CN113249396B

CN113249396B - 一种烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因及其应用

Info

Publication number: CN113249396B
Application number: CN202110572363.2A
Authority: CN
Inventors: 曾婉俐; 李雪梅; 张伟; 蒋佳芮; 高茜; 米其利; 杨光宇; 杨文武; 邓乐乐; 许力; 翟妞
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113249396A

Abstract

本发明涉及一种烟草葡萄糖‑1‑磷酸腺苷酸转移酶基因及其应用，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示。本申请中，通过对烟草葡萄糖‑1‑磷酸腺苷酸转移酶的初步研究，发现其与烟草叶片中淀粉的合成代谢相关。在本氏烟草中将该基因沉默，烟草叶片中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量明显降低，总淀粉含量下降47.3％。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育提供一定的参考借鉴。

Description

一种烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一种烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因及其应用。

背景技术

烟草作为一种重要的经济作物，其品质和安全性一直是研究人员关注的重点。淀粉是烟草生长过程中积累的重要碳水化合物，广泛存在于烟草的茎叶中。成熟的鲜烟叶中淀粉含量高达40％左右，经调制后，大部分淀粉降解为还原糖，但仍有部分留在烟叶中。淀粉含量是评价烟叶质量的关键因素之一。鲜烟淀粉含量高对品质是不利的，尤其对烟叶色泽、香味不利，烤后烟叶尽管淀粉含量较低，但仍会影响烟叶外观及内在品质。以淀粉形态存在的糖类在烟支燃吸时，一方面对烟气质量会产生不良影响，另一方面影响燃烧速度和完全性。另外，淀粉在燃烧时会产生焦糊气味，破坏烟草燃吸时所形成的香味，使安全性下降。目前，我国烤烟中淀粉含量(质量分数)约为4％～6％，而国外优质烤烟淀粉含量仅为1％～2％。

因此，烟草中影响淀粉含量的基因功能的研究将为烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供理论支持，对提高我国烟草产品品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因及其应用，以解决现烤烟中淀粉含量过高的问题，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定的基础。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示，含有1587个碱基，命名为NtGLGC。

进一步的，烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由528个氨基酸残基组成。

进一步的，烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组，并反转录为cDNA备用；

(2)设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtGLGC-F：5’-TGTTCAATCTCCAAAGTTCC-3’，

NtGLGC-R：5’-CGCAATCTCAGATTCTGTTTG-3’。

进一步的，在步骤(1)中，提取基因组时，以烟草品种红花大金元叶片为样品。

上述任一项的烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因的应用，该基因表达的蛋白与植物叶片中淀粉含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中总淀粉含量明显降低。

进一步的，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶NtGLGC表达量，来调节控制烟叶中淀粉含量。

进一步的，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtGLGC基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体，转化烟草，筛选获得淀粉含量变化的烟草新品种。

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)的技术，干扰NtGLGC基因的表达使其沉默，NtGLGC基因沉默植株中淀粉含量显著下降，进而获得淀粉含量下降的植物新品种。

本发明的有益效果是：

本申请中，通过对特定烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶NtGLGC的初步研究，发现其与烟草淀粉含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中淀粉含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1为与对照植株相比，NtGLGC基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的淀粉含量比较。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

生物材料：

本氏烟草，一种现常用烟草材料，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cm×10cm)中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理。

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体(tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2(一种常用载体)带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；10g氯化钠(NaCl)；5g酵母抽提物(yeast extract)，高温高压灭菌。

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g牛肉浸膏(beef extract)；5g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；5g蔗糖(sucrose)；1g酵母抽提物(yeast extract)；2mL 1M硫酸镁(MgSO4)，高温高压灭菌。

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用。

200mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)储备液：二甲基亚砜(DSMO)溶解，-20℃储存备用。

实施例1

本实施例就烟草NtGLGC基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

(1)烟草NtGLGC基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtGLGC基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtGLGC-F：5’-TGTTCAATCTCCAAAGTTCC-3’，

NtGLGC-R：5’-CGCAATCTCAGATTCTGTTTG-3’。

以烟草红花大金元叶片(先提取基因组，再反转录为cDNA)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtGLGC基因。

PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸2min，34个循环后，72℃彻底延伸5min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

(2)构建重组TRV2-NtGLGC载体

将步骤(1)中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接。

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜。

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtGLGC。

需要说明的是，烟草NtGLGC基因，包括1587个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶蛋白NtGLGC，包括528个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，进一步将所构建的重组TRV2-NtGLGC载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

(1)转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，同时制备了TRV2-GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP(载体对照)及TRV2-NtGLGC的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

(2)制备转染用菌液

将步骤(1)中筛选所得阳性农杆菌克隆在5mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan和50mg/L Rif)中，28℃、250rpm条件下培养过夜。

