原受體及熟習此項技術者已知之其等效物等。應進一步注意，申請專利範圍可能被設計成排除任何視情況可選用之要素。因此，此陳述意欲充當使用與申請專利範圍要素之引用相關之諸如「單獨」、「僅」及類似者之此類排他性術語或使用「否定」限制的前提基礎。
應理解，為清楚起見，在獨立實施例之上下文中描述之本發明之某些特徵亦可以組合方式提供於單個實施例中。相反地，為簡潔起見，在單個實施例之上下文中描述之本發明之各種特徵亦可單獨提供或以任何適合的子組合方式提供。屬於本發明之實施例之所有組合均特異性地包涵在本發明中，且正如各組合及每一組合單獨及清楚地揭示一樣揭示於本文中。另外，各種實施例及其要素之所有子組合亦均特異性地包涵在本 發明中，且正如各子組合及每一此類子組合單獨及清楚地揭示一樣揭示於本文中。
實施方式
本文中提供用於操作及典型地擴增免疫細胞，尤其是T細胞及NK細胞之方法，其比先前方法需要更少樣本處理及操作，由此提供更簡單及更流暢之方法。因此，此等方法減小人為錯誤及微生物污染之可能性。此外，此等方法有助於促進由更多實驗室有效執行此等方法，因此擴增使用該等方法處理細胞之途徑。本文中所揭示之說明性態樣及實施例提供用於富集、活化、轉導及擴增封閉系統中之T細胞及/或NK細胞的單反應器分批饋入過程之方法。在說明性態樣中，本發明有利地在短時間內自少量血液中產生大量經轉導T細胞及/或NK細胞。
本文中所提供之說明性方法(通常為離體外方法)包括以下步驟：在封閉系統內，通常在封閉系統之單個腔室(亦稱為反應器、容器(vessel/container)、區室或收容器)內用重組反轉錄病毒或重組反轉錄病毒顆粒(通常為非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒，且在說明性實施例中為非複製勝任型重組慢病毒顆粒)活化T細胞及/或NK細胞且轉導經活化T細胞及/或NK細胞，以產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。該腔室可為可撓性或剛性的。在說明性實施例中，該腔室可為剛性的。通常，此等方法進一步包括富集PBMC以分離包含用於活化步驟中之T細胞及/或NK細胞的PBMC。此外，在說明性實施例中，此等方法通常包括在轉導T細胞及/或NK細胞之後，在封閉系統內，通常在封閉系統之單個腔室內，擴增細胞擴增 介質中之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。在本文中所提供之方法之說明性實施例中，活化、轉導且典型地擴增T細胞。在說明性實施例中，用嵌合抗原受體(CAR)經基因方式修飾此等T細胞。
本文中所提供之說明性實施例在活化與轉導之間不包括洗滌步驟，且在轉導與擴增之間不包括洗滌步驟。因此，在此等說明性實施例中，在封閉系統之相同腔室內執行活化、轉導及擴增，且不洗滌T細胞及/或NK細胞或自開始活化至擴增之腔室移除T細胞及/或NK細胞。因此，包括於活化步驟中之活化試劑(諸如抗CD3抗體)通常在轉導及擴增步驟期間存在且可偵測。此外，本文中所提供之說明性實施例(其可包括自少至50ml所收集之血液分離PBMC)在擴增之後產生與存在於經分離PBMC中之T細胞及/或NK細胞相比至少10倍一樣多的經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
在一個態樣中，本文中提供一種用於轉導來自經分離血液之T細胞及/或NK細胞的方法，其包括：a)自經分離血液分離包括T細胞及/或NK細胞之周邊血液單核細胞(PBMC)；b)在封閉系統內在有效條件下活化經分離PBMC之T細胞及/或NK細胞，且不富集來自其他PBMC之T細胞及/或NK細胞，包括含有效量抗CD3抗體之溶液；及c)在有效條件下用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導經活化T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其中活化及轉導在相同封閉系統內執行且不在活化與轉導之間洗滌細胞。在其他實施例中，該方法可進一步包括擴增細胞擴增介質 中之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。在說明性實施例中，在相同封閉系統之相同腔室內執行活化、轉導及擴增。
在說明性實施例中，在富集、活化、轉導或擴增期間移除不多於20%或10%之細胞介質。在此等說明性實施例中，僅在少量樣本(諸如2ml或1ml或更少樣本)中移除介質以評估諸如擴增之步驟的進展，及/或評估在該方法期間細胞之數目、健康狀況、組成及/或狀態。在說明性實施例中，在活化、轉導及擴增之間不執行洗滌，且因此通常作為活化之部分添加的抗CD3抗體在擴增期間存在於介質中。在說明性實施例中，N-乙醯基半胱胺酸(NAC)在轉導期間不存在，但在擴增期間存在於介質中。在一些說明性實施例中，介質可在轉導、擴增及採集期間補有充細胞介素。在本文中所揭示之方法中，介質通常在擴增期間進一步補充有細胞介素。在說明性實施例中，介質可在擴增期間補充有IL-2及視情況選用之IL-7。
圖1中呈現一非限制性實施例。在第0天，自供體收集血液，且富集PBMC以自血液分離包含T細胞及/或NK細胞之PBMC並在封閉系統內洗滌。接著通常將PBMC轉移至封閉系統內之腔室以活化、轉導及擴增T細胞及/或NK細胞。接著將活化試劑添加至腔室以開始活化經分離PBMC。在第1天，將非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒添加至腔室以開始轉導經活化細胞。在第2天，用擴增介質饋入細胞以開始細胞擴增。細胞擴增介質通常包括在活化及轉導步驟期間存在之基礎介質。在說明性實施例中，用於細胞擴增之介質可補充有N-乙醯基-半胱胺酸(NAC)，其在說明性實施例中在活化步驟及和轉導步 驟中不存在。細胞擴增介質可補充有例如10mM NAC。在其他說明性實施例中，擴增步驟以及活化及轉導步驟中之基礎介質可補充有細胞介素，例如IL-2及視情況選用之IL-7。擴增之後，可在細胞擴增介質中之乳酸鹽濃度達到或超出預定濃度(例如10mM，或在說明性實施例中，20mM)時採集細胞，或若未達到乳酸鹽之預定濃度，則在第12天採集細胞。細胞藉由收集、洗滌以及將其轉移至難溶袋或將其冷凍保存於小瓶，或較佳低溫袋中來採集。
如上文所指示，在一些實施例中，介質在細胞擴增期間補充有細胞介素，例如100IU/ml IL-2及視情況選用之10ng/ml IL-7。在一些實施例中，介質可進一步在擴增期間每12小時、24小時或48小時補充有IL-2及視情況選用之IL-7。在說明性實施例中，介質可在擴增期間在第4天、第6天及第8天補充有IL-2及視情況選用之IL-7。在一些實施例中，在擴增期間，介質可補充有最終濃度在範圍之低端為50、60、70、80、90、100、110或120IU/ml與範圍之高端為60、70、80、90、100、110、120、130、140或150IU/ml之間的IL-2。在說明性實施例中，自活化至擴增細胞之步驟可在封閉系統中之單個封閉腔室中執行。事實上，在說明性實施例中，在封閉系統中執行自血液收集至採集的方法，使得在該方法期間之任何點處細胞不會暴露於環境中。在說明性實施例中，在整個方法期間移除不多於20%之介質，且因此活化試劑(諸如抗CD3抗體及/或抗CD28抗體)在整個轉導及擴增步驟期間存在。
在說明性實施例中，在封閉系統中執行以下步驟：活化T 細胞及/或NK細胞；用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導T細胞及/或NK細胞，以產生以基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；擴增經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；且採集經擴增T細胞及/或NK細胞。封閉系統為對環境大致上封閉或完全封閉之細胞處理系統，該環境諸如房間內之環境，或甚至系統之通風櫥內、系統之導管(諸如試管)及腔室外之環境，在該系統中處理、培養及/或轉運細胞。對於細胞處理程序中之安全及調控之最大風險中之一者為經由頻繁暴露於環境中之污染的風險，如在傳統的開放式細胞培養系統中所發現。為緩和此風險，尤其在不存在抗生素時，已研發出致力於使用一次性(單次使用)設備的一些商業方法。然而，即使在無菌條件下使用，打開燒瓶以取樣或添加額外生長介質總是存在污染風險。為克服此問題，本文中所提供之方法(通常為離體外方法)通常在封閉系統內執行。此方法經設計且可經操作以使得產物不暴露於外部環境。材料轉移經由無菌連接進行，諸如無菌管或無菌焊接連接。用於氣體交換之空氣可經由透氣膜經由0.2μm過濾器來進行以防止環境暴露。另外，使用本文中所提供之方法，可活化、轉導及擴增T細胞及/或NK細胞，且不在此等步驟之間或期間洗滌T細胞及/或NK細胞。此外，在說明性實施例中，活化試劑(諸如抗CD3抗體)呈溶液形式，且因此在該等說明性實施例中不必移除抗CD3抗體常常連接之基質(諸如珠粒)。在其他說明性實施例中，對T細胞執行該等方法，例如以提供經基因方式修飾之T細胞。
此等封閉系統方法可用可市購器件來執行。可在方法內之不同步驟處使用不同封閉系統器件，且可使用管及連接(諸如 焊接、魯爾、釘或端口)在此等器件之間轉移細胞以防止細胞或介質暴露於環境中。舉例而言，可將血液收集至IV袋或注射器中，且轉移至Sepax 2器件(Biosafe)以用於PBMC富集及分離。可將經分離PBMC轉移至G-Rex器件之腔室以用於活化、轉導及擴增。最終，可使用Sepax 2器件將細胞採集及收集至另一袋中。該等方法可在適用於封閉系統T細胞及/或NK細胞生產之任何器件或器件組合中進行。此等器件之非限制性實例包括G-Rex器件(Wilson Wolf)、GatheRex(Wilson Wolf)、Sepax 2(Biosafe)、WAVE Bioreactors(General Electric)、CultiLife Cell Culture袋(Takara)、PermaLife袋(OriGen)、CliniMACS Prodigy(Miltenyi Biotec)及VueLife袋(Saint-Gobain)。在說明性實施例中，在封閉系統中之相同腔室或容器中執行活化、轉導及擴增。舉例而言，在說明性實施例中，腔室可為G-Rex器件之腔室，且PBMC可在其經富集及分離後轉移至G-Rex器件之腔室且可保留於G-Rex器件之相同腔室中直至採集為止。
封閉系統通常包括塗佈與細胞接觸之一些或全部器件表面的步驟。舉例而言，表面可用重組纖連蛋白或纖連蛋白片段(諸如RetroNectin(Takara))塗佈，不受理論限制，其可利用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒促進T細胞及/或NK細胞之轉導。在細胞可引入至經塗佈器件中之前，必須執行洗滌。塗佈及洗滌器件之步驟引入更多污染風險。因此，在本文中所提供之實施例中之任一者中，可在不塗佈表面之情況下將T細胞及/或NK細胞有利地引入至封閉系統器件中。在一些實施例中，可在不存在重組纖連蛋白或RetroNectin之情況下執行該等方法。
血液收集
可藉由此項技術中已知之任何適合方法自供體收集或獲得含有PBMC之血液。舉例而言，可藉由靜脈穿刺或收集血液及/或PBMC之樣本的任何其他血液收集方法來收集血液。在一些實施例中，所收集血液體積通常在50ml與250ml之間，例如在75ml與125ml之間，或在90ml與120ml之間，或在95與110ml之間。在一些實施例中，所收集血液體積可在範圍之低端為25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800或900ml與範圍之高端為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800或900ml或1L之間。在本文中所揭示之方法中，可在少量時間(諸如10至14天)內自較小體積之血液(諸如80ml與100ml之間)中產生大量經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，可如下文所論述藉由血球分離獲得PBMC。然而，在血球分離期間，通常採集且處理比收集血液更大致積的血液。在一些實施例中，在血球分離期間所採集及處理之血液體積可在範圍之低端為0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.25或1.5供體之總血液體積與範圍之高端為0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25或2.5供體之總血液體積之間。如在本文之說明性實施例中，人類之總血液總體積通常在4.5至6L之範圍內，且因此在血球分離期間採集及處理比收集血液且接著分離PBMC多得多的血液。
PBMC之富集
在用於過繼性細胞療法之方法和包括離體外轉導T細胞及/或NK細胞的本文中所提供之任何方法中，包括T細胞及/或NK細胞之周邊血液單核細胞(PBMC)在富集步驟中與血液樣本之其他組分分離。可使用已知方法例如藉由自血液樣本形成血塊黃層來執行此富集。可使用已知方法藉由收集血塊黃層且自其他血液組分進一步富集PBMC來富集PBMC。在一些實施例中，可在計數之前使用已知方法裂解針對定量獲取之樣本中之污染紅血細胞。可例如使用血球分離及/或密度梯度離心來執行自其他血液組分及血細胞富集PBMC。在一些實施例中，在T細胞及/或NK細胞被處理、與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸、轉導或轉染之前，移除嗜中性細胞。關於待治療之供體，細胞可為異體性及/或自體性的。
在說明性實施例中，使用Sepax或Sepax 2細胞處理系統(BioSafe)富集且分離PBMC。在一些實施例中，使用CliniMACS Prodigy細胞處理器(Miltenyi Biotec)富集且分離PBMC。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，可例如使用Sepax細胞處理系統執行密度梯度離心。在一些實施例中，可使用Ficoll-Paque(GE Healthcare)。在一些實施例中，使用自動血球分離器，自供體採集血液，使血液穿過挑選出周邊細胞類型(諸如，PBMC)之裝置，且使剩餘部分返回至供體中。密度梯度離心可在血球分離之後執行。在一些實施例中，可使用去除白血球的過濾器器件富集且分離PBMC。在一些實施例中，接著根據細胞表型(亦即陽性選擇)使用磁珠活化細胞分類術 以用於純化來自PBMC(諸如T細胞及/或NK細胞)之特異性細胞群。在一些實施例中，可使用此項技術中已知之方法自PBMC移除單核球及/或巨噬細胞。舉例而言，使用磁珠活化細胞分類術(亦即陰性選擇)，或藉由允許PBMC在經組織培養物處理之表面上生長以使得單核球及/或巨噬細胞黏著，且隨後將上清液轉移至新容器來移除單核球及/或巨噬細胞。然而，在某些說明性實施例中，且在特定活化步驟中，對PBMC執行本文中所提供之方法，且不針對其他細胞類型(諸如T細胞及/或NK細胞)富集。在一些實施例中，可根據此項技術中已知之方法冷凍保存PBMC。然而，在說明性實施例中，PBMC在不首先冷凍保存之情況下活化。
在PBMC富集過程期間，可在分離且接著活化經富集PBMC之前如此項技術中所已知執行一或多次洗滌。舉例而言，可在用於富集PBMC之Sepax 2系統上執行洗滌。洗滌溶液可為適用於洗滌血液及/或PBMC之任何溶液。在一些實施例中，洗滌溶液可為補充有人血清白蛋白(HSA)、人類AB+血清、源自供體之血清或合成血清替代物的鹽水。在一些實施例中，HSA、人類AB+血清、源自供體之血清或合成血清替代物可以範圍之低端為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或9%與範圍之高端為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之間的最終濃度存在於洗滌溶液中。在說明性實施例中，HSA、人類AB+血清、源自供體之血清及/或合成血清替代物可以範圍之低端為0.5%、1%或1.5%與範圍之高端為1%、2%、3%、4%或5%之間的最終濃度存在於洗滌溶液中。在其他說明性實施例中，洗滌溶液可為補充有最終濃度為範圍之 低端為0.5%、1%或1.5%與範圍之高端為1%、2%、3%、4%或5%之間的HSA的鹽水。
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，經分離PBMC之數目可在範圍之低端為1×106、2.5×106、5×106或1×107個PBMC與範圍之高端為2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108或1×109個PBMC之間。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，經分離PBMC之數目可在範圍之低端為5×106、1×107、2.5×107、5×107個PBMC與範圍之高端為1×107、2.5×107、5×107或1×108個PBMC之間。根據此項技術中已知之方法，可將經分離PBMC再懸浮於用於離體外培養T細胞及/或NK細胞之任何適合基礎培養介質中，包括基礎培養介質及補充物，包括細胞介素，如下文在細胞擴增部分中更詳細地揭示。
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，PBMC可再懸浮於範圍之低端為50、60、70、80、90、100、125、150、175或200ml介質與範圍之高端為60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400或500ml介質之間中。在一些實施例中，PBMC可再懸浮於至少50、60、70、80、90、100、125、150、175或200ml介質中。在說明性實施例中，PBMC可再懸浮於至多50、60、70、80、90、100、125、150、175或200ml介質中。
PBMC之活化
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，方法通常包括用 一或多種活化試劑在活化反應混合物中活化或刺激經分離PBMC以產生經活化T細胞及/或NK細胞的步驟。在一些實施例中，在活化之前將經分離PBMC轉移至封閉系統中之另一器件內的腔室，諸如G-Rex器件。可用新鮮經分離PBMC或先前經冷凍保存之PBMC執行活化。在使用經冷凍保存之細胞的情形下，可在使用前使用已研發之方法融解細胞。在一些實施例中，可在不離心之情況下執行活化。
可調節活化之經分離PMBC之數目，使得在擴增後，採集足夠數目之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，以用於引入、再引入或轉移回至患者中。在一些實施例中，活化之PBMC之數目在範圍之低端為1×106、2.5×106、5×106或1×107個PBMC與範圍之高端為2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108或1×109個PBMC之間。在說明性實施例中，活化之PBMC之數目在範圍之低端為5×106、1×107、2.5×107、5×107個PBMC與範圍之高端為1×107、2.5×107、5×107或1×108個PBMC之間。在一些實施例中，可將介質(諸如基礎細胞培養介質)添加至經分離PBMC，以將PBMC之細胞密度調節至範圍之低端為1×103、2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105或5×105個PBMC/ml與範圍之高端為2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106或1×107個PBMC/ml之間。在說明性實施例中，將介質添加至經分離PBMC，以將PBMC之細胞密度調節至範圍之低端為5×103、1×104、2.5×104、5×104或1×105個PBMC/ml與範圍之高端為1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105 或5×105個PBMC/ml之間。在分離少於臨限值數目之PBMC(例如少於1×106、5×106、1×107、5×107或1×108個PBMC)的一些實施例中，減少所添加之細胞培養介質的總體積以達成所列舉之所要範圍內之PBMC細胞密度。
介質通常在活化期間存在，諸如用於離體外培養T細胞及/或NK細胞的此項技術中已知之彼等介質，包括基礎介質及包括細胞介素之補充物，如下文在細胞擴增部分中更詳細地揭示。
一或多種活化試劑的任何組合可用於產生經活化T細胞及/或NK細胞。可在封閉系統之腔室中將一或多種活化試劑添加至介質，且不將PBMC暴露於環境中。通常在封閉系統之腔室內形成反應混合物以執行活化。在一些實施例中，可藉由將一或多種活化試劑添加至介質來形成反應混合物。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，以有效量使用一或多種活化試劑，使得產生經活化T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，活化試劑可為靶向或結合至T細胞刺激或共刺激分子，或任何其他適合有絲分裂原(例如，十四醯基佛波醇乙酸酯(TPA)、植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(conA)、脂多醣(LPS)、美洲商陸有絲分裂原(PWM))或T細胞刺激或共刺激分子之天然配位體的抗體或其功能性片段。一些先前方法已用胺基雙磷酸鹽補充活化反應混合物。然而，在本文中之說明性實施例中，活化反應混合物中不存在胺基雙磷酸鹽(天然或合成)。
此項技術中已知活化或刺激T細胞及/或NK細胞之各種抗體及其功能性片段。在一些實施例中，可將抗CD2、抗CD3及 /或抗CD28添加至介質。在說明性實施例中，可將抗CD3及抗CD28抗體添加至介質。在其他說明性實施例中，可將抗CD3抗體單獨添加至介質。在一些實施例中，可將一或多種抗體或其功能性片段固定在固體表面(諸如珠粒)上。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，抗CD28可為CD80或CD86或保留結合CD28之能力的其任何功能性片段。然而，使用固定化抗體或其功能性片段通常需要在方法期間之某個點處移除其。在說明性實施例中，一或多種抗體或其功能性片段可有利地呈溶液形式。不受理論限制，在一些實施例中，呈溶液形式之一或多種抗體或其功能性片段可藉由在活化期間存在之抗原呈現細胞(例如，其他PBMC)結合。在一些實施例中，一或多種抗體或其功能性片段不連接至合成固體載體(諸如珠粒)或固定於合成固體載體上。
