BRPI0507477B1 - Método de produção de plantas transgênicas que expressam a enzima sacarose sintase - Google Patents
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Abstract
método de produção de sintase de sacarose recombinante, uso do mesmo na fabricação de kits para a determinação de sacarose, produção de glicose de adp e produção de plantas transgências cujas folhas e órgãos de armazenagem acumulam altos teores de glicose de adp e amido. a presente invenção refere-se a um médoto de produção de sintase de sacarose recombinante, ou seu uso na fabricação de kits para a determinação de sacarose, produção de adpglicose e produção de plantas transgênicas cujas folhas e órgãos de armazenagem acumulam altos tores de adpglicose e amido. um método é descrito para a prodção eficiente de grandes quantidades de ss recombinante solúvel em forma ativa, por expressão do gene gene que codifica ss em uma cepa de escherichia coli. o vetor de expressão usado significa que o ss recombinante produzido possui uma extremidade de histídina que facilita sua rápida purificação. além disso, ele descreve seqüencias de versões mutadas do gene de ss que codifica isoformas de ss adequadas para a produção de adpg. fazendo uso das versões de "tipo selvagem" e "mutadas" de ss recombinante, um método eficiente é descrito para a produção de adpg e udpg. ele também descreve o uso de ss para a produção de kits de ensaio para a determinação de sacarose. finalmente, ele descreve a produção a produção de plantas transgênicas que ultra-expressam o gene gene de ss, ou constitutivamente ou em folhas ou órgãos de armazenagem, e que têm um alto teor (tanto em folhas quanto em tecidos de armazenagem) de sacarose, adpg, g6p e amido como um resultado da atividade de sintetização de adpg de ss.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS QUE EXPRESSAM A ENZIMA SACAROSE SINTASE". Área da indústria à qual a invenção se refere [001] A invenção refere-se à otimização da produção de sa-carose sintase recombinante (SS) em forma ativa, solúvel que emprega uma cepa apropriada de Escherichia coli, ao uso de SS para a produção de kits para a determinação de sacarose, a projeto de formas otimizadas de SS para a síntese de glicose de ADP (ADPG), e à produção de plantas transgênicas cujas folhas e tecidos de armazenagem acumulam altos níveis de ADPG e amido enriquecido com amilose como um resultado de superprodução de ADPG citosólica em plantas que expressam SS. Técnica Anterior [002] Amido é a forma de armazenagem principal de carboidra-tos em plantas. Ele se acumula em grandes quantidades em órgãos tais como sementes (trigo, cevada, milho, ervilha, etc.) e tubérculos (batata e inhame entre outros) e é um constituinte fundamental da dieta humana. Além do mais é amplamente usado nas indústrias de papel, cosméticas, farmacêuticas e alimentícias, e é também usado como um componente essencial para a fabricação de plásticos biodegradáveis e tintas favoráveis ao meio ambiente. Uma vez que ele é formado de moléculas de glicose covalentemente ligadas, investigação dos processos envolvidos na síntese deste polissacarídeo é uma prioridade de topo em várias áreas da produção industrial.
[003] ADPG é o precursor universal da biossíntese de amido em plantas, tanto em órgãos heterotróficos (figura 1A) quanto em folhas (figura 2A), e é amplamente admitido que sua produção é controlada exclusivamente pela enzima ADPG pirofosforilase ou ADPG sintase (EC 2.7.7.27) (Okita, T.W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560- 56; Müller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADPglucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry, G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase. Science 258, 287-282; Neu-haus, E.H., Hausler, R.E., Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. at press). As várias aplicações do amido produzido em uma planta são baseadas principalmente na razão de amilose e amilopectina, que determina a estrutura do grão de amido, bem como sua viscosidade em suspensões aquosas. Esta razão de amilose e amilopectina dependente entre outras coisas, da concentração de ADPG na célula de planta (Clarke, B.R., Denyer, K., Jenner, C.F., Smith, A.M. (1999) The relationship between the rate of starch synthe-sis, the adenosine 5'-diphosphoglucose concentration and the amylose content of starch in developing pea embryos. Planta 209, 324-329).
[004] SS (EC 2.4.1.13, SS) (UDP-glicose:D-fructose-2-glicosila transferase) é uma enzima reversível que catalisa a produção de UDPG e frutose oriunda de sacarose e UDP. Embora, como mostrado na figura 1A, SS tenha classicamente sido considerada como um papel da produção de UDPG, processamento metabólico da qual finalmente se origina à produção de amido em tecidos heterotróficos tais como endoesperma e tubérculos (Zrenner, R., Salanoubat, M., Willmit-zer, L., Sonnewald, U. (1995) Evidence for the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants. Plant J. 7, 97-107; Baroja-Fernández, E., Mufioz, F.J., Saikusa, T., Rodríguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509; Pozueta-Romero, J., Munõz, F.J., Rodríguez-López, M., Ba-roja-Fernández, E., Akazawa, T. (agosto de 2003) New waves in the starch field. Lett. Plant Cell Physiol. 24-32), há referências à capacidade potencial da enzima de usar outros difosfatos de nucleotídeo in vitro para a produção de nucleotídeos de açúcar correspondentes (Murata, T., Sugiyama, T., Minamikawa, T., Akazawa, T. (1966) Enzymic mechanism of starch synthesis in ripening rice grains. Mechanism of the sucrose-starch conversion. Arch. Biochem. Biophys. 113, 34-44; Delmer, D.P. (1972) The purification and properties of sucrose synthase from etiolated Phaseolus aureus seedlings. J. Biol. Chem. 247, 3822-3828),. Embora relevância fisiológica questionável (Okita, T.W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Müller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADPglucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 12291238),. ele sugeriu que S8 é capaz de produzir ADPG diretamente, que pode ser usado para a produção de amido tanto em tecidos hete-rotróficos quanto em tecidos fotossintéticos (Figs. 1B e 2B) (Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) Sucrose- starch conversion in heterotrophic tissues of plants. Crit. Rev. Plant Sci. 18, 489-525; Ba-roja-Fernández, Munõz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) Reappraisal of the currently prevailing model of starch biosynthesis in photosynthetic tissues: a proposal involving the cytosolic production of ADPglucose by sucrose synthase and occurrence of cyclic turnover of starch in the chloroplast. Plant Cell Physiol. 42, 1311-1320; Baroja-Fernández, E., Munõz, F.J., Saikusa, T., Rodríguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in hetero- trophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509; Baroja-Fernández, E., Munõz, F.J., Zandueta-Criado, A., Morán-Zorzano, M.T., Viale, A.M., Alonso-Casajús, N., Pozueta-Romero, J. (2004) Most of ADPglucose linked to starch biosynthesis occurs outside the chloroplast in source leaves. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 13080-13085). De acordo com esta hipótese (baseado unicamente e circunstancialmente da evidência do tipo bioquímico), SS é responsável pela síntese de uma combinação importante de moléculas de ADPG necessárias para a biossíntese de amido. Esta hipótese não foi, no entanto, demonstrada experimentalmente por técnicas de aperfeiçoamento de colheita tradicional ou de engenharia genética, e não é consistente com os testes incontáveis do tipo molecular e genético indicando que AG-Pase é a única fonte de ADPG em plantas (Okita, T.W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 56056; Müller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADPglucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Neuhaus, E.H., Hausler, R.E., Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. at press).
