ES2354895B1 - Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y alto balance amilosa/amilopectina. - Google Patents
Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y alto balance amilosa/amilopectina. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y alto balance amilosa/amilopectina. Las alfa-1,4·glucan fosforilasas (GPs) catalizan el corte reversible de uniones alfa-1,4 de los extremos no-reductores de homopolisacáridos con al menos 5 moléculas de glucosa tales como almidón, maltodextrinas y glucógeno, dando lugar a la producción de glucosa-1-fosfato. Las GPs en bacterias y células animales son responsables de la degradación del glucógeno. Aunque el incremento de la actividad GP conlleva a una reducción de los niveles intracelulares de glucógeno en bacterias y células animales en esta invención se describe la obtención de plantas que poseen altos niveles y rendimientos de almidón, así como un elevado balance amilosa/amilopectina, como consecuencia de la expresión de genes que codifican para GPs.
Description
Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y alto balance amilosa/amilopectina.
Campo de la invención
La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética y de la fisiología vegetal. Concretamente la invención comprende un procedimiento para la producción de plantas transgénicas con altos niveles de almidón y alto ratio amilosa/amilopectina, los vectores utilizados para transformar las células, las propias células transformadas, las plantas transgénicas obtenidas por dicho procedimiento y sus respectivos usos.
Estado de la técnica anterior
Tanto el almidón de las plantas como el glucógeno de bacterias y animales son homopolímeros ramificados de moléculas de glucosa unidas por enlaces covalentes de tipo α-1,4 y α-1,6. Estos polímeros constituyen formas importantes de almacenamiento de carbohidratos y energía. En las plantas el almidón se sintetiza en el plastidio, se acumula en grandes cantidades en órganos tales como semillas (trigo, cebada, maíz, guisante, etc.) y tubérculos (patata y batata entre otros) y es un constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado, el almidón es utilizado frecuentemente en la industria papelera, cosmética, farmacéutica y alimentaria, y también como materia prima fundamental para la fabricación de plásticos biodegradables, pinturas de bajo impacto medioambiental y bioetanol. Numerosas aplicaciones del almidón están basadas principalmente en el balance de amilosa y amilopectina, el cual determina la estructura del gránulo de almidón, así como su viscosidad en suspensiones acuosas.
El ADPG es la molécula precursora universal de la biosíntesis del almidón y del glucógeno en plantas y bacterias, respectivamente. Está ampliamente asumido que la producción de este azúcar-nucleótido está exclusivamente controlada por el enzima ADPG pirofosforilasa (AGPasa) (EC 2.7.7.27) (1-4). Sin embargo, existen evidencias que muestran que la sacarosa sintasa (EC 2.4.1.13) (UDP-glucosa:D-fructosa-2-glucosil transferasa) está implicada en la síntesis de ADPG necesario para la biosíntesis del almidón (5-9). En lo que a mecanismos de degradación del ADPG se refiere, existen enzimas que hidrolizan ADPG tanto en plantas (10-13), como en bacterias (14, 15).
En plantas, la degradación del almidón está controlada por reacciones hidrolíticas catalizadas por α-amilasas, β-amilasas y α-glucosidasas (16, 17). Por el contrario, en animales, bacterias y levaduras son las alfa-l,4-glucan fosforilasas (GP) (EC 2.4.1.1) las que controlan la degradación de la molécula de glucógeno in vivo (18-22). Las GPs catalizan el corte reversible de uniones α-1,4 de los extremos no reductores de poliglucanos tales como almidón, maltodextrinas y glucógeno, dando lugar a la producción de glucosa-1-fosfato (G1P). Las secuencias nucleotídicas de origen animal, vegetal o bacteriano, que codifican para enzimas con actividad GPs, son secuencias conservadas.
Las plantas poseen GPs intra-y extra-plastidiales. A diferencia de lo que ocurre en bacterias, levaduras y animales, hasta el momento se desconoce la función de las GPs vegetales, especialmente las intraplastidiales. Teniendo en cuenta el carácter reversible de las GPs, es posible que su función en el metabolismo del almidón dependa del balance Pi/GlP (21). Siendo así, el alto balance Pi/GlP existente en la célula vegetal indicaría fuertemente que la GP plastidial no está implicada en la síntesis de almidón, reforzando la teoría de que la síntesis del almidón tiene lugar única y exclusivamente mediante procesos dependientes de la producción de ADPG.
Existen evidencias que sugieren la posible implicación de GPs plastidiales en la degradación del almidón en hojas de Phaseoulus vulgaris y Arabidopsis thaliana (23). Por otro lado, se ha sugerido que las GPs plastidiales poseen funciones relacionadas con el estrés abiótico, la floración y el crecimiento de semillas (24-27). La discusión sobre la función biológica de las GPs plastidiales en plantas se complica aún más al tener en cuenta que mutantes STA4 del alga Chlamydomonas reinhardtii deficitarios en GP plastidial poseen niveles reducidos de almidón, lo cual sugiere que la GP plastidial no está implicada en la degradación del almidón en C. reinhardtii (28). Por otro lado, existen trabajos que muestran que las GPs plastidiales no están implicadas en la degradación del almidón en plantas vasculares tales como patata y trigo (29, 30). Añadiendo más confusión al debate sobre la posible implicación de las GP plastidiales en la degradación del almidón, algunos trabajos han mostrado una correlación positiva entre la actividad de la GP plastidial, la actividad de enzimas implicados en la síntesis del almidón y el acúmulo de almidón (25, 31-33).
