WO2005075649A1 - Procedimiento para la producción de sacarosa sintasa recombinante su uso en la fabricación de kits de determinación de sacarosa producción de adpglucosa y obtención de plantas transgénicas cuyas hojas y órganos de reserva acumulen alto contenido en adpglucosa y almidón - Google Patents

Procedimiento para la producción de sacarosa sintasa recombinante su uso en la fabricación de kits de determinación de sacarosa producción de adpglucosa y obtención de plantas transgénicas cuyas hojas y órganos de reserva acumulen alto contenido en adpglucosa y almidón Download PDF

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Miren Edurne BAROJA FERNÁNDEZ
Francisco José MUÑOZ PÉREZ
Francisco Javier Pozueta Romero
María Teresa MORÁN ZORZANO
Nora ALONSO CASAJÚS
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Universidad Publica De Navarra
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Definitions

  • the invention relates to the optimization of the production of recombinant sucrose synthase (SS) in soluble and active form using an appropriate strain of Escheri chia coli, the use of the SS for the elaboration of sucrose determination devices (kits) , design of optimized forms of SS for the synthesis of ADPglucose (ADPG), and to obtain transgenic plants whose leaves and reserve tissues accumulate high levels of ADPG and starch enriched in anulose as a result of overproduction of cytosolic ADPG in plants that overexpress the SS.
  • SS sucrose synthase
  • Starch is the main form of carbohydrate storage in plants. It accumulates in large quantities in organs such as seeds (wheat, barley, corn, pea, etc.) and tubers (potato and sweet potato among others) and is a fundamental constituent of the human being's diet. On the other hand, starch is frequently used in the paper, cosmetic, pharmaceutical and food industries, and is also used as a fundamental component for the manufacture of biodegradable plastics and low environmental impact paints. Consisting of covalently linked glucose molecules, the study of the processes involved in the synthesis of this polysaccharide is a topic priority in various fields of industrial production.
  • ADPG is the universal precursor of starch biosynthesis in plants, both in heterotrophic organs (Fig. 1A) and in leaves (Fig. 2A), and it is widely assumed that its production is exclusively controlled by the enzyme ADPG pyrophosphorase (AGPase) or ADPG smtasa (EC 2.7.7.27) (Okita, TW (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Muller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. ( 1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase m transgenic potatoes leads to sugar-sto ⁇ ng tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protem genes EMBO J.
  • amylose and amylopectma depends, among other reasons, on the concentration of ADPG in the plant cell (Clarke, BR, Denyer, K., Jenner, CF, Smith, AM (1999)
  • concentration of ADPG in the plant cell The relationship between the rate of starch synthesis, the adenosme 5 "-diphosphoglucose concentration and the amylose content of starch m developmg pea embryos. Plant 209, 324-329).
  • SS (EC 2.4.1.13, SS) (UDP-glucose: D-fructose-2-glucosyl transferase) is a reversible enzyme that catalyzes the UDPG and fructose production from sucrose and UDP.
  • Fig. 1A the role of producing the UDPG whose metabolic processing results in the eventual production of starch in heterotrophic tissues such as endosperms and tubers (Zrenner, R.) has been classically attributed to the SS.
  • SS is capable of directly producing usable ADPG for the production of starch in both heterotrophic and photo-synthetic tissues (Figs. IB and 2B) (Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) Sucrose-starch conversion in heterotrophic tissues of plants. Crit. Rev Plant Sci. 18, 489-525; Baroj a-Fernández, E., Mu ⁇ oz, FJ, Akazawa, T., Pozueta-Romero, J.
  • ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants Plant Cell Physiol. 44, 500-509; Baroja- Fernández, E., Mu ⁇ oz, FJ, Zandueta-Criado, A., Morán- Zorzano, MT, Viale, AM, Alonso-Casaj ⁇ s, N., Pozueta- Romero, J. (2004) Most of ADPglucose linked to starch biosynthesis occurs outside the chloroplast in source leaves. Proc. Nati Acad. Sci. USA 101, 13080-13085).
  • Sugar nucleotides such as UDPG or ADPG are produced for commercialization from enzyme-catalyzed pyrophosphorylase reactions such as UDPG pyrophosphorylase (UGPase) and AGPase, respectively, based on the use of a high-cost substance called glucose -1-fos-fato (G1P).
  • UDPase UDPG pyrophosphorylase
  • AGPase AGPase
  • G1P glucose -1-fos-fato
  • An alternative to this sugar-nucleotide production practice is based on the use of SS whose development has been largely impeded by the limitations of Esche ⁇ chia coli to efficiently express and process a large number of eukaryotic proteins.
  • the SS intended for the production of sugar-nucleotides has had to be purified by costly protein purification processes from plant extracts (patent DE4221595 (1993), Purified sucrose synthase enzy and useful for production of nucleotide-activated sugars or oligosaccharides).
  • Such SS obtained from plant extracts has the disadvantage that it has a predilection for UDP and very low affinity for ADP (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol 44, 759-764; Nguyen-Quock B., Krivitzky, M., Huber, S.
  • the recombinant SS should be purified by conventional methods of protein purification such as chromatography, electrophoresis, isoelectric focusing, etc. which, combined, are expensive and do not guarantee the purification of the protein in a homogeneous state and (4) most of the SS is sent to inclusion bodies or accumulated in the form of inactive aggregates as a result of the inability of the machinery of the bacterium of correctly folding the proteme (Miroux, B., Walker, JE (1996) "Over-production of protems m Esche ⁇ chia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane protems and globular protems at high levéis" J. Mol. Biol. 260, 289-298).
  • the present invention describes the development of a system based on the use of an appropriate strain of E. coli and in the use of a suitable expression vector that allows large-scale production and rapid and easy purification of different versions of recombinant SS in its active form.
  • Some of these versions have an affinity for ADP much higher than those obtained from plant extracts and can be used for both the production of UDPG and ADPG from low-cost substances such as sucrose, UDP or ADP.
  • Chromatographic techniques constitute a powerful tool for determining sucrose content in complex samples such as plant extracts, serums, urine, juices, wines, fruits and food (D Aoust, MA., Yelle, S, Nguyen-Quoc, B. ( 1999) Antisense mhibition of to ato fruit sucrose synthase decreases fruit settmg and the sucrose unloadmg capacity of young fruit. Plant Cell 11, 2407-2418; Tang, GQ., Sturm, A. (1999) Antisense repression of sucrose synthase m carrot affects growth rather than sucrose partitionmg. Plant Mol. Biol.
  • sucrose determination kits based on the use of mvertase are available from companies such as Sigma, Biopharm GmbH and Megazyme.
  • sucrose determination method based on the determination of glucose-1-phosphate released by the action of sucrose phospholase of bacterial origin has been developed (Vinet, B., Panzini, B., Boucher, M., Massicotte, J. (1998) Automated enzymatic assay for the determmation of sucrose m serum and uri ⁇ e and ⁇ ts use as a marker of gastric damage. Clin. Chem. 44, 2369-2371).
  • the present invention describes the development of a simple, reliable and inexpensive alternative method for the determination of sucrose in a sample based on the use of SS and coupling enzymes that hydrolyse ADPG or UDPG.
  • the SS could be involved in the direct synthesis of ADPG necessary for starch biosynthesis (Baroj a-Fernández, E., Mu ⁇ oz, FJ, Saikusa, T., Rodriguez-López, M., Akazawa, T. , Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509).
  • An object of the invention is, first of all, the set-up and optimization of a method of producing large amounts of soluble, easily puftable, and high-specific recombinant SS based on the use of an E. coli strain. appropriate and in the use of an expression vector that allows the obtaining of the SS with a tail of histidmas.
  • Another object of the invention is the procedure followed for the elaboration of sucrose determination devices or kits based on the use of the enzymatic product with SS activity coupled to enzymes that metabolize ADPG or UDPG.
  • Another objective is the optimization of the production of sugar-nucleotides such as ADPG or UDPG from versions of the SS specially designed for this purpose.
  • the design of transgenic plants with high sucrose, ADPG and starch content and high amylose / amylopectma balance after overexpressing SS is detailed. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • nucleotide sequence of wild sucrose synthase SS4 (Fu, H., Park, WD (1995) Smk- and vascular-associated sucrose synthase functions are encoded by different gene classes m potato. Plant Cell 7, 1369-1385) two were created specific primers corresponding to ends 5 and 3 of the gene. Using these primers, a 2418 base pair DNA fragment, designated with SSX, was amplified by conventional PCR methods from a potato leaf cDNA library. Such a PCR fragment was introduced into the pSK Bluescript (Stratagene) plasma giving rise to the pSS construct (Fig. 3A) which was amplified in the XL1 Blue host bacteria.
  • pSK Bluescript Stratagene
  • pSS was digested with restriction enzymes Ncol and Notl.
  • the released fragment (containing the cDNA encoding SS, SSX) was cloned into the same restriction sites of the expression plasmid pET-28a (+) (Novagen) (Fig. 3B) which has a nucleotide sequence in the region polylmker that codes for a sequence rich in histidmas, which is fused with the recombinant protein.
  • the resulting plasmid (designated by the name of pET-SS, Fig. 3C) was introduced by electroporation into several strains of E. coli.
  • coli BLR (DE3) (Novagen) transformed with pET-SS was deposited in the Spanish Type Crops Collection on October 29, 2003, located in the Research Building of the University of Valencia, Burjassot Campus, Burjassot 46100 (Valencia, Spain) with CECT deposit number: 5850.
  • the bacteria were incubated at 20 ° C in LB medium.
  • Overexpression of SSX took place by adding 1 mM ⁇ sopropyl-DD-thiogalactopyranoside (IPTG) in 100 ml of cell culture grown at 20 2 C.
  • pSS5 pSS5 was digested with Ncol and Notl. The released fragment (containing SS5) was cloned into the same restriction sites of the expression plasmid pET-28a (+) resulting in pET-SS5, which was introduced by electroporation in E. coli BLR (DE3).
  • E. coli BLR E. coli BLR
  • coli XL1 Blue transformed with pSS5 was deposited in the Spanish Type Crops collection on October 29, 2003, located in the Research Building of the University of Valencia, Burjassot Campus, Burjassot 46100 (Valencia, Spain), With the deposit number CECT: 5849.
  • SS has been overexpressed (a) constitutively, (b) specifically in sheets and (c) specifically in reserve organs such as tubers.
  • p35S-SS-nos was digested sequentially with the enzymes Notl, T4 DNA polymerase and HmdlII and was cloned into the binary plasmid pBIN20 (Fig. 4A) Hennegan, K.P., Danna, K.J. (1998) pBIN20: An improved bmary vector for Agrobacte ⁇ um-mediated trans ⁇ ormation. Plant Mol. Biol. Rep. 16, 129-131) that previously has been digested sequentially with the enzymes EcoRI, T4 DNA polymerase and HindIII. The plasmid thus obtained was designated as pBIN35S-SS-NOS (Fig. 4C).
  • the promoter region (designated as RBCS) of the gene coding for the small subunit of the RUBISCO (R ⁇ bulose-1, 5-b ⁇ sphosphate carboxylase / oxygenase) of tobacco (Barnes, SA) was amplified by PCR. , Knight, JS, Gray, JC (1994) Alteration of the amount of the chloroplast phosphate translocator m transgenic tobaceous affeets the dist ⁇ bution of assimilate between starch and sugar. Plant Physiol 106, 1123-1129).
  • Such a nucleotide sequence (which confers specific expression in photosynthetically active cells) was introduced into the vector pGEMT-easy (Promega), giving rise to pGEMT-RBCSprom (Fig. 5A).
  • This construct was digested with HindIII and Ncol and the released fragment was cloned into the corresponding restriction sites of p35S-SS-NOS, resulting in pRBCS-SS-NOS (Fig. 5B).
  • This construct was digested sequentially with HmdlII, T4 DNA polymerase and Notl.
  • the released fragment was cloned in pBIN20 digested sequentially with HindIII, T4 DNA polymerase and EcoRI.
  • the resulting construction was designated as pBINRBCS-SS-NOS (Fig. 5C).
  • both pBIN35S-SS-NOS and pBINRBCS-SS-NOS were introduced in A. tumefaci C58: GV2260 (Debleare, R., Bytebier, B., de Greve, H., Debroeck, F., Schell, J., van Montagu, M., Leemans, J. (1985) "Efficient octopine Ti plasmid-de ⁇ ved vectors of
  • kits designed for the determination of sucrose illustrated in the following Scheme I of enzymatic reactions involved in the spectrophotometric / fluorimetric determination kit of sucrose based on the transformation of sucrose into a sugar-nucleotide and subsequent transformation of this into glucose -1-phosphate, glucose-6-phosphate and NAD (P) H.
  • NDP-glucose NMP pyrophosphatase Glucose fo sf or glucomut as a
  • 6-phosphogluconate dehydrogen 6-phospho-gluconate Scheme I
  • the kit is based on the action of the SS on the sucrose molecule in the presence of a nucleotide diphosphate (e. UDP or ADP), releasing equimolar amounts of fructose and the corresponding sugar-nucleotide.
