CN109337914A

CN109337914A - 一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用

Info

Publication number: CN109337914A
Application number: CN201811391818.5A
Authority: CN
Inventors: 张慧; 徐国云; 卢鹏; 郑庆霞; 金静静; 翟妞; 金立锋; 周会娜; 许亚龙; 刘萍萍; 陈千思; 李泽锋
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用专利申请。该基因CDS序列包括579bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1位-388位核苷酸为特异性核酸片段。烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8是烟草氯离子代谢的关键蛋白，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，抑制NtSLAH8基因表达后，转基因沉默植株中氯离子含量明显降低。基于此，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量改善提供了根本性的技术支撑。

Description

一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用专利申请。

背景技术

针对烟草的已有研究普遍认为，烟叶中的氯离子含量以0.3~0.8为宜，在含量达到1%时会影响阴燃持火性，进一步高于1%时会出现黑灰熄火现象；另一方面，烟叶中氯离子含量过高时会造成淀粉积累多，叶片肥厚而脆，吸湿性大，使得存放时颜色易变深，产生不良气味。总之，烟叶中氯离子含量对于烟叶质量具有较为重要的直接影响。

基于烟叶中氯离子含量对烟草品质的直接影响和其重要性，部分研究人员对全国各地烟叶中氯离子含量进行了检测统计，结果表明（中国烟草总公司郑州烟草研究院，《中国烟叶质量白皮书（2015年）》）：河南2011年~2015年烤烟烟叶化学成分中氯离子含量（0.53%-0.65%）远高于全国均值（0.26%-0.30%）。此外，根据上烟集团对豫中烟区2012-2015年氯含量测定的平均值，尤其是2014年度数据（下部叶2.21%、中部叶2.09%及上部叶2.03%），豫中烟区近几年氯离子含量都远远高于全国水平。这些统计数据表明，部分地区烟叶质量不均一性、尤其是烟叶中氯离子含量的不均一性甚至偏高特点，已成为制约浓香型烟叶品质提高的瓶颈之一。

为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，传统改善方式多是从栽培技术入手，通过优化田间管理措施、完善调制发酵技术来稳定和提升烟叶品质。但总体而言，这些措施并未从根本上改变这些烟叶质量偏低、工业实用性不强的局面。因而使得相关改进措施缺乏较好实用性。

随着基因组学尤其是基因编辑技术的快速发展，使得人们对于烟叶中氯离子积累与相关基因之间的关系认识越来越深入。基于已有研究已经知晓的是：慢阴离子通道（SLAC）蛋白家族主要在植物阴离子（氯离子和硝酸根离子等）摄取和气孔开闭过程中起到重要作用。但由于SLAC基因家族基因较多，在不同植物中发挥功能差异较大，因而对于不同植物、不同SLAC基因的功能尚需进行进一步的研究和区分，从而能够有针对性的用于将来的植物改良。

发明内容

本发明目的在于提供一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8（Slowly activatingAnion Channel Homologue, SLAH），该基因所编码的烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8与Cl^-的吸收转运相关，基于这一功能，可为低氯离子含量的烟草新品种奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因，该基因来源于烟草（Nicotiana tabacum），其CDS序列包括579bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1位-388位核苷酸为特异性核酸片段。

PCR扩增获得所述NtSLAH8基因的方法，具体可参考如下：

（1）提取烟草样品的总RNA，并反转录为cDNA备用；

（2）设计扩增引物序列如下：

F：5’-CGCGAGCTCGGTACCATGGTTGCAAATCCAACT-3’，

R：5’-GCTCACCATGGATCCATTACGTTTAGTGAAGT-3’；

以步骤（1）中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增即可。

烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8蛋白，为一种离子通道蛋白，该蛋白与氯离子转运相关，包括192个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8在烟草中的应用，用于转运氯离子。

所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因在烟草中的应用，将该基因沉默后，植物体内氯离子含量明显下降。

用于沉默烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体，其构建方法为：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，以所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段连接到瞬时表达载体TRV上，转化大肠杆菌DH5α后，进一步经筛选、鉴定，构建获得瞬时沉默VIGS载体：TRV-NtSLAH8。

所述用于沉默烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体在烟草中的应用，利用转基因技术，将该VIGS载体转化烟草植株后，用于沉默NtSLAH8基因，使得烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8基因表达量明显降低甚至无法表达，最终降低植物体中氯离子含量。

一种培育低氯植物品种的方法，利用转基因技术，将所述用于沉默烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体转化植物体，筛选、鉴定获得瞬时沉默植株；如果利用RNAi干扰的方法，构建基因沉默载体，转化植物体，经过筛选、鉴定即可获得转基因植物新品种，转基因植物新品种中NtSLAH8基因的表达受到限制；所述待转化植物体为普通栽培烟草。