Existen trabajos en los que se describe la producción y caracterización de plantas con actividad GP reducida (24). Tales plantas acumulan niveles normales de almidón. Por otro lado, existe un trabajo en el que se describe que la sobre-expresión del gen glgP de E. coli que codifica para GP da lugar a bacterias con reducidos o nulos niveles de glucógeno (22). Finalmente, existen trabajos en los que se describe que la sobre-expresión de genes que codifican para GP de mamíferos da lugar a células de humanos con niveles reducidos de glucógeno (18). El estado de la técnica no ofrece una clara relación entre la enzima GP vegetal y su función concreta. Es más, hasta el momento no se conocen publicaciones referidas a la producción y/o caracterización de especies de plantas superiores con alta actividad GP.
La presente invención se focaliza precisamente en este último aspecto al describir plantas transgénicas vasculares con alta actividad GP (tanto a nivel citosólico como plastidial) caracterizadas por expresar genes codificantes de proteínas/enzimas con actividad GP consiguiendo una elevada actividad GP (tanto a nivel citosólico como plastidial) y consecuentemente un elevado nivel y rendimiento en almidón así como un alto balance amilosa/amilopectina. Otro aspecto importante a tener en cuenta es que la presente invención evidencia que la expresión de los genes que codifican para enzimas GP, y por lo tanto el aumento de actividad GP, tiene como resultado un incremento del contenido en almidón.
Así, la presente invención rompe el prejuicio establecido en el estado de la técnica para la actividad de las GP de animales, bacterias y levaduras, donde se define que la actividad GP tiende al corte de las uniones α-1,4 de los polímeros de glucosa dando lugar a G1P. También pone en evidencia que la GP bacteriana promueve la síntesis de almidón en plantas transgénicas que expresan el gen que codifica para dicha enzima.
Así, el objeto de la invención es la producción de plantas con alto contenido y rendimiento de almidón y un alto balance amilosa/amilopectina como consecuencia del incremento de la actividad GP (tanto en el citosol como en el plastidio) al expresar genes que codifican para proteínas con actividad GP.
Descripción de la invención
Breve descripción de la invención
Tal y como se ha comentado anteriormente, el objeto de la invención es la producción de plantas transgénicas con alto contenido y rendimiento de almidón y un alto balance amilosa/amilopectina como consecuencia del incremento de la actividad GP (tanto en el citosol como en el plastidio) al expresar genes que codifican para proteínas con alta actividad GP. A efectos de la presente invención, se hacen constar los siguientes términos:
Célula: es la unidad mínima (morfológica y funcional) de todo ser vivo, capaz de actuar de manera autónoma. De particular interés a la presente invención resultan las células bacterianas y vegetales.
Citoplasma: solución líquida que compone el medio intracelular.
Plastidio: orgánulo propio de células vegetales. Es el encargado de realizar la fotosíntesis en los organismos eucariontes fotosintetizadores.
Vector genético: “vehículo” utilizado para transferir material genético exógeno al interior de una célula. Cualquiera de los vectores conocidos en el estado de la técnica puede utilizarse en la presente invención. Sin embargo en la presente invención fue utilizado preferentemente Agrobacterium tumefaciens.
Secuencias homologas: son secuencias nucleotídicas de ADN casi idénticas, entre las que se puede producir apareamiento de bases bajo estrictas condiciones.
Expresión ectópica: se entiende por expresión ectópica de un gen cuando su producto se expresa en un lugar en el que normalmente no lo hace.
Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes a las de la planta silvestre (como es el caso de la presente invención).
Alta actividad de la enzima GP: se entiende por alta actividad de la enzima GP cuando dicha actividad es al menos 5 veces superior a la existente en plantas silvestres.
Alto contenido en almidón: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente significativo, superior a los valores observados en las plantas control. En la Figura 7 se observa que el contenido medio en almidón en los tubérculos de las plantas silvestres analizadas (CR1 y CR2) es de aproximadamente 290 μmoles de glucosa/g (peso fresco), con un margen de variación del 10%. Por lo tanto podría considerarse como “alto contenido en amidón” aquel que supere, al menos en un 20%, dicho valor de 290 μmoles de glucosa/g (peso fresco). En la presente invención se supera dicho valor consiguiendo tubérculos transgénicos que acumulan cantidades de almidón de 400 μmoles de glucosa/g (peso fresco) como mínimo.
Alto balance amilosa/amilopectina: tal y como se observa en la figura 9 el balance amilosa/amilopectina, expresado en porcentaje de amilosa, en los tubérculos de las plantas silvestres (CR) analizadas es aproximadamente 22,5% con un margen de error de un 2,5% (lo cual constituye un 10% del valor medio observado en CR). Se considera que existe un alto balance en amilosa/amilopectina cuando el valor del porcentaje en amilosa de la planta transgénica analizada es al menos un 10% mayor que el valor del porcentaje en amilosa de la planta silvestre correspondiente (en este caso concreto, tubérculos con un balance amilosa/amilopectina superior a un 25% se consideran como ricos en amilosa).
Descripción de las figuras
Figura 1: Etapas de construcción del plásmido de expresión pET15b-glgP.
Figura 2: Etapas de construcción del plásmido de expresión pBIN20-B33-C1P-GP-NOS.
Figura 3: Etapas de construcción del plásmido de expresión pBIN2035S-GP-NOS.
Figura 4: SDS-PAGE. Tinción de la GP recombinante purificada a partir de extractos de células de E. coli BL21 (DE3)C43 transformadas con pET15b-glgP (CECT 7071).
Figura 5: Western blot de tubérculos de plantas patata no transformada (línea 1) y tubérculos de diferentes clones de plantas de patata transformadas con CECT 7054 (línea 2) y con CECT 7055 (líneas 3 y 4). En cada carril se cargaron 50 μg de proteína y fueron sometidas a SDS-PAGE. La GP de E. coli se immunodecoró haciendo uso del anticuerpo policlonal específico de GP de E. coli. Obsérvese que tan solo las líneas que expresan glgP de E. coli desarrollan una banda de aproximadamente 93 kDa.