  • a nucleotide diphosphate e. UDP or ADP
  • the sugar nucleotide resulting from the reaction is UDPG
  • it is subjected to the action of UDPG hydrolytic enzymes such as the UDPG pyrophosphatase of the Nudix type (EC 3.6.1.45) (Yag ⁇ , T., Baroj-Fernández, E., Yamamoto, R., Mu ⁇ oz, FJ, Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Clonmg, expression and characterization of a mammalian Nudix hydrolase-like enzyme that cleaves the pyrophosphate bond of UDP-glucose. Biochem. J.
  • UDPG hydrolase (Burns, DM, Beacham, IR (1986) Nucleotide sequence and transc ⁇ ptional analysis of the E. coli ushA gene, encodmg pe ⁇ plasmic UDP-sugar hydrolase (5 '-nucleotidase): regulation of the ushA gene, and the signal sequence of ⁇ ts encoded protem product. Nuc ⁇ . Acids Res. 14, 4325-4342).
  • the G1P released by the action of these hydrolytic enzymes is transformed by the action of phosphoglucomutase (PGM), yielding glucose-6-phosphate (G6P), which in turn can be reacted coupled with NAD (P) + by the action of the enzyme G6P dehydrogenase (G6PDH), obtaining 6- phosphogluconate and NAD (P) H, easily determinable by fluo ⁇ etria and by spectrophotometry at 340 nm.
  • the released NAD (P) H can be coupled to the action of FMN-oxidoreductase / luciferase, yielding light that is quantified spectrophotometrically.
  • the UDPG produced can be coupled with the UDPG dehydrogenase (EC 1.1.1.22) which, in the presence of NAD, gives rise to equimolar amounts of UDP-glucuronate and NADH determined by fluorometry or by spectrophotometry at 340 nm.
  • the released NADH can be coupled to the action of FMN-oxidoreductase / luciferase, rendering light which is quantified spectrophotometrically
  • ADPG hydrolytic enzymes such as bacterial pyrophosphatase ADPG (EC 3.6.1.21) (Moreno-Bruna, B., Baroj a-Fernández, E ., Mu ⁇ oz, FJ, Bastarrica-Berasategui, A., Zandueta-Criado, A., Rodriguez-López, M., Lasa, I., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) Adenosine diphosphate sugar pyrophosphatase prevents glycogen biosynthesis in Escheri chia coli.
  • ADPG hydrolytic enzymes such as bacterial pyrophosphatase ADPG (EC 3.6.1.21) (Moreno-Bruna, B., Baroj a-Fernández, E ., Mu ⁇ oz, FJ, Bastarrica-Berasategui, A., Zandueta-Criado, A
  • G6P glucose-6-phosphate
  • NAD NAD + by the action of the enzyme G6P dehydrogenase, obtaining 6-phosphogluconate and NAD (P ) H, easily determinable by fluorometry or spectrophotometry at 340 nm.
  • Examples are described below in which the cloning procedure of a cDNA coding for a potato SS isoform in a suitable expression vector and in an E. coli strain optimized for the production and accumulation of the enzyme is shown in detail. its active form
  • Other examples show the use of the recombinant SS for the production of kits (test devices) for the determination of sucrose in plant samples, serum, urine, juices, nectars, soft drinks, etc.
  • Another example shows the use of versions of SS optimized for large-scale production of sugar nucleotides such as UDPG and ADPG.
  • Another example shows the obtaining of plants with a high content of sucrose, ADPG, starch and high amylose / amylopectma balance as a result of the high ADPG producing activity in plants that overexpress the SS.
  • Example 1 Escher ⁇ chia coli BLR (DE3) expression of a recombinant SS with a histidine tail, easily purified and of high specific activity
  • SSX DNA fragment, designated as SSX, was amplified by conventional PCR methods from a potato tuber cDNA library, which was introduced into a plasmid pSK Bluescript (Stratagene) which was amplified in the bacteria XL1 Blue host.
  • the nucleotide sequence of SSX is SEQ ID NO: 3 which is slightly different from SS4 (accession number in GenBank U24087).
  • the ammoacidic sequence deduced from SEQ ID NO: 3 It is slightly different from SS4 and is therefore designated by the name of SSX.
  • the ammoacidic sequence deduced after the expression of SEQ ID NO: 3 in plasmid pET-28a (+) is SEQ ID NO: 4, which includes a 38 amino acid sequence rich in histidmas fused with the ammo-terminal end of the sequence ammoacidic deduced from SEQ ID NO: 3.
  • the contribution of the recombinant SSX in the total protein pool of CECT: 5850 is approximately 20 °, compared to the very low productivity of recombinant SS (30 micrograms per gram of bacteria) described in the literature (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) " Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escheri chia coli "Biosci. Biotech. Biochem.
  • sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107, 135-149) and greater than 3 units / mg corresponding to the SS purified from plant extracts (Pressey R (1969) Potato sucrose sy nthase: purification, properties, and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol 44, 759-764). The unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of a micromol of UDPG per minute.
  • Km 95 mM, Romer, U., Schrader, H., Gunther, N., Nettelstroth, N., Frommer, WB , Elling, L. (2004) Expression, pu ⁇ fication and characte ⁇ zation of recombmant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate engmee ⁇ ng. J. Biotechnology 107, 135-149).
  • Example 2 Production of large-scale UDPG and ADPG from the use of recombinant E. coli SS
  • ADPG The production of ADPG required the generation of a form SS mutated with an affinity for ADP much greater than that described for SS extracted from plant tissues
  • Potato sucrose synthase purification, properties, and changes m activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759- 764; Nguyen-Quock B., Krivitzky, M., Huber, S. C, Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase m developmg maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523; Morell, M., Copeland, L . (1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78, 149-154).
  • Such isoform designated as SS5 was obtained by point mutagenesis of SSX using the QuikChange Site-directed Mutagenesis kit (Stratagene) and sequentially using the following pairs of primers whose sequences are [SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ], [SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8] and [SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10].
  • the nucleotide sequence obtained, designated as SS5, is SEQ ID NO: 11.
  • the changes in the ammoacidic sequence of SS5 (Susy 5) with respect to SS4 -Susy 4- (existing in databases) are illustrated below in Table I shaded.
  • SEQ ID NO: 12 The ammoacidic sequence deduced after the expression of SEQ ID NO: 11 in plasmid pET-28a (+) is SEQ ID NO: 12, which includes a 38 amino acid sequence rich in histidmas fused with the mo-terminal end of the ammoacidic sequence deduced from SEQ ID NO: 11.
  • Table I includes said 38 amino acid sequence rich in histidmas fused to the amino-terminal part of SS5.
  • Table I - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
  • KITS BASED ON THE USE OF HYDROLYTIC ENZYMES OF SUGAR-NUCLEOTIDES a. 2 units of SS (recombinant or not) b. 2 mM of ADP or UDP (as ADPG or UDPG occurs, respectively) c. 2 units of ADPG pyrophosphatase or 2 units of UDPG pyrophosphatase (as included in the ADP or UDP reaction cocktail, respectively) d. 2 units of PGM e. 2 units of G6PDH f. 0.5 mM of NAD (P) g. reaction buffer: 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA / 20% polyethilenglycol / 1 mM MgCl2 / 15 mM KC1 h. Sample problem previously filtered
  • the determination of the amount of sucrose present in the test sample is based on the fluorometric or spectrophotometric determination at 340 nm of the NAD (P) H produced according to the coupled reactions illustrated in Schemes I and II.
  • the reactions took place in wells of 300 microliters of an Elisa plate for 3 minutes at 37 ° C.
  • the sample volume was 20 microliters, while the volume of the cocktail resulting from the combination of the reagents ag (kit # 1) and ae (kit # 2) was 280 microliters.
  • the whites contained all the components of the cocktail except the SS.
  • the measurement took place in a MultiSkan spectrophotometer.
  • Example 4 Obtaining transgenic plants that overexpress SS
  • Figures 8-10 illustrate the results obtained in potato plant leaves that overexpress the SS both constitutively (35S-SS-NOS), and specifically (RBCS-SS-NOS).
  • the SS activity in the leaves of any of these plants is 2-10 times higher than that existing in the same organ of a wild plant (WT).
  • WT wild plant
  • Such sheets had the following characteristics: 1. Clear correlation between the SS activity producing ADPG (Fig. 8) and starch levels (Fig. 9) and ADPG (Fig. 10). Such characteristic was observed not only in leaves, but also in reserve tissues such as tubers and seeds (see later).
  • FIGs 12-14 illustrate the results obtained in potato tubers that overexpress the SS constitutively (35S-SS-NOS). Such results are essentially identical to those observed in tubers that overexpress the SS under the control of a specific tuber promoter (patatin gene promoter). As illustrated in Fig. 12, the SS activity in the tubers of any of these plants is ??? times higher than that existing in the same organ of a wild plant. Such tubers had the following characteristics: 1. Clear correlation between the SS activity producing ADPG (Fig. 12) and starch levels (Fig. 13) and ADPG (Fig. 14).
  • AGPasa is the only source of ADPG.
  • ADPG levels have never been investigated in AGPase-deficient plants.
  • starch levels in TL25 plants of AGPase-deficient arabidopsis Lm, TP, Caspar, T. ,, Somerville, CR, Preiss, J. (1988) Isolation and characte ⁇ zation of a starchless mutant of Arabidopsis thaliana lacking ADPglucose pyrophosphorylase activity.
  • ADPglucose pyrophosphorylase m transgenic potatoes leads to sugar-sto ⁇ ng tubers and mfluences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238) are reduced with respect to those observed in wild plant leaves (Fig. 16A). However, ADPG levels are completely normal (Fig. 16B). Together, all these observations (a) demonstrate that SS, but not AGPasa, is the main source of ADPG in plants and (b) contrast the relevance of our invention after demonstrating that overexpression of SS results in plants with high content in starch.
  • Figure 1 Mechanisms of starch biosynthesis in heterotrophic organs.
  • A "Classic” mechanism according to which the SS is involved in the production of UDPG, which is eventually converted into starch after the combined action of the UDPG pyrophosphorylase (UGPase), cytosolic phosphoglucomutase (PGM), plastidial phosphoglucomutase, ADPG pyrophosphorylase (AGPase) and starch smtasa.
  • UDPase UDPG pyrophosphorylase
  • PGM cytosolic phosphoglucomutase
  • AGPase ADPG pyrophosphorylase
  • starch smtasa starch smtasa.
  • B "Alternative” mechanism according to which SS is involved in the direct production of ADPG in the cytosol. The ADPG is subsequently transported to the amyloplast by the action of a translocator. Once inside the amyloplast, star
  • FIG. 2 Mechanisms of leaf starch biosynthesis.
  • A "Classic” mechanism according to which the entire starch biosynthesis process takes place inside the chloroplast. According to this vision, the metabolism of starch and sucrose are not connected. In addition, SS does not intervene in the gluconeogenic process.
  • B "Alternative” mechanism of starch biosynthesis according to which SS is involved in the direct synthesis of ADPG in the cytosol. The ADPG is subsequently transported into the plastid where the starch synthase uses it as a substrate for the starch synthesis reaction.
  • Figure 3 Construction stages of the pET-SS expression plasmid from pET-28a (+) and pSS.
  • Figure 4 Construction stages of the expression plasmid pBIN35S-SS-NOS from pBIN20 and p35S-SS-NOS
  • Figure 5 Construction stages of the pRBCS-SS-NOS expression plasmid from pGEMT-RBCSprom, p35S-SS-NOS and pBIN20
  • Figure 6 Expression of pET-SS in different strains of Esche ⁇ chia coli.
  • A SS activity (in milliunits (mU) per milligram of bacterial protein) in bacterial extracts transformed with pET or with pET-SS. The reaction took place in the direction of sucrose degradation and ADPG production.
  • the reaction cocktail contained 50 mM HEPES (pH 7.0), 1 mM EDTA, 20% polyethylene glycol, 1 mM MgCl, 15 mM KC1 and 2 mM ADP. The reaction took place for 10 minutes at 37 r C.
  • B SDS-PAGE of protein extracts of the different strains of E. coli transformed with pET and with pET-SS. The position of the recombinant SSX is indicated with an arterisk.
  • Figure 7 Determination of sucrose at different stages of development of barley endosperms using the kit based on the coupled reactions of SS, ADPG (UDPG) pyrophosphatase, PGM and G6PDH. The results were identical to those obtained in parallel by (a) the use of a kit based on the coupled reactions of SS and UDPG dehydrogenase and (b) the use of high pressure chromatography (HPLC) with amperomet ⁇ ca detection in a DX system- 500 Dionex fitted to a Carbo-Pac PA1 column.
  • Axis of abscissa Days after flowering
  • Axis of ordinates Sucrose content ( ⁇ mol / gFW)
  • Figure 8 SS activity in leaves of wild potato plants (WT) and potato plants that overexpress SSX after integrating in their genome the 35S-SS-NOS constructs (by action of the strain of Agrobacteri um tumefaci ens CECT: 5851) or RBCS-SS-NOS.
  • the activity is referred to in milliunits (mU) per gram of fresh weight.
