CN114752562A - 重组人tpm4蛋白促进cik细胞增殖、提高其杀伤力的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重组人TPM4蛋白促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的用途。本发明通过实验发现：1、重组人TPM4蛋白可以刺激CIK细胞促进其增殖；2、重组人TPM4蛋白可以刺激CIK细胞提高其对肿瘤的杀伤力。基于该发现，可以制备一种促进CIK细胞增殖并提高其对肿瘤杀伤力的培养基，基本培养基为RPMI1640培养基，在基本培养基配方基础上增加适量重组人TPM4蛋白。

Description

重组人TPM4蛋白促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的用途
技术领域
本发明涉及CIK细胞，尤其涉及重组人TPM4蛋白促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的用途。
背景技术
恶性肿瘤无论是在发生时还是在发展时都与宿主的免疫状态密切相关，而抗肿瘤免疫主要为细胞免疫。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)是癌症免疫治疗的理想候选细胞类型，可在体外诱导大量具有肿瘤杀伤作用的外周血单个核细胞，具有较强的抗肿瘤活性。
如何体外诱导CIK细胞大量增殖、提高其对肿瘤细胞的杀伤力是研究热点。
原肌球蛋白(TPM)是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白，是一种调节蛋白，它在肌肉收缩过程中起着很重要的作用，哺乳动物中的4个TPM基因已被确认，即TPM1、TPM2、TPM3、TPM4。关于TPM4的研究主要集中在肿瘤、与肌肉相关疾病领域，对CIK细胞体外培养的影响还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供重组人TPM4蛋白促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的用途。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
重组人TPM4蛋白用于体外促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的用途。
重组人TPM4蛋白用于制备促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的培养基用途。
一种促进CIK细胞增殖并提高其对肿瘤杀伤力的培养基，基本培养基为RPMI 1640培养基，在基本培养基配方基础上增加适量重组人TPM4蛋白。
本发明通过实验发现：1、重组人TPM4蛋白可以刺激CIK细胞促进其增殖；2、重组人TPM4蛋白可以刺激CIK细胞提高其对肿瘤的杀伤力。基于该发现，可以制备一种促进CIK细胞增殖并提高其对肿瘤杀伤力的培养基，基本培养基为RPMI 1640培养基，在基本培养基配方基础上增加适量重组人TPM4蛋白。
附图说明
图1是流式细胞仪对细胞表型的检测结果。
图2是各组吸光度值。
图3是体外杀伤力结果。
图4是各组移植瘤比较结果。
具体实施方式
实施例1：
一、实验材料
重组人TPM4蛋白(Recombinant Human TPM4 protein，UniProt ID:P67936)购自武汉菲恩生物科技有限公司。人外周血单个核细胞(PBMC)购自武汉赛奥斯生物科技有限公司。RPMI 1640培养基和FBS购自Gibco公司。流式抗体购自BD。白血病K562细胞和胃癌MGC-803细胞购自ATCC。BALB/C裸鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。
二、实验方法
1、PBMC的复苏、传代和冻存
1.1复苏
1)将恒温水浴锅中的水预热到37℃；
2)准备一支15mL离心管，加入5mL含10％FBS的RPMI 1640完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；
3)戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
4)将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；
5)准备一个T-25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4mL完全培养基；
6)离心完成后弃去上清，用1mL完全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
1.2传代(一传二)
1)当细胞汇合度达到85％以上时，可进行传代；
2)在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3)向培养瓶内加入3mL无菌的1×PBS后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；
4)向瓶内加入消化液1mL，浸润底面后放入37℃CO2培养箱中孵育1～2min；
5)孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2mL含10％FBS的完全培养基中，将悬液吸入15mL离心管；
6)1000rpm离心5min；
7)准备两个新的T-25培养瓶，各加入4mL完全培养基。
8)离心完成后，弃上清，用2mL完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1mL；
9)水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
1.3冻存(每瓶T-25冻一支)
1)～6)参照传代步骤
7)离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8mL冻存管中；
8)将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
9)第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。
2、PBMC细胞的培养
将PBMC细胞用含10％FBS的RPMI 1640培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，细胞培养至密度达约80％时传代。取生长状态良好的PBMC细胞用于诱导CIK细胞。诱导前流式测定CD3+CD56+表型细胞比例。具体方法为：调整细胞浓度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液于流式细胞仪专用试管中，用CD3-PerCP和CD56-APC流式抗体标记细胞，在4℃孵育30min后用流式细胞仪进行细胞表型分析。
2、CIK细胞诱导培养
取生长状态良好的PBMC细胞，PBS洗涤，用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬成细胞密度为2×106个/mL的细胞悬液，并加入重组人IFN-γ至终浓度为1000U/mL，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。24h后加人白介素IL-2至终浓度为1000U/mL和抗CD3单抗至终浓度为50ng/mL。每2～3d更换培养液并补加人白介素IL-2。培养15d后，收集细胞。流式测定CD3+CD56+表型细胞比例。具体方法为：调整细胞浓度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液于流式细胞仪专用试管中，用CD3-PerCP和CD56-APC流式抗体标记细胞，在4℃孵育30min后用流式细胞仪进行细胞表型分析。