在一些實施例中，可在活化期間將抗CD3抗體、IL-2，且在一些子實施例中，能夠與CD28(諸如CD80或CD86)結合之抗CD28或多肽，及/或IL-7添加至介質。在說明性實施例中，可在活化期間將抗CD3抗體、IL-2及IL-7添加至介質。作為不移除介質之連續分批饋入過程的部分，一或多種活化試劑(諸如抗CD3抗體)可在轉導、擴增及採集期間保留於介質中。
在添加一或多種活化試劑後，可在23℃至39℃下，且在一些說明性實施例中，在37℃下，培育T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，可在37℃至39℃下進行活化反應。可將T細胞及/或NK細胞與一或多種活化試劑一起培育範圍之低端為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23或24小時與範圍之高端為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、27、30、36、40或48小時之間。在說明性實施例中，可將T細胞及/或NK細胞與一或多種活化試劑一起培育範圍之低端為15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時與範圍之高端為18、19、20、21、22、23、24、27、30或36小時之間，諸如在18與30小時之間。
T細胞及/或NK細胞之轉導
本文中提供用於經基因方式修飾T細胞及/或NK細胞，以及藉由此等方法產生之T細胞及/或NK細胞的方法。在本文中所揭示之此等方法及組合物的一些實施例中，使T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒離體外接觸，從而經基因方式修飾T細胞及/或NK細胞。不受理論限制，在接觸時段期間，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒與T細胞及/或NK細胞結合，此時反轉錄病毒與宿主細胞膜開始融合。接著，經由轉導程序，來自非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之基因材料進入T細胞及/或NK細胞，且通常併入至宿主細胞DNA中。因此，此等方法包括藉由轉導經基因方式修飾T細胞及/或NK細胞。在此項技術中已知用於離體外用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(諸如非複製勝任型重組慢病毒顆粒)轉導T細胞及/或NK細胞的方法。例示性方法描述於例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9)：689-701，Cooper等人(2003)Blood.101：1637-1644、Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506：97-114及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2)：497-505中。在一些實施例中，可使T細胞及/或NK細胞與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸。在說明性實施例中，可使T細胞及/或NK 細胞與非複製勝任型重組慢病毒顆粒接觸。在一些實施例中，可在不離心之情況下執行轉導。
可在封閉系統中執行本文中所提供之方法之轉導反應。通常，在不移除任何介質之情況下在與執行活化相同之封閉系統的腔室中執行轉導。舉例而言，血液細胞(諸如自所收集之血液樣本富集且分離之PBMC)可在G-Rex系統中活化，且接著在相同G-Rex系統中與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸。在說明性實施例中，血液細胞自在接觸步驟(亦即，轉導反應)期間通常不存在之粒細胞(包括嗜中性細胞)分隔、分離及/或純化，且根據本文之其他處所論述之方法活化。將在其他說明性實施例中可為非複製勝任型重組慢病毒顆粒之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒引入至含有經活化PBMC之封閉系統(在說明性子實施例中，執行活化之封閉系統之相同腔室)中，以形成轉導反應混合物。在一些實施例中，將非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒添加至在活化步驟期間形成之反應混合物。介質通常在轉導期間存在，諸如此項技術中已知之用於離體外培養T細胞及/或NK細胞之彼等介質，包括基礎介質及包括細胞介素之補充物，如下文在細胞擴增部分中更詳細地揭示。
在一些實施例中在添加非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒時開始之轉導反應可在23℃至39℃下，及在一些說明性實施例中，在37℃下，培育。在一些實施例中，可在37℃至39℃下進行轉導反應以供更快融合/轉導。可培育轉導反應範圍之低端為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時與範圍之高端為12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、27、30、36、40或48小時之間。在說明性實施例中，可培育轉導反應範圍之低端為15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時與範圍之高端為18、19、20、21、22、23、24、27、30或36小時之間，諸如在18與30小時之間。
在一說明性實施例中，將血液自供體收集至血袋中，且將該血袋連接至細胞處理系統，諸如Sepax 2細胞處理系統。將使用細胞處理系統富集且分離之PBMC收集至介質中之袋中，轉移至G-Rex系統，經活化，使其在足以轉導T細胞及/或NK細胞之條件下與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接觸，並對其進行培育。在轉導期間，產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。培育之後，將介質添加至含有PBMC與非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之混合物的G-Rex腔室，以擴增經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，直至達到特定細胞密度或乳酸鹽濃度或直至達到一定的天數。在一些實施例中，將細胞收集且連接至細胞處理系統，並洗滌T細胞及/或NK細胞。將經洗滌T細胞及/或NK細胞收集至袋中並再輸注至供體中。
可用非複製勝任型重組反轉錄病毒或慢病毒顆粒與細胞之不同比率(稱為感染倍率(MOI))轉導T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，可使用在範圍之低端為0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10與範圍之高端為0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15之間的MOI轉導T細胞及/或NK細胞。在說明性實施例中，可使用在範圍之低端為1、2、3、4或5與範圍之高端為3、4、5、6、7、8、9或10 之間的感染倍率(MOI)轉導T細胞及/或NK細胞。
在本文中所揭示之方法及組合物之一些實施例中，可轉導自血液分離之5%與90%之間的總T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，經轉導之T細胞及/或NK細胞的百分比可在範圍之低端為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%與範圍之高端為50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%之間。在一些實施例中，經轉導之T細胞及/或NK細胞的百分比可為至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。
經轉導T細胞及/或NK細胞之擴增
在本文中所揭示之說明性實施例中，可在採集前擴增經轉導T細胞及/或NK細胞。在說明性實施例中，本揭示內容提供用於封閉系統內之單反應器分批饋入過程的方法。在分批饋入過程中，將新鮮介質及/或補充物添加至封閉系統。然而，除用於分析介質及/或細胞之少量樣本(諸如1至2ml或更少樣本)外，在整個方法期間不移除介質或細胞。此有利地降低污染之風險，以及提供具有更少勞力及試劑成本之更簡單的方法。用於轉導T細胞及/或NK細胞之先前方法已包括在活化T細胞及/或NK細胞之間的一或多個步驟期間或之後及在開始採集經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之前(例如，在初始細胞收集步驟之前)洗滌一或多次，其中每次洗滌增加污染之風險以及費用。在本文中所提供之方法的說明性實施例中，在活化T細胞及/或NK細胞之間的任何步驟期間及在開始採集經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞之前(例如，在初始細胞收集步 驟之前)不執行洗滌。
在一些實施例中，可在不離心之情況下執行擴增。在說明性實施例中，可在不離心之情況下執行活化、轉導及擴增。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，可將細胞擴增介質添加至經轉導細胞以執行擴增。在一些實施例中，可將至少100、150、200、250、300、400、500、600、700、750、800或900ml或1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30L之細胞擴增介質添加至經轉導細胞以執行擴增。在一些實施例中，可以至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20倍之係數稀釋經轉導細胞以執行擴增。在一些實施例中，可將介質添加至在活化期間形成之反應混合物。在說明性實施例中，保留或不移除添加至經分離PBMC之介質，直至擴增及採集經轉導細胞。在說明性實施例中，在活化、轉導或擴增期間或之間不移除任何介質。在一些實施例中，在活化、轉導或擴增期間或之間移除少於20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%或0.1%之介質。在一些實施例中，在活化與開始採集之間的方法期間移除的唯一介質為10ml、5ml、2.5ml、2ml或1ml或更少之樣本，以計數或以其他方式評估正經處理之細胞的狀態，或分析介質組成，諸如乳酸鹽濃度。
擴增T細胞及/或NK細胞可在轉導T細胞及/或NK細胞之相同腔室(其在一些實施例中為活化T細胞及/或NK細胞之相同腔室)中進行。在說明性實施例中，腔室可為G-Rex器件或CliniMACS Prodigy器件之腔室。在其他說明性實施例中，在活化、轉導或擴增期間或之間不自腔室移除介質。在一些實施例 中，在先前步驟期間添加至介質之補充物在擴增期間存在於介質中。舉例而言，在一些實施例中，一或多種活化試劑(諸如抗CD3抗體及/或抗CD28抗體)在擴增期間可存在於介質中。因此，活化試劑可以大於在活化期間存在之活化試劑之濃度的1/1,000th、1/500th、1/250th、1/100th、1/50th、1/25th、1/20th或1/10th之濃度存在。在說明性實施例中，在活化步驟期間之任何點處且在擴增步驟開始時進行此活化試劑之濃度的量測。在一些實施例中，抗CD3抗體可在擴增期間，且在說明性實施例中，在開始擴增時以大於在活化期間存在之抗CD3抗體之濃度的1/1,000th、1/500th、1/250th、1/100th、1/50th、1/25th、1/20th或1/10th之濃度存在。在一些實施例中，抗CD28抗體可在開始開始擴增時或在擴增期間以大於在活化期間存在之抗CD28抗體之濃度的1/100th、1/50th、1/25th、1/20th或1/10th之濃度存在於介質中。在一些實施例中，抗CD3抗體及/或抗CD28抗體可在開始擴增時或在擴增期間以等於或小於活化中之初始濃度之5%、10%、15%、20%或25%除以在基礎介質或活化步驟之活化反應混合物之體積與在開始擴增時添加之介質之體積之間的稀釋係數的濃度存在於介質中。不受理論限制，在一些實施例中，認為將藉由經一部分PBMC(諸如單核球)吸收而自介質移除活化試劑中之一些。因此，細胞擴增介質中之一或多種活化試劑之濃度例如可小於活化步驟反應混合物體積相對於擴增介質體積之稀釋係數。然而，若在活化與擴增之間包括一或多次洗滌步驟之方法中的擴增期間存在任何活化試劑，則擴增期間活化試劑之量預期為可偵測的，且比痕量相對高得多。
先前方法已包括在活化PBMC與擴增經轉導T細胞及/或 NK細胞之間，例如在活化與轉導之間及/或在轉導與擴增之間及/或在此等步驟中之任一者期間進行一或多次洗滌。在說明性實施例中，在活化、轉導及擴增期間或之間不執行洗滌。在說明性實施例中，自活化至擴增(且在其他說明性實施例中，至採集)無細胞自封閉系統移除。
通常，在整個本文中所提供之方法的細胞活化、細胞轉導及細胞擴增步驟中存在離體外免疫細胞培養介質，特定而言T細胞及/或NK細胞且更特定而言T細胞介質。在說明性實施例中，在整個細胞活化、細胞轉導及細胞擴增步驟中存在相同基礎介質。此外，在某些說明性實施例中，除NAC之外，相同補充物，包括介質補充物(諸如血清替代物及細胞介素)在細胞活化、細胞轉導及細胞擴增期間存在。舉例而言，在說明性實施例中，在自活化PBMC直至採集經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞的整個方法中存在IL-2及視情況選用之IL-7。在某些說明性實施例中，NAC在擴增期間存在，但在轉導期間不存在，且在活化期間視情況存在。在某些說明性實施例中，除可能存在於基礎介質中之任何NAC之外，補充NAC在擴增期間存在，但在轉導期間不存在，且在活化期間視情況存在。對於細胞擴增，在說明性實施例中，可在轉導之後將介質(本文中亦稱為細胞擴增介質)添加至封閉系統中之腔室。除用於活化步驟之活化試劑的存在、用於轉導步驟之表現載體(諸如非複製勝任型反轉錄病毒顆粒)的存在以及用於擴增之除存在於細胞擴增介質中之任何NAC以外之補充NAC的存在之外，細胞擴增介質之相同組合物可存在於活化、轉導及擴增中。
在說明性實施例中，細胞擴增介質為無血清介質。在說明性實施例中，細胞擴增介質不含天然血清。應理解，天然血清為直接獲自生物體之血清。在其他說明性實施例中，細胞擴增介質可包括血清替代物，如此項技術中所已知。介質可包括基礎介質，諸如用於離體外T細胞及/或NK細胞擴增之可市購介質，諸如(作為非限制性實例)：X-VIVOTM 15 Chemically Defined、Serum-free Hematopoietic Cell Medium(Lonza)(2018目錄號BE02-060F、BE02-00Q、BE-02-061Q、04-744Q或04-418Q)、ImmunoCultTM-XF T Cell Expansion Medium(STEMCELL Technologies)(2018目錄號10981)、PRIME-XV® T Cell Expansion XSFM(Irvine Scientific)(2018目錄號91141)、AIM V® Medium CTSTM(Therapeutic Grade)(Thermo Fisher Scientific(本文中稱為「Thermo Fisher」)或CTSTM OptimizerTM介質(Thermo Fisher)(2018目錄號A10221-01(基礎介質(瓶))及A10484-02(補充物)、A10221-03(基礎介質(袋))、A1048501(基礎介質及補充物套組(瓶))及A1048503(基礎介質及補充物套組(袋))。此介質可為符合cGMP而製造的化學上定義之無血清調配物。介質可為無異源的及完整的。在一些實施例中，基礎介質已由法規機構清除以供用於離體外細胞處理中，諸如FDA 510(k)清除器件。在一些實施例中，介質為具有或不具有2018目錄號A1048501(CTSTM OpTmizerTM T Cell Expansion SFM，瓶型式)或A1048503(CTSTM OpTmizerTM T Cell Expansion SFM，袋型式)(兩者皆可獲自Thermo Fisher(Waltham,MA))之供應T細胞擴增補充物的基礎介質。在本文中應理解(其中敍述細胞擴增介質包含具有目錄號(諸如A1048501或A1048503)之介質補充物的基礎介質之組合物(其 包括介質補充物))，所述組合物意欲意謂具有經添加補充物之介質之組合物。通常，介質及補充物之製造提供待添加之補充體積的說明。
在一些實施例中，介質進一步補充有除具有介質之商用套組中所提供之補充物以外或代替該等補充物的補充物。在一些實施例中，介質可補充有HSA、人類AB+血清、源自供體之血清及/或血清替代物。在說明性實施例中，介質可補充有血清替代物，諸如不含衍生自牛或其他非人類、動物之組分的無異源調配物，諸如CTSTM Serum Replacement(Thermo Fisher)(2018目錄號A2596102)。在一些實施例中，介質可補充有最終濃度為範圍之低端為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或9%與範圍之高端為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之間的HSA、人類AB+血清、源自供體之血清及/或血清替代物。在說明性實施例中，介質可補充有最終濃度為範圍之低端為0.25%、0.5%、1%或1.5%與範圍之高端為1%、1.5%、2%、3%、4%或5%之間的HSA、人類AB+血清、源自供體之血清及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎介質補充有OpTmizerTM CTSTM T-Cell Expansion Supplement(可獲自2018目錄號AF10484-02,Thermo Fisher)及/或L-麩醯胺酸或L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(L-麩醯胺酸之二肽取代物)(參看CTSTM GlutaMAXTM-I Supplement(2018目錄號A1286001,Thermo Fisher))。
在一些實施例中，介質可在擴增之前及/或期間補充有細胞介素，諸如IL-2及/或IL-7.諸如IL-2及/或IL-7之細胞介素通 常不來自相同供體(其為已經轉染或轉導且正經擴增之初始T細胞)，且通常購自商業來源。此項技術中已知之細胞介素有益於生長T細胞及/或NK細胞，包括介白素1(IL-1)、介白素2(IL-2)、介白素4(IL-4)、介白素5(IL-5)、介白素7(IL-7)、介白素15(IL-15)及腫瘤壞死因-α(TNFα)之經分離、野生型或重組形式。可在擴增期間將此等細胞介素中之任一者或此等細胞介素之任何組合添加至介質。在說明性實施例中，IL-2之濃度低於此項技術中之典型濃度。在說明性實施例中，介質中之IL-2之濃度可在範圍之低端為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200或250IU/ml與範圍之高端為10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250或300、400、500、600、700、800、900或1,000IU/ml之間。在一些實施例中，介質中之IL-2之濃度可小於10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250或300IU/ml。在一些說明性實施例中，介質中之IL-2之濃度可在範圍之低端為75、100、125或150IU/ml與範圍之高端為200、250或275IU/ml之間。在一些實施例中，介質中之IL-7之濃度可在範圍之低端為0、0.1、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或45ng/ml與範圍之高端為0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml之間。在一些實施例中，介質中之IL-7之濃度可小於0.1、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml，或IL-7可不存在於細胞擴增介質及在整個方法期間形成的視情況選用之任何介質中。在一些實施例中，自活化PBMC直至採集經基因方式修飾之T細胞 及/或NK細胞可存在IL-2及視情況選用之IL-7。在一些實施例中，介質可在擴增期間多次補充有IL-2及視情況選用之IL-7。在某些說明性實施例中，介質可補充有IL-2，例如每12、24、36或48小時。在說明性實施例中，介質可在開始擴增後24小時及其後每48小時補充有IL-2及視情況選用之IL-7直至採集。
在用於活化、轉導及擴增T細胞及/或NK細胞之先前方法中，介質對於方法之所有步驟含有相同濃度之N-乙醯基-半胱胺酸(NAC)或已完全省略NAC。然而，在本文中所揭示之方法中，除存在於基礎介質中之任何NAC外，發現補充NAC在轉導期間為抑制性的，但在擴增期間為有益的。因此，在本文中所揭示之說明性實施例中，儘管NAC可例如以存在於CTSTM OptimizerTM介質中之NAC之濃度存在於基礎介質中，但補充NAC在活化及轉導T細胞及/或NK細胞期間自介質省略。接著，將補充NAC添加至細胞擴增介質。在一些實施例中，可將至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mM補充NAC添加至介質。因此，在說明性實施例中，細胞擴增介質中之NAC之濃度大於活化及轉導期間的介質中之NAC之濃度。在一些實施例中，可將補充NAC添加至細胞擴增介質，使得存在於細胞擴增介質中之NAC之濃度比在轉導期間存在於介質中之NAC之濃度高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mM。在某些說明性實施例中，細胞擴增介質包含比在轉導反應期間存在之NAC之濃度大5mM與20mM之間、或5mM與15mM之間、或7.5mM與12.5mM之間、或9mM與11mM之間或10mM的NAC之濃度。在某些說明性實施例中，細胞 擴增介質包含比存在於CTSTM OptimizerTM介質中之NAC之濃度大5mM與20mM之間、或5mM與15mM之間、或7.5mM與12.5mM之間、或9mM與11mM之間或10mM的NAC之濃度。在此等實施例中，NAC可不存在於轉導反應混合物及/或活化反應混合物中，或以小於或等於CTSTM OptimizerTM介質中之NAC之濃度的濃度存在於轉導反應混合物及/或活化反應混合物中。