取50uL过夜培养物接种至50mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan)中，培养至OD₆₀₀＝1.0-1.5左右，然后4000g离心5min，收集菌体，再用MMA重悬，调节OD₆₀₀＝1.0左右。

最后室温放置3h左右后，作为转染用菌液。

(3)瞬时转化

以3-4w(周)苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1mL规格注射器，将步骤(2)中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qRT-PCR对NtGLGC基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2-NtGLGC的侵染植株中，NtGLGC的表达量显著降低，qRT-PCR引物如下：

NtGLGC-F：5’-CTCCACGTTTTGACAGACGAC-3’，

NtGLGC-R：5’-GGGTGGCAGCTCTACTTGTC-3’。

进一步地，对实验组(TRV2-NtGLGC浸染植株)和对照组(TRV2-GFP浸染植株)中的叶片淀粉含量情况进行了检测(检测方法参照：格锐思生物的支链-直链-总淀粉含量试剂盒(分光光度法))，结果如图2所示。

从图2结果可以看出，实验组中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量与对照组相比均有显著下降，总淀粉含量下降47.3％。这进一步表明，通过沉默NtGLGC基因，可对烟草叶片中植物淀粉的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因及其应用

<130> WPC211440

<141> 2021-05-25

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1587

<212> DNA

<213> 人工序列(NtGLGC)

<400> 1

atggatactt gctttgtggc tttgaaatca actgcccatt tggggagagt gagcaaaggt 60

ggctttgaaa atggtgagaa ggagtttttg ggggagcaga ttagagggag tttaaacaac 120

aataatctca gggttaataa tttgtcgaaa agtttgaaac ttgagaagaa ggaaagcaag 180

atcaaacctg gggttgcttt ctctgttatc actacagaaa atggcaaaga aactctgact 240

gtagaggcac cacgttttga cagacgacgg gcaaatccaa agaatgtggc ttcagtcata 300

ctaggaggag gtgcagggac caagttattt ccacttacaa gtagagctgc aacccctgct 360

gtaccggttg gaggatgcta caggctaata gacatcccaa tgagcaactg tatcaacagt 420

ggtattaaca agatttttgt gctgacccag tacaattctg ctcccttgaa tcgtcacatt 480

gctcgaacat attttggcaa tggtgtgagc tttggagatg gatttgttga ggtgttggct 540

gcaactcaga cacctgggga aactgggaaa aaatggtttc aaggaactgc agatgctgtt 600

agacaattca tatgggtttt tgaggatgcc aagaacaaag atgttgataa tatccttata 660

ttatctgggg atcatcttta tcggatggat tatatggact tggtgcagaa ccatatcgac 720

cggaattctg atattactct ttcatgtgca ccggcctgcg acagccgagc atcagatttc 780

gggctggtca agattgacag tagaggcaga gttgtccagt ttgctgaaaa accaaaaggt 840

tttgatctaa aagcaatgca agtagatact actcttattg gattatctcc acaagaagcg 900

aagagatccc cttatatcgc ttcaatgggg gtttatgtat tcaaaacaga tgtattgttg 960

aagctgctga aatggagata tcctacagct aatgatttcg gctctgaaat tataccagca 1020

gccataaatg agcacaatgt tcaagcatac atattcagag actactggga ggacatagga 1080

acaataaaat ctttttatga tgctaacttg gccctcactg cagagtctcc aaagttcgaa 1140

ttttacgatc caaaaacacc tttttacaca tctcctaggt tccttccacc aaccaagatt 1200

gacaactgca agattaagga tgccataatc tctcatgggt gcttcttgcg cgaatgttca 1260

gtggatcact ccatagtggg tgaaagatcg cgcttagatt gtggtgttga actgaaggat 1320

actctgatga tgggagcaga ttattaccaa acagaatctg agattgcatc gctgctagca 1380

gaggggaagg taccaattgg agttggagaa aacacaaaaa taaggaattg tatcattgac 1440

aagaatgcaa agataggaaa ggatgttgtg atcatgaata aagatggtgt tcaagaagca 1500

gatagaccgg aggaaggatt ctacataagg gcaggattaa ccattgtagc agagaaagct 1560

acaattaaag atggaactgt catataa 1587

<210> 2

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工序列(NtGLGC)

<400> 2

Met Asp Thr Cys Phe Val Ala Leu Lys Ser Thr Ala His Leu Gly Arg

1 5 10 15

Val Ser Lys Gly Gly Phe Glu Asn Gly Glu Lys Glu Phe Leu Gly Glu

20 25 30

Gln Ile Arg Gly Ser Leu Asn Asn Asn Asn Leu Arg Val Asn Asn Leu

35 40 45

Ser Lys Ser Leu Lys Leu Glu Lys Lys Glu Ser Lys Ile Lys Pro Gly

50 55 60

Val Ala Phe Ser Val Ile Thr Thr Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Thr