[005] Nucleotídeos de açúcar tais como UDPG e ADPG são produzidos comercialmente a partir de reações de pirofosforilase catalisadas por enzimas tais como UDPG pirofosforilase (UGPase) e AGPase, respectivamente, baseado no uso de uma substância onerosa chamada glicose-1-fosfato (G1P). Um substituto para esta prática para a produção de nucleotídeos de açúcar é baseado no uso de SS, desenvolvimento de que foi largamente estorvado pelas limitações de Escherichia coli para a expressão e eficazmente processamento de um grande número de proteínas eucarióticas. Esta limitação inspirou alguns pesquisadores a produzir SS recombinante por fazer uso de fatores biológicos do tipo eucariótico tais como leveduras (Zervosen, A., Ro-mer, U., Elling, L. (1998) Application of recombinant sucrose synthase-large scale synthesis of ADP-glucose. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 5, 25-28; Romer, U., Schrader, H., Günther, N., Nettelstroth, N., From-mer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. for carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107, 135-149). Alternativamente, SS destinada à produção de nucleotídeos de açúcar tinha tido de ser purificada por processos onerosos de purificação de proteína a partir de extratos de planta (patente DE4221595 (1993), Purified sucrose synthase enzyme useful for production of nucleotide-activated sugars or oligosaccharides). Esta SS obtida a partir de extratos de plantas tem a desvantagem de que ela tem uma predileção para UDP e muito baixa afinidade para ADP (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764; Nguyen-Quock, B., Krivitz-ky, M., Huber, S.C., Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523; Morell, M., Copeland, L. (1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78, 149154). Production of recombinant SS from cultures of E. coli has recently bien achieved foi recentemente alcançada (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Eschericia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Nakai, T., Konishi, T., Zhang, Z-Q., Chollet, R., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Yoshinaga, F., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "An increase in apparent affinity for sucrose of mung bean sucrose synthase is caused by in vitro phosphorylation or directed mutagenesis of Serll" Plant Cell Physiol. 39, 1337-1341; Barratt, D.H.P., Barber, L., Kruger, N.J., Smith, A.M., Wang, T.L., Martin, C. (2001) Multiple, distinct isoforms of sucrose synthase in pea. Plant Physiol. 127, 655-664; Christopher, B., William, B., Robert, H. "Bacterial sucrose synthase compositions and methods of use" Patente WO9803637). No entanto, a produção de SS neste sistema procariótico estava associada a problemas tais como (1) a quantidade de SS produzida era muito baixa (30 microgramas/grama de bactérias, Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escherichia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B., Hew, C.S. (2003) "Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium goldiana. Physiol. Plantarum 118, 352-360), (2) a quantidade de SS ativa obtida era muito baixa ou zero (0,05-1,5 unidades/mg (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T, Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escherichia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B., Hew, C.S. (2003) "Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium goldiana. Physiol. Plantarum 118, 352-360); 5,6 U/mg (Romer, O., Schrader, H., Günther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. for carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107, 135- 149), (3) a SS recombinante tinha de ser purificada por métodos convencionais de purificação de proteínas tais como cromatografia, eletroforese, focalização isoelétrica, etc., que, combinados provaram ser onerosos e não garantem purificação da proteína em um estado homogêneo e (4) a maior parte da SS é enviada para corpos de inclusão ou é acumulada na forma de agregados inativos como um resultado da incapacidade da maquinária de bactéria para dobrar a proteína corretamente (Miroux, B., Walker, J. E. (1996) "Over-production proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis at high levels" J. Mol. Biol. 260, 289298).
[006] A presente invenção descreve o desenvolvimento de um sistema baseado no uso de uma cepa apropriada de E. coli e no uso de um vetor de expressão adequado que permite produção em grande escala e purificação rápida e fácil de diferentes variantes de SS re-combinante em sua forma ativa. Algumas destas variantes têm afinidade maior para ADP do que algumas obtidas a partir de extratos de planta e podem ser usadas tanto para aprodução de UDPG quanto ADPG a partir de substâncias onerosas tais como sacarose, UDP e ADP.
[007] Técnicas cromatográficas constituem uma ferramenta poderosa para a determinação do teor de sacarose de amostras complexas tais como extratos de planta, soros, urina, suco de fruta, vinhos, fruta e gêneros alimentícios (D'Aoust, M-A., Yelle, S, Nguyen-Quock, B. (1999) Antisense inhibition of tomato fruit sucrose synthase decreases fruit setting and the i sucrose unloading capacity of young fruit. Plant Cell 11, 2407-2418; Tang, G-Q., Sturm, A. (1999) Antisense repression of sucrose synthase in carrot affects growth rather than sucrose partitioning. Plant Mol. Biol. 41, : 465-479; Frias, J., Price, K.R., Fenwich, G.R., Hedley, I C.L., Sorensen, H., Vidal-Valverde, C. (1996) J. Chro-matogr. A 719, 213-219). Tais técnicas exigem pessoal técnica altamente especializada e envolvem um grande investimento em equipamento. Infelizmente, métodos alternativos com base em hidrólise da molécula de sacarose pela ação da enzima invertase e determinação espectrofotométrica ou fluorimétrica subsequente das moléculas de glicose e/ou frutose (Sweetlove, L.J., Burrell, M.M., ap Rees, T. (1996) Starch metabolism in tubers of transgenic potato with increased AD- Pglucose pyrophosphorylase. Biochem. 320, 493-498; Stitt, M., Lilley, R.M., Gerhardt, R., Heldt, H.W. (1989) Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods Enzymol. 174, 518-552; Holmes, E.W. (1997) Coupled enzymatic assay for the determination of sucrose. Anal. Biochem. 244, 103-109; Methods of Analysis (1996) Code of Practice for Evaluation of Fruit and Vegetable Juices. Associação da Indústria de Sucos e Nectares de Frutas e Vegetais da Comunidade Econômica Européia) são submetidas a limitações de uma natureza técnica tal como subtração das medidas cor-respodnentes à frutose e/ou glicose endógena presente na amostra. A abundância de glicose e/ou frutose na amostra pode adicionar ruído de fundo que estorva a determinação exata e confiável de sacarose. Na vasta maioria de casos é necessário realizar controles exaustivos antes de sair uma afirmação confiável no teor de sacarose verdadeiro de uma amostra (Worrell, A:. C. , Bruneau, J -M. , Summerfelt, K., Bo-ersig, M., Voelker, T.A. (1991) Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato altera leaf carbohydrate partitioning. Plant Cell 3, 1121-1130). Kits para a determinação de sacarose com base no uso de invertase estão disponíveis das companhias tais como Sigma, Biopharm GmbH e Megazyme. Alternativamente, um método automatizado de determinação de sacarose foi desenvolvido, com base na determinação do glicose-1-fosfato liberado pela ação de sacarose fosforilase de origem bacteriana (Vinet, B., Panzini, B., Boucher, M., Massicotte, J. (1998) Automated enzymatic assay for the determination of sucrose in serum and urine and its use as a marker of gastric damage. Clin. Chem. 44, 2369-2371). A presente invenção descreve o desenvolvimento de um método alternativo simples, confiável e econômico para a determinação de sacarose em uma amostra com base no uso de SS e enzimas de aclopamento que hidrolisam ADPG ou UDPG.