在某些實施例中，在方法中在擴增期間將NAC添加至細胞擴增介質，在該等方法中，自不健康之供體(例如，罹患癌症之供體)富集或分離PBMC。不受理論限制，認為NAC且尤其是除用於轉導反應之基礎介質中之任何NAC以外的補充NAC將尤其有益於來自不健康之供體的T細胞。
在擴增期間，細胞(例如，NK細胞，或NK細胞及T細胞)，或在說明性實施例中，T細胞之數目可比在開始擴增時存在或在活化或轉導期間存在之經分離PBMC或T細胞及NK細胞或T細胞之初始數目增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、110、120、125或130倍(亦即，存在與該等經分離PBMC或T細胞及NK細胞或T細胞之初始數目相比2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、35×、40×、45×、50×、60×、70×、75×、80×、90×、100×、110×、120×、125×或130×一樣多的細胞)。在說明性實施例中，細胞、活細胞、PBMC或T細胞及NK細胞或T細胞之數目可比經分離PBMC或活PBMC之初始數目、或在活化期間存在之PBMC之數目、或在轉導之 後存在之PBMC之數目、或在開始擴增時存在之T細胞及NK細胞或T細胞之數目增加範圍之低端為2.5、5、6、7、8、9、10、15及20倍與範圍之高端為25、30、40、50、60、70、75、80、90、100、110、120、125或130倍之間、或2與10倍之間、或2與75倍之間、或5與75倍之間、或10與60倍之間、或20與50倍之間、2與130倍之間、40與135倍之間、50與135倍之間、50與125倍之間、或50與150倍之間。在其他實施例中，細胞、活細胞、PBMC、T細胞及/或NK細胞之數目可比經分離PBMC或活PBMC之初始數目、或用於活化或用於轉導或在開始擴增時存在的PBMC、T細胞及/或NK細胞之數目增加至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、70、75、80、90、100、110、120、125或130倍，且在擴增期間介質中之IL-2之濃度可小於10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250或300IU/ml，或在50與275IU/ml之間或在150與250IU/ml之間。在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞之數目可比在分離PBMC之後存在的T細胞及/或NK細胞之數目增加至少10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500或1,000倍。在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞可在擴增期間經歷至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次細胞分裂。在說明性實施例中，T細胞及/或NK細胞可在擴增期間經歷至少4、5、6、7、8、9或10次細胞分裂。
細胞擴增可執行一定天數。在一些實施例中，擴增可執行4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20或21天。在一些實施例中，擴增可執行範圍之低端為4、5、6、7或8天與範圍之高端為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天之間。在某些說明性實施例中，擴增執行6與12天之間，或8與10天之間。
細胞採集
在本文中所揭示之方法中之任一者中，在擴增之後，可採集經轉導T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，可在採集期間使用此項技術中已知之方法濃縮或收集經轉導T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，可在封閉系統之相同腔室中執行採集。在於G-Rex中擴增細胞之實施例中，濃縮可包括使用GatheRex機器且自包括T細胞及/或NK細胞之沈澱物移除G-Rex中之上清液。
在一些實施例中，可在採集期間使用此項技術中已知之任何適合洗滌溶液洗滌T細胞及/或NK細胞一或多次。在一些實施例中，洗滌溶液可包括含5%右旋糖之生理鹽水。洗滌溶液可補充有HSA、人類AB+血清、源自供體之血清及/或合成血清替代物。在一些實施例中，可添加HSA、人類AB+血清、源自供體之血清及/或合成血清替代物至範圍之低端為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或9%與範圍之高端為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之間的最終濃度。在說明性實施例中，可用補充有最終濃度為範圍之低端為0.25%、0.5%、1%或1.5% HSA與範圍之高端為1%、1.5%、2%、3%、4%或5% HSA之間的HSA的含5%右旋糖之生理鹽水洗滌T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，洗滌溶 液可補充有碳酸氫鈉(NaHCO3)以將洗滌溶液之pH調節至生理pH或約pH 7.4。
在一些實施例中，可在洗滌一或多次之前在採集期間將T細胞及/或NK細胞轉移至封閉系統之另一腔室。在一些實施例中，可使用Sepax 2系統洗滌T細胞及/或NK細胞。
在採集結束時，可將T細胞及/或NK細胞再懸浮於此項技術中已知之任何適合介質中。在一些實施例中，可將細胞再懸浮於包括含5%右旋糖之生理鹽水的介質中。在一些實施例中，介質可補充有碳酸氫鈉(NaHCO3)以將洗滌溶液之pH調節至生理pH。介質中之碳酸氫鈉(NaHCO3)之用途為此項技術中所熟知的，且可添加其至範圍之低端為1、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50g/L與範圍之高端為2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100g/L之間的最終濃度。在其他說明性實施例中，可將NaHCO3添加至最終再懸浮介質至範圍之低端為1、2.5、5、10或15g/L與範圍之高端為2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50g/L之間的最終濃度。舉例而言，可將NaHCO3添加至最終再懸浮介質至約20g/L之最終濃度。在說明性實施例中，在活化、轉導或擴增T細胞及/或NK細胞時不將NaHCO3添加至介質。
在介質中達到代謝物(諸如乳酸鹽)之預定濃度時，及/或在規定時間段之後，及/或在T細胞及/或NK細胞達到一定密度時，可採集T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，可基於乳酸鹽濃度或直至規定之日執行採集，且無論乳酸鹽濃度如何。
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，可基於擴增完成標準或完成標準執行經擴增T細胞及/或NK細胞之採集。在一些實施例中，擴增完成標準可為或包括乳酸鹽濃度、細胞擴增程度、細胞密度或擴增天數。
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，可基於介質中之乳酸鹽濃度執行經擴增T細胞及/或NK細胞之採集。舉例而言，在一些實施例中，可在介質中之乳酸鹽濃度在範圍之低端為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mM與範圍之高端為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30mM之間時執行採集。在說明性實施例中，可在介質中之乳酸鹽濃度在15與25mM之間、在17.5與22.5mM之間或在19與21mM之間時執行採集。在一些實施例中，可在介質中之乳酸鹽濃度為至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30mM時執行採集。在說明性實施例中，可在介質中之乳酸鹽濃度為至少20mM時執行採集。在一些實施例中，若介質中之乳酸鹽濃度未達到預定濃度，則可在收集血液後7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天執行採集。
亦可在收集血液後一定天數執行細胞採集。在一些實施例中，可在收集血液後7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天執行採集。在一些實施例中，可在範圍之低端為收集血液後7、8、9、10、11、12、13或14天與範圍 之高端為收集血液後10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天之間執行採集。在一些實施例中，可在範圍之低端為擴增開始後6、7或8天及範圍之高端為擴增開始後8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天之間執行採集。
在一些實施例中，在T細胞及/或NK細胞已擴增至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25倍時執行細胞採集。在一些說明性實施例中，在T細胞及/或NK細胞已擴增至少5倍、至少10倍或至少20倍時執行細胞採集。此擴增通常藉由對擴增後所採集之細胞或活細胞與經活化PBMC或活PBMC之總數進行計數來量測。在將供體之所有經分離細胞置放於活化反應混合物中的一些實施例中，擴增可藉由將經分離之PBMC或活PBMC之總數與所採集之細胞或活細胞之數目進行比較來量測。在其他實施例中，藉由對經分離PBMC或活化反應中之T細胞及/或NK細胞與採集時之細胞的總數進行計數，或在說明性實施例中，藉由對採集時之T細胞，或NK細胞，或NK細胞及T細胞之數目進行計數來量測擴增。
亦可在T細胞及/或NK細胞在介質中達到規定細胞密度時執行細胞採集。在一些實施例中，可在細胞密度在範圍之低端為1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107或5×107個細胞/毫升與範圍之高端為2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108或1×109個細胞/毫升之間時執行採 集。在說明性實施例中，可在細胞密度在範圍之低端為5×105、1×106、2.5×106、5×106或1×107個細胞/毫升與範圍之高端為2.5×106、5×106、1×107、2.5×107或5×107個細胞/毫升之間時執行採集。在一些實施例中，可在細胞密度為至少1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108或1×109個細胞/毫升時執行採集。
所採集之T細胞及/或NK細胞之數目可比在PBMC中分離之T細胞及/或NK細胞的初始數目多至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍。在說明性實施例中，所採集之T細胞及/或NK細胞之數目可比在PBMC中分離之T細胞及/或NK細胞的初始數目多至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。
在一些實施例中，所採集之T細胞及/或NK細胞之數目可為至少1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108、1×109、2.5×109、5×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、1×1011、2.5×1011、5×1011、1×1012、2.5×1012、5×1012、1×1013、2.5×1013、5×1013、1×1014、2.5×1014、5×1014或1×1015個T細胞及/或NK細胞。在說明性實施例中，所採集之T細胞及/或NK細胞之數目可為至少1×108、2.5×108、5×108、1×109、2.5×109、5×109、1×1010個T細胞及/或NK細胞。
所採集之細胞可包括不同百分比之T細胞及/或NK細胞。在一些實施例中，所採集之細胞可包括至少50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞及/或NK細胞。在說明性實施例中，所採集之細胞可包括至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞。
在一些實施例中，可將所採集之細胞引入、引回、再引入、輸注或再輸注至供體中。在一些實施例中，可在再引入至供體中之前如下文所描述冷凍保存所採集之細胞。在說明性實施例中，將所採集之細胞引入、引回、再引入、輸注或再輸注至供體中且無需首先冷凍保存該等細胞。供體通常為自其收集血液之相同供體。
貫穿本揭示內容，經轉導T細胞及/或NK細胞包括經轉導細胞之子代，該轉導細胞之子代在離體外轉導期間保留併入至細胞中之核酸中之至少一者。在引用「再引入」經轉導細胞之本文中之方法中，應理解，此細胞在其自供體之血液收集時通常不呈經轉導狀態。
細胞引入/再引入
在本文中所揭示之方法之某些實施例中，在說明性實施例中，針對治療效果，可將所採集之T細胞及/或NK細胞引入、引回、再引入、輸注或再輸注於供體中。待再引入之T細胞及/或NK細胞之數目可為預定劑量，其可為如下文所提供之治療有效劑量。在一些實施例中，預定劑量可取決於在細胞上表現之CAR(例如，在經轉導T細胞及/或NK細胞上表現之抗原特異性靶向區域之親和性及密度)、靶細胞之類型、正經治療之疾 病或病理病況的性質，或兩者之組合。在一些實施例中，所採集之細胞的預定劑量可基於供體之質量，例如每公斤供體之細胞數(細胞/公斤)。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，待引入、再引入或轉移回供體中之T細胞及/或NK細胞之數目可在範圍之低端為1×103、2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106或1×107個細胞/公斤與範圍之高端為5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107或1×108個細胞/公斤之間。在說明性實施例中，待再輸注至供體中之T細胞及/或NK細胞之數目可在範圍之低端為1×104、2.5×104、5×104或1×105個細胞/公斤與範圍之高端為2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105或1×106個細胞/公斤之間。在一些實施例中，待再輸注至供體中之T細胞及/或NK細胞之數目可在範圍之低端為5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107或1×108個細胞與範圍之高端為2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108或1×109個細胞之間。
本文中所揭示之態樣中之任一者中之供體可為例如動物、哺乳動物且在說明性實施例中為人類。在一些實施例中，供體可為健康的。在其他實施例中，供體可為不健康的。在一些實施例中，供體可患有或罹患疾病。在說明性實施例中，疾病可為癌症。多個供體適用於用治療癌症之方法治療。適合供體包括患有癌症、經診斷患有癌症、處於患有癌症之風險、曾患有癌症且處於癌症復發之風險、已用用於癌症之試劑治療且未能對此治療作出反應或已用用於癌症的試劑治療但在對此治療之 初步反應之後復發的任何供體，例如人類或非人類動物。
適用於用免疫調節方法治療之供體包括具有自身免疫疾病之供體；為器官或組織移植接受者及類似者之供體；免疫缺陷之供體；及感染病原體之供體。
細胞冷凍保存
在一些實施例中，可以預定劑量冷凍保存藉由本文中所描述之方法產生的所採集之細胞以供稍後使用。用於冷凍保存細胞之方法及試劑為此項技術中所熟知的。冷凍保存可包括一或多次洗滌及/或用稀釋溶液濃縮T細胞及/或NK細胞之步驟，在說明性實施例中，該稀釋溶液為冷凍保存溶液。在一些實施例中，稀釋溶液可為生理鹽水、0.9%鹽水、PlasmaLyte A(PL)、5%右旋糖/0.45% NaCl鹽水溶液(D5)、人血清白蛋白(HSA)或其組合。在一些實施例中，可將HAS添加至經洗滌及濃縮之細胞，以用於在融解後提高細胞存活率及細胞回收率。在一些實施例中，洗滌溶液可為生理鹽水，且經洗滌及濃縮之細胞可補充有HAS，例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之HAS。方法亦可包括形成冷凍保存混合物之步驟，該冷凍保存混合物包括含T細胞及/或NK細胞之稀釋溶液及適合之冷凍保存溶液。在一些實施例中，冷凍保存溶液可為包括但不限於CryoStor10(BioLife Solution)之任何適合之冷凍保存溶液，其以1：1或2：1之比率與T細胞及/或NK細胞之稀釋溶液混合。在一些實施例中，冷凍保存溶液可包括至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之DMSO。在一些說明性實施例中，冷凍保存溶液包括2.5%與12.5%之間的DMSO 或5%與10%之間的DMSO。在一些實施例中，可添加HAS至在範圍之低端為1%、2%、3%、4%或5%之HSA與範圍之高端為5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%之HSA之間的冷凍保存溶液之最終濃度。在一些實施例中，方法可包括冷凍該冷凍保存混合物之步驟。在一個態樣中，以上文所論述之預定劑量中之任一者使用經定義冷凍週期將冷凍保存混合物冷凍在可控速率冷凍器中。方法可包括將冷凍保存混合物儲存於氣相液氮或液氮中之步驟。
在一些實施例中，預定劑量可為治療有效劑量，其可為如下文所提供之任何治療有效劑量。預定劑量可取決於在細胞上表現之CAR(例如，在細胞上表現之細胞表面受體的親和性及密度)、靶細胞之類型、正經治療之疾病或病理病況的性質，或兩者之組合。在一些實施例中，所採集之細胞的預定劑量可基於供體之質量，例如每公斤供體之細胞數(細胞/公斤)。在一些實施例中，表現CAR之所採集之細胞的預定劑量可在範圍之低端為1×105、2.5×105、5×105、7.5×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106或1×107個細胞/公斤與範圍之高端為2.5×105、5×105、7.5×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107或1×108個細胞/公斤之間。在一些實施例中，所採集之細胞之預定劑量可為至少1×105、2.5×105、5×105、7.5×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、 9×107及1×108個細胞/公斤。
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，可將所採集之細胞冷凍保存於約0.5至200ml之冷凍保存介質中。在一些實施例中，可將所採集之細胞冷凍保存於約0.5ml、約1ml、約5ml、約10ml、約20ml、約30ml、約40ml、約50ml、約60ml、約70ml、約80ml、約90ml或約100ml之冷凍保存介質中。在一些實施例中，可將所採集之細胞冷凍保存於範圍之低端為0.25、0.5、0.75、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、75或100ml冷凍保存介質與範圍之高端為0.5、0.75、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175或200ml冷凍保存介質之間中。在一些實施例中，可在CS250冷凍儲存袋(OriGen Biomedical,Austin,TX)中調配經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞以在含有鹽水(例如，0.9%鹽水)視情況加HAS(例如，5% HAS)或血清替代物之溶液中達成目標濃度，接著用Cryostor 10(BioLife Solutions,Bothell,WA)1：1稀釋。
融解經冷凍保存之T細胞及/或NK細胞的方法為此項技術中所已知的。舉例而言，經冷凍保存之細胞可在37℃下在水浴、珠浴或商用受控融解速率器件中快速融解，並轉移至具有預熱介質之容器。在一些實施例中，可用介質洗滌細胞以移除冷凍保存溶液。在一些實施例中，可允許回收細胞一或多天。在一些實施例中，可在融解後立即使用細胞。