  • the unit is defined as the amount of SS needed to produce one micromol of ADPG per minute.
  • Figure 9 Starch content in leaves of wild potato plants (WT) and potato plants that overexpress SSX after integrating in their genome the 35S-SS-NOS constructs (by action of the strain of Agrobacteri um tumefaci ens CECT: 5851) or RBCS-SS-NOS.
  • Figure 10 ADPG content in leaves of wild potato plants (WT) and potato plants that overexpress SSX after integrating in their genome the 35S-SS-NOS constructs (by action of the strain of Agrobacteri um tumefaci ens CECT: 5851) or RBCS-SS-NOS.
  • Figure 11 Transient accumulation of (A) starch and (B) ADPG during a photoperiod of 8 hours of light and 16 hours of darkness in leaves of WT (•), 35S-SS-NOS (M) and RBCS-SS- plants WE (A).
  • Figure 12 SS activity (referred to fresh weight, FW) in tubers of wild potato plants (WT), regeneration controls (RG) and potato plants that overexpress SSX (lines 4,5,6 and 12) after integrating into its genome the construction 35S-SS-NOS (by action of the strain of Agrobacteri um tumefaci ens CECT: 5851).
  • the activity is referred to in milliunits (mU) per gram of fresh weight.
  • the unit is defined as the amount of SS needed to produce one micromol of ADPG per minute.
  • Figure 13 Starch content (referred to fresh weight, FW) in tubers of wild potato plants (WT) regeneration controls (RG) and potato plants that overexpress SSX (lines 4,5,6 and 12) after integrate the 35S-SS-NOS construct into its genome (due to the action of the Agrobacteri um tumefaci en CECT strain: 5851).
  • FIG 14 Content of ADPG (referred to fresh weight, FW) in tubers of wild potato plants (WT) and potato plants that overexpress SSX after integrating the 35S-SS-NOS construction into its genome (by strain of Agrobacteri um tumefaci ens CECT: 5851).
  • Figure 15 Content of (A) starch and (B) ADPG in leaves of Arabidopsis thaliana TL25 deficient in AGPase
  • Figure 16 Content of (A) starch and (B) ADPG in AGP62 and AGP85 deficiency leaves in AGPase

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Abstract

Se describe un procedimiento de producción eficiente de grandes cantidades SS recombinante soluble en su forma activa, mediante expresión del gen que codifica para la SS en una cepa de Escherichia coli. El vector de expresión utilizado permite que la SS recombinante producida posea una cola de histidinas que facilita su purificación de manera rápida. Asimismo se describen secuencias de versiones mutadas del gen de la SS que codifican para isoformas de la SS adecuadas para la producción de ADPG. Haciendo uso de las versiones “silvestre” y “mutada” de SS recombinante, se describe un método eficiente de producción de ADPG y UDPG. También se describe la utilización de la SS para la producción de dispositivos de ensayo de determinación de sacarosa. Por último se describe la obtención de plantas transgénicas que sobre-expresan el gen de la SS, bien constitutivamente, bien en hojas u órganos de reserva, y que poseen un contenido alto (tanto en hojas como en tejidos de reserva) en sacarosa, ADPG, G6P y almidón como resultado de la alta actividad sintetizadora de ADPG de la SS.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE SACAROSA SINTASA RECOMBINANTE, SU USO EN LA FABRICACIÓN DE KITS DE DETERMINACIÓN DE SACAROSA, PRODUCCIÓN DE ADPGLUCOSA Y OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS CUYAS HOJAS Y ÓRGANOS DE RESERVA ACUMULEN ALTO CONTENIDO EN ADPGLUCOSA Y ALMIDÓN.
SECTOR DE LA TÉCNICA AL QUE SE REFIERE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a la optimización de la producción de sacarosa sintasa recombmante (SS) en forma soluble y activa haciendo uso de una cepa apropiada de Escheri chia coli , la utilización de la SS para la elaboración de dispositivos (kits) de determinación de sacarosa, diseño de formas optimizadas de SS para la síntesis de ADPglucosa (ADPG) , y a la obtención de plantas transgénicas cuyas hojas y tejidos de reserva acumulan altos niveles de ADPG y almidón enriquecido en anulosa como resultado de la sobreproducción de ADPG citosólico en plantas que sobreexpresan la SS.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El almidón constituye la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en plantas. Se acumula en grandes canti- dades en órganos tales como semillas (trigo, cebada, maíz, guisante, etc.) y tubérculos (patata y batata entre otros) y es un constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado, el almidón es utilizado frecuentemente en las industrias papelera, cosmética, farmacéutica y alimentaria, y también se utiliza como componente fundamental para la fabricación de plásticos biodegradables y pinturas de bajo impacto medioambiental. Constituidos por moléculas de glucosa unidas covalentemente, el estudio de los procesos implicados en la síntesis de este polisacáπdo constituye un tema prioritario en diversos ámbitos de la producción industrial .
El ADPG es el precursor universal de la biosintesis del almidón en plantas, tanto en órganos heterotróficos (Fig. 1A) como en hojas (Fig. 2A) , y está ampliamente asumido que su producción está exclusivamente controlada por el enzima ADPG pirofosfoπlasa (AGPasa) o ADPG smtasa (EC 2.7.7.27) (Okita, T. W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Muller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase m transgenic potatoes leads to sugar-stoπng tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protem genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry, G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch m plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase . Science 258, 287-282; Neuhaus, E.H., Hausler, R.E., Sonne ald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch m leaves. Trends Plant Sci. en prensa) . Las diferentes aplicaciones del almidón producido en una planta están basadas principalmente en el balance de a ilosa y amilopectma, el cual determina la estructura del granulo de almidón, asi como su viscosidad en suspensiones acuosas. Tal proporción de amilosa y amilopectma depende, entre otras razones, de la concen-tracion de ADPG en la célula vegetal (Clarke, B.R., Denyer, K., Jenner, C.F., Smith, A.M. (1999) The relationship between the rate of starch synthesis, the adenosme 5 " -diphosphoglucose concentration and the amylose content of starch m developmg pea embryos. Planta 209, 324-329) .
La SS (EC 2.4.1.13, SS) (UDP-glucose : D-fructose-2-glucosyl transferase) es una enzima reversible que cataliza la producción de UDPG y fructosa a partir de la sacarosa y UDP. Aunque, tal y como se ilustra en la Fig. 1A, clásicamente se ha atribuido a la SS el papel de producir el UDPG cuyo procesamiento metabólico dé lugar a la producción eventual de almidón en tejidos heterotróficos tales como endospermos y tubérculos (Zrenner, R., Salanoubat, M., illmitzer, L., Sonnewald, U. (1995) Evidence for the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants. Plant J. 7, 97- 107; Baroj a-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa, T., Rodriguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509; Pozueta-Romero, J., Muñoz, F.J., Rodriguez-López, M., Baroj a-Fernández, E., Akazawa, T. (agosto 2003) New waves in the starch field. Lett . Plant Cell Physiol. 24-32), existen referencias sobre la potencialidad del enzima de utilizar in vitro otros nucleótidos difosfato para la producción de los correspondientes azúcares-nucleótido (Murata, T., Sugiyama, T., Minamikawa, T., Akazawa, T. (1966) Enzymic mechanism of starch synthesis in ripening rice grains . Mechanism of the sucrose-starch conversión.
Arch. Biochem. Biophys . 113, 34-44; Delmer, D. P. (1972) The purification and properties of sucrose synthase from etiolated Phaseolus aureus seedlings. J. Biol. Chem. 247, 3822-3828;). Aunque de cuestionada relevancia fisiológica (Okita, T. W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Müller-Róber, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238), se ha sugerido que la SS está capacitada para producir directamente ADPG utilizable para la producción de almidón tanto en tejidos heterotróficos como tejidos foto- sintéticos (Figs. IB y 2B) (Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) Sucrose-starch conversión in heterotrophic tissues of plants. Crit. Rev. Plant Sci . 18, 489-525; Baroj a-Fernández, E., Muñoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) Reappraisal of the currently prevailing model of starch biosynthesis in photosynthetic tissues: a proposal involving the cytosolic production of ADP-glucose by sucrose synthase and occurrence of cyclic turnover of starch in the chloroplast. Plant Cell Physiol.
42, 1311-1320; Baroj a-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa,
T., Rodriguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of
ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509; Baroja- Fernández, E., Muñoz, F.J., Zandueta-Criado, A., Morán- Zorzano, M.T., Viale, A.M., Alonso-Casajús, N., Pozueta- Romero, J. (2004) Most of ADPglucose linked to starch biosynthesis occurs outside the chloroplast in source leaves. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101, 13080-13085). De acuerdo a esta hipótesis (basada única y circunstancialmente en evidencias de tipo bioquímico) , la SS seria responsable de la síntesis de un pool importante de moléculas de ADPG necesarias para la biosintesis del almidón. Tal hipótesis sin embargo no ha sido demostrada experimentalmente mediante ingeniería genética o técnicas de mejora tradicional de cultivos, y no es consistente con las innumerables pruebas de tipo genético y molecular que indican que la AGPasa es la única fuente de ADPG en plantas (Okita, T. . (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Müller-Róber, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Neuhaus, E.H., Hausler, R.E., Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch m leaves. Trends Plant Sci. en prensa) .
Azucares-nucleótidos tales como el UDPG o el ADPG se producen para su comercialización a partir de reacciones pirofosforilásicas catalizadas por enzimas tales como la UDPG pirofosforilasa (UGPasa) y la AGPasa, respectivamente, basadas en la utilización de una sustancia de alto coste económico denominada glucosa-1-fos-fato (G1P) . Una alternativa a esta práctica de producción de azúcares- nucleótidos se basa en la utilización de SS cuyo desarrollo se ha visto impedido en gran medida por las limitaciones de Escheπ chia coli para expresar y procesar de manera eficiente un gran número de proteínas eucariotas . Tal limitación ha impulsado a algunos investigadores a producir SS recombmante haciendo uso de factorías bioló-gicas de tipo eucaπota tales como las levaduras (Zervosen, A., Romer, U., Ellmg L. (1998) Application of recombinant sucrose synthase-large scale synthesis of ADP-glucose. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 5, 25-28; Romer, U., Schrader, H., Gunther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and characteπzation of recombmant sucrose synthase I fro Solanum tuberosum L. For carbohydrate engmeenng. J. Biotechnology 107, 135- 149) . Alternativamente, la SS destinada a la producción de azucares-nucleótidos ha tenido que ser purificada mediante costosos procesos de purificación de proteínas a partir de extractos vegetales (patente DE4221595 (1993), Purified sucrose synthase enzy e useful for production of nucleotide-activated sugars or oligosaccharides) . Tal SS obtenida desde extractos vegetales tiene el inconveniente de que presenta una predilección por el UDP y muy baja afinidad por el ADP (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764; Nguyen-Quock B., Krivitzky, M., Huber, S. C, Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523; Morell, M., Copeland, L. (1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78, 149-154) . Recientemente se ha logrado producir SS recombinante a partir de cultivos de E. coli (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escheri chi a coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Nakai, T., Konishi, T., Zhang, Z-Q., Chollet, R., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Yoshinaga, F., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "An increase in apparent affinity for sucrose of mung bean sucrose synthase is caused by in vitro phosphorylation or directed mutagenesis of Serll" Plant Cell Physiol. 39, 1337-1341; Barratt, D.H.P., Barber, L, Kruger, N.J., Smith, A.M., Wang, T.L., Martin, C. (2001) Múltiple, distinct isoforms of sucrose synthase in pea. Plant Physiol. 127, 655-664; Christopher, B., William, B., Robert, H. "Bacterial sucrose synthase compositions and methods of use" Patente WO9803637) . Sin embargo, la producción de SS en este sistema procariota estaba asociada a problemas tales como (1) la cantidad de SS producida era muy baja (30 microgramos/gramo de bacteria, Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escheri chia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B., Hew, C.S. (2003) "Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidi u Goldiana . Physiol. Plantarum 118, 352-360), (2) la cantidad de SS activa obtenida era muy baja o nula (0.05-1.5 unidades/mg (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Morí, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characteπzation of sucrose synthase from mung bean seedlmgs m Escheri chia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B, Hew, C.S. (2003) Clonmg, characterization and expression analysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidi um Goldiana . Physi ol . Plantarum 118, 352-360); 5.6 U/mg (Romer, U., Schrader, H., Gunther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Ellmg, L. (2004) Expression, puπfication and characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate engmeenng. J. Biotechnology 107, 135- 149,), (3) la SS recombmante debía ser purificada por métodos convencionales de purificación de proteínas tales como cromatografía, electroforesis, isoelectroenfoque, etc. que, combinados, resultan costosos y no garantizan la purificación de la proteina en estado homogéneo y (4) la mayor parte de la SS es enviada a cuerpos de inclusión o bien se acumulaba en forma de agregados inactivos como resultado de la incapacidad de la maquinaria de la bacteria de plegar correctamente la protema (Miroux, B., Walker, J.E. (1996) "Over-production of protems m Escheπchia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane protems and globular protems at high levéis" J. Mol. Biol. 260, 289-298) .