本发明中的烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8是烟草氯离子代谢的关键蛋白，通过real-time PCR 发现该NtSLAH8基因在烟草各个组织中都表达，且在烟草叶芽组织中表达相对较高。为进一步确认该蛋白功能，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，构建了沉默NtSLAH8基因的VIGS 载体，转化后成功获得了抑制NtSLAH8在本氏烟草中表达的转基因沉默植株。检测结果表明，相对对照植株，转基因沉默植株中氯离子含量明显降低，降低了约38%，即：所获得的转基因沉默植株拥有氯离子含量相对对照植株明显降低的特异表型，换言之，沉默NtSLAH8基因后可以显著降低植物体内的氯离子含量。

结合现有基因工程技术可以看出，利用基因沉默技术通过敲除或者沉默NtSLAH8基因后，可以明显降低植物体内的氯离子含量，基于此，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量改善提供了根本性的技术支撑。

附图说明

图1为不同组织器官中NtSLAH8的相对表达量；

图2 为沉默植株中NtSLAH8 基因的相对表达量；

图3 为烘干后各处理组烟叶中的氯离子含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。

生物材料：

烟草材料：本氏烟草（Nicotiana benthamiana），一种商品化烟草品种；

干扰载体：TRV，购自中国质粒载体菌细胞基因保藏中心；

基因测序及引物合成，由上海生工提供完成；

实验试剂：

LA Taq酶、PstI限制性内切酶，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等，购自Takara公司，

In-Fusion一步法克隆试剂盒，购自clontech公司；

RNA提取试剂盒，购自于GeneAnswer公司；

反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒，购自Roche公司；

蛋白胨、酵母提取物等，购自Oxoid公司；

部分试剂配方及配制方法简要说明如下：

（1）LB 液体培养基（1L）：10 g 细菌蛋白胨（bacteriological peptone），10 g 氯化钠（NaCl），5 g 酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

（2）YEB 液体培养基（1L）：5 g 牛肉浸膏（beef extract），5 g 细菌蛋白胨（bacteriological peptone），5 g 蔗糖（sucrose），1 g 酵母抽提物（yeast extract），2ml 1M 硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

（3）1M 2-(N- 吗啉) 乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O 溶解MES，过滤灭菌，-20℃储存备用；

（4）200 mM 乙酰丁香酮（Acetosyringone）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解乙酰丁香酮，-20℃储存备用；

（5）MMA（1L）： 20 g 蔗糖（sucrose），5 g MS salts（Duchefa Biochemie），1.95 gMES，1 ml 乙酰丁香酮（200 mM，），pH=5.6；

实验仪器：

PCR仪Tgradient，Biometra公司产品，

实时定量PCR仪LightCycler 96，Roche公司产品。

实施例1

本实施例主要就烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8基因的获得过程，简要介绍如下。

以栽培种烟草叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用；

设计扩增引物序列如下：

F：5’-CGCGAGCTCGGTACCATGGTTGCAAATCCAACT-3’，

R：5’-GCTCACCATGGATCCATTACGTTTAGTGAAGT-3’；

以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，以获得NtSLAH8基因的序列。

PCR反应体系为：

上游引物1μL，

下游引物1μL，

cDNA 1μL，

10×buffer 5μL，

dNTP 6μL，

EazyTaq酶1μL，

加ddH₂O至50μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带。采用In-Fusion方法将上述PCR产物与植物表达载体pFF19连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃培养过夜。

对扩增产物进行提纯后测序，获得了烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因，共包括579bp个碱基，分析表明其中第1位-388位核苷酸为特异性核酸片段，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGGTTGCAAATCCAACTAGCCAACTTTCTGTATTAGGAAATTTGACTGGTGCTTGGATTGCAAGTAAAAAGGAATGGAAAGAGAGTGCAGTTTGTATATTTACATTAGGGTTAACACATTATTTGGTAGTGTTTATTACACTTTATCAAAGATTATCTGGTAGTAATAGCTTACCTGCTATGCTTAGACCTTCTTTCTTTTTGTTTGTGGCTGCACCAAGTATGGCTAGCTTAGCTTGGGCTTCTATTTCTGGGGATTTTGATATGTCATGCAGGATGCTCTTTTTTCTGTCACTATTTCTCTTCACTTCTTTGGTTTGTAGGCCAGCAATATTCAAGAAATCAATGAAAAAGTTCAATGTTGCATGGTGGTCTTACTCATTTCCACTCACATTCCTAGCCTTAGCCTCTGTACAATATGCACATCAAGTGAAAAGTCCTGTTTCTGCTGGACTTATGCTTCTTCTCTCAGCCCTTTCAGTTCTTGTTTTTGTTGGTTTGACAGTTTCCACTGCTCTCAATCTTGACATGCTTTTGGCTGATAATGATCGCTATTTAAACTTCACTAAACGTAATTAG。