[008] Considerações que se referem a fatores que governam os níveis intracelulares de ADPG têm principalmente giraldo em volta da regulação da enzima de sintetização, AGPase (Preiss, (1988) Biosynthesis of starch and its regulation. The Biochemistry of Planta. Vol. 14, Academic Presa, New York, p. 182-249; Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) Sucrose-starch conversion in heterotrophic tissues. Crit. Rev. Plant. Sci. 18, 489-525). De fato, uma alta proporção das patentes e publicações científicas que se referem à produção de ADPG e à produção de planta que produz amidos de interesse industrial giram em torno do uso de AGPase (Stark, D.M., Tim-merman, K.P., Barry, G.F., Freias, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase. Science 258, 287-282; Slattery, C.J., Kavakli, H., Okita, T.W. (2000) Engineering starch for increased quantity and quality. Trends Plant Sci. 5, 291-298). No entanto, embora eles devam ainda ser confirmados com evidência de tipo genético/molecular, estudos científicos recentes de um tipo bioquímica indicam que, como mostrado nas figura 1B e 2B, SS poderia estar envolvida na síntese direta de ADPG necessária para a biossíntese de amido (Baroja-Fernández, E., Munõz, F.J., Saikusa, T., Rodríguez- López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509). Esta hipótese é especialmente controvérsia, portando em mente que (a) SS nunca estava ligada à produção de amido em folhas, (b) presença de um translocador de ADPG é necessário nas membranas de plastídios, ligação da combinação citosólica do ADPG produzido por SS para a síntese de amido presente dentro do plastídio e (c) o envolvimento de SS como uma fonte de produção de ADPG está em conflito direto com muitos testes do tipo bioquímico/genético/ molecular que parecem mostrar que AG- Pase é a única fonte de ADPG (Okita, T.W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Müller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADPglucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Stark, D.M., Timmer-man, K.P., Barry, G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase. Science 258, 287-282; Neuhaus, E.H., Hausler, R.E., Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. at press). Talvez por todas estas razões, para datar plantas que nunca foram projetadas su-perexpressar SS para a produção de altos níveis de amido. No entanto, a presente invenção descreve, pela primeira vez, a produção de plantas transgências que superexpressam SS para aumentar sua produção de ADPG e amido. De modo inverso, foi mostrado que plantas são deficientes em amido como um resultado de ausência de AGPase que possuem níveis de ADPG normais. Isto tudo mostra que, como mostrado nas figura 1B e 2B, SS está envolvida na síntese direta do ADPG exigido para a biossíntese de amido e é responsável pela síntese da maioria do ADPG acumulado na célula de planta.
[009] Embora com base na abordagem apresentada na figura 1A, de acordo com o qual SS está envolvida na síntese de UDPG (mas não ADPG) em tecidos de armazenagem, vários trabalhos foram descritos para a produção de plantas com teor reduzido de amido como uma consequência de atividade diminuída de SS (Chourey, P.S., Nelson, O.E. (1976) The enzymatic deficiency conditioned by the shrunken-1 mutations in maize. Biochem. Genet. 14, 1041-1055; Zrenner, R., Salanoubat, M., Willmitzer, L., Sonnewald, U. (1995) Evidence for the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants. Plant J. 7, 97-107; Tang, G-Q., Sturm, A. (1999) Antisense repression of sucrose synthase in carrot (Daucus carota L.) affects growth rather than sucrose partitioning. Plant Mol. Biol. 41, 465479). Neste sentido, não há evidência experimental de que superex-pressão de SS poderia ser usada para a produção de plantas com alto teor de amido como um resultado do aumento de níveis de ADPG de acordo com os esquemas metabólicos mostrados nas figura 1B e 2B. No entanto, com base na capacidade de SS para produzir a molécula precursora da biossíntese de polissacarídeos de parede celular (UDPG), trabalhos foram publicados e foram patenteados que descrevem a produção de plantas de algodão com alto teor de fibra ou cereais com alto teor de celulose como um resultado de superexpressão de SS (Timothy, H.J., Xiamomu, N., Kanwarpal, S. "Manipulation of sucrose synthase genes to improve stalk and grain quality" a Patente WO 02067662; Robert, F., Danny, L., Yong-Ling, R. "Modification of sucrose synthase gene expression in plant tissue and uses therefor" a Patente WO 0245485; Christopher, B., William, B., Robert, H. "Bacteri-al sucrose synthase compositions and methods of use" a Patente WO 9803637).
[0010] A invenção refere-se primeiramente ao desenvolvimento e otimização de um método de produção de grande quantidades de SS recombinante que seja solúvel, possa ser purificado facilmente e tenha alta atividade específica, com base no uso de uma cepa adequada de E. coli e no uso de um vetor de expressão que torna possível se obter SS com uma extremidade de histidina. A invenção ulteriormente refere-se ao procedimento seguido por produção de kits para a determinação de sacarose com base no uso do produto de enzima com atividade de SS acoplada a enzimas que metabolizam ADPG ou UDPG. Ele ulteriormente refere-se à otimização da produção de nucleotídeos de açúcar tal como partindo das variantes de SS especialmente projeta das para esta finalidade. Finalmente, detalhes são dados do projeto de plantas transgênicas com alto teor de sacarose, ADPG e amido e uma alta razão de amilose/amilopectina após superexpressão de SS. Descrição Detalhada da Invenção Ampliação de um cDNA que codifica uma SS
[0011] Conhecimento da sequência de nucleotídeos de sacarose sintase de tipo selvagem SS4 (Fu, H., Park, W. D. (1995) Sink- and vascular-associated sucrose synthase functions are encoded by different gene classes in potato. Plant Cell 7, 1369-1385), dois iniciadores específicos foram criados que correspondem às extremidades 5' e 3' do gene. Usando-se estes iniciadores, um fragmento de DNA de 2418 pares de base, designado SSX, oriundo de uma biblioteca de cDNA de folha de batata, foi ampliado por técnicas de PCR convencionais. Este fragmento de PCR foi inserido no plasmídeo Bluescript de pSK (Stra-tagene), originando a construção de pSS (figura 3A), que foi ampliado no XL1 Blue da bactéria do hospedeiro.
Produção de SS recombinante ativa a partir de uma cepa de E. coli especial [0012] pSS foi digerida com as enzimas de restrição de NcOI e de NotI. O fragmento liberado (que contém o cDNA que codifica SS, SSX) foi clonado nos mesmos sítios de restrição do plasmídeo de expressão de pET-28a(+) (Novagen) (figura 3B) que possui uma sequência de nucleotídeos na região de poligador que codifica uma sequência rica em histidina, que se torna fundida com a proteína recombinante. O plasmídeo resultante (designado pET-SS, figura 3C) foi inserido por eletroporação em várias cepas de E. coli. A cepa E. coli BLR(DE3) (Novagen) transformada com pET-SS foi depositada na Spanish Type Culture Collection em 29 de outubro de 2003, localizada na Research Building of Valencia University, Brujassot Campus, Burjassot 46100 (Valencia, Espanha) com o número de depósito CECT:5850. Superex- pressão de SSX foi efetuada a 20oC em meio de LB. Superexpressão de SSX foi efetuada por adição de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo a 1 mM (IPTG) em 100 ml de cultura de célula foram desenvolvidos a 20oC. Depois de 6 horas de cultura induzida, as bactérias foram coletadas e foram ressuspenas em 4 ml de tampão de ligação (Novagen, kits de purificação de ligação de His), então foram sonicados e foram centrifugados a 40.000 g por 20 minutos. O sobrenadante, que contém a SS recombinante com uma sequência de ami-noácidos rica em resíduos de histidina na extremidade N-terminal, foi passado através de uma coluna de afinidade do kit de purificação de proteína de ligação de His da Novagen. Após as instruções com o kit, SS foi eluída com 6 ml do tampão de eluição recombinante, que continha 200 mM de imidazol ao invés de 1 mol. Depois da eluição, a proteína foi rapidamente submetida à diálise para remover qualque traço de imidazol, que inativa SS irreversivelmente.