La presente invención describe el desarrollo de un sistema basado en la utilización de una cepa apropiada de E . coli y en el uso de un vector de expresión adecuado que permita la producción a gran escala y purificación rápida y fácil de distintas versiones de SS recombmante en su forma activa. Algunas de estas versiones presentan una afinidad por ADP muy superior a las obtenidas desde extractos vegetales y pueden ser empleadas tanto para la producción de UDPG como ADPG a partir de sustancias de bajo coste económico tales como la sacarosa, el UDP o el ADP .
Las técnicas cromatograficas constituyen una poderosa herramienta de determinación de contenido de sacarosa en muestras complejas tales como extractos vegetales, sueros, orina, zumos, vinos, frutos y alimentos (D Aoust, M-A. , Yelle, S, Nguyen-Quoc, B. (1999) Antisense mhibition of to ato fruit sucrose synthase decreases fruit settmg and the sucrose unloadmg capacity of young fruit. Plant Cell 11, 2407-2418; Tang, G-Q., Sturm, A. (1999) Antisense repression of sucrose synthase m carrot affects growth rather than sucrose partitionmg. Plant Mol. Biol. 41, 465- 479; Frías, J., Pnce, K.R., Fenwich, G.R., Hedley, C.L., Sorensen, H., Vidal-Valverde, C. (1996) J. Chromatogr. A 719, 213-219) . Tales técnicas requieren personal técnico altamente especializado y están asociadas a una alta inversión económica en equipamientos. Lamentablemente, métodos alternativos basados en la hidrólisis de la molécula de sacarosa por acción de la enzima mvertasa y posterior determinación espectrofotometrica o fluorometπca de las moléculas de glucosa y/o fructosa (Sweetlove, L.J., Burrell, M.M., ap Rees, T. (1996) Starch metabolism m tubers of transgenic potato with mcreased ADPglucose pyrophosphorylase . Biochem. J. 320, 493-498; Stitt, M., Lilley, R.M., Gerhardt, R., Heldt, H.W. (1989) Metabolite levéis m specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods Enzy ol. 174, 518-552; Holmes, E.W. (1997) Coupled enzymatic assay for the determmation of sucrose. Anal. Biochem. 244, 103-109; Methods of Analysis (1996) Code of Practice for Evaluation of Fruit and Vegetable Juicess. Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables of the European Economic Community) están sujetos a limitaciones de tipo técnico tales como la sustracción de las medidas correspondientes a la glucosa y/o fructosa endógenas existentes en la muestra. La abundancia de la glucosa y/o fructosa en la muestra puede aportar un ruido de fondo tal que impida la determinación fiable y exacta de sacarosa. En la gran mayoría de los casos es preciso realizar controles exhaustivos antes de emitir un dato fiable sobre el verdadero contenido de sacarosa de una muestra (Worrell, A.C, Bruneau, J-M., Summerfelt, K., Boersig, M., Voelker, T.A. (1991) Expression of a maize sucrose phosphate synthase m tomato alters leaf carbohydrate partitionmg. Plant Cell 3, 1121-1130) . Kits de determinación de sacarosa basados en la utilización de la mvertasa están disponibles en compañías tales como Sigma, Biopharm GmbH y Megazyme. Alternativamente se ha desarrolado un método automatizado de determinación de la sacarosa basado en la determinación de la glucosa-1-fosfato liberada por la acción de la sacarosa fosfoπlasa de origen bacteriano (Vinet, B., Panzini, B., Boucher, M., Massicotte, J. (1998) Automated enzymatic assay for the determmation of sucrose m serum and uriñe and íts use as a marker of gastric damage . Clin. Chem. 44, 2369-2371). La presente invención describe el desarrollo de un método alternativo simple, fiable y poco costoso para la determinación de la sacarosa en una muestra basado en la utilización de la SS y enzimas acopladores que hidrolizan el ADPG o el UDPG.
Las reflexiones acerca de los factores que gobiernan los niveles mtracelulares de ADPG han girado fundamentalmente en torno a la regulación del enzima smtetizador, la AGPasa (Preiss, (1988) Biosynthesis of starch and íts regulation. The Biochemistry of Plants. Vol. 14, Academic Press, New York, pp.182-249; Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) Sucrose-starch conversión m heterotrophic tissues. Crit. Rev. Plant. Sci. 18, 489-525) . De hecho, gran parte de las patentes y publicaciones científicas relacionadas con la obtención de ADPG y con la obtención de plantas productoras de almidones de interés industrial, giran en torno a la utilización de la AGPasa (Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry, G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase . Science 258, 287-282; Slattery, C.J., Kavakli, H., Okita, T.W. (2000) Engineering starch for increased quantity and quality. Trends Plant Sci 5, 291-298) . Sin embargo, pendiente de ser confirmado por evidencias de tipo genético/molecular, recientes aportaciones científicas de tipo bioquímico indican que, tal y como se ilustra en las Figs. IB y 2B, la SS podría estar implicada en la síntesis directa de ADPG necesario para la biosintesis del almidón (Baroj a-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa, T., Rodriguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509) . Esta hipótesis es especialmente conflictiva, teniendo en cuenta que (a) jamás se ha vinculado la SS con la producción de almidón en hojas, (b) es preciso la existencia de un translocador de ADPG en las membranas de los plastidios que conecte el pool citosólico del ADPG producido por SS con la almidón sintasa existente en el interior del plastidio y (c) la implicación de la SS como fuente productora de ADPG riñe frontalmente con multitud de pruebas de tipo bioquimico/genético/molecular que aparentemente muestran que la AGPasa es la única fuente de ADPG (Okita, T. W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Müller- Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry, G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch m plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase . Science 258, 287-282; Neuhaus, E.H., Hausler, R.E., Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch m leaves. Trends Plant Sci. en prensa) . Quizás por todo ello jamas hasta ahora se hayan diseñado plantas que sobre- expresan SS para la producción de altos niveles de almidón. Sin embargo, la presente invención describe por primera vez la producción de plantas transgénicas que sobre-expresan SS para incrementar su producción de ADPG y almidón Por otro lado demostramos que plantas deficitarias en almidón como resultado de la ausencia de AGPasa poseen niveles normales de ADPG. Con todo ello se demuestra que, tal y como se ilustra en las Figs. IB y 2B, la SS esta implicada en la síntesis directa del ADPG necesario para la biosintesis del almidón y es responsable de la síntesis de la mayor parte del ADPG acumulado en la célula vegetal.
Aunque basados en el planteamiento ilustrado en la Fig. 1A según el cual la SS esta implicada en la síntesis del UDPG (no ADPG) en tejidos de reserva, varios trabajos han descrito la producción de plantas con reducido contenido de almidón como consecuencia de la reducción de la actividad SS (Chourey, P.S., Nelson, O.E. (1976) The enzymatic deficiency conditioned by the shrunken-1 mutations m maize. Biochem. Genet. 14, 1041-1055 ; Zrenner, R., Salanoubat, M., Willmitzer, L., Sonnewald, U. (1995) Evidence for the crucial role of sucrose synthase for smk strength usmg transgenic potato plants. Plant J. 7, 97- 107; Tang, G-Q., Sturm, A. (1999) Antisense repression of sucrose synthase m carrot (Daucus carota L.) affects growth rather than sucrose partitiomng. Plant Mol. Biol. 41, 465-479) . En este sentido, no existen evidencias experimentales de que la sobre-expresión de la SS pueda utilizarse para la producción de plantas con alto contenido en almidón como resultado del incremento de los niveles de ADPG acorde a los esquemas metabólicos representados en las Figs. IB y 2B. Por el contrario, basados en la capacidad de la SS de producir la molécula precursora de la biosintesis de polisacáπdos de pared celular (la UDPG) se han publicado y patentado trabajos en los que se describe la producción de plantas de algodón con alto contenido en fibra o cereales con alto contenido en celulosas como resultado de la sobre-expresion de la SS (Timothy, H.J., Xiamomu N., Kanwarpal, S "Manipulation of sucrose synthase genes to improve stalk and grain quality" Patente WO02067662; Robert, F., Danny, L, Yong-Lmg, R. "Modification of sucrose synthase gene expression ín plant tissue and uses therefor" Patente WO0245485; Chπstopher, B., William, B., Robert, H. "Bacterial sucrose synthase compositions and methods of use" Patente WO9803637) .
Un objeto de la invención es, en primer lugar, la puesta a punto y optimización de un método de producción de grandes cantidades de SS recombinante soluble, fácilmente puπfi- cable y de alta actividad especifica basado en la utilización de una cepa de E. coli apropiada y en la utilización de un vector de expresión que permite la obtención de la SS con una cola de histidmas. Otro objeto de la invención es el procedimiento seguido para la elaboración de dispositivos o kits de determinación de sacarosa basados en el empleo del producto enzimático con actividad SS acoplado a enzimas que metabolizan el ADPG o el UDPG. Otro objetivo es la optimización de la producción de azucares-nucleótidos tales como el ADPG o el UDPG a partir de versiones de la SS especialmente diseñadas a tal efecto. Finalmente, se detalla el diseño de plantas transgenicas con alto contenido de sacarosa, ADPG y almidón y alto balance amilosa/amilopectma tras sobreexpresar la SS. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Ampliación de un cDNA que codifica para una SS .
Conocida la secuencia nucleotidica de Sacarosa sintasa silvestre SS4 (Fu, H., Park, W.D. (1995) Smk- and vascular-associated sucrose synthase functions are encoded by different gene classes m potato. Plant Cell 7, 1369- 1385) se crearon dos cebadores específicos correspondientes a los extremos 5 y 3 del gen. Haciendo uso de estos cebadores se amplifico por métodos convencionales de PCR un fragmento de DNA de 2418 pares de bases, designado con SSX, a partir de una genoteca de cDNA de hoja de patata. Tal fragmento de PCR se introdujo en el plasmado pSK Bluescript (Stratagene) dando lugar a la construcción pSS (Fig. 3A) la cual fue amplificada en la bacteria hospedadora XL1 Blue .
Obtención de SS recombinante activa a partir de una cepa especial de E. coli
pSS fue digerido con los enzimas de restricción Ncol y Notl . El fragmento liberado (que contiene al cDNA que codifica para SS, SSX) fue clonado en los mismos sitios de restricción del plasmido de expresión pET-28a(+) (Novagen) (Fig. 3B) el cual posee una secuencia nucleotidica en la región polylmker que codifica para una secuencia rica en histidmas, la cual queda fusionada con la protema recombinante . El plasmido resultante (designado con el nombre de pET-SS, Fig. 3C) fue introducido por electroporacion en varias cepas de E. coli . La cepa de E. coli BLR(DE3) (Novagen) transformada con pET-SS fue depositada en la Colección Española de Cultivos tipo el 29 de octubre de 2003, sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España) con el n° de depósito CECT:5850. Las bacterias fueron incubadas a 20°C en medio LB . La sobre-expresion de SSX tuvo lugar mediante la adición de 1 mM ísopropyl-D-D-thiogalactopyranoside (IPTG) en 100 mi de cultivo celular crecido a 202C. Tras seis horas de cultivo inducido se recogieron las bacterias y se resuspendieron en 4 mi de "bmdmg buffer" (Novagen, His-bmd purification kits), se sonicaron y se centrifugaron a 40.000 g durante veinte minutos. El sobrenadante que contiene la SS recombmante con una secuencia amonoacidica rica en residuos de histidmas en el extremo N-termmal se hizo pasar a través por una columna de afinidad del kit de purificación de proteínas "His-bmd" de Novagen. Siguiendo las instrucciones del kit se eluyó SS con 6 mi del tampón de elución recomendado, en el que se habla incluido 200 M de ímidazol en lugar de 1 molar. Tras la elución la protema fue sometida rápidamente a una diálisis para retirar cualquier traza de ímidazol que mactive irreversiblemente a la SS .
Producción de una isoforma de SS optimizada para la producción de ADPG
Haciendo uso de cebadores adecuados y utilizando pSS como molde, se diseñó la versión mutada SS5, dando lugar a la construcción pSS5. Para ello, se hizo uso del kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) . pSS5 fue digerido con Ncol y Notl. El fragmento liberado (que contiene a SS5) se clono en los mismos sitios de restricción del plásmido de expresión pET-28a(+) dando lugar a pET-SS5, el cual se introdujo por electroporación en E. coli BLR(DE3). La cepa de E . coli XL1 Blue transformada con pSS5 fue depositada en la colección Española de Cultivos Tipo el 29 de octubre de 2003, sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España), con el n° de deposito CECT:5849.
Obtención de plantas transgénicas que sobreexpresan SS4
En la presente invención SS ha sido sobre-expresada (a) constitutivamente, (b) específicamente en hojas y (c) específicamente en órganos de reserva tales como tubérculos .
Para la producción de plantas que sobre-expresen SS de manera constitutiva, se crearon construcciones gobernadas por la acción del promotor constitutive 35S del virus del mosaico del tabaco. La introducción secuencial en pSS del promotor 35S y del termmador NOS en las regiones 5' y 3 de SSX, dio lugar a la producción del plásmido p35S-SS-NOS cuyo mapa de restricción se representa en la Fig. 4B.