非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，方法可包括用包括一或多個核酸的非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導經活化T細胞及/或NK細胞以產生經轉導T細胞及/或NK細胞的步驟。在一些實施例中，一或多個核酸可編碼接著在經轉導之T細胞及/或NK細胞(例如，嵌合抗原受體(CAR))中表現之一或多個蛋白質。用於在本文中所提供之方法中轉導T細胞及/或NK細胞之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可根據此項技術中已知之方法製得。如本文中所揭示，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒為用於基因遞送之常用工具(Miller，Nature(1992)357：455-460)。非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒將未經排列之核酸序列遞送至廣泛範圍之齧齒動物、靈長類動物及人類體細胞中之能力使得非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒較適用於將基因轉移至細胞。在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可衍生自α反轉錄病毒屬，β反轉錄病毒屬，γ反轉錄病毒屬，δ反轉錄病毒屬，ε反轉錄病毒屬，慢病毒屬或泡沫病毒屬。存在適用於本文中所揭示之方法的許多反轉錄病毒。舉例而言，可使用鼠白血病病毒(MLV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、富士納肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾貝森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)(A-MLV)、禽骨髓細胞病變病毒-29(MC29)及禽紅細胞增生病毒(AEV)。反轉錄病毒之詳細清單可見於Coffin等人之(「Retroviruses」，1997，Cold Spring Harbor Laboratory Press編：J M Coffin,S M Hughes,H E Varmus，第758至763頁)。可在此項技術中找到關於某些反轉 錄病毒之基因組結構的細節。藉助於實例，可自NCBI Genbank(亦即Genome Accession第AF033819號)中找到關於HIV之細節。
在說明性實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可衍生自來自慢病毒屬之重組反轉錄病毒且可為非複製勝任型重組慢病毒顆粒。在一些實施例中，重組反轉錄病毒可衍生自HIV、SIV或FIV。在其他說明性實施例中，重組反轉錄病毒可衍生自慢病毒屬中之人類免疫缺陷病毒(HIV)。慢病毒為複雜的反轉錄病毒，除常見的反轉錄病毒基因gag、pol及env外，亦含有具有調節或結構功能之其他基因。較高複雜性使得慢病毒能夠如在潛伏感染之時程中調節其生命週期。典型之慢病毒為人類免疫缺陷病毒(HIV)，AIDS之病原體。在體內，HIV可感染極少分裂之終末分化的細胞，諸如淋巴球及巨噬細胞。
在一些實施例中，非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可在對非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒製造具有特異性之介質中的培養物中生長。用於使非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒生長之任何適合生長介質及/或補充物可根據本文中所揭示之方法用於非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒接種物中。根據一些態樣，接著可在轉導步驟期間將非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒添加至介質。
可根據此項技術中已知之方法使用哺乳動物細胞株產生非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒。適合之哺乳動物細胞包括原代細胞及固定化細胞株。適合之哺乳動物細胞株包括人類細胞 株、非人類靈長類細胞株、齧齒動物(例如，小鼠、大鼠)細胞株，及類似者。適合之哺乳動物細胞株包括(但不限於)HeLa細胞(例如，美國典型培養物保藏所(ATCC)第CCL-2號)、CHO細胞(例如，ATCC第CRL9618號、第CCL61號、第CRL9096號)、293細胞(例如，ATCC第CRL-1573號)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如，ATCC第CRL-1658號)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如，ATCC第CCLlO號)、PC12細胞(ATCC第CRL1721號)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC第CRL1651號)、RATl細胞、小鼠L細胞(ATCC第CCLI.3號)、人類胚胎腎(HEK)細胞(ATCC第CRL1573號)、HLHepG2細胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK細胞株(例如，NKL、NK92及YTS)，及類似者。在一些情況下，細胞並非固定化細胞株，而為自供體獲得之細胞(例如，原代細胞)或離體細胞。舉例而言，在一些實施例中，細胞為自供體獲得之免疫細胞。作為另一實例，細胞為自供體獲得之幹細胞或祖細胞。
編碼嵌合抗原受體之核酸
在一些實施例中，本揭示內容提供用包括核苷酸序列之一或多個核酸轉導T細胞及/或NK細胞之方法。在一些實施例中，該一或多個核酸包括編碼CAR之核苷酸序列。在一些實施例中，包括編碼CAR之核苷酸序列之核酸將為DNA，包括例如重組表現載體。在一些實施例中，包括編碼CAR之核苷酸序列之核酸將為RNA，例如活體內合成之RNA。
在一些實施例中，核酸提供例如在哺乳動物細胞中產生CAR。在其他實施例中，供體核酸提供編碼CAR之核酸的擴增。
編碼CAR之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件，例如啟動子及增強子等。適合之啟動子及增強子元件為此項技術中所已知的。為在細菌細胞中表現，適合之啟動子包括(但不限於)lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。為在真核細胞中表現，適合之啟動子包括(但不限於)輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及增強子元件；巨細胞病毒立即早期啟動子；單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；早期及晚期SV40啟動子；反轉錄病毒之長末端重複中存在之啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；及此項技術中已知的各種組織特異性啟動子。
適合之可逆啟動子(包括可逆誘導型啟動子)為此項技術中已知的。此等可逆啟動子可分離且衍生自許多生物體，例如真核生物及原核生物。對用於第二生物體中之衍生自第一生物體(例如，第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物等)的可逆啟動子之修飾為此項技術中已知的。此等可逆啟動子，及基於此等可逆啟動子但亦包含其他控制蛋白質之系統包括(但不限於)醇調節啟動子(例如，醇去氫酶I(alcA)基因啟動子、對醇反式活化子蛋白質具有反應性之啟動子(AlcR)等)、四環素調節之啟動子(例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等之啟動子系統)、類固醇調節之啟動子(例如，大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌性激素受體啟動子系統、類視黃素啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、米非司酮啟動子系統等)、金屬調節之啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子系統等)、相關病原調節之啟動子(例如，水楊酸調節之啟動子、乙烯調節之啟動子、苯 並噻二唑調節之啟動子等)、溫度調節之啟動子(例如，熱休克可誘導啟動子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等))、光調節之啟動子、合成可誘導啟動子，及類似者。
在一些情況下，含有適合之啟動子的基因座或構築體或轉基因經由對可誘導系統之誘導來進行不可逆轉換。用於誘導不可逆轉換之適合系統為此項技術中公知的，例如，不可逆轉換之誘導可利用Cre-lox介導之重組(參見例如Fuhrmann-Benzakein等人，PNAS(2000)28：e99)。此項技術中已知的重組酶、內切核酸酶、連接酶、重組位點等之任何適合之組合可用於產生不可逆轉換之啟動子。本文其他處揭示之用於執行位點特異性重組之方法、機制及要求用於產生不可逆轉換之啟動子且為此項技術中所熟知的，參見例如Grindley等人(2006)Annual Review of Biochemistry,567-605及Tropp(2012)Molecular Biology(Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,MA)。
在一些實施例中，CAR由在T細胞及/或NK細胞中有活性之啟動子表現。對於本文中所提供之方法及組合物，熟練的業內人士將認識到，已知啟動子在T細胞及/或NK細胞中有活性且可用於表現第一工程化訊號傳導多肽或第二工程化訊號傳導多肽，或其任何組分。在說明性實施例中，此啟動子在封裝細胞株，諸如用於製備反轉錄病毒(諸如慢病毒)、適用於在本文中所提供之方法中轉導之封裝細胞株中無活性。在一些實施例中，啟動子為EF1α啟動子或鼠幹細胞病毒(MSCV)啟動子(Jones等人，Human Gene Therapy(2009)20：630-40)。在說明性實施例中，啟動子為T細胞特異性CD3 ζ啟動子。
在說明性實施例中，啟動子為CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性粒細胞特異性啟動子或NK特異性啟動子。舉例而言，可使用CD4基因啟動子，參見例如Salmon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7739及Marodon等人(2003)Blood 101：3416。作為另一實例，可使用CD8基因啟動子。NK細胞特異性表現可藉由使用Neri(p46)啟動子來實現；參見例如Eckelhart等人(2011)Blood 117：1565。
編碼CAR之核苷酸序列可存在於表現載體及/或選殖載體中。在CAR包括兩個單獨多肽時，可在相同或不同載體中選殖編碼兩個多肽之核苷酸序列。表現載體可包括選擇性標記、複製源及提供載體之複製及/或維持之其他部件。適合之表現載體包括例如質粒、病毒載體，及類似者。
大量適合之載體及啟動子為熟習此項技術者所已知；許多在商業上可用於產生供體重組構築體。藉助於實例提供以下載體。細菌：pBs、phagescript、PsiXl74、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540，及pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXRl、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG，及pSVL(Pharmacia)。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近之方便限制位點，以提供編碼異源蛋白質之核酸序列之插入。可存在在表現宿主 中操作之可選擇標記。適合之表現載體包括(但不限於)病毒載體(例如，基於以下之病毒載體：痘苗病毒；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6：515 524,1999；Li及Davidson，PNAS 92：7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5：1088 1097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984 and WO 95/00655)；腺相關病毒(參見例如Ali等人，Hum Gene Ther 9：81 86,1998；Flannery等人，PNAS 94：6916 6921,1997；Bennett等人，Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4：683 690,1997，Rolling等人，Hum Gene Ther 10：641 648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5：591 594,1996；WO 93/09239中之Srivastava，Samulski等人，J.Vi(1989)63：3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165；及Flotte等人，PNAS(1993)90：10613-10617)；SV40；單純皰疹病毒；γ反轉錄病毒；人類免疫缺陷病毒(參見例如Miyoshi等人，PNAS 94：10319 23,1997；Takahashi等人，J Virol 73：7812 7816,1999)；反轉錄病毒載體(例如，小鼠白血病病毒、脾壞死病毒及衍生自諸如羅斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺腫瘤病毒之反轉錄病毒的載體)；及類似者。
如上文所提及，在一些實施例中，包括編碼CAR之核苷酸序列之核酸在一些實施例中將為RNA，例如活體外合成之RNA。活體外合成RNA之方法為此項技術中所已知的；可使用任何已知的方法來合成包括編碼CAR之核苷酸序列的RNA。用 於將RNA引入至宿主細胞中之方法為此項技術中所已知的。參見例如Zhao等人(2010)Cancer Res.15：9053。將包括編碼CAR之核苷酸序列的RNA引入至宿主細胞中可在活體外或離體外或活體內進行。舉例而言，可藉由包含編碼CAR之核苷酸序列的RNA對宿主細胞(例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴球等)進行活體外或離體外電穿孔。
嵌合抗原受體
在一些實施例中，用於轉導T細胞及/或NK細胞之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒可包括編碼一或多個嵌合抗原受體(CAR)之一或多個轉錄單元的一或多個核酸。貫穿本揭示內容，為簡單起見，CAR或編碼CAR之聚核苷酸在本文稱為「CAR」。在一些實施例中，CAR包括以下之任何組合：胞外抗原特異性靶向區(ASTR)、柄、跨膜域、胞內活化域及調節域(諸如共刺激域)。在一些實施例中，CAR包括：a)至少一個抗原特異性靶向區(ASTR)；b)跨膜域；及c)胞內活化域。
抗原特異性靶向區(ASTR)
在一些實施例中，CAR可包括特異性結合對之成員，其通常為ASTR，有時在本文中稱作抗原結合域。特異性結合對包括(但不限於)抗原-抗體結合對；配位體-受體結合對；及類似者。因此，適用於CAR中之特異性結合對之成員可包括ASTR，該ASTR為抗體、抗原、配位體、配位體之受體結合域、受體、受體之配位體結合域，以及親和抗體。適用於CAR中之ASTR可為任何抗原結合多肽。在某些實施例中，ASTR可為抗體，諸如全長抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fab'片段、(Fab')2片段、Fv 片段，以及二價單鏈抗體或雙功能抗體。在一些實施例中，ASTR為單鏈Fv(scFv)。在一些實施例中，重鏈位於ASTR中之輕鏈之N端。在其他實施例中，輕鏈位於ASTR中之重鏈之N端。在本文中所揭示之實施例中之任一者中，重鏈及輕鏈可由之連接子隔開，如本文中更詳細論述。在所揭示之實施例中之任一者中，重鏈或輕鏈可在ASTR之N端且通常為另一域(諸如訊號序列或訊號肽)之C端。
其他基於抗體之識別域(cAb VHH(駱駝抗體可變域)及人類化版本、IgNAR VH(鯊魚抗體可變域)及人類化版本、sdAb VH(單一域抗體可變域)及「駱駝化」抗體可變域)適用與CAR一起使用且適用於使用CAR之方法中。在一些情況下，亦適宜使用基於T細胞(TCR)之識別域，諸如單鏈TCR(scTv，含有VαVβ之單鏈兩域TCR)。
適用於CAR中之ASTR可具有多種抗原結合特異性。在一些實施例中，抗原結合域對於由靶細胞表現(由其合成)之抗原中存在的抗原決定基具有特異性。在一個實例中，靶細胞為癌細胞相關之抗原。癌細胞相關之抗原可為與以下相關之抗原：例如乳癌細胞、B細胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤細胞、卵巢癌細胞、前列腺癌細胞、間皮瘤、肺癌細胞(例如，小細胞肺癌細胞)、非霍奇金B細胞淋巴瘤(B-NHL)細胞、卵巢癌細胞、前列腺癌細胞、間皮瘤細胞、肺癌細胞(例如，小細胞肺癌細胞)、黑色素瘤細胞、慢性淋巴細胞白血病細胞、急性淋巴細胞白血病細胞、神經母細胞瘤細胞、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、神經管胚細胞瘤、結腸癌細胞等。癌細胞相關 之抗原亦可由非癌細胞表現。
ASTR可結合之抗原的非限制性實例包括例如CD19、CD20、CD38、CD30、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏著分子、間皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFRvIII、血管內皮生長因子受體-2(VEGFR2)、高分子量黑素瘤相關之抗原(HMW-MAA)、MAGE-Al、IL-13R-a2、GD2、Axl、Ror2，以及類似者。
在一些實施例中，適用於CAR中之特異性結合對之成員可為受體之配位體的ASTR。配位體包括(但不限於)：細胞介素(例如，IL-13等)；生長因子(例如，調節蛋白；血管內皮生長因子(VEGF)；以及類似者)；整合素結合肽(例如，包含序列Arg-Gly-Asp之肽)；以及類似者。
當CAR中之特異性結合對之成員為配位體時，可在特異性結合對之第二成員之存在下活化CAR，其中特異性結合對之第二成員為該配位體之受體。舉例而言，當配位體為VEGF時，特異性結合對之第二成員可為包括可溶性VEGF受體之VEGF受體。
如上文所提及，在一些實施例中，包括於CAR中之特異性結合對之成員為ASTR，該ASTR為受體，例如配位體之受體、共受體等。該受體可為受體之配位體結合片段。適合受體包括(但不限於)：生長因子受體(例如，VEGF受體)；殺手細胞凝 集素樣受體子家族K；成員1(NKG2D)多肽(MICA、MICB及ULB6之受體)；細胞介素受體(例如，IL-13受體；IL-2受體等)；CD27；自然細胞毒性受體(NCR)(例如，NKP30(NCR3/CD337)多肽(HLA-B相關之轉錄物3(BAT3)及B7-H6)之受體等)等。
受微環境限制之生物CAR(MRB-CAR)
在一些情況下，由本揭示內容之方法製備之CAR受微環境限制。此特性通常為CAR之ASTR域之受微環境限制性質的結果。因此，本發明之CAR可具有較低結合親和力或，在說明性實施例中，在目標微環境之條件下比在正常生理環境之條件下可具有針對一或多種靶標抗原之更高結合親和力。此等CAR可稱為受微環境限制之生物CAR或MRB-CAR，或在一些情況下，稱為條件活性CAR或CAB-CAR。在例示性實施例中，使用本文中所提供之方法製備之MRB-CAR具有較低結合親和力，或在某些說明性實施例中，在腫瘤微環境中具有較高結合親和力。
可用於製備ASTR之受微環境限制之抗體片段的方法可用於識別受微環境限制之抗體。舉例而言，可在篩選/淘選之前具有或不具有突變/進化庫之成員之情況下以及需要或不需在視情況選用之重複輪次篩選或淘選期間或之間進行突變/進化之情況下自多肽庫篩選識別受微環境限制之ASTR。用於識別受微環境限制之抗體、抗體片段及ASTR之例示性方法提供於WO2017/165245中。在一些實施例中，可藉由識別生理條件下識別之抗體(亦即，親本，「野生型」或「wt」抗體)之VH及/或VL來獲得MRB-CAR。接著可使抗體進行突變或測試(進 化)。熟練的業內人士可利用8,709,755中所揭示之用於識別條件活性抗體之方法來識別可用於本揭示內容之MRB-CAR之ASTR中之額外條件活性抗體及抗體片段。為了改變開始點(「wt」抗體)之結合特異性，期望突變VH及VL中之任一者或兩者可在MRB-CAR中產生受微環境限制之活性是合理的。然而，為產生受微環境限制之抗體，通常在生理條件下識別VH或VL兩者，且隨後使VH或VL(但通常非兩者)在非生理條件(諸如腫瘤微環境)下突變及測試，以產生條件活性抗體。在某些非限制性說明性實施例中，用於本文中所提供之實施例中之任一者中之MRB-CAR為抗Axl MRB-CAR或抗Ror2 MRB-CAR。
正常生理條件可包括針對供體而言視為在給藥位點或在作用位點之組織或器官處之正常範圍內的溫度、pH、滲透壓、重量莫耳滲透濃度、氧化應激及電解質濃度之彼等條件。異常條件為偏離正常可接受範圍之條件。在一個態樣中，微環境受限之ASTR(亦即多肽)在正常條件下實際上無活性，但在除正常條件以外在與正常條件相同或更好的位準下具有活性。舉例而言，在一個態樣中，受微環境限制之ASTR在體溫下實際上無活性，但在更低溫度下具有活性。在另一態樣中，在正常條件下使受微環境限制之的ASTR可逆地或不可逆地失活。
柄及鉸鏈區
在一些實施例中，CAR可包括位於CAR之部分(位於細胞外部)中且插入於ASTR與跨膜域之間的柄。柄可包括此項技術中已知之免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列；參見例如Tan等人， (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：162；及Huck等人(1986)Nucl.Acids Res.14：1779。在CAR中，所採用之柄允許ASTR及通常整個CAR保持增加與靶標抗原之結合。在一些實施例中，CAR之柄可包括至少一個半胱胺酸。柄區長度可為約4個胺基酸至約50個胺基酸，例如約4 aa至約10 aa、約10 aa至約15 aa、約15 aa至約20 aa、約20 aa至約25 aa、約25 aa至約30 aa、約30 aa至約40 aa或約40 aa至約50 aa。
