CN117771273A - 一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，涉及细胞疗法技术领域。有以下步骤：通过手术或穿刺获取肿瘤组织，将实体肿瘤组织润洗后切成2～3mm3的小块，进行11～14天的Pre‑REP培养，Pre‑REP培养11～14天后，对管中的Pre‑REP TIL进行收获，将CRISPR gRNA与Cas9核酸酶混合形成RNP，将与RNP后，使用电转仪，进行电转，将电转后的细胞进行恢复培养，然后进行快速扩增，成品收获。本发明中，在模拟肿瘤微环境的低氧或体外诱导T细胞耗竭系统中，未改造TIL对照对靶细胞的杀伤效力因低氧或发生耗竭而大幅下降，但OTUB1敲除TIL维持了杀伤效力，证明敲除OTUB1能使TIL抵抗肿瘤微环境中低氧或反复抗原刺激和抑制性细胞因子诱导的耗竭。
Description
技术领域
本发明涉及淋巴细胞疗法技术领域，具体为一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法。
背景技术
目前在实体肿瘤治疗中最具潜力的是TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)疗法，TIL是浸润到肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，大多数情况下以T细胞为主，对肿瘤起识别和杀伤作用。TIL疗法是从肿瘤附近组织中分离出TIL细胞，在体外大量扩增后回输到患者体内，从而扩大免疫应答，治疗肿瘤。未经过基因改造的TIL治疗末线恶性黑色素瘤和宫颈癌的客观缓解率(ORR)为40％左右，部分患者的完全响应(CR)能持续十年。对于PD-1抗体没有响应的临床上极难治疗的晚期肺癌患者，ORR也可达到21.4％。目前，TIL治疗其他实体瘤的研究正在进行中。
然而上述中，结构复杂、免疫抑制性强的肿瘤微环境对TIL发挥抗肿瘤作用造成了巨大障碍：低氧、酸性、营养不足、高浓度免疫抑制性细胞因子等抑制了T细胞的增殖和对肿瘤的杀伤作用，造成了T细胞的耗竭甚至凋亡。若能够通过对TIL进行基因编辑以提高其对肿瘤微环境的抗性，促进TIL和其他抗肿瘤免疫细胞发挥抗肿瘤作用，则经此改造后TIL在实体瘤中的疗效将大幅提升，恶性实体瘤患者的生存时间将明显延长甚至完全治愈，使TIL克服免疫抑制性微环境的另一种思路是通过IL-12、IL-18、TNF-α等肿瘤微环境重塑因子，临床上已经有体外合成重组肿瘤微环境重塑因子对患者全身使用的经验，但产生了较严重的全身毒性。TIL作为一个杀伤肿瘤的工具的同时，也可以作为合成、运载和分泌大分子药物的工具；而后者是往往被人忽视的。过表达肿瘤微环境重塑因子的TIL在回输人体后浸润到肿瘤微环境中，可更为精准地合成分泌这些重塑因子，在使肿瘤微环境更加利于免疫细胞发挥抗肿瘤作用的同时显著减少全身毒性。使用TIL作为肿瘤微环境重塑因子载体的尝试极少，仅有美国国立癌症研究院的Rosenberg博士团队曾在回输的T细胞中过表达细胞因子IL-12，浸润到微环境中的T细胞分泌的IL-12起到了重塑肿瘤微环境、提高T细胞疗法效能的作用，但遗憾的是其毒性仍然较强，且逆转录病毒介导的转基因随机插入基因组，有导致T细胞恶变的风险，因此，本领域的技术人员提供了一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了开发了一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具，对TIL中的OTUB1基因进行敲除，然后再进行快速扩增从而制备的新一代TIL疗法。这一基因编辑能够增强TIL对肿瘤微环境的抗性/适应性，促进TIL发挥抗肿瘤作用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，包括有以下步骤：
S1，通过手术或穿刺获取肿瘤组织；
S2，将实体肿瘤组织润洗后切成2～3mm3的小块，进行11～14天的Pre-REP培养；
S3，Pre-REP培养11～14天后，进行收获；
S4，与Cas9核酸酶混合形成RNP；
S5，使用电转仪，进行电转；
S6，将电转后的细胞进行恢复培养，然后进行快速扩增；
S7，成品收获。
将实体肿瘤组织润洗后切成2～3mm3的小块，每个组织小块放入24孔板的一个孔中，并使用WMS-LCM0培养基(90％)+胎牛血清(10％)进行11～14天的Pre-REP培养，期间根据细胞生长情况进行换液和分孔；
Pre-REP培养11～14天后，将各孔内容物转移到装有0.4μm细胞滤网的50mL离心管里，通过细胞滤网过滤掉肿瘤组织块和其他杂质，对管中的进行两次离心洗涤(1300rpm，5分钟)后计数；
