CN114438034A - 一种基因修饰的细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因修饰的细胞制备方法。具体地,本发明提供一种基因修饰的免疫细胞的制备方法,本发明的细胞制备方法能够快速制备免疫细胞且制备的免疫细胞具有高质量,从而能够保证临床疗效。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及一种基因修饰的细胞制备方法。
背景技术
细胞免疫疗法是一种收集患者免疫细胞,进行基因修饰或选择性扩增培养后增强免疫细胞靶向性、杀伤性以及持久性的新型医疗技术。在近年来的肿瘤免疫治疗临床上有着很好的表现,给临床治愈肿瘤带来了希望。但是免疫细胞的制备过程相对复杂,工艺流程、设备设施和试剂选择等中间环节的不足都会对制备的细胞质量产生不利影响,进而影响临床效果。
传统的免疫细胞制备具有周期长、操作复杂和容易造成培养过程中细胞过度分化衰老等劣势,从而增大制备成本,降低细胞免疫的疗效,难以满足免疫细胞治疗的临床需求。
因此,本领域需要开发一种提高免疫细胞制备效率且提高免疫细胞质量胞制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高免疫细胞制备效率且提高免疫细胞质量胞制备方法。
本发明第一方面,提供一种基因修饰的免疫细胞的制备方法,所述的方法包括步骤:
(a)提供含待进行基因修饰的免疫细胞的样本;
(b)对所述样本进行分选,从而获得富含免疫细胞的第一免疫细胞群;
(c)对所述的第一免疫细胞群进行激活处理,从而获得经激活的第二免疫细胞群;
(d)对所述的经激活的第二免疫细胞群进行转染前培养(pre-transfectionculturing,也称为预培育),从而获得预培养的第三免疫细胞群;
(e)采用病毒载体,通过转染,对所述的经激活的第三免疫细胞群进行基因修饰,从而获得经基因修饰的第四免疫细胞群;
(f)对所述的经基因修饰的第四免疫细胞群进行转染后培养 (post-transfection culturing),从而获得经培养的第四免疫细胞群,即所述的基因修饰的免疫细胞;
其中,所述方法具有选自下组的一个或多个特征:
(i)在步骤(c)中,采用激活磁珠进行激活,并且所述激活磁珠与所述的细胞的个数比为0.5-5:1;
(ii)在步骤(e)中,将所述病毒和所述的经激活的第四免疫细胞群进行混合,并孵育一段时间te,并且在孵育后不进行离心操作;
(iii)在步骤(f)中,在培养时,基于培养体系中的免疫细胞的密度采用不同的灌流方式:当免疫细胞的密度<2×106细胞/ml时,不进行灌流;当免疫细胞的密度≥2×106细胞/ml且<4×106细胞/ml时,按0.5V/天-1V/天的速率进行灌流,其中V为培养体系的体积;当免疫细胞的密度≥4×106细胞/ml时,按1V/ 天-2V/天的速率进行灌流,其中V为培养体系的体积。
在另一优选例中,在步骤(c)中,所述的第一免疫细胞群的密度为0.5-10×106cells/ml。
在另一优选例中,所述方法还具有选自下组的一个或多个特征:
(t1)步骤(b)至(f)的总时间t(b-f)为4-5天;
(t2)步骤(f)的培养时间tf为1.0-3.5天。
在另一优选例中,所述激活磁珠与所述的细胞的个数比为1-5:1。
在另一优选例中,步骤(b)包括:将所述样本与分选磁珠进行混合,对混合物孵育一段时间tb,然后分选出富含免疫细胞的第一免疫细胞群;
优选地,所述的tb为10-30分钟,较佳地10-25分钟。
在另一优选例中,步骤(c)包括:将所述的第一免疫细胞群和激活磁珠进行混合,对混合物孵育一段时间tc,从而获得经激活的第二免疫细胞群。
在另一优选例中,步骤(c)的所述的tc为12-24小时。
在另一优选例中,所述的方法具有选自下组的一种或多种特征:
步骤(d)中,预培养时间td为1.5-3天,较佳地为1.5-2.5天;
步骤(e)中,转染培养时间te为0.5-2.5天,较佳地1-2天;和/或
步骤(f)中,转染后培养的时间tf为1-3.5天,较佳地1.5-3天。
