JP4738351B2 - 組換型スクロースシンターゼを作製する方法、スクロース測定キットの作製におけるその使用、adpグルコースを作製する方法、並びに、高濃度のadpグルコース及びデンプンを蓄積する葉及び貯蔵器官を有するトランスジェニック植物を得る方法 - Google Patents
組換型スクロースシンターゼを作製する方法、スクロース測定キットの作製におけるその使用、adpグルコースを作製する方法、並びに、高濃度のadpグルコース及びデンプンを蓄積する葉及び貯蔵器官を有するトランスジェニック植物を得る方法 Download PDFInfo
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Description
野生型スクロースシンターゼSS4のヌクレオチド配列が分かっているので(Fu,H.、Park,W.D.(1995年)「シンク及び維管束に関連したスクロースシンターゼ機能は、ジャガイモにおいて様々な遺伝子クラスにコードされている(Sink− and vascular−associated sucrose synthase functions are encoded by different gene classes in potato)」Plant Cell 7、1369〜1385頁)、遺伝子の5’末端及び3’末端に対応する2種の特異的プライマーを作製した。これらのプライマーを用いて、ジャガイモの葉のcDNAライブラリーから、SSXと呼ばれる2418塩基対のDNA断片を従来のPCR技術によって増幅した。このPCR断片をpSKブルースクリプトプラスミド(Stratagene社)に挿入して、pSS構築物(図3A)を作製し、宿主細菌XL1 Blue中で増幅させた。
pSSを制限酵素NcoI及びNotIで消化した。(SS、SSXをコードするcDNAを含む)遊離された断片を、組換えタンパク質と融合されるヒスチジンに富む配列をコードしているヌクレオチド配列をポリリンカー領域に有するpET−28a(+)発現プラスミド(Novagen社)(図3B)の同じ制限酵素部位にクローニングした。得られたプラスミド(pET−SSと呼ぶ、図3C)をエレクトロポレーションによって大腸菌の様々な株に挿入した。pET−SSで形質転換した大腸菌株BLR(DE3)(Novagen社)を、2003年10月29日に、ブルハソート(Burjassot)46100(バレンシア、スペイン)、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関(Spanish Type Culture Collection)に寄託番号CECT:5850で寄託した。これらの細菌をLB培地中、20℃でインキュベートした。20℃で増殖させた細胞培養物100mLに1mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することによって、SSXの過剰発現を誘導した。培養物を誘導した6時間後に、細菌を回収し、4mlの結合緩衝液(Novagen社、His結合精製キット)中に再懸濁し、次いで、超音波処理し、40,000gで20分間遠心分離した。N末端にヒスチジン残基に富んだアミノ酸配列を有する組換型SSを含む上清を、Novagen社製のHis結合タンパク質精製キットのアフィニティーカラムに通した。キットに付属している取扱い説明書に従って、1モルの代わりに200mMのイミダゾールを含有する、推奨される溶出緩衝液6mlでSSを溶出させた。溶出後、そのタンパク質を直ちに透析にかけて、SSを不可逆的に不活性化する微量のイミダゾールを除去した。
適切なプライマーを用い、pSSを鋳型として、突然変異させた変異体SS5を設計して構築物pSS5を作製した。これは、QuikChange Site−Directed Mutagenesisキット(Stratagene社)を用いて行った。NcoI及びNotIを用いてpSS5を消化した。(SS5を含む)遊離された断片を、pET−28a(+)発現プラスミドの同じ制限酵素部位にクローニングしてpET−SS5を作製し、エレクトロポレーションによってそれを大腸菌BLR(DE3)中に挿入した。pSS5で形質転換した大腸菌株XL1 Blueを、2003年10月29日に、ブルハソート46100(バレンシア、スペイン)、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関に寄託番号CECT:5849で寄託した。
本発明では、(a)構成的に、(b)葉で特異的に、(c)塊茎などの貯蔵器官で特異的に、SSを過剰発現させた。
スクロース測定用に設計されたキットのうちの1つを、スクロースから糖ヌクレオチドへの変換、また、それに続く糖ヌクレオチドからグルコース−1−リン酸、グルコース−6−リン酸、NAD(P)Hへの変換に基づいてスクロースを分光光度的/蛍光定量的に測定するためのキットに含まれる酵素反応に関する以下のスキームIに示す。
容易に精製可能であり、且つ、高い比活性を有する、ヒスチジン末端を有する組換型SSの大腸菌BLR(DE3)における発現