使用将重悬至0.5～1.5×108/mL，与RNP混匀后，加入20μL或100μL电击杯中，整个过程应保证轻柔无气泡；
对电转后的细胞进行计数，然后按照0.5～2.0×106/瓶的量接种到培养瓶中，加入适量REP培养基I进行快速扩增；
快速扩增一般需要14天，期间根据细胞生长情况进行换液和分瓶，并检测编辑效率；
快速扩增结束后，进行成品收获与冻存，目标基因OTUB1序列为：GCGCTGTTTAAAGATGGCGG；
优选的，使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具，对TIL中的OTUB1基因进行敲除。
优选的，然后再进行快速扩增从而制备的新一代TIL疗法。这一基因编辑能够增强TIL对肿瘤微环境的抗性/适应性，促进TIL发挥抗肿瘤作用。
优选的，pre-REP阶段和REP(rapid expansion protocol)阶段可以使用不同的刺激性细胞因子和通路抑制剂的组合。
优选的，pre-REP阶段的特点包括采用一组特定的细胞因子，控制T细胞的激活和分化。
优选的，电转技术依靠的是物理方法，细胞表面的分子特性对电转影响比较小。相比化学转染方法和病毒载体转染方法，电转可以用在所有的细胞种类上，而且容易定量控制。
(三)有益效果
本发明提供了一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法。具备以下有益效果：
本发明中，利用CRISPR/Cas9在人的TIL中高效率敲除OTUB1后，并未观察到小鼠T细胞中所见的杀伤显著增强表型，在靶细胞刺激后细胞因子分泌方面，OTUB1敲除TIL与未改造TIL对照相比，也无明显差异。然而在模拟肿瘤微环境的体外低氧环境中，对照T细胞对靶细胞的杀伤效力大幅下降，而OTUB1敲除TIL维持了杀伤效力，与对照相比体现了显著的优势，这一现象的分子机制可能与OTUB1敲除T细胞中适应低氧代谢的重要酶基因能够快速诱导至更高水平有关。在模拟肿瘤微环境的体外诱导T细胞耗竭系统中，未改造TIL对照对靶细胞的杀伤效力因发生耗竭而大幅下降，但OTUB1敲除TIL维持了杀伤效力，证明敲除OTUB1能使TIL抵抗反复抗原刺激和抑制性细胞因子诱导的耗竭。
附图说明
图1为本发明的整体流程示意图；
图2为OTUB1敲除在正常培养条件下对T细胞杀伤能力无显著影响的示意图；
图3为本发明中OTUB1敲除及其对照T细胞在不同效靶比下对黑色素瘤靶细胞的杀伤，显示OTUB1敲除未能显著提高杀伤能力；OTUB1敲除及其对照T细胞对荷载了不同浓度抗原肽的T细胞杀伤，显示OTUB1敲除未能显著提高对抗原的亲和力的示意图；
图4为在蛋白水平验证OTUB1的敲除的示意图；
图5为OTUB1敲除对T细胞受黑色素瘤靶细胞刺激后生成细胞因子的能力并无十分显著的影响的示意图；
图6为OTUB1敲除T细胞与对照T细胞在正常培养条件和体外诱导耗竭后的杀伤能力的示意图；
图7为OTUB1敲除T细胞与对照T细胞在正常培养条件和低氧培养条件下的杀伤能力的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
如图1所示，本发明实施例提供一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，通过手术或穿刺获取肿瘤组织将实体肿瘤组织润洗后切成2.5mm3的小块，每个组织小块放入24孔板的一个孔中，并使用WMS-LCM0培养基(90％)+胎牛血清(10％)进行11天的Pre-REP培养，期间根据细胞生长情况进行换液和分孔，完成Pre-REP培养后，将各孔内容物转移到装有0.4μm细胞滤网的50mL离心管里，通过细胞滤网过滤掉肿瘤组织块和其他杂质，对管中的进行两次离心洗涤(1300rpm，5分钟)后计数，重悬至0.5～1.5×108/mL，与RNP混匀后，加入20μL或100μL电击杯中，整个过程应保证轻柔无气泡，对管中的进行收获；将与Cas9核酸酶混合形成RNP；将与RNP后，使用电转仪，进行电转，对电转后的细胞进行计数，然后按照0.5～2.0×106/瓶的量接种到培养瓶中，加入适量REP培养基I进行快速扩增，将电转后的细胞进行恢复培养，然后进行快速扩增，快速扩增一般需要14天，期间根据细胞生长情况进行换液和分瓶，并检测编辑效率快速，扩增结束后，进行成品收获与冻存，目标基因OTUB1序列为：GCGCTGTTTAAAGATGGCGG。
实施例二：
