CN111793641B - 甜樱桃PavSS或PavSPS基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途 - Google Patents

甜樱桃PavSS或PavSPS基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了甜樱桃PavSS或PavSPS基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途。本发明系统研究了甜樱桃7个PavSS基因和4个PavSPS基因在甜樱桃果实发育和成熟软化中的表达模式并分析了蔗糖对PavSS和PavSPS基因表达量的变化，进一步利用VIGS技术分析了PavSS和PavSPS在果实成熟软化过程中的基因功能，最终确定甜樱桃PavSS基因、PavSPS基因或由PavSS和PavSPS组成的融合基因具有调控甜樱桃果实着色或果实成熟软化的功能。由此，本发明提供了一种延迟甜樱桃果实着色或延迟果实成熟软化的方法，该方法能有效提高甜樱桃果实的贮藏期。

Description

甜樱桃PavSS或PavSPS基因在调控果实着色或果实成熟软化 中的用途
技术领域
本发明涉及甜樱桃基因的新用途，尤其涉及甜樱桃PavSS或PavSPS基因在调控甜樱桃果实着色或果实成熟软化中的新用途，属于甜樱桃PavSS或PavSPS基因的新功能领域。
背景技术
欧洲甜樱桃(Prunus avium.L)是目前北方落叶果树中栽培效益最好的树种之一，也是中国北方春季上市最早的鲜果，素有“春枝第一果”美誉。其色泽鲜艳、味道鲜美、营养丰富，富含多种碳水化合物、蛋白质、维生素、铁、钙、钾等人体必需的营养元素和矿物质等，深受人们喜爱。由于其果实发育期短，果实成熟过程中易软化变质，导致其货架期短，给果农、中间商和消费者造成严重的经济损失。因此，亟待需要明晰甜樱桃果实成熟软化的生理和分子机理，为提高果实的贮藏能力提供有力的科学依据。
蔗糖是植物光合作用同化产物输出的主要形式，同时也是水果中可溶性糖的主要组成部分，而且可作为信号分子参与调控果实发育和成熟。蔗糖代谢是果实中糖积累的过程中重要的代谢途径，直接影响果实甜度，并决定果实风味和品质，在果实成熟软化过程中起重要的作用。蔗糖合成酶类【蔗糖合酶(sucrose synthase,SS)和蔗糖磷酸合成酶(sucrose-phosphate synthase，SPS)】为蔗糖代谢的关键酶之一，在调节植物蔗糖代谢和运输方面具有重要的作用。SS在蔗糖代谢中催化蔗糖合成和分解，是一种可逆酶，其反应为：
Figure GDA0003701369710000011
Figure GDA0003701369710000012
通常认为分解作用是最主要的功能。SS主要参与淀粉、纤维素和ATP等的合成。SPS催化尿苷二磷酸葡糖(UDPG)和果糖–6–磷酸(F6P)生成蔗糖–6–磷酸(S6P)，此反应不可逆，是植物蔗糖合成过程中的限速酶，是提高蔗糖合成能力的主要靶基因。SPS在蔗糖代谢中影响“源”强和“库”强，调节光合产物在蔗糖和淀粉之间分配。因此鉴定和分析果实中的SS和SPS基因在果实成熟过程中对蔗糖积累、果实品质形成和果实成熟软化具有重要意义。然而，关于SS和SPS基因在甜樱桃果实发育和成熟中的分子机制尚不清楚，哪一个(或几个)SS和SPS基因在甜樱桃果实成熟软化过程中起重要作用等问题仍属空白。因此，非常有必要对甜樱桃SS和SPS家族成员在果实成熟软化过程中的功能展开研究，以期筛选到调控甜樱桃果实成熟软化的PavSS或PavSPS基因，为进一步研究甜樱桃果实成熟软化的分子机制提供基础。
发明内容
本发明的主要目的是提供甜樱桃PavSS或PavSPS基因在调控果实着色或果实成熟软化中的新用途
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了甜樱桃PavSS基因、PavSPS基因或由PavSS和PavSPS组成的融合基因在调控果实着色或果实成熟软化中的新用途，所述的PavSS基因是PavSS1基因；所述的PavSPS基因是PavSPSA1基因；所述的由PavSS和PavSPS组成的融合基因是由PavSS1基因和PavSPSA1基因组成的融合基因。
本发明还提供了甜樱桃PavSS1基因、PavSPSA1基因以及由PavSS和PavSPS组成的融合基因的靶基因片段，其中，PavSS1基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQID NO.4或SEQ ID NO.5所示；甜樱桃PavSPSA1基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；由PavSS和PavSPS组成的融合基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
相应的，含有PavSS基因、PavSPS基因或含有由PavSS基因和PavSPS组成的融合基因的靶标片段的干扰载体也属于本发明的保护范畴。