Figura 6: Actividad GP en tubérculos de plantas de patata silvestres y plantas de patata que expresan glgP de E. coli tras integrar en su genoma las construcciones 35S-glgP-NOS y B33-ChlTP-glgP-NOS haciendo uso de las cepas de A. tumefaciens CECT 7054 y CECT 7055, respectivamente. La actividad (en miliU/g peso fresco) se refiere a la cantidad de G1P producida a partir de glucógeno por peso fresco de un extracto crudo de tubérculo. Las dos plantas silvestres analizadas se designan como CR1 y CR2. Las plantas transgénicas reciben la designación de B33-7, B3311, B33-12, B33-13 y B33-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7055) y 35S-1, 35S-6, 35S-11 y 35S-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7054). Los valores representados se corresponden a la media y desviación típica de tubérculos de 10 plantas diferentes por línea.
Figura 7: Contenido en almidón en tubérculos de plantas de patata silvestres y plantas de patata que expresan glgP de E. coli tras integrar en su genoma las construcciones 35S-glgP-NOS y B33-ChlTP-glgP-NOS haciendo uso de las cepas de A. tumefaciens CECT 7054 y CECT 7055, respectivamente. Las dos plantas silvestres analizadas se designan como CR1 y CR2. Las plantas transgénicas reciben la designación de B33-7, B33-11, B33-12, B33-13 y B33-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7055) y 35S-1, 35S-6, 35S-11 y 35S-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7054). Los valores representados se corresponden a la media y desviación típica de tubérculos de 10 plantas diferentes por línea.
Figura 8: Contenido en sacarosa (A), glucosa (B) y fructosa (C) en tubérculos de plantas de patata silvestres y plantas de patata que expresan glgP de E. coli tras integrar en su genoma las construcciones 35S-glgP-NOS y B33-ChlTP-glgP-NOS haciendo uso de las cepas de A. tumefaciens CECT 7054 y CECT 7055, respectivamente. Las dos plantas silvestres analizadas se designan como CR1 y CR2. Las plantas transgénicas reciben la designación de B33-7, B33-11, B33-12, B33-13 y B33-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7055) y 35S-1, 35S-6, 35S-11 y 35S-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7054). Los valores representados se corresponden a la media y desviación típica de tubérculos de 10 plantas diferentes por línea.
Figura 9: Balance amilosa/amilopectina, expresado como % amilosa, en tubérculos de plantas de patata silvestres y plantas de patata que expresan glgP de E. coli tras integrar en su genoma las construcciones 35S-glgP-NOS y B33-ChlTP-glgP-NOS haciendo uso de las cepas de A. tumefaciens CECT 7054 y CECT 7055, respectivamente. Las dos plantas silvestres analizadas se designan como CR1 y CR2. Las plantas transgénicas reciben la designación de B33-7, B33-11, B33-12, B33-13 y B33-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7055) y 35S-1, 35S-6, 35S-11 y 35S-14 (las obtenidas haciendo uso de CECT 7054). Los valores representados se corresponden a la media y desviación típica de tubérculos de 10 plantas diferentes por línea.
Descripción detallada de la invención
Obtención y purificación de GP recombinante activa
Conocida la secuencia nucleotídica de glgP de Escherichia coli (22) se crearon dos cebadores específicos (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2), correspondientes a los extremos 5’ y 3’ del gen. Haciendo uso de estos cebadores se amplificó por métodos convencionales de PCR un fragmento de DNA de aproximadamente 2460 pares de bases a partir de ADN genómico de E. coli. Tal fragmento de DNA se introdujo en el plásmido pGemT-easy (Promega) dando lugar a la construcción pG-glgP (Fig. 1) la cual fue amplificada en la bacteria hospedadora XL1 Blue. pG-glgP fue digerido con los enzimas de restricción XhoI y BamHI. El fragmento liberado (que contiene a glgP) fue clonado en los mismos sitios de restricción del plásmido de expresión pET-15b(+) (Novagen). El plásmido resultante designado con el nombre de pET15b-glgP (Fig. 1) fue introducido por electroporación en la cepa E. coli BL21(DE3)C43 (Novagen) con número de depósito CECT 7071. La expresión de glgP tuvo lugar mediante la adición de 1 mM isopropil-βD-thiogalactopyranoside (IPTG) en 100 ml de cultivo celular crecido a 37ºC. Tras seis horas de cultivo inducido se recogieron las bacterias y se resuspendieron en 4 ml de “binding buffer” (Novagen, His-bind purification kits), se sonicaron y se centrifugaron a 40.000 g durante veinte minutos. El sobrenadante que contiene la GP recombinante con una cola de histidinas en el extremo N-terminal se hizo pasar a través por una columna de afinidad del kit de purificación de proteínas “His-bind” de Novagen. Siguiendo las instrucciones del kit se eluyó la GP con 6 ml del tampón de elución recomendado, en el que se había incluido 200 mM de imidazol en lugar de 1 molar. Tras la elución la proteína fue sometida rápidamente a una diálisis para retirar cualquier traza de imidazol que inactive irreversiblemente alaGP.