[0013] Produção de uma isoforma de SS otimizada para a produção de ADPG
[0014] Usando-se iniciadores adequados, com pSS como modelo, a variante mutada SS5 foi projetada, originando a construção pSS5. Isto foi feito usando-se o kit de mutagênese de sítio-dirigida Quikchan-ge (Stratagene). pSS5 foi digerida com NcoI e NotI. O fragmento liberado (que contém SS5) foi clonado nos mesmos sítios de restrição do plasmídeo de expressão de pET-28a(+) se originando pET-SS5, que foi inserida por eletroporação em E. coli BRL (DE3). A cepa de E. coli Blue XL1 transformada com pSS5 foi depositada na Spanish Type Culture Collection em 29 de outubro de 2003, localizada na Research Building of Valencia University, Brujassot Campus, Burjassot 46100 (Va-lencia, Espanha) com o número de depósito CECT: 5849.
Produção de plantas transgências que superexpressam SS4 [0015] Na presente invenção SS foi superexpressada (a) constitu- tivamente, (b) especificamente em folhas e (C) especificamente em órgãos de armazenagem tais como tubérculos.
[0016] Para a produção de plantas que superexpressam SS cons-titutivamente, construções foram criadas que foram controladas pela ação do promotor constitutivo de 35S do vírus de mosaico de tabaco. Inserções sucessivas em pSS do promotor de 35S e no terminador de NOS nas regiões 5' e 3' de SSX originou a produção do plasmídeo p35S-SS-NOS, cujo mapa de restrição é mostrado na figura 4B.
[0017] A fim de ser capaz de transferir esta construção para o ge-noma das plantas através de Agrobacterium tumefaciens, ela precisa primeiramente ser clonada em um plasmídeo binário. Para isso, p35S-SS-NOS foi digerido sucessivamente com as enzimas NotI, T4 DNA polimerase e HindIII e foi clonado dentro do plasmídeo binário pBIN20 (figura 4A) (Hennegan, K.P., Danna, K.J. (1998) pBIN20: An improved binary vector for Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 16, 129-131) que tinha sido anteriormente digerido sucessivamente com as enzimas EcoRI, T4 DNA polimerase e HindIII. O plasmídeo assim obtido foi digerido pBIN35S-SS-NOS (figura 4C).
[0018] Para ultera-expressar SS especificamente em folhas iluminadas, PCR foi usado para ampliar a região de promotor (designada RBCS) do gene que codifica a pequena subunidade de RUBISCO (ri-bulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase) de tobaco (Barnes, S.A., Knight, J.S., Gray, J.C. (1994) Alteration of the amount of the chloroplast phosphate translocator in transgenic tobacco affects the distribution of assimilate between starch and sugar. Plant Physiol. 106, 11231129). Esta sequência de nucleotídeos (que confere expressão específica em células fotossinteticamente ativas) foi inserida no vetor pGEMT-fácil, originando pGEMT-RBCSprom (figura 5A). Esta construção foi digerida com HindIII e NcoI e o fragmento liberado foi clonado nos sítios de restrição correspondentes de p35S-SS-NOS, originando pRBCS-SS-NOS (figura 5B). Esta construção foi digerida sucessivamente com HindIII, DNA polimerase e NotI. O fragmento liberado foi clonado em pBIN20 foi digerido sucessivamente com HindIII, T4 DNA polimerase e EcoRI. A construção resultante foi designada pBIN-RBCS-SS-NOS (figura 5C).
[0019] Depois de ser ampliado em E. coli (XL1 Blue), tanto pBIN35S-SS-NOS quanto pBINRBCS-SS-NOS foram inseridos em A. tumefaciens C58:GV2260 (Debleare, R., Rytebier, B., de Greve, H., Debroeck, F., Schell, J., van Montagu, M., Leemans, J. (1985) "Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors of Agrobacterium mediated gene transfer to plants" Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788), que foi usado para a transformação das espécies tais como tomate (Lycopersicon sculentum), tobacco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum) e arroz por técnicas convencionais (Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Ro-gers, S.G., Fraley, R.T. (1985) "A simple and general method for transferring genes into plants" Science 277, 1229-1231; Pozueta-Romero, J., Houlné, G., Schantz, R., Chamarro, J. (2001) "Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explants for Agrobacterium-mediated trans-formation" Plant Cell Tiss. Org. Cult.. 67, 173-180; Hiei, Y., Ohta, S., Ko-mari, T., Kumashiro. T. (1994) "Efficient transformation of rice (Oryza sa-tiva L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271-282). A cepa de A. tumefaciens C58:GV2260 transformada com pBIN35S-SS-NOS foi depositada na Spanish Type Culture Collection em 29 de outubro de 2003, localizada no Research Building da Valencia University, Burjassot Campus, Burjassot 46100 (Valencia, Espanha), com o número de depósito CECT:5851. Preparação de kits de ensaio para a determinação de sacarose [0020] Um dos kits projetados para a determinação de sacarose, mostrado no seguinte esquema I de reações enzimáticas envolvidas no kit para determinação espectrofotométrica/fluorimétrica de sacarose com base na conversão de sacarose em um nucleotídeo de açúcar e então conversão deste em glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e NAD(P)H.
[0021] O kit é baseado na ação de SS na molécula de sacarose na presença de difosfato de nucleotídeo (por exemplo, UDP ou ADP), liberando quantidades molares de frutose e o nucleotídeo de açúcar correspondente. Se o nucleotídeo de açúcar que resulta da reação for UDPG, ele é submetido à ação de enzimas hidrolíticas de UDPG tal como pirofosfato de UDPG do tipo Nudix (EC 3.6.1.45) (Yagi, T., Baro-ja-Fernández, E., Yamamoto, R., Munõz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Cloning, expression and characterization of a mammalian Nudix hydrolase-like enzyme that cleaves the pyrophos- phate bond of UDP-glucose. Biochem. J. 370, 409-415) or UDPG hydrolase (Burns, D.M., Beacham, I.R. (1986) Nucleotide sequence and transcriptional analysis of the E. coli ushA gene, encoding periplasmic UDP- sugar hydrolase (5'-nucleotidase): regulation of the ushA gene, and the signal sequence of its encoded protein product. Nucl. Acids Res. 14, 4325-4342). O G1P liberado pela ação destas enzimas hidro-líticas é transformado pela ação de fosfoglicomutase (PGM), fornecendo glicose-6-fosfato (G6P), que por sua vez pode ser produzido para sofrer uma reação de acoplagem com NAD(P)+ pela ação da enzima G6P desidrogenase (G6PDH), produzindo 6-fosfogliconato e NAD(P)H, que pode facilmente ser determinado por fluorimetria e por espectrofotometria a 340 nn. Por sua vez, o NAD(P)H liberado por ser acoplado à ação de FMN- oxidorreductase/luciferase, fornecendo luz, que é quantificado espectrofotometricamente.