本发明通过试验发现，PavSS1基因、PavSPSA1基因以及由PavSS和PavSPS组成的融合基因的不同的靶标片段的基因沉默效率相差较大，当PavSS1基因的靶标片段为PavSS1-1(其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)，PavSPSA1的靶标片段为PavSPSA1-2(其核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)，基因沉默效率达85％以上；由PavSS和PavSPS组成的融合基因的靶基因片段为PavSS1-PavSPSA1-2(其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)时，侵染的甜樱桃果实中PavSS1和PavSS6基因的表达同时被显著降低，两个基因同时沉默效率达90％以上。
本发明进一步提供了一种延迟甜樱桃果实着色或延迟果实成熟软化的方法，包括：沉默或抑制甜樱桃中PavSS基因或PavSPS基因的表达；或者同时沉默或抑制甜樱桃中PavSS和PavSPS基因的表达；该方法能够有效延迟或抑制甜樱桃果实着色，进而提高甜樱桃果实的贮藏期；优选的，所述的PavSS基因是PavSS1基因，其靶基因片段的核苷酸序列为SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；所述的PavSPS基因是PavSPSA1基因，其靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；所述的由PavSS和PavSPS组成的融合基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本领域技术人员可以通过常规的沉默基因的方法将甜樱桃中PavSS基因或PavSPS基因进行沉默或抑制其表达，包括：将甜樱桃PavSS1基因的靶基因片段、PavSPSA1基因的靶基因片段或由PavSS和PavSPS组成的融合基因的靶基因片段与pTRV2载体可操作性的连接后得到干扰载体，将该干扰载体转化到农杆菌中，再通过农杆菌介导法转化到樱桃组织或细胞中，能够有效沉默甜樱桃中PavSS1基因或PavSPSA1基因的表达。
相反的，本发明提供了一种促进甜樱桃果实着色或果实成熟软化的方法，包括：将甜樱桃中PavSS基因或PavSPS基因在甜樱桃中进行过表达或超表达，能够促进甜樱桃果实着色或果实成熟软化。譬如：将PavSS基因、PavSPS基因或由PavSS和PavSPS组成融合基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化甜樱桃，使PavSS基因、PavSPS基因或由PavSS和PavSPS组成的融合基因在甜樱桃植物中进行过表达；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，编码基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。
将所述基因引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将所述基因提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick etal.Plant Cell Reports.1986.5:81-84)。
本发明更进一步提供了甜樱桃PavSS基因、PavSPS基因或由PavSS和PavSPS组成的融合基因在调控甜樱桃中蔗糖合成中的应用；其中，所述的PavSS基因是PavSS1基因；所述的PavSPS基因是PavSPSA1基因；所述的由PavSS和PavSPS组成的融合基因是由PavSS1基因和PavSPSA1基因组成的融合基因。
本发明系统研究了甜樱桃7个PavSS基因和4个PavSPS基因在甜樱桃果实发育和成熟软化中的表达模式，并分析了蔗糖对PavSS和PavSPS基因表达量的变化，进一步利用VIGS技术分析了PavSS和PavSPS在果实成熟软化过程中的基因功能，确定了甜樱桃PavSS1与PavSPSA1基因功能冗余调控果实着色和果实成熟软化的分子功能，为研究甜樱桃果实成熟软化的分子机理奠定理论基础。
本发明技术方案概述
本发明为了获得甜樱桃果实的PavSS和PavSPS家族基因成员，分别以拟南芥的4个SPS基因和7个SS基因的氨基酸序列为Query序列，在甜樱桃基因组数据库(http://cherry.kazusa.or.jp/map.html)中进行BLASP寻找，获得4个SPS基因和7个SS基因家族成员，分别命名为PavSPSA1、PavSPSA2、PavSPSB和PavSPSC；PavSS1、PavSS2、PavSS3、PavSS4、PavSS5、PavSS6和PavSS7。