Para poder transferir esta construcción al genoma de las plantas vía Agrobacteπ um tumefaci ens, es preciso que pre- viamente sea clonada en un plasmido binario. Para ello, p35S-SS-nos fue digerido secuencialmente con los enzimas Notl, T4 DNA polimerasa y HmdlII y se clonó dentro del plasmido binario pBIN20 (Fig. 4A) Hennegan, K.P., Danna, K.J. (1998) pBIN20: An improved bmary vector for Agrobacteπ um-mediated transíormation. Plant Mol. Biol. Rep . 16, 129-131) que previamente habla sido digerido secuencialmente con los enzimas EcoRI, T4 DNA polimerasa y HindIII. El plásmido asi obtenido se designó con el nombre de pBIN35S-SS-NOS (Fig. 4C) .
Para sobre-expresar SS específicamente en hojas iluminadas se amplificó por PCR la región promotora (designada como RBCS) del gen que codifica para la subunidad pequeña de la RUBISCO (Rιbulose-1, 5-bιsphosphate carboxylase/oxygenase) de tabaco (Barnes, S.A., Knight, J.S., Gray, J.C. (1994) Alteration of the amount of the chloroplast phosphate translocator m transgenic tobáceo affeets the distπbution of assimilate between starch and sugar. Plant Physiol. 106, 1123-1129) . Tal secuencia nucleotidica (que confiere expresión especifica en células fotosmteticamente activas) se introdujo en el vector pGEMT-easy (Promega) , dando lugar a pGEMT-RBCSprom (Fig. 5A) . Esta construcción fue digerida con HindIII y Ncol y el fragmento liberado fue clonado en los sitios de restricción correspondientes de p35S-SS-NOS, dando lugar a pRBCS-SS-NOS (Fig. 5B) . Esta construcción fue digerida secuencialmente con HmdlII, T4 DNA polimerasa y Notl. El fragmento liberado fue clonado en pBIN20 digerido secuencial ente con HindIII, T4 DNA polimerasa y EcoRI . La construcción resultante se designo con el nombre de pBINRBCS-SS-NOS (Fig. 5C) .
Tras amplificarse en E . coli (XL1 Blue) , tanto pBIN35S-SS- NOS como pBINRBCS-SS-NOS se introdujeron en A. tumefaci ens C58:GV2260 (Debleare, R., Bytebier, B., de Greve, H., Debroeck, F., Schell, J., van Montagu, M., Leemans, J. (1985) "Efficient octopine Ti plasmid-deπved vectors of
Agrobacterium mediated gene transfer to plants" Nucí. Acids
Res. 13, 4777-4788) el cual fue utilizado para transformar especies tales como tomate { Lycopersi con scul entum) , tabaco { Ni coti ana tabacum) , patata { Solanum tuberosum) y arroz de acuerdo a técnicas convencionales (Horsch, R.B., Fry, J.E.,
Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R.T. (1985) "A simple and general method for transferπng genes into plants" Science 277, 1229-1231; Pozueta-Romero, J., Houlne, G., Schantz, R., Chamarro, J. (2001) "Enhanced regeneration of tomato and pepper seedlmg explants for Agrobact en um-mediated transformation" Plant Cell Tiss. Org. Cult. 67, 173-180; Hiei, Y., Ohta, S. Komari, T., Kumashiro, T. (1994) "Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271- 282). La cepa de A. tumefaci ens C58:GV2260 transformada con pBIN35S-SS-NOS fue depositada en la Colección Española de Cultivos tipo el 29 de octubre de 2003, sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus de Burjasot, Burjasot 46100 (Valencia, España), con el n° de depósito CECT:5851.
Elaboración de dispositivos (kits) de ensayo para determinación de sacarosa
Uno de los kits diseñados para la determinación de sacarosa, ilustrado en el siguiente Esquema I de reacciones enzimáticas implicadas en el kit de determinación espectrofotométrica/fluorimétrica de sacarosa basado en la transformación de la sacarosa en un azúcar-nucleótido y posterior transformación de éste en glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato y NAD(P)H.
osa
Figure imgf000019_0001
NDP-glucosa | NMP pirofosfatasa
Figure imgf000019_0002
Glucosa f o sf o glucomut as a
Glucosa i-6-fosfato
6-fosfogluconato deshidrogenas;!
Figure imgf000019_0003
6-fosfo-gluconato Esquema I El kit está basado en la acción de la SS sobre la molécula de sacarosa en presencia de un nucleótido difosfato (e . UDP o el ADP) , liberando cantidades equimolares de fructosa y el azúcar-nucleótido correspondiente. Si el azucar- nucleótido resultante de la reacción es UDPG, este se somete a la acción de enzimas hidroliticos del UDPG tales como la UDPG pirofosfatasa de tipo Nudix (EC 3.6.1.45) (Yagí, T., Baroj -Fernández, E., Yamamoto, R., Muñoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Clonmg, expression and characterization of a mammalian Nudix hydrolase-like enzyme that cleaves the pyrophosphate bond of UDP-glucose. Biochem. J. 370, 409-415) o la UDPG hidrolasa (Burns, D.M., Beacham, I.R. (1986) Nucleotide sequence and transcπptional analysis of the E. coli ushA gene, encodmg peπplasmic UDP-sugar hydrolase (5 ' -nucleotidase) : regulation of the ushA gene, and the signal sequence of íts encoded protem product . Nucí. Acids Res. 14, 4325-4342) . La G1P liberada por acción de estos enzimas hidroliticos es transformada por acción de la fosfoglucomutasa (PGM) , rindiendo glucosa-6-fosfato (G6P) , que a su vez puede hacerse reaccionar acopladamente con NAD(P)+ por acción del enzima G6P deshidrogenasa (G6PDH) , obteniéndose 6- fosfogluconato y NAD(P)H, fácilmente determinable por fluoπ etria y por espectrofotometria a 340 nm. A su vez, el NAD(P)H liberado puede acoplarse a la acción de la FMN- oxidoreductasa/luciferasa, rindiendo luz que es cuantificada espectrofotométπcamente .
Alternativamente, y tal y como se ilustra en el esquema II, el UDPG producido puede acoplarse con la UDPG deshidrogenasa (EC 1.1.1.22) que, en presencia de NAD, da lugar a cantidades equimolares de UDP-glucuronato y NADH determmable por fluorometria o por espectrofotometπa a 340 nm. A su vez, el NADH liberado puede acoplarse a la acción de la FMN-oxidoreductasa/luciferasa, rindiendo luz que es cuantificada espectrofotométricamente
Sacarosa Sacarosa sintasa ctosa
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UDP-glucuronato Esquema II
Si el producto de la reacción catalizada por la SS es ADPG, éste se somete a la acción de enzimas hidroliticos del ADPG tales como la ADPG pirofosfatasa bacteriana (EC 3.6.1.21) (Moreno-Bruna, B., Baroj a-Fernández, E., Muñoz, F.J., Bastarrica-Berasategui, A., Zandueta-Criado, A., Rodriguez- López, M., Lasa, I., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) Adenosine diphosphate sugar pyrophosphatase prevents glycogen biosynthesis in Escheri chia coli . Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 8128-8132). La G1P liberada es transformada por acción de la fosfoglucomutasa, rindiendo glucosa-6-fosfato (G6P) , que a su vez puede hacerse reaccionar acopladamente con NAD(P)+ por acción del enzima G6P deshidrogenasa, obteniéndose 6-fosfogluconato y NAD(P)H, fácilmente determinable por fluorometria o espectrofo-tometria a 340 nm.
En cualquier caso, los esquemas de reacciones enzimáticas acopladas a la producción de un azúcar-nucleótido por mediación de la SS, son perfectamente susceptibles de ser aplicados a la detección amperométrica . EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Se describen a continuación ejemplos en los que se muestra detalladamente el procedimiento de clonaje de un cDNA que codifica para una isoforma de SS de patata en un vector de expresión adecuado y en una cepa de E. coli optimizada para la producción y acumulo del enzima en su forma activa. Otros ejemplos muestran la utilización de la SS recombmante para la producción de kits (dispositivos de ensayo) de determinación de sacarosa en muestras vegetales, suero, orina, zumos, néctares, bebidas refrescantes, etc.. Otro ejemplo muestra la utilización de versiones de SS optimizadas para la producción a gran escala de azúcares- nucleotidos tales como UDPG y ADPG. Por último otro ejemplo muestra la obtención de plantas con alto contenido en sacarosa, ADPG, almidón y alto balance amilosa/amilopectma como resultado de la alta actividad productora de ADPG en plantas que sobreexpresan la SS .
Ejemplo 1: Expresión en Escher±chia coli BLR (DE3) de una SS recombinante con una cola de histidinas, fácilmente purificable y de alta actividad específica
El conocimiento de la secuencia nucleotidica del gen SS4 que codifica para una isoforma de SS de patata permitió la creación de dos cebadores específicos cuyas secuencias son, en sentido 5' - 3', SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Haciendo uso de estos cebadores se amplifico por métodos convencionales de PCR un fragmento de DNA, designado como SSX, a partir de una genoteca de cDNA de tubérculo de patata, que se introdujo en un plásmido pSK Bluescript (Stratagene) el cual fue amplificado en la bacteria hospedadora XL1 Blue. La secuencia nucleotidica de SSX es SEQ ID NO: 3 que es ligeramente diferente a SS4 (número de accesión en GenBank U24087) . La secuencia ammoacidica deducida de SEQ ID NO: 3 es ligeramente diferente a SS4 y por ello se designa con el nombre de SSX. La secuencia ammoacidica deducida tras la expresión de SEQ ID NO: 3 en el plasmido pET-28a(+) es SEQ ID NO: 4, la cual incluye una secuencia de 38 aminoácidos rica en histidmas fusionada con el extremo ammo-terminal de la secuencia ammoacidica deducida de SEQ ID NO: 3.
La inducción de la producción de SSX en bacterias BL21(DE3) transformadas con pET-SS tuvo lugar al añadir 1 mM IPTG. Tras seis horas adicionales de cultivo a 37 C, se observo que las bacterias transformadas con pET-SS acumulaban una proteina en forma agregada cuyo tamaño se corresponde al de la SS. Sin embargo, tales bacterias no tenían actividad SS. Tal fracaso en la expresión de una forma activa de SS es atπbuible a los problemas que posee E. coli en el correcto plegado de algunas proteínas eucaπotas de alto peso molecular (Miroux, B., Walker, J.E. (1996) "Over-production of protems m Escheπ chia coli : mutant hosts that allow synthesis of some membrane protems and globular protems at high levéis" J. Mol. Biol. 260, 289-298) . Con el fin de superar este problema, se investigo la capacidad de producción de SS activa en otras cepas bacterianas y a una temperatura de 20 C. En todas ellas la inducción de la producción de SSX tuvo lugar al añadir 1 mM de IPTG. Tras 6 horas de incubación adicional, las bacterias fueron somcadas y centrifugadas. El sobrenadante resultante fue analizado para la actividad SS . En estas condiciones, tal y como se ilustra en la Fig. 6, la cepa BLR(DE3) resulto ser la mas eficiente desde el punto de vista de la producción de SS activa y soluble. La cepa de E. coli BLR(DE3) (Novagen) transformada con pET-SS fue depositada en la Colección Española de Cultivos tipo el 29 de octubre de 2003, con el n° de deposito CECT:5850. La contribución de la SSX recombmante en el pool proteico total de CECT:5850 es de aproximadamente un 20°, frente a la muy escasa productividad de SS recombinante (30 microgramos por gramo de bacteria) descrita en la literatura (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escheri chia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B, Hew, C.S. (2003) Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidi um Goldiana . Physi ol . Plantarum 118, 352-360) . El sobrenadante se hizo pasar a través de la columna de afinidad "His-Bind" (Novagen) en la que se queda retenida específicamente la proteina recombinante poseedora de una cola de histidinas. Tras eluir y dializar la SS purificada, ésta fue incubada con 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethilenglycol / 1 mM MgCl / 15 mM KC1/ 2 mM UDP. La actividad especifica, estimada en términos de producción de UDPG, era de 80 unidades/mg de proteina, muy superior a la actividad de 0.05-5 unidades/mg de SS recombinante descrita en la literatura (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escheri chia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B, Hew, C.S. (2003) Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Onci di um Goldiana . Physi ol . Plantarum 118, 352-360; Rómer, U., Schrader, H., Günther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107, 135-149) y superior a 3 unidades/mg correspondiente a la SS purificada desde extractos vegetales (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764). La unidad se define como la cantidad de enzima que cataliza la producción de un micromol de UDPG por minuto. La afinidad por UDP en presencia de 500 mM sacarosa fue de Km (UDP) = 0.25 mM, mientras que la Km por sacarosa fue de 30 mM en presencia de 1 mM UDP. Esta afinidad por sacarosa en presencia de UDP es significativamente superior a la mostrada por la SS recombmante obtenida en levaduras (Km= 95 mM, Romer, U., Schrader, H., Gunther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, puπfication and characteπzation of recombmant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate engmeeπng. J. Biotechnology 107, 135-149) .