65 70 75 80

Val Glu Ala Pro Arg Phe Asp Arg Arg Arg Ala Asn Pro Lys Asn Val

85 90 95

Ala Ser Val Ile Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Lys Leu Phe Pro Leu

100 105 110

Thr Ser Arg Ala Ala Thr Pro Ala Val Pro Val Gly Gly Cys Tyr Arg

115 120 125

Leu Ile Asp Ile Pro Met Ser Asn Cys Ile Asn Ser Gly Ile Asn Lys

130 135 140

Ile Phe Val Leu Thr Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Leu Asn Arg His Ile

145 150 155 160

Ala Arg Thr Tyr Phe Gly Asn Gly Val Ser Phe Gly Asp Gly Phe Val

165 170 175

Glu Val Leu Ala Ala Thr Gln Thr Pro Gly Glu Thr Gly Lys Lys Trp

180 185 190

Phe Gln Gly Thr Ala Asp Ala Val Arg Gln Phe Ile Trp Val Phe Glu

195 200 205

Asp Ala Lys Asn Lys Asp Val Asp Asn Ile Leu Ile Leu Ser Gly Asp

210 215 220

His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr Met Asp Leu Val Gln Asn His Ile Asp

225 230 235 240

Arg Asn Ser Asp Ile Thr Leu Ser Cys Ala Pro Ala Cys Asp Ser Arg

245 250 255

Ala Ser Asp Phe Gly Leu Val Lys Ile Asp Ser Arg Gly Arg Val Val

260 265 270

Gln Phe Ala Glu Lys Pro Lys Gly Phe Asp Leu Lys Ala Met Gln Val

275 280 285

Asp Thr Thr Leu Ile Gly Leu Ser Pro Gln Glu Ala Lys Arg Ser Pro

290 295 300

Tyr Ile Ala Ser Met Gly Val Tyr Val Phe Lys Thr Asp Val Leu Leu

305 310 315 320

Lys Leu Leu Lys Trp Arg Tyr Pro Thr Ala Asn Asp Phe Gly Ser Glu

325 330 335

Ile Ile Pro Ala Ala Ile Asn Glu His Asn Val Gln Ala Tyr Ile Phe

340 345 350

Arg Asp Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr Ile Lys Ser Phe Tyr Asp Ala

355 360 365

Asn Leu Ala Leu Thr Ala Glu Ser Pro Lys Phe Glu Phe Tyr Asp Pro

370 375 380

Lys Thr Pro Phe Tyr Thr Ser Pro Arg Phe Leu Pro Pro Thr Lys Ile

385 390 395 400

Asp Asn Cys Lys Ile Lys Asp Ala Ile Ile Ser His Gly Cys Phe Leu

405 410 415

Arg Glu Cys Ser Val Asp His Ser Ile Val Gly Glu Arg Ser Arg Leu

420 425 430

Asp Cys Gly Val Glu Leu Lys Asp Thr Leu Met Met Gly Ala Asp Tyr

435 440 445

Tyr Gln Thr Glu Ser Glu Ile Ala Ser Leu Leu Ala Glu Gly Lys Val

450 455 460

Pro Ile Gly Val Gly Glu Asn Thr Lys Ile Arg Asn Cys Ile Ile Asp

465 470 475 480

Lys Asn Ala Lys Ile Gly Lys Asp Val Val Ile Met Asn Lys Asp Gly

485 490 495

Val Gln Glu Ala Asp Arg Pro Glu Glu Gly Phe Tyr Ile Arg Ala Gly

500 505 510

Leu Thr Ile Val Ala Glu Lys Ala Thr Ile Lys Asp Gly Thr Val Ile

515 520 525

Claims

1.一种获得淀粉含量降低的烟草品种的方法，其特征在于，利用烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示；

利用基因沉默技术，通过调节烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因的表达量，来调节控制烟叶中淀粉含量；

利用病毒诱导的基因沉默的技术，干扰烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因的表达使其沉默，烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因沉默植株中淀粉含量显著下降，进而获得淀粉含量下降的植物品种；

烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因的PCR扩增引物序列设计如下：

NtGLGC-F：5’-TGTTCAATCTCCAAAGTTCC-3’，

NtGLGC-R：5’-CGCAATCTCAGATTCTGTTTG-3’。

2.根据权利要求1所述的获得淀粉含量降低的烟草品种的方法，其特征在于，烟草葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的获得淀粉含量降低的烟草品种的方法，其特征在于，在提取基因组时，以烟草品种红花大金元叶片为样品。

4.根据权利要求1所述的获得淀粉含量降低的烟草品种的方法，其特征在于，该基因表达的蛋白与植物叶片中淀粉含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中淀粉含量明显降低。