为了分析甜樱桃果实发育与成熟过程中PavSS和PavSPS基因的表达特征，本发明利用实时荧光定量(qRT-PCR)分析了其在不同果实发育阶段的基因表达情况；试验结果显示：PavSS1、PavSS2和PavSS6基因的表达模式与甜樱桃果实的成熟过程较吻合，这些基因可能在果实成熟软化中起重要作用。同样地，本发明通过qRT-PCR分析了4个PavSPS基因在果实发育与成熟过程中基因的表达模式；试验结果表明：PavSPSA1和PavSPSA2基因在果实成熟软化过程中均上调表达，与甜樱桃果实的成熟软化过程吻合，可能与甜樱桃果实成熟软化有关。
本发明人前期研究证实外源蔗糖可作为一个信号分子，促进番茄和草莓果实成熟。为了进一步确定哪一个(或几个)PavSS和PavSPS基因影响甜樱桃果实成熟软化，本发明通过外施蔗糖确定是否可调控甜樱桃果实PavSS和PavSPS基因的表达而影响果实的成熟软化；试验结果表明PavSS1、PavSS6和PavSPSA1基因可能是蔗糖合成过程中的关键基因，或许调控甜樱桃果实的成熟软化。
为了确定PavSS1、PavSS6和PavSPSA1基因是否调控甜樱桃果实成熟软化功能，本发明通过病毒诱导基因沉默技术，将含有TRV::00(空白对照)和TRV::PavSS1、TRV::PavSS6、TRV::PavSPSA1、TRV::PavSS1-PavSPSA1的农杆菌菌液分别侵染甜樱桃栽培种‘布鲁克斯’。14天后提取侵染果实的总mRNA进行半定量PCR检测；试验结果发现，与TRV::00侵染的甜樱桃果实相比，TRV::PavSS1、TRV::PavSS6、TRV::PavSPSA1、TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染甜樱桃果实中均有1个靶标片段对应的PavSS1、PavSS6、PavSPSA1的表达量显著降低，基因沉默效率达85％以上，对应的靶标片段分别为PavSS1-1、PavSS6-3、PavSPSA1-2；而且靶基因片段TRV::PavSS1-PavSPSA1-2侵染的甜樱桃果实中PavSS1和PavSS6基因的表达同时被显著降低，两个基因同时沉默效率达90％以上。表明PavSS1、PavSS6、PavSPSA1和PavSS1-PavSPSA1基因分别被有效的沉默。侵染21天，表型观察发现：TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1侵染的甜樱桃果实与对照TRV::00相比，表皮呈浅红色或者黄白色(黄绿色)，TRV::00侵染的果实表皮颜色呈深红色。而TRV::PavSS6侵染的甜樱桃果实的表皮颜色也呈深红色，与对照相比，果实表型没有明显差异。同时沉默甜樱桃PavSS1和PavSPSA1基因的果实(TRV::PavSS1-PavSPSA1)表皮颜色呈黄绿色或浅绿色，而TRV::00侵染的果实的表皮颜色呈深红色。上述结果表明，沉默PavSS1和PavSPSA1基因延迟果实着色和果实成熟，且同时沉默PavSS1和PavSPSA1两个基因，果实着色和成熟缺陷更显著，暗示PavSS1、PavSPSA1可能功能冗余调控甜樱桃果实成熟。
为了进一步明确PavSS1和PavSPSA1是否调控甜樱桃果实成熟软化。本发明分析了花后55天(空载对照侵染的甜樱桃完全成熟)，TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实成熟软化的特征指标，包括花青素含量、ABA含量、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)和果实硬度。此外，还评估了与成熟相关的一些基因的表达量变化，包括ABA合成与降解的关键基因PavNCED1，影响果实硬度的相关基因PavPG1、PavXYL1和PavPL1，影响花青素合成的相关基因PavPAL、PavCHS、PavANS和PavDFR；试验结果显示：与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中花青素含量与ABA含量显著降低，表明PavSS1与PavSPSA1基因控制甜樱桃的果皮着色。TRV::PavSS1和TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实的果实硬度显著低于空白对照TRV::00侵染的甜樱桃果实的果实硬度，表明PavSS1与PavSPSA1基因影响甜樱桃果实软化。而且与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中花青素含量、ABA含量和果实硬度的变化达到极显著水平，暗示PavSS1与PavSPSA1调控甜樱桃果实着色和果实软化存在功能冗余。
可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)含量的测定结果发现：与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1侵染的甜樱桃果实中蔗糖含量显著降低，相反的果糖含量显著提高，而葡萄糖含量变化不显著。TRV::PavSPSA1侵染的甜樱桃果实的蔗糖含量与对照TRV::00相比显著降低，而果糖和葡萄糖的含量没有显著变化。然而TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)均显著低于TRV::00侵染的甜樱桃果实的可溶性糖成分，表明PavSS1与PavSPSA1可能是调控蔗糖合成的关键基因。