柄可包括具有人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區之胺基酸序列的鉸鏈區。柄與野生型(天然存在之)鉸鏈區相比可包括一或多個胺基酸取代及/或插入及/或缺失。舉例而言，人類IgG 1鉸鏈之His229可經Tyr取代，使得柄包括序列EPKSCDKTYTCPPCP(參見例如Yan等人(2012)J.Biol.Chem.287：5891)。柄可包括來源於人類CD8之胺基酸序列。
跨膜域
CAR可包括用於插入至真核細胞膜中之跨膜域。跨膜域可插入在ASTR與共刺激域之間。跨膜域可插入在柄與胞內活化域(IAD)或共刺激域(CSD)之間，使得嵌合抗原受體自胺基端(N端)至羧基端(C端)依次可包括：ASTR、柄、跨膜域以及活化域。提供將多肽插入至真核(例如，哺乳動物)細胞之細胞膜中的任何跨膜(TM)域適用於本文中所揭示之態樣及實施例中。作為非限制性實例，跨膜域可與CD8 β跨膜域、CD4跨膜域、CD3 ζ跨膜域、CD28跨膜域、CD134跨膜域或CD7跨膜域具有至少80%、90%或95%序列一致性。
胞內活化域
適用於CAR中之胞內活化域(IAD)在活化後通常誘導產生一或多種細胞介素；經增加之細胞死亡；及/或CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、自然殺手T細胞、γδ T細胞及/或嗜中性細胞之經增加增殖。胞內活化域在本文中亦可稱為活化域(activating domain/activation domain)。在一些實施例中，IAD可包括如下文所描述之至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個等)ITAM基元。在一些實施例中，IAD可包括DAP10/CD28型訊號傳導鏈。作為非限制性實例，CAR之IAD可為CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、DAP12、FCERlG、DAP10/CD28或ZAP70活化域。
適用於CAR中之IAD可包括含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)之胞內訊號傳導多肽。ITAM基元為YX1X2L/I，其中X1及X2獨立地為任何胺基酸。在一些實施例中，CAR之胞內活化域包括1個、2個、3個、4個或5個ITAM基元。在一些實施例中，ITAM基元在胞內活化域中重複兩次，其中ITAM基元之第一個例與第二個例彼此由6個至8個胺基酸(例如，(YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I)，其中n為整數6至8，且6個至8個X3中之每一者可為任何胺基酸)分隔開。在一些實施例中，CAR之IAD包括3個ITAM基元。
合適之IAD可為含有ITAM基元之部分，該部分來源於含有ITAM基元之多肽。舉例而言，合適之IAD可為來自任何含有ITAM基元之蛋白質的含有ITAM基元之域。因此，合適之IAD不需要含有其源自之整個蛋白質的整個序列。合適之IAD 及含有ITAM基元之多肽的實例包括(但不限於)：T細胞表面糖蛋白CD3Z(亦稱為CD3 ζ鏈、T細胞受體T3 ζ鏈、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)；CD3D(亦稱為CD3 δ、CD3-δ、T3D、CD3抗原、δ子單元、CD3d抗原、δ多肽(TiT3複合物)、OKT3 δ鏈、T細胞受體T3 δ鏈、T細胞表面糖蛋白CD3 δ鏈等)；CD3E(亦稱為CD3 ε鏈、T細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈、T細胞表面糖蛋白CD3 ε鏈、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)；CD3G(亦稱為T細胞表面糖蛋白CD3 γ鏈、T細胞受體T3 γ鏈、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3複合物)等)；CD79A(亦稱為B細胞抗原受體複合物相關之蛋白質α鏈；CD79a抗原(免疫球蛋白相關之α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜結合之免疫球蛋白相關之蛋白質；表面IgM相關之蛋白質；抗原受體複合物相關之蛋白質α鏈等)；DAP12(亦稱為TYROBP；TYRO蛋白質酪胺酸激酶結合蛋白質；KARAP；PLOSL；DNAX活化蛋白質12；KAR相關蛋白質；TYRO蛋白質酪胺酸激酶結合蛋白質；殺傷活化受體相關之蛋白質；殺傷活化受體相關之蛋白質等)；以及FCERlG(亦稱為FCRG；Fc ε受體I γ鏈；Fc受體γ鏈；fc-ε RI-γ；fcRγ；fceRI γ；高親和性免疫球蛋白ε受體子單元γ；免疫球蛋白E受體、高親和性γ鏈等)。
調節域
調節域可改變CAR中之IAD之作用，包括增強或抑制IAD之下游作用或改變反應之性質。適用於本發明之CAR中之調節域包括共刺激域(CSD)。適合於CAR中之包涵體之調節域或共刺激域之長度可為約30個胺基酸至約70個胺基酸(aa)，例如，調節域之長度可為約30 aa至約35 aa、約35 aa至約40 aa、 約40 aa至約45 aa、約45 aa至約50 aa、約50 aa至約55 aa、約55 aa至約60 aa、約60 aa至約65 aa或約65 aa至約70 aa。在其他情況下，調節域之長度可為約70 aa至約100 aa、約100 aa至約200 aa，或大於200 aa。
CSD通常增強及/或改變活化域之活化之反應的性質。適用於CAR中之CSD通常為衍生自受體之多肽。在一些實施例中，CSD同源二聚化。在一些實施例中，CSD可為跨膜蛋白質之胞內部分(亦即，CSD可衍生自跨膜蛋白質)。合適之共刺激多肽之非限制性實例包括(但不限於)：4-lBB(亦稱為TNFRSF9；CD137；CDwl37；ILA等)、CD27(亦稱為S 152、T 14、TNFRSF7及Tp55)、CD28(亦稱為Tp44)、用於Lck結合(IC△)缺失之CD28、ICOS(亦稱為AILIM、CD278及CVIDl)、OX40(亦稱為TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX-40、TXGPlL)、BTLA(亦稱為BTLAl及CD272)、CD30(亦稱為TNFRSF8、DlS166E及Ki-1)、GITR(亦稱為TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357及GITR-D)以及HVEM(亦稱為TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR及TR2)。舉例而言，CSD可與4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用於Lck結合(IC△)缺失之CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM之CSD具有至少80%、90%或95%序列一致性。
連接子
在一些實施例中，CAR可包括在任何兩個相鄰域之間的連接子。舉例而言，連接子可在跨膜域與CSD之間。作為另一實 例，ASTR可為抗體，且連接子可在重鏈與輕鏈之間。作為另一實例，連接子可在ASTR與跨膜域及共刺激域之間。作為另一實例，連接子可在第二多肽之共刺激域與胞內活化域之間。作為另一實例，連接子可在ASTR與胞內訊號傳導域之間。
連接子肽可具有多種胺基酸序列中之任一者。蛋白質可藉由通常具有可撓性性質之間隔肽連接，但不排除其他化學鍵。連接子可為長度在約1個與約100個胺基酸之間，或長度在約1個與約25個胺基酸之間的肽。此等連接子可藉由使用合成的編碼連接子之寡核苷酸偶合該等蛋白質來產生。可使用具有一定程度可撓性之肽連接子。連接肽可實際上具有任何胺基酸序列，考慮到合適之連接子將具有產生通常可撓性肽的序列。較小胺基酸(諸如甘胺酸及丙胺酸)之用途為用於創建可撓性肽。此類序列之創建對於熟習此項技術者而言為常規的。
合適之連接子可易於選擇且可為合適之不同長度中之任一者，諸如1個胺基酸(例如，Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸，且可為1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個胺基酸。例示性可撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、GSGGSn、GGGSn及GGGGSn，其中n為至少一之整數)，甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物，及此項技術中已知之其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物是令人感興趣的，此是由於此等胺基酸之兩者均為相對非結構化的，且因此可作為 組分之間的中性鏈。甘胺酸聚合物尤其令人感興趣，此是由於甘胺酸比甚至丙胺酸具有顯著更多的phi-psi空間，且比具有較長側鏈之殘基受到更少限制(參見Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。一般熟練技術人員將認識到，將肽結合至上文所描述之任何元件的設計可包括為完全或部分可撓性的連接子，使得連接子可包括可撓性連接子以及賦予較低可撓性結構之一或多個部分。
識別域或消除域
本文中所提供之非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒中之任一者可包括編碼識別或消除域之核酸，該識別域或消除域作為編碼本文中所提供之工程化訊號傳導多肽中之任一者的核酸之部分或與其隔開。因此，本文中所提供之工程化訊號傳導多肽中之任一者可包括識別域或消除域。舉例而言，本文中所揭示之CAR中之任一者可包括識別域或消除域。此外，識別域或消除域可與本文中所揭示之淋巴增殖性元件中之任一者一起表現，或甚至與其融合。識別域或消除域在T細胞及/或NK細胞上表現，但不在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒上表現。
在一些實施例中，識別域或消除域可來源於單純皰疹病毒衍生的酶胸苷激酶(HSV-tk)或誘導型半胱天冬酶-9。在一些實施例中，識別域或消除域可包括經修飾之內源細胞表面分子，例如如美國專利第8,802,374號中所揭示。經修飾之內源細胞表面分子可為任何細胞表面相關之受體、配位體、糖蛋白、細胞黏著分子、抗原、整合素或經修飾之分化簇(CD)。在一些實施例中，經修飾之內源細胞表面分子為經截斷之酪胺酸激 酶受體。在一個態樣中，經截斷之酪胺酸激酶受體為表皮生長因子受體(EGFR)家族中之成員，例如ErbB1、ErbB2、ErbB3及ErbB4。在一些實施例中，識別域可為由抗體識別之多肽，該抗體識別EGFR成員之胞外域。在一些實施例中，識別域可為EGFR家族成員之至少20個連續胺基酸，或在例如EGFR家族成員之20個與50個連續胺基酸之間。舉例而言，SEQ ID NO：78為由識別EGFR成員之胞外域的抗體結合且在適當條件下識別的例示性多肽。此類胞外EGFR抗原決定基在本文中有時稱為eTag。在說明性實施例中，此等抗原決定基由可市購抗EGFR單株抗體識別。
使用由本文中所提供方法產生細胞之方法
在一些實施例中，本揭示內容提供用於經基因方式修飾且擴增可用於多種治療方法中之T細胞及/或NK細胞的方法。在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞可經基因方式修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)且由此可用於CAR-T療法中。CAR及MRB-CAR不限用於治療腫瘤，而是可適用於一或多種病症，包括治療循環障礙、關節炎、多發性硬化症、自身免疫疾病、癌症、皮膚疾病及用於多種診斷型式。
在本文中所揭示之實施例中之任一者中，在將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至供體至中之前，供體可根據此項技術中已知之方法來進行淋巴消耗。典型地，將淋巴消耗劑投與至供體以對供體進行淋巴消耗。在本文之說明性實施例中，供體在細胞擴增達到擴增進展標準時在淋巴消耗時間點處經淋巴消耗。擴增進展標準可選自超出臨限值(例如，1mM、 2mM、2.5mM、5mM或10mM)之細胞擴增介質中之乳酸濃度。在其他實施例中，擴增進展標準為超出某一臨限水準之(倍數)擴增(諸如2、3、4、5、10、15或20倍擴增)之細胞擴增水準。在其他實施例中，擴增進展標準為超出臨限值之擴增期間的細胞密度。在又其他實施例中，擴增進展標準為預定天數之擴增。此等說明性實施例具有優於先前方法之優點，即確保協調且同步將投與經擴增T細胞之供體的T細胞擴增及淋巴消耗。
使用本文中所提供之方法，T細胞及/或NK細胞可經包括編碼CAR之核苷酸序列之一或多種核酸轉導。當存在於T細胞及/或NK細胞上時，CAR可介導對靶細胞之細胞毒性。CAR可與存在於靶細胞上之抗原結合，由此藉由經基因方式修飾以產生CAR之T細胞或NK細胞來介導靶細胞之殺傷。CAR之ASTR與存在於靶細胞之表面上之抗原結合。此等方法包括CAR-T療法。
靶細胞包括(但不限於)癌細胞。因此，本揭示內容提供殺傷或抑制靶癌細胞之方法，該方法涉及接觸經基因方式修飾以產生CAR之細胞毒性免疫效應細胞(例如，細胞毒性T細胞或NK細胞)，使得T細胞及/或NK細胞識別存在於靶癌細胞之表面上之抗原，且介導靶細胞之殺傷。
本揭示內容提供一種治療患有癌症之供體之癌症的方法。因此，本揭示內容提供用於抵抗癌症之過繼性細胞療法的方法。因此，在一個態樣中，該方法包括以下：a.將經組態以表現 編碼如本文中所提供之CAR之聚核苷酸序列的表現載體引入至獲自供體之PBMC中以產生經基因方式工程化之細胞毒性細胞(諸如，T細胞及/或NK細胞)；及b.向供體投與該經經基因方式工程化之細胞毒性細胞。CAR可為本文中所揭示之CAR中之任一者。可根據本文中所提供之方法藉由用載體轉導T細胞及/或NK細胞而將編碼CAR之表現載體引入至PBMC中。在某些說明性實施例中，載體可為非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒(在一些實施例中可為非複製勝任型重組慢病毒顆粒)。在一些實施例中，用本文中所揭示之CAR轉導供體之T細胞及/或NK細胞且接著向供體投與該等經轉導T細胞及/或NK細胞。
可適於由本文中所揭示之方法治療的癌包括(但不限於)食管癌、肝細胞癌、基底細胞癌(皮膚癌之形式)、鱗狀細胞癌(各種組織)、膀胱癌(包括移行細胞癌(惡性膀胱腫瘤))、支氣管癌、結腸癌、大腸癌、胃癌、肺癌(包括小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、腎細胞癌、原位管癌或膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆式腫瘤(Wilm's tumor)、宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、成骨癌、上皮癌及鼻咽癌。
可適於由本文中所揭示之方法治療的肉瘤包括(但不限於)纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因式肉瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤及其他軟組織肉瘤。
可適於由本文中所揭示之方法治療的其他固體腫瘤包括(但不限於)神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。
可適於由本文中所揭示之方法治療的白血病包括(但不限於)a)慢性骨髓增生性症候群(多潛能造血幹細胞之贅生性病症)；b)急性骨髓性白血病(多潛能造血幹細胞或限制譜系潛能之造血幹細胞之贅生性轉化)；c)慢性淋巴球白血病(CLL；免疫不成熟及功能不全小淋巴球之克隆增殖)，包括B細胞CLL、T細胞CLL幼淋巴球白血病及毛細胞白血病；及d)急性淋巴球白血病(其特徵為淋巴母細胞之累積)。可使用標的方法治療之淋巴瘤包括(但不限於)B細胞淋巴瘤(例如，伯基特式淋巴瘤(Burkitt's lymphoma))；霍奇金式淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；非霍奇金式淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)及其類似者。
可適於根據本文中所揭示之方法治療之其他癌症包括非典型脊膜瘤(頭)、胰島細胞癌(胰臟)、髓樣癌(甲狀腺)、間質瘤(腸)、肝細胞癌(肝)、肝母細胞瘤(肝)、透明細胞癌(腎)及神經纖維瘤縱膈。
在一些實施例中，將表現CAR細胞之T細胞及/或NK細胞作為佐劑療法投與至標準癌症療法。標準癌症療法包括手術(例 如，手術移除癌組織)、放射療法、骨髓生物移植、化學治療、抗體治療、生物反應修飾治療及前述之某些組合。標準癌症療法在此項技術為熟知的。放射療法包括(但不限於)自諸如光束之外部應用源或藉由植入較小放射源遞送之x射線或γ射線。
基因方式工程化之T細胞及/或NK細胞及細胞群
在一些態樣中，本文提供一種經基因方式工程化及/或經分離之T細胞或NK細胞，或經基因方式工程化之T細胞及/或NK細胞群，或經基因方式工程化之NK細胞群，或在說明性實施例中，使用本文中所提供之方法所產生之經基因方式工程化之T細胞群。此細胞或群可在化學限定之介質(諸如用於本文中所提供之方法中之介質)中。此細胞或群典型地發現於包含IL-2，且在一些實施例中包含IL-7之介質中，典型地為不為來自與T細胞及/或NK細胞之原始來源相同之供體的IL-2及IL-7，且在其他說明性實施例中，重組IL-2及IL-7。在一些實施例中，包括NK T細胞之由本文中之方法產生之細胞群大於75%、80%、85%、90%、或95%之T細胞。在一些實施例中，由本文中之方法產生之細胞群包括10%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、2%或更少、1%或更少之NK細胞，或範圍之低端為0.2、03、0.4或0.5% NK細胞與範圍之高端為0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、5或10% NK細胞之間。
在一些實施例中，由本文中之方法提供之經基因方式工程化之T細胞群在5% NK T細胞與20% NK T細胞之間。在一些實施例中，由本文中之方法提供之經基因方式工程化之T細胞群在5% NK T細胞與20% NK T細胞之間、在5%至30% CD4+ T細胞與60%至90% CD8+ T細胞之間。在某些實施例中，T細胞群之比率為1：1或在說明性實施例中，與CD4陽性細胞相比至少兩倍、2.5倍或三倍一樣多的CD8陽性細胞。舉例而言，經基因方式工程化之T細胞群中之CD8細胞與CD4細胞之比率可藉由在活性反應混合物中使用抗CD3及抗CD28兩者來朝向1：1轉變。
在一些實施例中，經基因方式工程之化T細胞群包含多於75%、80%、85%、90%或95%之T細胞，及30%與90%之間、或30%與80%之間、或30%與75%之間或30%或70%之間的經基因方式工程化之T細胞。在一些實施例中，經基因方式工程化之T細胞群包含範圍之低端為70%、75%、80%或85%之T細胞与範圍之高端為90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%之T細胞(經基因方式工程化與未經基因方式工程化)之间。在一些實施例中，經基因方式工程化之T細胞群包含在範圍之低端為20%、25%、30%、35%或40%與45%、50%、60%、70%及75%之間的經基因方式工程化之T細胞。
說明性實施例中之此等經基因方式工程化之T細胞及/或NK細胞經工程化，使得其之基因組包含編碼CAR之核酸。因此，在一些實施例中，經基因方式工程化之T細胞及/或NK細胞表現CAR。在一些實施例中，經基因方式工程化之細胞為T細胞。在一些實施例中，經基因方式工程化之T細胞群包含範圍之低端為20%、25%、30%、35%或40%與範圍之高端為45%、50%、60%、70%及75%之間的表現CAR之經基因方式工程化之T細胞。該CAR可包含本文中所揭示之CAR組分中之任一 者。在一些實施例中，T細胞及/或NK細胞表現消除域。在一些實施例中，該消除域為e-TAG。
在一些實施例中，本文中所提供之經基因方式工程化之T細胞及/或NK細胞或其群在化學限定培養介質中，該培養介質可在例如腔室或封閉細胞處理系統中，或在細胞收集袋中。在其他實施例中，經基因方式工程化之T細胞及/或NK細胞或其群在商購冷凍介質或部分由此商購冷凍介質組成之介質中。
例示性實施例
本文中所提供之實施例中之一些包括以下。
實施例1A1.一種用於自經分離血液轉導T細胞及/或NK細胞之方法，該方法包含：a)富集周邊血液單核細胞(PBMC)以將包含T細胞及/或NK細胞之PBMC自經分離血液分離；b)在封閉系統內在有效條件下活化經分離PBMC之T細胞及/或NK細胞且不富集來自其他PBMC之T細胞及/或NK細胞，該系統包含含有效量之抗CD3抗體的溶液；及c)在有效條件下用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導經活化T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其中，活化及轉導是在相同封閉系統內執行且不在活化與轉導之間洗滌細胞。
實施例1A2.如實施例1A1之方法，其進一步包含將細胞擴增介質中之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞擴增至超出 150ml之體積及選自超出10mM之乳酸濃度、T細胞及/或NK細胞之至少5倍擴增及在細胞擴增介質中至少10天的擴增完成選擇標準。
實施例1A3.如實施例1A1之方法，其中擴增在與活化及轉導相同之封閉系統之相同腔室內執行。
實施例1A4.如實施例1A2之方法，其中執行擴增，且無需在轉導與擴增之間洗滌細胞。
實施例1A5.如實施例1A2之方法，其中擴增完成選擇標準為T細胞及/或NK細胞之至少10倍擴增。