Determinación del contenido en azúcares solubles y almidón
Los azúcares solubles se extrajeron haciendo uso de las técnicas descritas en la literatura científica (34, 35). Sacarosa, maltosa, maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa, maltoheptaosa, fructosa y glucosa fueron determinados haciendo uso de un cromatógrafo iónico automatizado marca DIONEX ajustado a una columna CarboPac PA10, un detector electroquímico ED50, una bomba de gradiente GP50 El y un organizador de eluyentes E01 (22). El ADPG fue determinado haciendo uso de un sistema Waters de HPLC ajustado a una columna Partisil-10-SAX (10). El almidón, el glucógeno y la amilopectina se midieron haciendo uso de kits comerciales descritos en la literatura (36). El balance amilosa/amilopectina se determinó haciendo uso del método espectrofotométrico descrito en la literatura (36).
Identificación del producto con actividad enzimática GP
El producto enzimático GP se identificó mediante el siguiente patrón funcional:
Es una alfa-l,4-glucan fosforilasa (EC 2.4.1.1). Comúnmente esta enzima cataliza el corte reversible por fosforolisis de uniones α-1,4 de los extremos no-reductores de homopolisacáridos de moléculas de glucosa (ramificados o no) unidas covalentemente por enlaces α-1,4 y α-1,6 tales como maltodextrinas, almidón y glucógeno, dando lugar a la producción de G1P.
Obtención de anticuerpos policlonales específicos de GP de E. coli
Dos miligramos de GP de E. coli recombinante purificada fueron separados en SDS-PAGE. Tras haber sido eluída, la GP recombinante purificada fue mezclada con adyuvante completo de Freund (en una relación 50/50) y posteriormente fue alicuotada en tres fracciones iguales, cada una de las cuales fue inyectada en un conejo en períodos de dos semanas. Tras aproximadamente dos meses de la primera inyección, se extrajo el suero sanguíneo del conejo el cual contiene los anticuerpos policlonales específicos de GP de E. coli.
Identificación del producto mediante la técnica de Western blot
Extractos crudos de tubérculos de plantas silvestres y plantas transgénicas que expresan el gen glgP que codifica para GP de E. coli fueron separadas en SDS-PAGE. Posteriormente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y la GP de E. coli se detectó haciendo uso del anticuerpo específico anti GP de E. coli según la metodología descrita en la literatura (37).
Obtención de plantas transgénicas que expresan glgP de E. coli
a. Plantas de patata con elevada actividad GP en los amiloplastos de tubérculos
El plásmido pG-glgP-NcoI (idéntico a pG-glgP, excepto que posee un sitio NcoI en el codon ATG de iniciación de la traducción) fue digerido con los enzimas NcoI y BamHI. El fragmento liberado fue clonado en los sitios NcoI y BamHI de psK-B33-SuSy-NOS (B33 es la región promotora del gen que codifica para la patatina cuya expresión es específica de tubérculos)(38) dando lugar al plásmido pSK-B33-glgP-NOS (Fig. 2).
Para la producción de una construcción génica que codifique para la GP de E. coli localizada en el plastidio, pG-glgP-NcoI fue digerido con NcoI y BamHI. El fragmento liberado fue clonado entre los sitios NcoI y BamHI del plásmido pSK-ChlTP-ASPP que contiene la región del gen que codifica para el péptido de tránsito al cloroplasto de la proteína P541 (39), dando lugar al plásmido pSK-ChlTP-glgP (Fig. 2).
Para la producción de una construcción que codifique para la GP de E. coli que se acumule específicamente en los amiloplastos de tubérculos de patata, pSK-ChlTP-glgP fue digerido secuencialmente con SalI, T4-DNA polimerasa y BamHI. El fragmento liberado fue clonado en pSK-B33-glgP-NOS tras haber sido digerido secuencialmente con NcoI, T4 DNA polimerasa y BamHI, dando lugar al plásmido pSK-B33-ChlTP-glgP-NOS (Fig. 2).
Para la producción de un plásmido binario que contenga la construcción génica B33-ChlTP-glgP-NOS necesaria para transformar plantas vía Agrobacterium tumefaciens, psK-B33-ChlTP-glgP-NOS fue digerido secuencialmente con NotI, T4 DNA polimerasa y XhoI. El fragmento liberado fue clonado en el plásmido binario pBIN20 (40) que previamente había sido digerido secuencialmente con HpaI, T4 DNA polimerasa y XhoI, dando lugar al plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS (Fig. 2). PBIN20-B33-C1P-GP-NOS se introdujo por electroporación en diferentes cepas de A. tumefaciens necesarias para transformar especies tales como patata, Arabidopsis thaliana, tomate, tabaco, maíz y arroz (como por ejemplo la cepa C58:GV2260, con nº de depósito CECT 7055). CECT 7055 se utilizó para transformar plantas de patata según protocolos convencionales de transformación de esta especie (41).
b. Plantas que expresan constitutivamente glgP y que poseen una elevada actividad GP citosólica
Para la producción de plantas con alta actividad GP citosólica, se crearon construcciones del gen glgP de E. coli cuya expresión está gobernada por el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico del tabaco. Para ello, el plásmido pSK-35S fue digerido con XhoI y NcoI. El fragmento liberado (que contiene al promotor 35S unido a una región amplificadora (42), fue clonado entre los sitios XhoI y NcoI del plásmido pSK-B33-glgP-NOS, dando lugar al plásmido pSK-35S-glgP-NOS (Fig. 3). Para poder transferir esta construcción al genoma de las plantas vía A. tumefaciens, es preciso que previamente sea clonada en un plásmido binario. Para ello, pSK-35S-glgP-NOS fue digerido secuencialmente con las enzimas NotI, T4 DNA polimerasa y XhoI. El fragmento liberado fue clonado dentro del plásmido binario pBIN20 que previamente había sido digerido secuencialmente con los enzimas HpaI, T4 DNA polimerasa y XhoI. El plásmido así obtenido se designó con el nombre de pBIN2035S-GP-NOS (Fig. 3). pBIN2035S-GP-NOS se introdujo por electroporación en diferentes cepas de A. tumefaciens (como por ejemplo la cepa C58:GV2260 con el nº de depósito CECT 7054), necesarias para transformar especies tales como patata, Arabidopsis thaliana, tomate, tabaco, maíz y arroz.