与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中成熟相关基因PavNCED1、PavPG1、PavXYL1、PavPL1、PavPAL、PavCHS、PavANS和PavDFR表达量显著下调，且TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中的上述成熟相关基因的表达量更是极显著下调。
综合上述的试验结果表明，甜樱桃PavSS1与PavSPSA1功能冗余调控果实着色和果实成熟软化。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
术语“RNA干扰”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。
附图说明
图1PavSSs家族基因的表达模式分析。
图2PavSPSs家族基因的表达模式分析。
图3外源蔗糖调节PavSSs家族基因的表达情况。
图4外源蔗糖调节PavSPSs家族基因的表达情况。
图5TRV介导PavSS1、PavSS6与PavSPSA1基因沉默的表型观察结果。
图6PavSS1、PavSPSA1基因沉默的甜樱桃果实ABA、可溶性糖(蔗糖、果糖、葡萄糖)、花色素苷和硬度的变化及成熟相关基因的表达量变化结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料及数据处理方法
1.试验材料
植物材料：欧洲甜樱桃栽培品种“布鲁克斯”来自中国农业科学院郑州果树研究所樱桃种质资源圃，砧木为‘ZY-1’，树龄8年，树体生长正常。
菌株和TRV病毒载体：VIGS载体：烟草脆裂病毒载体(tobacco rattle virus，TRV)pTRV1与pTRV2由清华大学刘玉乐教授惠赠，根癌农杆菌菌种GV3101由本发明人实验室保存。
蔗糖处理：甜樱桃盛花期35天后，进行外施蔗糖处理(每个果实注射50mM蔗糖1mL，以注射50mM山梨醇1mL作为渗透势对照)。
2.数据处理
使用Microsoft Excel 2010软件对所获数据处理并绘图；使用SPSS17.0软件进行相关性分析和差异显著性(P<0.05，P<0.01)分析。糖含量采用one-way ANOVA方法对每个变量进行Duncan检验(P<0.05)。
试验例1甜樱桃PavSS和PavSPS家族基因的克隆以及实时荧光定量PCR分析甜樱桃果实发育过程中PavSS和PavSPS基因的表达模式
为了获得甜樱桃果实的PavSS和PavSPS家族基因成员，本发明分别以拟南芥的4个SPS基因(AT1G04920、AT4G10120、AT5G11110和AT5G20280)和7个SS基因(AT1G05560、AT1G73370、AT3G43190、AT4G02280、AT5G20830、AT5G37180和AT5G49190)的氨基酸序列为Query序列，在甜樱桃基因组数据库(http://cherry.kazusa.or.jp/map.html)中进行BLASP寻找，获得4个SPS基因和7个SS基因家族成员，分别命名为PavSPSA1(Pav_sc0000311.1_g960)、PavSPSA2(Pav_sc0001015.1_g350)、PavSPSB(Pav_sc0006188.1_g050)和PavSPSC(Pav_sc0000500.1_g060)；PavSS1(Pav_sc0000129.1_g1710)、PavSS2(Pav_co4071539.1_g010)、PavSS3(Pav_sc0000174.1_g950)、PavSS4(Pav_sc0000130.1_g850)、PavSS5(Pav_sc0000174.1_g960)、PavSS6(Pav_sc0000103.1_g1530)和PavSS7(Pav_sc0001124.1_g380)。
为了分析甜樱桃果实发育与成熟过程中PavSS和PavSPS基因的表达特征，利用实时荧光定量(qRT-PCR)分析了其在不同果实发育阶段的基因表达情况：
分别收集栽培品种‘布鲁克斯’的果实不同发育期的样品，提取总RNA，并反转录成cDNA，设计特异性引物(表1)，进行三次独立的荧光定量PCR，分析甜樱桃PavSS和PavSPS基因的差异表达模式。qPCR反应在ABI7500 PCR热循环仪(Applied Biosystems,FosterCity,CA,United States)上进行，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)试剂盒进行反应，以甜樱桃的Histone2(Pav_sc0000671.1)基因为内参进行分析。并进行三次生物学重复，取平均值。