ジャガイモのSSのアイソフォームをコードするSS4遺伝子のヌクレオチド配列が分かっているので、5’から3’の方向に、配列番号1及び配列番号2の配列を有する2種の特異的プライマーを作製することができた。これらのプライマーを用いて、ジャガイモの塊茎のcDNAライブラリーから、SSXと呼ばれるDNA断片を従来のPCR法によって増幅し、これをpSKブルースクリプトプラスミド(Stratagene社)に挿入して、宿主細菌XL1 Blue中で増幅させた。SSXのヌクレオチド配列は、配列番号3であり、SS4(ジェンバンクアクセッション番号U24087)と少し異なっている。配列番号3から演繹されるアミノ酸配列はSS4と少し異なっており、したがって、SSXと呼ぶ。pET−28a(+)プラスミドにおいて配列番号3を発現させた後に演繹されるアミノ酸配列は、配列番号4であり、この配列は、配列番号3から演繹されるアミノ酸配列のアミノ末端に融合された38アミノ酸からなるヒスチジンに富む配列を含んでいる。
大腸菌から得た組換型SSの使用に基づくUDPG及びADPGの大量作製
1M スクロース、50mM HEPES、pH7.0/1mM EDTA/20%ポリエチレングリコール/1mM MgCl2/15mM KCl/100mM UDP、並びにBLR(DE3)におけるpET−SSの発現及びそれに続く精製後に得たジャガイモの組換型SSの30ユニットを含有する溶液100ミリリットルを37℃で12時間インキュベートして、高純度のUDPG3グラムを効率的且つ経済的に作製した。この溶液を100℃で90秒間加熱して反応を終了させ、次いで10,000gで10分間遠心分離した。上清を分取スケールHPLCクロマトグラフ(Waters Associates社)に添加し、文献で記載されているようにしてUDPGを精製した(Rodriguez−Lopez,M.、Baroja−Fernandez,E.、Zandueta−Criado,A.、Pozueta−Romero,J.(2000年)「アデノシン2リン酸グルコースピロホスファターゼ:グリコーゲン生合成を妨げる色素体ホスホジエステラーゼ(Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase:a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis)」Proc.Natl.Acad.Sci.USA97、8705〜8710頁)。
スクロース測定用酵素キットの作製
スクロースを測定するために、以下の成分及び最終量/濃度を用いて次の反応混液を調製した。
1.糖ヌクレオチドの加水分解酵素の使用に基づくキット
a.2ユニットのSS(組換型又は非組換型)
b.2mMのADP又はUDP(それぞれ、ADPG又はUDPGを作製するかどうかに応じて)
c.2ユニットのADPGピロホスファターゼ又は2ユニットのUDPGピロホスファターゼ(それぞれ、ADP又はUDPの反応混液に含めるかどうかに応じて)
d.2ユニットのPGM
e.2ユニットのG6PDH
f.0.5mMのNAD(P)
g.反応緩衝液:50mM HEPES,pH7.0/1mM EDTA/20%ポリエチレングリコール/1mM MgCl2/15mM KCl
h.予めろ過した試験サンプル
2.UDPGデヒドロゲナーゼの使用に基づくキット
a.2ユニットのSS(組換型又は非組換型)
b.2mMのUDP
c.2ユニットのUDPGデヒドロゲナーゼ
d.0.5mMのNAD
e.反応緩衝液:50mM HEPES,pH7.0/1mM EDTA/20%ポリエチレングリコール/1mM MgCl2/15mM KCl
f.予めろ過した試験サンプル
SSを過剰発現するトランスジェニック植物の作製
図8〜10は、構成的(35S−SS−NOS)及び特異的(RBCS−SS−NOS)にSSを過剰発現するジャガイモ植物の葉で得られた双方の結果を示す。
1.ADPGを生成するSSの活性(図8)とデンプン(図9)及びADPG(図10)レベルとの明確な相関。この特徴は、葉だけでなく、塊茎や種子などの貯蔵組織でも観察された(以下参照)。
2.野生型植物の葉と比べてデンプン含有量が多い(図9)。例えば、20℃、明期8時間/暗期16時間の光周期の条件で発育させた「野生型」ジャガイモ植物の葉のデンプン含有量は新鮮重1グラム当たり5マイクロモルであるのに対し、SSを過剰発現するトランスジェニック植物の葉では、新鮮重1グラム当たり8マイクロモルである。野生型植物とトランスジェニック植物の差は、明期が長いときに拡大され、その結果、SSを過剰発現する植物の葉は野生型植物の葉の4倍のデンプンを含有する。
3.非形質転換植物の同一の組織又は器官に比べてADPG含有量が多い(図10)。20℃、明期8時間/暗期16時間の光周期の条件で発育させた野生型ジャガイモ植物の葉の平均含有量は新鮮重1グラム当たり0.35ナノモルであるのに対し、SSを過剰発現する植物の葉は、新鮮重1グラム当たり2.5ナノモルの含有量を有し得る。
4.ADPGもデンプンも、明期中に一時的蓄積を示す(図11)。どちらの物質の蓄積速度もSS活性との間に正の相関があり、このことは、デンプン生合成の「従来の」モデル(図2A)によって示されている内容とは異なり、また、図2Bに示す「代替の」モデルの仮説を確認するものであり、SSがADPGの生成、及びスクロース代謝とデンプン代謝の連結において基本的な役割を果たしていることを示唆している。
5.グルコースやフルクトースなどの可溶性糖は通常レベルである。しかし、トランスジェニックの葉におけるグルコース−6−P及びスクロースのレベルは、野生型ジャガイモの葉で観察されるそれらのレベルより高い(表2)。