Así, el primer objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de plantas transgénicas con elevada actividad GP, elevado contenido y rendimiento en almidón y alto balance amilosa/amilopectina, con respecto a las plantas silvestres sin transformar, caracterizado por la transformación de la planta silvestre con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica, de origen animal, vegetal o bacteriano, que codifica para una proteína con alta actividad GP y la expresa en el interior de la planta transformada.
En una realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque la actividad GP de la proteína codificada y expresada en el interior de la planta transformada es al menos 5 veces superior a la actividad GP de la planta silvestre, el contenido en almidón de las plantas transgénicas obtenidas es al menos un 20% superior al de las plantas silvestres y el valor del contenido en amilosa de las plantas transgénicas obtenidas es al menos un 10% superior al valor del contenido en amilosa de las plantas silvestres sin transformar, en todos los casos, cultivadas en las mismas condiciones que las plantas transgénicas.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque la secuencia nucleotídica comprendida en el vector de expresión utilizado para transformar la planta silvestre se selecciona entre:
- a.
- Una secuencia nucleotídica que codifique para la secuencia aminoacídica caracterizada por la SEQ ID NO: 4;
- b.
- Una secuencia nucleotídica caracterizada por la SEQ ID NO: 3;
- c.
- Una secuencia nucleotídica que hibride con las definidas en “a” o “b” y que codifique para un producto enzimático con actividad GP;
- d.
- Una secuencia nucleotídica que difiera de las definidas en “a”, “b” o “c” debido a la degeneración del código genético.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque la elevada actividad GP dentro de la planta transgénica transformada puede conseguirse tanto a nivel citosólico, mediante la transformación de la planta silvestre con Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS, como a nivel plastidial, mediante la transformación de la planta silvestre con Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS.
El segundo aspecto de la presente invención se refiere a los vectores de expresión:
- -
- Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 caracterizado por comprender el plásmido pBIN2035S-GP-NOS.
- -
- Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 caracterizado por comprender el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS.
El tercer objeto de la presente invención se refiere a las células transformadas o infectadas con los dos vectores mencionados anteriormente, caracterizadas por ser una célula bacteriana o vegetal.
En una realización preferida, la célula bacteriana de la invención se caracteriza por ser una célula bacteriana de E. coli BL21 (DE3) C43, transformada con el plásmido pET15b-glgP que expresa el gen que codifica para la proteína GP recombinante.
En otra realización preferida, la célula vegetal de la invención se caracteriza por estar transformada o infectada por Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS o por Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-N()S, y por pertenecer, entre otras, a cualquiera de las siguientes especies de plantas: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
El cuarto objeto de la presente invención se refiere al uso de la célula bacteriana definida anteriormente para la producción de la proteína GP recombinante activa, y para la producción de anticuerpos específicos frente a GP.
El quinto objeto de la presente invención se refiere al uso de las células bacterianas o vegetales transformadas
o infectadas con Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS o con Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS, para la producción de almidón.
El sexto objeto de la presente invención se refiere a las plantas transgénicas transformadas con el vector Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS o con Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS y que se caracterizan por poseer alta actividad GP respecto a la planta silvestre, tanto a nivel citosólico como plastidial y, consecuentemente, un elevado contenido y rendimiento en almidón y un alto balance amilosa/amilopectina respecto a la planta silvestre sin transformar, en todos los casos, cultivadas en las mismas condiciones y en las mismas fechas que las plantas transgénicas. En una realización preferida, la planta transgénica de la invención se caracteriza porque su actividad GP es al menos 5 veces superior a la actividad GP de la planta silvestre, su contenido en almidón es al menos un 20% superior al contenido en almidón de las plantas silvestres y el valor de su contenido en amilosa es al menos un 10% superior al valor del contenido en amilosa de las plantas silvestres, cultivadas en todos los casos en las mismas condiciones.
En otra realización preferida, la planta transgénica de la invención se caracteriza porque expresa el gen glgP (SEQ ID NO: 3) y codifica para proteínas con alta actividad GP, y además, es seleccionada de entre el grupo que comprende: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
El séptimo objeto de la presente invención se refiere al uso de las plantas transgénicas mencionadas anteriormente, para la producción de almidón.
El octavo objeto de la presente invención se refiere a los anticuerpos policlonales o monoclonales frente a la enzima GP.
El noveno objeto de la presente invención se refiere al uso de dichos anticuerpos para medir la concentración de GP presente en una muestra.
Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest
Los microorganismos utilizados en la presente invención fueron depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campues Bunassot, Burjassot 46100 (Valencia, España).
- •
- Cepa de E. coli BL21(DE3)C43 transformada con el plásmido pET15b-glgP, depositada en la fecha 09/05/2005 con nº de depósito CECT 7071.
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- Cepa de A. tumefaciens C58:GV2260 transformada con el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS, depositada en la fecha 25/07/2005 con nº de depósito CECT 7055.
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- Cepa de A. tumefaciens C58:GV2260 transformada con el plásmido pBIN2035S-GP-NOS, depositada en la fecha 25/07/2005 con nº de depósito CECT 7054.
Ejemplos
Los ejemplos que se exponen a continuación tienen el objetivo de ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.