實施例1B1.一種用於自經分離血液轉導T細胞及/或NK細胞之方法，該方法包含：a)富集周邊血液單核細胞(PBMC)以自經分離血液分離包含T細胞及/或NK細胞之PBMC；b)在封閉系統之腔室內在有效條件下活化該等經分離PBMC之T細胞及/或NK細胞，該系統包含有效量之抗CD3抗體及/或有效量之抗CD28；c)在有效條件下，用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導經活化T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；及d)將細胞擴增介質中之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞擴增至超出150ml之體積及選自超出10mM之乳酸濃度、T細胞及/或NK細胞之至少10倍擴增及在細胞擴增介質中至少 4天的擴增完成選擇標準，其中活化、轉導及擴增在腔室中執行，且無需在活化、轉導及擴增之間或期間洗滌細胞。
實施例1C1.一種用於自經分離血液轉導T細胞及/或NK細胞之方法，該方法包含：a)富集周邊血液單核細胞(PBMC)以自經分離血液分離包含T細胞及/或NK細胞之PBMC；b)在封閉系統內在有效條件下活化經分離PBMC之T細胞及/或NK細胞，該系統包含有效量之抗CD3抗體及/或有效量之抗CD28；c)在有效條件下，用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導經活化T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞；及d)將細胞擴增介質中之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞擴增至超出150ml之體積及選自超出10mM之乳酸濃度、T細胞及/或NK細胞之至少10倍擴增及在細胞擴增介質中至少10天的擴增完成選擇標準，其中抗CD3抗體及/或抗CD28存在於包含經擴增T細胞及/或NK細胞之細胞擴增介質中。
實施例1D1.一種用於自經分離血液轉導T細胞及/或NK細胞之方法，該方法包含：a)富集周邊血液單核細胞(PBMC)以自經分離血液分離包含T細胞及/或NK細胞之PBMC；b)在封閉系統內在有效條件下活化經分離PBMC之T細胞及/或NK細胞，該系統包含反應混合物，該反應混合物包含基礎細胞培養介質及有效量之抗CD3抗體及/或有效量之抗 CD28；c)在有效條件下，用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導經活化T細胞及/或NK細胞，由此產生經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其中活化及轉導在相同封閉系統內執行且其中轉導在藉由將非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒添加至反應混合物而活化後來執行；及d)將細胞擴增介質中之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞擴增至超出150ml之體積及選自超出10mM之乳酸濃度、T細胞及/或NK細胞之至少10倍擴增及在細胞擴增介質中至少10天的擴增完成選擇標準，其中細胞擴增介質包含基礎細胞培養介質及除該基礎細胞培養介質中存在之任何NAC以外的補充N-乙醯基半胱胺酸(NAC)，且其中在轉導期間不存在補充NAC。
實施例1D2.除非另外明確地敍述，否則根據實施例1C1或1D1，或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中多於1/1,000th、1/500th、1/250th、1/100th、1/50th或1/20th濃度之抗CD3抗體及/或抗CD28抗體存在於細胞擴增介質中，如存在於其中執行活化之活化反應混合物中。
實施例2.除非另外明確地敍述，否則如實施例1A2、1B1、1C1或1D1中之任一者，或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中執行擴增在，且無需在擴增期間之任何時間點處移除大於1%、2%、5%、10%、15%或20%之細胞擴增介質。
實施例3.如實施例1A2、1C1或1D1中之任一者，或本文 中所提供之任何其他實施例之方法，其中活化、轉導及擴增在相同腔室中執行，且無需在開始活化與完成至少7天擴增細胞擴增介質中之T細胞及/或NK細胞之間自腔室移除T細胞及/或NK細胞。
實施例4.除非另外敍述，否則根據實施例1A2、1B1或1C1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中將N-乙醯基半胱胺酸(NAC)添加至細胞擴增介質，其中該細胞擴增介質包含大於存在於執行轉導反應之轉導反應混合物中之NAC之濃度的NAC之濃度。
實施例5.根據實施例4之方法，其中NAC以比存在於轉導反應混合物中之NAC之濃度大5mM與20mM之間、5mM與15mM之間、7.5mM與12.5mM之間或9mM與11mM之間的濃度存在於細胞擴增介質中。
實施例6.如實施例1A2、1B1、1C1或1D1中之任一者或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中在活化期間，介質中不存在胺基雙磷酸鹽。
實施例7.如實施例1A2、1B1、1C1或1D1中之任一者或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中血清不存在於細胞擴增介質中。
實施例8.如實施例4或實施例1D1或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中PBMC自除健康供體以外之其他供體 分離。
實施例9.如實施例4、實施例8或實施例1D1，或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中未詳細指出供體患有某一種疾病，其中PBMC自診斷患有癌症之供體分離。
實施例10.如實施例1A1、1B1、1C1或1D1中之任一者或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中用於活化步驟之有效條件包含5×104PBMC/ml與4×106PBMC/ml之間的經分離PBMC之濃度。
實施例11.如實施例1A1、1B1、1C1或1D1中之任一者或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中用於活化步驟之有效條件包含培育經分離PBMC持續4小時與48小時之間或6小時與24小時之間或6小時與12小時之間。
實施例12.除非另外明確地敍述，否則如實施例1A1、1B1、1C1或1D1中之任一者或本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中經活化細胞包含T細胞。
實施例13.除非另外明確地陳述，否則如實施例1A2、1B1、1C1或1D1中之任一者或任何其他實施例之方法，其中活化及擴增在有效量之IL-2之存在下發生。
實施例14.如實施例13之方法，其中有效量之IL-2在25IU/ml與299IU/ml之間。
實施例15.如實施例13之方法，其中IL-2針對活化及擴增以低於300國際單位/毫升之濃度存在。
實施例16.如實施例13之方法，其中IL-2在開始擴增時存在於細胞培養介質中且在擴增期間至少兩次添加至細胞擴增介質。
實施例17.如實施例13之方法，其中IL-2在開始擴增時存在於細胞培養介質中且在擴增期間每兩至三天添加至細胞擴增介質。
實施例18.如實施例13之方法，其中IL-2在開始擴增時存在於細胞培養介質中且在擴增之第二天與第五天之間添加至細胞擴增介質。
實施例19.如實施例15至18中之任一者之方法，其中IL-7在擴增步驟期間存在於細胞培養介質中。
實施例20.如實施例14或15之方法，其中將T細胞及/或NK細胞自活化步驟中之T細胞及/或NK細胞之數目擴增至少20倍。
實施例21.如實施例14或15之方法，其中將T細胞及/或NK細胞自活化步驟中之T細胞及/或NK細胞之數目擴增至少25倍。
實施例22.根據本文中所提供之實施例中之任一者之方法，其中非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒各自包含反轉錄病毒基因組，該反轉錄病毒基因組包含可操作地連接至在T細胞及/或NK細胞中有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中該一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體包含：a)抗原特異性靶向區(ASTR)；b)跨膜域；及c)胞內活化域。
實施例23.如實施例22之方法，其中ASTR為受微環境限制之ASTR(MRB-ASTR)。如將理解，MRB-ASTR在存在於靶標微環境中之情況下比在存在於正常生理環境中之條件下展現與一或多個靶標抗原之經增加結合。在一些實施例中，MRB-ASTR在諸如pH為6.7之靶條件下與Axl或Ror2結合。
實施例24.如實施例23之方法，其中該條件選自由以下個者組成之群：溫度、pH、滲透壓、重量莫耳滲透濃度、氧化應激及電解質濃度。
實施例25.如實施例24之方法，其中該條件為pH。
實施例26.如實施例23至25中之任一者之方法，其中MRB-ASTR相較於7.4之pH，在6.7之pH下展現與其同源靶標抗原之經增加結合。
實施例27.除非另外明確地敍述，否者根據實施例1B1、1C1或1D1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中活化在含抗CD3抗體之溶液中之存在下執行。
實施例28.除非另外明確地敍述，否者如實施例1A1、1B1、1C1或1D1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中活化在在連接至固體載體之抗CD3抗體及/或連接至合成固體載體之抗CD28之缺失下執行。
實施例29.除非另外明確地敍述，否者如實施例1A2、1B1、1C1或1D1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中用於轉導之有效條件包含在添加細胞擴增介質之前在非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之存在下培育T細胞及/或NK細胞6小時與36小時之間。
實施例30.除非另外明確地敍述，否者如實施例1A2、1B1、1C1或1D1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中方法進一步包含在擴增後採集經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
實施例31.如實施例30之方法，其中採集在細胞擴增介質中之乳酸鹽之濃度達到10mM與30mM之間時執行。
實施例32.如實施例30之方法，其中採集在收集血液之12天內執行。
實施例33.除非另外明確地敍述，否者根據實施例1A2、1B1、1C1或1D1或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其進一步包含在細胞經擴增10天與14天之間時採集經擴增T細胞及/或NK細胞。
實施例34.如實施例30之方法，其中在自開始活化直至開始採集時執行方法之期間，移除不多於1%、2%、2.5%、5%或10%之介質。
實施例35.除非另外明確地敍述，否者根據實施例1B1、1C1或1D1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中執行方法且無需在活化步驟之前富集來自其他PBMC之T細胞及/或NK細胞。
實施例36.除非另外明確地敍述，否者如實施例1A2、1B1、1C1或1D1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中擴增在可透氣之封閉系統內在剛性細胞培養容器內執行。
實施例37.除非另外明確地敍述，否則如實施例1A1、1B1、1C1或1D1中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中重組人類纖維結合蛋白在活化及/或轉導期間不存在。
實施例38.如實施例36之方法，其中活化、轉導及擴增在 封閉系統內在相同剛性細胞培育容器內執行。
實施例39.如實施例38之方法，其中T細胞及/或NK細胞在自開始活化至完成擴增步驟之任何時間點處不自剛性細胞培育容器移除。
實施例40.如實施例30之方法，其中細胞在經轉導T細胞及/或NK細胞擴增至少10倍時採集。
實施例41.除非另外明確地敍述，否則根據前述實施例中之任一者或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其中經活化、經轉導及經擴增細胞包含至少60%、70%、75%、80%、85%或90%之T細胞。
實施例42.一種經修飾T細胞，其藉由本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法產生。
實施例43.一種經修飾NK細胞，其藉由本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法產生。
實施例44.實施例30至33中之任一者之方法，其進一步包含冷凍保存所採集之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
實施例45.如實施例44之方法，其中融解經冷凍保存之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
實施例46.實施例30至33及45中之任一者之方法，其進一步包含將所採集之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞引入至供體中。
實施例47.除非另外明確地敍述，否則如實施例46或根據本文中所提供之任何其他實施例之方法，其進一步包含自供體收集血液以獲得經分離血液。
實施例48.如實施例47之方法，其中將所採集之經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞再引入至收集血液之供體中。
實施例49.如實施例48之方法，其中在擴增達到或超出擴增進展標準時供體在所達到之淋巴消耗時間點處經淋巴消耗。
實施例50.如實施例49之方法，其中擴增進展標準選自超出1mM之細胞擴增介質中之乳酸濃度、T細胞及/或NK細胞之至少2倍擴增或之擴增天數之預定數目。
實施例51.如實施例49之方法，其中供體在細胞擴增介質中之乳酸濃度超出5mM時經淋巴消耗。
實施例52.如實施例49之方法，其中供體在細胞擴增介質中之乳酸濃度超出10mM時經淋巴消耗。
實施例53.如實施例49之方法，其中供體在細胞擴增介質中之乳酸濃度超出20mM時經淋巴消耗。
實施例54.如實施例49之方法，其中當達到超過在活化開始或期間或轉導開始時存在之PBMC之數目的細胞、存活細胞、PBMC、T細胞及NK或T細胞之至少2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍擴增時，供體經淋巴消耗。
實施例55.除非另外敍述，否者根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中供體罹患癌症。
實施例56.如實施例46至54中之任一者之方法，其中該方法經執行以治療供體所罹患之癌症。
實施例57.如實施例56之方法，其中該疾病為癌症。
實施例58.除非另外明確地敍述，否者根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中在無需離心之情況下執行轉導。
實施例59.除非另外明確地敍述，否者根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中在無需離心之情況下執行活化。
實施例60.除非另外明確地敍述，否者根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中在無需離心之情況下執行活化、轉導及擴增。
實施例61.除非另外明確地敍述，否者根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中用於活化之有效條件不包含抗CD28。
實施例62.除非另外明確地敍述，否者根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中呈可溶形式之抗CD28或連接至合成固體載體之抗CD28在活化步驟期間不存在。
實施例63.根據實施例61之方法，其中45%與95%之間、或50%與95%之間、或55%與90%之間、或60%與90%之間的經擴增細胞為CD8+ T細胞。
實施例64.根據實施例61之方法，其中經擴增細胞包含與CD4+ T細胞相比至少1.5倍、2倍、2.5倍或3倍一樣多的CD8+ T細胞。
實施例65.如實施例47之方法，其中收集50ml與150ml之間的血液。
實施例66.如實施例65之方法，其中將經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞擴增至250ml與5L之間、或500mL與2.5L之間、或500mL與2L之間、或1L與2L之間的體積。
實施例67.如實施例65之方法，其中採集與存在於經分離PBMC中或存在於活化步驟期間之T細胞及/或NK細胞之數目相比至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40 倍或50倍一樣多的經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞。
實施例68.除非另外敍述，否則根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中採集與存在於經分離PBMC中或存在於活化步驟期間之PBMC之數目相比至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、60倍或75倍一樣多的細胞。
實施例69.除非另外敍述，否則根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中採集與存在於經分離PBMC中或存在於活化步驟期間之PBMC之數目相比至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、60倍或75倍一樣多的存活細胞。
實施例70.除非另外敍述，否則根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中採集與存在於經分離PBMC中或存在於活化步驟期間之PBMC之數目相比5倍與75倍之間、或10倍與75倍之間、或20倍與50倍之間、或25倍與50倍之間一樣多的細胞或存活細胞。
實施例71.如實施例65之方法，其中採集與存在於經分離PBMC中或存在於活化步驟之間的T細胞之數目相比至少10倍一樣多的經基因方式修飾之T細胞。
實施例72.除非另外明確地敍述，否則根據本文提供之方法實施例中之任一者之方法，其中基礎介質為用於離體外T細胞 擴增之可商購之化學限定介質。
實施例73.如實施例72之方法，其中細胞擴增介質進一步包含合成血清替代物。
實施例74.如實施例72或73之方法，其中細胞擴增介質包含L-麩醯胺酸或L-麩醯胺酸之二肽取代基。
實施例75.如實施例72至74中之任一者之方法，其中介質具有Thermo Fisher Scientific之目錄號A1048501或A1048503之基底介質及介質補充物之組合物。
實施例76.除非另外明確地敍述，否則根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中細胞擴增介質包含Thermo Fisher Scientific之目錄號A1048501或A1048503之基底介質及介質補充物之組合物，其進一步補充具有L-麩醯胺酸或L-麩醯胺酸之二肽取代基、合成血清替代物及濃度為至少50IU/ml之IL-2。
實施例77.如實施例76之方法，其中將經基因方式修飾之T細胞擴增至少20倍、25倍、30倍、50倍、75倍、80倍、90倍、100倍或125倍。
實施例78.如實施例76或77之方法，其中細胞擴增介質包含低於300IU/ml之IL-2。
實施例79.如實施例76或77之方法，其中細胞擴增介質包含50IU/ml與150IU/ml之間的IL-2及比在轉導反應期間存在之NAC之濃度高至少5mM的NAC之濃度。
實施例80.除非另外明確地敍述，否者根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法，其中天然血清在擴增期間不存在。
實施例81.如實施例80之方法，其中血清替代物在擴增期間存在。
實施例82.除非另外敍述，否則根據實施例76至79中之任一者或根據本文中之任何實施例之方法，其中在擴增之後，存在與存在於經分離PBMC中或存在於活化步驟期間之PBMC之數目相比至少20倍、或至少25倍、或20倍與75倍之間、或25倍與70倍之間、或25與50倍之間、或25與150倍之間、或50與150倍之間、或50與135倍之間一樣多的細胞或存活細胞。
實施例83.除非另外明確地敍述，否則根據本文中所提供之任何方法實施例之方法，其中將T細胞及/或NK細胞自活化步驟中之T細胞及/或NK細胞之數目擴增至少5倍、10倍、20倍、25倍或50倍。
實施例84.除非另外明確地陳述，否則根據本文中所提供之任何方法實施例之方法，其中將T細胞及/或NK細胞自活化步 驟中之T細胞及/或NK細胞之數目擴增至少5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍或125倍。
實施例85.一種經基因方式修飾之T細胞及/或NK細胞，其藉由根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法產生。
實施例86.一種經基因方式修飾之T細胞群，其藉由根據本文中所提供之方法實施例中之任一者之方法產生。
實施例87.如實施例86之群，其中該群之比率為與CD4陽性細胞相比至少兩倍一樣多的CD8陽性細胞。
實施例88.如實施例86或87中之任一者之群，其中該等細胞存在於化學限定之介質中。
實施例89.如實施例88之群，其中該等細胞存在於包含重組IL-2之介質中。