3、CIK细胞增殖活性测定
收集诱导培养15d的CIK细胞，PBS洗涤，用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬成细胞密度为5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL。适应性培养24h后，TPM4组加入100μL含10％FBS和重组人TPM4蛋白的RPMI 1640培养基使得重组人TPM4蛋白的终浓度为500ng/mL、1000ng/mL，Blank组加入100μL含10％FBS的RPMI 1640培养基，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下继续培养48h后，每孔加入20μL CCK8试剂，继续培养4h，用酶标仪于450nm处测定各孔吸光值。
为了评价重组人TPM4蛋白对CIK细胞中CD3+CD56+表型细胞比例的影响，操作如下：收集诱导培养15d的CIK细胞，PBS洗涤，用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液，接种于10cm培养皿中。适应性培养24h后，加入终浓度为500ng/mL、1000ng/mL的重组人TPM4蛋白，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下继续培养48h后，收集细胞，流式测定CD3+CD56+表型细胞比例。设置不加重组人TPM4蛋白的对照。
4、CIK细胞体外杀伤力测定
效应细胞：收集诱导培养15d的CIK细胞，PBS洗涤，用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液，接种于10cm培养皿中。适应性培养24h后，刺激组加入终浓度为500ng/mL、1000ng/mL的重组人TPM4蛋白，常规组不加重组人TPM4蛋白，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下继续培养48h后，收集细胞，PBS洗涤，消化重悬。
靶细胞：白血病K562细胞。
共孵育步骤如下：
将生长状态良好的靶细胞用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬成细胞密度为5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL；将生长状态良好的效应细胞用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬成细胞密度为2.5×105个/mL的细胞悬液，接种于含有靶细胞的培养孔中，每孔100μL(相当于效靶比5:1)。同时设有空白对照孔、效应细胞对照孔和靶细胞对照孔。于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下继续培养18h后，每孔加入20μL CCK8试剂，继续培养4h，用酶标仪于450nm处测定各孔吸光值。
效应细胞对靶细胞的杀伤力根据如下公式计算：
杀伤力(％)＝[1-(共孵育孔-效应细胞对照孔)/(靶细胞对照孔-空白对照孔)]×100％。
5、CIK细胞体内杀伤力测定
CIK细胞：收集诱导培养15d的CIK细胞，PBS洗涤，用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液，接种于10cm培养皿中。适应性培养24h后，刺激组加入终浓度为1000ng/mL的重组人TPM4蛋白，常规组不加重组人TPM4蛋白，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下继续培养48h后，收集细胞，消化重悬。
移植瘤造瘤细胞：胃癌MGC-803细胞。
具体造瘤和注射治疗方法如下：
将生长状态良好的MGC-803细胞消化、用PBS洗涤重悬制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，皮下接种于状态良好的BALB/C裸鼠右腋皮下，每只0.2mL。14d后，挑选15只移植瘤大小基本一致的荷瘤裸鼠，随机分成对照组、常规组和刺激组，每组5只，常规组、刺激组分别在移植瘤部位注射0.2mL 1×107/mL的常规CIK细胞或重组人TPM4蛋白刺激的CIK细胞(溶媒为生理盐水)，对照组裸鼠注射等体积的生理盐水，隔天注射1次，共4次。最后一次注射CIK细胞2周后处死，剥离肿瘤块称重，根据公式计算抑瘤率。
抑瘤率(％)＝(对照组瘤重-常规组或刺激组瘤重)÷对照组瘤重×100％。
6、统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件进行分析，用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、PBMC细胞培养和CIK细胞诱导培养
流式细胞仪对细胞表型的检测结果如图1所示，CD3+CD56+表型细胞的比例从5％以下提高至约45％，说明CIK细胞诱导成功。
2、CIK细胞增殖活性
各组吸光度值如表1和图2所示，与Blank组相比，重组人TPM4蛋白刺激培养的TPM4组的吸光度值显著升高，说明重组人TPM4蛋白的刺激增强了CIK细胞的增殖活性。重组人TPM4蛋白刺激和不刺激的CIK细胞中CD3+CD56+表型细胞比例基本一致，结果见表1。
表1各组吸光度值和CD3+CD56+表型细胞比例
组别 吸光度值(450nm) CD3+CD56+表型细胞比例(％)
TPM4组(500ng/mL) 0.483±0.026 45.75±3.09
TPM4组(1000ng/mL) 0.758±0.025 44.92±3.13
Blank组(对照) 0.317±0.019 46.05±2.88
3、CIK细胞杀伤力
体外杀伤力结果如表2和图3所示，体内杀伤力结果如表2和图4(实验过程中每组均死去2只，存活3只)所示。体外杀伤力结果显示，重组人TPM4蛋白刺激培养的CIK细胞对肿瘤细胞明显具有更强的杀伤力力。体内杀伤力结果显示，注射重组人TPM4蛋白刺激培养的CIK细胞的裸鼠体内的移植瘤被抑制更明显。
表2各组杀伤力和抑瘤率
组别 杀伤力(％) 抑瘤率(％)
刺激组(500ng/mL) 26.50±2.85 /
刺激组(1000ng/mL) 43.59±2.74 74.8±6.3
常规组 14.65±2.42 32.7±5.5
上述实验结果可以说明：1、重组人TPM4蛋白可以刺激CIK细胞促进其增殖；2、重组人TPM4蛋白可以刺激CIK细胞提高其对肿瘤的杀伤力。
实施例2：
一种促进CIK细胞增殖并提高其对肿瘤杀伤力的培养基，基本培养基为RPMI 1640培养基，在基本培养基配方基础上增加适量重组人TPM4蛋白。

Claims (3)

1.重组人TPM4蛋白用于体外促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的用途。
2.重组人TPM4蛋白用于制备促进CIK细胞增殖、提高其杀伤力的培养基用途。
3.一种促进CIK细胞增殖并提高其对肿瘤杀伤力的培养基，基本培养基为RPMI 1640培养基，在基本培养基配方基础上增加适量重组人TPM4蛋白。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115305238A (zh) * 2022-09-19 2022-11-08 南京良纬生物科技有限公司 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用
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