Ejemplo 1
Producción en Escherichia coli de una GP recombinante
El conocimiento de la secuencia nucleotídica del gen glgP que codifica para la GP de E. coli permitió la creación de dos cebadores específicos cuyas secuencias son, en sentido 5’-3’, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Haciendo uso de estos cebadores se amplificó por métodos convencionales de PCR un fragmento de DNA a partir de ADN genómico de E. coli, que se introdujo en el plásmido pGemT-easy (Promega), dando lugar al plásmido pG-glgP. pG-glgP fue digerido con los enzimas de restricción XhoI y BamHI. El fragmento liberado (que contiene a glgP) fue clonado en los mismos sitios de restricción del plásmido de expresión pET-15b(+) (Novagen). El plásmido resultante (designado con el nombre de pET15b-glgP, Fig. 1) fue introducido por electroporación en E. coli BL21(DE3)C43 (Novagen). La secuencia nucleotídica del fragmento clonado en pET-15b(+) es SEQ ID NO: 3. La secuencia aminoacídica deducida tras la expresión de SEQ ID NO: 3 es SEQ ID NO: 4.
La inducción de la expresión de glgP en bacterias BL21(DE3)C43 transformadas con pET15b-glgP (CECT 7071) tuvo lugar al añadir 1 mM IPTG. Tras seis horas adicionales de cultivo a 37ºC, se observó que las bacterias transformadas con pET15b-glgP acumulaban una proteína de aproximadamente 95 kDa que podía purificarse a homogeneidad de manera simple por medio de cromatografía de afinidad haciendo uso del kit de purificación “His-bind” (Novagen) (Fig. 4). Además, estas bacterias se caracterizan por no poseer glucógeno (22).
Ejemplo 2
Ensayos enzimáticos
Las reacciones enzimáticas se desarrollaron a 37ºC. Las actividades GP se midieron en el sentido de la degradación del poliglucano analizado. En un primer paso, 50 μL de mezcla de reacción compuesta por 50 mM HEPES (pH 7.5), 30 mM tampón fosfato (pH 7.5), poliglucano (equivalente a 10 mM de glucosa) y extracto de proteína, se incubaron durante 15 minutos. La reacción fue detenida tras hervir durante 2 minutos y centrifugar a 30000 g durante 20 minutos. La G1P liberada existente en el sobrenadante fue determinada por cualquiera de los siguientes métodos:
- •
- Por espectrofotometría. 300 μL de mezcla conteniendo Hepes 50 mM pH 7, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, KC1 15 mM, NAD+ 0,6 mM, una unidad de fosfoglucomutasa y otra de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides,y30 μL del sobrenadante resultante del paso uno se incubaron durante 20 minutos. La producción de NADH se monitorizó a 340 nm utilizando un espectrofotómetro Multiskan EX (Labsystems). Fue despreciable la cantidad de NADH producida por cualquier extracto proteico en ausencia de glucógeno en el paso uno.
- •
- Por cromatografía. 40 μL del sobrenadante del paso 1 fueron sometidos a cromatografía líquida de alta afinidad haciendo uso de un sistema DX-500 Dionex acoplado a una columna Carbo-Pac PA10 y detección amperométrica.
La unidad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 μmol de producto por minuto.
Ejemplo 3
Identificación del producto con actividad GP
El producto con actividad GP así obtenido cumple las características generales descritas en la literatura científica relativas a cualquier GP (22, 43-45).
La GP de E. coli reconoce homopolisacáridos de 5 ó más moléculas de glucosa tales como glucógeno, almidón, maltoheptaosa, maltohexaosa y maltopentaosa.
No actúa sobre maltotetraosa, maltotriosa ni maltosa.
No se inhibe por ADPglucosa, UDPglucosa, nucleosido mono-di-y tri-fosfatos tales como AMP, ADP y ATP, 3-fosfoglicerato, fructosa-1,6-bifosfato, fructosa-6-fosfato, glucosa-6-fosfato o glucosa.
Peso molecular aparente de la proteína purificada en geles desnaturalizantes, en torno a 93 kDa (Fig. 4).
Ejemplo 4
Obtención de plantas con alta actividad GP (tanto plastidial como citosólica) como consecuencia de la expresión ectópica de un gen que codifica para una GP
Utilizando la cepa de A. tumefaciens CECT 7054 (que alberga el plásmido pBIN2035S-GP-NOS) se obtuvieron plantas de patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) y arabidopsis (Arabidopsis thaliana) que expresan constitutivamente glgP. Utilizando la cepa de A. tumefaciens CECT 7055 (que alberga el plásmido PBIN20-B33-C1P-GP-NOS) se obtuvieron plantas de patata que expresan en sus tubérculos glgP. Tubérculos de plantas de patata transformadas haciendo uso de CECT 7054 y CECT 7055 acumulaban una proteína que era reconocida específicamente por el anticuerpo policlonal obtenido frente a la GP de E. coli (Fig. 5), en cambio, los tubérculos de plantas de patata silvestres no transformadas cultivadas en las mismas condiciones ambientales, de cultivo (riego, abonos, tratamientos con pesticidas, etc), y en las mismas fechas que las plantas transformadas, no expresaban dicha enzima. Tanto los tubérculos de las plantas de patata transformadas haciendo uso de CECT 7054 (que alberga una construcción que codifica para una GP localizada en el citosol) como los de plantas de patata transformadas haciendo uso de CECT 7055 (que alberga una construcción que codifica para una GP localizada en los amiloplastos) presentaron las siguientes características:
1. La actividad GP es 5-8 veces superior a la existente en tubérculos no transformados (Fig. 6).
- 2.