[0022] Alternativamente, como mostrado no esquema II, o UDPG produzido pode ser acoplado com UDPG desidrogenase (EC 1.1.1.22) que, na presença de NAD, origina quantidades equimolares de UDP-glicuronato e NADH, que podem ser determinadas por fluorimetria ou por espectrofotometria a 340 nm. Por sua vez, o NADH liberado pode se acoplado à ação de FMN-oxidorreductase/luciferase, fornecendo luz, que é quantificado espectrofotometricamente.
[0023] Se o produto da reação catalisada pela SS for ADPG, este é submetido à ação de enzimas hidrolíticas de ADPG tal como pirofos-fato de ADPG (EC 3.6.1.21) (Moreno-Bruna, B., Baroja-Fernández, E., Munõz, F.J., Bastarrica-Berasategui, A., Zandueta- Criado, A., Rodrí-guez-López, M., Lasa, I., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) Adenosine diphosphate sugar pyrophosphatase prevents glycogen biosynthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 81288132). O G1P liberado é transformado pela ação de fosfoglicomutase, fornecendo glicose-6-fosfato (G6P), que pode por sua vez ser produzido para sofrer uma reação de acoplagem com NAD(P)+ pela ação da enzima G6P desidrogenase, produzindo 6-fosfogliconato e NAD(P)H, que pode facilmente ser determinado por fluorimetria ou espectrofoto-metria a 340 nm.
[0024] Em qualquer caso, os esquemas de reações enzimáticas acoplados à produção de um nucleotídeo de açúcar mediado por SS são perfeitamente adequados para a aplicação à detecção amperomé-trica.
Exemplos de realização da invenção [0025] Exemplos são descritos abaixo, que mostram em detalhes o procedimento para a clonagem de um cDNA que codifica uma isoforma de SS de batata em um vetor de expressão adequado e em uma cepa de E. coli otimizada para a produção e acúmulo da enzima em sua forma ativa. Outros exemplos descrevem o uso do SS recombi-nante para a produção de kits de ensaio para a determinação de saca-rose em amostras de planta, soro, urina, sucos de fruta, bebidas de fruta adoçadas, etc., bebidas refrescantes, etc. Um outro exemplo descreve o uso de variantes de SS otimizadas para a produção em grande escala de nucleotídeos de açúcar tais como UDPG e ADPG. Finalmente, um outro exemplo descreve a produção de plantas com alto teor de sacarose, ADPG e amido e uma alta razão de amilo- se/amilopectina como um resultado da alta atividade de produção de ADPG em plantas que superexpressam SS.
[0026] Exemplo 1: Expressão, em BLR de Escherichia coli (DE3), de uma SS recombinante com uma extremidade de histidina, que pode ser purificada facilmente e tem alta atividade específica [0027] Conhecimento da sequência de nucleotídeos do gene de SS4 que codifica uma isoforma de SS de batata, foi possível criar dois iniciadores específicos cujas sequências são, na direção 5’-3’, SEQ. ID N°: 1 e SEQ. ID N°: 2. Usando-se estes iniciadores, um fragmento de DNA, designado como SSX, foi ampliado por métodos convencionais de PCR, a partir de uma biblioteca de cDNA de tubérculo de batata, e isto foi inserido em um plasmídeo de Bluescript de pSK (Stratagene), que foi ampliado no XL1 Blue de bactéria de hospedeiro. A sequência de nucleotídeos de SSX é SEQ. ID N°: 3, que é levemente diferente de SS4 (número de acesso de GenBank U24087). A sequência de ami-noácidos diminuída de SEQ. ID N°: 3 é levemente diferente da SS4 e é, portanto, designada SSX. A sequência de aminoácidos diminuída depois da expressão de SEQ. ID N°: 3 no plasmídeo de pET-28a(+) é SEQ ID NO: 4, que inclui sequência enriquecida de histidina de 38 aminoácidos fundidos com a extremidade amino-terminal da sequência de aminoácidos diminuída de SEQ. ID N°: 3.
[0028] Produção de SSX em bactérias de BL21(DE3) transformadas com pET-SS foi induzida na adição de IPTG a 1 mM. Depois de seis horas adicionais de cultura a 37oC, foi observado que as bactérias transformadas com pET-SS acumulou uma proteína em forma agregada, cujo tamanho corresponde a SS. No entanto, estas bactérias não têm atividade de SS. Esta falha na expressão de uma forma ativa de SS pode ser atribuída aos problemas que E. coli tem na dobragem correta de certas proteínas eucarióticas de alto peso molecular (Miroux, B., Walker, J.E. (1996) "Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels" J. Mol. Biol. 260, 289-298). Com o objetivo de superar este problema, a capacidade de produção de SS ativa em outras cepas bacterinas e a uma temperatura de 20°C foi investigada. Na totalidade delas, a produção de SSX foi induzida na adição de 1 mM de IPTG. Depois de 6 horas de incubação adicional, as bactérias foram sonicadas e foram centrifugadas. O sobrenadante resultante foi analisado quanto à atividade de SS. Nestas condições, como mostrado na figura 6, a cepa de BLR(DE3) provou ser a mais eficiente a partir do ponto de vista de produção de SS ativa, solúvel. A cepa de E. coli BLR(DE3) (Novagen) transformada com pET-SS foi depositada na Spanish Type Culture Collection em 29 de Outubro de 2003, com o número de depósito CECT:5850. A contribuição de SSX recombinante na combinação de proteínas totais de CECT:5850 é cerca de 20%, em comparação com a baixa produtividade de SS recombinante (30 mi-crogramas por grama de bactérias) descrito na literatura (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Ex-pression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escherichia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B., Hew, C.S. (2003) "Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium goldiana. Physiol. Plantarum 118, 352-360). O sobre-nadante foi passado através da coluna de afinidade de ligação de His (Novagen), em que a proteína recombinante que processa uma extremidade de histidina é retida especificamente. Depois eluindo e diali-sando a SS purificada, ela foi incubada com HEPES a 50 mM, pH 7,0/ EDTA a 1 mM/20% de polietileno glicol/MgCl2 a 1 mM/KCl a 15 mM/UDP a 2 mM. A atividade específica, determinada em termos de produção de UDPG, era de 80 unidades/mg de proteína, muito mais do que a atividade de 0,05-5 unidades/mg de SS recombinante des crito na literatura (Nakai, T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sa-kai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in Escherichia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B., Hew, C.S. (2003) "Cloning, characterization and expression ana1ysis of a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium goldiana. Physiol. Plantarum 118, 352-360); Romer, U., Schrader, H., Günther, N., Net-telstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. for carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107, 135149) e maiores do que 3 unidades/mg que correspondem à SS purificada de extratos de plantas (Pressey R (1969) Potato sucrose syn-thase: purification, properties, and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764. A unidade é definida como a quantidade de enzima que catalisa a produção de um micromol de UDPG por minuto. A afinidade para UDP na presença de sacarose a 500 mM era Km(UDP) = 0,25 mM, enquanto que o Km para sacarose era de 30 mM na presença de UDP a 1 mM. Esta afinidade para saca-rose na presença de UDP é significativamente mais alta do que aquela exibida pela SS recombinante obtida em leveduras (Km = 95 mM, Romer, U., Schrader, H., Günther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. for carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107, 135-149).