如图1所示，本发明实施例提供一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，通过手术或穿刺获取肿瘤组织将实体肿瘤组织润洗后切成3mm3的小块，每个组织小块放入24孔板的一个孔中，并使用WMS-LCM0培养基(90％)+胎牛血清(10％)进行14天的Pre-REP培养，期间根据细胞生长情况进行换液和分孔，进行14天的Pre-REP培养，将各孔内容物转移到装有0.4μm细胞滤网的50mL离心管里，通过细胞滤网过滤掉肿瘤组织块和其他杂质，对管中的进行两次离心洗涤(1300rpm，5分钟)后计数，使用将重悬至0.5～1.5×108/mL，与RNP混匀后，加入20μL或100μL电击杯中，整个过程应保证轻柔无气泡，对管中的进行收获；将与Cas9核酸酶混合形成RNP；将与RNP后，使用电转仪，进行电转，对电转后的细胞进行计数，然后按照0.5～2.0×106/瓶的量接种到培养瓶中，加入适量REP培养基I进行快速扩增，将电转后的细胞进行恢复培养，然后进行快速扩增，快速扩增一般需要14天，期间根据细胞生长情况进行换液和分瓶，并检测编辑效率快速，扩增结束后，进行成品收获与冻存，目标基因OTUB1序列为：GCGCTGTTTAAAGATGGCGG。
工作原理：OTUB1被认为是T细胞增殖和效应器作用的负调控因子，但其参与抵抗低氧和耗竭的作用却未得到关注,利用CRISPR/Cas9在人的TIL中高效率敲除OTUB1后，并未观察到小鼠T细胞中所见的杀伤显著增强表型，在靶细胞刺激后细胞因子分泌方面，OTUB1敲除TIL与未改造TIL对照相比，也无明显差异。然而在模拟肿瘤微环境的体外低氧环境中，对照T细胞对靶细胞的杀伤效力大幅下降，而OTUB1敲除TIL维持了杀伤效力，与对照相比体现了显著的优势，这一现象的分子机制可能与OTUB1敲除T细胞中适应低氧代谢的重要酶基因能够快速诱导至更高水平有关。在模拟肿瘤微环境的体外诱导T细胞耗竭系统中，未改造TIL对照对靶细胞的杀伤效力因发生耗竭而大幅下降，但OTUB1敲除TIL维持了杀伤效力，证明敲除OTUB1能使TIL抵抗反复抗原刺激和抑制性细胞因子诱导的耗竭。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：包括有以下步骤：
S1，通过手术或穿刺获取肿瘤组织；
S2，将实体肿瘤组织润洗后切成2～3mm3的小块，进行11～14天的Pre-REP培养；
S3，Pre-REP培养11～14天后，对管中的Pre-REP TIL进行收获；
S4，将CRISPR gRNA与Cas9核酸酶混合形成RNP；
S5，将Pre-REP TIL与RNP后，使用电转仪，进行电转；
S6，将电转后的细胞进行恢复培养，然后进行快速扩增；
S7，成品收获。
2.根据权利要求1所述的一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：将实体肿瘤组织润洗后切成2～3mm3的小块，每个组织小块放入24孔板的一个孔中，并使用WMS-LCM0培养基(90％)+胎牛血清(10％)进行11～14天的Pre-REP培养，期间根据细胞生长情况进行换液和分孔。
3.根据权利要求1所述的一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：Pre-REP培养11～14天后，将各孔内容物转移到装有0.4μm细胞滤网的50mL离心管里，通过细胞滤网过滤掉肿瘤组织块和其他杂质，对管中的Pre-REP TIL进行两次离心洗涤(1300rpm，5分钟)后计数。
4.根据权利要求1所述的一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：使用Lonza P3 Buffer将Pre-REP TIL重悬至0.5～1.5×108/mL，与RNP混匀后，加入20μL或100μL电击杯中，整个过程应保证轻柔无气泡。
5.根据权利要求1所述的一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：使用电转仪，选取适合的电转参数，进行电转，将细胞转移至恢复培养基中，进行1～3小时恢复培养。
6.根据权利要求1所述的一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：对电转后的细胞进行计数，然后按照0.5～2.0×106/瓶的量接种到培养瓶中，加入适量REP培养基I进行快速扩增。
7.根据权利要求1所述的一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：快速扩增一般需要14天，期间根据细胞生长情况进行换液和分瓶，并检测编辑效率。
8.根据权利要求1所述的一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法，其特征在于：快速扩增结束后，进行成品收获与冻存，目标基因OTUB1 CRISPR gRNA序列为：GCGCTGTTTAAAGATGGCGG。
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