- Alto contenido en almidón respecto al existente en tubérculos no transformados (ap. 300 μmol glucosa/g peso fresco frente a 450-700 μmol glucosa/g peso fresco observado en las líneas 35S-glgP-NOS y B33-ChlTP-glgP-NOS) (Fig. 7). Sorprendentemente por lo tanto, al contrario de lo que ocurre en bacterias y células de mamíferos, el incremento de la actividad GP da lugar a un incremento del contenido en almidón.
- 3.
- Alto contenido en sacarosa y tendencia a un bajo contenido en glucosa y fructosa (Fig. 8).
- 4.
- Alto balance amilosa/amilopectina comparado con tubérculos de plantas no transformadas (Fig. 9). De nuevo, este resultado es sorprendente ya que, si la GP tuviese una función degradadora de polímeros de glucosa, el balance amilosa/amilopectina de los tubérculos que expresan GP ectópicamente debería ser más bajo que el observado en tubérculos de plantas no transformadas. Los resultados ilustrados en la Fig. 7 y en la Fig. 9 indican que la expresión de GP conduce a un incremento de la cantidad de almidón acumulado en el órgano de reserva.
- 5.
- La morfología externa de las plantas que expresan GP ectópicamente no es aberrante, tras ser comparada con la de las plantas no transformadas.
- 6.
- El número de tubérculos en las líneas que expresan GP ectópicamente es normal al comparar con las plantas no transformadas. La productividad en Kg de peso fresco por planta no se ve afectada por la expresión de GP, pero si la producción de almidón por planta.
TABLA 1
Especificidad de sustrato de la GP de E. coli. La mezcla de reacción (50 μl) está compuesta por 50 mM HEPES (pH 7.5), 30 mM Pi, el glucano indicado (5 mM glucosa)y3UdeGPrecombinante. Tras 3 horas de incubación a 37ºC la reacción se detuvo tras calentar a 100ºC durante 2 min. Los productos se analizaron por HPLC con detección amperométrica
TABLA 2
Efecto de diferentes compuestos en la actividad GP de E. coli
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Claims (26)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Procedimiento para la obtención de plantas transgénicas que comprende la transformación de la planta silvestre con el vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 caracterizado por comprender el plásmido pBIN2035S-GP-NOS o Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 caracterizado por comprender el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS.
-
- 2.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad GP de la proteína codificada y expresada en el interior de la planta transformada es al menos 5 veces superior a la actividad GP de la planta silvestre.
-
- 3.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido en almidón de las plantas transgénicas obtenidas es al menos un 20% superior al contenido en almidón de las plantas silvestres sin transformar cultivadas en las mismas condiciones.
-
- 4.
- Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el valor del contenido en amilosa de las plantas transgénicas obtenidas es al menos un 10% superior al valor del contenido en amilosa de las plantas silvestres sin transformar.
-
- 5.
- Procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia nucleotídica comprendida en el vector de expresión utilizado para transformar la planta silvestre se selecciona entre:
- a.
- Una secuencia nucleotídica que codifique para la secuencia aminoacídica caracterizada por la SEQ ID NO: 4;
- b.
- Una secuencia nucleotídica caracterizada por la SEQ ID NO: 3;
- c.
- Una secuencia nucleotídica que hibride con las definidas en “a” o “b” y que codifique para un producto enzimático con actividad GP;
- d.
- Una secuencia nucleotídica que difiera de las definidas en “a”, “b” o “c” debido a la degeneración del código genético.
-
- 6.
- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elevada actividad GP dentro de la planta transgénica transformada puede conseguirse tanto a nivel citosólico como a nivel plastidial.
-
- 7.
- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elevada actividad GP a nivel citosólico es conseguida mediante la transformación de la planta silvestre con Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS.
-
- 8.
- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elevada actividad GP a nivel plastidial es conseguida mediante la transformación de la planta silvestre con Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS.
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- 9.
- Vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 caracterizado por comprender el plásmido pBIN2035S-GP-NOS.
-
- 10.
- Vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 caracterizado por comprender el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS.
-
- 11.
- Célula transformada o infectada con el vector de las reivindicaciones9o10.
-
- 12.
- Célula, según la reivindicación 11, caracterizada por ser una célula bacteriana o vegetal.
-
- 13.
- Célula bacteriana de E. coli CECT 7071, según la reivindicación 12, caracterizada por estar transformada con el plásmido pET15b-glgP y expresar el gen que codifica para la proteína GP recombinante.
-
- 14.
- Célula vegetal, según la reivindicación 12, caracterizada por estar transformada o infectada por Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS o por Agrobacterium tumefaciens CECT 7055 que comprende el plásmido pBIN20-B33-C1P-GP-NOS.
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- 15.
- Célula vegetal, según la reivindicación 14, caracterizada por pertenecer a cualquiera de las siguientes especies de plantas: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays)o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
- 16. Uso de la célula de la reivindicación 13 para la producción de la proteína GP recombinante activa.
-
- 17.
- Uso de la célula de la reivindicación 13 para la producción de anticuerpos específicos frente a GP.
-
- 18.
- Uso de la célula de cualquiera de las reivindicaciones 11,12,14 y/ó 15 para la producción de almidón.
-
- 19.
- Planta transgénica transformada con el vector de las reivindicaciones9o10 caracterizada por poseer alta actividad GP respecto a la planta silvestre, tanto a nivel citosólico como plastidial y, consecuentemente, un elevado contenido y rendimiento en almidón y un alto balance amilosa/amilopectina.
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- 20.
- Planta transgénica, según la reivindicación 19, caracterizada porque su actividad GP es al menos 5 veces superior a la actividad GP de la planta silvestre sin transformar.
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- 21.
- Planta transgénica, según la reivindicación 19, caracterizada porque su contenido en almidón es al menos un 20% superior al contenido en almidón de las plantas silvestres sin transformar.
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- 22.