对编码基因NtSLAH8基因进行分析、翻译后，获得烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的氨基酸序列，该蛋白共包括192个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MVANPTSQLSVLGNLTGAWIASKKEWKESAVCIFTLGLTHYLVVFITLYQRLSGSNSLPAMLRPSFFLFVAAPSMASLAWASISGDFDMSCRMLFFLSLFLFTSLVCRPAIFKKSMKKFNVAWWSYSFPLTFLALASVQYAHQVKSPVSAGLMLLLSALSVLVFVGLTVSTALNLDMLLADNDRYLNFTKRN。

为了进一步了解NtSLAH8基因在不同组织中的表达特异性，利用real-time PCR技术，分别以栽培烟种子、成熟期烟草叶片、茎、根、叶芽、雄蕊、雌蕊和花萼等器官为样品，对NtSLAH8基因在不同组织中的表达情况进行了检测。结果如图1所示。

分析可以看出，NtSLAH8基因在烟草的各个组织中都有表达，但在烟草茎中的表达量最高。

实施例2

为确定NtSLAH8基因在烟草中的功能，选择NtSLAH8基因中特异核酸片段（序列表SEQID NO.1的第1位-388位核苷酸序列）作为引导序列，构建了沉默NtSLAH8基因用的瞬时沉默用VIGS载体，并进一步转化烟草植株构建了转基因植株，相关实验过程简要介绍如下。

（一）构建瞬时沉默用VIGS载体

首先，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtSLAH8-F：5’- TCGACGACAAGACCCTGCAGATGGTTGCAAATCCAAC-3’，

NtSLAH8-R：5’- TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGGTGGAAATGAGTAAGAC-3’；

以上述引物序列进行PCR扩增（扩增长度：388bp）获得VIGS 的引导序列；

其次，利用In-Fusion的法，将上述扩增的引导序列与TRV载体（50℃连接15min）连接，筛选、测序验证构建获得连接正确的TRV-NtSLAH8载体。

（二）转化农杆菌

采用冻融法，将TRV-NtSLAH8载体转化农杆菌GV3101后，挑取阳性单克隆菌落，液体培养后，利用菌液PCR方法验证确保目的片段转化正确，并将转化正确的菌液保存备用。

需要说明的是，作为对照，同样操作方式条件下，分别将TRV1、TRV2、TRV2-PDS（阳性对照）转化了农杆菌GV3101并制备了对照用转染菌液。

（三）制备转染液

将步骤（三）中所制备的含有TRV1、TRV2、TRV2-PDS（阳性对照）、TRV2-NtSLAH8的农杆菌单菌落分别接入YEB（5mL）培养基中(卡那霉素，50μg/mL)，28℃、250 r/min 过夜振荡培养约48h；

转接至50 mL的YEB中，28℃过夜振荡培养；

4000r/min 离心8 min 收集农杆菌到50 mL离心管中，并用含有10 mmol/L 2-N- 吗琳基乙磺酸(MES) 、20 μl/L 乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)和10mmol/L的MgCl₂的混合溶液将上述菌液的OD值调至1.0左右。

在含有TRV2、TRV2-PDS、TRV-NtSLAH8的农杆菌的MMA 悬浮液中等体积加入含TRV1农杆菌的MMA 悬浮液混匀，室温放置3~6h作为转染液。

（四）制备转化体并进行转化

将烟草种子（本氏烟草）播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，于22℃、16h光/8h 暗条件下进行日常肥水管理等，生长4~5w，选取长势一致12 盆烟草幼苗作为转化体；

转化接种时挑选长势一致的约4~5 片叶子，用1mL无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同TRV 重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于22℃、75%湿度条件下进行培养；

其中，含TRV2-PDS阳性对照的注射植株接种4盆，其余含TRV2空载体、含TRV2-NtSLAH8的注射植株各接种4盆。

接种6周后，检测各处理组植株中NtSLAH8 基因表达量（采用real-time PCR 技术）及氯离子的含量。

氯离子含量的检测，具体参考如下方法进行：

每个处理组植株取3~4片叶子，用锡箔纸包裹后放入烘箱90℃烘干过夜；

将烘干的样品用研磨仪打碎，称取0.05g烟叶（精确至0.0001g），加入15ml、5%的乙酸溶液，置于恒温振荡器（30℃摇床），恒温震荡30min；

滤纸过滤后上连续流动分析仪测定氯离子含量。

对NtSLAH8 基因表达量检测结果如图2所示，从图2可以看出，NtSLAH8 基因表达量较低，表明NtSLAH8 基因成功被沉默，转基因体构建成功。

对植株体内氯离子含量检测结果如图3所示。从图3中可以看出，基因沉默植株中氯离子含量约是对照植株氯离子含量的62%；即，基因沉默后，植株中氯离子含量下降了38%左右。