提出以下實例以便為熟習此項技術者提供如何做出及使用本發明之完整揭示內容及描述，且並不意欲限制發明者視為其發明之範疇，其亦不意欲表示以下實驗為所有或僅經執行之實驗。已努力確保關於所使用數字(例如量、溫度等)之準確度，但應考慮一些實驗性誤差及偏差。除非另外指示，否則份數為重量份數，分子量為重均分子量，溫度以攝氏度(℃)計，且壓力呈大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如bp，鹼基 對；kb，千鹼基；pl，公升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；bp，鹼基對；nt，核苷酸；i.m.，胞內(地)；i.p.，腹膜內(地)；s.c.，皮下(地)；i.v.，靜脈內(地)；及其類似縮寫。
實例
實例1..在單個腔室分批饋入系統中進行離體外活化、轉導及擴增。
此實例成功地證明在若干條件(包括在單個反應腔室內)之離體外T細胞之活化、轉導及擴增且無需在此等步驟之間轉移或洗滌細胞。此外，此實例證明使用分批饋入系統，其中介質在自活化至擴增之任何步驟期間未進行交換。
方法
PBMC富集及細胞計數
0天.根據製造商之說明書，藉由Ficoll-Paque PREMIUM®(GE Healthcare Life Sciences)之密度梯度離心自單一血塊黃層(San Diego Blood Bank)富集人類周邊血液單核細胞(PBMC)。對於細胞計數，根據製造商之說明書，使用紅血球裂解溶液(BD Biosciences，555899)裂解樣本中之紅血球。使用台盼藍(trypan blue)洗滌PBMC且使用血球計計數PBMC。
細胞活化
0天.將經富集PBMC再懸浮於另外補充有100IU/ml之重組人類介白素2(IL-2)(R&D System，202-IL-500)及呈0.5×106個細胞/毫升之50ng/ml之抗CD3抗體(Biolegend，#317326) 的40ml之介質1(M1)、介質2(M2)、介質3(M3)或介質4(M4)中之每一者中。M1為X-VIVOTM 15 1 L(Lonza)。M2為補充有25ml之CTSTM免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)的M1。M3為補充有26ml之OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增補充物(Thermo Fisher，A10484-02)及10ml之CTSTM GlutaMAXTM-I補充物(Thermo Fisher，A1286001)的OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增基礎介質1L(Thermo Fisher，A10221-01)。M4為補充有25ml之CTSTM免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)的M3。再懸浮於4個介質中之每一者中之PBMC以0.5×106個細胞/毫升之濃度接種於G-Rex 6孔板(Wilson Wolf，80240M)(3毫升/孔PBMC)之孔中，G-Rex 6孔板為標準12孔培養板(Corning，3513)(1毫升/孔PBMC)或具有或不具有預塗佈有RetroNectin(TakaRa，T100B)之培養袋(CultiLife 215培養袋)(10毫升/袋PBMC)(Clontech，FU0005)。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育細胞隔夜(12小時與24小時之間)。
病毒轉導
1天.在隔夜培育之後，針對10之感染倍率(MOI)，將效價為3.48×108個轉導單元/毫升之14.36μl慢病毒顆粒製劑添加至各樣本。慢病毒基因組編碼e-TAG。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育轉導反應混合物隔夜(12小時與24小時之間)。
T細胞擴增
第2天至第9天.在隔夜轉導之後，將12孔培養板中及培養 袋中之細胞轉移至G-Rex 6孔板之孔中。將來自12孔培養板之3個孔之細胞(總計3ml)合併至G-Rex 6孔板之1個孔中。將來自1個培養袋之細胞分裂至G-Rex 6孔板之3個孔中(3毫升/孔)。將在G-Rex 6孔板之孔中轉導之細胞留在此等板中。測試分批饋入系統。因此，藉由使用M1、M2、M3或M4使各樣本之介質體積達至40ml以匹配現存培養介質且添加100IU/ml之IL-2來饋入細胞。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex板，且在第4天時開始每48小時補充有額外100IU/ml之IL-2。
採集、細胞計數及細胞存活率
第9天.在第9天時在將各樣品收集至50ml錐形管中之前，藉由向上向下輕輕移液各孔中之介質來收集PBMC。樣品經洗滌且接著使用Countess II FL自動細胞計數器(Thermo Fisher，AMQAF1000)來對細胞進行計數並分析存活率。
流式細胞術
對於各樣品，0.5×106個細胞經洗滌且再懸浮於FACS緩衝液(PBS+2% FBS+0.1%迭氮化鈉)中。在冰上用含有0.9μg/ml之生物素化西妥昔單抗(biotinylated-cetuximab)之100μl FACS緩衝液染色細胞30min。將經染色細胞用FACS緩衝液洗滌且在冰上用Streptavidin PE(eBioscience，12-4317-87，0.2mg/ml)、CD3-BV421(Biolegend，317344)、CD4-PE-Dazzle 594(Biolegend，300548)及CD8-BV570(Biolegend，301038)染色30min。將細胞於FACS緩衝液中洗滌兩次，固定於FACS緩衝液與BD Cytofix(BD #554655)之1：1混合物中，用Novocyte (ACEA)處理，且使用基於前向及側向散射之淋巴球門用NovoExpress軟體(ACEA)分析所得資料。
結果
T細胞之離體外活化、轉導及擴增是在多種條件下進行測試且無需在此等步驟之間洗滌細胞或交換介質。轉導效率對於所有經測試條件為大於5%，而對於保留在G-Rex中以供活化及轉導之樣本中之一些為大於40%，從而展示轉導可有效地在G-Rex腔室內執行。在類似條件下執行之隨後實驗實現大於50%之轉導效率(例如，用編碼針對圖9中之ROR2(ROR2 CAR)及圖12中之樣本2A之CAR之慢病毒顆粒轉導之供體13及21。另外出乎意料地，來自所有經測試條件之細胞經成功活化、轉導及擴增，即使在此等步驟中之任一者期間未洗滌該等細胞(圖2)。
擴增是使用分批饋入方法執行，其中首先添加介質及生長因子，且定期添加生長因子，但不交換或灌注介質。在所有經測試條件下，使用分批饋入方法擴增是成功地，其中基於活化反應中之初始PBMC與採集時經擴增培養物中之細胞數目之間的細胞計數至少5倍擴增，且在許多所測試條件下大於50倍擴增。一些最大擴增是使用M4介質、補充有OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增補充物、CTSTM GlutaMAXTM-I補充物及CTSTM免疫細胞SR(血清替代物)之OpTmizerTM CTSTMT細胞擴增基礎介質獲得。此外，添加血清替代物似乎通常為有益地。細胞之CD8：CD4表型偏向CD8+細胞(圖3)。當細胞在板或袋中經活化及轉導且接著轉移至G-Rex(分別G-Rex板或G-Rex培養袋) 時，觀察到較大細胞擴增。然而，此系統需要更多樣本處理且比在G-Rex(直接至G-Rex)之單個腔室中執行活化、轉導及擴增較不適於封閉系統過程。RetroNectin並不顯著影響細胞之轉導。對於在缺少RetroNectin之M4介質中之G-Rex之單個腔室中之細胞活化、轉導及擴增，CD8：CD4表型為55%：22%或2.5：1。當使用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28套組(Thermo Fisher Scientific)活化細胞時，觀察到更大細胞擴增及接近1之CD8：CD4比率，但需要移除珠粒，產生更多樣本處理及增加之污染風險。
此實例中所報導之結果顯示T細胞可在單個反應腔室中經活化、轉導及擴增且從不在活化、轉導或擴增期間自腔室中抽取直至在擴增後經採集其。此外，分批饋入過程在若干不同條件下成功地證明，其中介質經添加但不在開始活化與完成擴增之間移除或交換。此等分批饋入過程用100IU/ml之IL-2執行。最終，在無需RetroNectin之情況下且在適於完全封閉系統之G-Rex腔室內成功地執行轉導。
實例2.分析分批饋入單個腔室系統中之離體外活化、轉導及擴增條件中之各種因素。
此實例證明IL-2、IL-7、抗CD28及補充N-乙醯基半胱胺酸(NAC)對分批饋入過程中之單個反應腔室內之T細胞之離體外活化、轉導及擴增的影響。
方法
血液收集
第0天.將來自健康供體之全部人體血液(100ml)收集至含有檸檬酸磷酸葡萄糖(Citrate Phosphate Dextrose，CPD)抗凝劑之標準血液收集袋或管中。
PBMC富集
第0天.根據製造商之說明書，使用Sepax 2 S-100裝置(Biosafe；14000)上之CS-900.2套組(BioSafe；1008)，使用Ficoll-PaqueTM(General Electric)密度梯度離心處理血液，以獲得45ml之PBMC。用於Sepax 2過程中之洗滌溶液為生理鹽水(Chenixin Pharm)+2%人類血清蛋白(HSA)(Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical)。最終細胞再懸浮溶液為補充有26ml之OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增補充物(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml之CTSTM免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml之CTSTM GlutaMAXTM-I補充物(Thermo Fisher，A1286001)的45ml之完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增基礎介質1L(Thermo Fisher，A10221-03)。
細胞計數
第0天.使用連接至路爾口(luer port)之1m注射器自CS-900.2套組之最終袋移除PBMC之0.5ml等分試樣。在執行細胞計數之前，根據製造商之說明書，使用紅血球裂解溶液(BD Biosciences，555899)裂解每各等分試樣中之紅血球。使用Countess II FL自動細胞計數器來計數剩下的細胞並分析存活率。
細胞活化
第0天.將含1.5×106個存活PBMC之3ml完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(如實例1中所描述之M4)無菌接種至G-Rex 6孔板之孔中。將抗CD3抗體(OKT3，Novoprotein)添加至所有樣本至50ng/ml之最終濃度。將IL-2(Novoprotein)添加至樣本1、2A、2B、3、5、6A及6B至100IU/ml之最終濃度。將IL-2添加至樣本4至300IU/ml之最終濃度。將IL-7(Novoprotein)添加至樣本3、6A及6B至10ng/ml之最終濃度。將抗CD28抗體(Novoprotein)添加至樣本5至50ng/ml之最終濃度。將足夠量之NAC(Sigma)添加至樣本2A及6A以使NAC之濃度增加10mM。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex板隔夜(12小時與24小時之間)。
病毒轉導
第1天.在隔夜培育之後，在5之感染倍率(MOI)下將125μl慢病毒顆粒製劑添加至各樣本。慢病毒基因組編碼包括ASTR、柄、跨膜域、及胞內域及共刺激域之抗Axl MRB-CAR且在相同轉錄物上表現eTag。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育轉導反應混合物隔夜(12小時與24小時之間)。
T細胞擴增
第2至11天.在隔夜培育之後，藉由使用完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(實例1之介質4)使G-Rex 6孔板之各孔中之總體積達至30ml來饋入細胞。在第0天時含有NAC之 樣本2A及6A補充有足夠量之NAC以將NAC之最終濃度保持呈10mM。亦將NAC添加至先前未接收NAC之樣本2B及6B至10mM NAC之最終濃度。在第2天及隨後每48小時將額外細胞介素饋入至細胞；將100IU/ml之IL-2(Novoprotein)添加至樣本1、2A、2B、3、5、6A及6B，將300IU/ml之IL-2添加至樣本4，且將10ng/ml之IL-7(Novoprotein)添加至樣本3、6A及6B。
採集、細胞計數及細胞存活率
第11天.在第11天時在將各樣品收集至50ml錐形管中之前，藉由向上向下輕輕移液各孔中之介質來收集PBMC。洗滌樣品且接著使用Countess II FL自動細胞計數器計數細胞並分析存活率。根據製造商之說明書，使用Mr.Frosty冷凍容器(Thermo Fisher或CoolCell細胞冷凍容器(BioCision))在補充有20%之熱失活FBS(Gibco)及10%之二甲亞碸的RPMI-1640(Gibco)中以1×107個細胞/毫升之最終密度冷凍細胞。將經冷凍保存之細胞儲存於液氮中以供未來使用。
流式細胞術
在第11天融解所採集之經冷凍保存之細胞且將各染色條件之0.5×106個細胞再懸浮於FACS緩衝液(PBS+2% FBS+0.1%迭氮化鈉)中。在冰上用含有生物素化西妥昔單抗(西妥昔單抗獲自Chembest(目錄號C13458)且由BioDuro(San Diego,CA)生物素化))之100μl FACS緩衝液染色細胞30min。經染色細胞用FACS緩衝液洗滌且在冰上用Streptavidin PE(eBioscience，12-4317-87，0.2mg/ml)染色經染色細胞30min。 將細胞於FACS緩衝液中洗滌兩次，固定於FACS緩衝液與BD Cytofix(BD Biosciences,554655)之1：1混合物中，用Novocyte(ACEA)處理，且使用基於前向及側向散射之淋巴球門用NovoExpress軟體(ACEA)分析所得資料。T細胞之成功轉導量測為CD3+eTAG+細胞之百分比。
結果
T細胞在各種條件下在G-Rex之單個反應腔室內成功地離體外經活化、轉導及擴增。圖4顯示針對各種條件之擴增倍數、存活百分比及轉導效率(CD3+eTAG+細胞之百分比)。在介質中，以100或300IU/ml IL-2之濃度測試IL-2。將10ng/ml IL-7或50ng/ml抗CD28之效果與缺乏兩者之樣本進行比較。將在第0天或第2天補充有NAC之細胞與不具有經補充NAC之樣本進行比較。相對於具有100IU/ml IL-2且無IL-7(圖4，樣本1)之樣本，添加IL-2(300IU/ml IL-2；圖4樣本4)及添加IL-7(10ng/ml IL-7；圖4樣本3)兩者增加了轉導效率(亦即，CD3+eTAG+細胞之百分比)，但降低了擴增倍數及存活百分比。不限於理論，包括IL-7仍可為有利的，此是因為鹹信包括IL-7致使將具有較少分化表型(其可在轉導PBMC後之擴增期間有幫助)之更多T細胞引入至供體中(Xu等人，Blood(2014)123：3750-59)。類似實驗證明50IU/ml IL-2為有效的，其中經轉導T細胞經擴增及採集，儘管100IU/ml IL-2提供更好結果(資料未顯示)。添加抗CD28未顯著影響擴增倍數、存活百分比或轉導效率(亦即，CD3+eTAG+細胞之百分比)(參見圖4中之樣本1及5)。
圖5顯示聚中於在過程期間之不同時間處添加NAC之結果。相對於僅在商業介質中存在NAC且無IL-7之樣本(樣本1)，在第0天(轉導之前)之添加NAC在缺少(樣本2A)或存在(樣本6A)10ng/ml IL-7之情況下降低CD3+eTAG+細胞之百分比。出人意料地，相對於不具有補充NAC或IL-7之樣本(樣本1)，在第2天(轉導之後)之添加NAC在缺少(樣本2B)或存在(樣本6B)10ng/ml IL-7之情況下極大地增加經轉導細胞之百分比。
此等結果證明以分批饋入方式在單個腔室內離體外活化、轉導及擴增T細胞之有效且簡單的方法，其中在轉導之後添加補充NAC，IL-7及抗CD28為視情況選用的，且在活化、轉導或擴增步驟期間不執行洗滌。濃度呈100IU/ml之IL-2在所測試系統中提供最佳結果。IL-7及抗CD28為視情況選用的，此是因為其未顯著影響結果。出人意料地，補充NAC在第0天添加時具有抑制性效果且在第2天添加時具有刺激性效果。
實例3.分批饋入單個腔室系統中之離體外活化、轉導及擴增之其他特徵。
以下實例進一步證明且特徵化分批饋入單個腔室系統中之活化、轉導及擴增。此外，實例分析乳酸鹽濃度作為細胞密度之替代物。
方法
血液收集
第0天.將來自3個健康供體(供體13、21及28)中之每 一者之全部人體血液(約40ml)收集至含有檸檬酸磷酸葡萄糖(CPD)抗凝劑之標準血液收集袋或管中。自各供體收集之血液體積顯示於圖6中。不在同一天為不同供體執行方法。
PBMC富集
第0天.如實例2，在收集之6小時內處理各血液樣本。
細胞計數
第0天.移除來自各樣本之PBMC之0.5ml等分試樣且如實例2中在細胞計數之前裂解等分試樣中之紅血球。來自各供體之總PBMC產量顯示於圖6中。根據實例2之相同方案移除且冷凍來自各樣本之2×106個PBMC。將經冷凍保存之細胞儲存於液氮中以用於稍後藉由FACS分析。
細胞活化
第0天.將來自各供體之1.5×106個存活PBMC之複製無菌接種至G-Rex 6孔板之各孔中且用補充有100IU/ml之重組人類介白素-2(IL-2)(Novoprotein)及10ng/ml之重組人類介白素-7(IL-7)(Novoprotein)之完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(如實例1中所描述之介質M4)使體積達至3ml(5×105個存活PBMC細胞/毫升)。將來自供體13之PBMC以一式三份接種，將來自供體21之PBMC以一式四份接種，且將來自供體28之PBMC以一式四份接種，將50ng/ml之抗CD3抗體(OKT3，Novoprotein)添加至各孔以活化PBMC以用於病毒轉導。不將NAC添加至任何樣本。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex板隔夜(12小時與24小時 之間)。
病毒轉導
第1天.在隔夜培育之後，在5感染倍率(MOI)下，將編碼針對Axl(Axl CAR)之MRB-CAR的125μl慢病毒顆粒製劑或編碼針對Ror2(Ror2 CAR)之MRB-CAR的23μl慢病毒顆粒製劑添加至各孔，以形成轉導反應混合物。慢病毒基因組編碼包括ASTR、柄、跨膜域、胞內域及共刺激域之CAR且在相同轉錄物上表現e-TAG。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育轉導反應混合物隔夜(12小時與24小時之間)。
T細胞擴增
第2天.在隔夜培育轉導反應物之後，藉由用含有10mM NAC之完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(實例1之介質4)使G-Rex 6孔板之各孔之總體積達至30ml來饋入細胞。另外，在第2天且其後之每48小時，將100IU/ml IL-2(Novoprotein)及10ng/ml IL-7(Novoprotein)添加至各孔。
量測乳酸鹽及葡萄糖
自第3天開始針對供體13及21之各孔且針對來自供體28之各孔之相等混合物每日量測介質中之乳酸鹽之濃度(圖7A至圖7C)。使用Lactate Plus表(Nova Biomedical)量測乳酸鹽。亦自第3天開始每日量測各孔之介質中之葡萄糖濃度。葡萄糖是使用Accu-Chek Aviva Plus表(Roche)或Accu-Chek Performa表(Roche)量測。在第9天時採集來自供體13、21及28之經 擴增細胞。與乳酸鹽濃度之增加相關聯之葡萄糖濃度之降低指示細胞在擴增期間未受細菌污染。
採集、細胞計數及細胞存活率
在第9天時在將各樣品收集至50ml之錐形管中之前，藉由向上向下輕輕移液各孔中之介質來採集經擴增PBMC。洗滌樣品且接著使用Countess II FL自動細胞計數器計數細胞並分析存活率。根據實例2之相同方案來冷凍細胞。將經冷凍保存之細胞儲存於液氮中以用於節藉由FACS分析。
流式細胞術
融解經冷凍保存之細胞及將洗滌針對各染色條件之0.5×106個細胞並將其再懸浮於FACS緩衝液(PBS+2% FBS+0.1%迭氮化鈉)中。在冰上用含生物素化西妥昔單抗之100μl FACS緩衝液染色細胞30min。經染色細胞用FACS緩衝液洗滌且在冰上用Streptavidin FITC(Becton Dickenson，554060)、CD3-PerCp-Cy5.5(Becton Dickenson，560835)、CD4-APC(Becton Dickenson，551980)及CD8-PE(Becton Dickenson，557086)，或Streptavidin FITC(Becton Dickenson，554060)、CD3-PerCp-Cy5.5(Becton Dickenson，560835)及CD56-PE(Becton Dickenson，555516)之混合物染色30min。將細胞於FACS緩衝液中洗滌兩次，固定於FACS緩衝液與BD Cytofix(BD Biosciences,554655)之1：1混合物中，用Novocyte(ACEA)處理，且使用基於前向及側向散射之淋巴球門用NovoExpress軟體(ACEA)分析所得資料。
結果
在自3個不同健康人類供體收集之血液樣本上測試方法，該等方法建立在提供於用於離體外活化、轉導及擴增T細胞而無需在此等步驟期間洗滌或轉移T細胞且在可適於完全封閉之系統中使用分批饋入過程之實例2中之實驗中。將來自健康供體之血液收集至袋中且在Sepax裝置首先處理以富集並洗滌PBMC。大約40ml血液用於處理，其產量在2.1×107與4.1×107個PBMC之間，其之71%於78%之間為T細胞(CD3+)且16%至17%為NK細胞(CD3- CD56+)(圖6)。