qRT-PCR分析结果显示：PavSS1基因在甜樱桃整个果实发育和成熟过程中均高表达，从花后7天开始，表达量逐渐升高，花后21天表达量有个峰值，随后在果实发育后期和成熟过程中表达量逐渐降低(图1A)。PavSS2基因表达模式与PavSS1基因表达模式基本类似，表现为前期逐渐升高，后期逐渐降低，但在甜樱桃果实成熟和发育过程中表达量均较低，是PavSS1基因表达的1/10(图1B)。PavSS3和PavSS5基因在甜樱桃果实发育和成熟过程中均表达，但表达量均较低，且在整个果实发育和成熟过程中表达量差异不显著(图1C,E)。PavSS4基因在果实发育初期表达量较高(0-14d)，在花后14天，表达量最高，在果实发育后期和成熟过程中，表达量都较低，在花后42天表达量最低(图1D)。PavSS6基因在果实发育初期表达量较低(0-35d)，在果实发育后期表达量逐渐升高，花后49天表达量最高(图1F)。PavSS7基因在整个果实发育过程中均表达，但表达量均较低，在花后7天和花后28天出现两个峰值，果实成熟过程中，表达量较低(图1G)。综上结果暗示：PavSS1、PavSS2和PavSS6基因的表达模式与甜樱桃果实的成熟过程较吻合，可能在果实成熟软化中起重要作用。
同样地，通过qRT-PCR分析了4个PavSPS基因在果实发育与成熟过程中基因的表达模式。结果显示：PavSPSA1基因在甜樱桃果实发育和成熟的过程均高表达，果实发育前期(0-28d)，PavSPSA1基因表达量较低，在果实发育后期(35-56d)表达量均较高，且PavSPSA1基因的表达量从花后21天，逐渐升高，花后49天，表达量最高(图2A)。PavSPSA2基因的表达量表现为前期表达量较低(0-14d)，花后21天开始，表达量逐渐升高，花后42天和花后56天，出现两个峰值，且表达量是花后7天的5.9倍和5.7倍(图2B)。PavSPSB基因在果实发育前期，表达量较高，花后28天，表达量最高，但在果实发育后期和成熟过程中，表达量较低(图2C)。PavSPSC基因在甜樱桃果实发育前期(0-21d)，表达量较低，随后基因表达量逐渐升高，在花后35天表达量达最高；在果实发育后期与果实成熟过程中，PavSPSC基因的表达量也较高，是花后7天的2.5-3倍(图2D)。综上结果表明：PavSPSA1和PavSPSA2基因在果实成熟软化过程中均上调表达，与甜樱桃果实的成熟软化过程吻合，可能与甜樱桃果实成熟软化有关。
试验例2外施蔗糖对甜樱桃PavSS和PavSPS基因表达模式的影响试验
前期研究证实外源蔗糖可作为一个信号分子，促进番茄和草莓果实成熟。为了进一步确定哪一个(或几个)PavSS和PavSPS基因影响甜樱桃果实成熟软化，本试验通过外施蔗糖确定是否可调控甜樱桃果实PavSS和PavSPS基因的表达而影响果实的成熟软化。
试验结果显示：与山梨醇处理(阴性对照)的甜樱桃果实相比，蔗糖处理6h、12h后，甜樱桃果实中PavSS1的表达上调，是阴性对照的1.5-2倍；随后蔗糖处理24h和48h后，甜樱桃果实中PavSS1的表达下调，是阴性对照的0.7-0.8倍(图3)。类似地，蔗糖处理的甜樱桃果实中PavSS6基因的表达与阴性对照相比，表达趋势也是先上调后下调。而蔗糖处理的甜樱桃果实中PavSS2、PavSS3、PavSS4、PavSS5和PavSS7基因的表达与阴性对照相比，都没有变化(图3)。
同样地，本试验还分析了外施蔗糖后，甜樱桃果实中4个PavSPS基因的表达量变化。试验结果显示：与山梨醇处理(阴性对照)的甜樱桃果实相比，蔗糖处理的甜樱桃果实中PavSPSA1的表达上调，是阴性对照的1.5-2.5倍(图4)。而蔗糖处理的甜樱桃果实中PavSPSA2、PavSPSB和PavSPSC基因的表达与阴性对照相比，没有显著变化(图4)。综上结果表明PavSS1、PavSS6和PavSPSA1基因可能是蔗糖合成过程中的关键基因，或许调控甜樱桃果实的成熟软化。
试验例3TRV介导PavSS1、PavSS6、PavSPSA1和PavSS1-PavSPSA1基因沉默的表型观察及甜樱桃果实成熟软化的功能分析
1试验方法
1.1VIGS-PavSS和VIGS-PavSPS重组载体的构建及农杆菌转化。
pTRV2-PavSS1、pTRV2-PavSS6、pTRV2-PavSPSA1和pTRV2-PavSS1-PavSPSA1载体构建采用In-Fusion Cloning技术。以甜樱桃果实的总RNA为模板，分别设计带有16个重叠区域(与经EcoRI和KpnI线性化的pTRV2片段互为反向互补的接头)的pTRV2-PavSS1、pTRV2-PavSS6、pTRV2-PavSPSA1基因特异性引物对PavSS1/6-RNAi-F1-3/R1-3和PavSPSA1-RNAi-F1-3/R1-3(表1)扩增靶标基因片段。
表1引物序列信息
Figure GDA0003701369710000101
Figure GDA0003701369710000111