[0029] Exemplo 2: Produção em grande escala de UDPG e ADPG baseado no uso de SS recombinante oriunda de E. coli [0030] Três gramas de UDPG de alta pureza foram produzidos eficazmente e economicamente depois da incubação por 12 horas a 37oC de 100 mililitros de uma solução contendo sacarose a 1 M, HEPES a 50 mM, pH 7,0/EDTA a 1 mM/20% de polietileno glicol/MgCl2 a 1 mM/KCl a 15 mM/UDP a 100 mM e 30 unidades de SS recombinante a partir de batata obtidos depois da expressão de pET-SS em BLR(DE3) e purificação subsequente. Reação entra em uma extremidade depois do aquecimento da solução a 100oC por 90 segundos e então centrifugação a 10.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi aplicado a um cromatógrafo de HPLC de escala preparativa como descrito na literatura (Rodríguez-López, M., Baroja-Fernández, E., Znadueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8705-8710).
[0031] A produção de ADPG exigiu a geração de uma forma mutada de SS com uma afinidade para ADP muito maior do que descrito para a SS extraída de tecidos de plantas (Pressey R (1969) Potato sucrose syn-thase: purification, properties and changes in activity assiciated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764; Nguyen-Quock, B., Krivitzky, M., Hu-ber, S. C., Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523; Morell, M., Copeland, L. (1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78, 149-154).
[0032] Esta isoforma, designada SS5, foi obtida por mutagênese de ponto de SSX usando-se o kit de mutagênese de sítio-dirigido Qu-ikChange (Stratagene) e uso sucessivo dos seguintes pares de inicia-dores cujas sequências são [SEQ. ID N°: 5, SEQ. ID N°: 6], [SEQ. ID N°: 7, SEQ. ID N°: 8] e [SEQ. ID N°: 9, SEQ. ID N°: 10]. A sequência de nucleotídeos obtida, designada SS5, é a SEQ. ID N°: 11. As mudanças na sequência de aminoácidos de SS5 (Susy 5) em relação a SS4-Susy 4- (presente nas bases de dados) são mostradas sombreadas na tabela I. A sequência de aminoácidos diminuída depois da expressão de SEQ. ID N°: 11 no plasmídeo de pET-28a(+) é SEQ. ID N°: 12, que inclui uma sequência rica em histidina de 38 aminoácidos fundida com a extremidade amino-terminal da sequência de aminoácidos diminuída de SEQ. ID N°: 11.
[0033] Tabela I inclui a dita sequência rica em histidina de 38 ami-noácidos fundida à porção de amino-terminal de SS5.
Tabela I
[0034] A SS5 recombinante obtida depois da expressão de pET-SS5 tinha um Vmax de 80 unidades/mg da proteína e 65 unidades/mg da proteína na presença de UDP e ADP, respectivamente. As afinidades para UDP e ADP na presença de sacarose a 500 mM eram muito similares (Km = 0,2 mM tanto para ADP quanto para UDP), enquanto que o Km para sacarose era 30 mM e 100 mM na presença de concentrações saturadas de UDP e ADP, respectivamente.
[0035] Estes parâmetros cinéticos são muito diferentes daqueles descritos para a SS extraída de tubérculo de batata e outros órgãos de outras espécies de acordo com as quais a Vmax da enzima é 10 vezes mais alta na presença de UDP do que na presença de ADP (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties and changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44, 759-764; Mo-rell, M., Copeland, L. (1985) Sucrose sinthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78, 149-154; Nguyen-Quock, B., Krivitzky, M., Huber, S. C., Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523). A cepa de E. coli XL1 Blue transformada com pSS5 foi depositada na Spanish Type Culture Collection, com o número de depósito CECT:5849.
[0036] Três gramas de ADPG de alta pureza foram produzidos eficazmente e economicamente depois da incubação por 12 horas a 37oC de 100 mililitros de uma solução contendo sacarose a 1 M, HEPES a 50 mM, pH 7,0/EDTA a 1 mM/20% de polietileno glicol/MgCl2 a 1 mM/KCl a 15 mM/ADP a 100 mM e 30 unidades de SS recombi-nante da batata obtidos depois da expressão de pET-SS5 em BLR(DE3) e purificação subsequente em uma coluna de ligação de His. A reação entra em uma extremidade depois do aquecimento da solução a 100oC por 90 segundos e então centrifugação a 10.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi aplicado a um cromátografo de HPLC de escala preparativa (Waters Associates) para a purificação do ADPG.
[0037] Exemplo 3: Preparação de kits enzimáticos para determinação de sacarose [0038] Para a determinação de sacarose, os seguintes coquetéis de reação foram preparados com os seguintes componentes e quanti-dades/concentrações finais: 1. Kit com base no uso de enzimas hidrolíticas de nucleotí-deos de açúcar: a. 2 unidades de SS (recombinante ou não) b. 2 mM de ADP ou UDP (dependendo de se ADPG ou UDPG está sendo produzido, respectivamente) c. 2 unidades de ADPG pirofosfatase ou 2 unidades de UDPG pirofosfatase (dependendo de dever ela ser incluída no coquetel de reação de ADP ou de UDP, res-pecitamente) d. 2 uniddes de PGM
e. 2 unidades de G6PDH f. 0,5 mM de NAD(P) g. tampão de reação: HEBES a 50 mM, pH 7,0/EDTA a 1 mM/20% de polietileno glicol/MgCl2 a 1 mM/KCl a 15 mM h. amostra de teste anteriormente filtrada 2. Kit com base no uso de UDPG desidrogenase a. 2 unidades de SS (recombinante ou não) b. 2 mM de UDP c. 2 unidades de UDPG desidrogenase d. 0,5 mM de NAD
e. tampão de reação: HEPES a 50 mM, pH 7,0/EDTA a 1 mM/20% de polietileno glicol/MgCl2 a 1 mM/KCl a 15 mM f. amostra de teste anteriormente filtrada [0039] A determinação da quantidade de sacarose presente na amostra de teste é baseada na determinação fluorimétrica ou na determinação espectrofotométrica (a 340 nm) da NAD(P)H produzida de acordo com as reações acopladas mostradas nos esquemas I e II.
[0040] Para a determinação do teor de sacarose de sementes de cevada com graus diferentes de desenvolvimento (figura 7), as reações aconteceram em cavidades de 300 microlitros de uma placa ELISA por 3 minutos a 37oC. O volume da amostra de teste era de 20 mi-crolitros, e o volume do coquetel resultante da combinação de reagen-tes a-g (kit #1) e a-e (kit # 2) era de 280 microlitos. Os brancos continham todos os componentes de coquetel exceto SS. Medição foi realizada com um espectrofotômetro Multiskan. Os valores obtidos, tanto com o kit de tipo "1"quanto o kit de tipo "2" foram encontrados serem comparáveis com aqueles determinados usando-se técnicas de cro-matografia descritas na introdução (Baroja-Fernández, E., Munoz F. J., Saikusa, T., Rodríguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPgli-cose linked to starch biosynthesis in hetertrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509).
[0041] Exemplo 4: Produção de plantas transgênicas que supe-rexpressam SS
[0042] As figura 8-10 apresentam os resultados obtidos em folhas de plantas de batata que superexpressam SS tanto (35S-SS-NOS) constitutivamente, quanto (RBCS-SS-NOS) especificamente.