Ejemplo 2: Producción de UDPG y ADPG a gran escala a partir de la utilización de SS recombinante de E. coli
La producción económica y eficiente de 3 gramos de UDPG de alta pureza tuvo lugar tras la incubación durante 12 horas a 37 C de 100 mililitros de una solución con 1 M sacarosa, 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethllenglycol / 1 mM MgCl / 15 mM KC1/ 100 mM UDP y 30 unidades de SS recombinante de patata obtenida tras la expresión de pET-SS en BLR(DE3) y posterior purificación. La reacción finalizo tras calentar la solución a 100JC durante 90 segundos y posterior centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se aplicó a un cromatógrafo HPLC (Waters Associate's) a escala preparativa y el UDPG se purifico según se describe en la literatura (Rodriguez-López, M., Baroj a-Fernández, E., Zandueta-Cπado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) Adenosme diphosphate glucose pyrophosphatase : a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 8705-8710) La producción de ADPG requirió la generación de una forma mutada de SS con una afinidad por el ADP mucho mayor que la descrita para la SS extraída desde tejidos vegetales (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and changes m activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764; Nguyen-Quock B., Krivitzky, M., Huber, S. C, Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase m developmg maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523; Morell, M., Copeland, L. (1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78, 149-154) .
Tal isoforma, designada como SS5 se obtuvo mediante mutagenesis puntual de SSX haciendo uso del kit QuikChange Site-directed Mutagenesis (Stratagene) y utilizando secuen- cialmente las siguientes parejas de cebadores cuyas secuencias son [SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6], [SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8] y [SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10]. La secuencia nucleotidica obtenida, designada como SS5, es SEQ ID NO: 11. Los cambios en la secuencia ammoacidica de SS5 (Susy 5) respecto a SS4 -Susy 4- (existente en bancos de datos) se ilustran a continuación en la Tabla I sombreados. La secuencia ammoacidica deducida tras la expresión de SEQ ID NO: 11 en el plasmido pET-28a(+) es SEQ ID NO: 12, la cual incluye una secuencia de 38 aminoácidos rica en histidmas fusionada con el extremo a mo-terminal de la secuencia ammoacidica deducida de SEQ ID NO: 11.
En la Tabla I se incluye dicha secuencia de 38 aminoácidos rica en histidmas fusionada a la parte amino-terminal de SS5. Tabla I - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SuSy 4 1 M Θ ≤ S K H H H H H S -3 G- I_ V £» R β jS ÍΪ A S S.Í T I3 <? - C- :K- SuSy 5 2 - - - - - - M A E R V L T R V H S L R E R V D A T L A A H R SuSy 4 31 B R G .9 5- F M A E R V L T R V H S L R E R V D A T L A A H R SuSy 5 25 N E I L L F L S R I E S H G K G Ϊ L K P H E L L A E F D A I SuSy 4 61 N E I L L F L S R I E S H G K G I L K P H E L L A E F D A I SuSy 5 55 R Q D D K N K L N E H A F E E L L K S T Q E A I V L P P V SuSy 4 91 R Q D D K N K L N E H A F E E F L K S T Q E A I V L P P V SuSy 5 85 A L A I R L R P G V W E Y I R V N V N A L V V E E L S V P E SuSy 4 121 A L A I R L R P G V E Y I R V N V N A L V V E E L Ξ V P E SuSy 5 115 Y L Q F K E E L V D G A S N G N F V L E L D F E P F T A S F SuSy 4 151 Y L Q F K E E L V D G A S N G N F V L E L D F E P F T A S F SuSy 5 145 K P T L T K S I G N G V E F L N R H L S A K M F H D K E S SuSy 4 181 P K P T L T K S X G N G V E F L N R H L S A K M F H D K E S SuSy 5
10 175 M T P L L E F L R A H H Y K G K T M M L N D R 1 Q N S N T L SuSy 4 211 M T P L L E F L R A H H Y K G K T M L N D R I Q N s N T L SuSy 5 205 Q N V L R K A E E Y L I M L P P E T P Y F E F E H K F Q E I SuSy 4 241 Q N V L R K A E E Y L X M L & P í T P Y F E F E H K F Q E I SuSy 5 235 G L E G G D T A E R V L E M V C M L L D L L E A P D S C SuSy 4 271 G X. E K G G D T A E R V L E M V C M L L D L L E A P D S c SuSy 5 265 T L E K F L G R I P M V F N V V I L S P H G Y F A Q E N V L SuSy 4 T L E K F L G R I P M V F N V V X L S P H G Y F A
1155 301 Q E N V L SuSy 5 295 G Y P D T G G Q V V Y 1 L D Q V P A L E R E M L K R 1 K E Q SuSy 4 331 G Y P D T G G Q V V Y I L D Q V P A L E R E M L K R I K E Q SuSy 5 325 G L D I X P R 1 L I V T R L L P D A V G T T C G Q R I E K V SuSy 4 361 G L D I I P R I L I V T R L L P D A V G T T C G Q R I E K V" SuSy 5 355 Y G A E H S H I L R V P F R T E K G I V R K I S R F E V SuSy 4 391 Y G A E H S H I L R V P F R T E K G I V R K I S R F E V w SuSy 5 385 P Y M E T F I E D V A K E I S A E L Q A K P D L I I G N Y s SuSy 4
2200 421 P Y E T F I E D V A K E I S A E L Q A K P D L I I G N Y s SuSy 5 415 E G N L A A s L L A H K L G V T Q C T I A H A L E K T K Y P SuSy 4 451 E G N L A A s L L A H K L G V T Q C T I A H A L E K T K Y P SuSy 5 445 D S D I Y W K K F D E K Y H F S S Q F T A D L I A M N H T D SuSy 4 481 D S D I Y K K F D E K Y H F S s Q F T A D L I A M N H T D SuSy 5 475 F I I T S T F Q E I A G s K D T V G Q Y E S H M A F T M P G SuSy 4 511 F I I T S T F Q E I A G s K D T V G Q Y E S H A F T M P G SuSy 5 505 L Y R V V H G I N V F D P K F N I V S P G A D I N L Y F S Y SuSy 4
25 541 L Y R V V H G I N V F D P K F N I V S P G A D I N L Y F s Y SuSy 5 535 S E T E K R L T A F H P E I D E L L Y S D V E N D E H L c V SuSy 4 571 S E T E K R L T A *s H P E X D E L L Y s D V E N D E H L c V SuSy 5 565 L K D R T K P I L F T M A R L D R V K N L T G L V E W Y A K SuSy 4 601 L K D R T K P I L F T A R L D R V K N L T G L V E Y A K SuSy 5 595 N P R L R G L V N L V V V G G D R R K E S K D L E E Q A E SuSy 4 631 M P R L R G L V N L V V V G G D R R K E S K D L E E A E M SuSy 5 625 K K M Y E L I E T H N L N G Q F R I S S Q M N R V R N G E SuSy 4
30 6S1 K K M Y E L, I E T H N L N G Q F R I S S Q M N R V R N G E SuSy 5 655 L Y R Y I A D T K G A F V Q P A F Y E A F G L T V V E A M T SuSy 4 691 L Y R Y I A D T K σ A F V Q P A F Y E A F G L T V V E A M T SuSy 5 685 C G 1, P T F A T N I-I G G P A E I I V H G K S G F H X D P Y H SuSy 4 721 C G L P T F A T N H G G P A E I I V H G K S G F H X D P Y H SuSy 5 715 G E Q A A D L L A D F F E K C K K D P S H E T I s M G G L SuSy 4 751 G E Q A A D L L A D F F E K c K R 3? P S H E T I s T τ> G L SuSy 5 745 K R I E E K Y T W Q I Y S E s L L T L A A V Y G F w K H V s SuSy 4
35 781 K R I Q E K Y T W Q I Y S E R L L T L, A A V Y G F K H V s SuSy 5 775 L D R L E I R R Y L E M F Y A L K Y R K M A E A V P L A A SuSy 4 811 K L D R L E I R R Y L E M F Y A L K Y R M A E A V P L A A SuSy 5 805 E SuSy 4 841 E SuSy 5 La SS5 recombinante obtenida tras la expresión de pET-SS5 tuvo una Vmax de 80 unidades/ mg de proteina y 65 unidades/mg de proteina en presencia de UDP y ADP, respectivamente. Las afinidades por UDP y ADP en presencia de 500 mM sacarosa resultaron ser similares (Km= 0.2 mM tanto para ADP como para UDP) , mientras que la Km por sacarosa fue de 30 mM y 100 mM en presencia de concentraciones saturantes de UDP y ADP, respectivamente. Estos parámetros cinéticos son muy diferentes a los descritos para la SS extraída desde tubérculo de patata y otros órganos de otras especies, según los cuales la Vmax del enzima es 10 veces superior en presencia de UDP que en presencia de ADP (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764; Morell, M., Copeland, L. (1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78, 149-154; Nguyen-Quoc, B., Krivitzky, M., Huber, S.C., Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523) . La cepa de E. coli XL1 Blue transformada con pSS5 fue depositada en la colección Española de Cultivos Tipo con el n° de depósito CECT:5849.
La producción económica y eficiente de 3 gramos de ADPG de alta pureza tuvo lugar tras la incubación durante 12 horas a 37 'C de 100 mililitros de una solución con 1 M sacarosa,
50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethilenglycol / 1 mM MgCl / 15 mM KC1/ 100 mM ADP y 30 unidades de SS recom-binante de patata obtenida tras la expresión de pET- SS5 en BLR(DE3) y posterior purificación en una columna
His-bind. La reacción finalizó tras calentar la solución a 100°C durante 90 segundos y posterior centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se aplicó a un cromatógrafo HPLC (Waters Associate's) a escala preparativa para la purificación del ADPG. Ejemplo 3: Elaboración de kits enzimáticos de determinación de sacarosa
Para la determinación de sacarosa se elaboraron los siguientes cocktails de reacción con los siguientes elementos y cantidades/concentraciones finales:
1. KITS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE ENZIMAS HIDROLITICOS DE AZÚCARES-NUCLEÓTIDOS: a. 2 unidades de SS (recombinante o no) b. 2 mM de ADP o UDP (según se produzca ADPG o UDPG, respectivamente) c. 2 unidades de ADPG pirofosfatasa o 2 unidades de UDPG pirofosfatasa (según se incluya en el cocktail de reacción ADP o UDP, respectivamente) d. 2 unidades de PGM e. 2 unidades de G6PDH f . 0.5 mM de NAD (P) g. tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethilenglycol / 1 mM MgCl2 / 15 mM KC1 h. muestra problema previamente filtrada
2. KIT BASADO EN LA UTILIZACIÓN DE LA UDPG DESHIDROGENASA a.2 unidades de SS (recombinante o no) b.2 mM de UDP c.2 unidades de UDPG deshidrogenasa d. 0.5 mM de NAD e. tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethilenglycol / 1 mM MgCl2 / 15 mM KC1 f . muestra problema previamente filtrada
La determinación de la cantidad de sacarosa presente en la muestra problema se basa en la determinación fluorométrica o espectrofotométrica a 340 nm del NAD(P)H producido según las reacciones acopladas ilustradas en los esquemas I y II. Para la determinación del contenido de sacarosa en semillas de cebada con diferentes grados de desarrollo (Figura 7), las reacciones tuvieron lugar en pocilios de 300 microlitros de una placa de Elisa durante 3 minutos a 37°C. El volumen de muestra problema fue de 20 microlitros, mientras que el volumen del cocktail resultante de la combinación de los reactivos a-g (kit #1) y a-e (kit #2) fue de 280 microlitros. Los blancos contenían todos los componentes del cocktail excepto la SS . La medición tuvo lugar en un espectrofotómetro MultiSkan. Los valores obtenidos, tanto por el kit de tipo "1" como por el kit de tipo "2" resultaron ser comparables a las determinados haciendo uso de técnicas cromatográficas descritas en la introducción (Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa, T., Rodriguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509).
Ejemplo 4: Obtención de plantas transgénicas que sobreexpresan SS
Las Figuras 8-10 ilustran los resultados obtenidos en hojas de plantas de patata que sobreexpresan la SS tanto de manera constitutiva (35S-SS-NOS) , como de manera especifica (RBCS-SS-NOS) .
Tal y como se ilustra en la Fig. 8, la actividad SS en las hojas de cualquiera de estas plantas es 2-10 veces superior a la existente en el mismo órgano de una planta silvestre (WT) . Tales hojas presentaron las siguientes características : 1. Clara correlación entre la actividad SS productora de ADPG (Fig. 8) y niveles de almidón (Fig. 9) y ADPG (Fig. 10) . Tal característica se observó no solamente en hojas, sino también en tejidos de reserva tales como tubérculos y semillas (ver después).