在另一优选例中,所述方法还包括:
(f)当所述经培养的第四免疫细胞群的细胞数量或细胞密度达到预定值时,收获所述经培养的第四免疫细胞群。
在另一优选例中,所述的预定值为2×106细胞/ml~20×106细胞/ml。
在另一优选例中,在步骤(e)中,将所述病毒和所述的经激活的第四免疫细胞群进行混合,并孵育一段时间te,获得孵育液;对所述孵育液用培养基进行按体积计0.5-2倍(较佳地0.75-1.5倍)的稀释,从而获得经稀释的孵育液。
在另一优选例中,在步骤(f)中,对经稀释的孵育液孵育0.5-1.5天,然后接种至生物反应器如Xuri Wave,进行继续培养1-7天。
在另一优选例中,所述的样本选自下组:血液、细胞、新鲜单采物、冻存单采物、PBMC采集物,或其组合。
在另一优选例中,所述的免疫细胞选自下组:T细胞、NK细胞,或其组合。
在另一优选例中,在对所述样本进行分选前,对样品进行洗涤。
在另一优选例中,所述的洗涤包括步骤:向细胞样本中加入洗涤液后混合,离心,去除上清液,得到沉淀。
在另一优选例中,所述的洗涤在Sepax 2、Sepax C-pro、Sefia、Lovo、CS 5+、CSElite或Prodigy设备上进行。
在另一优选例中,所述的洗涤在Sepax C-pro设备上进行。
在另一优选例中,用Sepax C-pro的“Beadwash”程序进行的样本洗涤和磁珠孵育,Beadwash参数包括选自如下表A中的一种或多种参数:
表A
在另一优选例中,在步骤(b)中,所述的分选包括正分选或负分选。
在另一优选例中,在步骤(b)中,所述的分选包括通过加入分选磁珠进行分选,所述的分选磁珠含有与免疫细胞表面标记物(如CD4和/或CD8)结合的捕获体,所述的分选磁珠通过捕获体与免疫细胞表面标记物结合,形成分选磁珠-细胞复合物,从而获得富含免疫细胞的第一免疫细胞群。
在另一优选例中,所述的捕获体为抗体。
在另一优选例中,所述的抗体为特异性抗体。
在另一优选例中,所述的抗体选自下组:CD4+抗体、CD8+抗体,或其组合。
在另一优选例中,所述的细胞表面标记物选自下组:CD4+、CD8+,或其组合。
在另一优选例中,所述的捕获体与所述的细胞表面标记物特异性结合。
在另一优选例中,所述的分选磁珠为含CD4+抗体和CD8+抗体的分选磁珠。
在另一优选例中,所述的洗涤液为缓冲液。
在另一优选例中,所述的分选液为含有分选磁珠的缓冲液。
在另一优选例中,所述的缓冲液为pH6.8-7.4PBS缓冲液。
在另一优选例中,所述步骤(c)中,所述的激活磁珠为CD3+、CD28+或其组合型激活磁珠。
在另一优选例中,所述的激活磁珠为Dynabeads。
在另一优选例中,所述步骤(c)中,所述第二免疫细胞群中的细胞密度为 0.5-10×106cells/ml。
在另一优选例中,步骤(e)中,所述病毒为慢病毒。
在另一优选例中,所述的基因为肿瘤杀死基因。
在另一优选例中,步骤(e)中,所述的转染步骤中,所述的病毒与细胞的个数比为1-10:1。
在另一优选例中,步骤(f)中,所述的培养是在Wave设备中进行培养。
在另一优选例中,所述的培养在wave培养袋中进行。
在另一优选例中,所述的wave培养袋的规格为2L-10L。
在另一优选例中,Wave参数:温度35-39℃,Gas Flow 0.08-0.15L/min, CO2 4-6%,Rocking Speed 10-18rpm,Rocking angle 6-10°。
在另一优选例中,所述的步骤(f)中,所述的培养后,用Dynamag CTS 对激活磁珠进行去除。
在另一优选例中,所述的步骤(f)还包括对培养的第四免疫细胞群进行浓缩,所述的浓缩是在Sepax C-pro设备上进行;
在另一优选例中,用Sepax C-pro的“culturewash”程序进行浓缩,所述的culturewash参数包括选自下组的一种或多种如下:
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而又深入的研究,首次意外开发一种基因修饰的免疫细胞的制备方法,本发明的细胞制备方法能够快速制备免疫细胞且制备的免疫细胞具有高质量,从而能够保证临床疗效。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用,术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用,不仅包括开放式定义,还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之,所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
制备方法
本发明提供一种基因修饰的免疫细胞的制备方法,所述的方法包括步骤:
(a)提供含待进行基因修饰的免疫细胞的样本;
(b)对所述样本进行分选,从而获得富含免疫细胞的第一免疫细胞群;
(c)对所述的第一免疫细胞群进行激活处理,从而获得经激活的第二免疫细胞群;
(d)对所述的经激活的第二免疫细胞群进行转染前培养(pre-transfectionculturing,也称为预培育),从而获得预培养的第三免疫细胞群;
(e)采用病毒载体,通过转染,对所述的经激活的第三免疫细胞群进行基因修饰,从而获得经基因修饰的第四免疫细胞群;
(f)对所述的经基因修饰的第四免疫细胞群进行转染后培养 (post-transfection culturing),从而获得经培养的第四免疫细胞群,即所述的基因修饰的免疫细胞;
其中,所述方法具有选自下组的一个或多个特征:
(i)在步骤(c)中,采用激活磁珠进行激活,并且所述激活磁珠与所述的细胞的个数比为0.5-5:1;
(ii)在步骤(e)中,将所述病毒和所述的经激活的第四免疫细胞群进行混合,并孵育一段时间te,并且在孵育后不进行离心操作;
(iii)在步骤(f)中,在培养时,基于培养体系中的免疫细胞的密度采用不同的灌流方式:当免疫细胞的密度<2×106细胞/ml时,不进行灌流;当免疫细胞的密度≥2×106细胞/ml且<4×106细胞/ml时,按0.5V/天-1V/天的速率进行灌流,其中V为培养体系的体积;当免疫细胞的密度≥4×106细胞/ml时,按1V/ 天-2V/天的速率进行灌流,其中V为培养体系的体积。
在另一优选例中,在步骤(c)中,所述的第一免疫细胞群的密度为0.5-10×106cells/ml。
本发明所述的方法能够快速的制备细胞,制备时间短,从而有利于工业化生产。
优选地,所述方法还具有选自下组的一个或多个特征:
(t1)步骤(b)至(f)的总时间t(b-f)为4-5天;
(t2)步骤(f)的培养时间tf为1.0-3.5天。
在本发明的另一优选例中,所述激活磁珠与所述的细胞的个数比为1-5:1;
在本发明的另一优选例中,步骤(b)包括:将所述样本与分选磁珠进行混合,对混合物孵育一段时间tb,然后分选出富含免疫细胞的第一免疫细胞群;
优选地,所述的tb为10-30分钟,较佳地10-25分钟。
在另一优选例中,步骤(c)包括:将所述的第一免疫细胞群和激活磁珠进行混合,对混合物孵育一段时间tc,从而获得经激活的第二免疫细胞群;
在另一优选例中,步骤(c)的所述的tc为12-24小时。
在本发明的另一优选例中,所述的方法具有选自下组的一种或多种特征:
步骤(d)中,预培养时间td为1.5-3天,较佳地为1.5-2.5天;
步骤(e)中,转染培养时间te为0.5-2.5天,较佳地1-2天;和/或
步骤(f)中,转染后培养的时间tf为1-3.5天,较佳地1.5-3天。
在本发明的另一优选例中,所述方法还包括:
(f)当所述经培养的第四免疫细胞群的细胞数量或细胞密度达到预定值时,收获所述经培养的第四免疫细胞群。
在另一优选例中,所述的预定值为2×106细胞/ml~20×106细胞/ml。
在另一优选例中,在步骤(e)中,将所述病毒和所述的经激活的第四免疫细胞群进行混合,并孵育一段时间te,获得孵育液;对所述孵育液用培养基进行按体积计0.5-2倍(较佳地0.75-1.5倍)的稀释,从而获得经稀释的孵育液。
在另一优选例中,在步骤(f)中,对经稀释的孵育液孵育0.5-1.5天,然后接种至生物反应器如Xuri Wave,进行继续培养1-7天。