Figure GDA0003701369710000121
Figure GDA0003701369710000131
同时利用基因合成技术合成2段PavSS1-PavSPSA1基因的融合靶标片段；其中，PavSS1-PavSPSA1融合基因的靶标序列PavSS1-PavSPSA1-1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，PavSS1-PavSPSA1融合基因的靶标序列PavSS1-PavSPSA1-2的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示；由于靶基因片段的长度及序列是影响TRV病毒诱导基因沉默效率的关键因素，本实验进一步针对PavSS1、PavSS6和PavSPSA1分别设计扩增了3条靶标序列，其中，PavSS1基因的三条靶序列分别为PavSS1-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)、PavSS1-2(核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)和PavSS1-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)；PavSS6基因的三条靶序列分别为PavSS6-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)、PavSS6-2(核苷酸序列为SEQ IDNO.7所示)和PavSS6-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)；PavSPSA1基因的三条靶序列分别为PavSPSA1-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示)、PavSPSA1-2(核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)和PavSPSA1-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示)；然后将扩增和合成的靶基因片段，利用In-FusionTM HD Cloning kit(Clontech,Mount-ain View,CA,United States)分别将PavSS1、PavSS6、PavSPSA1和PavSS1-PavSPSA1基因的靶标片段连接到经EcoRI和KpnI双酶切线性化的pTRV2载体上，分别命名为pTRV2-PavSS1、pTRV2-PavSS6、pTRV2-PavSPSA1和pTRV2-PavSS1-PavSPSA1，并转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性菌株，经PCR鉴定，双酶切鉴定和测序正确后，分别将pTRV2-PavSS1、pTRV2-PavSS6、pTRV2-PavSPSA1和pTRV2-PavSS1-PavSPSA1载体转入农杆菌菌种GV3101中备用。
1.2VIGS技术瞬时转化甜樱桃果实
甜樱桃果实的VIGS方法参照齐希梁等(齐希梁,李明,刘聪利,宋露露.2018.TRV介导欧洲甜樱桃果实VIGS体系的建立.果树学报,35(11):1309-1315.)的方法进行，选取花后25d的甜樱桃果实，采用注射压迫法将含有pTRV2或pTRV2-PavSS1、pTRV2-PavSS6、pTRV2-PavSPSA1或pTRV2-PavSS1-PavSPSA1与pTRV1的混合菌液从果实果柄处注射，看到果实组织中果实表面颜色改变，表示注射液扩散到果实组织，注射后的甜樱桃果实发育阶段的温度和湿度要相对低，温度不宜超过25℃，湿度控制在30％～70％，同时注射过的果实进行套袋处理，3d后去除果袋。每次选择1株健壮的植株，每种混合菌液注射80个果实以上，并进行三次生物学重复。
1.3半定量RT-PCR检测。
提取甜樱桃果实样品的总RNA并反转录成cDNA，以甜樱桃的Histone2(Pav_sc0000671.1)基因为内参，对不同样品的cDNA含量进行调节，然后分别利用PavSS1、PavSS6、PavSPSA1和PavSS1-PavSPSA基因特异性引物对PavSS1/6-J-F\R、PavSPSA1-J-F\R或PavSS1-PavSPSA-J-F\R(表1)检测沉默后相关PavSS或PavSPS基因的表达水平。
1.4TRV侵染的甜樱桃果实的果实硬度、可溶性糖、花青素含量和ABA含量的测定。
果实硬度GY-4型硬度计测定，单位为kg·cm-2。每次生物学重复随机选取5个果实，每个果实不同部位选2个点测定，并进行三次重复，取平均值。