對於活化，接著將1.5×106個存活PBMC接種至G-Rex 6孔板之各孔中且使用補充有100IU/ml重組IL-2及10ng/ml重組IL-7之完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(如實例1中所描述之介質M4)使體積達至3ml(5×105個存活PBMC細胞/毫升)。接著，將50ng/ml抗CD3抗體添加至PBMC以形成活化反應混合物，且培育細胞隔夜以活化經富集PBMC內之T細胞。活化之後，在5之感染倍率(MOI)下，將編碼兩種CAR中之任一種的兩種慢病毒顆粒製劑(Ror2 CAR及Axl CAR)中之一者直接添加至孔內之各樣本，且無需在活化與轉導之間洗滌細胞。在轉導反應混合物中培育細胞直至之下一天。
轉導之後，細胞經擴增且無需在轉導與擴增之間洗滌或轉移細胞。對於擴增，藉由用含有10mM NAC之完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(實例1之介質4)使G-Rex 6孔板之各孔之總體積達至30ml來饋入經轉導細胞。另外，在第2天且其後之每48小時，將100IU/ml IL-2(Novoprotein)及10ng/ml IL-7(Novoprotein)添加至各孔。允許細胞自原始血液收集(第0天)擴增至多第9天。
在擴增期間量測乳酸鹽濃度(圖7A至圖7C)。乳酸鹽濃度之改變在滯後期(持續至第4天或第5天，視供體而定)，對數期及高原期(在約第6天與第9天之間開始，視供體而定)之後，如在細胞擴增期間細胞密度之改變所預期。事實上，在其他實驗中，證實乳酸鹽濃度與細胞密度之間的相關性(資料未顯示)。乳酸鹽濃度似乎在達到約20nmol/L之濃度後趨於穩定。
經擴增細胞在第9天時經採集及分析。細胞計數顯示對於所有樣本T細胞擴增大於40倍(在45倍與118倍之間)，從而證實活化、轉導及擴增過程之有效性(圖8A至圖8C)。此外，對於所有樣本細胞存活率大於70%(圖8A至圖8C)。如圖9中所顯示，執行經擴增細胞群之免疫細胞標記分析。32%與53%之間的經擴增細胞為表現eTAG之經轉導T細胞(亦即，經基因方式修飾之T細胞)。45%與77%之間的經擴增細胞為CD8+ T細胞且在12%與41%之間為CD4+ T細胞。7%與27%之間的經擴增細胞為NK T細胞。0.6%與1.3%之間的細胞為NK細胞。
總體而言，此等結果證實在可適於完全封閉之系統中使用分批饋入過程離體外活化、轉導及擴增T細胞且無需在此等步驟之間洗滌或轉移T細胞之所揭示方法對轉導及擴增T細胞有效。用於完全封閉系統內之系統潛能提供在離體外處理T細胞 期間降低可能的污染的機會。
實例4.封閉系統中之分批饋入單個腔室系統中之全規模離體外活化、轉導及擴增。
此實例證明使用建立於實例1及2中之條件(亦即活化期間之100IU/ml IL-2、10ng/ml IL-7及50ng/ml抗CD3抗體及轉導後添加之10mM補充N-乙醯基半胱胺酸(NAC))用於離體外擴增CAR-T細胞之全規模1L單個腔室分批饋入封閉系統。
方法
血液收集
第0天.將來自4個健康供體中之每一者之全部人類血液收集至含有1.5ml酸性檸檬酸鹽葡萄糖溶液(抗凝劑)之100mm采血管(Becton Dickenson；364606)中。對於各供體，將來自采血管之血液彙集且分配至2個標準500ml血液收集袋以用於單獨處理。對於經處理之各經彙集樣本之總血液體積針對供體1至4顯示於圖10中，其中供體之不同經彙集樣本經指定為「A」或「B」。
PBMC富集
第0天.如實例2中所描述，在收集之6小時內，在包括Sepax單元之封閉系統內處理各血液樣本。
細胞計數
第0天.移除來自各樣本之PBMC之0.5ml等分試樣且如實例2所執行在細胞計數之前裂解等分試樣中之紅血球。在第0 天藉由注射器自Sepax單元之輸出袋上之無菌口移除5.0×106個存活細胞且根據實例2中之方案冷凍。將經冷凍保存之細胞儲存於液氮中以用於稍後藉由FACS分析。
細胞活化
第0天.使用無菌口或管將5.0×107個存活PBMC自各血液收集袋無菌地轉移至1L G-Rex封閉細胞培養系統(Wilson-Wolf 100M CS)。用完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(實例1之介質4)使體積達至100ml(5×105個存活PBMC細胞/毫升)且補充有100IU/ml重組人類介白素-2(IL-2)(Novoprotein)、10ng/ml重組人類介白素-7(IL-7)(Novoprotein)及50ng/ml抗CD3抗體(OKT3，Novoprotein)，以活化PBMC以供病毒轉導。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex裝置隔夜(12小時與24小時之間)，以活化T細胞。
病毒轉導
第1天.在隔夜培育之後，在2.5之感染倍率(MOI)下將506μl慢病毒顆粒製劑添加至G-Rex裝置之反應腔室。慢病毒基因組編碼包括ASTR、柄、跨膜域、胞內域及共刺激域之CAR且在相同轉錄物上表現e-TAG。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex裝置隔夜(12小時與24小時之間)。
T細胞擴增
第2至12天.在隔夜培育之後，藉由用補充有足夠量之NAC(Sigma)的完整OpTmizerTM CTSTM T細胞擴增SFM(實例1 之介質4)使各G-Rex裝置之腔室中之總體積達至1L來饋入細胞，以產生最終濃度為10mM NAC以及100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7。在每48小時添加100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7之情況下，在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex裝置。
量測乳酸鹽及葡萄糖
在第4天開始每日量測各孔之介質中之乳酸鹽濃度(圖11)。根據製造商之說明書，使用Lactate Plus表(Nova Biomedical)或生化分析器(YSI)來量測乳酸鹽濃度。根據製造商之說明書，使用Accu-Chek Aviva Plus表(Roche)、Accu-Chek Performa表(Roche)或生化分析器(YSI)來量測葡萄糖濃度。與乳酸鹽濃度之增加相關聯之葡萄糖濃度之降低指示PMBC在擴增期間未受細菌污染。
採集、細胞計數及細胞存活率
在第12天時，根據製造商之說明書，使用移液管之手動過程或使用GatheRex裝置(Wilson Wolf)之自動過程用於自G-Rex封閉細胞培養系統之頂部移除過量介質。在介質移除之後，移液管或GatheRex裝置用於將經濃縮細胞產物轉移至500ml IV袋中。使用台盼藍及Countess裝置(Thermo Fisher)針對IV袋中之細胞產物獲取細胞計數。遵循製造商之說明書，使用三個細胞洗滌循環及經選擇以產生1×108個存活細胞/毫升之最終體積，使用Sepax 2 S-100裝置(Biosafe；14000)上之CS900.2套組(BioSafe；1008)洗滌並濃縮所採集細胞。用於Sepax 2過程中之洗滌溶液為生理鹽水加2%人類血清蛋白(HSA)。最 終細胞產物再懸浮溶液為含5%葡萄糖之生理鹽水(D5NS，Shandong Qidu)加2% HAS加20g/L碳酸氫鈉(NaHCO3)(Shanghai Experiment Reagent Co.)。根據實例2之方案來冷凍PBMC。將經冷凍保存之細胞儲存於液氮中。
流式細胞術
在37℃之水浴中快速融解自第0天及第12天冷經凍保存之PBMC之等分試樣。經融解PBMC接著經洗滌且再懸浮於染色緩衝液(BD Biosciences，554656)中且在冰上與人類Fc嵌段(Becton Dickenson)一起培育10min。在冰上用含有2.5μl之以下抗體中之每一者的50μl FACS緩衝液染色來自第0天之PBMC30分鐘；CD3-BV421(Biolegend)、CD8-BV510(Biolegend)、CD4-PE-Cy7(Biolegend)、CD56-BV785(Biolegend)及CD14-PE(Biolegend)用於5個染色。以相同方式染色來自第12天之PBMC，除抗CD-14-PE抗體不包括於染色混合物中以外。將細胞於FACS緩衝液中洗滌兩次，固定於FACS緩衝液與BD Cytofix(BD Biosciences,554655)之1：1混合物中，用Novocyte(ACEA)處理，且使用基於前向及側向散射之淋巴球門或在針對CD14在圖10所指示之情況用NovoExpress軟體(ACEA)分析所得資料。
結果
包括G-Rex單元之大規模封閉系統用於在分批饋入條件下在G-Rex的單個反應腔室內活體外活化、轉導及擴增CAR-T細胞且無需在此等步驟期間或之間洗滌或轉移細胞。血液收集自健康供體。PBMC富集於封閉Sepax單元內。分析經富集PBMC (圖10)。64%與77%之間的所收集PBMC為T細胞。分離富集群中之CD8細胞與CD4細胞之比率自樣本至樣本而在約1：1與約2：1之間變化。在淋巴球門內之9%與22%之間的PBMC為CD14陽性淋巴球，且在單核球門內之70%與91%之間的PBMC為CD14陽性單核球或巨噬細胞。不受理論限制，相信抗原呈遞細胞之存在潛在地藉由呈遞抗CD3以及內源性表現之共同受體來輔助活化過程。
使用無菌管將經分離富集PBMC之5×107個存活PBMC自Sepax單元轉移至G-Rex系統之反應腔室中。PBMC內之T細胞藉由在含有T細胞擴增介質中之可溶抗CD3抗體之反應混合物中培育隔夜來活化。經活化細胞隨後藉由將編碼CAR之慢病毒添加至活化反應混合物中且培育直至下一日來進行轉導，且無需在活化與轉導之間洗滌細胞或交換介質。
經轉導T細胞接著在具有補充NAC之T細胞擴增介質中擴增，皆在G-Rex之相同反應腔室內使用小規模建立之條件(參見實例1至3)。在轉導與擴增之間不對經轉導細胞執行洗滌或轉移。用於活化、轉導及擴增之介質為補充有100IU/ml重組人類介白素-2(IL-2)及10ng/ml重組人類介白素-7(IL-7)之完整OpTmizer CTS T細胞擴增無血清介質。使用分批饋入方法而在於反應腔室內執行細胞擴增，其中用T細胞擴增介質將介質體積自約100ml增加至約1L，且將NAC添加至T細胞擴增介質至10mM NAC之最終濃度。100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7在活化及轉導期間存在於細胞擴增介質中，且在轉導期間每48小時將其添加至細胞擴增介質。除 OpTmizer介質中所存在之任何NAC外，不添加額外NAC至活化及轉導反應混合物。開始活化之後，實行擴增至多12天。在活化、轉導或擴增期間不交換介質且經活化T細胞留保於反應腔室中以用於此等步驟。
圖11顯示在使用此大規模分批饋入方法的細胞擴增期間之乳酸鹽及葡萄糖濃度。如實例3中所論述，乳酸鹽含量提供細胞密度之替代量測。乳酸鹽含量持續增加至第12天至大於20nmol/L之濃度。此外，與乳酸鹽濃度之增加相關聯之葡萄糖濃度之降低指示在擴增期間不存在細菌污染。
圖12提供在第12天時採集之經擴增細胞之細胞分析的結果。2.0×109個與4.2×109個之間的存活細胞採集自經擴增細胞且69%與86%之間的經擴增細胞為存活的。此表示介於41倍與83倍之間的擴增。對於所採集細胞，90%與99%之間的所採集細胞為T細胞。對於所有樣本，CD8：CD4 T細胞之比率大於2。7%與21%之間的經擴增細胞為NK T細胞。0.24%與7.79%之間的經擴增細胞為NK細胞。
此等結果確立所揭示之大規模封閉方法之有效性，其中活化、轉導及擴增在分批饋入過程中在封閉系統之單個腔室內執行，且無需洗滌或介質交換。此過程提供簡單、穩健、污染機會少及節省成本之優點，此使得此方法可比當前之方法更廣泛地採用。
實例5.臨床背景下之離體外活化、轉導及擴增
此實例提供用於製備用於再引入至供體中之CAR-T細胞之封閉系統內之全規模方法之細節，其中活化、轉導及擴增在封閉系統之單個反應腔室內執行，且無需在此等步驟期間洗滌並使用用於細胞擴增之分批饋入方法。該方法利用在轉導之前添加之100IU/ml IL-2、10ng/ml IL-7及50ng/ml抗CD3抗體，及轉導後添加之10mM N-乙醯基半胱胺酸(NAC)。
例式性大規模方法
封閉系統
提供於此實例中之用於執行T細胞處理之系統自血液收集至採集為封閉的。此系統包括Sepax裝置、G-Rex裝置及GatheRex裝置。血液收集袋、Sepax裝置、G-Rex裝置及GatheRex裝置是使用無菌焊接連接及無菌管組連接的。介質經購買呈具有自愈口之無菌袋。
血液收集
將全部人體血液(80至100ml)收集至含有抗凝劑(酸性檸檬酸鹽葡萄糖溶液(ACD)或檸檬酸磷酸葡萄糖(CPD))之標準血液收集袋中。
PBMC富集
根據製造商之說明書，使用Sepax 2 S-100裝置(Biosafe；14000)上之CS900.2套組(BioSafe；1008)用Ficoll-PaqueTM(General Electric)使用密度梯度離心在收集之6小時內處理血液，來以富集周邊血單核細胞(PBMC)。用45ml體積之兩個洗滌循環洗滌PBMC。Sepax 2過程中之洗滌溶液為生理鹽水加 2%人類血清蛋白(HSA)(Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co.,Ltd)。最終細胞再懸浮溶液為約45ml介質，該介質藉由使1L完整OpTmizer CTS T細胞擴增SFM(OpTmizer CTS T細胞擴增基礎介質(Thermo Fisher，A10221-03)補充有26ml OpTmizer CTS T細胞擴增補充物(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTS免疫細胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I補充物(Thermo Fisher，A1286001))來製得。
細胞活化
細胞計數使用Nucleocounter NC200裝置(Chemometec)在經富集PBMC上執行。經由無菌口及管將5×107個存活PBMC細胞以完整OpTmizer CTS T細胞擴增SFM以5×105個存活PBMC細胞/毫升轉移至具有100IU/ml重組人類介白素-2(IL-2)(Novoprotein)、10ng/ml重組人類介白素-7(IL-7)(Novoprotein)及50ng/ml抗CD3抗體(OKT3,Novoprotein)中之在之1L G-Rex封閉細胞培養系統(Wilson-Wolf，100M CS)，以活化PBMC以供病毒轉導。因此，活化反應混合物之體積通常為100ml。在少於5×107個存活PBMC細胞富集之情況下，將添加至G-Rex之存活PBMC之總數減少至將G-Rex裝置中之細胞之濃度恆定的保持於5×105個存活PBMC/毫升之總富集量。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex裝置隔夜(12小時與24小時之間)。
病毒轉導
隔夜培育之後，在2.5之感染倍率(MOI)下，將編碼CAR (例如MRB-CAR)之慢病毒顆粒製劑添加至G-Rex裝置。在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex裝置隔夜(12小時與24小時之間)。
T細胞擴增
隔夜培育之後，用補充有足夠量之NAC之完整OpTmizer CTS T細胞擴增SFM使G-Rex裝置中之總體積達至1L，以產生最終濃度為G-Rex裝置中之10mM NAC以及100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7。在藉由自注射器注射至G-Rex裝置上之無菌口每48小時添加100IU/ml重組人類IL-2及10ng/ml重組人類IL-7之情況下，在37℃及5% CO2下，在標準濕潤組織培養培育箱中培育G-Rex裝置。藉由抽取1ml樣本且使用生化分析器(YSI)分析該樣本來每日檢測葡萄糖及乳酸鹽含量。此過程持續至多12天。
採集及細胞計數
在採集經擴增細胞產物當日，根據製造商之說明書，GatheRex裝置(Wilson Wolf)用於藉由將過量介質自G-Rex裝置之頂部移除而減小含有G-Rex裝置中之細胞的細胞體積。在介質移除之後，GatheRex裝置用於將經濃縮細胞產物轉移至500ml IV袋中。使用Nucleocounter NC-200裝置針對IV袋中之細胞產物獲取細胞計數。遵循製造商之說明書，使用三個細胞洗滌循環且經選擇以產生1×108個存活細胞/毫升之最終體積，使用Sepax 2 S-100裝置(Biosafe；14000)上之CS900.2套組(BioSafe；1008)洗滌並濃縮細胞產物。用於Sepax 2過程之洗滌溶液及最終細胞產物再懸浮溶液為D5NS(Shandong Qidu) 加2% HSA(Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co.,Ltd)加20g/L碳酸氫鈉(NaHCO3)(Shanghai Experiment Reagent Co,.Ltd or Dongya Pharmaceutical Co.,Ltd)。根據實例2之方案，細胞可視情況經冷凍保存。
結果
除使用管執行血液收集外，執行上述方法。使用此大規模封閉系統方法成功地轉導PBMC。此外，對比活化反應中之PBMC之數目(3.86×107個細胞)，基於第10天時擴增後之總細胞之細胞計數實現95倍擴增(3.66×109個細胞)。在隨後實驗中，藉由超過100倍擴增之多次運行，實現40與134倍之間的擴增。
熟習此項技術者可在本揭示之範疇及精神下設計許多修改及其他實施例。實際上，可在不改變本揭示內容之基本態樣之情況下由熟習之技術者對所描述之材料、方法、圖式、實驗、實例及實施例進行變化。所揭示實施例中之任一者可結合其他所揭示之實施例來使用。

Claims (15)

  1. 一種用於自經分離血液轉導T細胞的方法，包含以下步驟：a)富集周邊血液單核細胞(PBMC)以自經分離血液分離包含T細胞之周邊血液單核細胞(PBMC)；b)將經分離周邊血液單核細胞(PBMC)轉導至封閉系統之腔室；c)在前述封閉系統之腔室內在有效活化條件下活化前述經分離周邊血液單核細胞(PBMC)之T細胞，前述封閉系統包含有效量之抗CD3抗體，其中前述有效活化條件不包含抗CD28抗體；d)在有效條件下，用非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒轉導經活化T細胞，其中用於前述轉導的前述有效條件包含在添加至少300ml之細胞擴增介質之前在前述非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒之存在下培育前述經活化T細胞6小時和36小時之間；e)擴增T細胞，其中前述活化、前述轉導及前述擴增是在前述封閉系統之腔室內執行，且無需在前述活化、前述轉導及前述擴增之間或期間洗滌前述細胞；及f)培育前述T細胞。
  2. 如請求項1所記載之方法，其中前述細胞擴增介質中存在比其中執行前述轉導的轉導反應混合物中至少多5mM的N-乙醯基半胱胺酸。
  3. 如請求項1所記載之方法，其中轉導至前述封閉系統之腔室中之前述經分離周邊血液單核細胞(PBMC)的數目在1×107個和5×107個之間，其中轉導至前述封閉系統之腔室中 之前述經分離周邊血液單核細胞(PBMC)的密度在1×105細胞/ml和2.5×106細胞/ml之間，其中前述轉導是在不離心之情況下執行，其中前述T細胞的體積擴增至500ml和2L之間，其中前述T細胞擴增6天至12天，其中經培育之T細胞的總數為至少1×109個，且其中經培育之前述T細胞中至少10%為經轉導T細胞。
  4. 如請求項3所記載之方法，其中執行前述擴增，且無需在前述擴增期間之任何時間處移除多於10%之前述細胞擴增介質。
  5. 如請求項3所記載之方法，其中60%和90%之間的經擴增細胞為CD8+細胞。
  6. 如請求項3所記載之方法，其中IL-2在擴增開始時存在於前述細胞擴增介質中，並在擴增期間至少2次添加到前述細胞擴增介質中，且其中每次添加的IL-2濃度少於150IU/ml。
  7. 如請求項3所記載之方法，其中前述非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒各自包含反轉錄病毒基因組，前述反轉錄病毒基因組包含可操作地連接至在T細胞中有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中前述一或多個核酸序列之第一核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)包含：a)抗原特異性靶向區(ASTR)，b)跨膜域，及c)胞內活化域。
  8. 如請求項1所記載之方法，其中前述非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒各自包含反轉錄病毒基因組，前述反轉錄病毒基因組包含可操作地連接至在T細胞中有活性之啟動子的一或多個核酸序列，其中前述一或多個核酸序列之第一核 酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)包含：a)抗原特異性靶向區(ASTR)，b)跨膜域，及c)胞內活化域，其中前述抗原特異性靶向區(ASTR)為受微環境限制之抗原特異性靶向區(ASTR)，其中相較於7.4之pH在6.7之pH下，前述受微環境限制之抗原特異性靶向區(ASTR)展現與其同源靶標抗原之經增加結合。
  9. 如請求項3所記載之方法，其中前述活化是在不連接至合成固體載體或固定至合成固體載體上的抗CD3抗體的存在下執行。
  10. 如請求項3所記載之方法，其中前述非複製勝任型重組反轉錄病毒顆粒為慢病毒顆粒，且其中用於前述轉導的前述有效條件進一步包含在前述慢病毒顆粒的存在下以1和5之間的感染倍率培育前述經活化T細胞。
  11. 如請求項3所記載之方法，其中前述細胞擴增介質為化學限定之介質且進一步包含合成血清替代物。
  12. 如請求項3所記載之方法，其中前述周邊血液單核細胞(PBMC)先前未進行冷凍保存，且其中前述方法係無需在前述活化步驟之前富集來自其他周邊血液單核細胞(PBMC)之T細胞下執行。
  13. 如請求項3所記載之方法，其中前述擴增是在可透氣之密封系統內在剛性細胞培育容器內執行。
  14. 如請求項3所記載之方法，其進一步包括自供體收集血液以獲得前述經分離血液，其中收集50ml和150ml之間的血液。
  15. 一種T細胞群，其係經由如請求項3所述之方法產生。
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