- Planta transgénica, según la reivindicación 19, caracterizada porque el valor de su contenido en amilosa es al menos un 10% superior al valor del contenido en amilosa de las plantas silvestres sin transformar.
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- 23.
- Planta transgénica, según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizada por expresar el gen glgP (SEQ ID NO: 3) y codificar para proteínas con alta actividad GP.
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- 24.
- Planta transgénica, según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, seleccionada el grupo que comprende: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
- 25. Uso de las plantas transgénicas de las reivindicaciones 19 a 24, para la producción de almidón.LISTA DE SECUENCIAS<110> IDEN CARBOHYDRATE BIOTECHNOLOGY, S.L.<120> Procedimiento de producción de plantas transgénicas que presentan un alto contenido y rendimiento en almidón y con alto balance amilosa/amilopectina.<130> P-02382<160> 4<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 43<212> DNA<213> Escherichia coli<223> Cebador 5’ de glgP<400> 1<210> 2<211> 31<212> DNA<213> Escherichia coli<223> Cebador 3’ de glgP<400> 2<210> 3<211> 2448<212> DNA<213> Escherichia coli<223> Gen glgP<400> 3ES 2 354 895 A1<210> 4<211> 815<212> PRT<213> Escherichia coli<223> Péptido glgP<400> 4ES 2 354 895 A1ES 2 354 895 A1ES 2 354 895 A1OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCASN.º solicitud: 200802608ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 12.09.2008Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. : C12N15/82 (01.01.2006) A01H5/00 (01.01.2006)DOCUMENTOS RELEVANTES
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- Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- Y
- EP 1535998 A1 (UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA. CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) 01.06.2005, página 5. 1,6,7,9,11,12,14,15
- Y
- EP 1721980 A1 (UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA. CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) 15.11.2006, página 18. 1,6,7,9,11,12,14,15
- Y
- US 20060160192 A1 (KONSTANTIN VYACHESLAVOVICH RYBAK et al.) 20.07.2006, páginas 19-21. 1,6,7,9,11,12,14,15
- A
- SATOH H. et al. Mutation of the plastidial �-glucan phosphorylase gene in rice affects the synthesis and structure of starch in the endosperm. Julio 2008. The Plant Cell. Vol. 20, páginas 1833-1849. Página 1843. 1-25
- A
- CURTIS L. et al. The complexities of starch biosynthesis in cereal endosperms. Abril 2008. Current Opinion in Biotechnology. Vol. 19, páginas 160-165. Página 163. 1-25
- A
- SCHUPP N. et al. The relation of starch phosphorylases to starch metabolism in wheat. 2004. Plant and Cell Physiology. Vol. 45 (10), páginas 1471-1484. Página 1471. 1-25
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 03.03.2011
- Examinador I. Rueda Molins Página 1/4
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICANº de solicitud: 200802608Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, A01H Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos debúsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXTInforme del Estado de la Técnica Página 2/4OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 200802608Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 03.03.2011Declaración- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-25 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 2-5, 8, 10, 13, 16-25 1, 6, 7, 9, 11, 12, 14, 15 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Informe del Estado de la Técnica Página 3/4OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2008026081. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
- EP 1535998 A1 (UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA. CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) 01.06.2005
- D02
- EP 1721980 A1 (UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA. CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) 15.11.2006
- D03
- US 20060160192 A1 (KONSTANTIN VYACHESLAVOVICH RYBAK et al.) 20.07.2006
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónLa solicitud de patente divulga un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido en almidón y alto balance amilosa/amilopectina.Los documentos D01 y D02 reflejan un método para la obtención de plantas trasngénicas.El documento D03 muestra la secuencia nucleotídica del gen glgP.NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Artículos 6 y 8 LP 11/1986)En las reivindicaciones 1, 6 y 7 de la solicitud de patente se reivindica un procedimiento para la obtención de plantas transgénicas que emplea el vector de expresión de Agrobacterium tumefaciens CECT 7054 caracterizado por comprender el plásmido pBIN2035S-GP-NOS. En la reivindicación 9 de la solicitud de patente se reivindica dicho vector y en las reivindicaciones 11, 12, 14 y 15 una célula transformada con el mismo.Los documentos D01 y D02 muestran un procedimiento para la obtención de plantas transgénicas, con un vector de expresión de Agrobacterium tumefaciens que comprende un plásmido determinado. Las etapas de construcción de dicho plásmido (que se muestran tanto en la página 5 del documento D01 como en la página 18 del documento D02), son similares a las que se divulgan en la página 11 de la solicitud de patente (empleadas para la construcción del plásmido pBIN2035S-GP-NOS) . La diferencia fundamental entre el plásmido pBIN2035S-GP-NOS reivindicado en la solicitud de patente y los plásmidos divulgados en los documentos D01 y D02 reside en la secuencia de interés introducida en dichas construcciones.El documento D03 divulga (con la secuencia 13 de la página 19) una secuencia nucleotídica del gen glgP. Es precisamente este gen el que comprende el plásmido pBIN2035S-GP-NOS divulgado en la solicitud de patente.La construcción de un plásmido (pBIN2035S-GP-NOS) siguiendo las etapas divulgadas en el documento D01, o en el documento D02, que contenga la secuencia del gen glgP, divulgada en el documento D03, no presentaría dificultad técnica para un experto en la materia. Igualmente, el empleo de dicho plásmido para la transformación de células resultaría evidente para un experto en la materia. Por tanto, las reivindicaciones 1, 6, 7, 9, 11, 12, 14 y 15, presentan novedad pero no actividad inventiva, en el sentido de los Artículos 6 y 8 LP 11/1986.Informe del Estado de la Técnica Página 4/4
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