参考Shen et al.(Shen X,Guo X,Zhao D,Zhang Q,Jiang Y,Wang Y,LiT.Cloning and expression profiling of the PacSnRK2 and PacPP2C gene familiesduring fruit development,ABA treatment,and dehydration stress in sweetcherry.Plant Physiol.Bioch.119(2017)275-285.)和Liu et al(Liu Y,Shen X,Zhao K,Ben Y,Guo X,Zhang X,Li T.Expression analysis of anthocyanin biosyntheticgenes in different colored sweet cherries(Prunus avium L.)during fruitdevelopment.J.Plant Growth Regul.32(2013)901e908.)的方法提取并测量甜樱桃果实中的可溶性糖(蔗糖，葡萄糖和果糖)，花青素和ABA含量，并进行六次生物学重复，每次生物学重复进行三次重复，取平均值。
2试验结果
2.1TRV介导PavSS1、PavSS6、PavSPSA1和PavSS1-PavSPSA1基因沉默的表型观察结果
为了确定PavSS1、PavSS6和PavSPSA1基因是否调控甜樱桃果实成熟软化功能，本试验通过病毒诱导基因沉默技术，将含有TRV::00(空白对照)和TRV::PavSS1、TRV::PavSS6、TRV::PavSPSA1、TRV::PavSS1-PavSPSA1的农杆菌菌液分别侵染甜樱桃栽培种‘布鲁克斯’。14天后提取侵染果实的总mRNA进行半定量PCR检测。结果发现，与TRV::00侵染的甜樱桃果实相比，TRV::PavSS1、TRV::PavSS6、TRV::PavSPSA1、TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染甜樱桃果实中均有1个靶标片段对应的PavSS1、PavSS6、PavSPSA1的表达量显著降低，基因沉默效率达85％以上，对应的靶标片段分别为PavSS1-1(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)、PavSS6-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)、PavSPSA1-2(核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)；而且靶基因片段TRV::PavSS1-PavSPSA1-2侵染的甜樱桃果实中PavSS1和PavSS6基因的表达同时被显著降低，两个基因同时沉默效率达90％以上(图5A)。表明PavSS1、PavSS6、PavSPSA1和PavSS1-PavSPSA1基因分别被有效的沉默。
侵染21天，表型观察发现：TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1侵染的甜樱桃果实与对照TRV::00相比，表皮呈浅红色或者黄白色(黄绿色)，TRV::00侵染的果实的表皮颜色呈深红色。而TRV::PavSS6侵染的甜樱桃果实的表皮颜色也呈深红色，与对照相比，果实表型没有明显差异(图5B)。同时沉默甜樱桃PavSS1和PavSPSA1基因的果实(TRV::PavSS1-PavSPSA1)表皮颜色呈黄绿色或浅绿色，而TRV::00侵染的果实表皮颜色呈深红色(图5B)。上述结果表明，沉默PavSS1和PavSPSA1基因延迟果实着色和果实成熟，且同时沉默PavSS1和PavSPSA1两个基因，果实着色和成熟缺陷更显著，暗示PavSS1、PavSPSA1可能功能冗余调控甜樱桃果实成熟。
2.2TRV介导PavSS1、PavSS6、PavSPSA1和PavSS1-PavSPSA1基因沉默的甜樱桃果实成熟软化的功能分析
为了进一步明确PavSS1和PavSPSA1是否调控甜樱桃果实成熟软化。本试验分析了花后55天(空载对照侵染的甜樱桃完全成熟)，TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实成熟软化的特征指标，包括花青素含量、ABA含量、可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)和果实硬度。本试验还评估与成熟相关的一些基因的表达量变化，包括ABA合成与降解的关键基因PavNCED1，影响果实硬度的相关基因PavPG1、PavXYL1和PavPL1，影响花青素合成的相关基因PavPAL、PavCHS、PavANS和PavDFR。
试验结果显示：与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中花青素含量与ABA含量显著降低，表明PavSS1与PavSPSA1基因控制甜樱桃的果皮着色。TRV::PavSS1和TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实的果实硬度显著低于空白对照TRV::00侵染的甜樱桃果实的果实硬度，表明PavSS1与PavSPSA1基因影响甜樱桃果实软化。而且与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中花青素含量、ABA含量和果实硬度的变化达到极显著水平，暗示PavSS1与PavSPSA1调控甜樱桃果实着色和果实软化存在功能冗余。