[0043] Como mostrado na figura 8, a atividade de SS nas folhas de qualquer uma das plantas é de 2-10 vezes mais altas do que no mesmo órgão de uma planta de tipo de selvagem (WT). Estas folhas tinham as seguintes características: 1. Correlação clara entre a atividade de SS de produção de ADPG (figura 8) e folhas de amido (figura 9) e ADPG (figura 10). Esta característica foi observada não apenas em folhas, mas também em tecidos de armazenagem tais como tubérculos e sementes (ver abaixo). 2. Alto teor de amido (figura 9) em relação a folhas de plantas de tipo selvagem. Por exemplo, o teor de amido de uma folha de uma planta de batata de "tipo selvagem" desenvolvida em um fotoperí-odo de 8 horas de luz/16 horas de escuridão e a 20oC é 5 micromo-les/grama de peso fresco, enquanto que uma folha de uma planta transgênica que superexpressa SS é 8 micromoles/grama de peso fresco. As diferenças entre plantas de tipo selvagem e transgênicas são acentuadas quando o fotoperíodo é longo, de modo que as folhas de uma planta que superexpressem SS contenhe 4 vezes mais amido do que aquelas de uma planta de tipo selvagem. 3. Alto teor de ADPG em relação ao mesmo tecido ou órgão da planta não transformada (figura 10). O teor médio em um fotoperío-do de 8 horas de luz/16 horas de escuridão e a 20oC é 0,35 na-mol/grama de peso fresco, enquanto que as folhas das plantas que superexpressam SS podem ter um teor de 2,5 nanomoles/grama de peso fresco. 4. Tanto ADPG quanto amido exibem acúmulo transitório durante o fotoperíodo (figura 11). A taxa de acúmulo de ambas as substâncias mantém uma correlação positiva que a atividade de SS, indicando que, ao contrário de que é sugerido pelo modelo "clássico" de biossíntese de amido (figura 2A) e confirmando a hipótese do modelo "alternativo" mostrado na figura 2B, SS desempenham um papel fundamental na produção de ADPG e na ligação entre metabolismo de sacarose e metabolismo de amido. 5. Níveis normais de açúcares solúveis tais como glicose e frutose. No entanto, os níveis de glicose-6-P e sacarose em folhas transgênicas são mais altos do que aqueles observados nas folhas de batata de tipo selvagem (tabela 2).
Tabela 2: Níveis de metabolitos (expressas em nmol/g de peso fresco) em folhas de plantas de controle (WT) e folhas de fonte de 35S-SuSy-NOS. Valores significativamente diferentes daqueles observados em WT são mostrados em negrito. 6. A morfologia externo das plantas que superexpressam SS não é aberrante, quando comparada com aquela das plantas não transformadas.
Figs. 12-14 mostram os resultados obtidos em tubérculos de batata que superexpressam SS constitutivamente (35S-SS-NOS). Estes resultados são essencialmente idênticos àqueles observados nos tubérculos que superexpressam SS sob o controle de um promotor de tubérculo específico (promotor do gene de patatina).
[0044] Como mostrado na figura 12, a atividade de SS nos tubérculos de qualquer uma das plantas é ? vezes maior do que no mesmo órgão de uma planta de tipo selvagem. Estes tubérculos tinham as seguintes características: 1. Correlação clara entre a atividade de SS de produção de ADPG (figura 12) e as folhas de amido (figura 13) e ADPG (figura 14). 2. Alto teor de amido (figura 13) em relação a tubérculos de plantas não transformadas. Por exemplo, o teor de amido no tubérclo da planta de "tipo selvagem" é cerca de 300 micromoles/grama de peso fresco (equivalente a 54 mg de amido/grama de peso fresco), enquanto que em um tubérculo que superexpressa SS é de 450-600 mi-cromoles/grama de peso fresco. 3. Alto teor de ADPG em relação a tubérculos de plantas de tipo selvagem (figura 14). O teor médio é um tubérculo de tipo selvagem é de 5 nanomoles/grama de peso fresco, enquanto que os tubérculos que superexpressam SS podem ter um teor de 7-9 nanomo-les/grama peso de fresco.
[0045] Os resultados obtidos em sementes de arroz, tomate e folhas de tobaco, bem como frutas de tomate, são qualitativamente similares àqueles mostrados nas figura 8-14. Em todos os caso houve um aumento no teor de amido e um aumento na razão de amilo-se/amilopectina.
[0046] A produção de plantas com alto teor de ADPG e amido após superexpressam de SS é um resultado que é totalmente inesperado de acordo com idéias correntes na biossíntese de amido (ilustrado nas figura 1A e 2A) e talvez explique porque o projeto de plantas que superexpressam SS não foi anteriormente adotado como uma estratégia para o aumento da produção de amido. Os resultados obtidos com base neste trabalho sugerem que SS, mas nao AGPase, é a fonte fundamental de ADPG que acumula nas plantas. De acordo com os modelos que são ainda corrente, AGPase é a única fonte de ADPG. Surpreendentemente, no entanto, níveis de ADPG nunca foram investigados em plantas deficientes de AGPase. Para explorar a significân-cia de nossa invenção, nós analisaremos os níveis de ADPG e amido em Arabidopsis e plantas de batata com atividade de AGPase reduzi da pela primeira vez. Como mostrado na figura 15A, os níveis de amido em plantas de Arabidopsis de TL25 deficientes de AGPase (Lin, T. P., Caspar, T., Somerville, C. R. Preiss, J. (1988) Isolation and characterization of a starchless mutant of Arabidopsis thaliana lacking AD-Pglucose pyrophosphorilase activity. Plant Physiol. 88, 1131-1135) são mais baixos do que aqueles observados nas plantas de WT. Em contraste com isso, os níveis de amido em plantas de batata de AGP62 e AGP85 (Müller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADPglucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238) são reduzidos em relação àqueles observados em folhas de plantas de tipo selvagem (figura 16A). No entanto, as folhas de plantas de tipo selvagem (figura 16A). No entanto, as folhas de ADPG são totalmente normais (figura 16B). Tomados juntos, estas observações (a) mostram que SS, e não AGPase, é a principal fonte de ADPG em plantas e (b) alta compreensão da significância da nossa invenção depois da demonstração que superexpressão de SS origina plantas com alto teor de amido.
Descrição dos diagramas [0047] Figura 1: Mecanismos de biossíntese de amido em órgãos heterotróficos. (A) Mecanismos "clássicos" de acordo com os quais SS está envolvida na produção de UDPG, que é finalmente convertido em amido depois da ação combinada de UDPG pirofosforilase (UGPase), fosfoglicomutase citosólica (PGM), fosfoglicomutase plastidial, ADPG pirofosforilase (AGPase) e amido sintase. (B) Mecanismo "alternativo" de acordo com o qual SS está envolvida na produção direta de ADPG no citosol. O ADPG é então transportado para o amiloplasto pela ação de um deslocador. Uma vez que dentro do amiloplasto, a amido sin-tase utiliza o ADPG para a produção de amido.
[0048] Figura 2: Mecanismos de biossíntese de amido em folhas. (A) Mecanismos "clássicos" de acordo com o qual o processo total de biossíntese de amido ocorre dentro do cloroplasto. De acordo com esta finalidade, o metabolismo de amido e sacarose não estão ligados. Além do mais, SS não toma parte no processo glicogênico. (B) Mecanismo "alternativo" de biossínte de amido de acordo com o qual SS etá envolvida na síntese direta de ADPG no citosol. O ADPG é então transportado para o interior do plasmídeo onde a amido sintase o utiliza como substrato para a reação de síntese de amido.