2. Alto contenido en almidón (Fig. 9) respecto a hojas de plantas silvestres. Asi por ejemplo, el contenido en almidón de una hoja de planta de patata "silvestre" crecida en un fotoperiodo de 8 horas luz/16 horas obscuridad y a 20°C es de 5 micromoles/gramo de peso fresco, mientras que en una hoja de una planta transgénica que sobreextresa la SS es de 8 micromoles/gramo peso fresco. Las diferencias entre plantas silvestres y transgénicas se acentúan cuando el fotoperiodo es largo, de tal modo que las hojas de una planta que sobreexpresa SS contiene 4 veces más almidón que las de una silvestre.
3. Alto contenido en ADPG respecto al mismo tejido u órgano de la planta no transformada (Fig. 10) . El contenido promedio de una hoja de planta de patata silvestre crecida en un fotoperiodo de 8 horas luz/16 horas obscuridad y a 20 "C es de 0.35 nanomoles/gramo de peso fresco, mientras que las hojas de las plantas que sobreexpresan SS pueden tener un contenido de 2.5 nanomoles/gramo de peso fresco.
4. Tanto el ADPG como el almidón se acumulan de manera transitoria a lo largo del fotoperiodo (Fig. 11) . La tasa de acumulo de ambas sustancias guarda una correlación positiva con la actividad SS, indicando que, contrariamente a lo que el modelo "clásico" de biosintesis de almidón sugiere (Fig. 2A) y confirmando las tesis del modelo "alternativo" ilustrado en la Fig. 2B, la SS juega un papel fundamental en la producción de ADPG y en la conexión del metabolismo de la sacarosa con el metabolismo del almidón.
5. Niveles normales de azúcares solubles tales como glucosa y fructosa. Sin embargo, los niveles de glucose-6-P y sacarosa en hojas transgénicas son superiores a los observados en las hojas de patata silvestres (Tabla 2) . Tabla 2: Niveles de etabolitos ( reflejados en nmol/g peso fresco) en hojas de plantas control (WT) y 35S-SuSy-NOS source leaves. Valores significativamente diferentes a los observados en WT se indican en negrita.
Figure imgf000032_0001
6. La morfología externa de las plantas que sobreexpresan SS no es aberrante, tras ser comparada con la de las plantas no transformadas.
Las Figuras 12-14 ilustran los resultados obtenidos en tubérculos de patata que sobreexpresan la SS de manera constitutiva (35S-SS-NOS) . Tales resultados son esencialmente idénticos a los observados en tubérculos que sobre-expresan la SS bajo el control de un promotor especifico de tubérculo (promotor del gen de la patatina) . Tal y como se ilustra en la Fig. 12, la actividad SS en los tubérculos de cualquiera de estas plantas es ¿??? veces superior a la existente en el mismo órgano de una planta silvestre. Tales tubérculos presentaron las siguientes características : 1. Clara correlación entre la actividad SS productora de ADPG (Fig. 12) y niveles de almidón (Fig. 13) y ADPG (Fig. 14) .
2. Alto contenido en almidón (Fig. 13) respecto a tubérculos de plantas no transformadas. Asi por ejemplo, el contenido en almidón de tubérculo de planta "silvestre" es de aproximadamente 300 micromoles/gramo de peso fresco, (equivalente a 54 mg de almidón/ gramo de peso fresco) , mientras que en tubérculo que sobreextresa la SS es de 450-600 micromoles/gramo peso fresco.
3. Alto contenido en ADPG respecto a tubérculos de plantas silvestres (Fig. 14) . El contenido promedio de un tubérculo silvestre es de 5 nanomoles/gramo de peso fresco, mientras que los tubérculos que sobreexpresan SS pueden tener un contenido de 7-9 nanomoles/gramo de peso fresco .
Los resultados obtenidos en semillas de arroz, hojas de tomate y tabaco, asi como en frutos de tomate, son cualita- tivamente similares a los mostrados en las Figuras 8-14. En todo caso se dio un incremento del contenido de almidón y un incremento del balance a ilosa/amilopectma . La producción de plantas con alto contenido en ADPG y almidón tras sobre-expresar SS es un resultado totalmente inesperado según la percepción actual de la biosintesis del almidón (ilustrado en las Figs. 1A y 2A) y quizás ello explica por qué no se han diseñado hasta ahora plantas que sobre-expresen SS como estrategia de incremento de producción de almidón. Los resultados obtenidos a partir de este trabajo sugieren que la SS, pero no la AGPasa, es la fuente fundamental de ADPG que se acumula en las plantas. Según los modelos aún vigentes, la AGPasa es la única fuente de ADPG. Sorprendentemente sin embargo, los niveles de ADPG jamas han sido investigados en plantas deficitarias en AGPasa. Para explorar la relevancia de nuestra invención hemos analizado por primera vez los niveles de ADPG y almidón en plantas de Arabidopsis y patata con reducida actividad AGPasa. Tal y como se ilustra en la Fig. 15A, los niveles de almidón en plantas TL25 de arabidopsis deficitarias en AGPasa (Lm, T.P., Caspar, T.,, Somerville, C.R., Preiss, J. (1988) Isolation and characteπzation of a starchless mutant of Arabidopsis thaliana lacking ADPglucose pyrophosphorylase activity. Plant Physiol. 88, 1131-1135) son reducidos respecto a los observados en las plantas WT . Sin embargo, los niveles de ADPG son normales (Fig. 15B) . Por otro lado, los niveles de almidón en plantas AGP62 y AGP85 de patata (Muller-Rober, B.,
Sonnewald, U., Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the
ADPglucose pyrophosphorylase m transgenic potatoes leads to sugar-stoπng tubers and mfluences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238) son reducidos con respecto a los observados en hojas de plantas silvestres (Fig. 16A) . Sin embargo, los niveles de ADPG son totalmente normales (Fig. 16B) . En conjunto, todas estas observaciones (a) demuestran que SS, pero no AGPasa, es la fuente principal de ADPG en plantas y (b) contrastan la relevancia de nuestra invención tras demostrar que la sobreexpresión de SS da lugar a plantas con alto contenido en almidón.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Mecanismos de biosintesis de almidón en órganos heterotróficos . (A) Mecanismo "clásico" según el cual la SS esta implicada en la producción de UDPG, el cual es eventualmente convertido en almidón tras la acción combinada de la UDPG pirofosforilasa (UGPase) , fosfoglucomutasa (PGM) citosólica, fosfoglucomutasa plastidial, ADPG pirofosforilasa (AGPase) y almidón smtasa. (B) Mecanismo "alternativo" según el cual SS esta implicada en la producción directa de ADPG en el citosol. El ADPG es transportado posteriormente al amiloplasto por acción de un translocador . Una vez en el interior del amiloplasto, la almidón sintasa utiliza el ADPG para producir almidón.
Figura 2: Mecanismos de biosmtesis de almidón en hojas. (A) Mecanismo "clásico" según el cual todo el proceso de biosmtesis del almidón tiene lugar en el interior del cloroplasto. Según esta visión, el metabolismo del almidón y la sacarosa no están conectados. Además, la SS no interviene en el proceso gluconeogénico . (B) Mecanismo "alternativo" de biosmtesis del almidón según el cual la SS esta implicada en la síntesis directa de ADPG en el citosol. El ADPG es posteriormente transportado al interior del plastidio donde la almidón sintasa lo utiliza como sustrato para la reacción de síntesis del almidón.
Figura 3: Etapas de construcción del plásmido de expresión pET-SS a partir de pET-28a(+) y pSS.
Figura 4: Etapas de construcción del plásmido de expresión pBIN35S-SS-NOS a partir de pBIN20 y p35S-SS-NOS
Figura 5: Etapas de construcción del plasmido de expresión pRBCS-SS-NOS a partir de pGEMT-RBCSprom, p35S-SS-NOS y pBIN20
Figura 6: Expresión de pET-SS en diferentes cepas de Escheπ chia coli . (A) Actividad SS (en miliunidades (mU) por miligramo de proteina bacteriana) en extractos bacterianos transformados con pET o con pET-SS. La reacción tuvo lugar en la dirección de degradación de sacarosa y producción de ADPG. El cocktail de reacción contenia 50 mM HEPES (pH 7.0), 1 mM EDTA, 20% polietilenglicol, 1 mM MgCl , 15 mM de KC1 y 2 mM de ADP. La reacción tuvo lugar durante 10 minutos a 37rC. (B) SDS-PAGE de extractos proteicos de las las diferentes cepas de E. coli transformadas con pET y con pET-SS. Con un arterisco se indica la posición de la SSX recombmante .
Figura 7: Determinación de la sacarosa en diferentes estadios de desarrollo de endospermos de cebada haciendo uso del kit basado en las reacciones acopladas de la SS, la ADPG (UDPG) pirofosfatasa, la PGM y la G6PDH. Los resultados fueron idénticos a los obtenidos paralelamente mediante (a) la utilización de un kit basado en las reacciones acopladas de SS y la UDPG deshidrogenasa y (b) la utilización de cromatografía de alta presión (HPLC) con detección amperométπca en un sistema DX-500 Dionex ajustado a una columna Carbo-Pac PA1. Eje de abcisas: Dias tras floración Eje de ordenadas: Contenido en sacarosa (μmol/gFW)
Figura 8: Actividad SS en hojas de plantas de patata silvestres (WT) y plantas de patata que sobreexpresan SSX tras integrar en su genoma las construcciones 35S-SS-NOS (por acción de la cepa de Agrobacteri um tumefaci ens CECT:5851) o RBCS-SS-NOS . La actividad está referida en miliunidades (mU) por gramo de peso fresco. La unidad se define como la cantidad de SS necesaria para producir un micromol de ADPG por minuto.
Figura 9: Contenido de almidón en hojas de plantas de patata silvestres (WT) y plantas de patata que sobreexpresan SSX tras integrar en su genoma las construcciones 35S-SS-NOS (por acción de la cepa de Agrobacteri um tumefaci ens CECT:5851) o RBCS-SS-NOS. Figura 10: Contenido de ADPG en hojas de plantas de patata silvestres (WT) y plantas de patata que sobreexpresan SSX tras integrar en su genoma las construcciones 35S-SS-NOS (por acción de la cepa de Agrobacteri um tumefaci ens CECT:5851) o RBCS-SS-NOS.
Figura 11: Acumulación transitoria de (A) almidón y (B) ADPG durante un fotoperiodo de 8 horas de luz y 16 horas de obscuridad en hojas de plantas WT (•) , 35S-SS-NOS ( M ) y RBCS-SS-NOS (A) .
Figura 12: Actividad SS (referida a peso fresco, FW) en tubérculos de plantas de patata silvestres (WT) , controles de regeneración (RG) y plantas de patata que sobreexpresan SSX (lineas 4,5,6 y 12) tras integrar en su genoma la construcción 35S-SS-NOS (por acción de la cepa de Agrobacteri um tumefaci ens CECT:5851). La actividad esta referida en miliunidades (mU) por gramo de peso fresco. La unidad se define como la cantidad de SS necesaria para producir un micromol de ADPG por minuto.
Figura 13: Contenido de almidón (referido a peso fresco, FW) en tubérculos de plantas de patata silvestres (WT) controles de regeneración (RG) y plantas de patata que sobre-expresan SSX (lineas 4,5,6 y 12) tras integrar en su genoma la construcción 35S-SS-NOS (por acción de la cepa de Agrobacteri um tumefaci ens CECT:5851).
Figura 14: Contenido de ADPG (referido a peso fresco, FW) en tubérculos de plantas de patata silvestres (WT) y plantas de patata que sobreexpresan SSX tras integrar en su genoma la construcción 35S-SS-NOS (por acción de la cepa de Agrobacteri um tumefaci ens CECT:5851). Figura 15: Contenido de (A) almidón y (B) ADPG en hojas de Arabidopsis thaliana TL25 deficitarias en AGPasa
Figura 16: Contenido de (A) almidón y (B) ADPG en hojas de patata AGP62 y AGP85 deficitarias en AGPasa

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento de obtención eficiente de altos niveles de la enzima sacarosa sintetasa (SS) recombinante en su forma soluble y activa caracterizado por: a) A partir de la secuencia nucleotidica del gen que codifica para la isoforma de SS de patata SS4 obtener 2 cebadores, representados por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, con los que a partir de una genoteca de ADNc de hoja de patata, se amplia por PCR un fragmento de ADNc de 2418 pares de bases repre-sentado por SEQ ID NO: 3 b) Introducir dicho fragmento de ADNc en un primer vector c) Introducir dicho primer vector en un primer microorganismo hospedador donde se amplifica d) Digerir la construcción amplificada con al menos 2 enzimas de restricción e) Obtener, tras la digestión anterior, un fragmento de ADN que contiene el ADNc que codifica para SSX, cuya secuencia aminoacidica deducida está represen-tada por SEQ ID NO: 4 f) Clonar dicho fragmento en los mismos sitios de restricción que un vector que contenga una secuencia nucleotidica codificante para una secuencia rica en Histidinas, fusionando dicha cola rica en Histidinas a SS, dando lugar a un 2 ° vector de expresión. g) Introducir este 2° vector en un 2° microorganismo hospedador donde se exprese h) Incubar dicho microorganismo transformado en condiciones de cultivo apropiadas para la síntesis de SSX en su forma soluble y activa i) Aislar y purificar SSX en su forma activa
2.- Procedimiento de obtención de SS recombinante según la reivindicación anterior caracterizado porque el primer vector de expresión utilizado en la etapa b) es el plásmido pSK, que al introducir en él SEQ ID NO: 3 da lugar a la construcción pSS de la figura 3A.