在本发明所述的方法中,所述的样本并没有特别的限定,优选地,所述的样本包括(但不限于):血液、细胞、新鲜单采物、冻存单采物、PBMC采集物,或其组合。
在另一优选例中,所述的免疫细胞包括(但不限于):T细胞、NK细胞,或其组合。
在本发明的另一优选例中,在对所述样本进行分选前,对样品进行洗涤。
在另一优选例中,所述的洗涤包括步骤:向细胞样本中加入洗涤液后混合,离心,去除上清液,得到沉淀。本发明所述的洗涤可以在Sepax 2、Sepax C-pro、 Sefia、Lovo、CS5+、CS Elite或Prodigy设备上进行。
在另一优选例中,所述的洗涤在Sepax C-pro设备上进行。
Sepax C-Pro是一种全自动封闭式细胞处理系统,是生产细胞治疗产品时用于处理细胞的一种自动化、功能性封闭技术产品,与软件方案和套件联用,可实现多种处理步骤的多功能组合,包括但不限于各种来源细胞的富集、分离、洗涤、浓缩、稀释和分袋(脐带血、骨髓、外周血、脂肪、培养细胞等)。
代表性地,用Sepax C-pro的“Beadwash”程序进行的样本洗涤和磁珠孵育,Beadwash参数包括选自如上表A中的一种或多种参数。
在另一优选例中,在步骤(b)中,所述的分选包括正分选或负分选。
在另一优选例中,在步骤(b)中,所述的分选包括通过加入分选磁珠进行分选,所述的分选磁珠含有与免疫细胞表面标记物(如CD4和/或CD8)结合的捕获体,所述的分选磁珠通过捕获体与免疫细胞表面标记物结合,形成分选磁珠-细胞复合物,从而获得富含免疫细胞的第一免疫细胞群。
在一个优选例中,所述的捕获体为抗体。所述的抗体可以为为特异性抗体。代表性地,所述的抗体选自下组:CD4+抗体、CD8+抗体,或其组合。
在另一优选例中,所述的细胞表面标记物选自下组:CD4+、CD8+,或其组合。本发明所述的捕获体可以与所述的细胞表面标记物特异性结合。
在本发明的另一优选例中,所述的分选磁珠为含CD4+抗体和CD8+抗体的分选磁珠。
在本发明的另一优选例中,所述步骤(c)中,所述的激活磁珠为CD3+、 CD28+或其组合型激活磁珠。
代表性地,所述的激活磁珠为Dynabeads。
在另一优选例中,所述步骤(c)中,所述第二免疫细胞群中的细胞密度为 0.5-10×106cells/ml。
在本发明的另一优选例中,步骤(e)中,所述病毒为慢病毒。
在另一优选例中,所述的基因为肿瘤杀死基因。
在另一优选例中,步骤(e)中,所述的转染步骤中,所述的病毒与细胞的个数比为1-10:1。
在本发明的另一优选例中,步骤(f)中,所述的培养是在Wave设备中进行培养。
在另一优选例中,所述的培养在wave培养袋中进行。
在另一优选例中,所述的wave培养袋的规格为2L-10L。
在另一优选例中,Wave参数:温度35-39℃,Gas Flow 0.08-0.15L/min, CO2 4-6%,Rocking Speed 10-18rpm,Rocking angle 6-10°。
在另一优选例中,所述的步骤(f)中,所述的培养后,用Dynamag CTS 对激活磁珠进行去除。
在另一优选例中,所述的步骤(f)还包括对培养的第四免疫细胞群进行浓缩,所述的浓缩是在Sepax C-pro设备上进行;
优选地,用Sepax C-pro的“culturewash”程序进行浓缩,所述的culturewash 参数包括选自下组的一种或多种如下:
本发明的主要优点主要包括:
本发明的细胞制备方法能够快速制备免疫细胞,降低了企业的成本,提高了生产产能,适合工业化生产,同时本发明的细胞制备方法制备的免疫细胞具有高质量,能够保证临床疗效。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1用于细胞免疫疗法的细胞制备方法
1.细胞培养:
所有的细胞培养均在正常细胞培养条件下进行。
2.制备方法
(1)提供细胞样本:
复苏10~440ml冻存表达CD4+和CD8+的细胞(血液样本),作为细胞样本。
(2)洗涤和分选步骤:
使用Sepax C-Pro“beadWash”程序进行细胞洗涤和用含CD4+抗体和CD8+抗体的分选磁珠孵育,设置参数如下表1所示:
表1 Sepax Pro Beadwash参数设置
Sepax Pro“beadWash”程序的工作如下:
向细胞样本中加入洗涤液pH7.2 PBS缓冲液后混合,离心,去除上清液,得到沉淀。
向所述沉淀中加入分选液进行孵育10-30min,得到孵育混合液,其中,所述的分选液为含有分选磁珠的液pH7.2 PBS缓冲液,分选磁珠的体积用量= CD4/CD8淋巴细胞量/[(200~800)×106/ml],所述的分选磁珠含有CD4+抗体和 CD8+抗体作为捕获体,所述的分选磁珠通过CD4+抗体和CD8+抗体与细胞表面的CD4+和CD8+特异性结合,形成分选磁珠-细胞复合物。
在该步骤(2)中,发现当孵育时间过低会影响目的细胞的结合,细胞与磁珠孵育时间过短会或导致部分目的细胞不能与分选磁珠相结合,影响分选效率,然后当孵育时间过长时,细胞的生长状态不佳。当分选磁珠的体积用量过低时导致部分目的细胞不能被标记,影响分选效率,当磁珠用量过高会增加磁珠孵育清洗后的残留量,占据分选柱结合位点,影响分选效果。
使用CliniMacs设备所述的孵育混合液中分离得到分选磁珠-细胞复合物 pH7.2PBS缓冲液。
CliniMacs设备工作如下:
首先利用磁场对分选磁珠-细胞复合物进行吸附,去除孵育混合液中液体,然后,去除磁场,用pH7.2 PBS缓冲液冲洗分选磁珠-细胞复合物,得到分选磁珠-细胞复合物pH7.2 PBS缓冲液。
(3)细胞激活步骤:
将分选磁珠-细胞复合物pH7.2 PBS缓冲液离心,去除上清液,得到含有分选磁珠-细胞复合物的沉淀,使用培养基重悬后加入含有用于激活细胞的激活磁珠(Dynabeads)的细胞培养液,得到细胞混合液,孵育12-24后进行后续操作,其中,在所述的细胞混合液中,所述的激活磁珠与所述的细胞的个数比为0.5 -5:1,激活的细胞的密度为0.5-10×106cells/ml。
在该步骤(4)中,发现激活磁珠使用量比例过高,可能会造成淋巴T细胞的过度活化和磁珠去除时残留量的增加;细胞过度活化会造成细胞的凋亡和分化,磁珠量过多易造成磁铁吸附能力过载,造成细胞终产品中磁珠残留过多,风险度高。当激活密度过高或过低会影响细胞与激活磁珠的接触几率,从而影响磁珠对细胞的激活效果,进而影响细胞的扩增。
(4)转染步骤:
对细胞混合液进行培养2天后,用携带目的基因的病毒转染细胞,携带目的基因的病毒与细胞的个数比(MOI)为1-10:1,孵育2天后,得到孵育液,向孵育液中加入同体积的细胞培养液对病毒进行稀释1倍,继续培养1天,然后将细胞接种至Xuri Wave中继续培养,在Wave中培养1-2天后结束培养,得到携带目的基因的细胞混合液,其中细胞培养Wave参数:温度37℃,Gas Flow 0.1L/min,CO2 5%,Rocking Speed 10-18rpm,Rocking angle 6-10°。
在该步骤(5)中,发现Wave培养温度过低或过高会影响细胞的代谢生长速率;CO2比例,气体流速,摇摆角度和速率的过低过高,会影响溶氧率等培养条件抑制细胞的生长,使用Wave培养可对上述参数进行严格控制。
(5)去除激活磁珠步骤:
使用Dynamag CTS设备对携带目的基因的细胞混合液中的激活磁珠进行去除,得到去除激活磁珠的细胞混合液;
(6)细胞灌流
对去除激活磁珠的细胞混合液进行培养,培养过程中进行灌流(流动补充培养基,保持细胞培养液为500ml),得到培养的细胞液,灌流如下表2所示:
表2细胞灌流培养
灌流速率 | 细胞密度 |
不进行灌流 | 细胞密度<2×10<sup>6</sup>cell/ml |
0.25~0.5L/day | 2×10<sup>6</sup>cell/ml≤细胞密度<4×10<sup>6</sup>cell/ml |
0.5~1L/day | 4×10<sup>6</sup>cell/ml≤细胞密度 |
(7)细胞浓缩和分装冻干:
对步骤(7)得到的细胞液进行洗涤浓缩后,加入冻干保护液后,分装,冷冻干燥得到基因修饰的细胞。