[0049] Figura 3: Estágios em construção da plasmídeo de expressão de pET-AA oriundo de pET-28a(+) e pSS.
[0050] Figura 4: Estágios de contrução de plasmídeo de expressão de pBIN35S-SS-NOS oriundo de pBIN20 e P35-SS-NOS.
[0051] Figura 5: Estágios de contrução de plasmídeo de expressão de pRBCS-SS-NOS oriundo de pGEMT-RBCSprom, p35S-SS-NOS e pBIN20.
[0052] Figura 6: Expressão de pET-SS em diferentes cepas de Escherichia coli. (A) atividade de SS (em miliunidades (mU) por miligrama de proteína bacteriana) em extratos bacterianos transformados com pET ou com pET-SS. A reação ocorreu na direção de degradação de sacarose e produção de ADPG. O coquetel de reação continha HEPES a 50 mM (pH 7,0), EDTA a 1 mM, 20% de polietileno glicol, MgCl2 a 1 mM, 15 mM de KCl e 2 mM de ADP. A reação ocorreu por 10 minutos a 37oC. (B) SDS-PAGE de extratos de proteína oriundos das várias cepas de E. coli transformadas com pET e com pET-SS. A posição da SSX recombinante é indicada com um asterisco.
[0053] Figura 7: Determinação da sacarose em diferentes estágios de desenvolvimento de endoesperma de cevada usando-se o kit baseado nas reações acopladas de SS, pirofosfato de ADPG (UDPG), PGM e G6PDH. Os resultados eram idênticos àqueles obtidos em paralelo pelo uso de um kit baseado nas reações acopladas de SS desi-drogenase e UDPG e (b) uso de cromatografia de alto desempenho (HPLC) com detecção amperométrica em um sistema Dionex DX-500 ligado a uma coluna de Carbo-Pac PA1.
Abcissa: dias depois da floração Ordenada: teor de sacarose (qmol/gFW) [0054] Figura 8: Atividade de SS em folhas de plantas de batata de tipo selvagem (WT) e plantas de batata que superexpressam SSX após a integração das construções 35S-SS-NOS (pela ação da cepa de Agrobacterium tumefaciens CECT:5851) ou RBCS-SS-NOS em seu genoma. Atividade é expressa em miliunidades (mU) por grama de peso fresco. A unidade é definida como a quantidade de SS exigida para a produção de um micromol de ADPG por minuto.
[0055] Figura 9: Teor de amido em folhas de plantas de batata de tipo selvagem (WT) e plantas de batata que superexpressam SSX após a integração das construções 35S-SS-NOS (pela ação da cepa de Agrobacterium tumefaciens CECT:5851) ou RBCS-SS-NOS em seu genoma.
[0056] Figura 10: Teor de ADPG em folhas de de plantas de batata de tipo selvagem (WT) e plantas de batata que superexpressam SSX após a integração das construções 35S-SS-NOS (pela ação da cepa de Agrobacterium tumefaciens CECT:5851) ou RBCS-SS-NOS em seu genoma.
[0057] Figura 11: Acúmulo transitório de (A) amido e (B) ADPG durante um fotoperíodo de 8 horas de luz e 16 horas de escuridão em folhas de plantas de WT (·), 35S-SS-NOS (■) e RBCS-SS-NOS (▲).
[0058] Figura 12: Atividade de SS (mencionada de peso fresco, FW) em tubérculos de plantas de batata de tipo selvagem (WT), controles de regeneração (RG) e plantas de batata que superexpressam SSX (linhas 4, 5, 6 e 12) depois da integração da construção 35S-SS-NOS em seu genoma (pela ação da cepa Agrobacterium tumefaciens CECT:5851). A atividade é expressa em miliunidades (mU) por grama de peso fresco. A unidade é definida como a quantidade de SS exigida para a produção de um micromol de ADPG por minuto.
[0059] Figura 13: Teor de amido (mencionado de peso fresco, FW) em tubérclos de plantas de batata de tipo selvagem (WT), controles de regeneração (RG) e plantas de batata que superexpressam SSX (linhas 4, 5, 6 e 12) depois da integração da construção 35S-SS-NOS em seu genoma (pela ação da cepa de Agrobacterium tumefaciens CECT:5851).
[0060] Figura 14: Teor de ADPG (mencionado de peso fresco, FW) em tubérclos de plantas de batata de tipo selvagem (WT) e plantas de batata que superexpressam SSX depois da integração da construção 35S-SS-NOS em seu genoma (pela ação da cepa de Agrobacterium tumefaciens CECT:5851).
[0061] Figura 15: Teor de (A) amido e (B) ADPG em folhas de Aradiposis thalina TL25 deficientes de AGPase.
[0062] Figura 16: de (A) amido e (B) ADPG em folhas de batata AGP62 e AGP85 deficientes de AGPase.
REIVINDICAÇÕES
Claims (5)
1. Método de produção de plantas transgênicas que expressam a enzima sacarose sintase, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de inserção de uma construção genética contendo sequência de DNA de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:11, em vetor apropriado, transferência da construção genética para o genoma da planta, em que as plantas transgênicas produzidas possuem um teor de amido pelo menos 3% maior.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima sacarose sintase é expressa constitutivamente na planta, o qual compreende as etapas a seguir: a) introdução de sequência de DNA de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:11, em plasmídeo sob promotor constitutivo 35S do vírus de mosaico de tabaco e terminador NOS na terminação 3' da sequência; b) digestão do plasmídeo da etapa a) com enzimas de restrição Not I, T4 DNA polimerase e HindIII; c) inserção do fragmento obtido na etapa b) dentro do plasmídeo pBIN20; d) transformação do plasmídeo obtido na etapa c) na cepa XL1 Blue de bactéria E. coli para a sua amplificação; e) inserção da construção genética amplificada na etapa d) na planta, através do vetor Agrobacterium tumefaciens.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima sacarose sintase é expressa especificamente em folhas, frutos ou órgãos de armazenagem da planta, o qual compreende as etapas a seguir: a) amplificação por PCR de fragmento contendo região de promotor do gene que codifica pequena subunidade de ribulose-1,5- bifosfato carboxilase/oxigenase de tabaco; b) inserção do fragmento obtido na etapa a) no vetor pGEMT-fácil; c) digestão do vetor obtido na etapa b) com HindIII e NcoI; d) inserção do fragmento obtido na etapa c) em plasmídeo compreendendo sequência de DNA de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:11, e terminador NOS na terminação 3' da sequência, digerido com HindIII e Ncol; e) digestão do plasmídeo obtido na etapa d) com enzimas de restrição HindIII, T4 DNA polimerase e NotI; f) clonagem do fragmento obtido na etapa e) dentro do plasmídeo pBIN20; g) transformação do plasmídeo obtido na etapa f) na cepa XL1 Blue de bactéria E. coli para a sua amplificação; h) inserção da construção genética amplificada na etapa g) na planta, através do vetor Agrobacterium tumefaciens.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o órgão de armazenagem é selecionado a partir do grupo compreendendo tubérculos e sementes.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as plantas transformadas são selecionadas a partir do grupo compreendendo tomate (Lycopersicon sculentum), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum) e arroz.
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