3.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según la reivindicación anterior caracterizado porque el primer microorganismo hospedador utilizado en la etapa c) para amplificar el plásmido pSK es la bacteria E. coli XL1 Blue.
4.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque las enzimas de restricción utilizadas en la etapa d) son Ncol y Notl .
5.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque, en la etapa f) , los sitios de restricción donde se clona el fragmento de ADN liberado tras la etapa d) son los mismos del plásmido pET-28a (+), representado en la figura 3B, dando lugar al plásmido pET-SS representado en la figura 3C.
6.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el 2° microorganismo hospedador utilizado en la etapa g) es la cepa BLR(DE3) de Escheri chia coli .
7.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la cepa transformada en la etapa g) que se incuba en la etapa h) en condiciones de cultivo apropiadas para la síntesis de SSX en su forma soluble y activa, es CECT5850.
8.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque las condiciones de cultivo apropiadas para la síntesis de SSX comprenden someter el cultivo bacteriano a una temperatura de 20°C.
9.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la purificación de SSX se hace preferentemente por cromatografía de afinidad para secuencias ammoacidicas ricas en residuos de histidma con un tampón de elusión que contiene ímidazol, preferentemente, a una concentración 200 mM.
10.- Procedimiento de obtención de SS recombmante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque para preservar el enzima SSX purificado en su forma activa se somete inmediatamente a dicho enzima purificado eluido de la cromatografía de afinidad a diálisis para eliminar cualquier traza de ímidazol.
11.- Procedimiento de obtención de una isoforma de patata SS5 recombmante caracterizado por: a) Utilizar la construcción pSS como molde y mediante mutagénesis dirigida tras utilizar secuencialmente las parejas de cebadores cuyas secuencias son [SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6], [SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8] y [SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10] obtener un fragmento de ADN de 2418 pares de bases representado por SEQ ID NO: 11 b) Introducir dicho fragmento de ADN en un primer vector c) Introducir dicho primer vector en un primer microorganismo hospedador donde se amplifica d) Digerir la construcción amplificada con al menos 2 enzimas de restricción e) Obtener tras la digestión anterior un fragmento de ADN que codifica para SS5 cuya secuencia aminoacidica está representada por SEQ ID NO: 12 f) Clonar dicho fragmento en los mismos sitios de restricción que un vector que contenga una secuencia nucleotidica codificante para una secuencia rica en His, fusionando dicha cola rica en His a SS5, dando lugar a un 2° vector de expresión. g) Introducir este 2° vector en un 2° microorganismo hospedador donde se exprese h) Incubar dicho microorganismo transformado en condiciones de cultivo apropiadas para la síntesis de SS5 en su forma soluble y activa i) Aislar y purificar SS5 en su forma activa
12.- Procedimiento de obtención de SS5 recombinante según la reivindicación 11 caracterizado porque la etapa b) da lugar a la construcción pSS5.
13.- Procedimiento de obtención de SS5 recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque el primer microorganismo hospedador utilizado en la etapa c) para amplificar pSS5 es la bacteria E . coli XL1 Blue.
14.- Procedimiento de obtención de SS5 recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque las enzimas de restricción utilizadas en la etapa d) son Ncol y Notl .
15.- Procedimiento de obtención de SS5 recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque, en la etapa f) , los sitios de restricción donde se clona el fragmento de ADN liberado tras la etapa d) son los mismos del plasmido pET-28a(+) dando lugar al plasmido pET- SS5.
16.- Procedimiento de obtención de SS5 recombmante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque el 2° microorganismo hospedador utilizado en la etapa g) es la cepa BLR(DE3) de Escheπ chia coli .
17.- Procedimiento de obtención de SS5 recombmante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque la cepa transformada en la etapa g) que se incuba en la etapa h) en condiciones de cultivo apropiadas para la síntesis de SS5 en su forma soluble y activa, es CECT5849.
18.- Procedimiento de obtención de SS5 recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque las condiciones de cultivo apropiadas para la síntesis de SS5 comprenden someter el cultivo bacteriano a una temperatura de 20°C.
19.- Procedimiento de obtención de SS5 recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, caracterizado porque la purificación de SS5 se hace preferentemente por cromatografía de afinidad con un tampon de elución que contiene ímidazol, preferentemente, a una concentración 200 mM.
20.- Procedimiento de obtención de SS5 recombmante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, caracterizado porque para preservar el enzima SS5 purificado en su forma activa se somete inmediatamente a dicho enzima purificado eluido de la cromatografía de afinidad a diálisis para eliminar cualquier traza de ímidazol.
21. Producto enzimático recombmante soluble y activo SSX, obtenible según el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizado por tener una secuencia deducida representada por SEQ ID NO: 4 y presentar actividad sacarosa smtetasa (SS) .
22. Producto enzimático recombmante soluble y activo SSX según la reivindicación 21, caracterizado por tener una actividad especifica de 80 U/mg proteina en presencia de sacarosa y UDP, y unos parámetros cinéticos de Km (UDP) = 0.25 mM y Km(sacarosa) = 30 mM.
23. Isoforma SS5 del producto enzimático recombmante soluble y activo de las reivindicaciones 21 y 22, obtenible según el procedimiento de las reivindicaciones 11 a 20 caracterizado por tener una secuencia de aminoácidos deducida representada en SEQ ID NO: 12 y presentar actividad sacarosa smtetasa (SS) .
24.- Isoforma SS5 recombinante según la reivindicación 23, caracterizada por tener una actividad especifica de 80 U/mg protema y 60 U/mg proteina en presencia de UDP y ADP, respectivamente, y unos parámetros cinéticos respecto a UDP y ADP de Km (UDP) = Km (ADP) = 0.3 mM.
25. Uso del producto enzimático de la reivindicaciones 21 y 22 en la producción de UDPG caracterizado por incubar en condiciones adecuadas UDP y SSX y posterior aislamiento y purificación del UDPG producido.
26.- Uso según la reivindicación 25 caracterizado porque comprende : a) Incubar durante 12 h a 37° C, 100 mi de la siguiente solución:
Sacarosa 1 M HEPES, pH 7. 0 50 mM EDTA 1 mM Polietilenglicol 20% MgCl2 lmM KC1 15 mM UDP 100 mM SSX 30 U b) Finalizar la reacción por calentamiento, preferentemente a 100°C durante 90 s c) Centrifugar a 10000 g durante 10 min d) Cromatografiar el sobrenadante por HPLC, eluir y purificar el UDPG por métodos convencionales.
27.- Uso del producto enzimático de las reivindicaciones 23 y 24 en la producción de ADPG caracterizado por incubar en condiciones adecuadas ADP y SS5 con posterior aislamiento y purificación del ADPG producido.
28.- Uso según la reivindicación 27 caracterizado porque comprende: e) Incubar durante 12 h a 37° C, 100 mi de la siguiente solución: Sacarosa 1 M HEPES, pH 7.0 50 mM EDTA 1 mM Polietilenglicol 20% MgCl2 lmM KC1 15 mM ADP 100 mM f) Finalizar la reacción por calentamiento, preferen- temente a 100°C durante 90 s g) Centrifugar a 10000 g durante 10 min h) Cromatografiar el sobrenadante por HPLC, eluir y purificar el ADPG por métodos convencionales.
29.- Uso de un producto enzimático con actividad sacarosa sintetasa (SS) en la elaboración de dispositivos de ensayo para la determinación espectrofotométrica/fluorimétrica/ amperométrica de sacarosa.
30.- Uso según la reivindicación 29 caracterizado porque comprende el siguiente medio de incubación: a. 2 unidades de SS b. 2 mM de ADP c. 2 unidades de ADPG pirofosfatasa de origen vegetal, animal o microbiano d. 2 unidades de PGM e. 2 unidades de G6PDH f. 0.5 mM de NAD(P) g. 100 mi de tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethilenglycol / 1 mM MgCl¿ / 15 mM KC1 h. muestra problema previamente filtrada.
31.- Uso según la reivindicación 29 caracterizado porque comprende el siguiente medio de incubación: a. 2 unidades de SS b. 2 mM de UDP c. 2 unidades de UDPG pirofosfatasa de origen vegetal, animal o microbiano d. 2 unidades de PGM e. 2 unidades de G6PDH f . 0 . 5 mM de NAD ( P ) g. 100 mi de tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethllenglycol / 1 mM MgCl2 / 15 mM KC1 h. muestra problema previamente filtrada.
32. -Uso según la reivindicación 29 caracterizado porque comprende el siguiente medio de incubación: a. 2 unidades de SS b. 2 mM de UDP c. 2 unidades de UDPG deshidrogenasa d. 0.5 mM de NAD e. 100 mi de tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0 / 1 mM EDTA/ 20% polyethllenglycol / 1 mM MgCl2 / 15 mM KC1 f. muestra problema previamente filtrada.
33.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 caracterizado porque la SS presente en el dispositivo de ensayo es indistintamente SS4, SS5 o SSX o una combinación de ambas .
34.- Uso de un ADN que codifica para SS, en la obtención de plantas transgénicas que expresen SS caracterizado por introducir una construcción génica que contenga y exprese dicho ADN en un vector adecuado y transferir dicha contrucción genica al genoma de una planta.
35.- Uso según la reivindicación 34, caracterizado porque el ADNc utilizado codifica para SSX.
36.- Uso según la reivindicación 35 caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) Introducción secuencial en el plásmido pSS del promotor 35S y del termmador NOS en las regiones 5' y 3', respectivamente, del gen SSX o cualquiera otra versión que codifique para SS para producir el plásmido p35S-SS-NOS cuyo mapa de restricción se representa en la figura 4B b) Digestión secuencial de p35S-SS-NOS con las enzimas Notl, T4 DNA polimerasa y HindIII c) Clonación del fragmento producido dentro del plásmido binario pBIN20, previamente digerido secuencialmente con EcoRI, T4 DNA polimerasa y HindIII, obteniéndose el plásmido pBIN35S-SS-NOS representado en la figura 4C d) Amplificación de pBIN35S-SS-NOS en E. coli (XL1 Blue) e) Introducción de la construcción génica amplificada en la etapa anterior en Agrobacteri um tumefaci ens C58:GV2260 obteniendo una cepa transformada CECT 5851 f) Transfección de plantas con la cepa transformada CECT 5851.
37.- Uso según la reivindicación 35 caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) Introducción secuencial en el plásmido pGEMT del promotor del gen que codifica para la subunidad pequeña de la RUBISCO para producir el plásmido pGEMT- RBCSprom cuyo mapa de restricción se representa en la figura 5A b) Digestión de pGEMP-RBCS con las enzimas HindIII y Ncol para introducir el fragmento liberado en los sitios de restricción correspondientes de p35S-SS-NOS, dando lugar a pRBCS-SS-NOS cuyo mapa de restricción se representa en la Fig. 5B . c) Digestión secuencial de pRBCS-SS-NOS con HindIII, T4 DNA polimerasa y Notl y clonaje del fragmento liberado en pBIN20 digerido secuencialmente con HindIII, T4 DNA polimerasa y EcoRI, dando lugar a pBINRBCS-SS-NOS cuyo mapa de restricción se representa en la Fig. 5C. d) Amplificación de pBINRBCS-SS-NOS en E . coli (XL1 ¡ Blue) e) Introducción de la construcción génica amplificada en la etapa anterior en Agroba cteri um t umefaci ens C58:GV2260 y transfección de plantas con la cepa transformada.
38.- Plantas transgénicas obtenibles por el procedimiento de uso de las reivindicaciones 33 a 37 caracterizadas por sobrexpresar una actividad enzimática SS.
39.- Plantas transgénicas según la reivindicación 37 caracterizadas porque dicha sobrexpresión supone unos niveles de actividad enzimática SS del orden de 2-10 veces superiores a los existentes en el mismo tejido de una planta silvestre no transgénica.
40.- Plantas transgénicas según las reivindicaciones 38 ó 39 caracterizadas por seleccionarse preferentemente entre plantas de tabaco, patata, tomate o arroz.
41.- Plantas trasgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40 caracterizadas por presentar además contenidos superiores de sacarosa, G6P, ADPG y almidón, a los observados en el mismo tejido u órgano de las correspondientes plantas silvestres, crecidas en0 idénticas condiciones.
42.- Plantas transgénicas según reivindicación 40 cuyas hojas presentan un contenido de sacarosa, G6P, ADPG y almidón, y un balance amilosa/amilopectina superiores a los5 observador en las hojas de las correspondientes plantas silvestres
43. Plantas transgénicas según reivindicación 40 cuyas raices, tubérculos y/o semillas presentan un contenido de sacarosa, G6P, ADPG y almidón, y un balance amilosa/amilopectma superiores a los observador en las mismos tejidos u órganos de las correspondientes plantas silvestres .
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