其中,用Sepax C-pro的“culturewash”程序进行细胞洗涤浓缩步骤,所述的culturewash参数如下表3所示:
表-3 Culturewash参数设置
3、实验结果
按照上述的方法多次进行平行实验,考察不同的工艺参数,结果如下:
3.1在步骤(2)洗涤孵育中,使用Sepax Pro“beadWash”程序进行洗涤孵育步骤后,其中,单核细胞和淋巴细胞的回收率如表4所示。
表4单核细胞和淋巴细胞的回收率
从表4中可以看出,使用Sepax Pro“beadWash”对细胞样本进行洗涤孵育后,细胞回收率高达90%以上,表明使用Sepax Pro“beadWash”对细胞样本进行洗涤孵育基本上不会导致细胞损失。
3.2在步骤(3)分选步骤中,使用CliniMacs进行细胞分选,细胞的回收率如表5所示:
表5细胞的回收率
细胞样本中CD4<sup>+</sup>+CD8<sup>+</sup>T cell个数 | 1832.7×10<sup>6</sup> |
分选后CD4<sup>+</sup>+CD8<sup>+</sup>T cell个数 | 1500×10<sup>6</sup> |
分选CD4<sup>+</sup>+CD8<sup>+</sup>T cell回收率 | 82% |
从表5中可以看出,使用CliniMacs对细胞样本进行细胞分选后,细胞回收率高达80%以上,表明CliniMacs对细胞样本进行细胞分选后,能够收集大部分目的细胞。
3.3在步骤(5)的转染步骤中,在细胞混合液中培养到第1天后检测细胞激活比例,病毒转染后继续孵育细胞2天。第1天的细胞激活比例,第3、4天的细胞量和细胞阳性率如表6所示:
表6步骤(4)的细胞激活步骤中的激活效果
从表6中可以看出,步骤(4)的细胞混合液经过1天的培养,高达85%的细胞都处于活化状态,表明细胞激活效果良好,继续培养细胞能够持续扩增且高效表达转基因表达物。
3.4在本实施例细胞的制备方法中,分别在步骤(1)的细胞样本(开始的血药样本)、在步骤(3)的分选后和步骤(5)的转染步骤中病毒转染后继续孵育细胞2 天时的细胞亚群信息,结果如表7所示:
表7细胞亚群信息
备注:Tnaive:naive T cell;Tcm:Central Memory T cell。
从表7中可以看出,在细胞的制备过程中,Tnaive和Tcm细胞比例不断增加,表明在制备过程中,细胞的活力不断增强。
3.5使用Dynamag CTS去除dynabeads前后的细胞回收率和活率如表8所示:
表8Dynamag CTS去除dynabeads前后的细胞回收率和活率
从表8中可以看出,Dynamag CTS去除dynabeads能够保证细胞具有较高的回收率和活率。
3.6细胞洗涤浓缩工艺实验
使用Sepax Pro对细胞样本进行洗涤浓缩前后的细胞回收率和存活率如表 9所示:
表9细胞洗涤浓缩前后的细胞回收率和存活率
从表9中可以看出,使用Sepax Pro对细胞样本进行洗涤浓缩前后具有优异的细胞回收率和存活率。
3.7细胞分装工艺实验
使用Cell Connect分装管路或Sefia对细胞样本进行分装,可保证分装时输出体积的准确及细胞密度的一致性,结果如表10所示:
表10
Cell Connect分装管路 | 设定值/理论值 | 实际体积 |
分装第一袋样本体积 | 88ml | 86ml |
分装第一袋样本浓度 | 16×10<sup>6</sup>/ml | 16.4×10<sup>6</sup>/ml |
分装第二袋样本体积 | 880ml | 86ml |
分装第二袋样本浓度 | 16×10<sup>6</sup>/ml | 16.4×10<sup>6</sup>/ml |
Sefia | 设定值/理论值 | 实际体积 |
分装第一袋样本体积 | 88ml | 86.2ml |
分装第一袋样本浓度 | 12×10<sup>6</sup>/ml | 12×10<sup>6</sup>/ml |
分装第二袋样本体积 | 88ml | 82.4ml |