可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)含量的测定结果发现：与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1侵染的甜樱桃果实中蔗糖含量显著降低，相反的果糖含量显著提高，而葡萄糖含量变化不显著。TRV::PavSPSA1侵染的甜樱桃果实的蔗糖含量与对照TRV::00相比显著降低，而果糖和葡萄糖的含量没有显著变化。然而TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中可溶性糖成分(果糖、葡萄糖、蔗糖)均显著低于TRV::00侵染的甜樱桃果实的可溶性糖成分，表明PavSS1与PavSPSA1可能调控蔗糖合成的关键基因。
与对照TRV::00相比，TRV::PavSS1、TRV::PavSPSA1和TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中成熟相关的基因PavNCED1、PavPG1、PavXYL1、PavPL1、PavPAL、PavCHS、PavANS和PavDFR基因的表达显著下调(图6)，且TRV::PavSS1-PavSPSA1侵染的甜樱桃果实中的上述成熟相关基因的表达量更是极显著下调。综上研究结果表明甜樱桃PavSS1与PavSPSA1功能冗余调控果实着色和果实成熟软化。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 甜樱桃PavSS或PavSPS基因在调控果实着色或果实成熟软化中的用途
<130> HN-2002-200703A
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
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gggacacacg gaaggctggg ttctcagaga aagcagacca taacagtgct ggtaagttcc 300
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<213> Artifical sequence
<400> 11
cctcgcaagc ctatgattct tgcccttgct agaccagatc caaaaaagaa catcacaact 60
ttggtcaaag catttggaga atgtcgccca ctaagagagc ttgcgaatct tacactaatt 120
atgggcaacc gcgatggaat tgatgaaatg tcaggcacaa gttcttctgt tcttctctca 180
gtactcaagc ttattgacaa acatgatttg tacgggcaag tggcataccc caaacaccac 240
aaacagtctg atgttcctga gatttatcgt ctagcagcaa agacgaaggg tgttttcatt 300
aatccagctt tcatcgagcc gtttggactc acattaattg aggcagctgc tcatggtttg 360
cctattgttg ccacaaaaaa tgggggtcct gttgatatac atcaggtact tga 413

Claims (1)

1. 一种延迟甜樱桃果实着色或延迟果实成熟软化的方法，其特征在于，包括：沉默或抑制甜樱桃中PavSS基因或PavSPS基因的表达；或者同时沉默或抑制甜樱桃中PavSS和PavSPS基因的表达；所述的PavSS基因是PavSS1基因；所述的PavSPS基因是PavSPSA1基因；将PavSS1基因的靶基因片段、PavSPSA1基因的靶基因片段或者将PavSS1基因和PavSPSA1的融合基因的靶基因片段与pTRV2载体可操作性的连接后得到干扰载体，将该干扰载体转化到农杆菌中，再通过农杆菌介导法转化到樱桃组织或细胞中；所述的PavSS1基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；所述的PavSPSA1基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示；所述的PavSS1和PavSPSA1的融合基因的靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
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