6.SSを過剰発現する植物の外部形態は、非形質転換植物と比較した場合、異常ではない。
1.ADPGを生成するSSの活性(図12)とデンプン(図13)及びADPG(図14)レベルとの明確な相関。
2.非形質転換植物の塊茎と比べてデンプン含有量が多い(図13)。例えば、「野生型」植物の塊茎のデンプン含有量は新鮮重1グラム当たり約300マイクロモル(新鮮重1グラム当たり54mgのデンプンに相当)であるのに対し、SSを過剰発現する塊茎では、新鮮重1グラム当たり450〜600マイクロモルである。
3.野生型植物の塊茎と比べてADPG含有量が多い(図14)。野生型塊茎の平均含有量は新鮮重1グラム当たり5ナノモルであるのに対し、SSを過剰発現する塊茎は、新鮮重1グラム当たり7〜9ナノモルの含有量を有し得る。
Claims (13)
- 配列番号12で特徴付けられる、スクロースシンターゼ。
- ADPGの作製における請求項1に記載のスクロースシンターゼの使用であって、ADP及びスクロースシンターゼジャガイモアイソフォームを適切な条件においてインキュベートし、次いで作製されたADPGを単離及び精製することにより特徴付けられる、上記使用。
- 請求項2に記載の使用であって、
a)下記の溶液の100mlを12時間37℃でインキュベートする工程:
スクロース 1M
HEPES、pH7.0 50mM
EDTA 1mM
ポリエチレングリコール 20%
MgCl 2 1mM
KCl 15mM
ADP 100mM
b)反応を加熱することにより、好ましくは100℃で90秒間で、停止させる工程、
c)10000gで10分間遠心する工程、及び
d)上清をHPLCでクロマトグラフィー分析し、ADPGを慣用方法により溶出及び精製する工程
を含むことを特徴とする、上記使用。 - スクロースの分光光度的/蛍光定量的/アンペロメトリックな測定用のアッセイキットの製造における、請求項1に記載のスクロースシンターゼの使用。
- 請求項4に記載の使用であって、下記のインキュベーション媒体:
a)2ユニットのスクロースシンターゼ
b)2mMのADP
c)2ユニットの植物、動物、又は微生物由来ADPGピロホスファターゼ
d)2ユニットのPGM
e)2ユニットのG6PDH
f)0.5mMのNAD(P)
g)100mlの反応緩衝液:50mM HEPES、pH7.0/1mM EDTA/20%ポリエチレングリコール/1mM MgCl 2 /15mM KC1
h)予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする、上記使用。 - 請求項4に記載の使用であって、下記のインキュベーション媒体:
a)2ユニットのスクロースシンターゼ
b)2mMのUDP
c)2ユニットの植物、動物、又は微生物由来UDPGピロホスファターゼ
d)2ユニットのPGM
e)2ユニットのG6PDH
f)0.5mMのNAD(P)
g)100mlの反応緩衝液:50mM HEPES、pH7.0/1mM EDTA/20%ポリエチレングリコール/1mM MgCl 2 /15mM KC1
h)予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする、上記使用。 - 請求項4に記載の使用であって、下記のインキュベーション媒体:
a)2ユニットのスクロースシンターゼ
b)2mMのUDP
c)2ユニットのUDPGデヒドロゲナーゼ
d)0.5mMのNAD
e)100mlの反応緩衝液:50mM HEPES、pH7.0/1mM EDTA/20%ポリエチレングリコール/1mM MgCl 2 /15mM KC1
f)予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする、上記使用。 - スクロースシンターゼを過剰発現するトランスジェニック植物の作製における配列番号11で特徴付けられるDNA断片の使用であって、配列番号11のDNA断片を含有しかつ発現する遺伝子構築物を適切なベクターに挿入する工程、及び前記遺伝子構築物を植物のゲノムへ移転させる工程、により特徴付けられる、上記使用。
- 請求項1に記載のスクロースシンターゼを過剰発現することにより、及び同等の条件において成長させた、対応する野生型植物の同じ組織又は器官において観察されるよりも高含有量のスクロース、G6P、ADPG及びデンプンを有することにより特徴付けられる、トランスジェニック植物。
- 前記過剰発現が、非トランスジェニックの野生型植物の同じ組織において存在するよりも2〜10倍のスクロースシンターゼ酵素活性のレベルを示すものであることを特徴とする、請求項9に記載のトランスジェニック植物。
- 好ましくは、タバコ、ジャガイモ、トマト又は稲から選択されることを特徴とする、請求項9又は10に記載のトランスジェニック植物。
- 葉が、対応する野生型植物の葉において観察されるよりも高い、スクロース、G6P、ADPG及びデンプンの含有量並びにアミロース/アミロペクチン比を有する、請求項11に記載のトランスジェニック植物。
- 根、塊茎、及び/又は種子が、対応する野生型植物の同じ組織又は器官において観察されるよりも高い、スクロース、G6P、ADPG及びデンプンの含有量並びにアミロース/アミロペクチン比を有する、請求項11に記載のトランスジェニック植物。
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