分装第二袋样本浓度 | 12×10<sup>6</sup>/ml | 11.7×10<sup>6</sup>/ml |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种基因修饰的免疫细胞的制备方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(a)提供含待进行基因修饰的免疫细胞的样本;
(b)对所述样本进行分选,从而获得富含免疫细胞的第一免疫细胞群;
(c)对所述的第一免疫细胞群进行激活处理,从而获得经激活的第二免疫细胞群;
(d)对所述的经激活的第二免疫细胞群进行转染前培养(pre-transfectionculturing,也称为预培育),从而获得预培养的第三免疫细胞群;
(e)采用病毒载体,通过转染,对所述的经激活的第三免疫细胞群进行基因修饰,从而获得经基因修饰的第四免疫细胞群;
(f)对所述的经基因修饰的第四免疫细胞群进行转染后培养(post-transfectionculturing),从而获得经培养的第四免疫细胞群,即所述的基因修饰的免疫细胞;
其中,所述方法具有选自下组的一个或多个特征:
(i)在步骤(c)中,采用激活磁珠进行激活,并且所述激活磁珠与所述的细胞的个数比为0.5-5:1;
(ii)在步骤(e)中,将所述病毒和所述的经激活的第四免疫细胞群进行混合,并孵育一段时间te,并且在孵育后不进行离心操作;
(iii)在步骤(f)中,在培养时,基于培养体系中的免疫细胞的密度采用不同的灌流方式:当免疫细胞的密度<2×106细胞/ml时,不进行灌流;当免疫细胞的密度≥2×106细胞/ml且<4×106细胞/ml时,按0.5V/天-1V/天的速率进行灌流,其中V为培养体系的体积;当免疫细胞的密度≥4×106细胞/ml时,按1V/天-2V/天的速率进行灌流,其中V为培养体系的体积。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还具有选自下组的一个或多个特征:
(t1)步骤(b)至(f)的总时间t(b-f)为4-5天;
(t2)步骤(f)的培养时间tf为1.0-3.5天。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(b)包括:将所述样本与分选磁珠进行混合,对混合物孵育一段时间tb,然后分选出富含免疫细胞的第一免疫细胞群。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法具有选自下组的一种或多种特征:
步骤(d)中,预培养时间td为1.5-3天,较佳地为1.5-2.5天;
步骤(e)中,转染培养时间te为0.5-2.5天,较佳地1-2天;和/或
步骤(f)中,转染后培养的时间tf为1-3.5天,较佳地1.5-3天。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
(f)当所述经培养的第四免疫细胞群的细胞数量或细胞密度达到预定值时,收获所述经培养的第四免疫细胞群。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(e)中,将所述病毒和所述的经激活的第四免疫细胞群进行混合,并孵育一段时间te,获得孵育液;对所述孵育液用培养基进行按体积计0.5-2倍(较佳地0.75-1.5倍)的稀释,从而获得经稀释的孵育液。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的样本选自下组:血液、细胞、新鲜单采物、冻存单采物、PBMC采集物,或其组合。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在对所述样本进行分选前,对样品进行洗涤。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的激活磁珠为Dynabeads。
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