基于上述数据结果可以看出，NtSLAH8基因与其编码的烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8与氯离子转运高度相关，利用这一成果，可为低氯含量烟草新品种培育奠定良好基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 1

atggttgcaa atccaactag ccaactttct gtattaggaa atttgactgg tgcttggatt 60

gcaagtaaaa aggaatggaa agagagtgca gtttgtatat ttacattagg gttaacacat 120

tatttggtag tgtttattac actttatcaa agattatctg gtagtaatag cttacctgct 180

atgcttagac cttctttctt tttgtttgtg gctgcaccaa gtatggctag cttagcttgg 240

gcttctattt ctggggattt tgatatgtca tgcaggatgc tcttttttct gtcactattt 300

ctcttcactt ctttggtttg taggccagca atattcaaga aatcaatgaa aaagttcaat 360

gttgcatggt ggtcttactc atttccactc acattcctag ccttagcctc tgtacaatat 420

gcacatcaag tgaaaagtcc tgtttctgct ggacttatgc ttcttctctc agccctttca 480

gttcttgttt ttgttggttt gacagtttcc actgctctca atcttgacat gcttttggct 540

gataatgatc gctatttaaa cttcactaaa cgtaattag 579

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 2

Met Val Ala Asn Pro Thr Ser Gln Leu Ser Val Leu Gly Asn Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ala Trp Ile Ala Ser Lys Lys Glu Trp Lys Glu Ser Ala Val Cys

20 25 30

Ile Phe Thr Leu Gly Leu Thr His Tyr Leu Val Val Phe Ile Thr Leu

35 40 45

Tyr Gln Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Leu Pro Ala Met Leu Arg Pro

50 55 60

Ser Phe Phe Leu Phe Val Ala Ala Pro Ser Met Ala Ser Leu Ala Trp

65 70 75 80

Ala Ser Ile Ser Gly Asp Phe Asp Met Ser Cys Arg Met Leu Phe Phe

85 90 95

Leu Ser Leu Phe Leu Phe Thr Ser Leu Val Cys Arg Pro Ala Ile Phe

100 105 110

Lys Lys Ser Met Lys Lys Phe Asn Val Ala Trp Trp Ser Tyr Ser Phe

115 120 125

Pro Leu Thr Phe Leu Ala Leu Ala Ser Val Gln Tyr Ala His Gln Val

130 135 140

Lys Ser Pro Val Ser Ala Gly Leu Met Leu Leu Leu Ser Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Leu Val Phe Val Gly Leu Thr Val Ser Thr Ala Leu Asn Leu Asp

165 170 175

Met Leu Leu Ala Asp Asn Asp Arg Tyr Leu Asn Phe Thr Lys Arg Asn

180 185 190

Claims

1.烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因，其特征在于，该基因CDS序列包括579bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1位-388位核苷酸为特异性核酸片段。

2.一种PCR扩增获得权利要求1所述NtSLAH8基因的方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）提取烟草样品的总RNA，并反转录为cDNA备用；

（2）设计扩增引物序列如下：

F：5’- CGCGAGCTCGGTACCATGGTTGCAAATCCAACT -3’，

R：5’- GCTCACCATGGATCCATTACGTTTAGTGAAGT -3’；

以步骤（1）中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。

3.权利要求1所述NtSLAH8基因所编码的烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8蛋白，其特征在于，该蛋白为一种离子通道蛋白，与氯离子转运相关，包括192个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求2所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8在烟草中的应用，其特征在于，用于转运氯离子。

5.权利要求1所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因在烟草中的应用，其特征在于，将该基因沉默后，植物体内氯离子含量明显下降。

6.利用权利要求1所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因所构建的用于沉默NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体，其特征在于，其构建方法为：利用病毒诱导的基因沉默技术，以所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段连接到瞬时表达载体TRV上，转化后，进一步经筛选、鉴定，构建获得瞬时沉默VIGS载体：TRV-NtSLAH8。

7.权利要求6所述用于沉默NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体在烟草中的应用，其特征在于，利用转基因技术，将该VIGS载体转化烟草植株后，用于沉默NtSLAH8基因，使得烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8蛋白表达量明显降低甚至无法表达，最终降低植物体中氯离子含量。